KR102398743B1 - 초음파유도 마이크로버블을 포함하는 배뇨장애 치료제 조성물 - Google Patents

초음파유도 마이크로버블을 포함하는 배뇨장애 치료제 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 배뇨장애 치료제 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 약물 전달 시스템으로서 마이크로버블을 사용하고, 특정 출력의 초음파로 상기 마이크로버블을 표적 장기로 이동시킨 후 초음파로 상기 마이크로버블을 파괴함으로써 마이크로버블 상에 탑재된 치료약물이 표적 장기, 즉 방광에서 국소적으로 분비되도록 설계하여 치료 효과를 상승시킨 배뇨장애 치료제 조성물에 관한 것이다.

Description

초음파유도 마이크로버블을 포함하는 배뇨장애 치료제 조성물{Composition for treating the dysuresia comprising microbubbles to be ultrasonic-induced}
본 발명은 배뇨장애 치료제 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 약물 전달 시스템으로서 마이크로버블을 사용하고, 특정 출력의 초음파로 상기 마이크로버블을 표적 장기로 이동시킨 후 초음파로 상기 마이크로버블을 파괴함으로써 마이크로버블 상에 탑재된 치료약물이 표적 장기, 즉 방광에서 국소적으로 분비되도록 설계하여 치료 효과를 상승시킨 배뇨장애 치료제 조성물에 관한 것이다.
배뇨장애는 소변을 저장하고 배뇨하는 모든 과정의 이상을 의미하는 것으로, 방광의 기능적 이상으로 발생하는 질환이다.
2008년 20세 이상 세계 성인 인구의 45.2%가 적어도 한 가지 이상의 배뇨장애 질환을 가지고 있는 것으로 보고되었으며, 배노장애 인구는 세계적으로 점점 더 증가하는 추세이다.
한편, 인간의 노화가 진행됨에 따라 배뇨 기능이 저하되고, 전립선비대증, 과민성방광, 신경인성방광 등 배뇨장애를 유발하는 질환 유병율이 높아지므로, 미래에는 노인인구의 증가와 동시에 배뇨장애 인구의 증가가 명확히 예견된다. 또한, 실제로 40대 이상 성인 남녀에서 배뇨장애의 연구에 의하면, 배뇨장애의 종류와 원인에 관계없이 60세 이상에서 배뇨장애 유병 인구가 증가하는 것으로 알려져 있다.
배뇨장애 치료약물로는 크게 알파차단제와 항콜린제 이들 2가지 계열의 약물이 많이 쓰이며, 이들은 증상 및 원인 질환에 따라 선택된다. 주로 알파차단제는 전립선비대증에 사용되고, 항콜린제는 과민성방광에 사용된다. 이외에도 뇌졸중, 파킨슨병, 척수 손상, 신경 손상 등과 같은 기질성 질환에서도 각각 다양한 양상의 배뇨장애가 발생하는데, 이에 맞춰 각각의 약물들이 환자의 증상 개선을 위해 사용 되고 있다.
현재 임상적으로 사용되는 알파차단제와 항콜린제는 경구로 복용하는 제형으로 증상 개선의 효과가 있으나, 배뇨장애의 원인 기관인 방광에 선택적으로 작용하는 약물이 아니다. 따라서, 이들 약물을 경구로 투여하게 되면, 전신적인 영향을 끼칠 수 있어 다른 장기에도 부작용을 유발할 수 있다는 문제점이 존재한다. 특히, 알파차단제와 항콜린제의 경구 복용은 소화불량, 가벼운 입마름 등과 같은 경한 합병증 뿐만 아니라, 기립성저혈압, 시야 저야, 인지기능장애, 부정맥 등과 같은 심각한 합병증을 유발할 수도 있다. 특히 60세 이상 노인의 경우, 노화에 의한 뇌혈관장벽의 약화에 따라 중추신경계까지 영향을 받을 위험성이 높다.
또한, 노인 배뇨장애 환자의 경우 고혈압, 당뇨 등과 같은 흔한 성인 질환이 대부분 동반되어 있고, 뇌졸중, 파킨슨병 등과 같은 신경계 질환으로 인해 이미 다른 종류의 약물을 복용하고 있는 경우, 배뇨장애 치료약물뿐만 아니라 타 질환의 치료약물도 함께 경구 복용하게 되고, 여러 종류의 약물을 함께 복용할수록 약물에 의한 부작용이 더 심각하게 발생할 가능성이 높아진다.
이러한 약제의 부작용에 따르는 위험성과 불편은 배뇨장애 환자에서 약물치료의 순응도 저하로 귀결된다. 일례로, 요실금으로 경구 항콜린제를 복용하는 환자들의 약물 순응도(compliance) 연구에 의하면 1년째와 3년째까지 항콜린제 복용을 중단한 환자가 전체의 각각 74.8%와 87%에 이르렀다는 보고가 있다. 이는 약물에 대한 효과가 없거나 약물에 의한 부작용에 의한 것이다.
이와 같이, 현재 배뇨장애 치료약물은 대부분 경구로 투여하며, 따라서 치료 효율이 낮고 전신적 부작용이 크다는 문제점이 있다. 이러한 문제를 해결하기 위하여, 최근에는 카테터를 통해 방광 내로 약물을 직접 주입하는 방법이 시도되고 있다. 그러나 방광의 표층 점막을 구성하는 요로상피(urothelium)의 낮은 약물 투과도(low permeability)로 인해 방광의 근육층에 도달하여 효과를 일으키는 약물의 비율이 매우 낮아 여러 번 카테터를 통해 약물을 반복적으로 주입해야 하므로, 환자의 불편감을 증가시키고 효과도 낮은 한계가 있다.
또한, 요로상피층에 대한 약물 투과도를 높이고 약물이 방광 내에 충분히 머무를 수 있도록 리포좀, 나노입자, 덴드리머, EMDA(Electromotive drug-administration; 전동 약물 투여), 하이드로겔 등을 매개로 하는 연구가 진행 중이나 효과가 제한적인 것으로 나타났다. 이는, 반복적, 주기적으로 배뇨가 이루어지게 되므로, 방광에 도달한 약물이 요로상피를 뚫고 약물이 방광의 근육층으로 도달하는 데 충분한 시간 동안 방광 내에 머물지 못하기 때문이다.
따라서 비뇨기과 분야에서 난치성 부위인 방광에 선택적으로 작용하여 배뇨장애를 호전시키고 치료 효율을 높일 수 있는 방법에 대한 절박한 필요성이 존재한다.
미국 공개특허 2018/0344872 (2018년 12월 6일 공개) 한국 공개특허 10-2015-0010909 (2015년 1월 29일 공개)
이에 본 발명자는 방광에 선택적으로 작용할 수 있는 초음파 유도에 의한 마이크로버블 매개 약물 전달 시스템을 활용함으로써 치료약물을 방광 선택적으로 작용할 수 있게 하고, 이에 따라 소변의 저장 및 배뇨에 대한 치료 효과를 높이면서 전신적인 약물 투여에 의한 부작용을 최소화할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명은 방광에 선택적으로 작용하여 부작용은 감소시키면서 배뇨장애 치료 효율을 높일 수 있는 초음파유도 마이크로버블 매개의 새로운 약물 전달 시스템 및 이를 포함하는 배뇨장애 치료제 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 표면 상에 배뇨장애 치료제가 탑재되어 있는 초음파유도 마이크로버블을 포함하는 배뇨장애 치료제 조성물을 제공한다.
본 발명의 실시예에 따른 조성물은 초음파유도 마이크로버블을 약물 전달 시스템으로서 사용함으로써 표적 장기인 방광에 선택적으로 작용할 수 있게 하여 배뇨장애 치료 효율을 크게 향상시킬 수 있다. 또한, 본원발명의 조성물은 방광에 직접 주사 후 초음파로 표적 위치까지 이동을 유도한 다음, 표적에서 터지도록 설계되어, 경구 투여시 약물이 전신적으로 작용하여 생기는 부작용을 피할 수 있다는 장점이 있다.
도 1은 리포좀의 내부에 치료제인 펜토산 폴리설페이트를 담지하는 과정의 모식도이다.
도 2는 치료제를 마이크로버블 상에 탑재하는 과정의 모식도가 도 2에 제시되어 있다.
도 3은 약물별, 초음파 자극별 전립선 지수 결과를 나타낸다.
도 4는 전립선 동물모델에서 약물과 마이크로버블 투여 후 초음파 자극에 따른 배뇨기능에 미치는 영향을 나타낸다.
도 5는 약물과 마이크로버블 투여 후 초음파 자극에 따른 염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-1βIL-6 발현에 미치는 영향을 나타낸다.
도 6은 약물과 마이크로버블 투여 후 초음파 자극에 따른 신경성장인자인 NGF(nerve growth factor) 발현에 미치는 영향을 나타낸다.
도 7은 약물과 마이크로버블 투여 후 초음파 자극에 따른 섬유화 인자인 CTGF와 피브로넥틴 발현에 미치는 영향을 나타낸다.
도 8은 약물과 마이크로버블 투여 후 초음파 자극에 따른 전달 유효성 평가 결과를 나타낸다.
도 9는 약물과 마이크로버블 투여 후 초음파 자극에 따른 배뇨중추 내 c-Fos 발현에 미치는 영향을 나타낸다.
도 10은 방광염 동물모델에서 약물과 마이크로버블 투여 후 초음파 자극에 따른 배뇨기능에 미치는 영향을 나타낸다.
도 11은 약물과 마이크로버블 투여 후 초음파 자극에 따른 방광 수축압과 시간 등에 미치는 영향을 나타낸다. A: 대조군(초음파 처리), B: 약물 비처리군(초음파 처리), C: 솔리페나신 + 복강투여군(초음파 처리), D: 솔리페나신 + 방광내 투여군(초음파 처리), E: 보톡스 + 방광내 투여군(초음파 처리), F: 보톡스 + 방광 피하 투여군(초음파 처리), G: 솔리페나신 + 복강 투여군(초음파 비처리), H: 솔리페나신 + 방광내 투여군(초음파 비처리), E: 보톡스 + 방광내 투여군(초음파 비처리), F: 보톡스 + 방광 피하 투여군(초음파 비처리).
도 12는 약물과 마이크로버블 투여 후 초음파 자극에 따른 전염증성 사이토카인 발현에 미치는 영향을 나타낸다. A: 대조군(초음파 처리), B: 약물 비처리군(초음파 처리), C: 솔리페나신 + 복강투여군(초음파 처리), D: 솔리페나신 + 방광내 투여군(초음파 처리), E: 보톡스 + 방광내 투여군(초음파 처리), F: 보톡스 + 방광 피하 투여군(초음파 처리), G: 솔리페나신 + 복강 투여군(초음파 비처리), H: 솔리페나신 + 방광내 투여군(초음파 비처리), E: 보톡스 + 방광내 투여군(초음파 비처리), F: 보톡스 + 방광 피하 투여군(초음파 비처리).
도 13은 약물과 마이크로버블 투여 후 초음파 자극에 따른 성장 인자 발현에 미치는 영향을 나타낸다. A: 대조군(초음파 처리), B: 약물 비처리군(초음파 처리), C: 솔리페나신 + 복강투여군(초음파 처리), D: 솔리페나신 + 방광내 투여군(초음파 처리), E: 보톡스 + 방광내 투여군(초음파 처리), F: 보톡스 + 방광 피하 투여군(초음파 처리), G: 솔리페나신 + 복강 투여군(초음파 비처리), H: 솔리페나신 + 방광내 투여군(초음파 비처리), E: 보톡스 + 방광내 투여군(초음파 비처리), F: 보톡스 + 방광 피하 투여군(초음파 비처리).
도 14는 약물과 마이크로버블 투여 후 초음파 자극에 따른 염증관련인자인 COX-2 및 iNOS 발현에 미치는 영향을 나타낸다. A: 대조군(초음파 처리), B: 약물 비처리군(초음파 처리), C: 솔리페나신 + 복강투여군(초음파 처리), D: 솔리페나신 + 방광내 투여군(초음파 처리), E: 보톡스 + 방광내 투여군(초음파 처리), F: 보톡스 + 방광 피하 투여군(초음파 처리), G: 솔리페나신 + 복강 투여군(초음파 비처리), H: 솔리페나신 + 방광내 투여군(초음파 비처리), E: 보톡스 + 방광내 투여군(초음파 비처리), F: 보톡스 + 방광 피하 투여군(초음파 비처리).
도 15는 약물과 마이크로버블 투여 후 초음파 자극에 따른 AMPK 발현에 미치는 영향을 나타낸다. A: 대조군(초음파 처리), B: 약물 비처리군(초음파 처리), C: 솔리페나신 + 복강투여군(초음파 처리), D: 솔리페나신 + 방광내 투여군(초음파 처리), E: 보톡스 + 방광내 투여군(초음파 처리), F: 보톡스 + 방광 피하 투여군(초음파 처리), G: 솔리페나신 + 복강 투여군(초음파 비처리), H: 솔리페나신 + 방광내 투여군(초음파 비처리), E: 보톡스 + 방광내 투여군(초음파 비처리), F: 보톡스 + 방광 피하 투여군(초음파 비처리).
도 16은 약물과 마이크로버블 투여 후 초음파 자극에 따른 배뇨중추 내 c-Fos 발현에 미치는 영향을 나타낸다. A: 대조군(초음파 처리), B: 약물 비처리군(초음파 처리), C: 솔리페나신 + 복강투여군(초음파 처리), D: 솔리페나신 + 방광내 투여군(초음파 처리), E: 보톡스 + 방광내 투여군(초음파 처리), F: 보톡스 + 방광 피하 투여군(초음파 처리), G: 솔리페나신 + 복강 투여군(초음파 비처리), H: 솔리페나신 + 방광내 투여군(초음파 비처리), E: 보톡스 + 방광내 투여군(초음파 비처리), F: 보톡스 + 방광 피하 투여군(초음파 비처리).
도 17은 약물과 마이크로버블 투여 후 초음파 자극에 따른 전체 NOS를 확인하기 위해 NADPH-d 염색을 MPA, PAG 및 PMC에 대하여 실시한 결과를 나타낸다. A: 대조군(초음파 처리), B: 약물 비처리군(초음파 처리), C: 솔리페나신 + 복강투여군(초음파 처리), D: 솔리페나신 + 방광내 투여군(초음파 처리), E: 보톡스 + 방광내 투여군(초음파 처리), F: 보톡스 + 방광 피하 투여군(초음파 처리), G: 솔리페나신 + 복강 투여군(초음파 비처리), H: 솔리페나신 + 방광내 투여군(초음파 비처리), E: 보톡스 + 방광내 투여군(초음파 비처리), F: 보톡스 + 방광 피하 투여군(초음파 비처리).
본 발명은 초음파유도 마이크로버블을 약물 전달 시스템으로 사용하고, 상기 마이크로버블 표면 상에 배뇨장애 치료제를 탑재한, 배뇨장애 치료제 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 일 실시예에 따른 조성물은 약물 전달 시스템으로서 초음파유도 마이크로버블을 포함한다. 상기 초음파유도 마이크로버블은 특정 출력의 초음파를 이용하여 상기 마이크로버블을 표적 장기로 이동시킬 수 있으며, 표적 장기, 즉 방광에서 초음파로 상기 마이크로버블을 파괴함으로써 마이크로버블의 표면 상에 탑재된 치료약물이 표적 장기에서 국소적으로 분비될 수 있게 한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 약물 전달 시스템으로서 사용되는 마이크로버블은 공지된 것, 시판된 것 등을 사용할 수 있고, 특별히 제한되는 것은 아니다. 구체적으로, 본 발명의 일 실시예에 있어서, 사용가능한 마이크로버블로는 한국 등록특허 10-2031571(2019년 10월 14일 공고)에 기재된 약물 전달을 위한 미소 기포, 한국 공개특허 10-2019-0001022(2019년 1월 4일 공개)에 기재된 마이크로버블 등을 포함하지만, 이로 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 마이크로버블은 대략적으로 다음과 같은 구조를 가진다.
Figure 112020093096474-pat00001
상기 나타낸 바와 같이, 마이크로버블은 대략적으로 1 내지 10 μm의 직경을 가지며, 지질, 단백질 및 중합체를 포함하는 쉘과 가스가 충진되어 있는 코어 영역으로 구성된다.
구체적으로, 본 발명의 일 실시예에 있어서, 마이크로버블은 가스가 충전된 마이크로스피어(microsphere), 가스 충전된 리포좀 또는 가스 포밍 에멀젼(gas-forming emulsion)일 수 있으며, 바람직하게는 마이크로버블은 인지질 기반의 리포좀에 가스가 충진되어 마이크로 크기화 된 것일 수 있다.
상기 리포좀은 인지질을 포함하는 양친매성 화합물에 의해 형성된다. 이러한 양친매성 화합물은 전형적으로 수성 매질과 본질적으로 수불용성인 유기용매 간의 계면에 배열되어, 유화된 용매 미세방울을 안정화한다. 상기 양친매성 화합물은 수성 매질과 반응할 수 있는 친수성극 머리 부분(예: 극성 또는 이온성기)과 유기 매질과 반응할 수 있는 소수성 유기 꼬리 부분(예: 탄화수소 사슬)을 가진 분자를 가진 화합물을 포함한다. 양친매성 화합물은 비혼화성인 두 가지의 액체(예: 물과 오일)의 혼합물, 액체와 기체의 혼합물(예: 물 중에 기체 마이크로버블) 또는 액체와 불용성 입자의 혼합물(예: 물 중의 금속 나노 입자)과 같이 다른 방법으로는 통상적으로 섞일 수 없는 물질의 혼합물을 안정화시킬 수 있는 화합물이다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 마이크로버블 내부에 충진되는 가스는 공지된 기체를 사용할 수 있으며, 예를 들어 이산화탄소, 헬륨, 질소, 아르곤, 설퍼 헥사플루오라이드, 퍼플루오르화 기체 등을 사용할 수 있지만, 이로 한정되는 것은 아니다. 구체적으로, 상기 기체로는 불소 가스가 포함된 불화물을 사용하는 것이 바람직하고, 예를 들어 퍼플루오로프로판(C3F8), 설퍼 헥사플루오라이드(SF6), 퍼플루오로펜탄(perfluoropentane), 데카플루오로부탄(decafluorobutane) 및 퍼플루오로헥산(perfluorohexane)이 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 초음파에 의해 마이크로버블이 파괴되면, 마이크로버블 내부에 충진된 가스는 마이크로버블 구조의 파괴와 동시에 압력파를 제공하여 마이크로버블 표면에 탑재된 치료제가 표적 장기의 조직 내부로 강제 주입될 수 있게 하여 약물 전달 효능을 향상시킬 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 마이크로버블 표면 상에 치료제, 구체적으로는 배뇨장애 치료제 약물이 탑재될 수 있으며, 구체적으로는 내부에 치료제 약물이 담지된 리포좀 나노입자를 마이크로버블 표면 상에 탑재할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 배뇨장애 치료제로는 솔리페나신(Solifenacin), PDE-5 억제제(타다라필(Tadalafil)), 보툴리눔 독소(Botulium-Toxin), 리도카인(Lidocaine), 펜토산 폴리설페이트(Pentosane Polysulfate), 탐수로신(Tamsulosin) 등이 사용될 수 있다. 이들 치료제는 친수성의 특징을 가지고 있기 때문에, 내부가 친수성인 리포좀의 내부에 담지시키는 것이 가능하다. 리포좀의 내부에 치료제를 담지하는 과정의 모식도가 도 1에 제시되어 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 내부에 치료제를 담지한 리포좀을 마이크로버블의 표면 상에 탑재하는 방법은 이로 한정되는 것은 아니지만, 바람직하게는 HSA(Human serum albumin; 인간 혈청 알부민)와 치료제를 결합시킨 후, 이를 에탄올 중에서 탈용매화시켜 치료제가 담지된 HSA 나노입자를 형성하고, 이러한 나노입자를 마이크로버블의 표면 상에 컨쥬게이션시킴으로써 치료제가 탑재된 마이크로버블 복합체를 얻을 수 있다. 치료제를 마이크로버블 상에 탑재하는 과정의 모식도가 도 2에 제시되어 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 마이크로버블은 특정 출력(즉, 강도, 시간, 듀티 사이클(duty cycle) 파라미터 등)의 초음파를 조사하여 목적하는 부위로 이동될 수 있으며, 이때 마이크로버블의 이동에 사용되는 초음파의 특정 출력 파라미터 값은 강도가 1~2 w/cm2이고, 시간은 1~2분이며, 듀티 사이클은 20~60%임이 바람직하다.
또한, 본 발명의 일 실시예에 있어서, 마이크로버블은 특정 출력의 초음파를 이용하여 표적 부위에서 파괴하고 치료제 약물을 방출할 수 있는데, 이때 마이크로버블을 파괴하는 데 사용되는 초음파의 특정 출력 파라미터 값은 강도가 1~2 w/cm2이고, 시간은 1~2분이며, 듀티 사이클은 20~60%임이 바람직하다.
본 발명의 일 실시예에 따른 조성물은 종래 배뇨장애 치료제를 경구로 투여한 경우에 비하여 치료 효율을 증가시킬 수 있다. 또한, 표적 장기, 즉 방광에서 선택적으로 치료제 약물이 방출되도록 설계된 마이크로버블을 약물 전달 시스템으로 사용함으로써 경구 투여시에 비하여 보다 적은 양의 치료제의 적용으로도 만족스러운 결과를 얻을 수 있다. 게다가, 경구 투여에 의한 전신적인 작용에 따른 부작용을 현저하게 감소시킬 수 있으므로, 부작용의 감소뿐만 아니라, 환자의 치료 순응도(compliance)를 높일 수 있다.
이하, 본 발명의 내용을 실시예 및 시험예를 들어 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 이들 실시예 및 시험예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위해 예시의 목적으로만 제공된 것일 뿐 본 발명의 범주 및 범위가 하기 예에 의해 제한되는 것은 아니다.
[시험예 1] 정상 방광 조직을 이용한 시험관내(in vitro) 연구
1. 실험동물
5주령 된 Sprague-Dawley 암컷 흰쥐를 사용하였다. 실험동물은 항온, 항습이 유지되며 12시간 간격으로 밤낮 주기가 조절되는 실험실 환경에서 사육하였다. 전 실험기간을 통하여 고형 사료와 물을 자유롭게 섭취하도록 하고, 온도는 22∼℃, 습도는 60%를 유지하였다.
2. 마이크로버블의 제작
마이크로버블에 녹색의 형광 염료인 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 포함하여 준비하고, 소수성 가스(SF6 가스), DPPC(1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phospho choline), DPPE(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine)와 DSPE-PEG-SPDP(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[PDP(polyethylene glycol)-2000]를 함께 준비하였다.
H2O를 DPPC, DPPE, DSPE-PEG-SPDP와 FITC로 배합된 필름에 공급해준 다음 밀폐된 유리병에 이동시키고 아말감메이터(JS 2001MX, KIMS)를 사용하여 유리병에 SF6 가스와 MB-FITC를 채우고 준비시켰다. 적색 형광 염료인 텍사스 레드(Texas red), DPPC 및 DPPE를 배합하여 나노리포좀-텍사스 레드를 만들어 놓았다. 본 배합을 처음 제작해 유리병에 있는 필름에 넣고 수조형 초음파장치(bath-type sonicator; 4020P, Kodo Technical Research)를 이용해 초음파처리시켰다.
원심분리 및 세척(13,000 rpm, 5분, 2회)을 통해 과량의 텍사스 레드를 제거하였다. 이후 나노레포좀-텍사스 레드를 앞서 준비한 MB-FITC와 2시간 동안 반응시켜 MB-FITC-나노리포좀-텍사스 레드 복합체(MLC)를 준비시킨다. 반응하지 않은 구성물은 원심분리 후에 세척하여 제거하였다. 이후 트라스투주맙(Herceptin, Roche)과 MLC, MB-FITC-나노리포좀-텍사스 레드-Her2Ab를 원심분리하여 준비시켰다.
3. 기관 수조(Organ bath) 배양
실험동물을 이소플루란(중외제약, 서울, 한국)으로 마취 후 복강을 열어 방광과 요도를 노출시킨 다음, 주변부 신경과 잔여조직을 박리한 뒤 채취하였다. 8 내지 10 mm 길이, 2 내지 3mm 너비 크기의 방광삼각근, 근위부요도조직을 세로단면으로 각 1개씩 추출하여 크레브스(Krebs) 용액 수조에 길이방향으로 매단 후 수조를 37℃ 유지하고 95% O2와 5% CO2를 통기시키면서 초기 장력을 5 mM로 가하여 30분간 안정화시켰다. 이후 준비된 마이크로버블을 투여하였다.
4. 초음파 자극
마이크로버블을 투여한 방광과 요도 조직에 초음파 자극을 가하였다. 먼저 조직을 세척하고, 마이크로버블을 투여한 실험동물을 루미날 챔버(Luminal chamber)에 위치시킨 후 다양한 구성으로 Sonidel® 초음파 발생기를 이용하여 초음파로 자극시켰다. 자극 구성과 시간(강도, 시간, 듀티 사이클 파라미터)은 하기 표 1에 나타낸 바와 같다.
초음파 자극 구성 및 시간
분류 강도(w/cm2) 시간(min) 듀티 사이클(%)
A 1 1 20
B 1 1 60
C 1 2 20
D 2 1 20
E 1 2 60
F 2 2 60
5. 마이크로버블 전달효과 평가
마이크로버블 전달효과는 공초점 레이저 주사 현미경(CLSM; Leica)을 이용하여 평가하였다. ×20와 ×63 렌즈를 사용하여 FITC(여기, 488 nm; 방출, 500 내지 570 nm), 텍사스 레드(여기, 594 nm; 방출, 600 내지 680 nm)로 평가하였다.
[시험예 2] 실험동물의 정상 방광을 이용한 생체내(in vivo) 연구
1. 실험동물
10주령 된 Sprague-Dawley 암컷 흰쥐를 사용하였다. 모든 실험은 동물윤리위원회의 심의규정에 맞게 진행하였다. 실험동물은 항온, 항습이 유지되며 12시간 간격으로 밤낮 주기가 조절되는 실험실 환경에서 사육하였다. 전 실험기간을 통하여 고형 사료와 물을 자유롭게 섭취하도록 하고, 온도는 22∼℃, 습도는 60%를 유지하였다.
2. 마이크로버블의 제작
마이크로버블에 녹색의 형광 염료인 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 포함하여 준비하고, 소수성 가스(SF6 가스), DPPC(1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phospho choline), DPPE(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine)와 DSPE-PEG-SPDP(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[PDP(polyethylene glycol)-2000]를 함께 준비하였다.
H2O를 DPPC, DPPE, DSPE-PEG-SPDP와 FITC로 배합된 필름에 공급해준 다음 밀폐된 유리병에 이동시키고 아말감메이터(JS 2001MX, KIMS)를 사용하여 유리병에 SF6 가스와 MB-FITC를 채우고 준비시켰다. 적색 형광 염료인 텍사스 레드, DPPC 및 DPPE를 배합하여 나노리포좀-텍사스 레드를 만들어 놓았다. 본 배합을 처음 제작해 유리병에 있는 필름에 넣고 수조형 초음파장치(4020P, Kodo Technical Research)를 이용해 초음파처리시켰다.
원심분리 및 세척(13,000 rpm, 5분, 2회)을 통해 과량의 텍사스 레드를 제거하였다. 이후 나노레포좀-텍사스 레드를 앞서 준비한 MB-FITC와 2시간 동안 반응시켜 MB-FITC-나노리포좀-텍사스 레드 복합체(MLC)를 준비시킨다. 반응하지 않은 구성물은 원심분리 후에 세척하여 제거하였다. 이후 트라스투주맙(Herceptin, Roche)과 MLC, MB-FITC-나노리포좀-텍사스 레드-Her2Ab를 원심분리하여 준비시켰다.
3. 마이크로버블의 투여
크게 요도를 통해 방광에 직접투여하는 방법과 혈관에 직접 투여하는 방법으로 진행하였다. 요도를 통해 방광에 직접투여 하는 방법은 먼저 Zoletil 50®(10 mg/kg, i.p.; Virbac Laboratories)을 복강 주사하여 실험동물을 마취시킨 후 폴리에틸렌 카테터를 요도를 통해 방광까지 삽입하고, 충분이 삽입된 것을 확인한 후에 마이크로버블을 투여하였다. 혈관에 직접 투여하는 방법은 실험동물을 고정화 기구를 이용하여 고정시킨 뒤, 꼬리에 주사기를 이용하여 정맥에 직접 투여하였다. 모든 약물은 4일에 한 번씩 총 10회를 투여하였으며(소요기간 40일), 실험동물의 이상반응이 나타나면 실험에서 제외시켰다.
4. 희생 및 조직처리
마이크로버블 투여가 끝난 실험동물은 Zoletil 50®(10 mg/kg, i.p.;)으로 마취 후 복강을 열고 방광과 요도부위를 떼어내었다. 이후 적출된 방광과 요도 부위는 100 mM 인산 완충액에 녹인 4% 파라포름알데하이드(PFA) 고정액에 넣어 24시간 동안 고정을 실시하였다. 이후 70%, 80%, 90%, 100% 에탄올에 넣어 탈수시키며, 자일렌에 침착시킨 후 경질 파라핀(Leica, USA) 용액으로 3단계의 과정을 거쳐 조직에 파라핀을 침습시켰다. 침습이 끝난 조직은 절편을 제작하기 위해 블록을 만들고, 고정된 파라핀 조직은 파라핀 절편기(Shandon Finesse 325, Thermo Electron Co. England)를 이용하여, 5 μm 두께로 절편을 제작하고, 코팅 슬라이드에 붙인 후 37℃ 슬라이드 오븐에 밤새 두었다.
5. 마이크로버블 전달효과 평가
마이크로버블 전달효과는 공초점 레이저 주사 현미경(CLSM; Leica)을 이용하여 평가하였다. ×20와 ×63 렌즈를 사용하여 FITC(여기, 488 nm; 방출, 500 내지 570 nm), 텍사스 레드(여기, 594 nm; 방출, 600 내지 680 nm)로 평가하였다.
[시험예 3] 치료약물을 탑재한 방광 선택적 초음파유도 마이크로버블의 배뇨장애 치료 효과 확인 - 배뇨장애 동물 모델의 확립
1. 실험동물 모델의 구성
배뇨장애 동물 모델의 확립을 위해 4가지의 실험동물 모델을 하기 표 2와 같이 구성하였다.
배뇨장애 동물모델 분류 및 방법
분류 질환명 성별 사용 동물 종류 유발 방법
CON-1 대조군-1 암컷 SD계열 -
CON-2 대조군-2 수컷 SD계열 -
A 과민성 방광 암컷 SD계열 약물투여에 의한 유발
B 전립선 비대 수컷 SD계열 약물투여에 의한 유발
2. 과민성 방광(간질성 방광염) 유발
과민성 방광의 유발은 항암제인 사이클로포스파미드를 이용하여 유발하였으며, 급성 방광염 모델이 아닌 만성 과민성 방광증상을 유발하기 위해 하기 나타낸 바와 같이 사이클로포스파미드를 75 mg/kg의 농도로 3일에 한번씩 10일 동안 투여하였다(3회 투여). 투여 중 실험동물의 치사율이 높기 때문에 충분한 마리수를 보유한 이후에 실험을 진행하였다. 10일 동안의 사이클로포스파미드 투여가 끝나면 3일간의 안정기를 취한 뒤 요역동학 검사를 통해 과민성 방광증상의 유발여부를 평가하였다.
Figure 112020093096474-pat00002
3. 전립선 비대 유발
고환절제술 후 테스토스테론을 투여하여 전립선 비대를 유발하였다. 고환절제술은 Zoletil 50®(10 mg/kg, i.p.)을 복강 주사하여 마취한 후, 음낭을 절개하여 혈관 및 정관(vas deferens)을 멸균한 외과용 실크(surgical silk; 5.0)로 묶은 뒤 고환을 떼어낸 후 봉합하였다. 또한 수술 직후 저체온증을 방지하기 위해 37℃가 유지되는 매트에서 4시간 동안 유지 후 마취가 깨어나면 동물용 케이지로 이동을 시켰으며, 수술 후 3일 동안 진통제와 항생제를 투여하여 진통효과와 음낭부위의 염증유발을 방지하였다.
테스토스테론 약물투여는 고환절제술 후 3일째부터 테스토스테론(Wako, Japan)을 옥수수유와 에탄올의 부피비로 9:1 비율의 혼합액에 희석하여 30일 동안 20 mg/kg의 용량으로 실험동물의 피하에 0.5 ml씩 투여하여 전립선 비대를 유도하였다.
4. 요역동학 검사
각각 배뇨장애를 유발시킨 동물모델들에 있어서, 유발 유무와 정도를 확인하기 위해 동물모델의 배뇨기능을 측정하였다. 배뇨기능의 측정은 요역동학 검사의 실시로 이루어졌으며, 각각의 배뇨장애 유발 기간이 완료되는 날 평가하였다. 먼저 Zoletil 50®(10 mg/kg, i.p.)을 복강 내 주사하여 마취한 후 하복부를 2 cm 가량 절개하여 방광을 노출시켰다. 그 다음 방광 천정부(bladder dome)에 미세수술용 가위를 이용하여 0.2 cm 가량 절개한 뒤 폴리에틸렌 카테터를 삽입하였다. 카테터의 유출을 방지하기 위해 6-0 수술용 실을 이용하여 방광과 카테터를 고정하였다. 카테터는 압력측정기(Havard Apparatus, Massachusetts, USA)로 연결되어 있으며, 방광이 비워지면 0.5 ml의 0.9% 생리식염수를 채워 방광기능을 측정하였다. 모든 기록은 labscribe(iWorx/CB Science, Inc, Dover, USA)를 활용하여 수치화하였다.
5. 조직처리 및 조직학적 평가
요역동학 검사가 끝난 실험동물은 Zoletil 50®(10 mg/kg, i.p.)으로 마취 후 복강을 열고 방광과 요도부위 및 전립선을 떼어내었다. 이후 적출된 방광과 요도, 전립선 조직을 100 mM 인산 완충액에 녹인 4% 파라포름알데하이드(PFA) 고정액에 넣어 24시간 동안 고정을 실시하였다. 이후 70%, 80%, 90%, 100% 에탄올에 넣어 탈수시키며, 자일렌에 침착시킨 후 경질 파라핀(Leica, USA) 용액으로 3단계의 과정을 거쳐 조직에 파라핀을 침습시켰다. 침습이 끝난 조직은 절편을 제작하기 위해 블록을 만들고, 고정된 파라핀 조직은 파라핀 절편기(Shandon Finesse 325, Thermo Electron Co. England)를 이용하여, 5 μm 두께로 절편을 제작하고, 코팅 슬라이드에 붙인 후 37℃ 슬라이드 오븐에 밤새 두었다.
조직학적 평가는 크게 3가지를 평가하며, 이를 위해 조직학적 변화를 확인하는 헤마톡실린 & 에오신 염색과 염증인자 변화를 평가하는 메이슨 트리크롬(masson’s trichrome) 염색, 전체 NOS를 확인하는 NADPH-d 염색을 실시하였다.
[시험예 4] 배뇨장애 동물 모델에 치료약물을 탑재한 방광 선택적 초음파유도 마이크로버블의 과활동성 방광 치료 효과 확인
1. 마이크로버블에 치료약물 탑재
배뇨장애 동물 모델에 치료약물을 사용하기 위해, 치료약물을 마이크로버블에 탑재하는 방법으로는 치료약물을 리포좀 나노입자에 담지시킨 다음, 이를 마이크로버블에 탑재하는 방식을 이용하였다. 이는 대부분의 배뇨장애 치료약물이 친수성의 특징을 지닌다는 특성을 이용하는 것으로, 내부가 친수성인 리포좀 내부에 해당 약물을 담지시켰다(도 1 참조). 또한 본 실험에 탑재할 후보약물은 도 2에 나타내었다.
2. 배뇨장애 동물모델 제작 및 치료약물이 탑재된 마이크로버블 복합체 투여 및 초음파자극
10주령 된 Sprague-Dawley 흰쥐를 사용하였다(1개 집단에 사용하는 동물수는 5마리임). 이 때, 과민성 방광(간질성 방광염) 모델에는 암컷을, 전립선 비대 모델에는 수컷을 사용하였다. 모든 실험은 동물윤리위원회의 심의규정에 맞게 진행하였다. 실험동물은 항온, 항습이 유지되며 12시간 간격으로 밤낮 주기가 조절되는 실험실 환경에서 사육하였다. 전 실험기간을 통하여 고형 사료와 물을 자유롭게 섭취하도록 하고, 온도는 22∼24℃, 습도는 60%를 유지하였다.
특히, 전립선 비대 유발에서의 집단분류는 하기 표 3에 나타낸 바와 같고, 방광염 유발 모델에서의 집단분류는 하기 표 4에 나타낸 바와 같다.
분류 약물 전립선 비대 여부 초음파 처리 여부
A(대조군) - × ×
B - ○ ×
C 탐수로신 ○ ×
D 솔리페나신 ○ ×
E 탐수로신 ○ ○
F 솔리페나신 ○ ○
분류 약물 투여방법 초음파 처리 여부
A(대조군) - - ○
B - - ○
C 솔리페나신 복강 투여 ○
D 솔리페나신 방광내 투여 ○
E 보톡스 방광내 투여 ○
F 보톡스 방광 피하 투여 ○
G 솔리페나신 복강 투여 ×
H 솔리페나신 방광내 투여 ×
I 보톡스 방광내 투여 ×
J 보톡스 방광 피하 투여 ×
치료약물이 탑재된 마이크로버블 복합체는 각각의 배뇨장애 모델을 제작한 뒤 카테터를 이용하여 요도를 통해 방광에 직접 투여하였다. 그 후 초음파전사 장비를 이용해 하복부 방광주변을 자극하여(강도: 1~2 w/cm2; 시간 1~2분; 듀티 사이클 20~60%) 약물이 탐지된 마이크로버블의 활성화를 유발시켰다.
3. 요역동학 검사
각각 배뇨장애를 유발시킨 동물모델들에 있어서, 유발 유무와 정도를 확인하기 위해 동물모델의 배뇨기능을 측정하였다. 배뇨기능의 측정은 요역동학 검사의 실시로 이루어졌으며, 각각의 배뇨장애 유발 기간이 완료되는 날 평가하였다. 먼저 Zoletil 50*(10 mg/kg, i.p.)을 복강 내 주사하여 마취한 후 하복부를 2 cm 가량 절개하여 방광을 노출시켰다. 그 다음 방광 천정부(bladder dome)에 미세수술용 가위를 이용하여 0.2 cm 가량 절개한 뒤 폴리에틸렌 카테터를 삽입하였다. 카테터의 유출을 방지하기 위해 6-0 수술용 실을 이용하여 방광과 카테터를 고정하였다. 카테터는 압력측정기(Havard Apparatus)로 연결되어 있으며, 방광이 비워지면 0.5 ml의 0.9% 생리식염수를 채워 방광기능을 측정하였다. 모든 기록은 labscribe(iWorx/CB Science, Inc, Dover, USA)를 활용하여 수치화하였다.
4. 조직처리
각 배뇨장애 질환별 요역동학 검사가 끝난 실험동물은 Zoletil 50*(10 mg/kg, i.p.)으로 마취시킨 후 복강을 열고 방광과 요도부위 및 전립선을 떼어내었다. 이후 일부는 분자생물학적 평가를 위해 -80℃에 보관하였다. 나머지 적출된 방광과 요도, 전립선 조직은 파라핀 절편 제작을 하였다. 방광과 요도, 전립선 조직을 떼어낸 후 흉강을 열고 강을 열고 좌심실을 통하여 50 mM 인산염 완충식염수(phosphate buffer saline, PBS)를 주입하고, 이 후 100 mM 인산 완충액에 녹인 4% 파라포름알데하이드(PFA) 고정액을 관류시켰다. 관류 고정 후, 뇌와 척수를 적출한 다음 상기 PFA 고정액에 담아서 4℃에서 12시간 동안 고정을 실시하였다. 고정된 뇌와 척수 조직은 30% 수크로스 용액에서 2 내지 5일간 침적시킨 후 크라이오스탯(American Optica, USA)을 이용하여 40 ㎛ 두께의 연속관상 절편을 제작하였다.
5. 마이크로버블 전달효과 평가
마이크로버블 전달효과는 공초점 레이저 주사 현미경(CLSM; Leica)을 이용하여 평가하였다. ×20와 ×63 렌즈를 사용하여 FITC(여기, 488 nm; 방출, 500 내지 570 nm), 텍사스 레드(여기, 594 nm; 방출, 600 내지 680 nm)로 평가하였다.
6. 조직학적 평가
조직학적 평가는 크게 3가지를 평가하며, 이를 위해 조직학적 변화를 확인하는 헤마톡실린 & 에오신 염색과 염증인자 변화를 평가하는 메이슨 트리크롬 염색, 전체 NOS를 확인하는 NADPH-d 염색을 실시하였다.
7. c-Fos와 신경 성장 인자(NGF) 면역조직화학법
배뇨장애 질환에 마이크로버블에 탑재된 치료약물의 효용성을 평가하기 위해, 뇌의 배뇨중추(vlPAG, PMC, 척수 L4-L5)에서 신경활성 지표인 c-Fos와 혈관신생인자인 NGF를 평가하였다. 조직을 그룹별로 배뇨중추 부위 PMC, vlPAG, 척수(L4-L5)를 선택한 후 50 mM PBS로 5분 동안 3회 세척하였다. 세척 후, 30% H2O2 용액으로 20분간 반응시켰다.
50 mM PBS로 세척하고 항체와 반응하기 전에 차단 용액(5% non fat milk/TBST)으로 한 시간 동안 반응시켰다. c-Fos와 NGF 일차항체를 50 mM PBS에 0.5% BSA와 0.5% 아지드화나트륨을 함유한 일차 항체 용액에 1:1000의 비율로 희석한 후 24시간 이상 반응시켰다. 50 mM PBS로 세척한 후, 각각의 이차항체(secondary antibody)를 50 mM PBS에 0.3% Triton X-100을 함유한 이차 항체용액에 1:200의 비율로 희석한 후 1시간 동안 반응시켰다.
50 mM PBS로 세척한 후, 아비딘-비오틴 복합체(Vector Laboratories)에서 1시간 동안 반응시켰다. 50 mM PBS로 세척한 후, 50 mM Tris 완충액에 과산화수소와 DAB을 함유하는 발색제로 발색반응을 실시한 다음, 50 mM PBS로 세척하였다. 발색이 완료된 조직은 탈수과정을 걸쳐 Permount*(Fischer scientific)로 봉입시켰다.
8. 역전사 중합효소 연쇄반응(revers transcription polymerase chain reaction; RT-PCR)
배뇨장애 질환에 대한 마이크로버블에 탑재된 치료약물의 효용성을 평가하기 위해, 방광과 전립선 조직에서 iNOS, NGF, COX-2의 mRNA의 발현을 확인하였으며, 평가방법으로는 RT-PCR을 이용하였다. RNAzolTMB(TEL-TEST, Friendswood, TX, USA)를 이용하여 조직으로부터 전체 RNA를 분리하였다. 2 ㎍의 RNA와 3 ㎕의 랜덤 헥사머(Promega, Madison, WI, USA)를 함께 첨가하여 혼합물을 만들고, 이를 65℃에서 15분 동안 반응시켰다.
혼합물에 1 ㎕의 AMV 역전사효소(Promega), 5 ㎕의 2.5 mM dNTP(Promega), 0.5 ㎕의 RNasin(Promega)과 8 ㎕의 5 x AMV RT 버퍼(Promega)를 첨가하고, 전체 최종 부피가 40 ㎕가 되도록 디에틸파이로카르보네이트(DEPC)-처리 수를 첨가하였다. 그리고 이러한 반응 혼합물을 42℃에서 2시간 동안 반응시켰다. PTC-0150 MiniCycler(Bio-Rad, Hercules, CA, U.S.A.)를 이용하여, 2 ㎕의 cDNA, 0.5 ㎕의 10 pM 프라이머(up), 0.5 ㎕의 10 pM 프라이머(down), 4 ㎕의 10X RT 버퍼, 1 ㎕의 2.5 mM dNTP와 0.3 ㎕의 Taq DNA 중합효소(Takara, Shiga, Japan)를 포함하는 전체 부피 40 ㎕의 반응물을 통하여 PCR 증폭을 수행하였다.
PCR의 반응조건과 증폭수는 다음과 같다: 94℃에서 5분 동안 초기 변성, 94℃에서 30초 동안 변성, 58℃에서 30초 동안 어닐링, 72℃에서 30초 동안 연장, 이를 30 내지 35 사이클 진행하고, 마지막으로 72℃에서 10분 동안 연장 시행. Molecular analystTM version 1.4.1(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)을 이용하여 RT-PCR 생산물의 최종 양의 밀도를 계산하였다.
9. 결과
(1) 전립선 동물모델에서 약물투여 후 초음파 자극에 따른 전립선지수(prostate index) 미치는 영향
약물과 마이크로버블의 투여 후 초음파 자극에 따른 전립선 지수에 미치는 영향은 도 3에 나타내었다.
전립선 비대의 유발은 전립선 지수를 의미있게 증가시켰다. 그러나 탐수로신과 솔리페나신의 투여는 증가된 전립선 크기를 감소시키는 것으로 나타났으며, 약물투여 후 초음파를 노출시킨 집단에서 전립선 지수가 더 감소하는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 마이크로버블과 함께 투여한 약물이 초음파의 자극에 따라 전립선까지 전달하는 효과가 뛰어남을 의미한다.
(2) 전립선 동물모델에서 약물투여 후 초음파 자극에 따른 배뇨기능에 미치는 영향
약물과 마이크로버블 투여 후 초음파 자극에 따른 배뇨기능에 미치는 영향은 도 4에 나타내었다.
전립선 비대의 유발은 배뇨 시 수축압력(contraction pressure)과 배뇨 간 수축시간(interval contraction time)이 증가하는 것으로 나타났다. 반면에 탐수로신과 솔리페나신 투여 후 수축압력과 배뇨 간 수축시간이 감소하는 것으로 나타났으며, 초음파 자극 시 감소폭이 더 큰 것으로 나타났다. 이러한 결과는 마이크로버블과 함께 투여한 약물이 초음파의 자극에 따라 전립선까지 전달하는 효과가 뛰어남을 의미한다.
(3) 전립선 동물모델에서 약물투여 후 초음파 자극에 따른 염증성 사이토카인에 미치는 영향
약물과 마이크로버블 투여 후 초음파 자극에 따른 염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-1βIL-6 발현에 미치는 영향은 도 5에 나타내었다.
전립선 비대의 유발은 전립선 조직에서 염증성 사이토카인이 증가하는 것으로 나타났다. 반면에 탐수로신과 솔리페나신 투여 후 염증성 사이토카인이 감소한 것으로 나타났으며, 초음파 자극 시 감소폭이 더 큰 것으로 나타났다. 이러한 결과는 마이크로버블과 함께 투여한 약물이 초음파의 자극에 따라 전립선까지 전달하는 효과가 뛰어남을 의미한다.
(4) 전립선 동물모델에서 약물투여 후 초음파 자극에 따른 신경 성장 인자에 미치는 영향
약물과 마이크로버블 투여 후 초음파 자극에 따른 신경성장인자인 NGF(nerve growth factor) 발현에 미치는 영향은 도 6에 나타내었다.
전립선 비대의 유발은 전립선 조직에서 NGF가 증가하는 것으로 나타났다. 반면에 탐수로신과 솔리페나신 투여 후 NGF 발현이 감소한 것으로 나타났으며, 초음파 자극 시 감소폭이 더 큰 것으로 나타났다. 이러한 결과는 마이크로버블과 함께 투여한 약물이 초음파의 자극에 따라 전립선까지 전달하는 효과가 뛰어남을 의미한다.
(5) 전립선 동물모델에서 약물투여 후 초음파 자극에 따른 섬유화 인자에 미치는 영향
약물과 마이크로버블 투여 후 초음파 자극에 따른 섬유화 인자인 CTGF와 피브로넥틴 발현에 미치는 영향은 도 7에 나타내었다.
전립선 비대의 유발은 전립선 조직에서 섬유화인자가 증가하는 것으로 나타났다. 반면에 탐수로신과 솔리페나신 투여 후 섬유화 인자가 감소한 것으로 나타났으며, 초음파 자극시 감소폭이 더 큰 것으로 나타났다. 이러한 결과는 마이크로버블과 함께 투여한 약물이 초음파의 자극에 따라 전립선까지 전달하는 효과가 뛰어남을 의미한다.
(6) 전립선 동물모델에서 약물투여 후 초음파 자극에 따른 전립선에 전달 유효성 분석
약물과 마이크로버블 투여 후 초음파 자극에 따른 전달 유효성 평가는 도 8에 나타내었다.
형광 표지물질이 포함된 마이크로버블 투여 후 초음파 자극을 수행한 결과 약물과 함께 투여한 집단에 비해 초음파까지 자극한 집단이 전립선 조직에 잘 흡수 된 것으로 나타났다.
(7) 전립선 동물모델에서 약물투여 후 초음파 자극에 따른 배뇨중추 내 c-Fos 발현에 미치는 영향
약물과 마이크로버블 투여 후 초음파 자극에 따른 배뇨중추 내 c-Fos 발현에 미치는 영향은 도 9에 나타내었다.
전립선 비대의 유발은 배뇨중추영역인 MPA, vlPAG, PMC에서 c-Fos 발현이 증가한 것으로 나타났다. 반면에 탐수로신과 솔리페나신 투여 후 c-Fos 발현이 감소한 것으로 나타났으며, 초음파 자극 시 감소폭이 더 큰 것으로 나타났다. 이러한 결과는 마이크로버블과 함께 투여한 약물이 초음파의 자극에 따라 전립선까지 전달하는 효과가 뛰어남을 의미한다.
(8) 방광염 동물모델에서 약물투여 후 초음파 자극에 따른 영향
약물과 마이크로버블 투여 후 초음파 자극에 따른 방광 수축압과 시간 등에 미치는 영향을 도 10 및 11에 나타내었다.
약물투여 전체적으로 방광 수축압과 시간 등의 개선을 보였으나, 그 중 보톡스 투여군에서 좋은 배뇨기능 개선을 나타내었다.
초음파 자극 여부에 따른 변화는 방광 수축압과 시간이 초음파 비처리군에 비해 효용성이 뛰어난 것으로 나타났다.
(9) 방광염 동물모델에서 약물투여 후 초음파 자극에 따른 전염증성 사이토카인 발현에 미치는 영향
약물과 마이크로버블 투여 후 초음파 자극에 따른 전염증성 사이토카인 발현에 미치는 영향을 도 12에 나타내었다.
방광염의 유발은 전염증성 사이토카인의 증가를 보였고, 투여약물에서 모두 전염증성 사이토카인의 억제효과를 나타냈다.
초음파 자극 여부에 따른 변화는 보톡스 투여군에서 전염증성 사이토카인 억제에 차이가 있는 것으로 나타났다.
(10) 방광염 동물모델에서 약물투여 후 초음파 자극에 따른 성장 인자 발현에 미치는 영향
약물과 마이크로버블 투여 후 초음파 자극에 따른 성장 인자 발현에 미치는 영향을 도 13에 나타내었다.
방광염의 유발은 성장 인자의 증가를 보였고, 투여약물에서 모두 성장 인자의 억제효과를 나타냈다.
초음파 자극 여부에 따른 변화는 보톡스 투여군에서 성장 인자 억제에 유효성이 뛰어난 것으로 나타났다.
(11) 방광염 동물모델에서 약물투여 후 초음파 자극에 따른 염증관련인자 발현에 미치는 영향
약물과 마이크로버블 투여 후 초음파 자극에 따른 염증관련인자인 COX-2 및 iNOS 발현에 미치는 영향을 도 14에 나타내었다.
방광염의 유발은 염증관련인자인 COX-2 및 iNOS 발현의 증가를 나타내었고, 투여약물에서 모두 COX-2 및 iNOS의 억제효과를 나타냈다.
초음파 자극 여부에 따른 변화는 보톡스 투여군에서 COX-2 및 iNOS 억제에 차이가 있는 것으로 나타났다.
(12) 방광염 동물모델에서 약물투여 후 초음파 자극에 따른 AMPK 발현에 미치는 영향
AMPK(AMP-activated protein kinase)의 경우 염증 억제와 관련하여 주요 매개체로 여겨 이의 발현에 미치는 영향에 대하여 확인하였다.
약물과 마이크로버블 투여 후 초음파 자극에 따른 AMPK 발현에 미치는 영향을 도 15에 나타내었다.
방광염의 유발에 따라 감소된 AMPK에서 모든 약물투여 및 초음파자극에 따라 발현이 증가하였으나, 초음파 자극여부에 따른 주요한 차이는 나타나지 않았다.
(13) 방광염 동물모델에서 약물투여 후 초음파 자극에 따른 배뇨중추 내 c-Fos 발현에 미치는 영향
약물과 마이크로버블 투여 후 초음파 자극에 따른 배뇨중추 내 c-Fos 발현에 미치는 영향은 도 16에 나타내었다.
방광염의 유발은 배뇨중추 내 c-Fos 발현의 증가를 나타내었고, 이는 부위에 따라 투여약물에서 c-Fos의 억제효과에 차이가 있는 것으로 나타냈다.
초음파 자극 여부에 따른 변화는 PMC에서의 c-Fos 억제에 효능이 있는 것으로 나타났다.
(14) 방광염 동물모델에서 약물투여 후 초음파 자극에 따른 NADPH-d 분석 결과
약물과 마이크로버블 투여 후 초음파 자극에 따른 전체 NOS를 확인하기 위해 NADPH-d 염색을 MPA, PAG 및 PMC에 대하여 실시하고, 이의 결과를 도 17에 나타내었다.
방광염의 유발은 전체 NOS의 증가를 나타내었고, 이는 부위에 따라 투여약물에서 NOS의 억제효과에 차이가 있는 것으로 나타냈다.
초음파 자극 여부에 따른 변화는 PMC에서의 NOSs 억제에 효능이 있는 것으로 나타났다.

Claims (4)

  1. 표면 상에 배뇨장애 치료제가 탑재되어 있는 초음파유도 마이크로버블을 포함하는 배뇨장애 치료제 조성물로서,
    상기 치료제는 솔리페나신(Solifenacin), 보툴리눔 독소(Botulium-Toxin), 및 탐수로신(Tamsulosin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상이고,
    상기 치료제는 인지질 기반의 리포좀 나노입자 내부에 담지된 것이며,
    상기 마이크로버블은 인지질 기반의 리포좀에 불소 가스가 포함된 불화물 기체를 충진하여 만든 것이고,
    상기 마이크로버블은 강도가 1~2 w/cm2이고, 시간은 1~2분이며, 듀티 사이클은 20~60%인 초음파에 의해 표적 장기로 이동되고 파괴되는 것인, 배뇨장애 치료제 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 배뇨장애 치료제를 담지하는 리포좀 나노입자는 DPPC(1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phospho choline)와 DPPE(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine)를 배합하여 이루어진 것인, 배뇨장애 치료제 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 마이크로버블은 DPPC(1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phospho choline), DPPE(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine)와 DSPE-PEG-SPDP(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[PDP(polyethylene glycol)-2000]로 구성되는 리포좀에 불화물 기체를 충진하여 마이크로 크기화한 것인, 배뇨장애 치료제 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 배뇨장애는 과민성 방광, 전립선 비대, 저활동성 방광, 및 복압성 요실금으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인, 배뇨장애 치료제 조성물.
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