KR20100131471A - 리포솜 보톨리눔 독소를 이용한 방광기능장애의 치료 - Google Patents

Abstract

리포솜은 방광내 약물전달, 특히 방광 자극 및 빈도를 줄임으로써 하부요로 증상을 개선하는데 유용한 BoNT의 전달을 위하여 사용된다. 본 시스템은 주사보다도 소변정체의 위험성이 더 낮은, BoNT의 저투여량 및 안전한 투여량을 사용한다. 액상 제재인 리포솜-BoNT을 30-60ml의 체적으로 방광내로 간단히 점적주입하면, BoNT를 바늘주사로 주입한 것과 유사한 효과를 얻을 수 있다. BoNT의 투여량은 주사에 의한 투여량보다 더 낮을 수 있고, 이에 따라 소변정체의 위험을 더 낮춘다.
리포솜-BoNT는 BoNT를 방광 및 소변 쇠약으로부터 보호할 수 있다. 리포솜- BoNT의 점적주입은 환자에게 더욱 편안하고, 방광경적 BoNT 주사로숙련되고 인정받은 의사들에 의해 한정된 것에 비하여 더 많은 의사들에게 치료 형태를 제공하게 한다.

Description

방광 기능 장애 치료방법{METHOD OF TREATMENT FOR BLADDER DYSFUNCTION}

본 발명은 방광 기능 장애, 특히 난치성 과민성 방광의 치료에 관한 것이다.

요실금(urinary incontinence), 또는 방광 기능장애는, 방광 통제의 불능이다. 증상은 미약한 누설에서부터 통제 불능의 배뇨에 이르기까지 다양하다. 그것은 누구에게나 일어날 수 있지만 나이가 들어감에 따라 보편적인 현상이 된다. 대부분의 방광통제 문제는 근육이 너무 약하거나 지나치게 민감할 때 생긴다. 방광 폐쇄 근육이 약한 경우, 재채기할 때, 웃거나 무거운 물체를 들어올릴 때, 소변 누설이 있을 수 있다. 이것은 스트레스 요실금이다. 방광 근육이 너무 민감할 경우, 약간의 소변이 방광에 있을 때 화장실에 가고 싶은 강한 충동이 있다. 이것은 절박성 요실금(urge incontinence)이나 과민성 방광이다. 전립선(prostate)의 문제 및 신경 손상 등과 같은 요실금의 다른 원인이 있다.

치료는 문제의 유형에 따른다. 그것은 간단한 운동, 약제, 특수 장치 또는의사에 의한 처방 또는 수술을 포함할 수 있다.

방광 요법은 수년간 치료의 근간이 되어 왔다. (Parkin, 외, 비뇨기과 49, 105-7 (1997)). 방광 약물요법(Intravesical pharmacotherapy)은 방광에, 국부적인 높은 약물 농도, 조직의 부작용의 저 위험성을 제공하고, 경구 투여제로써 저 수준의 배뇨 문제를 제거한다. 30분의 표준 방울주입시간(instillation time) 시험에서 환자에게 우수한 참을성(tolerability)을 제공하였다.

임상적으로, 디메틸술폭시드(dimethylsulfoxide, DMSO) (Rimso-50)는 고통스러운 방광 증후군/간질성 방광염(PBS/ C)의 방광치료제로서 FDA가 승인한 유일한 것이고, 항염증 특성(anti-inflammatory)과 비만 세포 안전화 효과를 가지고 있는 것으로 알려져 있다(SUN and Chai BJU int 90, 381-5(2002)). 그러나 DSMO의 성공율은 일반적으로 높지 않다. 방광 상피는 독성 비뇨기 폐기물(urinary wastes)에 대한 불투과성을 유지하기 위해 방광 상피가 표면 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycan: GAG)층과 세포간 접촉의 구조적 통합성(integrity), 즉 밀착 접속의 존재 여부에 의존한다(Parsons 외, Science 208, 605-7 (1980)). 이 장벽이 손상될 때, 하부의 방광층으로의 소변 성분의 누설은 감각신경섬유의 자극 및 고통, 절박성 요설 및 빈뇨증상을 유도하는, 방광에의 자극성 변화를 일으킨다(Lavelle 외, Am J Physiol Renal Physiol 283, F242 - 53 (2002)). 요로상피(urothelium) 및 GAG도 효과적인 방광 약물 절단에 심각한 장벽을 제공한다.

노화와 함께 발병률이 증가함에 따라 미국의 남성과 여성의 17%에 영향을 미치는 과민성 방광(OAB)이 더욱 심각하고, 16억4천만 달러의 예상 경제적 부담을 진다. 많은 전문가들은 OAB 환자 25%가 의료 치료를 받고 있다. 보존적으로, 그것은 치료를 받는 4백만 OAB 환자 중 25 %가 구강 약물요법에 실패하고 난치성 OAB에 대한 치료를 차고 있는 것으로 추산되고 있다.

지난 수년간, 몇몇 항무스카린성(antimuscarinic) 치료와 OAB용 개선 제형들이 출현하였다. 2008년 매년 200만 $의 판매를 기록한 6가지의 FDA 승인 OAB 무스카린성 약제가 있다. 그러나 제한된 효과와, 구강건조, 변비, 인지기능장애 등과 같은 부작용 때문에 항무스카린성(antimuscarinic) 치료를 받는 환자는 20% 이하에 머물고 있다. 항무스카린성 난치성 환자를 위한 이차 치료로서 종종 시행되는 2가지 절차는 FDA가 승인한 엉치 신경자극(sacral nerve stimulation:SNS)(Interstim, Medtronics사)과, 난치성 OAB를 위한 FDA의 제2상 시험(Phase II trials)중인 배뇨근내 주사(Botox, Allergan Inc.,)이다. 보톨리눔 독소(botulinum toxin:BoNT)가 투여되는 몇몇 임상시험들이 최근에 행하여지고 있다. 보톨리눔 독소는 난치성 과민 방광(OAB)의 치료에 도움이 되는 것으로 알려져 있으나, 아직 그 독소를 방광벽내로 직접 주사하는 데에는 방광경적 절차(cystoscopic procedure)가 요구된다. 상기 독소가 방광배뇨근 안으로 도입되고 방광 수축력을 약화시킬 수 있기 때문에 43%의 환자가 소변정체로 전개될 수 있다.

제약 산업은 또한 간질성 방광염과 관련된 배뇨 절박 및 빈뇨를 위한 치료법 개발에 상당한 관심을 보여 왔다. 가장 최근에는 이들 치료제는 칼메트-구에린 간균(BCG), 리신니페라톡신(resiniferatoxin, RTX), 히알루론산(hyaluronic acid) (Cystistat), 하이알루론산 나트륨(sodium hyaluronate, SI-7201), 및 엉치 신경자극장치를 포함한다.

주사바늘이 필요없이 보툴리눔 독소(BoNT)를 간단히 점적주입할 수 있는 필요가 생긴다. 더욱이, BoNT를 방광 요로상피 내막과 감각신경 종말에, 정체 및/또는 방광근 약화를 일으키지 않고 하부 비뇨 증상을 개선하는 데 도움이 될 수 있는 저 농도로 전달할 필요가 있다.

요로감염 및 방광암과 같은 다른 비뇨기 조건에서 장기간의 방광내 약물접촉기간으로 국부화된 방광내 약물전달을 할 필요가 있다.

방광기능장애를 치료하기 위한 지속적 약물전달 시스템 중 상업적으로 이용가능한 것은 전혀 없다. 지속적 약물방출을 위하여 약물을 가진 풍선 저장소 또는 매트릭스 물질을 방광내에 설치하려는 다른 시도는 있었다. 그러나 이들 기계적인 방법은 자극, 고통을 유발하고, 크기나 형태로 인하여 방광 출구의 차단에 의한 장애를 유발할 수 있다.

방광내 BoNT의 점적주입(방울주입)에 대한 한정된 치료 경험은 현재까지 성공적이지 않았다. 방광내 BoNT의 점적주입의 효과가 부족한 것에 대한 이유는 소변내의 단백질 분해효소에 의한 분해, 소변내의 희석 또는 방광내로 점적주입된 BoNT 용액으로부터 방광상피로 섭취가 불충분한 것을 포함한다.

따라서, 본 발명의 목적은 OAB와 다른 방광 장애를 치료하기 위하여 방광에 점적주입에 의한 약물전달을 위한 조성물을 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 OAB와 다른 방광 장애를 치료하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명은 방광 내에 점적주입을 위한 약제학적으로 수용가능한 수송체 내에 보툴리눔 독소를 포함하는 리포솜 제형을 제공한다.

상기 보톨리눔 독소에 대한 지질의 비율은 전달을 최적화하기 위하여 조절된다.

또한 본 발명은 과민성 방광과 저 요로 증후군을 치료하기 위한 방법으로서, 리포솜 수송체 내의 보톨리눔 독소를 방광내로 점적주입하는 것을 포함한다.

상기 보톨리눔 독소는 일곱가지 혈청형중 하나 또는 하나 이상이고, 이중 또는 단일 사슬이다.

상기 보톨리눔 독소의 투여량은 과민성 방광과 저 요로 증후군에 대한 동일한 효과를 얻기 위하여 주사에 의해 투여되는 투여량보다 적은 것을 특징으로 하는 리포솜 제형 또는 치료방법.

상기 점적 주입되는 제형의 체적은 섭취를 최적화하기 위하여 최적화된다.

상기 제형은 질, 항문, 직장, 피부, 목, 구강, 비강 및 경비호흡관을 포함하는 다른 신체 캐비티와 표면 안으로 점적주입된다.

리포솜은 방광내 약물전달, 특히 방광 자극 및 빈도를 줄임으로써 하부요로 증상을 개선하는데 유용한 BoNT의 전달을 위하여 사용된다. 본 시스템은 주사보다도 방광정체의 위험성이 더 낮은, BoNT의 저투여량 및 안전한 투여량을 사용한다. 액상 제재인 리포솜-BoNT을 30-60ml의 체적으로 방광내로 간단히 점적주입하면, BoNT를 바늘주사로 주입한 것과 유시한 효과를 얻을 수 있다. BoNT의 투여량은 주사에 의한 투여량보다 더 낮을 수 있고, 이에 따라 소변정체의 위험을 더 낮춘다.

상기 제재의 효과는 실시예들에 의해 입증된다.

Ⅰ. 리포솜-약물 제형

리포솜 캡슐화는 점적투입후의 낮은 흡수성의 문제점을 해결할 것이다. BoNT의리포솜 캡슐화는 BoNT를 소변에서 분해를 방지할 수 있고, 방광 표면에 부착된 리포솜으로부터 요로상피를 통하여 흡수를 방해받지 않도록 할 수 있다. BoNT가 리포솜 내에 포착되어 있으므로 BoNT는 소변에 의해 희석되는 것에 취약하지 않고, 리포솜 표면에서 BoNT의 국소 농도는, 방광내 표면에 부착된 리포솜에서 여과된 BoNT의 진입을 촉진할 정도로 충분히 높일 수 있다.

A. 리포솜(Liposomes)

리포솜(Lps)은 구형의 포낭(vesicles)으로서, 수성 구획에 의해 분리된 동심상 인지질 이중층으로 구성되어 있다. 리포솜(Lps)은 세표 표면상에 분자막을 생성하고 그 분자막에 부착하는 특성을 가진다. 수성의 내부를 밀폐하는 동심의 인지질 이중층으로 구성된 지질 소포(lipid vesicles)이다(Gregoriadis, 외, Int J Pharm 300, 125-30 2005; Gregoriadis and Ryman, Biochem J 124, 58P (1971)). 상기 지질 소포는 단층(unilamellar) 또는 복수층(multilamellar)의 인지질 이중층에 의해 윤곽이 형성된 하나 또는 다수의 수성의 구획을 포함한다(Sapra, et al., Curr Drug Deliv 2, 369-81 (2005)). 치료에서 리포솜의 성공은 그 제형에 사용된 지질의 비족성 속성에 기인하는 것이었다. 지질 이중층과 상기 리포솜의 수성 내부 코어 양쪽이 치료의 목적에 도움이 될 수 있다. 리포솜은 저 투여량에서 효과를 강화하기 위한 독소의 캐리어로서 연구되어 왔다(Alam 외, MoI Cell Biochem 1 12, 97-107 1992; Chaim-Matyas, 외, Biotechnol Appl Biochem 17 ( Pt 1), 31-6 1993; de Paiva and Dolly, FEBS Lett 277, 171-4 (1990); Freitas and Frezard, Toxicon 35, 91-100 (1997); Mandal and Lee, Biochim Biophys Acta 1563, 7-17 (2002)).

리포솜은 세포와 조직 표면에 분자 필름을 형성하는 능력을 가지고 있고, 현재는 눈물 대체재로서 안구 건조의 치료와 치료를 촉진하기 위한 치료제로서 시험되고 있다. 임상 연구는 국소 치료제로서 리포솜의 효능을 입증했다(Dausch, et al., Klin Monatsbl Augenheilkd 223, 974-83 (2006); Lee, et al., Klin Monatsbl Augenheilkd 221, 825-36 (2004)). 리포솜은, 각막염, 각막이식 거부반응, 포도막염, 안구내염, 증식유리체 망막병을 개선하기 위한 안과학에서 사용되어 왔다(Ebrahim, et al., 2005; Li, et al., 2007). 리포솜은 다양한 화학요법제를 위한 약물 수송체(이에 관련된 과학논문이 약 25,000종이 발간되었다)로서 널리 연구되어 왔다(Gregoriadis, N Engl J Med 295, 765-70 (1976); Gregoriadis, et al., Int J Pharm 300, 125-30 (2005)). 독소루비신(doxorubicin)과 같은 수용성 항암물질은 인지질 이중충에 의해 경계가 설정되는 리포솜의 수성 구획내에서 보호될 수 있는 반면에, 암포테리신(amphotericin), 캡사이신(capsaicin)과 같은 지용성 물질은 인지질 이중층안으로 통합될 수 있다(Aboul-Fadl, Curr Med Chem 12, 2193-214 (2005); Tyagi, et al., J Urol 171, 483-9 (2004)). 시크로스포린(cyclosporine)의 국소 및 유리체 전달은 리포솜에 의해 극적으로 개선되었다(Lallemand, et al., Eur J Pharm Biopharm 56, 307-18 2003). 화학요법제의 전달은 개선된 약물동력학을 낳고, 독성 프로파일의 감소를 유도하였다(Gregoriadis, Trends Biotechnol 13, 527-37 (1995); Gregoriadis and Allison, FEBS Lett 45, 71-4 1974; Sapra, et al., Curr Drug Deliv 2, 369-81 (2005)). 10가지 이상의 리포솜 및 지질기반 제형이 조절 기관에 의해 승인되었고, 많은 리포솜 약물은 임상전 개발 또는 임상시험에서 사용되고 있다(Barnes, Expert Opin Pharmacother 7, 607-15 (2006); Minko, et al., Anticancer Agents Med Chem 6, 537-52 (2006)). Fraser, et al. Urology, 2003; 61: 656- 663'는 리포솜의 방광내 점적주입이 기능장애의 요로상피의 장벽 특성을 강화하였고, 요로상피를 프로타민 황산염으로 절개한 후 방광을 염산칼륨을 자극하여 유도된 과다활동성 방광의 쥐 모델에서 고 배뇨빈도를 부분적으로 반전시켰음을 입증하였다. “Tyagi et al. J Urol, 2004; 171 ; 483-489”는 리포솜이 30% 에탄올과 비교하여 더 적은 수송체가 도입된 염증을 가진 방광내 캡사이신의 투여를 위한 우수한 수송체임을 보고하였다. 리포솜의 급성, 아만성 및 만성 독성에 대한 안전성 자료는 수많은 환자의 치료에 리포솜을 사용하는 광범위한 치료 경험으로부터 이해되었다. 계획된 치료 경로를 위한 리포솜의 안전한 사용은 환자에게 항암제를 위한 수송체로서 광범위하게 사용되고 있다.

B. 보툴리눔 독소( BoNT ) 및 점적주입(instillation)을 위한 다른 약물

보톨리눔 신경독, 클로스트리디움 보톨리눔에 의해 제조된 것, 은 인간에게 알려진 가장 효능있는 생물학적 독소로서 간주된다(Smith Sc Chancellor, J Urol, 171 : 2128 (2004). 7개의 면역 특성 신경독소(A-G형)중에서, BoNT-A는 치료적으로 가장 보편적으로 사용되는 보툴리눔 독소이다. 지난 몇 년동안, BoNT-A와 BoNT-B는 배뇨근내 BoNT-A 주사를 사용하여 신경성 방광 과민성의 척수 환자의 치료에 가장 성공적으로 사용되었다(Schurch et al., 2000).

Ach 및 노르에피네프린( Norepinephrine ) 방출억제 효과:

BoNT는 자율신경전달계는 물론 신경근 접합부에서 Ach 방출을 억제함으로써 효과를 발휘하는 것으로 알려져 있다. BoNT의 근육주사 후에, 일시적인 화학 탈신경과 근육이완이 평활근 뿐만 아니라 골격근에서 획득될 수 있다(Chuang & Chancellor, J Urol. 176(6 Pt l):2375-82 (2006)). Smith 등(J Urol, 169: 1896 (2003))은 쥐의 근위 요도괄약근 내부로 BoNT를 주입하면 높은 전기장의 자극에서 표지된 노르에피네프린(norepinephrine)의 현저한 감소를 유발하였고, 이는 BoNT가 자율 신경계 종말에서 노르에피네프린 방출을 억제하는 것을 나타낸다.

감각기관 억제에 대한 효과:

BoNT 또한 방광내에 뚜렷한 신경전달을 억제한다는 추론을 지지하는 여러가지 증거가 있어 왔다(Chuang et al., J Urol 172, 1529-32 (2004); Khera et at, Neurochem Int, 45: 987 (2004)). 신경펩티드, 글루탐산염, 아데노신 삼인산의 방출을 억제하는 것이 보여지고, 이는 통증 감각의 매개체이다(Cui et al., Pain, 107: 125 (2004)). 아세트산이 도입된 방광 과민성 모델에서 유사한 효과가 관찰되었다. BoNT의 배뇨근내 감소된 절박성과 관련된 부 요로상피 신경섬유내의 P2X3 감각수용체 및 일과성 잠재적 바닐로이드 1(TRPV 1) 수용체는 인간 배뇨근 과민성에서 발견되었다(Apostolidis et al., J Urol, 174: 977 2005).

BoNT용 목표 단백질은 지질 환경에 잔류하는 통합 멤브레인 단백질이다. 리포솜은, 요로상피에 더욱 강력히 부착하게 함으로써 BoNT과 같은 메탈로프로타아제의 활성을 강화할 수 있다. 방광경에 안내된 주사는 BoNT를 방광에 투여하는 치료에 최근의 표준 시술이다. 최근에 여러 시험들이 방광 자극의 동물모델안에 BoNT의 방광내 점적주입의 잠재성을 평가하였다(Khera, et al., Urology 66, 208-12 (2005)). 문헌속의 이전 보고들은 VAMP용 BoNT의 금속성 단백질분해 활동이 지질막 존재에 의해 더욱 강화될 수 있음을 제안하고 있다. 이러한 효과는 지질 수송체안으로 그리고 뉴런안에 삽입된 VAMP에 더욱 활성적이라는 사실에 대한 설명을 제공한다. 이러한 지질-강화 효과는 지질에 의해 생겨난다. 이러한 연구는 BoNT 점적 투입을 위한 전달 수송체로서 리포솜을 사용하기 위한 이유를 강력히 지지한다.

방광내로 점적투입될 수 있는 다른 약물은 또한 리포솜 전달시스템, 특히 국소 전달에 의해 피해지는 시스템적인 부작용을 가지는 것을 사용하여 전달될 수 있다.

알려진 리포솜 전달 시스템을 사용하여 전달될 수 있는 적합한 약물 또는 활성제는 암치료제, 면역물질조절제, 진통제, 소염제, 항히스타민제, 엔도르핀, 프로스타글란딘, 카나보이드(canaboid) TRP수용체, 텝티드, 단백질, 항체, 플라스미드, 나 DNA, 바이러스 벡터, RNA, siRNA, 아미노산, 히알루론산, 펜토산 폴리셀페이트 소디움, 베타3 수용체 작용체 및 길항제, Ghrelin 수용체 작용체 및 길항제, 및 리도카인과 같은 국소 마취제를 포함한다. 그러나 이에는 한정되지 않는다.

전형적인 암치료제는 시스플라틴(cisplatin), 카보플라틴(carboplatin), 미토마이신(mitomycin), 옥살리플라틴(oxaliplatin), 메크로레타민(mechlorethamine), 사이클로포스파미드(cyclophosphamide), 크로르암부실(chlorambucil), 빈크리스틴(vincristine), 파크리탁셀(paclitaxel), 빈블라스틴(vinblastine), 독소루비신(doxorubicin), 메토트렉세이트(methotrexate), 비노렐빈(vinorelbine), 빈데신(vindesine), 탁솔(taxol) 및 그 유도체, 이리노테칸(irinotecan), 토포테칸(topotecan), 암사크린(amsacrine), 에토포사이드(etoposide), 에토포사이드 포스페이트(etoposide phosphate), 테니포사이드(teniposide), 에피포도필로톡신(epipodophyllotoxins), 트라츄마브(trastuzumab) (HERCEPTIN®), 세투시맙(cetuximab), 및 리투시맙(rituximab) (RITUXAN® 혹은 MABTHERA®), 베바시주맙(bevacizumab) (AVASTIN®), 및 이들 조합물을 포함한다.

전형적인 면역물질조절제는 인터페론 및 바실 칼메트-구에린을 포함한다.

개시된 약물전달 조성물은 간질성 방광염, 통증 방광 증후군, 과민성 방광, 방광암, 전립선 암, 및 박테리아, 무좀 혹은 바이러스성 요로감염을 치료하기에 적합한 약물을 전달하기 위하여 사용될 수 있다.

Ⅱ. 제조방법

리포솜 제조:

리포솜의 제조방법은 위에서 인용된 문헌에 기술되어 있고 잘 알려져 있다.

일실시예에서는, 수성 리포솜 현탁액은 미세유동화(microfluidization)에 의해 제조될 수 있다. 최종 제품은 응집, 혼합, 및 인지질 가수분해과 같은 일련의 안정성 문제를 가질 수 있다(Nounou, et al., Acta Pol Pharm 62, 381-91 (2005)). 리포솜 제품은 그 치료적 장점이 이해되기 앞서 적당한 화학적 물리적 안정성을 보유하여야 한다(Torchilin, Adv Drug Deliv Rev 58, 1532-55 (2006)). 바람직한 실시예에서, 탈수소 리포솜은 테르트-부틸 알코올(TBA)/물 공동 용제 시스템에서 인지질의 균일한 확산으로부터 형성된다. 상기 리포솜의 등방성 단상 용액은 냉동건조되어 무균 바이알 내에서 탈수소 리포솜 분말을 생성한다. 냉동 건조단계는 상기 바이알에서 물과 TBA를 제거한 후 공 지질 수용체 또는 탈수소 리포솜을 남긴다. 생리식염수의 추가에 의해, 냉동진공건조된 산물은 자발적으로 균일한 리포솜 제제를 형성한다(Amselem, et al., J Pharm Sci 79, 1045- 52 (1990)). 지질과 TBA 비율은 결과적인 리포솜 제제의 크기와 다분산동 영향을 미치는 중요한 인자이므로, 저 지질 농도는 이 방법에 이상적으로 작용한다.

리포솜 BoNT 의 제조:

바람직한 실시예에서, 리포솜 BoNT(“LPA-08”)는 탈수소-재수화 방법을 약간 수정하여 제조된다. 이전 단계에서 제조된 리포솜은 37℃에서 주사(50units/ml)용 물안에 BoNT 용액으로써 수화된다. 그리고나서 그 혼합물은 층판결핍 수화 리포솜을 형성하기 위하여 수조를 사용하여 37℃에서 2시간 동안 배양된다. 만니톨(Mannitol)은 아세톤-건조 얼름조에서 냉동되기전에 최종 혼합물에 0.5%, 1%, 2.5%, 및 5%(w/v) 만니톨 농도로 첨가된다. 만니톨은 냉동건조 공정에서 동결완화제로서 작용한다. 냉동 혼합물은 40℃와 5밀리바아에서 냉동건조된다. 냉동건조된 케이크는 BoNT의 소망하는 최종 농도로 식염수로 재현탁된다. 자유 BoNT는 초원심분리기를 사용하여 12,000xg으로 30분 동안 원심분리하여 포착된 BoNT에서 제거된다. 3번의 수세 후, 침전물은 다시 식염수에 재현탁된다. 리포솜안의 효능있는 박테리아 독소의 제형은 세심한 접근을 요구한다. BoNT는 일반적으로 리포솜의 제조에 사용되고 있는 유기 용매에 노출될 수 없다. 실험은 박막 수화 방법과 지질 디팔미토일 포스페이티디일크로라인(DPPC)을 사용하여 행해진다. 간단히, 클로로포름내의 DPPC 용액은 먼저 둥근 바닥 플라스크 안에서 수소 스트림 하에서 증발된다. 상기 지질 필름은 진공하에서 건조되었다. 건조된 지질은 수용성 BoNT 용액으로 수화되었다.

최적의 결과는 아래 실시예2에서 입증된 바와 같이, 지질에 대한 BoNT의 비율을 제어함으로써 얻어진다. 최적의 비율과 지질 조성물은 이번 연구에서 입증된 바와 같이 반복 실험을 사용하여 입증될 수 있다.

Ⅲ. 리포솜 BoNT 의 전달

리포솜-BoNT 점적주입은 환자에게 더욱 안락하고 방광경적 BoNT 주사로숙련되고 인정받은 의사들에 의해 한정된 것에 비하여 더 많은 의사들에게 치료 형태를 제공하게 한다. BoNT는 큰 분자량이고, 근육과 신경 단말에 도달하기 위하여 세포층을 관통하지 않는다. 그렇지 않으면, 리포솜의 사용없이 BoNT의 점적주입은 방광 내벽에 손상을 줄 수 있는 프로타민과 같은 부식제를 필요로 할 것이다. 이것은 FDA의 승인을 받지 않았고 방광 통증 및 손상을 야기할 수 있다. BoNT의 점적주입은 난치성 과민성 방광의 환자들을 위한 치료제의 비용을 낮출 수 있다. 다른 실험에서 보고된 다양한 연구들은 방광 자극의 동물 모델에서 BoNT의 점적주입의 잠재성을 평가하였다(Chuang, et al., 2004; Khera, et al., 2005). 그러나, 방광내 BoNT의 점적주입으로 제한된 치료 경험들은 성공적이었다. 리포솜 캡슐화는 점적주입후의 저 흡수성의 문제를 해결한다. BoNT가 리포솜 내에 포착되어 있으므로 BoNT는 소변에 의해 희석되는 것에 취약하지 않고, 리포솜 표면에서 BoNT의 국소 농도는, 방광내 표면에 부착된 리포솜에서 여과된 BoNT의 진입을 촉진할 정도로 충분히 높일 수 있다. 리포솜의 지질 장벽은 또한 방광에 의해 흡수되기 전에 프로타아제와 소변내의 단백질 분해효소가 BoNT를 절개하는 것을 방지할 수 있다.

점적 주입의 방법은 알려져 있다. 예를 들면 Lawrencia, et al., Gene Ther 8, 760-8 (2001); Nogawa, et al., J Clin Invest 1 15, 978-85 (2005); Ng, et al., Methods Enzymol 391, 304-13 2005; Tyagi, et al., J Urol 171, 483-9 (2004); Trevisani, et al., J Pharmacol Exp Ther 309, 1167-73 (2004); Trevisani, et al., Nat Neurosci 5, 546-51 (2002)); (Segal, et al., 1975). (Dyson, et al., 2005). (Batista, et al., 2005; Dyson, et al., 2005)에 나타나 있다. 리포솜-BoNT는 아래 실시예1에 의해 입증된 바와 같이 잔달 효율에 있어서 중요하다. 반복적인 시험이 전달 체적을 최적화하는 데 사용될 수 있다.

상기 개시된 리포솜은 또한 점적 치료제를, 요도, 방광, 요관 및 콩팥속집뇨계를 포함하는 요도와 같은 다른 부위와; 질, 자궁, 자궁관과 같은 부인과 부위; 구강, 식도, 위, 창자, 결장, 직장, 항문을 포함하는 위장 부위; 및 외이 또는 내이, 피부, 코에 치료제를 점적주입하는 데 사용될 수 있다.

본 발명은 다음의 비한정 실시예들을 참조하면 더욱 이해될 것이다.

점적 주입후 리포솜 BoNT 의 흡수에 대한 방광 팽창의 효과

재료와 방법

점적 주입후 리포솜 BoNT의 흡수에 대한 방광 팽창의 효과는 증가하는 체적에 리포솜 BoNT의 동일한 투여량을 점적주입함으로써 결정될 수 있다. 쥐는 지질과 BoNT의 동일한 조성물(BoNT의 각 단위에 대하여 지질 0.5mg)로써 만들어진 리포솜으로 다른 침적 체적(0.5, 0.55, 0.6ml)으로 침적되었다. 리포솜은 30분의 드웰타임(dwell time)으로 할로탄 마취(halothane anesthesia)된 쥐의 방광안에 점적주입되었고; 그리고나서 동물은 회복되게 허용되었고, 음식과 물이 공급되었으며, 우레탄 마취(투여량 1.0 g/kg 체중)하에서 24시간 후에 집안에 가두어졌고, 식염수를 0.04ml/min의 비율로 투여함으로써 요도경유 개방된 방광내압측정이 처리된 쥐에 행해졌다. 1시간 동안 정상의 기준을 취한 후 식염수내의 아세트산(0.25%)이 투여되어 방광자극을 유도하였다. 다른 점적주입 용량으로 BoNT 처리를 한 7일후, 방광팽창의 효과는 우레판 마취하에서 연속적인 요도경유 방광내압측정술로써 평가되었다.

결과

0.5ml의 표준 체적으로 점적주입된 쥐는, 0.08ml/min의 일정한 속도로 식염수를 일정하게 혼힙함으로써 유도된 반사배뇨(reflex voiding)에 규칙적인 CMG를 보여주었다. 그러나 10~20% 더 증가한 점적주입 체적(0.55ml 또는 0.6ml의 점적주입체적)으로 동일한 투여량의 리포솜 BoNT로써 투여된 쥐는 식염수 방광내압측정하에서 과다유출 자제의 특징을 보여주었다.

저 체적의 점적주입은 요로에 대한 BoNT의 효과를 제한할 뿐아니라 점적주입의 체적에 있어서 10-20% 증가는 흡수에 대한 장벽을 극적으로 감소시켰고, BoNT가 점적주입후 배뇨근에 도달하게 허용한다. 큰 체적의 리포솜 BoNT이 점적주입된 쥐들은 깨어있는 상태에서, 반사배뇨의 강렬한 억제를 나타내는 마취조건에서 소변정체(urinary retention)와 범람요실(overflow incontinence )를 보였다. 마취조건하에서 범람요실은 배뇨반사(micturition reflex)의 구심 팔에 작용하는 약물에 만족스러운 특징을 반영하는 것에 주목하는 것은 흥미롭다. 마취조건하에서 범람요실은 깨어있는 조건하의 감소된 구심(afferent)의 입력으로 해석된다.

BoNT는 150kD의 분자량을 가진 큰 분자량의 물질이다. 그래서 확산은 흡수 메커니즘과 같이 대개 배제될 수 있다. 세포내 이입(endocytosis)은 방광 흡수에서 매우 유망한 메커니즘이다. 이전의 연구는 요로상피의 우산세포안의 세포내 이입이 정수압과 같은 외부 자극에 따라 증가하는 것을 보여주었다. 방광 충전 동안에 세포내 이입과 세포외 배출의 비율은 그 순효과(net effect)가 멤브레인을 부가하고 요로상피의 표면적을 증가시켜 방광 스트레칭을 수용하는 것으로 되게 한다. 그러므로, 방광의 스트레칭에 수반하는 더많은 세포내 이입이 일어나서 BoNT의 방광 섭취를 개선한다.

BoNT 에 대한 지질 비율의 효과

BoNT의 최적 효능을 위하여 지질과 독소는 최적의 비율이어야 한다.

재료 및 방법

BoNT의 비율을 고정하면서 지질의 비율을 변화시켜 리포솜 BoNT를 준비하였다. 예를 들면, 25IU의 BoNT로 시작하여 지질과 BoNT의 동일 조성물(각 단위BoNT에 대하여 0.5mg의 지질)로써 만들어진 리포솜으로 할로탄 마취하에서 다른 부피로 쥐에 점적주입하였다. BoNT의 방광내 투여량은 일정하게 유지되었고, 지질 농도는 최적 독소: 지질 비를 결정하기 위하여 가변되었다. 리포솜 효능은 식염수 용액내의 자유 BoNT에 대하여 비교되었다. 점적주입 7일 후 아세트산이 도입된 방광자극을 둔화시키는 능력은 할로탄 마취된 쥐들에게서 시험되었다. 점적주입과 효능 평가 사이의 7일간의 간격은 공개된 연구에 기초하여 선택되었다(Chuang, et al., 2004).

결과

지질에 대한 독소의 최적 비로서 1:0.5는 방광내 점적주입후 BoNT의 효능을 강화하는 데 효과적이다. 지질의 고비율에서 감소된 효능은 방광내로 BoNT의 비효율적인 섭취를 유도하는 다층 리포솜으로부터 BoNT의 느린 방출에 기인할 수 있다.

아세트산이 도입된 쥐의 방광 과다활동에 방광내 BoNT -A 리포솜 전달의 요역동학적 효과 및 면역조직화학적 효과에 대한 평가

재료 및 방법

리포솜(LPs) 제제, 보툴리늄 독소 A(BoNT-A), 및 리포톡신(LPs+BoNT-A): LPs (10 mg, 리포이드)는 생리식염수(1ml) 내에 분산되고, 상기 분산은 리포솜 형태로 되고, BoNT-A는 생리식염수(1ml, 20u/ml) 내에 용해되었다(1 ml, 식염수내 20u/ml, Allergan, Irvine, CA). BoNT를 캡슐화한 LPs(이하, 리포폭신이라 한다)는 LPs 분산액(1ml) 10mg 안에 BoNT-A의 20 단위(unit)를 투여하는 수정 탈수소-재수화 수포 방법에 의해 제조되었다(Gregoriadis, et al., Methods 19, 156-62 1999). BoNT-A의 투여량은 다른 동물군에서 동일하게 유지되었다.

방광내압곡선 ( CMG ): 모든 실험절차는 'Sprague-Dawley' 암컷 쥐(220-280 gm)에 행하여졌고, 연구시작전 실험동물운영위원회(Institutional Animal Care and Use Committee) 에 의해 검토되고 승인되었다. 동물은 우레탄(1.2g/kg)의 피하주사에 의해 마취되었다. PE-50 관이 요도를 통하여 방광속으로 삽입되었고, 3-way 스톱밸브로 압력 변환기에 연결되고 방광내 압력을 기록하고 방광내 용액을 투여하기 위한 시린지 펌프에 연결되었다. 1일차에 반복 배뇨를 유도하기 위하여 방광에 식염수(0.08 ml/min)를 충전함으로써 CMG의 제어가 행해졌다. 의 진폭, 압력 역치(pressure threshold:PB), 압력 기준(PB), 및 반사 방광(reflex bladder)의 내부 수축 간격(ICI)들은 기록되었다. 각 동물에 대한 측정은 평균 3-5 방광 수축을 나타내었다.

8일차, 식염수 투여 동안에 기준 측정이 이루어진 후, 방광 과활동을 급속히0.3%촉진하기 위하여 0.3%의 아세트산(AA)를 방광에 0.08 ml/min의 속도로 투여하였다. 아세트산 투여후 30분 후에 3-5의 방광 수축이 측정되었다.

약물 점적주입 : 기준 CMG후 1일차에, PE-50 관(Clay- Adams, Parsippany, NJ)이 할로판 마취하에서 요로 오리피스 주위를 결속실로 결속되었다. 방광은 소변이 비워졌고, LPs, BoNT-A 또는 리포톡신을 도관을 통하여 1시간동안 충전하였다.

경심 관류( Transcardiac perfusion ): 8일차에 CMG 연구후 몇몇 동물(각 군에 대해 N=6)들은 마취되었고, 경심 관류를 통하여 희생되었고, 먼저 4%의 파라폼알데히드 고정액(paraformaldehyde fixative)에 의해 추종되는 크랩스 완충제로 희생되었다. 그 동물은 그리고나서 방광을 수집하기 위하여 해부되었다.

조직학: 조직학을 위한 방광 조직은 인산염 완충식염수(PBS) 내에서 4%의 파라폼알데히드 고정액안에 4시간동안 고정되었고, 그리고나서 PBS 안의 30% 설탕(슈크로스)안에서 고정되었다. 조직학용 시료는 10㎛ 두께의 조각으로 절단된 파라핀안에 매입되었고, 'H&E"로 염색되었다. AA 유도된 염증 반응은 다음과 같이 0-3 점으로 등급이 매겨졌다.: 0,: 염증성 세포의 침윤 또는 간질성 부종의 증거는 전혀 없음. 1: 중등도(염증 세포 침윤의 중등의 양 및 중등도 간질성 부종); 3, 중증( 염증세포 침윤의 다량 확산존재 및 중증 간질성 부종).

CGRP 및 SNAP - 25용 면역형광 현미경검사:

양자택일로, 시료들은 냉동되고 Tissue-Tek OCT 설치 매개체에 설치된다(Sakura Finetek, Torrance, CA, USA); 10㎛두께의 길이방향 절편들이 냉동미세절단기에서 절단되고, 슈퍼-프로스트(SuperFrost) 슬라이드 위에 설치되었다. 그 절편들은 15분 동안 아세톤에 침적함으로써 고정되었고, 그리고나서 인산염완충식염수(PBS)으로 세척하였고, 상기 슬라이드를 PBS안의 0.3% 과산화수소 용액안에서 10분 동안 배양함으로써 내부 과산화효소 활성을 저지하였다. PBS안에서 추가로 세척한 후, 상기 절편들은 Image-iT ™고정 신호 확장기(Molecular Probes, invitrogen) 에서 1시간 동안 배양되었다. CGRP 면역조직 염색을 위하여 슬라이드들은 산양 항-CGRP 다클론항체(Santa Cruz, 1 :50 희석)로 +4℃에서 48시간 동안 염색되었다. 그리고나서 다음날, 절편들은 PBS 안에서 세척되었고 당나귀 항-산양 IgG FITC(Santa Cruz, 1 :2000 희석)로써 1시간 동안 배양되었다. 절편들은 SlowFade antifade 금 시약안에 설치되었다(Molecular Probes, Invitrogen). SNAP-25 면역 염색에 있어서는, 슬라이드들이 쥐 항-SNAP-25 단클론 항체(AbD₅ NC, USA₉ 1 :2000 희석)로 +4℃에서 밤새 염색되었다. 다음날 그 절편들은 PBS안에서 세척되었고 산양 항-쥐 lgG Alexa Flour 488(Molecular Probes, Invitrogen, 1 :2000 희석)으로 1시간 동안 배양되었다. 근육 섬유를 검출하기 위하여, 절편들이 테트라메틸로다민 이소티오시안산염(TRITC)-표지 팔로이딘(Sigma, 1 :2000 dilution)으로 대조염색되었고, 세척되었으며, SlowFade antifade 금 시약안에 설치되었다(Molecular Probes, Invitrogen). 상기 슬라이드들은 형광 현미경검사로써 검사되어 이미지를 기록하였다.

SNAP -25 발현에 대한 웨스턴 블롯 분석:

몇몇 동물(각 군에 대해, N=6)들은 마취되었고, 경심 관류없이 희생되었다. 그 방광은 표준 프로토콜에 따라 SNAP-25 발현에 대한 웨스턴 슬롯 분석을 위하여 제거되었다(Amersham Biosciences). 샘플은 음파파쇄와 정제에 앞서 단백질 추출 용액(T-PER; Pierce Biotechnology)에서 균질화된다. 총 단백질 양은 Bradford 단백질 분석방법(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)으로 측정되었다. SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동법(polyacrylamide gel electrophoresis ;PAGE)은 Laemmli의 완충시스템을 사용하여 수행되었다. 즉, 30㎍ 단백질에 상당하는 추출물의 일정부분은 1시간 동안 100V의 정전압하에서 전기영동된 8%의 폴리아크릴아미드 겔상에 적재되고 Hybond-P PVDF 멤브레인으로 전달되었다(Amersham Biosciences). 상기 멤브레인은 역제제로써 억제되었고, 그리고나서 쥐 항-SNAP-25 단클론 항체(AbD, NC, USA, 1 :500 희석)와 쥐 항-β-액틴 단클론 항체(Rockland, Gilbertsville, USA, 1 :2000 희석)로써 +4℃에서 밤새 면역블롯되었다. 세척후, 상기 멤브레인은 TBS 내의 탈지된 우유분말 5%를 사용하는 2차 항체로써, 홍당무과산화효소-연결된 항-토끼 또는 항-쥐 면역글로부린 G를 사용하여 상온에서 2시간 동안 배양되었다. 웨스턴 블롯은 증대된 화학발광(ELC) 검출 시스템에 의해 눈으로 보였다(Amersham Biosciences). β-액틴의 량도 내부 제어로서 검출되었다. 정량 분석은 'Lab Works Image Acquisition and Analysis'소프트웨어를 사용하여 수행되었다.

통계분석: 정량 데이터는 평균값에 평균값의 표준오차를 더하거나 차감한 값으로표현된다. 통계분석은 ANOVA with Bonferroni post-test 또는 Kruskal-Wallis with Dunn's post-test를 사용하여 행하여졌고, 이들은 중요하다고 간주되는 p<0.05에서 적용가능하다.

결과

LPs, BoNT-A 및 리포톡신 사전처리에 대한 CMG 반응: 1일차에 방광내 식염수 점적주입하는 동안에 LPs, BoNT-A 및 리포톡신 군에서 CMG 변수들은 8일차의 것과는 그다지 다르지 않았다. 이러한 결과는 8일차에서 정상조건하에서 방광기능은 LPs, BoNT-A 및 리포톡신의 전처리에 의해 영향을 받지 않음을 나타낸다. 8일차에서, 아세트산의 자극효과는 투입시작후 20 내지 30분에 분명하였다. LPs, BoNT-A가 전처리된 군에서, 내부 수축 간격(ICI)은 AA의 방광내 점적주입 후, 각각 57.2%, 및 56%만큼 상당히 감소하였다. 그러나, 리포톡신 전처리를 받은 쥐들은 AA 점적주입에 대하여 상당히 감소한 반응(ICI 21.1% 감소)을 보였다. 이러한 결과는 리포톡신 전처리가 AA 유도된 방광 과민성을 억제하였음을 나타내고, 그러한 효과는 BoNT-A 전처리 군에 동일한 투여량에서 보여지지 않았다.

LPs , BoNT -A 및 리포톡신 사전처리에 대한 조직학적 반응:

하마톡실린 및 에오신으로 염색된 조직 절편의 조직병리학적 평가에 의해 결정되는 바와 같이, AA 점적주입은 LPs, BoNT-A 및 리포톡신 사전처리된 군에 중등 염증반응을 유도하였다. 그러나, AA 유도된 염증 반응은 리포톡신 군에서 상당히 감소하였다(총 염증 스코어는 LPs, BoNT-A 전처리된 군에 비하여 48.9%와 33.3% 만큼 감소하였다). 이러한 결과는 리포톡신 전처리가 AA유도된 방강 염증을 억제하는 것을 나타낸다.

LPs , BoNT -A 및 리포톡신 사전처리에 대한 CGRP 면역염색:

CGRP 면역염색은 리포톡신 전처리된 군에서 방광점막층에서 확인되었고, 이것은 LPs 또는 BoNT-A 전처리된 군에서는 관찰되지 않았다. 이러한 결과는 리포톡신 전처리가 CGRP방출을 억제하는 것을 제시한다.

LPs , BoNT -A 및 리포톡신 사전처리에 SNAP -25 발현:

SNAP-25 양성 신경섬유는 LPs, BoNT-A 처리된 동물의 방광 샘플에서 검출되었다. 그러나 리포톡신 전처리된 동물에서는 SNAP-25 양성 신경섬유는 거의 보이지 않았다. 웨스턴 블롯팅은 SNAP-25 단백질 평균 농도가 LPs와 BoNT-A 전처리된 군에 비하여 66.4%와 58.1% 감소하였음을 입증하였다. 이러한 결과는 리포톡신 전처리는 SNAP-25의 발현을 감소시킴을 나타낸다.

결론

내부수축 간격(ICI)는 LPs 및 BoNT-A 전처리된 쥐에 방광내 AA의 점적주입 후 각각 57.2%와, 56.0% 만큼 감소되었다. 거라나 리포톡신을 수용한 쥐는 AA 점적주입에 대하여 상당히 감소된 반응(ICI 21.1% 감소)를 보였다. 또, 리포톡신 전처리된 쥐는 LPs 및 BoNT-A 전처리된 쥐에 비하여 염증 반응과, SNAP-25 발현에서 상당한 감소를 보였고, CGRP 면역반응성에서는 증가를 보였다. 방광내 리포톡신 투여는 SNAP-25를 절단하였고 구심 신경 단말에서 CGRP 방출을 억제하였고, AA-도입된 과민성 방광을 저지하였다. 이러한 결과는 주사의 필요없이 BoNT-A의 전달을 위한 효과적인 수송체로서 LPs를 지지하고 배뇨근에 영향을 회피한다.

본 발명의 주요 발견은 방광내 리포톡신 전처리가 AA-유도된 방광 과민성과 염증 반응을 억제하고, 이러한 효과는 이 동물 모델에서 LPs 및 BoNT-A 전처리된 군에서 관찰되지 않았다. 소변 정체는 보여지지 않았다. 더욱이, SNAP-25 발현은 LPs 및 BoNT-A 전처리된 군에 비하여 상당히 감소하였고, CGRP는 리포톡신 전처리된 군에서 상당히 증가되었다. 방광내 리포톡신 점적주입은 BoNT-A를 소변정체를 야기하는 주사에 의하지 않고 전달하는 더욱 단순하고 효과적인 방법을 제공할 수 있다.

Claims (7)

1. 리포솜 제형에 있어서, 방광 내에 점적주입을 위한 약제학적으로 수용가능한 수송체 내에 보툴리눔 독소를 포함하는 것을 특징으로 하는 리포솜 제형.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 보톨리눔 독소에 대한 지질의 비율은 전달을 최적화하기 위하여 조절되는 것을 특징으로 하는 리포솜 제형.
   
3. 과민성 방광과 저 요로 증후군을 치료하기 위한 방법으로서, 리포솜 수송체 내의 보톨리눔 독소를 방광내로 점적주입하는 것을 포함하는 방법.
4. 제1항 또는 제3항에 있어서, 상기 보톨리눔 독소는 일곱가지 혈청형중 하나 또는 하나 이상이고, 이중 또는 단일 사슬인 것을 특징으로 하는 리포솜 제형 또는 치료방법.
5. 제1항 또는 제3항에 있어서, 상기 보톨리눔 독소의 투여량은 과민성 방광과 저 요로 증후군에 대한 동일한 효과를 얻기 위하여 주사에 의해 투여되는 투여량보다 적은 것을 특징으로 하는 리포솜 제형 또는 치료방법.
6. 제1항 또는 제3항에 있어서, 상기 점적 주입되는 제형의 체적은 섭취를 최적화하기 위하여 최적화된 것을 특징으로 하는 리포솜 제형 또는 치료방법.
7. 제1항에 있어서, 상기 제형은 질, 항문, 직장, 피부, 목, 구강, 비강 및 경비호흡관을 포함하는 다른 신체 캐비티와 표면 안으로 점적주입되는 것을 특징으로 하는 리포솜 제형.