JP2014196344A - 標的遺伝子の発現を抑制する組成物 - Google Patents
標的遺伝子の発現を抑制する組成物 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2014196344A JP2014196344A JP2014140383A JP2014140383A JP2014196344A JP 2014196344 A JP2014196344 A JP 2014196344A JP 2014140383 A JP2014140383 A JP 2014140383A JP 2014140383 A JP2014140383 A JP 2014140383A JP 2014196344 A JP2014196344 A JP 2014196344A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- rna
- sequence
- lipid
- liposome
- strand
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
- C12N15/1135—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against oncogenes or tumor suppressor genes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
- A61K31/7105—Natural ribonucleic acids, i.e. containing only riboses attached to adenine, guanine, cytosine or uracil and having 3'-5' phosphodiester links
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/44—Oils, fats or waxes according to two or more groups of A61K47/02-A61K47/42; Natural or modified natural oils, fats or waxes, e.g. castor oil, polyethoxylated castor oil, montan wax, lignite, shellac, rosin, beeswax or lanolin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/10—Dispersions; Emulsions
- A61K9/127—Liposomes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/14—Vasoprotectives; Antihaemorrhoidals; Drugs for varicose therapy; Capillary stabilisers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
【解決手段】リード粒子と標的遺伝子のmRNAの連続する15〜30塩基の配列および該配列と相補的な配列を含むRNAを構成成分とする複合粒子および該複合粒子を被覆する脂質膜から構成され、該脂質膜の構成成分が可溶な極性有機溶媒を含む液中に、該脂質膜の構成成分が分散可能で、該複合粒子も分散可能な濃度で該極性有機溶媒を含む液が存在する、該RNAを封入したリポソームを含有する組成物等を提供する。
【選択図】なし
Description
一方、核酸の細胞内への送達手段として、カチオニックリポソームやカチオニックポリマーを用いる方法が知られている。しかし、該方法では、核酸を含有するカチオニックリポソームやカチオニックポリマーを静脈内に投与後、血中から速やかに核酸が除去されてしまい、標的組織が肝臓や肺以外の場合、例えば腫瘍部位等の場合には核酸を標的組織に送達することができず、十分な作用の発現を可能とするに至っていない。そこで、核酸が血中で速やかに除去されるという問題点を解決した核酸封入リポソーム(リポソーム内に核酸を封入したリポソーム)が報告されている(特許文献3〜5および非特許文献3参照)。特許文献3では、核酸等を含有するリポソームの製造方法として、例えば、カチオン性脂質をクロロホルムに予め溶解し、次いでオリゴデオキシヌクレオチド(ODN)の水溶液とメタノールを加え混合後、遠心分離することでクロロホルム層にカチオン性脂質/ODNの複合体を移行させ、さらにクロロホルム層を取り出し、これにポリエチレングリコール化リン脂質と中性の脂質と水を加えて油中水型(W/O)エマルジョンを形成し、逆相蒸発法で処理してODN内包リポソームを製造する方法が報告され、特許文献4および非特許文献3では、ODNを、pH3.8のクエン酸水溶液に溶解し、脂質(エタノール中)を加え、エタノール濃度を20v/v%まで下げてODN内包リポソームを調製し、サイジングろ過し、透析によって、過剰のエタノールを除去した後、試料をさらにpH7.5にて透析してリポソーム表面に付着したODNを除去してODN内包リポソームを製造する方法が報告され、それぞれ核酸等の有効成分を封入したリポソームを製造している。
(1) 標的遺伝子のmRNAの連続する15〜30塩基の配列および該配列と相補的な配列を含むRNAを封入したリポソームを含有し、該リポソームが標的遺伝子の発現部位を含む組織または臓器に到達するリポソームである、組成物。
(2) リポソームが、静脈内投与可能な大きさのリポソームである、前記(1)記載の組成物。
(3) RNAが、RNA干渉(RNAi)を利用した該標的遺伝子の発現抑制作用を有するRNAである、前記(1)または(2)記載の組成物。
(4) 標的遺伝子が、腫瘍や炎症に関連する遺伝子である、前記(1)〜(3)のいずれかに記載の組成物。
(5) 標的遺伝子が、血管新生に関連する遺伝子である、前記(1)〜(4)のいずれかに記載の組成物。
(6) mRNAがKLF5 mRNAである、前記(1)〜(3)のいずれかに記載の組成物。
(7) mRNAがヒトまたはマウスのKLF5 mRNAである、前記(1)〜(3)のいずれかに記載の組成物。
(8) RNAが、KLF5 mRNAの連続する15〜30塩基の配列の鎖および該配列と相補的な配列の鎖からなる二本鎖RNAのそれぞれの鎖の3’端にヌクレオチドの1種または複数種のあわせて1〜6個が同一または異なって付加した二本鎖RNAである、前記(6)または(7)記載の組成物。
(9) RNAが、KLF5 mRNAの連続する15〜30塩基の配列からなるRNAおよび該配列と相補的な配列からなるRNAが、スペーサーオリゴヌクレオチドでつながれ、3’端にヌクレオチドの1種または複数種のあわせて1〜6個が付加した、ヘアピン構造を有するRNAである、前記(6)または(7)記載の組成物。
(10) RNAが、以下の(a)〜(c)からなる群から選ばれるRNAである、前記(6)または(7)記載の組成物。
(a)配列番号2〜16のいずれか1つの配列の鎖および該配列と相補的な配列の鎖からなる二本鎖RNAのそれぞれの鎖の3’端にウリジル酸およびデオキシチミジル酸のいずれか1種または2種あわせて2〜4個が同一または異なって付加した二本鎖RNA
(b)配列番号2〜16のいずれか1つの配列からなるRNAおよび該配列と相補的な配列からなるRNAが2個のウリジル酸またはデオキシチミジル酸を5’端に有するスペーサーオリゴヌクレオチドでつながれ、3’端にウリジル酸およびデオキシチミジル酸のいずれか1種または2種あわせて2〜4個が付加した、ヘアピン構造を有するRNA
(c)配列番号2〜11のいずれか1つの配列の鎖および該配列と相補的な配列の鎖からなる二本鎖RNAのそれぞれの鎖の3’端にウリジル酸2個が付加した二本鎖RNA
(11) mRNAがbcl2 mRNAである、前記(1)〜(3)のいずれかに記載の組成物。
(12) RNAを封入したリポソームが、リード粒子と該RNAを構成成分とする複合粒子および該複合粒子を被覆する脂質膜から構成され、
該脂質膜の構成成分が可溶な極性有機溶媒を含む液の中に、該脂質膜の構成成分が分散可能で、該複合粒子も分散可能な濃度で該極性有機溶媒を含む液が存在する、リポソームである、前記(1)〜(11)に記載の組成物。
(13) 極性有機溶媒がアルコールである、前記(12)記載の組成物。
(14) 極性有機溶媒がエタノールである、前記(12)記載の組成物。
(15) リード粒子が、カチオン性脂質を含むリード粒子であり、脂質膜が、中性脂質および水溶性物質の脂質誘導体、脂肪酸誘導体または脂肪族炭化水素誘導体を構成成分とする、前記(12)〜(14)のいずれかに記載の組成物。
(16) RNAを封入したリポソームが、カチオン性脂質を含むリード粒子と前記RNAを構成成分とする複合粒子および該複合粒子を被覆する脂質膜から構成され、
該脂質膜が、中性脂質および水溶性物質の脂質誘導体、脂肪酸誘導体または脂肪族炭化水素誘導体を構成成分とするリポソームである、前記(1)〜(11)のいずれかに記載の組成物。
(17) カチオン性脂質がN-[1-(2,3-ジオレオイルプロピル)]-N,N,N-トリメチル塩化アンモニウム、N-[1-(2,3-ジオレオイルプロピル)]-N,N-ジメチルアミン、N-[1-(2,3-ジオレイルオキシプロピル)]-N,N,N-トリメチル塩化アンモニウム、N-[1-(2,3-ジテトラデシルオキシプロピル)]-N,N-ジメチル-N-ヒドロキシエチル臭化アンモニウムおよび3β-[N-(N',N'-ジメチルアミノエチル)カルバモイル]コレステロールから選ばれる一つ以上である、前記(15)または(16)記載の組成物。
(18) 水溶性物質の脂質誘導体、脂肪酸誘導体または脂肪族炭化水素誘導体が、ポリエチレングリコール-ホスファチジルエタノールアミンである、前記(15)〜(17)のいずれかに記載の組成物。
(19) 中性脂質が卵黄ホスファチジルコリンである、前記(15)〜(18)のいずれかに記載の組成物。
(20) リード粒子と標的遺伝子のmRNAの連続する15〜30塩基の配列および該配列と相補的な配列を含むRNAを構成成分とする複合粒子および該複合粒子を被覆する脂質膜から構成され、
該脂質膜の構成成分が可溶な極性有機溶媒を含む液の中に、該脂質膜の構成成分が分散可能で、該複合粒子も分散可能な濃度で該極性有機溶媒を含む液が存在する、該RNAを封入したリポソーム。
(21) 極性有機溶媒がアルコールである、前記(20)記載のリポソーム。
(22) 極性有機溶媒がエタノールである、前記(20)記載のリポソーム。
(23) リード粒子が、カチオン性脂質を含むリード粒子であり、脂質膜が、中性脂質および水溶性物質の脂質誘導体、脂肪酸誘導体または脂肪族炭化水素誘導体を構成成分とする、前記(20)〜(22)のいずれかに記載のリポソーム。
(24) カチオン性脂質を含むリード粒子と標的遺伝子のmRNAの連続する15〜30塩基の配列および該配列と相補的な配列を含むRNAとを構成成分とする複合粒子、および該複合粒子を被覆する脂質膜から構成され、
該脂質膜が、中性脂質および水溶性物質の脂質誘導体、脂肪酸誘導体または脂肪族炭化水素誘導体を構成成分とする、該RNAを封入したリポソーム。
(25) カチオン性脂質がN-[1-(2,3-ジオレオイルプロピル)]-N,N,N-トリメチル塩化アンモニウム、N-[1-(2,3-ジオレオイルプロピル)]-N,N-ジメチルアミン、N-[1-(2,3-ジオレイルオキシプロピル)]-N,N,N-トリメチル塩化アンモニウム、N-[1-(2,3-ジテトラデシルオキシプロピル)]-N,N-ジメチル-N-ヒドロキシエチル臭化アンモニウムおよび3β-[N-(N',N'-ジメチルアミノエチル)カルバモイル]コレステロールから選ばれる一つ以上である、前記(23)または(24)記載のリポソーム。
(26) 水溶性物質の脂質誘導体、脂肪酸誘導体または脂肪族炭化水素誘導体が、ポリエチレングリコール-ホスファチジルエタノールアミンである、前記(20)〜(25)のいずれかに記載のリポソーム。
(27) 中性脂質が卵黄ホスファチジルコリンである、前記(20)〜(26)のいずれかに記載のリポソーム。
(28) RNAが、RNA干渉(RNAi)を利用した該標的遺伝子の発現抑制作用を有するRNAである、前記(20)〜(27)のいずれかに記載のリポソーム。
(29) 標的遺伝子が、腫瘍や炎症に関連する遺伝子である、前記(20)〜(28)のいずれかに記載のリポソーム。
(30) 標的遺伝子が、血管新生に関係する遺伝子である、前記(20)〜(28)のいずれかに記載のリポソーム。
(31) mRNAがKLF5mRNAである、前記(20)〜(28)のいずれかに記載のリポソーム。
(32) mRNAがヒトまたはマウスのKLF5 mRNAである、前記(20)〜(28)のいずれかに記載のリポソーム。
(33) RNAが、KLF5 mRNAの連続する15〜30塩基の配列の鎖および該配列と相補的な配列の鎖からなる二本鎖RNAのそれぞれの鎖の3’端にヌクレオチドの1種または複数種あわせて1〜6個が同一または異なって付加した二本鎖RNAである、前記(31)または(32)記載のリポソーム。
(34) RNAが、KLF5 mRNAの連続する15〜30塩基の配列からなるRNAおよび該配列と相補的な配列からなるRNAが、スペーサーオリゴヌクレオチドでつながれ、3’端にヌクレオチドの1種または複数種あわせて1〜6個が付加した、ヘアピン構造を有するRNAである、前記(31)または(32)記載のリポソーム。
(35) RNAが、以下の(a)〜(c)からなる群から選ばれるRNAである、前記(31)または(32)記載のリポソーム。
(a)配列番号2〜16のいずれか1つの配列の鎖および該配列と相補的な配列の鎖からなる二本鎖RNAのそれぞれの鎖の3’端にウリジル酸およびデオキシチミジル酸のいずれか1種または2種あわせて2〜4個が同一または異なって付加した二本鎖RNA
(b)配列番号2〜16のいずれか1つの配列からなるRNAおよび該配列と相補的な配列からなるRNAが2個のウリジル酸またはデオキシチミジル酸を5’端に有するスペーサーオリゴヌクレオチドでつながれ、3’端にウリジル酸およびデオキシチミジル酸のいずれか1種または2種あわせて2〜4個が付加した、ヘアピン構造を有するRNA
(c)配列番号2〜11のいずれか1つの配列の鎖および該配列と相補的な配列の鎖からなる二本鎖RNAのそれぞれの鎖の3’端にウリジル酸2個が付加した二本鎖RNA
(36) mRNAがbcl2 mRNAである、前記(20)〜(28)のいずれかに記載のリポソーム。
(37) 前記(20)〜(36)のいずれかに記載のリポソームを含有する組成物。
(I)配列Xの設計
遺伝子の発現を抑制したい動物のKLF5 cDNAの塩基配列から、AAではじまる21塩基の部分配列を取り出す。取り出した配列のGC含量を計算し、GC含量が20〜80%、好ましくは30%〜70%、より好ましくは40〜60%の配列を複数個選択する。
(II) RNAの調製
(I)で選択した配列Xを元に、以下のようにしてRNA(siRNA、shRNA等)を調製することができる。以下には付加するオリゴヌクレオチドとしてUおよびdTのいずれか1種または2種のあわせて2個の場合を記載するが、他のヌクレオチドの場合も同様にして調製することができる。
(i)siRNAの場合
配列Xの3’端にUおよびdTのいずれか1種または2種あわせて2個が付加した配列からなるRNA、および相補配列X’の3’端にUおよびdTのいずれか1種または2種のあわせて2個が付加した配列からなるRNAの2本のRNAを調製する。この2本のRNAは、化学合成またはインビトロ転写により調製できる。化学合成は、DNA合成機を用いて行うことができる。またアンビオン(Ambion)社、日本バイオサービス株式会社、キアゲン(QIAGEN)社等のメーカーに化学合成を依頼することもできる。化学合成した互いに相補的な配列を含む2本のRNAをアニーリングすることにより、配列Xの鎖および相補配列X’の鎖からなる二本鎖RNAのそれぞれの鎖の3’端にUおよびdTのいずれか1種または2種あわせて2個が同一または異なって付加した二本鎖RNAを調製することができる。アニーリングは、2本のRNAを適当なバッファー中で90〜95℃に1〜5分間加熱後、45〜60分間かけて室温にまで冷却することにより行うことができる。
(ii)shRNAの場合
配列XからなるRNAおよび相補配列X’からなるRNAが、スペーサーオリゴヌクレオチドでつながれ、3’端に1〜6個、好ましくは2〜4個のヌクレオチド(前記と同義)が付加した、ヘアピン構造を有するRNAは、DNA合成機を用いた化学合成によって調製できる。
(III)KLF5遺伝子の発現抑制
KLF5遺伝子を発現する細胞株に(II)で調製したsiRNAまたはshRNAを導入する。細胞株としては、(I)の配列Xの設計のもとにしたKLF5 cDNAと同じ動物種の細胞を用いる。KLF5遺伝子を発現する細胞株としては、平滑筋、繊維芽細胞または血管内皮細胞に由来する細胞株、例えばマウス胎児繊維芽細胞株C3H/10T1/2(ATCC番号:CCL-226)、ヒト臍帯血管内皮細胞等をあげることができる。RNAの導入は、動物細胞へのトランスフェクション用試薬、例えばポリフェクト(Polyfect)トランスフェクション試薬(キアゲン社製)、トランスメッセンジャー(TransMessenger)トランスフェクション試薬、オリゴフェクトアミン(Oligofectamine)試薬(インビトロジェン社製)、リポフェクトアミン(Lipofectamine)2000(インビトロジェン社製)等を利用して、これらの試薬とRNAを混合して複合体を形成させた後、細胞に添加することにより行うことができる。
スフィンゴ糖脂質としては、例えばガラクトシルセレブロシド、ラクトシルセレブロシド、ガングリオシド等があげられる。
ステロールとしては、例えばコレステロール、ジヒドロコレステロール、ラノステロール、β-シトステロール、カンペステロール、スチグマステロール、ブラシカステロール、エルゴカステロール、フコステロール、3β-[N-(N',N'-ジメチルアミノエチル)カルバモイル]コレステロール(DC-Chol)等があげられる。
カチオン性界面活性剤としては、例えばアルキルアミン塩、アシルアミン塩、第四級アンモニウム塩、アミン誘導体等があげられる。具体的には塩化ベンザルコニウム、アシルアミノエチルジエチルアミン塩、N-アルキルポリアルキルポリアミン塩、脂肪酸ポリエチレンポリアミド、セチルトリメチルアンモニウムブロミド、ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド、アルキルポリオキシエチレンアミン、N-アルキルアミノプロピルアミン、脂肪酸トリエタノールアミンエステル等があげられる。
リポソームBにおいては、これら脂質および界面活性剤は、単独でまたは組み合わせて用いられ、好ましくは組み合わせて用いられる。組み合わせて用いる場合の組み合わせとしては、例えば水素添加大豆ホスファチジルコリン、ポリエチレングリコール化リン脂質およびコレステロールから選ばれる2成分以上の組み合わせ、ジステアロイルホスファチジルコリン、ポリエチレングリコール化リン脂質およびコレステロールから選ばれる2成分以上の組み合わせ、EPCとDOTAPの組み合わせ、EPC、DOTAPおよびポリエチレングリコール化リン脂質の組み合わせ、EPC、DOTAP、コレステロールおよびポリエチレングリコール化リン脂質の組み合わせ等があげられる。
脂質集合体としては、例えば球状ミセル、球状逆ミセル、ソーセージ状ミセル、ソーセージ状逆ミセル、板状ミセル、板状逆ミセル、ヘキサゴナルI、ヘキサゴナルIIおよび脂質2分子以上からなる会合体等があげられる。
高分子としては、例えばアルブミン、デキストラン、キトサン、デキストラン硫酸、DNA等の天然高分子、例えばポリ-L-リジン、ポリエチレンイミン、ポリアスパラギン酸、スチレンマレイン酸共重合体、イソプロピルアクリルアミド-アクリルピロリドン共重合体、ポリエチレングリコール修飾デンドリマー、ポリ乳酸、ポリ乳酸ポリグリコール酸、ポリエチレングリコール化ポリ乳酸等の合成高分子、およびそれらの塩等があげられる。
微粒子製剤としては、例えばマイクロスフェアー、マイクロカプセル、ナノクリスタル、リピッドナノパーティクル、高分子ミセル等があげられる。
水溶性高分子の脂質誘導体または脂肪酸誘導体としては、例えばポリエチレングリコール、ポリグリセリン、ポリエチレンイミン、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸、ポリアクリルアミド、オリゴ糖、デキストリン、水溶性セルロース、デキストラン、コンドロイチン硫酸、ポリグリセリン、キトサン、ポリビニルピロリドン、ポリアスパラギン酸アミド、ポリ-L-リジン、マンナン、プルラン、オリゴグリセロール等またはそれらの誘導体と、例えば前記リード粒子の定義の中であげた脂質、または例えばステアリン酸、パルミチン酸、ミリスチン酸、ラウリン酸等の脂肪酸とが結合してなるもの等があげられ、より好ましくは、ポリエチレングリコール誘導体、ポリグリセリン誘導体等の脂質誘導体または脂肪酸誘導体があげられ、さらに好ましくは、ポリエチレングリコール誘導体の脂質誘導体または脂肪酸誘導体があげられる。
界面活性剤としては、例えば前記リード粒子の定義の中であげた界面活性剤、ポリエチレングリコールアルキルエーテル等があげられ、好ましくは、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール、グリセリン脂肪酸エステル、ポリエチレングリコールアルキルエーテル等があげられる。
リード粒子に含有されるカチオン性物質は、カチオン性を呈する物質であるが、カチオン性の基とアニオン性の基の両方をもつ両性の物質であっても、pHや、他の物質との結合等により相対的な陰性度が変化するので、その時々に応じてカチオン性物質に分類され得る。これらカチオン性物質は、リード粒子の構成成分として用いても、リード粒子の構成成分に加えて用いても構わない。
カチオン性脂質としては、例えばDOTAP、DODAP、DOTMA、DOSPA、DMRIE、DORIE、DC-Chol等があげられる。
等電点以下の値のpHで、複合体の形成を行える蛋白質またはペプチドとしては、その物質の等電点以下の値のpHで、複合体の形成を行える蛋白質またはペプチドであれば、特に限定されない。例えば、アルブミン、オロソムコイド、グロブリン、フィブリノーゲン、ペプシン、リボヌクレアーゼT1等があげられる。
本発明における脂質膜を構成成分としては、例えば前記リード粒子の定義の中であげた脂質、界面活性剤等があげられ、好ましくは、脂質、界面活性剤のうちの中性脂質があげられ、より好ましくはリン脂質があげられ、さらに好ましくはEPCがあげられる。また、脂質膜の構成成分は、極性有機溶媒に可溶であることが好ましく、該極性有機溶媒を含む液中に、該脂質膜の構成成分が分散可能で、該複合粒子も分散可能な濃度で該極性有機溶媒を含む液が存在することが好ましい。ここで、中性脂質とは、脂質、界面活性剤のうちの、前記リード粒子が正電荷をもつ場合におけるカチオン性物質の中であげたカチオン性脂質とカチオン性界面活性剤および後記の付着競合剤の中であげたアニオン性脂質とアニオン性界面活性剤を除いたもののことであり、中性脂質としてより好ましくは、リン脂質、グリセロ糖脂質、スフィンゴ糖脂質等があげられる。
糖、ペプチドまたは核酸の脂肪族炭化水素誘導体としては、例えばショ糖、ソルビトール、乳糖等の糖、例えばカゼイン由来ペプチド、卵白由来ペプチド、大豆由来ペプチド、グルタチオン等のペプチド、または例えばDNA、RNA、プラスミド、siRNA、ODN等の核酸の脂肪族炭化水素誘導体があげられる。
工程1) リード粒子と前記RNAを構成成分とする複合粒子を製造する工程
リード粒子を、例えば水等の溶媒中に分散させ、リード粒子が分散した液中に、前記RNAを分散または溶解して含有させて混合し、リード粒子に該RNAを付着させる。工程1において、リード粒子の凝集を抑制するために、リード粒子は凝集抑制物質を含有するリード粒子であることが好ましく、凝集抑制物質として前記糖、ペプチド、核酸および水溶性高分子から選ばれる1つ以上の物質の脂質誘導体もしくは脂肪酸誘導体または界面活性剤を含有することがより好ましい。また、リード粒子が、正電荷をもつものである場合、リード粒子が分散した液中で、該RNAと付着競合剤を共存させ、付着競合剤を該RNAとともにリード粒子に付着させてもよく、さらにリード粒子が凝集抑制物質を含有するリード粒子である場合にも、リード粒子の凝集をより抑制させるために付着競合剤を用いてもよい。リード粒子と前記RNAの組み合わせとしては、複合粒子が極性有機溶媒を含有する液に分散可能となる組み合わせを選択することが好ましく、極性有機溶媒に対しての溶解度が、工程2または3で用いる脂質膜の構成成分よりも低いことがより好ましく、また、該極性有機溶媒を含む液中に、該脂質膜の構成成分が分散可能で、該複合粒子も分散可能な濃度で該極性有機溶媒を含む液が存在する組み合わせを選択することがより好ましい。
アニオン性高分子としては、例えばポリアスパラギン酸、スチレンマレイン酸共重合体、イソプロピルアクリルアミド-アクリルピロリドン共重合体、ポリエチレングリコール修飾デンドリマー、ポリ乳酸、ポリ乳酸ポリグリコール酸、ポリエチレングリコール化ポリ乳酸、デキストラン硫酸、デキストラン硫酸ナトリウム、コンドロイチン硫酸、コンドロイチン硫酸ナトリウム、ヒアルロン酸、コンドロイチン、デルタマン硫酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ケタラン硫酸、デキストランフルオレセインアニオニック等があげられる。
アニオン性物質としての核酸としては、例えばDNA、RNA、プラスミド、siRNA、ODN等があげられ、生理活性を示さないものであれば、どのような長さ、配列のものであってもよい。
工程1は、より具体的には、例えば凝集抑制物質を含有するリード粒子が分散した液を製造する操作および該リード粒子が分散した液中に、前記RNAを分散または溶解して含有させる操作(例えば該リード粒子が分散した液中に、該RNAを加えて分散または溶解する操作、該リード粒子が分散した液中に、該RNAが分散または溶解した液を加える操作等)を含む製造方法において実施することができる。ここで、リード粒子が分散した液中に、前記RNAを分散または溶解して含有させる工程により得られる複合粒子としては、具体的には、該カチオン性脂質を含有するリポソームBを構成成分とする微粒子に該RNAが付着して形成される複合粒子、カチオン性脂質を含有する脂質集合体を構成成分とする微粒子に前記RNAが付着して形成される複合粒子、ポリ-L-リジン等のカチオン性高分子を含有する高分子を構成成分とする微粒子に前記RNAが付着して形成される複合粒子があげられる。また、リード粒子が分散した液中に、前記RNAを分散または溶解して含有させる操作が、該RNAが分散または溶解した液に、さらに付着競合剤を含有させて、これを該リード粒子が分散した液中に加える操作であることが好ましく、この場合、該リード粒子に、該RNAと該付着競合剤が共に付着して複合粒子が製造され、該複合粒子の製造中におけるリード粒子の凝集も、製造後における複合粒子の凝集もより抑制されて製造できる。
工程2) 複合粒子を脂質膜で被覆する工程(その1)
工程1で得られた複合粒子が分散し、かつ脂質膜の構成成分が溶解した極性有機溶媒を含む液(液A)を調製する操作、次いで、液A中の極性有機溶媒の割合を減少させることによって、複合粒子を脂質膜で被覆する操作を含む製造方法によってリポソームAが製造でき、この場合、リポソームAは分散液(液B)の形態で得られる。液Aにおける溶媒は、該脂質膜の構成成分が可溶で、該複合粒子が分散可能な極性有機溶媒の濃度の該極性有機溶媒を含む溶媒であり、液A中の極性有機溶媒の割合を減少させた液Bでは、該脂質膜の構成成分が分散可能で、該複合粒子も分散可能である。液A中の溶媒が、極性有機溶媒と極性有機溶媒以外の溶媒との混合液である場合、例えば該極性有機溶媒と混合可能な極性有機溶媒以外の溶媒を含む溶媒(液C)を加えること、および/または、蒸発留去、半透膜分離、分留等によって、選択的に極性有機溶媒を取り除くことで、極性有機溶媒の割合を減少させることができる。ここで、液Cは、極性有機溶媒以外の溶媒を含む溶媒であり、極性有機溶媒も液Aにおける極性有機溶媒の割合より低ければ含んでいてよい。
極性有機溶媒と極性有機溶媒以外の溶媒の組み合わせは、相互に混合可能である組み合わせであるのが好ましく、液Aおよび液B中の溶媒ならびに液Cに対する、複合粒子および脂質膜の構成成分の溶解度等を考慮して選択できる。一方、複合粒子については、液Aおよび液B中の溶媒ならびに液Cのいずれに対しての溶解度も低いことが好ましく、また極性有機溶媒および極性有機溶媒以外の溶媒のいずれに対しての溶解度も低いことが好ましく、脂質膜の構成成分は、液B中の溶媒および液Cに対しての溶解度が低いことが好ましく、液A中の溶媒に対しての溶解度が高いことが好ましく、また極性有機溶媒に対しての溶解度が高いことが好ましく、極性有機溶媒以外の溶媒に対する溶解度が低いことが好ましい。ここで、複合粒子の溶解度が低いとは、複合粒子に含有されるリード粒子、RNAおよび付着競合剤等の各成分の、溶媒中における溶出性が小さいことであり、各成分の個々の溶解度が高くても各成分間の結合等によって各成分の溶出性が小さくなっていればよい。例えば、リード粒子に含まれる成分のいずれかの液A中の溶媒に対する溶解度が高い場合でも、リード粒子が正電荷をもつ場合、RNA内の電荷、分子内分極等に対して静電的に結合し、液A中の溶媒に対する溶解度が低くなれば、複合粒子中の成分の溶出が抑制され、複合粒子の液A中の溶媒に対する溶解度を低くすることが可能である。すなわち、リード粒子が正電荷をもつことは、リポソームAの製造において、複合粒子の成分の溶出を抑制し、製造性と歩留まりを向上させる効果も備えている。
工程3) 複合粒子を脂質膜で被覆する工程(その2)
工程1で得られた複合粒子および脂質膜の構成成分を、該脂質膜の構成成分が可溶な極性有機溶媒を含む、該複合粒子が溶解せず、該脂質膜の構成成分が分散状態で存在することが可能な濃度の液(液F)中に分散させる操作を含む製造方法でリポソームAが製造でき、この場合、リポソームAは分散液の状態で得られる。液Fにおける溶媒は、該脂質膜の構成成分が可溶な極性有機溶媒を含み、該極性有機溶媒を含む溶媒に、該脂質膜の構成成分が分散可能で、該複合粒子も分散可能な濃度で該極性有機溶媒を含む液が存在する溶媒である。
液Fにおける極性有機溶媒の割合は、複合粒子と、脂質膜の構成成分がともに分散されている条件さえ満たしていれば特に限定されるものではなく、用いる溶媒や複合粒子、脂質膜の構成成分の種類等により異なるが、好ましくは1〜80vol%、より好ましくは10〜60vol%、さらに好ましくは20〜50vol%、最も好ましくは30〜40vol%である。
さらに、上記で得られるリポソームAに抗体等の蛋白質、糖類、糖脂質、アミノ酸、核酸、種々の低分子化合物、高分子化合物等の物質による修飾を行うこともでき、これらで得られる被覆複合粒子もリポソームAに包含される。例えば、ターゲッティングに応用するため、上記で得られるリポソームAに対して、さらに抗体等の蛋白質、ペプチド、脂肪酸類等による脂質膜の表面修飾を行うこともできる[ラジック(D. D. Lasic)、マーティン(F. Martin)編,“ステルス・リポソームズ(Stealth Liposomes)”(米国),シーアールシー・プレス・インク(CRC Press Inc),1995年,p.93-102参照]。また、リポソームAに例えば水溶性物質の脂質誘導体、脂肪酸誘導体または脂肪族炭化水素誘導体による表面改質も任意に行うことができ、これら表面改質に用いられる水溶性物質の脂質誘導体、脂肪酸誘導体または脂肪族炭化水素誘導体は、前記脂質膜の構成成分としての水溶性物質の脂質誘導体、脂肪酸誘導体または脂肪族炭化水素誘導体と同義である。
本発明の組成物を、医薬品の製剤として使用する場合、投与経路としては、治療に際し最も効果的なものを使用するのが望ましく、口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内、静脈内等の非経口投与または経口投与をあげることができ、好ましくは静脈内投与または筋肉内投与をあげることができ、より好ましくは静脈内投与があげられる。
本発明のリポソームは、リポソームAのうち、リード粒子と前記RNAを構成成分とする複合粒子および該複合粒子を被覆する脂質膜から構成され、該脂質膜の構成成分が可溶な極性有機溶媒を含む液の中に、該脂質膜の構成成分が分散可能で、該複合粒子も分散可能な濃度で該極性有機溶媒を含む液が存在する、リポソーム、またはカチオン性脂質を含むリード粒子と前記RNAを構成成分とする複合粒子、および該複合粒子を被覆する脂質膜から構成され、該脂質膜が、中性脂質および水溶性物質の脂質誘導体、脂肪酸誘導体または脂肪族炭化水素誘導体を構成成分とするリポソームがあげられる。
参考例1 siRNAの調製1
KLF5遺伝子の発現を抑制できるsiRNAの配列として、マウスKLF5 cDNAの配列(GenBank登録番号:NM_009769、配列番号41)から、(a)AAではじまる21塩基の配列、(b)GC含量が20〜80%の2つの条件に当てはまる、11個の部分配列を選択した。ただし、開始コドン(配列番号41の167〜169番目の配列)より75塩基以上下流の、コード領域(配列番号167〜1507番目の配列)内の配列で、GC含量が40〜60%のものをなるべく選択するようにした。選択した配列の配列番号41における配列の位置、GC含量を第1表に示した。選択した配列の5'端のAAを除いた19塩基の配列のTをUに変えた配列をそれぞれ配列番号1〜11に示した。
参考例2 siRNAの調製2
参考例1で得られたsiRNA No. 2〜4および7〜11について、マウスKLF5 cDNAと、ヒトKLF5 cDNAを、配列の相同性に基づいてアライメントすることにより、マウスで選択された配列と対応するヒトの配列を得た。第2表に、設計のもとにしたマウスKLF5 cDNA上の21塩基の配列および配列番号41におけるその位置と、該マウス配列に対応するヒトcDNA上の21塩基の配列、配列番号42におけるその位置、該ヒト配列から5'端のAAを除いたRNAの配列を表す配列番号を示した。なお、siRNA No. 5および6は、非コード領域の配列をもとにしているため、対応するヒト配列は示さなかった。
動的光散乱法(A model ELS-800、大塚電子)でリポソームの平均粒子径を測定したところ、それぞれ102、103、95 nmであった。
比較例1
実施例1におけるsiRNAを、scrambled KLF5-siRNA(sense strand, 5’- GGU ACA CAU GUG CAC ACA C -dTdT-3’;antisense strand, 5’- GUG UGU GCA CAU GUG UAC C-dTdT-3’、北海道システムサイエンス社)に変え、同様に製剤を得た。製剤は3ロット以上調製した。なお、scrambled KLF5-siRNAは、KLF5-mRNAの配列および該配列と相補的な配列を含まないRNAである。
比較例2
参考例1または2のsiRNA No.4(KLF5siRNA)を生理食塩水に溶解し、0.5mg/mL水溶液を調製した。
比較例3
比較例1と同じscrambled KLF5siRNAを生理食塩水に溶解し、0.5mg/mL水溶液を調製した。
試験例1
1×106個のMurine LL/2;lewis lung carcinoma[“ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(The Journal of Biological Chemistry) ”, 2003年, 278巻, p.34598-34604]をマウス(BL6J mouse、オス、5週齢)の皮下に投与した。LL/2は、その増殖が血管新生の影響を大きく受けることから、血管新生阻害剤のスクリーニングに使用されている。細胞が固定された時点(皮下投与後1〜2日)から、実施例1で得られた製剤を、連日、尾静脈内投与した。投与した製剤は、予めリン酸緩衝生理食塩水で総脂質濃度が5mg/mLになるように希釈しており、マウスに対する投与量はsiRNA 150μg/shot/mouse/dayとした。
また、投与10日後にマウスから、腫瘍を摘出し、癌細胞周辺の血管新生を観察すると共に、癌周辺切片を次の方法でCD31免疫染色およびヘマトキシリン・エオジン染色を行って顕微鏡で観察した。
CD31免疫染色
メタノール固定した腫瘍をパラフィンで埋包した後、厚さ5μmの切片を作成し、切片を脱パラフィン化後、室温で10分間、0.5%ヤギ血清を添加しブロッキングした。ブロッキング液を吸引後、抗マウスCD31抗体(100倍希釈)[ファーミンゲン(pharmingen)社製]を添加し室温で2時間静置した。PBSで洗浄後、ビオチン付抗ラットIg抗体(200倍希釈)(DAKO社製)を添加し室温で1時間静置した。PBSで洗浄後、ABC-APキットAK-5000[ベクター・ラボラトリー(Vector Laboratories)社製]を添加し室温で30分間静置した。PBSで洗浄後、Vector Red SK-5100[ベクター・ラボラトリー(Vector Laboratories)社製]を添加し室温で30分間静置して発色させた。水洗後、ヘマトキシン染色液で後染色し、脱水して、顕微鏡で観察した。
ヘマトキシリン・エオジン染色
メタノール固定した腫瘍をパラフィンで埋包した後、厚さ5μmの切片を作成した。切片を脱パラフィン化後、流水で洗浄し、蒸留水を通した。ヘマトキシリン染色液を添加し5分間静置した。水洗し、0.5%塩酸水を添加し分別した。流水で5分間色出し水洗後、蒸留水を通した。エオジン染色液を添加し3分間静置した。95%エタノールで分別、脱水して、顕微鏡で観察した。
試験例2
1×106個のMurine LL/2;lewis lung carcinomaをマウス(C57BL/6jjcl mouse、オス、6週齢、日本クレア)の腋部皮下に投与した。腫瘍細胞注射2日後から8日後まで、50μgのsiRNAを含む製剤(実施例1、比較例1)、50μgのsiRNAをsiRNA溶液(比較例2、3)および生理食塩水を、それぞれ連日、尾静脈内投与した。
また、投与10日後にマウスから、腫瘍を摘出し、癌細胞周辺の血管新生を観察すると共に、癌周辺切片を次の方法でCD31免疫染色し、組織切片に見られるCD31構造をカウントした。一つの腫瘍あたり2視野、各5腫瘍をカウントし、その平均を示した。有意差をTukey-kramer法で検定した。結果を図3に示す。
CD31免疫染色
腫瘍を摘出し、95%メタノール溶液で固定した後、パラフィンに包埋した。5μm厚にスライスした腫瘍を脱パラフィン後、100倍希釈した抗CD31ポリクローナル抗体(ファーミンジェン社製、米国)室温で120分間作用させた。CD31抗体を洗浄後、200倍希釈したビオチン化抗ラットIgG(ダコ社製、米国)を室温で60分間作用させた。さらに洗浄後、HRP化アビジン(ベクター社製、米国)を室温で30分間作用させた。洗浄後、ジアミノベンジジン(シグマ社製、米国)で発色させた。
試験例3
1×106個のMurine LL/2;lewis lung carcinomaをマウス(C57BL/6jjcl mouse、オス、6週齢、日本クレア)の腋部皮下に投与した。50μgのsiRNAを含む製剤(実施例1、比較例1)、50μgのsiRNAを含むsiRNA溶液(比較例2、3)および生理食塩水を、それぞれ投与し、投与36時間後に腫瘍を摘出し、次の方法でmRNA発現量およびKLF5の量を測定した。
mRNA発現量の測定
摘出した腫瘍細胞を、RNeasy Fibrous tissue kit(キアゲン社製)を用い、ジルコニアボールと破砕機(MM300、キアゲン)を用いて溶解した後精製してRNAを取得した。cDNAはSuperScript First-Strand Synthesis Kit (インビトロジェン社製、米国)を用い、1 μgのRNAからランダムプライマーで逆転写した。cDNAはHot Star TaqTM(キアゲン社製)と、特異的プライマーを用いて増幅した。このとき、リボソーマル18SRNAプライマーを内部標準として用いた。増幅サイクルは、95℃15分→(94℃30秒→53℃30秒→72℃30秒)×45回とし、プライマー配列は以下の通りとした:5′-GGTTGCACAAAAGTTTATAC-3′、 5′-GGCTTGGCGCCTGTGTGCTTCC-3′。mRNA発現量をABI PRISMTM 7900HT(アプライドバイオシステム社製、米国)とQuantiTect SYBR Green PCR kit(キアゲン社製)を使って定量した。QuantumRNATM Classic 18S ribosomal RNA primer (アンビオン社製、米国)を内部標準物質として標準化した。有意差をTukey-kramer法で検定した。結果を図4に示す。
KLF5量の測定
摘出した腫瘍細胞を、適量の溶解用溶液(150mmol/L NaCl, 20 mmol/L Tris, pH 7.5, 0.1% Nonidet P-40, 0.1% Sodium laulyl sulfate, 0.5% Sodium deoxycholate, 0.1mmol/L DTT, タンパク分解酵素阻害剤)に浸し、ジルコニアボールと破砕機(MM300、キアゲン)を用いて溶解し、遠心上清を取得した。タンパク濃度はDc protein assay reagent (バイオラッド、米国)を用いて測定した。10μgのタンパクを95℃で15分間加熱処理し、10%ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付した。泳動したタンパクはニトロセルロース膜(アマシャム社製、米国)に転写し、ブロッキング処理(5%スキムミルク中で振とう)をした後、1000倍した抗KLF5モノクローナル抗体(協和発酵工業製)中で1時間振とうした。膜を洗浄後、2000倍したHRPラベル化抗ラットIgG(アマシャム社製)処理し、洗浄後に蛍光発色試薬(ECLplus、アマシャム社製)で発色し、ウエスタンブロッティングのバンドを、画像解析ソフト(Image Quant、アマシャム社製)を用いて定量した。一群3匹、KLF5siRNA投与群のみ一群5匹で定量を行った。有意差をTukey-kramer法で検定した。結果を図5に示す。
参考試験例1
1×106個のMurine LL/2;lewis lung carcinomaをマウス(C57BL/6jjcl mouse、オス、5〜6週齢)の腋部皮下に投与した。腫瘍細胞注射2日後から8日後まで、1μgのsiRNAを含むsiRNA溶液(比較例2、比較例3)および生理食塩水を、それぞれ連日、腫瘍に直接投与した。
図6によると、比較例1で得られたKLF5siRNA溶液投与群で腫瘍の成長が抑制される傾向が見られたが、有意差は見られなかった。
動的光散乱法(ゼータサイザーナノ-ZS、マルバーン製)でリポソームの平均粒子径を測定したところ、一例をとると、110 nmであった。
比較例4
実施例1におけるsiRNAを、GL3-siRNA(sense strand, 5’-CUUACGCUGAGUACUUCGA -dTdT-3’;antisense strand, 5’-UCGAAGUACUCAGCGUAAG-dTdT-3’、ダーマコン社または北海道システムサイエンス社)に変え、同様に製剤を得た。製剤は3ロット以上調製した。なお、GL3-siRNAは、bcl2-mRNAの配列および該配列と相補的な配列を含まないRNAである。
比較例5
実施例3と同じbcl2-siRNAを生理食塩水に溶解し、0.5mg/mL水溶液を調製した。
試験例4
1×107個のヒト前立腺癌細胞DU145 (ATCC No.HTB-81)をヌードマウス(BALB/cAJcl-nu、オス、5週齢、日本クレア)の皮下に投与した。皮下投与17日後に腫瘍の大きさを測定し、150-350 mm3に達したヌードマウスを選択し、実施例3で得られた製剤を、尾静脈内投与した。投与は5日間連続して行った後、2日間休薬し、さらに5日間連続投与した。
経時的に、マウスに植え付けた腫瘍の大きさを測定し、腫瘍の増殖を測定した。結果を図7に示す。
図7によると、実施例3で得られた製剤を投与した群では、無処理群と比べ、癌細胞の増殖が抑制された。
試験例5
1×106個のヒト前立腺癌細胞PC-3 (ATCC No.CRL-1435)をヌードマウス(BALB/cAJcl-nu、オス、6週齢、日本クレア)の皮下に投与した。皮下投与6日後に腫瘍の大きさを測定し、80-120 mm3に達したヌードマウスを選択し、実施例3、比較例4、5で得られた製剤を、尾静脈内投与した。投与は5日間連続して行った後、2日間休薬し、さらに5日間連続投与した。
経時的に、マウスに植え付けた腫瘍の大きさを測定し、腫瘍の増殖を測定した。結果を図8に示す。
図8によると、実施例3で得られた製剤を投与した群では、無処理群、比較例4で得られた製剤および比較例5で得られた溶液を投与した群と比べ、癌細胞の増殖が抑制された。
「配列表フリーテキスト」
配列番号1-発明者:山内雅博;鳥取恒彰;石原淳;八木信宏;加藤泰己
配列番号17-siRNA No. 1 センス鎖
配列番号18-siRNA No. 1 アンチセンス鎖
配列番号19-siRNA No. 2 センス鎖
配列番号20-siRNA No. 2 アンチセンス鎖
配列番号21-siRNA No. 3 センス鎖
配列番号22-siRNA No. 3 アンチセンス鎖
配列番号23-siRNA No. 4 センス鎖
配列番号24-siRNA No. 4 アンチセンス鎖
配列番号25-siRNA No. 5 センス鎖
配列番号26-siRNA No. 5 アンチセンス鎖
配列番号27-siRNA No. 6 センス鎖
配列番号28-siRNA No. 6 アンチセンス鎖
配列番号29-siRNA No. 7 センス鎖
配列番号30-siRNA No. 7 アンチセンス鎖
配列番号31-siRNA No. 8 センス鎖
配列番号32-siRNA No. 8 アンチセンス鎖
配列番号33-siRNA No. 9 センス鎖
配列番号34-siRNA No. 9 アンチセンス鎖
配列番号35-siRNA No. 10 センス鎖
配列番号36-siRNA No. 10 アンチセンス鎖
配列番号37-siRNA No. 11 センス鎖
配列番号38-siRNA No. 11 アンチセンス鎖
配列番号39-SEAP-siRNA センス鎖
配列番号40-SEAP-siRNA アンチセンス鎖
Claims (37)
- 標的遺伝子のmRNAの連続する15〜30塩基の配列および該配列と相補的な配列を含むRNAを封入したリポソームを含有し、該リポソームが標的遺伝子の発現部位を含む組織または臓器に到達するリポソームである、組成物。
- リポソームが、静脈内投与可能な大きさのリポソームである、請求項1記載の組成物。
- RNAが、RNA干渉(RNAi)を利用した該標的遺伝子の発現抑制作用を有するRNAである、請求項1または2記載の組成物。
- 標的遺伝子が、腫瘍や炎症に関連する遺伝子である、請求項1〜3のいずれかに記載の組成物。
- 標的遺伝子が、血管新生に関連する遺伝子である、請求項1〜4のいずれかに記載の組成物。
- mRNAがKLF5 mRNAである、請求項1〜3のいずれかに記載の組成物。
- mRNAがヒトまたはマウスのKLF5 mRNAである、請求項1〜3のいずれかに記載の組成物。
- RNAが、KLF5 mRNAの連続する15〜30塩基の配列の鎖および該配列と相補的な配列の鎖からなる二本鎖RNAのそれぞれの鎖の3’端にヌクレオチドの1種または複数種のあわせて1〜6個が同一または異なって付加した二本鎖RNAである、請求項6または7記載の組成物。
- RNAが、KLF5 mRNAの連続する15〜30塩基の配列からなるRNAおよび該配列と相補的な配列からなるRNAが、スペーサーオリゴヌクレオチドでつながれ、3’端にヌクレオチドの1種または複数種のあわせて1〜6個が付加した、ヘアピン構造を有するRNAである、請求項6または7記載の組成物。
- RNAが、以下の(a)〜(c)からなる群から選ばれるRNAである、請求項6または7記載の組成物。
(a)配列番号2〜16のいずれか1つの配列の鎖および該配列と相補的な配列の鎖からなる二本鎖RNAのそれぞれの鎖の3’端にウリジル酸およびデオキシチミジル酸のいずれか1種または2種あわせて2〜4個が同一または異なって付加した二本鎖RNA
(b)配列番号2〜16のいずれか1つの配列からなるRNAおよび該配列と相補的な配列からなるRNAが2個のウリジル酸またはデオキシチミジル酸を5’端に有するスペーサーオリゴヌクレオチドでつながれ、3’端にウリジル酸およびデオキシチミジル酸のいずれか1種または2種あわせて2〜4個が付加した、ヘアピン構造を有するRNA
(c)配列番号2〜11のいずれか1つの配列の鎖および該配列と相補的な配列の鎖からなる二本鎖RNAのそれぞれの鎖の3’端にウリジル酸2個が付加した二本鎖RNA - mRNAがbcl2 mRNAである、請求項1〜3のいずれかに記載の組成物。
- RNAを封入したリポソームが、リード粒子と該RNAを構成成分とする複合粒子および該複合粒子を被覆する脂質膜から構成され、
該脂質膜の構成成分が可溶な極性有機溶媒を含む液の中に、該脂質膜の構成成分が分散可能で、該複合粒子も分散可能な濃度で該極性有機溶媒を含む液が存在する、リポソームである、請求項1〜11に記載の組成物。 - 極性有機溶媒がアルコールである、請求項12記載の組成物。
- 極性有機溶媒がエタノールである、請求項12記載の組成物。
- リード粒子が、カチオン性脂質を含むリード粒子であり、脂質膜が、中性脂質および水溶性物質の脂質誘導体、脂肪酸誘導体または脂肪族炭化水素誘導体を構成成分とする、請求項12〜14のいずれかに記載の組成物。
- RNAを封入したリポソームが、カチオン性脂質を含むリード粒子と前記RNAを構成成分とする複合粒子および該複合粒子を被覆する脂質膜から構成され、
該脂質膜が、中性脂質および水溶性物質の脂質誘導体、脂肪酸誘導体または脂肪族炭化水素誘導体を構成成分とするリポソームである、請求項1〜11のいずれかに記載の組成物。 - カチオン性脂質がN-[1-(2,3-ジオレオイルプロピル)]-N,N,N-トリメチル塩化アンモニウム、N-[1-(2,3-ジオレオイルプロピル)]-N,N-ジメチルアミン、N-[1-(2,3-ジオレイルオキシプロピル)]-N,N,N-トリメチル塩化アンモニウム、N-[1-(2,3-ジテトラデシルオキシプロピル)]-N,N-ジメチル-N-ヒドロキシエチル臭化アンモニウムおよび3β-[N-(N',N'-ジメチルアミノエチル)カルバモイル]コレステロールから選ばれる一つ以上である、請求項15または16記載の組成物。
- 水溶性物質の脂質誘導体、脂肪酸誘導体または脂肪族炭化水素誘導体が、ポリエチレングリコール-ホスファチジルエタノールアミンである、請求項15〜17のいずれかに記載の組成物。
- 中性脂質が卵黄ホスファチジルコリンである、請求項15〜18のいずれかに記載の組成物。
- リード粒子と標的遺伝子のmRNAの連続する15〜30塩基の配列および該配列と相補的な配列を含むRNAを構成成分とする複合粒子および該複合粒子を被覆する脂質膜から構成され、
該脂質膜の構成成分が可溶な極性有機溶媒を含む液の中に、該脂質膜の構成成分が分散可能で、該複合粒子も分散可能な濃度で該極性有機溶媒を含む液が存在する、該RNAを封入したリポソーム。 - 極性有機溶媒がアルコールである、請求項20記載のリポソーム。
- 極性有機溶媒がエタノールである、請求項20記載のリポソーム。
- リード粒子が、カチオン性脂質を含むリード粒子であり、脂質膜が、中性脂質および水溶性物質の脂質誘導体、脂肪酸誘導体または脂肪族炭化水素誘導体を構成成分とする、請求項20〜22のいずれかに記載のリポソーム。
- カチオン性脂質を含むリード粒子と標的遺伝子のmRNAの連続する15〜30塩基の配列および該配列と相補的な配列を含むRNAとを構成成分とする複合粒子、および該複合粒子を被覆する脂質膜から構成され、
該脂質膜が、中性脂質および水溶性物質の脂質誘導体、脂肪酸誘導体または脂肪族炭化水素誘導体を構成成分とする、該RNAを封入したリポソーム。 - カチオン性脂質がN-[1-(2,3-ジオレオイルプロピル)]-N,N,N-トリメチル塩化アンモニウム、N-[1-(2,3-ジオレオイルプロピル)]-N,N-ジメチルアミン、N-[1-(2,3-ジオレイルオキシプロピル)]-N,N,N-トリメチル塩化アンモニウム、N-[1-(2,3-ジテトラデシルオキシプロピル)]-N,N-ジメチル-N-ヒドロキシエチル臭化アンモニウムおよび3β-[N-(N',N'-ジメチルアミノエチル)カルバモイル]コレステロールから選ばれる一つ以上である、請求項23または24記載のリポソーム。
- 水溶性物質の脂質誘導体、脂肪酸誘導体または脂肪族炭化水素誘導体が、ポリエチレングリコール-ホスファチジルエタノールアミンである、請求項20〜25のいずれかに記載のリポソーム。
- 中性脂質が卵黄ホスファチジルコリンである、請求項20〜26のいずれかに記載のリポソーム。
- RNAが、RNA干渉(RNAi)を利用した該標的遺伝子の発現抑制作用を有するRNAである、請求項20〜27のいずれかに記載のリポソーム。
- 標的遺伝子が、腫瘍や炎症に関連する遺伝子である、請求項20〜28のいずれかに記載のリポソーム。
- 標的遺伝子が、血管新生に関連する遺伝子である、請求項20〜28のいずれかに記載のリポソーム。
- mRNAがKLF5mRNAである、請求項20〜28のいずれかに記載のリポソーム。
- mRNAがヒトまたはマウスのKLF5 mRNAである、請求項20〜28のいずれかに記載のリポソーム。
- RNAが、KLF5 mRNAの連続する15〜30塩基の配列の鎖および該配列と相補的な配列の鎖からなる二本鎖RNAのそれぞれの鎖の3’端にヌクレオチドの1種または複数種あわせて1〜6個が同一または異なって付加した二本鎖RNAである、請求項31または32記載のリポソーム。
- RNAが、KLF5 mRNAの連続する15〜30塩基の配列からなるRNAおよび該配列と相補的な配列からなるRNAが、スペーサーオリゴヌクレオチドでつながれ、3’端にヌクレオチドの1種または複数種あわせて1〜6個が付加した、ヘアピン構造を有するRNAである、請求項31または32記載のリポソーム。
- RNAが、以下の(a)〜(c)からなる群から選ばれるRNAである、請求項31または32記載のリポソーム。
(a)配列番号2〜16のいずれか1つの配列の鎖および該配列と相補的な配列の鎖からなる二本鎖RNAのそれぞれの鎖の3’端にウリジル酸およびデオキシチミジル酸のいずれか1種または2種あわせて2〜4個が同一または異なって付加した二本鎖RNA
(b)配列番号2〜16のいずれか1つの配列からなるRNAおよび該配列と相補的な配列からなるRNAが2個のウリジル酸またはデオキシチミジル酸を5’端に有するスペーサーオリゴヌクレオチドでつながれ、3’端にウリジル酸およびデオキシチミジル酸のいずれか1種または2種あわせて2〜4個が付加した、ヘアピン構造を有するRNA
(c)配列番号2〜11のいずれか1つの配列の鎖および該配列と相補的な配列の鎖からなる二本鎖RNAのそれぞれの鎖の3’端にウリジル酸2個が付加した二本鎖RNA - mRNAがbcl2 mRNAである、請求項20〜28のいずれかに記載のリポソーム。
- 請求項20〜36のいずれかに記載のリポソームを含有する組成物。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2014140383A JP6023126B2 (ja) | 2005-01-28 | 2014-07-08 | 標的遺伝子の発現を抑制する組成物 |
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2005022253 | 2005-01-28 | ||
JP2005022253 | 2005-01-28 | ||
JP2014140383A JP6023126B2 (ja) | 2005-01-28 | 2014-07-08 | 標的遺伝子の発現を抑制する組成物 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2012205586A Division JP5872988B2 (ja) | 2005-01-28 | 2012-09-19 | 標的遺伝子の発現を抑制する組成物 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2014196344A true JP2014196344A (ja) | 2014-10-16 |
JP6023126B2 JP6023126B2 (ja) | 2016-11-09 |
Family
ID=36740152
Family Applications (4)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2007500421A Pending JPWO2006080118A1 (ja) | 2005-01-28 | 2005-10-24 | 標的遺伝子の発現を抑制する組成物 |
JP2011278409A Abandoned JP2012072181A (ja) | 2005-01-28 | 2011-12-20 | 標的遺伝子の発現を抑制する組成物 |
JP2012205586A Expired - Fee Related JP5872988B2 (ja) | 2005-01-28 | 2012-09-19 | 標的遺伝子の発現を抑制する組成物 |
JP2014140383A Expired - Fee Related JP6023126B2 (ja) | 2005-01-28 | 2014-07-08 | 標的遺伝子の発現を抑制する組成物 |
Family Applications Before (3)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2007500421A Pending JPWO2006080118A1 (ja) | 2005-01-28 | 2005-10-24 | 標的遺伝子の発現を抑制する組成物 |
JP2011278409A Abandoned JP2012072181A (ja) | 2005-01-28 | 2011-12-20 | 標的遺伝子の発現を抑制する組成物 |
JP2012205586A Expired - Fee Related JP5872988B2 (ja) | 2005-01-28 | 2012-09-19 | 標的遺伝子の発現を抑制する組成物 |
Country Status (9)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20090011003A1 (ja) |
EP (1) | EP1842558B1 (ja) |
JP (4) | JPWO2006080118A1 (ja) |
KR (1) | KR20070104575A (ja) |
CN (1) | CN101111269A (ja) |
AU (1) | AU2005326371A1 (ja) |
CA (1) | CA2596230A1 (ja) |
ES (1) | ES2386549T3 (ja) |
WO (1) | WO2006080118A1 (ja) |
Families Citing this family (26)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP1970078A4 (en) * | 2006-01-11 | 2010-11-17 | Kyowa Hakko Kirin Co Ltd | COMPOSITION FOR INHIBITING A TARGET GENE IN AN EYEBORN AND REMEDY FOR ACAPIC DISEASE |
AU2007243370A1 (en) * | 2006-04-24 | 2007-11-08 | The Cbr Institute For Biomedical Research, Inc. | Method of producing immunoliposomes and compositions thereof |
AR067997A1 (es) * | 2007-08-24 | 2009-10-28 | Novartis Ag | Compuestos organicos |
CN102112110A (zh) * | 2008-06-06 | 2011-06-29 | 米尔纳医疗股份有限公司 | 用于RNAi试剂体内递送的新型组合物 |
CN105030809A (zh) | 2008-08-01 | 2015-11-11 | 协和发酵麒麟株式会社 | 抑制靶基因表达的组合物 |
JPWO2010110314A1 (ja) * | 2009-03-27 | 2012-10-04 | 協和発酵キリン株式会社 | 核酸を含有する肺高血圧症治療剤 |
WO2010110318A1 (ja) * | 2009-03-27 | 2010-09-30 | 協和発酵キリン株式会社 | 核酸を含有する動脈硬化性疾患治療剤 |
JP5872898B2 (ja) * | 2009-07-14 | 2016-03-01 | 協和発酵キリン株式会社 | 標的遺伝子の発現を抑制する組成物 |
US8609617B2 (en) | 2009-09-04 | 2013-12-17 | University Of Miami | KLF family members regulate intrinsic axon regeneration ability |
ES2373704B1 (es) * | 2010-02-18 | 2013-01-24 | Lipotec S.A. | Liposomas para el tratamiento de materiales textiles. |
US9408914B2 (en) | 2010-04-28 | 2016-08-09 | Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. | Cationic lipid |
EP2567952A4 (en) | 2010-04-28 | 2015-11-25 | Kyowa Hakko Kirin Co Ltd | CATIONIC LIPID |
EP2666856A4 (en) * | 2011-01-19 | 2015-01-14 | Kyowa Hakko Kirin Co Ltd | COMPOSITION TO INHIBIT TARGET EXPRESSION |
US20150247148A1 (en) * | 2011-01-31 | 2015-09-03 | Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. | Composition for suppressing expression of target gene |
JP2013095755A (ja) | 2011-11-02 | 2013-05-20 | Kyowa Hakko Kirin Co Ltd | カチオン性脂質 |
AU2012353463B2 (en) | 2011-12-12 | 2017-08-24 | Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. | Lipid nanoparticles containing combinations of cationic lipids |
TWI594767B (zh) | 2011-12-12 | 2017-08-11 | 協和醱酵麒麟有限公司 | 含有陽離子性脂質之藥物傳遞系統用脂質奈米粒子 |
TW201726599A (zh) | 2012-07-06 | 2017-08-01 | 協和醱酵麒麟有限公司 | 陽離子性脂質 |
US9913907B2 (en) | 2012-07-16 | 2018-03-13 | Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. | RNAi pharmaceutical composition for suppressing expression of KRAS gene |
KR101460204B1 (ko) | 2013-01-08 | 2014-11-10 | 한국과학기술원 | 친수성 핵산 유전자를 유기용매에 가용화시키고, 이를 소수성 미립자에 봉입한 제어방출형 유전자 전달용 복합체와 이의 제조방법 |
CA2937118A1 (en) | 2014-01-17 | 2015-07-23 | Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. | Nucleic acid capable of inhibiting expression of .beta.2gpi |
CN108289846B (zh) * | 2015-12-08 | 2020-12-04 | 正大天晴药业集团股份有限公司 | 脂质体的制备方法 |
US10525138B2 (en) | 2015-12-25 | 2020-01-07 | Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. | Compound as cationic lipid |
TW201837172A (zh) | 2017-03-09 | 2018-10-16 | 日商協和醱酵麒麟有限公司 | 抑制masp2之表現之核酸 |
AU2018277476A1 (en) | 2017-05-31 | 2020-01-02 | Kyowa Kirin Co., Ltd. | APCS-expression-suppressing nucleic acids |
KR20190127277A (ko) * | 2018-05-04 | 2019-11-13 | 주식회사 삼양바이오팜 | mRNA 전달용 고분자 나노입자 조성물 및 그 제조방법 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2002028367A1 (fr) * | 2000-10-04 | 2002-04-11 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Procede de revetement de particules fines avec un film de lipides |
Family Cites Families (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0956001B1 (en) * | 1996-11-12 | 2012-09-12 | The Regents of The University of California | Preparation of stable formulations of lipid-nucleic acid complexes for efficient in vivo delivery |
US20020132788A1 (en) * | 2000-11-06 | 2002-09-19 | David Lewis | Inhibition of gene expression by delivery of small interfering RNA to post-embryonic animal cells in vivo |
US10590418B2 (en) * | 2001-07-23 | 2020-03-17 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Methods and compositions for RNAi mediated inhibition of gene expression in mammals |
US20030153519A1 (en) * | 2001-07-23 | 2003-08-14 | Kay Mark A. | Methods and compositions for RNAi mediated inhibition of gene expression in mammals |
JP2005527639A (ja) * | 2001-11-02 | 2005-09-15 | インサート セラピューティクス インコーポレイテッド | Rna干渉の治療的利用のための方法及び組成物 |
KR20060063788A (ko) * | 2003-05-30 | 2006-06-12 | 니뽄 신야쿠 가부시키가이샤 | 올리고 핵산 담지 복합체, 이 복합체를 함유하는 의약조성물 |
JP2006180710A (ja) * | 2003-07-29 | 2006-07-13 | Ryozo Nagai | Klf5遺伝子の発現を抑制するrna |
WO2005076998A2 (en) * | 2004-02-05 | 2005-08-25 | Intradigm Corporation | Rnai therapeutics for treatment of eye neovascularization diseases |
-
2005
- 2005-10-24 US US11/883,168 patent/US20090011003A1/en not_active Abandoned
- 2005-10-24 ES ES05805115T patent/ES2386549T3/es active Active
- 2005-10-24 WO PCT/JP2005/019526 patent/WO2006080118A1/ja active Application Filing
- 2005-10-24 KR KR1020077017502A patent/KR20070104575A/ko not_active Application Discontinuation
- 2005-10-24 EP EP05805115A patent/EP1842558B1/en not_active Not-in-force
- 2005-10-24 JP JP2007500421A patent/JPWO2006080118A1/ja active Pending
- 2005-10-24 CA CA002596230A patent/CA2596230A1/en not_active Abandoned
- 2005-10-24 AU AU2005326371A patent/AU2005326371A1/en not_active Abandoned
- 2005-10-24 CN CNA2005800473663A patent/CN101111269A/zh active Pending
-
2011
- 2011-12-20 JP JP2011278409A patent/JP2012072181A/ja not_active Abandoned
-
2012
- 2012-09-19 JP JP2012205586A patent/JP5872988B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2014
- 2014-07-08 JP JP2014140383A patent/JP6023126B2/ja not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2002028367A1 (fr) * | 2000-10-04 | 2002-04-11 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Procede de revetement de particules fines avec un film de lipides |
Non-Patent Citations (8)
Title |
---|
JPN6011032172; J. Mol. Biol. Vol.327, 2003, p.761-766 * |
JPN6012013496; Biochem. Biophys. Res. Commun. Vol.312, No.4, 2003, 1220-1225 * |
JPN6012013498; Pharmacol. Rev. Vol.55, No.4, 2003, 629-648 * |
JPN6015033548; Cancer Res, vol.69 p.6531-6538 (2009) * |
JPN6016011569; 日本脳神経外科学会総会抄録集,vol.63,p.692 , 2004 * |
JPN6016011570; 日本癌学会総会記事,vol.63,p.73 , 2004 * |
JPN6016011571; 日本脳神経外科学会総会抄録集,vol.62,p.145 , 2003 * |
JPN6016011572; 日本癌学会総会記事,vol.62,p.200 , 2003 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
AU2005326371A1 (en) | 2006-08-03 |
EP1842558A4 (en) | 2010-04-07 |
EP1842558A1 (en) | 2007-10-10 |
KR20070104575A (ko) | 2007-10-26 |
JP5872988B2 (ja) | 2016-03-01 |
US20090011003A1 (en) | 2009-01-08 |
CN101111269A (zh) | 2008-01-23 |
JPWO2006080118A1 (ja) | 2008-06-19 |
JP2013010786A (ja) | 2013-01-17 |
WO2006080118A1 (ja) | 2006-08-03 |
JP6023126B2 (ja) | 2016-11-09 |
ES2386549T3 (es) | 2012-08-22 |
JP2012072181A (ja) | 2012-04-12 |
EP1842558B1 (en) | 2012-06-13 |
CA2596230A1 (en) | 2006-08-03 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6023126B2 (ja) | 標的遺伝子の発現を抑制する組成物 | |
Shobaki et al. | Manipulating the function of tumor-associated macrophages by siRNA-loaded lipid nanoparticles for cancer immunotherapy | |
JP5801055B2 (ja) | 標的遺伝子の発現を抑制する組成物 | |
TW201623614A (zh) | 用於使b型肝炎病毒基因表現靜默之組成物及方法 | |
JP2011126892A (ja) | 脂質に封入された干渉rna | |
JP2022501064A (ja) | ケイ素を含有するカチオン性脂質 | |
EP1970078A1 (en) | Composition inhibiting the expression of target gene in eyeball and remedy for disease in eyeball | |
JP5952197B2 (ja) | 標的遺伝子の発現を抑制する組成物 | |
JP5872898B2 (ja) | 標的遺伝子の発現を抑制する組成物 | |
WO2010110314A1 (ja) | 核酸を含有する肺高血圧症治療剤 | |
WO2010021389A1 (ja) | Bcl-2蛋白質の発現を抑制する核酸 | |
WO2010110318A1 (ja) | 核酸を含有する動脈硬化性疾患治療剤 | |
US20120244210A1 (en) | Composition for suppressing expression of target gene | |
US20120207818A1 (en) | Composition for suppressing expression of target gene | |
US20150247148A1 (en) | Composition for suppressing expression of target gene |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20140806 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20140806 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20150826 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20151026 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20160330 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20160527 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20160913 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20161006 |
|
R151 | Written notification of patent or utility model registration |
Ref document number: 6023126 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R151 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |