CN101573130B - 表皮生长因子用于在糖尿病性神经病中外周神经的形态功能恢复的用途 - Google Patents

表皮生长因子用于在糖尿病性神经病中外周神经的形态功能恢复的用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及人类医学，并且涉及表皮生长因子(EGF)在制备药物组合物中的用途，所述组合物通过渗入神经干和/或神经节的周边中来进行施用，以用于在痛性感觉-运动神经病以及缺血性神经炎表现中外周神经的形态功能恢复。本发明还包括包含EGF的组合物，所述EGF可以与麻醉药或镇痛药一起进行配制，或者包囊在微球体中；以及它们用于在痛性感觉-运动型糖尿病性神经病以及缺血性神经炎表现中外周神经的形态功能恢复的用途。

Description

表皮生长因子用于在糖尿病性神经病中外周神经的形态功能恢复的用途
技术领域
本发明涉及包含表皮生长因子(EGF)的药物组合物(优选为可注射的形式)的医学或实验应用，所述组合物通过渗入(infiltration)神经干和/或神经节的周边中来进行施用，以用于预防或校正糖尿病性神经病的任何临床表现，以及缺血性神经炎的表现。还可以在肢体的远侧区域中或者在经历神经病性疼痛的截肢残留基底上，局部地施用所述制剂。
现有技术
血液中葡萄糖水平不足和其他糖尿病相关因素可以改变机体的任何部分中的神经纤维，从而取决于受影响的神经而产生具有特定特性的一组病症。这些病症总称为糖尿病性神经病，并且已描述了至少3种主要类型：(1)感觉-运动神经病(最典型和常见的形式)，(2)自主神经病，和(3)单神经病(Sadikot SM，Nigam A，Das S等人(2004).The burden of diabetes and impaired glucose tolerancein India using the WHO 1999 criteria：prevalence of diabetesin India study(PODIS).Diabetes Res Clin Pract，66，301-7)。
尽管在这些病症背后的精确机制未完全了解，但已知神经纤维通过源自恶化的葡萄糖代谢的物质的积聚而在结构上发生改变，这导致神经纤维中髓鞘的丧失。这种保护性鞘的丧失意味着在传递神经冲动(感受的，以及运动和其他类型级别的)的能力方面的延迟。除了这种直接机制外，灌溉神经的血管可以通过对于糖尿病的其他慢性并发症而言所共有的机制而遭受梗阻(Ashok S，Ramu M，Deepa R等人(2002).Prevalence of neuropathy in type 2 diabetes patients attendingdiabetes center in South India.J Assoc Physicians India，50，546-50)。
如糖尿病中所共同的，糖尿病性神经病的初发期一般是无症状的，甚至可以持续数年，并且直到现在也没有预料其隐匿的临床过程的方法。当医生怀疑感觉-运动糖尿病性神经病时，他可以通过进行测试以评估神经传导的速度来证实该诊断。这种测试在于测定小电流通过所选的神经进行传递的速度。
在糖尿病性神经病的更常见形式(感觉-运动神经病变)中，最初症状包括感觉能力的丧失，触觉的错误知觉，以及在某些情况下，在极小的皮肤擦伤后的剧痛。通常，这首先在足和手中发生，并且主要在夜间发生。当受影响的神经负责消化能动性时，可以发生缓慢的消化过程或者肠节律的改变(腹泻和/或便秘)。有时，糖尿病性神经病影响心血管系统的控制，从而如果患者突然起立，那么会产生晕厥或低动脉压(Levitt NS，Stansberry KB，Wychanck S等人(1996).Natural progression of autonomic neuropathy and autonomicfunction tests in a cohort of IDDM.Diabetes Care，19，751-54)。
糖尿病性单神经病实际上可以影响任何分离的神经，引起面部一侧的麻痹，眼运动的改变、具体解剖学位置中的麻痹和/或疼痛。
外周神经病可以影响脑神经或者脊髓及其分支的神经，并且是趋于分阶段发展的一类神经病(神经损害)。开始时，在肢体特别是足中存在间歇的疼痛和麻刺感；而在更晚期的阶段中，疼痛更加强烈和持久。最后，当出现大量的神经衰退时，发展成无痛神经病(Oh SJ.(1993).Clinical electromyography：nerve conduction studies.In：Nerve conduction in polyneuropathies.Baltimore：Williamsand Wilkins，p：579-91)。
糖尿病性神经病的较严重后果之一是相关的疼痛，其有时具有高强度并且不对标准治疗程序作出应答。已使用了药理学和临床治疗，但没有获得很大成功。前者主要是指镇痛药与非甾类抗炎药、抗惊厥药(例如卡马西平和酚妥拉明)、三环类抗抑郁药和局部麻醉药(其甚至可以渗透而达到被阻断的纤维)的组合形式。抗惊厥药近期已用于治疗与糖尿病性神经病相关的疼痛。在它们中，最近引入以治疗疼痛的是加巴喷丁。在神经化学方面，加巴喷丁增加γ-氨基丁酸(GABA)生物利用率，抑制GAT-1转运蛋白(这反过来减少GABA的重捕获)，降低生物胺例如去甲肾上腺素、多巴胺和5-OH-色胺的合成和释放，并诱导参与疼痛调节的脑啡肽类型阿片样肽的释放(Didangelos TP，Karamitsos DT，Athyros VG等人(1998).Effect of Aldose reductaseinhibition on cardiovascular reflex tests in patients withdefinite diabetic autonomic neuropathy.J DiabetesComplications，12，201-7)。
在具有痛性神经病并缺乏对治疗的应答的患者中，已采用这样的方式使用了经皮的电刺激，即通过施加按程序工作的低强度电压，阻止了通过受影响的神经来传递疼痛。
痛性糖尿病性神经病被分成慢性和急性形式。急性形式通常在诊断后的前3年期间观察到；它自发地开始并结束。慢性形式存在于患有该疾病平均8或9年的人中。它缓慢地开始并持续数年，其中伴随多次复发。脑神经病可以影响视力并引起眼中的疼痛。
该疾病的症状一般是嗜睡，麻刺感，机体的某些部分中的感觉能力降低，机体的某些部分中的感觉能力丧失，腹泻或便秘，排尿控制丧失，阳痿，面部、眼睑和/或嘴下垂。它还可以引起视力的改变、头晕、吞咽困难、语言改变和肌肉收缩。这些症状依据受影响的神经而变，并且一般逐步发展。
与糖尿病性神经病相关的感觉能力的丧失增加了损害的风险。小感染可以进展，直至变成溃疡并需要截肢。此外，运动神经中的损伤可以导致分解和肌肉平衡失调。换言之，神经病可能是在这种疾病中腿和足截肢的主要原因。
糖尿病性神经病治疗的目标是阻止疾病的进展和减少疾病的症状。葡萄糖的严格控制对于避免这种进展而言是重要的。目前没有能够预防、延缓或逆转糖尿病性神经病中神经纤维的改变的特异性治疗。没有能够修复神经损伤的药物得到批准，但其中几种目前正在研究中。复合B族维生素可能是用于所有形式的神经病的最常用药物。尽管这些药物减轻某些症状，但它们只不过是姑息剂。近来使用的其他治疗备选方案是通过静脉内途径使用硫辛酸，基于其抗氧化性质(ZieglerD，Hanefeld M，Ruhnau KJ等人(1999).Treatment of symptomaticdiabetic polyneuropathy with the antioxidant alpha-lipoicacid：a 7 month multicenter randomized controlled trial(ALADINIII study).ALADIN III study group.Alpha-lipoic acid indiabetic neuropathy.Diabetes Care，22，1296-301)。已进行了其他测定法，其中引入了使用乙酰L-肉碱的口服治疗，这是对于小感觉纤维显示出离散的影响的化合物。
涉及致病基础的唯一的外周糖尿病性神经病治疗操作程序牵涉醛糖还原酶抑制剂的使用。它的使用基于醛糖还原酶在由糖尿病生物体的神经中的高血糖症所诱导的结构和功能性代谢异常中所起的作用。到目前为止，在临床试验中评估了在具有神经病的糖尿病病人中在改善运动传导速度方面有效的索比尼尔，但由于毒性作用它退出了市场。Statil在动物中显示出令人鼓舞的结果，但这些结果不能在人中得到确证。一般而言，醛糖还原酶抑制剂是非常毒的。
由于在临床中引入神经生长因子(NGF)和其他生长因子，从而有了相当大的乐观期待。在包括具有小纤维(C纤维)神经病的250位患者的测定法中，证明了在疼痛缓解和感知热刺激的能力方面的改善。然而，在具有更多数目的患者的两个后续测定法中，用NGF的治疗未显示任何益处(Vinik AI.(1999).Treatment of diabeticpolyneuropathy(DPN)with recombinant human nerve growth factor(rh NGF).Diabetes，48，A54-5)。
已在动物中广泛评估了使用血管内皮生长因子(VEGF)的基因疗法，显示出在神经冲动的传导和向神经提供血液的血管的密度方面的改善。然而，这种和使用另外的神经营养试剂的其他方法在临床试验中不能停止向糖尿病性神经病的进展，尽管先前在动物中具有阳性结果(Schratzberger P，Walter DH，Rittig K等人(2001).Reversalof experimental diabetic neuropathy by VEGF gene transfer.JClin Invest，107，1083-92)。为了减少症状，推荐使用辣椒辣素或者口服药物例如阿米替林、加巴喷丁和卡马西平的局部治疗。
糖尿病性神经病的致病机制未充分了解。目前的治疗缓解疼痛并且可以控制部分相关症状，但该过程一般是进行性的。最糟的是，用于这种疾病的特异性药物看起来在不久的将来是不可用的。
发明概述
本发明通过EGF在制备药物组合物中的用途而促成解决了上述问题，所述药物组合物通过渗入神经干和/或神经节的周边中来进行施用，以用于在痛性感觉-运动神经病以及缺血性神经炎表现中外周神经的形态功能恢复。
外周神经的与糖尿病相关的改变是复杂的并可能涉及各种原因。两种主要致病机制是：1)山梨糖醇积聚导致一系列生物化学异常的理论，这最后引起外周神经中的结构改变；2)神经内膜微血管的结构和功能损伤，这引起由缺氧或局部缺血触发的神经纤维中的变化。产生糖尿病性神经病的其他机制是酶的产生的调节，补体系统的激活，对于重金属例如铁和铜具有高亲和力的蛋白质的积聚，和神经营养因子的减少。特别援引的另一要素是过氧化和亚硝化产物的积聚。已在患有神经病的糖尿病患者的神经中观察到神经内膜氧张力的减少。所有这些事件导致神经结构中高水平的凋亡和细胞死亡。这是糖尿病性神经病的特征在于在有髓神经纤维水平上功能单位的丧失和神经传导速度(NCV)的显著降低的原因。外周多发性神经病的特征在于疼痛的存在，这涉及α纤维和C纤维的功能障碍。
一般而言，本发明的组合物通过局部渗入来进行应用，其中将其置于神经干和/或神经节附近，下肢的远端疼痛区(在截肢前或后)，并且在本领域专家推测在C纤维中存在损伤的那些情况下。用本发明的组合物治疗数周已显示出能够消除神经病性疼痛；调节非自主病症；以及恢复对压力和温度的外周感觉能力。
在糖尿病动物中，在药物组合物3次全身注射，或于神经干的周边进行局部渗入后，我们检测出：
1.坐骨神经髓鞘的完整性的改善；
2.轴突水肿的减少；
3.轴突神经丝的保持；
4.神经滋养血管的完整性；
5.神经内膜胶原化的减少；
6.运动纤维的传导速度的正常化。
所述组合物以1-5毫升的体积于接近目的结构处缓慢释放。渗入神经干和神经节中的频率可以在每周1-3次之间波动。用本发明中所描述的组合物来进行的治疗可以与下述相联合或不联合：醛糖还原酶的抑制剂，氨基胍，口服或肠胃外降血糖药，胰岛素，对于胰岛素的外周感觉能力的刺激剂，胰高血糖素样肽，维生素疗法，GABA系统的激动剂或扩增剂，内啡肽前体，抗氧化剂，脂肪酸或其前体，在镇痛药、三环类抗抑郁药和抗炎药之间单独或组合的疗法。每位患者所接受的应用次数根据患者的临床症状的严重度而变。如果症状再出现，那么需要几个治疗周期。
本发明的一个具体实施方案是EGF在制备制剂中的用途，所述制剂通过渗入神经干和/或神经节的周边中来进行施用，以用于在感觉-运动神经病中外周神经的形态功能恢复，当这种神经病的更重要的表现影响腿时。在一个优选的实施方案中，用于制备药物组合物的EGF是重组人EGF，所述药物组合物通过渗入神经干和/或神经节的周边中来进行施用，以用于外周神经的形态功能恢复。
在本发明的另一个具体实施方案中，包含EGF的药物组合物的渗入在坐骨神经中进行。
本发明的目的是包含EGF和至少一种局部麻醉药或镇痛药的组合的可注射药物组合物，其通过渗入神经干和/或神经节的周边中来进行施用，以用于在糖尿病性神经病中外周神经的形态功能恢复。在一个具体的实施方案中，所述麻醉药是利多卡因，其促成减轻由EGF渗入引起的疼痛。此外，在组合物中存在的伴随的麻醉药可以尤其为布比卡因或奴佛卡因。
其中借助于控释系统而通过渗入神经干和/或神经节的周边中来施用EGF的组合物也是本发明的一部分。在一个优选的实施方案中，所述控释系统是携带有EGF的由乳酸和乙醇酸或聚乳酸的共聚物构成的微球体。
微球体可以提供几个优点，最常见的是施用频率的减少。关于缺乏对于糖尿病性神经病的治疗特异的可用药物，本发明提供了技术解决方案。然而，使用其中EGF不与微球体结合的包含EGF的组合物来进行治疗需要每周至少2次应用相应剂量的药物。考虑到这种不便，用于缓慢和持续释放EGF的制剂的使用减少产品的施用频率，这对于患者是有利的。基于微球体的制剂具有下述优点：
施用频率减少，这导致患者对于该治疗能更好地坚持；
Figure G2007800422158D00072
由于消除了血清中蛋白质水平的波动，因而治疗益处增加；
Figure G2007800422158D00073
由于所施用的剂量的更佳性能，因而治疗所需的总剂量的可能减少；
Figure G2007800422158D00074
由于在应用时在机体中释放的蛋白质的量减少，因而不良反应可能减少。
附图简述
图1.负载有EGF的微球体的显微照片。显微照片下的条表示10μm的长度。
图2.包囊在PAL微球体中的EGF的释放特性曲线。X轴显示以天表示的时间，和Y轴显示释放的EGF的量，其表示为在测定法中所使用的微球体内的EGF总量的百分比。
实施例
实施例1.所述药物组合物在防止糖尿病性神经病的建立中的作用。
该研究的目的是评估包含EGF的药物组合物在糖尿病动物模型中的神经保护作用。首先，必需在Wistar大鼠中建立用于通过施用链脲佐菌素来诱导糖尿病的方法。
体重为200-250克的雄性Wistar大鼠接受皮下注射链脲佐菌素(75mg/kg，在柠檬酸钠缓冲液中)。然后，在接下来的24小时期间用10％蔗糖溶液替换水，以防止由低血糖引起的死亡。在注射后在接下来的72小时期间每天早晨监测血液中的葡萄糖水平。仅使用具有超过15mmol/L的持续葡萄糖值的动物。将大鼠以每笼4只进行圈养，并以常规方法进行饲喂。其他80只大鼠的并行组接受不含链脲佐菌素的柠檬酸盐缓冲液，并且以与糖尿病组相似的方式进行处理。在这个组中在72小时期间平均糖血值为5.87mmol/L。
为了研究包含EGF的药物组合物在预防糖尿病性神经病方面的作用，使用下述实验设计，其中每一个下列组中具有10只大鼠：
·对照组-通过腹膜内途径以1ml每周3次接受盐水的糖尿病大鼠组；
·处理组1-通过腹膜内途径以1ml每周1次接受包含EGF的药物组合物的糖尿病大鼠组；
·处理组3-通过腹膜内途径以1ml每周3次接受包含EGF的药物组合物的糖尿病大鼠组。
所有处理在8周期间进行，在链脲佐菌素注射后1周开始。所使用的组合物包含75μg重组人EGF/ml。在所研究的动物中进行几种类型的观察：
(1)测定伤害感受阈值(nociceptive threshold，NCT)。疼痛测试。
在所述处理起始后第28和56天时，通过在尾中施加渐增的压力来进行疼痛测试，其中每一个实验组使用10只动物。测定以克表示的NCT，其中使用Ugo Basile型痛觉测量计(analgesimeter)来对动物的尾部施加逐步增加的压力直至它们形成撤回发射(withdrawalreflex)。在人糖尿病性神经病中，伤害感受阈值降低。表1显示了在第28天时测量的NCT的结果。
表1.NCT测试的结果(28天)。
  实验组   NCT＊(克)
  盐水对照   120±11
  处理组1   125±18
  处理组3   123±16
  非糖尿病大鼠   128±9
＊数据表示为平均值和标准偏差
在疾病进展28天后未检测出动物的伤害感受模式的变化。这暗示，临床形式的感觉过敏仍未建立。由于这个原因，在该时间点上不可能察觉到处理的效应。在第56天时的检查结果显示于表2中。
如结果所证实的，在糖尿病诱导后2个月，可以察觉到在动物中外周糖尿病性神经病的影响。在该实验点上检测出压力疼痛感觉能力阈值的降低。在2个月期间接受盐水的糖尿病大鼠组和每周3次接受用包含EGF的组合物进行处理的组之间还存在显著的差异。
表2.NCT测试的结果(56天)。
  实验组   NCT(克)
  盐水对照   80±19＊＊
  处理组1   91±14＊
  处理组3   121±22
  非糖尿病大鼠   123±6
在用盐水处理的糖尿病组和接受处理3的组以及非糖尿病大鼠组之间观察到显著差异(＊＊p＜0.01，ANOVA和Bonferroni校正)。在处理1的组和处理3的组以及完好动物组之间也存在显著差异(＊p＜0.05)。经处理的动物一般显示出更大的对疼痛的耐受性这一发现暗示，用包含EGF的组合物进行处理阻止了感觉纤维的衰退。
(2)测定通过感觉纤维的冲动传导速度。
为了评估包含EGF的药物组合物对于感觉和运动纤维的保护作用，在处理开始后60天时测量电脉冲的传导速度。在每个实验组中使用15只动物。在糖尿病性神经病中，传导速度一般是降低的。
采用使用双极电极的以坐骨-胫骨途径的远端超最大刺激来研究运动传导。通过在尾部中的近端点处施加刺激并在距离3cm处测量它，来测定该感觉途径中的传导速度。在第60天时该研究的结果显示于表3中。
表3.在第60天时的运动传导速度(MCV)。
  实验组   MCV(m/s)
  盐水对照   34±18＊＊
  处理组1   45±13＊
  处理组3   56±11
  非糖尿病大鼠   60±8
在用盐水处理的糖尿病组和接受处理3的组以及非糖尿病大鼠组之间观察到显著差异(＊＊p＜0.01，ANOVA和Bonferroni校正)。在处理1的组和处理3的组以及完好动物组之间；以及在处理1的组和接受盐水的对照糖尿病动物之间也存在显著差异(＊p＜0.05)。
注意到了组合物的正面效应，特别是在接受每周3次施用的组中。运动纤维中的传导值非常类似于完好动物中的传导值。尽管与非糖尿病动物组仍具有统计学差异，但是接受处理1的组中的大鼠也改善了传导速度。在第60天时该感觉传导速度(SCV)研究的结果显示于表4中。
表4.在第60天时的感觉传导速度(SCV)。
  实验组   SCV(m/s)
  盐水对照   31±7＊＊
  处理组1   38±6＊
  处理组3   44±9
  非糖尿病大鼠   56±3
在用盐水处理的糖尿病组和接受处理3的组以及非糖尿病大鼠组之间观察到显著差异(＊＊p＜0.01，ANOVA和Bonferroni校正)。在处理1的组和处理3的组以及完好动物组之间也存在显著差异(＊p＜0.05)；在处理1的组和接受盐水的对照糖尿病动物之间未检测出统计学差异。该研究证明了当每周施用3次时，包含EGF的药物组合物在保持动物的功能完整性方面的作用。
(3)评估所述组合物在血液灌注的完整性方面对于外周神经的影响。
将大鼠的右坐骨神经用作模型。每一个实验组包括10只动物。将类似数目的非糖尿病大鼠用于计算参照值。使用激光多普勒灌注成像(Laser Doppler Perfusion Imaging，LDPI)系统。周围组织对神经的灌注数据按程序规定为零值。对照动物在测量前的2个月期间接受盐水。所有测定在相同的麻醉条件和环境条件下进行。它们反映在表5中。
表5.用激光多普勒灌注成像系统进行的研究的结果。
  实验组   LDPI单位
  盐水对照   525.5±88.8＊＊
  处理组1   653.4±41.9＊＊
  处理组3   988.7±80.3
  非糖尿病大鼠   1301.7±112.2
在用盐水处理的糖尿病动物和每周1次接受所述治疗组合物的动物(这两种处理均在2个月期间进行)之间，以及与每周3次接受所述治疗组合物的动物，观察到显著差异(＊＊p＜0.01，ANOVA和Bonferroni校正)。在最后那一组的动物和非糖尿病健康大鼠之间未检测出统计学差异。
(4)死后的测定和表征。
组织形态计量学研究
一旦处理结束，就在糖尿病诱导后第70天，即在给予最后一次剂量并完成上面所描述的分析后10天，处死动物。通过麻醉过量来处死动物，并用盐水缓冲液(pH 7.4)来进行灌注。每个实验组包括了总共10只动物以用于组织形态计量学研究，并且将相等数目的大鼠用于生物化学测定。在这两个系统中，解剖出两肢的坐骨神经；将片段保存于-70℃直至进行加工。将用于组织学和/或组织形态计量学研究的样品用苏木精/伊红和甲苯胺蓝进行染色。使用MADIP程序来定量研究同一神经的至少5个片段。所述片段被包括在火棉明胶块中，并且将这些块进行水平和横向切片。评估下列组织学指标：
Figure G2007800422158D00121
在神经的纵向切片中的10个显微镜视野(使用10X作为恒定的放大倍数)中血管(在神经弓上/在神经周围)的总数目。
Figure G2007800422158D00131
脱髓鞘的纤维的百分比。通过将每显微镜视野(x20，至少5个视野)的值平均来进行评估。
Figure G2007800422158D00132
每显微镜视野(x20，至少5个视野)中受损的(膨胀的或变形的)有髓鞘或无髓鞘纤维的百分比。
神经内膜胶原化的百分比(中等：在横截切片中25-50％的神经内膜区域；严重：在横截切片中超过50％的神经内膜区域，并且使用至少3个不同的切片)。
该研究的结果显示于表6中。
表6.对于坐骨神经的片段所施行的形态计量学研究的结果。
  组   血管的数目   脱髓鞘的纤维％   受损的纤维％   胶原化的区域％
  盐水对照   87.65±17.8   64.77±19.72   81.5±9.73   58.93±28
  处理组1   111.33±14.5   51.2±17.94   60.12±11   42.69±14.71
  处理组3   158.6±26.12   35.56±12.18   41.38±10.26   13.45±11.82
  非糖尿病大鼠   194.42±43.81   0   0   0
在用盐水处理的糖尿病组和健康的对照动物之间在血管的数目方面显示出统计学上显著的差异(p＝0.0023)。此外，当将盐水组和接受处理1的组相比较时，也发现了统计学差异(p＝0.031)。当将盐水组与接受处理3的组相比较时，也存在统计学差异(p＝0.014)。结果通过ANOVA以及Bonferroni校正来进行分析。通过Fisher精确检验来比较这些百分比。
对于下列三个参数，在处理组之间发现了统计学上显著的差异：脱髓鞘的纤维的百分比，受损的纤维的百分比，和胶原化区域的百分比。在用盐水处理的糖尿病组和接受处理3的动物组之间检测出统计学差异(p＜0.05)。
部分结论-用包含EGF的组合物进行的处理(每周3次，在2个月的时间内)能够防止脱髓鞘过程，从而显著减少坐骨神经纤维的形态学衰退，并因此防止神经内膜胶原化。类似地，用这种组合物进行的持续处理显著避免了营养神经的血管的萎缩和退化。所有这些发现与关于感觉和运动刺激传导而施行的功能测试和用激光多普勒系统来进行的灌注研究相一致。
(5)神经片段的生物化学表征。
每个实验组10只动物用于进行在所收集的坐骨神经片段中的生物化学测定。所研究的生物化学参数如下：
氧化还原特性谱：
总超氧化物歧化酶(tSOD)的活性。
过氧化氢酶的活性。
Figure G2007800422158D00143
总氢过氧化物(THP)的轴突内积聚。
Figure G2007800422158D00144
丙二醛(MDA)的轴突内积聚。
该研究的结果显示于表7中。
表7.在坐骨神经片段中的氧化还原状态的表征。
  实验组   tSODa，b   过氧化氢酶   THPc   MDA
  非糖尿病大鼠   2267.05±202.9   26.40±5.95   18.66±1.43   0.06±0.01
  盐水组   433.55±95.21＊＊   440.26±52.19＊＊   208.62±11.3＊＊   0.32±0.02＊＊
  处理组1   958.17±244.61＊   274.60±52.3＊   143.05±1.98＊   0.24±0.04＊
  处理组3   2102.83±112.67   37.62±8.13   25.15±1.81   0.08±0.02
a值被表示为平均值和标准偏差。b酶被表示为单位/毫克蛋白质/分钟。c以nmol/mg蛋白质表示的THP和MDA。
在用安慰剂处理的糖尿病动物和用包含EGF的组合物每周处理3次的糖尿病动物之间观察到显著差异(＊＊p＝0.0001)。在用包含EGF的组合物每周处理1次和每周处理3次的组之间，并且当与非糖尿病动物相比较时，也存在差异(＊p＝0.003)。根据双尾Student t-检验，在健康动物和用所述组合物每周处理3次的动物之间未发现差异。
因为葡萄糖积聚通过几种生物化学机制而有助于增加脂质过氧化的水平，并因而有助于高级糖基化终产物(AGE)在组织内的积聚，所以必需评估与这个过程相关的标记物。如通过表7中所示结果所证明的，用进行测定的药物组合物进行处理显著地并且依赖于应用频率地减少作为过氧化过程的指示的代谢产物的积聚。平行地，该处理能够防止超氧化物歧化酶的减少。
(6)坐骨神经片段中的脂蛋白脂肪酶(LPL)的活性。
将来自每只动物的神经片段与3μg/ml肝素一起在Krebs-Ringer缓冲液中于37℃温育50分钟。然后，将这些样品的等分试样在[14C]油酸甘油酯-磷脂酰胆碱存在下进行温育。经14C标记的脂肪酸通过常规方法来进行定量。将LPL活性表示为每分钟和每克组织释放的脂肪酸(RFA)的纳摩尔数。结果显示于表8中。
表8.坐骨神经中的LPL活性。
  实验组   LPL(nmoles RFA/分钟/g)
  非糖尿病大鼠   6.18±1.05
  盐水对照   2.24±0.97＊＊
  处理组1   3.75±2.2＊
  处理组3   5.41±1.83
在用盐水处理的糖尿病组和接受处理3的组以及非糖尿病大鼠组之间发现了显著差异(＊＊p＜0.01，ANOVA和Tukey检验)。在处理1的组和完好动物组之间也存在差异(＊p＜0.05)。在处理3的组和非糖尿病动物组之间未发现统计学上显著的差异。
本分析显示，用包含EGF的组合物进行处理保证了LPL的活性的保持，这反过来改善了神经合成髓鞘质的能力，这是由于磷脂对于该功能的相关贡献。
实施例2.所述药物组合物在已建立的糖尿病性神经病的逆转中的作用。
该研究的目的是评估所述药物组合物的神经恢复作用。体重为200-250克的雄性Wistar大鼠接受皮下注射链脲佐菌素(75mg/kg，在柠檬酸钠缓冲液中)，并让其发展直至疾病诱导后120天。在这个实验中所使用的所有大鼠已显示超过15mmol/L的持续葡萄糖水平。如前所述，管理和饲喂动物。设定并行的对照组，其中动物接受盐水而不是链脲佐菌素。在链脲佐菌素攻击后观察动物3个月。在这个时间段后，进行所有大鼠的电生理学表征，并将动物分成2个随机的处理组：
组I.接受盐水(1ml)的动物，每周3天，通过腹膜内途径；
组II.接受药物组合物(含100μg EGF，1ml)的动物，每周3天，通过腹膜内途径。
将至少10只来自同一窝的健康的非糖尿病大鼠的组包括在内，以作为关于非糖尿病动物中的生理学值的参照。在处理开始前动物的神经生理学表征的结果显示于表9中。这些探究中所采用的方法先前已进行了描述。
表9.在处理开始前动物的神经生理学表征的结果。
  所研究的参数   糖尿病   非糖尿病
  伤害感受阈值   55±5克   115±15克
  运动传导速度   20.53±8.44m/s   66.18±4.32m/s
  感觉传导速度   26.88±13.27m/s   69.94±11.8m/s
  对神经的血液灌溉   480.61±65.92 LDPI   1413.8±73.41 LDPI
(1)测定伤害感受阈值(NCT)。疼痛测试。
在糖尿病诱导后第120天时和在处理一个月后，通过在尾中施加渐增的压力来进行疼痛测试，以及接下来描述的所述探究的其余部分。每一个实验组使用至少10只动物。如前所述进行NCT测定，并且结果描述在表10中。
表10.NCT测试的结果。
  实验组   NCT(克)
  糖尿病+盐水   55±10＊＊
  糖尿病+处理   80±5＊
  非糖尿病大鼠   115±10
在用盐水处理的糖尿病大鼠组和接受所述处理的大鼠组以及非糖尿病大鼠组之间观察到显著差异(＊＊p＜0.01，ANOVA和Bonferroni校正)。在处理组和完好动物组之间也存在差异(＊p＜0.05)。
结果证明，与健康动物相比较，在糖尿病诱导后3个月，外周糖尿病性神经病的进展增加，压力疼痛感觉能力阈值降低了超过50％。在糖尿病大鼠组和用所述药物组合物每周处理3次(在一个月期间)的组之间所观察到的差异也是显著的。
经处理的动物一般显示出更高的对于疼痛的耐受性这一发现暗示，用所述药物组合物进行处理以某种方式校正或恢复了感觉纤维。
(2)测定通过运动纤维的冲动传导速度。
为了检查所述药物组合物对于感觉和运动纤维的恢复的作用，在糖尿病诱导后第120天时，以及在用药物组合物或盐水处理动物后，测量电脉冲的传导速度。采用每个实验组15只动物。所采用的操作程序已在关于先前的研究时进行了描述，并且结果显示于表11中。
表11.运动纤维的传导速度的探究的结果。
  实验组   速度(m/s)
  糖尿病+盐水   23.62±18.7＊＊
  糖尿病+处理   54.8±1.66＊
  非糖尿病大鼠   64.72±10.55
在用盐水处理的糖尿病大鼠组和接受本发明组合物的大鼠组以及非糖尿病大鼠组之间发现了显著差异(＊＊p＜0.01，ANOVA和Bonferroni校正)。在用包含EGF的组合物处理的组和完好的非糖尿病动物组之间也存在差异(＊p＜0.05)。
结果证明，在糖尿病诱导后3个月，外周糖尿病性神经病的进展增加，和刺激沿着运动纤维的传导速度降低，特别是当与健康动物相比较时。然而，重要的是应当注意，在一个月期间，与接受每周3次盐水的糖尿病大鼠组相比较，用所述药物组合物进行的处理产生了巨大的差异。一般而言，用所述药物组合物进行的处理通过改善其传导能力而恢复了运动神经纤维。
所研究的另一个方面是感觉传导速度(SCV)，如表12中所反映的。
表12.感觉传导速度(SCV)的研究的结果。
  实验组   速度(m/s)
  糖尿病+盐水   31.27±10.6＊＊
  糖尿病+处理   59.42±3.35＊
  非糖尿病大鼠   68.9±11.27
在用盐水处理的糖尿病大鼠组和接受包含EGF的组合物的大鼠组以及非糖尿病大鼠组之间发现了显著差异(＊＊p＜0.01，ANOVA和Bonferroni校正)。在用本发明组合物处理的组和完好的非糖尿病动物组之间也存在差异(＊p＜0.05)。
结果证明，在糖尿病诱导后3个月，外周糖尿病性神经病的进展增加，和刺激沿着感觉纤维的传导速度降低，特别是当与健康动物相比较时。参数的变坏超过50％。然而，重要的是应当注意，在一个月期间，与接受每周3次盐水的糖尿病大鼠组相比较，用所述药物组合物进行的处理产生了巨大的差异。一般而言，用所述药物组合物进行的处理恢复了感觉神经纤维，这与伤害感受阈值测试相一致。
(3)评估所述组合物在血液灌注的完整性方面对于外周神经的影响。
再次将大鼠的右坐骨神经用作模型。采用每一个实验组10只动物。包括了来自非糖尿病大鼠的值以作为参照。如前所述进行实验，尽管在这个情况下，动物已经患糖尿病3个月了，并且根据实验组已经用包含EGF的组合物或盐水进行了一个月的持续处理。结果描述在表13中。
表13.用激光多普勒灌注成像系统进行的研究的结果。
  实验组   LDPI单位
  盐水对照   418.5±66.9＊＊
  处理组   934±60.18＊
  非糖尿病大鼠   1397.3±101.55
在用盐水处理的糖尿病组和接受包含EGF的组合物的处理组以及健康大鼠的对照组之间发现了显著差异(＊＊p＜0.01，ANOVA和Bonferroni校正)。在用本发明组合物处理的组和完好的非糖尿病动物之间也发现了显著差异(＊p＜0.05)。
用本发明的组合物进行处理明显改善了对于神经的血液灌注水平。虽然值仍不能与完好的非糖尿病动物的值相当，但它们与接受盐水的糖尿病大鼠相比较而言则高得多。这种作用背后的分子机制仍未得到阐明。
(4)死后的测定和表征。
组织形态计量学研究
在用包含EGF的组合物或盐水进行处理1个月结束后，以及在疾病诱导后120天时，通过麻醉过量来处死动物，并用盐水缓冲液(pH7.4)来进行灌注。每个实验组包括了总共10只动物以用于组织形态计量学研究，并且将相等数目的大鼠用于生物化学测定。在这两个系统中，解剖出两肢的坐骨神经。操作程序类似于对于神经病损伤预防测定法所描述的那些。将用于组织学和/或组织形态计量学研究的样品用苏木精/伊红和甲苯胺蓝进行染色。使用MADIP程序来定量研究同一神经的至少5个片段。所述片段被包括在OCT块中，随后用戊二醛进行后固定，以用于进行水平和横向切片。所评估的组织学指标已在上文中进行了描述，而用于其加工和评估的操作程序也是相当的：
Figure G2007800422158D00201
在神经的纵向切片中的10个显微镜视野(使用10X作为恒定的放大倍数)中血管(在神经弓上/在神经周围)的总数目。
脱髓鞘的纤维的百分比。通过将每显微镜视野(x20，至少5个视野)的值平均来进行评估。
每显微镜视野(x20，至少5个视野)中受损的(膨胀的或变形的)有髓鞘或无髓鞘纤维的百分比。
Figure G2007800422158D00204
神经内膜胶原化的百分比(中等：在横截切片中25-50％的神经内膜区域；严重：在横截切片中超过50％的神经内膜区域，并且使用至少3个不同的切片)。
结果显示于表14中。在两个糖尿病大鼠组和完好的大鼠之间在血管的数目方面显示出统计学上显著的差异(p＜0.001)。在用包含EGF的组合物处理的大鼠和接受盐水的动物之间也发现了统计学差异(p＜0.05，ANOVA和Bonferroni校正)。
表14.对于坐骨神经的片段所施行的形态计量学研究的结果。
在30天后进行的评估。
  组   血管的数目   脱髓鞘的纤维％   受损的纤维％   胶原化的区域％
  盐水对照   43.2±9.8   71.5±22.7   83±7.5   64.1±16.4
  处理组   86.5±14.6   50.6±12.3   52.6±8.3   46.3±9.5
  非糖尿病大鼠   178.1±44.2   0   0   0
糖尿病动物中脱髓鞘的纤维的百分比、受损的纤维的百分比和胶原化的神经内膜区域的百分比与在非糖尿病动物中观察到的值显著不同(p＜0.001)。尽管在健康动物和用包含EGF的组合物处理的动物之间检测出显著差异(p＜0.05)，但损伤减弱效应是明显的。通过Fisher精确检验来比较这些百分比。
部分结论-用本发明组合物进行的处理(每周3次，在1个月的时间内，并且在糖尿病性神经病建立后)显著减少了坐骨神经纤维的形态学衰退。用所述组合物进行的处理还能够减少血管的萎缩和退化。再次，所有这些发现与所施行的功能测试相一致。
(5)神经片段的生物化学表征。
每个实验组10只动物用于进行在所收集的坐骨神经片段中的生物化学测定。所研究的生物化学参数如下：
氧化还原特性谱：
Figure G2007800422158D00211
总超氧化物歧化酶(tSOD)的活性。
Figure G2007800422158D00212
过氧化氢酶的活性。
Figure G2007800422158D00213
总氢过氧化物(THP)的轴突内积聚。
Figure G2007800422158D00214
丙二醛(MDA)的轴突内积聚。
该研究的结果显示于表15中。
表15.在坐骨神经片段中的氧化还原状态的表征。
  实验组   tSODa，b   过氧化氢酶   THPc   MDA
  非糖尿病大鼠   2108.3±109.7   31.8±3.22   21.1±1.11   0.08±0.005
  糖尿病+盐水   375.8±88.2   603.6±99.4   317.5±12.2   0.87±0.1
  糖尿病+处理   1988.4±101.6   86.1±6.5   55.8±12.7   0.1±0.03
a值被表示为平均值和标准偏差。b酶被表示为单位/毫克蛋白质/分钟。c以nmol/mg蛋白质表示的THP和MDA。
在用安慰剂处理的糖尿病动物和用包含EGF的组合物处理的大鼠之间发现了统计学上显著的差异(p＜0.01，双尾Student t-检验)。如表15中所示，用所述药物组合物进行的处理显著减少了在所研究的神经组织中作为过氧化过程的指示的代谢产物的存在。平行地，显示了，所述处理减弱了超氧化物歧化酶的功能障碍。
(6)坐骨神经片段中的脂蛋白脂肪酶(LPL)的活性。
该研究的目的是相对于用盐水处理的糖尿病动物，比较在用包含EGF的组合物处理1个月后LPL的活性。结果显示于表16中。在用盐水处理的糖尿病组和用本发明组合物处理的组之间观察到显著差异(＊＊p＜0.01，ANOVA和Tukey检验)。
表16.坐骨神经中的LPL活性。
  实验组   LPL(nmoles RFA/分钟/g)
  非糖尿病大鼠   7.02±1.24
  糖尿病+盐水   2.18±0.73＊＊
  糖尿病+处理   6.29±1.67
这个分析证明，用包含EGF的药物组合物进行处理恢复了LPL的活性，这因而改善了神经合成髓鞘质的能力。
实施例3.证明包含EGF的组合物在治疗具有糖尿病性神经病的患者中的疗效。
总共5位患者用包含EGF的组合物进行治疗。那些患者具有痛性感觉-运动神经病的表现，对于先前的治疗无应答。所施用的EGF的剂量为20-25μg。通过渗入来应用包含这种活性药物学成分的组合物。所治疗的病例如下：
患者PCM.50岁的女性患者，具有超过20年的I型糖尿病诊断，有着缺血性心脏病、高血压和肾病的表现。具有进展了超过10年的痛性感觉-运动神经病表现的历史，并且对于先前的治疗无临床应答。将包含25μg EGF和100mg利多卡因/剂的组合物渗入主坐骨神经(majorsciatic nerve)中。将这个操作程序再重复5次，总共6次应用，总是在坐骨神经中，每周2次。在第3次渗入后疼痛消失。在治疗开始后8周，感觉-运动表现停止，并且在3个月随访期期间始终保持那样。
患者OZD.72岁的患有糖尿病的女性患者，具有严重的动脉闭塞和休息时痛。她不能走路并且具有整腿麻木。在相同的解剖学位置中(主坐骨神经)进行相同组合物的3次应用。该患者称，腿麻木在施用包含EGF的组合物后未停止，然而，在3次应用这种组合物后休息时痛消失，并且患者可以走得更快。
患者BCB.60岁的女性患者，具有超过10年的I型糖尿病诊断，有着休息时痛和肢体麻木。她接受了通过渗入主坐骨神经中来进行的相同组合物的6次应用。在第3次应用后，疼痛消失并且感觉异常减少。最后一次剂量应用后3周疼痛再次出现，因此进行新的治疗周期。
患者GTC.57岁的患有糖尿病的男性患者，具有肢体麻木。以4天间隔，在相同的解剖学位置中进行相同组合物的6次应用。在结束所述治疗后，腿麻木的症状消失，并且在3个月随访期期间始终保持那样。
患者STL.68岁的患有I型糖尿病超过10年的男性患者。他显示出在下肢中麻木的表现。以每周2次应用的比率，在相同的解剖学位置中进行相同组合物的6次应用。在第一轮治疗(6剂)后，下肢麻木消失，6个月后复发。因此遵循相同的操作程序来进行新的治疗周期，并且麻木的表现在第3次渗入后停止。
一般地，观察到患者的神经系统功能的实质性改善，伴随自发性休息时痛和感觉异常知觉的消除。
实施例4.获得包囊在聚乳酸(PLA)微球体中的EGF的药物组合物。
负载有EGF的微球体的制备和表征
通过使1g所述聚合物溶解于二氯甲烷(DCM)中来制备5％(w/v)聚乳酸溶液(Sigma，St.Louis，Missouri，USA)。
将3毫升的PLA溶液置于玻璃容器中，并加入以100μl的30mg/mlEGF水溶液。
借助于Ultraturrax T8匀浆器(IKA Labortechnik，Germany)，以14000rpm将该混合物搅拌2分钟。将所得到的乳状液倒入30ml1％聚乙烯醇中，并且通过使用Ultraturrax T8匀浆器(IKALabortechnik，Germany)以14000rpm剧烈搅动这两个相而获得第二种乳状液(w/o/w)。将该双重乳状液倒入270ml 1％聚乙烯醇30000-70000(Sigma，St.Louis，Missouri，USA)中，并在匀浆器(IKALabortechnik，Germany)中以300rpm搅拌1小时以蒸发掉二氯甲烷。最后，通过过滤来收集微球体，用50ml蒸馏水洗涤5次，并在冷冻干燥器(Edwards，UK)中进行冷冻干燥。将经干燥的微球体贮存于4℃直至其使用。
所得到的负载有EGF的微球体是球形的并且显示出规则的多孔表面(图1)。该过程的产率为85％，具有68-71％的包囊效率。微球体的负荷为0.82-0.85％。颗粒小于30μm。
经包囊的EGF的体外释放
将50mg负载有EGF的微球体悬浮于1ml接纳液体(0.001％Tween80和0.1％叠氮化钠，在PBS pH 7.2中)中。使该悬浮液于37℃在轻轻搅拌下进行温育。在第1、3、7和14天时，使样品在Hettich微量离心机(Tuttlingen，Germany)中以5000rpm离心5分钟。收集上清液，并加入相同体积的接纳液体。通过微量测定法形式的双金鸡宁酸方法(microBCA测定法)来估定每种样品中的EGF浓度。
EGF从微球体中释放的特性曲线展示出在第一天期间的爆发式释放阶段以及直至第14天的连续且逐步的EGF释放的第二个阶段。大致地，在第一个阶段期间释放出30％的总蛋白质，而在该评估时间段的其余部分期间释放出高达50％的包含到颗粒中的EGF，以大约7μg/天的速率(图2)。
实施例5.证明包含包囊在微球体中的EGF的组合物在具有糖尿病性神经病的患者中的疗效。
接下来概括了用包含包囊在微球体中的EGF的组合物进行治疗的3位患者的某些特征，以及关于应用于其的治疗的信息：
患者LNP.47岁的女性患者，具有超过10年的I型糖尿病诊断，有着痛性感觉-运动神经病的表现。用包含20μg EGF/剂的组合物对主坐骨神经进行渗入。这个操作程序重复3次，总共4次应用，以每周2次剂量的频率。疼痛在第3次渗入后减少，并且在第4次应用后消失。感觉-运动表现在2周后消失，并且在3个月随访期期间始终保持那样。
患者JVR.63岁的具有I型糖尿病的女性患者。显示出休息时痛和肢体麻木。她接受包含25μg EGF/剂的组合物的6次应用，每次间隔12天。通过渗入主坐骨神经中来完成所述组合物的应用。在第3次应用后，疼痛消失并且感觉异常减少。在所述组合物的最后一次应用后6周，疼痛再次出现并因此开始新一轮的治疗。
患者DGR.52岁的患有糖尿病的男性患者，具有肢体麻木。以14天的间隔，在相同的解剖学位置中，他接受5次剂量的上述组合物，所述组合物包含包囊在微球体中的EGF以用于缓慢释放。在EGF治疗结束后，腿麻木已消失，并且在4个月随访期期间始终保持那样。

Claims (16)

1.表皮生长因子(EGF)在制备药物组合物中的用途，所述药物组合物通过渗入神经干和/或神经节的周边中来进行施用，以用于受糖尿病性神经病影响的外周神经的形态功能恢复。
2.根据权利要求1的EGF的用途，其中所述糖尿病性神经病是指痛性感觉-运动神经病。
3.根据权利要求2的EGF的用途，其中所述痛性感觉-运动神经病影响下肢。
4.根据权利要求1的EGF的用途，其中所述生长因子是重组人EGF。
5.根据权利要求1-4任一项的EGF的用途，其中所述EGF被包囊在微球体中。
6.根据权利要求1-4任一项的EGF的用途，其中所述包含EGF的药物组合物是液体的或冻干的以便在其使用前进行重构。
7.根据权利要求6的EGF的用途，其中所述包含EGF的药物组合物是水性组合物，可选地经缓冲；或者是待用水或水性缓冲溶液进行重构的冻干组合物。
8.根据权利要求1的EGF的用途，其中所述包含EGF的药物组合物含有10-1000微克EGF/毫升。
9.根据权利要求1的EGF的用途，其中所述包含EGF的药物组合物另外还含有10微克-500毫克的选自下列的至少一种局部麻醉药或镇痛药：利多卡因、布比卡因或奴佛卡因。
10.根据权利要求9的EGF的用途，其中所述局部麻醉药是2％的利多卡因。
11.包含与局部麻醉药或镇痛药相组合的EGF的药物组合物在制备用于痛性感觉-运动型糖尿病性神经病中外周神经的形态功能恢复的药物中的用途。
12.包含与局部麻醉药或镇痛药相组合的EGF的药物组合物在制备用于治疗与糖尿病性神经病相关的运动纤维损伤的药物中的用途。
13.根据权利要求11或12的用途，其中所述药物通过渗入神经干和/或神经节的周边中来施用。
14.根据权利要求13的用途，其中所述渗入在坐骨神经中进行。
15.根据权利要求13的用途，其中所述渗入以每周1-3次并且持续3-8周来进行。
16.根据权利要求11或12的用途，其中所述药物通过局部渗入受损或未受损的区域中来进行，所述区域具有与单或双下肢的局部缺血相关或不相关的强烈的神经病性疼痛，并且其中所述局部渗入以每周1-5次并且持续2-6周来进行。
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