JP5927588B1 - 新規過排卵誘起処理によるマウス卵子の大量作製法 - Google Patents
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Abstract
【課題】過排卵誘起効率がよい新規な方法を提供すること。具体的には、従来のウマ絨毛性ゴナドトロピン（ｅＣＧ）とヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）を用いた方法に比べて過排卵誘起効率が優れた方法を提供することを目的とする。【解決手段】３〜４０週齢の雌マウスに抗インヒビン抗体及びウマ絨毛性ゴナドトロピン（ｅＣＧ）を同時に投与し、次いでヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）を投与することを特徴とする過排卵誘起方法が提供された。【選択図】図４
Description
本発明は、雌マウスの過排卵を誘起する方法に関する。
実験動物は、健康な又は病理学的な状態を深く理解するための研究において、そして、ヒト疾患への応用を目的とした候補治療法の有効性を評価するために不可欠である。マウスは、ライフサイエンスの研究において最も一般的に用いられる実験動物である。近年、生命現象や疾患モデルとして遺伝子の機能解明のために、多くの遺伝子改変マウスの系統が作製されている。
膨大な数の遺伝子改変マウスは、マウスリソースバンクに保存され、それらは国際マウス系統リソース（International Mouse Strain Resource （ＩＭＳＲ））のウエブサイトを用いて入手可能である。マウスリソースバンクでは、様々な生殖工学技術が用いられており、遺伝子改変マウスを効率的に保存、輸送又は作製している。これまでに、遺伝子改変マウスの精子、卵子及び胚の凍結保存により、効率的なマウスリソースバンクシステムが構築されている。マウスリソースバンクに凍結保存された精子、卵子および胚は、遺伝子改変マウスを必要とする研究者へ、宅配便を用いて容易に輸送できる。
加えて、本発明者らは、非凍結マウス胚又は精子を４℃にて簡便に輸送する新たは技術を開発した。その技術により、凍結保存したサンプルを扱う特別な技術と断熱容器（dryshipper）が不要となった。さらに本発明者らは、メチル−β−シクロデキストリン（ＭＢＣＤ）と還元型グルタチオン（ＧＳＨ）を用いた体外受精システムを開発した（非特許文献１、非特許文献２、特許文献１、特許文献２）。その技術は医薬及び薬学分野を支援している。このような体外受精法は、凍結保存又は冷蔵保存したマウス精子を用いて、安定して高い受精率を達成できる。生殖工学技術の改善は、遺伝子改変マウスを用いた研究を効率的に行う上で非常に重要なものである。
過排卵の現象は、ホルモン投与による卵胞の成熟と排卵の誘起である。過排卵は、一般に、様々な生殖工学技術を用いて遺伝子改変マウスを作製するために使用され、体外受精（in vitro fertilization：ＩＶＦ）に先立ち卵子ドナーから卵子を得るために日常的に用いられている。マウスの過排卵において、ウマ絨毛性ゴナドトロピン（ｅＣＧ）の投与は卵胞の成長を促進し、そして、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）の投与は排卵を誘起する。一般には、雌マウスの腹腔内に、卵胞の成長を刺激するウマ絨毛性ゴナドトロピン（ｅＣＧ）を投与し、次いで、排卵を誘起するヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）を注射する（例えば、特許文献３）。ウマ絨毛性ゴナドトロピン（ｅＣＧ）は、性腺刺激ホルモンの一つで、ＰＭＳＧとも呼ばれ、同じく性腺刺激ホルモンの一つである卵巣刺激ホルモン（ＦＳＨ）様の作用を示す。遺伝子改変マウスのバックグランドとして通常用いられるＣ５７ＢＬ／６系統の排卵される卵子の数は、雌マウスあたり、通常では約９個であるが、ｅＣＧ及びｈＣＧを用いた過排卵処理によって約２５個となる（非特許文献３、非特許文献４）。
他の過排卵処理として、インヒビン抗血清（ＩＡＳ）の投与により、例えば、ハムスター、ラット、天竺ネズミ、牛、馬などの種々の動物において、排卵される卵子の数を増加させることが報告されている（非特許文献５、非特許文献６、非特許文献７、非特許文献８、非特許文献９、特許文献４）。インヒビンは、卵胞において顆粒膜細胞によって分泌されるホルモンとして知られている。分泌されたインヒビンは、全身循環中に下垂体前葉へ作用し、前葉からの卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の分泌を阻害する。雌へのインヒビン抗血清の投与は、インヒビンの機能を中和し、インヒビンによるＦＳＨへの負のフィードバックを回避し、ラットにおける卵胞の成長及び排卵される卵子の数を促進する。
インヒビン抗血清がｄｄＹ系統の雌マウスで排卵された卵子の数を増加させたことが報告されている（非特許文献１０、非特許文献１１）。インヒビン抗血清の効果はまた、野生系統の雌マウスにおいても報告されている（非特許文献１２）。ＩＡＳによる内因性インヒビンの免疫中和は、ネガティブフィードバックを抑制し内因性のＦＳＨを上昇させることにより、マウスで過排卵を誘導するための効果的な戦略である。
Ｗａｎｇらはまず、ｅＣＧの代わりに２００μＬのＩＡＳの投与が、ｄｄＹ系統の未成熟マウス及び成体マウスにおいて排卵される卵子の数を増加させたことを報告している。Ｍｅｄａｎらは、ｄｄＹ系統のＩＡＳ処理した雌マウスでは、プラズマ中のＦＳＨの濃度が著しく増加していることを示した。ＦＳＨの上昇は、卵胞の成長を促進し、排卵される卵子の数を増加させることに貢献している。
長谷川らは、同様に、ｅＣＧに対する応答性が低いMus musculus molossinus に属する日本の野生由来系統（ＭＳＭ／Ｍｓ及びＪＦ１／Ｍｓ）において、５０μＬのＩＡＳが卵子の数を増加させることを報告している。大部分の系統マウスでは、ＦＳＨ作用を持つｅＣＧにより多くの卵胞の成熟を促し、次いでｈＣＧにより排卵を誘起することにより、１匹の雌マウスから２０〜４０個程度の卵子を得ることができるが、多くの野生由来マウスではこの系が上手く反応しないことが知られている。そこで長谷川らは、その原因の一つとして別種由来のホルモンに反応しないことが考えられるとして、抗インヒビン抗体を投与することにより、ネガティブフィードバックを抑制し内因性のＦＳＨを上昇させることにより、野生由来マウスであるＭＳＭ／ＭｓとＪＦ１／Ｍｓにおいて、５個程度の排卵数を平均２５個まで上昇させることに成功した。
このように、抗インヒビン抗体を用いた方法は、ＦＳＨ様作用をもつｅＣＧを外から過剰に投与（外因性）して卵胞の成長を促進する代わりに、内因性のＦＳＨを上昇させ、排卵される卵子数を増大させようとするものである。これは上記のように、特にｅＣＧでは効果が顕著でない野生由来マウスに対して有効であろう。
このように、抗インヒビン抗体を用いた方法は、ＦＳＨ様作用をもつｅＣＧを外から過剰に投与（外因性）して卵胞の成長を促進する代わりに、内因性のＦＳＨを上昇させ、排卵される卵子数を増大させようとするものである。これは上記のように、特にｅＣＧでは効果が顕著でない野生由来マウスに対して有効であろう。
長谷川らによると、ＩＡＳ投与に最も適した雌マウスの週齢は、ＭＳＭ／Ｍｓ及びＪＦ１／Ｍｓで５〜７週齢である。最近、持田らは、Mus musculus の５つの亜種からの種々の野生由来系統での排卵される卵子の数に対する、ｅＣＧ又はＩＡＳの効果を比較した（非特許文献１３）。ｅＣＧ又はＩＡＳに対する応答性は、それらの遺伝的バックグランドに依存して強かった。持田らによると、Mus musculus molossinus に属する雌マウスは、ｅＣＧに比べてＩＡＳに対する高い応答性を示す傾向があった。一方、Mus musculus domesticus は、ｅＣＧに比べてＩＡＳに対する低い応答性を示す傾向があった。
このようにいくつかのマウス系統についてＩＡＳの効果が報告されているが、近交系として最も広く用いられているＣ５７ＢＬ／６系統マウスに対するインヒビン抗血清の効果は報告がない。これは、外因性の別種由来の性腺刺激ホルモンであるｅＣＧの投与に対してＣ５７ＢＬ／６系統のマウスが高い応答性を示している、という事情によるのかもしれない。また、Ｃ５７ＢＬ／６はMus musculus domesticus に属するとして知られているが、持田らによれば、上記のように、Mus musculus domesticus は、ｅＣＧに比べてインヒビン抗血清（ＩＡＳ）に対する応答性が低いと考えられているからである。
過排卵処理によって排卵される卵子の増加は、卵子ドナーの数を明確に減少させ、そして動物の作製効率を増加させる。動物実験においては、３Ｒｓ（削減、改善及び代替）の原則に基づいて動物数を最少化することが重要である。それ故、排卵される卵子数を増加させるさらに効率的な新規な過排卵技術の開発は非常に望まれている。
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上記のように、過排卵処理技術としては、ウマ絨毛性ゴナドトロピン（ｅＣＧ）を投与し次いでヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）を投与する方法や、ｅＣＧの代わりにインヒビン抗血清（ＩＡＳ）を用いる方法が知られているが、さらに過排卵誘起効率がよい方法が望まれている。加えて、近交系として最も広く用いられているＣ５７ＢＬ／６系統マウスについては、ｅＣＧとｈＣＧを用いた方法が報告されているが、更なる改良法の報告はなく、また、Ｃ５７ＢＬ／６系統が属するMus musculus domesticus のマウスを用いた実験では、ｅＣＧの代わりにＩＡＳを用いた場合には過排卵に対する応答性が低いことが報告されている。
そのため遺伝子改変マウスの技術分野で最も広く用いられているＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて、過排卵を効率良く誘起できる更なる方法が望まれていた。
そのため遺伝子改変マウスの技術分野で最も広く用いられているＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて、過排卵を効率良く誘起できる更なる方法が望まれていた。
前記課題を解決するために本発明者らは鋭意研究をした結果、過排卵処理において、Ｃ５７ＢＬ／６系統の未成熟雌マウスの排卵される卵子数に対するＩＡＳとｅＣＧの組み合わせ（ＩＡＳｅ）による効果を見出し、本発明を完成させた。Ｃ５７ＢＬ／６系統マウスにおいては、ＦＳＨ様作用を持つ外因性のｅＣＧの投与に対して高い応答性を示し、加えて、内因性のＦＳＨを上昇させるインヒビン抗血清の投与に対してはｅＣＧに比べて低い応答性しか示さないと報告されている。ところが驚くことに、ＩＡＳとｅＣＧの組み合わせ（ＩＡＳｅ）は、顕著な過排卵を誘起した。
また、本発明者らは、Ｃ５７ＢＬ／６マウス又は遺伝子改変マウスの精子との体外受精（ＩＶＦ）によって、ＩＡＳｅを用いた過排卵によって作製された卵子の質を確認したところ良好であることも見出した。さらに、得られた胚（新鮮な又はその後凍結保存したもの）の発生能力を胚移植により確認した。その結果、発生能に関しても良好であった。
また、本発明者らは、Ｃ５７ＢＬ／６マウス又は遺伝子改変マウスの精子との体外受精（ＩＶＦ）によって、ＩＡＳｅを用いた過排卵によって作製された卵子の質を確認したところ良好であることも見出した。さらに、得られた胚（新鮮な又はその後凍結保存したもの）の発生能力を胚移植により確認した。その結果、発生能に関しても良好であった。
本発明は以下のものを含む。
（１）３〜４０週齢の雌マウスに抗インヒビン抗体及びウマ絨毛性ゴナドトロピン（ｅＣＧ）を同時に投与し、次いでヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）を投与することを特徴とする過排卵誘起方法。
（２）前記抗インヒビン抗体が、インヒビン抗血清として投与される上記（１）に記載の過排卵誘起方法。
（３）前記雌マウスがＣ５７ＢＬ/６系統の雌マウスである上記（１）又は（２）に記載の過排卵誘起方法。
（４）前記雌マウスが３〜５週齢である上記（１）〜（３）のいずれか一つに記載の過排卵誘起方法。
（５）前記雌マウスが４週齢のＣ５７ＢＬ／６雌マウスである上記（４）に記載の過排卵誘起方法。
（６）前記（１）〜（５）のいずれか一つに記載の方法を用いて作製された卵子。
（７）前記（１）〜（５）のいずれか一つに記載の方法を用いて作製された卵子と、遺伝子改変マウスの精子とを用いる体外受精方法。
（８）前記精子がＣ５７ＢＬ/６系統の雄マウス由来の精子である前記（７）に記載の体外受精方法。
（９）前記（７）又は（８）の体外受精方法により得られた受精卵から作製された２細胞期胚。
（１）３〜４０週齢の雌マウスに抗インヒビン抗体及びウマ絨毛性ゴナドトロピン（ｅＣＧ）を同時に投与し、次いでヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）を投与することを特徴とする過排卵誘起方法。
（２）前記抗インヒビン抗体が、インヒビン抗血清として投与される上記（１）に記載の過排卵誘起方法。
（３）前記雌マウスがＣ５７ＢＬ/６系統の雌マウスである上記（１）又は（２）に記載の過排卵誘起方法。
（４）前記雌マウスが３〜５週齢である上記（１）〜（３）のいずれか一つに記載の過排卵誘起方法。
（５）前記雌マウスが４週齢のＣ５７ＢＬ／６雌マウスである上記（４）に記載の過排卵誘起方法。
（６）前記（１）〜（５）のいずれか一つに記載の方法を用いて作製された卵子。
（７）前記（１）〜（５）のいずれか一つに記載の方法を用いて作製された卵子と、遺伝子改変マウスの精子とを用いる体外受精方法。
（８）前記精子がＣ５７ＢＬ/６系統の雄マウス由来の精子である前記（７）に記載の体外受精方法。
（９）前記（７）又は（８）の体外受精方法により得られた受精卵から作製された２細胞期胚。
本発明のＩＡＳ及びｅＣＧの組合せ投与を用いた新規な過排卵技術は、ｅＣＧによる慣用の方法に比べ、排卵される卵子数を大きく増加させことができ、１匹の雌マウスから非常の多くの卵子を作製することができる。
以下、本発明を、例示的な実施態様を例として詳細に説明するが、本発明は以下に記載の実施態様に限定されるものではない。
なお、文中で特に断らない限り、本明細書で用いるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されるのと同じ意味をもつ。また、本明細書に記載されたものと同等又は同様の任意の材料および方法は、本発明の実施において同様に使用することができる。
また、本明細書に記載された発明に関連して本明細書中で引用されるすべての刊行物および特許は、例えば、本発明で使用できる方法や材料その他を示すものとして、本明細書の一部を構成するものである。
なお、文中で特に断らない限り、本明細書で用いるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されるのと同じ意味をもつ。また、本明細書に記載されたものと同等又は同様の任意の材料および方法は、本発明の実施において同様に使用することができる。
また、本明細書に記載された発明に関連して本明細書中で引用されるすべての刊行物および特許は、例えば、本発明で使用できる方法や材料その他を示すものとして、本明細書の一部を構成するものである。
本発明者らは、まず、Ｃ５７ＢＬ／６系統の雌マウスの過排卵において、ＩＡＳ（０．１又は０．２ｍＬ）とｅＣＧ（７．５ＩＵ）の応答性が同様であることを見出した。そして、本発明者らはさらに、ＩＡＳ及びｅＣＧに対する応答性は、それらを組み合わせて投与することにより顕著に増幅されることを見出した。ＩＡＳｅの投与は、ＩＡＳ又はｅＣＧの単独の投与に比べて、排卵される卵子数を約３倍に増加させた。Ｃ５７ＢＬ／６マウスの精子を用いた体外受精によって、ＩＡＳｅを用いた過排卵により得られた卵子は、２細胞期胚へと通常の発生を示した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスの卵子と遺伝子改変マウスの精子を用いた体外受精によって得られた新鮮な又は凍結保存した胚は、胚移植により、通常通り産子へと発生した。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、未成熟な３〜４０週齢の雌マウスに、抗インヒビン抗体及びウマ絨毛性ゴナドトロピン（ｅＣＧ）の投与し、次いで、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）の投与することにより、過排卵を誘起し、排卵される卵子数を増大させることを特徴とする。
本発明はまた、そのようにして得られた卵子を含む。
本発明はまた、上記の過排卵誘起方法を用いて得られた卵子を、新鮮な、冷蔵保存した、又は凍結保存したマウスの精子と受精させて２細胞期胚を作成する方法を含み、さらには、そのようにして作製した２細胞期胚を含む。
本発明はまた、前記のようにして作製した２細胞胚を移植し、産子を作製する方法を含み、さらには、そのようにして作製したマウスを含む。
本発明は、未成熟な３〜４０週齢の雌マウスに、抗インヒビン抗体及びウマ絨毛性ゴナドトロピン（ｅＣＧ）の投与し、次いで、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）の投与することにより、過排卵を誘起し、排卵される卵子数を増大させることを特徴とする。
本発明はまた、そのようにして得られた卵子を含む。
本発明はまた、上記の過排卵誘起方法を用いて得られた卵子を、新鮮な、冷蔵保存した、又は凍結保存したマウスの精子と受精させて２細胞期胚を作成する方法を含み、さらには、そのようにして作製した２細胞期胚を含む。
本発明はまた、前記のようにして作製した２細胞胚を移植し、産子を作製する方法を含み、さらには、そのようにして作製したマウスを含む。
本発明で用いる雌マウス系統は、特に限定されず、例えば、ＢＡＬＢ／ｃ，Ｃ３Ｈ／Ｈｅ，Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ，Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ，ＤＢＡ／２Ｎ，ＩＣＲ，ＦＶＢ/Ｎ, ＢＤＦ１，Ｂ６ＣＦ３Ｆ１，１２９Ｔ２／ＳｖＥｍｓＪ，ＮＯＤ，ＣＢＡ/Ｊ，ＭＳＭ/Ｍｓ，ＪＦ１/Ｍｓ等をあげることができるが、好ましくはＣ５７ＢＬ系統のマウス、より好ましくはＣ５７ＢＬ／６系統のマウスである。また、本発明で用いることができる雌マウスは、任意の変異（例えば、トランスジェニック、ノックアウト、ノックイン）を含んでいてもよい。特定の性質を持ったマウスを作製する場合は、目的に合った任意の変異を含むマウスを用いることができる。
本発明で用いる雌マウスの週齢は、３〜４０週齢であるが、好ましくは３〜１９週齢、より好ましくは約３週齢〜約５週齢、最も好ましくは約４週齢である。Ｃ５７ＢＬ／６系統のマウスを用いた場合は、約４週齢のマウスを用いることが特に好ましく、それにより、非常に多くの卵子を作製することができる。
本発明で用いる抗インヒビン抗体は、マウスの内因性インヒビンを中和する活性を有する抗体であればよい。例えば、精製した３２ｋＤａのブタあるいはマウスインヒビンを抗原として、去勢山羊を免疫して作製することにより、抗インヒビン抗体を含むインヒビン抗血清を得ることができる。抗インヒビン活性は、常法により測定することが可能である。例えば、イムノアッセイ法により免疫力価を測定することができる。本発明においては、抗インヒビン抗体は、インヒビン抗血清でも、或いは、精製（粗精製を含む）した抗体の状態であってもよい。
本発明の過排卵誘起方法において雌マウスに投与するウマ絨毛性ゴナドトロピン（ｅＣＧ）の量は、実験マウスにおける過排卵処理において通常用いられる量で使用される。例えば、通常では、２〜１５ＩＵであり、好ましくは３〜１０ＩＵ、さらに好ましくは３〜８ＩＵである。なお、約３〜約５週齢、より好ましくは約４週齢のＣ５７ＢＬ／６系統マウスの場合は、３〜８ＩＵのｅＣＧをＩＡＳと組合せて用いることにより、特に優れた過排卵誘起が達成できる。
本発明の過排卵誘起方法において雌マウスに投与するヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）の量は、実験マウスにおける過排卵処理において通常用いられる量で使用される。例えば、２〜１５ＩＵであり、好ましくは３〜１０ＩＵ、さらに好ましくは３〜８ＩＵである。
本発明の過排卵誘起方法において雌マウスに投与するヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）の量は、実験マウスにおける過排卵処理において通常用いられる量で使用される。例えば、２〜１５ＩＵであり、好ましくは３〜１０ＩＵ、さらに好ましくは３〜８ＩＵである。
本発明の過排卵誘起方法の特徴は、未成熟の雌マウスに、抗インヒビン抗体（例えば、インヒビン抗血清）とウマ絨毛性ゴナドトロピン（ｅＣＧ）を同時に投与し、次いで、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）を投与することである。
抗インヒビン抗体とｅＣＧは、同時期又は（ほぼ）同時に別々に投与しても、或いは混合物として一緒に投与してもよい。投与は、これに限定されないが、例えば腹腔内に注射することにより行える。その後、一定期間を経た後、例えば４８時間の間をあけて、ｈＣＧを投与する。ｈＣＧの投与は、これに限定されないが、例えば腹腔内に注射することにより行える。
本発明の過排卵誘起法を用いると、通常の排卵により得られる卵子数に比べて非常に多くの卵子を得ることができる。例えば、Ｃ５７ＢＬ／６系統のマウスに本発明の方法を用いた場合は、１匹の雌マウスから、通常であれば８０以上の、最適な場合には１００を超える卵子を得ることもできる。このようにして得られた卵子も本発明に含まれる。
抗インヒビン抗体とｅＣＧは、同時期又は（ほぼ）同時に別々に投与しても、或いは混合物として一緒に投与してもよい。投与は、これに限定されないが、例えば腹腔内に注射することにより行える。その後、一定期間を経た後、例えば４８時間の間をあけて、ｈＣＧを投与する。ｈＣＧの投与は、これに限定されないが、例えば腹腔内に注射することにより行える。
本発明の過排卵誘起法を用いると、通常の排卵により得られる卵子数に比べて非常に多くの卵子を得ることができる。例えば、Ｃ５７ＢＬ／６系統のマウスに本発明の方法を用いた場合は、１匹の雌マウスから、通常であれば８０以上の、最適な場合には１００を超える卵子を得ることもできる。このようにして得られた卵子も本発明に含まれる。
本発明により得られた卵子は、雄マウスの精子と受精させて利用することができる。精子は、成体雄マウスから常法により採取し、新鮮な状態で、或いは、冷蔵保存又は冷凍保存した後、本発明で作製した卵子と受精させることができる。受精は常法に従って行うことができる。例えば、本発明者らにより報告された方法（非特許文献１及び２）に従って行うことができる。本発明で作製した卵子から得られる受精卵は、２細胞期胚まで良好に発達できる。例えば、Ｃ５７ＢＬ／６系統の雌マウスに本発明の方法を用いた場合は、通常であれば受精卵の約８０％以上が、好ましい場合は、約９０％以上が２細胞期胚まで発生できる。そのようにして得られた２細胞胚は、凍結保存することも可能である。このようにして得られた新鮮な又は凍結保存した２細胞期胚も本発明に含まれる。
さらに、本発明の方法により作製された卵子を用いて得られた２細胞期胚を、胚移植によりレシピエントに移植して、産子を作製することも可能である。胚移植は常法により行うことができる。このようにして産生されたマウスも本発明に含まれる。
以下、実施例により、本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
１．材料と方法
（１−１）動物
Ｃ５７ＢＬ／６系統の雌及び雄マウスは、日本クレアから購入した。マウスは、通常の実験では、４週齢で卵子ドナーとして、１２週齢で精子ドナーとして用いた。卵子ドナーとしてのマウスの週齢を検討する実験においては、それぞれ記載した週齢の雌マウスを用いた。Ｃ５７ＢＬ／６バックグランドの遺伝子改変マウスの３系統について、１２週齢において精子ドナーとして同様に用いた。ＩＣＲマウスは、８−１６週齢にて、２細胞期胚のレシピエントとして用いた。すべての動物は、食事及び水は自由に与え、１２時間暗明サイクル（照明時間：７：００〜１９：００）で２２℃±１℃にて、飼育した。動物実験は、熊本大学医学部動物実験委員会の承認を得たプロトコルにて行った。
（１−１）動物
Ｃ５７ＢＬ／６系統の雌及び雄マウスは、日本クレアから購入した。マウスは、通常の実験では、４週齢で卵子ドナーとして、１２週齢で精子ドナーとして用いた。卵子ドナーとしてのマウスの週齢を検討する実験においては、それぞれ記載した週齢の雌マウスを用いた。Ｃ５７ＢＬ／６バックグランドの遺伝子改変マウスの３系統について、１２週齢において精子ドナーとして同様に用いた。ＩＣＲマウスは、８−１６週齢にて、２細胞期胚のレシピエントとして用いた。すべての動物は、食事及び水は自由に与え、１２時間暗明サイクル（照明時間：７：００〜１９：００）で２２℃±１℃にて、飼育した。動物実験は、熊本大学医学部動物実験委員会の承認を得たプロトコルにて行った。
（１−２）培地
精子は、１．０ｍｇ／ｍＬのポリビニルアルコール及び０．７５ｍＭのメチル−β−シクロデキストリン（シグマーアルドリッチ社）を含んだ、修正クレブス−リンガー重炭酸ナトリウム液（ＴＹＨ）で前培養を行った。カルシウムを増量したヒト卵管液（ｍＨＴＦ）を、受精培地として用いた。２細胞期胚の操作あるいは胚盤胞期胚までの培養には、カリウムシンプレックス最適培地（ＫＳＯＭ）を用いた。胚の凍結保存は、修正リン酸緩衝液（ＰＢ１）で希釈した１Ｍのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、及び２ＭのＤＭＳＯ、１Ｍのアセトアミド及び３Ｍのプロピレングリコールを含むＰＢ１（ＤＡＰ２１３）を用いて行った。ガラス化胚は、０．２５Mのスクロースを含むＰＢ１中で加温した。
精子は、１．０ｍｇ／ｍＬのポリビニルアルコール及び０．７５ｍＭのメチル−β−シクロデキストリン（シグマーアルドリッチ社）を含んだ、修正クレブス−リンガー重炭酸ナトリウム液（ＴＹＨ）で前培養を行った。カルシウムを増量したヒト卵管液（ｍＨＴＦ）を、受精培地として用いた。２細胞期胚の操作あるいは胚盤胞期胚までの培養には、カリウムシンプレックス最適培地（ＫＳＯＭ）を用いた。胚の凍結保存は、修正リン酸緩衝液（ＰＢ１）で希釈した１Ｍのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、及び２ＭのＤＭＳＯ、１Ｍのアセトアミド及び３Ｍのプロピレングリコールを含むＰＢ１（ＤＡＰ２１３）を用いて行った。ガラス化胚は、０．２５Mのスクロースを含むＰＢ１中で加温した。
（１−３）排卵と卵子の採取
雌マウスに、ＩＡＳ（０．１ｍＬ又は０．２ｍＬ又は０．４ｍＬ）単独、ｅＣＧ（３．７５又は７．５ＩＵ又は１５ＩＵ、あすか製薬株式会社）単独、或いはＩＡＳ及びｅＣＧの組合せを投与した。ＩＡＳは、マウスインヒビンペプチドを用いて岸らの論文（非特許文献５、本文献は引用することにより本明細書の一部である。）に記載された方法に準じて調製し、調製した抗血清をそのまま用いた。調製したＩＡＳは、ＥＬＩＳＡ法を用いてその抗体活性を測定して、必要に応じて標準化して使用した。具体的には、５μｇ／ｍＬの濃度のマウスインヒビンペプチドをＥＬＩＳＡ用プレートに吸着させた後に、洗浄及びブロッキングを行った。１，０００倍−１２８，０００倍に希釈したインヒビン抗血清を処理し、二次抗体として西洋ワサビペルオキシダーゼ標識した抗ヤギＩｇＧ抗体を使用してＥＬＩＳＡを行い、最大希釈倍率でもインヒビン抗体が十分に検出できることを確認し、以下の実験に用いた。
これらの試薬（ＩＡＳ単独、ｅＣＧ単独、或いはＩＡＳ及びｅＣＧの組合せ）の投与４８時間後に、７．５ＩＵのｈＣＧ（あすか製薬株式会社）をマウスに投与した。ｈＣＧの投与１７時間後に、マウスを頸椎脱臼により安楽死させ、そしてマウスの卵管を素早く採取し、パラフィンオイルで覆われた受精ディッシュに移した。顕微鏡観察下で、卵丘卵子複合体（ＣＯＣ）を卵管から採取して、受精培地の２００μＬのドロップに移した（雌／ドロップ）。各グループについて、排卵された卵子の数及び卵子の受精能を確認した。
雌マウスに、ＩＡＳ（０．１ｍＬ又は０．２ｍＬ又は０．４ｍＬ）単独、ｅＣＧ（３．７５又は７．５ＩＵ又は１５ＩＵ、あすか製薬株式会社）単独、或いはＩＡＳ及びｅＣＧの組合せを投与した。ＩＡＳは、マウスインヒビンペプチドを用いて岸らの論文（非特許文献５、本文献は引用することにより本明細書の一部である。）に記載された方法に準じて調製し、調製した抗血清をそのまま用いた。調製したＩＡＳは、ＥＬＩＳＡ法を用いてその抗体活性を測定して、必要に応じて標準化して使用した。具体的には、５μｇ／ｍＬの濃度のマウスインヒビンペプチドをＥＬＩＳＡ用プレートに吸着させた後に、洗浄及びブロッキングを行った。１，０００倍−１２８，０００倍に希釈したインヒビン抗血清を処理し、二次抗体として西洋ワサビペルオキシダーゼ標識した抗ヤギＩｇＧ抗体を使用してＥＬＩＳＡを行い、最大希釈倍率でもインヒビン抗体が十分に検出できることを確認し、以下の実験に用いた。
これらの試薬（ＩＡＳ単独、ｅＣＧ単独、或いはＩＡＳ及びｅＣＧの組合せ）の投与４８時間後に、７．５ＩＵのｈＣＧ（あすか製薬株式会社）をマウスに投与した。ｈＣＧの投与１７時間後に、マウスを頸椎脱臼により安楽死させ、そしてマウスの卵管を素早く採取し、パラフィンオイルで覆われた受精ディッシュに移した。顕微鏡観察下で、卵丘卵子複合体（ＣＯＣ）を卵管から採取して、受精培地の２００μＬのドロップに移した（雌／ドロップ）。各グループについて、排卵された卵子の数及び卵子の受精能を確認した。
（１−４）体外受精
精子は、Ｃ５７ＢＬ／６又はＣ５７ＢＬ／６バックグランドの遺伝子改変マウスから以下のようにして採取した。雄マウスを頸椎脱臼で安楽死させた後、精巣上体尾部を採取し、パラフィンオイルで覆われた精子前培養用のディッシュに移した。精子の塊を、解剖針を用いて精巣上体尾部から回収し、精子前培養培地の１００μＬのドロップに移した。精子を６０分間前培養して、受精能獲得を誘導した。前培養した精子をＣＯＣが入った受精培地のドロップに加え、３７℃で、５％ＣＯ２を含む大気中で３時間、卵子を培養した。受精培地中の運動性精子の最終濃度は、４００〜８００精子／μＬであった。受精の３時間後に、卵子を、ｍＨＴＦの３ドロップ（８０μＬ）中で洗浄した。卵子の洗浄後に、卵子の数を数えた。受精２４時間後に、２細胞期胚の全数を総卵子数で割って１００をかけることにより、受精率を計算した。
精子は、Ｃ５７ＢＬ／６又はＣ５７ＢＬ／６バックグランドの遺伝子改変マウスから以下のようにして採取した。雄マウスを頸椎脱臼で安楽死させた後、精巣上体尾部を採取し、パラフィンオイルで覆われた精子前培養用のディッシュに移した。精子の塊を、解剖針を用いて精巣上体尾部から回収し、精子前培養培地の１００μＬのドロップに移した。精子を６０分間前培養して、受精能獲得を誘導した。前培養した精子をＣＯＣが入った受精培地のドロップに加え、３７℃で、５％ＣＯ２を含む大気中で３時間、卵子を培養した。受精培地中の運動性精子の最終濃度は、４００〜８００精子／μＬであった。受精の３時間後に、卵子を、ｍＨＴＦの３ドロップ（８０μＬ）中で洗浄した。卵子の洗浄後に、卵子の数を数えた。受精２４時間後に、２細胞期胚の全数を総卵子数で割って１００をかけることにより、受精率を計算した。
（１−５）胚のガラス化及び加温
胚のガラス化の手順は中尾ら報告（非特許文献１４、本文献は引用することにより本明細書の一部である。）に従った。体外受精後に、遺伝子改変マウスの２細胞期胚を約１００μＬのＤＭＳＯのドロップに入れ、次いで、他のＤＭＳＯのドロップに移した。卵子を含んだ５μＬのＤＭＳＯの分割サンプルをクライオチューブに入れ、０℃で５分間平衡化した。５分間の平衡化の後、卵子が入ったクライオチューブを液体窒素中に沈め、保存した。クライオチューブ内のガラス化胚は、３７℃で予め加温した０．９ｍＬのスクロース溶液を加えることにより温めた。ガラス化加温胚をスクロース溶液から回収し、次いで、１００μＬのＤＭＳＯのドロップ中に移した。１０分後、胚移植の前に形態学的に正常な胚の数を数えることにより、生存率を求めた。
胚のガラス化の手順は中尾ら報告（非特許文献１４、本文献は引用することにより本明細書の一部である。）に従った。体外受精後に、遺伝子改変マウスの２細胞期胚を約１００μＬのＤＭＳＯのドロップに入れ、次いで、他のＤＭＳＯのドロップに移した。卵子を含んだ５μＬのＤＭＳＯの分割サンプルをクライオチューブに入れ、０℃で５分間平衡化した。５分間の平衡化の後、卵子が入ったクライオチューブを液体窒素中に沈め、保存した。クライオチューブ内のガラス化胚は、３７℃で予め加温した０．９ｍＬのスクロース溶液を加えることにより温めた。ガラス化加温胚をスクロース溶液から回収し、次いで、１００μＬのＤＭＳＯのドロップ中に移した。１０分後、胚移植の前に形態学的に正常な胚の数を数えることにより、生存率を求めた。
（１−６）胚移植
胚移植は、本発明者が以前報告した手順に従って行った（非特許文献１５、本文献は引用することにより本明細書の一部である。）。遺伝子改変マウスの新たに採取した又はガラス化加温した２細胞期胚を、膣プラグが見られた日（偽妊娠の１日目）のＩＣＲ雌マウスの卵管に移植した（８〜１１胚／卵管）。胚は、卵管壁を介して移植した。子孫の数は、１９日後に記録した。
胚移植は、本発明者が以前報告した手順に従って行った（非特許文献１５、本文献は引用することにより本明細書の一部である。）。遺伝子改変マウスの新たに採取した又はガラス化加温した２細胞期胚を、膣プラグが見られた日（偽妊娠の１日目）のＩＣＲ雌マウスの卵管に移植した（８〜１１胚／卵管）。胚は、卵管壁を介して移植した。子孫の数は、１９日後に記録した。
（１−７）統計処理
統計分析は、Ｐｒｉｓｍバージョン５．０（ＧｒａｐｈＰａｄ）を用いて行った。結果は、平均±標準偏差ＳＤ）として表してある。グループの結果は、百分率のアークサイン変換後に分散分析を用いて比較した。ｐ＜０．０５は、統計的に有意と判定した。
統計分析は、Ｐｒｉｓｍバージョン５．０（ＧｒａｐｈＰａｄ）を用いて行った。結果は、平均±標準偏差ＳＤ）として表してある。グループの結果は、百分率のアークサイン変換後に分散分析を用いて比較した。ｐ＜０．０５は、統計的に有意と判定した。
２．実験
（２−１）ＩＡＳとｅＣＧの組合せ投与
ＩＡＳ単独、ｅＣＧ単独、ＩＡＳｅ（ＩＡＳとｅＣＧの組合せ）の３種類の投与を行い、過排卵を誘起する能力を調べた。７．５ＩＵのｅＣＧ又はＩＡＳｅ（０．１ｍＬのＩＡＳと３．７５ＩＵのｅＣＧ）、次いでｈＣＧを注射後の卵管膨大部を観察した写真を図１に示す。また、得られた卵子の数を表１に示す。
（２−１）ＩＡＳとｅＣＧの組合せ投与
ＩＡＳ単独、ｅＣＧ単独、ＩＡＳｅ（ＩＡＳとｅＣＧの組合せ）の３種類の投与を行い、過排卵を誘起する能力を調べた。７．５ＩＵのｅＣＧ又はＩＡＳｅ（０．１ｍＬのＩＡＳと３．７５ＩＵのｅＣＧ）、次いでｈＣＧを注射後の卵管膨大部を観察した写真を図１に示す。また、得られた卵子の数を表１に示す。
ＩＡＳｅ（０．１ｍＬのＩＳＡと３．７５ＩＵのｅＣＧの組合せ）が、ＩＡＳ単独又はｅＣＧ単独に比べて、最も効果的に排卵される卵子の数を増加した。ＩＡＳｅの投与で排卵された卵子の数は、０．２ｍＬのＩＡＳ又は７．５ＩＵのｅＣＧの投与により誘起された数の約３倍であった。０．１又は０．２ｍＬのＩＡＳの効果は、７．５ＩＵのｅＣＧの効果と同じであった。即ち、ＩＡＳとｅＣＧの組合せの投与は、Ｃ５７ＢＬ／６雌マウスにおいて排卵される卵子の数を増加させた。
（２−２）卵子から２細胞期胚の作製
ＩＡＳｅを投与したＣ５７ＢＬ／６雌マウス由来の卵子と遺伝子改変マウスの精子との間での胚の作製効率を評価した。精子ドナーとして、３系統の遺伝子改変マウスを用いてＩＶＦを行い、２細胞期胚まで発生させた。２細胞期胚の写真を図２に示す。また、胚の作製効率の結果を表２に示す。
過排卵は、ＩＡＳｅ（０．１ｍＬのＩＡＳ及び３．７５ＩＵのｅＣＧ）を用いて誘起した。ＩＡＳｅは、各マウス系統において２匹の雌マウスに投与した（Ｃ５７ＢＬ／６雌マウスのＩＤ：７−１２）。コントロールとして、７．５ＩＵのｅＣＧで６匹の雌マウスを用いて過排卵を誘起した（Ｃ５７ＢＬ／６雌マウスのＩＤ：１−６）。ＩＶＦは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの卵子と遺伝子改変マウスの精子の間で行った。精子ドナーとして、遺伝子改変マウスの３つの系統（Ａ，Ｂ又はＣ）を用いた。
ＩＡＳｅを投与したＣ５７ＢＬ／６雌マウス由来の卵子と遺伝子改変マウスの精子との間での胚の作製効率を評価した。精子ドナーとして、３系統の遺伝子改変マウスを用いてＩＶＦを行い、２細胞期胚まで発生させた。２細胞期胚の写真を図２に示す。また、胚の作製効率の結果を表２に示す。
過排卵は、ＩＡＳｅ（０．１ｍＬのＩＡＳ及び３．７５ＩＵのｅＣＧ）を用いて誘起した。ＩＡＳｅは、各マウス系統において２匹の雌マウスに投与した（Ｃ５７ＢＬ／６雌マウスのＩＤ：７−１２）。コントロールとして、７．５ＩＵのｅＣＧで６匹の雌マウスを用いて過排卵を誘起した（Ｃ５７ＢＬ／６雌マウスのＩＤ：１−６）。ＩＶＦは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの卵子と遺伝子改変マウスの精子の間で行った。精子ドナーとして、遺伝子改変マウスの３つの系統（Ａ，Ｂ又はＣ）を用いた。
表２に示すように、ＩＡＳｅ処理により１匹の雌マウスから１００を超える卵子が得られた。排卵された卵子は、遺伝子改変マウスの精子とＩＶＦにより通常の受精を行った。その結果、遺伝子改変マウスの２細胞期胚が、ＩＡＳｅを用いた過排卵の卵子から作製できた。得られた胚は、以下の実験による凍結保存前又は後に、レシピエントに移植した。
（２−３）産子の作製
Ｃ５７ＢＬ／６雌マウスと遺伝子改変雄マウス間でのＩＶＦにより作製された新鮮な又は凍結保存された２細胞期胚の発生能を、胚移植により確認した。
Ｃ５７ＢＬ／６雌マウスの卵子と遺伝子改変雄マウスの精子の間でＩＶＦを行った後、凍結保存なし（雌マウスのＩＤ；ｅＣＧ：１−３、ＩＡＳｅ：７，９，１１）又は凍結保存あり（雌マウスのＩＤ；ｅＣＧ４−６、ＩＡＳｅ：８，１０，１２）の２細胞期胚を移植に用いた。結果を表３に示す。
Ｃ５７ＢＬ／６雌マウスと遺伝子改変雄マウス間でのＩＶＦにより作製された新鮮な又は凍結保存された２細胞期胚の発生能を、胚移植により確認した。
Ｃ５７ＢＬ／６雌マウスの卵子と遺伝子改変雄マウスの精子の間でＩＶＦを行った後、凍結保存なし（雌マウスのＩＤ；ｅＣＧ：１−３、ＩＡＳｅ：７，９，１１）又は凍結保存あり（雌マウスのＩＤ；ｅＣＧ４−６、ＩＡＳｅ：８，１０，１２）の２細胞期胚を移植に用いた。結果を表３に示す。
表３に示されるように、胚移植後に、全てのレシピエントは、ＩＡＳｅによる過排卵により得られた排卵された卵子から産子を作製した。作製された産子を図３に示す。即ち、子孫が、ＩＡＳｅを用いた過排卵から得られた新鮮又は凍結保存胚から得られた。産子率は、新鮮又は凍結保存卵子のいずれのグループでも、ｅＣＧ処理とＩＡＳｅ処理で差がなかった。ＩＡＳｅで過排卵させた雌マウスからの子孫数は、ｅＣＧ処理に比べて約３倍であった。
（２−４）卵子ドナーの週齢の検討１
２−１と同様にして、４週齢及び１０週齢の雌マウスを用いて、ＩＡＳ単独（０．１ｍＬ又は０．２ｍＬ）、ｅＣＧ単独（３．７５ＩＵ又は７．５ＩＵ）、ＩＡＳｅ（ＩＡＳとｅＣＧの組合せ：０．１ｍＬのＩＡＳと３．７５ＩＵのｅＣＧ）の３種類の投与を行い、過排卵を誘起する能力を調べた。結果を図４及び図５に示す。
１０週齢のマウスに比べ、４週齢のマウスにおいて顕著に過排卵が誘起されていた。
２−１と同様にして、４週齢及び１０週齢の雌マウスを用いて、ＩＡＳ単独（０．１ｍＬ又は０．２ｍＬ）、ｅＣＧ単独（３．７５ＩＵ又は７．５ＩＵ）、ＩＡＳｅ（ＩＡＳとｅＣＧの組合せ：０．１ｍＬのＩＡＳと３．７５ＩＵのｅＣＧ）の３種類の投与を行い、過排卵を誘起する能力を調べた。結果を図４及び図５に示す。
１０週齢のマウスに比べ、４週齢のマウスにおいて顕著に過排卵が誘起されていた。
（２−５）卵子ドナーの週齢の検討２
２−１と同様にして、３週齢〜１０週齢の雌マウスを用いて、ＩＡＳｅ（ＩＡＳとｅＣＧの組合せ：０．１ｍＬのＩＡＳと３．７５ＩＵのｅＣＧ）の投与を行い、過排卵を誘起する能力を調べた。結果を図６に示す。
２−１と同様にして、３週齢〜１０週齢の雌マウスを用いて、ＩＡＳｅ（ＩＡＳとｅＣＧの組合せ：０．１ｍＬのＩＡＳと３．７５ＩＵのｅＣＧ）の投与を行い、過排卵を誘起する能力を調べた。結果を図６に示す。
（２−６）ＩＡＳとｅＣＧの併用投与の検討
ＩＡＳとｅＣＧ併用併投与における、投与比の排卵数に及ぼす影響を検討した。
２−１と同様にして、４週齢、及び１０−１９週齢の雌マウスを用いて、ＩＡＳとｅＣＧの投与比を変更して、過排卵を誘起する能力を調べた。ＩＡＳは、０ｍＬ、０．１ｍＬ、０．２ｍＬ、及び０．４ｍＬを投与した。ｅＣＧは、０ ＩＵ、３．７５ ＩＵ、７．５ ＩＵ、及び１５ ＩＵを投与した。４週齢のマウスを用いた結果を図７に、１０−１９週齢のマウスを用いた結果を図８に示す。
０．１ｍＬ又は０．２ｍＬの至適用量のＩＡＳの投与は、７．５ ＩＵのｅＣＧの投与と同等の排卵誘起を示した。また、より低用量のＩＡＳ（０．１ｍＬより低容量）及び高い用量のＩＡＳ（０．４ｍＬより高用量）は、いずれも過排卵効果を示した。しかし、それらの用量での過排卵数は安定ではなかった（データ示さず）。
結果から判るように、０．１ｍＬ又は０．２ｍＬのＩＡＳと、３．７５又は７．５ ＩＵのｅＣＧとの組合せが特に顕著な排卵誘起効果を示した。
ＩＡＳとｅＣＧ併用併投与における、投与比の排卵数に及ぼす影響を検討した。
２−１と同様にして、４週齢、及び１０−１９週齢の雌マウスを用いて、ＩＡＳとｅＣＧの投与比を変更して、過排卵を誘起する能力を調べた。ＩＡＳは、０ｍＬ、０．１ｍＬ、０．２ｍＬ、及び０．４ｍＬを投与した。ｅＣＧは、０ ＩＵ、３．７５ ＩＵ、７．５ ＩＵ、及び１５ ＩＵを投与した。４週齢のマウスを用いた結果を図７に、１０−１９週齢のマウスを用いた結果を図８に示す。
０．１ｍＬ又は０．２ｍＬの至適用量のＩＡＳの投与は、７．５ ＩＵのｅＣＧの投与と同等の排卵誘起を示した。また、より低用量のＩＡＳ（０．１ｍＬより低容量）及び高い用量のＩＡＳ（０．４ｍＬより高用量）は、いずれも過排卵効果を示した。しかし、それらの用量での過排卵数は安定ではなかった（データ示さず）。
結果から判るように、０．１ｍＬ又は０．２ｍＬのＩＡＳと、３．７５又は７．５ ＩＵのｅＣＧとの組合せが特に顕著な排卵誘起効果を示した。
以上の結果より、ＩＡＳとｅＣＧを組み合わせた投与が、ｅＣＧ又はＩＡＳを単独で用いた過排卵処理に比べて、Ｃ５７ＢＬ／６雌マウスの排卵される卵子の数を大きく増加させることが示された。また、ＩＡＳｅ処理は、排卵される卵子の受精率に負の効果を示さなかった。加えて、ＩＡＳｅ処理を用いたＣ５７ＢＬ／６雌マウスの卵子と遺伝子改変マウスの精子との間のＩＶＦによって作製された、新鮮又は凍結保存された２細胞期胚から正常に産子が得られた。本発明は、Ｃ５７ＢＬ／６系統の１匹の雌マウスから、８０を超える卵子及び３０より多くの産子を安定に作製する最初の発明であり、ＩＡＳｅを用いた新規の過排卵誘起方法である。
過排卵は、実験動物において、卵子ドナーから卵子を効率良く作製して得るための重要な技術である。マウスの過排卵では、ｅＣＧが雌マウスに腹腔内投与され、次いで、ｅＣＧ投与の４８時間後にｈＣＧが同じ方法により投与される。そして、ｈＣＧ投与の１４〜１７時間後に、卵子が採取される。この技術は、プロトコルが確立して以来、過排卵の標準法として広く受け入れられてきた。本発明者らは、０．１又は０．２ｍＬのＩＡＳの投与が、７．５ＩＵのｅＣＧの投与と同様に排卵される卵子の数を増加させることを示した。興味深いことに、Ｃ５７ＢＬ／６雌マウスへのＩＡＳとｅＣＧとを組み合わせた投与が、排卵される卵子の数を著しく増加させた。過排卵技術の改良は、卵子及び動物の効率的な作製を可能にし、そして遺伝子改変マウスを用いた実験効率の改善に有用である。
Ｃ５７ＢＬ／６は、Mus musculus domesticus に属するとして知られている。本発明者らは、Ｃ５７ＢＬ／６系統の雌マウスの過排卵において、ＩＡＳ（０．１又は０．２ｍＬ）とｅＣＧ（7．５ＩＵ）の応答性が同様であることを示した。そして、本発明者らはさらに、ＩＡＳ及びｅＣＧに対する応答性は、それらを組み合わせて投与することにより顕著に増幅されることを示した。ＩＡＳ及びｅＣＧの組合せという新規な投与方法は、遺伝的バックグランドにかかわらず、野生由来の系統における排卵される卵子の数を増加させる可能性がある。
上記の記載は、本発明の目的及び対象を単に説明するものであり、添付の特許請求の範囲を限定するものではない。添付の特許請求の範囲から離れることなしに、記載された実施態様に対しての、種々の変更及び置換は、本明細書に記載された教示より当業者にとって明らかである。
本発明の技術は、卵子ドナーとなる雌マウスの数を最少化し、３Ｒｓの原則に完全に合致し動物試験の実施基準に沿ったものである。本発明の過排卵誘起技術による動物作製効率の改善は、遺伝子改変マウスを用いたゲノム科学の研究を強力に推進することができるマウスリソースバンク及び世界中の研究所における研究の効率化に極めて有用である。
Claims (7)
- ３〜１９週齢のＣ５７ＢＬ／６系統の雌マウスに、０．４ｍＬ以下のインヒビン抗血清及びウマ絨毛性ゴナドトロピン（ｅＣＧ）を同時に投与し、次いでヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）を投与することを特徴とする過排卵誘起方法。
- 前記雌マウスが、３〜１０週齢の雌マウスである請求項１に記載の過排卵誘起方法。
- 前記雌マウスが、３〜５週齢の雌マウスである請求項１に記載の過排卵誘起方法。
- 前記雌マウスが４週齢の雌マウスである請求項１に記載の過排卵誘起方法。
- 前記インヒビン抗血清が０．１ｍＬ以上０．４ｍＬ以下の容量で投与される請求項１〜４の何れか一つに記載の過排卵誘起方法。
- 前記ウマ絨毛性ゴナドトロピンが、２ＩＵ以上１５ＩＵ以下で投与される請求項１〜５のいずれか一つに記載の過排卵誘起方法。
- 以下の工程：
ａ．請求項１〜６のいずれか一つに記載の方法を用いて卵子を作製する工程と、
ｂ．前記工程により作製した卵子とＣ５７ＢＬ/６系統の遺伝子改変マウスの精子とを受精させる工程、
を含む体外受精方法。
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