JP4970764B2 - 樹状細胞活性化剤 - Google Patents

Description

本出願は、冬虫夏草抽出物またはその分画物を含む樹状細胞活性化剤、特に樹状細胞成熟化促進剤に関する。さらに本発明は、当該樹状細胞活性化剤を含む経口摂取用組成物、医薬組成物、食品組成物等に関する。

樹状細胞は樹枝状の突起を持つという形態的な特徴を有する免疫細胞の一種であり、様々な組織（例えば、皮膚や粘膜など）に分布し、免疫監視細胞としての役割を果たしている。特に、樹状細胞は、体内に進入した抗原をリンパ組織に運び、Ｔ細胞を刺激して免疫反応を惹起させる機能を有し、リンパ球とともに免疫反応の中心的役割を担う細胞である。

様々な生体内組織に分布する樹状細胞のうち、末梢組織に存在する樹状細胞はＴ細胞活性化能が低いことから未成熟樹状細胞と呼ばれる。これに対して、リンパ器官に存在する樹状細胞は強力なＴ細胞活性化能を有することから成熟樹状細胞と呼ばれる。このような機能の差は、ＭＨＣ（主要組織適合遺伝子複合体）分子に加えて細胞接着分子および共刺激分子（例えば、ＣＤ４０、ＣＤ５４、ＣＤ５８、ＣＤ８０およびＣＤ８６など）の発現量の増加ならびにサイトカインやケモカインなどの生産能の変化に起因する。また、成熟に伴って、樹状細胞は、細胞骨格の再構成により固着性の強い構造から運動性の高い構造となり、リンパ節への移動を開始する。所属リンパ器官のＴ領域において、樹状細胞はケモカインの産生などによりＴ細胞の活性化を促進する（非特許文献１：細胞工学、第１９巻、第９号、２０００年、第１３１１−１３１７頁）。

生体内において、樹状細胞の成熟は、感染細菌やウイルス由来のＬＰＳ（リポ多糖）、ＤＮＡ、二重鎖ＲＮＡ、あるいは炎症応答の誘導によって組織細胞から産生されるＴＮＦα（腫瘍壊死因子α）およびＩＬ−１（インターロイキン−１）、さらに活性化血小板、好塩基球、肥満細胞などにおいて発現するＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）により誘導されることが知られている（非特許文献２：Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ Ｊ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、第３９２巻、１９９８年、第２４５−２５２頁）。

また、インビトロ系の実験において、樹状細胞活性化作用を有する物質を探索する試みも行われている。例えば、カワラタケ菌糸体抽出物に由来するクレスチン（以下、「ＰＳＫ」とも称す）およびＡ群溶血性連鎖球菌の弱毒性自然変異株（Ｓｕ株）をペニシリンで処理した製剤であるＯＫ−４３２が樹状細胞の成熟を促進する効果を有すること、および椎茸由来のβ−グルカンを活性成分として含み抗癌剤として市販されているレンチナンが樹状細胞に対して何らの効果も有さないことが報告されている（非特許文献３：Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ、第１５巻、第３号、２００１年、第３８５−３８８頁；非特許文献４：Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ、第５２巻、２００３年、第２０７−２１４頁）。また、ある種のグラム陽性菌の細胞壁骨格により樹状細胞の成熟化が促進されることが報告されている（特許文献１：国際特許公報０１／０４８１５４パンフレット）。さらに、化学合成により得られる特定の低分子化合物が樹状細胞活性化作用を有することについても報告されている（特許文献２：特開２００４−２１０７６８号公報）。

冬虫夏草は昆虫などから生じるきのこの総称であり、子のう菌類・麦角菌目・麦角菌科の一属として位置づけられる。そのうちのコルジセプス シネンシス（Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ（Ｂｅｒｋｅｌｙ）Ｓａｃｃａｒｄｏ）は鱗翅類のコウモリ蛾の幼虫に寄生し、中国、チベット、ネパール、ヒマラヤの高山帯、海抜３０００〜４０００ｍの荒草原に分布するきのこであり、中国では古くから不老不死、強壮強精の漢方薬として伝承されてきた。近年の研究により冬虫夏草に含まれる成分の種々の生理活性についての報告がなされている（非特許文献７：Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．第２２巻、第９号、１９９９年、第９６６−９７０頁；非特許文献８：Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．第１６巻、第１２号、１９９３年、第１２９１−１２９３頁；非特許文献９：Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第５１巻、１９９９年、第８９１−８９８頁）。しかし、樹状細胞に対して何らかの効果を有する冬虫夏草抽出物、特にコルジセプス シネンシスの抽出物については、これまでに何らの報告もされていなかった。

また、樹状細胞の有する強力な抗原提示能を臨床に応用することを目的として、樹状細胞を用いた抗癌療法および抗感染症療法についての研究が進められている（非特許文献５：日経サイエンス、２００３年２月号、第８４−９１頁；非特許文献６：現代医療、２００３年８月号、第８６−９２頁）。このような療法においては、何らかの手段により樹状細胞を活性化することが必要であり、特に、安全で効率のよい樹状細胞活性化剤が求められている。

国際特許公報０１／０４８１５４パンフレット 特開２００４−２１０７６８号公報 細胞工学、第１９巻、第９号、２０００年、第１３１１−１３１７頁 Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ Ｊら、Ｎａｔｕｒｅ、第３９２巻、１９９８年、第２４５−２５２頁 Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ、第１５巻、第３号、２００１年、第３８５−３８８頁 Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ、第５２巻、２００３年、第２０７−２１４頁 日経サイエンス、２００３年２月号、第８４−９１頁 現代医療、２００３年８月号、第８６−９２頁 Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．第２２巻、第９号、１９９９年、第９６６−９７０頁 Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．第１６巻、第１２号、１９９３年、第１２９１−１２９３頁 Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第５１巻、１９９９年、第８９１−８９８頁

本発明者は、上記の課題解決のために鋭意研究を進めたところ、冬虫夏草抽出物、特にコルジセプス シネンシスの抽出物が樹状細胞活性化作用を有することを発見して本発明を完成させた。

本発明の目的は、樹状細胞活性化作用を有する冬虫夏草由来の抽出物、および当該抽出物を含む樹状細胞活性化剤、免疫賦活剤、経口摂取用組成物、医薬組成物、食品組成物、食品および飲料を提供することである。

すなわち本発明の一つの側面によれば、コルジセプス シネンシスの抽出物を含む樹状細胞活性化剤が提供される。ここで、「樹状細胞の活性化」という用語は、樹状細胞が有する何らかの機能が強化され、または樹状細胞において発現するタンパク質などの分子の量が増幅されることを意味し、当該用語の意図するところには、例えば、樹状細胞の成熟化促進、抗原取り込み能増強、抗原提示能増強、Ｔリンパ球刺激能増強などが含まれる。当該活性化に伴って樹状細胞に観察される現象としては、接着分子／共刺激分子（例えば、ＣＤ４０、ＣＤ５４、ＣＤ５８、ＣＤ８０、ＣＤ８６など）の発現量の増加、サイトカイン（例えば、インターロイキン−１２、インターフェロンγおよびインターロイキン−１など）の生産能の増強、ＭＨＣ分子の発現量の増量などが挙げられる。

本発明の別の側面によれば、上記の樹状細胞活性化剤を含む医薬組成物が提供される。当該医薬組成物は、特に限定はされないが、例えば、免疫賦活化、癌もしくは悪性腫瘍の治療もしくは予防、または感染症の治療または予防のために用いられうる。ここで、癌および悪性腫瘍としては、特に限定はされないが、例えば、大腸癌および胃癌などの消化器癌、骨髄腫、肝臓癌、白血病、メラノーマ、前立腺癌、乳癌、子宮癌、肺癌、口腔癌、脳腫瘍などが挙げられる。また、特に限定はされないが、感染症にはウイルス感染症などが含まれ、例えば、Ｂ型肝炎およびＣ型肝炎ウイルスによる慢性肝炎、ＨＩＶ、インフルエンザなどが挙げられる。

本発明におけるコルジセプス シネンシスの抽出物は、子実体および／または菌糸体の抽出物であればよい。好ましくはコルジセプス シネンシスの菌糸体の抽出物、特に好ましくは、食用にされる子実体の前段階の菌糸の状態のものを用いて抽出物が調製される。コルジセプス シネンシスは培養により生産されたものであっても天然より採取されたものであってもよい。例えば、コルジセプス シネンシス菌を固体培地で培養して得られる菌糸体を用いることができる。本発明において用いられるコルジセプス シネンシスの抽出物は、当該技術分野において公知の方法により調製することができるが、例えば、菌糸体を含む固体培地を水および酵素の存在下に粉砕、分解して得られる抽出物を用いることができる。抽出物の調製に用いられる溶媒としては、例えば、水、エタノール、メタノール、ブタノール、イソプロパノールなど、好ましくは水を使用することができる。抽出は溶媒の加熱下（例えば、８５〜１０５℃程度）で行うこともできるが、より低温（例えば、２５〜５０℃、好ましくは３０〜４５℃）で超音波を照射することにより行うこともできる。

このようにして得られるコルジセプス シネンシス抽出物はフェノール−硫酸法による糖質分析により糖質を１〜５０％、好ましくは５〜２０％（ｗ／ｗ）、Ｌｏｗｒｙ法によるタンパク質分析によりタンパク質を１〜５０％、好ましくは５〜２０％（ｗ／ｗ）含むが、これに限定されない。

本発明におけるコルジセプス シネンシス抽出物は、抽出物から得られる分画物であってもよい。分画方法は本発明の属する技術分野において通常用いられる方法であってよく、分画方法の例には、任意の溶媒を用いての抽出による分画、ゲルろ過カラムクロマトグラフィー、イオン交換カラムを用いた分画、およびシリカゲルカラムクロマトグラフィーなどが含まれる。分画方法は１種類の方法であってもよく、または複数の手段の組み合わせであってもよい。上記の分画方法で用いる溶媒としては、特に限定はされないが、例えば、水、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、酢酸、アセトン、およびそれらの混合物を用いることができる。

本発明の１つの態様において、本発明におけるコルジセプス シネンシス抽出物として、以下の工程：
１）コルジセプス シネンシス菌糸体から水抽出液を得る工程；および
２）当該水抽出液に、Ｃ_１−３アルカノールを加え、生じる析出物を得る工程
を含む製造方法により調製することができる分画物を使用することができる。ここで、Ｃ_１−３アルカノールには、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノールが含まれ、好ましいＣ_１−３アルカノールはエタノールである。加えるＣ_１−３アルカノールの量は、特には限定されないが、例えば当該抽出液に対して容積比で０．７〜５倍量、好ましくは０．７〜１．５、より好ましくは０．８〜１．２である。

工程１）の水抽出は、本発明の属する技術分野において通常行われる方法により行うことができる。使用する水の量は特に限定されないが、例えばコルジセプス シネンシス菌糸体１００ｇに対して、１〜５Ｌの水を使用することができる。抽出温度は、特に限定されないが、例えば２５〜１０５℃、好ましくは５０〜１０５℃、さらに好ましくは９０〜９５℃で行うことができる。

本発明の１つの態様において、上記の工程１）および２）により得られる抽出物をさらに分画に付すこともできる。分画方法は、当業者に周知の方法であれば特に限定されないが、例えば陰イオン交換体を使用して分画することもできる。本発明において使用することができる陰イオン交換体の具体例としては、第４級アンモニウム基、第３級アミノ基、第２級アミノ基、アミノ基、および第１・２級ポリアミノ基が導入されたポリマーなどが挙げられる。従って、本発明の１つの態様において、コルジセプス シネンシスの抽出物は酸性物質、好ましくは酸性の多糖類であってもよい。

本発明の別の態様において、成分として糖類を含み、特に分子量１万〜５万と１５万〜４０万の多糖類を含むコルジセプス シネンシスの抽出物が使用されうる。
抽出物中の糖類の含有量は、特に限定されないが、例えば５０重量％以上、好ましくは８０重量％以上、特に好ましくは９０重量％以上であってもよい。また、分子量１万〜５万と１５万〜４０万の多糖類の合計の含有量は、特に限定はされないが、例えば全体の３０重量％以上、好ましくは５０重量％以上、特に好ましくは７０重量％以上であってもよい。また、上記の分子量１万〜５万の多糖類（ａ）と１５万〜４０万の多糖類（ｂ）の比（ａ：ｂ）は、特に限定はされないが、例えば２：１〜１：１０、好ましくは２：１〜１：５、さらに好ましくは１：１〜１：３でありうる。この比は、示差屈折率検出法を用いたゲルろ過クロマトグラフィーにおけるピーク比により決定される。

ここで、抽出物における糖類の成分比はフェノール硫酸法（例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｒ．Ｌ．ＷｈｉｓｔｌｅｒおよびＭ．Ｌ．Ｗｏｌｆｒｏｍ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、 Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、第１巻、第３８８頁、１９６２年を参照。）により、また１万〜５万と１５万〜４０万の多糖類の成分比は示差屈折率検出法を用いたゲル濾過クロマトグラフィーのピーク面積より決定することができる。

本発明で用いられる抽出物および分画物は、必要に応じて濃縮および／または凍結乾燥などを行うことにより得られる濃縮液、粘稠物質または固体を可溶性画分として使用することができる。

本明細書で用いられる用語「樹状細胞活性化剤」とは、一般的には、樹状細胞に作用することにより、樹状細胞が有する機能を強化する作用、または樹状細胞上または細胞内に発現する物質の量を増幅する作用を有する薬剤を意味し、樹状細胞活性化剤により、例えば、樹状細胞の成熟化促進作用、サイトカイン（例えば、インターロイキン−１２、インターフェロンγまたはインターロイキン−１など）の産生能が高められるなどの効果を得ることができる。

本発明の樹状細胞活性化剤は、医薬組成物の有効成分として使用することができる。当該医薬組成物は、種々の剤形、例えば、経口投与のためには、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、丸剤、液剤、乳剤、懸濁液、溶液剤、酒精剤、シロップ剤、エキス剤、エリキシル剤とすることができ、非経口剤としては、例えば、皮下注射剤、静脈内注射剤、筋肉内注射剤、腹腔内注射剤などの注射剤とすることができるが、これらには限定されない。これらの製剤は、製剤工程において通常用いられる公知の方法により製造することができる。

当該医薬組成物は、一般に用いられる各種成分を含みうるものであり、例えば、１種もしくはそれ以上の薬学的に許容され得る賦形剤、崩壊剤、希釈剤、滑沢剤、着香剤、着色剤、甘味剤、矯味剤、懸濁化剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、補助剤、防腐剤、緩衝剤、結合剤、安定剤、コーティング剤等を含みうる。また本発明の医薬組成物は、持続性または徐放性剤形であってもよい。

本発明の医薬組成物の投与量は、投与経路、患者の体型、年齢、体調、疾患の度合い、発症後の経過時間等により、適宜選択することができ、本発明の医薬組成物は、治療有効量および／または予防有効量の樹状細胞活性化剤を含むことができる。コルジセプス シネンシス菌糸体抽出物は元来食品や漢方薬として使用されてきたものであり過剰症に対する懸念の少ない比較的安全な物質であるので、必要に応じて高濃度で投与することも可能である。本発明において冬虫夏草抽出物は、一般に１００〜５０００ｍｇ／日／成人、好ましくは３００〜３０００ｍｇ／日／成人の用量で使用されうる。当該医薬組成物の投与は、単回投与または複数回投与であってもよく、例えば他の樹状細胞活性化剤、免疫賦活剤、抗癌剤、抗腫瘍剤、好感染症剤などの他の薬剤と組み合わせて使用することもできる。

本発明のさらに別の側面によれば、上記の樹状細胞活性化剤により、未成熟樹状細胞を処理することにより成熟樹状細胞を誘導する方法が提供される。ここで、未成熟樹状細胞は、特に限定はされないが、例えば単球細胞をサイトカイン（例えば、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（以下、「ＧＭ−ＣＦＳ」とも称す）およびインターロイキン−４（以下、「ＩＬ−４」とも称す））を含む培地で培養することにより調製することができる。ここで、単球細胞は特に限定はされないが、例えば血中単球細胞を使用することができ、好ましくはヒト血中単球細胞である。

未成熟樹状細胞の成熟樹状細胞への変化は、当該技術分野において当業者に知られた方法により確認することができるが、例えば、樹状細胞に共通の共刺激因子（例えば、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６）の発現量の増加や、成熟樹状細胞に特異的なタンパク質（例えば、ＣＤ８３など）の発現量の増加を観測することにより判断されうる。これらのタンパク質の発現量は、例えばフローメトリー法などにより観測することができる。

生体外で樹状細胞を活性化させる際に使用する本発明の樹状細胞活性化剤は、例えば、１日に１０〜１０００μｇ／ｍＬ、好ましくは１００〜５００μｇ／ｍＬの量で培養液中に添加することができる。また、例えば１〜５日、好ましくは２〜３日の期間培養することにより樹状細胞の活性化を誘導することができる。

本発明の方法は、得られる成熟樹状細胞に特定の抗原を提示させるために、樹状細胞と抗原性物質を混合する工程をさらに含んでいてもよい。ここで、抗原性物質は特には限定されないが、腫瘍由来ペプチドまたはウイルス由来ペプチドなどを使用することができ、例えば、ＣＥＡ由来ペプチド、ＭＡＧＥ由来ペプチドなどを使用することができる。樹状細胞と抗原性物質との混合は、樹状細胞の活性化の前後、または樹状細胞の活性化と同時であってもよいが、好ましくは樹状細胞の活性化と同時に行われる。

本発明のさらに別の側面によれば、樹状細胞活性化剤により未成熟樹状細胞を処理することにより得られる成熟樹状細胞、および当該成熟樹状細胞を含む医薬組成物が提供される。ここで、当該医薬組成物は、特に限定はされないが、癌、悪性腫瘍または感染症を予防または治療するために使用することができ、例えば、大腸癌および胃癌などの消化器癌、骨髄腫、肝臓癌、白血病、メラノーマ、前立腺癌、乳癌、子宮癌、肺癌、口腔癌、脳腫瘍などの癌もしくは悪性腫瘍；またはＢ型またはＣ型肝炎ウイルスによる慢性肝炎、ＨＩＶ、インフルエンザなどの感染症に適用することができる。本発明の補助活性化剤は、一般に用いられる各種成分を含みうるものであり、またその投与量は、投与経路、患者の体型、年齢、体調、疾患の度合い、発症後の経過時間等により、適宜選択することができる。例えば、本発明の補助活性化剤は上述の本発明の医薬組成物と同様の実施態様により実施することができる。

本発明のさらなる側面によれば、上記の樹状細胞活性化剤を含む、免疫療法において使用する補助活性化剤が提供される。ここで、補助活性化剤とは、免疫療法の際に樹状細胞の活性化を誘導するために樹状細胞とともに生体内に投与する物質であり、医薬組成物の１成分として含まれていてもよい。ここで、免疫療法が対象とする疾患は特に限定はされないが、例えば、大腸癌および胃癌などの消化器癌、骨髄腫、肝臓癌、白血病、メラノーマ、前立腺癌、乳癌、子宮癌、肺癌、口腔癌、脳腫瘍などの癌もしくは悪性腫瘍；またはＢ型またはＣ型肝炎ウイルスによる慢性肝炎、ＨＩＶ、インフルエンザなどの感染症に適用することができる。

本発明のさらに別の側面によれば、上記の樹状細胞活性化剤を含む食品組成物が提供される。本発明の食品組成物は、機能性飲料などの液体飲料を含む。当該食品組成物は、機能性食品として使用できるほか、医薬部外品、飲食物などの成分、食品添加物などとして使用することができる。また本明細書における食品組成物は、そのまま機能性食品として使用できるほか、飲食物、医薬品、医薬部外品、飲食物等の成分、食品添加物などとして使用することができる。当該使用により、樹状細胞活性化効果および免疫賦活化効果を有する飲食物、食品組成物または経口摂取用組成物の日常的および継続的な摂取が可能となり、効果的な樹状細胞活性化効果および免疫賦活化効果による体質改善、癌、悪性腫瘍および感染症などの疾患の治療および発症の予防が可能となる。本発明の樹状細胞活性化剤または免疫賦活化剤を含む食品組成物、食品または飲料の例としては、樹状細胞活性化効果もしくは免疫賦活化効果を有する機能性食品、健康食品、一般食品（ジュース、菓子、加工食品等）、栄養補助食品（栄養ドリンク等）などが含まれる。本明細書における食品または飲料は、限定はされないが、鉄およびカルシウムなどの無機成分、種々のビタミン類、オリゴ糖およびキトサンなどの食物繊維、大豆抽出物などのタンパク質、レシチンなどの脂質、ショ糖および乳糖などの糖類、椎茸などの植物抽出物などを含むことができる。

以下の実施例で示すように、本発明の樹状細胞活性化剤は、未成熟樹状細胞の成熟化を促進する作用および当該作用に起因する免疫賦活化作用を有する。したがって本発明により、免疫賦活化による癌、悪性腫瘍および感染症などを治療および／または予防するための有効な手段が提供される。

さらに本発明により、未成熟樹状細胞を処理することにより成熟樹状細胞を誘導する方法が提供される。本発明の方法により活性化された樹状細胞は、高いＩＬ−１２生産能を有するので、ＩＬ−１２産生を介してのＴｈ１細胞の活性化を強く促進し、疾患に対して高い治療効果または予防効果を発揮すると考えられる。

以下、本発明の好適な実施例についてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

［実施例１］冬虫夏草抽出物の調製
コルジセプス シネンシス抽出物（以下、「冬虫夏草抽出物」とも称す）は以下の手順により調製した。コルジセプス シネンシス菌糸をトウモロコシ粉末の抽出液、蚕蛹粉末の抽出液、大豆粉末の抽出液にブドウ糖液を加えた培地で、１５〜１８℃で液体培養した。培養後、菌糸体を高速遠心分離で分離し、層流乾燥機で乾燥させてコルジセプス シネンシス菌糸体粉末とした。このコルジセプス シネンシス菌糸体粉末１００ｇに対して、２Ｌ容量の蒸留水を加え、９０〜９５℃で４時間抽出し、その後濾過して冬虫夏草水抽出液を得た。その後抽出液を減圧濃縮し、冬虫夏草抽出物粉末とした。回収率は菌糸体粉末から換算して約３０％であった。

［実施例２］冬虫夏草抽出物のヒト樹状細胞活性化効果の測定
（２−１）ヒト末梢血からの未熟樹状細胞の誘導
健常人末梢血をヘパリン採血し、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ Ｈｕｍｏｎ ｍｏｎｏｃｙｔｅ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ｃｏｃｋｔａｉｌ キット（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ社）を用い、キット付属のプロトコル通りに単球を調整し、ＲＰＭＩ１６４０培地（ｓｉｇｍａ、１０％ＦＢＳ含有）に５ｘ１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるように細胞懸濁液を調製した。調製した細胞懸濁液を２４穴プレートに５００μＬずつ分注し、さらにＧＭ−ＣＳＦ（ペプロテック）、ＩＬ−４（ペプロテック）各４０ｎｇ／ｍｌになるように添加した。これを３７℃、５％ＣＯ_２条件で３日間培養した。３日後に培養上清３００μＬを、細胞を吸わないように注意深く吸い取り、新しいＲＰＭＩ１６４０培地（ｓｉｇｍａ、１０％ＦＢＳ含有）３００μＬを加えた。さらにＧＭ−ＣＳＦ（ペプロテック）、ＩＬ−４（ペプロテック）各４０ｎｇ／ｍｌになるように添加し、さらに３日間培養（合計６日間）し、未熟樹状細胞を誘導した。未熟樹状細胞の誘導は、細胞表面の単球マーカーであるＣＤ１４タンパクが発現低下、共刺激因子であるＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６タンパクが発現していることを、それぞれのタンパク特異的な抗体である、抗ＣＤ１４抗体ＦＩＴＣ標識、抗ＣＤ４０抗体ＦＩＴＣ標識、抗ＣＤ８０抗体ＰＥ標識、抗ＣＤ８６抗体ＰＣ５標識（ペプロテック）を用いて、フローサイトメーター（ベックマンコールター Ｅｐｉｃｓ ＸＬ）で測定し確認した。

（２−２）成熟樹状細胞の誘導
上記のように調製した未熟樹状細胞に、冬虫夏草抽出物及びＰＳＫを最終濃度が２００μｇ／ｍｌになるように添加し、３７℃、５％ＣＯ_２条件で２日間培養した。また、コントロールとして何も添加せずに３７℃、５％ＣＯ_２条件で２日間培養した。２日後、各条件で培養した細胞の細胞表面の共刺激因子ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６タンパク及び成熟樹状細胞特異的マーカーであるＣＤ８３タンパクの発現量を抗ＣＤ４０抗体ＦＩＴＣ標識、抗ＣＤ８０抗体ＰＥ標識、抗ＣＤ８６抗体ＰＣ５標識（ペプロテック）及び抗ＣＤ８３抗体ＦＩＴＣ標識（ペプロテック）を用いて、フローサイトメーター（ベックマンコールター Ｅｐｉｃｓ ＸＬ）で測定した。結果を図１に示す。

測定の結果、冬虫夏草抽出物およびＰＳＫのいずれを添加した場合も、コントロールと比較してすべてのマーカーについて発現量の増加が認められ、冬虫夏草抽出物およびＰＳＫの添加により樹状細胞が活性化され、成熟化が促進されたことが確認された。また、すべてのマーカーについて冬虫夏草抽出物を添加した系の発現量はＰＳＫの系の発現量を上回り、特に、成熟樹状細胞特異的マーカーであるＣＤ８３の冬虫夏草抽出物を添加した系における発現量は、ＰＳＫを添加した系と比して約３倍であることが確認された。このことから、本発明の樹状細胞活性化剤は、従来知られていた樹状細胞活性化剤と比べて、高い活性化効果を有することが示唆された。

［実施例３］冬虫夏草抽出物により活性化されたヒト樹状細胞のＩＬ−１２産生能の測定
実施例２と同じ方法で、ヒト末梢血から未熟樹状細胞を誘導した。調製した未熟樹状細胞に、冬虫夏草抽出物及びＰＳＫを最終濃度が２００μｇ／ｍｌになるように添加し、３７℃、５％ＣＯ_２条件で２４時間培養した。また、コントロールとして何も添加せずに３７℃、５％ＣＯ_２条件で２４時間培養した。２４時間後、各培養上清を回収し、培養上清中のＩＬ−１２量をＥＬＩＳＡキット（バイオソース）で、キットのプロトコルに従って測定した。結果を図２に示す。

ＰＳＫを添加した系においては、コントロールに比べてほとんどＩＬ−１２産生の増加は認められなかった。一方、冬虫夏草抽出物の系ではＩＬ−１２産生量の大幅の増加が確認された。このことから、冬虫夏草抽出物により活性化された樹状細胞は、高いＩＬ−１２生産能を有することが確認された。

［実施例４］冬虫夏草分画物ＥＰＡの調製
実施例１で得た冬虫夏草抽出物粉末１０ｇを水１Ｌに溶解させ、さらに当倍量のエタノールを加え、ろ過・遠心分離によって沈殿物を回収した。これを水に溶解させ、適度に濃縮後凍結乾燥を行った。冬虫夏草抽出物粉末からの収率は代表例として１７．９％であった。得られた凍結乾燥粉末６１０ｍｇを蒸留水３００ｍＬに溶解させ、陰イオン交換体（東ソー株式会社 ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＤＥＡＥ−６５０Ｍ）１００ｍｇを含む水スラリー２００ｍＬに加えた。室温にて１時間攪拌後、グラスファイバーで液をろ過し、約１．５Ｌの蒸留水で洗浄した。薄い褐色となったゲルを２Ｍ ＮａＣｌ水溶液２５０ｍＬに加えた。室温にて１時間攪拌後、グラスファイバーで液をろ過し、２Ｍ ＮａＣｌ水溶液約７５０ｍＬで洗浄した。ろ液を濃縮後透析膜（Ｍｗ＝１０００）にて透析し、ＮａＣｌを除去した。これを濃縮後、凍結乾燥し冬虫夏草分画物ＥＰＡを褐色粉末として得た。

冬虫夏草抽出物からの収率は代表例として約１０％であった。得られた冬虫夏草分画物（ＥＰＡ）はフェノール・硫酸法による糖分定量により、９０％以上が糖類であった。また、示差屈折率検出法を用いたゲルろ過クロマトグラフィーによる分子量推定法から、分子量１５〜４０万と１万〜５万の二つのピークを持つ多糖体と推定された。ピーク比は代表例として１：２．２であった。チャートを図４に示す。

［実施例５］冬虫夏草分画物ＥＰＡのマウス樹状細胞活性化効果の測定
マウスの骨髄細胞をＲＰＭＩ１６４０培地（ｓｉｇｍａ、１０％ＦＢＳ含有）に１ｘ１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるように細胞懸濁液を調製した。調製した細胞懸濁液を２４穴プレートに５００μＬずつ分注し、さらにＧＭ−ＣＳＦ（ペプロテック）を５０ｎｇ／ｍｌ、ＩＬ−４（ペプロテック）を４０ｎｇ／ｍｌになるように添加した。これを３７℃、５％ＣＯ_２条件で３日間培養した。３日後に培養上清３００μＬを、細胞を吸わないように注意深く吸い取り、新しいＲＰＭＩ１６４０培地（ｓｉｇｍａ、１０％ＦＢＳ含有）３００μＬを加えた。ＧＭ−ＣＳＦ（ペプロテック）を５０ｎｇ／ｍｌ、ＩＬ−４（ペプロテック）を４０ｎｇ／ｍｌになるように添加し、さらに３日間培養（合計６日間）し、未熟樹状細胞を誘導した。調製した未熟樹状細胞に、ＰＳＫ、冬虫夏草抽出物及び冬虫夏草分画物ＥＰＡ、さらにＥＰＡ中分子量が１５〜４０万のＥＰＡ−Ａ１と分子量１万〜５万のＥＰＡ−Ａ２を最終濃度が各１００μｇ／ｍｌになるように添加し、３７℃、５％ＣＯ_２条件で２日間培養した。コントロールは何も添加しない系を用いた。２日後、各条件で培養した細胞の細胞表面の樹状細胞活性化マーカーであるＣＤ８６タンパクの発現量を測定した。発現量は抗ＣＤ８６抗体ＦＩＴＣ標識（ベックマンコールター）を用いて細胞表面上のＣＤ８６タンパクをＦＩＴＣ蛍光標識し、フローサイトメーター（ベックマンコールター Ｅｐｉｃｓ ＸＬ）でレーザー強度５００ｖｏｌｔ、蛍光検出力１．０ｇａｉｎと設定して、ＦＩＴＣ蛍光を検出することで測定した。また、各薬剤の効果は各薬剤を添加したときの発現量から、何も添加しなかったコントロールの発現量を差し引いた、発現増加量で評価した。結果を図３に示す。

測定の結果、いずれを添加した場合も、樹状細胞活性化マーカーであるＣＤ８６タンパクの発現量が増加した。また、冬虫夏草抽出物を添加した系における発現増加量は従来より知られている樹状細胞活性化剤ＰＳＫ添加の系の３倍以上、さらに冬虫夏草抽出物分画物ＥＰＡは５７倍以上、ＥＰＡ−Ａ１は６２倍以上、ＥＰＡ−Ａ２は５８倍以上の発現量の増加が認められた。このことから、本発明の樹状細胞活性化剤は、従来知られていた樹状細胞活性化剤と比べて、高い活性化効果を有することが示唆された。

冬虫夏草菌糸体抽出物とＰＳＫの樹状細胞活性化能を比較する試験結果の一例である。 冬虫夏草菌糸体抽出物およびＰＳＫにより活性化された樹状細胞のインターロイキン−１２の産生能を比較する試験結果の一例である。 冬虫夏草抽出物、冬虫夏草抽出物分画物とＰＳＫの樹状細胞活性化能を比較する試験結果の一例である。 冬虫夏草分画物ＥＰＡの示差屈折率検出法によるゲル濾過クロマトグラフィーの一例である。

Claims (8)

1. コルジセプス シネンシス（Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ（Ｂｅｒｋｅｌｙ）Ｓａｃｃａｒｄｏ）の熱水抽出物を含み、当該抽出物の成分の５０重量％以上が糖類であり、分子量１万〜５万と１５万〜４０万の多糖類をあわせると全体の３０重量％以上となる、樹状細胞活性化剤。
2. 樹状細胞の活性化により樹状細胞の成熟化が促進される、請求項１に記載の樹状細胞活性化剤。
3. 樹状細胞の活性化により樹状細胞のインターロイキン−１２、インターフェロンγまたはインターロイキン−１の産生能が増強される、請求項１または２に記載の樹状細胞活性化剤。
4. 免疫賦活化に用いられる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の樹状細胞活性化剤を含む医薬組成物。
5. 癌または悪性腫瘍を治療または予防するための、請求項１〜３のいずれか１項に記載の樹状細胞活性化剤を含む医薬組成物。
6. 感染症を治療または予防するための、請求項１〜３のいずれか１項に記載の樹状細胞活性化剤を含む医薬組成物。
7. 請求項１〜３のいずれか１項に記載の樹状細胞活性化剤を用いて未成熟樹状細胞を処理することにより得られる成熟樹状細胞を含む、癌、悪性腫瘍または感染症を予防または治療するための医薬組成物。
8. 請求項１〜３に記載の樹状細胞活性化剤を含む、免疫療法において使用するための補助活性化剤。

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