ES2336766T3 - Procedimiento de recubrimiento de particulas finas con pelicula lipidica. - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento para recubrir partículas finas que tienen un tamaño promedio de partículas de 10 nm hasta 1.000 nm y que forman un complejo de fármaco con uno o más miembro(s) seleccionado(s) de sistema lipídico, liposoma, partículas finas en emulsión, polímero natural, polímero sintético, coloide metálico, lípido catiónico, lípido aniónico y una preparación de partículas finas con membrana lipídica, que comprende las etapas de: preparar una solución acuosa que contiene un disolvente orgánico polar en la que se suspende el complejo y se disuelve el lípido, en el que el lípido se selecciona de fosfolípido, gliceroglicolípido, esfingoglicolípido, colesterol y lípido sintético, y el disolvente orgánico polar es uno o más miembro(s) seleccionado(s) de un alcohol, un glicol y un políalquilenglicol; recubrir las partículas finas con la membrana lipídica formada por el lípido mediante la reducción de la proporción del disolvente orgánico polar en la solución acuosa añadiendo agua o por evaporación del disolvente orgánico polar.
Description
Procedimiento de recubrimiento de partículas
finas con película lipídica.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para recubrir partículas finas con membrana
lipídica.
Es un hecho muy conocido que un fármaco se
contiene en partículas finas para potenciar el efecto del fármaco,
y que las partículas finas incluyen, por ejemplo, liposoma, emulsión
de grasa, etc. Sus aplicaciones clínicas se llevan a cabo
principalmente mediante inyecciones, particularmente por
administración intravascular. Se ha sabido que las partículas finas
administradas al vaso sanguíneo interactúan con los componentes de
la sangre y, como resultado de la Interacción, las propias
partículas finas o el fármaco, se destruyen (desintegran), o las
partículas finas se opsonizan luego de lo cual se eliminan de la
sangre (se eliminan como una sustancia extraña a través de un
sistema reticuloendotelial). Con el fin de evitar esa eliminación,
se ha estudiado, por ejemplo, la modificación del liposoma con
polietilenglicol, [Stealth Liposomes, ed. by D. D. Lasic and F.
Martin, CRC Press Inc., Florida, 93-102 (1995)].
Además, con el fin de administrar un ácido
nucleico tal como un oligonucleótido, ADN y ARN a células blanco,
se ha usado frecuentemente un complejo de un ácido nucleico con
liposoma que comprende un lípido catiónico (a partir de aquí
denominado liposoma lipídico catiónico), un polímero básico tal como
poli-L-lisina y poliamidaamina. Sin
embargo, se ha sabido que, cuando se administra un complejo de
liposoma lipídico catiónico con un ácido nucleico por vía
intravenosa, éste se distribuye fácilmente desde la sangre al
hígado, pulmón, etc. [Biochim. Biophys. Acta,
1281,139-149 (1996); J. Controíled Release,
41,121-130 (1996)]. Por otro lado, S. Li, et
al. han informado que, cuando se pone en contacto suero de
ratón con un complejo liposoma lipídico catiónico/ADN, se ha
desarrollado un aumento en el tamaño del complejo, agregación,
desintegración del liposoma y liberación y desintegración del ADN
[Gene Therapy, 5, 930-937 (1998); Gene Therapy, 6,
585-594 (1999)]. Con el fin de resolver esos
problemas, se estudió la modificación del liposoma lipídico
catiónico con polietilenglicol, y O. Meyer, et al.
prepararon un complejo de oligodesoxinucleótido (ODN) con liposoma
lipídico catiónico que contiene
poíietilenglicol-fosfatidiletanolamina
(PEG-PE) [J. Biol. Chem., 273,
15621-15627 (1998)]. Sin embargo, cuando se puso en
contacto con una solución acuosa al 50% de plasma humano durante 4
horas, el 35% del ODN se disoció. Con el fin de reducir la
disociación, D. Stuart y T. Alien disolvieron previamente el
liposoma lipídico catiónico en cloroformo, mezclaron el disolvente
resultante con una solución acuosa de ODN y metanol, y
transfirieron un complejo de liposoma lipídico catiónico/ODN a la
fase clorofórmica y lo sometieron a separación centrífuga. Además,
extrajeron la fase de cloroformo, agregaron a ésta
lípido-PEG, lípido neutro y agua para formar una
emulsión W/O. Han intentado incluir ODN dentro del liposoma
completamente formando la emulsión W/O de un modo similar al
procedimiento de evaporación de fase reversa de F. Szoka, et
al. [Biochim. Biophys. Acta, 1463,219-229
(2000)]. En años recientes, sin embargo, el uso de cloroformo no se
considera deseable en vista de la seguridad. Además, D. McPhail,
et al. prepararon una suspensión de vesícula en vesícula en
la cual la vesícula de quitosano se coloca en el liposoma agregando
una suspensión de vesícula (vesícula de quitosano) de
palmitoilquitosano y colesterol a una capa delgada de
fosfatidilcolina de yema de huevo y colesterol [Int. J.
Pharmaceutics, 200, 73-86 (2000)]. Sin embargo, no
hay descripción sobre la eficiencia y, cuando se intuye a partir
del procedimiento de preparación, la eficacia de inclusión se supuso
que era tan baja como del orden de un pequeño porcentaje, lo que,
según se presume, es la causa de un problema en su uso práctico. A
partir de dichos puntos de vista también, la contención conveniente
y altamente eficiente de partículas finas con el uso de una
vesícula cerrada es muy útil cuando se busca aplicación al
tratamiento médico.
Además, hay algunos casos en los que muchos
péptidos y proteínas que son útiles en el cuidado médico se
descomponen rápidamente en el cuerpo vivo por acción de las enzimas
o similares o se eliminan del cuerpo vivo como resultado de la
generación de un anticuerpo por administraciones frecuentes, por lo
cual su efecto ya no se ejerce. Por lo tanto, con un objetivo de
potenciar la estabilidad de esos péptidos y proteínas en el cuerpo
vivo, se ha intentado incluirlas dentro de un liposoma. Como medio
de contenerlos en el liposoma, se han conocido, por ejemplo, un
procedimiento de preparación de liposomas diseñado por Bangham,
et al. [J. Mol. Biol., 13, 238 (1965)], un procedimiento de
inyección de etanol [J. Cell Biol,, 66, 621 (1975)], un
procedimiento de prensa francesa [FEBS Lett., 99, 210 (1979)], un
procedimiento de congelamiento-descongelamiento
[Arch. Biochem. Biophys., 212, 186 (1981)], un procedimiento de
evaporación en fase reversa [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75,186
(1981)], un procedimiento de gradiente de pH (Patente Japonesa No.
2,572,554; Patente Japonesa No. 2,659,136; etc.) y similares. Para
los compuestos de bajo peso molecular, un procedimiento de gradiente
de pH es apropiado y también se ha contemplado un procedimiento
mejorado de este tipo. Sin embargo, con respecto a péptidos y
proteínas, no se ha logrado una contención invariablemente eficiente
aún y, en el caso de la insulina marcada con fluorescencia, se
contuvo hasta un grado de aproximadamente 5 a 40% pero no se contuvo
en absoluto insulina sin marcar [Int. J. Pharmaceutics, 179,
85-95 (1999)]. Con el fin de potenciar el efecto
terapéutico producido por péptidos y proteínas, es una exigencia
desarrollar un procedimiento por el cual los péptidos y proteínas
se contienen eficientemente dentro de vesículas cerradas.
Un objetivo de la presente invención es
proporcionar un procedimiento seguro, conveniente y eficiente para
recubrir partículas finas con membrana lipídica con el fin de
estabilizar un medicamento etc. contenido en dichas partículas
finas. Cuando las partículas finas están contenidas en vesículas
cerradas que comprenden membrana de bicapa lipídica o multicapa
usando el mencionado procedimiento de recubrimiento, se puede
suprimir la afección producida por los componentes en el cuerpo
vivo particularmente en la sangre o en el tracto gastrointestinal y
por el sistema reticuloendotelial y además, puede suprimirse la
afección durante el período de conservación producida por cada una
de las partículas finas o por un medio de dispersión en eI que las
partículas finas se dispersan.
Los presentes inventores han encontrado que un
complejo que comprende un fármaco soluble en agua y el lípido
catiónico formado a causa de interacción electrostática no es
soluble en una solución acuosa de etanol y que, aunque el
fosfolípido es soluble en una solución acuosa de etanol que tiene
una alta concentración de etanol, forma un liposoma debido a la
formación de una membrana lipídica en una solución acuosa de etanol
que tiene una baja concentración de etanol. Como resultado de
investigaciones intensivas adicionales, se ha encontrado que un
complejo de un medicamento con lípido puede recubrirse con una
membrana lipídica que comprende lípido con polietilenglicol y
fosfolípidos, cuando un derivado polimérico soluble en agua tal como
lípido con polietilenglicol se agrega anteriormente a un complejo
de un fármaco soluble en agua con lípido, la mezcla se dispersa en
una solución acuosa de etanol que tiene una alta concentración de
etanol, lípido con polietilenglicol y fosfolípido se disuelven en
el líquido resultante y luego el contenido de etanol se reduce
gradualmente.
De este modo, la presente invención se refiere a
los siguientes puntos (1) hasta (19).
- (1)
- Un procedimiento para recubrir partículas finas con membrana lipídica, que comprende recubrir las partículas finas con membrana lipídica mediante la reducción de la proporción de un disolvente orgánico polar en una solución acuosa que contiene el disolvente orgánico polar donde las partículas finas se dispersan y el lípido se disuelve.
- (2)
- Un procedimiento para recubrir partículas finas con membrana lipídica, que comprende recubrir las partículas finas con membrana lipídica mediante la dispersión de partículas finas en una solución acuosa que contiene un disolvente orgánico polar (líquido A), disolviendo el lípido en un disolvente orgánico polar o una solución acuosa que contiene un disolvente orgánico polar que es igual o diferente de la solución acuosa anterior que contiene un disolvente orgánico polar (líquido B), mezclar el líquido A y el líquido B en el líquido C, y reducir la proporción de un disolvente orgánico polar en el líquido C para obtener el líquido D.
- (3)
- El procedimiento para recubrir partículas finas con membrana lipídica de acuerdo con el punto anterior (2), en el que el líquido B es una solución que se prepara por disolución de un derivado polimérico soluble en agua (I) junto con el lípido.
- (4)
- El procedimiento para recubrir partículas finas con membrana lipídica de acuerdo con el punto anterior (2) o (3), en el que las concentraciones del disolvente orgánico polar en el líquido A y el líquido B son del 30% o más.
- (5)
- El procedimiento para recubrir partículas finas con membrana lipídica de acuerdo con el punto anterior (2) o (3), en el que las concentraciones del disolvente orgánico polar en el líquido A y el líquido B son del 60 al 90%.
- (6)
- El procedimiento para recubrir partículas finas con membrana lipídica de acuerdo con el punto anterior (5), en el que la concentración del disolvente orgánico polar en el líquido D es 50% o menos.
- (7)
- El procedimiento para recubrir partículas finas con membrana lipídica de acuerdo con cualquiera de los puntos anteriores (1) hasta (6), en el que las partículas finas son aquellas que contienen un derivado polimérico soluble en agua que es igual o diferente del derivado polimérico soluble en agua (I) mencionado en el punto anterior (3).
- (8)
- El procedimiento para recubrir partículas finas con membrana lipídica de acuerdo con cualquiera de los puntos anteriores (1) hasta (7), en el que las partículas finas son aquellas que contienen uno o más miem- bro(s) seleccionado(s) de un fármaco, sistema lipídico, liposoma, partículas finas en la emulsión, polímero natural, polímero sintético, coloide metálico, lípido catiónico, lípido aniónico y una preparación de partículas finas.
- (9)
- El procedimiento para recubrir partículas finas con membrana lipídica de acuerdo con cualquiera de los puntos anteriores (1) hasta (7), en el que las partículas finas son aquellas que contienen un fármaco.
- (10)
- El procedimiento para recubrir partículas finas con membrana lipídica de acuerdo con cualquiera de los puntos anteriores (1) hasta (7), en el que las partículas finas comprenden un complejo de un medicamento con uno o más miembro(s) seleccionado(s) de sistema lipídico, liposoma, partículas finas en la emulsión, polímero natural, polímero sintético, coloide metálico, lípido catiónico, lípido aniónico y una preparación de partículas finas.
\newpage
- (11)
- El procedimiento para recubrir partículas finas con membrana lipídica de acuerdo con cualquiera de los puntos anteriores (1) hasta (7), en el que las partículas finas comprenden un complejo de un medicamento con lípido catiónico.
- (12)
- El procedimiento para recubrir partículas finas con membrana lipídica de acuerdo con cualquiera de los puntos anteriores (1) hasta (7), en el que las partículas finas comprenden un complejo de un medicamento con lípido aniónico.
- (13)
- El procedimiento para recubrir partículas finas con membrana lipídica de acuerdo con cualquiera de los puntos anteriores (1) hasta (7), en el que las partículas finas comprenden un complejo de un medicamento, fosfolípido que contiene liposomas y una sal sódica de sulfato de dextrano.
- (14)
- El procedimiento para recubrir partículas finas con membrana lipídica de acuerdo con cualquiera de los puntos anteriores (8) hasta (13), en el que el fármaco es un fármaco seleccionado de un péptido, una proteína, un ácido nucleico, un compuesto de bajo peso molecular, un sacárido y un compuesto polimérico.
- (15)
- El procedimiento para recubrir partículas finas con membrana lipídica de acuerdo con cualquiera de los puntos anteriores (1) hasta (14), en el que el disolvente orgánico polar es uno o más miembro(s) seleccionado(s) de un alcohol, un glicol y un polialquilenglicol.
- (16)
- El procedimiento para recubrir partículas finas con membrana lipídica de acuerdo con el punto anterior (15), en el que el alcohol es etanol.
- (17)
- El procedimiento para recubrir partículas finas con membrana lipídica de acuerdo con el punto anterior (15) o (16), en el que el glicol es un propilenglicol.
- (18)
- El procedimiento para recubrir partículas finas con membrana lipídica de acuerdo con cualquiera de los puntos anteriores (15) hasta (17), en el que el políalquilenglicol es polietilenglicol.
- (19)
- El procedimiento para recubrir partículas finas con membrana lipídica de acuerdo con cualquiera de los puntos anteriores (3) hasta (18), en el que el derivado polimérico soluble en agua es uno o más miem- bro(s) seleccionado(s) de lípido con polietilenglicol, un alquil éter de polietilenglicol, un derivado de aceite de ricino de polietilenglicol, un éster de ácido graso de polietilenglicol sorbitano, un estearato de polietilenglicol, un co-polímero de etilenglicol con propilenglicol y un glicerol éster.
\vskip1.000000\baselineskip
Algunos ejemplos del disolvente orgánico polar
en la solución acuosa que contiene el disolvente orgánico polar
usado en la presente invención son un alcohol tal como metanol,
etanol, n-propanol, isopropanol,
n-butanol, isobutanol y
ter-butanol; un glicol tal como glicerol,
etilenglicol y propilenglicol; y políalquilenglicol tal como
polietilenglicol.
Con respecto al elemento que constituye las
partículas finas usadas en la presente invención, no hay limitación
particular y sus ejemplos son un fármaco, sistema lipídico,
liposoma, partículas finas en emulsión, polímero natural, polímero
sintético, coloide metálico, lípido catiónico, lípido aniónico, una
preparación de partículas finas y un derivado polimérico soluble en
agua. Se los puede utilizar en forma independiente, como un complejo
en el que se combinan dos o más de ellos, o como un complejo en el
que se combinan uno o más de ellos y otro compuesto.
Para ser específicos, un ejemplo del complejo
mencionado con anterioridad es un complejo de un fármaco con uno o
más miembro(s) seleccionado(s) de sistema lipídico,
liposoma, partículas finas en emulsión, polímero natural, polímero
sintético, coloide metálico, lípido catiónico, lípido aniónico y una
preparación de partículas finas y, para ser más específicos, es un
complejo de un ácido nucleico con lípido catiónico formado debido a
interacción electrostática; un complejo de un ácido nucleico con
polímero de carga positiva tal como
poli-L-lisina; un complejo de una
proteína alcalina que tiene un punto isoeléctrico elevado con lípido
aniónico tal como ácido fosfatídico o polímero con carga negativa
tal como ácido estireno-maleico; un complejo de una
proteína ácida con polímero de carga positiva tal como lípido
catiónico y poli-L-lisina; etc.
Con respecto al fármaco, sus ejemplos son
sustancias que tienen una actividad farmacológica tal como una
proteína incluyendo enzima, un péptido, un ácido nucleico
incluyendo gen, un compuesto de bajo peso molecular, un sacárido y
un compuesto polimérico. Algunos ejemplos de la proteína incluyendo
enzima y el péptido son bradiquinina, angiotensina, oxitocina,
vasopresina, adrenocorticotropina (ACTH), calcitonina, insulina,
glucagón, colecistoquinina, p-endorfina, factor
inhibidor de melanocitos, hormona estimulante de melanocitos,
antagonista de gastrina, neurotensina, somatostatina, brucina,
ciclosporina, encefalina, transferrína, péptido RGD
(Arg-Gly-Asp), hormona tiroides,
hormona de crecimiento, hormona gonadotrópica, hormona luteinizante
(LHRH), asparaginasa, arginasa, uricasa, carboxipeptidasa,
glutaminasa, superóxido dismutasa (SOD), activador del plasminógeno
de tejidos (t-PA), estreptoquinasa, interleucina,
interferón, dipéptido de muramilo, timopoyetina, factor estimulante
de la colonia de granulocitos (G-CSF), factor
estimulante de la colonia de micrófagos de granulocitos
(GM-CSF), eritropoyetina (EPO), trombopoyetina
(TPO), inhibidor de tripsina, lisozima, factor del crecimiento
epidérmico (EGF), factor de crecimiento símil insulina (IGF),
factor del crecimiento nervioso (NGF), factor del crecimiento
derivado de plaquetas (PDGF), factor de crecimiento de
transformación (TGF), factor de crecimiento de células endoteliales
(ECGF), factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), factor de
crecimiento glíal (GGF), timosina y un anticuerpo específico {tal
como anticuerpo del receptor anti-EGF); algunos
ejemplos del gen que incluye ácido nucleico son ácidos nucleicos
tales como oligonucleótido antisentido, ADN y ARN; algunos ejemplos
del compuesto de bajo peso molecular, ácido
\varepsilon-aminocaproico, hidrocloruro de
arginina, L-aspartato de potasio, ácido
tranexámico, sulfato de bieomicina, sulfato de vincristina,
cefazolina de sodio, cefalotina de sodio, csticolina, citarabina,
sulfato de gentamicina, hidrocloruro de vancomicina, sulfato de
canamicina y sulfato de amicacina; algunos ejemplos del sacárido
son sulfato sódico de condroitina, heparina sódica y dextrano
fluorescefna; y algunos ejemplos del compuesto polimérico son
polietilensuifonato de sodio, DIVEMA (copolímero de divinil éter
con anhídrido maleico) y SMANCS (producto unido de un copolímero de
anhídrido maleico-estireno con
neocarzinostatina).
Algunos ejemplos de sistemas de lípidos son
micelas esféricas, micelas inversas esféricas, micelas con forma de
salchicha, micelas inversas con forma de salchicha, micela con forma
de placa, micela inversa con forma de placa, hexagonal I, hexagonal
II y producto asociado que comprende dos o más moléculas de
lípido.
Algunos ejemplos del lípido que constituye el
liposoma son fosfolípido, gliceroglicolípido, esfingoglicolípido,
colesterol y lípido catiónico, y con preferencia se usa el
fosfolípido. Dicho lípido puede modificarse con un detergente no
iónico tal como Polisorbato 80, Pluronic F68 y monolaurato sorbitano
(por ej., Span 20); detergentes catiónicos tales como cloruro de
benzalconio; detergente aniónico tal como lauril sulfato de sodio;
polisacárido tal como dextrano o uno de sus derivados; un derivado
de polioxietileno tal como alcohol laurílico polioxietilenado y
polietilenglicol (PEG); etc.
Algunos ejemplos del fosfolípido son
fosfolípidos naturales o sintéticos tales como fosfatidilcolina
(fosfatidilcolina de soja, fosfatidilcolina de yema de huevo,
diestearoil fosfatidilcolina, dipalmitoil fosfatidilcolina, etc.),
fosfatidiletanolamina (diestearoil fosfatidiletanolamina,
dipalmitoil fosfatidiletanolamina, etc.), fosfatidilserina, ácido
fosfatídico, fosfatidilglicerol, fosfatidilinositol,
lisofosfatidilcolina, esfingomielina, fosfolípido
polietilenglicolado, lecitina de yema de huevo, lecitina de soja y
fosfolípido hidrogenado.
Algunos ejemplos del gliceroglicolípido son
sulfoxiribosil glicérido, diglicosil diglicérido, digalactosil
diglicérido, galactosil diglicérido y glicosil diglicérido.
Algunos ejemplos del esfingoglicolípido son
galactosil cerebrósido, lactosil cerebrósido y gangliósido.
Algunos ejemplos del lípido catiónico son
1,2-dioleil-3-trimetilamonio
propano (DOTAP), cloruro de
N-(2,3-dioleiloxipropan-1-il)-N,N,N-trimetilamonio
(DOTMA), trifluoroacetato de
2,3-dioleiloxi-N-[2-(esperminacarboxia-
mido)etil]-N,N-dimetil-1-propanaminio (DOSPA), bromuro de 1,2-dimiristiloxipropil-3-dimetilhidroxietil amonio
(DMRIE), bromuro de 1,2-dioleoiloxipropil-3-dietilhidroxietilamonio (DORIE) y 3\beta-[N-(N',N'-dimetilaminoetil)carbamoil]-colesterol (DC-Chol).
mido)etil]-N,N-dimetil-1-propanaminio (DOSPA), bromuro de 1,2-dimiristiloxipropil-3-dimetilhidroxietil amonio
(DMRIE), bromuro de 1,2-dioleoiloxipropil-3-dietilhidroxietilamonio (DORIE) y 3\beta-[N-(N',N'-dimetilaminoetil)carbamoil]-colesterol (DC-Chol).
En el liposoma, esos lípidos se usan, cada uno,
ya sea en forma independiente o en conjunto. Cuando se usan en
conjunto, los lípidos usados son, por ejemplo, lípidos que
comprenden por lo menos dos componentes seleccionados de
fosfatidilcolina de soja hidrogenada, fosfolípido
polietilenglicolado y colesterol; lípidos que comprenden por lo
menos dos componentes seleccionados de distearoil fosfatidilcolina,
fosfolípido polietilenglicosilado y colesterol; lípidos que
comprenden fosfatidilcolina de yema de huevo y DOTAR; lípidos que
comprenden fosfatidilcolina de yema de huevo, DOTAP y fosfolípido
polietilenglicosilado; lípidos que comprenden fosfatidilcolina de
yema de huevo, DOTAP, colesterol y fosfolípido
polietilenglicosilado; etc.
Además, en la preparación del liposoma, también
pueden añadirse esterol o similares tales como colesterol como
estabilizador de membrana, tocoferol o similares como antioxidante y
estearilamina, fosfato de dicetilo, gangliósido y lípido catiónico
tal como DOTMA [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84,
7413-7417 (1987)], dioctadecilamidoglicil espermina
(DOGS) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 6982-6986
(1989)], DMRIE o DORIE [Methods, 5, 67-75 (1993)] y
DC-Chol [Biochem. Biophys. Res. Commun., 179,
280-285 (1991)] como sustancia de carga, si es
necesario, junto con el lípido.
No hay limitación particular para las partículas
finas en la emulsión, y sus ejemplos específicos son partículas
finas incluidas en todas las clases de emulsión de aceite en agua y
emulsión agua/aceite/agua tal como una emulsión de grasa, una
emulsión que comprende detergente no iónico y aceite de soja, una
emulsión lipídica y una nano esfera lipídica.
No hay limitación particular para el polímero
natural, y sus ejemplos específicos son albúmina, dextrano,
quitosano, ácido desoxirribonucleico y similares.
No hay limitación particular para la sustancia
polimérica sintética y sus ejemplos específicos son
poli-L-lisina, polsetileneimina,
ácido poliaspártico, un copolímero de estireno con ácido maleico, un
copolímero de isopropilacrilamida con acrilpirrolidona, dendrímero
modificado con PEG, ácido poliláctico, y ácido poliglicósico, ácido
poliláctico polietilenglicolado, sulfato de dextrano y una de sus
sales.
Aquí, la sal incluye sal de metal, sal de
amonio, sal de adición con amina orgánica, sal de adición con
aminoácido, etc. Algunos ejemplos de la sal de metal son sal de
metales alcalinos tal como sal de litio, sal de sodio y sal de
potasio; sal de metales alcalino térreos tal como sal de magnesio y
sal de calcio; sal de aluminio; sal de zinc; etc. Algunos ejemplos
de la sal de amonio son la sal de amonio, sal de tetrametilamonio,
etc.; algunos ejemplos de la sal de adición con amina orgánica son
las sales de adición de morfolina, piperidina, etc.; y algunos
ejemplos de la sal de adición con aminoácidos son sales de adición
de glicina, fenilalanina, ácido aspártico, ácido glutámíco, lisina,
etc.
Algunos ejemplos del coloide metálico son
coloides metálicos que contienen oro, plata, cobre, rodio, sílice,
calcio, aluminio, hierro, indio, cadmio, bario, plomo, etc.
Con respecto al lípido catiónico, pueden
ejemplificarse los mismos que se mencionaron con anterioridad.
Algunos ejemplos del lípido aniónico son
fosfatidilserina, fosfatidilglicerol y fosfatidilinositol.
Algunos ejemplos de la preparación de la
partícula fina son micro esfera, microcápsula, nano cristal y micela
polimérica de nanopartícula lipídica.
Con respecto a las partículas finas, pueden
ejemplificarse preferiblemente aquellas incluidas en el
liposoma.
Con respecto al tamaño de las partículas finas,
uno de sus tamaños promedio de partícula es preferiblemente de
varios nm hasta varias decenas de \mum y, más preferiblemente,
desde 10 nm hasta 1.000 nm.
No hay limitación particular para el derivado
polimérico soluble en agua usadas en la presente invención, y sus
ejemplos son lípido con polietilenglicol tal como
REG-PE,
1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfatidiletanolamina-N-(polietileneglicol
2000) (PEG-DSPE); alquil éter de polietilenglicol;
un derivado de aceite de ricino de polioxietileno tal como aceite
de ricino hidrogenado de polioxietileno 60 y Cremophor EL; un éster
de ácido graso de polietilenglicol sorbitano tal como monooleato de
polioxietilensorbitano (Tween 80); un éster de ácido esteárico de
polietilenglicol; un copolímero de etilenglicol con propilenglicol;
un éster de glicerol; un derivado de polietilenimina; un derivado
de alcohol polivinílico; un derivado de ácido poliacrílico; un
derivado de poliacrilamida; un derivado de dextrano; un derivado de
poliglicerol; un derivado de quitosano; un derivado de
polivinilpirrolidona; un derivado de amida poliaspártica; un
derivado de poli-L-lisina; un
derivado de manano; y un derivado de pululano.
Algunos ejemplos del lípido usado para la
membrana lipídica en la presente invención son fosfolípido,
gliceroglicolípido, esfingoglicolípido, colesterol y lípido
sintético, y preferiblemente se usa en particular el fosfolípido.
Con respecto al fosfolípido, gliceroglicolípido y
esfingoglicolípido, pueden mencionarse los mismos que se
ejemplificaron con anterioridad y, con respecto al lípido sintético,
pueden ejemplificarse fosfatidilcolina adicionada con flúor,
detergente adicionado con flúor y bromuro de dialquilamonio.
Con respecto al procedimiento para la
preparación de una solución acuosa que contiene un disolvente
orgánico polar en el que las partículas finas se dispersan y el
lípido se disuelve para usarse en la presente invención, puede
ejemplificarse un procedimiento en el que partículas finas se
dispersan en una solución acuosa que contiene un disolvente
orgánico polar (líquido A), el lípido se disuelve en un disolvente
orgánico polar o una solución acuosa que contiene un disolvente
orgánico polar que es igual o diferente de la mencionada solución
acuosa que contiene un disolvente orgánico polar (líquido B) y
luego se mezclan el líquido A y el líquido B.
Con respecto al procedimiento para recubrir las
partículas finas con membrana lipídica de acuerdo con la presente
invención, puede ejemplificarse específicamente el siguiente
procedimiento.
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa
1
Las partículas finas se dispersan (suspenden) en
una solución acuosa que contiene un disolvente orgánico polar,
preferiblemente en una solución acuosa que contiene un alcohol tal
como etanol;
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa
2
El lípido que se disuelve en una solución acuosa
que contiene un disolvente orgánico polar que es igual o diferente
de la solución acuosa que contiene el mencionado disolvente orgánico
polar o, preferiblemente en la misma solución acuosa que contiene
el disolvente orgánico polar o en el disolvente orgánico polar se
añade a la suspensión preparada en la etapa 1, seguido de mezclado.
En ese momento, un derivado polimérico soluble en agua puede
añadirse en forma adicional a lo anterior y no hay limitación
particular para la cantidad del derivado polimérico soluble en agua
que se añadirá aquí; y
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa
3
Se agregan pequeñas cantidades de agua a la
solución mixta preparada en la etapa 2, se lleva a cabo diálisis o
el disolvente orgánico polar se evapora para reducir la proporción
del disolvente orgánico polar en la solución mixta por lo cual el
lípido disuelto (lípido y el derivado polimérico soluble en agua, en
el caso del derivado polimérico soluble en agua se añade en la
etapa 2) se acumula sobre la superficies de las partículas finas,
se forma una membrana lipídica sobre la superficie de las partículas
finas y se preparan vesículas cerradas en las cuales las partículas
finas están delimitadas/circunscriptas.
No hay limitación particular para la proporción
del disolvente orgánico polar en la solución acuosa que contiene el
disolvente orgánico polar usado en el procedimiento de la presente
invención en tanto se cumplan las condiciones de que las partículas
finas estén presentes sin disolverse, y que los componentes que
constituyen el recubrimiento de las partículas finas de la membrana
lipídica se disuelva, aunque la proporción varía dependiendo del
disolvente y las partículas finas usadas y el tipo de lípido usado,
es preferiblemente 30% o más y, más preferiblemente, es 60 a 90%.
Además, con respecto a la proporción del disolvente orgánico polar
en la solución mixta luego de reducirse durante la etapa 3
mencionada con anterioridad, no hay limitación particular en tanto
la proporción esté dentro de dicho grado en que el lípido disuelto
(lípido y el derivado polimérico soluble en agua, en caso que se
añada el derivado polimérico soluble en agua en la etapa 2) se
acumula/n sobre la superficie de las partículas finas por lo cual
puede formarse membrana lipídica sobre la superficie de las
partículas finas y, preferiblemente, la concentración del
disolvente orgánico polar en la solución acuosa es 50% o menor.
Aunque la proporción de las partículas finas
usadas en la presente invención respecto de la solución acuosa que
contiene el disolvente orgánico polar o a la preparación obtenida
por el procedimiento de la presente invención no se limita
particularmente en tanto las mencionadas partículas finas puede
recubrirse con la membrana lipídica, es preferiblemente 1 \mug/ml
hasta 1 g/ml o, más preferiblemente, 0,1 a 500 mg/ml.
Aunque la proporción del lípido usada en la
presente invención a la solución acuosa que contiene el disolvente
orgánico polar o a la preparación obtenida por el procedimiento de
la presente invención no se limita particularmente en tanto las
partículas finas puedan recubrirse con éste, es preferiblemente 1
\mug/ml hasta 1 g/ml o, más preferiblemente, 0,1 a 400 mg/ml.
Independientemente del tipo de las partículas
finas usadas, es básicamente posible recubrir las partículas finas
con la membrana lipídica por el mismo procedimiento que se mencionó
con anterioridad.
Con respecto al disolvente orgánico polar y el
lípido usados en la presente invención, pueden usarse los que se
encuentran en el mercado.
Las partículas finas usadas en la presente
invención se encuentran disponibles en el mercado o pueden
fabricarse por procedimientos conocidos.
Por ejemplo, para la fabricación del liposoma
que constituye las partículas finas, puede aplicarse un
procedimiento conocido para la preparación del liposoma. Con
respecto a un procedimiento conocido para la preparación of
liposoma, puede ejemplificarse un procedimiento de preparación de
liposomas descrito por Bangham, et al. [J. Mol. Biol., 13,
238 (1965)], un procedimiento de inyección de etanol [J. Cell.
Biol., 66, 621 (1975)], un procedimiento de prensa Francesa [FEBS
Lett., 99, 210 (1979)], un procedimiento de
congelamiento-descongelamiento [Arch, Biochem.
Biophys., 212, 186 (1981)], un procedimiento de evaporación de fase
reversa [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 4194 (1978)] y un
procedimiento de gradiente de pH (Patente Japonesa No. 2.572.554;
Patente Japonesa No. 2.659.136; etc.).
La mejora en la calidad de la superficie de
liposomas producida por el detergente no iónico, detergente
catiónico, detergente aniónico, polisacárido o uno de sus
derivados, un derivado de polioxietileno, etc. también puede
llevarse a cabo en forma opcional, y también pueden utilizarse como
partículas finas de la presente invención aquellos liposomas en los
cuales la calidad de la superficie se mejora [Stealth Liposomes, ed.
by D, D. Lasic and F. Martín, CRC Press Inc., Florida,
93-102 (1995)].
Con respecto a una solución para suspender el
liposoma en la fabricación de las partículas finas que constituyen
los liposomas, pueden usarse ácido, álcali, varias clases de
tampones, solución salina fisiológica, solución de infusión de
aminoácidos, etc., además de agua. También es posible agregar un
antioxidante tal como ácido cítrico, ácido ascórbico, cisteína y
ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) a una suspensión de
liposomas. Además es posible añadir glicerol, glucosa, cloruro de
sodio, etc. como solución de isotonicidad.
También es posible que un fármaco y el lípido se
disuelvan en un disolvente orgánico tal como etanol, que el
disolvente se evapore de allí, se añada una solución salina
fisiológica, o similares al residuo y que la mezcla se agite y
sacuda para formar el liposoma.
Puede agregarse un derivado polimérico soluble
en agua cuando el fármaco está contenido en el liposoma, cuando se
forma un complejo del liposoma con el medicamento o después de
eso.
No hay limitación particular para un tamaño de
partícula promedio del liposoma y puede seleccionarse libremente a
demanda. Algunos ejemplos de un procedimiento para ajustar el tamaño
de partícula promedio son un procedimiento de extrusión y un
procedimiento en el que se pulveriza un liposoma multilaminar grande
(MLV) en forma mecánica usando Manton-gaulin,
microfluidificadores, etc. [R. H. Muller, S. Benita, B. Bohm (ed.),
"Emulsión and Nanosuspensions for the Formulation of Poorly
Soluble Drugs", High-Pressure Homogenization
Techniques for the Production of Liposome Dispersions: Potential
and Limitations, M. Brandl, 267-294 (1998)
(Scientific Publishers, Stuttgart, Germany)].
Un procedimiento para la formación de un
complejo combinado por dos o más miembros seleccionados de un
fármaco que constituye las partículas finas, sistema lipídico,
liposoma, partículas finas en emulsión, polímero natural, polímero
sintético, coloide metálico, lípido catiónico, lípido aniónico, una
preparación de partículas finas y un derivado polimérico soluble en
agua puede ser un procedimiento en el que el fármaco solo se mezcla
con lípidos, polímeros, etc. en agua y, en ese momento, la etapa de
selección del tamaño de partículas, etapa aséptica, etc. pueden
añadirse adicionalmente si es necesario. También es posible que la
formación del complejo se lleve a cabo en varios disolventes tales
como acetona y éter.
Con respecto a las partículas finas usadas en la
presente invención y/o la membrana lipídica que recubre las
partículas finas obtenidas por la presente invención, es posible que
su superficie se modifique a través de una proteína tal como un
anticuerpo, un sacárido, glicolípido, un aminoácido, un ácido
nucleico y varios compuestos de bajo peso molecular y compuestos
poliméricos, o que dicha sustancia se añada solo a las partículas
finas y/o membrana de lípidos seguido del uso.
Por ejemplo, con el fin de aplicar al blanco, es
posible que la membrana recubierta se someta además a una
modificación de superficie de la membrana lipídica usando una
proteína (incluyendo un anticuerpo), un péptido, un ácido graso,
etc. [Stealth Liposomas, ed. by D. D. Lasic and F. Martín, CRC Press
Inc., Florida, 93-102, (1995)].
Las partículas finas recubiertas con la membrana
lipídica obtenidas por el procedimiento de la presente invención
pueden usarse tal como están, o dependiendo de la finalidad de uso,
condición de conservación, etc., pueden liofilizarse luego de la
incorporación del excipiente tal como manitol, lactosa, trehalosa,
maltosa o glicina. La conservación por congelamiento luego de la
añadidura de un agente conservador de congelamiento tal como
glicerol también es posible. Además, también es posible que la
granulación, secado, etc. se lleven a cabo junto con un excipiente
apropiado para la fabricación de una preparación oral tal como
cápsulas, comprimidos o gránulos.
Las partículas finas recubiertas con la membrana
lipídica obtenidas por el procedimiento de la presente invención
pueden suspenderse usando ácido, álcali, varios buffers, solución
salina fisiológica, solución de transfusión de aminoácidos, etc.
además de agua. También es posible que se añada un antioxidante tal
como ácido cítrico, ácido ascórbico, cisteína o EDTA a una
suspensión de liposomas. Además es posible incorporar glicerol,
glucosa, cloruro de sodio o similares como agente de
isotonicidad.
La preparación obtenida por el procedimiento de
la presente invención se usa generalmente como inyecciones pero
también es posible que se use luego en la fabricación de
preparaciones orales, gotas nasales, soluciones oftálmicas,
preparaciones percutáneas, supositorios, preparaciones para
inhalación o similares.
La preparación obtenida por la presente
invención puede usarse con el objetivo de estabilización del fármaco
en el cuerpo vivo de componentes tales como los componentes de la
sangre o en la sangre o tractos gastrointestinales, reducción de
efectos colaterales, aumento en la propiedad de acumulación a
órganos blanco tal como tumor, mejora en la absorción per os
o a través de la membrana mucosa, etc.
A continuación se mostrarán Ejemplos y Ejemplos
Comparativos de la presente invención.
Se añadió agua destilada (3 ml) a 10 mg de
dextrano fluoresceína aniónica (FD) (fabricada por Molecular
Probes), 60 mg de DOTAP (fabricado por Avanti) y 24 mg de
PEG-DSPE (fabricado por Avanti), seguido de
agitación en un mezclador de vórtex. Se pasó la suspensión, a
temperatura ambiente, a través de un filtro de membrana de
policarbonato de 0,4 \mum durante 20 veces y luego por un filtro
de membrana de policarbonato de 0,1 \mum durante 20 veces y 4 ml
de etanol se añadió a lo anterior. Luego de eso, a esta suspensión
se añadió una solución preparada disolviendo 240 mg de
fosfatidilcolina de yema de huevo (EggPC) y 50 mg de
PEG-DSPE en 1 ml de etanol. Se añadió agua
destilada (92 ml) gradualmente a la suspensión de modo que la
concentración de etanol se ajustó hasta 5% o menos. La suspensión
de liposoma resultante se sometió a una separación ultracentrífuga
(110.000 x g a 25ºC durante 1 hora) y se retiró el sobrenadante
líquido. Se añadió una solución salina con buffer de fosfato (PBS)
a lo anterior y se sometió a re-suspensión para
ajustar la concentración total de lípidos hasta 30 mg/ml, luego de
lo cual se obtuvo una suspensión de liposomas (Preparación 1).
Cuando se midió un tamaño de partícula promedio
del liposoma por medio de una difracción de luz dinámica (DLS) [Un
modelo ELS-800, Otsuka Electronics, Ltd.; de aquí en
adelante se usó el mismo], se encontró que era
134 nm.
134 nm.
\vskip1.000000\baselineskip
Se añadió agua destilada (3 ml) a 10 mg de FD,
60 mg de DOTAP y 24 mg de PEG-DSPE, seguido de
agitación en un mezclador de vórtex. Se pasó la suspensión, a
temperatura ambiente, a través de un filtro de membrana de
poficarbonato de 0,4 \mum durante 20 veces y luego por un filtro
de membrana de policarbonato de 0,1 \mum durante 20 veces y 4 ml
de etanol se añadió a lo anterior. Luego de eso, a esta suspensión
se añadió una solución preparada disolviendo 120 mg de EggPC y 25
mg de PEG-DSPE en 1 ml de etanol. Se añadió agua
destilada (92 ml) gradualmente a esta suspensión de modo que la
concentración de etanol se ajustó hasta 5% o menos. La suspensión
de liposoma resultante se sometió a una separación ultracentrífuga
(110.000 x g a 25ºC durante 1 hora) y se retiró el sobrenadante
líquido. Se añadió PBS a lo anterior y se sometió a
re-suspensión para ajustar la concentración total
de lípidos hasta 30 mg/ml, luego de lo cual se obtuvo una suspensión
de liposomas (Preparación 2).
Cuando se midió un tamaño de partícula promedio
del liposoma por medio de DLS, se encontró que era 179 nm.
\vskip1.000000\baselineskip
Se añadió agua destilada (3 ml) a 10 mg de FD,
60 mg de DOTAP y 24 mg de PEG-DSPE, seguido de
agitación en un mezclador de vórtex. Se pasó la suspensión, a
temperatura ambiente, a través de un filtro de membrana de
policarbonato de 0,4 \mum durante 20 veces y luego por un filtro
de membrana de policarbonato de 0,1 \mum por 20 veces y 4 ml de
etanol se añadió a lo anterior. Luego de eso, a esta suspensión se
añadió una solución preparada disolviendo 60 mg de EggPC y 12,5 mg
de PEG-DSPE en 1 ml de etanol. Se añadió agua
destilada (92 ml) gradualmente a esta suspensión de modo que la
concentración de etanol se ajustó hasta 5% o menos. La suspensión
de liposoma resultante se sometió a una separación ultracentrífuga
(110.000 x g a 25ºC durante 1 hora) y se retiró el sobrenadante
líquido. Se añadió PBS a lo anterior y se sometió a
re-suspensión para ajustar la concentración total
de lípidos hasta 30 mg/ml, luego de lo cual se obtuvo una suspensión
de liposomas (Preparación 3).
Cuando se midió un tamaño de partícula promedio
del liposoma por medio de DLS, se encontró que era 184 nm.
\vskip1.000000\baselineskip
Se añadió agua destilada (3 ml) a 10 mg de FD y
60 mg de DOTAP, seguido de agitación en un mezclador de vórtex. Se
pasó la suspensión, a temperatura ambiente, a través de un filtro de
membrana de policarbonato de 0,4 \mum durante 20 veces y luego
por un filtro de membrana de policarbonato de 0,1 \mum durante 20
veces y 4 ml de etanol se añadió a lo anterior. Luego de eso, a
esta suspensión se añadió una solución preparada disolviendo 240 mg
de EggPC y 74 mg de PEG-DSPE en 1 ml de etanol. Se
añadió agua destilada (92 ml) gradualmente a esta suspensión de
modo que la concentración de etanol se ajustó hasta 5% o menos. La
suspensión de liposoma resultante se sometió a una separación
ultracentrífuga (110.000 x g a 25ºC durante 1 hora) y se retiró el
sobrenadante líquido. Se añadió PBS a lo anterior y se sometió a
re-suspensión para ajustar la concentración total de
lípidos hasta 30 mg/ml, luego de lo cual se obtuvo una suspensión
de liposomas (Preparación 4).
Cuando se midió un tamaño de partícula promedio
del liposoma por medio de DLS, se encontró que era 131 nm.
\vskip1.000000\baselineskip
Se añadió agua destilada (3 ml) a 10 mg de FD y
60 mg de DOTAP, seguido de agitación en un mezclador de vórtex. Se
pasó la suspensión, a temperatura ambiente, a través de un filtro de
membrana de policarbonato de 0,4 \mum durante 20 veces y luego
por un filtro de membrana de policarbonato de 0,1 \mum durante 20
veces y 4 ml de etanol se añadió a lo anterior. Luego de eso, a
esta suspensión se añadió una solución preparada disolviendo 240 mg
de EggPC en 1 ml de etanol. Se añadió agua destilada (92 ml)
gradualmente a esta suspensión de modo que la concentración de
etanol se ajustó hasta 5% o menos. La suspensión de liposoma
resultante se sometió a una separación ultracentrífuga (110.000 x g
a 25ºC durante 1 hora) y se retiró el sobrenadante líquido. Se
añadió PBS a lo anterior y se sometió a
re-suspensión para ajustar la concentración total de
lípidos hasta 30 mg/ml, luego de lo cual se obtuvo una suspensión
de liposomas (Preparación 5).
Cuando se midió un tamaño de partícula promedio
del liposoma por medio de DLS, se encontró que era 458 nm.
\vskip1.000000\baselineskip
Se agregaron agua destilada (1,49 ml) y 0,01 ml
de una solución acuosa de hidróxido de sodio (1 mol/l) a 2,5 mg de
insulina marcada con (FITC) isotiocianato de fluoresceína
(F-Ins), 30 mg de DOTAP y 12 mg de
PEG-DSPE, seguido de agitación en un mezclador de
vórtex. Se pasó la suspensión, a temperatura ambiente, a través de
un filtro de membrana de policarbonato de 0,4 \mum durante 20
veces y luego por un filtro de membrana de policarbonato de 0,1
\mum durante 20 veces y 2 ml de etanol se añadió a lo anterior.
Luego de eso, a esta suspensión se añadió una solución preparada
disolviendo 120 mg de EggPC y 25 mg de PEG-DSPE en
0,5 ml de etanol. Se añadió agua destilada (46 ml) gradualmente a
esta suspensión de modo que la concentración de etanol se ajustó
hasta 5% o menos. La suspensión de liposoma resultante se sometió a
una separación ultracentrífuga (110,000 x g a 25ºC durante 1 hora)
y se retiró el sobrenadante líquido. Se añadió PBS a lo anterior y
se sometió a re-suspensión para ajustar la
concentración total de lípidos hasta 30 mg/ml, luego de lo cual se
obtuvo una suspensión de liposomas (Preparación 6).
Cuando se midió un tamaño de partícula promedio
del liposoma por medio de DLS, se encontró que era 132 nm.
\vskip1.000000\baselineskip
Se llevó a cabo un mezclado para preparar
DOTAP/PEG-DSPE/agua destilada (30 mg/12 mg/ml),
seguido de agitación en un mezclador de vórtex. Se pasó la
suspensión, a temperatura ambiente, a través de un filtro de
membrana de policarbonato de 0,4 \mum durante 20 veces, por un
filtro de membrana de policarbonato de 0,1 \mum durante 20 veces
y adicionalmente un filtro de membrana de policarbonato de 0,05
\mum durante 20 veces. A esta suspensión (0,5 ml) se añadió 0,25
ml de una solución preparada disolviendo fosforotioato unido a
isotiocianato de fluoresceína (F-PS) (fabricado por
Sci Media) en agua destilada para ajustar hasta 15 mg/ml, seguido
del añadido de 1 ml de etanol a lo anterior. A esta suspensión se
añadió en forma adicional 0,25 ml de una solución de
EggPC/PEG-DSPE/etanol (120 mg/25 mg/ml). Se añadió
agua destilada (23 ml) gradualmente a esta suspensión de modo que
la concentración de etanol se ajustó hasta 5% o menos. La suspensión
de liposoma resultante se sometió a una separación ultracentrífuga
(110.000 x g a 25ºC durante 1 hora) y se retiró el sobrenadante
líquido. Se añadió PBS a lo anterior seguido y se sometió a
re-suspensión para ajustar la concentración total de
lípidos hasta 30 mg/ml, luego de lo cual se obtuvo una suspensión
de liposomas. Se disolvió PEG-DSPE (la proporción
de PEG-DSPE a EggPC es 50:120 (peso: peso)) en una
pequeña cantidad de etanol (4% en volumen de la suspensión de
liposomas) seguido de la mezcla con la suspensión de liposomas y
aplicación de calor a 70ºC durante 2 minutos. Se añadió PBS a lo
anterior para ajustar la concentración total de lípidos hasta 30
mg/ml, luego de lo cual se obtuvo una suspensión de liposomas
(Preparación 7).
Cuando se midió un tamaño de partícula promedio
del liposoma por medio de DLS, se encontró que era 111 nm.
\vskip1.000000\baselineskip
Se llevó a cabo un mezclado para preparar
DOTAP/PEG-DSPE/agua destilada (30 mg/12 mg/ml),
seguido de agitación en un mezclador de vórtex. Se pasó la
suspensión, a temperatura ambiente, a través de un filtro de
membrana de policarbonato de 0,4 \mum durante 20 veces, por un
filtro de membrana de policarbonato de 0,1 \mum durante 20 veces
y adicionalmente un filtro de membrana de policarbonato de 0,05
\mum durante 20 veces. A esta suspensión (0,4 ml) se añadió 0,2
ml de una solución preparada disolviendo F-PS en
agua destilada para ajustar hasta 10 mg/ml seguido del añadido de
0,8 ml de etanol a lo anterior. A esta suspensión se añadió en
forma adicional 0,2 ml de una solución de
EggPC/PEG-DSPE/etanol (240 mg/50 mg/ml). Se añadió
agua destilada (18,4 ml) gradualmente a esta suspensión de modo que
la concentración de etanol se ajustó hasta 5% o menos. La
suspensión de liposoma resultante se sometió a una separación
ultracentrífuga (110.000 x g a 25ºC durante 1 hora) y se retiró el
sobrenadante líquido. Se añadió PBS a lo anterior seguido y se
sometió a re-suspensión para ajustar la
concentración total de lípidos. hasta 30 mg/ml, luego de lo cual se
obtuvo una suspensión de liposomas (Preparación 8).
Cuando se midió un tamaño de partícula promedio
del liposoma por medio de DLS, se encontró que era 112 nm.
\vskip1.000000\baselineskip
Se llevó a cabo un mezclado para preparar
DOTAP/PEG-DSPE/agua destilada (30 mg/12 mg/ml),
seguido de agitación en un mezclador de vórtex. Se pasó la
suspensión, a temperatura ambiente, a través de un filtro de
membrana de policarbonato de 0,4 \mum durante 20 veces, por un
filtro de membrana de policarbonato de 0,1 \mum durante 20 veces
y adicionalmente un filtro de membrana de policarbonato de 0,05
\mum durante 20 veces. A esta suspensión (0,4 ml) se añadió 0,2
ml de una solución preparada disolviendo F-PS en
agua destilada para ajustar hasta 15 mg/ml seguido del añadido de
0,8 ml de etanol a lo anterior. A esta suspensión se añadió en
forma adicional 0,2 ml de una solución de
EggPC/PEG-DSPE/etanol (240 mg/50 mg/ml). Se añadió
agua destilada (18,4 ml) gradualmente a esta suspensión de manera
que la concentración de etanol se ajustó hasta 5% o menos. La
suspensión de liposoma resultante se sometió a una separación
ultracentrífuga (110.000 x g a 25ºC durante 1 hora) y se retiró el
sobrenadante líquido. Se añadió PBS a lo anterior y se sometió a
re-suspensión para ajustar la concentración total
de lípidos hasta 30 mg/ml, luego de lo cual se obtuvo una suspensión
de liposomas (Preparación 9).
Cuando se midió un tamaño de partícula promedio
del liposoma por medio de DLS, se encontró que era 137 nm.
\vskip1.000000\baselineskip
Se llevó a cabo un mezclado para preparar
DOTAP/PEG-DSPE/agua destilada (30 mg/12 mg/ml),
seguido de agitación en un mezclador de vórtex. Se pasó la
suspensión, a temperatura ambiente, a través de un filtro de
membrana de policarbonato de 0,4 \mum durante 20 veces, por un
filtro de membrana de policarbonato de 0,1 \mum durante 20 veces
y adicionalmente un filtro de membrana de policarbonato de 0,05
\mum durante 20 veces. A esta suspensión (0,4 ml) se añadió 0,2
ml de una solución preparada disolviendo F-PS en
agua destilada para ajustar hasta 17,5 mg/ml seguido del añadido de
0,8 ml de etanol a lo anterior. A esta suspensión se añadió en
forma adicional 0,2 ml de una solución de
EggPC/PEG-DSPE/etanol (240 mg/50 mg/ml). Se añadió
agua destilada (18,4 ml) gradualmente a esta suspensión de modo que
la concentración de etanol se ajustó hasta 5% o menos. La
suspensión de liposoma resultante se sometió a una separación
ultracentrífuga (110.000 x g a 25ºC durante 1 hora) y se retiró el
sobrenadante líquido. Se añadió PBS a lo anterior y se sometió a
re-suspensión para ajustar la concentración total
de lípidos hasta 30 mg/ml, luego de lo cual se obtuvo una suspensión
de liposomas (Preparación 10).
Cuando se midió un tamaño de partícula promedio
del liposoma por medio de DLS, se encontró que era 132 nm.
\vskip1.000000\baselineskip
Se llevó a cabo un mezclado para preparar
DOTAP/PEG-DSPE/agua destilada (30 mg/12 mg/ml),
seguido de agitación en un mezclador de vórtex. Se pasó la
suspensión, a temperatura ambiente, a través de un filtro de
membrana de policarbonato de 0,4 \mum durante 20 veces, por un
filtro de membrana de policarbonato de 0,1 \mum durante 20 veces
y adicionalmente un filtro de membrana de policarbonato de 0,05
\mum durante 20 veces. A esta suspensión (0,4 ml) se añadió 0,2
ml de una solución preparada disolviendo F-PS en
agua destilada para ajustar hasta 20 mg/ml seguido del añadido de
0,8 ml de etanol a lo anterior. A esta suspensión se añadió en
forma adicional 0,2 ml de una solución de
EggPC/PEG-DSPE/etanol (240 mg/50 mg/ml). Se añadió
agua destilada (18,4 ml) gradualmente a esta suspensión de modo que
la concentración de etanol se ajustó hasta 5% o menos. La
suspensión de liposoma resultante se sometió a una separación
ultracentrífuga (110.000 x g a 25ºC durante 1 hora) y se retiró el
sobrenadante líquido. Se añadió PBS a lo anterior y se sometió a
re-suspensión para ajustar la concentración total
de lípidos hasta 30 mg/ml, luego de lo cual se obtuvo una suspensión
de liposomas (Preparación 11).
Cuando se midió un tamaño de partícula promedio
del liposoma por medio de DLS, se encontró que era 164 nm.
\vskip1.000000\baselineskip
Se llevó a cabo un mezclado para preparar
DOTAP/PEG-DSPE/agua destilada (30 mg/12 mg/ml),
seguido de agitación en un mezclador de vórtex. Se pasó la
suspensión, a temperatura ambiente, a través de un filtro de
membrana de policarbonato de 0,4 \mum durante 20 veces, por un
filtro de membrana de policarbonato de 0,1 \mum durante 20 veces
y adicionalmente por un filtro de membrana de policarbonato de 0,05
\mum durante 20 veces. A esta suspensión (0,25 ml) se añadió
0,125 ml de una solución preparada disolviendo F-PS
en agua destilada para ajustar hasta 15 mg/ml seguido del añadido
de 0,5 ml de etanol a lo anterior. A esta suspensión se añadió en
forma adicional 0,125 ml de una solución de
EggPC/PEG-DSPE/etanol (240 mg/100 mg/ml). Se añadió
agua destilada (11,5 ml) gradualmente a esta suspensión de modo que
la concentración de etanol se ajustó hasta 5% o menos. La
suspensión de liposoma resultante se sometió a una separación
ultracentrífuga (110.000 x g a 25ºC durante 1 hora) y se retiró el
sobrenadante líquido. Se añadió PBS a lo anterior y se sometió a
re-suspensión para ajustar la concentración total
de lípidos hasta 30 mg/ml, luego de lo cual se obtuvo una suspensión
de liposomas (Preparación 12).
Cuando se midió un tamaño de partícula promedio
del liposoma por medio de DLS, se encontró que era 122 nm.
\vskip1.000000\baselineskip
Se llevó a cabo un mezclado para preparar
DOTAP/PEG-DSPE/agua destilada (30 mg/12 mg/ml),
seguido de agitación en un mezclador de vórtex. Se pasó la
suspensión, a temperatura ambiente, a través de un filtro de
membrana de policarbonato de 0,4 \mum durante 20 veces, por un
filtro de membrana de policarbonato de 0,1 \mum durante 20 veces
y adicionalmente un filtro de membrana de policarbonato de 0,05
\mum durante 20 veces. A esta suspensión (0,25 ml) se añadió
0,125 ml de una solución preparada disolviendo F-PS
en agua destilada para ajustar hasta 15 mg/ml seguido del añadido
de 0,5 ml de etanol a lo anterior. A esta suspensión se añadió en
forma adicional 0,125 ml de una solución de
EggPC/PEG-DSPE/etanol (360 mg/150 mg/ml). Se añadió
agua destilada (11,5 ml) gradualmente a esta suspensión de modo que
la concentración de etanol se ajustó hasta 5% o menos. La
suspensión de liposoma resultante se sometió a una separación
ultracentrífuga (110.000 x g a 25ºC durante 1 hora) y se retiró el
sobrenadante líquido. Se añadió PBS a lo anterior y se sometió a
re-suspensión para ajustar la concentración total
de lípidos hasta 30 mg/ml, luego de lo cual se obtuvo una suspensión
de liposomas (Preparación 13).
Cuando se midió un tamaño de partícula promedio
del liposoma por medio de DLS, se encontró que era 165 nm.
\vskip1.000000\baselineskip
Se agitaron y batieron suspensiones de DOTAP (30
mg/ml) y PEG-DSPE (12 mg/ml) en un mezclador de
vórtex. Se pasó la suspensión, a temperatura ambiente, a través de
un filtro de membrana de policarbonato de 0,4 \mum durante 20
veces, por un filtro de membrana de policarbonato de 0,1 \mum
durante 20 veces y adicionalmente por un filtro de membrana de
policarbonato de 0,05 \mum durante 20 veces para dar una
suspensión de liposoma donde el tamaño de partículas era de
aproximadamente 80 nm. Con agitación con el uso de un agitador, 125
ml de una solución acuosa de 15 mg/ml de F-PS se
añadió a 250 \mul de la suspensión seguido del añadido de 0,5 ml
de etanol a lo anterior. A esta suspensión se añadió en forma
adicional 125 \mul de una solución donde 120 mg de EggPC y 25 mg
de aceite de ricino hidrogenado con polioxietileno 60 (fabricado por
NOF CORPORATION) se disolvieron en 1 ml de etanol. Se añadió agua
destilada (11,5 ml) gradualmente a esta suspensión de modo que la
concentración de etanol se ajustó hasta 5% o menos. La suspensión de
liposoma resultante se sometió a una separación ultracentrífuga
(110.000 x g a 25ºC durante 1 hora) y se retiró el sobrenadante
líquido. PBS (40 \mul) se añadió a lo anterior y se sometió a
re-suspensión y diluyendo en forma adicional con
PBS, luego de lo cual se obtuvo una suspensión de liposomas de 3
mg/ml de F-PS. Se disolvió PEG-DSPE
(la proporción de PEG-DSPE a EggPc es de 50:120
(peso: peso)) en una pequeña cantidad (aproximadamente 1/25 en
volumen de la suspensión de liposomas) de etanol. Cada una de la
suspensión de liposomas y la solución etanólica de
PEG-DSPE se calentó a 70ºC durante 2 minutos. Luego
la suspensión de liposomas se añadió a la solución etanólica de
PEG-DSPE y, luego de mezclar, la mezcla se calentó a
70ºC durante 2 minutos y se enfrió con agua. A la suspensión de
liposoma resultante se añadió PBS para diluir de manera tal que la
concentración total de lípidos se ajustó hasta 30 mg/ml, luego de
lo cual se obtuvo una suspensión de liposomas (Preparación 14).
Cuando se midió un tamaño de partícula promedio
del liposoma por medio de DLS, se encontró que era 116 nm.
\vskip1.000000\baselineskip
Se agitaron y se batieron suspensiones de DOTAP
(30 mg/ml) y PEG-DSPE (12 mg/ml) en un mezclador de
vórtex. Se pasó la suspensión, a temperatura ambiente, a través de
un filtro de membrana de policarbonato de 0,4 \mum durante 20
veces, por un filtro de membrana de policarbonato de 0,1 \mum
durante 20 veces y adicionalmente por un filtro de membrana de
policarbonato de 0,05 \mum durante 20 veces para dar una
suspensión de liposoma donde et tamaño de partículas era de
aproximadamente 80 nm. Con agitación con el uso de un agitador, 250
\mul de una solución acuosa de 15 mg/ml de F-PS
se añadió a 500 \mul de la suspensión seguido del añadido de 1 ml
de etanol a lo anterior, A esta suspensión se añadió en forma
adicional 250 \mul de una solución donde 120 mg de EggPC y 25 mg
de Cremophor EL (fabricado por Sigma) se disolvieron en 1 ml de
etanol. Se añadió agua destilada (23 ml) gradualmente a esta
suspensión de modo que la concentración de etanol se ajustó hasta
5% o menos. La suspensión de liposoma resultante se sometió a una
separación ultracentrífuga (110.000 x g a 25ºC durante 1 hora) y se
retiró el sobrenadante líquido. PBS (40 \mul) se añadió a lo
anterior y se sometió a re-suspensión y diluyendo
en forma adicional con PBS, luego de lo cual se obtuvo una
suspensión de liposomas de 3 mg/ml de F-PS. Se
disolvió PEG-DSPE (la proporción de
PEG-DSPE a EggPc es de 50:120 (peso: peso)) en una
pequeña cantidad (aproximadamente 1/25 en volumen de la suspensión
de liposomas) de etanol. Cada una de la suspensión de liposomas y
la solución etanólica de pEG-DSPE se calentó a 70ºC
durante 2 minutos. Luego la suspensión de liposomas se añadió a la
solución etanólica de PEG-DSPE y, luego de mezclar,
la mezcla se calentó a 70ºC durante 2 minutos y se enfrió con agua.
A la suspensión de liposoma resultante se añadió PBS para diluir de
manera tal que la concentración total de lípidos se ajustó hasta 30
mg/ml, luego de lo cual se obtuvo una suspensión de liposomas
(Preparación 15).
Cuando se midió un tamaño de partícula promedio
del liposoma por medio de DLS, se encontró que era 140 nm.
\vskip1.000000\baselineskip
Se agitaron y se batieron suspensiones de DOTAP
(30 mg/ml) y PEG-DSPE (12 mg/ml) en un mezclador de
vórtex. Se pasó la suspensión, a temperatura ambiente, a través de
un filtro de membrana de policarbonato de 0,4 \mum durante 20
veces, por un filtro de membrana de policarbonato de 0,1 \mum
durante 20 veces y adicionalmente por un filtro de membrana de
policarbonato de 0,05 \mum durante 20 veces para dar una
suspensión de liposoma donde el tamaño de partículas era de
aproximadamente 80 nm. Con agitación con el uso de un agitador, 120
\mul de una solución acuosa de 15 mg/ml de F-PS
se añadió a 250 \mul de la suspensión seguido del añadido de 0,5
ml de etanol a lo anterior. A esta suspensión se añadió en forma
adicional 125 \mul de una solución donde 25 mg deTween 80 se
disolvió en 1 ml de una solución etanólica de 120 mg/ml EggPC. Se
añadió agua destilada (11,5 \mul) gradualmente a esta suspensión
de modo que la concentración de etanol se ajustó hasta 5% o menos.
La suspensión de liposoma resultante se sometió a una separación
ultracentrífuga (110.000 x g a 25ºC durante 1 hora) y se retiró el
sobrenadante líquido. PBS (40 ml) se añadió a lo anterior y se
sometió a re-suspensión y diluyendo en forma
adicional con PBS, luego de lo cual se obtuvo una suspensión de
liposomas de 3 mg/ml de F-PS.
PEG-DSPE (proporción de PEG-DSPE a
EggPc es de 50:120 (peso: peso)) se disolvió en una pequeña cantidad
(aproximadamente 1/25 en volumen de la suspensión de liposomas) de
etanol. Cada una de la suspensión de liposomas y la solución
etanólica de PEG-DSPE se calentó a 70ºC durante 2
minutos. Luego la suspensión de liposomas se añadió a la solución
etanólica de PEG-DSPE y, luego de mezclar, la mezcla
se calentó a 70ºC durante 2 minutos y se enfrió con agua. A la
suspensión de liposoma resultante se añadió PBS para diluir de
manera tal que la concentración total de lípidos se ajustó hasta 30
mg/ml, luego de lo cual se obtuvo una suspensión de liposomas
(Preparación 16).
Cuando se midió un tamaño de partícula promedio
del liposoma por medio de DLS, se encontró que era 151 nm.
\vskip1.000000\baselineskip
Se agitaron y se batieron suspensiones de DOTAP
(30 mg/ml) y PEG-DSPE (12 mg/ml) en un mezclador de
vórtex. Se pasó la suspensión, a temperatura ambiente, a través de
un filtro de membrana de policarbonato de 0,4 \mum durante 20
veces, por un filtro de membrana de policarbonato de 0,1 \mum
durante 20 veces y adicionalmente por un filtro de membrana de
policarbonato de 0,05 \mum durante 20 veces para dar una
suspensión de liposoma donde el tamaño de partículas era de
aproximadamente 80 nm. Con agitación con el uso de un agitador, 125
\mul de una solución acuosa de 15 mg/ml de F-PS
se añadió a 250 \mul de la suspensión seguido del añadido de 0,5
ml de etanol a lo anterior. A esta suspensión se añadió en forma
adicional 125 \mul de una solución donde 120 mg de EggPC, 120 mg
de.Span 20 (fabricado por Kanto Kagaku) y 50 mg de
PEG-DSPE se disolvieron in 2 ml de etanol. Se
añadió agua destilada (11,5 ml) gradualmente a esta suspensión de
modo que la concentración de etanol se ajustó hasta 5% o menos. La
suspensión de liposoma resultante se sometió a una separación
ultracentrífuga (110.000 x g a 25ºC durante 1 hora) y se retiró el
sobrenadante líquido. PBS (40 ml) se añadió a lo anterior y se
sometió a re-suspensión y diluyendo en forma
adicional con PBS, luego de lo cual se obtuvo una suspensión de
liposomas de 3 mg/ml de F-PS.
PEG-DSPE (proporción de PEG-DSPE a
EggPc es de 50:120 (peso: peso)) se disolvió en una pequeña
cantidad (aproximadamente 1/25 en volumen de la suspensión de
liposomas) de etanol. Cada una de las suspensiones de liposomas y
la solución etanólica de PEG-DSPE se calentaron a
70ºC durante 2 minutos. Luego la suspensión de liposomas se añadió
a la solución etanólica de PEG-DSPE y, luego de
mezclar, la mezcla se calentó a 70ºC durante 2 minutos y se enfrió
con agua. A la suspensión de liposoma resultante se añadió PBS para
diluir de manera tal que la concentración total de lípidos se ajustó
hasta 30 mg/ml, luego de lo cual se obtuvo una suspensión de
liposomas (Preparación 17).
Cuando se midió un tamaño de partícula promedio
del liposoma por medio de DLS, se encontró que era 131 nm.
\vskip1.000000\baselineskip
Se agitaron y se batieron suspensiones de DOTAP
(30 mg/ml) y PEG-DSPE (12 mg/ml) en un mezclador de
vórtex. Se pasó la suspensión, a temperatura ambiente, a través de
un filtro de membrana de policarbonato de 0,4 \mum durante 20
veces, por un filtro de membrana de policarbonato de 0,1 \mum
durante 20 veces y adicionalmente por un filtro de membrana de
policarbonato de 0,05 \mum durante 20 veces para dar una
suspensión de liposoma donde el tamaño de partículas era de
aproximadamente 80 nm. Con agitación con el uso de un agitador, 250
\mul de una solución acuosa de 15 mg/ml de F-PS
se añadió a 500 \mul de la suspensión seguido del añadido de 1 ml
de etanol a lo anterior. A esta suspensión se añadió en forma
adicional 250 \mul de una solución donde 120 mg de EggPC y 12,5
mg de Cremophor EL (fabricado por Sigma) se disolvieron en 1 ml de
etanol. Se añadió agua destilada (23 ml) gradualmente a esta
suspensión de modo que la concentración de etanol se ajustó hasta
5% o menos. La suspensión de liposoma resultante se sometió a una
separación ultracentrífuga (110.000 x g a 25ºC durante 1 hora) y se
retiró el sobrenadante líquido. PBS (40 ml) se añadió a lo anterior
y se sometió a re-suspensión y diluyendo en forma
adicional con PBS, luego de lo cual se obtuvo una suspensión de
liposomas de 3 mg/ml de F-PS. Se disolvió
PEG-DSPE (la proporción de PEG-DSPE
a EggPc es de 50:120 (peso: peso)) en una pequeña cantidad
(aproximadamente 1/25 en volumen de la suspensión de liposomas) de
etanol. Cada una de las suspensiones de liposomas y la solución
etanólica de PEG-DSPE se calentaron a 70ºC durante 2
minutos. Luego la suspensión de liposomas se añadió a la solución
etanólica de PEG-DSPE y, luego de mezclar, la mezcla
se calentó a 70ºC durante 2 minutos y se enfrió con agua. A la
suspensión de liposoma resultante se añadió PBS para diluir para
ajustar la concentración total de lípidos hasta 30 mg/ml, luego de
lo cual se obtuvo una suspensión de liposomas (Preparación 18).
Cuando se midió un tamaño de partícula promedio
del liposoma por medio de DLS, se encontró que era 133 nm.
\vskip1.000000\baselineskip
A 589 mg de lecitina de yema de huevo (fabricada
por QP CORPORATION) se añadió 11,8 ml de una solución acuosa de
fosfato diácido de potasio de 50 mmol/l, seguido de agitación en un
mezclador de vórtex. Se pasó la suspensión, a temperatura ambiente,
a través de un filtro de membrana de policarbonato de 0,1 \mum
durante 30 veces. La suspensión (40 ml) se mezcló con una solución
mixta que comprende 1 ml de una solución acuosa de 1 mg/ml de
G-CSF (fabricado por Kyowa Hakko; Nartograstim;
mulante G-CSF humano recombinado genéticamente) y 1
ml de una solución acuosa de 2 mg/ml de dextransuifato de sodio
(fabricado por Merck), y el valor de pH de la solución mixta se
ajustó hasta 4 usando soluciones acuosas de ácido clorhídrico de 1
mol/l y 0,1 mol/l (fabricado por Kanto Kagaku). A 500 \mul de
esta solución mixta se agregaron 753 \mul de etanol y luego 80
\mul de una solución etanólica de 50 mg/ml de lecitina de yema de
huevo. Se añadió agua destilada (7 ml) gradualmente a esta
suspensión de modo que la concentración de etanol se ajustó hasta
10% o menos. La suspensión de liposoma resultante se sometió a una
separación ultracentrífuga (146.000 x g a 25ºC durante 1 hora) y se
retiró el sobrenadante líquido. Se añadió agua a lo anterior y se
sometió a re-suspensión para conformar la cantidad
total a 500 \mul, luego de lo cual se obtuvo una suspensión de
liposomas (Preparación 19).
Cuando se midió un tamaño de partícula promedio
del liposoma por medio de DLS, se encontró que era 316 nm.
\vskip1.000000\baselineskip
A 588 mg de lecitina de yema de huevo y 205 mg
de PEG-DSPE se añadió una cantidad apropiada de
etanol a temperatura ambiente para disolverla y luego se evaporó el
etanol, seguido de secado al vacío. Se añadió a lo anterior 11,8 ml
de una solución acuosa de fosfato diácido de potasio de 50 mmol/l
seguido de agitación en un mezclador de vórtex. Se pasó la
suspensión, a temperatura ambiente, a través de un filtro de
membrana de policarbonato de 0,1 \mum durante 30 veces. La
suspensión (40 \mul) se mezcló con una solución mixta que
comprende 1 ml de una solución acuosa de 1 mg/ml de
G-CSF y 1 ml de una solución acuosa de 2 mg/ml de
dextransulfato de sodio, y el valor de pH de la solución mixta se
ajustó hasta 4 usando soluciones acuosas de ácido clorhídrico de 1
mol/l y 0,1 mol/l, A 500 \mul de esta solución mixta se añadió 753
\mul de etanol, y luego 80 \mul de etanol que contiene 50 mg/ml
de lecitina de yema de huevo y 16,7 mg/ml de
PEG-DSPE se añadió a lo anterior. Se añadió agua
destilada (7 ml) gradualmente a esta suspensión de modo que la
concentración de etanol se ajustó hasta 10% o menos. La suspensión
de liposoma resultante se sometió a una separación ultracentrífuga
(146.000 x g a 25ºC durante 1 hora) y se retiró el sobrenadante
líquido. Se añadió agua a lo anterior y se sometió a
re-suspensión para llegar a la cantidad total de 500
\mul, luego de lo cual se obtuvo una suspensión de liposoma
(Preparación 20).
Cuando se midió un tamaño de partícula promedio
del liposoma por medio de DLS, se encontró que era 316 nm.
\vskip1.000000\baselineskip
A 598 mg de lecitina de yema de huevo y 68,8 mg
de éster de ácido graso de sacarosa (fabricado por Mitsubishi
Chemical) se añadió una cantidad apropiada de etanol a temperatura
ambiente para disolverla y luego se evaporó el etanol, seguido de
secado al vacío. 12,0 ml de una solución acuosa de fosfato diácido
de potasio de 50 mmol/l se añadió a lo anterior seguido de
agitación en un mezclador de vórtex. Se pasó la suspensión, a
temperatura ambiente, a través de un filtro de membrana de
policarbonato de 0,1 \mum durante 30 veces. La suspensión (40
\mul) se mezcló con una solución mixta que comprende 1 ml de una
solución acuosa de 1 mg/ml de G-CSF y 1 ml de una
solución acuosa de 2 mg/ml de dextransulfato de sodio, y el valor de
pH de la solución mixta se ajustó hasta 4 con soluciones acuosas de
ácido clorhídrico de 1 mol/l y 0,1 mol/l. A 500 \mul de esta
solución mixta se añadió 753 \mul de etanol, y luego 80 \mul de
etanol donde 50 mg/ml de lecitina de yema de huevo y 4,5 mg/ml de
éster de ácido graso de sacarosa se disolvieron y se añadió a lo
anterior. Se añadió agua destilada (7 ml) gradualmente a esta
suspensión de modo que la concentración de etanol se ajustó hasta
10% o menos. La suspensión de liposoma resultante se sometió a una
separación ultracentrífuga (146.000 x g a 25ºC durante 1 hora) y se
retiró el sobrenadante líquido. Se añadió agua a lo anterior y se
sometió a re-suspensión para conformar la cantidad
total a 500 \mul, luego de lo cual se obtuvo una suspensión de
liposomas (Preparación 21).
Cuando se midió un tamaño de partícula promedio
del liposoma por medio de DLS, se encontró que era 242 nm.
\vskip1.000000\baselineskip
A 150 mg de lecitina de yema de huevo y 60 mg de
PEG-DSPE se añadió 5 ml de agua destilada, seguido
de agitación en un mezclador de vórtex. Se pasó la suspensión, a
temperatura ambiente, a través de un filtro de membrana de
policarbonato de 0,08 \mum durante 20 veces. La suspensión (571
\mul) se mezcló con una solución mixta que comprende 119 \mul
de una solución acuosa de fosfato diácido de potasio que contiene
1,4 mg/ml de G-CSF y 167 ml de una solución acuosa
de 2 mg/ml de dextransulfato de sodio, y el valor de pH de la
solución mixta se ajustó hasta 4 con soluciones acuosas de ácido
clorhídrico de 1 mol/l y 0,1 mol/l, A 0,5 ml de esta solución mixta
se añadió 666 \mul de etanol, y luego 167 \mul de una solución
donde 120 mg de fosfatidilcolina de yema de huevo (EggPC; fabricado
por NOF CORPORATION) y 25 mg de PEG-DSPE se
disolvieron en 1 ml de etanol se añadió a lo anterior. Se añadió
agua destilada (47 ml) gradualmente a esta suspensión de modo que la
concentración de etanol se ajustó hasta 5% o menos. La suspensión
de liposoma resultante se sometió a una separación ultracentrífuga
(146.000 x g a 4ºC durante 1 hora) y se retiró el sobrenadante
líquido. Se añadió agua destilada a lo anterior y se sometió a
re-suspensión, luego de lo cual se obtuvo una
suspensión de liposomas (Preparación 22).
Cuando se midió un tamaño de partícula promedio
del liposoma por medio de DLS, se encontró que era 126 nm.
\vskip1.000000\baselineskip
A 150 mg de lecitina de yema de huevo y 60 mg de
PEG-DSPE se añadió 5 ml de agua destilada seguido de
agitación en un mezclador de vórtex. Se pasó la suspensión, a
temperatura ambiente, a través de un filtro de membrana de
policarbonato de 0,08 \mum durante 20 veces y luego por un filtro
de membrana de policarbonato de 0,03 \mum durante 7 veces. La
suspensión (286 \mul) se mezcló con 286 \mul de una solución
mixta que comprende 119 \mul de una solución acuosa de fosfato
diácido de potasio que contiene 1,4 mg/ml de G-CSF y
167 \mul de una solución acuosa de 2 mg/ml de dextransulfato de
sodio, y el valor de pH de la solución mixta se ajustó hasta 4 con
soluciones acuosas de ácido clorhídrico de 1 mol/l y 0,1 mol/l. A
0,25 ml de esta solución mixta se añadió 333 \mul de etanol, y
luego 84 \mul de una solución donde 120 mg de fosfatidilcolina de
yema de huevo y 25 mg de PEG-DSPE se disolvieron en
1 ml de etanol se añadió a lo anterior. Se añadió agua destilada
(23,5 ml) gradualmente a esta suspensión de modo que la
concentración de etanol se ajustó hasta 5% o menos. La suspensión
de liposoma resultante se sometió a una separación ultracentrífuga
(146.000 x g a 4ºC durante 1 hora) y se retiró el sobrenadante
líquido. Se llevó a cabo la re-suspensión por la
incorporación una solución acuosa de fosfato diácido de potasio,
luego de lo cual se obtuvo una suspensión de liposomas (Preparación
23).
Cuando se midió un tamaño de partícula promedio
del liposoma por medio de DLS, se encontró que era 146 nm.
\vskip1.000000\baselineskip
A 150 mg de lecitina de yema de huevo y 60 mg de
PEG-DSPE se añadió 5 ml de agua destilada seguido de
agitación en un mezclador de vórtex. Se pasó la suspensión, a
temperatura ambiente, a través de un filtro de membrana de
policarbonato de 0,08 \mum durante 20 veces y luego un filtro de
membrana de policarbonato de 0,05 \mum durante 20 veces. La
suspensión (428 \mul) se mezcló con una solución mixta que
comprende 89 \mul de una solución acuosa de fosfato diácido de
potasio que contiene 1,4 mg/ml de G-CSF y 125 \mul
de una solución acuosa de 2 mg/ml de dextransulfato de sodio, y el
valor de pH de la solución mixta se ajustó hasta 4 con soluciones
acuosas de ácido clorhídrico de 1 mol/l y 0,1 mol/l. A 0,5 ml de
esta solución mixta se añadió 666 \mul de etanol, y luego 167
\mul de una solución donde 120 mg de fosfatidilcolina de yema de
huevo y 25 mg de PEG-DSPE se disolvieron en 1 ml de
etanol se añadió a lo anterior. Se añadió agua destilada (47 ml)
gradualmente a esta suspensión de modo que la concentración de
etanol se ajustó hasta 5% o menos. La suspensión de liposoma
resultante se sometió a una separación ultracentrífuga (146.000 x g
a 4ºC durante 1 hora) y se retiró el sobrenadante líquido. Se llevó
a cabo ta re-suspensión por la incorporación de una
solución
acuosa de fosfato diácido de potasio, luego de lo cual se obtuvo una suspensión de liposomas (Preparación 24).
acuosa de fosfato diácido de potasio, luego de lo cual se obtuvo una suspensión de liposomas (Preparación 24).
Cuando se midió un tamaño de partícula promedio
del liposoma por medio de DLS, se encontró que era 134 nm.
\vskip1.000000\baselineskip
A 150 mg de lecitina de yema de huevo y 60 mg de
PEG-DSPE se añadió 5 ml de agua destilada, seguido
de agitación en un mezclador de vórtex. Se pasó la suspensión, a
temperatura ambiente, a través de un filtro de membrana de
policarbonato de 0,08 \mum durante 20 veces y luego por un filtro
de membrana de policarbonato de 0,05 \mum durante 20 veces. La
suspensión (500 \mul) se mezcló con una solución mixta que
comprende 20 \mul de una solución de PBS que contiene 1.000.000
unidades/ml de interferón \alpha-2b (fabricado por
Research Diagnostics), 150 \mul de una solución acuosa de 2 mg/ml
de dextransulfato de sodio y 80 \mul de agua destilada, y el
valor de pH de la solución mixta se ajustó hasta 4 con soluciones
acuosas de ácido clorhídrico de 1 mol/l y 0,1 mol/l. A 0,5 ml de
esta solución mixta se añadió 666 \mul de etanol, y luego 167
\mul de una solución donde 120 mg de fosfatidilcolina de yema de
huevo y 25 mg de PEG-DSPE se disolvieron en 1 ml de
etanol se añadió a lo anterior. Se añadió agua destilada (47 ml)
gradualmente a esta suspensión de modo que la concentración de
etanol se ajustó hasta 5% o menos. La suspensión de liposoma
resultante se sometió a una separación ultracentrífuga (146.000 x g
a 4ºC durante 1 hora) y se retiró el sobrenadante líquido. Se llevó
a cabo la re-suspensión por la incorporación una
solución acuosa de fosfato diácido de potasio, luego de lo cual se
obtuvo una suspensión de liposomas (Preparación 25).
Cuando se midió el tamaño promedio de partícula
del liposoma por medio de DLS, se encontró que era 164 nm.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo Comparativo
1
Se disolvieron EggPC (215 mg), 61 mg de DOTAP y
54 mg de colesterol (Col) en cloroformo y el disolvente se evaporó
de allí al vacío. A la capa delgada resultante se añadió 5 ml de una
solución acuosa de FD (2 mg/ml). Se pasó la suspensión, a
temperatura ambiente, a través de un filtro de membrana de
policarbonato de 0,4 \mum durante 20 veces y luego por un filtro
de membrana de policarbonato de 0,1 \mum durante 20 veces. Se
añadió PBS a lo anterior para ajustar la concentración total de
lípidos hasta 30 mg/ml, luego de lo cual se obtuvo una suspensión
de liposomas (Preparación a).
Cuando se midió un tamaño promedio de partícula
del liposoma por medio de DLS, se encontró que era 134 nm.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo Comparativo
2
Se disolvieron EggPC (215 mg), 61 mg de DOTAP y
54 mg de Col en cloroformo y el disolvente se evaporó de allí al
vacío. A la capa delgada resultante se añadió 5 ml de una solución
acuosa de FD (2 mg/ml). Se pasó la suspensión, a temperatura
ambiente, a través de un filtro de membrana de policarbonato de 0,4
\mum durante 20 veces y luego por un filtro de membrana de
policarbonato de 0,1 \mum durante 20 veces. Una solución etanólica
de PEG-DSPE con una concentración de 1471 mg/ml
(0,05 ml) se añadió a lo anterior seguido de aplicación de calor a
70ºC durante 5 minutos, luego de lo cual la superficie del liposoma
se recubrió con PEG. Se añadió PBS a lo anterior para ajustar la
concen-
tración total de lípidos hasta 30 mg/ml, luego de lo cual se obtuvo una suspensión de liposomas (Preparación b).
tración total de lípidos hasta 30 mg/ml, luego de lo cual se obtuvo una suspensión de liposomas (Preparación b).
Cuando se midió un tamaño promedio de partícula
del liposoma por medio de DLS, se encontró que era 143 nm.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo Comparativo
3
Se disolvieron fosfatidilcolina de soja
hidrogenada (HSPC) (300 mg), 100 mg de Col y 100 mg de
PEG-DSPE en cloroformo y el disolvente se evaporó
de allí al vacío. A la capa delgada resultante se añadió 8 ml de una
solución acuosa de FD (18,8 mg/ml). Se pasó la suspensión, a 70ºC,
a través de un filtro de membrana de policarbonato de 0,4 \mum
durante 4 veces y luego por un filtro de membrana de policarbonato
de 0,1 \mum durante 10 veces. La suspensión de liposoma
resultante se sometió a una separación ultracentrífuga (110.000 x g
a 25ºC durante 1 hora) y se retiró el sobrenadante líquido. Se llevó
a cabo la re-suspensión por la incorporación de PBS
a lo anterior para ajustar la concentración total de lípidos hasta
30 mg/ml, luego de lo cual se obtuvo una suspensión de liposomas
(Preparación c).
Cuando se midió un tamaño de partícula promedio
del liposoma por medio de DLS, se encontró que era 149 nm.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo Comparativo
4
Se disolvieron EggPC (215 mg), 61 mg de DOTAP y
54 mg de Col en cloroformo y el disolvente se evaporó de allí al
vacío. A la capa delgada resultante se agregaron 5 ml de una
solución acuosa de FD (2 mg/ml). Se pasó la suspensión, a
temperatura ambiente, a través de un filtro de membrana de
policarbonato de 0,4 \mum durante 20 veces y luego por un filtro
de membrana de policarbonato de 0,1 \mum durante 20 veces. La
suspensión de liposoma resultante se sometió a una separación
ultracentrífuga (110.000 x g a 25ºC durante 1 hora) y se retiró el
sobrenadante líquido. Se llevó a cabo la
re-suspensión por la incorporación de PBS a lo
anterior para ajustar la concentración total de lípidos hasta 30
mg/ml, luego de lo cual se obtuvo una suspensión de liposomas
(Preparación d).
Cuando se midió un tamaño promedio de partícula
del liposoma por medio de DLS, se encontró que era 141 nm.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo Comparativo
5
Se disolvieron EggPC (215 mg), 61 mg de DOTAP y
54 mg de Col en cloroformo y el disolvente se evaporó de allí al
vacío. A la capa delgada resultante se añadió 5 ml de una solución
acuosa de FD (2 mg/ml). Se pasó la suspensión, a temperatura
ambiente, a través de un filtro de membrana de policarbonato de 0,4
\mum durante 20 veces y luego por un filtro de membrana de
policarbonato de 0,1 \mum durante 20 veces. Una solución etanólica
de PEG-DSPE con una concentración de 1471 mg/ml
(0,05 ml) se añadió a lo anterior seguido de aplicación de calor a
70ºC durante 5 minutos, luego de lo cual la superficie del liposoma
se recubrió con PEG. La suspensión de liposoma resultante se
sometió a una separación ultracentrífuga (110.000 x g a 25ºC durante
1 hora) y se retiró el sobrenadante líquido. Se llevó a cabo la
re-suspensión por la incorporación de PBS a lo
anterior para ajustar la concentración total de lípidos hasta 30
mg/ml, luego de lo cual se obtuvo una suspensión de liposomas
(Preparación e).
Cuando se midió un tamaño de partícula promedio
del liposoma por medio de DLS, se encontró que era 139 nm.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo Comparativo
6
Se disolvió F-PS en PBS luego de
lo cual se obtuvo una solución de F-PS (Preparación
f).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo Comparativo
7
Se llevó a cabo un mezclado para preparar
DOTAP/PEG-DSPE/agua destilada (30 mg/12 mg/ml),
seguido de agitación por un mezclador de vórtex. Se pasó la
suspensión, a temperatura ambiente, a través de un filtro de
membrana de policarbonato de 0,4 \mum durante 20 veces, por un
filtro de membrana de policarbonato de 0,1 \mum durante 20 veces
y un filtro de membrana de policarbonato de 0,05 \mum durante 20
veces. A 0,5 ml de la suspensión se añadió 0,25 ml de una solución
acuosa donde F-PS se disolvió en agua destilada en
una cantidad de 15 mg/ml, luego de lo cual se obtuvo una suspensión
de liposomas (Preparación g) en la cual la concentración total de
lípidos fue de 28 mg/ml.
Cuando se midió un tamaño promedio de partícula
del liposoma por medio de DLS, se encontró que era 108 nm.
Ahora, se ilustrarán las ventajas de la presente
invención a través de los siguientes Ejemplos de Prueba.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo de Prueba
1
Las preparaciones 1 a 5 preparadas en los
Ejemplos 1 a 5 y las preparaciones a que se prepararon en los
Ejemplos Comparativos 1 a 5 se sometieron a una separación
ultracentrífuga (110.000 x g a 25ºC durante 1 hora). Con el fin de
determinar la cantidad del FD en cada preparación y el FD en el
líquido sobrenadante luego de la separación ultra centrífuga,
intensidad fluorescente a una longitud de onda de excitación de 485
nm y longitud de onda de fluorescencia de 530 nm se midió usando
una lectora de microplacas fluorescentes. Además, la
fosfatidilcolina (PC) en liposoma de cada preparación se cuantificó
por medio de un procedimiento enzimático usando un Test de
Fosfolípidos C Wako (fabricado por Wako Puré Chemical). Se calculó
la concentración total de lípidos sobre la base de ta concentración
de PC en vista de una tasa de inducción. La eficiencia de contención
de FD en liposoma por lípido y la proporción de contención por
separación centrífuga se calcularon con aplicación de las siguientes
expresiones
(1) y (2).
(1) y (2).
(1)Eficiencia
de contención por lípido (mg FD/mg total de lípidos) = (A^{1} -
C^{1})/B^{1}
en la
que
A^{1}: cantidad de FD en cada preparación
(mg/ml)
B^{1}: cantidad total de lípidos en cada
preparación (mg/ml)
C^{1}: cantidad de FD en el líquido
sobrenadante (mg/ml)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2)Relación de
Contención por Separación Ultracentrífuga (%) = [(A^{1} - C^{1}) +
B^{1}]/(D^{1} + E^{1}) \ x \
100
en la
que
A^{1}: cantidad de FD en cada preparación
(mg/ml)
B^{1}: cantidad total de lípidos en cada
preparación (mg/ml)
C^{1}: cantidad de FD en el líquido
sobrenadante (mg/ml)
D^{1}: tasa de inducción de FD (mg/ml) en los
Ejemplos 1 a 5 o en los Ejemplos Comparativos 1 a 5
E^{1}: tasa de inducción de total de lípidos
(mg/ml) en los Ejemplos 1 a 5 o en los Ejemplos Comparativos 1 a
5.
\vskip1.000000\baselineskip
El resultado se muestra en la Tabla 1 y Tabla
2.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La Tabla 1 muestra que los liposomas de las
preparaciones 1 a 5 tienen alta eficiencia de contención al igual
que aquellas de las preparaciones a y c, sin embargo la (cantidad de
FD)/(cantidad total de lípidos) en la etapa de inducción no se
tiene en cuenta. Las cantidades de inducción en la fabricación de
las preparaciones 1 a 5 y las preparaciones a hasta e son
diferentes y, dado que se usa una gran cantidad de FD para el lípido
para la fabricación particularmente en el caso de la preparación c,
puede decirse que los liposomas de las preparaciones 1 a 5 y la
preparación a son el liposoma donde la cantidad de FD para la
cantidad total de lípidos es significativa cuando la tasa de
inducción se tiene en cuenta.
La Relación de Contención como se muestra en la
Tabla 2 es el porcentaje obtenido dividiendo el resultado de Tabla
1 por (cantidad de FD)/(cantidad total de lípidos) en la etapa de
inducción, y refleja la (cantidad de FD)/(cantidad total de
lípidos) en la etapa de inducción. La Tabla 2 muestra que Relación
de Contención de FD es alta en los liposomas de las preparaciones 1
a 5 y a, mientras que la Relación de Contención es baja en los
liposomas de las preparaciones b a e. Esto significa que, en los
liposomas de las preparaciones b a e, hay mucho FD libre que no
está contenido y, durante el proceso de preparación para la Relación
de Contención, el FD libre se elimina. A partir del resultado, se
entiende que, en el FD de inducción, una cantidad del FD que se
incluye en el liposoma o se une levemente a (electrostáticamente
adsorbido con) la superficie del liposoma es pequeña y el FD
efectivamente utilizado es pequeño en las preparaciones b a e.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo de Prueba
2
Se añadió PBS (1,98 ml) a y se mezcló con cada
uno de 0,02 ml de las preparaciones 1 a 5 fabricadas en los
Ejemplos 1 a 5 y las preparaciones a hasta e fabricadas en los
Ejemplos Comparativos 1 a 5, luego de lo cual se produjo una
solución muestra. Inmediatamente después de mezclar, 0,5 ml de la
solución de muestra se sometió a filtración con gel (Sepharose
CL-4B: 0 10 mm x 20 cm; fase móvil: PBS; cantidad
de la muestra agregada: 2 ml; cantidad de fracción recolectada:
aproximadamente 2 ml). Se separaron la fracción de liposoma y una
fracción del componente que no se contiene en el liposoma y la
intensidad de fluorescencia del eluato se midió de igual modo que
en el Ejemplo de Prueba 1. La Relación de Contención por la
filtración con gel se calculó por aplicación de la
fórmula (3).
fórmula (3).
\vskip1.000000\baselineskip
(3)Relación de
Contención (%) por la filtración con gel = [F^{1}/F^{1} + G^{1})] \
x \
100
en la
que
F^{1}: cantidad de FD en la fracción de
liposoma (mg)
G^{1}: cantidad de FD en la fracción del
componente que no se contiene en el liposoma (mg)
\newpage
El resultado se muestra en la Tabla 3.
\vskip1.000000\baselineskip
En la filtración con gel, no sólo se elimina el
FD libre sino también et FD que está levemente unido a (adsorbido
electrostáticamente con) la superficie de liposoma. Además, cuando
la estabilidad de la preparación es escasa, una parte de FD
existente en la fase acuosa interna se filtra. La Tabla 3 muestra
que las Relaciones de Contención de liposomas en las preparaciones
1 a 5, c y e son altas. Esto significa que FD está presente en
abundancia en la fase acuosa interna del liposoma. Sin embargo, en
la Tabla 3, (cantidad de FD)/(cantidad de total de lípidos) en la
etapa de inducción no se tiene en cuenta y, en la preparación c, la
fabricación se realiza usando un lote de FD para el lípido, por el
cual la Relación de Contención es naturalmente alta. Por otro lado,
en las preparaciones a, b y d, los valores son bajos y FD no se
incluye sustancialmente en el liposoma, por lo cual puede decirse
que son las preparaciones que tienen poca estabilidad.
La Tabla 2 muestra una propiedad de fabricación,
mientras que la Tabla 3 muestra la estabilidad de liposoma. A
partir de la Tabla 2 y Tabla 3, es obvio que la preparación a tiene
una buena propiedad de fabricación pero no es muy estable y, por el
contrario, las preparaciones c y e son estables pero la propiedad de
fabricación es escasa. Además, es obvio que las preparaciones b y d
tienen escasa propiedad de fabricación y estabilidad, mientras que
las preparaciones 1 a 5 tienen buena propiedad de fabricación y
estabilidad. Eso muestra que FD está sustancialmente contenido
dentro del
liposoma o, en otras palabras, et complejo FD-lípido catiónico esté recubierto con lípido en las preparaciones 1 a 5.
liposoma o, en otras palabras, et complejo FD-lípido catiónico esté recubierto con lípido en las preparaciones 1 a 5.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo de Prueba
3
La preparación 6 preparada en el Ejemplo 6 se
sometió a una separación ultracentrífuga (110.000 x g a 25ºC
durante 1 hora). Con el fin de determinar la cantidad de la
F-Ins en la preparación 6 y la F-Ins
en el líquido sobrenadante luego de la separación ultra centrífuga,
intensidad fluorescente a una longitud de onda de excitación de 485
nm y longitud de onda de fluorescencia de 530 nm se midió usando una
lectora de microplacas fluorescentes. Además, el PC en liposoma de
la preparación se cuantificó por medio de un procedimiento
enzimático usando a Fosfolípido C-Test Wako
(fabricado por Wako Puré Chemical). Se calculó la concentración
total de lípidos sobre la base de la concentración de PC en vista
de una relación de inducción. La eficiencia de contención de
F-Ins en liposoma por lípido y la Relación de
Contención por Separación Ultracentrífuga se calcularon por las
siguientes expresiones (4) y (5).
(4)Eficiencia
de contención por lípido (mg F-Ins/mg total de
lípidos) = (A^{2} -
C^{2})/B^{2}
en la
que
A^{2}: cantidad de F-Ins en la
preparación 6 (mg/ml)
B^{2}: cantidad total de lípidos en la
preparación 6 (mg/ml)
C^{2}: cantidad de F-Ins en el
líquido sobrenadante (mg/ml)
(5)Relación de
Contención por Separación Ultracentrífuga (%) = [(A^{2} - C^{2}) /
B^{2}]/(D^{2} + E^{2}) \ x \
100
en la
que
A^{2}: cantidad de F-Ins en la
preparación 6 (mg/ml)
B^{2}: cantidad total de lípidos en la
preparación 6 (mg/ml)
C^{2}: cantidad de F-Ins en el
líquido sobrenadante (mg/ml)
D^{2}: tasa de inducción de
F-Ins (mg/ml) en el Ejemplo 6
E^{2}: tasa de inducción de total de lípidos
(mg/ml) en el Ejemplo 6.
\vskip1.000000\baselineskip
El resultado se muestra en la Tabla 4 y Tabla
5.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La Tabla 4 muestra que, en la preparación 6, la
eficiencia de contención de F-Ins en el liposoma por
lípido es alta a pesar del hecho de que la cantidad de inducción de
F-Ins por lípido es pequeña.
Con respecto a la Relación de Contención por
Separación Ultracentrífuga, la medición se conduce en tal aspecto
que la F-Ins que se une débilmente a la superficie
del liposoma queda contenida. La Tabla 5 muestra que en el liposoma
de la preparación 6, la Relación de Contención es alta en el
liposoma de la preparación 6 al igual que en los casos de liposomas
de las preparaciones 1 a 5.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo de Prueba
4
Se añadió PBS (1,98 ml) y se mezcló con 0,02 ml
de la preparación 6 fabricada en el Ejemplo 6, luego de lo cual se
produjo una solución muestra. Inmediatamente luego de mezclar, 0,5
ml de la solución muestra se sometió a filtración con gel
(Sepharose CL-4B; \diameter 10 mm x 20 cm; fase
móvil: PBS; cantidad de la muestra agregada: 2 ml; cantidad de
fracción recolectada: aproximadamente 2 ml). La fracción de liposoma
y una fracción del componente que no se contiene en el liposoma se
separaron y la intensidad de fluorescencia del eluato se midió de
igual modo que en el
Ejemplo de Prueba 3. La Relación de Contención por ta filtración con gel se calculó por aplicación de la fórmula (6).
Ejemplo de Prueba 3. La Relación de Contención por ta filtración con gel se calculó por aplicación de la fórmula (6).
(6)Relación de
Contención (%) por la filtración con gel = [F^{2}/(F^{2} + G^{2})]
\ x \
100
en la
que
F^{2}: cantidad de F-Ins en la
fracción de liposoma (mg)
G^{2}: cantidad de F-Ins en la
fracción del componente que no se contiene en el liposoma (mg).
El resultado se muestra en la Tabla 6.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La Relación de Contención por filtración con gel
se mide luego de la eliminación de F-Ins que se une
suavemente a la superficie del liposoma. La Tabla 6 muestra que, en
el caso del liposoma de la preparación 6, la relación de contención
es alta y F-Ins está presente en forma abundante en
la fase acuosa interna del liposoma al igual que en los casos de
las preparaciones 1 a 5. De este modo, puede decirse que la
preparación 6 es una preparación que tiene buena estabilidad donde
F-Ins está sustancialmente incluido en el liposoma,
lo que muestra que un complejo de F-Ins con lípido
está recubierto con lípido.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo de Prueba
5
Las preparaciones 7 a 13 preparadas en los
Ejemplos 7 a 13 se sometieron a una separación ultracentrífuga
(110.000 x g a 25ºC durante 1 hora). Con el fin de determinar la
cantidad de F-PS en cada preparación y el
F-PS en el líquido sobrenadante luego de la
separación ultra centrífuga, intensidad fluorescente a una longitud
de onda de excitación de 485 nm y longitud de onda de fluorescencia
de 530 nm se midió usando una lectora de microplacas fluorescentes.
Además, PC en liposoma de cada preparación se cuantificó por medio
de un procedimiento enzimático usando una prueba Fosfolípido
C-Test Wako (fabricado por Wako Puré Chemical). Se
calculó la concentración total de lípidos sobre la base de la
concentración de PC en vista de una relación de inducción. La
eficiencia de contención de F-PS en liposoma por
lípido y Relación de Contención por Separación Ultracentrífuga se
calcularon a través de las siguientes expresiones (7) y (8).
\vskip1.000000\baselineskip
(7)Eficiencia
de contención por lípido (mg F-PS/mg total de
lípidos) = (A^{3} -
C^{3})/B^{3}
en la
que
A^{3}: cantidad de F-PS en
cada preparación (mg/ml)
B^{3}: cantidad total de lípidos en cada
preparación (mg/ml)
C^{3}: cantidad de F-PS en el
líquido sobrenadante (mg/ml)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(8)Relación de
Contención por Separación Ultracentrífuga (%) = [(A^{3} - C^{3}) /
B^{3}]/(D^{3} + E^{3}) \ x \
100
A^{3}: cantidad de F-PS en
cada preparación (mg/ml)
B^{3}: cantidad total de lípidos en cada
preparación (mg/ml)
C^{3}: cantidad de F-PS en el
líquido sobrenadante (mg/ml)
D^{3}: tasa de inducción (mg/ml) de
F-PS en los Ejemplos 7 a 13
E^{3}; tasa de inducción (mg/ml) del total de
lípidos en los Ejemplos 7 a 13
\newpage
El resultado se muestra en la Tabla 7 y Tabla
8.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La Tabla 7 muestra que, en las preparaciones 7 a
13, la eficiencia de contención de F-PS por lípido
es alta.
En la Relación de Contención por Separación
Ultracentrífuga, la medición se conduce en tal respecto que también
se incluye el F-PS que está unido débilmente a la
superficie del liposoma. La Tabla 8 muestra que los liposomas de
las preparaciones 7 a 13 son liposomas donde la Relación de
Contención de F-PS es alta.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo de Prueba
6
Se añadió PBS (1,98 ml) a y se mezcló con 0,02
ml de las preparaciones 7 a 9, 11 y 12 fabricadas en los Ejemplos 7
a 9, 11 y 12, luego de lo cual se produjo una solución de muestra.
Inmediatamente luego de mezclar, se sometió 0,5 ml de la solución
de muestra a filtración con gel (Sepharose CL-4B; Ø
10 mm x 20 cm; fase móvil: PBS; cantidad de la muestra agregada: 2
ml; cantidad de fracción recolectada: aproximadamente 2 ml). La
fracción de liposoma y una fracción del componente que no se
contiene en el liposoma se separaron y la intensidad de
fluorescencia del eluato se midió por el mismo modo que en el
Ejemplo de Prueba 5. La Relación de Contención por la filtración
con gel se calculó por aplicación de la fórmula (9).
(9)Relación de
Contención (%) por la filtración con gel = [F^{3}/(F^{3} + G^{3})]
\ x \
100
\newpage
en la
que
F^{3}: cantidad de F-PS en la
fracción de liposoma (mg)
G^{3}: cantidad de F-PS en la
fracción del componente que no se contiene en el liposoma (mg).
\vskip1.000000\baselineskip
El resultado se muestra en la Tabla 9.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La Relación de Contención por filtración con gel
se midió luego de la eliminación de F-PS que se unió
levemente a la superficie del liposoma. La Tabla 9 muestra que, en
el caso de liposoma de las preparaciones 7 a 9, 11 y 12, la
Relación de Contención es alta y F-PS está presente
en forma abundante en la fase acuosa interna del liposoma. De este
modo, puede decirse que las preparaciones 7 a 9, 11 y 12 son las
preparaciones que tienen buena estabilidad donde
F-PS se incluye sustancialmente en el liposoma, lo
que muestra que un complejo de F-PS con lípido está
recubierto con lípido.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo de Prueba
7
Se realizó la comparación para investigar la
distribución de F-PS a un tumor. Se trasplantó una
sección de tumor de 2 mm cuadrado de célula de cáncer de células
renales Caki-1 humano bajo la piel del cuerpo del
lado derecho de un ratón lampiño de seis semanas de vida (CLEA
Japan) de una cepa BALB/cA Jcl-nu. Luego de 20 días
a partir del trasplante, se agruparon los ratones en los cuales el
volumen del tumor alcanzó los 102 a 349 mm^{3} de manera tal que
cada grupo comprendía 3 ratones, y la preparación 7 fabricada en el
Ejemplo 7 y la preparación f fabricada en el Ejemplo Comparativo 6
se administró desde la vena de la cola usando una jeringa (26G; 1
ml; fabricada por Terumo) a la dosis de 25 mg
F-PS/kg. Se extirpó el tumor cada tanto, se
homogeneizó el tumor y se midió la intensidad en el homogenato de
igual modo que en el Ejemplo de Prueba 5. Se evaluó la distribución
de F-PS calculando la cantidad de
F-PS en el tumor (mg/g) en cada momento
predeterminado.
El resultado se muestra en la Fig. 1.
La Fig. 1 muestra que, en los ratones a los
cuales se administró la preparación 7, la cantidad de
F-PS distribuida al tumor aumenta cuando se compara
con el ratón al cual se administró la preparación f.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo de Prueba
8
La preparación 1 fabricada en el Ejemplo 1 se
sometió a una observación morfológica usando microscopio
electrónico. La preparación se añadió a una solución acuosa al 1%
de molibdato de amonio (ajustado hasta un pH 7,3 usando amoníaco)
para ajustar la concentración total de lípidos hasta 0,5 mg/ml. Esta
se goteó sobre una malla (malla 400; Nisshin EM) a la cual se
adjuntó membrana de colodión y, luego de aproximadamente 1 minuto,
se absorbió el exceso de agua con papal de filtro seguido de
secado. Se hizo una observación usando un microscopio de
transmisión de electrones (tipo H-7000; Hitachi) con
un voltaje de aceleración de 75 kV.
El resultado fue que, en la preparación 1, hubo
una gran cantidad de partículas que tenían partículas cuya forma es
diferente de la de la membrana que rodeaba la parte externa. De este
modo, este resultado muestra que las partículas internas están
recubiertas con una doble capa lipídica.
\newpage
Ejemplo de Prueba
9
La preparación 1 fabricada en el Ejemplo 1 y las
preparaciones a y b fabricada en los Ejemplos Comparativos 1 y 2
se administraron (dosis: correspondientes a 10 mg del total de
lípidos por kg) a ratas CD(SD)IGS macho bajo
anestesia con uretano (peso corporal: 200 a 300 g; un grupo
comprendía 2 o 3 ratas) administrado por la vena femoral. Se
recolectó sangre de la vena yugular cada tanto usando una jeringa
tratada con heparina y se centrifugó (10.000 x g a 4ºC durante 5
minutos). A partir de entonces, la intensidad fluorescente de FD en
el plasma se midió de igual modo que en el Ejemplo de Prueba 1 y se
calculó la concentración de FD.
El resultado se muestra en la Fig. 2.
La Fig. 2 muestra que, en las ratas a las cuales
se administró la preparación 1, el nivel de concentración de FD en
el plasma fue alto comparado con las ratas a las cuales se
administró la preparación a o b. De este modo, se demostró que,
debido al recubrimiento del complejo FD-lípidos con
lípido, se mejora la retención en la sangre.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo de Prueba
10
Las preparaciones 7 a 13 fabricadas en los
Ejemplos 7 a 13 y la preparación f fabricada en el Ejemplo
Comparativo 6 se administraron (dosis: correspondiente a 10 mg del
total de lípidos por kg) a ratas macho CD(SD)IGS (peso
corporal: 200 a 300 g; un grupo formado por 2 ratas) bajo anestesia
con uretano administrado por la vena femoral. Se recolectó sangre
de la vena yugular cada tanto usando una jeringa tratada con
heparina y se centrifugó (10.000 x g a 4ºC durante 5 minutos). A
partir de entonces, se midió la intensidad fluorescente de
F-PS en el plasma de igual modo que en el Ejemplo
de Prueba 5 y se calculó la concentración de F-PS en
el plasma.
El resultado se muestra en la Fig. 3.
La Fig. 3 muestra que, en las ratas a las cuales
se administraron las preparaciones 7 a 13, el nivel de concentración
de F-PS en el plasma fue alto comparado con las
ratas a las cuales se administró la preparación f.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo de Prueba
11
La preparación 7 fabricada en el Ejemplo 7 y las
preparaciones f a g fabricada en los Ejemplos Comparativos 6 a 7
se administraron (dosis: correspondiente a 10 mg de total de lípidos
por kg) a ratones machos BALB/cA Jcl (peso corporal: 20 a 30 g; un
grupo comprendía 2 o 3 ratones) de la vena de la cola. Bajo
anestesia con éter, se recolectó sangre de la vena femoral usando
una jeringa tratada con heparina y se centrifugó (10.000 x g a 4ºC
durante 5 minutos). A partir de entonces, se midió la intensidad de
fluorescencia de F-PS en el plasma del mismo modo
que en el Ejemplo de Prueba 5 y se calculó la concentración de
F-PS en el plasma.
El resultado se muestra en la Fig. 4.
La Fig. 4 muestra que, en los ratones a los
cuales se administraron las preparaciones f a g, el
F-PS desapareció rápidamente del plasma luego de su
administración, mientras que en los ratones a los cuales se
administró la preparación 7, el nivel en la concentración de
F-PS en el plasma fue alto.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo de Prueba
12
Las preparaciones 13 a 18 fabricada en los
Ejemplos 13 a 18 se sometieron a separación ultracentrífuga (110.000
x g a 25ºC durante 1 hora). Con el fin de determinar la cantidad de
F-PS en cada preparación y F-PS en
el líquido sobrenadante luego de la separación ultra centrífuga,
intensidad fluorescente a una longitud de onda de excitación de 485
nm y longitud de onda de fluorescencia de 530 nm se midió usando una
lectora de microplacas fluorescentes. La Relación de Contención de
F-PS a liposoma por Separación Ultracentrífuga se
calculó por la siguiente
expresión (10).
expresión (10).
(10)Relación de
Contención por Separación Ultracentrífuga (%) = [(A^{4} -
B^{4})]/B^{4} \ x \
100
A^{4}: cantidad de F-PS en
cada preparación (mg/ml)
B^{4}: cantidad de F-PS en el
líquido sobrenadante (mg/ml).
\newpage
El resultado se muestra en la Tabla 10.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo de Prueba
13
Se añadió suero fetal bovino (FBS) (7,92 ml) a y
se mezcló con cada una de 0,08 ml de las preparaciones 7 y 14 a 18
fabricadas en los Ejemplos 7 y 14 a 18, luego de lo cual se produjo
una solución de muestra. Inmediatamente después de mezclar (hora 0)
y luego de dejar reposar a 37ºC durante 6 a 168 horas, se tomaron
muestras y 0,5 ml de cada una de las soluciones de muestras se
sometió a filtración con gel (Sepharose CL-4B; 0 10
mm x 20 cm; fase móvil: PBS; cantidad de muestra añadida: 2 ml;
cantidad de fracción recolectada: aproximadamente 2 ml). Se
separaron la fracción de liposoma y una fracción del componente que
no se incluyó en el liposoma. Con el fin de cuantificar
F-PS en cada fracción, se midió la intensidad de
fluorescencia a una longitud de onda de excitación de 485 nm y
longitud de onda de fluorescencia de 530 nm usando una lectora de
microplacas fluorescentes. Se calculó la cantidad de
F-PS que se filtró del liposoma con el uso de la
expresión (11).
(11)Cantidad de
F-PS filtrada (%) = [B^{5}/(A^{5} + B^{5})] \ x \
100
A^{5}: cantidad de F-PS en la
fracción de liposoma (mg)
B^{5}: cantidad de F-PS en el
componente que no se contiene en el liposoma (mg).
\vskip1.000000\baselineskip
El resultado se muestra en la Tabla 11.
La Tabla 11 muestra que el F-PS
en las preparaciones 7 y 14 a 18 se filtra del liposoma con el
transcurso del tiempo. De este modo, cuando las partículas finas se
recubren con membrana lipídica usando el procedimiento de la
presente invención, las partículas finas de un medicamento o
similares contenidas en la membrana lipídica se filtran luego de
acumularse en el sitio blanco en el cuerpo, luego de lo cual ahora
es posible el logro de un efecto farmacéutico prolongado.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo de Prueba
14
Se llevó a cabo la filtración con gel de las
preparaciones 19 a 21 fabricada en los Ejemplos 19 a 21. Se usó una
suspensión de liposomas (0,5 ml) como solución de muestra y se
añadió a una columna de filtración con gel (Sepharose
CL-4B; \diameter 10 mm x 20 cm; fase móvil: PBS;
cantidad de la muestra agregada: 0,5 ml; cantidad de la fracción
recolectada: aproximadamente 1,5 ml). Se separaron la fracción de
liposomas y la fracción de G-CSF libre, y cada uno
de estos se concentró por medio de evaporación centrífuga. Se añadió
agua destilada a la fracción de liposoma concentrada para llevar el
volumen total a 2 ml. A 200 \mul de la suspensión de liposomas se
agregaron 50 \mul de un buffer fosfato 50 mmol/l de pH 7 que
contiene 10% de lauril sulfato de sodio y 150 \mul de agua
destilada, seguido de agitación. Además, se añadió 400 \mul de
2-propanol a lo anterior seguido de agitación de
manera que el liposoma se destruyó completamente, y luego 800 \mul
de la siguiente fase móvil I se añadió a lo anterior y se mezcló.
Se llevó a cabo una separación centrífuga (10.000 x g durante 5
minutos) y el sobrenadante líquido se sometió a un análisis por
HPLC. A la fracción de G-CSF libre concentrada se
agregaron una solución acuosa al 50% de acetonitrilo que contiene 2%
de Pluronic F 127 (fabricado por Sigma) y 0,5% de ácido
trifluoroacético (TFA) para hacer el volumen total igual a 5 ml,
que luego se sometió a análisis por HPLC.
- Columna:
- YMCpack ODS-AM, Ø 6,0 mm x 15 cm
- Fase móvil:
- I acetonitrilo al 50% que contiene 0,5% de TFA
- \quad
- II acetonitrilo al 80% que contiene 0,5% de TFA
\vskip1.000000\baselineskip
La proporción del líquido II luego del inicio
del análisis se fijó en 0% durante 0 a 5 minuto(s), aumentó
en forma lineal entre de 0% y 100% durante 5 a 35 minutos y se llevó
a 100% durante el lapso de 35 a 45 minutos.
Detección: 280 nm
Temperatura para análisis: 30ºC
Caudal de flujo: 1 ml/minuto
Cantidad inyectada: 200 \mul
La Relación de Contención de
G-CSF incluida en cada liposoma se calculó a través
de la expresión (12).
(12)Relación de
Contención (%) = A^{6}/(A^{6} + B^{6}) \ x \
100
A^{6}: cantidad de G-CSF en la
fracción de liposoma (\mug)
B^{6}: cantidad de G-CSF en la
fracción de G-CSF libre (\mug).
\vskip1.000000\baselineskip
El resultado se muestra en la Tabla 12.
La Tabla 12 muestra que las preparaciones 19 a
21 son aquellas en las cuales no hay G-CSF libre
separado por filtración con gel.
\vskip1.000000\baselineskip
La Fig. 1 muestra la cantidad de
F-PS distribuido al tumor. La abscisa muestra el
tiempo (hora(s)) luego de la administración de la
preparación, mientras que la ordenada muestra la cantidad de
F-PS en el tumor.
La Fig. 2 muestra la concentración de FD in
plasma. La abscisa muestra el tiempo (hora(s)) luego de la
administración de la preparación, mientras que la ordenada muestra
la concentración de FD en el plasma.
La Fig. 3 muestra la concentración de
F-PS en el plasma. La abscisa muestra el tiempo
(hora(s)) luego de la administración de la preparación,
mientras que la ordenada muestra la concentración de
F-PS en el plasma.
La Fig. 4 muestra la concentración de
F-PS en el plasma. La abscisa muestra el tiempo
(hora(s)) luego de la administración de la preparación,
mientras que la ordenada muestra la concentración de
F-PS en el plasma.
Los símbolos usados en la Fig. 1 a la Fig. 4
tienen los siguientes significados.
Fig.
1
- - \bullet -:
- grupo en el que se administró la preparación 7
- - \medcirc -:
- grupo en el que se administró la preparación f
\vskip1.000000\baselineskip
Fig.
2
- - \bullet -:
- grupo en el que se administró la preparación 1
- - \lozenge -:
- grupo en el que se administró la preparación a
- - \Delta -:
- grupo en el que se administró la preparación b
\vskip1.000000\baselineskip
Fig.
3
- - \bullet -:
- grupo en el que se administró la preparación 7
- - \lozenge -:
- grupo en el que se administró la preparación 8
- - \blacklozenge -:
- grupo en el que se administró la preparación 9
- - \Delta -:
- grupo en el que se administró la preparación 10
- - \ding{115} -:
- grupo en el que se administró la preparación 11
- - \Box -:
- grupo en el que se administró la preparación 12
- - \blacksquare -:
- grupo en el que se administró la preparación 13
- - + -:
- grupo en el que la preparación f se administró
\vskip1.000000\baselineskip
Fig.
4
- - \bullet -:
- grupo en el que se administró la preparación 7
- - + -:
- grupo en el que se administró la preparación f
- - \blacklozenge -:
- grupo en el que se administró la preparación g.
\vskip1.000000\baselineskip
De acuerdo con la presente invención, ahora es
posible el recubrimiento seguro, conveniente y eficiente de
partículas finas con membrana lipídica.
Claims (13)
1. Un procedimiento para recubrir partículas
finas que tienen un tamaño promedio de partículas de 10 nm hasta
1.000 nm y que forman un complejo de fármaco con uno o más
miembro(s) seleccionado(s) de sistema lipídico,
liposoma, partículas finas en emulsión, polímero natural, polímero
sintético, coloide metálico, lípido catiónico, lípido aniónico y
una preparación de partículas finas con membrana lipídica, que
comprende las etapas de:
preparar una solución acuosa que contiene un
disolvente orgánico polar en la que se suspende el complejo y se
disuelve el lípido,
en el que el lípido se selecciona de
fosfolípido, gliceroglicolípido, esfingoglicolípido, colesterol y
lípido sintético, y
el disolvente orgánico polar es uno o más
miembro(s) seleccionado(s) de un alcohol, un glicol y
un políalquilenglicol;
recubrir las partículas finas con la membrana
lipídica formada por el lípido mediante la reducción de la
proporción del disolvente orgánico polar en la solución acuosa
añadiendo agua o por evaporación del disolvente orgánico
polar.
polar.
2. Un procedimiento para recubrir partículas
finas que tienen un tamaño promedio de partículas de 10 nm hasta
1,000 nm y que forman un complejo de fármaco con uno o más
miembro(s) seleccionado(s) de sistema lipídico,
liposoma, partículas finas en emulsión, polímero natural, polímero
sintético, coloide metálico, lípido catiónico, lípido aniónico y
una preparación de partículas finas con membrana lipídica, que
comprende las etapas de:
suspender las partículas finas en una solución
acuosa que contiene un disolvente orgánico polar (líquido A),
en el que el disolvente orgánico polar es uno o
más miembro(s) seleccionado(s) de un alcohol, un
glicol y un polialquilenglicol;
disolver el lípido en un disolvente orgánico
polar o una solución acuosa que contiene un disolvente orgánico
polar que es igual o diferente de la solución acuosa anterior que
contiene un disolvente orgánico polar (líquido B),
en el que el lípido se selecciona de
fosfolípido, gliceroglicolípido, esfingoglicolípido, colesterol y
lípido sintético, y
el disolvente orgánico polar es uno o más
miembro(s) seleccionado(s) de un alcohol, un glicol y
un polialquilenglicol;
mezclar el líquido A y el líquido B para obtener
líquido C; y
recubrir las partículas finas con la membrana
lipídica formada por el lípido mediante la reducción de la
proporción del disolvente orgánico polar en el líquido C añadiendo
agua o por evaporación del disolvente orgánico polar para obtener
el líquido D.
3. El procedimiento para recubrir de acuerdo con
la reivindicación 2, en el que las concentraciones del disolvente
orgánico polar en el líquido A y el líquido B son de 60 a 90%.
4. El procedimiento para recubrir de acuerdo con
la reivindicación 3, en el que la concentración del disolvente
orgánico polar en el líquido D es 50% o menor.
5. El procedimiento para recubrir de acuerdo con
una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que las
partículas finas son aquellas que contienen uno o más
miembro(s) seleccionado(s) de lípido con
polietilenglicol, un alquil éter de polietilenglicol, un derivado
de aceite de ricino con polietilenglicol, un éster de ácido graso
de polietilenglicol sorbitano, estearato de polietilenglicol, un
copolímero de etilenglicol con propilenglicol y un éster de
glicerol.
6. El procedimiento para recubrir de acuerdo con
una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que las
partículas finas son un complejo de un medicamento con lípido
catiónico.
7. El procedimiento para recubrir de acuerdo con
una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que las
partículas finas son un complejo de un medicamento con lípido
aniónico.
8. El procedimiento para recubrir de acuerdo con
una cualquiera de tas reivindicaciones 1 a 5, en el que las
partículas finas son un complejo de un medicamento, fosfolípido que
contiene liposomas y una sal sódica de sulfato de dextrano.
\newpage
9. El procedimiento para recubrir de acuerdo con
una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el fármaco
es un fármaco seleccionado de un péptido, una proteína, un ácido
nucleico, un compuesto de bajo peso molecular, un sacárido y un
compuesto polimérico.
10. El procedimiento para recubrir de acuerdo
con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el
alcohol es etanol.
11. El procedimiento para recubrir de acuerdo
con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que el
glicol es un propilenglicol.
12. El procedimiento para recubrir de acuerdo
con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que el
polialquilenglicol es polietilenglicol.
13. Las partículas finas que pueden obtenerse
por el procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 12.
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