CN105581979A - 一种抑制her-2表达的核酸脂质体纳米药物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术制药技术领域，具体涉及一种抑制HER-2表达的核酸脂质体纳米药物及其制备方法和应用。本发明中阳离子脂质体能够包封大量的可转录表达HER-2干扰RNA的质粒药物，在动物水平上避免了核酸药物的降解，并将大量核酸药物靶向传输到荷瘤小鼠肿瘤部位富集，实现对肿瘤的显著生长抑制作用。本发明所述的核酸脂质体纳米药物在制备乳腺癌个性化治疗药物中具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物技术制药技术领域，具体涉及一种抑制HER-2表达的核酸脂质体纳米药物及其制备方法和应用。
背景技术
近年来，乳腺癌已经成为全球女性发病率最高的恶性肿瘤之一，约占全身所患肿瘤的7％-10％，其中40％患者HER-2/neu(表皮生长因子家族成员)表达结果为阳性。目前，乳腺癌的治疗方法逐渐发展成为按肿瘤特征(如针对HER-2阳性患者)而进行个体化治疗。曲妥珠单抗是一种以HER-2受体细胞外位点为靶标的重组人源IgG单克隆抗体，它能够结合细胞膜上HER-2蛋白，抑制磷酸酰基肌醇-3-激酶和丝裂原活化蛋白激酶，从而抑制细胞周期和抑制肿瘤生长。曲妥珠单抗的临床治疗取得了较好效果，但同时也发现经曲妥珠单抗治疗的患者，产生较大的耐药性。
开发高效低毒，靶向性好的基于抑制HER-2的核酸药物输送体系一直是广大科学家的努力方向。病毒载体在细胞中有很高的转染效率，然而，相关研究表明病毒载体可以引起非特异性免疫应答和炎症反应，并且病毒载体在细胞内的多拷贝复制有可能激活原癌基因，导致细胞发生转化，进而引发肿瘤。为了克服病毒载体在临床基因治疗中的缺陷，非病毒载体作为替代物，在将核酸药物传输进活体动物方面具有很大潜能。脂质体作为药物传输载体广泛应用于实验室和临床。但目前应用于乳腺癌治疗的脂质体大多半衰期较短，价格昂贵，药物包封率较低等缺点。
发明内容
本发明需要解决的问题就是公开了一种有效的治疗小鼠乳腺癌的基于抑制HER-2表达的核酸脂质体药物及其制备方法。
本发明通过控制二十聚甘油单油酸酯与N，N′-羰基二咪唑(CDI)的摩尔质量比，得到了不同程度氨基修饰的阳离子二十聚甘油单油酸酯，通过实验检测发现，其中阳离子脂质体(CDGMS-21)具有肿瘤靶向作用、缓释作用、降低药物毒性作用和提高药物稳定性的作用，与Lipofectamine2000相比，这种新型的核酸脂质体具有较小的粒径和适当的表面电位，且细胞毒性明显较小，小鼠的耐受度较高，可以用于动物体内。
本发明所述的核酸脂质体纳米药物，是由一种抑制HER-2表达的核酸药物和阳离子脂质体(CDGMS-21)构成的纳米复合物，其中抑制HER-2的核酸药物为一种可转录表达HER-2干扰RNA的质粒，该质粒在细胞内表达可高度特异性地导致HER-2mRNA基因沉默；阳离子脂质体是以二十聚甘油单硬脂酸酯为原料。
本发明中使用的基于HER-2表达抑制的核酸药物包括：可转录表达HER-2干扰RNA的质粒，可转录表达HER-2干扰RNA的病毒载体，化学合成的HER-2siRNA片段。本次实验中采用的基于HER-2表达抑制的核酸药物为可转录表达HER-2干扰RNA的质粒，但是不应视为对基于HER-2表达抑制的核酸药物使用种类的限制。
本发明中核酸脂质体药物(即可转录表达HER-2干扰RNA的质粒和CDGMS-21构成的脂质体给药体系)采用尾静脉给药给予合适剂量。该试剂的有效量是能导致乳腺癌症状明显降低的剂量。
本发明通过动物体内实验对乳腺癌疗效进行例证。此处的动物包括但是不限于：小鼠，大鼠，驯养动物包括但是不限于猫，狗，以及其它一些动物包括但是不限于牛，羊，猪，马，灵长类动物包括但是不限于猴子和人。小鼠腋下植瘤的乳腺癌模型是被广泛认可和接受的体内药物活性检测模型，同时也可以为其它生物包括但是不局限人提供参考。
下面的部分以描述这项发明的内容，但是不应该被视作对这项发明的功能范围的限定。
本发明所述的由可转录表达HER-2干扰RNA的质粒/CDGMS-21构成的核酸脂质体纳米药物的制备方法，在可转录表达HER-2干扰RNA的质粒溶液中加入适量CDGMS-21，搅拌混匀，室温静置20分钟，即可制得核酸脂质体纳米药物，通过Zeta电位仪测得电位和粒径。
本发明所述的由可转录表达HER-2干扰RNA的质粒/CDGMS-21构成的核酸脂质体纳米药物在小鼠乳腺癌肿瘤模型治疗中的应用：
(1)BALB/C小鼠腋下4T1细胞植瘤
(2)小鼠乳腺癌肿瘤模型建立5天后，肿瘤直径大约在0.3-0.5厘米左右，将预先制备好的核酸脂质体纳米药物通过尾静脉给药的方式注入小鼠体内
(3)每隔三天给药一次，一共给药4次，15天后，分离肿瘤测量
本发明的有益效果是：本发明首次采用阳离子脂质体(CDGMS-21)和一种可转录表达HER-2干扰RNA的质粒来制备一种新型核酸脂质体药物，并应用于小鼠乳腺癌治疗。该种新型的包裹核酸脂质体微粒，应用于活体实验动物而不致死，并且能显著减小小鼠实体瘤体积，实验动物生理机能有明显改善，该新型纳米药物大大提高了核酸药物在体内的稳定性；该核酸纳米药物通过尾静脉给药能直接下调小鼠乳腺癌肿瘤中HER-2的水平，明显缓解小鼠乳腺癌肿瘤症状。本发明为乳腺癌疾病开发了一种疗效显著的核酸纳米新药。
附图说明
图1核酸脂质体纳米复合物粒径图
图2核酸脂质体纳米复合物电位图
图3脂质体包裹GFP质粒细胞转染荧光照片
图4核酸脂质体药物治疗小鼠乳腺癌的肿瘤实物图
A.生理盐水组
B.可转录表达HER-2干扰RNA组
C.CDGMS-21组
D.可转录表达HER-2干扰RNA/CDGMS-21组
图5核酸脂质体药物治疗小鼠乳腺癌的肿瘤体积图
A.生理盐水组
B.可转录表达HER-2干扰RNA组
C.CDGMS-21组
D.可转录表达HER-2干扰RNA/CDGMS-21组
图6核酸脂质体药物治疗小鼠乳腺癌的肿瘤重量图
A.生理盐水组
B.可转录表达HER-2干扰RNA组
C.CDGMS-21组
D.可转录表达HER-2干扰RNA/CDGMS-21组
具体实施方式
1.材料来源
雌性BALB/c小鼠(16-18g)，购自北京军事医学院动物中心。小鼠乳腺癌细胞系4T1购自上海细胞研究院细胞资源中心。二十聚甘油单硬脂酸酯和N，N′-羰基二咪唑(CDI)购自上海生工生物有限公司。细胞培养试剂和可转录表达HER-2干扰RNA的质粒及其纯化试剂购自美国LifeTechnology公司；其他含氮小分子化合物、有机溶剂和其它试剂均为国产分析纯。
2.阳离子脂质体(CDGMS-21)的制备方法
(1)将4.415g二十聚甘油单硬脂酸酯溶解于50mL二甲基亚砜中，常温下磁力搅拌至溶液透明，无固形物存在
(2)加入8.513gN，N′-羰基二咪唑磁力搅拌1小时，得到活化了的二十聚甘油单硬脂酸酯
(3)在另一个广口瓶中加入35mLN,N′-二甲基乙二胺，并开始磁力搅拌
(4)将步骤(2)活化了的二十聚甘油单硬脂酸酯逐滴加入到N,N′-二甲基乙二胺中(35mL)，磁力搅拌24小时
(5)将溶液倒入截留分子量为3,500Da的透析袋，用双蒸水透析3天至pH达到中性
(6)收集白色乳液，冻干机上冻干3天至完全干燥，得到粗制产物
(7)将粗制产物溶解在氯仿中，使用硅胶柱(Gel60)纯化该粗制产物，用包含0～3％甲醇的氯仿进行洗脱。通过薄层层析(TLC)(硅胶，氯仿/甲醇＝9:1v/v，用1.6％的硝酸/乙醇溶液，加热至120℃，进行显色观察)确定柱层析各组分产物，将包含纯化产物的组分合并。用常压蒸馏法除去溶剂。用甲醇洗涤纯化产物三次。用水洗涤纯化产物三次。冻干，得到纯化的产物
(8)将12mg上述合成的阳离子聚甘油酯脂质与1.2mg胆固醇溶解在3ml的体积比为1:1的氯仿/甲醇溶剂中
(9)倒入旋转蒸发仪圆底烧瓶中，真空条件下，55℃水浴恒温旋转蒸发2小时；55℃水浴恒温，通氮气流1小时至有机溶剂完全除去
(10)加入3ml水相，常压，55℃水浴恒温旋转1小时至得到白色乳液
(11)将白色乳液转移到玻璃离心管中，100w超声输出功率，55℃水浴恒温超声，30分钟至乳液基本透明
(12)在超净台中无菌操作，将基本透明的乳液通过0.22μm滤器滤过除菌，得到空载的阳离子脂质体(CDGMS-21)溶液
(13)4℃冰箱保存
3.核酸脂质体纳米药物的制备及其理化性质
在浓度为1μg/μl质粒(转录表达HER-2干扰RNA的质粒)溶液中加入等体积的上述制备得到的阳离子脂质体(CDGMS-21)或商品化的Lipofectamine2000，轻轻搅拌混匀，室温静置20分钟，即制备得到核酸脂质体纳米药物，通过Zeta电位仪测得电位和粒径(如图1，2所示)。
4.核酸脂质体纳米复合物细胞转染实验
将浓度为1μg/μlEGFP质粒溶液和等体积的空载阳离子脂质体(CDGMS-21)或商品化的Lipofectamine2000混匀，在室温静置20分钟，对4T1细胞进行转染，鉴定脂质体的转染效率。如图3所示，从荧光显微镜照片可以看出，阳离子脂质体(CDGMS-21)可与商品化的脂质体Lipofectamine2000相比，具有较高的细胞转染效率。
5.由可转录表达HER-2干扰RNA的质粒/CDGMS-21构成的核酸脂质体纳米药物对小鼠乳腺癌的治疗作用
按照文献报道方法建立小鼠乳腺癌模型，即取雌性BALB/C小鼠20只，将培养的小鼠乳腺癌4T1细胞用胰酶消化计数，将细胞用PBS稀释至1x107个/mL，接种于BALB/c雌性小鼠左前肢腋下，接种量为100μL/只。在细胞接种至5天后，将20只小鼠随机分为以下4组进行治疗实验：(1)生理盐水组，(2)可转录表达HER-2干扰RNA的质粒组，(3)CDGMS-21组，(4)可转录表达HER-2干扰RNA的质粒/CDGMS-21组。
小鼠具体给药治疗方案如下：(1)生理盐水组：每只小鼠200μL生理盐水；(2)可转录表达HER-2干扰RNA的质粒组：每只小鼠200μL含可转录表达HER-2干扰RNA的质粒溶液，其中质粒的剂量为100μg/只；(3)CDGMS-21组：每只小鼠200μL阳离子脂质体溶液；(4)可转录表达HER-2干扰RNA的质粒/CDGMS-21组：取实验步骤3合成好的由CDGMS-21和可转录表达HER-2干扰RNA的质粒构成的核酸脂质体纳米药物，每只小鼠200μL，其中质粒的剂量为100μg/只。所有小鼠尾静脉给药总体积200μL/只，每隔三天给药，给药4次后，处死小鼠，分离肿瘤进行了拍照，测肿瘤重量，肿瘤体积。如图4，5，6所示，相比于对照组，由CDGMS-21和可转录表达HER-2干扰RNA的质粒构成的核酸脂质体纳米药物，通过尾静脉给药能明显抑制肿瘤生长，为乳腺癌个体化治疗开发了一种疗效显著的核酸脂质体纳米新药。
Claims (4)
1.一种核酸脂质体纳米药物，其特征是由一种抑制HER-2表达的核酸药物和阳离子脂质体CDGMS-21构成的纳米复合物，其中阳离子脂质体是以二十聚甘油单硬脂酸酯为原料。
2.根据权利要求1所述一种核酸脂质体纳米药物，其特征是抑制HER-2表达的核酸药物为可转录表达HER-2干扰RNA的质粒或可转录表达HER-2干扰RNA的病毒载体或化学合成的HER-2siRNA片段。
3.根据权利要求1所述一种核酸脂质体纳米药物的制备方法，其特征是在浓度为1μg/μl质粒即转录表达HER-2干扰RNA的质粒的溶液中加入等体积的阳离子脂质体CDGMS-21，轻轻搅拌混匀，室温静置20分钟，即制备得到核酸脂质体纳米药物。
4.根据权利要求1所述一种核酸脂质体纳米药物在制备治疗乳腺癌药物中的应用。
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