KR101464208B1 - 당뇨성 신경병증에서 말초 신경의 형태기능의 복원을 위한 상피 성장인자의 용도 - Google Patents

당뇨성 신경병증에서 말초 신경의 형태기능의 복원을 위한 상피 성장인자의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 인간 의약이고, 그리고 특히 약학적 조성물로 상피 성장 인자(EGF)의 사용에 관한 것으로, 상기 조성물은 허혈성 신경염 뿐 아니라 통증성, 감각-운동 신경병증에서 말초신경의 형상기능적 회복을 위한 말초 신경 다발 및/또는 신경절에 흡입을 통해 투여된다. 또한, 본 발명은 EGF 함유 조성물에 관련되는 것으로, 여기서 이 분자는 마취 또는 진통 약물과 함께 제형되거나 또는 미소구형에 캡슐화되고, 그리고 본 발명은 허혈성 신경염 뿐 아니라 통증성, 감각-운동 신경병증에서 말초신경의 형상기능적 회복을 위한 이들의 용도에 관한 것이다.

Description

당뇨성 신경병증에서 말초 신경의 형태기능의 복원을 위한 상피 성장인자의 용도{USE OF EPIDERMAL GROWTH FACTOR FOR THE MORPHOFUNCTIONAL RESTORATION OF PERIPHERAL NERVES IN DIABETIC NEUROPATHY}
본 발명은 당뇨성 신경병증의 임상적 출현 및 허혈성 신경염 출현의 어느 하나를 방지하거나 또는 교정하기 위한, 바람직하게는 말초 신경 다발 및/또는 신경절에 흡입에 의해 투여되는 상피 성장 인자(EGF)를 포함하는 약학적 조성물의 의료적 또는 실험적인 적용에 관한 것이다. 상기 제형은 또한 신경병증 통증을 경험한 절단된 사지의 베이스 상 또는 끝 단의 말초 영역에 국부적으로 투여되어 질 수 있다.
혈액에서의 글루코스의 불충분한 수준과 기타 당뇨병 관련 인자들은 영향을 받는 신경에 의존하여 특이적인 특성으로 일군의 질환을 생성하는 신체의 일부에 신경 섬유를 변화시킬 수 있다. 이들 질환은 통틀어 당뇨성 신경병증이라고 명명되고, 그리고 적어도 세 가지의 주요한 타입이 밝혀졌다: (1) 민감성-운동 신경병증 (대부분의 타입이고 빈발한 형태), (2) 자율 신경병증 및 (3) 단신경병증(Sadikot SM, Nigam A, Das S, et al . (2004). The burden of diabetes and impaired glucose tolerance in India using the WHO 1999 criteria: prevalence of diabetes in India study (PODIS). Diabetes Res Clin Pract , 66, 301-7).
비록 이들 질병의 정확한 메커니즘이 완전하게 이해되지는 않았지만, 신경 섬유에서 미엘린 초(수초)의 손실을 이끄는 글루코스의 악화된 신진대사로부터 유래된 기질의 축적에 의해 신경섬유가 구조적으로 변형되어 지는 것으로 공지되어 있다. 이 보호 초의 손실은 운동 순서의 수용, 전달에서 뿐 아니라 다른 종류의 신호에 있어서 신경 임펄스를 전달하는 능력에 있어서의 지연을 의미한다. 이 직접적인 메커니즘에 부가하여, 신경을 관계하는 혈관이 당뇨병의 기타 만성적인 합병증에 공통됨으로써 방해를 받을 수 있다 (Ashok S, Ramu M, Deepa R, et al. (2002). Prevalence of neuropathy in type 2 diabetes patients attending diabetes center in South India. J Assoc Physicians India , 50, 546-50).
당뇨병에 있어서의 공통적인 것으로, 당뇨병성 신경병증의 초기 상태는 일반적으로 수년간일지라도 자각 증상이 없는 것이고, 지금까지는 이들의 잠행성인 임상적 경과를 예견하는 방법은 없었다. 의사가 민감성 운동 당뇨성 신경병증을 의심하는 경우는, 그는 신경 전도성의 속도를 평가하는 시험을 수행하여 진단을 확인할 수 있다. 이 시험은 선택된 신경을 통해 적은 전류의 전달 속도를 결정하는 것으로 구성된다.
당뇨성 신경병증의 가장 빈번한 형태인 민감성 운동 신경병증에 있어서, 초기증상은 민감성의 손실, 촉감의 부정확한 인지 및 어떤 경우에는 최소한의 피부 찰과상 후 정교한 통증을 포함한다. 일반적으로, 이것은 먼저 수족에서 그리고 대부분은 야간에 발생한다. 감염된 신경이 소화 운동성을 담당하는 경우에, 늦은 소화 진행 또는 장의 리듬의 변화(설사 및/또는 변비)가 일어날 수 있다. 때로는, 당뇨성 신경병증은 심혈관계 조절에 영향을 미쳐, 만일 환자가 갑자기 일어난다면, 졸도나 저혈압을 일으킨다 (Levitt NS, Stansberry KB, Wychanck S, et al . (1996). Natural progression of autonomic neuropathy and autonomic function tests in a cohort of IDDM. Diabetes Care, 19, 751-54).
당뇨성 단-신경병증은 어떤 분리된 신경에 실질적으로 영향을 미칠 수 있어, 안면 일면의 마비, 눈동자 움직임의 변화, 구체적인 해부학적 위치(복부 정중선)에서의 마비 및/또는 통증을 유발한다.
말초 신경병증은 뇌 신경이나 척수의 신경 및 그의 분지에 영향을 미칠 수 있고 그리고 단계적으로 전개되는 경향이 있는 신경병증(신경 손상)의 한 타입이다. 시작 단계에서는 말초, 특히 발에 통증과 간헐적인 뭉침이 있고, 반면 보다 진행된 단계에서는 통증은 더욱 강력해지고 지속적으로 된다. 최종적으로, 신경 퇴화가 매우 심해질 때 무통증 신경병증이 전개된다 (Oh SJ. (1993). Clinical electromyography: nerve conduction studies. In: Nerve conduction in polyneuropathies. Baltimore: Williams and Wilkins, p:579-91).
당뇨병성 신경병증의 가장 심각한 결과의 하나는 연관된 통증으로, 이것은 때로는 높은 강도이고 표준적인 치료 절차에 반응하지 않는다. 많은 성공이 없는 약리학적 및 임상적인 치료는 사용되어 왔다. 이전에는 주로 차단된 섬유에 도달하 도록 관통할 수 있는 진통제, 비 스테로이드성 항-염증제, 카바마제핀 및 펜톨라민과 같은 항경련제, 트리사이클릭 항-우울제 및 국부 마취제와 조합하여 처방되었다. 항경련제는 당뇨성 신경병증 연관 통증을 치료하기 위해 최근까지 사용되어 왔다. 이들 중에서, 통증을 치료하기 위해 가장 최근까지 사용된 것은 가바펜틴이다. 신경화학적으로, 가바펜틴은 감마-아미노 부틸 산(GABA) 의 생체 이용가능성을 증진하고, GAT-1 담체를 저해하여, 차례로 GABA의 재 포획을 감소하고; 노르아드레날린, 도파민 및 5-OH-트립트아민과 같은 바이오제닉 아민의 합성과 방출을 줄이고; 그리고 통증 조절에 포함된 엔세팔린 타입 오피움 펩티드의 방출을 유도한다 (Didangelos TP, Karamitsos DT, Athyros VG, et al . (1998). Effect of Aldose reductase inhibition on cardiovascular reflex tests in patients with definite diabetic autonomic neuropathy. J Diabetes Complications , 12, 201-7).
통증성 신경병증이 있고 그리고 치료에 대한 반응이 결핍된 환자에 있어서, 프로그램된 낮은 강도의 전압을 적용함으로써 감염된 신경을 통한 통증 방지 방법으로 피하를 통한 전기적 자극이 사용되어 왔다.
통증이 있는 당뇨성 신경병증은 만성 및 급성의 형태로 나누어진다. 급성 형태는 진단 후 처음 삼 년 동안 전형적으로 관찰되어 진다. 이것은 자발적으로 시작되고 종료된다. 만성 형태는 평균 8 내지 9년 동안 질환을 앓은 사람들에게 존재한다. 이것은 서서히 시작되고 그리고 다발성 재발로 수년 동안 지속된다. 뇌 신경병증은 시각에 영향을 미칠 수 있고 눈에 통증을 유발할 수 있다.
이들 질환의 증상은 일반적으로 졸림, 뭉침, 신체 일부에 있어서의 감각 상 실, 설사 또는 변비, 방광제어의 상실, 발기부전, 안면, 눈꺼풀 및/또는 입의 하수증이다. 이것은 또한 시력의 변화, 현기증, 팽창곤란, 발음변화 및 근육 수축을 유발할 수 있다. 이들 증상은 감염된 신경에 의존하여 다양하게 변하고 그리고 일반적으로 점진적으로 전개된다.
당뇨성 신경병증에 연관된 감각의 상실은 손상의 위험을 증가시킨다. 적은 감염도 궤양이 되고 절단을 요할 때까지 진행되어 질 수 있다. 게다가, 운동성 신경에서의 손상은 부패와 근육의 불균형을 이끌 수 있다. 달리 말하면, 신경병증은 아마 이 질병에 있어서 다리와 발 절단의 주요 원인일 것이다.
당뇨성 신경병증 치료의 목적은 질환의 진행의 방지와 증상의 감소이다. 글루코스의 엄격한 제어는 그 진행을 회피하는데 중요하다. 예방할 수 있는 특정 치료인 당뇨성 신경병증에서 신경섬유의 지연된 또는 되돌려진 개변은 현재로서 이용 불가능하다. 신경 손상을 회복할 수 있는 약물이 승인되지 않았지만, 이들의 몇몇은 현재로서는 연구 중에 있다. 가능하기로는, 복합 B 비타민이 모든 형태의 신경병증에 대해 가장 많이 사용된 약물이다. 비록 이들 약물이 몇몇 증상을 완화하지만, 고통완화 이상은 아니다. 최근 들어 사용된 다른 치료적인 대안은 그 항산화 특성에 기초한 리포 산의 정맥으로의 적용이다 (Ziegler D, Hanefeld M, Ruhnau KJ, et al . (1999). Treatment of symptomatic diabetic polyneuropathy with the antioxidant alpha-lipoic acid: a 7 month multicenter randomized controlled trial (ALADIN III study). ALADIN III study group. Alpha-lipoic acid in diabetic neuropathy. Diabetes Care, 22, 1296-301). 소 감각 섬유에 구별된 영향 을 나타내는 화합물인 아세틸 L-카르니틴으로 경구 치료를 도입하기 위한 또 다른 분석이 수행되어 졌다.
말초 당뇨성 신경병증에 대한 발병성 근본으로 단지 치료적 과정은 알도스-리덕타제 저해제의 사용을 포함한다. 그 활성은 당뇨성 조직의 신경에서의 혈당과다에 의해 유도된 구조적 및 기능적 대사질환에서 알도스-리덕타제의 역할에 기초된다. 신경병증이 있는 당뇨환자에 있어서 운동 수행성 속도를 개선하는 데 효과적인 솔비닐에 대해서는 임상적 시험으로 평가되었지만, 그러나 이것은 독성효과에 기인하여 시장에서 회수되었다. 스타틸은 동물에 있어서 고무적인 결과를 보였지만, 이들 결과가 인간에 있어서 확증적으로 될 수는 없었다. 일반적으로 알도스-리덕타제 저해제는 매우 독성이 있다.
고려할 만한 낙관론은 임상적으로 신경 성장인자(NGF) 및 기타 성장인자의 도입 가능성을 높였다. 소 섬유(C 섬유) 신경병증이 있는 250 환자로 한 분석에 있어서, 통증 완화 및 뜨거운 자극을 검지하는 능력의 증가가 문헌에 보고되어 졌다. 그러나, 보다 많은 수의 환자로 두 번째의 연속적인 분석에서는, NGF로의 치료는 어떤 이점도 나타내지 않았다 (Vinik AI. (1999). Treatment of diabetic polyneuropathy (DPN) with recombinant human nerve growth factor (rh NGF). Diabetes, 48, A54-5).
혈관 내피 성장 인자(VEGF)로의 유전자 치료법은 동물에서 광범위하게 평가되어, 신경 충격의 전도성과 혈관 제거신경의 밀도에 있어서의 개선을 보였다. 그러나, 이것 및 부가적인 신경영양적인 제제로의 다른 어프로치는 이전의 동물에 있 어서의 긍정적인 결과에도 불구하고 임상적인 실험에서 당뇨성 신경병증으로의 진전을 중지할 수 없었다 (Schratzberger P, Walter DH, Rittig K, et al . (2001). Reversal of experimental diabetic neuropathy by VEGF gene transfer. J Clin Invest, 107, 1083-92). 증상을 감소하기 위해 아미트립틸린, 가바펜틴 및 카르바마제핀과 같은 경구 약물 또는 캡사이신으로의 국부적인 치료가 권장되어 졌다.
당뇨성 신경병증의 발병성 메커니즘은 잘 이해되지 않는다. 현행 치료는 통증을 완화하고 연관된 증상의 부분을 조절할 수 있지만, 과정은 일반적으로 진행성이다. 가장 나쁜 부분은 이 질환에 대한 특정한 약물이 다음 미래에도 이용 가능한 것으로 여겨지지 않는다는 것이다.
본 발명은 허혈성 신경염에서 뿐 아니라 통증 있는 감각-운동 신경병증에서 말초 신경의 형태기능적 복원을 위한 말초 신경 다발 및/또는 신경절에 흡입에 의해 투여되는 약학적 조성물에 EGF를 사용하여 상술한 문제를 해결하는 데 공헌한다.
말초 신경의 당뇨병 관련 변화는 복잡하고 그리고 아마 다양한 원인을 포함한다. 두 가지 주요한 발병적 메카니즘은 1) 장기간 진행에 있어서 말초 신경에 구조적 변화를 유발하는 일련의 생화학적 변칙으로 이끄는 솔비톨 축적의 이론, 2) 저산소증이나 허혈에 의해 발병된 신경 섬유에서의 변화에 기원하는 신경속막 미소혈관의 구조적 및 기능적 손상이다. 당뇨성 신경병증의 발생의 다른 메카니즘은 효소 생산의 제어, 보충 시스템의 활성화, 철이나 구리와 같은 중금속에 대한 높은 친화도를 갖는 단백질의 축적, 및 신경영양적 인자의 감소이다. 강조적으로 요구되어진 또 다른 요소는 과산화 및 질소화 생성물의 축적이다. 신경속막 산소 강도의 감소가 신경병증으로 고통을 당하는 당뇨병 환자의 신경에서 관찰되었다. 이들 모두는 중립 구조에서 높은 수준의 어팝토시스와 세포사를 이끈다. 이것이 왜 당뇨성 신경병증이 신경 전도 속도(NCV)에서의 유의적인 감소와 미엘린화 신경 섬유의 수준에서 기능적 단위의 손실로 특징지어진다는 이유이다. 말초 다신경병증은 통증의 존재로 특징되어 지며, 알파 및 C 섬유 기능이상에 관련된다
일반적으로, 본 발명의 조성물은 이것을 절단 전 후에 다리의 말단 통증 영역인 신경 다발 및/또는 신경절 근처에 두고, 그리고 C 섬유에 있어서 예술 감상 손상에서 전문가인 이들의 경우에 국부적 흡입에 의해 적용된다. 몇 주 동안 본 조성물로의 치료는 신경병증 통증을 제거하고; 비자율적 질환을 조절하고; 그리고 압력과 온도에 대한 말초 감수성을 복원하는 것이 가능한 것으로 나타났다.
당뇨성 동물에 약학적 조성물의 세 번의 조직적 주입 또는 말초 신경 다발에서의 주입 후 다음이 감지되었다:
1. 좌골 신경의 미엘린 초의 완전성에서의 개선.
2. 액손 이데마의 재생.
3. 신경돌기 심경섬유의 보전.
4. 맥관 신경의 완전성.
5. 신경속막 콜라겐화의 감소
6. 운동 섬유의 전도 속도의 정상화.
조성물은 1 내지 5밀리리터의 부피로 대상 구조 근처에 서서히 방출되었다. 신경다발과 신경절에서 흡수의 빈도는 주당 일 회에서 삼 회 사이로 될 수 있다. 본 발명에 기술된 조성물로의 치료는 알도스 리덕타제, 아미노구아니딘, 경구 또는 비경구 히포글리세믹, 인슐린, 인슐린에 대한 말초 감수성의 자극제, 펩티드와 같은 글루칸, 비타민 치료요법, GABA 시스템의 어고니스트 또는 증폭제, 엔돌핀 전구체, 항산화제, 지방산 또는 이들의 전구체, 진통제 개별 또는 조합된 치료법, 트리사이클릭 항우울제 및 항염증성 약물과 연계되거나 되지 않을 수 있다. 환자에 투여되는 적용의 수는 환자의 임상적 증상의 심각성에 따라 다양하게 변한다. 증상이 재발하면 치료의 몇 주기가 요구되어 진다.
본 발명의 하나의 특정한 실시형태는, 이 신경병증의 보다 중요한 증상이 다리에 영향을 미칠 때, 감각-운동 신경병증에서의 말초 신경의 형태기능적 복원을 위한 말초 신경 다발 및/또는 신경절에 흡입에 의해 투여되는 제형을 제조하기 위한 EGF의 사용이다. 바람직한 실시형태에 있어서, 말초 신경의 형태기능적 복원을 위한 말초 신경 다발 및/또는 신경절에 흡수를 통해 투여되는 약학적 조성물을 제조하기 위해 사용된 EGF는 인간 재조합 EGF이다.
본 발명의 다른 특정한 실시형태에서, EGF 함유 약학적 조성물의 흡수는 좌골 신경에서 이루어진다.
본 발명의 다른 목적은 당뇨성 신경병증에서의 말초 신경의 형태기능적 복원을 위한 말초 신경 다발 및/또는 신경절에 흡수를 통해 투여되는, EGF 및 적어도 하나의 국부적 마취제나 진통제의 조합을 포함하는 주사가능한 약학적 조성물이다. 특정한 실시형태로서, 상기 마취제는 리도카인으로, 이것은 EGF 흡입에 의해 유발된 통증을 완화하는데 기여한다. 더욱이, 본 조성물에 존재하여 수반되는 마취제는 기타들 중에 뷰피바카인 또는 노보카인일 수 있다.
또한, EGF가 제어된 방출 시스템의 도움으로 말초 신경 다발 및/또는 신경절에 흡수를 통해 투여되는 조성물이 본 발명의 일부이다. 바람직한 실시형태에서, 상기 제어된 방출 시스템은 EGF를 담지하는 락틱 산 및 글리콜 산, 또는 폴리락틱 산 중합체로 만들어진 미소구형이다.
미소구형은 몇 가지 이점을 제공할 수 있는데, 가장 공통적인 것이 투여 빈도의 감소이다. 본 발명은 당뇨성 신경병증의 치료에 특이적인 이용가능한 약물의 결핍에 대해 기술적인 해결책을 제공한다. 그러나, 이 EGF 분자가 미소구형에 결합하지 않은 EGF 함유 조성물로의 치료는 일 주일에 적어도 두 번 약물의 상당하는 복용량의 적용을 요한다. 이러한 불편한 점을 고려하여, EGF의 서서히 그리고 지연된 방출을 위한 제형의 사용은 산물의 투여 빈도를 감소하여 환자에게 유익하다. 미세구형에 기초된 제형은 다음의 이점을 가진다:
◆ 투여빈도를 감소하여, 환자에게 치료에 대한 보다 양호한 충실성을 이끔.
◆ 혈청에서 단백질 준위에 등락의 제거에 기인한 치료적 이점의 증가.
◆ 투여된 복용량의 보다 양호한 수행성에 기인한 치료에 필요한 전체 복용량의 현격한 감소.
◆ 적용 순간에 신체에서 방출된 단백질 양에 있어서의 감소에 기인한 부작용의 현격한 감소.
도 1은 EGF를 담지한 미소구형의 현미경사진이다. 현미경사진 아래의 막대는 길이 10㎛를 나타낸다.
도 2는 PAL 미소구형에 캡슐화된 EGF의 방출 프로필이다. 축 X는 일(日)로 시간을 나타내고 그리고 Y 축은 방출된 EGF의 양으로, 분석에서 사용된 미소구형 내 EGF 전체 양의 백분율로 표현되었다.
실시예 1. 당뇨성 신경병증의 회복에 있어서 약학적 조성물의 예방적 효과.
본 연구의 목적은 진성 당뇨병의 동물 모델에서 EGF 함유 약학적 조성물의 신경-보호적 효과를 평가하기 위한 것이다. 먼저, 스트렙토조토신을 투여하여 위스터 랫트에 진성 당뇨병 유발의 방법론을 확립할 필요가 있다.
체중 200-250그램의 웅성 위스터에 소디움 시트레이트 버퍼 내에서 75 mg/kg으로 스트렙토조토신을 피하 주입한다. 그런 다음 물이 다음 24시간 동안 10% 슈크로스 용액으로 대체되어, 저혈당에 의해 유발된 사(死)를 방지한다. 혈액에서의 글루코스 준위가 주입 후 다음 72시간 동안 매일 아침에 모니터된다. 15mmol/L 이상의 지속된 글루코스 값을 갖는 동물들만이 사용되었다. 랫트는 우리 당 4마리씩 수용되고 그리고 통상적인 방법에 의해 사육되었다. 다른 80마리 랫트의 동시시행 군 들은 스트렙토조토신이 없는 시트레이트 버퍼를 주입하고 그리고 당뇨병 군과 유사한 방법으로 다루어졌다. 이 군에서 72시간 동안 혈당증에 대한 평균 값은 5.87mmol/L이었다.
당뇨성 신경병증의 예방에 있어서 EGF 함유 약학적 조성물의 효과를 연구하기 위해, 다음의 실험적 디자인이 각 하나의 군 당 10 랫트로 하여 사용되었다:
● 대조군 - 복강 내 경로로 일주일에 삼 회 생리식염수를 1ml 수용한 당뇨병 랫트.
● 처리군 1 - 복강 내 경로로 주에 한번 EGF 함유 약학적 조성물을 1ml 수용한 당뇨병 랫트.
● 처리군 3 - 복강 내 경로로 일 주일에 삼 회 EGF 함유 약학적 조성물을 1ml 수용한 당뇨병 랫트.
모든 처리는 스트렙토조토신 주사 일 주일 후 시작하여 8주 동안 수행되었다. 사용된 조성물은 75㎍의 인간 재조합 EGF/ml을 함유한다. 다음 몇 가지 타입의 관찰이 시험 하에 있는 랫트에서 수행되었다:
(1) 아픈자극에 반응하는 임계치(nociceptive threshold ; NCT)의 결정. 통증 테스트
꼬리에 증가하는 압력의 적용에 의한 통증 테스트가 실험 군의 각 하나 당 10 마리의 동물을 사용하여 처리 시작 28 및 56일 후에 수행되었다. 그램으로 표시된 NCT가 유고 바실 타입 아날게시미터(Ugo Basile type analgesimeter)가 철회 반사로 전개될 때까지 동물의 꼬리에 점진적으로 증가하는 압력을 가하는 유고 바실 타입 아날게시미터를 사용하여 결정되었다. 인간 당뇨성 신경병증에 있어서 아픈자극에 반응하는 임계치는 감소되었다. 표 1은 28일에 측정된 NCT의 결과를 나타낸다.
NCT 테스트의 결과 (28 일).
실험군 NCT* (그램)
식염수 군 120 ±11
처리군 1 125 ±18
처리군 3 123 ±16
비당뇨병 랫트 128 ±9
*평균 및 표준편차로 표현된 데이터
동물의 아픈자극에 반응하는 패턴에서의 변화는 질환의 전개 28일 후에 검지되지 않았다. 이것은 지각과민의 임상적 형태가 여전히 개시되지 않았다는 것을 제시한다. 이런 이유 때문에, 처리의 효과는 이 시점에서는 여전히 인정되어 질 수 없다. 56일에서의 실험의 결과는 다음 표 2에 나타나 있다.
결과가 입증하는 바와 같이, 당뇨병 유발 2개월 후 동물에 있어서 말초 당뇨성 신경병증의 효과를 인정할 수 있다. 통증 감수성 임계치에 있어서의 감소는 이 실험 시점에서 검지되었다. 또한 이 개월 동안 식염수를 수용한 당뇨병 랫트 군과 일주일 당 삼 회 EGF 함유 조성물로의 처리를 받은 군과의 차이는 현저하다.
NCT 테스트의 결과 (56 일).
실험군 NCT (그램)
식염수 군 80 ±19**
처리군 1 91 ±14*
처리군 3 121 ±22
비당뇨병 랫트 123 ±6
식염수로 처리된 당뇨병 군과 처리 3을 받은 군 뿐 아니라 비당뇨병 랫트 군과의 유의성 있는 차이가 관찰되었다(**p<0.01 ANOVA with Bonferroni correction). 또한 처리 1 군과 처리 3 및 건강한 동물과의 사이에 유의성 있는 차이가 있었다. 처리된 동물은 일반적으로 통증에 보다 내성을 보였다는 것을 밝힌 것은 EGF 함유 조성물로의 처리가 감수성 섬유의 퇴화를 방지한다는 것을 제시한다.
(2) 감수성 섬유에 의한 임펄스 전도 속도의 결정
감수성 및 운동 섬유에 대한 EGF 함유 약학적 조성물의 보호적 효과를 평가하기 위하여, 전기 충격파의 전도 속도가 처리 시작 60일 후에 측정되었다. 15마리 동물들이 각각의 실험 군에서 사용되었다. 당뇨성 신경병증에서 전도 속도는 일반적으로 감소되었다.
이극성 전극을 사용한 좌골-경골 경로에 말단 초-최대 자극이 운동 전도성을 연구하기 위해 사용되었다. 감수성 경로에서 전도 속도의 결정은 꼬리에서 기부점에 자극을 적용하여 수행하였고 3cm 떨어져 측정했다. 60일에 이 연구의 결과는 표 3에 나타냈다.
60일에 운동전도속도(MCV).
실험군 MCV (m/s)
식염수 군 34 ±18**
처리군 1 45 ±13*
처리군 3 56 ±11
비당뇨병 랫트 60 ±8
식염수로 처리된 당뇨병 군과 처리 3을 받은 군 뿐 아니라 비당뇨병 랫트 군과의 유의성 있는 차이가 관찰되었다(**p<0.01 ANOVA with Bonferroni correction). 또한 처리 1 군과 처리 3 및 건강한 동물과의 사이에 유의성 있는 차이가 있었고(*p<0.05); 그리고 처리군 1군과 식염수를 수용한 대조 당뇨병 동물과 사이에 유의성 있는 차이가 있다.
조성물의 긍정적 효과, 특히 주마다 세 번의 적용을 수용한 군에 있어서의 효과를 주목하라. 운동 섬유에서 전도의 값은 건강한 동물에서의 것에 매우 유사하다. 비당뇨병 동물의 군과는 통계적인 차이가 여전하지만, 처리 1을 수용한 군에서의 랫트 또한 전도 속도를 개선하였다. 60일에서의 감수성 전도 속도(SCV)의 연구의 결과는 표 4에 나타냈다.
60일에 감수성 전도 속도(SCV).
실험군 SCV m/s
식염수 군 31 ±7**
처리군 1 38 ±6*
처리군 3 44 ±9
비당뇨병 랫트 56 ±3
식염수로 처리된 당뇨병 군과 처리 3을 받은 군 뿐 아니라 비당뇨병 랫트 군과의 유의성 있는 차이가 관찰되었다(**p<0.01 ANOVA with Bonferroni correction). 또한 처리 1 군과 처리 3 및 건강한 동물과의 사이에 유의성 있는 차이가 있었다(*p<0.05); 처리군 1군과 식염수를 수용한 대조 당뇨병 동물과 사이에는 통계적 차이가 없다. 이 연구는 일 주일에 삼 회 투여되어 질 때 동물의 기능적 완전성을 보존하기 위한 EGF 함유 약학적 조성물의 효과를 입증한다.
(3) 말초 신경의 혈액 관류의 완전성에 있어서 조성물의 영향.
랫트의 우측 좌골 신경이 모델로서 사용되었다. 열 마리의 동물들이 각 하나의 실험 군에 포함되었다. 유사한 수의 비당뇨병 랫트가 레퍼런스 값을 계산하기 위해 사용되었다. 레이저 도플러 관류 영상(LDPI) 시스템이 사용되었다. 신경으로 말단 조직에서 관류의 데이터는 제로 값으로 프로그램되었다. 대조 동물은 측정 전에 2개월 동안 식염수를 수용했다. 모든 결정은 동일한 조건의 마취와 환경적 조건하에서 행하여 졌다. 이들은 표 5에 반영되어 졌다.
레이저 도플러 관류 영상 시스템으로 수행된 연구의 결과.
실험군 LDPI Units
식염수 군 525.5 ±88.8**
처리군 1 653.4 ±41.9**
처리군 3 988.7 ±80.3
비당뇨병 랫트 1301.7 ±112.2
식염수로 처리된 당뇨병 군과 치료적 조성물을 수용한 군인 2개월 동안 처리 및 또한 일 주일에 삼 회 치료적 조성물을 수용한 것 양자 사이의 유의성 있는 차이(**p<0.01 ANOVA with Bonferroni correction)가 관찰되었다. 후자의 군과 건강한 비당뇨병 랫트로부터의 값 사이에는 통계적 차이는 검지되지 않았다.
(4) 부검후 결정 및 특징화
조직형태계측 연구
처리가 일단 종결되고, 동물은 마지막 복용 10일 후에 주어진 당뇨병의 유발 70일 후 희생되고, 그리고 상술된 것과 같은 분석이 완료되었다. 동물들은 마취제의 과다 복용으로 희생되었고 그리고 pH 7.4 식염수 완충액으로 채웠다. 실험군 당 전체 10마리의 동물들이 조직형태계측 연구에 포함되었고, 그리고 동등한 수의 랫트가 생화학적 결정을 위해 사용되었다. 양 시스템에서, 양 수족으로부터 좌골 신경이 절개되었다; 분획은 진행될 때까지 -70℃로 유지되었다. 조직학적 및/또는 조직형태계측 연구를 위해 취해진 샘플은 헤마톡실린/에오신 및 톨루이딘 블루로 염색되었다. 동일한 신경의 적어도 다섯 분획이 MADIP 프로그램을 사용하여 정량적으로 연구되었다. 분획은 셀로이딘 및 젤라틴의 블럭에 포함되어 졌고, 그리고 이들 블럭은 균질화되고 그리고 횡으로 절단되었다. 다음의 조직학적 인디케이터가 평가되었다:
▶ 신경의 길이방향 절단으로 상수 배율로 10X를 사용한 10 현미경적 분야에서 전체 수의 혈관(외막신경/말초신경).
▶ 탈미엘린화 섬유의 백분율. 현미경적 분야 당 값을 평균함에 의해 평가됨(x20, 적어도 다섯 분야에서).
▶ 현미경적 분야 당 (융기된 또는 일그러진)손상이 있는 미엘린 또는 비-미엘린 섬유의 백분율(x20, 적어도 다섯 분야에서).
▶ 신경속막의 콜라겐화의 백분율(온건한 것: 25 내지 50%; 중증인 것: 횡으로 슬라이스된 신경속막 영역 및 적어도 세 개의 다른 영역에서 50% 이상).
이 연구 결과는 다음 표 6에 나타냈다.
좌골 신경의 분획에 대해 수행된 형태계측 연구.
실험군 혈관의 수 탈미엘린화 섬유의 % 손상입은
섬유의 % 		콜라겐화
영역의 %
식염수 군 87.65±17.8 64.77±19.72 81.5±9.73 58.93 ±28
처리군 1 111.33±14.5 51.2±17.94 60.12±11 42.69 ±14.71
처리군 3 158.6±26.12 35.56±12.18 41.38±10.26 13.45 ±11.82
비당뇨병
랫트		 194.42±43.81 0 0 0
식염수로 처리된 당뇨병 군과 건강한 대조 랫트 사이의 혈관 수에 있어서 통계적으로 유의성 있는 차이가 수록되어 졌다(p=0.0023). 더욱이, 통계학적인 차이 또한 식염수 군과 처리 1을 수용한 군을 비교할 때 발견되었다(p=0.031). 또한 식염수 군이 처리 3을 수용한 군을 비교할 때 통계학적인 차이(p=0.014)가 있었다. 결과는 본페로니 콜렉션을 한 ANOVA에 의해 분석되었다. 백분율은 피셔 이그젝트 테스트로 비교되었다.
세 개의 변수에 대한 처리 군들 간의 통계학적으로 유의성 있는 차이가 발견되었다: 탈미엘린화 섬유의 백분율, 손상이 있는 섬유의 백분율 및 콜라겐화 영역의 백분율. 인슐린 처리 당뇨병 마우스의 군과 처리 3을 수용한 동물과의 사이의 통계학적 차이가 검지되었다 (p<0.05).
부분적 결론 - 이 개월 동안 주당 삼 회 EGF 함유 조성물로의 처리는 탈미엘린화 진행을 방지할 수 있고, 좌골 신경 섬유의 형태학적 퇴화를 유의적으로 감소할 수 있고, 그리고 결론적으로 신경속막 콜라겐화를 방지할 수 있다. 유사한 방법으로, 이 조성물로의 지연된 처리는 신경에 영양을 공급하는 혈관의 퇴화와 위축증을 유의적으로 회피한다. 모든 이들의 발견은 감각 및 운동 자극에 관해 기능적으로 수행된 테스트와 레이저 도플러 시스템으로 한 관류 연구와 부합된다.
(5) 신경 분획의 생화학적 특징화
실험군 당 10마리 동물이 수집된 좌골 신경의 분획에서 생화학적 결정을 수행하기 위해 사용되었다. 연구된 생화학적 변수는 다음과 같다:
산화환원 프로필:
▶ 전체 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(tSOD) 효소의 활성.
▶ 카탈라제 효소의 활성.
▶ 전체 하이드로퍼옥사이드의 액손 내 축적 (HPT).
▶ 말로닐디알데하이드의 액손 내 축적 (MDA).
이 연구의 결과는 표 7에 나타냈다.
좌골신경으로부터의 분획에서 산화환원 상태의 특징화
실험 군 tSOD a ,b 카탈라제 HPT c MDA
비당뇨병 랫트 2267.05
±202.9		 26.40
±5.95		 18.66
±1.43		 0.06
±0.01
식염수 군 433.55±95.21** 440.26±52.19** 208.62±11.3* 0.32
±0.02**
처리군 1 958.17±244.61* 274.60±52.3* 143.05±1.98* 0.24
±0.04*
처리군 3 2102.83±112.67 37.62
±8.13		 25.15
±1.81		 0.08
±0.02
a 이 값은 평균 및 표준편차로 표현됨. b 미뉴트 당 단백질의 밀리그램 당 유닛트로 표현된 효소. c 단백질의 HPT 및 MDA nmol/mg.
플라시보 처리된 당뇨병 동물과 EGF 함유 조성물로 일 주일 당 삼 회 처리된 것과의 유의성 있는 차이가 관찰되었다(** p=0.0001). 또한 EGF 함유 제제로 일 주일에 한번 및 일 주일에 세번 처리된 군과의 사이 및 또한 비당뇨병 동물과 비교할 때 차이가 있었다(*p=0.003). 건강한 동물과의 일 주일에 세번 처리된 군과의 사이에 두 개의 꼬리 T 스튜던트에 따른 차이가 없었다.
글루코스 축적은 몇 가지 생화학적 메카니즘을 통해 지질 과산화의 준위를 증가하고 그리고 다음으로 진행 글리코실화 최종산물(AGE)의 조직 내에 축적을 증가하기 때문에, 이 과정과 관련된 마커들의 평가가 필수불가결하다. 표 7에 나타난 결과에 의해 입증되어 진 것과 같이, 분석된 약학적 조성물로의 처리는 과산화 과정을 표지하는 대사산물의 축적을 유의적으로 감소하고, 그리고 적용의 빈도에 의존한다. 병행하여, 이 처리는 슈퍼옥시다제 디스뮤타제의 감소를 방지할 수 있다.
(6) 좌골 신경 분획에서 지질단백질 리파제 ( LPL ) 효소적 활성.
각 동물로부터 신경의 분획이 클렙스-링거 버퍼 내 3 ㎍/ml 헤파린과 함께 37℃에서 50분 동안 배양되어 진다. 이들 샘플로부터의 동등량이 그런 다음 [14C] 트리올레인-포스파티딜콜린의 존재하에서 배양되었다. 14C 표지 지방산이 전통적인 방법으로 정량되었다. LPL 활성은 조직의 그램 및 미소분 당 방출된 지방산(RFA)의 나노몰로 표시되었다. 결과는 표 8에 나타냈다.
좌골 신경에서 LPL 활성.
실험군 LPL ( nmoles RFA / min /g)
비당뇨병 랫트 6.18 ±1.05
식염수 군 2.24 ±0.97**
처리군 1 3.75 ±2.2*
처리군 3 5.41 ±1.83
식염수로 처리된 당뇨병 랫트와 처리 3을 받은 군 뿐 아니라 비당뇨병 랫트 군과의 사이에 유의성 있는 차이가 발견되었다(**p<0.01, ANOVA and Tukey test). 또한 처리군 1과 대조 동물과의 사이에 차이(*p<0.05)가 있었다. 처리군 3과 비당뇨병 동물과의 사이에 통계적으로 유의성 있는 차이가 없었다.
본 분석은 EGF 함유 조성물로의 처리는 LPL 효소적 활성의 보전을 보증하여, 다음으로 이 기능에 대한 인지질의 적절한 공헌에 기인하여 미엘린을 합성하기 위한 신경의 능력을 개선하는 것을 보여준다.
실시예 2. 확립된 당뇨성 신경병증의 회복에 있어 약학적 조성물의 효과.
본 연구의 목적은 약학적 조성물의 신경회복 효과를 평가하기 위한 것이다. 체중 200-250그램의 웅성 위스터 랫트에 소디움 시트레이트 버퍼 내에서 75 mg/kg으로 스트렙토조토신의 피하 주사를 주입하고, 그리고 질환 유발 120일 후 까지 전개하도록 둔다. 이 실험에 사용된 모든 랫트는 지속된 글루코스 준위가 15mmol/L 이상을 나타냈다. 동물들은 이전에서 기술되어 진 바와 같이 조작되고 그리고 사육되었다. 동물들이 스트렙토조토신 대신에 식염수를 수용한 동시적 대조군이 설정되었다. 동물들은 스트렙토조토신 챌린지 후 삼 개월 동안 관찰되었다. 이 기간 후, 모든 랫트의 전기물리학적 특성화가 수행되어 지고 그리고 동물들은 두 개의 랜덤한 처리 군으로 분할되었다:
군 I. 복강내 경로로 일 주일에 3일 식염수(1ml)를 수용한 동물.
군 II . 복강내 경로로 일 주일에 3일 1ml 내에 100㎍의 EGF를 갖는 약학적 조성물을 수용한 동물.
동일한 동물 종으로부터 적어도 10마리 건강한 비당뇨병 랫트의 군이 비당뇨병 동물들에서의 물리학적 값에 대한 레퍼런스로 포함되었다. 처리 시작 전의 동물의 신경물리학적 특성화 결과는 표 9에 나타냈다. 이들 탐구에서 사용된 방법론은 이미 기술되어 졌다.
처리 시작 전의 동물의 신경물리학적 특성화
연구된 변수 당뇨병 비당뇨병
아픈자극에 반응하는 임계치 55±5 grams 115 ±15 grams
운동 전도 속도 20.53±8.44 m/s 66.18 ±4.32 m/s
감각 전도 속도 26.88±13.27 m/s 69.94 ±11.8 m/s
신경에 대한 혈액 관류 480.61±65.92
LDPI		 1413.8 ±73.41 LDPI
(1) 아픈자극에 반응하는 임계치( NCT )의 결정. 통증 테스트
꼬리에 점진적으로 증가하는 압력의 적용으로 구성된 통증 테스트 및 다음에 기술된 나머지의 탐구가 당뇨병 유도 120일 후 및 치료의 한 달 후에 수행되었다. 각 하나의 실험군 당 적어도 10마리의 동물들이 사용되었다. NCT 결정은 전술한 바와 같이 수행되었고 그리고 결과는 표 10에 묘사되었다.
NCT 테스트의 결과.
실험군 UNC ( grams )
당뇨병 + 식염수 55 ±10 **
당뇨병 + 처리 80 ±5 *
비당뇨병 랫트 115 ±10
식염수로 처리된 당뇨병 랫트의 군과 처리를 받은 랫트의 군 뿐 아니라 비당뇨병 랫트 군과의 유의성 있는 차이가 관찰되었다(**p<0.01 ANOVA and Bonferroni correction). 또한 처리 군과 비접촉 동물과의 사이에 차이가 있었다(* p<0.05).
이 결과는 당뇨병 유발 삼 개월 후에, 건강한 동물과 비교하여 50% 이상으로 통증 감각 임계치에서의 감소인 말초 신경병증의 진행에 있어서의 증가가 있었다는 것을 입증한다. 또한 당뇨병 랫트의 군과 약학적 조성물로 일 개월 동안 일 주일에 삼 회 처리된 군과의 사이에 관찰된 차이는 주목할 만하다.
일반적으로 처리된 동물은 통증에 대해 보다 높은 내성을 보이며, 이 발견은 약학적 조성물로 처리는 감각 섬유를 몇 가지 방식으로 보정하거나 복구한다는 것을 제시한다.
(2) 운동 섬유를 통한 임펄스 전도 속도의 결정
감수성 및 운동 섬유의 복원에 대한 약학적 조성물의 효과를 평가하기 위하여, 전기 충격파의 전도 속도가 당뇨병을 유발한지 120일 후에 약학적 조성물 또는 식염수로 동물을 처리한 후 측정되었다. 실험군 당 15마리 동물들이 각각 사용되었다. 다음의 절차는 이전의 연구에 대해 이미 기술되었고 그 결과는 표 11에 나타냈다.
운동 섬유의 전도 속도의 탐구.
실험군 속도 m/s
당뇨병 + 식염수 23.62 ±18.7 **
당뇨병 + 처리 54.8 ±1.66 *
비당뇨병 랫트 64.72 ±10.55
식염수로 처리된 당뇨병 랫트의 군과 본 발명의 조성물을 수용한 랫트의 군 뿐 아니라 비당뇨병 랫트 군과의 유의성 있는 차이가 발견되었다(**p<0.01 ANOVA and Bonferroni correction). 또한 EGF 함유 조성물로 처리된 군과 온전한 비당뇨병 동물과의 사이에 차이가 있었다(* p<0.05).
이 결과는 당뇨병 유발 삼 개월 후에, 특히 건강한 동물과 비교할 때 운동 섬유를 따라 자극의 전도 속도의 감소 및 말초 신경병증의 진행에 있어서의 증가가 있었다는 것을 입증한다. 그러나 약학적 조성물로의 처리는 한 달 동안 일 주일에 삼 회 식염수를 수용한 당뇨병 랫트의 군에 비하여 큰 차이가 있는 것으로 인지된다는 것은 중요하다. 일반적으로 약학적 조성물로의 처리는 운동 신경 섬유를 회복하여, 그의 전도 능력을 개선하였다.
연구된 또 다른 측면은 표 12에 반영된 것과 같은 감각 전도 속도(SCV) 이다.
감각 전도 속도(SCV)의 연구.
실험군 속도 m/s
당뇨병 + 식염수 31.27 ±10.6 **
당뇨병 + 처리 59.42 ±3.35 *
비당뇨병 랫트 68.9 ±11.27
식염수로 처리된 당뇨병 랫트의 군과 EGF 함유 조성물을 수용한 랫트의 군 뿐 아니라 비당뇨병 랫트 군과의 유의성 있는 차이가 발견되었다(**p<0.01 ANOVA and Bonferroni correction). 또한 본 발명의 조성물로 처리된 군과 온전한 비당뇨병 동물과의 사이에 차이가 있었다(* p<0.05).
이 결과는 당뇨병 유발 삼 개월 후에, 특히 건강한 동물과 비교할 때 감각 섬유를 따라 자극의 전도 속도의 감소 및 말초 신경병증의 진행에 있어서의 증가가 있었다는 것을 입증한다. 변수의 퇴화는 50% 이상이다. 그러나 약학적 조성물로의 처리는 한 달 동안 일 주일에 삼 회 식염수를 수용한 당뇨병 랫트의 군에 비하여 큰 차이가 있는 것으로 인지된다는 것은 중요하다. 일반적으로 약학적 조성물로의 처리는 감각 신경 섬유를 회복하여, 아픈 자극에 반응하는 임계 시험과 일치한다.
(3) 말초 신경의 혈액 관류의 완전성에 대한 약학적 조성물의 영향.
랫트의 우측 좌골 신경이 모델로서 다시 사용되었다. 열 마리의 동물들이 각 하나의 실험 군에서 사용되었다. 비당뇨병 랫트로부터의 값이 레퍼런스로 포함되었다. 비록 본 내용에서는 동물들이 이미 삼 개월 동안 당뇨병이었고 그리고 실험군에 따라 EGF 함유 조성물이나 식염수로 일 개월 동안 지속된 처리를 수용하였지만, 실험은 이전에 기술한 것과 같이 수행되었다. 결과는 표 13에 묘사되어 졌다.
레이저 도플러 관류 영상 시스템으로 수행된 연구의 결과.
실험군 LDPI Units
식염수 대조 418.5 ±66.9**
처리군 934 ±60.18*
비당뇨병 랫트 1397.3 ±101.55
식염수로 처리된 당뇨병 랫트 군과 EGF 함유 조성물을 수용한 군 뿐 아니라 건강한 랫트의 대조군과의 유의성 있는 차이가 발견되었다(**p<0.01 ANOVA and Bonferroni correction). 또한 본 발명의 조성물로 처리된 군과 온전한 비당뇨병 동물과의 사이에 유의성 있는 차이가 있었다(* p<0.05).
본 발명의 조성물로 처리는 신경에 혈액 관류의 준위를 명확하게 개선하였다. 비록 그 값은 여전히 건강한 동물들과는 필적할만하지는 않지만, 이들은 식염수를 수용한 당뇨병 랫트에 비교할 때 아주 높다. 이 효과 뒤에 있는 분자 메카니즘은 여전히 명확하지는 않다.
(4) 부검후 결정 및 특징화
조직형태계측 연구
EGF 함유 조성물이나 식염수로 처리의 종료 한 달 후, 그리고 질병 유발 120일 후, 동물은 마취제의 과다 복용으로 희생되었고 그리고 pH 7.4 식염수 완충액으로 채웠다. 실험군 당 전체 10마리의 동물들이 조직형태계측 연구에 포함되었고, 그리고 동등한 수의 랫트가 생화학적 결정을 위해 사용되었다. 양 시스템에서, 양 수족으로부터 좌골 신경이 절개되었다. 절차는 신경병증 손상 방지 분석에 대해 기술되어 진 것에 유사하다. 조직학적 및 조직형태계측 연구를 위해 취해진 샘플은 헤마톡실린/에오신 및 톨루이딘 블루로 염색되었다. 동일한 신경의 적어도 다섯 분획이 MADIP 프로그램을 사용하여 정량적으로 연구되었다. 분획은 글루타르알데하이드로 후-고정된 OCT 블럭에 포함되어 졌고, 그리고 횡으로 그리고 종으로 절단되었다. 평가된 조직학적 인디케이터 뿐 아니라 진행 및 평가를 위해 사용된 과정은 위에 기술되어져 있다:
▶ 신경의 길이방향 절단으로 상수 배율로 10X를 사용한 10 현미경적 분야에서 전체 수의 혈관(외막신경/말초신경).
▶ 탈미엘린화 섬유의 백분율. 현미경적 분야 당 값을 평균하여 평가됨(x20, 적어도 다섯 분야에서).
▶ 현미경적 분야 당 (융기된 또는 일그러진)손상이 있는 미엘린 또는 비-미엘린 섬유의 백분율(x20, 적어도 다섯 분야에서).
▶ 신경속막의 콜라겐화의 백분율(온건한 것: 25 내지 50%; 중증인 것: 횡으로 슬라이스된 신경속막 영역 및 적어도 세 개의 다른영역에서 50% 이상).
이 연구 결과는 다음 표 14에 나타냈다. 당뇨병 랫트와 온전한 랫트 양자 사이의 혈관 수에 있어서 통계학적으로 유의성 있는 차이가 수록되어 졌다(p<0.001). EGF 함유 조성물 처리 랫트와 식염수를 수용한 동물들 사이의 통계학적인 차이가 또한 발견되었다 (p<0.05, ANOVA with Bonferroni correction).
좌골 신경의 분획에 대해 수행된 형태계측 연구. 30일 후 평가.
실험군 혈관의 수 탈미엘린화
섬유의 % 		손상입은
섬유의 % 		콜라겐화
영역의 %
식염수 대조 43.2±9.8 71.5±22.7 83±7.5 64.1±16.4
처리군 86.5±14.6 50.6±12.3 52.6±8.3 46.3±9.5
비당뇨병 랫트 178.1±44.2 0 0 0
당뇨병 동물에서 탈미엘린화 섬유, 손상이 있는 섬유 및 콜라겐화 섬유속막 영역의 백분율은 비당뇨병 동물에서 관찰된 값보다 유의적으로 차이(p<0.001)가 있다. 비록 건강한 동물과 EGF 함유 조성물로 처리된 동물과의 사이의 통계학적 차이(p<0.05)가 검지되었지만, 손상 희석 효과가 명백하다. 백분율은 피셔 이그젝트 테스트를 사용하여 비교되었다.
부분적 결론 - 당뇨성 신경병증의 확립 후에 그리고 일 개월 동안 주당 삼 회 본 발명의 조성물로의 처리는 좌골 신경 섬유의 형태학적 퇴화를 유의적으로 감소했다. 또한, 이 조성물로의 처리는 혈관의 퇴화와 위축증을 감소할 수 있었다. 다시 한번, 모든 이들의 발견은 기능적으로 수행된 테스트와 부합된다.
(5) 신경 분획의 생화학적 특징화 .
각 군으로부터 10마리 동물이 수집된 좌골 신경의 분획에서 생화학적 결정을 위해 사용되었다. 다음의 생화학적 변수가 연구되었다:
산화환원 프로필:
▶ 전체 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(tSOD) 효소적 활성 전체.
▶ 카탈라제 효소적 활성.
▶ 전체 하이드로퍼옥사이드의 액손 내 축적 (THP).
▶ 말로닐디알데하이드의 액손 내 축적 (MDA).
이 연구의 결과는 표 15에 나타냈다.
좌골신경으로부터의 분획에서 산화환원 상태의 특징화
실험 군 tSOD a ,b 카탈라제 THP c MDA
비당뇨병 랫트 2108.3
±109.7		 31.8
±3.22		 21.1
±1.11		 0.08
±0.005
당뇨병 + 식염수 375.8±88.2 603.6
±99.4		 317.5
±12.2		 0.87
±0.1
당뇨병 + 처리 1988.4±101.6 86.1
±6.5		 55.8
±12.7		 0.1±
0.03
a 평균 및 표준편차로 표현된 값. b 미뉴트 당 단백질의 밀리그램 당 유닛트로 표현된 효소. c 단백질의 THP 및 MDA nmol/mg.
플라시보 및 처리된 당뇨병 동물과 EGF 함유 조성물로 처리된 랫트의 군과의 통계학적으로 유의성 있는 차이가 발견되었다(p<0.01, two tailed Student t-Test). 표 15에 나타난 바와 같이 약학적 조성물로의 처리는 연구된 신경 조직에서 과산화반응 진행을 나타내는 대사산물의 존재를 유의적으로 감소했다. 병행하여, 치료는 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 효소의 기능이상을 희석하는 것을 나타낸다.
(6) 좌골 신경 분획에서 지질단백질 리파제 ( LPL ) 효소적 활성.
이 연구의 목적은 식염수 처리 당뇨병 동물들에 비교하는 것으로서, EGF 함유 조성물로 치료의 한 달 후에 LPL 효소적 활성을 비교하기 위한 것이다. 결과는 표 16에 나타냈다. 식염수 처리 당뇨병 동물과 본 발명의 조성물로 치료한 것과의 사이에 유의성 있는 차이가 관찰되었다(**p<0.01, ANOVA and Tukey tests).
좌골 신경에서 LPL 활성.
실험군 LPL ( nmoles AGL / min /g)
비당뇨병 랫트 7.02 ±1.24
당뇨병 + 식염수 2.18 ±0.73**
당뇨병 + 처리군 6.29 ±1.67
본 분석은 EGF 함유 약학적 조성물로의 처리는 LPL 효소적 활성을 복구하여, 결과적으로 합성된 미엘린에 대한 신경 능력의 개선을 입증한다.
실시예 3 당뇨성 신경병증이 있는 환자에 있어서 EGF 함유 조성물의 치료적 효과의 입증.
전체 다섯 환자가 EGF 함유 조성물로 치료되었다. 이들 환자는 이전의 치료에는 반응이 없는 명백한 감각-운동 및 통증성 신경병증을 가졌다. 투여된 EGF의 복용량은 20 내지 25㎍의 범위로 되었다. 이 활성 약학적 성분을 함유하는 조성물의 적용은 흡수에 의한 것이다. 처리된 케이스는 다음과 같다:
환자 PCM . 20년 이상의 타입 1 당뇨병으로 진단을 받은 연령 50살의 여성 환자로 허혈성 심장병, 고혈압 및 신경병증의 명확. 10년 이상의 전개와 이전의 치료에는 임상적 반응이 없는 통증성 신경병증의 명확 및 감각-운동 신경병증의 병력. 복용량 당 25㎍의 EGF 및 100mg의 리도케인을 함유하는 조성물이 주 좌골 신경으로 흡수되어 졌다. 이 과정은 항상 좌골 신경에서 주 당 이 회, 전체 6곳 적용으로 다섯 차례 이상 반복되었다. 제 삼차 흡수 후 통증이 사라졌다. 치료를 시작한 지 8주 후, 감각-운동 명확성이 중단되고, 그리고 삼 개월을 동안 나머지 뒤따르는 기간도 그렇게 되었다.
환자 OZD . 심각한 동맥 폐쇄 및 휴식중 통증이 있는 당뇨병으로 고통을 받는 연령 72살의 여성 환자. 이 환자는 걸을 수 없으며 전체 다리가 감각을 잃었다. 동일한 조성물의 삼 회 적용이 같은 해부적 위치(주로 좌골 신경)에서 수행되었다. 환자는 다리 무감각은 EGF 함유 조성물의 투여 후 중단되지 않았으나, 휴식중의 통증은 이 조성물의 삼 회 적용 후 사라졌고, 그리고 환자는 보다 빠르게 걸을 수 있었다는 것을 언급했다.
환자 BCB . 10년 이상의 타입 1 당뇨병으로 진단을 받고, 휴식중 통증 및 수족 무감각이 있는 연령 60살의 여성 환자. 이 환자는 동일한 조성물의 여섯 번 적용을 주로 좌골 신경으로 흡수에 의해 수용하였다. 삼 회차 적용 후 통증은 사라졌고, 지각이상이 감소하였다. 마지막 복용량의 적용 삼 주 후, 통증이 다시 나타났고, 따라서 새로운 치료 주기가 수행되었다.
환자 GTC. 수족 무감각이 있는 당뇨병으로 고통을 받는 연령 50살의 남성 환자. 동일한 조성물의 여섯 번 적용을 동일한 해부학적 위치에 4일 간격으로 수행하였다. 상기 언급된 치료가 종료되고 다리의 무감각 증상이 사라지고, 삼 개월을 동안 나머지 뒤따르는 기간도 그렇게 되었다.
환자 STL . 10년 이상 동안 타입 1 당뇨병으로 고통을 받는 연령 68살의 남성 환자. 환자는 보다 낮은 수족에 명백한 무감각을 보였다. 동일한 조성물의 여섯 번 적용을 동일한 해부학적 위치에 주 당 두 번 적용의 비율로 수행하였다. 제일 라운드의 치료(6 복용) 후, 하부 수족 무감각은 사라져 6개월 후에 다시 나타났다. 새로운 치료 주기가 따라서 동일한 절차에 따라 적용되고, 그리고 제 삼차 흡수 후에 명백한 무감각은 줄어들었다.
일반적으로, 환자의 신경학적 기능에 있어서 실질적인 개선이 휴식 중에서의 자발적 통증 및 괴사성 감각의 제거로 관찰되었다.
실시예 4. EGF 를 갖는 PLGA 미소구형을 포함하는 약학적 조성물의 제조
EGF 적하 미소구형의 제조 및 특성화.
5% (w/v) 폴리유산 용액(Sigma, St. Louis, Missouri, USA)이 디클로로메탄(DCM) 내에 1 g의 폴리머를 용해하여 제조되었다.
삼 밀리리터의 PLGA 용액이 글라스 컨테이너에 부어지고 그리고 30 mg/ml에서 EGF의 100 ㎕의 수성 용액이 부가되었다.
이 혼합물은 2분 동안 14 000 rpm에서 울트라튜랙스 T8 호모게나이저(IKA Labortechnik, Alemania)로 교반되었다. 얻어진 에멀젼은 30 ml의 1% 폴리비닐 알코올에 부어지고 그리고 제 이차 에멀젼(w/o/w)이 T8 울트라튜랙스 호모게나이저(IKA Labortechnik, Germany)를 사용하여 14 000 rpm에서 두 개의 상의 강렬한 교반을 통해 얻어졌다. 이중 에멀젼은 270 ml의 1% 폴리비닐 알코올 30 000-70 000 (Sigma, St. Louis, Missouri, USA)에 부어지고 그리고 디클로로메탄을 증발시키기 위해 1시간 동안 300 rpm에서 호모게나이저(IKA Labortechnik, Germany)에서 교반되었다. 최종적으로, 미소구형은 여과에 의해 수집되고, 50 ml의 증류수로 5회 수세되고 그리고 동결건조기(Edwards, UK)에서 동결건조되었다. 건조된 미소구형은 사용할 때까지 4℃에서 보관되었다.
얻어진 EGF 적하 미소입자는 구형이고 그리고 규칙적인 다공성 표면을 나타냈다(도 1). 공정 수율은 68 내지 71%의 범위로 되는 캡슐화 효능성으로 85%였다. 미소구형의 하중은 0.82 내지 0.85% 사이의 범위로 되었다. 입자는 30㎛ 보다 적었다.
캡슐화된 EGF 의 생체 외 방출.
50 mg의 EGF 적하 미소구형이 1 ml의 수용체 유동체(pH 7,2 PBS 내에 0,001% 트윈 80 및 0.1% 소디움 아지드)에 현탁되었다. 현탁액은 37℃에서 온화한 교반 하에서 배양되었다. 샘플은 1, 3, 7, 및 14일에 Hettich microcentrifuge (Tuttlingen, Germany) 내에서 5분 동안 5000 rpm으로 원심분리되었다. 상등액이 수집되고 그리고 동일한 부피의 수용체 유동체가 부가되었다. 각 샘플에서 EGF 농도는 마이크로어세이 포맷(microBCA assay)에서 비신콘닌산 방법에 의해 분석되었다.
미소구형으로부터 EGF 방출 프로필은 제 일일 동안에는 폭발적인 방출 단계와 14일까지는 지속적이고 점진적인 EGF 방출의 제이 단계를 나타냈다. 대략적으로, 전체 단백질의 약 30%는 제일 단계 동안에 방출되었고, 반면 입자에 함유된 EGF의 50%까지는 대략 일(日) 당 7㎍의 비율로 나머지 평가기간 동안 방출되었다(도 2).
실시예 5. 당뇨성 신경병증을 갖는 환자에 있어서 미소구형에 캡슐화된 EGF 함유 조성물의 치료적 효과의 입증.
다음으로, 미소구형에 캡슐화된 EGF 함유 조성물로 치료된 세 환자의 몇 가지 특징 및 이들에게 적용된 치료에 대한 정보를 요약하였다:
환자 LNP . 명확한 감각-운동 및 통증성 신경병증 l을 갖는 10년 이상의 타입 1 당뇨병으로 진단을 받은 연령 47살의 여성 환자. 주요 좌골 신경에 복용량 당 20㎍의 EGF를 함유하는 조성물이 흡수되어 졌다. 이 과정은 일 주일 당 두 번 복용의 빈도로 전체 네 번의 적용에 대해 삼 회 반복되었다. 삼 회차 흡수 후 통증은 감소되었고 그리고 네 번째 적용 후 사라졌다. 감각-운동 명확성은 이 주 후 사라지고, 그리고 삼 개월을 동안 나머지 뒤따르는 기간도 그렇게 되었다.
환자 JVR . 타입 1 당뇨병이 있는 연령 63살의 여성 환자. 휴식중 통증 및 수족의 무감각을 보임. 매 12일 마다 복용량 당 25㎍의 EGF를 함유하는 조성물의 육회 적용이 수용되었다. 조성물의 적용은 주요 좌골 신경의 흡수에 의해 수행되었다. 삼 회차 적용 후 통증은 사라지고 그리고 지각이상이 감소되었다. 조성물의 마지막 적용 6주 후 통증은 사라지고 그리고 따라서 새로운 라운드의 치료가 시작되었다.
환자 DGR . 사지 무감각으로 고통을 받는 타입 1 당뇨병이 있는 연령 52살의 남성 환자. 동일한 해부학적 위치에 14일 간격으로, 서서히 방출을 위한 미소구형에 캡술화된 EGF를 함유하는 상기한 조성물의 5 복용량을 수용하였다. EGF 치료가 일단 종료되면, 다리 무감각은 벌써 사라졌고, 사 개월동안 나머지 뒤따르는 기간도 그렇게 되었다.

Claims (20)

  1. 상피 성장 인자(EGF)를 포함하며, 당뇨성 신경병증에 의해 영향을 받은 말초신경의 형상기능적 회복을 위한, 말초 신경 다발 또는 신경절에 흡입 (infiltration)에 의해 투여되는 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 당뇨성 신경병증은 감각-운동, 통증성 신경병증인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 감각-운동, 통증성 신경병증은 하부 수족에 영향을 미치는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 성장 인자는 인간 재조합 EGF임을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 EGF는 미소구형에 캡슐화된 것임을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 그 사용 전에 재조성되도록 동결건조되거나 또는 액체임을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 선택적으로 완충된 수성 조성물이거나, 또는 물로 또는 수성 완충용액으로 재조성된 동결건조된 조성물임을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 10 내지 1000 마이크로그램의 EGF/ml를 함유함을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  9. 국부 마취제 또는 진통제와 조합한 EGF를 포함하며, 말초신경의 형상기능적 회복을 위한, 말초 신경 다발 또는 신경절에 흡입에 의해서 투여되는, 감각-운동, 통증성 당뇨성 신경병증의 치료를 위한 약학적 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 EGF는 미소구형에 캡슐화된 것임을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  11. 제9항에 있어서, 상기 마취제는 리도카인, 뷰피바카인 또는 노보카인의 군에서 선택된 국부 마취제임을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  12. 제9항에 있어서, 상기 국부 마취제는 2% (w/v) 리도카인임을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  13. 제9항에 있어서, 상기 EGF는 10 내지 1000마이크로그램/밀리리터의 범위로 포함되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  14. 제9항에 있어서, 상기 흡입은 좌골 신경에서 수행되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  15. 제9항에 있어서, 상기 흡입은 주 당 1 내지 3회로, 3 내지 8주 동안 수행됨을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  16. 제9항에 있어서, 상기 흡입은 상기 조성물의 국부적 흡입에 의해서, 주 당 1 내지 5회로, 2 내지 6주 동안 수행됨을 특징으로 하는 약학적 조성물.
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