JPWO2006080118A1 - 標的遺伝子の発現を抑制する組成物 - Google Patents

Abstract

本発明は、標的遺伝子の発現を抑制するための組成物等を提供することを目的とし、リード粒子と標的遺伝子のｍＲＮＡの連続する１５〜３０塩基の配列および該配列と相補的な配列を含むＲＮＡを構成成分とする複合粒子および該複合粒子を被覆する脂質膜から構成され、該脂質膜の構成成分が可溶な極性有機溶媒を含む液中に、該脂質膜の構成成分が分散可能で、該複合粒子も分散可能な濃度で該極性有機溶媒を含む液が存在する、該ＲＮＡを封入したリポソームを含有する組成物等を提供する。

Description

本発明は、標的遺伝子の発現を抑制するための組成物等に関する。

標的遺伝子の発現を抑制する方法として、例えばＲＮＡ干渉（ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ、以下、ＲＮＡｉとよぶ）を利用した方法等が知られており、具体的には、線虫において標的とする遺伝子と同一の配列を有する二本鎖ＲＮＡを導入することにより、該標的遺伝子の発現が特異的に抑制される現象が報告されている［“ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）”，１９９８年，第３９１巻，第６６６９号，ｐ．８０６−８１１参照］。また、ショウジョウバエにおいて長い二本鎖ＲＮＡの代わりに、２１〜２３塩基の長さの二本鎖ＲＮＡを導入することによっても、標的遺伝子の発現が抑制されることが見出され、これはｓｈｏｒｔ
ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）と名づけられている（国際公開第０１／７５１６４号パンフレット参照）。

哺乳類細胞では、長い二本鎖ＲＮＡを導入した場合、ウイルス防御機構によりアポトーシスが起こり、特定の遺伝子の発現を抑制することができなかったが、２０〜２９塩基のｓｉＲＮＡであれば、このような反応が起こらず、特定の遺伝子の発現を抑制できることが見出された。中でも２１〜２５塩基のものの発現抑制効果が高い［“ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）”，２００１年，第４１１巻，第６８３６号，ｐ．４９４−４９８、“ネイチャー・レビューズ・ジェネティクス（Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）”，２００２年，第３巻，第１０号，ｐ．７３７−７４７、“モレキュラー・セル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ）”，（米国），２００２年，第１０巻，第３号，ｐ．５４９−５６１、“ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）”，（米国），２００２年，第２０巻，第５号，ｐ．４９７−５００］。また、二本鎖ＲＮＡでなく、分子内ハイブリダイズにより、ヘアピン構造を有する一本鎖ＲＮＡも、ｓｉＲＮＡと同様にＲＮＡｉを示すことが報告されている［“プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステーツ・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）”，２００２年，第９９巻，第９号，ｐ．６０４７−６０５２参照］。

ＲＮＡｉについては、ｉｎ ｖｉｖｏ試験においても多く検証されており、５０塩基対以下のｓｉＲＮＡを用いた胎児の動物での効果（特許文献１参照）および成体マウスでの効果（特許文献２参照）が報告されている。また、ｓｉＲＮＡをマウス胎児に静脈内投与した場合に、腎臓、脾臓、肺、膵臓および肝臓の各臓器で特定の遺伝子の発現抑制効果が確認されている（非特許文献１参照）。さらに、脳細胞においてもｓｉＲＮＡを直接投与することで特定の遺伝子が発現抑制されることが報告されている（非特許文献２参照）。

特許文献１、非特許文献１および２では、局所投与や、ハイドロダイナミック法と呼ばれる大量のｓｉＲＮＡ溶液を一気に注入する方法による全身投与によって、ｉｎ ｖｉｖｏでのｓｉＲＮＡの投与が行われている。ｓｉＲＮＡは血中では不安定であり、血中での分解を避けるために、このような投与方法が選択されているが、局所投与では、投与した近傍にしかｓｉＲＮＡを送達できないため、一般に発現の抑制効率は極めて低く、一方、ハイドロダイナミック法では、一般的に標的組織は肝臓に限定される。

すなわち、標的遺伝子の発現を抑制する目的において、全身投与によって該標的遺伝子の発現を抑制するＲＮＡを標的組織に効率よく送達する方法の開発が求められている。

一方、核酸の細胞内への送達手段として、カチオニックリポソームやカチオニックポリマーを用いる方法が知られている。しかし、該方法では、核酸を含有するカチオニックリポソームやカチオニックポリマーを静脈内に投与後、血中から速やかに核酸が除去されてしまい、標的組織が肝臓や肺以外の場合、例えば腫瘍部位等の場合には核酸を標的組織に送達することができず、十分な作用の発現を可能とするに至っていない。そこで、核酸が血中で速やかに除去されるという問題点を解決した核酸封入リポソーム（リポソーム内に核酸を封入したリポソーム）が報告されている（特許文献３〜５および非特許文献３参照）。特許文献３では、核酸等を含有するリポソームの製造方法として、例えば、カチオン性脂質をクロロホルムに予め溶解し、次いでオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）の水溶液とメタノールを加え混合後、遠心分離することでクロロホルム層にカチオン性脂質／ＯＤＮの複合体を移行させ、さらにクロロホルム層を取り出し、これにポリエチレングリコール化リン脂質と中性の脂質と水を加えて油中水型（Ｗ／Ｏ）エマルジョンを形成し、逆相蒸発法で処理してＯＤＮ内包リポソームを製造する方法が報告され、特許文献４および非特許文献３では、ＯＤＮを、ｐＨ３．８のクエン酸水溶液に溶解し、脂質（エタノール中）を加え、エタノール濃度を２０ｖ／ｖ％まで下げてＯＤＮ内包リポソームを調製し、サイジングろ過し、透析によって、過剰のエタノールを除去した後、試料をさらにｐＨ７．５にて透析してリポソーム表面に付着したＯＤＮを除去してＯＤＮ内包リポソームを製造する方法が報告され、それぞれ核酸等の有効成分を封入したリポソームを製造している。

これらに対して特許文献５では、液体中で微粒子を脂質膜で被覆する方法で核酸等の有効成分を封入したリポソームを製造することが報告されている。該方法においては、微粒子が分散し、かつ脂質が溶解した極性有機溶媒含有水溶液中の極性有機溶媒の割合を減少させることによって、微粒子が脂質膜で被覆されており、液体中において被覆が行われ、例えば静脈注射用微粒子等に好適な大きさの脂質膜で被覆された微粒子（被覆微粒子）が、すぐれた効率で製造されており、また、特許文献５では微粒子の例として例えば水溶性薬物とカチオン脂質からなる静電的相互作用により形成される複合体が例示されている。複合粒子を被覆した被覆微粒子の粒子径は、被覆される複合粒子に応じて異なるが、ＯＤＮ−脂質複合体を被覆して得られた被覆微粒子は、粒子径が小さく、注射剤として使用可能であること、該被覆微粒子は、静脈内に投与した場合、高い血中滞留性を示し、腫瘍組織に多く集積したことが報告されている。
国際公開第０２／１３２７８８号パンフレット 国際公開第０３／１０１８０号パンフレット 特表２００２−５０８７６５号公報 特表２００２−５０１５１１号公報 国際公開第０２／２８３６７号パンフレット "ネイチャー・ジェネティクス（Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）"，２００２年，第３２巻，第１号，ｐ．１０７−１０８ "ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）"，２００２年，第２０巻，第１０号，ｐ．１００６−１０１０ "バイオキミカ・エ・バイオフィジカ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ）"，２００１年，第１５１０巻，ｐ．１５２−１６６

本発明の目的は、標的遺伝子の発現を抑制するための組成物等を提供することにある。

本発明は以下の（１）〜（３７）に関する。
（１）標的遺伝子のｍＲＮＡの連続する１５〜３０塩基の配列および該配列と相補的な配列を含むＲＮＡを封入したリポソームを含有し、該リポソームが標的遺伝子の発現部位を含む組織または臓器に到達するリポソームである、組成物。
（２）リポソームが、静脈内投与可能な大きさのリポソームである、前記（１）記載の組成物。
（３）ＲＮＡが、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を利用した該標的遺伝子の発現抑制作用を有するＲＮＡである、前記（１）または（２）記載の組成物。
（４）標的遺伝子が、腫瘍や炎症に関連する遺伝子である、前記（１）〜（３）のいずれかに記載の組成物。
（５）標的遺伝子が、血管新生に関連する遺伝子である、前記（１）〜（４）のいずれかに記載の組成物。
（６）ｍＲＮＡがＫＬＦ５ ｍＲＮＡである、前記（１）〜（３）のいずれかに記載の組成物。
（７）ｍＲＮＡがヒトまたはマウスのＫＬＦ５ ｍＲＮＡである、前記（１）〜（３）のいずれかに記載の組成物。
（８）ＲＮＡが、ＫＬＦ５ ｍＲＮＡの連続する１５〜３０塩基の配列の鎖および該配列と相補的な配列の鎖からなる二本鎖ＲＮＡのそれぞれの鎖の３’端にヌクレオチドの１種または複数種のあわせて１〜６個が同一または異なって付加した二本鎖ＲＮＡである、前記（６）または（７）記載の組成物。
（９）ＲＮＡが、ＫＬＦ５ ｍＲＮＡの連続する１５〜３０塩基の配列からなるＲＮＡおよび該配列と相補的な配列からなるＲＮＡが、スペーサーオリゴヌクレオチドでつながれ、３’端にヌクレオチドの１種または複数種のあわせて１〜６個が付加した、ヘアピン構造を有するＲＮＡである、前記（６）または（７）記載の組成物。
（１０）ＲＮＡが、以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群から選ばれるＲＮＡである、前記（６）または（７）記載の組成物。
（ａ）配列番号２〜１６のいずれか１つの配列の鎖および該配列と相補的な配列の鎖からなる二本鎖ＲＮＡのそれぞれの鎖の３’端にウリジル酸およびデオキシチミジル酸のいずれか１種または２種あわせて２〜４個が同一または異なって付加した二本鎖ＲＮＡ
（ｂ）配列番号２〜１６のいずれか１つの配列からなるＲＮＡおよび該配列と相補的な配列からなるＲＮＡが２個のウリジル酸またはデオキシチミジル酸を５’端に有するスペーサーオリゴヌクレオチドでつながれ、３’端にウリジル酸およびデオキシチミジル酸のいずれか１種または２種あわせて２〜４個が付加した、ヘアピン構造を有するＲＮＡ
（ｃ）配列番号２〜１１のいずれか１つの配列の鎖および該配列と相補的な配列の鎖からなる二本鎖ＲＮＡのそれぞれの鎖の３’端にウリジル酸２個が付加した二本鎖ＲＮＡ
（１１）ｍＲＮＡがｂｃｌ２ ｍＲＮＡである、前記（１）〜（３）のいずれかに記載の組成物。
（１２）ＲＮＡを封入したリポソームが、リード粒子と該ＲＮＡを構成成分とする複合粒子および該複合粒子を被覆する脂質膜から構成され、
該脂質膜の構成成分が可溶な極性有機溶媒を含む液の中に、該脂質膜の構成成分が分散可能で、該複合粒子も分散可能な濃度で該極性有機溶媒を含む液が存在する、リポソームである、前記（１）〜（１１）に記載の組成物。
（１３）極性有機溶媒がアルコールである、前記（１２）記載の組成物。
（１４）極性有機溶媒がエタノールである、前記（１２）記載の組成物。
（１５）リード粒子が、カチオン性脂質を含むリード粒子であり、脂質膜が、中性脂質および水溶性物質の脂質誘導体、脂肪酸誘導体または脂肪族炭化水素誘導体を構成成分とする、前記（１２）〜（１４）のいずれかに記載の組成物。
（１６）ＲＮＡを封入したリポソームが、カチオン性脂質を含むリード粒子と前記ＲＮＡを構成成分とする複合粒子および該複合粒子を被覆する脂質膜から構成され、
該脂質膜が、中性脂質および水溶性物質の脂質誘導体、脂肪酸誘導体または脂肪族炭化水素誘導体を構成成分とするリポソームである、前記（１）〜（１１）のいずれかに記載の組成物。
（１７）カチオン性脂質がＮ−［１−（２，３−ジオレオイルプロピル）］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル塩化アンモニウム、Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルプロピル）］−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミン、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシプロピル）］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル塩化アンモニウム、Ｎ−［１−（２，３−ジテトラデシルオキシプロピル）］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチル臭化アンモニウムおよび３β−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエチル）カルバモイル］コレステロールから選ばれる一つ以上である、前記（１５）または（１６）記載の組成物。
（１８）水溶性物質の脂質誘導体、脂肪酸誘導体または脂肪族炭化水素誘導体が、ポリエチレングリコール−ホスファチジルエタノールアミンである、前記（１５）〜（１７）のいずれかに記載の組成物。
（１９）中性脂質が卵黄ホスファチジルコリンである、前記（１５）〜（１８）のいずれかに記載の組成物。
（２０）リード粒子と標的遺伝子のｍＲＮＡの連続する１５〜３０塩基の配列および該配列と相補的な配列を含むＲＮＡを構成成分とする複合粒子および該複合粒子を被覆する脂質膜から構成され、
該脂質膜の構成成分が可溶な極性有機溶媒を含む液の中に、該脂質膜の構成成分が分散可能で、該複合粒子も分散可能な濃度で該極性有機溶媒を含む液が存在する、該ＲＮＡを封入したリポソーム。
（２１）極性有機溶媒がアルコールである、前記（２０）記載のリポソーム。
（２２）極性有機溶媒がエタノールである、前記（２０）記載のリポソーム。
（２３）リード粒子が、カチオン性脂質を含むリード粒子であり、脂質膜が、中性脂質および水溶性物質の脂質誘導体、脂肪酸誘導体または脂肪族炭化水素誘導体を構成成分とする、前記（２０）〜（２２）のいずれかに記載のリポソーム。
（２４）カチオン性脂質を含むリード粒子と標的遺伝子のｍＲＮＡの連続する１５〜３０塩基の配列および該配列と相補的な配列を含むＲＮＡとを構成成分とする複合粒子、および該複合粒子を被覆する脂質膜から構成され、
該脂質膜が、中性脂質および水溶性物質の脂質誘導体、脂肪酸誘導体または脂肪族炭化水素誘導体を構成成分とする、該ＲＮＡを封入したリポソーム。
（２５）カチオン性脂質がＮ−［１−（２，３−ジオレオイルプロピル）］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル塩化アンモニウム、Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルプロピル）］−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミン、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシプロピル）］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル塩化アンモニウム、Ｎ−［１−（２，３−ジテトラデシルオキシプロピル）］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチル臭化アンモニウムおよび３β−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエチル）カルバモイル］コレステロールから選ばれる一つ以上である、前記（２３）または（２４）記載のリポソーム。
（２６）水溶性物質の脂質誘導体、脂肪酸誘導体または脂肪族炭化水素誘導体が、ポリエチレングリコール−ホスファチジルエタノールアミンである、前記（２０）〜（２５）のいずれかに記載のリポソーム。
（２７）中性脂質が卵黄ホスファチジルコリンである、前記（２０）〜（２６）のいずれかに記載のリポソーム。
（２８）ＲＮＡが、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を利用した該標的遺伝子の発現抑制作用を有するＲＮＡである、前記（２０）〜（２７）のいずれかに記載のリポソーム。
（２９）標的遺伝子が、腫瘍や炎症に関連する遺伝子である、前記（２０）〜（２８）のいずれかに記載のリポソーム。
（３０）標的遺伝子が、血管新生に関係する遺伝子である、前記（２０）〜（２８）のいずれかに記載のリポソーム。
（３１）ｍＲＮＡがＫＬＦ５ｍＲＮＡである、前記（２０）〜（２８）のいずれかに記載のリポソーム。
（３２）ｍＲＮＡがヒトまたはマウスのＫＬＦ５ ｍＲＮＡである、前記（２０）〜（２８）のいずれかに記載のリポソーム。
（３３）ＲＮＡが、ＫＬＦ５ ｍＲＮＡの連続する１５〜３０塩基の配列の鎖および該配列と相補的な配列の鎖からなる二本鎖ＲＮＡのそれぞれの鎖の３’端にヌクレオチドの１種または複数種あわせて１〜６個が同一または異なって付加した二本鎖ＲＮＡである、前記（３１）または（３２）記載のリポソーム。
（３４）ＲＮＡが、ＫＬＦ５ ｍＲＮＡの連続する１５〜３０塩基の配列からなるＲＮＡおよび該配列と相補的な配列からなるＲＮＡが、スペーサーオリゴヌクレオチドでつながれ、３’端にヌクレオチドの１種または複数種あわせて１〜６個が付加した、ヘアピン構造を有するＲＮＡである、前記（３１）または（３２）記載のリポソーム。
（３５）ＲＮＡが、以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群から選ばれるＲＮＡである、前記（３１）または（３２）記載のリポソーム。
（ａ）配列番号２〜１６のいずれか１つの配列の鎖および該配列と相補的な配列の鎖からなる二本鎖ＲＮＡのそれぞれの鎖の３’端にウリジル酸およびデオキシチミジル酸のいずれか１種または２種あわせて２〜４個が同一または異なって付加した二本鎖ＲＮＡ
（ｂ）配列番号２〜１６のいずれか１つの配列からなるＲＮＡおよび該配列と相補的な配列からなるＲＮＡが２個のウリジル酸またはデオキシチミジル酸を５’端に有するスペーサーオリゴヌクレオチドでつながれ、３’端にウリジル酸およびデオキシチミジル酸のいずれか１種または２種あわせて２〜４個が付加した、ヘアピン構造を有するＲＮＡ
（ｃ）配列番号２〜１１のいずれか１つの配列の鎖および該配列と相補的な配列の鎖からなる二本鎖ＲＮＡのそれぞれの鎖の３’端にウリジル酸２個が付加した二本鎖ＲＮＡ
（３６）ｍＲＮＡがｂｃｌ２ ｍＲＮＡである、前記（２０）〜（２８）のいずれかに記載のリポソーム。
（３７）前記（２０）〜（３６）のいずれかに記載のリポソームを含有する組成物。

本発明の標的遺伝子のｍＲＮＡの連続する１５〜３０塩基の配列および該配列と相補的な配列を含むＲＮＡを封入したリポソームを含有する組成物を、ほ乳類等に投与することにより、該標的遺伝子の発現を抑制することができる。

マウスに植え付けた腫瘍の増殖の経時変化を示す。横軸は時間（時間）、縦軸は腫瘍の大きさ（ｍｍ^３）を表わしている。●は無処理群、○は実施例１で得られた製剤の投与群を表わしている。 担癌マウスの尾静脈から、５０μｇのｓｉＲＮＡを含む製剤（実施例１；図中○、比較例１；図中●）、５０μｇのｓｉＲＮＡを含むｓｉＲＮＡ溶液（比較例２；図中□、比較例３；図中■）および生理食塩水（図中△）を投与したときの腫瘍増殖曲線である。 腫瘍組織切片中に見られたＣＤ３１陽性構造をカウントした結果である。Ｓａｌｉｎｅは生理的食塩水を、Ｓｃ−ｓａｌｉｎｅは比較例３を、ｓｃ−ＷＬは比較例１を、ＫＬＦ５−ｓａｌｉｎｅは比較例２を、ＫＬＦ５−ＷＬは実施例１を投与したマウスの腫瘍でのＣＤ３１陽性構造の数を示している。 腫瘍から抽出したｍＲＮＡの定量的ＰＣＲの分析結果である。Ｓａｌｉｎｅは生理的食塩水を、Ｓｃ−ｓａｌｉｎｅは比較例３を、ｓｃ−ＷＬは比較例１を、ＫＬＦ５−ｓａｌｉｎｅは比較例２を、ＫＬＦ５−ＷＬは実施例１を示している。 腫瘍から抽出したＫＬＦ５の定量結果である。Ｓａｌｉｎｅは生理的食塩水を、Ｓｃ−ｓａｌｉｎｅは比較例３を、ｓｃ−ＷＬは比較例１を、ＫＬＦ５−ｓａｌｉｎｅは比較例２を、ＫＬＦ５−ＷＬは実施例１を示している。 腫瘍近傍に直接ｓｉＲＮＡを投与したときの腫瘍増殖曲線である。△は生理的食塩水投与を、□はｓｃｒａｍｂｌｅ−ｓｉＲＮＡ投与を、○はＫＬＦ５−ｓｉＲＮＡ投与をそれぞれ示す。 マウスに植え付けたＤＵ１４５腫瘍の増殖の経時変化を示す。横軸は時間（日）、縦軸は腫瘍の大きさ（ｍｍ^３）を表わしている。●は無処理群、○は実施例３で得られた製剤の投与群を表わしている。 マウスに植え付けたＰＣ−３腫瘍の増殖の経時変化を示す。横軸は時間（日）、縦軸は腫瘍の大きさ（ｍｍ^３）を表わしている。●は無処理群、○は実施例３、□は比較例４、■は比較例５（ｎａｋｅｄ）で得られた製剤の投与群を表わしている。

本発明における標的遺伝子としては、ほ乳類においてｍＲＮＡを産生して発現する遺伝子であれば特に限定されないが、例えばクルッペル様因子（Ｋｒｕｐｐｅｌ−ｌｉｋｅ ｆａｃｔｏｒ、以下ＫＬＦと略す）遺伝子があげられ、好ましくはＫＬＦ５遺伝子があげられる。ＫＬＦファミリーは、Ｃ末端のジンク・フィンガー（ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ）モチーフを特徴とする、転写因子のファミリーであり、ＫＬＦ１、ＫＬＦ２、ＫＬＦ３、ＫＬＦ４、ＫＬＦ５、ＫＬＦ６、ＫＬＦ７、ＫＬＦ８、ＫＬＦ９、ＫＬＦ１０、ＫＬＦ１１、ＫＬＦ１２、ＫＬＦ１３、ＫＬＦ１４、ＫＬＦ１５、ＫＬＦ１６等が知られている。哺乳類において、ＫＬＦファミリーは、様々な組織や細胞、例えば赤血球、血管内皮細胞、平滑筋、皮膚、リンパ球等の分化に重要であること、また癌、心血管疾患、肝硬変、腎疾患、免疫疾患等の各種疾患の病態形成に重要な役割を果たしていることが報告されている［ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），２００１年，第２７６巻，第３７号，ｐ．３４３５５−３４３５８、ジェノム・バイオロジー（Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ），２００３年，第４巻，第２号，ｐ．２０６］。

ＫＬＦファミリーのうちのＫＬＦ５は、ＢＴＥＢ２（ｂａｓｉｃ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｅｌｅｍｅｎｔ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ２）あるいはＩＫＬＦ（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ−ｅｎｒｉｃｈｅｄ Ｋｒｕｐｐｅｌ−ｌｉｋｅ ｆａｃｔｏｒ）ともよばれる。血管平滑筋におけるＫＬＦ５の発現は、発生段階で制御を受けており、胎児の血管平滑筋では、高い発現を示すのに対し、正常な成人の血管平滑筋では発現が見られなくなる。また、バルーンカテーテルによる削剥後に新生した血管内膜の平滑筋では、ＫＬＦ５の高い発現がみられ、動脈硬化や再狭窄の病変部の平滑筋でもＫＬＦ５の発現がみられる［サーキュレーション（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ），２０００年，第１０２巻，第２０号，ｐ．２５２８−２５３４］。また、標的遺伝子として、例えば、Ｂ−ＣＥＬＬ ＣＬＬ／ＬＹＭＰＨＯＭＡ（以下ｂｃｌと略す）遺伝子があげられ、好ましくはｂｃｌ２遺伝子があげらる。

本発明におけるＲＮＡとしては、前記標的遺伝子のｍＲＮＡの連続する１５〜３０塩基、好ましくは１７〜２５塩基、より好ましくは１９〜２３塩基の配列および該配列と相補的な配列を含んでいるＲＮＡがあげられ、核酸の構造中のリン酸部、エステル部等に含まれる酸素原子等が、例えば硫黄原子等の他の原子に置換された誘導体を包含する。また、本発明におけるＲＮＡとしては、好ましくはＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を利用した該標的遺伝子の発現抑制作用を有するＲＮＡがあげられ、ここではＫＬＦ５遺伝子の発現を抑制するＲＮＡを例にとって、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を利用した標的遺伝子の発現を抑制するＲＮＡについて説明する。他の遺伝子の場合も同様の構造を有し、また同様の操作で得ることができる。

ＫＬＦ５遺伝子の発現を抑制するＲＮＡは、ＫＬＦ５ｍＲＮＡの連続する１５〜３０塩基、好ましくは１７〜２５塩基、より好ましくは１９〜２３塩基の配列（以下配列Ｘとする）および該配列と相補的な配列（以下、相補配列Ｘ’とする）を含んでいる。ＲＮＡとしては、（Ａ）配列Ｘの鎖（センス鎖）および相補配列Ｘ’の鎖（アンチセンス鎖）からなる二本鎖ＲＮＡのそれぞれの鎖の３’端に１〜６個、好ましくは２〜４個のヌクレオチドが同一または異なって付加した二本鎖ＲＮＡ（以下、このような構造のＲＮＡをｓｉＲＮＡとよぶ）であってＫＬＦ５遺伝子の発現を抑制するＲＮＡ、（Ｂ）配列ＸからなるＲＮＡおよび相補配列Ｘ’からなるＲＮＡが、スペーサーオリゴヌクレオチドでつながれ、３’端に１〜６個、好ましくは２〜４個のヌクレオチドが付加した、ヘアピン構造を有するＲＮＡ（以下、このようなＲＮＡをｓｈＲＮＡとよぶ）等があげられる。これらのＲＮＡに付加したヌクレオチドの塩基は、グアニン、アデニン、シトシン、チミンおよびウラシルのいずれか１種または複数種でもよく、またＲＮＡでもＤＮＡでもよいが、ウリジル酸（Ｕ）およびデオキシチミジル酸（ｄＴ）のいずれか１種または２種が好ましい。またスペーサーオリゴヌクレオチドとしては６〜１２塩基のＲＮＡが好ましく、その５’端の配列は２個のＵであるのが好ましい。スペーサーオリゴヌクレオチドの例として、ＵＵＣＡＡＧＡＧＡの配列からなるＲＮＡがあげられる。スペーサーオリゴヌクレオチドによってつながれる２つのＲＮＡの順番はどちらが５’側になってもよい。配列Ｘは、ＫＬＦ５ ｍＲＮＡの連続する１５〜３０塩基の配列、好ましくは１７〜２５塩基、より好ましくは１９〜２３塩基の配列であれば、いずれの配列でもよいが、以下の（Ｉ）に記載の方法で設計した１９塩基の配列が最も好ましい。

上記の構造のＲＮＡは、配列ＸによってＫＬＦ５遺伝子の発現の抑制の強さが異なり、抑制が弱い場合もあるので、配列Ｘとして複数の配列を設計（Ｉ）して、それぞれの配列ＸをもとにしたＲＮＡを調製（ＩＩ）し、ＲＮＡをＫＬＦ５遺伝子が発現している細胞に導入してＫＬＦ５遺伝子の発現を測定（ＩＩＩ）し、ＫＬＦ５遺伝子の発現をより強く抑制するＲＮＡを選択することより、本発明のＲＮＡを取得できる。

（Ｉ）配列Ｘの設計
遺伝子の発現を抑制したい動物のＫＬＦ５ ｃＤＮＡの塩基配列から、ＡＡではじまる２１塩基の部分配列を取り出す。取り出した配列のＧＣ含量を計算し、ＧＣ含量が２０〜８０％、好ましくは３０％〜７０％、より好ましくは４０〜６０％の配列を複数個選択する。

配列としては、好ましくは、コード領域内の配列で、開始コドンから７５塩基以上下流の配列を選択する。ＫＬＦ５ ｃＤＮＡの塩基配列の情報は、ＧｅｎＢａｎｋ等の塩基配列データベースから得ることができる。例えば、マウスＫＬＦ５ ｃＤＮＡの配列はＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００９７６９（配列番号４１）、ヒトＫＬＦ５ ｃＤＮＡの配列はＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ２８７２７２（配列番号４２）で、配列情報が得られる。
選択した配列の５’末端のＡＡを除き、配列中のＴをＵに変えた１９塩基の配列を配列Ｘとする。

（ＩＩ）ＲＮＡの調製
（Ｉ）で選択した配列Ｘを元に、以下のようにしてＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ等）を調製することができる。以下には付加するオリゴヌクレオチドとしてＵおよびｄＴのいずれか１種または２種のあわせて２個の場合を記載するが、他のヌクレオチドの場合も同様にして調製することができる。

（ｉ）ｓｉＲＮＡの場合
配列Ｘの３’端にＵおよびｄＴのいずれか１種または２種あわせて２個が付加した配列からなるＲＮＡ、および相補配列Ｘ’の３’端にＵおよびｄＴのいずれか１種または２種のあわせて２個が付加した配列からなるＲＮＡの２本のＲＮＡを調製する。この２本のＲＮＡは、化学合成またはインビトロ転写により調製できる。化学合成は、ＤＮＡ合成機を用いて行うことができる。またアンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）社、日本バイオサービス株式会社、キアゲン（ＱＩＡＧＥＮ）社等のメーカーに化学合成を依頼することもできる。化学合成した互いに相補的な配列を含む２本のＲＮＡをアニーリングすることにより、配列Ｘの鎖および相補配列Ｘ’の鎖からなる二本鎖ＲＮＡのそれぞれの鎖の３’端にＵおよびｄＴのいずれか１種または２種あわせて２個が同一または異なって付加した二本鎖ＲＮＡを調製することができる。アニーリングは、２本のＲＮＡを適当なバッファー中で９０〜９５℃に１〜５分間加熱後、４５〜６０分間かけて室温にまで冷却することにより行うことができる。

インビトロ転写によるＲＮＡの調製は、以下のようにして行うことができる。まず、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を有するＤＮＡ（Ｔ７プライマー）、相補配列Ｘ’のＵがＴで、その５’端には２個のＡが付加し、３’端にはＴ７プライマーの３’端８塩基と相補的な配列が付加した配列を有するＤＮＡ（ＤＮＡ１）、配列ＸのＵがＴで、その５’端には２個のＡが付加し、３’端にはＴ７プライマーの３’端８塩基と相補的な配列が付加した配列を有するＤＮＡ（ＤＮＡ２）、をそれぞれ調製する。

Ｔ７プライマーとＤＮＡ１とをアニールさせた後、ＤＮＡポリメラーゼ反応により、二本鎖ＤＮＡにする。得られた二本鎖ＤＮＡを鋳型として、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いたインビトロ転写反応を行うことにより、配列Ｘの３’端に２個のＵが付加し、５’端にはリーダー配列が付加した配列を有するＲＮＡを合成することができる。同様にＴ７プライマーとＤＮＡ２とを用いて同様の反応を行うことにより、相補配列Ｘ’の３’端に２個のＵが付加し、５’端にはリーダー配列が付加した配列を有するＲＮＡを合成することができる。

２つの反応液を混ぜて、さらにインビトロ転写反応を続けることにより、互いに相補的な配列を含む２本のＲＮＡをアニールさせる。その後、デオキシリボヌクレアーゼおよび一本鎖ＲＮＡ特異的なリボヌクレアーゼにより、鋳型の二本鎖ＤＮＡおよび各ＲＮＡ鎖の５’側のリーダー配列を分解して除去する。各ＲＮＡ鎖の３’端の２個のＵは分解を受けずに付加したまま残る。

以上の反応は、サイレンサーＳｉＲＮＡ作製キット（Ｓｉｌｅｎｃｅｒ・ｓｉＲＮＡ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ、アンビオン社製）等のキットを用いて行うことができる。Ｔ７プライマーとアニールさせるＤＮＡは、ＤＮＡ合成機により化学合成することができる。またアンビオン社、日本バイオサービス株式会社、北海道システム・サイエンス株式会社、キアゲン社等のメーカーに化学合成を依頼することもできる。

（ｉｉ）ｓｈＲＮＡの場合
配列ＸからなるＲＮＡおよび相補配列Ｘ’からなるＲＮＡが、スペーサーオリゴヌクレオチドでつながれ、３’端に１〜６個、好ましくは２〜４個のヌクレオチド（前記と同義）が付加した、ヘアピン構造を有するＲＮＡは、ＤＮＡ合成機を用いた化学合成によって調製できる。

（ＩＩＩ）ＫＬＦ５遺伝子の発現抑制
ＫＬＦ５遺伝子を発現する細胞株に（ＩＩ）で調製したｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを導入する。細胞株としては、（Ｉ）の配列Ｘの設計のもとにしたＫＬＦ５ ｃＤＮＡと同じ動物種の細胞を用いる。ＫＬＦ５遺伝子を発現する細胞株としては、平滑筋、繊維芽細胞または血管内皮細胞に由来する細胞株、例えばマウス胎児繊維芽細胞株Ｃ３Ｈ／１０Ｔ１／２（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ−２２６）、ヒト臍帯血管内皮細胞等をあげることができる。ＲＮＡの導入は、動物細胞へのトランスフェクション用試薬、例えばポリフェクト（Ｐｏｌｙｆｅｃｔ）トランスフェクション試薬（キアゲン社製）、トランスメッセンジャー（ＴｒａｎｓＭｅｓｓｅｎｇｅｒ）トランスフェクション試薬、オリゴフェクトアミン（Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）試薬（インビトロジェン社製）、リポフェクトアミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）２０００（インビトロジェン社製）等を利用して、これらの試薬とＲＮＡを混合して複合体を形成させた後、細胞に添加することにより行うことができる。

ＲＮＡを導入した細胞におけるＫＬＦ５遺伝子の発現は、ＲＴ−ＰＣＲにより解析することができる。ＲＮＡを導入した細胞および導入しなかった細胞から総ＲＮＡを調製し、このＲＮＡからｃＤＮＡを合成する。合成したｃＤＮＡを鋳型にして、ＫＬＦ５遺伝子に特異的なプライマーを用いたＰＣＲを行い、ＫＬＦ５ ｃＤＮＡに由来する増幅産物の量を、アガロースゲル電気泳動によって定量することにより、ＫＬＦ５遺伝子の発現量を測定することができる。ＲＮＡを導入しなかった細胞のＫＬＦ５遺伝子の発現量と比較して、ＫＬＦ５遺伝子の発現量が減少した細胞に導入したＲＮＡを選択する。

例えばＫＬＦ５遺伝子の発現を抑制するＲＮＡとしては、配列番号２〜１１のいずれか１つの配列の鎖および該配列と相補的な配列の鎖からなる二本鎖ＲＮＡのそれぞれの鎖の３’端に２個のウリジル酸が付加した二本鎖ＲＮＡ等をあげることができる。配列番号１〜１１のいずれか１つの配列の鎖および該配列と相補的な配列の鎖からなる二本鎖ＲＮＡのそれぞれの鎖の３’端に２個のウリジル酸が付加した二本鎖ＲＮＡはマウスｃＤＮＡの配列に基づいて設計されたものであり、マウスＫＬＦ５遺伝子の発現を抑制する。このうち、配列番号４、８および１０の配列はそれぞれマウスとヒトのぞれぞれのＫＬＦ５ ｍＲＮＡで共通する配列であるので、配列番号４、８および１０のいずれか１つの配列の鎖および該配列と相補的な配列の鎖からなる二本鎖ＲＮＡのそれぞれの鎖の３’端に２個のウリジル酸が付加した二本鎖ＲＮＡは、マウスＫＬＦ５遺伝子だけでなくヒトＫＬＦ５遺伝子の発現も抑制する。

（Ｉ）の配列Ｘの設計のもとにしたある動物種ＡのＫＬＦ５ ｃＤＮＡと、異なる動物種ＢのＫＬＦ５ ｃＤＮＡを配列の相同性に基づいてアライメントすることにより、動物種Ａで選択された配列Ｘと対応する動物種Ｂの配列Ｙを得ることができる。上記の方法で、動物種ＡのＫＬＦ５遺伝子の発現を抑制するＲＮＡが得られた場合、ＲＮＡの配列Ｘおよびその相補配列Ｘ’の領域をそれぞれ配列Ｙとその相補配列Ｙ’に置換したＲＮＡは、動物種ＢのＫＬＦ５遺伝子を抑制すると考えられる。

例えば、マウスＫＬＦ５ ｃＤＮＡの配列に基づく配列番号２、３、７、９および１１のいずれか１つの配列の鎖および該配列と相補的な配列の鎖からなる二本鎖ＲＮＡのそれぞれの鎖の３’端に２個のウリジル酸が付加した二本鎖ＲＮＡは、マウスＫＬＦ５遺伝子の発現を抑制するので、ヒトＫＬＦ５ ｃＤＮＡにおいて対応する配列である配列番号１２〜１６のいずれか１つの配列の鎖および該配列と相補的な配列の鎖からなる二本鎖ＲＮＡのそれぞれの鎖の３’端に２個のウリジル酸が付加した二本鎖ＲＮＡは、ヒトＫＬＦ５遺伝子の発現を抑制すると考えられる。

本発明の組成物におけるリポソーム（以下リポソームＡ）としては、標的遺伝子のｍＲＮＡの連続する１５〜３０塩基の配列および該配列と相補的な配列を含むＲＮＡを封入したリポソームであり、該リポソームが標的遺伝子の発現部位を含む組織または臓器に到達するリポソームであれば特に限定されないが、例えばリード粒子と前記ＲＮＡから構成される複合粒子および該複合粒子を封入する脂質膜から構成されたリポソーム等があげられ、好ましくはリード粒子と該ＲＮＡを構成成分とする複合粒子および該複合粒子を被覆する脂質膜から構成され、該脂質膜の構成成分が可溶な極性有機溶媒を含む液の中に、該脂質膜の構成成分が分散可能で、該複合粒子も分散可能な濃度で該極性有機溶媒を含む液が存在する、リポソームがあげられる。また、リポソームＡとしては、好ましくはカチオン性脂質を含むリード粒子と前記ＲＮＡを構成成分とする複合粒子、および該複合粒子を被覆する脂質膜から構成され、該脂質膜が、中性脂質および水溶性物質の脂質誘導体、脂肪酸誘導体または脂肪族炭化水素誘導体を構成成分とするリポソームもあげられ、好ましくはリード粒子と該ＲＮＡを構成成分とする複合粒子および該複合粒子を被覆する脂質膜から構成され、該脂質膜の構成成分が中性脂質および水溶性物質の脂質誘導体、脂肪酸誘導体または脂肪族炭化水素誘導体であるリポソームであり、かつ該脂質膜の構成成分が可溶な極性有機溶媒を含む液の中に、該脂質膜の構成成分が分散可能で、該複合粒子も分散可能な濃度で該極性有機溶媒を含む液が存在する、リポソームがあげられる。

本発明におけるリード粒子とは、例えば、脂質集合体、リポソーム、エマルジョン粒子、高分子、金属コロイド、微粒子製剤等を構成成分とする微粒子のことであり、好ましくはリポソームを構成成分とする微粒子があげられる。本発明におけるリード粒子は、脂質集合体、リポソーム、エマルジョン粒子、高分子、金属コロイド、微粒子製剤等を２つ以上組み合わせた複合体を構成成分としていてもよく、脂質集合体、リポソーム、エマルジョン粒子、高分子、金属コロイド、微粒子製剤等と他の化合物（例えば糖、脂質、無機化合物等）とを組み合わせた複合体を構成成分としていてもよい。

リード粒子の構成成分としての脂質集合体またはリポソーム（以下リポソームＢ）は、例えば脂質および／または界面活性剤等によって構成され、脂質としては、単純脂質、複合脂質または誘導脂質のいかなるものであってもよく、例えばリン脂質、グリセロ糖脂質、スフィンゴ糖脂質、スフィンゴイド、ステロール等があげられ、好ましくはリン脂質があげられる。また、脂質としては、例えば界面活性剤（後記の界面活性剤と同義）、高分子（後記の高分子と同義、具体的にはデキストラン等）、ポリオキシエチレン誘導体（具体的にはポリエチレングリコール等）等の脂質誘導体もあげられ、好ましくはポリエチレングリコール化リン脂質があげられる。界面活性剤としては、例えば非イオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、両性界面活性剤等があげられる。

リン脂質としては、例えばホスファチジルコリン（具体的には大豆ホスファチジルコリン、卵黄ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン等）、ホスファチジルエタノールアミン（具体的にはジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン等）、グリセロリン脂質（具体的にはホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、リゾホスファチジルコリン等）、スフィンゴリン脂質（具体的にはスフィンゴミエリン、セラミドホスホエタノールアミン、セラミドホスホグリセロール、セラミドホスホグリセロリン酸等）、グリセロホスホノ脂質、スフィンゴホスホノ脂質、天然レシチン（具体的には卵黄レシチン、大豆レシチン等）、水素添加リン脂質（具体的には水素添加ホスファチジルコリン等）等の天然または合成のリン脂質があげられる。

グリセロ糖脂質としては、例えばスルホキシリボシルグリセリド、ジグリコシルジグリセリド、ジガラクトシルジグリセリド、ガラクトシルジグリセリド、グリコシルジグリセリド等があげられる。
スフィンゴ糖脂質としては、例えばガラクトシルセレブロシド、ラクトシルセレブロシド、ガングリオシド等があげられる。

スフィンゴイドとしては、例えばスフィンガン、イコサスフィンガン、スフィンゴシン、それらの誘導体等があげられる。誘導体としては、例えばスフィンガン、イコサスフィンガン、スフィンゴシン等の−ＮＨ_２を−ＮＨＣＯ（ＣＨ_２）_ｘＣＨ_３（式中、ｘは０〜１８の整数を表し、中でも６、１２または１８が好ましい）に変換したもの等があげられる。
ステロールとしては、例えばコレステロール、ジヒドロコレステロール、ラノステロール、β−シトステロール、カンペステロール、スチグマステロール、ブラシカステロール、エルゴカステロール、フコステロール、３β−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエチル）カルバモイル］コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）等があげられる。

その他、脂質としては、例えば、Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルプロピル）］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル塩化アンモニウム（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルプロピル）］−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミン（ＤＯＤＡＰ）、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシプロピル）］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル塩化アンモニウム（ＤＯＴＭＡ）、２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２−（スペルミンカルボキシアミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパナミニウムトリフルオロ酢酸（ＤＯＳＰＡ）、Ｎ−［１−（２，３−ジテトラデシルオキシプロピル）］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチル臭化アンモニウム（ＤＭＲＩＥ）、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシプロピル）］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチル臭化アンモニウム（ＤＯＲＩＥ）等もあげられる。

非イオン性界面活性剤としては、例えばモノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン（具体的にはポリソルベート８０等）、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール（具体的にはプルロニックＦ６８等）、ソルビタン脂肪酸（具体的にはソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノオレエート等）、ポリオキシエチレン誘導体（具体的にはポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０、ポリオキシエチレンラウリルアルコール等）、グリセリン脂肪酸エステル等があげられる。

アニオン性界面活性剤としては、例えばアシルサルコシン、アルキル硫酸ナトリウム、アルキルベンゼンスルホン酸塩、炭素数７〜２２の脂肪酸ナトリウム等があげられる。具体的にはドデシル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、タウロデオキシコール酸ナトリウム等があげられる。

カチオン性界面活性剤としては、例えばアルキルアミン塩、アシルアミン塩、第四級アンモニウム塩、アミン誘導体等があげられる。具体的には塩化ベンザルコニウム、アシルアミノエチルジエチルアミン塩、Ｎ−アルキルポリアルキルポリアミン塩、脂肪酸ポリエチレンポリアミド、セチルトリメチルアンモニウムブロミド、ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド、アルキルポリオキシエチレンアミン、Ｎ−アルキルアミノプロピルアミン、脂肪酸トリエタノールアミンエステル等があげられる。

両性界面活性剤としては、例えば３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホン酸、Ｎ−テトラデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホン酸等があげられる。

リポソームＢにおいては、これら脂質および界面活性剤は、単独でまたは組み合わせて用いられ、好ましくは組み合わせて用いられる。組み合わせて用いる場合の組み合わせとしては、例えば水素添加大豆ホスファチジルコリン、ポリエチレングリコール化リン脂質およびコレステロールから選ばれる２成分以上の組み合わせ、ジステアロイルホスファチジルコリン、ポリエチレングリコール化リン脂質およびコレステロールから選ばれる２成分以上の組み合わせ、ＥＰＣとＤＯＴＡＰの組み合わせ、ＥＰＣ、ＤＯＴＡＰおよびポリエチレングリコール化リン脂質の組み合わせ、ＥＰＣ、ＤＯＴＡＰ、コレステロールおよびポリエチレングリコール化リン脂質の組み合わせ等があげられる。

また、リポソームＢは、必要に応じて、例えばコレステロール等のステロール等の膜安定化剤、例えばトコフェロール等の抗酸化剤等を含有していてもよい。
脂質集合体としては、例えば球状ミセル、球状逆ミセル、ソーセージ状ミセル、ソーセージ状逆ミセル、板状ミセル、板状逆ミセル、ヘキサゴナルＩ、ヘキサゴナルＩＩおよび脂質２分子以上からなる会合体等があげられる。

エマルジョン粒子としては、例えば脂肪乳剤、非イオン性界面活性剤と大豆油からなるエマルジョン、リピッドエマルジョン、リピッドナノスフェアー等の水中油型（Ｏ／Ｗ）エマルジョンや水中油中水型（Ｗ／Ｏ／Ｗ）エマルジョン粒子等があげられる。
高分子としては、例えばアルブミン、デキストラン、キトサン、デキストラン硫酸、ＤＮＡ等の天然高分子、例えばポリ−Ｌ−リジン、ポリエチレンイミン、ポリアスパラギン酸、スチレンマレイン酸共重合体、イソプロピルアクリルアミド−アクリルピロリドン共重合体、ポリエチレングリコール修飾デンドリマー、ポリ乳酸、ポリ乳酸ポリグリコール酸、ポリエチレングリコール化ポリ乳酸等の合成高分子、およびそれらの塩等があげられる。

ここで、高分子における塩は、例えば金属塩、アンモニウム塩、酸付加塩、有機アミン付加塩、アミノ酸付加塩等を包含する。金属塩としては、例えばリチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、マグネシウム塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、亜鉛塩等があげられ、アンモニウム塩としては、例えばアンモニウム、テトラメチルアンモニウム等の塩があげられ、酸付加塩としては、例えば塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩等の無機酸塩、および酢酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、クエン酸塩等の有機酸塩があげられ、有機アミン付加塩としては、例えばモルホリン、ピペリジン等の付加塩があげられ、アミノ酸付加塩としては、例えばグリシン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン等の付加塩があげられる。

金属コロイドとしては、例えば金、銀、白金、銅、ロジウム、シリカ、カルシウム、アルミニウム、鉄、インジウム、カドミウム、バリウム、鉛等を含む金属コロイドがあげられる。

微粒子製剤としては、例えばマイクロスフェアー、マイクロカプセル、ナノクリスタル、リピッドナノパーティクル、高分子ミセル等があげられる。

また、本発明におけるリード粒子は、例えば糖、ペプチド、核酸および水溶性高分子から選ばれる１つ以上の物質の脂質誘導体もしくは脂肪酸誘導体または界面活性剤等を含有することが好ましい。糖、ペプチド、核酸および水溶性高分子から選ばれる１つ以上の物質の脂質誘導体もしくは脂肪酸誘導体または界面活性剤は、リード粒子の構成成分として用いても、リード粒子の構成成分に加えて用いても構わない。

糖、ペプチド、核酸および水溶性高分子から選ばれる１つ以上の物質の脂質誘導体もしくは脂肪酸誘導体または界面活性剤としては、好ましくは、糖脂質、または水溶性高分子の脂質誘導体もしくは脂肪酸誘導体があげられ、より好ましくは、水溶性高分子の脂質誘導体または脂肪酸誘導体があげられる。糖、ペプチド、核酸および水溶性高分子から選ばれる１つ以上の物質の脂質誘導体もしくは脂肪酸誘導体または界面活性剤は、分子の一部がリード粒子の他の構成成分と例えば疎水性親和力、静電的相互作用等で結合する性質をもち、他の部分がリード粒子の製造時の溶媒と例えば親水性親和力、静電的相互作用等で結合する性質をもつ、２面性をもつ物質であるのが好ましい。

糖、ペプチドまたは核酸の脂質誘導体もしくは脂肪酸誘導体としては、例えばショ糖、ソルビトール、乳糖等の糖、例えばカゼイン由来ペプチド、卵自由来ペプチド、大豆由来ペプチド、グルタチオン等のペプチド、または例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、プラスミド、ｓｉＲＮＡ、ＯＤＮ等の核酸と、例えば前記リード粒子の定義の中であげた脂質、例えばステアリン酸、パルミチン酸、ミリスチン酸、ラウリン酸等の脂肪酸とが結合してなるもの等があげられ、好ましくは例えばポリエチレングリコール化脂質、ポリグリセリン化脂質、ポリエチレングリコールアルキルエーテル、ポリエチレングリコールソルビタン脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール、グリセリン脂肪酸エステル等があげられる。

糖の脂質誘導体または脂肪酸誘導体としては、例えば前記リード粒子の定義の中であげたグリセロ糖脂質、スフィンゴ糖脂質等があげられる。
水溶性高分子の脂質誘導体または脂肪酸誘導体としては、例えばポリエチレングリコール、ポリグリセリン、ポリエチレンイミン、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸、ポリアクリルアミド、オリゴ糖、デキストリン、水溶性セルロース、デキストラン、コンドロイチン硫酸、ポリグリセリン、キトサン、ポリビニルピロリドン、ポリアスパラギン酸アミド、ポリ−Ｌ−リジン、マンナン、プルラン、オリゴグリセロール等またはそれらの誘導体と、例えば前記リード粒子の定義の中であげた脂質、または例えばステアリン酸、パルミチン酸、ミリスチン酸、ラウリン酸等の脂肪酸とが結合してなるもの等があげられ、より好ましくは、ポリエチレングリコール誘導体、ポリグリセリン誘導体等の脂質誘導体または脂肪酸誘導体があげられ、さらに好ましくは、ポリエチレングリコール誘導体の脂質誘導体または脂肪酸誘導体があげられる。

ポリエチレングリコール誘導体の脂質誘導体または脂肪酸誘導体としては、例えばポリエチレングリコール化脂質（具体的にはポリエチレングリコール−ホスファチジルエタノールアミン（より具体的には１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（ＰＥＧ−ＤＳＰＥ）等）、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０、クレモフォアイーエル（ＣＲＥＭＯＰＨＯＲ ＥＬ）等）、ポリエチレングリコールソルビタン脂肪酸エステル類（具体的にはモノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン等）、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル類等があげられ、より好ましくは、ポリエチレングリコール化脂質があげられる。

ポリグリセリン誘導体の脂質誘導体または脂肪酸誘導体としては、例えばポリグリセリン化脂質（具体的にはポリグリセリン−ホスファチジルエタノールアミン等）、ポリグリセリン脂肪酸エステル類等があげられ、より好ましくは、ポリグリセリン化脂質があげられる。

界面活性剤としては、例えば前記リード粒子の定義の中であげた界面活性剤、ポリエチレングリコールアルキルエーテル等があげられ、好ましくは、ポリオキシエチレンポリプロピレングリコールポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール、グリセリン脂肪酸エステル、ポリエチレングリコールアルキルエーテル等があげられる。

また、好ましくは、リード粒子は、正電荷をもつ。ここで述べる、正電荷とは、前記ＲＮＡ内の電荷、分子内分極等に対して静電的引力を生じる電荷、表面分極等を包含する。リード粒子が正電荷をもつには、好ましくは、リード粒子は、カチオン性物質を含有し、より好ましくは、リード粒子は、カチオン性脂質を含有する。

リード粒子に含有されるカチオン性物質は、カチオン性を呈する物質であるが、カチオン性の基とアニオン性の基の両方をもつ両性の物質であっても、ｐＨや、他の物質との結合等により相対的な陰性度が変化するので、その時々に応じてカチオン性物質に分類され得る。これらカチオン性物質は、リード粒子の構成成分として用いても、リード粒子の構成成分に加えて用いても構わない。

カチオン性物質としては、例えば前記のリード粒子の定義で例示したもののうちのカチオン性物質［具体的には、カチオン性脂質、カチオン性界面活性剤（前記と同義）、カチオン性高分子等］、等電点以下の値のｐＨで、複合体の形成を行える蛋白質またはペプチド等があげられる。

カチオン性脂質としては、例えばＤＯＴＡＰ、ＤＯＤＡＰ、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＳＰＡ、ＤＭＲＩＥ、ＤＯＲＩＥ、ＤＣ−Ｃｈｏｌ等があげられる。

カチオン性高分子としては、例えばポリ−Ｌ−リジン、ポリエチレンイミン、ポリフェクト（ｐｏｌｙｆｅｃｔ）、キトサン等があげられる。

等電点以下の値のｐＨで、複合体の形成を行える蛋白質またはペプチドとしては、その物質の等電点以下の値のｐＨで、複合体の形成を行える蛋白質またはペプチドであれば、特に限定されない。例えば、アルブミン、オロソムコイド、グロブリン、フィブリノーゲン、ペプシン、リボヌクレアーゼＴ１等があげられる。

本発明におけるリード粒子は、公知の製造方法またはそれに準じて製造することができ、いかなる製造方法で製造されたものであってよい。例えば、リード粒子の１つであるリポソームＢを構成成分とするリード粒子の製造には、公知のリポソームの調製方法が適用できる。公知のリポソームの調製方法としては、例えばバンガム（Ｂａｎｇｈａｍ）らのリポソーム調製法［“ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）”，１９６５年，第１３巻，ｐ．２３８−２５２参照］、エタノール注入法［“ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー（Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．）”，１９７５年，第６６巻，ｐ．６２１−６３４参照］、フレンチプレス法［“エフイービーエス・レターズ（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．）”，１９７９年，第９９巻，ｐ．２１０−２１４参照］、凍結融解法［“アーカイブス・オブ・バイオケミストリー・アンド・バイオフィジックス（Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．）”，１９８１年，第２１２巻，ｐ．１８６−１９４参照］、逆相蒸発法［“プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）”，１９７８年，第７５巻，ｐ．４１９４−４１９８参照］、ｐＨ勾配法（例えば特許第２５７２５５４号公報、特許第２６５９１３６号公報等参照）等があげられる。リポソームＢの製造の際にリポソームＢを分散させる溶液としては、例えば水、酸、アルカリ、種々の緩衝液、生理的食塩液、アミノ酸輸液等を用いることができる。また、リポソームＢの製造の際には、例えばクエン酸、アスコルビン酸、システイン、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等の抗酸化剤、例えばグリセリン、ブドウ糖、塩化ナトリウム等の等張化剤等の添加も可能である。また、脂質等を例えばエタノール等の有機溶媒に溶解し、溶媒留去した後、生理食塩水等を添加、振とう撹拌し、リポソームＢを形成させることによってもリポソームを製造することができる。

また、例えば非イオン性界面活性剤（前記と同義）、カチオン性界面活性剤（前記と同義）、アニオン性界面活性剤（前記と同義）、高分子、ポリオキシエチレン誘導体等によるリポソーム表面改質も任意に行うことができ、これらの表面改質リポソームも本発明におけるリード粒子の構成成分として用いられる［ラジック（Ｄ．Ｄ．Ｌａｓｉｃ）、マーティン（Ｆ．Ｍａｒｔｉｎ）編，“ステルス・リポソームズ（Ｓｔｅａｌｔｈ Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ）”（米国），シーアールシー・プレス・インク（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ），１９９５年，ｐ．９３−１０２参照］。高分子としては、例えばデキストラン、プルラン、マンナン、アミロペクチン、ヒドロキシエチルデンプン等があげられる。ポリオキシエチレン誘導体としては、例えばポリソルベート８０、プルロニックＦ６８、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０、ポリオキシエチレンラウリルアルコール、ＰＥＧ−ＤＳＰＥ等があげられる。リポソーム表面改質は、リード粒子に糖、ペプチド、核酸および水溶性高分子から選ばれる１つ以上の物質の脂質誘導体もしくは脂肪酸誘導体または界面活性剤を含有させる方法の１つとしても用いることができる。

リポソームＢの平均粒子径は、所望により自由に選択できる。平均粒子径を調節する方法としては、例えばエクストルージョン法、大きな多重膜リポソーム（ＭＬＶ）を機械的に粉砕（具体的にはマントンゴウリン、マイクロフルイダイザー等を使用）する方法［ミュラー（Ｒ．Ｈ．Ｍｕｌｌｅｒ）、ベニタ（Ｓ．Ｂｅｎｉｔａ）、ボーム（Ｂ．Ｂｏｈｍ）編著，“エマルジョン・アンド・ナノサスペンジョンズ・フォー・ザ・フォーミュレーション・オブ・ポアリー・ソラブル・ドラッグズ（Ｅｍｕｌｓｉｏｎ ａｎｄ Ｎａｎｏｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｏｒｌｙ Ｓｏｌｕｂｌｅ Ｄｒｕｇｓ）”，ドイツ，サイエンティフィック・パブリッシャーズ・スチュットガルト（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ），１９９８年，ｐ．２６７−２９４参照］等があげられる。

また、リード粒子を構成する例えば脂質集合体、リポソームＢ、エマルジョン粒子、高分子、金属コロイド、微粒子製剤等から選ばれる２つ以上を組み合わせた複合体の製造方法は、例えば水中で例えば脂質、高分子等を混合するだけの製造方法でもよく、この際、必要であればさらに整粒工程や無菌化工程等を加えることもできる。また、複合体形成を例えばアセトン、エーテル等種々の溶媒中で行うことも可能である。

本発明におけるリード粒子の大きさは、平均粒子径が数ｎｍ〜数十μｍであるのが好ましく、１０ｎｍ〜１０００ｎｍであるのがより好ましく、５０ｎｍ〜３００ｎｍであるのがさらに好ましい。
本発明における脂質膜を構成成分としては、例えば前記リード粒子の定義の中であげた脂質、界面活性剤等があげられ、好ましくは、脂質、界面活性剤のうちの中性脂質があげられ、より好ましくはリン脂質があげられ、さらに好ましくはＥＰＣがあげられる。また、脂質膜の構成成分は、極性有機溶媒に可溶であることが好ましく、該極性有機溶媒を含む液中に、該脂質膜の構成成分が分散可能で、該複合粒子も分散可能な濃度で該極性有機溶媒を含む液が存在することが好ましい。ここで、中性脂質とは、脂質、界面活性剤のうちの、前記リード粒子が正電荷をもつ場合におけるカチオン性物質の中であげたカチオン脂質とカチオン性界面活性剤および後記の付着競合剤の中であげたアニオン性脂質とアニオン性界面活性剤を除いたもののことであり、中性脂質としてより好ましくは、リン脂質、グリセロ糖脂質、スフィンゴ糖脂質等があげられる。

本発明における極性有機溶媒としては、例えばメタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、２−プロパノール、ｎ−ブタノール、２−ブタノール、ｔｅｒｔ−ブタノール等のアルコール、グリセリン、エチレングリコール、プロピレングリコール等のグリコール、ポリエチレングリコール等のポリアルキレングリコール等があげられ、好ましくはエタノールがあげられる。

また、脂質膜に用いられる脂質として、例えば合成脂質等もあげられる。合成脂質としては、例えばフッ素添加ホスファチジルコリン、フッ素添加界面活性剤、臭化ジアルキルアンモニウム等があげられ、これらは単独でまたは他の脂質等と組み合わせて用いられてもよい。また、脂質膜は、好ましくは水溶性物質の脂質誘導体、脂肪酸誘導体またはもしくは脂肪族炭化水素誘導体、あるいは前記の糖、ペプチド、核酸および水溶性高分子から選ばれる１つ以上の物質の脂質誘導体もしくは脂肪酸誘導体または界面活性剤を含み、前記水溶性高分子の脂質誘導体または脂肪酸誘導体を含有することがより好ましく、前記ポリエチレングリコール化リン脂質を含有することがさらに好ましく、ポリエチレングリコール−ホスファチジルエタノールアミンを含有することが最も好ましい。

本発明における水溶性物質の脂質誘導体、脂肪酸誘導体または脂肪族炭化水素誘導体としては、例えば前記の糖、蛋白質およびペプチド、核酸および水溶性高分子から選ばれる１つ以上の物質の脂質誘導体もしくは脂肪酸誘導体、または糖、蛋白質およびペプチド、核酸および水溶性高分子から選ばれる１つ以上の物質脂肪族炭化水素誘導体があげられ、好ましくは、糖脂質、または水溶性高分子の脂質誘導体もしくは脂肪酸誘導体があげられ、より好ましくは、水溶性高分子の脂質誘導体または脂肪酸誘導体があげられる。

水溶性物質の脂肪族炭化水素誘導体としては、水溶性物質と、例えば長鎖脂肪族アルコール、ポリオキシプロピレンアルキル、グリセリン脂肪酸エステルのアルコール性残基等とが結合してなるものがあげられる。

糖、ペプチドまたは核酸の脂肪族炭化水素誘導体としては、例えばショ糖、ソルビトール、乳糖等の糖、例えばカゼイン由来ペプチド、卵自由来ペプチド、大豆由来ペプチド、グルタチオン等のペプチド、または例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、プラスミド、ｓｉＲＮＡ、ＯＤＮ等の核酸の脂肪族炭化水素誘導体があげられる。

水溶性高分子の脂肪族炭化水素誘導体としては、例えばポリエチレングリコール、ポリグリセリン、ポリエチレンイミン、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸、ポリアクリルアミド、オリゴ糖、デキストリン、水溶性セルロース、デキストラン、コンドロイチン硫酸、ポリグリセリン、キトサン、ポリビニルピロリドン、ポリアスパラギン酸アミド、ポリ−Ｌ−リジン、マンナン、プルラン、オリゴグリセロール等またはそれらの誘導体の脂肪族炭化水素誘導体があげられ、より好ましくは、ポリエチレングリコール誘導体、ポリグリセリン誘導体等の脂肪族炭化水素誘導体があげられ、さらに好ましくは、ポリエチレングリコール誘導体の脂肪族炭化水素誘導体があげられる。

リード粒子がリポソームＢを構成成分とする微粒子である場合、リポソームＢと前記ＲＮＡを構成成分とする複合粒子および該複合粒子を被覆する脂質膜から構成されるものがリポソームＡとなり、その構成から狭義のリポソームと分類され、リード粒子がリポソームＢを構成成分とする微粒子以外である場合でも、脂質膜で被覆されているので、広義のリポソームと分類される。本発明において、リード粒子の構成成分もリポソームであることがより好ましい。

本発明におけるリード粒子と前記ＲＮＡを構成成分とする複合粒子は、該リード粒子を製造後または該リード粒子の製造と同時に、該ＲＮＡをリード粒子に付着または封入して複合粒子を製造でき、さらに該複合粒子の製造後または複合粒子の製造と同時に、脂質膜で該複合粒子を被覆することリポソームＡを製造することができる。リポソームＡは、例えば、特表２００２−５０８７６５号公報、特表２００２−５０１５１１号公報、“バイオキミカ・エ・バイオフィジカ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ
ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ）”，２００１年，第１５１０巻，ｐ．１５２−１６６、国際公開第０２／２８３６７号パンフレット等の公知の製造方法またはそれに準じて製造するか、例えばリード粒子に前記ＲＮＡを付着または封入して複合粒子を製造後、該複合粒子および被覆層成分を、該被覆層成分が可溶な極性有機溶媒を含む、該複合粒子が溶解せず、該被覆層成分が分散状態で存在することが可能な濃度の液中に分散させる工程および該複合粒子を該被覆層成分で被覆する工程を含む製造方法で製造することができる。

本発明の組成物におけるリポソームの好ましい製造方法としては、以下のリード粒子と前記ＲＮＡを構成成分とする複合粒子を製造する工程（工程１）および該複合粒子を脂質膜で被覆する工程（工程２または工程３）を含む製造方法があげられる。

工程１）リード粒子と前記ＲＮＡを構成成分とする複合粒子を製造する工程
リード粒子を、例えば水等の溶媒中に分散させ、リード粒子が分散した液中に、前記ＲＮＡを分散または溶解して含有させて混合し、リード粒子に該ＲＮＡを付着させる。工程１において、リード粒子の凝集を抑制するために、リード粒子は凝集抑制物質を含有するリード粒子であることが好ましく、凝集抑制物質として前記糖、ペプチド、核酸および水溶性高分子から選ばれる１つ以上の物質の脂質誘導体もしくは脂肪酸誘導体または界面活性剤を含有することがより好ましい。また、リード粒子が、正電荷をもつものである場合、リード粒子が分散した液中で、該ＲＮＡと付着競合剤を共存させ、付着競合剤を該ＲＮＡとともにリード粒子に付着させてもよく、さらにリード粒子が凝集抑制物質を含有するリード粒子である場合にも、リード粒子の凝集をより抑制させるために付着競合剤を用いてもよい。リード粒子と前記ＲＮＡの組み合わせとしては、複合粒子が極性有機溶媒を含有する液に分散可能となる組み合わせを選択することが好ましく、極性有機溶媒に対しての溶解度が、工程２または３で用いる脂質膜の構成成分よりも低いことがより好ましく、また、該極性有機溶媒を含む液中に、該脂質膜の構成成分が分散可能で、該複合粒子も分散可能な濃度で該極性有機溶媒を含む液が存在する組み合わせを選択することがより好ましい。

付着競合剤としては、例えばアニオン性物質等があげられ、該アニオン性物質は、分子内の電荷、分子内分極等による静電的引力により、リード粒子の構成成分に静電的に付着する物質を包含する。付着競合剤としてのアニオン性物質は、アニオン性を呈する物質であるが、アニオン性の基とカチオン性の基の両方をもつ両性の物質であっても、ｐＨや、他の物質との結合等により相対的な陰性度が変化するので、その時々に応じてアニオン性物質に分類され得る。

アニオン性物質としては、例えば前記のリード粒子の定義で例示したもののうちのアニオン性物質［具体的には、アニオン性脂質、アニオン性界面活性剤（前記と同義）、アニオン性高分子等］、等電点以上の値のｐＨで、複合体の形成を行える蛋白質またはペプチド、核酸等があげられ、好ましくはデキストラン硫酸、デキストラン硫酸ナトリウム、コンドロイチン硫酸、コンドロイチン硫酸ナトリウム、ヒアルロン酸、コンドロイチン、デルタマン硫酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ケタラン硫酸、デキストランフルオレセインアニオニック等から選ばれる１つ以上の物質があげられる。

アニオン性脂質としては、例えばホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸等があげられる。
アニオン性高分子としては、例えばポリアスパラギン酸、スチレンマレイン酸共重合体、イソプロピルアクリルアミド−アクリルピロリドン共重合体、ポリエチレングリコール修飾デンドリマー、ポリ乳酸、ポリ乳酸ポリグリコール酸、ポリエチレングリコール化ポリ乳酸、デキストラン硫酸、デキストラン硫酸ナトリウム、コンドロイチン硫酸、コンドロイチン硫酸ナトリウム、ヒアルロン酸、コンドロイチン、デルタマン硫酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ケタラン硫酸、デキストランフルオレセインアニオニック等があげられる。

等電点以上の値のｐＨで、複合体の形成を行える蛋白質またはペプチドとしては、その物質の等電点以上の値のｐＨで、複合体の形成を行える蛋白質またはペプチドであれば、特に限定されない。例えば、アルブミン、オロソムコイド、グロブリン、フィブリノーゲン、ヒストン、プロタミン、リボヌクレアーゼ、リゾチーム等があげられる。

アニオン性物質としての核酸としては、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、プラスミド、ｓｉＲＮＡ、ＯＤＮ等があげられ、生理活性を示さないものであれば、どのような長さ、配列のものであってもよい。

付着競合剤は、リード粒子の構成成分に静電的に付着することが好ましく、リード粒子の構成成分に付着してもリード粒子の構成成分を凝集させるような架橋を形成しない大きさの物質であるか、分子内に付着する部分と、付着に反発してリード粒子の凝集を抑制する部分をもつ物質であることが好ましい。
工程１は、より具体的には、例えば凝集抑制物質を含有するリード粒子が分散した液を製造する操作および該リード粒子が分散した液中に、前記ＲＮＡを分散または溶解して含有させる操作（例えば該リード粒子が分散した液中に、該ＲＮＡを加えて分散または溶解する操作、該リード粒子が分散した液中に、該ＲＮＡが分散または溶解した液を加える操作等）を含む製造方法において実施することができる。ここで、リード粒子が分散した液中に、前記ＲＮＡを分散または溶解して含有させる工程により得られる複合粒子としては、具体的には、該カチオン性脂質を含有するリポソームＢを構成成分とする微粒子に該ＲＮＡが付着して形成される複合粒子、カチオン性脂質を含有する脂質集合体を構成成分とする微粒子に前記ＲＮＡが付着して形成される複合粒子、ポリ−Ｌ−リジン等のカチオン性高分子を含有する高分子を構成成分とする微粒子に前記ＲＮＡが付着して形成される複合粒子があげられる。また、リード粒子が分散した液中に、前記ＲＮＡを分散または溶解して含有させる操作が、該ＲＮＡが分散または溶解した液に、さらに付着競合剤を含有させて、これを該リード粒子が分散した液中に加える操作であることが好ましく、この場合、該リード粒子に、該ＲＮＡと該付着競合剤が共に付着して複合粒子が製造され、該複合粒子の製造中におけるリード粒子の凝集も、製造後における複合粒子の凝集もより抑制されて製造できる。

リード粒子のリード粒子が分散する液に対する割合は、リード粒子に前記ＲＮＡが付着できれば特に限定されるものではないが、１μｇ／ｍＬ〜１ｇ／ｍＬであるのが好ましく、０．１〜５００ｍｇ／ｍＬであるのがより好ましい。

工程２）複合粒子を脂質膜で被覆する工程（その１）
工程１で得られた複合粒子が分散し、かつ脂質膜の構成成分が溶解した極性有機溶媒を含む液（液Ａ）を調製する操作、次いで、液Ａ中の極性有機溶媒の割合を減少させることによって、複合粒子を脂質膜で被覆する操作を含む製造方法によってリポソームＡが製造でき、この場合、リポソームＡは分散液（液Ｂ）の形態で得られる。液Ａにおける溶媒は、該脂質膜の構成成分が可溶で、該複合粒子が分散可能な極性有機溶媒の濃度の該極性有機溶媒を含む溶媒であり、液Ａ中の極性有機溶媒の割合を減少させた液Ｂでは、該脂質膜の構成成分が分散可能で、該複合粒子も分散可能である。液Ａ中の溶媒が、極性有機溶媒と極性有機溶媒以外の溶媒との混合液である場合、例えば該極性有機溶媒と混合可能な極性有機溶媒以外の溶媒を含む溶媒（液Ｃ）を加えること、および／または、蒸発留去、半透膜分離、分留等によって、選択的に極性有機溶媒を取り除くことで、極性有機溶媒の割合を減少させることができる。ここで、液Ｃは、極性有機溶媒以外の溶媒を含む溶媒であり、極性有機溶媒も液Ａにおける極性有機溶媒の割合より低ければ含んでいてよい。

工程２における極性有機溶媒以外の溶媒としては、例えば、水、液体二酸化炭素、液体炭化水素、ハロゲン化炭素、ハロゲン化炭化水素等があげられ、好ましくは水があげられる。また、液Ａおよび液Ｃは、イオン、緩衝成分等を含んでいてもよい。

極性有機溶媒と極性有機溶媒以外の溶媒の組み合わせは、相互に混合可能である組み合わせであるのが好ましく、液Ａおよび液Ｂ中の溶媒ならびに液Ｃに対する、複合粒子および脂質膜の構成成分の溶解度等を考慮して選択できる。一方、複合粒子については、液Ａおよび液Ｂ中の溶媒ならびに液Ｃのいずれに対しての溶解度も低いことが好ましく、また極性有機溶媒および極性有機溶媒以外の溶媒のいずれに対しての溶解度も低いことが好ましく、脂質膜の構成成分は、液Ｂ中の溶媒および液Ｃに対しての溶解度が低いことが好ましく、液Ａ中の溶媒に対しての溶解度が高いことが好ましく、また極性有機溶媒に対しての溶解度が高いことが好ましく、極性有機溶媒以外の溶媒に対する溶解度が低いことが好ましい。ここで、複合粒子の溶解度が低いとは、複合粒子に含有されるリード粒子、ＲＮＡおよび付着競合剤等の各成分の、溶媒中における溶出性が小さいことであり、各成分の個々の溶解度が高くても各成分間の結合等によって各成分の溶出性が小さくなっていればよい。例えば、リード粒子に含まれる成分のいずれかの液Ａ中の溶媒に対する溶解度が高い場合でも、リード粒子が正電荷をもつ場合、ＲＮＡ内の電荷、分子内分極等に対して静電的に結合し、液Ａ中の溶媒に対する溶解度が低くなれば、複合粒子中の成分の溶出が抑制され、複合粒子の液Ａ中の溶媒に対する溶解度を低くすることが可能である。すなわち、リード粒子が正電荷をもつことは、リポソームＡの製造において、複合粒子の成分の溶出を抑制し、製造性と歩留まりを向上させる効果も備えている。

液Ａにおける極性有機溶媒の割合は、脂質膜の構成成分が可溶で、複合粒子が分散可能であるであれば特に限定されるものではなく、用いる溶媒や複合粒子、脂質膜の構成成分の種類等により異なるが、好ましくは３０ｖ／ｖ％以上、より好ましくは６０〜９０ｖ／ｖ％である。また、液Ｂにおける極性有機溶媒の割合は、液Ａよりも低い濃度で該極性有機溶媒を含み、脂質膜の構成成分が分散可能で、複合粒子も分散可能であれば特に限定されるものではないが、好ましくは５０ｖ／ｖ％以下である。

液Ａを調製する工程としては、複合粒子が溶解しなければ、極性有機溶媒、複合粒子および脂質膜の構成成分、または極性有機溶媒、複合粒子、脂質膜の構成成分および極性有機溶媒以外の溶媒をいかなる順に加えて液Ａを調製する工程でもかまわず、好ましくは、該複合粒子が分散した極性有機溶媒を含む液（液Ｄ）を調製し、液Ｄ１中の極性有機溶媒と同一または異なった極性有機溶媒を含む溶媒に該脂質膜の構成成分を溶解させた液（液Ｅ）を調製し、液Ｄと液Ｅを混合して調製する工程があげられる。液Ｄと液Ｅを混合して液Ａを調製する際には、徐々に混合することが好ましい。

工程３）複合粒子を脂質膜で被覆する工程（その２）
工程１で得られた複合粒子および脂質膜の構成成分を、該脂質膜の構成成分が可溶な極性有機溶媒を含む、該複合粒子が溶解せず、該脂質膜の構成成分が分散状態で存在することが可能な濃度の液（液Ｆ）中に分散させる操作を含む製造方法でリポソームＡが製造でき、この場合、リポソームＡは分散液の状態で得られる。液Ｆにおける溶媒は、該脂質膜の構成成分が可溶な極性有機溶媒を含み、該極性有機溶媒を含む溶媒に、該脂質膜の構成成分が分散可能で、該複合粒子も分散可能な濃度で該極性有機溶媒を含む液が存在する溶媒である。

液Ｆの調製方法はいかなる形態をも取ることができる。例えば複合粒子の分散液と、脂質膜の構成成分の溶解液または分散液を調製した後、両液を混合して液Ｆを調製しても、複合粒子または脂質膜の構成成分のどちらか一方の分散液を調製し、その分散液に、固体状態の複合粒子または脂質膜の構成成分の残る一方を加えて分散させて液Ｆを調製してもよい。複合粒子の分散液と、脂質膜の構成成分の溶解液または分散液を混合する場合には、複合粒子の分散媒は、あらかじめ極性有機溶媒を含んでいてもよく、また被脂質膜の構成成分は溶解していてもまたは分散していてもよく、脂質膜の構成成分の溶媒または分散媒は極性有機溶媒を含む液または極性有機溶媒のみで構成される液でよい。一方、複合粒子または脂質膜の構成成分のどちらか一方の分散液を調製し、該分散液に、固体状態の複合粒子または脂質膜の構成成分の残る一方を加える場合には、該分散液は、極性有機溶媒を含む液である。なお、液Ｆを調製した後に複合粒子が溶解せず、脂質膜の構成成分が分散している場合には、複合粒子が溶解せず、脂質膜の構成成分が分散する極性有機溶媒濃度の範囲で極性有機溶媒を加えても、有機溶媒を除去または濃度を減少させてもよい。一方、液Ｆを調製した後に複合粒子は溶解していないが、脂質膜の構成成分が溶解している場合には、複合粒子が溶解せず、脂質膜の構成成分が分散する極性有機溶媒濃度の範囲で極性有機溶媒を除去または濃度を減少させればよい。また、複合粒子と脂質膜の構成成分をあらかじめ極性有機溶媒以外の溶媒中で混合し、そこに複合粒子が溶解せず、脂質膜の構成成分が分散する極性有機溶媒濃度の範囲で極性有機溶媒を加えてもよく、その場合には、複合粒子および脂質膜の構成成分のそれぞれを極性有機溶媒以外の溶媒中に分散させ、両分散液を混合した後で、極性有機溶媒を加えることでもよく、複合粒子または脂質膜の構成成分のどちらか一方を極性有機溶媒以外の溶媒中に分散させ、その分散液に、固体状態の複合粒子または脂質膜の構成成分の残る一方を加えて分散させた後で、極性有機溶媒を加えることでもよい。また、複合粒子および脂質膜の構成成分が分散し、極性有機溶媒を含有する液を、複合粒子が脂質膜で被覆されるに充分な時間、静置または混合する操作を含むことが好ましく、複合粒子と脂質膜の構成成分を、極性有機溶媒を含有する液中に分散させた後、静置または混合する時間は、複合粒子および脂質膜の構成成分を、極性有機溶媒を含有する液中に分散させた後に瞬時に終了させるのでなければ制限はないが、脂質膜の構成成分や、極性有機溶媒を含有する液の種類に応じて任意に設定することができ、得られたリポソームＡの収率が定常量となる時間を設定することが好ましく、例えば３秒〜３０分である。

液Ｆにおける極性有機溶媒以外の溶媒としては、例えば工程２における極性有機溶媒以外の溶媒で例示した物があげられ、好ましくは水があげられる。

液Ｆにおける極性有機溶媒の割合は、複合粒子と、脂質膜の構成成分がともに分散されている条件さえ満たしていれば特に限定されるものではなく、用いる溶媒や複合粒子、脂質膜の構成成分の種類等により異なるが、好ましくは１〜８０ｖｏｌ％、より好ましくは１０〜６０ｖｏｌ％、さらに好ましくは２０〜５０ｖｏｌ％、最も好ましくは３０〜４０ｖｏｌ％である。

本発明において、脂質膜の構成成分が極性有機溶媒に対して可溶とは、脂質膜の構成成分が極性有機溶媒に溶解する性質をもつ場合、可溶化剤等を用いることにより脂質膜の構成成分が極性有機溶媒に溶解する性質をもつ場合、脂質膜の構成成分が極性有機溶媒中で凝集体またはミセル等を形成して乳濁もしくはエマルジョン化し得る性質をもつ場合等を包含する。また、脂質膜の構成成分が分散するとは、脂質膜の構成成分の全部が凝集体またはミセル等を形成して乳濁もしくはエマルジョン化している状態、脂質膜の構成成分の一部が凝集体またはミセル等を形成して乳濁もしくはエマルジョン化し、残る部分が溶解している状態、脂質膜の構成成分の一部が凝集体またはミセル等を形成して乳濁もしくはエマルジョン化し、残る部分が沈殿している状態等を包含する。なお、脂質膜の構成成分が溶解するとは、脂質膜の構成成分の全部が凝集体またはミセル等を形成して乳濁もしくはエマルジョン化している状態を包含しない。

本発明において、複合粒子が分散するとは、複合粒子が懸濁または乳濁もしくはエマルジョン化している状態のことであり、複合粒子の一部が懸濁または乳濁もしくはエマルジョン化し、残る部分が溶解している状態、複合粒子の一部が乳濁もしくはエマルジョン化し、残る部分が沈殿している状態等を包含する。複合粒子が溶解しないとは、前記の複合粒子が分散すると同義である。

本発明におけるリポソームＡの製造方法において用いられる、極性有機溶媒含有水溶液中の複合粒子の濃度は、複合粒子を脂質膜で被覆できれば特に限定されるものではないが、１μｇ／ｍＬ〜１ｇ／ｍＬであるのが好ましく、０．１〜５００ｍｇ／ｍＬであるのがより好ましい。また、用いられる脂質膜の構成成分の濃度は、複合粒子を被覆できれば特に限定されるものではないが、１μｇ／ｍＬ〜１ｇ／ｍＬであるのが好ましく、０．１〜４００ｍｇ／ｍＬであるのがより好ましい。
本発明のリポソームＡに対する脂質膜の割合は、重量比で１：０．１〜１：１０００が好ましく、１：１〜１：１０がより好ましい。

また、本発明におけるリポソームＡの大きさは、平均粒子径が３００ｎｍ以下であるのが好ましく、２００ｎｍ以下であるのがより好ましく、具体的には、例えば注射可能な大きさであるのが好ましい。

さらに、上記で得られるリポソームＡに抗体等の蛋白質、糖類、糖脂質、アミノ酸、核酸、種々の低分子化合物、高分子化合物等の物質による修飾を行うこともでき、これらで得られる被覆複合粒子もリポソームＡに包含される。例えば、ターゲッティングに応用するため、上記で得られるリポソームＡに対して、さらに抗体等の蛋白質、ペプチド、脂肪酸類等による脂質膜の表面修飾を行うこともできる［ラジック（Ｄ．Ｄ．Ｌａｓｉｃ）、マーティン（Ｆ．Ｍａｒｔｉｎ）編，“ステルス・リポソームズ（Ｓｔｅａｌｔｈ Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ）”（米国），シーアールシー・プレス・インク（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ），１９９５年，ｐ．９３−１０２参照］。また、リポソームＡに例えば水溶性物質の脂質誘導体、脂肪酸誘導体または脂肪族炭化水素誘導体による表面改質も任意に行うことができ、これら表面改質に用いられる水溶性物質の脂質誘導体、脂肪酸誘導体または脂肪族炭化水素誘導体は、前記脂質膜の構成成分としての水溶性物質の脂質誘導体、脂肪酸誘導体または脂肪族炭化水素誘導体と同義である。

本発明の組成物は、ほ乳類に投与することで、前記ＲＮＡを標的遺伝子の発現部位を含む組織または臓器へ送達することができ、ｉｎ ｖｉｖｏでほ乳類の細胞に、例えばＫＬＦ５遺伝子およびＫＬＦ５により転写が活性化される遺伝子の発現を抑制するＲＮＡを導入することができ、ＫＬＦ５遺伝子およびＫＬＦ５により転写が活性化される遺伝子等の発現の抑制ができる。本発明の組成物によって、例えばＫＬＦ５遺伝子およびＫＬＦ５により転写が活性化される遺伝子の発現が抑制され、平滑筋の増殖や血管新生を抑制できるので、本発明の組成物を、動脈硬化、冠動脈インターベンション後の再狭窄、心肥大等の心血管系疾患、癌等の治療剤または予防剤の有効成分として使用することができる。また、前記ＲＮＡの標的遺伝子が腫瘍や炎症に関連する遺伝子や管新生に関連する遺伝子である場合、例えば、腫瘍の治療剤として該組成物を投与することで、腫瘍の治療を行うことや、炎症の治療剤として該組成物を投与することで、炎症の治療を行うことができる。また、本発明の組成物は、ｉｎ ｖｉｖｏのスクリーニング系においてピーオーシー［ＰＯＣ（Ｐｒｏｏｆ ｏｆ ｃｏｎｃｅｐｔ）］取得のツールとして使用することもできる。

本発明の組成物は、例えば血液成分等の生体成分（例えば血液、消化管等）中での前記ＲＮＡの安定化、副作用の低減、腫瘍等の標的臓器への薬剤集積性の増大、経口や経粘膜での薬剤の吸収の改善等を目的とする製剤としても使用できる。
本発明の組成物を、医薬品の製剤として使用する場合、投与経路としては、治療に際し最も効果的なものを使用するのが望ましく、口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内、静脈内等の非経口投与または経口投与をあげることができ、好ましくは静脈内投与または筋肉内投与をあげることができ、より好ましくは静脈内投与があげられる。

静脈内投与または筋肉内投与に適当な製剤としては、例えば注射剤があげられ、上述の方法により調製したリポソームＡの分散液をそのまま例えば注射剤等の形態として用いることも可能であるが、該分散液から例えば濾過、遠心分離等によって溶媒を除去して使用することも、該分散液、または例えばマンニトール、ラクトース、トレハロース、マルトース、グリシン等の賦形剤を加えた分散液を凍結乾燥して使用することもできる。

注射剤の場合、前記のリポソームＡの分散液または前記の溶媒を除去または凍結乾燥したリポソームＡに、例えば水、酸、アルカリ、種々の緩衝液、生理的食塩液、アミノ酸輸液等を混合して注射剤を調製することが好ましい。また、例えばクエン酸、アスコルビン酸、システイン、ＥＤＴＡ等の抗酸化剤、グリセリン、ブドウ糖、塩化ナトリウム等の等張化剤等を添加して注射剤を調製することも可能である。また、例えばグリセリン等の凍結保存剤を加えて凍結保存することもできる。

また、リポソームＡは、適当な賦形剤等と共に造粒、乾燥する等して例えばカプセル剤、錠剤、顆粒剤等の経口用製剤に加工してもよい。

本発明のリポソームは、リポソームＡのうち、リード粒子と前記ＲＮＡを構成成分とする複合粒子および該複合粒子を被覆する脂質膜から構成され、該脂質膜の構成成分が可溶な極性有機溶媒を含む液の中に、該脂質膜の構成成分が分散可能で、該複合粒子も分散可能な濃度で該極性有機溶媒を含む液が存在する、リポソーム、またはカチオン性脂質を含むリード粒子と前記ＲＮＡを構成成分とする複合粒子、および該複合粒子を被覆する脂質膜から構成され、該脂質膜が、中性脂質および水溶性物質の脂質誘導体、脂肪酸誘導体または脂肪族炭化水素誘導体を構成成分とするリポソームがあげられる。

次に、実施例および参考例により、本発明を具体的に説明する。ただし、本発明はこれら実施例および参考例に限定されるものではない。

参考例１ ｓｉＲＮＡの調製１
ＫＬＦ５遺伝子の発現を抑制できるｓｉＲＮＡの配列として、マウスＫＬＦ５ ｃＤＮＡの配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＮＭ＿００９７６９、配列番号４１）から、（ａ）ＡＡではじまる２１塩基の配列、（ｂ）ＧＣ含量が２０〜８０％の２つの条件に当てはまる、１１個の部分配列を選択した。ただし、開始コドン（配列番号４１の１６７〜１６９番目の配列）より７５塩基以上下流の、コード領域（配列番号１６７〜１５０７番目の配列）内の配列で、ＧＣ含量が４０〜６０％のものをなるべく選択するようにした。選択した配列の配列番号４１における配列の位置、ＧＣ含量を第１表に示した。選択した配列の５’端のＡＡを除いた１９塩基の配列のＴをＵに変えた配列をそれぞれ配列番号１〜１１に示した。

配列番号１〜１１のいずれかの配列および該配列と相補的な配列の３’端にそれぞれ２個のＵまたはｄＴを付加した配列からなる１１種類の二本鎖ＲＮＡ（以下、それぞれｓｉＲＮＡ Ｎｏ．１〜Ｎｏ．１１とよぶ）を以下のようにして調製した。ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．１〜Ｎｏ．１１それぞれのセンス鎖およびアンチセンス鎖の配列を第１表に示した（配列番号１７〜３８）。ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．１は、配列番号１７および１８の配列からなる２本のＲＮＡを、株式会社日本バイオサービスに依頼して化学合成し、アニーリングさせることにより調製した。ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．２〜Ｎｏ．１１はサイレンサーｓｉＲＮＡ作製キット（Ｓｉｌｅｎｃｅｒ^ＴＭｓｉＲＮＡ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ、アンビオン社製）を利用したインビトロ転写により調製した。インビトロ転写の鋳型作製に用いるＤＮＡは、北海道システム・サイエンス株式会社に化学合成を依頼した。

参考例２ ｓｉＲＮＡの調製２
参考例１で得られたｓｉＲＮＡ Ｎｏ．２〜４および７〜１１について、マウスＫＬＦ５ ｃＤＮＡと、ヒトＫＬＦ５ ｃＤＮＡを、配列の相同性に基づいてアライメントすることにより、マウスで選択された配列と対応するヒトの配列を得た。第２表に、設計のもとにしたマウスＫＬＦ５ ｃＤＮＡ上の２１塩基の配列および配列番号４１におけるその位置と、該マウス配列に対応するヒトｃＤＮＡ上の２１塩基の配列、配列番号４２におけるその位置、該ヒト配列から５’端のＡＡを除いたＲＮＡの配列を表す配列番号を示した。なお、ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．５および６は、非コード領域の配列をもとにしているため、対応するヒト配列は示さなかった。

ＤＯＴＡＰ（アバンチポーラルリピッズ社製）／ＰＥＧ−ＤＳＰＥ（日本油脂製、以下同様）／蒸留水を３０ｍｇ／１２ｍｇ／ｍＬになるように混合し、ボルテックスミキサーで振とう攪拌した。得られた分散液を室温で０．４μｍのポリカーボネートメンブランフィルター（ワットマン製）に４回、０．１μｍのポリカーボネートメンブランフィルター（ワットマン製）に１０回、さらに０．０５μｍのポリカーボネートメンブランフィルター（ワットマン製）に２４回通してリード粒子を調製した。得られたリード粒子の分散液０．５ｍＬに、参考例１または２のｓｉＲＮＡ Ｎｏ．４の８ｍｇ／ｍＬ水溶液０．２５ｍＬを添加し、エタノール１ｍＬを加えて複合粒子を調製した。得られた複合粒子の分散液に、脂質膜の構成成分のＥＰＣ（日本油脂製）／ＰＥＧ−ＤＳＰＥを１２０ｍｇ／２５ｍｇ／ｍＬになるようにエタノールに溶解した溶液０．２５ｍＬを添加し、次に蒸留水２３ｍＬを徐々に加え、エタノールの濃度が５ｖｏｌ％以下になるよう調整しリポソームを調製した。得られたリポソームの分散液を超遠心（１時間、１１０，０００×ｇ、２５℃）し、上清を除去し、生理食塩水を添加して再分散させてリポソーム分散液を得た（ＰＥＧ−ＤＳＰＥエタノール溶液）。ＥＰＣ １２０重量部に対して５０重量部のＰＥＧ−ＤＳＰＥを少量（リポソーム分散液の約１／２５容量）のエタノールに溶解した。リポソーム分散液とＰＥＧ−ＤＳＰＥエタノール溶液をそれぞれ７０℃で２分間加熱した。ついで、ＰＥＧ−ＤＳＰＥエタノール溶液にリポソーム分散液を添加し、混合後、７０℃で２分間の加熱後、水冷し、製剤を得た。
製剤は３ロット調製した。

動的光散乱法（Ａ ｍｏｄｅｌ ＥＬＳ−８００、大塚電子）でリポソームの平均粒子径を測定したところ、それぞれ１０２、１０３、９５ｎｍであった。

実施例１と同様にして得られるリード粒子の分散液０．５ｍＬに、参考例１または２のｓｉＲＮＡ Ｎｏ．１〜３および５〜１６のそれぞれの８ｍｇ／ｍＬ水溶液０．２５ｍＬを添加し、エタノール１ｍＬを加えて、該ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．１〜３および５〜１６のそれぞれの複合粒子が得られる。得られた複合粒子の分散液に、実施例１と同様の操作をして該ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．１〜３および５〜１６のそれぞれの封入されたリポソームが得られる。得られたリポソームについて実施例１と同様の操作をして該ｓｉＲＮＡＮｏ．１〜３および５〜１６のそれぞれの製剤が得られる。

比較例１
実施例１におけるｓｉＲＮＡを、ｓｃｒａｍｂｌｅｄ ＫＬＦ５−ｓｉＲＮＡ（ｓｅｎｓｅ ｓｔｒａｎｄ，５’−ＧＧＵ ＡＣＡ ＣＡＵ ＧＵＧ ＣＡＣ ＡＣＡ Ｃ−ｄＴｄＴ−３’；ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｓｔｒａｎｄ，５’−ＧＵＧ ＵＧＵ ＧＣＡ ＣＡＵ ＧＵＧ ＵＡＣ Ｃ−ｄＴｄＴ−３’、北海道システムサイエンス社）に変え、同様に製剤を得た。製剤は３ロット以上調製した。なお、ｓｃｒａｍｂｌｅｄ ＫＬＦ５−ｓｉＲＮＡは、ＫＬＦ５−ｍＲＮＡの配列および該配列と相補的な配列を含まないＲＮＡである。
動的光散乱法（ゼータサイザーナノ−ＺＳ、マルバーン製）でリポソームの平均粒子径を測定したところ、一例をとると、８８ｎｍであった。

比較例２
参考例１または２のｓｉＲＮＡ Ｎｏ．４（ＫＬＦ５ｓｉＲＮＡ）を生理食塩水に溶解し、０．５ｍｇ／ｍＬ水溶液を調製した。

比較例３
比較例１と同じｓｃｒａｍｂｌｅｄ ＫＬＦ５ｓｉＲＮＡを生理食塩水に溶解し、０．５ｍｇ／ｍＬ水溶液を調製した。

試験例１
１×１０^６個のＭｕｒｉｎｅ ＬＬ／２；ｌｅｗｉｓ ｌｕｎｇ ｃａｒｃｉｎｏｍａ［“ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）”，２００３年，２７８巻，ｐ．３４５９８−３４６０４］をマウス（ＢＬ６Ｊ ｍｏｕｓｅ、オス、５週齢）の皮下に投与した。ＬＬ／２は、その増殖が血管新生の影響を大きく受けることから、血管新生阻害剤のスクリーニングに使用されている。細胞が固定された時点（皮下投与後１〜２日）から、実施例１で得られた製剤を、連日、尾静脈内投与した。投与した製剤は、予めリン酸緩衝生理食塩水で総脂質濃度が５ｍｇ／ｍＬになるように希釈しており、マウスに対する投与量はｓｉＲＮＡ １５０μｇ／ｓｈｏｔ／ｍｏｕｓｅ／ｄａｙとした。

経時的に、マウスに植え付けた腫瘍の大きさを測定し、腫瘍の増殖を測定した。結果を図１に示す。

また、投与１０日後にマウスから、腫瘍を摘出し、癌細胞周辺の血管新生を観察すると共に、癌周辺切片を次の方法でＣＤ３１免疫染色およびヘマトキシリン・エオジン染色を行って顕微鏡で観察した。

ＣＤ３１免疫染色
メタノール固定した腫瘍をパラフィンで埋包した後、厚さ５μｍの切片を作成し、切片を脱パラフィン化後、室温で１０分間、０．５％ヤギ血清を添加しブロッキングした。ブロッキング液を吸引後、抗マウスＣＤ３１抗体（１００倍希釈）［ファーミンゲン（ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）社製］を添加し室温で２時間静置した。ＰＢＳで洗浄後、ビオチン付抗ラットＩｇ抗体（２００倍希釈）（ＤＡＫＯ社製）を添加し室温で１時間静置した。ＰＢＳで洗浄後、ＡＢＣ−ＡＰキットＡＫ−５０００［ベクター・ラボラトリー（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）社製］を添加し室温で３０分間静置した。ＰＢＳで洗浄後、Ｖｅｃｔｏｒ Ｒｅｄ ＳＫ−５１００［ベクター・ラボラトリー（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）社製］を添加し室温で３０分間静置して発色させた。水洗後、ヘマトキシン染色液で後染色し、脱水して、顕微鏡で観察した。

ヘマトキシリン・エオジン染色
メタノール固定した腫瘍をパラフィンで埋包した後、厚さ５μｍの切片を作成した。切片を脱パラフィン化後、流水で洗浄し、蒸留水を通した。ヘマトキシリン染色液を添加し５分間静置した。水洗し、０．５％塩酸水を添加し分別した。流水で５分間色出し水洗後、蒸留水を通した。エオジン染色液を添加し３分間静置した。９５％エタノールで分別、脱水して、顕微鏡で観察した。

図１によると、実施例１で得られた製剤を投与した群では、無処理群と比べ、癌細胞の増殖が抑制された。また、投与１０日後の癌細胞周辺の観察において、実施例１で得られた製剤を投与した群では、無処理群と比べ、腫瘍自身の大きさも小さい上、腫瘍中心部が大きく壊死していることが観察された。さらに、実施例１で得られた製剤を投与した群のヘマトキシリン・エオジン染色およびＣＤ３１免疫染色した腫瘍組織切片の顕微鏡観察において、無処理群と比較して、腫瘍周辺および腫瘍内で観察された血管内皮細胞が減少していることが観察され、実施例１で得られた製剤を投与した群は、血管新生が抑制されていることが明らかであった。

すなわち、抗血管新生効果および癌細胞の増殖が抑制されたことより、本発明の組成物は、例えばＫＬＦ５−ｓｉＲＮＡをほ乳類に静脈内投与した場合に、効率よく腫瘍近傍に到達することができ、ＫＬＦ５遺伝子の発現を抑制することが可能であることが明らかとなった。

試験例２
１×１０^６個のＭｕｒｉｎｅ ＬＬ／２；ｌｅｗｉｓ ｌｕｎｇ ｃａｒｃｉｎｏｍａをマウス（Ｃ５７ＢＬ／６ｊｊｃｌ ｍｏｕｓｅ、オス、６週齢、日本クレア）の腋部皮下に投与した。腫瘍細胞注射２日後から８日後まで、５０μｇのｓｉＲＮＡを含む製剤（実施例１、比較例１）、５０μｇのｓｉＲＮＡをｓｉＲＮＡ溶液（比較例２、３）および生理食塩水を、それぞれ連日、尾静脈内投与した。

経時的に、マウスに植え付けた腫瘍の大きさを測定した。腫瘍体積を、腫瘍の長径×（短径）^２×１／２で計算し、有意差をＴｕｋｅｙ−ｋｒａｍｅｒ法で検定した。結果を図２に示す。

また、投与１０日後にマウスから、腫瘍を摘出し、癌細胞周辺の血管新生を観察すると共に、癌周辺切片を次の方法でＣＤ３１免疫染色し、組織切片に見られるＣＤ３１構造をカウントした。一つの腫瘍あたり２視野、各５腫瘍をカウントし、その平均を示した。有意差をＴｕｋｅｙ−ｋｒａｍｅｒ法で検定した。結果を図３に示す。
ＣＤ３１免疫染色
腫瘍を摘出し、９５％メタノール溶液で固定した後、パラフィンに包埋した。５μｍ厚にスライスした腫瘍を脱パラフィン後、１００倍希釈した抗ＣＤ３１ポリクローナル抗体（ファーミンジェン社製、米国）室温で１２０分間作用させた。ＣＤ３１抗体を洗浄後、２００倍希釈したビオチン化抗ラットＩｇＧ（ダコ社製、米国）を室温で６０分間作用させた。さらに洗浄後、ＨＲＰ化アビジン（ベクター社製、米国）を室温で３０分間作用させた。洗浄後、ジアミノベンジジン（シグマ社製、米国）で発色させた。

図２によると、実施例１で得られた製剤を投与した群のみ、有意に腫瘍増殖の抑制効果が見られた。また、図３によると、実施例１で得られた製剤を投与した群は、新生血管を示すＣＤ３１の茶色の構造が少なく、腫瘍の血管新生が阻害されている。

試験例３
１×１０^６個のＭｕｒｉｎｅ ＬＬ／２；ｌｅｗｉｓ ｌｕｎｇ ｃａｒｃｉｎｏｍａをマウス（Ｃ５７ＢＬ／６ｊｊｃｌ ｍｏｕｓｅ、オス、６週齢、日本クレア）の腋部皮下に投与した。５０μｇのｓｉＲＮＡを含む製剤（実施例１、比較例１）、５０μｇのｓｉＲＮＡを含むｓｉＲＮＡ溶液（比較例２、３）および生理食塩水を、それぞれ投与し、投与３６時間後に腫瘍を摘出し、次の方法でｍＲＮＡ発現量およびＫＬＦ５の量を測定した。

ｍＲＮＡ発現量の測定
摘出した腫瘍細胞を、ＲＮｅａｓｙ Ｆｉｂｒｏｕｓ ｔｉｓｓｕｅ ｋｉｔ（キアゲン社製）を用い、ジルコニアボールと破砕機（ＭＭ３００、キアゲン）を用いて溶解した後精製してＲＮＡを取得した。ｃＤＮＡはＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（インビトロジェン社製、米国）を用い、１μｇのＲＮＡからランダムプライマーで逆転写した。ｃＤＮＡはＨｏｔ Ｓｔａｒ Ｔａｑ^ＴＭ（キアゲン社製）と、特異的プライマーを用いて増幅した。このとき、リボソーマル１８ＳＲＮＡプライマーを内部標準として用いた。増幅サイクルは、９５℃１５分→（９４℃３０秒→５３℃３０秒→７２℃３０秒）×４５回とし、プライマー配列は以下の通りとした：５′−ＧＧＴＴＧＣＡＣＡＡＡＡＧＴＴＴＡＴＡＣ−３′、５′−ＧＧＣＴＴＧＧＣＧＣＣＴＧＴＧＴＧＣＴＴＣＣ−３′。ｍＲＮＡ発現量をＡＢＩＰＲＩＳＭ^ＴＭ７９００ＨＴ（アプライドバイオシステム社製、米国）とＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ ｋｉｔ（キアゲン社製）を使って定量した。ＱｕａｎｔｕｍＲＮＡ^ＴＭＣｌａｓｓｉｃ １８Ｓ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＲＮＡ ｐｒｉｍｅｒ（アンビオン社製、米国）を内部標準物質として標準化した。有意差をＴｕｋｅｙ−ｋｒａｍｅｒ法で検定した。結果を図４に示す。

ＫＬＦ５量の測定
摘出した腫瘍細胞を、適量の溶解用溶液（１５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ，２０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ，ｐＨ ７．５，０．１％Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０，０．１％ Ｓｏｄｉｕｍ ｌａｕｌｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ，０．５％ Ｓｏｄｉｕｍ ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ，０．１ｍｍｏｌ／Ｌ ＤＴＴ，タンパク分解酵素阻害剤）に浸し、ジルコニアボールと破砕機（ＭＭ３００、キアゲン）を用いて溶解し、遠心上清を取得した。タンパク濃度はＤｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ ｒｅａｇｅｎｔ（バイオラッド、米国）を用いて測定した。１０μｇのタンパクを９５℃で１５分間加熱処理し、１０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付した。泳動したタンパクはニトロセルロース膜（アマシャム社製、米国）に転写し、ブロッキング処理（５％スキムミルク中で振とう）をした後、１０００倍した抗ＫＬＦ５モノクローナル抗体（協和発酵工業製）中で１時間振とうした。膜を洗浄後、２０００倍したＨＲＰラベル化抗ラットＩｇＧ（アマシャム社製）処理し、洗浄後に蛍光発色試薬（ＥＣＬｐｌｕｓ、アマシャム社製）で発色し、ウエスタンブロッティングのバンドを、画像解析ソフト（Ｉｍａｇｅ Ｑｕａｎｔ、アマシャム社製）を用いて定量した。一群３匹、ＫＬＦ５ｓｉＲＮＡ投与群のみ一群５匹で定量を行った。有意差をＴｕｋｅｙ−ｋｒａｍｅｒ法で検定した。結果を図５に示す。

図４によると、実施例１で得られた製剤の投与群のみ、ＫＬＦ５ｍＲＮＡの産生抑制が観察された。図５によると、実施例１で得られた製剤の投与群のみ、ＫＬＦ５の産生抑制が観察された。

参考試験例１
１×１０^６個のＭｕｒｉｎｅ ＬＬ／２；ｌｅｗｉｓ ｌｕｎｇ ｃａｒｃｉｎｏｍａをマウス（Ｃ５７ＢＬ／６ｊｊｃｌ ｍｏｕｓｅ、オス、５〜６週齢）の腋部皮下に投与した。腫瘍細胞注射２日後から８日後まで、１μｇのｓｉＲＮＡを含むｓｉＲＮＡ溶液（比較例２、比較例３）および生理食塩水を、それぞれ連日、腫瘍に直接投与した。

経時的に、マウスに植え付けた腫瘍の大きさを測定した。腫瘍体積を、腫瘍の長径×（短径）^２×１／２で計算し、有意差をＴｕｋｅｙ−ｋｒａｍｅｒ法で検定した。結果を図６に示す。
図６によると、比較例１で得られたＫＬＦ５ｓｉＲＮＡ溶液投与群で腫瘍の成長が抑制される傾向が見られたが、有意差は見られなかった。

また、投与１０日後にマウスから、腫瘍を摘出し、試験例２と同様に癌周辺切片をＣＤ３１免疫染色し、観察した。新生血管を示すＣＤ３１に、両群で明らかな差は見られなかった。

実施例１におけるｓｉＲＮＡを、ｂｃｌ２−ｓｉＲＮＡ（ｓｅｎｓｅ ｓｔｒａｎｄ，５’−ＧＵＧＡＡＧＵＣＡＡＣＡＵＧＣＣＵＧＣ−ｄＴｄＴ−３’；ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｓｔｒａｎｄ，５’−ＧＣＡＧＧＣＡＵＧＵＵＧＡＣＵＵＣＡＣ−ｄＴｄＴ−３’、ダーマコン社または北海道システムサイエンス社）に変え、同様に製剤を得た。製剤は３ロット以上調製した。
動的光散乱法（ゼータサイザーナノ−ＺＳ、マルバーン製）でリポソームの平均粒子径を測定したところ、一例をとると、１１０ｎｍであった。

比較例４
実施例１におけるｓｉＲＮＡを、ＧＬ３−ｓｉＲＮＡ（ｓｅｎｓｅ ｓｔｒａｎｄ，５’−ＣＵＵＡＣＧＣＵＧＡＧＵＡＣＵＵＣＧＡ−ｄＴｄＴ−３’；ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｓｔｒａｎｄ，５’−ＵＣＧＡＡＧＵＡＣＵＣＡＧＣＧＵＡＡＧ−ｄＴｄＴ−３’、ダーマコン社または北海道システムサイエンス社）に変え、同様に製剤を得た。製剤は３ロット以上調製した。なお、ＧＬ３−ｓｉＲＮＡは、ｂｃｌ２−ｍＲＮＡの配列および該配列と相補的な配列を含まないＲＮＡである。
動的光散乱法（ゼータサイザーナノ−ＺＳ、マルバーン製）でリポソームの平均粒子径を測定したところ、一例をとると、９９ｎｍであった。

比較例５
実施例３と同じｂｃｌ２−ｓｉＲＮＡを生理食塩水に溶解し、０．５ｍｇ／ｍＬ水溶液を調製した。

試験例４
１×１０^７個のヒト前立腺癌細胞ＤＵ１４５（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＨＴＢ−８１）をヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃＡＪｃｌ−ｎｕ、オス、５週齢、日本クレア）の皮下に投与した。皮下投与１７日後に腫瘍の大きさを測定し、１５０−３５０ｍｍ^３に達したヌードマウスを選択し、実施例３で得られた製剤を、尾静脈内投与した。投与は５日間連続して行った後、２日間休薬し、さらに５日間連続投与した。
投与した製剤は、予め生理食塩水でｓｉＲＮＡ濃度が０．７５ｍｇ／ｍＬになるように希釈し、マウスに対して、投与量をｓｉＲＮＡ１５０μｇ／ｓｈｏｔ／ｍｏｕｓｅ／ｄａｙとした。
経時的に、マウスに植え付けた腫瘍の大きさを測定し、腫瘍の増殖を測定した。結果を図７に示す。
図７によると、実施例３で得られた製剤を投与した群では、無処理群と比べ、癌細胞の増殖が抑制された。

試験例５
１×１０^６個のヒト前立腺癌細胞ＰＣ−３（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ−１４３５）をヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃＡＪｃｌ−ｎｕ、オス、６週齢、日本クレア）の皮下に投与した。皮下投与６日後に腫瘍の大きさを測定し、８０−１２０ｍｍ^３に達したヌードマウスを選択し、実施例３、比較例４、５で得られた製剤を、尾静脈内投与した。投与は５日間連続して行った後、２日間休薬し、さらに５日間連続投与した。
投与した製剤は、予め生理食塩水でｓｉＲＮＡ濃度が０．７５ｍｇ／ｍＬになるように希釈し、マウスに対して、投与量をｓｉＲＮＡ １５０μｇ／ｓｈｏｔ／ｍｏｕｓｅ／ｄａｙとした。
経時的に、マウスに植え付けた腫瘍の大きさを測定し、腫瘍の増殖を測定した。結果を図８に示す。
図８によると、実施例３で得られた製剤を投与した群では、無処理群、比較例４で得られた製剤および比較例５で得られた溶液を投与した群と比べ、癌細胞の増殖が抑制された。

本発明の標的遺伝子のｍＲＮＡの連続する１５〜３０塩基の配列および該配列と相補的な配列を含むＲＮＡを封入したリポソームを含有する組成物を、ほ乳類等に投与することにより、該標的遺伝子の発現を抑制することができる。

「配列表フリーテキスト」
配列番号１−発明者：山内雅博；鳥取恒彰；石原淳；八木信宏；加藤泰己
配列番号１７−ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．１センス鎖
配列番号１８−ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．１アンチセンス鎖
配列番号１９−ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．２センス鎖
配列番号２０−ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．２アンチセンス鎖
配列番号２１−ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．３センス鎖
配列番号２２−ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．３アンチセンス鎖
配列番号２３−ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．４センス鎖
配列番号２４−ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．４アンチセンス鎖
配列番号２５−ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．５センス鎖
配列番号２６−ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．５アンチセンス鎖
配列番号２７−ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．６センス鎖
配列番号２８−ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．６アンチセンス鎖
配列番号２９−ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．７センス鎖
配列番号３０−ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．７アンチセンス鎖
配列番号３１−ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．８センス鎖
配列番号３２−ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．８アンチセンス鎖
配列番号３３−ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．９センス鎖
配列番号３４−ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．９アンチセンス鎖
配列番号３５−ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．１０センス鎖
配列番号３６−ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．１０アンチセンス鎖
配列番号３７−ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．１１センス鎖
配列番号３８−ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．１１アンチセンス鎖
配列番号３９−ＳＥＡＰ−ｓｉＲＮＡ センス鎖
配列番号４０−ＳＥＡＰ−ｓｉＲＮＡ アンチセンス鎖

Claims (37)

1. 標的遺伝子のｍＲＮＡの連続する１５〜３０塩基の配列および該配列と相補的な配列を含むＲＮＡを封入したリポソームを含有し、該リポソームが標的遺伝子の発現部位を含む組織または臓器に到達するリポソームである、組成物。
2. リポソームが、静脈内投与可能な大きさのリポソームである、請求項１記載の組成物。
3. ＲＮＡが、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を利用した該標的遺伝子の発現抑制作用を有するＲＮＡである、請求項１または２記載の組成物。
4. 標的遺伝子が、腫瘍や炎症に関連する遺伝子である、請求項１〜３のいずれかに記載の組成物。
5. 標的遺伝子が、血管新生に関連する遺伝子である、請求項１〜４のいずれかに記載の組成物。
6. ｍＲＮＡがＫＬＦ５ ｍＲＮＡである、請求項１〜３のいずれかに記載の組成物。
7. ｍＲＮＡがヒトまたはマウスのＫＬＦ５ ｍＲＮＡである、請求項１〜３のいずれかに記載の組成物。
8. ＲＮＡが、ＫＬＦ５ ｍＲＮＡの連続する１５〜３０塩基の配列の鎖および該配列と相補的な配列の鎖からなる二本鎖ＲＮＡのそれぞれの鎖の３’端にヌクレオチドの１種または複数種のあわせて１〜６個が同一または異なって付加した二本鎖ＲＮＡである、請求項６または７記載の組成物。
9. ＲＮＡが、ＫＬＦ５ ｍＲＮＡの連続する１５〜３０塩基の配列からなるＲＮＡおよび該配列と相補的な配列からなるＲＮＡが、スペーサーオリゴヌクレオチドでつながれ、３’端にヌクレオチドの１種または複数種のあわせて１〜６個が付加した、ヘアピン構造を有するＲＮＡである、請求項６または７記載の組成物。
10. ＲＮＡが、以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群から選ばれるＲＮＡである、請求項６または７記載の組成物。
    （ａ）配列番号２〜１６のいずれか１つの配列の鎖および該配列と相補的な配列の鎖からなる二本鎖ＲＮＡのそれぞれの鎖の３’端にウリジル酸およびデオキシチミジル酸のいずれか１種または２種あわせて２〜４個が同一または異なって付加した二本鎖ＲＮＡ
    （ｂ）配列番号２〜１６のいずれか１つの配列からなるＲＮＡおよび該配列と相補的な配列からなるＲＮＡが２個のウリジル酸またはデオキシチミジル酸を５’端に有するスペーサーオリゴヌクレオチドでつながれ、３’端にウリジル酸およびデオキシチミジル酸のいずれか１種または２種あわせて２〜４個が付加した、ヘアピン構造を有するＲＮＡ
    （ｃ）配列番号２〜１１のいずれか１つの配列の鎖および該配列と相補的な配列の鎖からなる二本鎖ＲＮＡのそれぞれの鎖の３’端にウリジル酸２個が付加した二本鎖ＲＮＡ
11. ｍＲＮＡがｂｃｌ２ ｍＲＮＡである、請求項１〜３のいずれかに記載の組成物。
12. ＲＮＡを封入したリポソームが、リード粒子と該ＲＮＡを構成成分とする複合粒子および該複合粒子を被覆する脂質膜から構成され、
    該脂質膜の構成成分が可溶な極性有機溶媒を含む液の中に、該脂質膜の構成成分が分散可能で、該複合粒子も分散可能な濃度で該極性有機溶媒を含む液が存在する、リポソームである、請求項１〜１１に記載の組成物。
13. 極性有機溶媒がアルコールである、請求項１２記載の組成物。
14. 極性有機溶媒がエタノールである、請求項１２記載の組成物。
15. リード粒子が、カチオン性脂質を含むリード粒子であり、脂質膜が、中性脂質および水溶性物質の脂質誘導体、脂肪酸誘導体または脂肪族炭化水素誘導体を構成成分とする、請求項１２〜１４のいずれかに記載の組成物。
16. ＲＮＡを封入したリポソームが、カチオン性脂質を含むリード粒子と前記ＲＮＡを構成成分とする複合粒子および該複合粒子を被覆する脂質膜から構成され、
    該脂質膜が、中性脂質および水溶性物質の脂質誘導体、脂肪酸誘導体または脂肪族炭化水素誘導体を構成成分とするリポソームである、請求項１〜１１のいずれかに記載の組成物。
17. カチオン性脂質がＮ−［１−（２，３−ジオレオイルプロピル）］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル塩化アンモニウム、Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルプロピル）］−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミン、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシプロピル）］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル塩化アンモニウム、Ｎ−［１−（２，３−ジテトラデシルオキシプロピル）］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチル臭化アンモニウムおよび３β−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエチル）カルバモイル］コレステロールから選ばれる一つ以上である、請求項１５または１６記載の組成物。
18. 水溶性物質の脂質誘導体、脂肪酸誘導体または脂肪族炭化水素誘導体が、ポリエチレングリコール−ホスファチジルエタノールアミンである、請求項１５〜１７のいずれかに記載の組成物。
19. 中性脂質が卵黄ホスファチジルコリンである、請求項１５〜１８のいずれかに記載の組成物。
20. リード粒子と標的遺伝子のｍＲＮＡの連続する１５〜３０塩基の配列および該配列と相補的な配列を含むＲＮＡを構成成分とする複合粒子および該複合粒子を被覆する脂質膜から構成され、
    該脂質膜の構成成分が可溶な極性有機溶媒を含む液の中に、該脂質膜の構成成分が分散可能で、該複合粒子も分散可能な濃度で該極性有機溶媒を含む液が存在する、該ＲＮＡを封入したリポソーム。
21. 極性有機溶媒がアルコールである、請求項２０記載のリポソーム。
22. 極性有機溶媒がエタノールである、請求項２０記載のリポソーム。
23. リード粒子が、カチオン性脂質を含むリード粒子であり、脂質膜が、中性脂質および水溶性物質の脂質誘導体、脂肪酸誘導体または脂肪族炭化水素誘導体を構成成分とする、請求項２０〜２２のいずれかに記載のリポソーム。
24. カチオン性脂質を含むリード粒子と標的遺伝子のｍＲＮＡの連続する１５〜３０塩基の配列および該配列と相補的な配列を含むＲＮＡとを構成成分とする複合粒子、および該複合粒子を被覆する脂質膜から構成され、
    該脂質膜が、中性脂質および水溶性物質の脂質誘導体、脂肪酸誘導体または脂肪族炭化水素誘導体を構成成分とする、該ＲＮＡを封入したリポソーム。
25. カチオン性脂質がＮ−［１−（２，３−ジオレオイルプロピル）］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル塩化アンモニウム、Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルプロピル）］−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミン、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシプロピル）］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル塩化アンモニウム、Ｎ−［１−（２，３−ジテトラデシルオキシプロピル）］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチル臭化アンモニウムおよび３β−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエチル）カルバモイル］コレステロールから選ばれる一つ以上である、請求項２３または２４記載のリポソーム。
26. 水溶性物質の脂質誘導体、脂肪酸誘導体または脂肪族炭化水素誘導体が、ポリエチレングリコール−ホスファチジルエタノールアミンである、請求項２０〜２５のいずれかに記載のリポソーム。
27. 中性脂質が卵黄ホスファチジルコリンである、請求項２０〜２６のいずれかに記載のリポソーム。
28. ＲＮＡが、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を利用した該標的遺伝子の発現抑制作用を有するＲＮＡである、請求項２０〜２７のいずれかに記載のリポソーム。
29. 標的遺伝子が、腫瘍や炎症に関連する遺伝子である、請求項２０〜２８のいずれかに記載のリポソーム。
30. 標的遺伝子が、血管新生に関連する遺伝子である、請求項２０〜２８のいずれかに記載のリポソーム。
31. ｍＲＮＡがＫＬＦ５ｍＲＮＡである、請求項２０〜２８のいずれかに記載のリポソーム。
32. ｍＲＮＡがヒトまたはマウスのＫＬＦ５ ｍＲＮＡである、請求項２０〜２８のいずれかに記載のリポソーム。
33. ＲＮＡが、ＫＬＦ５ ｍＲＮＡの連続する１５〜３０塩基の配列の鎖および該配列と相補的な配列の鎖からなる二本鎖ＲＮＡのそれぞれの鎖の３’端にヌクレオチドの１種または複数種あわせて１〜６個が同一または異なって付加した二本鎖ＲＮＡである、請求項３１または３２記載のリポソーム。
34. ＲＮＡが、ＫＬＦ５ ｍＲＮＡの連続する１５〜３０塩基の配列からなるＲＮＡおよび該配列と相補的な配列からなるＲＮＡが、スペーサーオリゴヌクレオチドでつながれ、３’端にヌクレオチドの１種または複数種あわせて１〜６個が付加した、ヘアピン構造を有するＲＮＡである、請求項３１または３２記載のリポソーム。
35. ＲＮＡが、以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群から選ばれるＲＮＡである、請求項３１または３２記載のリポソーム。
    （ａ）配列番号２〜１６のいずれか１つの配列の鎖および該配列と相補的な配列の鎖からなる二本鎖ＲＮＡのそれぞれの鎖の３’端にウリジル酸およびデオキシチミジル酸のいずれか１種または２種あわせて２〜４個が同一または異なって付加した二本鎖ＲＮＡ
    （ｂ）配列番号２〜１６のいずれか１つの配列からなるＲＮＡおよび該配列と相補的な配列からなるＲＮＡが２個のウリジル酸またはデオキシチミジル酸を５’端に有するスペーサーオリゴヌクレオチドでつながれ、３’端にウリジル酸およびデオキシチミジル酸のいずれか１種または２種あわせて２〜４個が付加した、ヘアピン構造を有するＲＮＡ
    （ｃ）配列番号２〜１１のいずれか１つの配列の鎖および該配列と相補的な配列の鎖からなる二本鎖ＲＮＡのそれぞれの鎖の３’端にウリジル酸２個が付加した二本鎖ＲＮＡ
36. ｍＲＮＡがｂｃｌ２ ｍＲＮＡである、請求項２０〜２８のいずれかに記載のリポソーム。
37. 請求項２０〜３６のいずれかに記載のリポソームを含有する組成物。

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