MX2010010635A - Tratamiento de la disfuncion de la vejiga usando toxina botulinum liposomal. - Google Patents

Abstract

Los liposomas se usan para el suministro de fármaco intravesical, especialmente suministro de toxina botulinum (BoNT) para ayudar a mejorar los síntomas del tracto urinario inferior al disminuir la irritación y frecuencia de la vejiga. El sistema usa una dosis inferior y más segura de BoNT con menor riesgo de retención urinaria. Una instilación simple de liposoma-BoNT como una formulación líquida en la vejiga, en un volumen típico de 30-60 ml, logrará eficacia similar a aquella actualmente alcanzada con la inyección de aguja cistoscópica de BoNT. La dosis puede ser menor que aquella hecha por la inyección, para de esta manera causar significativamente menos riesgo de retención urinaria. El liposoma-BoNT puede proteger al BoNT de la descomposición en la vejiga y la orina. La instilación de iiposoma-BoNT es más confortable para los pacientes y permite a mucho más consultorios de doctores ofrecer esta forma de tratamiento que de otra manera sería restringido a doctores expertos y certificados en la inyección de BoNT cistoscópica.

Description

TRATAMIENTO DE LA DISFUNCION DE LA VEJIGA USANDO TOXINA BOTULINUM LIPOSOMAL Campo de la Invención Esta invención está generalmente en el campo de tratamientos para la disfunción de la vejiga, especialmente vejiga hiperactiva refractaria.

Antecedentes de la Invención La incontinencia urinaria, o disfunción dé la vejiga, es la pérdida del control de la vejiga. Los síntomas pueden variar de fuga leve a mojadura incontrolable. Esto puede suceder a cualquiera, pero llega a ser más común con la edad. La mayoría de los problemas del control de la vejiga suceden cuando los músculos están demasiado débiles o demasiado activos. Si los músculos que mantienen la vejiga cerrada están débiles, puede haber fuga de orina cuando se estornuda, da risa o se levanta un objeto pesado. Esto ¡es la •incontinencia de esfuerzo. Si los músculos de la vejiga llegan a ser demasiado activos, hay una fuerte urgencia' para ir al baño cuando hay poca orina en la vejiga. Esta es la incontinencia de urgencia o vejiga hiperactiva. Hay 'otras causas de incontinencia, tales como problemas de próstata y daño a los nervios.

? El tratamiento depende del tipo del problema. Este puede incluir ejercicios simples, medicinas, dispositivos o procedimientos especiales prescritos por un doctor, o cirugía .

Las terapias intravesicales han sido un soporte principal en el tratamiento por muchos años (Parkin, y colaboradores, Urology 49, 105-7 (1997). La fármacoterapia intravesical proporciona altas concentraciones de fármaco local en la vejiga, bajo riesgo de efectos secundarios sistémicos y elimina el problema de bajos niveles de excreción urinaria con los agentes oralmente administrados. Un tiempo de instilación estándar de 30 min se ha probado con excelente tolerabilidad en los pacientes. Clínicamente, el dimetilsulfóxido (DMSO) (Rimso-50) es el único tratamiento intravesical aprobado por la FDA para el síndrome de vejiga dolorosa/cistitis intersticial (PBS/IC), que se cree qüe se tiene propiedades antiinflamatorias y efectos estabilizantes de los mastocitos (Sun y Chai, BJU Int 90, 381-5 (2002)'. Sin embargo las proporciones de éxito del DMSO son generalmente moderadas. El epitelio de la vejiga depende principalmente de I la presencia de una capa de glucosaminoglicano (GAG) de superficie y la integridad estructural del contacto de célula-célula, específicamente uniones herméticas, | para mantener la impermeabilidad a los desechos urinarios tóxicos (Parsons, y colaboradores, Science 208, 605-7 (1980). Cuando esta barrera es dañada, la fuga de los componentes de la orina en las capas de la vejiga implícitas inicia los cambios irritantes en la vejiga conduciendo a la estimulación de las i I fibras nerviosas sensoriales y el dolor, síntomas de urgencia y frecuencia (Lavelle, y colaboradores, Am J Physiol Renal Physiol 283, F242-53 (2002). El urotelio y GAG también presenta una barrera significante para el suministro de fármaco intravesical efectivo.

Aún más significante es la vejiga hiperactiva (OAB) que afecta 17% de hombres y mujeres en los Estados Unidos con incidencia incrementada con el envejecimiento, y tiene una carga económica estimada de 16.4 billones de dólares. Muchos expertos creen que 25% con OAB buscarán terapia médica. Conservativamente, se ha estimado que 25% de esos 4 Millones de pacientes OAB quienes buscan tratamiento fracasarán en la farmacoterapia oral y buscaran terapia para la OAB refractaria.

En los últimos años, varias medicaciones antimuscarínicas nuevas y formulaciones mejoradas para OAB han emergido. Hay seis agentes antimuscarínicos OAB aprobados por la FDA en 2008 con ventas globales de $2B por año. Sin embargo, menos de 20% de los pacientes permanecen en la terapia antimuscarínica debido a la eficacia limitada y los efectos adversos, tal como la boca seca, estreñimiento y disfunción cognoscitiva. Dos procedimientos frecuentemente implementados como terapia de segunda línea para pacientes refractarios antimuscarínicos son la estimulación del nervio sacro (SNS) aprobada por la FDA (Interstim, Medtronics ¡Inc.) y las inyecciones intra-detrusoras de BoNT que está en experimentos de FDA de Fase II para OAB refractaria (Bótox, Allergan Inc.)- Varios experimentos clínicos están siendo actualmente conducidos donde se administra toxina botulinum. La toxina botulinum se ha mostrado que es útil para tratar la vejiga hiperactiva refractaria (OAB), pero requiere un procedimiento cistoscópico para inyectar directamente la toxina en la pared de la vejiga. Puesto que la toxina se introduce en el músculo detrusor de la vejiga y puede debilitar la contractibilidad de la vejiga, hasta 43% de pacientes pueden desarrollar retención urinaria.

La industria farmacéutica también ha mostrado interés significante en desarrollar terapias para la urgencia y frecuencia urinaria asociada con la cistitis intersticial . Más recientemente, estas terapias han incluido el baqillus Calmette-Guerin (BCG) , resiniferatoxina (RTX) , ácido hialurónico (Cystistat), hialuronato de sodio (SI-7201), y dispositivos de estimulación del nervio sacro.

Hay una necesidad para ser capaz de simplemente · instilar la toxina botulinum (BoNT) sin la necesidad pára la inyección con aguja. Por otra parte, hay una necesidad para suministrar BoNT al revestimiento urotelial de la vejiga y el nervio sensorial terminal en concentraciones inferiores que pueden ayudar a mejorar los síntomas urinarios inferiores sin causar retención y/o debilidad del músculo de la vejiga.! También hay una necesidad en otras condiciones urológicas tal como la infección del tracto urinario y el cáncer de vejiga para el suministro de fármaco intravesical localizado con duración más larga del contacto del fármaco en í la vejiga.

No hay sistemas de suministro de fármaco sostenido comercialmente disponibles para la disfunción de la vejiga. Otros han intentado colocar un depósito en forma de globo o de material de matriz con fármacos en la vejiga para la liberación de fármaco sostenida pero estos métodos mecánicos causan irritación, dolor y pueden causar obstrucción mediante el bloqueo de la salida del cuello de la vejiga debido! a su tamaño y forma.

La experiencia clínica limitada con la instilación de BoNT intravesical no ha sido exitosa hasta ahora i Las posibles razones que implican la falta de eficacia de instilación de BoNT en la vejiga incluyen la degradaciqn por las proteasas en la orina, dilución en la orina o pobre i captación en el urotelio de la solución de BoNT instilada en el lumen de la vejiga. ! Por lo tanto es un objetivo de la presente invención proporcionar un método y composiciones para el suministro de fármacos mediante instilación en la vejiga para el tratamiento de OAB y otros desórdenes de la vejiga.

Breve Descripción de la Invención Los liposomas se utilizan para el suministro de fármaco intravesical , especialmente suministro de BoNT para ayudar a mejorar los síntomas del tracto urinario inferior al disminuir la irritación y frecuencia de la vejiga. El sistema usa una dosis inferior y más segura de BoNT con menor riesgo de retención urinaria, que la inyección.

Una instilación simple de liposoma-BoNT como una formulación líquida en la vejiga, en un volumen típico de 30-60 mi, logra eficacia similar a aquella actualmente alcanzada con la inyección de aguja cistoscópica de BoNT. La dosis puede ser menor que aquella hecha mediante la inyección, | para de esta manera causar significativamente menos riesgo de la retención urinaria. El liposoma-BoNT puede proteger al' BoNT de la descomposición en la vejiga y en la orina. 1 Ejemplos demuestran la eficacia de ( las formulaciones. i Descripción Detallada de la Invención 1 I . Formulaciones de Liposoma-Fármaco La encapsulacion de liposoma debe resolver los problemas con la pobre absorción después de la instilación. La encapsulacion de liposoma del BoNT puede proteger al BoNT de la degradación en la orina y permitir la absorción no impedida a través del urotelio de los liposomas que se I adhieren a la superficie de la vejiga. Puesto que el BC NT es atrapado dentro de los liposomas, este no es vulnerable a la dilución por la orina y las concentraciones localizadas de BoNT en la superficie de liposoma puede ser bastante alta para acelerar la entrada del BoNT lixiviado de los liposomas que se adhieren a la superficie del lumen de la vejiga.

A . Liposomas Los liposomas (LPs) son vesículas esféricas, compuestas de bicapas de fosfolípidos concéntricas separadas i por compartimientos acuosos. Los LPs tienen las j características de adhesión y creación de una película molecular sobre las superficies celulares. Los liposomas son vesículas de lípido compuestas de bicapas de fosfolípidos concéntricas que encierran un interior acuoso (Gregoriadis, y colaboradores, Int J Pharm 300, 125-30 2005; Gregoriadis y Ryman, Biochem J 124, 58P (1971)). Las vesículas de lípido í comprenden ya sea uno o varios compartimientos acuosos delineados por ya sea una (unilaminar) o varias (multilaminadas) bicapas de fosfolípidos (Sapra, y colaboradores, Curr Drug Deliv 2, 369-81 (2005)). El éxito de los liposomas en la clínica se ha atribuido a la naturaleza no toxica de los lípidos utilizados en su formulación. Tanto i la bicapa de lípido como un núcleo interior acuoso de los liposomas pueden servir para el propósito tratamiento] Los liposomas han sido bien estudiados como portadores de toxinas para aumentar su eficacia en dosis menores (Alam, y colaboradores, Mol Cell Biochem 112, 97-107 1992; Chaira- Matyas, y colaboradores, Biotechnol Appl Biochem 17 (Pt 1), 31-6 1993; de Paiva and Dolly, FEBS Lett 277, 171-4 (1990); Freitas y Frezard, Toxicon 35, 91-100 (1997); Mandal y lee, Biochim Biophys Acta 1563, 7-17 (2002)).

Los liposomas tienen la habilidad para formar! una película molecular sobre las células y la superficie del tejido y actualmente están siendo probados como posibles agentes terapéuticos para promover la sanación de heridas y la sanación del ojo seco como un sustituto de lágrima. Los estudios clínicos han probado la eficacia de los liposomas como un agente de sanación tópico (Dausch, y colaboradores, Klin Monatsbl Augenheilkd 223, 974-83 (2006); Lee, y i colaboradores, Klin Monatsbl Augenheilkd 221, 825-36 (2004)). Los liposomas también se han utilizado en la oftalmología para aminorar la queratitis, rechazo de transplante de la córnea, uveítis, endoftalmitis, y vitreoretinopatía proliferativa (Ebrahim, y colaboradores, 2005; Li, y colaboradores, 2007).

Los liposomas se han estudiado ampliamente ! como portadores de fármaco para una variedad de agentes quimioterapéuticos (aproximadamente 25,000 artípulos científicos se han publicado sobre el tema) (Gregoriadis, N Engl J Med 295, 765-70 (1976); Gregoriadis, y colaboradores, Int J Pharm 300, 125-30 (2005)). Las sustancias anticáncer solubles en agua tal como doxorubicina se pueden proteger dentro del compartimiento ( s ) acuosos de los liposomas delimitado por la bicapa(s) de fosfolipido, mientras que las sustancias solubles en grasa tales como anfotericina y capsaicina se pueden integrar en la bicapa de fosfolipido (Aboul-Fadl, Curr Med Chem 12, 2193-214 (2005); Tyagi, y colaboradores, J Urol 171, 483-9(2004)). El suministro tópico y vitreo de la ciclosporina fue notablemente mejorado con los liposomas (Lallemand, y colaboradores, Eur J Pharm Biopharm 56, 307-18 2003) . El suministro de agentes quimioterapéuticos condujo a la farmacocinética mejorada y perfil de toxicidad reducido (Gregoriadis , Trends Biotechnol 13, 527-37 (1995); Gregoriadis and Allison, FEBS Lett 45, 71-4 1974; Sapfa, y colaboradores, Curr Drug Deliv 2, 369-81 (2005) ) . Más de: diez formulaciones liposomales y basadas en lipido se han aprobado por las autoridades regulatorias y muchos fármacos liposomales están en desarrollo preclinico o en experimentos clínicos (Barnes, Expert Opin Pharmacother 7, 607-15 (2¡006) ; Minko, y colaboradores, Anticancer Agents Med Chem 6, 537-52 (2006)). Fraser, y colaboradores, Urology, 2003; 61: 656- 663 demostraron que la instilación intravesical de liposomas aumento las propiedades de barrera del urotelio disfuncional y parcialmente invirtió la alta frecuencia de micción en un modelo de rata de vejiga hiperactiva inducida al abrir el uroepitelio con sulfato de protamina y después de la irritación de la vejiga con KC1. Tyagi y colaboradores. J Urol, 2004; 171; 483-489 reportaron que los liposomas son un vehículo superior para la administración intravesical de capsaicina con menos inflamación inducida por el vehículo en comparación con etanol a 30%. Los datos de seguridad con respecto a la toxicidad aguda, subcrónica, y crónica de los liposomas se ha asimilado de la vasta experiencia clínica de la utilización de liposomas en la clínica para miles de pacientes. El uso seguro de los liposomas para la ' ruta clínica propuesta también es sustentado por su uso difundido como un vehículo para fármacos anticáncer en pacientes.

B. Toxina Botulinum (BoNT) y Otros fármacos para instilación La neurotoxina botulinum, que es producida por Clostridium botulinum, se considera como la toxina biológica más potente conocida para el hombre (Smith & Chancellor, J Urol, 171: 2128 (2004). BoNT se ha utilizado efectivamente para diferentes condiciones con hipercontracción muscular. Entre las siete neurotoxinas inmunológicamente distintas (tipos A ha G) , la BoNT-A es la toxina botulinum mucho más comúnmente utilizada clínicamente. En los últimos años,. BoNT-A y BoNT-B se han utilizado exitosamente para el tratamiento de pacientes lesionados en la medula espinal con hiperactividad de vejiga neurogénica utilizando la inyección de BoNT-A intradetrusora en múltiples sitios (Schürch y colaboradores, 2000) . : Efectos sobre ACh y la Inhibición de Liberación de Norepineprina : BoNT se ha conocido que ejerce efectos al inhibir la liberación de ACh en la unión neuromuscular asi como la neurotransmisión autonómica. Después de la inyección i intramuscular de BoNT se puede lograr la quimiodenervacion temporal y relajación muscular en el músculo esquelético asi como . en el músculo liso (Chuang & Chancellor, J Urol. 176(6 Pt l):2375-82 (2006)). Smith y colaboradores. (J Urol, 169: 1896 . (2003) ) encontraron que la inyección de BoNT en el esfínter uretral próximo de la rata causó disminuciones marcadas en la norepinefriña marcada en alta pero no en' baja estimulación de campo eléctrico, indicando que BoNT inhibe la liberación de norepinefriña en ' terminales de nervios autonómicas. 1 Efectos Sobre la Inhibición del Mecanismo Sensorial : Ha existido evidencia incrementada para sustentar la noción de que la BoNT también inhibe la neurotransmisión aferente en la vejiga (Chuang y colaboradores, J Urol, 172, 1529-32 (2004); Khera y colaboradores, Neurochem Int, 45:987 (2004)). Esta se ha mostrado que inhibe la liberación de los neuropéptidos , glutamato y adenosina trifosfato, qué son I mediadores de la sensación dolorosa (Cui y colaboradores, Pain, 107: 125 (2004)). Efectos similares se observaron en un modelo de hiperactividad de vejiga inducida con ácido acético. Los niveles disminuidos de los receptores I i sensoriales P2X3 y los receptores de vanilloide 1 potenciales de receptor transiente (TRPV1) en las fibras nerviosas suburoteliales asociadas con la urgencia disminuida después de las inyecciones intradetrusoras de BoNT se han encontrado en la hiperactividad detrusora humana (Apostolidis y colaboradores, J Urol, 174: 977 2005) .

La proteina objetivo para BoNT es una proteína de membrana integral que reside en un ambiente de lípido. Los liposomas pueden aumentar la actividad de las metaloproteasas tal como BoNT al permitir la adhesión más fuerte al urotélio. Las inyecciones guiadas con cistoscopio es la práctica estándar actual en la clínica para, administrar BoNT ¡a la vejiga. En años recientes, estudios han estimado el potencial de la instilación intravesical de BoNT en modelos de animales de irritación de la vejiga (Khera, y colaboradores, Urology 66, 208-12 (2005) ) . Reportes previos en la literatura sugieren que la actividad metaloproteolít ica del j BoNT específica para VAMP es fuertemente aumentada por la presencia de membranas de lípido. Este efecto proporciona una explicación para el lecho de que estas neurotoxinas son más activas sobre el VAMP insertado en las vesículas de lípido y en las neuronas que sobre la molécula de VAMP aislada.; Este efecto aumentador de lípido es originado por los lípidos. Esta investigación fuertemente sustenta la exposición razonada para utilizar el liposoma como un vehículo de suministro para la instilación de BoN . ' Otros fármacos que pueden ser instilados en la vejiga también- pueden ser suministrados utilizando el sistema de suministro de liposoma, especialmente aquellos que tienen efectos secundarios sistémicos que son evitados por el suministro local.

Los fármacos o agentes activos adecuados que pueden ser suministrados utilizando el sistema de suministro de liposoma divulgado incluyen, pero no están limitadots a, sustancias terapéuticas de cáncer, inmunomoduladores , analgésicos, agentes anti-inflamatorios , antihistaminas, endorfinas, prostaglandina, receptores de TRP canaboides, péptidos, proteínas y anticuerpos, plásmidos, DNA desnudo, vectores virales, RNA, siRNA, aminoácidos; ácido hialurónico; polisulfato de pentosan sódico, agonistas y antagonistas del receptor beta 3, agonistas y antagonistas del receptor de Ghrelina y anestésicos locales tal como lidocaína.

Las sustancias terapéuticas de cáncer ejemplares incluyen cisplatina, carboplatina , mitomicina, oxaliplatina , meclometamina, ciclofosfamida , clorambucilo, vincristina, paclitaxel, vinblastina, doxorubicina , metotrexato, vinorelbina, vindesina, taxol y derivados de los mismos, i irinotecan, topotecan, amsacrina, etoposido, fosfato de i etoposido, teniposido, epipodofillotoxinas, trastuzumab (HERCEPTIN®) , cetuximab, y rituximab (RITUXAN® o MABTf-ÍERA®) , bevacizumab (AVASTIN®) , y combinaciones de los mismos. ; Los inmunomoduladores ejemplares incluyen interferona y el bacilo Calmette-Guerin .

Las composiciones de suministro de fármaco divulgadas también se pueden utilizar para suministrar fármacos adecuados para tratar la cistitis intersticial, síndrome de vejiga dolorosa, vejiga hiperactiva, cáncer de i vejiga, cáncer de próstata e infecciones del tracto urinario causadas por bacterias, hongos o virus. j II. Métodos de Fabricación , Fabricación de liposomas : Los métodos de fabricación de los liposomás se describen en la literatura citada en lo anterior y soni bien conocidos. i En una modalidad, la suspensión de liposoma acuosa se produce mediante microfluidización . El producto final puede ser sometido a una serie de problemas de estabilidad i tal como agregación, fusión e hidrólisis de fosfolipidos (Nounou, y colaboradores, Acta Pol Pharm 62, 381-91 (200(5) ) . i El producto liposomal debe poseer estabilidad química y física adecuada antes de que se pueda alcanzar su beneficio clínico (Torchilin, Adv Drug Deliv Rev 58, 1532-55 (2005) ) . En una modalidad preferida, los liposomas deshidratados se forman de una dispersión homogénea de fosfolípido en un sistema de cosolvente de alcohol1 ter- butílico (TBA)/agua. La solución monofásica isotrópicá de liposomas se seca por congelación para, generar polvo liposomal deshidratado en un frasquito estéril. La etapa de secado por congelación deja las vesículas de lipido vacías o los liposomas deshidratados después de remover tanto el agua como el TBA de frasquito. En la adición de la solución salina fisiológica, el producto liofilizado espontáneamente forma una preparación de liposoma homogénea (A selem, y colaboradores, J Pharm Sci 79, 1045- 52 (1990); Ozturk, y colaboradores, Adv Exp Med Biol 553, 231-42 (2004)), Las bajas concentraciones de lipido trabajan idealmente para este método debido a que la relación de lipido y TBA es el factor clave que afecta el tamaño y la polidispersividad de la preparación de liposomas resultante.

Preparación para BoNT Liposomal: En una modalidad preferida, el BoNT Liposomal ("LPA-08") se prepara mediante un método de deshidratación-rehidratación con modificaciones ligeras. Los liposomas preparados en la etapa previa se hidratan con una solución de BoNT en agua para inyección (50 unidades/ml) a 37°C. Luego la mezcla se incuba durante 2h a la temperatura de 37°C utilizando un baño de agua para formar liposomas de hidratación oligolamina . Se adiciona manitol a la ¡mezcla final en una concentración de 0.5%, 1%, 2.5% y 5% de manitol (p/v) , respectivamente antes de la congelación en el baño de acetona/hielo seco. El manitol actúa como un crioprotector en el proceso de secado por congelación. La mezcla congelada se liofiliza a -40°C y 5 milibar durante la noche. La torta liofilizada se resuspende con solución salina a: la concentración final de BoNT . La BoNT libre se remueve de la BoNT atrapada mediante centrifugación a 12,000xg durante 30 min utilizando una ultracentrifuga . Después de lavar tres veces, los precipitados nuevamente se resuspenden en solución salina. i La formulación de las toxinas bacterianas potentes en liposomas requiere un procedimiento meticuloso. BoNT no se puede exponer a solventes orgánicos que son generalmente utilizados en la fabricación de liposomas. Se hicieron ejemplos utilizando el método de hidratación de película delgada y el lípido dipalmitoil osfatidilcolina (DPPC) . Brevemente, una solución de DPPC en cloroformo primero se evaporó bajo una corriente delgada de nitrógeno en un matraz de fondo redondo. La película de lípido se secó durante la noche bajo vació. Los lípidos secos luego se hidrataron con solución de BoNT acuosa. ' Resultados óptimos se obtienen al controlar cuidadosamente la relación de BoNT al lípido, como es demostrado enseguida en el Ejemplo 2. La relación óptima y la composición de lípido se pueden determinar utilizando la experimentación de rutina, como es demostrado por1 este estudio.

III . Stuninistro de BoNT Liposomal La instilación de liposoma-BoNT es más confortable para los pacientes y permite a mucho más consultorios de doctores ofrecer esta forma de tratamiento que de otra manera seria restringida a doctores expertos y certificados en la inyección de BoNT cistoscópica . La BoNT es una molécula grande y no penetra las capas celulares para alcanzar el músculo y la terminal nerviosa. La instilación · de BoNT s,in el uso de liposomas de otra manera requeriría agentes cáusticos tal como protamina que podrían dañar el revestimiento de la vejiga. Esto no es aprobado por la FDA y . puede causar dolor y daño de la vejiga. La instilación de BoNT puede bajar el costo del tratamiento para pacientes de vejiga hiperactiva refractaria. Varios estudios reportados de diferentes laboratorios han estimado el potencial de instilación intravesical de BoNT en modelos de animales de irritación de la vejiga (Chuang, y colaboradores., 2004; Khera, y colaboradores, 2005) . Sin embargo, la experiencia clínica limitada con la instilación intravesical de BoNT ha sido no i exitosa. La encapsulacion de liposoma resuelve los problemas i con la doble absorción después de la instilación. Puesto que la BoNT es atrapada dentro de los liposomas, esta no es vulnerable a la dilución por la orina y la concentración localizada en BoNT en la superficie de liposoma es bastante i i i alta para apresurar la difusión pasiva de la BoNT lixiviada de los liposomas adherentes sobre la superficie de la vejiga. La barrera de lipido de los liposomas también puede prevenir el acceso de proteasas y proteinazas en la orina de la segmentación del BoNT antes de que sea absorbida por la vej iga .

Métodos de instilación son conocidos. Ver, por ejemplo, Lawrencia, y colaboradores, Gene Ther 8, 760-8 (2001) ; Nogawa, y colaboradores, J Clin Invest 115, 978-85 (2005); Ng, y colaboradores, Methods Enzymol 391, 304-13 2005; Tyagi, y colaboradores, J Urol 171, 483-9 (2004); Trevisani, y colaboradores, J Pharmacol Exp Ther 309, 1167-73 (2004); Trevisani, y colaboradores, Nat Neurosci 5, 546-51 (2002) ); (Segal, y colaboradores, 1975). (Dyson, y colaboradores, 2005). (Batista, y colaboradores, 2005; Dyson, y colaboradores, 2005) . 1 El volumen de liposoma-BoNT es importante en la eficacia de suministro, como es demostrado por el ejemplo 1, enseguida. La experimentación de rutina se puede utilizar para optimizar el volumen de suministro.

Los liposomas divulgados también se pueden utilizar para instilar agentes terapéuticos a otros sitios tal como el tacto urinario incluyendo la uretra, vejiga, uréter y sistema de recolección intrarrenal; sitios ginecológicos tal como la vagina, útero, tubo de falopio; sitios gastrointestinales incluyendo la boca, esófago, estómago, intestino, colon, recto, ano; y el oído externo o interno; piel, nariz.

La presente invención además será entendida' por referencia a los siguientes ejemplos no limitativos. 1 Ejemplo 1: Efecto de la distensión de la vejiga sobre la absorción de la BoNT liposomal después de la instilación.

Materiales y Métodos El efecto de la distensión de la vejiga sobre la absorción de BoNT liposomal después de la instilación se I determinó al instilar la misma dosis de BoNT liposomal en volúmenes incrementados. Las ratas se instilaron con liposomas hechos con las mismas composiciones de lípidos y BoNT (0.5mg de lípido por cada unidad de BoNT) en diferente volumen de instilaciones (0.5, 0.55, 0.6ml). Los liposomas se instilaron en la vejiga de la rata bajo anestesia de halotano con un tiempo de residencia de 30min; los animales luego se dejaron recuperar, se les dio alimento y agua y se alojaron en jaulas. 24 horas después bajo la anestesia de uretano (dosis 1.0 g/kg de peso corporal), la cistometría abierta transuretral se realizó en las ratas tratadas al infusionar solución salina en la proporción de 0.04ml/min. Después de obtener una línea de base normal durante una hora, | ácido acético (0.25%) en solución salina se infusionó para inducir la irritación de la vejiga. Siete días despuéjs del tratamiento con BoNT con diferentes volúmenes de instigación, el efecto de la distensión de la vejiga se estimó mediante la cistometria transuretral continua bajo anestesia con uretano.

Resultados Las ratas instiladas con un volumen estándar de 0.5ml, mostraron CMG regular sobre la anulación del reflejo inducida por la infusión constante de solución salina en la proporción de 0.08ml/min. Sin embargo, las ratas infusionadas con la misma dosis de BoNT liposomal en un volumen más : alto de 10-20% de instilación (0.55ml. o 0.6ml de volumen de instilación) mostraron características de continencia de sobreflujo bajo la cistometria salina.

El bajo volumen de la instilación restringe el efecto de la BoNT al urotelio solamente, de un incremento de 10-20% en el volumen de instilación notablemente reduce la barrera a la absorción y permite a la BoNT alcanzar el músculo detrusor después de la instilación. Las 'ratas instiladas con el altos volúmenes de BoNT liposomal mostraron retención urinaria en la condición despierta e incontinencia de sobreflujo bajo condición anestesiada para indicar fuerte supresión de la anulación de reflejo. Es interesante observar que la incontinencia de sobreflujo bajo condición anestesiada refleja una característica deseable para los fármacos que actúan sobre el brazo aferente del reflejo de micción. La incontinencia de sobreflujo bajo condición anestesiada se traduce en la entrada aferente reducida bajo la condición despierta.

La BoNT es una molécula grande con un peso molecular de 150 KD, asi la difusión puede ser grandemente excluida como un mecanismo de absorción. La endocitosís es más probablemente el mecanismo en la absorción de la vejiga. Estudios previos han mostrado que la endocitosís en la célula de cobertura del urotelio se incrementa con estímulos externos tal como presión hidrostática . Las proporciones de endocitosís y exocitosis durante el llenado de la vejiga son tales que el efecto neto es adicionado a la membrana e incrementa el área de superficie del urotelio para ajustarse al estiramiento de la vejiga. Por lo tanto probablemente hay más actividad endocitótica después del estiramiento de la i vejiga para causar la captación por la vejiga mejorada de la BoNT.

Ejemplo 2: Efecto de la Relación de Lipido a BoNT Para la eficacia óptima de la BoNT, el lípidó y la toxina tiene que estar en la relación óptima.

Materiales y Métodos La BoNT liposomal se preparó con diferentes relaciones de lipido, manteniendo la relación de BoNT fijada. Por ejemplo, iniciando con 25 IU de BoNT, las ratas se instilaron con liposomas hechas con las mismas composiciones de lipido y BoNT (0.5mg de lipido por cada unidad de BoNT) en diferentes volúmenes bajo anestesia con halotano. Lat dosis intravesícal de BoNT se mantuvo constante y la concentración de lípido se varió para determinar la relación óptima de toxina : lipido. La eficacia de la BoNT liposomal se comparó i contra la BoNT libre en solución salina. La habilidad para i mitigar la irritación de la vejiga inducida por ácido acético 7 días después de la instilación se probó en ratas anestesiadas con halotano. El intervalo de 7 días entre la instilación y la evaluación de la eficacia se seleccionó basado en estudios publicados (Chuang, y colaboradores, 2004) . j Resultados i Una relación óptima de 1:0.5 de toxina a lipido es efectiva en aumentar la eficacia de la BoNT después de la instilación intravesícal. La eficacia reducida en la relación de lípido más alta puede ser debido a la liberación muy 'lenta de la BoNT de los liposomas multilaminares conduciendo una captación ineficaz de la BoNT en la vejiga. j Ejemplo 3: Evaluación de los efectos urodinámicbs e i inmunohistoquimicos del suministro liposomal de BoNT-A intravesícal en la hiperactividad de la vejiga inducida por ácido acético en ratas .

Materiales y Métodos Preparación de liposomas (LPs) , toxina Botulinum A (BoNT-A) , y Lipotoxina (LPs+BoNT-A) : los LPs (10 mg, Lipoid) se dispersaron en solución salina fisiológica (1 mi), 'donde la dispersión esta en forma liposomal. BoNT-A se disolvió en solución salina fisiológica (1 mi, 20u/ml en solución salina, Allergan, Irvine, CA) . Los LPs que encapsulan BoNT-A (referida como Lipotoxina) se prepararon mediante un método de vesículas de deshidratación-rehidratación modificado que carga 20 unidades de BoNT-A en lOmg de dispersión de LPs (1 mi) (Gregoriadis, y colaboradores, Methods 19, 156-62 1999) . La dosis de BoNT-A permaneció la misma en diferentes grupos de animales.

Cistometrograma (CMG) : Todos los procedimientos experimentales se realizaron en ratas Sprag'ue-Da ley hembras (220-280 gm) y se revisaron y se aprobaron por el Institutional Animal Care and Use Committee antes del comienzo del estudio. Los animales se anestesiaron mediante la inyección subcutánea de uretano (1.2 g/kg) . La tubería PE-50 se insertó en la vejiga a través de la uretra y se conectó por la vía de un grifo de tres vías a un transductor de presión y a una bomba de jeringa para registrar la presión intravesical y para infusionar las soluciones en la vejiga. En el día 1, un CMG de control se realizó al llenar la vejiga con solución salina (0.08 ml/min) para inducir el vaciado repetitivo. La amplitud, umbral de presión (PT), línea de í base de presión (PB) y el intervalo de intercontracción (ICI) de las contracciones de la vejiga de reflejo se registraron. Las mediciones en cada animal representaron el promedio de 3 a 5 contracciones de la vejiga.

En el día 8, después de que se estableció, una medición de la linea de base durante la infusión de solución salina, los inventores infusionaron ácido acético (AA) a' 0.3% en la vejiga en 0.08 ml/min para promover agudamente la hiperactividad de la vejiga. 3 a 5 contracciones de la vejiga se midieron después de 30 min de la infusión.

I Instilación de fármacos: En el día 1 después del C G de linea de base, la tubería PE-50 (Clay-Adams, Parsippany, NJ) se ató en el lugar mediante una ligadura alrededor del orificio uretral bajo anestesia de halotano, la vejiga se vació de orina, y se llenó con LPs, BoNT-A o Lipotoxina durante 1 hora a través del catéter.

Perfusión transcardiaca: En el día 8 después del estudio de CMG, algunos animales (N=6, para cada grupo) se anestesiaron intensamente y se sacrificaron por la vía Jde la perfusión, transcardíaca, primero con solución reguladora de Krebs seguido por el paraformaldehído fijativo al 4%'. Los animales luego se diseccionaron para obtener la vejiga.

Histología: Los tejidos de la vejiga para la histología se fijaron en paraformaldehído al 4% en solución i salina regulada con fosfato (PBS) durante 4 horas, y luégo en sacarosa al 30% en PBS durante la noche. Las muestras pára la. histología se incrustaron en parafina, se cortaron en piezas gruesas de 10 µ?t? y se mancharon con H & E. La reacción I inflamatoria inducida por AA se clasificó por un registro de 0-3 como sigue: 0, no evidencia de infiltrados de células inflamatorias o edema intersticial; 1, leve (pocos infiltrados de células inflamatorias y poco edema intersticial); 2, moderado (cantidad moderada de infiltrados de células inflamatorias y edema intersticial moderado) ; 3, severo (presencia difusa de cantidad grande de infiltrados de células inflamatorias y edema intersticial severo) . < Microscopía de inmunofluorescencia para CGRP y SNAP-25: Alternativamente, las muestras se congelaron1 y se montaron en el medio de montaje de Tissue-Tek OCT (Sakura Finetek, Torrance, CA, USA) ; secciones longitudinales gruesas de ??µp? se cortaron en un criostato y se montaron sobre platina SuperFrost. · Las secciones se fijaron mediante inversión en acetona durante 15 minutos, luego se lavaron en solución salina regulada de fosfato (PBS) y se bloqueó la actividad de peroxidasa endógena al incubar las platinas en i solución de H202 al 0.3% en PBS durante 10 minutos. Después del lavado adicional en PBS en la sección se incubaron1 en el aumentador de señal fija y Image-iTTW (Molecular Probes, Invitrogen) durante 1 hora. Para el inmunomanchado de CGRP, las platinas luego se mancharon con anticuerpo polidonal anti-CGRP de cabra (Santa Cruz, 1:50 dilución) a +4°C durante 48 hrs. Al siguiente día las secciones se lavaron en PBS y se incubaron con FITC IgG anti-cabra de asno (Santa Cruz, I ? i dilución 1:2000) durante 1 hora. Las secciones se lavaron y se montaron en los reactivo de oro anti desvanecedor SlowFade ( (Molecular Probes, Invitrogen) . Para el inmunomanchado de SNAP-25, las platinas luego se mancharon con anticuerpo monoclonal anti-SNAP-25 de ratón (AbD, NC, USA, dilución 1:2000) a +4°C durante la noche. Al siguiente día las secciones luego se lavaron en PBS y se incubaron con Alexa Fluor 488 IgG anti-ratón de cabra (Molecular Probes, Invitrogen, dilución 1:2000) durante 1 hora. Para detectar las fibras musculares, las secciones se contramarcharon con faloidina marcada con isotiocianato de tetrametilrodamina (TRITC) (Sigma, dilución 1:2000), se lavaron y se montaron en el reactivo de oro antidesvanecedor SlowFade ( (Molecular Probes, Invitrogen) . Las platinas se examinaron cón un microscopio de fluorescencia para registrar la imagen.

Análisis de manchado de Western para la expresión de SNAP-25: Algunos animales (N=6, para cada grupo) se anestesiaron intensamente y se sacrificaron sin perfusión transcardiaca. Las vejigas se removieron para el análisis de manchado de western de la expresión SNAP-25 de acuerdo con el i protocolo estándar (Amersham Biosciences) . Las muestras se homogenizaron en solución de extracción de proteina (T-PER; Pierce Biotechnology) antes de la sonicación y purificación. La cantidad de proteina total se midió con el método de ensayo de proteina Bradford (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) . La electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS (PAGE) se realizó utilizando el sistema regulador de Laemmli.

Brevemente, una alicota de los extractos equivalente a 30 g de proteína se cargó sobre gel de poliacrilamida de 8%, se sometió electroforesis en un voltaje constante de 1 100V durante Ih y se transfirió a la Membrana Hybond-P PVDF (Amersham Biosciences) . La membrana se bloqueó con agente' bloqueante y luego se inmunomanchó durante la noche a +4C con anticuerpo monoclonal anti-SNAP-25 de ratón (AbD, NC, : USA, dilución 1:500) y el anticuerpo monoclonal ant?-ß-actina de ratón (Rockland, Gilbertsville, USA, dilución 1:2000). Después del lavado, la membrana se incubó con anticuerpos secundarios utilizando polvo de leche desgrasada al 5% en TBS durante 2 hr a temperatura ambiente utilizando: una inmunoglobulina G anti-conejo antiratón enlazada a peroxidasa de rábano picante. Los manchados de western se visualizaron mediante el sistema de detección de quimioluminiscencia aumentado (ECL) (Amersham Biosciences) . La cantidad ;de ß-actina también se detectó como el control internó. El análisis cuantitativo se hizo utilizando el software de Adquisición y Análisis de Imagen Works. j Análisis estadístico : Los datos cuantitativos se expresaron como medias más o menos error estándar |de la media. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando ANOVA de una vía con las post-pruebas de Bonferroni o i I Kruskal- allis con la post-prueba de Dunn' s donde es aplicable, con p < 0.05 considerado significante.

Resultados Respuesta de CMG al pretratamiento de LPs , BoNT-A y Lipotoxina : Los parámetros de CMG en el grupo de LPs (grupo de control), BoNT-A, y Lipotoxina durante la instilación salina intravesical en el día 1 no fueron significativamente diferentes de aquel en día 8. Estos resultados indican que la función de la vejiga en el día bajo condición normal n;o fue afectada por el pretratamiento de LPs, BoNT-A, y Lipotóxina. En el día 8, el efecto irritante del ácido acético fue evidente 20 a 30 min después del inicio de la infusión. En los grupos, pretratados con LPs y BoNT-A, el intervalo de intercontracción (ICI) fue significativamente disminuido por 57.2% y 56.0% respectivamente después de la instilación intravesical de AA. Sin embargo, las ratas que recibieron antes el tratamiento con Lipotoxina mostraron una respuesta significativamente reducida (disminución de 21.1% de ICI) a la instilación de AA. Estos resultados indican que el pretratamiento de Lipotoxina suprimió la hiperactividad ; de la vejiga inducida por AA, el efecto que no se observó en la i dosis idéntica del grupo, de pretratamiento de BoNT-A.

Respuesta histológica al pretratamiento de LPs, BoNT-A y Lipotoxina: La instilación de AA indujo la reacción i I inflamatoria moderada en los grupos pretratados con LPs y BoNT-A como es determinado por la evaluación histopatológica de la sección de tejido manchada con hematoxilina y eosina. Sin embargo, la reacción inflamatoria inducida por AA fue significativamente disminuida en el grupo pretratado con Lipotoxina (registro inflamatorio total disminuido por 48.9% y 33.3% con relación al grupo pretratado con LPs y BbNT-A respectivamente) . Estos resultados indican que el pretratamiento de Lipotoxina inhibe la inflamación de la vejiga inducida por AA.

Inmunomanchado de C6RP sobre el pretratamiento de LPs, BoNT-A y Lipotoxina: el inmunomanchado de CGRP se confirmó en la capa mucosal de la vejiga en el grupo i pretratado con Lipotoxina, que no se observó en el ,grupo pretratado con LPs o BoNT-A. Estos resultados sugieren que el pretratamiento con Lipotoxina inhibe la liberación de CGRP.

Expresión de SNAP-25 sobre el pretratamiento de LPs, BoNT-A y Lipotoxina: las fibras neuronales positivas de SNAP-25 se detectaron en las muestras de la vejiga de animales pretratados con LPs y BoNT-A. Sin embargo,1 las fibras neuronales positivas de SNAP-25 fueron raramente observadas en los animales pretratados con Lipotoxina. El manchado de Western demostró que el nivel de proteínas de SNAP-25 medio fue 66.4% disminuido y .58.1% disminuido comparado con el grupo pretratado con LPs y BoNT-A, respectivamente. Estos resultados indican que el pretratamiento con Lipotoxina disminuyó la expresión de SNAP-25. ! Conclusión : El intervalo de intercontracción (ICI) fue 57,.2% y 56.0% disminuido después de la instilación intravesical de AA en las ratas pretratadas con LPs y BoNT-A, respectivamente. Sin embargo, las ratas que recibieron Lipotoxina mostraron una respuesta significativamente reducida (disminución de 21.1% de ICI) a la instilación de AA. Además, las (ratas pretratadas con Lipotoxina tuvieron una disminución significante en la reacción inflamatoria y la expresión de SNAP-25 y un incremento en la inmunoreactividad de CGRP comparado con las ratas pretratadas con LPs o BoNT-A. La administración de Lipotoxina intravesical segmentó la SNAP-25 e inhibió la liberación de CGRP de las terminales nerviosas aferentes y bloqueó la vejiga hiperactiva inducida por AA.

Estos resultados sustentan los LPs como un vehículo eficiente para el suministro de BoNT-A sin la necesidad por inyección y evitan el efecto sobre el detrusor.

Lo mayores descubrimientos del presente estudio son que el pretratamiento de Lipotoxina intravesical suprimió la hiperactividad de la vejiga inducida por AA y la reacción inflamatoria, los efectos que no se observaron en los 'grupos pretratados con LPs y BoNT-A en este modelo de animalJ No se observó retención urinaria. Además, la expresión de SNAP-25 fue significativamente reducida y CGRP fue significativamente incrementado en el grupo pretratado con Lipotoxina comparado con los grupos pretratados con LPs y BoNT-A en este modelo. La instilación de Lipotoxina intravesical puede proporcionar un método más simple y efectivo para suministrar BoNT-A sin la necesidad por inyección que puede causar retención urinaria.

Claims (10)

REIVINDICACIONES ' i

1. Una formulación liposomal, caracterizada pprque comprende botulinum en un portador farmacéuticamente aceptable para la instilación en la vejiga, en donde la formulación está en un volumen que maximiza la captación o en donde la relación de toxina botulinum a lipido es de hasta 1:0.5.

2. La formulación de conformidad con' la reivindicación 1, caracterizada porque la relación de botulinum a lipido se ajusta a 0.5:1. ]

3. La formulación de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque está en un volumen de entre 30 y 60 mi.

4. Una formulación liposomal, caracterizada porque comprende botulinum en un portador farmacéuticamente aceptable para la instilación en la vejiga, en donde el liposoma se prepara mediante la rehidratación después del secado por congelación usando una solución acuosa' que comprende la toxina botulinum.

5. La formulación de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque se adiciona un crioprotector al liposoma antes del secado por congelación. i

6. La formulación de conformidad corl la I reivindicación 5, caracterizada porque el crioprotectpr es manitol adicionado en una concentración de 0.5% a 5% (p/v) .

7. La formulación de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque la toxina botulinum libre que no es atrapada es removida de los liposomas.

8. La formulación de conformidad coa la reivindicación 1 o 5, caracterizada porque el liposoma comprende dipalmitoil fosfatidilcolina .

9. La formulación de conformidad con la reivindicación 1 o 5, caracterizada porque la toxina botulinum es uno o más de los siete serotipos.

10. Un método para tratar la vejiga hiperactiva, caracterizado porque comprende instilar en la vejiga una cantidad efectiva de toxina botulinum en un portador liposomal como es definido por cualquiera de las reivindicaciones 1-9. I