ES2354505T3

ES2354505T3 - Extractos de piña de pino y usos de los mismos.

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Publication number: ES2354505T3
Application number: ES02773584T
Authority: ES
Inventors: Akiko Tanaka; William Guy Bradley; John Jessip
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2001-09-26
Filing date: 2002-09-26
Publication date: 2011-03-15
Anticipated expiration: 2022-09-26
Also published as: US20050153004A1; WO2003026578A3; AU2002337697A1; US6866875B2; WO2003026578A9; US20090142833A1; EP1438057A4; US20080226663A1; EP1438057A2; DK1438057T3; JP2005508909A; EP1438057B1; DE60238070D1; US7371417B2; CN1596117A; US7838052B2; HK1068275A1; US20030072826A1; US20060034955A1; US20050158413A1

Abstract

Un procedimiento para producir un extracto de piña de pino que comprende las etapas de: a) extraer en caliente material de piña de pino triturado y desgrasado con un disolvente acuoso que comprende hidróxido potásico; b) separar la materia particulada con un tamaño medio de partículas mayor que 0,2 μm, dejando un líquido sobrenadante; c) ajustar el pH del líquido sobrenadante resultante a entre 6,0 y 8,0, caracterizado porque el procedimiento comprende además las etapas de: d) filtrar el líquido sobrenadante para obtener una fracción de retenido; e) secar por succión la fracción de retenido y separar las partículas con una masa molecular media menor que 30 kDa; y f) suspender la fracción de retenido en un disolvente acuoso que comprende hidróxido potásico a un pH entre 6,0 y 8,0.

Description

Campo de la Invención

La presente invención se refiere en general a la preparación de extractos de piña de pino, a los propios extractos de piña de pino y a los usos de los mismos, en particular como adyuvantes en la vacunación o el tratamiento de vertebrados y como agentes para promover la diferenciación de células sanguíneas.

Antecedentes de la Invención

A medida que los investigadores aumentan la comprensión del sistema inmunitario de los vertebrados, se buscan constantemente procedimientos para aprovechar y usar específicamente el sistema inmunitario para prevenir y luchar contra enfermedades. Debido a la extraordinaria versatilidad del sistema inmunitario, este procedimiento, en principio, ofrece la posibilidad de reaccionar frente a cualquier sustancia de suficiente tamaño. Por lo tanto se han hecho numerosos intentos de establecer procedimientos de vacunación y/o de tratamiento inmunológico del cáncer, infecciones bacterianas y víricas.

Dichos procedimientos de terapia y vacunación normalmente usan la exposición del organismo que se va a tratar (tratamiento in vivo) a preparaciones de vacunas de una sustancia antígena, con el fin de generar una respuesta inmunitaria. En particular, la sustancia antígena (antígeno) se usa para iniciar la producción de inmunoglobulinas y/o células fagocíticas citotóxicas capaces de detectar la propia sustancia antígena o partes de la misma (epítopo), haciéndose así rápidamente reconocible para el sistema inmunitario. Un antígeno como este, se convierte rápidamente en reconocible y puede ser inactivado o destruido, p. ej., mediante la absorción en linfocitos T y posterior desintegración o por destrucción de las células que comprenden el antígeno.

Un procedimiento similar de vacunación o tratamiento es extraer linfocitos, en particular células madre linfocíticas, del organismo que se va a tratar, exponiendo las células extraídas al antígeno, induciendo así la producción de inmunoglobulinas capaces de detectar el antígeno, y después reintroducir los linfocitos que producen inmunoglobulinas en el organismo que se va a tratar (tratamiento ex vivo).

El término “vacunación” indica tratamientos de vertebrados principalmente para prevenir la enfermedad o afección creando, potenciando o manteniendo la capacidad del sistema inmunitario de responder a antígenos correlacionados con la enfermedad o afección. El término “tratamiento” indica crear, potenciar o mantener la capacidad del sistema inmunitario para responder a antígenos correlacionados con una enfermedad o afección después de la primera aparición de la enfermedad o afección, siendo por lo tanto de naturaleza terapéutica. El principio activo en un tratamiento de vacunación se denomina “vacuna”, mientras que el principio activo en un tratamiento terapéutico se denomina “medicamento”. Los términos “vacunación” y “tratamiento” se usan de forma intercambiable, y lo mismo para los términos “vacuna” y “medicamento”.

Uno de los descubrimientos científicos más importantes en los últimos 10 años ha sido la definición de antígenos asociados a tumor (TAA) reconocidos por linfocitos T humanos. Para una recapitulación véase, p. ej., Robbins y Kawakami "Human tumor antigens recognized by T cells", Current Opinion in Immunology 1996, 8:628-636; Rosenberg S.A., "A new era for cancer immunotherapy based on the genes that encode cancer antigens", Immunity 1999, 10:281-287; Van den Eynde B.J. y van der Bruggen P., "T cell defined tumor antigens", Current Opinion in Immunology 1997, 9:684-693. Se cree ampliamente que la identificación y caracterización molecular de los TAA ha proporcionado medios para crear vacunas para el cáncer. Los esfuerzos actuales para crear dichas vacunas se basan en técnicas de inmunización mediada por ácidos nucleicos, es decir, inserción de una o más secuencias que codifican antígenos (p. ej., una secuencia que codifica un TAA) en vectores (huéspedes) de expresión adecuados capaces de producir la expresión de la secuencia que codifica el antígeno directamente en las células transfectadas. El término “secuencia” indica en lo sucesivo un ácido nucleico caracterizado por la secuencia de sus nucleótidos, en el que un ácido nucleico es cualquier molécula que comprende uno o más nucleótidos seleccionados del grupo de adenina, guanina, citosina, timina, uracilo o sus equivalentes funcionales, como por ejemplo, inosina e hipoxantina, en la que cada nucleobase está unida a una cadena principal que comprende una pentosa tal como ribosa y/o desoxirribosa, y otro azúcar o un aminoácido, y en la que las cadenas principales individuales están unidas/conectadas entre sí, por ejemplo, por enlace fosfodiéster, enlace peptídico u otro medio adecuado de unión/conexión. Los ejemplos de ácidos nucleicos son ácido desoxirribonucleico (ADN) y ácido ribonucleico (ARN). Los vectores hospedadores usados normalmente son bacterias y virus o genomas bacterianos y víricos respectivamente. Estudios recientes han mostrado que no siempre es necesario un vector celular o encapsulado para la preparación de una vacuna. La inmunización con ADN y/o ARN plasmídico “desnudo”, es decir, el ácido nucleico que carece de cualquier otro componente estructural tales como proteínas, lípidos o hidratos de carbono, puede producir respuestas celulares y de anticuerpos potentes. Las vacunas de ácidos nucleicos, también denominadas vacunas recombinantes, son aquellas vacunas en las que el genoma del vector huésped integra una secuencia de ácido nucleico, con frecuencia heteróloga, que codifica un inmunógeno (antígeno).

En comparación con las vacunas basadas en células o lisados celulares, las vacunas recombinantes tienen múltiples ventajas, siendo probablemente la más destacada el que pueden centrar la respuesta inmunitaria contra un solo antígeno específico tal como un TAA, y por lo tanto limitar la posibilidad de desencadenar una agresión autoinmune incontrolada contra antígenos hasta ahora desconocidos que están presentes en tejidos normales y células tumorales.

Actualmente, el éxito de la vacunación y la terapia varían en gran medida para diferentes afecciones e incluso entre los pacientes tratados de la misma afección. Además, la vacunación no siempre dura un tiempo satisfactoriamente largo, sino que puede desaparecer en semanas. Estos inconvenientes siguen siendo ciertos también para una serie de otros procedimientos de vacunación, que pueden implicar en particular la administración de vacunas vivas o inactivadas. En general, las vacunas no siempre pueden generar una respuesta inmunitaria adecuada y eficaz por sí mismas.

Algunas sustancias, cuando se administran simultáneamente con un antígeno específico potenciarán la respuesta inmunitaria para ese antígeno. Dichas sustancias (adyuvantes) se incluyen de forma rutinaria en vacunas de antígenos purificados o inactivados. Son ejemplos de adyuvantes de uso común las sales de aluminio, liposomas y complejos inmunoestimuladores (ISCOMS), adyuvante de Freund completo e incompleto, dipéptido de muramilo y citocinas tales como interleucina (IL) 2, IL-12 e interferón (IFN) gamma.

Incluso aunque algunos adyuvantes son adecuados en combinación con antígenos o vacunas específicos, pueden fallar en otras combinaciones, o pueden ser ellos mismos tóxicos para vertebrados como seres humanos, promover inmunidad mediada por células pobre, son inestables o son caros y/o difíciles de preparar.

Por lo tanto, las composiciones mejoradas para la vacunación y el tratamiento de enfermedades y afecciones en vertebrados son extremadamente útiles.

Otro aspecto es que para los propósitos científicos, con frecuencia es necesaria la generación de tipos de células específicas, p. ej., para propósitos de cultivo de tejidos. Entre los tipos de células necesarios para la investigación están las células dendríticas y los fibrocitos recientemente descubiertos.

Las células dendríticas son células presentadoras de antígeno potentes. También se ha descrito que actúan como estimuladoras de una reacción de linfocitos mixtos, para migrar selectivamente a través de los tejidos, absorber, procesar y presentar antígenos, y sirven como células pasajeras que producen rechazo de los tejidos trasplantados. Para una recapitulación véase, por ejemplo, Hart DNJ "Dendritic cells: unique leukocyte populations which control the primary immune response", Blood, 1997, 90:3245-3287. Claramente, el estudio de las células dendríticas ofrece potenciales aplicaciones en cualquier campo en los que se desee el reconocimiento correcto de antígenos y la generación de respuestas inmunitarias. Dichos campos son, por ejemplo, la medicina de trasplantes, vacunación, terapia de cáncer y otras enfermedades conectadas con la presentación de antígenos, prevención y tratamiento de enfermedades autoinmunes y similares, véase, por ejemplo, Dallal R.M. y Lotze M.T., "Dendritic cells and human cancer vaccines", Current Opinion in Immunology, 2000, 12:583-588. Sin embargo, la comprensión de las células dendríticas y su diferenciación es insuficiente. Por lo tanto, es conveniente tener procedimientos para producir células dendríticas.

Los protocolos actuales para la producción de células dendríticas se basan en su diferenciación a partir de células mononucleares de sangre periférica, células de la médula ósea u otras células CD34+, por exposición de dichas células a combinaciones de múltiples citocinas incluyendo factor estimulador de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF), factor de células madre (SCF), factor alfa de necrosis tumoral (TNF), factor beta de crecimiento tumoral (TGF) e IL-4. Para una recapitulación véase, por ejemplo, Strunk D y col., "Generation of human dendritic cells/Langerhans cells from circulating CD34+ hematopoietic progenitor cells", Blood, 1996, 87:1292-1302 y Soligo D y col., "Expansion of dendritic cells derived from human CD34+ cells in static and continuous perfusion cultures", British Journal of Hematology, 1998, 101:352-363. Igualmente, las células dendríticas se han producido a partir de monocitos de la sangre CDE14+ y se han descrito diferentes etapas de maduración. Para una recapitulación, véase Winzler C y col., "Maturation stages of mouse dendritic cells in growth factor-dependent long-term cultures", Journal of Experimental Medicine, 1997, 185: 317-328 y la patente de EE.UU. nº US 6.194.204 B1 de Crawford y Chester. Los protocolos presentes todavía se basan en componentes en medios con citocinas caros e inestables. Igualmente, el resultado de los protocolos presentes para la producción de células dendríticas se considera a menudo insatisfactoriamente bajo.

Los fibrocitos son un tipo de células recientemente descritas, caracterizadas por su fenotipo distinto (colágeno+, CD34+), que normalmente también son vimetina+, CD13+ y CD45+. Se ha descrito que entran rápidamente desde la sangre a cámaras de heridas implantadas por vía subcutánea. Con frecuencia también están presentes en cicatrices de tejido conjuntivo y pueden tener una función importante en la reparación de heridas y respuestas fibróticas patológicas. Para una recapitulación, véase por ejemplo Bucala R y col., "Circulating fibrocytes define a new leukocyte subpopulation that mediates tissue repair", Mol. Med. 1994, 1:71-81, y Chesney J. y Bucala R., "Peripheral blood fibrocytes: novel fibroblastlike cells that present antigen and mediate tissue repair", Biochemical Society Transactions, 1997, 25:520-4. Como las células dendríticas, los protocolos para la producción de fibrocitos se basan en componentes en medios con citocinas caros e inestables y a menudo proporcionan resultados insatisfactoriamente bajos. Por lo tanto, se puede apreciar que existe una necesidad continua de nuevos tratamientos de enfermedades y afecciones en vertebrados que se puedan usar aprovechando y usaando el sistema inmunitario de los vertebrados para prevenir y luchar contra enfermedades y afecciones que permanecen sin resolver en la técnica anterior. Además, se necesitan nuevos procedimientos para generar tipos de células específicos para uso científico. En relación con esto, la presente invención cumple esta necesidad.

Resumen de la Invención

Por lo tanto, un objetivo de la invención es proporcionar sustancias nuevas para la vacunación y/o tratamiento, en particular para mejorar y potenciar los efectos de vacunas de ácidos nucleicos y de medicamentos. Las sustancias que proporciona la invención serían aplicables a un amplio espectro de propósitos de vacunación y tratamiento. Las sustancias de acuerdo con el objeto de la invención deben tener baja toxicidad o no tenerla para el vertebrado tratado o las células, tejidos y órganos sanos de dicho vertebrado. Las sustancias deben ser fáciles de preparar, estables y baratas.

Otro objetivo de la invención es proporcionar sustancias y procedimientos para preparar células con fenotipo de tipo dendrítico y/o fibrocito. Las sustancias deben ser fáciles de preparar, estables y baratas. Los procedimientos deben tener un rendimiento alto en al menos uno de esos tipos de células. También deben ser fáciles de llevar a cabo y no necesitar equipo adicional caro.

Los inventores ahora han encontrado que los extractos de piña de pino tienen excelentes propiedades adyuvantas cuando se combinan con vacunas y medicamentos para inmunoterapia. Los inventores también han encontrado que los extractos de piña de pino pueden inducir la diferenciación de una serie de tipos de células en células con un fenotipo de células fibrocitos y/o dendríticas inmaduras y/o maduras. Los inventores también han encontrado que una fracción de los extractos de piña de pino es particularmente útil para lograr los objetivos anteriores.

Es objetivo de la invención proporcionar un procedimiento para producir un extracto de piña de pino. Un objetivo adicional de la invención es proporcionar un extracto de piña de pino producido por ese procedimiento.

Otro objetivo de la invención es proporcionar sistemas para la vacunación y/o terapia de vertebrados que incluyan un kit que tenga una vacuna y un adyuvante o un medicamento y un adyuvante; y proporcionar sustancias para administrar la vacuna y/o para el tratamiento de un vertebrado.

Otro objetivo adicional de la presente invención es proporcionar un procedimiento para

producir células fibrocitos y/o dendríticas fenotípicamente inmaduras y/o maduras.

Estos y otros objetivos de la invención, junto con las diferentes características de novedad que caracterizan la invención, se señalan en particular en las reivindicaciones adjuntas y que forman parte de esta descripción. Para una mejor comprensión de la invención, sus ventajas operativas y los objetivos específicos logrados con sus usos, debe hacerse referencia a los ejemplos y parte descriptiva que acompaña en las que se ilustran las realizaciones preferidas de la invención.

Breve Descripción de los dibujos

La invención se entenderá mejor y otros objetivos distintos de los presentados antes serán evidentes cuando se considere la siguiente descripción detallada. Las figuras muestran:

La Figura 1 es un espectro de cromatografía líquida rápida de proteínas (FPLC) del extracto de piña de pino del procedimiento 1;

la Figura 2 es un espectro de absorción del extracto de piña de pino del procedimiento 1;

la Figura 3 es la microscopía de contraste de fase de CMSP expuestas a diferentes concentraciones de extractos de piña de pino del procedimiento 1;

la Figura 4 es la microscopía de contraste de fase de CMSP expuestas a citocinas y a extracto de piña de pino del procedimiento 1;

la Figura 5 es la producción de citocinas inducida por extracto de piña de pino en cultivos de CMSP derivadas de dos donantes de sangre diferentes;

la figura 6 es la producción de interferón gamma por células CD3+ alogénicas y autólogas tras incubación conjunta con diferentes concentraciones de células CD14+ que se han expuesto a extractos de piña de pino del procedimiento 1; y

las Figuras 7 y 7a son los efectos adyuvantes de los extractos de piña de pino en la producción de IFN-gamma intracelular por esplenocitos CD8+ y CD4+ de animales vacunados con vacunas de ADN.

Descripción detallada de la Invención

Las plantas han sido una fuente principal de compuestos medicinales durante miles de años. Los componentes químicos y análogos que se han obtenido de materiales vegetales en la actualidad comprenden una parte principal de las medicinas en uso clínico. Uno de dichos productos vegetales se obtiene de piñas de pinos de diferentes pinos.

Los extractos de piña de pino se han conocido anteriormente. Sakagami H y col. en "Antitumor, antiviral and immunopotentiating activities of pine cone extracts: potential medicinal efficacy of natural and synthetic lignin-related materials", Anticancer Research, 1991, 11:2881-2888, describen que los extractos brutos en agua de piñas de pino comprenden sustancias con potencial para inducir diferenciación de células ML-1 de leucemias mieloblásticas humanas en células como macrófagos. Se describió que la sustancia que induce la diferenciación migraba muy rápidamente en gel de poliacrilamida y no se podía recuperar en una cantidad útil.

Además de los extractos brutos basados en agua, Sakagami y col. describen en la misma publicación procedimientos de preparación y fraccionamiento de extractos de piña de pino. Los extractos de piña de pino se preparan por extracción repetida en agua caliente de piñas de Pinus parviflora Sieb. et Zucc. y posterior precipitación con etanol. También describen que algunas fracciones de los extractos de piña de pino preparados así, podían prolongar la supervivencia de ratones trasplantados con células de ascitis de sarcoma 180 y de ratones BALB/c trasplantados con ascitis de fibrosarcoma Meth A. Sakagami y col. también describen que los componentes activos de los extractos de piña de pino son ligninas. Además, concluyen que las ligninas naturales y sintéticas pueden tener capacidad inmunoadyuvante. Sakagami y col. también sugieren que la capacidad inmunoadyuvante es mediada al menos parcialmente por la activación de linfocitos T, aunque se dice que la activación de poblaciones distintas de los linfocitos T y la posterior activación de los linfocitos T es un posible modo de activación.

La patente de EE.UU. nº US 4.985.249 (Sakagami, Konno y Nonoyama) describe el uso de extractos de piña de pino como agentes anti-VIH. El resumen de la patente china CN 1279107 (Xin Yaolu) describe una medicina para tratar el SIDA y cánceres, preparada a partir de ricino, raíz de fitolaca, raíz de regaliz y piña de pino mediante extracción de fitolacatoxina, fitolacapoliosa, ricino, ácido glicirrícico para inyección y poliosa del ácido pineal, y lo preparan en forma de inyección y de cápsulas de liberación lenta. El resumen de la patente china CN 1122206 (Xiyun Sun y Yinglong Wang) describe una salsa de soja baja en sal producida por fermentación sólida, que se caracteriza por la preparación de piñones de piña y preparaciones de extracto de setas Xianggu como complementos añadidos a la salsa de soja. Se ha descrito que la salsa de soja producida de esta forma tiene ciertas funciones de prevención del cáncer y restablecimiento de la salud.

Sin embargo, las referencias anteriores no describen propiedades inmunoestimuladoras de los extractos de piña de pino en general ni describen los procedimientos de producción de fibrocitos y/o células dendríticas inmaduras y/o maduras. Es mérito de los inventores el haber establecido la utilidad de los extractos de piña de pino en dichas aplicaciones.

En lo que se refiere a la presente invención, las piñas de pino útiles pueden ser de cualquier especie y variedad del género Pinus, en especial los de la tabla 1, sin limitación pretendida por la corrección de la clasificación taxonómica de esta tabla. Las piñas de pino preferidas son las de P. taeda (pino taeda), P. elliottii (pino elioti), y P. palustris (pino de hoja larga). Los inventores han encontrado que las piñas de pino en general y las piñas de pino de las especies preferidas en particular contienen sustancias y composiciones (principios activos) útiles en los procedimientos de vacunación y/o terapia, y asimismo comprenden sustancias y composiciones útiles para la producción de células dendríticas y/o fibrocitos. También han

5 encontrado que, al contrario de lo que sugerían Sakagami y col. (véase antes), la fracción de lignina de los extractos de piña de pino es necesaria pero no suficiente para las propiedades adyuvantes satisfactorias de los extractos de piña de pino, en particular en los procedimientos de tratamiento y/o vacunación con ácidos nucleicos. Tabla 1: Pinos que producen piñas de pino útiles para preparar los extractos de piña de

10 pino.

Subgéneros de Pinus

Sección Pinus,: P. densata, P. densiflora,

Subsección Pinus: P. heldreichii, P. hwangshanensis, P. kesiya, P. luchuensis, P. massoniana, P. mugo, P. nigra, P. resinosa, P. sylvestris, P. tabuliformis, P. thunbergii, P. tropicalis, P. yunnanensis

Sección Pinea, Subsección Pinaster Loudon: P. brutia, P. canariensis, P. halepensis, P. latteri, P. merkusii, P. pinaster, P. roxburghii

Sección Pinea, Subsección Pineae Little y Critchfield: P. pinea

Sección Trifoliis, Subsección Contortae Little y Critchfield: P. banksiana, P. contorta

Sección Trifoliis, Subsección Australes Loudon: P. caribaea, P. clausa, P. cubensis, P. echinata, P. elliottii, P. glabra, P. occidentalis, P. palustris, P. pungens, P. rigida, P. serotina, P. taeda, P. virginiana

Sección Trifoliis, Subsección Ponderosae Loudon: “Grupo Sabinianae”: P. coulteri, P. sabiniana, P. torreyana “Grupo Ponderosa”: P. arizonica, P. durangensis, P. engelmannii, P. jeffreyi, P. ponderosa, P. washoensis

“Grupo Montezumae”: P. devoniana, P. hartwegii, P. montezumae

“Grupo Pseudostrobus”: P. douglasiana, P. maximinoi, P. pseudostrobus

Sección Trifoliis, Subsección Oocarpae: “Grupo Attenuata”: P. attenuata, P. muricata, P. radiata

Little y Critchfield: “Grupo Oocarpa”: P. greggii, P. jaliscana, P. oocarpa, P. patula, P. praetermissa, P. pringlei, P. tecunumanii

“Grupo Teocote”: P. herrerae, P. lawsonii, P. teocote

Sección Trifoliis, Subsección Leiophyllae Loudon: P. leiophylla, P. lumholtzii

Subgénero Ducampopinua

Sección Ducampopinus, Subsección Krempfianae Little y Critchfield: P. krempfii

Sección Gerardiana, Subsección Gerardianae Loudon: P. bungeana, P. gerardiana, P. squamata

Sección Parryana, Subsección Nelsoniae Van der Burgh: P. nelsonii

Sección Parryana, Subsección Rzedowskianae Carvajal: P. maximartinezii, P. pinceana, P. rzedowskii

Sección Parryana,: P. cembroides, P. culminicola,

Subsección Cembroides: P. discolor, P. edulis,

Engelmann: P. johannis, P. juarezensis, P. monophylla, P. orizabensis, P. remota

Sección Parryana, Subsección Balfourianae Engelmann: P. aristata, P. balfouriana, P. longaeva

Subgénero Strobus

Sección Strobus, Subsección Strobi Loudon: P. amamiana, P. armandii, P. ayacahuite, P. bhutanica, P. chiapensis, P. dalatensis, P. fenzeliana, P. flexilis, P. lambertiana, P. monticola, P. morrisonicola, P. parviflora, P. peuce, P. pumila, P. strobiformis, P. strobus, P. wallichiana, P. wangii

Sección Strobus, Subsección Cembrae Loudon: P. albicaulis, P. cembra, P. koraiensis, P. sibirica

Un aspecto de la presente invención es proporcionar un procedimiento para producir

un extracto de piña de pino. Este procedimiento se puede dividir en dos fases, en lo sucesivo

denominadas procedimiento 1 y procedimiento 2.

El procedimiento 1 requiere la extracción con calor del material de la piña de pino

5 triturado y desgrasado con un disolvente acuoso que contiene hidróxido potásico. Una vez extraído el material de piña de pino, se separa la materia particulada con un tamaño medio de partículas mayor que 0,2 m. Se obtiene una disolución acuosa resultante (líquido sobrenadante), que tiene que tener el pH ajustado entre 6,0 y 8,0 para obtener el extracto del procedimiento 1.

10 El procedimiento 2 usa el extracto (líquido sobrenadante) obtenido en el procedimiento 1. En el procedimiento 2, el extracto del procedimiento 1 (una disolución) se somete a filtración adicional para obtener una fracción de retenido. Mediante el procedimiento de filtración centrífuga se elimina la materia particulada menor de 30 kDa. Lo que permanece es la materia particulada mayor de 30 kDa en la parte superior del filtro, esta fracción de retenido es el extracto de piña de pino del procedimiento preferido (procedimiento 2).

Para el propósito del procedimiento anterior, las piñas de pino pueden estar en forma de material de piña de pino triturado. Se prefiere dicho material de piña de pino porque facilita la posterior extracción. También está fácilmente disponible en el comercio y se mantiene suficientemente estable y la composición uniforme a lo largo de varios lotes.

Antes de usar en el procedimiento anterior de acuerdo con la invención, las piñas de pino se pueden limpiar. Esto se puede hacer preferiblemente lavando las piñas de pino (o material de piña de pino) con agua desionizada.

Las piñas de pino (o material de piña de pino) se desengrasan antes de la extracción acuosa. El desgrasado se logra preferiblemente lavando las piñas de pino con etanol y posterior secado de las piñas o trozos lavados. Las piñas de pino desengrasadas se pueden almacenar a temperatura ambiente en un recipiente cerrado.

Las piñas de pino desengrasadas preferiblemente se trituran en partículas pequeñas antes de la etapa de extracción. Este tratamiento facilita la liberación de los principios activos. Preferiblemente, el tamaño de las partículas debe estar en el intervalo de número de malla 80

120.

El disolvente para la extracción en caliente de las piñas de pino es una disolución acuosa que comprende hidróxido potásico (KOH). La disolución comprende al menos hidróxido potásico al 0,25% en p/p, preferiblemente comprende hidróxido potásico al 0,5-2% en p/p, más preferiblemente comprende hidróxido potásico al 1% en p/p. Los inventores han encontrado que con estas concentraciones de hidróxido potásico, se pueden obtener extractos particularmente eficaces. El pH del disolvente preferiblemente es al menos 8, más preferiblemente al menos 10, lo más preferiblemente está en el intervalo de 11-13.

La extracción del material de piña de pino se lleva a cabo añadiendo disolvente a las piñas de pino y calentando la mezcla, preferiblemente a temperaturas de o superiores a 80ºC. Los inventores han encontrado que la extracción se puede realizar convenientemente rápido y con tasas de extracción suficientes cuando el disolvente está hirviendo. Se prefiere en particular extraer el material de pino mediante autoclave, es decir a 121ºC. De esta forma se puede lograr una extracción particularmente rápida, suave y completa de los principios activos.

Después de la extracción es conveniente dejar enfriar la mezcla, preferiblemente a

temperatura ambiente. Si es necesario, la mezcla se puede almacenar en el frigorífico durante 12 horas antes del posterior procesamiento.

La materia particulada con tamaños medios de partículas mayores que 0,20 m después se elimina de la mezcla. Esto se puede lograr mediante cualquier procedimiento de separación de partículas. Los inventores han encontrado que un procedimiento particularmente conveniente y eficaz es un procedimiento en dos etapas, en el que en la primera etapa se separa por filtración la materia de partículas gruesas, y después la materia particulada no deseada que queda se separa por centrifugación, preferiblemente a 4ºC  2ºC.

La mezcla resultante desprovista de partículas resultante después se trata para ajustar el pH entre 6,0 y 8,0. Esto se hace preferiblemente por valoración con HCl 1 N hasta que el pH de la mezcla es 7,0. Después la mezcla se puede distribuir en unidades de envasado.

La mezcla se puede esterilizar después de ajustar el pH. Se prefiere la esterilización con autoclave a 121ºC, ciclo de líquidos, durante 20 minutos. También se pueden aplicar otras técnicas de esterilización, como la irradiación.

La mezcla (EPP (extracto de piña de pino) del procedimiento 1) se puede almacenar después de ajustar el pH y esterilización opcional. La estabilidad del almacenamiento a largo plazo se asegura mejor mediante el almacenamiento a temperaturas bajas, preferiblemente a

o inferiores a 4ºC, incluso más preferiblemente en estado congelado, lo más preferiblemente a -20ºC. Sin embargo, se prefiere no almacenar la mezcla en absoluto sino usarla inmediatamente.

Después de ajustar el pH y la esterilización opcional del extracto anterior, se somete a filtración adicional para separar el material menor de 30 kDa, usando concentradores de Millipore Ultrafree Centrifugal (Ultrafree-15, con corte de exclusión de peso molecular 30.000). Se prefiere centrifugar a 2000xg durante 60 min para filtrar la disolución y recuperar la fracción de retenido con una masa molecular media no inferior a 30 kDa.

La fracción de retenido que contiene una masa molecular media mayor que 30 kDa después se devuelve a su volumen original usando disolución acuosa de hidróxido potásico 10 mM a un pH entre 6,0 y 8,0. Se prefiere en particular devolver la fracción de retenido en disolución acuosa de hidróxido potásico 10 mM, pH 7,0. El volumen de disolución de hidróxido potásico se puede ajustar de acuerdo con la concentración deseada de la fracción de retenido.

Finalmente, la disolución se puede esterilizar por filtración con un filtro de 0,2 m. Se pueden aplicar igualmente otras técnicas de esterilización. El extracto de piña de pino resultante del procedimiento 2, es decir, el concentrado de

filtración adicional y opcionalmente esterilizado, está listo para usar.

Otro aspecto de la invención proporciona un sistema para la vacunación y/o terapia. Los vertebrados que se pueden elegir para el tratamiento o la vacunación son cualquier vertebrado. Los vertebrados preferidos son mamíferos incluyendo seres humanos, monos, perros, gatos, conejos, cabras, cobayas, hámsteres, vacas, caballos, ovejas, ratones y ratas. Las propiedades generales del sistema inmunitario de estos vertebrados son suficientemente similares para que los resultados experimentales en una especie se puedan interpolar con confianza razonable también a otras especies.

El sistema para la vacunación y/o terapia incluye una composición o un kit que comprende a) una vacuna o medicamento y b) un adyuvante, en el que el adyuvante comprende un extracto de piña de pino.

Los inventores, habiendo reconocido la utilidad de los extractos de piña de pino como adyuvantes, han encontrado además que el efecto adyuvante beneficioso de los extractos de piña de pino no depende de la administración simultánea de la vacuna y el extracto de piña de pino. El extracto de piña de pino se puede administrar al vertebrado antes, durante, simultáneamente o después de la administración de la vacuna o el medicamento. Por lo tanto, el sistema de la invención para la vacunación y/o terapia no está limitado a composiciones que comprenden tanto la vacuna como el extracto de piña de pino, sino que también puede ser un kit que comprende, como entidades separadas, la vacuna, que opcionalmente también comprende un extracto de piña de pino, y el extracto de piña de pino. Una composición que comprende vacuna y/o medicamento y un extracto de piña de pino es particularmente útil para la administración simultánea de ambos ingredientes al vertebrado que se va a tratar. El kit permite la administración independiente de la vacuna (o medicamento) y el extracto de piña de pino. Por lo tanto, el kit es particularmente adecuado si la administración del extracto de piña de pino al vertebrado va a empezar antes de la administración de la vacuna.

Preferiblemente, la vacuna o medicamento es una vacuna o medicamento de ácido nucleico. Los inventores han encontrado que los extractos de piña de pino son particularmente eficaces como adyuvantes en procedimientos de tratamiento o vacunación con ácidos nucleicos. Con los medicamentos y/o vacunas de ácidos nucleicos se puede lograr un grado particularmente alto de inmunización, de activación del sistema inmunitario, cuando se usan con un adyuvante de extracto de piña de pino.

En un procedimiento preferido adicional de la invención, el extracto de piña de pino comprende un extracto de piña de pino producido por el procedimiento 1 (véase antes), es decir, por extracción con calor del material de piña de pino triturado y desgrasado con un disolvente acuoso que contiene hidróxido potásico, después eliminación de la materia particulada con un tamaño medio de partículas mayor que 0,2 m, y finalmente ajuste del pH de la disolución resultante a entre 6,0 y 8,0.

Los extractos de piña de pino preparados de esta forma tienen efectos particularmente fuertes en aplicaciones terapéuticas y de vacunación. Se prefiere usar estos extractos de piña de pino en adyuvantes con vacunas o medicamentos de ácidos nucleicos, ya que dichos extractos de piña de pino ofrecen propiedades de inmunoactivación fuerte y ofrecen la ventaja de aumentar la respuesta inmunitaria que resulta de la vacuna o medicamento. Para los modos preferidos de fabricación de dichos extractos de piña de pino, véase más arriba.

Una realización particularmente preferida del kit o composición de la invención es una en la que el extracto de piña de pino comprende un extracto de piña de pino producido por el procedimiento 2. Ha resultado que dicho extracto de piña de pino, que es de hecho la fracción de moléculas con 30 kDa o más del extracto de piña de pino obtenido por el procedimiento 1, comprende esencialmente todos los ingredientes inmunoactivos necesarios para estimular el sistema inmunitario o, en aplicaciones ex vivo o in vitro, las células necesarias para la mediación de la respuesta inmunitaria al antígeno de la vacuna o medicamento.

La invención también proporciona sustancias para la vacunación o tratamiento de un vertebrado, en la que se administra al vertebrado una vacuna o medicamento. Después de la administración de la vacuna o medicamento, se administra al vertebrado el extracto de piña de pino.

Dichas sustancias ofrecen las ventajas de la administración de la piña de pino en la vacunación y/o terapia como se ha mencionado previamente.

La administración tanto de la vacuna como del extracto de piña de pino se puede llevar a cabo de varias formas. Entre estas están la administración oral y anal, aplicación cutánea, inyección subcutánea, inyección intramuscular e inyección intravenosa. La inyección se puede llevar a cabo usando sistemas de jeringuilla o dispositivos denominados normalmente “pistolas de partículas”. El modo de administración de la vacuna o medicamento se elige de acuerdo con la naturaleza de la vacuna o medicamento. Aunque algunas vacunas alcanzan niveles de inmunización altos por inyección intramuscular, otras se administran preferentemente por vía oral.

Se prefiere administrar el extracto de piña de pino por vía oral o por inyección intramuscular. Ambos modos de administración ofrecen un efecto inmunoestimulador del extracto de piña de pino particularmente pronunciado, aumentando sus propiedades adyuvantes.

Por las razones detalladas antes, en realizaciones preferidas la vacuna o medicamento comprende una vacuna o medicamento de ácidos nucleicos.

Además, el extracto de piña de pino administrado al vertebrado con la vacuna o

medicamento, preferiblemente es un extracto de piña de pino producido por el procedimiento

1.

Dicha administración, en particular en combinación con las vacunas o medicamentos de ácidos nucleicos, explota eficazmente las ventajas del extracto de piña de pino especial como se descrito antes.

Se prefiere en particular que el extracto de piña de pino comprenda un extracto de piña de pino producido por el procedimiento 2. Las ventajas de este extracto de piña de pino se han descrito antes. En combinación con las vacunas y/o medicamentos de ácidos nucleicos, dichos extractos de piña de pino pueden proporcionar una vacunación fuerte, particularmente duradera y/o un alivio rápido o acelerado de la enfermedad/afección.

De acuerdo con otro aspecto, la invención proporciona un procedimiento para producir fibrocitos y/o células dendríticas fenotípicamente inmaduras y/o maduras, cuyo procedimiento comprende exponer células seleccionadas del grupo de células sanguíneas mononucleares, timocitos, esplenocitos, células sanguíneas del cordón umbilical, células de la médula ósea, células CD34+, células CD14+ o mezclas de las mismas, a una cantidad eficaz de un extracto de piña de pino.

Los inventores han encontrado que los extractos de piña de pino tienen un efecto pronunciado en el procedimiento de diferenciación de células del sistema inmunitario. En particular han establecido que los extractos de piña de pino pueden inducir diferenciación a fibrocitos y células dendríticas fenotípicamente inmaduras y/o maduras. La invención ahora permite alcanzar un rendimiento particularmente alto de células que se han diferenciado en células dendríticas inmaduras y/o maduras. Dichos rendimientos altos no se pudieron establecer previamente mediante procedimientos comunes de inducción de la diferenciación,

p. ej., dosis de citocinas. La diferenciación se puede potenciar ventajosamente mediante la exposición adicional de las células seleccionadas o la mezcla seleccionada a células CD3+.

Preferiblemente, el extracto de piña de pino usado para lograr un rendimiento alto de células fibrocitos y/o dendríticas inmaduras y/o maduras se produce por el procedimiento 1. Dichos extractos de piña de pino son particularmente eficaces en la inducción de la diferenciación deseada en fibroblastos y/o células dendríticas fenotípicamente inmaduras o maduras. Este procedimiento de diferenciación se puede combinar ventajosamente con la exposición a células CD3+ para lograr y mantener un rendimiento alto de diferenciación.

Se prefiere en particular que el extracto de piña de pino se obtenga por el procedimiento 2. Dicho procedimiento explota las ventajas inherentes en este extracto de piña de pino como se ha descrito antes.

Ejemplo 1: Preparación de un extracto de piña de pino de acuerdo con el procedimiento 1

Este ejemplo ilustra la producción de extractos de piña de pino (EPP) de acuerdo con el procedimiento 1.

Se usa material de piña de pino triturado disponible en el comercio de International Forest Company, tal como de pino taeda, pino elioti y pino de hoja larga. Se lavan 5 kg del material de piña de pino triturado dos veces en aproximadamente 10 litros de agua desionizada. El material de piña de pino lavado después de desgrasa brevemente lavándolo en 10 litros de etanol al 95% mientras se agita. El material de piña de pino se seca al aire durante la noche y se puede almacenar a temperatura ambiente (18-25ºC) si no se usa inmediatamente.

El material de piña de pino desgrasado y limpiado se muele a un tamaño de partículas de aproximadamente nº de malla 80-120 en una mezcladora. De este material molido, se ponen 600 g en un matraz agitador de 20 litros. Se añaden 4,5 litros de una disolución acuosa de hidróxido potásico al 1% en p/p. La boca del matraz se tapona con una bola de algodón envuelta en gasa. Después el matraz se introduce en el autoclave durante 1 h con escape lento a 121ºC en condiciones de ciclo de líquidos. Después de tratamiento en el autoclave, el matraz se deja enfriar. Si su contenido no se va a procesar más inmediatamente, el matraz se puede almacenar en un frigorífico a 4ºC.

Las partículas grandes se separan por filtración de la suspensión del autoclave con un filtro de malla de nailon en un embudo Buchner unido a un matraz de succión con vacío aplicado al mismo. Las partículas finas se separan por centrifugación del filtrado en una centrífuga de velocidad media Beckman, usando un rotor JA-10 y las botellas correspondientes, centrifugando a 8000 rpm durante 10 min a 4ºC. El líquido sobrenadante se separa y se procesa más.

El pH del líquido sobrenadante de la centrifugación (extracto) se ajusta a 7,0 por adición de ácido clorhídrico acuoso 1 N. Se retiene una muestra de control de 10 ml del líquido sobrenadante neutralizado.

El extracto neutralizado se distribuye en botellas de vidrio de 500 ml (aproximadamente 400 ml por botella). Si no se usa inmediatamente, el extracto se almacena en el frigorífico. El extracto se esteriliza en el autoclave durante 20 min a 121ºC en condiciones de ciclo de líquidos. Después de enfriar, el extracto del autoclave (extracto de acuerdo con el procedimiento 1) está listo para usar. Se puede almacenar en un frigorífico. Ejemplo 2: Preparación de un extracto de piña de pino de acuerdo con el procedimiento 2 a partir del extracto de piña de pino del ejemplo 1

Este ejemplo ilustra la producción de extractos de piña de pino de acuerdo con el

procedimiento 2.

Se ponen 15 ml de extracto de piña de pino del ejemplo 1 en una botella de centrífuga de polipropileno cónica, de 50 ml, estéril (concentrador de centrífuga Millipore Ultrafree-15, Fisher nº cat. UFV2BTK10) y se centrifuga durante 1 h a 2000xg (centrífuga Eppendorf

5 modelo 5810R) (de temperatura ambiente a 4ºC). La fracción de retenido se saca y se guarda. El filtrado que contiene moléculas menores de 30 kDa se descarta. La fracción de retenido se suspende en tampón de hidróxido potásico acuoso 10 mM a pH 7,0 para producir un volumen final de extracto de 15 ml. La fracción de retenido suspendida (extracto del procedimiento 2) se esteriliza por 10 filtración a vacío con un filtro de 0,2 m (membrana de PES Nalgene, nº cat. 124-0020).

El extracto de piña de pino esterilizado del procedimiento 2 está entonces listo para usar. Se puede almacenar en un frigorífico. Ejemplo 3: Propiedades de las piñas de pino de los ejemplos 1 y 2

Este ejemplo ilustra las propiedades de los extractos de piña de pino de acuerdo con 15 los procedimientos 1 y 2.

Los extractos de piña de pino de los procedimientos 1 y 2 son líquidos marrones. Son miscibles con agua, con mezclas de agua y etanol y con acetona. Comprenden polisacáridos y polifenilpropenoides. Los pesos moleculares de los componentes principales se dan en la tabla 2. En la figura 1 se da un espectro de cromatografía líquida rápida de proteínas (PFLC)

20 del extracto de piña de pino del procedimiento 1. En la figura 2 se da un espectro de absorción de UV/VIS del extracto de piña de pino del procedimiento 1. Tabla 2: Pesos moleculares de los componentes principales del extracto de piña de pino

Componente nº: Extracto del procedimiento 1 [kDa] Extracto del procedimiento 2 [kDa]

1: > 30 > 30

2: 21,0 -

3: 13,5 -

4: 3,6 -

5: 2,1 -

Ejemplo 4: Preparación de células mononucleares de sangre periférica

Este ejemplo ilustra la preparación de células mononucleares de sangre periférica

(CMSP).

Las células mononucleares de sangre periférica se aíslan de capas leucocitarias. Las

capas leucocitarias son la capa de leucocitos recuperada después de centrifugación de unidades de sangre entera donadas. Las CMSP se recogen por gradiente de densidad (Histopaque 1.077, Sigma Chemical Company). Las CMSP se recuperan del gradiente y se lavan con disolución salina tamponada con fosfato (PBS, véase Sambrook J.C. y col., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989), pH 7,4. Después de lavar, las células se suspendieron en un medio completo RPMI 1640 aumentado que comprende el medio RPMI 1640 estándar como definen Moore, G.E., Gerner, R.E., y Franklin, H.A. (1967) A.M.A. Vol. 199, página 519, y además suero ternero fetal al 10%, penicilina 100 unidades/ml, estreptomicina 100 g/ml y 2-mercaptoetanol 50 M. La concentración final de células se ajusta para que sea 2 x 106 células/ml. De estas, se aislaron las células CD14+ y CD3+ con microperlas CD14 o CD3 (Miltenyi Biotech, Auburn, California), respectivamente, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se comprobó en las células aisladas que eran más de 95% de CD14+ y CD3+, respectivamente, determinado por tinción inmunofluorescente. Ejemplo 5: Exposición de CMSP con extractos de piña de pino

Este ejemplo ilustra los cambios morfológicos inducidos por exposición de CMSP a extractos de piña de pino.

Las CMSP del ejemplo 4 con una concentración celular de 2 x 106 células/ml en medio RPMI 1649 aumentado (definición del medio como en el ejemplo 4) se distribuyen en los pocillos de placas de microvaloración de fondo plano de 96 pocillos (Nunc) con 100 l de suspensión por pocillo. Los extractos de piña de pino de los procedimientos 1 y 2 (ejemplos 1 y 2, respectivamente) se añaden a cada pocillo con una concentración final de 0, 6,25, 12,5, 25, 50, 100 y 300 mg/ml, respectivamente.

Las células se cultivan durante hasta 8 días a 37ºC en una atmósfera que comprende CO2 al 5%. La figura 3 muestra una imagen de microscopía de contraste de fase típico de CMSP expuestas a diferentes concentraciones de extractos de piña de pino del procedimiento

1. Claramente, se ve un aumento notable del número de células más o menos proporcional a la concentración de extracto de piña de pino. Además, la morfología celular cambia de la morfología de las CMSP en forma de disco a la morfología de las células dendríticas tras exposición al extracto de piña de pino; este efecto se ve mejor a concentraciones mayores (12,5-100 g/ml) y 8 días de tiempo de exposición, pero puede verse ya con estas concentraciones el día 2. No se observaron diferencias visibles entre las CMSP expuestas a extractos de piña de pino del procedimiento 1 y las CMSP expuestas a extracto de piña de pino del procedimiento 2 (no se muestran las imágenes). Ejemplo 6: Efectos de citocinas y extractos de piña de pino en las CMSP

Este ejemplo ilustra los efectos en las CMSP causados por la exposición a citocinas y

a extractos de piña de pino.

Se distribuyen 500 l de CMSP del ejemplo 4 (concentración celular: 2 x 106 células/ml) en cada uno de los pocillos de una primera placa de cultivo tisular de 24 pocillos (Nunc). Después, se añaden a cada pocillo 500 l de medio RPMI 1640 aumentado (véase el ejemplo 4), en los que las muestras en el medio añadidas comprenden (= concentraciones añadidas en el medio, no concentraciones finales) sin sustancias extra, GM-CSF 200 g/ml, IL-4 20 ng/ml, TNFa 20 ng/ml o EPP del procedimiento 1 200 g/ml. Después de 72 h (cultivo inicial) se recogen las células no adherentes y se ponen en pocillos de una segunda placa de 24 pocillos. A cada uno de estos pocillos se añaden 500 l de medio RPMI 1640 aumentado (véase el ejemplo 4) con extracto de piña de pino del procedimiento 1 a una concentración de 200 g/ml de EPP (concentración final de EPP 100 g/ml). Después de 48 h de cultivo (segundo cultivo) se separaron las células no adherentes. Las células adherentes se lavaron con PBS (véase el ejemplo 4) y se fotografiaron con microscopía de contraste de fase.

La figura 4 muestra las imágenes de microscopía de contraste de fase de las CMSP expuestas a las citocinas y al extracto de piña de pino del procedimiento 1. Las imágenes de la columna A muestran células adherentes después de 72 h de exposición a citocinas o EPP. Las imágenes de la columna B muestran células adherentes generadas por el segundo cultivo a partir de la fracción de células no adherentes obtenidas después del cultivo inicial. Las imágenes muestran que la exposición de las CMSP a una cualquiera de las citocinas ensayadas todavía permite un aumento considerable de células adherentes por exposición al EPP. También muestran que el efecto de la exposición de las CMSP al extracto de piña de pino es similar al de la exposición de las CMSP a una combinación de citocinas que se sabe que inducen diferenciación en células dendríticas. No se observaron diferencias entre los efectos de los extractos de piña de pino del procedimiento 1 y los extractos de piña de pino del procedimiento 2. Ejemplo 7: Generación de células dendríticas por procedimiento convencional

Este ejemplo ilustra un procedimiento convencional para inducir la diferenciación de CMSP a células dendríticas por exposición a citocinas.

Las CMSP del ejemplo 4 se cultivan durante 5 días en medio RPMI 1640 aumentado (definición del medio como en el ejemplo 4) con GM-CSF humano 100 ng/ml (R&D Systems, Minneapolis, nº cat. 215-GM-005) y IL-4 10 ng/ml (R&D Systems, Minneapolis, nº cat. 204-IL005) adicionales. Las células después se cultivan durante al menos 3 días en medio RMPI 1640 como antes con TNFa 10 ng/ml adicional (R&D Systems, Minneapolis, nº cat. 210-TA010). Ejemplo 8: Detección de producción de citocinas por las CMSP expuestas a extractos de piña de pino

Este ejemplo ilustra los cambios en la producción de citocinas de las CMSP causado por exposición al extracto de piña de pino del procedimiento 1.

Las CMSP se exponen a concentraciones crecientes del extracto de piña de pino del procedimiento 1 como se detalla en el ejemplo 5. La producción de citocinas después se analiza por ELISA. Los análisis de ELISA se realizan usando los líquidos sobrenadantes de cultivos de 48 h de CMSP que se habían tratado con dosis crecientes de EPP. Los análisis de ELISA para detectar las siguientes citocinas: GM-CSR (nº cat. DGM00), IL-1β (nº cat. DLB50), IL-6 (nº cat. D6050), y TNFα (nº cat. DTA50), se realizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante (R&D Systems, Minneapolis, MN). Esencialmente, se añadieron 100 l del líquido sobrenadante del cultivo a los pocillos adecuados en la placa de 96 pocillos proporcionada en el kit de ELISA y se incubaron a temperatura ambiente durante 2 horas. Los pocillos se lavaron con el tampón de lavado proporcionado y después se secaron con papel secante. Después, se añadió anticuerpo biotinilado específico para la citocina al pocillo y se incubaron a temperatura ambiente durante 2 horas. Los pocillos se lavaron y se secaron con papel secante. Se añadió peroxidasa de rábano picante conjugada con estreptavidina a cada pocillo durante 20 minutos y después se detectó usando tetrametilbencidina en peróxido de hidrógeno como sustrato. Después de 30 minutos, la reacción se terminó por adición de una disolución ácida y se midió la absorbancia de la muestra a 450 nm usando un espectrofotómetro de placa (Molecular Devices, Mountainview, CA).

La figura 5 muestra la producción de citocinas inducida por extracto de piña de pino en cultivos de CMSP obtenidas de dos donantes de sangre diferentes. Los datos de producción de citocinas de un donante se dan regularmente en barras negras, mientras que los datos del otro donante se dan en barra blancas. Los diagramas muestran la producción inducida por el extracto de piña de pino de GM-CSF (diagrama superior izquierdo), IL-1 (diagrama superior derecho), IL-6 (diagrama inferior izquierdo) y TNF (diagrama inferior derecho). La concentración final de extracto de piña de pino en el medio de cultivo se da en g/ml. Los diagramas muestran un aumento general de la producción de citocinas más o menos proporcional a la concentración de extracto de piña de pino durante la exposición. Los inventores no pudieron detectar IL-4 o IL-10 en el medio (no se muestran los datos). No se observaron diferencias en la expresión de citocinas entre células expuestas a los extractos de piña de pino del procedimiento 1 y las células expuestas a los extractos de piña de pino del procedimiento 2. Ejemplo 9: Activación de linfocitos T alogénicos vírgenes por células CD14+ expuestas a extractos de piña de pino

Este ejemplo ilustra la capacidad de CD14+ que se ha expuesto a extractos de piña de pino del procedimiento 1, para activar células CD3+ alogénicas vírgenes.

Se obtiene una población pura de células fenotípicamente dendríticas a partir de CMSP del ejemplo, por extracción con perlas magnéticas (CD14+ Miltenyi Biotech, Auburn California, nº cat. 502-01) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Las células CD14+ aisladas de este modo se distribuyen en los pocillos de una placa de cultivo tisular de 6 pocillos (Nunc) y se exponen a medio RPMI 1640 aumentado como se define en el ejemplo 4, con un extracto de piña de pino del procedimiento 1 con una concentración final de 100 g/ml durante 8 días. Las células se diferencian en células fenotípicamente dendríticas como se describe en el ejemplo 5.

Las células no adherentes que quedan se separan. Las células fenotípicamente dendríticas se recogen (véase el ejemplo 5), se transfieren a medio RPMI 1640 aumentado reciente como se define en el ejemplo 4 y se distribuyen en volúmenes de 100 l en los pocillos de una placa de cultivo tisular de fondo redondo de 96 pocillos (Nunc) a diferentes concentraciones finales por pocillo de las células fenotípicamente dendríticas.

Las células CD3+ autólogas y alogénicas vírgenes se obtienen usando microperlas CD3+ (Miltenyi Biotech) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Las células CD3+ se recogen y se distribuyen en medio RPMI 1640 aumentado como se ha definido en el ejemplo 4, en volúmenes de 100 l en las células fenotípicamente dendríticas en la segunda placa de cultivo tisular con una concentración final de 105 células CD3+ por pocillo. Las células mezcladas se incuban conjuntamente durante 3 días. Después de 3 días, las concentraciones de IFN-gamma se determinan por ELISA (R&D Systems, Minneapolis, nº cat. DIF50) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

La figura 6 muestra la producción de IFN-gamma por las células CD3+ autólogas y alogénicas, determinada después de incubación conjunta. Los triángulos muestran las concentraciones de IFN-gamma después de incubación conjunta de células CD3+ con células dendríticas que se obtuvieron como se describe en el ejemplo 7. Los cuadrados muestran las concentraciones de IFN-gamma después de incubación conjunta con células fenotípicamente dendríticas como se ha descrito antes (preparadas en presencia de EPP). Los rombos muestran las concentraciones de IFN-gamma de células CD3+ incubadas con CMSP expuestas solo a medio. Las células dendríticas, obtenidas por el procedimiento descrito en el ejemplo 7, son las más eficaces en la estimulación de la producción de IFN-gamma. Las células fenotípicamente dendríticas obtenidas por el procedimiento descrito antes son significativamente más eficaces en la estimulación de la producción de IFN-gamma que el medio solo, pero son más eficaces que las células dendríticas obtenidas por el procedimiento del ejemplo 7. No se observaron diferencias significativas en el efecto entre el uso de los extractos de piña de pino del procedimiento 1 y 2 (no se muestran los datos).

Parece que las células obtenidas por exposición a los extractos de piña de pino, aunque son células fenotípicamente dendríticas, son células dendríticas inmaduras y no completamente maduras. Ejemplo 10: Actividad adyuvante del extracto de piña de pino en un modelo de vacuna de ADN (gag) para el VIH

Este ejemplo ilustra los efectos de la administración de piña de pino en un procedimiento de vacunación con ADN.

Se inyecta por vía intramuscular a ratones Balb/c en cada cuádriceps 50 g de vacuna de ADN, suspendida en 50 l de PBS o suspendida en 50 l de una composición de extracto de piña de pino del procedimiento 1 de 40 g/ml (inyección simultánea). El ADN de la vacuna es un vector plasmídico que expresa gag del VIH como inmunógeno, es decir pClgag. El ADN de control es un vector plasmídico que expresa CAT, es decir pCICAT. En otro grupo de tratamiento, se suministró a ratones Balb/c extracto de piña de pino 200 g/ml en el agua de beber durante la duración del experimento. Estos ratones también se vacunaron con los vectores plásmidos como se ha descrito antes.

Tres semanas después de la vacunación, los ratones vacunados se estimulan con una inyección intravenosa de 3x106 ufc de un vector de expresión de virus vaccinia que expresa gag del VIH. Tres días después de esta estimulación, se matan los ratones, se recogen los bazos y se aíslan los esplenocitos por técnicas comunes, véase Bradley, W.G., Ogata, N., Good, R.A., y N.K. Day; "Alteration of in vivo cytokine gene expression in mice infected with a molecular clone of the defective MAIDS virus", 1994, J. Acquired Immune Deficiency Syndromes. 7:1-9.

Los esplenocitos se lavan con PBS (véase el ejemplo 5), se sedimentan por centrifugación a baja velocidad y después se suspenden en PBS enfriado con hielo que contiene suero de ternero fetal inactivado por calor al 2% en p/p y se ponen sobre hielo durante 15 min. Después, se añaden a las células los anticuerpos adecuados que reconocen CD4+ o CD8+ e IFN-gamma. Las células y los anticuerpos se incuban durante 30 min sobre hielo en la oscuridad para marcar las células. Después, las células se lavan con PBS enfriado con hielo. Las células lavadas se fijan en 1 ml de paraformaldehído acuoso al 1% en p/p recién preparado. Se analiza en las células marcadas y fijadas la expresión de antígeno usando un citómetro de flujo Becton Dickinson FACS Caliber. Se recogen un mínimo de

10.000 casos para el análisis.

Las figuras 7 y 7a muestran el efecto de la administración de piña de pino en los

efectos de la vacunación, medidos por la producción de IFN-gamma por esplenocitos murinos CD8+ y CD4+. La porción de péptido de p7g del VIH es un estimulante que reconocen los linfocitos T, específicamente los linfocitos T CD8+. La proteína gag entera = gag = p24 recombinante es el estimulante y es reconocida por linfocitos T CD4+. La respuesta a p24 es 5 óptima para linfocitos T CD4+. Los datos muestran que tanto la administración oral como la intramuscular de extractos de piña de pino durante o inmediatamente después de la vacunación con una vacuna de ácido nucleico, potencian la activación de células CD8+ (paneles "pCIGag/EPP alimentado" y "pCIGag/EPP coiny."). La potenciación es significativamente más fuerte que para la vacuna (pCIGag) administrada sin el adyuvante de

10 extracto de piña de pino (panel "pCIGag solo") o el ADN de "vacunación" control (panel "pCICAT/EPP alimentado"). Otra vez, no se observaron diferencias significativas entre los extractos de piña de pino obtenidos de acuerdo con el procedimiento 1 y el procedimiento 2.

Claims

1.-Un procedimiento para producir un extracto de piña de pino que comprende las etapas de:

a) extraer en caliente material de piña de pino triturado y desgrasado con un disolvente acuoso que comprende hidróxido potásico;

b) separar la materia particulada con un tamaño medio de partículas mayor que 0,2 m, dejando un líquido sobrenadante;

c) ajustar el pH del líquido sobrenadante resultante a entre 6,0 y 8,0, caracterizado porque el procedimiento comprende además las etapas de:

d) filtrar el líquido sobrenadante para obtener una fracción de retenido;

e) secar por succión la fracción de retenido y separar las partículas con una masa molecular media menor que 30 kDa; y

f) suspender la fracción de retenido en un disolvente acuoso que comprende hidróxido potásico a un pH entre 6,0 y 8,0.

2.-Un extracto de piña de pino producido por un procedimiento de la reivindicación 1.

3.-Un sistema de vacunación y/o terapia, que consiste en una composición o un kit que comprende a) una vacuna o medicamento y b) un adyuvante, en el que el adyuvante comprende un extracto de piña de pino obtenido por extracción en caliente de piña de pino con una disolución acuosa de hidróxido potásico, y en el que dicho extracto comprende potasio.

4.-El sistema de la reivindicación 3, en el que la vacuna o el medicamento es una vacuna o medicamento de ácido nucleico.

5.-Un extracto de piña de pino para usar en la vacunación o tratamiento de un vertebrado, pudiéndose obtener dicho extracto por extracción en caliente de piña de pino con una disolución acuosa de hidróxido potásico, y comprendiendo dicho extracto potasio.

6.-Extracto de piña de pino de la reivindicación 5, extracto de piña de pino que está adaptado para la administración oral, para inyección intramuscular, para inhalación o para la aplicación sobre las mucosas.

7.-Extracto de piña de pino de la reivindicación 5, extracto de piña de pino que está adaptado para una vacunación o un tratamiento contra un cáncer y/o una infección vírica.

8.-Procedimiento para producir células fibrocitos y/o dendríticas inmaduras y/o maduras, que comprende exponer células seleccionadas del grupo de células sanguíneas mononuclares, timocitos, esplenocitos, células sanguíneas del cordón umbilical, células de la médula ósea, células CD34+, células CD14+ o mezclas de las mismas, a una cantidad eficaz de un extracto de piña de pino, excluyendo procedimientos para el tratamiento del cuerpo

humano o animal por cirugía o terapia y procedimientos de diagnóstico practicados en el cuerpo humano o animal. 9.-Procedimiento de la reivindicación 8, que además comprende exponer las células seleccionadas o la mezcla seleccionada a células CD3+.

10.-Adyuvante para administrar antes, durante, simultáneamente con o después de una vacuna, comprendiendo dicho adyuvante un extracto de piña de pino obtenido por extracción en caliente de dicha piña de pino con una disolución acuosa de hidróxido potásico y comprendiendo dicho extracto potasio.