JP2782009B2

JP2782009B2 - リグニン配糖体およびその用途

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Publication number: JP2782009B2
Application number: JP11304890A
Authority: JP
Inventors: 靖一田沼
Original assignee: 靖一田沼
Priority date: 1989-10-28
Filing date: 1990-04-28
Publication date: 1998-07-30
Anticipated expiration: 2013-07-30
Also published as: JPH03205402A

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は新規なリグニン配糖体およびその用途に関す
る。

〔従来技術・発明が解決しようとする課題〕

現有の抗癌剤の殆どは、DNA合成あるいは細胞分裂を
抑制する作用を持つが、これは正常細胞に対しても同等
な作用を示す。わずかに癌細胞は細胞分裂が速く、正常
細胞は遅いと言う差を利用して、癌細胞に、より多くの
障害を与えることで治療が成り立っている。正常細胞が
受けた障害は、副作用として表現され、生体がその副作
用にどこまで耐えられるかが、癌治療の上で重要なポイ
ントとなっている。

以上の様に、本来の癌治療は癌細胞の生物学、生化学
などに根ざすべきものであるが、現実にはその様な癌治
療法にまで結びついていない。

さて、癌の原因と言うと発癌物質、放射線およびウイ
ルスの３つが古くより言われてきた。その内、癌ウイル
スの持つ遺伝情報により細胞が癌化することが明らかに
なり、oncogene（癌遺伝子）なる言葉が生まれた。その
後、癌遺伝子は正常細胞にも存在し、それがある時スイ
ッチオンされて、細胞が癌化すると言う仮説が立てられ
たのである。これは、時の流れと共に発展し、今日その
大筋は正しかったことを誰しも認めるところである。

一方、高等動物のゲノムには癌遺伝子となり得るprot
o−oncogeneは50種以上存在し、それらは正常細胞の増
殖や分化に重要な生理機能を果たしている。それ故、細
胞増殖や癌の制御の遺伝子のレベルもしくは遺伝子産物
のレベルでのコントロールの可能性が生まれて来た。本
発明は癌遺伝子発現の段階を、特異的阻害剤で抑制する
癌治療剤を開発することにある。挿入されたマウス乳癌
ウイルス（MMTV）遺伝子の発現がコルチコイドにより制
御されているマウス乳癌細胞を用い、MMTV遺伝子発現に
はクロマチンタンパク質での脱ポリADP−リボース反応
が引金となっていることが見出されている。即ち、ポリ
ADP−リボースが分解されることにより、その部分のク
ロマチン構造の局所変化が、最終的にはRNAポリメラー
ゼのプロモーターへの結合と転写促進につながると考え
られている。〔ジャーナル・バイオロジカル・ケミスト
リー、258:15371（1983）〕。

そこで、発明者はポリADP−リボースの分解を阻止す
れば、癌遺伝子が活性化されなくなることが予想された
ため、ADP−リボースの分解に関与する酵素であるポリ
（ADP−リボース）グリコヒドロラーゼをヒト胎盤より
分離精製し、本酵素に対し阻害作用をもつ化合物を検討
した結果、幾つかの天然化合物に強い阻害活性を見出し
た。

また、この化合物には腫瘍壊死因子（TNF）のもつ細
胞殺傷作用と細胞分化誘導作用を増強する全く新しい活
性があることを見出し、この増強効果がTNF受容体へのT
NFの結合親和性を高めることに起因することも突き止め
た。さらに、この化合物にはマクロファージからのTN
F、インターロイキン１の産生を誘導する作用があるこ
とを見出した。そして、さらに検討を進め、ポリ（ADP
−リボース）グリコヒドロラーゼ阻害、及びTNFをはじ
めとするサイトカインの誘導およびそれらの作用増強効
果に基づく抗癌作用を有する医薬として、使用に耐え得
る新規化合物を見出し、本発明を完成した。

〔課題を解決するための手段〕

即ち、本発明は次の要旨を有するものである。

以下に示す性質を有するリグニン配糖体（ｉ）リグニンおよび多糖類が結合（ii）分子量は60000〜140000 （iii）リグニンと多糖類の結合比は1:1〜20:1（分子
比）（iv）多糖類はウロン酸60〜70％、中性糖30〜40％で構
成されている。

リグニン配糖体を主成分とするポリ（ADP−リボー
ス）グリコヒドロラーゼ阻害剤。

リグニン配糖体を主成分とするサイトカイン、すな
わち腫瘍壊死因子（TNF）作用増強剤。

リグニン配糖体を主成分とするサイトカイン（TNF,
IL−１）の産生誘導剤。

リグニン配糖体を主成分とする（TNFなどのサイト
カインとの併用による）癌免疫療法剤。

本発明のリグニン配糖体は、リグニンと糖（多糖類）
との結合体である。リグニンと糖（多糖類）との結合は
エーテル結合による。その結合比は、リグニン：構成糖
の重量比で1:3〜５程度が例示される。また、リグニン
と多糖体との分子比で１〜20:1程度が例示される。

リグニン配糖体の糖部分はウロン酸および中性糖より
構成される。その組成としてはウロン酸60〜70％、中性
糖30〜40％程度が例示される。

中性糖としては、グルコース、ガラクトース、マンノ
ース、アラビノースが挙げられる。その組成としてはグ
ルコース15〜20mol％、ガラクトース25〜30mol％、マン
ノース35〜50mol％、アラビノース10〜15mol％程度が例
示される。

これらの構成糖は全体として糖鎖構造を取っており、
多糖類を形成する。

リグニン配糖体の分子量は80000〜140000程度であ
り、多糖類部分の分子量は４万〜10万程度である。また
リグニン部分は分子量1000〜10000程度を有する。

本発明リグニン配糖体は、元素的にはＣ原子35〜45重
量％、Ｈ原子１〜10重量％、Ｏ原子45〜64重量％程度が
例示される。

本発明のリグニン配糖体は以下のように調製される。

出発原料としては茶（葉・枝）、紫根、三豆根、朝鮮
人参、松（かさ・葉）、草みづき（幹）等が挙げられ
る。

原料を各種溶媒（例えば、熱水、エタノール、アセト
ン等）で処理する。処理時間は１〜15時間程度である。
処理済み原料をアルカリ性溶液（0.1〜1N水酸化ナトリ
ウム、アンモニウム等）で抽出する。抽出液をpH4〜６
に調整し、１−５倍量のエタノールを添加して沈澱画分
を回収する。沈澱画分をゲル濾過で精製して活性部分を
回収する。

こうして得られたリグニン配糖体は透析、遠心分離、
凍結乾燥等を施すことができる。

本発明のリグニン配糖体は、ポリ（ADP−リボース）
グリコヒドロラーゼ阻害作用、及びTNFの産生誘導およ
びその作用の増強効果を有し、ヒトを含む哺乳動物（ヒ
ト、ウマ、イヌ、マウス、モルモット、ラット等）に対
してポリ（ADP−リボース）グリコヒドロラーゼ阻害活
性、及びTNFの産生誘導およびその作用の増強活性を有
し、ポリ（ADP−リボース）グリコヒドロラーゼ阻害
剤、及びTNFの産生誘導およびその作用増強活性剤とし
て悪性腫瘍、ウイルス性感染症の治療、予防に有用なも
のである。

本発明のリグニン配糖体は、経口的または非経口的に
投与される。

リグニン配糖体は、それ自体または製薬上許容される
キャリアとの医薬製剤の形で投与される。当該製剤は、
自体既知の方法によって調製される。剤型としては、錠
剤、カプセル剤、散剤、坐剤、注射剤等が例示される。

リグニン配糖体は、例えば、経口投与の場合、通常0.
1〜100mg/kg体重程度を１日１回または数回にわたって
投与されるが、年齢、体重、および／または処置すべき
病状の重度や治療に対する反応によりその投与量は変わ
りうる。

毒性実験本発明のリグニン配糖体のマウスに対する毒性は、い
ずれも経口投与でLD₅₀値が100mg/kg以上であり、投与量
にくらべてLD₅₀値が極めて大きく、安全域の広い化合物
である。

〔実施例〕

実施例１以下の処理に付することによってリグニン配糖体を抽
出した。

実施例２リグニン配糖体の糖部分、グリコン（glycone）及び
非糖部分、アグリコン（aglycone）の構造の特徴を検討
するために、本配糖体をメタノリシス（メタノール−塩
酸分解）、あるいは亜塩素酸塩（NaClO₂）法によりグリ
コンとアグリコンに分離して分析を行った。その結果は
次の通りである。

〔グリコンの分析〕

分子量：セファロース（Sepharose）CL−4Bゲル濾過法
により60000〜100000 糖組成^a) （％）（全重量％）ウロン酸 63.4 48.8 中性糖 36.6 28.2 グリコンの2/3がウロン酸であるという特徴を持つ。

中性糖の組成^b) （mol％）グルコース 18.2 ガラクトース 27.4 マンノース 40.2 アラビノース 13.8 フコース 0 中性糖としてはグルコース、ガラクトース、マンノー
ス、アラビノースを含むがフコースは含まない。

ａ）ウロン酸はカルバゾール法、中性糖はフェノール硫
酸法で定量した。

ｂ）中性糖の組成はメタノリシスで生成するメチルグリ
コシドをトリメチル化した後ガスクロマトグラフィーで
分析した。

〔アグリコンの分析〕

分子量：セファロース（Sepharose）CL−6Bゲル濾過法
により4000±2000 赤外吸収分析（IR） IRはKBrディスクにより測定した。

その結果、3500〜3700cm^-1範囲に3400cm^-1にピークを
もつ吸収が検出された。この吸収はフェノール性水酸基
の存在を示す。1600cm付近の吸収は芳香族二重結合を示
す。1700cm付近にカルボニル基の吸収がないことよりタ
ンニンに見られるようなエステル結合はなく、リグニン
に見られるようなエーテル結合で重合している化合物で
あることを示す。

指紋領域も含めて全体のスペクトラムはリグニン（ア
ルカリ）と極めて類似している。

以上のIRスペクトルの結果から本配糖体のアグリコン
はタンニン様化合物ではなく、リグニン様化合物である
と結論される。

紫外吸収（UV）分析 280nmの最大吸収値、260nmに最小吸収値をもつ。

280/260＝1.02 リグニンも同様のUVスペクトルをもつ 280/260＝1.03 UVスペクトルにより芳香族（おそらくフェノール）の
存在を示す。

電子スピン共鳴（ESR）分析リグニンと同様にｇ＝2.004ESRシグナルが検出される
ことより安定なフリーラジカルを有する構造体を含むこ
とを示す。なお、タンニンにはこの様なシグナルは見ら
れない。

〔リグニン配糖体の分析〕

リグニン配糖体全体としての特徴元素分析（weight％）Ｃ 39.83 Ｈ 4.41 Ｏ 55.73 Ｎ 0.03以下Ｓ 0 窒素、硫黄を含有しないことより蛋白、硫酸基を含ま
ずセファロース（Sepharose）CL−4Bゲル濾過法による
分子量は約11万である。

リグニンと糖の結合比は重量比で約1:4である。

従って本配糖体は、糖部分（グリコン）としてウロン
酸を全重量の約50％も含有するという特徴をもってい
る。中性糖としてはグルコース、ガラクトース、マンノ
ース、アラビノースを含む。非糖部分（アグリコン）は
リグニンより成るという特徴を有する。

本配糖体は糖の還元末端ラクトール水酸基がリグニン
のアルコール性またはフェノール性水酸基と脱水縮合し
てエーテル状に結合したＯ−配糖体である。また、リグ
ニンと糖の結合比が重量比で約1:4であり、特に、酸性
糖のウロン酸を多く含有する、分子量約11万のリグニン
配糖体（アグリコンの特徴で分類した場合）である。

本配糖体の推定構造モデルは図面に示す通りである。

試験例1. ポリ（ADP−リボース）グリコヒドロラーゼに対する阻
害効果アッセイ用バッファー（0.01％ウシ血清アルブミン−
10mMメルカプトエタノール−50mMカリウム・リン酸、pH
7.0）に、³H−（ADP−リボース）_ｎ＝15を加え、その27
μに被験物質およびヒト胎盤より調製した核由来、ポ
リ（ADP−リボース）グリコヒドロラーゼ溶液を加えて
全量30μとした後、37℃にて１時間インキュベーショ
ンした。その後、DE81濾紙に反応液を吸収させ、水、エ
タノール、アセトンで濾紙を洗浄した後、それを乾燥さ
せ、液体シンチレーションカウンターにて、未反応基質
³H−（ADP−リボース）を測定し、本酵素に対する試験
物質の阻害作用を検討した。その結果を示したのが表１
であり、用いた被験物質の全てが、用量依存的にポリ
（ADP−リボース）グリコヒドロラーゼを阻害した。

試験例２遺伝子発現に対する阻害効果本試験で用いた遺伝子発現系は、糖質コルチコイド感
受性遺伝子である、マウス乳癌ウイルス（MMTV）遺伝子
を持つ、マウス乳癌細胞である34I株を使用した。本細
胞は、糖質コルチコイド存在下において、35S RNAと、
さらにスプライシングを受けた24S RNAの２種類を発現
する。この発現はenv部分のcDNAを用いることにより検
出することが出来る。そこで、34I株に被験物質を30μg
/mlとなる様に加え、37℃、30分間インキュベーション
し、次に、その系に10^-7Mとなる様にデキサメタゾンを
添加し、さらに１時間インキュベーションした。その
後、34I細胞を集め、高分子RNAをグアニジン−塩酸法で
抽出、60℃で５分間処理（20mMMDPS,pH7.0,5mM 酢酸ナ
トリウム、1mMEDTA）後、1.2％アガロース・ゲル（同バ
ッファー）にて、電気泳動（40V,16h）を行った。その
後、ニトロセルロースヘトランスファーし、³²P−MMTV
−DNA（envに特異的なcDNA）をハイブリダイズし、Ｘ線
フィルムによるオートラジオグラムを作成した。その
後、オートラジオグラムより35S および24S RNAのバン
ドの濃度をデンシトメーターで測定することにより、RN
A発現量を測定し、被験物質の無添加の場合と比較し
て、RNA発現抑制割合を算出した。その結果を示したの
が表２であり、用いた被験物質はMMTV遺伝子発現抑制作
用を示した。

１は陽性対照、2,3は陰性対照、４は実験群試験例3. マウス実験腫瘍に対する制癌効果マウスの腹腔内に、ザルコーマ180腫瘍細胞を１×10⁶
個移植し、移植後１〜４日間被験物質を腹腔内に連続投
与した。抗腫瘍活性は、生理食塩液投与群との比較によ
る延命率より求めた。腫瘍移植後45日目にて実験終了と
した。その結果を示したのが表３であり、用いた被験物
質は制癌作用を示した。

リグニン配糖体は移植日翌日から４日間連続投与し
た。

試験例4. マウス線維芽腫細胞Ｌ−929に対するTNF作用の増強効果 TNFのもつ細胞殺傷作用はＬ−929細胞のシャーレへの
接着性を利用し、生き残った生細胞を染色してその染色
濃度を測定することにより測定することができる。そこ
でＬ−929細胞に被験物質を加え、次にアクチノマイシ
ンＤを４μg/mlになる様に添加し、さらにTNFを加え、3
7℃、18時間インキュベーションする。その後、プレー
トを生理食塩水で洗い死細胞を除去する。その後、生細
胞を0.1％クリスタルバイオレットで染色し、染色され
た生細胞を0.5％SDSにより溶解し、その色素濃度をOD59
0nmで測定し、TNF作用に対する増強効果を検討した。そ
の結果を示したものが表４であり、用いた被験物質の全
てが、用量依存的にTNFの細胞殺傷作用を増強した。

試験例５マウス実験腫瘍に対するTNF併用による制癌効果マウスの皮下にザルコーマ180腫瘍細胞を１×10⁶個移
植し、移植後１〜５日間被験物質およびTNFを連続投与
した。抗腫瘍活性は生理食塩液投与群での比較による延
命率より求めた。腫瘍移植後、45日目にて実験終了とし
た。その結果を示したのが表５であり、用いた被験物質
はTNFとの併用により強い制癌作用を示した。

リグニン配糖体はTNFとともに移植日翌日から４日間
連日投与した。

【図面の簡単な説明】

図面は本発明リグニン配糖体の推定構造を示す。 1:糖 2:リグニン

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】以下の性質を有するリグニン配糖体。（ｉ）リグニンおよび多糖類が結合（ii）分子量は60000〜140000 （iii）リグニンと多糖類の結合比は1:1〜20:1（分子
比）（iv）多糖類はウロン酸60〜70％、中性糖30〜40％で構
成されている。
【請求項２】リグニン配糖体を主成分とするポリ（ADP
−リボース）グリコヒドロラーゼ阻害剤。
【請求項３】リグニン配糖体を主成分とするサイトカイ
ン作用の増強剤。
【請求項４】リグニン配糖体を主成分とするサイトカイ
ン産生の誘発剤。
【請求項５】リグニン配糖体を主成分とする癌免疫療法
剤。