JP2019500410A - 音響力学的療法のための微小気泡−化学療法剤複合体 - Google Patents
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Abstract
【選択図】なし
Description
その最も広い態様において、本発明は、音響力学的治療の方法における使用のための微小気泡−化学療法剤複合体を提供する。本明細書で使用する場合、用語「音響力学的療法」は、超音波と超音波感受性薬剤(本明細書では「超音波感受性薬物」とも呼ばれる)の組み合わせを含み、音響エネルギーによる超音波感受性薬剤の活性化が一重項酸素などの活性酸素種の生成をもたらす方法を指すことが意図される。
(a)式IIIの化合物:
を反応させる工程;及び
(b)必要に応じて、生じた化合物をその薬学的に許容される塩に変換する工程、
を含む方法を提供する。
(a)本明細書に記載の有効量の組成物を、影響を受けた細胞又は組織に投与すること;及び
(b)前記細胞又は組織を超音波に供すること、
を含む。
試薬及び器具:
ローズベンガルナトリウム塩、2−ブロモエチルアミン、NHS−ビオチン、MTT、アビジン、FITCアビジン、クロロ酢酸、4−ジメチルアミノピリジン(DMAP)、ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)、Ν,Ν’−ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)、無水ジメチルホルムアミド(DMF)及びエタノールを、可能な限り最高級でSigma Aldrich社(UK)から購入した。ビオチン、5−フルオロウラシル、ジ(N−スクシンイミジル)カーボネート及び2−アミノエタノールを、Tokyo Chemical Industry UK社から購入した。1,2−ジベヘノイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(DSPC)、ジベヘノイルホスファチジルコリン(DBPC)、1,2−ジステアロイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン−N−[アミノ(ポリエチレングリコール)−2000(DSPE−PEG(2000))及びDSPE−PEG(2000)−ビオチンを、Avanti Polar Lipids(Alabaster,Alabama,USA)から購入した。ドキソルビシンをXBBC(中国)から購入した。酸素ガスをBOC Industrial Gases UKから購入し、パーフルオロブタン(PFB)ガスをApollo Scientific社から購入した。リン酸緩衝生理食塩水(PBS)をGibco,Life Technologies,UKから購入した。
DSPC MBを、McEwanら(J Control Release.2015;203,51−6)に記載されるように調製した。しかしながら、MBの物理的安定性及びO2保持に対するそれらの安定性の両方を改善するために、発明者らは、ジステアロイルホスファチジルコリン(DSPC)の代わりに、長鎖脂質ジベヘノイルホスファチジルコリン(DBPC)を利用し、これは、MB表面の拡散を低減し、ひいては安定性を向上させることが以前の研究で示されている。
無水DMF(40mL)中のビオチン−N−ヒドロキシスクシンイミドエステル(1)(KangらのJr.Rapid Commun Mass Spectrom.2009,23(11),1719−1726)に記載のビオチンとジ(N−スクシンイミジル)カーボネートとの反応によって調製した)の氷冷溶液(3.75g、11ミリモル)に、2−アミノエタノール(1.0ml、16.4ミリモル)を加え、混合物を30分間、25℃で撹拌した。反応を薄層クロマトグラフィー(TLC)(Merck Silica 60、HF 254、20:80メタノール−ジクロロメタン v/v)により監視した。ビオチン−N−ヒドロキシスクシンイミドエステル(Rf=0.76)は、アルコール生成物(Rf=0.47)の同時形成と共に、15分以内に消費された。反応混合物を減圧下で濃縮し、残渣をDMFと共蒸発させ、過剰量の2−アミノエタノールを除去した。白色残留物を水から再結晶し、明黄色の固体(1.7g、38%)として2を得た。分析試料を、2回目の再結晶から得て、融点は192−195℃であった。
13C NMR(125MHz,D2O)177.09(C=O),61.98(CH2),60.19(CH),59.91(CH),55.24(CH),41.29(CH2),39.61(CH2),35.42(CH2),27.77(CH2),27.56(CH2),25.02(CH2)。
ESMS(M+H+):C12H21N3O3Sの実測値288.70、計算値=287.13。
水100mL中の5−フルオロウラシル(3)(5g、38.4ミリモル)、水酸化カリウム(9.07g、161.6ミリモル)及びクロロ酢酸(3.63g、38.4ミリモル)の混合物を、70℃で2時間還流した。室温まで冷却した後、溶液のpHを濃塩酸の添加により5.5に調整した。次いで、反応混合物を18時間、冷蔵庫(5℃)で保管し、得られた白色結晶を濾過により単離し、冷水で洗浄し、52.5%の収率で4を生成した。融点は200℃を超える。
13C NMR(D2O):173.58(C=O),159.97(C=O),150.80(C=O),141.20(C),131.74(CH),51.48(CH2)。
ESMS (M−H+):C6H5O4N2Fの実測値187.10、計算値=188.11。
N−(2−ヒドロキシエチル)−5−(2−オキソヘキサヒドロ−1H−チエノ[3,4−d]イミダゾール−4−イル)ペンタンアミド(2)(0.5g、1.7ミリモル)、5−フルオロウラシル−1−カルボン酸(4)(0.4g、2.1ミリモル)、DMAP(0.023g、0.17ミリモル)及びHOBT(0.023g、0.17ミリモル)を、N2雰囲気下で、100mLの2口丸底フラスコ中の20mLの無水DMFに加えた。混合物を40℃に加熱し、均一な溶液が得られるまで撹拌した。次いで、DCC(0.4g、1.9ミリモル)を反応混合物に加え、12時間室温で撹拌した。DMFを減圧下で除去し、ジエチルエーテル(50mL)を加え、内容物を20分間撹拌した。得られた白色半固体生成物を濾過により除去し、減圧下で過剰のジエチルエーテルを除去した後、粗生成物を、移動相としてアセトニトリル/水(80:20 v/v)を使用して分取HPLC(C−18カラム)により精製した。生成物5を、白色半固体(0.24g、収率30%)として所望の画分の凍結乾燥後に得た。
ESMS (M−H+):C18H24FN5O6Sの実測値456.20、計算値=457.48。
5(91.2mM)及び6(0.61mM)の飽和溶液を、PBS(pH7.4±0.1)中の0.5%DMSO液で調製した。次いで、これらのストック溶液の0.3mLのアリコートを、アビジン官能化PFBMB(1×109 MB/mL)の2つの1mL懸濁液に別々に添加し、内容物を15分間、ボルテックスで混合した。次いで、懸濁液を5分間で、遠心分離(900rpm)し、溶液の上部に浮遊した乳状懸濁液としてMBコンジュゲートを単離した。溶液を除去し、さらに、5又は6のいずれかを含有するストック溶液0.3mLと交換し、混合/遠心分離の工程を繰り返した。次いで、MB懸濁液を、PBS(5mL)で洗浄し、5分間遠心分離(900rpm)し、MBを清浄な遠心管に移した。この洗浄手順を再度繰り返し、単離したPFBMB−RB及びPFBMB−5FUコンジュゲートをガラスバイアルに入れた。次いで、PFBMB−RB及びPFBMB−5FUコンジュゲートに、酸素ガスを2分間噴霧し、得られたO2MB−RB及びO2MB−5FUコンジュゲートを1:3.25の比率で混合し、90.8μMのRB及び440μMの5−FUで、6.8×107MB/mLを含有する最終懸濁液を生成した。
化合物7を、文献の手順に従って調製した(Jamesら、腫瘍の近赤外蛍光イメージングのための潜在的プローブとしてのポリメチン色素の評価(Evaluation of Polymethine Dyes as Potential Probes for Near Infrared Fluorescence Imaging of Tumors):パート−1.Theranostics.2013,3(9),692−702)。4−アミノチオフェノール(0.63g、5ミリモル)をN2雰囲気下で無水DMF(50ml)に溶解した。7(0.6g、0.7ミリモル)をこの溶液に添加し、混合物を室温で18時間撹拌した。この反応を、TLC(移動相として25%のMeOH/DCMを使用して、Merck Silica 60、HF 254)によって監視した。DMFを減圧下で除去し、残渣をDMF(5mL)に再溶解し、Et2O(15mL)で沈殿させた。固体生成物を濾過し、Et2O(30mL)で洗浄し、溶出剤としてMeOH/DCM(1:3)を用いるカラムクロマトグラフィー(シリカゲル、60〜120メッシュ)によって精製した。生成物(230mg、4.8%)を赤褐色の半固体として単離した。この化合物は、安定せず、次の工程で直ちに使用した。
ESMS:C52H58N3O6S3Na2 +の計算値=961.1、実測値960.3。
化合物8(100mg、0.1ミリモル)を、無水DMF(50mL)中の1(40.9mg、0.12ミリモル)の撹拌溶液に添加し、そこへ触媒量のトリエチルアミンを添加した。溶液を室温で5時間撹拌した。反応混合物をエーテル(100ml)に加え、内容物を30分間攪拌した。沈殿物を濾過により回収し、溶出剤としてMeOH:DCM(1:4)を用いて分取TLCにより精製し、生成物を緑色の粉末として単離した。収率=21mg、18.4%。
ESMS:C62H72N5O8S4 +の計算値=1142.4(プロトン化形態,M+)、実測値1143.4。
ビオチン官能化IR-820(9)を、5−FU及びローズベンガルについて上で説明した手順に従って、O2MBの表面に付着させた。[MB]=2.6×108;[9]=280μΜ。
実施例1で調製した0.5mLのO2MB懸濁液(1×108)を、脱気したPBS液(pH7.4±0.1)(4.5mL)に加えた。この溶液の溶存酸素レベルを、溶存酸素計を用いて、2分間隔で20分間にわたって測定した。超音波を、1MHzの周波数、3.0Wcm-2の超音波パワー密度及び50%のデューティサイクル(パルス周波数=100Hz)を使用して、4.5分後に1分間適用した。PFBMBを用いた対照実験も、同じ手順に従って実施した。
ヒト原発膵臓腺癌細胞株MIA PaCa−2及びPANC−1は、ダルベッコ改変イーグル培地中で維持するが、BxPC−3細胞はRPMI−1640培地中で維持し、これらの全てに、加湿した5%CO2の雰囲気中、37℃で10%(v/v)のウシ胎児血清を補充した。これらの細胞株を、ウェルあたり5×103細胞の濃度で96ウェルプレートのウェルに播種し、加湿した5%CO2雰囲気中、37℃で21時間インキュベートし、その後、3時間、37℃の低酸素(O2/CO2/N2、0.1:5:94.9 v/v/v)チャンバーに移した(これは、腫瘍部位で見出される低酸素状態を模倣することを意図している)。次いで、培地を各ウェルから除去し、O2MB−RB(50μL、5μΜのRB)及びO2MB−5FU(50μL、100μΜの5FU)コンジュゲートで置換した。次いで、個々のウェルを、Sonidel SP100 sonoporator(30秒、周波数=1MHz、超音波パワー密度=3.0Wcm-2、デューティ・サイクル=50%、パルス繰り返し周波数=100Hz)を用いて送達する超音波で処理した。細胞を、処理液を除去する前に、さらに3時間低酸素環境で維持し、細胞をPBSで洗浄し、新鮮な培地(ウェル当たり200μL)を加えた。次いで、MTTアッセイ(McHaleら,cancer Lett 1988;41,315−21)を用いて細胞生存率を決定する前に、プレートをさらに21時間、正常酸素条件(すなわち、37℃で、加湿した5%CO2雰囲気)でインキュベートした。ビヒクルのみ、ゲムシタビン(膵臓癌治療で使用するための承認薬)、5−FU、O2MB−5FU+US、O2MB−RB+US及びO2MB−RB/O2MB−5FU混合物−USについて、同様の手順を繰り返した。全ての実験で、RB、5FU及びゲムシタビンの量は、それぞれ5μΜ、100μΜ及び100μΜを使用した。全てのグループも、同じ量のRB又は5−FUが付着したPFBMBコンジュゲートを用いて繰り返した。
BxPc−3細胞を、上記のように10%ウシ胎児血清を補充したRPMI−1640培地中で維持した。細胞(1×106)を、100μLのマトリゲル(登録商標)に再懸濁し、雌のBalb/c SCID(C.B−17/IcrHan(登録商標)Hsd−Prkdcscid)マウスの後部背部に移植した。腫瘍形成は、移植後約2週間で生じ、キャリパーを使用して、腫瘍測定を1日おきに行った。腫瘍が、腫瘍体積の式=4πR3/3を用いる幾何平均直径から計算して218mm3の平均体積に達したら、動物を無作為に10のグループ(n=4)に分けた。麻酔の誘導(Hypnorm/Hypnovelの腹腔内注射)後に、O2MB−RB(MB=1.6×107、[RB]=90.8μΜ)及びO2MB−5FU(MB=5.2×107、[5FU]=440μΜ)を含有するPBSの100μL混合物を各腫瘍に直接注射した。腫瘍内注射は、プラットフォームの薬物動態学的挙動に起因する実験的変動を排除するために、投与の経路として選択した。次いで、必要であれば、1MHzの超音波周波数、3.5Wcm-2の超音波パワー密度(ISATP;空間平均時間ピーク)及び100Hzのパルス反復周波数で30%のデューティ・サイクルを用いて、3.5分間超音波で腫瘍を処置した。追加の処置グループに、(i)薬物なし、(ii)O2MB−RBコンジュゲート単独±超音波処理;及び(iii)O2MB−5FUコンジュゲート単独±超音波処理を含めた。ゲムシタビン(440μΜ)及び5−FU(440μΜ)単独処置も行った。処置後、動物を麻酔から回復させ、腫瘍体積及び体重を9日間毎日記録した。腫瘍体積の増加率(%)を、各グループについての処置前測定値を用いて計算した。
無胸腺ヌードマウスを麻酔し(Hypnorm/Hypnovelの腹腔内注射)、O2MB−9コンジュゲート(100μL)を、尾静脈注射により投与した。処置グループにおいて、IV注射中に、及びIV注射後に3分間、超音波(上記2.10の条件)を腫瘍に適用したが、対照グループ(各グループにおいてn=3)の腫瘍には超音波を適用しなかった。投与後(t=5分及びt=10分)、ICGフィルターセット(励起:705〜780nm;発光:810〜885nm)を使用して蛍光モードで、Xenogen IVIS(登録商標)ルミナイメージングシステムのチャンバー内に動物を入れた。データをキャプチャし、Living Image(登録商標)ソフトウェアパッケージのバージョン2.60を用いて分析した。定量的データを、腫瘍の周囲の対象となる領域を描画し、O2MB−9投与後t=5及びt=10分の時点での蛍光シグナル(光子/秒)を、投与前に取得した蛍光シグナルと比較することによって取得した。
発明者らはまた、5−FUの単独処置と比較した場合の、分子レベルでのSDT/5−FU組み合わせ処置の効果をプロービングすることに興味を持った。これを行うために、対照グループ(すなわち、無処置)、O2MB−5FU+USグループ(すなわち、5−FU)、及びO2MB−RB/O2MB−5FU混合物+USグループ(すなわち、併用処置)の腫瘍を、監視期間の終了時に採取し、免疫組織化学及びqRT−PCR分析に供した。
無胸腺ヌードマウスを麻酔(Hypnorm/Hypnovelの腹腔内注射)し、PFBMB又はO2MB(100μL)のいずれかを尾静脈注射により投与した(各グループn=3)。IV注射中に、及びIV注射後に3分間、超音波(上記の2.10の条件)を腫瘍に適用し、腫瘍を30分後に摘出した。HIF−1αタンパク質発現のウェスタンブロット分析のために、総タンパク質を、尿素緩衝液を用いて抽出した。これらの研究で用いられる一次マウス抗体は、抗HIF1α(Millipore,1:500)、及び抗GBPDH(Sigma,1:1000)であった。タンパク質試料を、4〜12%のTruPAGE(登録商標)ゲルで電気泳動し、ニトロセルロース膜に移した。非特異的結合のブロッキングを、0.05%(v/v)Tween20を含有する1×トリス緩衝生理食塩水で希釈した5%(w/v)のウシ血清アルブミン中で行った。次いで、膜を適切な二次抗体、ヤギ抗マウスIgG−HRP(原液の1:10000)中でインキュベートした。二次抗体を、ドイツのハイデルベルクのSanta Cruz Biotechnology社から購入した。デンシトメトリーを、ハウスキーピング基準としてGAPDHを用いて、HIF1αのタンパク質発現を定量するために行った。
処置を施した組織における免疫応答を特徴付けるために、Bcl3及びBcl2タンパク質発現を、監視期間の終了時に採取した組織試料における免疫組織化学を用いて調べた。Bcl2及びBcl3タンパク質の免疫組織化学(IHC)評価を、パラフィン包埋切片にて行った。パラフィン包埋組織試料を、Leica RM2235 ミクロトーム(Leica Biosystems社、Newcastle)を用いて4μmの厚さに切断し、コーティングしたスライドガラス上で調べた。Bcl2(クローン:BCL−2/100/D5)及びBcl3(クローン:1E8)のIHC分析物を、それぞれ1:200及び1:150に希釈した。両方の抗体は、Leica Biosystemsから入手したマウス抗ヒトであった。免疫染色を、ボンドエピトープ回収溶液(Bond Epitope Retrieval Solution)2(pH9.0のEDTAベース)と共に、オンボード熱誘導抗原回収(on board heat−induced antigen retrieval)を用いる自動化Bond−Max system(Leica Biosystems社、Newcastle)を用いて30分間行った。内因性ペルオキシダーゼ活性を、5分間、0.3%過酸化水素を用いてブロックした。組織学的標本を室温で15分間、一次抗体とインキュベートし、スライドを室温で8分間、ウサギ抗マウスとインキュベートした。次いで、スライドを、室温で8分間、ヤギ抗ウサギポリマー試薬とインキュベートした。反応を、ボンドポリマーレファイン検出キット(bond polymer refine detection kit)、その後、色原体として3,3’−ジアミノベンジジンテトラヒドロクロリドを用いて10分間発色した。免疫組織強度及び比例スコアを、オールレッドら(免疫組織化学的分析による乳癌の予後因子及び予測因子(Prognostic and predictive factors in breast cancer by immunohistochemical analysis).1998,11(2):155−68)に従って行った。免疫組織化学研究を行うために、Bcl3発現を転写レベルで確認した。Bcl3のmRNA発現を、表1に記載のプライマーを用いて遺伝子特異的qRT−PCRで測定した。
免疫組織化学の結果は、タンパク質レベルで、治療グループと対照グループの両方の間に、Bcl3及びBcl2の調節解除があったことを明らかにした。分析のこのレベルで、Bcl3の強度及び割合は、対照及び5FUのグループにおいて高かったが、併用処置グループでは減少した。同様に、Bcl2タンパク質発現は、対照グループで最も高く、5FUグループで減少し、併用処置グループで検出されなかった(図10)。mRNAレベルで、同様のパターンがBcl3について観察され(図11a及び11b)、ΔΔCtは、5FUと組み合わせ処置グループのそれぞれについて、対照グループに比べて約5倍及び7倍の有意な減少を示した(p<0.001)。Bcl3は、NF−κβ経路の重要なメンバーであり、生存、増殖、炎症及び免疫応答を含む多くの細胞経路の調節に関与している。Bcl3の発現及び活性化は、組織及び刺激の種類に依存して、高まった細胞増殖又は生存に関連している。その転写リプレッサー機能は、免疫応答の調節並びに免疫細胞の発達及び活性化に関与することが示されている(Wessellsら、J Biol Chem 2004;279:49995−50003、及びKuwataら、Blood 2003;102:4123−4129)。Bcl3発現が調節解除されたという事実は、免疫応答並びに生存及び増殖細胞シグナル伝達の変化を示唆している。これは、重要な抗アポトーシス遺伝子であるBcl2が、対照において高く、その発現は併用処置後に著しく減少したという事実によって確認された。実際、Bcl2発現は、原発膵臓腫瘍の大部分において上方制御されることが知られており(Campaniら、Pathol.2001,194(4),444−450)、その発現を下方制御するためにBcl2特異的siRNAを用いることは、インビトロ及びインビボで膵臓腫瘍成長に対する抗増殖及びアポトーシス促進効果を有することが実証されている(Ockerら,Gut,2005,54(9),1298−1308)。より最近には、MIA PaCa−2膵臓癌異種移植モデルを用いて抗腫瘍活性を示すG−四重鎖結合化合物(MM41)が、タンパク質レベルでの解析後に、Bcl2レベルを40%低下させたことが示されている(Ohnmachtら、Sci Rep.2015,16(5):11385)。まとめると、これらの結果は、SDT/5−FU組み合わせ処置の結果として、細胞シグナル伝達経路に顕著な効果を示し、従来の化学療法ベースのレジメンと共に使用した場合に、SDTが膵臓癌患者にとって重要な治療上の利益を提供できることを示唆している。
臨床橋渡しに適するために、MB懸濁液を静脈内投与する必要があり、MBを適切な超音波条件を用いて腫瘍部位で破壊した。そのような方法は、増感剤/化学療法剤の局在化を高め、腫瘍部位での腫瘍pO2を増やす必要がある。そのようなアプローチの実現可能性を試験するために、ビオチン官能化赤外線吸収シアニン色素(9)をRB及び5−FU(スキーム2)の代わりとして用いた。実施例4を参照されたい。9のUV−Vis及び蛍光スペクトルは、この化合物をインビボイメージングに最適にさせるNIR領域に吸光度(750nm)及び発光極大(818nm)を明らかにする。
20g(91.3ミリモル)の4−ヨードアニリンを15mLの濃塩酸と15mLの水の溶液と共に撹拌した。混合物を約−10℃に冷却し、水45mL中12.6g(182.6ミリモル)のNaNO2を連続的に撹拌しながら滴加した。懸濁液をさらに30分間撹拌し、その後、SnCl2.2H2O(67.99g,40mlの濃HCl中301.3ミリモル)の氷冷溶液を、−10℃で温度を維持しながら滴加した。反応混合物をこの温度で1.5時間、5℃で一晩撹拌した。得られた淡褐色の沈殿物を濾過し、水で3回洗浄した。次いで、このようにして得られたこの固体塊を、水(100ml)中のNaOHの飽和溶液で攪拌し、エーテル(200ml)で抽出した。エーテル層をNaOH、Na2S2O3及び水の水溶液で洗浄した。MgSO4(無水)で乾燥した後、エーテル層を乾燥状態まで蒸発させ、褐色粉末として(4−ヨードフェニル)ヒドラジンを17.94g得た。融点=104〜106℃。
ESMS(M+H) C6H7IN2の実測値=235.00、計測値=234.04。
12.68g(54.1ミリモル)の(4−ヨードフェニル)ヒドラジン(1)及び8g(92.8ミリモル)の3−メチル−2−ブタノンを、20時間、100mlの氷酢酸中で還流した。酢酸を蒸発させ、残渣をエーテルに溶解した。不溶性沈殿物を濾別し、エーテル溶液をNaOHの水溶液で洗浄し、その後、Na2S2O3及び水で洗浄した。有機層を無水Na2SO4で乾燥させ、エーテルを減圧下で除去し、赤色ガム状液体として10.5gの5−ヨード−2,3,3−トリメチル−3H−インドール(2)を得た。
13C NMR(CDCl3):153.4(C),148.1(C),139.3(C),136.6(CH),130.6(CH),121.8(CH),89.9(C),54.0(C),23.0(CH3),22.9(CH3),15.3(CH3)。
ESMS(M+H) C11H12INの実測値=286.1、計算値=285.12。
トルエン(70ml)、5−ヨード−2,3,3−トリメチル−3H−インドール(2)(12g、42.1ミリモル)及び1,4−ブタンスルトン(8.6g、63.1ミリモル)を18時間加熱還流した。反応混合物を室温まで冷却させた。得られた褐色の結晶を濾過し、アセトン(3×10ml)で洗浄した。濾過した生成物をMeOH及びジエチルエーテルの溶液から再結晶させた。結晶を収集し、真空乾燥させ、8gの5−ヨード−2,3,3−トリメチル−1−(4−スルホブチル)−3H−インドール−1−イウム(3)を得た。
13C NMR(DMSO−d6):176.2,148.4,139.9,136.7,132.5,126.8,96.8,49.8,46.8,42.6,26.8,25.6,10.5。
ESMS(M+H) C15H21INO3S+の実測値=422.10、計算値=422.30。
無水EtOH(10ml)中の3(0.2g、0.47ミリモル)、(Flanaganら、Bioconjugate Chem,1997,8,751−756に記載の方法に従って調製した)4(0.153g、0.47ミリモル)及び無水酢酸ナトリウム(0.077g、0.93ミリモル)の溶液を、N2雰囲気下で4時間加熱還流した。EtOHを減圧下で除去し、残渣を、溶出剤として25%MeOH−CHCl3混合物を用いるカラムクロマトグラフィー(シリカ60−120メッシュ)によって精製した。生成物(0.152g、収率33%)を緑色がかった粉末として単離した。
13C NMR(DMSO−d6):174.7,173.9,150.1,149.6,148.0,146.7,145.9,130.8,134.8,132.6,130.1,129.8,128.3,126.4,124.7,120.7,116.1,114.9,104.6,102.8,98.6,62.1,60.1,50.4,29.1,48.7,30.5,28.4,28.5,26.3,26.2,4.6。
ESMS(M−H+) C38H46ClI2N2O6S2 +の実測値=977.2、計算値=979.06。
0℃に冷却した濃H2SO4(96%、15mL)溶液に、少量ずつ2,6−ジヨード−4−ニトロアニリン1(3.9g、10ミリモル)を加えた。この溶液をこの温度で20分間撹拌し、NaNO2(1.5g、22ミリモル)を加えた。撹拌を2時間、0℃で続けた。次いで、粘性溶液を氷(100g)に注ぎ、任意の固体物質を濾別した。黄色の濾液を、EtOH(200mL)中のCuSO4.5H2O(160mg,1ミリモル)の還流溶液に注意深く注ぎ、2時間撹拌して、ジアゾニウム塩を減少させた。室温に冷却後、固体の3,5−ジヨードニトロベンゼン(2)を分離した。生成物を濾別し、中性になるまで水で洗浄した。生成物を、EtOHから再結晶し、2.48gの微細褐色針(収率66%)を得た。
13C NMR(CDCl3)δ=94.1,131.7,148.4,151.0。
ESMS[M+H+]:C6H3I2NO2Naの計算値397.8、実測値398.9m/z。
アルゴン雰囲気下で無水EtOH(75mL)中2(7.15g、19ミリモル)の懸濁液に、SnCl2・2H2O(21.6g、96ミリモル)を加えた。この混合物を沸騰させ、EtOH(40mL)中のNaBH4(361mg、9.5ミリモル)溶液を滴加した。反応混合物を45分間、還流で撹拌した。反応物を0℃に冷却した後、水(60mL)を加え、混合物をNaOH(H2O中2.5M)で中和した。アニリン誘導体を、ジエチルエーテルで抽出し、Na2SO4上で乾燥させ、減圧下で蒸発させて、アニリン3(5.86g、粗収率89%)を得た。
13C NMR(CDCl3)δ=148.5,134.8,122.9,95.1。
ESMS[M+H+]:C6H5I2Nの計算値344.8、実測値345.5m/z。
この化合物を米国特許公開第2013/0231604号に記載の手順にしたがって合成した。
この化合物を米国特許公開第2013/0231604号に記載の手順にしたがって合成した。
トルエン(10ml)、4,6−ジヨード−2,3,3−トリメチル−3H−インドール(5)(2.1g、5.1ミリモル)及び1,4−ブタンスルトン(3.5g、25.7ミリモル)を還流下で18時間加熱した。反応混合物を室温まで冷却させた。得られた褐色の結晶を濾過し、アセトン(3×10ml)で洗浄した。濾過した生成物をMeOH及びジエチルエーテルの溶液から再結晶させた。結晶を収集し、真空乾燥させ、1.9gの4,6−ジヨード−2,3,3−トリメチル−1−(4−スルホブチル)−3H−インドール−1−イウム(6)を得た。
ESMS[M−H+]:C15H20I2NO3S+の計算値547.9、実測値546.1m/z。
無水EtOH(10ml)中8(0.84g、1.5ミリモル)、(Flanaganら、Bioconjugate Chem,1997,8,751−756に記載の方法に従って調製した)7(0.25g、0.7ミリモル)及び無水酢酸ナトリウム(0.13g、1.5ミリモル)の溶液に、N2雰囲気下で、4時間加熱還流した。EtOHを減圧下で除去し、残渣を、溶出剤として25%MeOH−CHCl3混合物を用いるカラムクロマトグラフィー(シリカ60−120メッシュ)によって精製した。生成物(0.153g、収率8%)を褐色粉末として単離した。
13C NMR(DMSO−d6):170.2,169.9,158.9,150.1,149.7,148.6,146.8,144.9,140.8,139.3,134.2,132.1,126.7,124.3,104.0,100.4,96.7,96.2,94.5,64.1,59.5,50.5,48.7,48.1,30.3,28.7,28.2,26.3,26.1,24.3。
ESMS[M−H+]:C38H44CI4N2O6S2Na+の計算値1253.85、実測値1252.81m/z。
BxPC−3細胞を、10%ウシ胎児血清を補充したRPMI−160培地中で維持した。細胞を、空気中5%CO2下、37℃で培養した。BxPC−3細胞(1×106)を、100μlのマトリゲルに再懸濁し、雄性SCIDマウスの後背部に移植した。腫瘍形成は、移植後約2週間で生じ、キャリパーを使用して、毎日腫瘍を測定した。腫瘍が、腫瘍体積の式=4πR3/3を用いて幾何平均直径から計算された平均体積267mm3に達したら、動物を無作為に2つのグループ(n=2)に分けた。麻酔(Hypnorm/Hypnovelの腹腔内注射)の誘導後、各腫瘍内に直接注入されるPBS:DMSO(98:2)ビヒクル中のI2−IR783(1mg/kg)の100μlアリコートを処置グループに与え、処置間で1分間の遅れで、3×3分間、780nmの光照射(100mW)で処置した。第2グループ(対照)にビヒクルのみを与えた。処置後、動物を麻酔から回復させ、腫瘍体積を示した時間に監視した。腫瘍体積の増加率(%)を、各グループの前処理測定を用いて計算した。8日目に、処置グループに、上記の第2の処置を施すだけでなく、光照射前に、100μlのO2MB(1×108 MB/mL)を腫瘍内注射した。結果を図13に示す。
図14は、(a)UV/Vis及び(b)カルジオグリーンと比較したI2−IRCYDYE及びI4−IRCYDYEの蛍光発光スペクトルを示す。新規化合物は、明らかにカルジオグリーンと同様の吸収プロファイルを示す。しかしながら、I2−IRCYDYEの蛍光発光はカルジオグリーンと同様のままであるが、I4−IRCYDYEからの発光はかなりクエンチする。これは、追加のヨウ素原子によって増加したISCに起因している。
図15は、780nmで励起した時に、I2−IRCYDYE及びI4−IRCYDYEの両方がカルジオグリーンよりも一重項酸素を生成することを示す。
手順:
ヒト原発膵臓腺癌細胞株MIA PaCa−2を、ダルベッコ改変イーグル培地中で維持し、37℃で、加湿した5%CO2雰囲気で10%(v/v)のウシ胎児血清を補充した。細胞を、ウェル当たり4×103細胞の濃度で96ウェルプレートのウェルに播種し、加湿した5%CO2雰囲気で、37℃で21時間インキュベートした。次いで、培地を除去し、ウェルは、ローズベンガル(3μΜ)、5−フルオロウラシル(50μΜ)又はRB(3μΜ)と5−FU(50μΜ)の両方の組合せのいずれかで3時間処理した。次いで、薬物溶液を除去し、新鮮な培地を添加し、Sonidel SP100 sonoporator(30秒、周波数=1MHz、超音波パワー密度=30Wcm-2、デューティ・サイクル=50%、パルス繰り返し周波数=100Hz)を用いて送達される超音波で処理したウェルを選択した。次いで、細胞を24時間インキュベートし、その後に、細胞生存率を、MTTアッセイを用いて決定した。
結果を図17に示す。結果は、SDT処置(すなわち、RB+US)がRB単独(RB−US)と比較して細胞生存率を11.1%低下させることを実証する。5FU処理+超音波は、5FU単独処理よりも細胞生存率を5.9%低下させた。組み合わせたSDT/5FU+超音波(コンボ+US)での処理は、RB/5FU−超音波での処理と比較して21.9%低下させた。驚くべきことに、この差は、両方の処理による影響を加えることによって予想されるものよりも大きく(17%)、両方の技術を組み合わせることによって相乗効果があることを示す(n=6)。
ビオチン−ローズベンガル及びビオチン−ドキソルビシンの合成:
ビオチン−ローズベンガルの合成については上記の実施例2に記載した。ビオチン−ドキソルビシン(ビオチン−Dox)をスキーム3に従って調製した。
DMF(10ml)中のビオチン−N−ヒドロキシスクシンイミドエステル(0.14g、0.41ミリモル)の氷冷溶液に、窒素雰囲気下でドキソルビシン(0.3g、0.41ミリモル)を添加した。30分間撹拌後、トリエチルアミン(0.5ml、2ミリモル)をこの反応混合物に加え、室温でさらに12時間撹拌した。反応をTLC(Merck Silica 60、HF 254、20:80メタノール−ジクロロメタン v/v)により監視した。反応完了後、過剰のジエチルエーテル(100ml)を反応混合物に加えた。このようにして得られた赤色固体を濾過し、ジエチルエーテル(50ml×3)で3回洗浄した。次いで、この赤色固体を溶出液としてメタノール−ジクロロメタン(20:80、v/v)を用いてPTLC精製に供し、0.25g(収率=78%)のビオチン化ドキソルビシンを得た。分析試料を、エタノールからのこの生成物の再結晶から得た。
ESMS [M−H]:C37H43I2N3O13Sの計算値=769.25、実測値=767.9m/z。
ビオチン−RB(2.5mg/mL)及びビオチン−DOX(2.5mg/mL)を含有する溶液を、PBS中の0.5%DMSO液(pH7.4±0.1)で調製した。次いで、これらの原液の2mLのアリコートを、アビジン官能化PFBMB(1×109 MB/mL)の2つの2mLの懸濁液に別々に添加し、内容物を15分間混合した。次いで、懸濁液を5分間遠心分離(900rpm)し、MBコンジュゲートを溶液の上部に浮遊している乳状懸濁液として単離した。溶液を除去し、さらにビオチン−RB又はビオチン−Doxのいずれかを含有する2mLの原液と交換し、混合/遠心分離工程を繰り返した。次いで、MB懸濁液を、PBS(5mL)で洗浄し、5分間、遠心分離(900rpm)し、MBを清浄な遠心管に移した。この洗浄手順を再度繰り返し、単離したPFBMB−RB及びPFBMB−Doxコンジュゲートをガラスバイアルに入れた。次いで、PFBMB−RB及びPFBMB−Doxコンジュゲートに、酸素ガスを2分間噴霧し、得られたRBO2MB及びDoxO2MB(図18参照)を動物実験に直接使用した。
本研究で用いた全ての動物を、英国の動物(科学的処置)法1986の下でライセンス化された手順に従って人道的に処置した。MDA−MB−231細胞を、上記の10%ウシ胎児血清を補充したRPMI−1640培地中で維持した。細胞(1×106)を100μLのマトリゲル(登録商標)に再懸濁し、雌Balb/c SCID(C.B−17/IcrHan(登録商標)Hsd−Prkdcscid)マウスの後部背部に移植した。腫瘍形成は、移植後約2週間で生じ、キャリパーを使用して一日おきに腫瘍を測定した。腫瘍体積の式=4πR3/3を用いて幾何平均直径から計算された平均体積100mm3に腫瘍が達したら、動物を無作為に3つのグループ(n=3)に分けた。麻酔(Hypnorm/Hypnovelの腹腔内注射)の誘導後、グループ1に100μLのRBO2MB(300μΜのRB)を与え、グループ2に100μLのDoxO2MB(475μΜ)を与え、グループ3にRBO2MB(150μΜのRB)及びDoxO2MB(237.5μΜ)を100μL与えた。プラットフォームの薬物動態学的挙動に起因する実験的変動を排除するために、腫瘍内注射を投与経路として選択した。次いで、腫瘍を1MHzの超音波周波数、3.5Wcm-2の超音波パワー密度(ISATP;空間平均時間ピーク)で、100Hzのパルス繰り返し周波数で30%のデューティ・サイクルを用いて3.5分間超音波で処置した。処置を14日目に繰り返した。処置後、動物を麻酔から回復させ、9日間毎日、腫瘍体積及び体重を記録した。腫瘍体積の増加率(%)を、各グループの処置前測定値を用いて計算した。
結果を図19に示す。結果は、DoxO2MB/RBO2MB+US組み合わせ治療が、ドキソルビシン及びローズベンガルの半分濃度を用いるRBO2MB+USよりも効果的で、DoxO2MB+USと同じくらい効果的であったことを示す。結果は、このプラットフォームを用いて、乳癌を治療することができることを実証する。
Claims (34)
- 音響化学療法において使用するための微小気泡−化学療法剤複合体であって、前記音響化学療法が、微小気泡−超音波感受性薬剤複合体の同時使用または逐次使用を含む、微小気泡−化学療法剤複合体。
- 音響化学療法において使用するための微小気泡−化学療法剤複合体であって、前記複合体が、さらに、好ましくは、非共有結合を介して、例えば、ビオチン−アビジン相互作用を介して少なくとも1つの超音波感受性薬剤に付着又は結合している、微小気泡−化学療法剤複合体。
- 好ましくは、非共有結合を介して、例えば、ビオチン−アビジン相互作用を介して少なくとも1つの化学療法剤に付着又は結合している微小気泡を含む、請求項1に記載の使用のための複合体。
- 前記微小気泡−化学療法剤複合体が、気体、好ましくは酸素を保持するシェルを有する微小気泡を含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の使用のための複合体。
- 前記微小気泡−超音波感受性薬剤複合体が、気体、好ましくは酸素を保持するシェルを有する微小気泡を含む、請求項1、3及び4のいずれか一項に記載の使用のための複合体。
- 前記微小気泡−化学療法剤複合体及び/又は前記微小気泡−超音波感受性薬剤複合体が、0.5〜100μmの直径を有する微小気泡を含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載の使用のための複合体。
- 前記微小気泡−化学療法剤複合体及び/又は前記微小気泡−超音波感受性薬剤複合体が、1種以上のポリマー、例えば、ポリエチレングリコールに連結されたリン脂質単層シェルを含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載の使用のための複合体。
- 前記超音波感受性薬剤が、メチレンブルー、トルイジンブルー、ローズベンガルなどのフェノチアジン色素、フォトフリン(登録商標)などのポルフィリン、クロリン、ベンゾクロリン、フタロシアニン、ナフタロシアニン、ポルフィセン、メロシアニン540及びインドシアニングリーンなどのシアニン及びシアニン類似体、BODIPY及びそのハロゲン化誘導体などのアゾジピロメチン(azodipyromethine)、アクリジン色素、プルプリン、フェオホルビド、ベルジン、ソラレン、ヘマトポルフィリン、プロトポルフィリン及びクルクミンから選択され、好ましくは、前記超音波感受性薬剤が、ローズベンガル、メチレンブルー、インドシアニングリーン又はインドシアニングリーンの類似体である、請求項1〜7のいずれか一項に記載の使用のための複合体。
- 少なくとも1種類の医薬担体または賦形剤と共に、請求項2及び4〜8のいずれか一項に定義される微小気泡−化学療法剤複合体(例えば、少なくとも1つの化学療法剤と少なくとも1つの超音波感受性薬剤に非共有結合した微小気泡)を含む医薬組成物。
- 少なくとも1種類の医薬担体または賦形剤と共に、請求項1及び3〜8のいずれか一項に定義される微小気泡−化学療法剤複合体、並びに請求項1及び3〜8のいずれか一項に定義される微小気泡−超音波感受性薬剤複合体を含む医薬組成物。
- 音響化学療法及び/又は診断方法における使用のための、好ましくは、音響化学療法及び同時画像診断の方法における使用のための、請求項9又は請求項10に記載の医薬組成物。
- 前記組成物が、同時に又は経時的に患者の細胞又は組織と接触し、前記細胞又は組織が超音波及び/又は光による照射に供される、請求項11に記載の使用のための医薬組成物。
- 癌の治療及び/又は診断、好ましくは、深部腫瘍の治療及び/又は診断に使用するための、請求項9〜12のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 前記癌が、骨肉腫及び軟部組織肉腫を含む肉腫;癌、例えば、乳癌、肺癌、脳癌、膀胱癌、甲状腺癌、前立腺癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、胃癌、肝臓癌、子宮癌、肝臓癌、腎臓癌、前立腺癌、子宮頸癌及び卵巣癌、ホジキン及び非ホジキンリンパ腫を含むリンパ腫、神経芽細胞腫、黒色腫、骨髄腫、ウィルムス腫瘍、並びに急性リンパ芽球性白血病及び急性骨髄芽球性白血病を含む白血病、星細胞腫、神経膠腫並びに網膜芽腫からなる群から選択される、請求項13に記載の使用のための医薬組成物。
- 前記癌が膵臓癌である、請求項14に記載の使用のための医薬組成物。
- 音響化学療法及び/又は音響化学診断の方法における同時使用又は逐次使用のための、請求項1及び3〜8のいずれか一項に定義される微小気泡−化学療法剤複合体、並びに請求項1及び3〜8のいずれか一項に定義される微小気泡−超音波感受性薬剤複合体を含む生成物。
- 以下の成分:必要に応じて、(iii)音響化学療法及び/又は診断の方法における前記成分の使用のための取扱説明書ともに、(i)請求項1及び3〜8のいずれか一項に定義される微小気泡−化学療法剤複合体;並びに別々に(ii)請求項1及び3〜8のいずれか一項に定義される微小気泡−超音波感受性薬剤複合体を含むキット。
- 例えば、音響化学療法及び/又は診断の方法において、請求項1及び3〜8のいずれか一項に定義される微小気泡−超音波感受性薬剤複合体との組み合わせ療法で使用するための医薬の製造における、請求項1及び3〜8のいずれか一項に定義される微小気泡−化学療法剤複合体の使用。
- 例えば、音響化学療法及び/又は診断の方法において、請求項1及び3〜8のいずれか一項に定義される微小気泡−化学療法剤複合体との組み合わせ療法で使用するための医薬の製造における、請求項1及び3〜8のいずれか一項に定義される微小気泡−超音波感受性薬剤複合体の使用。
- 音響化学療法及び同時画像診断の方法における、請求項18又は請求項19に記載の使用。
- 前記方法が、
(a)請求項9又は請求項10に記載の有効量の医薬組成物を、影響を受けた細胞又は組織に投与すること;並びに
(b)前記細胞又は組織を超音波照射及び/又は光に供すること、
を含む、患者の細胞又は組織の音響化学治療法。 - 請求項1及び3〜8のいずれかに定義される微小気泡−化学療法剤複合体。
- 少なくとも1つの化学療法剤及び少なくとも1つの超音波感受性薬剤に連結し、好ましくは、酸素ガスを含有する微小気泡。
- 前記超音波感受性薬剤がハロゲン化(例えば、臭素化又はヨウ素化)され、好ましくは、前記超音波感受性薬剤がハロゲン化シアニン色素、例えば、IR783のハロゲン化類似体である、微小気泡−超音波感受性薬剤複合体。
- 前記超音波感受性薬剤が、式I又は式II
の化合物、又はその薬学的に許容される塩である、請求項24に記載の微小気泡−超音波感受性薬剤複合体。 - 前記超音波感受性薬剤が、
- 療法における、例えば、音響化学療法及び/又は診断の方法における使用のための、請求項24〜26のいずれか一項に記載の微小気泡−超音波感受性薬剤複合体。
- 近赤外イメージング(例えば、NIR蛍光イメージング)の方法における使用のための、請求項24〜26のいずれか一項に記載の微小気泡−超音波感受性薬剤複合体。
- 式Iの化合物、式IIの化合物
から選択される化合物、又はその薬学的に許容される塩。 -
- 療法における、例えば、音響化学療法及び/又は診断の方法における使用のための、請求項29又は請求項30に記載の化合物。
- 近赤外イメージング剤として使用するための式I
の化合物、又はその薬学的に許容される塩。 -
- 超音波感受性薬剤及び近赤外イメージング剤の組み合わせとして使用するための、請求項32又は請求項33に記載の化合物。
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