KR20230117807A - 화학-초음파동역학 치료를 위한 이중 자극 감응성 약물 방출형 세포 외 소포체 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 화학-초음파동역학 치료를 위한 이중 자극 민감성 약물 방출형 세포 외 소포체에 관한 것으로, 더 상세하게는 초음파감작제, 항암제(항종양제) 및 탄산수소나트륨이 탑재되어 있는 초음파 및 pH 이중 감응성 세포 외 소포체에 관한 것이다. 본 발명에 따른 화학-초음파동역학 치료를 위한 이중 자극 감응성 약물 방출형 세포 외 소포체는 초음파 조사에 의한 ROS 생성으로 암 세포를 사멸시키는 효과 뿐만 아니라, 초음파에 의해 유발되는 공동화 효과와 함께 약산성 조건인 암 조직 내에서 특이적으로 세포외 소포체가 파열되면서 항암제를 효과적으로 방출할 수 있어, 화학-초음파동역학 치료 효과를 극대화 할 수 있는 장점이 있다.
Description
본 발명은 화학-초음파동역학 치료를 위한 이중 자극 민감성 약물 방출형 세포 외 소포체에 관한 것으로, 더 상세하게는 초음파감작제, 항암제(항종양제) 및 탄산수소나트륨이 탑재되어 있는 초음파 및 pH 이중 감응성 세포 외 소포체에 관한 것이다.
최근 효과적인 암 치료를 위하여 활성산소(ROS)의 농도를 증가시켜 산화 스트레스를 유발하는 항암 요법이 개발되고 있다. 또한 이러한 접근 방식을 기반으로 빛으로 감광제를 활성화하여 인접한 산소 분자로 에너지를 전달함으로써 세포 독성 ROS를 생성하는 PDT(Photodynamic Therapy)가 효과적인 암 표적화 치료법으로 각광받고 있다. 다만, PDT는 선택적인 종양 제거와 낮은 전신 독성을 나타내는 반면, 조직에 침투할 수 있는 빛이 제한되어 임상 적용에 어려움이 있었다. 이와 비교하여, 초음파감작제(sonosensitizer)를 사용하여 초음파(US)에서 ROS를 생성하는 초음파동역학 치료법(Sonodynamic Therapy, SDT)은 US의 깊은 조직 침투능으로 인해 다양한 종류의 심부 종양을 치료할 수 있어, SDT는 PDT의 유망한 대안으로 대두되고 있다.
SDT 효과는 초음파감작제의 효능에 크게 영향을 받는다. ROS 생산의 양자 수율, 생체 적합성, 암 선택성 및 장기 안정성을 고려하면 효과적이고 안전한 초음파 감광제의 개발은 여전히 중요한 과제로 남아 있다. 한편, 초음파감작제의 물리화학적 특성과 항암 활성을 크게 향상시킬 수 있는 나노 물질의 개발이 또한 상당한 주목을 받고 있다. 마이셀, 리포솜 및 고분자 나노입자를 포함한 나노운반체는 생체적합성, 세포내 전달, 암 특이성 및 초음파감작제의 생체내 약동학적 특성을 향상시킬 수 있다.
최근 여러 연구에서 암 치료의 복합 요법을 활용하면 암 치료에 시너지 효과를 발휘하고 항암제의 치료 용량을 줄여 부작용을 최소화할 수 있음이 입증되었다. 화학 요법과 SDT의 조합은 암 치료에 대해 상승적인 치료 결과를 달성할 수 있다 (Liang S et al., Adv Mater. 2020; 32: 2003214). SDT는 또한 약물의 세포 내재화를 개선하고 P-당단백질과 같은 ATP 결합 카세트 수송체의 발현 수준을 감소시켜 화학요법의 약물 내성을 극복하는 것으로 알려져있다. 효과적인 화학-초음파동역학적 조합 치료 효능을 얻기 위해서는 초음파감작제와 항암제를 동시에 우선적으로 암세포에 전달할 수 있는 나노캐리어를 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 종양의 특정 자극에 반응하여 항암제의 방출을 촉진할 수 있는 나노운반체를 조작하는 것은 주변 정상 조직으로의 원치 않는 약물 방출을 피하면서 항암 효능을 최대화하는 데 중요하다. 화학-초음파동역학적(chemo-SDT) 조합 요법을 위한 자극-반응성 나노운반체의 엄청난 잠재력에도 불구하고, 나노운반체 고유의 독성과 면역원성 때문에 임상 적용은 제한적이다. 따라서 임상에서 화학-초음파동역학 조합 요법의 적용을 용이하게 하기 위해서는 생체 적합성이 높은 자극 반응성 나노운반체의 개발이 특히 중요하다.
최근 몇 년 동안 나노 크기의 세포 유래막 소포인 세포외 소포(extracellular vesicle, EV)가 약물 전달을 위한 안전하고 유용한 나노 플랫폼으로 부상하였다. 이러한 내인성 나노 플랫폼은 탁월한 생체적합성, 장기간의 혈액 순환 및 최소 면역원성을 보장한다. 또한, 나노 크기의 EV는 EPR(Enhanced Permeability and Retention) 효과로 인해 종양에 우선적으로 축적될 수 있다. 따라서 EV는 종양 부위에 초음파감작제와 항암제를 선택적으로 전달하는 효과적인 나노플랫폼이 되어 시너지 효과와 종양 특이적 조합 항암 요법으로 작용할 수 있다.
한편, 질병의 조기 진단과 치료 평가를 위한 광학 영상은 개인 맞춤형 의료에 있어 매우 중요하다. 단일 플랫폼에서 치료와 진단을 통합하는 테라노스틱 나노캐리어는 조기 진단, 개인 맞춤 치료 및 치료 모니터링을 포함하여 개인 맞춤형 암 치료에서 중추적인 역할을 하는 실질적인 잠재력을 보여주었다. 광자 에너지를 음압파로 변환하여 영상을 얻는 광음향 (Photoacoustic, PA) 영상은 높은 공간 해상도를 가지는 심부 조직의 영상화로 인해 임상 암 진단을 위한 매력적인 영상 기법으로 급부상하고 있다. 따라서, PA 영상 유도 암 치료를 달성할 수 있는 테라노스틱 제제의 개발은 암 치료의 효능과 안전성을 동시에 향상시킬 수 있다는 점에서 중요하다.
본 발명에서는 PA 이미징과 동시에 chemo-SDT의 조합을 달성하기 위해 초음파감작제 및 항암제가 탑재된 EV를 개발하였다. EV에는 FDA(Food and Drug Administration)의 승인을 받은 생체 적합성 치료 염료인 근적외선(NIR) 흡수 인도시아닌 그린(ICG)이 초음파감작제 및 PA 이미징 에이전트로 기능하도록 탑재되었ㄱ고, 파클리탁셀(PTX)도 EV에 캡슐화되어 chemo-SDT를 구현하였다. 또한 EV에 pH에 민감성을 부여하고자, NaHCO3 (탄산수소나트륨, sodium bicarbonate, SBC)를 ICG 및 PTX와 함께 EV에 통합하였으며, EV에 탑재된 SBC는 산성 조건에서 자발적으로 분해되어 CO2 거품을 빠르게 생성함으로써 EV 멤브레인이 파열되어 페이로드 방출 효과를 현저히 개선하였으며, 이러한 pH 반응성 EV는 암세포로의 엔도사이토시스 후 산성 엔도/리소좀에 들어가면 약물의 세포 내 방출에 효과적으로 유도하여, 별도의 암세포 표적화 없이도 암세포 특이적 약물 방출이 가능하도록 하였다.
Liang S et al., Recent advances in nanomaterial assisted combinational sonodynamic cancer therapy. Adv Mater. 2020; 32: 2003214.
본 발명의 목적은 종양 또는 암 조직을 효과적으로 치료하기 위한 화학-초음파동역학 치료에 적합한 약물 전달체 및 이의 용도를 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 초음파감작제; 항암제 또는 항종양제; 및 탄산수소나트륨이 탑재되어 있는 초음파 및 pH 이중 감응성 세포 외 소포체를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 세포 외 소포체는 화학-초음파동역학 치료용인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 세포 외 소포체는 산성 pH에서 파열되어 초음파감작제와 항암제를 방출하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 산성 pH는 pH 4.5 내지 6.8인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 세포 외 소포체는 산성 pH에서 발생하는 CO2에 의해 파열되는 것을 특징으로 한다
본 발명에 있어서, 상기 세포 외 소포체는 초음파 처리에 의해 유발되는 공동화 효과에 의해 파열되는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 초음파감작제는 포르피린계(phorphyrins) 화합물, 프탈로시아닌계(phtalocyanine) 화합물, 로다민(rhodamine)계 화합물, 나프탈로시아닌계(naphthalocyanines) 화합물, 보디피계 (BODIPY) 화합물 및 시아닌(cyanine)계 화합물로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 초음파감작제는 인도시아닌 그린(ICG)인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 세포 외 소포체에 탑재되는 인도시아닌 그린의 농도는 20 내지 40 ㎍/㎖ 인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 항암제는 사이클로포스파아마이드(cyclophosphamide), 메클로레타민(mecholrethamine), 우라무스틴(uramustine), 멜파란(melphalan), 클로라부실(chlorambucil), 이포스파미드(ifosfamide), 벤다무스틴(bendamustine), 카르무스틴(carmustine), 로무스틴(lomustine), 스트렙토조신(streptozocin), 부설판(busulfan), 다카바진(dacarbazine), 테모졸로마이드(temozolomide), 티오테파(thiotepa), 알트레타민(altretamine), 듀오카르마이신(duocarmycin), 시스플라틴(cisplatin), 카르보플라틴(carboplatin), 네다플라틴(nedaplatin), 옥사리플라틴(oxaliplatin), 사트라플라틴(satraplatin), 트리플라틴 테트라나이트레이트(triplatin tetranitrate), 5-플루오로우라실(5-fluorouracil), 6-머캅토퓨린(6-mercaptopurine), 카페시타빈(capecitabine), 클라드리빈(cladribine), 클로파라빈(clofarabine), 시스타르빈(cystarbine), 플록스유리딘(floxuridine), 플루다라빈(fludarabine), 겜시타빈(gemcitabine), 하이드록시우레아(hydroxyurea), 메토트렉세이트(methotrexate), 페메트렉세드(pemetrexed), 펜토스타틴(pentostatin), 티오구아닌(thioguanine), 캠토테신(camptothecin), 토포테칸(topotecan), 이리노테칸(irinotecan), 에토포사이드(etoposide), 테니포시드(teniposide), 미토산트론(mitoxantrone), 파클리탁셀(paclitaxel), 도세탁셀(docetaxel), 이자베필론(izabepilone), 빈블라스틴(vinblastine), 빈크리스틴(vincristine), 빈데신(vindesine), 비노렐빈(vinorelbine), 에스트라머스틴(estramustine), 메이탄신(maytansine), DM1 (mertansine, 메르탄신), DM4, 돌라스타틴(dolastatin), 아우리스타틴 E(auristatin E), 아우리스타틴 F(auristatin F), 모노메틸 아우리스타틴 E(monomethyl auristatin E), 모노메틸 아우리스타틴 F(monomethyl auristatin F), 독소루비신(doxorubicin), 다우노루비신(daunorubicin), 에피루비신(epirubicin), 이다루비신(idarubicin) 및 발루비신(valrubicin)으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 항암제는 파클리탁셀이고, 상기 세포 외 소포체에 탑재되는 파클리탁셀의 농도는 5 내지 15 ㎍/㎖ 인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 세포 외 소포체는 초음파 조사하여 ROS를 생성하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 초음파는 0.3 내지 1.0 W/cm2의 강도로 조사되는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 초음파는 생체 내 세포 외 소포체 투여 후 4 내지 24시간에 조사되는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 세포 외 소포체는 PA조영제로 작용하는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 또한, 상기 세포 외 소포체를 유효성분으로 포함하는, 종양 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 종양은 골발생 육종, 연조직 육종, 유방암, 폐암, 뇌암, 방광암, 갑상선암, 전립선암, 결장암, 직장암, 췌장암, 위암, 간암, 자궁암, 신장암, 자궁경부암, 피부암, 식도암 및 난소암; 호지킨 림프종, 비-호지킨, 신경교세포종, 흑색종, 골수종, 윌름스 종양, 급성 림프아구성 백혈병, 급성 골수아세포 백혈병, 별아교세포종, 신경아교종 및 망막모세포종으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 화학-초음파동역학 치료를 위한 이중 자극 감응성 약물 방출형 세포 외 소포체는 초음파 조사에 의한 ROS 생성으로 암 세포를 사멸시키는 효과 뿐만 아니라, 초음파에 의해 유발되는 공동화 효과와 함께 약산성 조건인 암 조직 내에서 특이적으로 세포외 소포체가 파열되면서 항암제를 암 조직 내로 효과적으로 방출할 수 있어, 화학-초음파동역학 치료 효과를 극대화 할 수 있는 장점이 있다.
도 1은 ICG, PTX 및 SBC를 공동 캡슐화하는 이중 pH/US 반응 EV의 초음파 치료 작용에 대한 개략도이다. EV가 엔도사이토시스를 통해 암세포에 들어가면 엔도/리소좀의 산성 pH는 SBC에서 CO2 거품 생성에 의해 유발되는 파열 효과로 인해 ICG 및 PTX의 방출을 촉진한다. ICG 및 PTX의 세포질 방출 후, US 조사는 세포내 ROS를 생성함으로써 초음파역학적 효과를 유발하고, 이어서 유방암 세포의 세포사멸을 유발한다. ICG가 탑재된 EV는 PA 이미징 신호를 생성하여 PA 이미징 유도 화학-초음파동역학적 조합(chemo-sonodynamic combination) 암 치료를 가능하게 한다.
도 2A는 블랭크 EV, 유리 ICG, 무료 PTX, EV(ICG), EV(ICG/PTX) 및 SBC-EV(ICG/PTX) 샘플의 흡수 스펙트럼을 나타낸다. 도 2B는 블랭크 EV 및 SBC-EV(ICG/PTX)의 TEM 이미지를 나타내며, 스케일 바는 50 nm를 나타낸다. 도 2C는 HEK-293T 세포 및 다양한 EV 샘플의 전형적인 엑소좀 마커(CD81, CD63 및 신테닌)의 웨스턴 블롯 결과이다. 대조군으로 하우스키핑 유전자인 Calnexin과 GAPDH를 사용하였다. 도 2D는 14일 동안 PBS(4℃에서 배양 후 유리 ICG, EV(ICG), SBC-EV(ICG) 및 SBC-EV(ICG/PTX)의 형광 강도의 변화를 나타낸다. 도 2E는 상이한 ICG 농도에서 유리 ICG, EV(ICG/PTX), SBC-EV(ICG/PTX)의 PA 진폭을 나타낸다. 도 2F는 DLS에 의해 결정된 생리학적(즉, pH 7.4) 및 산성(즉, pH 6.0) 조건에서 SBC-EV(ICG/PTX)의 크기 변화를 나타낸다. pH 6.0 완충액에서 48시간 동안 배양한 후, SBC-EV(ICG/PTX)는 불안정화되고 부풀어오르며, 크기 분포가 급격히 증가하였다. 도 2G는 48시간 동안 pH 7.4 및 6.0 완충액에서 배양 후 SBC-EV(ICG/PTX)의 TEM 이미지로, 스케일 바는 50nm이다. 도 2H는 다양한 pH 및 US(조사 1분) 조건에서 SBC-EV(ICG/PTX)로부터의 PTX 방출 프로파일이다. 도 2I는 8 시간의 배양 후 다른 pH 조건에서 EV(ICG/PTX) 및 SBC-EV(ICG/PTX)의 PTX 방출 프로파일이다. (*p < 0.05, **p < 0.01, n = 3).
도 3A는 유리 ICG, EV(ICG) 및 SBC-EV(ICG)로 4시간 처리한 후 MCF-7 세포에 의한 ICG의 상대적 내재화를 보여준다. 도 3B는 RB 표지 EV(ICG) 및 RB 표지 SBC-EV(ICG)로 처리된 MCF-7 세포의 라이브 공초점 현미경 이미지이다. LysoTracker(녹색 점)는 엔도/리소좀 구획을 염색하는데 사용되었다. Hoechst 33342(파란색 점)는 세포 핵을 염색하는 데 사용되었다. 스케일 바 = 20 μm. 도 3C는 MCF-7 세포를 상이한 배양 시간 동안 RB-표지된 EV(ICG) 및 RB-표지된 SBC-EV(ICG)와 함께 배양 후 LysoTracker로 RB의 상대적 colocalization 비율을 확인한 것이다. 도 3D는 살아있는 MCF-7 세포에서 RB로 표시된 EV(빨간색 점) 및 ICG(녹색 점)의 세포내 분포, 공초점 레이저 스캐닝 현미경으로 관찰한 결과이다. 세포를 RB-표지된 EV(ICG) 및 RB-표지된 SBC-EV(ICG)로 1시간 동안 처리하였다. 차등 간섭 대비 이미지(Differential interference contrast images)는 이미징 프로세스 전반에 걸쳐 세포 형태를 보여준다. 스케일 바 = 20 μm. 도 3E는 US 처리 전후에 유리 ICG 및 ICG-탑재된 EV 샘플로 처리된 MCF-7 세포의 세포내 ROS 수준을 나타낸다. 도 3F는 US 조사(1분 동안 0.3 W/cm2) 전후에 다양한 EV 샘플로 처리한 후 MCF-7 세포의 생존을 확인한 결과이다. 도 3G는 다양한 농도에서 블랭크 EV로 처리된 MCF-7 세포의 생존력을 나타낸다. 데이터는 평균 ± SD로 표시되었다 (*p < 0.05, **p < 0.01, n = 3). 도 3H는 US 처리 전후에 유리 ICG 및 SBC EV(ICG/PTX) 처리된 MCF-7 세포의 세포사멸을 분석한 것이다.
도 4A는 종양 이종이식 마우스의 유리 ICG 및 SBC-EV(ICG/PTX) 정맥 내 투여 후, in vivo 생체 분포 이미지를 보여준다. 도 4B는 유리 ICG 및 SBC-EV(ICG/PTX) 정맥 주사 후 24시간에서 종양 및 주요 기관의 ex vivo 영상화를 보여준다. 도 4C는 유리 ICG 및 SBC-EV(ICG/PTX) 정맥 주사 후 24시간에서 주요 기관의 ex vivo 영상화로부터 ICG를 정량화한 것이다. (**p < 0.01, n = 4)
도 5는 EV(ICG/PTX) 및 유리 ICG의 꼬리 정맥 주사 후 상이한 시간 간격에서 MCF-7 베어링 마우스의 in vivo 전신 PA 이미지를 보여준다. 도 5A는 EV(ICG/PTX) 정맥 내 주사 후 마우스의 PA MAP 및 깊이 분해 B 모드 이미지(MAP: 최대 진폭 투영). 눈금 막대는 1cm를 나타냄. 도 5B는 유리 ICG 투여 후 마우스의 PA MAP 및 깊이 분해 B 모드 이미지. 눈금 막대는 1cm를 나타냄. 도 5C는 종양 및 간의 PA 이미지 서브스트랙션 (4시간 - 대조군). 눈금 막대는 1cm를 나타냄. 도 5D는 EV(ICG/PTX)의 정맥 내 주사 4시간 후 깊이 코딩된 MAP PA 이미지. 눈금 막대는 1cm를 나타냄. 도 5E는 EV(ICG/PTX) 및 유리 ICG 주입 후 종양 영역에서 정량화된 PA 진폭 향상. 도 5F는 EV(ICG/PTX) 주입 후 장기(간 및 비장)에서 정량화된 PA 진폭 향상(*p < 0.05, **p < 0.01).
도 6A는 다양한 샘플 투여 및 US 조사 후 14일 동안 MCF-7 종양 보유 마우스(n = 4)의 정상화된 종양 성장 비율을 보여준다. 마우스는 각 샘플의 정맥 내 주사 후 4시간에 US로 조사되었다. 도 6B는 샘플 정맥 주사 및 US 조사 후 14일째 종양의 대표 이미지를 보여준다. 도 6C는 샘플 정맥 주사 및 US 조사 후 14일 동안 종양 보유 마우스(n = 4)의 체중 변화를 보여준다 (*p < 0.05, **p < 0.01, n.s., 유의하지 않음). 도 6D는 샘플 정맥 주사 및 US 조사 후 14일에 주요 기관의 H&E 염색 결과를 보여준다. 스케일 바 = 200μm
도 2A는 블랭크 EV, 유리 ICG, 무료 PTX, EV(ICG), EV(ICG/PTX) 및 SBC-EV(ICG/PTX) 샘플의 흡수 스펙트럼을 나타낸다. 도 2B는 블랭크 EV 및 SBC-EV(ICG/PTX)의 TEM 이미지를 나타내며, 스케일 바는 50 nm를 나타낸다. 도 2C는 HEK-293T 세포 및 다양한 EV 샘플의 전형적인 엑소좀 마커(CD81, CD63 및 신테닌)의 웨스턴 블롯 결과이다. 대조군으로 하우스키핑 유전자인 Calnexin과 GAPDH를 사용하였다. 도 2D는 14일 동안 PBS(4℃에서 배양 후 유리 ICG, EV(ICG), SBC-EV(ICG) 및 SBC-EV(ICG/PTX)의 형광 강도의 변화를 나타낸다. 도 2E는 상이한 ICG 농도에서 유리 ICG, EV(ICG/PTX), SBC-EV(ICG/PTX)의 PA 진폭을 나타낸다. 도 2F는 DLS에 의해 결정된 생리학적(즉, pH 7.4) 및 산성(즉, pH 6.0) 조건에서 SBC-EV(ICG/PTX)의 크기 변화를 나타낸다. pH 6.0 완충액에서 48시간 동안 배양한 후, SBC-EV(ICG/PTX)는 불안정화되고 부풀어오르며, 크기 분포가 급격히 증가하였다. 도 2G는 48시간 동안 pH 7.4 및 6.0 완충액에서 배양 후 SBC-EV(ICG/PTX)의 TEM 이미지로, 스케일 바는 50nm이다. 도 2H는 다양한 pH 및 US(조사 1분) 조건에서 SBC-EV(ICG/PTX)로부터의 PTX 방출 프로파일이다. 도 2I는 8 시간의 배양 후 다른 pH 조건에서 EV(ICG/PTX) 및 SBC-EV(ICG/PTX)의 PTX 방출 프로파일이다. (*p < 0.05, **p < 0.01, n = 3).
도 3A는 유리 ICG, EV(ICG) 및 SBC-EV(ICG)로 4시간 처리한 후 MCF-7 세포에 의한 ICG의 상대적 내재화를 보여준다. 도 3B는 RB 표지 EV(ICG) 및 RB 표지 SBC-EV(ICG)로 처리된 MCF-7 세포의 라이브 공초점 현미경 이미지이다. LysoTracker(녹색 점)는 엔도/리소좀 구획을 염색하는데 사용되었다. Hoechst 33342(파란색 점)는 세포 핵을 염색하는 데 사용되었다. 스케일 바 = 20 μm. 도 3C는 MCF-7 세포를 상이한 배양 시간 동안 RB-표지된 EV(ICG) 및 RB-표지된 SBC-EV(ICG)와 함께 배양 후 LysoTracker로 RB의 상대적 colocalization 비율을 확인한 것이다. 도 3D는 살아있는 MCF-7 세포에서 RB로 표시된 EV(빨간색 점) 및 ICG(녹색 점)의 세포내 분포, 공초점 레이저 스캐닝 현미경으로 관찰한 결과이다. 세포를 RB-표지된 EV(ICG) 및 RB-표지된 SBC-EV(ICG)로 1시간 동안 처리하였다. 차등 간섭 대비 이미지(Differential interference contrast images)는 이미징 프로세스 전반에 걸쳐 세포 형태를 보여준다. 스케일 바 = 20 μm. 도 3E는 US 처리 전후에 유리 ICG 및 ICG-탑재된 EV 샘플로 처리된 MCF-7 세포의 세포내 ROS 수준을 나타낸다. 도 3F는 US 조사(1분 동안 0.3 W/cm2) 전후에 다양한 EV 샘플로 처리한 후 MCF-7 세포의 생존을 확인한 결과이다. 도 3G는 다양한 농도에서 블랭크 EV로 처리된 MCF-7 세포의 생존력을 나타낸다. 데이터는 평균 ± SD로 표시되었다 (*p < 0.05, **p < 0.01, n = 3). 도 3H는 US 처리 전후에 유리 ICG 및 SBC EV(ICG/PTX) 처리된 MCF-7 세포의 세포사멸을 분석한 것이다.
도 4A는 종양 이종이식 마우스의 유리 ICG 및 SBC-EV(ICG/PTX) 정맥 내 투여 후, in vivo 생체 분포 이미지를 보여준다. 도 4B는 유리 ICG 및 SBC-EV(ICG/PTX) 정맥 주사 후 24시간에서 종양 및 주요 기관의 ex vivo 영상화를 보여준다. 도 4C는 유리 ICG 및 SBC-EV(ICG/PTX) 정맥 주사 후 24시간에서 주요 기관의 ex vivo 영상화로부터 ICG를 정량화한 것이다. (**p < 0.01, n = 4)
도 5는 EV(ICG/PTX) 및 유리 ICG의 꼬리 정맥 주사 후 상이한 시간 간격에서 MCF-7 베어링 마우스의 in vivo 전신 PA 이미지를 보여준다. 도 5A는 EV(ICG/PTX) 정맥 내 주사 후 마우스의 PA MAP 및 깊이 분해 B 모드 이미지(MAP: 최대 진폭 투영). 눈금 막대는 1cm를 나타냄. 도 5B는 유리 ICG 투여 후 마우스의 PA MAP 및 깊이 분해 B 모드 이미지. 눈금 막대는 1cm를 나타냄. 도 5C는 종양 및 간의 PA 이미지 서브스트랙션 (4시간 - 대조군). 눈금 막대는 1cm를 나타냄. 도 5D는 EV(ICG/PTX)의 정맥 내 주사 4시간 후 깊이 코딩된 MAP PA 이미지. 눈금 막대는 1cm를 나타냄. 도 5E는 EV(ICG/PTX) 및 유리 ICG 주입 후 종양 영역에서 정량화된 PA 진폭 향상. 도 5F는 EV(ICG/PTX) 주입 후 장기(간 및 비장)에서 정량화된 PA 진폭 향상(*p < 0.05, **p < 0.01).
도 6A는 다양한 샘플 투여 및 US 조사 후 14일 동안 MCF-7 종양 보유 마우스(n = 4)의 정상화된 종양 성장 비율을 보여준다. 마우스는 각 샘플의 정맥 내 주사 후 4시간에 US로 조사되었다. 도 6B는 샘플 정맥 주사 및 US 조사 후 14일째 종양의 대표 이미지를 보여준다. 도 6C는 샘플 정맥 주사 및 US 조사 후 14일 동안 종양 보유 마우스(n = 4)의 체중 변화를 보여준다 (*p < 0.05, **p < 0.01, n.s., 유의하지 않음). 도 6D는 샘플 정맥 주사 및 US 조사 후 14일에 주요 기관의 H&E 염색 결과를 보여준다. 스케일 바 = 200μm
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서는 초음파감작제로 ICG, 항암제로 PTX를 사용하여 pH에 민감한 SBC가 함께 탐재된 세포외 소포체 [SBC-EV(ICG/PTX)]를 제작하고, 세포외 소포체가 엔도사이토시스를 통해 암세포에 들어가면 엔도/리소좀의 산성 pH 조건에서 SBC는 CO2 거품을 생성하여 ICG와 PTX의 방출을 촉진할 수 있음을 확인하였다. ICG 및 PTX의 세포질 방출 후, 초음파 방사선 조사는 ICG를 활성화하여 유방암 세포에서 ROS를 생성하고, 이는 후속적으로 사멸을 유발하였으며, PTX는 또한 세포 사멸을 유도하여 화학 요법과 SDT의 조합을 통해 상승적인 항암 효과를 나타냈다. 뿐만 아니라, 본 발명에서는 pH에 민감한 세포 외 소포체의 in vivo 생체 분포를 통해 암 조직을 PA 이미징으로 모니터링할 수 있었다. 본 발명은 PA 영상과 함께 화학-초음파동역학 암 표적 조합 치료에 이중 pH/US에 민감한 세포외 소포체를 활용하는 첫 번째 연구로써, 이중 자극에 민감한 세포 외 소포체는 높은 생체 적합성과 항암 효능으로 인해 임상 적용 가능성이 매우 높은 장점이 있다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서 초음파감작제; 항암제 또는 항종양제; 및 탄산수소나트륨이 탑재되어 있는 초음파 및 pH 이중 감응성 세포 외 소포체에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 세포 외 소포체는 화학-초음파동역학 치료용인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 세포 외 소포체는 산성 pH에서 파열되어 초음파감작제와 항암제를 방출하는 것을 특징으로 할 수 있다.
이와 같은 pH 반응성 약물 방출은 세포 외 소포체에 탑재되어 있는 탄산수소나트륨(sodium bicarbonate, SBC)이 암 조직과 같은 산성 조건에서 CO2 생성에 의해 유발되는, 세포 외 소포체를 파열시키는 효과에 의한 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 산성 pH는 pH 4.5 내지 6.8인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 상기 산성 pH는 병리학적으로 산성을 나타내는 세포(예컨대, 암세포)의 pH를 의미하며, 바람직하게는 pH 6.0 내지, 6.8, 더 바람직하게는, pH 6.4 내지 6.8일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 세포 외 소포체는 초음파 처리에 의해 유발되는 공동화 효과에 의해 파열되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서, 상기 공동화 효과는 세포 내 액체 환경에서 증기로 채워진 기포가 터지면서 발생하는 에너지에 의한 세포외 소포체의 붕괴를 의미할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 초음파감작제는 포르피린계(phorphyrins) 화합물, 프탈로시아닌계(phtalocyanine) 화합물, 로다민(rhodamine)계 화합물, 나프탈로시아닌계(naphthalocyanines) 화합물,보디피계 (BODIPY) 화합물 및 시아닌(cyanine)계 화합물로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되지는 않으며, 바람직하게는 상기 초음파감작제는 인도시아닌 그린(ICG)일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 세포 외 소포체에 탑재되는 인도시아닌 그린의 농도는 20 내지 40 ㎍/㎖ 인 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 25 내지 35 ㎍/㎖인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 항암제는 사이클로포스파아마이드(cyclophosphamide), 메클로레타민(mecholrethamine), 우라무스틴(uramustine), 멜파란(melphalan), 클로라부실(chlorambucil), 이포스파미드(ifosfamide), 벤다무스틴(bendamustine), 카르무스틴(carmustine), 로무스틴(lomustine), 스트렙토조신(streptozocin), 부설판(busulfan), 다카바진(dacarbazine), 테모졸로마이드(temozolomide), 티오테파(thiotepa), 알트레타민(altretamine), 듀오카르마이신(duocarmycin), 시스플라틴(cisplatin), 카르보플라틴(carboplatin), 네다플라틴(nedaplatin), 옥사리플라틴(oxaliplatin), 사트라플라틴(satraplatin), 트리플라틴 테트라나이트레이트(triplatin tetranitrate), 5-플루오로우라실(5-fluorouracil), 6-머캅토퓨린(6-mercaptopurine), 카페시타빈(capecitabine), 클라드리빈(cladribine), 클로파라빈(clofarabine), 시스타르빈(cystarbine), 플록스유리딘(floxuridine), 플루다라빈(fludarabine), 겜시타빈(gemcitabine), 하이드록시우레아(hydroxyurea), 메토트렉세이트(methotrexate), 페메트렉세드(pemetrexed), 펜토스타틴(pentostatin), 티오구아닌(thioguanine), 캠토테신(camptothecin), 토포테칸(topotecan), 이리노테칸(irinotecan), 에토포사이드(etoposide), 테니포시드(teniposide), 미토산트론(mitoxantrone), 파클리탁셀(paclitaxel), 도세탁셀(docetaxel), 이자베필론(izabepilone), 빈블라스틴(vinblastine), 빈크리스틴(vincristine), 빈데신(vindesine), 비노렐빈(vinorelbine), 에스트라머스틴(estramustine), 메이탄신(maytansine), DM1 (mertansine, 메르탄신), DM4, 돌라스타틴(dolastatin), 아우리스타틴 E(auristatin E), 아우리스타틴 F(auristatin F), 모노메틸 아우리스타틴 E(monomethyl auristatin E), 모노메틸 아우리스타틴 F(monomethyl auristatin F), 독소루비신(doxorubicin), 다우노루비신(daunorubicin), 에피루비신(epirubicin), 이다루비신(idarubicin) 및 발루비신(valrubicin)으로 구성된 군에서 선택되는 항암제인 것을 특지응로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 항암제는 파클리탁셀이고, 상기 세포 외 소포체에 탑재되는 파클리탁셀의 농도는 1 내지 100 ㎍/㎖, 바람직하게는 2 내지 50 ㎍/㎖, 가장 바람직하게는 5 내지 15 ㎍/㎖ 인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 세포 외 소포체는 초음파 조사하여 ROS를 생성하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 초음파는 0.3 내지 1.0 W/cm2 , 바람직하게는 0.4 내지 0.7 W/cm2 의 강도로 조사되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 초음파는 생체 내 세포 외 소포체 투여 후 4 내지 24시간에 조사되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 세포 외 소포체는 PA조영제로 작용하는 것을 특징으로 할 수 있다.
즉, 본 발명에 따른 세포외 소포체는 PA 이미징 에이전트로 기능하기 때문에 EV(ICG/PTX)가 주사된 마우스의 종양에서 인도시아닌 그린의 향상된 국소화는 고해상도 생체내 PA 이미징을 통해 시각화될 수 있으며, 따라서 상기 세포 외 소포체는 PA 조영제로 생체 내 진단에 이용될 수 있으며, 동시에 세포 외 소포체에 탑재된 초음파감작제 및 항암제의 작용에 의해 치료제로도 작용할 수 있다. 이와 같이 단일 플랫폼에서 치료와 진단을 통합하는 본 발명에 따른 테라노스틱 나노캐리어는 치료 효과를 극대화할 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서, 상기 세포 외 소포체를 유효성분으로 포함하는, 종양 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 종양은 골발생 육종, 연조직 육종, 유방암, 폐암, 뇌암, 방광암, 갑상선암, 전립선암, 결장암, 직장암, 췌장암, 위암, 간암, 자궁암, 신장암, 자궁경부암, 피부암, 식도암 및 난소암; 호지킨 림프종, 비-호지킨, 신경교세포종, 흑색종, 골수종, 윌름스 종양, 급성 림프아구성 백혈병, 급성 골수아세포 백혈병, 별아교세포종, 신경아교종 및 망막모세포종으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
최근 연구에서는 질병 또는 암 관련 경로에 관련된 분자는 HEK-293T 세포 유래 세포외 소포체에서 증가되지 않으며, 동물 연구에서 독성 및 면역 반응이 일반적으로 경미하다는 것이 입증된 바, 세포외 소포체는 인간 배아 신장 HEK-293T 세포를 배양하여 분리되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지는 않는다. 우유와 식물을 포함한 다른 세포외 소포체 공급원의 사용도 약물 전달을 위한 대체 수단으로 고려될 수 있음은 본 기술 분야의 통상의 기술자에게 자명할 것이다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 당해 분야에서 잘 알려진 기술을 사용하여 제형화될 수 있다. 투여 경로는 의도한 용도에 따라 좌우될 것이다. 전형적으로, 이들은 전신으로 투여될 것이며 따라서 비경구 투여, 예를 들면 진피내, 피하, 복강내 또는 정맥내 주사에 의한 투여에 적합한 형태로 제공될 수 있다. 적합한 약제학적 형태는 세포외 소포체를 하나 이상의 캐리어 또는 부형제와 함께 함유하는 현탁액 및 용액을 포함한다. 적합한 캐리어는 염수, 멸균수, 포스페이트 완충 식염수 및 이들의 혼합물을 포함한다.
상기 약학적 조성물은 다른 제제 예컨대 유화제, 현탁화제, 분산제, 가용화제, 안정제, 완충제, 보존제, 등을 추가로 포함할 수 있다. 상기 약학적 조성물은 종래의 멸균 기술에 의해 멸균될 수 있다.
상기 세포외 소포체를 함유하는 용액은, 예를 들면 제제 예컨대 점도 조절제, 유화제, 가용화제, 등의 첨가에 의해 안정화될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명에서 사용하기 위한 약학적 조성물은 물 또는 염수 용액, 예를 들면 포스페이트-완충 식염수 중의 수성 현탁액의 형태로 사용될 것이다. 엑소좀은 사용현장에서 재구성을 위해, 예를 들면 물, 염수 또는 PBS에서의 재구성을 위해 동결건조된 분말의 형태로 공급될 수 있다.
본 발명은 상기 세포외 소포체를 함유하는 치료적 유효량의 조성물의 투여를 포함한다. 이후 세포외 소포체를 신체의 원하는 부분 또는 표적체 부분에 분포되도록 한다. 일단 신체에 투여되면, 표적체 부분에서 원하는 치료 효과를 달성하는 빈도 및 강도로 초음파에 노출시킨다.
본 발명에 기재된 조성물의 효과적인 용량은 본 발명에 따른 세포외 소포체의 성질, 투여 방식, 치료될 병태, 환자 등에 의존적일 것이며 이에 따라 조정될 수 있다.
사용될 수 있는 초음파의 빈도 및 강도는 표적 부위에서 세포외 소포체에 탑재된 인도시아닌 그린의 활성화를 유도하기 위한 필요에 기반하여 선택될 수 있으며, 초음파 주파수는 전형적으로 의료용 초음파에 사용되는 0.1 내지 15 MHz, 바람직하게는 0.1 내지 3 MHz 범위일 것이다. 초음파의 강도 (즉 전력 밀도)는 약 0.01 W/cm2 내지 약 10 W/cm2, 바람직하게는 약 0.1 내지 약 1 W/cm2의 범위일 수 있다. 치료 시간은 전형적으로 10초 내지 600초, 바람직하게는 30초 내지 300초의 범위일 것이고 이것은 선택된 강도에 의존적일 것이며, 즉 낮은 초음파 강도의 경우 치료 시간은 장기적일 것이고 더 높은 초음파 강도의 경우 치료 시간은 더 낮을 것이다. 초음파는 연속 또는 펄스 방식으로 적용될 수 있고 집중적이거나 주상 빔으로서 전달될 수 있다.
음향 에너지 (예를 들면 초음파)를 생산할 수 있는 임의의 공급원이 본원에 기재된 방법에서 사용될 수 있다. 공급원은 에너지를 표적 부위에 지시할 수 있어야 하며, 예를 들면, 탐침 또는 에너지를 상기 표적 조직으로 지시할 수 있는 디바이스를 포함할 수 있다.
실시예
일 양태로서 인도시아닌 그린(ICG) 및 파클리탁셀(PTX)를 캡슐화한 pH에 민감한 본 발명 세포외 소포체는 몇 가지 두드러진 특징을 나타낸다. 세포외 소포체에 ICG를 캡슐화하면 낮은 수성 안정성, 빠른 전신 제거, 암 표적 전달 부족과 같은 ICG의 본질적인 단점을 해결할 수 있다. 특히 세포외 소포체 기반 약물 전달 시스템은 생체 적합성 물질[즉, EV 및 카고(즉, ICG)]로만 구성되어 있기 때문에 다른 합성 나노운반체보다 더 나은 안전성 프로파일을 가지고 있다. 이러한 pH에 민감한 세포외 소포체는 엔도/리소좀 구획의 산성 pH에 반응하여 세포외 소포체의 산-불안정화를 통해 약물의 엔도/리소좀 탈출 및 세포질 방출을 촉진하여 항암 효과를 향상시킬 수 있다. 마지막으로, 나노스케일 ICG가 탑재된 세포외 소포체는 암에 대한 PA 이미징 유도 초음파광역학 치료를 달성하기 위해 암 표적 치료학적 나노운반체로 기능할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 실험방법
1-1. 실험재료
2',7'-디클로로플루오레세인 디아세테이트(DCF-DA)는 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA), ICG는 TCI(Tokyo, Japan), PTX는 LC Laboratories(Woburn, MA, USA)에서 각각 입수하였다. 초음파 조사에는 Sonicator 740 (Mettler Electronics Corp., Anaheim, CA, USA)이 사용되었다. 수컷 CANN.Cg-Foxn1 nu/Crl 마우스는 ORIENT(경기도, 한국)에서 구입하였다.
1-2. EV의 준비 및 특성화
EV는 ExoQuick-TC™Biosciences, Palo Alto, USA)를 이용하여 HEK-293T 인간 배아 신장 세포에서 분리 및 제작되었다. 세포는 EV를 생산하기 위해 3일 동안 EV가 없는 FBS (Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)로 유지시켰다. 배양 후 배지(conditioned media)에서 세포 파편을 제거하기 위하여 15분 원심분리(3000g)하였다. 상층액을 ExoQuick-TC™용액으로 처리하고 밤새 방치한 후 30분간 원심분리(1500g)하였다. EV를 포함하는 펠릿을 세척한 다음 PBS에 재현탁하였다. EV는 -80℃보관하였다. 나노 입자 추적 분석(NTA, Nanosight NS300, Malvern, Worcestershire, UK)을 사용하여 EV 농도를 측정하였다.
1-3. 엔지니어링 된 EV의 제작 및 특성화
ICG(20mg/㎖) 및 PTX(20mg/㎖) 스톡 용액을 DMSO를 이용하여 준비하였다. ICG 및 PTX는 간단한 인큐베이션 방법으로 EV로 캡슐화하였다. 요약하면, 0.2 mg ICG를 500㎕ DMSO/PBS[4%(v/v)]에서 5 × 1011 EV와 혼합하고 4℃ 암실에서 2시간 동안 인큐베이션하여 EV(ICG)를 생성하였다. 탑재되지 않은 ICG 및 벌크 단백질은 PD MiniTrap G-25 컬럼(Cytiva, Marlborough, MA, USA)을 사용하여 제거하였다. SBC-EV(ICG)를 준비하기 위하여 DI water에 용해된 SBC 용액(1mM) 2.5㎕를 0.2mg ICG와 함께 5 × 1011 EV를 함유하는 4% DMSO(v/v)를 포함하는 PBS 500㎕에 첨가하였다. 혼합물을 암실에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 정제된 SBC-EV(ICG)는 PD G-25 컬럼을 사용하여 얻었다. ICG와 PTX가 함께 탑재된 EV[EV(ICG/PTX)]를 제작하기 위해 0.2mg의 ICG와 0.1mg의 PTX가 5 × 1011 EV를 포함하는 500 ㎕의 PBS[총 4%(v/v) DMSO]에 추가되었다. 혼합물을 4℃에서 4시간 동안 교반하고, EV(ICG/PTX)를 PD G-25 컬럼을 사용하여 정제하였다. SBC-EV(ICG/PTX)를 얻고자, DI water 상의 2.5㎕의 SBC 용액(1mM)을 4%(v/v) DMSO를 포함하는 500㎕의 PBS 상의 5 × 1011 EV, 0.2 mg ICG 및 0.1 mg PTX의 혼합물에 추가하였다. 혼합물 용액을 4℃에서 4시간 동안 유지한 후 PD G-25 컬럼을 사용하여 신속하게 정제하였다. 최종 산물은 4℃에서 보관하였다. ICG와 PTX의 캡슐화 비율이 상이한 SBC-EV(ICG/PTX)를 제작하기 위하여, 0.2mg ICG, 0.2mg PTX 및 5μM SBC 용액의 조합을 4%(v/v) DMSO를 포함하는 500 ㎕의 PBS 상의 5 × 1011 EV와 혼합하였다.
약물이 탑재된 EV의 크기는 NTA(Nanosight NS300)를 사용하여 측정되었다. 엔지니어링 된 EV의 제타 전위는 Nano-ZS Zetasizer(Malvern)를 사용하여 측정되었다. ICG 및 PTX의 캡슐화 효율은 (EV에 탑재된 ICG 또는 PTX의 양)/(ICG 또는 PTX의 초기 양) × 100%로 계산되었다. 다양한 EV에 탑재된 ICG 및 PTX의 양을 정량화하기 위하여 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분석(LC-MS/MS)을 수행하였다. 6490 삼중 사중극자 질량 분석기와 전자분무 이온화(ESI) 소스(Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)가 장착된 Agilent LC 1100 시리즈를 사용하여 샘플의 LC-MS/MS 결과를 얻었다. 물 중 아세토니트릴 및 0.1% 포름산[ICG의 경우 40:60(v/v); PTX의 경우 60:40 (v/v)]을 용리액으로 사용하였다. EV에서 SBC의 캡슐화 효율은 ICP-OES(iCAP 7000)를 사용한 나트륨 이온의 정량화에 의해 평가되었다. 블랭크 EV를 음성 대조군으로 사용하였다.
1-4. SBC-EV(ICG/PTX)의 콜로이드 안정성 평가
EV(ICG/PTX) 또는 SBC-EV(ICG/PTX)의 콜로이드 안정성을 평가하기 위해 10% EV-고갈된 FBS를 포함하는 PBS에 현탁시키고 37℃에서 배양하였다. EV(ICG/PTX) 또는 SBC-EV(ICG/PTX)의 크기는 NTA를 사용하여 일정 시간 간격으로 측정되었다.
1-5. ICG 탑재 EV에서 ICG의 수성 안정성 평가
다양한 ICG가 탑재된 EV의 수성 안정성을 평가하기 위해 ICG 형광의 변화를 14일 동안 모니터링하였다. 10㎍/㎖의 등가 ICG 농도에서 유리(free) ICG, EV(ICG), SBC-EV(ICG) 및 SBC-EV(ICG/PTX)를 PBS에 현탁시키고 정상적인 조명 조건에서 4℃로 유지시켰다. EV-유래 샘플에서 ICG의 형광 강도는 UV-Vis 분광법(λex:780 nm, λem:835 nm)(Infinite M200 pro)으로 으로 측정되었다.
1-6. 산성 조건에서 SBC가 탑재된 EV의 CO
2
생성 측정
SBC-EV의 CO2 생성은 상업적으로 이용 가능한 이산화탄소 테스트 키트(Hanna Instruments, Smithfield, RI, USA)를 사용하여 평가되었다. 블랭크 EV 및 SBC-EV 샘플의 용액을 산-염기 지시약으로 페놀프탈레인을 포함하는 작은 플라스틱 용기에서 pH 7.4 또는 pH 6.0 수용액과 혼합하였다. 서로 다른 pH 조건에서 SBC가 탑재된 EV와 블랭크 EV에서 발생하는 CO2의 상대적 수준은 CO2가 용해되어 탄산을 형성하는 혼합 용액을 중화하는 데 사용되는 NaOH의 양에 의해 결정되었다.
1-7. SBC-EV(ICG/PTX)의 in vitro 약물 방출 프로파일
pH 및 US가 SBC-EV(ICG/PTX)에서 PTX 및 ICG의 방출에 영향을 미치는지 조사하기 위하여, pH 5.0, 6.0, 6.6 또는 7.4에서 100㎕의 SBC-EV(ICG/PTX) [또는 EV(ICG/PTX)] 용액을 Slide-A-Lyzer 미니 투석 장치(MW 컷오프 = 20kDa, Thermo Fisher Scientific)에 추가하였다. 장치를 PBS(pH 7.4, 0.9㎖)가 들어 있는 미세원심분리 튜브(1.5㎖)에 삽입하였다. US에 반응하는 약물 방출을 조사하기 위하여 SBC-EV(ICG/PTX)에 US (1 MHz, 0.3 W/cm2)로 1분간 처리하고 37℃의 암실에서 배양하였다. 특정 시간 간격(즉, 4, 8 및 12시간)에 미세원심분리기 튜브의 용액을 취하여 방출된 PTX(또는 ICG)의 양을 정량화하였다. 바닥 튜브(bottom tube)는 신선한 PBS가 들어 있는 새 튜브로 교체되었다. 각 바닥 튜브에서 방출된 PTX(또는 ICG)의 양은 LC-MS/MS를 사용하여 정량화되었다. 생체 내 모방 조건에서 SBC-EV(ICG/PTX)에 얼마나 많은 SBC가 남아 있는지 평가하기 위하여 위와 동일한 투석 방법을 사용하여 SBC-EV에서 SBC의 방출 프로파일을 평가하였다. 260mM KCl 용액에 분산된 블랭크 EV 및 SBC-EV를 미니 투석 장치에 도입하였다. 정해진 시간 간격(즉, 1, 2, 4, 8, 12, 24, 48h)에서 방출된 SBC의 양은 ICP-OES(iCAP 7000, Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 정량화되었다. 블랭크 EV는 음성 대조군으로 사용되었다.
1-8. 유리 ICG 및 ICG 탑재 EV의 세포 내재화 분석
MCF-7 세포를 약물 처리 24시간 전에 24웰 플레이트(웰당 5×104개 세포)에 접종하였다. 동일한 ICG 농도의 유리 ICG, EV(ICG) 및 SBC-EV(ICG)를 세포에 처리하였다. 처리 4시간 후 세포에서 ICG의 형광은 이전 연구에서 설명한 대로 유세포 분석기(CytoFLEX)를 사용하여 측정되었다 (J Ind Eng Chem. 2020; 88: 260-7 참조).
MCF-7 세포에 의한 EV 샘플의 세포 내 흡수(cellular uptake)를 정량화하기 위하여 FITC를 사용하여 EV에 표지하였다. 이어서, 0.4㎍의 FITC를 1 × 1012 EV 함유 500㎕ PBS에 첨가하고 4℃ 암실에서 2시간 동안 유지시켰다. PD G-25 컬럼을 사용하여 최종 생성물을 정제하였다. FITC-EV(ICG) 및 FITC-SBC-EV(ICG)는 EV(ICG) 및 SBC-EV(ICG)의 제조에 사용한 것과 동일한 방법으로 제조하였다. MCF-7 세포를 다양한 샘플로 처리하고 4시간 동안 인큐베이션 하였다. FITC로 표지된 EV 샘플의 세포 내 흡수는 이전 연구에서 설명한 대로 FITC의 형광 신호를 정량화하여 결정되었다 (J Ind Eng Chem. 2020; 88: 260-7 참조).
1-9. 공초점 레이저 주사 현미경(CLSM)을 사용한 살아있는 세포 이미징
공초점 레이저 주사현미경으로 EV(ICG)와 SBC-EV(ICG)의 세포 내 위치를 관찰하기 위하여, RB-표지한 EV를 준비하였다. 0.4㎍ RB 이소티오시아네이트(Sigma Aldrich)를 500㎕의 PBS에서 1 × 1012 EV와 혼합하였다. 혼합물을 4℃ 암실에서 2시간 동안 교반하였다. 조 생성물에서 PD G-25 컬럼을 사용하여 미반응 RB를 정제하였다. RB-표지된 EV(ICG) 및 RB-표지된 SBC-EV(ICG)는 EV(ICG) 및 SBC-EV(ICG) 제조를 위해 위에서 언급한 방법에 따라 제조 및 정제되었다. RB-표지된 EV 샘플을 준비하기 위하여 EV 대신 RB-표지된 EV를 사용하였다.
공초점 레이저 주사 현미경(CLSM)의 경우, MCF-7 세포를 유리 바닥 접시(35 x 10 mm)(Eppendorf, Hamburg, Germany)에 웰당 2 x 103 세포의 농도로 분주하고 24시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 37℃에서 10분 동안 1μM LysoTracker™Green DND-26(Thermo Fisher Scientific) 및 1㎍/㎖ Hoechst 33342(Thermo Fisher Scientific)로 염색하였다. 이후 공초점 레이저 스캐닝 현미경(Al Plus, Nikon, Japan)에 연결된 살아있는 세포 챔버 시스템(37 ℃에서 5% CO2)에 유리 바닥 접시를넣었다. 세포를 동등한 ICG 농도로 RB-표지된 EV(ICG) 및 RB-표지된 SBC-EV(ICG)로 처리한 다음 60X 오일 침지 대물렌즈를 사용하여 즉시 관찰하였다. 1시간 동안 0.1mm 두께의 z 단면을 사용하여 살아있는 세포 이미지를 획득하였다. 형광 이미지는 Nikon NIS-E 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 분석되었다. Mander의 중첩 계수가 형광 신호 사이의 공동위치화(colocalization) 정도를 정량화하기 위해 얻어졌다.
1-10. US 처리에 따른 ICG 탑재 EV를 이용한 ROS 생성
무세포 시스템에서 유리 ICG 및 ICG 탑재 EV를 사용하여 US에 의해 촉발된(triggered) ROS 생성은 2',7'-디클로로플루오레세인(DCF)에 의해 결정되었다. DCF는 DCF-DA를 KOH(0.1mM)와 반응시켜 제조하였다. ICG가 탑재된 EV와 유리 ICG 및 용액이 10μM DCF 용액에 추가되었다. 이후, 미세원심분리 튜브의 혼합 용액을 1분간 US (1MHz, 0.3 W/cm2)에 노출시켰다. 암실에서 1시간 동안 추가 배양한 후, 시료 용액의 녹색 형광 강도를 측정하였다(λex: 495 nm, λem: 529 nm). US 처리되지 않은 샘플을 대조군으로 사용하였다.
유리 ICG 및 ICG가 탑재된 EV와 함께 배양된 세포에서 세포 내 ROS 생산이 US 조사 전후에 정량화되었다. 처리 24시간 전에 MCF-7 세포가 24웰 플레이트(5 x 104 cells/well)에서 준비되었다. 이후 세포를 PBS로 세척하고 10μM DCF-DA 용액으로 30분간 처리하였다. 세포를 PBS로 세척한 후, 유리 ICG(28㎍/㎖), 유리 PTX, EV(ICG)(28㎍/㎖ ICG), SBC-EV(ICG)(28㎍/㎖ ICG) 및 SBC-EV(ICG/PTX)(28㎍/㎖ ICG, 10㎍/㎖ PTX)를 처리하였다. 처리 4시간 후, 세포를 두 그룹(대조군과 US 처리군)으로 분리하였다. 1 MHz US를 1분 동안 세포에 조사하였다(0.3 W/cm2). 인큐베이션 30분 후, 이전에 보고된 것과 동일한 방식으로 세포의 세포 내 ROS 수준을 정량화하였다 (J Ind Eng Chem. 2020; 88: 260-7 참조).
MCF-7 세포에서 US 유발 ROS 생성을 관찰하기 위해 세포를 24웰 플레이트에 접종하고 10 μM DCF-DA로 염색하였다. DCF-DA로 염색된 세포를 유리 ICG 및 SBC-EV(ICG/PTX)(28 ㎍/㎖ ICG, 10 ㎍/㎖ PTX)로 4시간 동안 처리하였다. 이후 처리 용액을 PBS로 교체하였다. US 처리된 샘플의 경우, 초음파 겔층이 있는 웰 플레이트의 바닥에 1분 동안 1MHz의 US(0.3 W/cm2)를 조사하였다. 30분 배양 후, 형광현미경(Nikon Eclipse Ti-S, Nikon, Tokyo, Japan)을 사용하여 세포로부터의 ROS 생성을 관찰하였다.
1-11. In vitro 초음파 독성 평가
MCF-7 세포를 96웰 플레이트(1 x 104 cells/well)에서 배양하였다. 유리 ICG(28㎍/㎖ ICG), EV(ICG)(28㎍/㎖ ICG), SBC-EV(ICG)(28㎍/㎖ ICG), EV(ICG/PTX)(28㎍/㎖ ICG 및 10 ㎍/㎖ PTX, 5.59 × 1010 EVs/㎖) 및 SBC-EV(ICG/PTX)(28㎍/㎖ ICG 및 10 ㎍/㎖ PTX, 5.88 × 1010 EVs/㎖)를 세포에 추가하였다. 4시간 배양 후, 세포를 새로운 배양 배지[MEM/EBSS/10% FBS]로 배양하고 1분 동안 0.3 W/cm2에서 1 MHz US로 조사하였다. 24시간 배양 후 MTT 분석으로 세포 생존율을 분석하였다.
1-12. In vitro 세포사멸 분석 및 살아있는/죽은 세포 염색
MCF-7 세포를 약물 처리 24시간 전에 12웰 플레이트(3 x 105 세포/웰)에 접종하였다. 세포를 유리 ICG(28㎍/㎖ ICG) 및 SBC-EV(ICG/PTX)(28㎍/㎖ ICG, 5.88 × 1010 EVs/㎖)와 함께 4시간 동안 인큐베이션하였다. 샘플 처리 후, 세포를 PBS로 세척하고 배양 배지에 현탁시켰다. 현탁액을 반으로 나누어, 반은 0.3 W/cm2의 US를 1분 동안 처리하고 나머지 반은 대조군으로 사용하였다. 세포를 12-웰 플레이트에 다시 분주한 후 8시간 동안 인큐베이션하였다. 이후 세포를 트립신 처리하고 Annexin V-FITC 및 PI(BD Biosciences, Heidelberg, Germany)로 추가 염색하기 위해 결합 완충액에 재현탁하였다. Annexin V 양성 및 PI 음성 세포를 초기 세포 사멸 세포로, Annexin V 및 PI 양성 세포는 후기 세포 사멸 세포로 확인하였다. 두 염색에 음성인 세포를 살아있는 세포로 확인하였다.
살아있는 세포와 죽은 세포 염색을 위해 MCF-7 세포를 US 처리 그룹과 미처리 그룹에 대해 서로 다른 12웰 플레이트(3 x 105 cells/well)에 별도로 준비하였다. 유리 ICG 및 SBC-EV(ICG/PTX)(28 ㎍/㎖ ICG, 5.88 × 1010 EVs/㎖)를 처리하고 세포를 4시간 동안 배양하였다. 이후, 웰의 용액을 새로운 배지로 교체한 후 1분간 US 처리하였다(0.3 W/cm2). 8 시간 인큐베이션 후, 세포를 PBS로 세척하고 제조자의 지침에 따라 1μM 칼세인-AM(Thermo Fisher Scientific) 및 2μM ethidium homodimer-1(Thermo Fisher Scientific)로 염색하였다. 형광 현미경(Nikon Eclipse Ti-S)을 사용하여 세포의 형광 이미지를 획득하였다.
1-13. Real-Time PCR (qRT-PCR)
ROS 생성과 관련된 mRNA 발현에 대한 PTX의 영향을 평가하기 위하여, StepOnePlus Real-Time PCR System(Applied Biosystems, USA)을 사용하여 실시간 중합효소 연쇄 반응(qRT-PCR)을 수행하였다. MCF-7 세포를 PTX와 함께 2시간 동안 인큐베이션하고, NADPH 산화효소를 활성화하였다. RNA는 Tris-RNA 시약(Favorgen, 대만)을 사용하여 제조자의 지침에 따라 분리하였다. cDNA는 ReverTra Ace qPCR RT Master Mix(Toyobo, Japan)을 사용하여 합성되었고 RT-PCR은 THUNDERBIRD SYBR qPCR mix(Toyobo, Japan)를 사용하여 수행되었다. NADPH 산화효소 1(NOX1) 및 내부 대조군인 β액틴을 표 1에 나열된 프라이머로 분석하였다.
| Samples | qRT-PCR primers | 서열번호 | |
| NOX1 | Forward | GGTTTTACCGCTCCCAGCAGAA | 서열번호 1 |
| Reverse | CTTCCATGCTGAAGCCACGCTT | 서열번호 2 | |
| β-actin | Forward | ATGAAGTGTGACGTTGACATCCG | 서열번호 3 |
| Reverse | GCTTGCTGATCCACATCT | 서열번호 4 | |
1-14. In vivo 연구를 위한 MCF-7 종양 보유 마우스 모델
모든 동물 실험은 대한민국 가천대학교 동물연구소 동물관리위원회에서 승인한 프로토콜(LCDI-2017-0131)에 따라 수행되었다. 5주령 BALB/c 누드 마우스에 MCF-7 세포(100㎕ PBS에 1 × 106 세포)를 오른쪽 등 부위에 피하 주사하였다. 종양 부피가 약 100 mm3에 도달했을 때 마우스를 각 샘플 그룹(n = 4)으로 무작위 그룹화하였다.
1-15. In vivo 이미징 시스템(IVIS)을 사용한 in vivo 생체 분포 연구
SBC-EV(ICG/PTX) 및 유리 ICG의 생체 내 실시간 생체분포 영상화를 위해 MCF-7 종양-이종 이식 마우스에 100㎕의 유리 ICG 및 SBC-EV(ICG/PTX)(1.0mg ICG/kg 및 0.4mg PTX/kg)를 정맥 주사하였다. 장파 방출 필터(745-830 nm)로 전신의 ICG 형광 강도를 24시간 이내에 특정 시간 간격으로 측정함으로써 IVIS 시스템(Ami HT imaging system, Spectral Instruments Imaging, Tucson, AZ, USA)을 사용하여 생체 내 생체 분포 이미징을 수행하였다. 마우스를 주사 후 4시간 또는 24시간에 안락사시켜 마우스의 주요 기관 및 종양의 ex vivo 형광 이미지를 얻었다.
1-16. In vitro 및 in vivo PA 이미징
시험관 내 및 생체 내 PA 영상 연구는 이전에 보고된 방법을 사용하여 수행되었다(Angew Chem Int Ed. 2020, 132, 8708-12 참조). 또한, Q-switched 펌프 레이저(Surelite III-10, Continuum, USA; 파장: 532 nm 또는 1064 nm) 및 광학 매개변수 발진기 레이저(Surelite OPO PLUS, Continuum, USA; 파장: 680-930 nm; 펄스 반복 주파수: 10 Hz; 펄스 폭: 5 ns)가 사용되었으며, 두 개의 레이저가 합성되었다. 파장은 ICG의 흡수 피크의 PA 이미징을 위해 780nm로 설정되었다. 투과광 강도는 약 5mJ/cm2로 780nm에서 ANSI(American National Standards Institute)의 안전 한계보다 낮은 값이다. 레이저에 의해 생성된 PA 신호는 5MHz US 변환기(V308, Olympus NDT, Waltham, MA, USA)를 사용하여 감지되었다. 체외 실험을 위해 ICG의 동등한 농도에서 유리 ICG, EV(ICG/PTX) 및 SBC-EV(ICG/PTX)를 15.625 내지 1000㎍/㎖의 실리콘 튜브(Dow Corning)에 주입하고 PA 신호를 780 nm에서 측정하였다.
MCF-7 종양 이종 이식 마우스는 정맥 내 주사를 통해 150 ㎕의 유리 ICG(0.8 mg/㎖ ICG) 및 EV(ICG/PTX)(0.8 mg/㎖ ICG 및 0.3 mg/㎖ PTX)를 투여받았다. PA 이미징 프로세스를 용이하게 하기 위하여 종양 주변의 가는 털을 제모 크림을 사용하여 제거하고 마우스를 음향 임피던스 매칭(acoustic impedance matching)을 위해 플라스틱 랩으로 쌓인 물 탱크 아래에 두었다. 음향 해상도 광음향 현미경(AR-PAM)을 이미징에 사용하였다. 스캐닝 영역은 60 × 40 mm2이고 단차 크기는 x 및 y 방향으로 각각 0.4 mm이다. 단일 전신 PA 이미지를 얻는 데 약 45분이 소요되었다. 주사 후 0시간 및 4시간에 마우스의 전신 PA 이미지를 얻었다. 획득한 데이터를 계산하여 탑뷰 MAP 영상을 획득하고, 시간에 따라 깊이 코딩된 MAP 영상을 획득하였다.
AR-PAM은 종양의 생체 내 PA 이미징에 사용되었다. 물탱크는 임피던스 갭을 최소화하기 위해 랩핑되었다. MCF-7 종양 보유 마우스는 정맥 내 주사를 통해 150㎕의 SBC-EV(ICG/PTX)(0.8mg/㎖ ICG)를 투여받았다. 제모 크림을 이용하여 종양 주변의 잔털을 미리 제거하고 체온 유지를 위해 온열 매트를 사용하였다. 스캐닝 영역은 15 × 15 mm2로 설정되었고, 단차 크기는 x 및 y 방향으로 0.4 mm이다. 주사 후 1시간 및 4시간에 마우스의 종양 PA 이미지를 얻었다. 탑뷰 MAP 이미지를 얻었다.
1-17. US 치료와 병용하는 SBC-EV(ICG/PTX)의 생체 내 항종양 효능
MCF-7 종양 보유 마우스는 꼬리 정맥 주사를 통해 다음 요법 중 하나를 받았다: (i) PBS; (ii) 유리 ICG 및 유리 PTX(1.0mg ICG/kg 및 0.4mg PTX/kg); (iii) EV(ICG/PTX)(1.0mg ICG/kg 및 0.4mg PTX/kg); (iv) SBC-EV(ICG/PTX) (1.0mg ICG/kg 및 0.4mg PTX/kg). 정맥 주사 4시간 후 마우스의 종양 부위에 3분간 US(1MHz, 0.5W/cm2)를 조사하였다. 종양 부피[(종양 길이) ×(종양 폭)2/2]를 격일로 측정하였다. 또한 엔지니어링된 EV의 안전성을 평가하기 위해 각 마우스의 무게를 격일로 측정하였다. 시료 처리 및 초음파 조사 2주 후, 혈액 분석을 위해 복재 정맥(saphenous vein)에서 칼륨 에틸렌디아민 테트라아세트산 수집관으로 혈액을 수집하였다. 그런 다음 마우스를 희생시키고 종양 이종이식편과 심장, 간, 폐, 신장, 비장을 포함한 주요 장기를 분리하고 4% 파라포름알데히드로 고정하였다. 조직 절편을 염색하기 위해 기존의 H&E 염색을 수행하였다.
1-18. 통계 분석
달리 명시되지 않는 한 모든 데이터는 삼중으로 획득되었다. 데이터는 평균 ± 표준 편차(SD) 값으로 표시하였다. 샘플 그룹 간의 통계적 유의성은 일원 분산 분석에 의해 결정되었으며 다음과 같이 표시되었다. *p < 0.05; **p < 0.01.
실시예 2. 약물이 탑재된 EV의 설계, 준비 및 특성화
항암제 전달에 있어서 중요한 한계는 종양 부위에 치료제를 선택적으로 전달하는 것이다. 나노크기의 약물 담체가 EPR 효과를 통해 종양 병변에 선택적으로 축적될 수 있다는 것은 잘 알려져 있다. 그러나 인공 나노운반체는 전신 독성 및 세망내피(reticuloendothelial) 시스템에 의한 비특이적 흡수와 같은 특정 중요한 문제에 직면해 있다. 합성 나노운반체와 달리 EV는 생체적합성이 우수하고 장기간 혈액 순환 능력이 있는 자연 발생 나노입자이다. 본 발명에서 EV는 초음파감작제(즉, ICG) 및 화학 약물(즉, PTX)을 종양에 안전하고 효율적으로 전달하기 위해 소노테라노스틱 나노운반체로 설계되었다.
ICG 및 PTX 탑재 EV를 준비하기 위하여 인간 배아 신장 HEK-293T 세포에서 EV를 얻었다. HEK-293T 세포에서 얻은 EV는 생체 내 면역원성 및 독성 측면에서 양성인 것으로 알려져 있다. HEK-293T 세포 유래 EV는 질병 또는 암 관련 경로와 관련된 낮은 수준의 단백질 및 RNA를 함유하는 것으로 알려져 있다. 인산완충식염수(PBS)의 HEK-293T 세포 유래 EV를 ICG 용액과 단독으로 혼합하거나 DMSO(디메틸설폭사이드)의 PTX 용액과 함께 혼합하였다. DMSO는 약물의 용해도와 EV의 지질막 투과성을 증가시키는 투과성 향상제로 사용되었다. DMSO는 지질 이중층에서 수분 공극을 유도하여 친수성 및 소수성 분자의 막 투과성을 향상시킬 수 있다. EV에 대한 ICG 및 PTX의 로딩 용량은 DMSO의 농도에 비례하였다. 더 높은 DMSO 농도가 EV를 상당히 파괴하기 때문에, PBS 중 4%(v/v) DMSO를 약물 캡슐화에 사용되었다.
ICG 및 PTX가 EV에 탑재되는 것은 UV-Vis 분광법으로 확인되었다. 블랭크 EV, ICG, PTX, ICG 탑재 EV [EV(ICG)], ICG 및 PTX 탑재 EV [EV(ICG/PTX)], 그리고 SBC-EV(ICG/PTX)의 UV-Vis 흡수 스펙트럼은 도 2A에 나타낸 바와 같다. EV(ICG) 및 EV(ICG/PTX)는 모두 786 nm에서 ICG의 뚜렷한 흡수 피크를 나타내었다(도 2A). SBC-EV(ICG/PTX)에 대한 ICG 및 PTX의 캡슐화 효율은 각각 42.9% 및 39.9%였다. SBC EV(ICG/PTX)에 대한 ICG 및 PTX의 탑재 용량은 각각 4.76 × 10-10 및 1.92 × 10-10㎍/EVs였다. EV(ICG/PTX)에서 ICG와 PTX의 탑재 용량은 4.77 × 10-10 및 1.90 × 10-10 ㎍/EVs였다. 이는 SBC가 ICG 및 PTX의 EV로의 약물 탑재에 영향을 미치지 않음을 나타낸다. PTX는 소수성 화합물이기 때문에 EV의 소수성 지질 이중층에 포함될 수 있다. 상대적으로 친수성인 ICG는 수성 코어 또는 이중층 계면에 갇힐 수 있다.
EV는 친수성 코어-소수성 쉘 구조를 형성하는 지질 이중층으로 둘러싸여 있기 때문에 다양한 소수성 및 친수성 약물을 운반할 수 있다. 다양한 약물을 캡슐화하는 EV의 능력을 입증하기 위해 소수성 모델 약물인 피페론구민(piperlongumine)과 친수성 모델 약물인 독소루비신(doxorubicin hydrochloride, DOX·HCl)를 ICG 및 PTX에 사용된 것과 동일한 방식으로 EV에 캡슐화하였다. 피페론구민과 DOX·HCl은 모두 높은 캡슐화 효율로 EV에 성공적으로 캡슐화되어(피페론구민의 경우 36.3±2.3%, DOX·HCl의 경우 41.1±3.2%), EV가 보편적인 약물 운반체임을 알 수 있었다.
유도 결합 플라즈마 광 방출 분광법(ICP-OES)을 통해 나트륨 이온을 정량화하여 EV에서 SBC의 캡슐화 효율 및 로딩 용량을 측정하였다. SBC-EV(ICG/PTX)용 SBC의 캡슐화 효율은 26.4%였다. SBC-EV(ICG/PTX)용 SBC의 적재용량은 1.09 × 10-10㎍/EVs였다. SBC-EV(ICG/PTX)에서 초기 SBC 양의 약 91%가 pH 7.4 완충액에서 배양 시 약 48시간 동안 안정적으로 유지되는 것으로 확인되었다.
다양한 EV 파생 샘플의 크기와 표면 전하를 측정하였다. 블랭크 EV, EV(ICG), SBC 및 ICG 탑재 EV[SBC EV(ICG)], EV(ICG/PTX), SBC-EV(ICG/PTX)의 크기는 각각 117.1±2.0, 129.6±3.1, 132.7±6.8, 149.9±5.2 및 150.8±4.2 nm였다. ICG와 PTX를 탑재했을 때 EV의 크기가 약간 커졌다. 블랭크 EV, EV(ICG), SBC-EV(ICG), EV(ICG/PTX) 및 SBC-EV(ICG/PTX)의 제타 전위는 각각 -19.6±1.2, -20.1±0.3, -23.6±2.5, -22.7±1.2, -26.4±2.4mV였다. 블랭크 EV 및 SBC EV(ICG/PTX)의 형태는 투과전자현미경(TEM)으로 분석하였다. 그들은 직경이 50-90 nm인 구형 형태를 나타냈다 (도 2B).
ICG 및 PTX 캡슐화 프로세스가 EV의 단백질 함량에 영향을 미치는지 여부를 확인하고자, 세 가지 일반적인 EV 마커 단백질인 CD81, CD63 및 신테닌의 발현을 웨스턴 블롯팅으로 시각화하였다. 블랭크 EV, EV(ICG/PTX) 및 SBC-EV(ICG/PTX)는 CD81, CD63 및 신테닌을 나타내는 명확한 밴드를 보여주었다 (도 2C). 이 결과는 EV의 단백질 함량이 약물 탑재 과정의 영향을 받지 않았음을 나타낸다.
실시예 3. 엔지니어링 된 EV의 높은 콜로이드 안정성 및 보관 안정성
나노 입자와 혈액 내 단백질의 상호 작용은 나노 입자의 물리화학적 특성, 콜로이드 안정성 및 생체 내 전달 효능에 영향을 미치는 중요한 요소 중 하나이다. 혈청 단백질에 대한 EV(ICG/PTX) 및 SBC-EV(ICG/PTX)의 콜로이드 안정성을 확인하기 위해 10% FBS을 포함하는 PBS에 현탁시킨 후 37℃에서 96시간 동안 배양하였다. EV(ICG/PTX) 및 SBC EV(ICG/PTX)의 크기를 모니터링하여 인큐베이션 중에 응집이 발생했는지 여부를 확인해 본 결과, EV(ICG/PTX)와 SBC-EV(ICG/PTX)는 배양 조건에 관계없이 최대 96시간까지 큰 크기 변화를 나타내지 않아 (데이터 미도시), 혈청 단백질에 대한 높은 안정성이 있음을 알 수 있었다. SBC EV(ICG/PTX)의 높은 콜로이드 안정성은 효율적인 chemo-SDT를 위한 장기간의 혈액 순환을 보장한다.
실시예 4. EV 캡슐화에 의한 ICG의 향상된 수성 안정성
ICG는 수용액에서 이온과 라디칼에 의해 비가역적으로 분해되어 흡수와 형광을 동시에 감소시킨다. EV는 세포 외 환경에서 캡슐화된 카고를 보호하기 위해 생체 적합성 인지질 이중층을 포함한다. EV가 ICG가 수용액에서 분해되는 것을 보호할 수 있는지 여부를 조사하기 위하여, 유리 ICG, EV(ICG), SBC-EV(ICG) 및 SBC-EV(ICG/PTX)를 4℃PBS에서 배양하며 형광 강도를 정량화하였다. 도 2D에 나타낸 바와 같이, 모든 ICG 로딩된 EV는 인큐베이션 14일 후 ICG의 초기 형광 강도를 84% 이상으로 유지하였다. 대조적으로, 유리 ICG 용액은 배양 14일 후에 형광을 실질적으로 상실하여(초기 값의 49%) 수성 안정성이 좋지 않음을 확인하였다. 혈청 단백질에 대한 높은 콜로이드 안정성과 함께 ICG가 탑재된 EV의 향상된 수성 안정성은 EV 매개 ICG 전달이 임상 적용에 상당한 잠재력을 나타냄을 의미한다.
실시예 5.
In vitro
PA imaging
ICG 캡슐화 EV의 PA 특성을 평가하기 위해 유리 ICG, EV(ICG/PTX) 및 SBC-EV(ICG/PTX)의 PA 신호를 다양한 ICG 농도에서 측정하였다(도 2E). 780 nm에서의 모든 샘플의 PA 신호는 농도가 증가함에 따라 선형으로 증가하여 우수한 PA 대비(contrast)를 검증하였다.
실시예 6. SBC 탑재 EV에 의한 산성 유발 CO
2
생성
산성 조건에서 SBC가 장착된 EV로부터의 CO2 생성은 상업적으로 이용 가능한 CO2 정량 키트를 사용하여 산-염기 적정 방법에 의해 결정되었다. SBC가 탑재된 EV에서 생성된 CO2는 수용액에 용해되어 탄산(H2CO3)을 형성한다. 탄산 용액을 지시약으로 페놀프탈레인을 사용하여 NaOH로 적정하였다. 다른 pH 조건에서 SBC가 장착된 EV와 블랭크 EV에서 발생하는 CO2 생성의 상대적 수준은 탄산 용액을 중화하는 데 사용되는 NaOH의 양에 의해 결정되었다. 블랭크 EV는 pH 조건에 관계없이 처리되지 않은 그룹과 비교하여 CO2 생성이 크게 증가하지 않는 반면, SBC-EV는 pH 6.0에서 CO2 생성이 크게 증가하여 EV 내부 SBC에 의한 산성 유발 CO2 생성을 보여준다.
실시예 7. SBC 탑재 EV의 pH 반응성
SBC 탑재 EV의 pH 반응성을 입증하기 위하여 산성 조건에서 크기 변화를 동적 광산란(DLS)을 사용하여 측정하였다. SBC-EV(ICG/PTX)의 평균 크기 및 크기 분포는 pH 6.0 완충액에서 48시간 배양 후 극적으로 증가하였다(도 2F). 이 결과는 SBC-EV(ICG/PTX)가 산성 조건에서 불안정화되어 CO2에 의해 유발된 EV 멤브레인 파열로 인해 불안정함을 나타낸다. 산성 조건에서 SBC-EV(ICG/PTX)의 형태 변화를 TEM으로 관찰하였다. TEM 이미지는 SBC-EV(ICG/PTX)가 pH 6.0 완충액에서 배양되었을 때 눈에 띄는 막 파괴를 보여주었다 (도 2G). 이 결과는 SBC-EV(ICG/PTX)의 산성 조건에서 유발되는 불안정성을 보여준다. 따라서 SBC-EV(ICG/PTX)는 산성 조건에서 약물 방출을 촉진할 것으로 기대된다.
실시예 8. SBC 탑재 EV에 의한 이중 pH 및 US 반응 약물 방출
pH 반응성 약물 방출을 실현하는 SBC 탑재 EV의 능력을 검증하기 위하여, 투석 방법을 통해 다양한 pH 조건에서 PTX 및 ICG의 방출 프로파일을 결정하였다. 또한 US가 SBC가 탑재된 EV에서 pH에 민감한 약물 방출을 촉진할 수 있는지 여부를 평가하기 위하여, US 조사의 존재 또는 부재 하에 다양한 pH 조건(예를 들어, 엔도/리소좀 pH 6.0 및 종양 미세환경 pH 6.6)에서 PTX의 방출을 측정하였다. 도 2H에 나타낸 바와 같이, pH 5.0 및 6.0에서 PTX의 누적 방출은 pH 7.4에서보다 현저히 높았고, 따라서 pH에 민감한 SBC-EV(ICG/PTX)가 엔도/리소좀 구획과 유사한 약산성 조건에서 PTX를 빠르게 방출할 수 있음을 입증하였다. 흥미롭게도, pH 조건에 관계없이 US 처리는 PTX의 방출을 더욱 촉진하여 SBC가 장착된 EV에 의한 이중 pH 및 US 반응성 약물 방출을 입증하였다 (도 2H). SBC 탑재 EV에 의한 US 유발 약물 방출은 US 유발 공동화 효과(액체에서 증기로 채워진 기포의 붕괴)에 기인할 수 있다. 이 붕괴는 SBC-EV(ICG/PTX)를 불안정하게 하고 캡슐화된 약물을 방출할 수 있는 충격파를 생성한다. 또한 ICG에서 US의 방사선 유발 ROS 생성은 지질 과산화 및 결과적으로 EV의 불안정화로 이어져 ICG 및 PTX의 방출을 촉진할 수 있다. US 조사를 통한 EV의 이러한 물리적 및 화학적 파괴는 EV의 소수성 지질 이중층에 갇힌 PTX의 방출을 촉진할 것이다.
SBC-EV(ICG/PTX)에서 PTX의 누적 방출은 US가 있는 상태에서 pH 5.0에서 배양될 때 가장 높았다 (도 2H). 탄산수소나트륨(SBC)이 SBC가 장착된 EV에서 pH에 민감한 약물 방출을 유발하는 실제 기여자인지 확인하기 위해 다른 pH 조건에서 EV(ICG/PTX) 및 SBC-EV(ICG/PTX)의 누적 PTX 방출을 비교하였다. SBC-EV(ICG/PTX)에서 방출된 PTX의 양은 pH 5.0에서 배양되었을 때 EV(ICG/PTX)에서 방출된 양보다 상당히 높았다 (도 2I). 대조적으로, pH 7.4에서 배양했을 때 SBC-EV(ICG/PTX)에서 방출된 PTX의 양은 EV(ICG/PTX)에서 방출된 양과 유사하였고, 이는 SBC가 SBC-EV(ICG/PTX)의 pH에 민감한 약물 방출의 주로 기여한다는 것을 의미한다.
SBC-EV(ICG/PTX)에서 이중 pH/US 종속 ICG 방출도 입증되었다. ICG의 가장 높은 누적 방출은 US 조사량 및 배양 시간에 관계없이 pH 5.0에서 관찰되었다 (데이터 미도시). PTX 방출에서 관찰된 것과 유사하게, SBC-EV(ICG/PTX)로부터의 ICG 방출은 US 처리에 의해 더욱 촉진되었다. SBC EV(ICG/PTX)의 약물 방출 프로파일은 또한 약산성 종양 미세 환경 조건을 모방하는 pH 6.6에서 평가되었다. pH 6.6에서 배양했을 때 SBC-EV(ICG/PTX)에서 방출된 PTX 및 ICG의 양이 EV(ICG/PTX)에서 방출된 양보다 훨씬 많았다. pH 및 US 이중 반응성 SBC 탑재 EV는 표적 종양 영역에서 약물 방출을 보다 정확하게 조절한다. pH 및 US 이중 반응성 EV에 의한 ICG 및 PTX의 향상된 방출은 표적 암 세포에서 화학 SDT의 높은 항암 효과를 보장할 것이다.
실시예 9. ICG 탑재 EV의 효율적인 세포 내 흡수
EV가 치료용 카고의 세포 내 전달을 향상시킬 수 있는지 여부를 조사하기 위하여, 동일한 농도의 ICG에서 유리 ICG, EV(ICG) 및 SBC-EV(ICG)를 MCF-7 인간 유방암 세포에 처리하였다. EV(ICG) 및 SBC-EV(ICG)에 대한 ICG의 세포 흡수는 유리 ICG에 비해 크게 증가하였다 (도 3A). EV(ICG) 및 SBC-EV(ICG)의 향상된 세포 흡수는 수용체-리간드 결합 또는 직접 융합을 통해 EV와 세포막의 유리한 상호작용에 의해 설명될 수 있다. EV가 클라트린 의존성 수용체 매개 엔도사이토시스, 미세음세포작용, 막 융합 등을 포함한 수많은 분자 메커니즘을 통해 세포에 효율적으로 들어가는 것이 이미 알려져 있다. 세포 흡수 경로는 EV 및 이를 흡수하는 세포 모두에서 특정 표면 단백질의 존재에 따라 달라진다. 어떤 흡수 메커니즘이 선호되는지는 아직 불분명하지만 EV는 엔도솜/리소솜 막과 융합하여 카고를 세포질로 방출할 수 있다. EV의 SBC가 세포 흡수에 영향을 미치는지 여부를 조사하기 위해 fluorescein isothiocyanate(FITC) 표지된 EV를 사용하여 EV(ICG) 및 SBC-EV(ICG)를 준비하였다. SBC-EV(ICG)와 EV(ICG)의 세포 흡수를 FITC의 형광 강도를 측정하여 비교하였다. 그 결과는 FITC-EV(ICG)와 FITC-SBC-EV(ICG) 사이에 세포 흡수에 큰 차이가 없음을 보여주었다.
실시예 10. SBC 탑재 EV에 의한 ICG의 세포질 방출 강화
SBC 탑재 카고가 화물의 세포질 방출을 촉진할 수 있는지 여부를 조사하기 위하여 SBC-EV(ICG)의 세포내 국소화 및 엔도솜 탈출을 공초점 레이저 스캐닝 현미경으로 평가하였다. EV의 세포 내 분포를 추적하기 위해 로다민 B(RB)로 표지된 EV를 사용하여 SBC 및 ICG를 캡슐화하였다. 생성된 RB-표지된 SBC EV(ICG)를 살아있는 MCF-7 세포와 함께 인큐베이션하였다. RB로 표시된 EV(ICG)는 pH에 반응하지 않는 대응물로도 사용되었다. MCF-7 세포를 엔도/리소좀 영역에 선택적으로 축적하는 LysoTracker로 염색하여 EV가 엔도사이토시스를 통해 세포에 내재화될 수 있는지 여부를 조사하였다. 도 3B와 같이 다량의 RB 표지 EV(ICG) 및 RB 표지 SBC-EV(ICG)(빨간색 점)가 LysoTracker(녹색)와 함께 국소화되었다. 이 결과는 ICG가 탑재된 EV가 엔도사이토시스를 통해 세포 내재화되었음을 나타낸다.
EV의 엔도사이토시스 후 카고의 효율적인 세포질 전달을 위한 전제 조건은 엔도/리소좀 구획에서 탈출하는 것이다. ICG가 탑재된 EV가 엔도/리소좀 구획을 탈출할 수 있는지 여부를 조사하기 위해 RB 표지된 EV와 Lysotracker 사이의 공동위치화(colocalization) 정도를 다양한 배양 시간에서 정량화하였다. 정량 결과, pH 반응성 RB 표지 SBC-EV(ICG)와 엔도/리소좀의 공동위치화가 시간이 지남에 따라 크게 감소한 것으로 나타났다 (도 3C). 대조적으로, 엔도/리소좀이 있는 비 pH 반응 RB 표지 EV(ICG)의 공동위치화는 약간 감소하였다. SBC-EV(ICG)의 보다 효율적인 엔도솜 탈출은 산성 엔도/리소좀 pH에 대한 응답으로 SBC-EV(ICG)의 파열 효과를 통해 엔도/리소좀 막의 불안정화에 연루될 수 있다. 그러나 SBC가 탑재된 EV의 엔도솜 탈출에 대한 자세한 메커니즘은 여전히 알려지지 않은 실정이다. 최근 연구에서는 EV의 엔도/리소좀 막과 직접 융합이 EV의 엔도/리소좀 탈출의 주요 메커니즘 중 하나라고 제안하며, 내부화된 EV의 일부가 엔도/리소좀 막과 융합되어 카고가 방출된다는 것을 보여주었다. EV의 엔도/리소좀 막과의 융합은 엔도/리소좀의 산성 pH에 의해 촉진되어 EV의 막 유동성 및 지질 조성의 변화를 유발할 수 있다. 약물 운반체로부터 치료 화물의 효율적인 세포질 방출은 치료 효능을 최대화하는 데 중요하다. RB 표지 EV(ICG) 및 RB 표지 SBC-EV(ICG)와 함께 1시간 배양 후 RB 표지 EV(빨간색 점) 및 ICG(녹색 점)의 세포내 분포는 도 3D와 같다. RB 표지된 EV(ICG) 처리된 세포는 약한 노란색 형광 신호를 보인 반면, RB 표지된 SBC-EV(ICG) 처리된 세포는 강한 노란색 형광 신호를 보였다. 응집된 ICG는 형광성에서 자가소광을 유도하기 때문에, RB-표지된 EV(ICG) 처리된 세포에서 ICG의 약한 형광은 ICG가 주로 EV 내부에 축적됨을 나타낸다. 그러나 pH에 민감한 SBC-EV(ICG)는 엔도/리소좀 구획에서 EV의 산 불안정화를 통해 캡슐화된 ICG를 빠르게 방출했고, 따라서 ICG의 형광 강도가 증가하였다(도 3D). 이 결과는 pH 반응성 SBC 탑재 EV가 캡슐화된 카고의 효율적인 세포질 방출을 달성하여 chemo-SDT 조합 효능을 향상시킬 수 있음을 보여준다.
실시예 11. ICG 탑재 EV에 의한 US 유발 세포 내 ROS 생성
암세포는 정상 세포보다 세포 내 ROS 수치가 높기 때문에 산화 환원 불균형 상태에 있다. 결과적으로 암세포에 ROS가 과도하게 축적되면 세포사멸이 유도된다. MCF-7 세포를 ICG, EV(ICG), SBC-EV(ICG) 또는 SBC-EV(ICG/PTX)와 함께 배양한 후 MCF-7 세포의 세포 내 ROS 농도는 ROS 감지 염료를 사용하여 정량화되었다. 또한 세포는 초음파 역학 효과를 유발하기 위해 US 조사에 노출되었다. 도 3E와 같이 US 조사에 관계없이 유리 ICG(28㎍/㎖) 및 ICG 탑재된 EV(28㎍/㎖ ICG)의 처리는 세포에서 세포내 ROS 수준을 증가시켰다. 액체 환경에서의 US 조사는 캐비테이션 기포를 생성하는 것으로 보고되었다. 캐비테이션 기포의 내파에 의해 생성된 음향발광광은 ICG와 같은 유기 초음파감작제를 자극할 수 있다. 결과적으로 ROS는 광역학적 효과와 유사하게 여기된 초음파감작기에서 생성된다. US 조사에 관계없이 EV(ICG)로 처리된 세포는 유리 ICG로 처리된 세포보다 높은 세포내 ROS 수준을 나타냈다 (도 3E). 이 결과는 유리 ICG와 비교하여 EV(ICG)의 향상된 안정성 및 세포 흡수와 밀접한 관련이 있다. EV(ICG/PTX)는 US 조사에 관계없이 EV(ICG)보다 세포에서 더 높은 수준의 세포내 ROS를 유도하였다. PTX는 원형질막과 관련된 NADPH(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate) 산화효소의 활성 증가를 통해 ROS 생성을 촉진하는 것으로 보고되었다. PTX가 세포내 ROS 수준을 상승시킨다는 것을 입증하기 위해, MCF-7 세포에서 NADPH oxidase 1(NOX1)의 상대적 mRNA 발현 수준을 PTX 처리 후 분석하였다. PTX와 함께 2시간 동안 배양한 후, MCF-7 세포에서 NOX1의 상대적 mRNA 발현 수준이 유의하게 증가하였다. 유리 ICG와 함께 모든 ICG 탑재 EV는 US에 대응하여 세포 내 ROS 수준을 크게 증가시켰다. US와 결합된 SBC-EV(ICG/PTX)는 가장 높은 세포내 ROS 수준을 나타냈다. SBC-EV(ICG/PTX)에 의한 US 유발 ROS 생성은 2',7'-디클로로플루오레세인 디아세테이트(DCF-DA)로 염색된 MCF-7 세포의 형광 이미지에 의해 시각화다. 유리 ICG와 함께 배양된 세포는 US 조사 시 약한 녹색 형광을 나타냈다. 대조적으로, SBC-EV(ICG/PTX)로 처리된 세포는 US 노출시 강한 녹색 형광을 나타내었다.
SBC-EV(ICG/PTX)의 SBC가 세포내 ROS 증가에 역할을 하는지 알아보기 위해, SBC-EV(ICG/PTX)에 사용되는 등가 농도인 4 nM SBC로 처리된 MCF-7 세포의 세포내 ROS 생산을 평가하였다. US 방사선 조사에 관계없이 SBC는 세포내 ROS를 증가시켰지만 유리 ICG(28㎍/㎖)에 비해 증가량이 상대적으로 작았다. 유리 PTX(10㎍/㎖) 처리도 MCF-7 세포에서 세포 내 ROS를 증가시켰다. 4 nM SBC가 세포독성을 유도할 수 있는지 여부를 조사하기 위해, MCF-7 세포에 대한 SBC-EV의 세포독성을 US 조사 전후에 결정하였다. 4 nM SBC를 포함하는 SBC-EV는 US 조사에 관계없이 높은 세포 독성을 나타내지 않았다 (US 조사 전 ~96% 생존율 및 US 조사 후 ~85% 생존율). 증가된 세포내 ROS는 세포독성 역치 수준을 초과할 때 세포 사멸을 유발할 수 있는 것으로 알려져 있다. SBC-EV에 의한 세포 내 ROS 수준의 증가는 상당한 세포 독성을 유발하기에 충분하지 않을 수 있다.
실시예 12. 효율적인 chemo-SDT 병용 요법을 위한 SBC-EV(ICG/PTX) 및 US 조사 강도의 약물 캡슐화 비율 최적화
효율적인 chemo-SDT 병용 요법을 위한 SBC-EV(ICG/PTX) 내 SBC의 최적화된 캡슐화 비율을 결정하기 위하여, MCF-7 세포를 사용하여 SBC의 다양한 농도에서 SBC-EV(ICG/PTX)의 세포 독성을 평가하였다. EV의 높은 SBC 농도는 MCF-7 세포에 대한 일부 세포 독성을 초래하였다. SBC-EV(ICG/PTX)의 SBC 농도는 4 nM로 설정되었는데, 4 nM 보다 높은 SBC 농도가 상당한 세포독성을 일으키기 때문이다.
효율적인 chemo-SDT 치료 효과를 위하여, ICG와 PTX의 서로 다른 캡슐화 비율에서 SBC-EV(ICG/PTX)의 MCF-7 세포를 사용하여 세포독성을 평가하여 ICG와 PTX의 캡슐화 비율을 최적화하였다. 각 SBC-EV(ICG/PTX) 제형에서 ICG 및 PTX의 최대 억제 농도(IC50) 값의 절반은 ICG 및 PTX의 다양한 농도에서 세포 생존율 결과에 의해 결정되었다. US 처리와 상관없이 SBC-EV(ICG/PTX)에서 PTX의 캡슐화 비율을 증가시키면 세포독성이 증가하였다. SBC-EV(ICG/PTX)의 세포 독성은 28 ㎍/㎖ ICG와 10 ㎍/㎖ PTX가 EV에 탑재되었을 때 US 조사 시 유의하게 증가하였다. 매우 높은 농도의 PTX는 US가 없는 경우에도 정상 세포에 대해 심각한 세포 독성을 유발할 수 있으므로 최적화된 PTX 농도는 10 ㎍/㎖로 결정되었다. US 조사 전후의 다양한 SBC-EV(ICG/PTX) 샘플의 IC50 값은 표 2에 나타내었다.
SBC-EV(ICG/PTX)에서 ICG와 PTX의 IC50 값은 US 조사에 관계없이 SBC-EV(ICG/PTX)에서 PTX의 캡슐화 비율이 증가할수록 감소하였다. SBC-EV(ICG/PTX)에서 ICG와 PTX의 IC50 값은 세포에 US 조사를 처리했을 때 눈에 띄게 떨어져 SBC-EV(ICG/PTX)에 의한 효과적인 chemo-SDT 입증하였다. US 조사에서 28㎍/㎖ ICG 및 10㎍/㎖ PTX를 캡슐화한 SBC-EV(ICG/PTX)에서 ICG 및 PTX의 IC50 값은 각각 17.17 및 6.13㎍/㎖인 것으로 나타났다.
US의 상이한 전력 밀도(power densities)가 SBC-EV(ICG/PTX)의 항암 활성에 영향을 미치는지 알아보기 위하여, 다른 전력 밀도에서 US을 조사한 후 SBC-EV(ICG/PTX)를 처리한 MCF-7 세포의 세포 생존율을 평가한 결과, US 전력 강도가 증가함에 따라 세포 생존율이 감소하였다. US 조사 자체는 그 전력 밀도에 따라 MCF-7 세포에 대해 약간의 세포독성을 초래할 수 있다. 따라서, 본 발명에서는 US 조사 자체에 의한 세포독성 효과를 최소화하기 위해 US power density를 0.3 W/cm2(in vitro) 또는 0.5 W/cm2(in vivo)로 선택하였다.
실시예 13. SBC-EV(ICG/PTX)의
in vitro
chemo-SDT 효능
인간 유방암 세포에 대한 SBC-EV(ICG/PTX)의 US 유발 chemo-SDT 항암 활성을 조사하였다. MCF-7 세포는 유리 ICG, EV(ICG), SBC-EV(ICG), EV(ICG/PTX) 및 SBC-EV(ICG/PTX)의 처리 후, 1분 동안 US 조사하였다(1MHz, 0.3W/cm2). 도 3F에 나타낸 바와 같이, US 조사의 세포 독성은 세포에 대해 최소화하였다. 세포의 90% 이상이 US 조사 후 생존 능력을 유지하였다. US 처리 없이 유리 ICG 및 ICG가 탑재된 EV로 치료하면 약간의 세포 독성이 나타났다. EV(ICG)로 처리된 MCF-7 세포는 유리 ICG와 함께 배양된 세포보다 낮은 생존력을 나타내었으며, 이는 EV에 의한 향상된 ICG 흡수와 밀접하게 관련되어 있다 (도 3A, 3F). 세포가 ICG가 탑재된 EV와 US 방사선의 조합을 받았을 때, ICG의 초음파동역학 효과로 인해 세포 생존력이 상당히 낮아졌다. 예를 들어, US 조사와 함께 유리 ICG 및 EV(ICG)를 받은 세포의 생존율은 각각 75.1% 및 58.1%였다 (도 3F). EV(ICG/PTX)는 SDT와 화학요법의 조합 효과로 인해 US 방사선 조사시 세포 생존율을 55.3%에서 22.7%로 유의하게 감소되었다. 특히, pH 민감성 SBC-EV(ICG/PTX)는 US 처리에 관계없이 EV(ICG/PTX) 보다 MCF-7 세포에 대한 세포독성이 유의하게 증가하는 것으로 나타났다. 이 결과는 엔도/리소좀의 산성 pH에 대한 반응으로 EV에서 PTX가 효율적으로 방출되는 것으로 설명할 수 있다(도 2I). 세포가 SBC-EV(ICG/PTX)를 받은 후 US 조사를 받았을 때 유의하게 높은 세포독성(9.9% 세포 생존율)이 관찰되었다. 산성 엔도/리소좀 구획의 EV에서 ICG 및 PTX의 촉진된 방출은 화학-SDT 조합의 높은 항암 효과에 기여할 수 있다(도 2H, 및 도 3D). 이러한 결과는 또한 EV가 친수성 ICG와 소수성 PTX의 효율적인 세포 내 수송에 적합한 나노운반체임을 입증하는바, 이는 효과적인 chemo-SDT 조합을 생성하게 한다.
MCF-7 세포에서 생물학적 안전성을 입증하기 위하여, 블랭크 EV의 세포 독성을 확인하였다. 블랭크 EV는 최대 1.0 x 1011 입자/㎖ 농도(도 3G)까지 무시할 수 있는 세포독성(> 95% 생존율)을 보여주었다. 이 결과는 EV가 안전한 나노운반체임을 명확하게 입증한다. 약물 운반체의 고유 독성은 임상 전환에 상당한 제한 되기 때문에, EV의 무시해도 될 정도로 낮은 독성은 성공적인 임상 사용을 위한 상당한 잠재력을 보여준다. SBC-EV(ICG/PTX)의 US 유발 초음파동역학적 효과가 세포사멸을 유도하는지 여부를 조사하기 위해 US 조사 전후에 유리 ICG 및 SBC-EV(ICG/PTX)로 처리한 세포사멸 MCF-7 세포를 정량화하였다. Annexin V-FITC/PI 염색 결과는 세포가 유리 ICG 및 SBC-EV(ICG/PTX) + US 처리시, 총 세포사멸 세포(초기 세포사멸 + 후기 세포사멸)의 개체군이 상당히 증가했음을 나타낸다 (도 3H). US 조사와 결합된 SBC-EV(ICG/PTX) 치료는 총 세포사멸 세포의 비율을 39.75%에서 83.91%로 유의하게 증가시켰다. 세포사멸 결과는 도 3F에 도시된 바와 같이 세포독성 결과와 일치하였다. 세포 내 ROS 생성 분석과 결합하여, 세포사멸 결과는 SBC-EV(ICG/PTX)의 US 유발 초음파동역학적 효과가 상승된 산화 스트레스를 통해 암세포의 세포사멸를 유도함을 나타낸다(도 3E).
MCF-7 세포에 대한 유리 ICG 및 SBC-EV(ICG/PTX)의 초음파독성은 칼세인 아세톡시메틸 에스테르(칼세인 AM, 녹색, 살아있는 세포)/에티듐 동종이량체-1(EthD1, 적색, 죽은 세포) 공동 염색을 통해 시각화되었다. SBC-EV(ICG/PTX) 및 US 조사로 처리된 세포는 가장 낮은 생존력을 나타내어 세포독성 결과와 일치하였다(도 3F 및 3H).
실시예 14. SBC-EV(ICG/PTX)의 효과적인 종양 내 축적
EV와 같은 나노운반체는 EPR 효과를 활용하여 종양으로의 혈관외유출(extravasation)을 촉진한다는 것이 알려져 있다. ICG의 EV의 우선적인 종양 축적은 MCF-7 이종이식편이 있는 마우스에서 in vivo 실시간 형광 이미징을 통해 확인되었다 (도 4A). 다양한 시간(주사 후 0 - 24시간)에서의 유리 ICG 및 SBC-EV(ICG/PTX)의 마우스 생체 내 분포는 생체 내 이미징 시스템(IVIS)을 사용하여 시각화되었으며, 이로부터 ICG의 NIR 형광 강도를 정량화할 수 있었다. SBC-EV(ICG/PTX)로 처리된 마우스의 종양은 주사 후 24 시간까지 형광을 나타내었다(도 4A). 반대로, 유리 ICG 처리된 마우스의 종양에서 형광은 주사 후 24 시간에 거의 사라졌다. 이러한 발견은 ICG가 나노스케일 EV의 EPR 효과를 통해 종양에 효율적으로 전달되었음을 확인시켜준다.
SBC-EV(ICG/PTX) 및 유리 ICG를 정맥 내 투여한 후 종양 보유 마우스의 전체 기관에서 ICG의 분포를 평가하였다. 절제된 종양 및 주요 장기의 생체 외 영상화는 주사 후 24시간에 SBC-EV(ICG/PTX) 및 유리 ICG의 생체 분포를 나타낸다(도 4B). SBC-EV(ICG/PTX) 처리된 마우스와 유리 ICG 처리된 마우스 모두 주사 후 24시간에 간에서 가장 높은 수준의 ICG를 나타내었다(도 4B 및 4C). SBC-EV(ICG/PTX)의 효율적인 종양 축적도 확인되었다. 투여 후 24시간에 SBC-EV(ICG/PTX) 처리된 마우스의 종양에서 ICG 국소화 수준은 유리 ICG 처리된 마우스의 경우보다 현저하게 높았으며(도 4B 및 4C), 이는 생체 분포 결과에 상응한다 (도 4A). 이 결과는 EV가 유리 ICG보다 더 효율적으로 종양에 축적될 수 있음을 나타낸다. 유리 ICG와 SBC-EV(ICG/PTX)의 정맥 내 투여 4시간 및 24시간 후 간 및 종양의 생체 외 영상화로부터 ICG의 정량화도 함께 진행되었다. 그 결과, 마우스의 종양 및 간에서 유리 ICG 및 SBC-EV(ICG/PTX)의 축적은 주사 후 24시간에서의 축적보다 주사 후 4시간에서 유의하게 더 높았다(데이터 미도시).
EV의 주요 생물학적 기능 중 하나는 연장된 혈액 내 순환인데, 이는 단핵 식세포 시스템에 의한 제거를 피할 수 있기 때문이다. EV의 연장된 혈액 내 순환 시간을 입증하기 위하여 정맥 투여 후 종양 보유 마우스의 혈장에서 유리 ICG 및 EV(ICG/PTX)의 농도-시간 프로파일을 결정하였다. EV(ICG/PTX) 그룹에 대해 결정된 24 시간 동안 종양 보유 마우스의 ICG의 혈장 농도-시간 곡선(AUC) 아래 면적은 유리 ICG 그룹에 대한 면적과 비교하여 상당히 증가하였다 (데이터 미도시).
EV(ICG/PTX)의 장기적인 혈액 순환 능력은 EV의 내인성 기원과 특정 막 단백질에 기인할 수 있다. ICG가 로딩된 리포솜을 사용한 이전 연구에서는 유리 ICG에 비해 24시간 동안 ICG의 AUC가 ~1.8배만 더 높은 것으로 확인된 바 있다.
SBC와 같은 이온성 화합물은 농도 구배에 따라 EV 외부로 확산될 수 있기 때문에 생체 내 모방 조건을 이용하여 EV에서 SBC의 안정성을 조사하였다. EV에서 SBC의 방출 프로파일은 생체 내 조건을 모방하는 높은 염 농도(즉, 260mM KCl 수용액)에서 결정되었다. ICP-OES를 통해 나트륨 이온을 정량하여 투석 방법을 사용하여 EV에서 방출된 SBC의 양을 측정한 결과, 높은 염 농도에 대해 인큐베이션 48시간까지 SBC의 91.3%가 EV에서 유지되는 것으로 확인되었다. EV에서 SBC가 느리게 방출되는 것은 인지질 이중층의 낮은 이온 투과성 때문일 수 있다. 주사 후 24시간 이내에 다량의 SBC-EV(ICG/PTX)가 마우스의 종양에 축적되었다는 사실을 고려하면(도 4A-4C), EV에 남아 있는 SBC는 엔도사이토시스 후 엔도/리소좀의 산성 pH에 반응하여 pH에 민감한 약물 방출을 유발할 수 있다.
실시예 15. ICG 탑재 EV를 사용한 생체 내 PA 이미징
ICG는 NIR 영역에서 높은 흡수율을 나타내기 때문에 ICG가 탑재된 EV는 PA 조영제 역할을 할 수 있다. ICG가 탑재된 EV 및 유리 ICG의 생체 내 PA 이미징은 MCF-7 종양 보유 마우스를 사용하여 수행되었다. EV(ICG/PTX) 및 유리 ICG로 처리된 마우스의 전신 PA 최대 진폭 투영(MAP) 이미지 및 단면 PA-B 모드 이미지는 각각 도 5A 및 5B에 나타낸 바와 같다. 마우스가 EV(ICG/PTX)로 처리되었을 때 시간에 따라 종양 영역에서 강한 PA 신호가 관찰되었다 (도 5A). 종양과 간 내의 EV(ICG/PTX) 축적은 깊이 분해 PA B-모드 이미지에서도 시각화되었다(도 5A1-A3). 이와는 대조적으로, 마우스에 유리 ICG를 투여하였을 때 시간이 지남에 따라 종양 영역에서 강력한 PA 신호가 확인되지 않았다 (도 5B). 종양 및 간 영역의 서브스트랙션 PA B-모드 이미지(4시간 - 대조군)는 EV(ICG/PTX)의 상당한 축적을 보여주었다 (도 5C). 주입 전보다 주입 후 4시간에서 PA 신호의 더 큰 증가가 관찰되었다. 주입 후 4시간에 EV(ICG/PTX)로 처리된 마우스의 깊이 코딩된 PA MAP 이미지는 도 5D에 표시된 바와 같다. 깊이 코딩된 PA MAP 이미지는 EV(ICG/PTX)가 종양 및 기타 장기(간 및 비장)에 고도로 축적되어 있음을 보여준다. 도 5E는 유리 ICG 및 EV(ICG/PTX)를 주사한 마우스의 종양 영역에서 PA 신호 진폭의 정량적 비교를 제시한다. EV(ICG/PTX)를 주사한 쥐는 유리 ICG를 주사한 쥐보다 PA 신호 강도가 더 높았다. EV(ICG/PTX)로 처리된 주요 기관(간 및 비장)의 in vivo 생체 분포를 광음향적으로 정량화하였다(도 5F). 가장 강한 PA 신호는 EV(ICG/PTX) 주입 후 1시간 후에 간에서 발견되었고, 간에서 PA 신호는 주입 후 4시간 동안 비장에서보다 더 강하게 나타났다. 간에서 나노 입자가 높게 관찰되는 것은 생체 내 약물 전달에 사용되는 거의 모든 나노 입자에서 일반적으로 관찰되는 현상이다. 또한, SBC-EV(ICG/PTX)를 주사한 마우스의 종양에 대한 생체 내 PA MAP 영상화를 다른 시간 간격 (1시간 및 4시간)으로 수행하였다. 강한 PA 신호는 시간 의존적 방식으로 종양에서 관찰되었다. PA 이미징을 통한 이 in vivo 생체 분포 연구는 ICG가 탑재된 EV가 생체 내에서 효과적인 PA 조영제로 작용하여 PA 이미징 유도 조합 화학-초음파동역학 치료를 가능하게 할 수 있음을 보여준다.
실시예 16. pH에 민감한 SBC-EV(ICG/PTX)에 의한
in vivo
SDT 향상
다양한 EV의 생체 내 SDT 효능을 MCF-7 종양 이종이식 마우스 모델을 사용하여 조사하였다. 다양한 샘플 [예: PBS, 유리 ICG/PTX, EV(ICG/PTX), SBC-EV(ICG/PTX)]이 종양 이식 쥐의 꼬리 정맥에 주사되었다. US 조사를 위한 최적의 시점을 찾기 위해 SBC-EV(ICG/PTX) 처리된 마우스에서 종양 코어 면적/종양주위 조직 면적(C/P)의 형광 강도 비율을 계산한 결과, 주사 후 4시간에 가장 높은 C/P 비율이 관찰되었다. 따라서, 종양은 각 샘플의 주입 4시간 후 3분의 US(1MHz, 0.5W/cm2)로 조사되었다. 종양 부피를 14일 동안 모니터링했다. 샘플의 추가 주입이나 US 치료는 없었다. 도 6A에서 볼 수 있듯이, EV(ICG/PTX) 또는 SBC-EV(ICG/PTX) 치료는 유리 ICG/PTX로 치료하는 것과 비교하여 종양 성장을 유의하게 억제하였다. 특히, SBC-EV(ICG/PTX)는 EV(ICG/PTX)보다 종양 성장 억제에 더 높은 효능을 보였다(도 6A). 14일째에 SBC-EV(ICG/PTX) 처리된 마우스의 종양 이미지는 또한 종양의 가장 억제된 성장을 나타냈다(도 6B). 이는 SBC-EV(ICG/PTX)가 엔도/리소좀의 산성 pH에 의해 유발된 암세포에서 촉진된 ICG 및 PTX의 세포질 방출로 인해 종양 증식의 상당한 억제를 유도했음을 나타낸다. 모든 테스트 그룹의 체중은 14일 동안 유의미한 변화를 나타내지 않았으며, 이는 모든 치료에 의해 유해한 부작용이 유도되지 않았음을 나타낸다 (도 6C). 각 그룹의 모든 마우스는 처리 후 14일까지 생존했다(생존율 = 100%). 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색 이미지는 SBC-EV(ICG/PTX) 및 US로 처리된 마우스의 종양에서 심각한 핵 응축 및 단편화를 나타냈다(도 6D).
US와 결합된 SBC-EV(ICG/PTX)의 생체내 독성을 혈액 생화학적 분석으로 평가하였다. 알라닌 아미노전이효소(ALT, 간독성 지표), 알부민(ALB, 간 기능 지표) 및 혈액 요소 질소(BUN, 신독성 지표)의 혈청 수치가 BC-EV(ICG/PTX) i.v. 후 14일째에 마우스의 혈액에서 측정되었다. 대조군과 비교하여 마우스의 혈액 샘플에서 ALT, ALB 및 BUN 수준의 유의한 변화는 없는 것으로 나타나, SBC-EV(ICG/PTX)의 높은 생물학적 안전성을 확인하였다. 또한, EV(ICG/PTX) 및 SBC-EV(ICG/PTX) 처리된 마우스의 주요 기관에서는 병리학적 변화가 발견되지 않았다(도 6D). 이러한 결과는 나노 초음파감작제로서 ICG가 탑재된 EV의 높은 효능과 생물학적 안전성을 명확하게 보여준다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
ROS: reactive oxygen species;
PDT: photodynamic therapy;
SDT: sonodynamic therapy;
US: ultrasound;
EPR: enhanced permeability and retention;
PA: photoacoustic;
NIR: near-infrared;
ICG: indocyanine green;
PTX: paclitaxel;
SBC: sodium bicarbonate;
EV: extracellular vesicle;
DCF-DA: 2',7'-dichlorofluorescein diacetate;
RB: rhodamine B;
NADPH: nicotinamide adenine dinucleotide phosphate;
ICP-OES: inductively coupled plasma optical emission spectrometry;
NTA: nanoparticle tracking analysis;
MAP: maximum amplitude projection;
AR-PAM: acoustic-resolution photoacoustic microscopy.
PDT: photodynamic therapy;
SDT: sonodynamic therapy;
US: ultrasound;
EPR: enhanced permeability and retention;
PA: photoacoustic;
NIR: near-infrared;
ICG: indocyanine green;
PTX: paclitaxel;
SBC: sodium bicarbonate;
EV: extracellular vesicle;
DCF-DA: 2',7'-dichlorofluorescein diacetate;
RB: rhodamine B;
NADPH: nicotinamide adenine dinucleotide phosphate;
ICP-OES: inductively coupled plasma optical emission spectrometry;
NTA: nanoparticle tracking analysis;
MAP: maximum amplitude projection;
AR-PAM: acoustic-resolution photoacoustic microscopy.
<110> INCHEON NATIONAL UNIVERSITY RESEARCH AND BUSINESS FOUNDATION
<120> Dual stimuli-sensitive drug releasing extracellular vesicle for
chemo-sonodynamic therapy
<130> 1070534
<160> 4
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NOX1 forward primer
<400> 1
ggttttaccg ctcccagcag aa 22
<210> 2
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> NOX1 reverse primer
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cttccatgct gaagccacgc tt 22
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<211> 23
<212> DNA
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<223> beta-actin forward primer
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atgaagtgtg acgttgacat ccg 23
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> beta-actin reverse primer
<400> 4
gcttgctgat ccacatct 18
Claims (16)
- 초음파감작제; 항암제 또는 항종양제; 및 탄산수소나트륨이 탑재되어 있는 초음파 및 pH 이중 감응성 세포 외 소포체.
- 제1항에 있어서, 상기 세포 외 소포체는 화학-초음파동역학 치료용인 것을 특징으로 하는, 세포 외 소포체.
- 제1항에 있어서, 상기 세포 외 소포체는 산성 pH에서 파열되어 초음파감작제와 항암제를 방출하는 것을 특징으로 하는, 세포 외 소포체.
- 제3항에 있어서, 상기 산성 pH는 pH 4.5 내지 6.8인 것을 특징으로 하는, 세포 외 소포체.
- 제3항에 있어서, 상기 세포 외 소포체는 초음파 처리에 의해 유발되는 공동화 효과에 의해 파열되는 것을 특징으로 하는, 세포 외 소포체.
- 제1항에 있어서, 상기 초음파감작제는 포르피린계(phorphyrins) 화합물, 프탈로시아닌계(phtalocyanine) 화합물, 로다민(rhodamine)계 화합물, 나프탈로시아닌계(naphthalocyanines) 화합물,보디피계 (BODIPY) 화합물 및 시아닌(cyanine)계 화합물로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 세포 외 소포체.
- 제6항에 있어서, 상기 초음파감작제는 인도시아닌 그린(ICG)인 것을 특징으로 하는, 세포 외 소포체.
- 제7항에 있어서, 상기 세포 외 소포체에 탑재되는 인도시아닌 그린의 농도는 20 내지 40 ㎍/㎖ 인 것을 특징으로 하는, 세포 외 소포체.
- 제1항에 있어서, 상기 항암제는 사이클로포스파아마이드(cyclophosphamide), 메클로레타민(mecholrethamine), 우라무스틴(uramustine), 멜파란(melphalan), 클로라부실(chlorambucil), 이포스파미드(ifosfamide), 벤다무스틴(bendamustine), 카르무스틴(carmustine), 로무스틴(lomustine), 스트렙토조신(streptozocin), 부설판(busulfan), 다카바진(dacarbazine), 테모졸로마이드(temozolomide), 티오테파(thiotepa), 알트레타민(altretamine), 듀오카르마이신(duocarmycin), 시스플라틴(cisplatin), 카르보플라틴(carboplatin), 네다플라틴(nedaplatin), 옥사리플라틴(oxaliplatin), 사트라플라틴(satraplatin), 트리플라틴 테트라나이트레이트(triplatin tetranitrate), 5-플루오로우라실(5-fluorouracil), 6-머캅토퓨린(6-mercaptopurine), 카페시타빈(capecitabine), 클라드리빈(cladribine), 클로파라빈(clofarabine), 시스타르빈(cystarbine), 플록스유리딘(floxuridine), 플루다라빈(fludarabine), 겜시타빈(gemcitabine), 하이드록시우레아(hydroxyurea), 메토트렉세이트(methotrexate), 페메트렉세드(pemetrexed), 펜토스타틴(pentostatin), 티오구아닌(thioguanine), 캠토테신(camptothecin), 토포테칸(topotecan), 이리노테칸(irinotecan), 에토포사이드(etoposide), 테니포시드(teniposide), 미토산트론(mitoxantrone), 파클리탁셀(paclitaxel), 도세탁셀(docetaxel), 이자베필론(izabepilone), 빈블라스틴(vinblastine), 빈크리스틴(vincristine), 빈데신(vindesine), 비노렐빈(vinorelbine), 에스트라머스틴(estramustine), 메이탄신(maytansine), DM1 (mertansine, 메르탄신), DM4, 돌라스타틴(dolastatin), 아우리스타틴 E(auristatin E), 아우리스타틴 F(auristatin F), 모노메틸 아우리스타틴 E(monomethyl auristatin E), 모노메틸 아우리스타틴 F(monomethyl auristatin F), 독소루비신(doxorubicin), 다우노루비신(daunorubicin), 에피루비신(epirubicin), 이다루비신(idarubicin) 및 발루비신(valrubicin)으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 세포 외 소포체.
- 제9항에 있어서, 상기 항암제는 파클리탁셀이고, 상기 세포 외 소포체에 탑재되는 파클리탁셀의 농도는 5 내지 15 ㎍/㎖ 인 것을 특징으로 하는, 세포 외 소포체.
- 제1항에 있어서, 상기 세포 외 소포체는 초음파 조사하여 ROS를 생성하는 것을 특징으로 하는, 세포 외 소포체.
- 제11항에 있어서, 상기 초음파는 0.3 내지 1.0 W/cm2 의 강도로 조사되는 것을 특징으로 하는, 세포 외 소포체.
- 제11항에 있어서, 상기 초음파는 생체 내 세포 외 소포체 투여 후 4 내지 24시간에 조사되는 것을 특징으로 하는, 세포 외 소포체.
- 제1항에 있어서, 상기 세포 외 소포체는 PA조영제로 작용하는 것을 특징으로 하는, 세포 외 소포체.
- 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 세포 외 소포체를 유효성분으로 포함하는, 종양 치료용 약학적 조성물.
- 제15항에 있어서, 상기 종양은 골발생 육종, 연조직 육종, 유방암, 폐암, 뇌암, 방광암, 갑상선암, 전립선암, 결장암, 직장암, 췌장암, 위암, 간암, 자궁암, 신장암, 자궁경부암, 피부암, 식도암 및 난소암; 호지킨 림프종, 비-호지킨, 신경교세포종, 흑색종, 골수종, 윌름스 종양, 급성 림프아구성 백혈병, 급성 골수아세포 백혈병, 별아교세포종, 신경아교종 및 망막모세포종으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
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Family Applications (1)
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Non-Patent Citations (1)
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|---|
| Liang S et al., Recent advances in nanomaterial assisted combinational sonodynamic cancer therapy. Adv Mater. 2020; 32: 2003214. |
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