RU2460536C2

RU2460536C2 - Применение эпидермального фактора роста для морфофункционального восстановления периферических нервов при диабетической невропатии

Info

Publication number: RU2460536C2
Application number: RU2009116646/15A
Authority: RU
Inventors: МОНТЕКИН Хосе Игнасио ФЕРНАНДЕС (CU); МОНТЕКИН Хосе Игнасио ФЕРНАНДЕС; МАРТИНЕС Луис Сатурнино ЭРРЕРА (CU); МАРТИНЕС Луис Сатурнино ЭРРЕРА; АКОСТА Хорхе Амадор БЕРЛАНГА (CU); АКОСТА Хорхе Амадор БЕРЛАНГА; ДЕЛЬ БАРКО ЭРРЕРА Диана ГАРСИЯ (CU); Дель Барко Эррера Диана Гарсия; ВЕРА Данай СИБРИАН (CU); ВЕРА Данай СИБРИАН; НЬЕТО Херардо Энрике ГИЛЬЕН (CU); Ньето Херардо Энрике Гильен; ГОМЕС Раймундо УБЬЕТА (CU); ГОМЕС Раймундо УБЬЕТА; БЛАНКО Сонья ГОНСАЛЕС (CU); БЛАНКО Сонья ГОНСАЛЕС; МАРТИНЕС Вивиан Мария САЕС (CU); Мартинес Вивиан Мария Саес
Original assignee: Сентро Де Инхеньерия Хенетика И Биотекнолохия
Priority date: 2006-10-03
Filing date: 2007-10-01
Publication date: 2012-09-10
Also published as: EP2075004B1; KR20090103862A; CA2665117A1; PL2075004T3; US20140105990A1; EP2075004A1; RU2009116646A; CU23526B6; BRPI0719816A2; AU2007304640B2; BRPI0719816B8; WO2008040260A1; US9034826B2; AR063088A1; CA2665117C; DK2075004T3; CN101573130A; CN101573130B; JP5508853B2; ES2386058T3

Abstract

Изобретение относится к медицине и касается применения эпидермального фактора роста (EGF) для получения инъецируемой фармацевтической композиции, где указанную композицию вводят посредством инфильтрации на периферии нервных стволов и/или ганглиев, для морфофункционального восстановления периферических нервов при болезненной сенсомоторной невропатии или ишемическом неврите. Оно относится также к содержащей EGF композиции, где это вещество можно составлять вместе с анестетическими или анальгетическими лекарственными средствами, или инкапсулировать в микросферы. Изобретение обеспечивает прекращение невропатической боли. 3 н. и 17 з.п. ф-лы, 5 пр., 2 ил., 16 табл.

Description

Область техники

Настоящее изобретение относится к медицинским или экспериментальным применениям фармацевтической композиции, содержащей эпидермальный фактор роста (EGF), предпочтительно вводимой посредством инфильтрации на периферии нервных стволов и/или ганглиев, для предотвращения или коррекции любого из клинических проявлений диабетической невропатии и проявлений ишемического неврита. Указанную композицию можно также вводить местно, в дистальные области конечностей или в основание ампутированных конечностей, испытывающих невропатическую боль.

Предшествующий уровень техники

Недостаточные уровни глюкозы в крови и другие связанные с диабетом факторы могут изменять нервные волокна в любой части организма, вызывая группу нарушений со специфическими характеристиками, в зависимости от пораженных нервов. Эти нарушения вместе называют диабетической невропатией, и описано по меньшей мере, три главных типа: (1) сенсомоторная невропатия (наиболее типичная и частая форма), (2) автономная невропатия и (3) мононевропатия (Sadikot S.M., Nigam A., Das S., et al. (2004). The burden of diabetes and impaired glucose tolerance in India using the WHO 1999 criteria: prevalence of diabetes in India study (PODIS). Diabetes Res Clin Pract, 66, 301-7).

Хотя точные механизмы, лежащие в основе этих нарушений, не понятны полностью, известно, что нервные волокна являются структурно модифицированными посредством накопления веществ, полученных в результате усиленного метаболизма глюкозы, что приводит к потере миелиновой оболочки нервных волокон. Потеря этой защитной оболочки подразумевает задержку способности к переносу нервного импульса при получении или переносе моторных сигналов или любого другого типа сигналов. В дополнение к этому прямому механизму, кровеносные сосуды, орошающие нервы, могут страдать от обструкций из-за событий, которые являются общими для других хронических осложнений диабета (Ashok S., Ramu M., Deepa R., et al. (2002). Prevalence of neuropathy in type 2 diabetes patients attending diabetes center in South India. J Assoc Physicians India, 50, 546-50).

Как является общераспространенным при диабете, начальные фазы диабетической невропатии, как правило, являются бессимптомными, даже в течение нескольких лет, и до настоящего времени нет способа предсказать ее скрытое клиническое течение. Когда врач подозревает сенсомоторную диабетическую невропатию, он может подтвердить диагноз посредством проведения теста для оценки скорости нервной проводимости. Этот тест состоит в определении скорости переноса слабых электрических токов по выбранным нервам.

При наиболее частой форме диабетической невропатии, сенсомоторной невропатии, начальные симптомы включают в себя потерю чувствительности, некорректное восприятие тактильных ощущений и, в определенных случаях, острую боль после минимальных царапин на коже. Обычно это происходит в первую очередь на ногах и руках и, в большинстве случаев, в течение ночи. Когда пораженные нервы отвечают за подвижность пищеварительного тракта, могут иметь место замедление процесса пищеварения или изменения ритма деятельности кишечника (диарея и/или запор). Иногда диабетическая невропатия нарушает контроль сердечно-сосудистой системы, приводя к обмороку или гипотонии, если пациенты неожиданно встают (Levitt N.S., Stansberry K.B., Wychanck S., et al. (1996) Natural progression of autonomic neuropathy and autonomic function tests in a cohort of IDDM. Diabetes Care, 19, 751-54).

Диабетическая мононевропатия может поражать практически любой отдельный нерв, приводя к параличу одной стороны лица, изменению движений глаза, параличу и/или боли в конкретной анатомической локализации.

Периферическая невропатия может поражать черепно-мозговые нервы или спинномозговые нервы и их ответвления и представляет собой тип невропатии (поражение нерва), который проявляет тенденцию развиваться по стадиям. Сначала присутствует боль и перемежающееся дрожание в конечностях, в частности, в ногах; в то время как на более поздних стадиях боль является более интенсивной и постоянной. Наконец, развивается безболезненная невропатия, когда повреждение нервов становится массовым (Oh S.J. (1993). Clinical electromyography: nerve conduction studies. In: Nerve conduction in polyneuropathies. Baltimore: Williams and Wilkins, p:579-91).

Одним из наиболее тяжелых последствий диабетической невропатии является связанная с ней боль, которая иногда является высокоинтенсивной и не отвечает на общепринятые терапевтические процедуры. Использовали фармакологические и клинические способы лечения без большого успеха. Последние наиболее часто назначали в комбинации с анальгетиками, нестероидными противовоспалительными средствами, противосудорожными средствами, такими как карбамазепин и фентоламин, трициклическими антидепрессантами и местными анестетиками, которые могут проникать даже для достижения заблокированных волокон. Противосудорожные препараты недавно использовали для лечения боли, связанной с диабетической невропатией. Среди них наиболее недавно представлен для лечения боли габапентин. Нейрохимически габапентин увеличивает биодоступность гамма-аминомасляной кислоты (GABA), ингибирует переносчик GAT-1, который, в свою очередь, уменьшает повторное поглощение GABA; уменьшает синтез и высвобождение биогенных аминов, таких как норадреналин, дофамин и 5-OH-триптамин; и индуцирует высвобождение опиоидных пептидов типа энцефалина, вовлеченных в модуляцию боли (Didangelos T.P., Karamitsos D.T., Athyros V.G., et al. (1998). Effect of Aldose reductase inhibition on cardiovascular reflex tests in patients with definite diabetic autonomic neuropathy. J Diabetes Complications, 12, 201-7).

Для пациентов с болезненной невропатией и отсутствием ответа на лечение использовали чрескожную электронную стимуляцию таким образом, что, посредством применения запрограммированных напряжений с низкой интенсивностью, предотвращали передачу боли через пораженные нервы.

Болезненную диабетическую невропатию разделяют на хроническую и острую формы. Острую форму, как правило, наблюдают в течение первых трех лет после постановки диагноза; она начинается и заканчивается спонтанно. Хроническая форма присутствует у лиц, страдающих от заболевания в течение в среднем 8 или 9 лет, она начинается медленно и продолжается годами с множеством рецидивов. Невропатии черепно-мозговых нервов могут поражать зрение и вызывают боль в глазу.

Симптомы заболевания, как правило, представляют собой сонливость, звон в ушах, потерю чувствительности в некоторых частях организма, диарею или запор, потерю контроля над мочевым пузырем, импотенцию, птоз лица, бровей и/или рта. Оно может также вызывать изменения зрения, головокружение, затруднения глотания, изменения речи и сокращения мышц. Эти симптомы меняются в зависимости от пораженного нерва или нервов и, как правило, развиваются постепенно.

Потеря чувствительности, связанная с диабетической невропатией, увеличивает риск поражений. Небольшие инфекции могут прогрессировать, пока не становятся язвами и не требуют ампутации. Кроме того, повреждение двигательных нервов может приводить к разложению и асимметрии мышц. Иными словами, невропатия, возможно, является основной причиной ампутации ног и стоп при этом заболевании.

Целями лечения диабетической невропатии являются предупреждение прогрессирования и уменьшение симптомов заболевания. Строгий контроль глюкозы является важным для избегания этого прогрессирования. В настоящее время не является доступным специфическое лечение, способное предотвращать, задерживать или обращать изменение нервных волокон при диабетической невропатии. Не одобрено лекарственных средств, способных репарировать разрушение нервов, однако несколько из них в настоящее время исследуют. Комплексы витаминов В являются, возможно, наиболее применяемыми лекарственными средствами для всех форм невропатии. Хотя эти лекарственные средства облегчают некоторые симптомы, они являются не более чем паллиативными. Другой терапевтической альтернативой, используемой в последнее время, является введение липоевой кислоты внутривенным способом, на основании ее свойств антиоксиданта (Ziegler D., Hanefeld M., Ruhnau K.J., et al. (1999). Treatment of symptomatic diabetic polyneuropathy with the antioxidant alpha-lipoic acid: a 7 month multicenter randomized controlled trial (ALADIN III study). ALADIN III study group. Alpha-lipoic acid in diabetic neuropathy. Diabetes Care, 22, 1296-301). Другие исследования проводили для представления перорального лечения ацетил L-карнитином, соединением, оказывающим дискретное влияние на малые чувствительные волокна.

Единственный терапевтический способ на основании патогенеза для периферической диабетической невропатии включает в себя использование ингибиторов альдозоредуктазы. Его действие основано на роли альдозоредуктазы в структурных и функциональных метаболических нарушениях, индуцированных гипергликемией нервов пораженного диабетом организма. До настоящего времени сорбинил, который является эффективным для улучшения скорости моторного проведения у страдающих диабетом лиц с невропатией, оценивали в клинических испытаниях, но его изъяли из продажи из-за токсических эффектов. Для статила показали обнадеживающие результаты для животных, но эти результаты не смогли подтвердить для человека. Как правило, ингибиторы альдозоредуктазы являются очень токсичными.

Значительный оптимизм вызвало введение в клинику фактора роста нервов (NGF) и других факторов роста. В исследовании для 250 пациентов с невропатией малых волокон (C-волокон) документировали избавление от боли и увеличение способности детекции горячих стимулов. Однако в двух последующих исследованиях с более высоким числом пациентов лечение с помощью NGF не показало никакого преимущества (Vinik Al. (1999). Treatment of diabetic polyneuropathy (DPN) with recombinant human nerve growth factor (rh NGF). Diabetes, 48, A54-5).

Генотерапию с помощью фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) интенсивно исследовали у животных, показав улучшение проведения нервных импульсов и плотности кровеносных сосудов, дренирующих нерв. Однако этот и другие способы с использованием дополнительных нейротропных средств являлись неспособными прекращать прогрессирование до диабетической невропатии в клинических испытаниях, несмотря на предыдущие положительные результаты для животных. (Schratzberger P., Walter D.H., Rittig K., et al. (2001). Reversal of experimental diabetic neuropathy by VEGF gene transfer. J Clin Invest, 107, 1083-92). Для уменьшения симптомов рекомендовано местное лечение капсаицином или пероральные лекарственные средства, такие как амитриптилин, габапентин и карбамазепин.

Патогенетические механизмы диабетической невропатии не являются хорошо понятными. Современное лечение облегчает боль и может контролировать часть связанных симптомов, однако процесс в общем прогрессирует. Хуже всего то, что специфическое лекарственное средство для этого заболевания, по-видимому, не будет доступно в ближайшем будущем.

Краткое описание изобретения

Это изобретение относится к решению вышеупомянутых проблем с использованием EGF в фармацевтической композиции, которую вводят посредством инфильтрации на периферии нервных стволов и/или ганглиев, для морфофункционального восстановления периферических нервов при болезненной, сенсомоторной невропатии, так же как при ишемическом неврите.

Связанные с диабетом изменения периферических нервов являются сложными, и, возможно, в них вовлечено множество причин. Два основных патогенетических механизма представляют собой 1) теорию накопления сорбита, приводящего к серии биохимических аномалий, которые, в конце концов, вызывают структурные изменения в периферических нервах, 2) структурное и функциональное повреждение эндоневральных микрососудов, вызывающее изменения нервных волокон, запускаемые гипоксией или ишемией. Другими механизмами возникновения диабетической невропатии являются модуляция продукции ферментов, активация системы комплемента, накопление белков с высокой аффинностью для тяжелых металлов, таких как железо и медь, и уменьшение количества нейротрофических факторов. Другим элементом, о котором категорически заявляют, является накопление продуктов перекисного окисления и нитрозилирования. Снижение эндоневрального давления кислорода наблюдали в нервах пациентов с диабетом, страдающих от невропатии. Все эти события приводят к высокому уровню апоптоза и клеточной смерти в нервных структурах. Это является причиной того, почему диабетическая невропатия характеризуется потерей функциональных единиц на уровне миелинизированных нервных волокон и значительным снижением скорости нервной проводимости (NCV). Периферическая полиневропатия характеризуется присутствием боли, которая связана с дисфункцией альфа- и С-волокон.

Как правило, композицию по настоящему изобретению вводят посредством местной инфильтрации, помещая ее вблизи нервных стволов и/или ганглиев, в дистальные болезненные зоны ног до или после ампутации, и в тех случаях, когда опытный специалист в данной области признает разрушение С-волокон. Показано, что лечение настоящей композицией в течение нескольких недель способно прекращать невропатическую боль; смягчать неавтономные нарушения; и восстанавливать периферическую чувствительность к давлению и температуре.

После трех системных инъекций или местных инфильтраций на периферии нервных стволов фармацевтической композиции у животных с диабетом авторы настоящего изобретения выявили:

1. Улучшение целостности миелиновой оболочки седалищного нерва.

2. Уменьшения отека аксона.

3. Сохранение аксональных нейрофиламентов.

4. Целостность питающих нервы сосудов.

5. Уменьшение эндоневральной коллагенизации.

6. Нормализацию скорости проводимости моторных волокон.

Композиция медленно высвобождается около интересующей структуры в объеме 1-5 миллилитров. Частота инфильтрации в нервных стволах и ганглиях может колебаться от одного до трех раз в неделю. Лечение композицией, описанной в этом изобретении, может являться или не являться сочетанным с ингибиторами альдозоредуктазы, аминогуанидином, пероральными или парентеральными гипогликемическими средствами, инсулином, стимуляторами периферической чувствительности к инсулину, глюкагон-подобными пептидами, терапией витаминами, агонистами или усилителями системы GABA, предшественниками эндорфина, антиокислителями, жирными кислотами или их предшественниками, монотерапией или сочетанной терапией анальгетиками, трициклическими антидепрессантами и противовоспалительными лекарственными средствами. Число введений, вводимых пациенту, меняется в зависимости от тяжести клинических симптомов у пациента. Если симптомы возникают вновь, необходимо несколько циклов лечения.

Один из конкретных вариантов осуществления настоящего изобретения представляет собой применение EGF для получения составов, вводимых посредством инфильтрации на периферии нервных стволов и/или ганглиев для морфофункционального восстановления периферических нервов при сенсомоторной невропатии, когда наиболее важные проявления этой невропатии поражают ноги. В предпочтительном варианте осуществления EGF, применяемый для получения фармацевтической композиции, вводимой посредством инфильтрации на периферии нервных стволов и/или ганглиев для морфофункционального восстановления периферических нервов, представляет собой рекомбинантный EGF человека.

В другом конкретном варианте осуществления изобретения осуществляют инфильтрацию содержащей EGF фармацевтической композиции в седалищный нерв.

Целью настоящего изобретения является пригодная для инъекции фармацевтическая композиция, содержащая комбинацию EGF и по меньшей мере одного местного анестетика или анальгетика, вводимая посредством инфильтрации на периферию нервных стволов и/или ганглиев, для морфофункционального восстановления периферических нервов при диабетической невропатии. В конкретном варианте осуществления указанный анестетик представляет собой лидокаин, который вносит вклад в облегчение боли, вызванной инфильтрацией EGF. Более того, сопроводительный анестетик, присутствующий в композиции, может представлять собой, среди прочих, бупивакаин или новокаин.

Настоящее изобретение относится также к композиции, в которой EGF вводят посредством инфильтрации на периферии нервных стволов и/или ганглиев с помощью систем с контролируемым высвобождением. В предпочтительном варианте осуществления указанные системы с контролируемым высвобождением представляют собой микросферы, изготовленные из сополимеров молочной кислоты и гликолевой кислоты, или полимолочной кислоты, несущие EGF.

Микросферы могут обеспечивать несколько преимуществ, где наиболее распространенным является уменьшение частоты введения. Настоящее изобретение относится к техническому решению проблемы отсутствия доступного лекарственного средства, специфического для лечения диабетической невропатии. Однако для лечения с помощью содержащих EGF композиций, где эта молекула не является связанной с микросферами, необходимо применение соответствующих доз лекарственного средства по меньшей мере дважды в неделю. Принимая во внимание это неудобство, применение состава для замедленного и отложенного высвобождения EGF уменьшает частоту введения продукта, что является благоприятным для пациента. Состав на основе микросфер обладает следующими преимуществами:

Уменьшение частоты введения, что приводит к лучшему следованию пациента лечению.

Увеличение терапевтического преимущества благодаря исключению колебаний уровней белка в сыворотке.

Потенциальное уменьшение общей дозы, необходимой для лечения, благодаря лучшей эффективности вводимой дозы.

Потенциальное уменьшение неблагоприятных эффектов благодаря уменьшению количества белка, высвобождаемого в организме в момент введения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

Фигура 1. Микрофотография нагруженной EGF микросферы. Шкала внизу микрофотографии представляет длину 10 мкм.

Фигура 2. Профиль высвобождения EGF, инкапсулированного в микросферы PAL. На оси X показано время в сутках, а на оси Y - количество высвобожденного EGF, выраженное в процентах от общего количества EGF внутри микросфер, использованного для анализа.

Подробное описание изобретения

Примеры

Пример 1. Профилактический эффект фармацевтической композиции на повторное проявление диабетической невропатии

Целью этого исследования являлась оценка нейропротективного эффекта содержащей EGF фармацевтической композиции в модели сахарного диабета на животных. Во-первых, являлось необходимым разработать способ индукции сахарного диабета у крыс Wistar посредством введения стрептозотоцина.

Самцам Wistar с массой тела 200-250 граммов вводили подкожную инъекцию стрептозотоцина, при 75 мг/кг в буфере - цитрате натрия. Затем воду заменяли 10% раствором сахарозы в течение следующих 24 часов для предотвращения смертей, вызванных гипогликемией. Уровни глюкозы в крови мониторировали каждое утро в течение следующих 72 часов после инъекции. Использовали только животных с постоянными уровнями глюкозы выше 15 ммоль/л. Крыс содержали по 4 на клетку и кормили общепринятым способом. Параллельной группе из других 80 крыс вводили цитратный буфер без стрептозотоцина и содержали ее сходным с диабетической группой образом. Среднее значение гликемии в течение 72 часов в этой группе составляло 5,87 ммоль/л.

Для исследования эффекта содержащей EGF фармацевтической композиции для предотвращения диабетической невропатии использовали следующий дизайн эксперимента с 10 крысами на каждую из групп:

• Контрольная группа - группа крыс с диабетом с введением солевого раствора три раза в неделю в 1 мл внутрибрюшинным способом.

• Группа обработки 1 - группа крыс с диабетом с введением содержащей EGF фармацевтической композиции один раз в неделю в 1 мл внутрибрюшинным способом.

• Группа обработки 3 - группа крыс с диабетом с введением содержащей EGF фармацевтической композиции три раза в неделю в 1 мл внутрибрюшинным способом.

Все обработки проводили в течение 8 недель, начиная через одну неделю после инъекции стрептозотоцина. Используемая композиция содержала 75 мкг рекомбинантного EGF человека/мл. Для исследуемых животных проводили несколько типов наблюдений:

(1) Определение порога ноцицептивных реакций (NCT). Болевой тест.

Болевой тест, посредством воздействия увеличивающимся давлением на хвост, проводили на 28 и 56 сутки после начала обработки, с использованием 10 животных на каждую из экспериментальных групп. NCT, выраженный в граммах, определяли с использованием анальгезиметра типа Ugo Basile для воздействия постепенно увеличивающегося давления на хвосты животных, пока у них не разовьется рефлекс отдергивания. У людей при диабетической невропатии порог ноцицептивных реакций снижен. В таблице 1 показаны результаты NCT при измерении на 28 сутки.

Таблица 1 Результаты теста NCT (28 суток)
Экспериментальная группа	*NCT (граммы)**
Контроль с солевым раствором	120±11
Группа обработки 1	125±18
Группа обработки 3	123±16
Крысы без диабета	128±9
*Данные выражены как среднее и стандартное отклонение

Не детектировали изменений ноцицептивной картины у животных после 28 суток развития заболевания. Это позволяет предполагать, что клиническая форма гиперестезии еще не установилась. По этой причине эффект обработки еще невозможно оценить в этой временной точке. Результаты обследования на 56 сутки показаны в таблице 2.

Как показывают результаты, через два месяца после индукции диабета возможно оценить эффект периферической диабетической невропатии у животных. Снижение порога болевой чувствительности детектировали в этой экспериментальной точке. Заметна также разница между группой крыс с диабетом после введения солевого раствора в течение двух месяцев и группой после проведения обработки содержащей EGF композицией три раза в неделю.

Таблица 2 Результаты теста NCT (56 суток)
Экспериментальная группа	NCT (граммы)
Контроль с солевым раствором	80±19**
Группа обработки 1	91±14*
Группа обработки 3	121±22
Крысы без диабета	123±6

Наблюдали значимые различия между группой с диабетом после обработки солевым раствором и группой после проведения обработки 3, так же как с группой крыс без диабета (**p<0,01, ANOVA с коррекцией по Бонферрони). Присутствовали также значимые различия между группой обработки 1 и группами обработки 3 и здоровых животных. Обнаружение того, что животные после обработки, как правило, обладают большей устойчивостью к боли, позволяет предполагать, что обработка содержащей EGF композицией предотвращает изнашивание чувствительных волокон.

(2) Определение скорости проводимости импульса по чувствительным волокнам.

Для оценки протективного эффекта содержащей EGF фармацевтической композиции для чувствительных и моторных волокон скорость проводимости электрического импульса измеряли на 60 сутки после начала обработки. Пятнадцать животных использовали в каждой экспериментальной группе. При диабетической невропатии скорость проводимости, как правило, снижена.

Дистальную сверхмаксимальную стимуляцию в седалищно-тибиальном пути с использованием биполярных электродов использовали для исследования моторной проводимости. Определение скорости проводимости в чувствительных путях проводили посредством воздействия стимула на проксимальную точку хвоста и измерения его на отдалении 3 см. Результаты этого исследования на 60 сутки показаны в таблице 3.

Таблица 3 Скорость моторной проводимости (MCV) на 60 сутки
Экспериментальная группа	MCV (м/с)
Контроль с солевым раствором	34±18**
Группа обработки 1	45±13*
Группа обработки 3	56±11
Крысы без диабета	60±8

Наблюдали значимые различия между группой с диабетом после обработки солевым раствором и группой после проведения обработки 3, так же как с группой крыс без диабета (**p<0,01, ANOVA с коррекцией по Бонферрони). Присутствовали также значимые различия между группой обработки 1 и группами обработки 3 и здоровых животных (*p<0,05); и между группой обработки 1 и контрольными животными с диабетом после введения солевого раствора.

Следует отметить положительный эффект композиции, особенно в группе после проведения трех обработок в неделю. Значения проводимости моторных волокон являются очень сходными со значениями для здоровых животных. Хотя еще со статистической разницей с группой животных без диабета, у крыс в группе после проведения обработки 1 также улучшалась скорость проводимости. Результаты исследования скорости чувствительной проводимости (SCV) на 60 сутки показаны в таблице 4.

Таблица 4 Скорость чувствительной проводимости (SCV) на 60 сутки
Экспериментальная группа	SCV (м/с)
Контроль с солевым раствором	31±7**
Группа обработки 1	38±6*
Группа обработки 3	44±9
Крысы без диабета	56±3

Наблюдали значимые различия между группой с диабетом после обработки солевым раствором и группой после проведения обработки 3, так же как с группой крыс без диабета (**p<0,01, ANOVA с коррекцией по Бонферрони). Присутствовали также значимые различия между группой обработки 1 и группами обработки 3 и здоровых животных (*p<0,05); не наблюдали статистических различий между группой обработки 1 и контрольными животными с диабетом после введения солевого раствора. Это исследование показало эффект содержащей EGF фармацевтической композиции для сохранения функциональной полноценности животных при введении три раза в неделю.

(3) Влияние композиции на сохранность перфузии кровью периферического нерва.

Правый седалищный нерв крыс использовали в качестве модели. По десять животных включали в каждую из экспериментальных групп. Подобное число крыс без диабета использовали для расчета контрольных значений. Использовали систему лазерной визуализации перфузии по Доплеру (LDPI). Данные по перфузии в периферических тканях нерва программировали на нулевые значения. Контрольным животным вводили солевой раствор в течение двух месяцев перед измерением. Все определения проводили в одних и тех же условиях анестезии и условиях окружающей среды. Они отражены в таблице 5.

Таблица 5 Результаты исследования, проведенного с помощью системы лазерной визуализации перфузии по Доплеру
Экспериментальная группа	Единицы LDPI
Контроль с солевым раствором	525,5±88,8**
Группа обработки 1	653,4±41,9**
Группа обработки 3	988,7±80,3
Крысы без диабета	1301,7±112,2

Наблюдали значимые различия между группой с диабетом после обработки солевым раствором и группой после введения терапевтической композиции один раз в неделю, где обе обработки продолжались два месяца; а также с группой после введения терапевтической композиции три раза в неделю (**p<0,01, ANOVA с коррекцией по Бонферрони). Не обнаружили статистических различий между значениями для последней группы и значениями для здоровых крыс без диабета.

(4) Посмертные определения и оценки.

Гистоморфометрическое исследование.

После завершения обработки животных умерщвляли на 70 сутки после индукции диабета, через 10 суток после введения последней дозы и завершения описанных выше анализов. Животных умерщвляли посредством передозировки анестезии и проводили перфузию солевым буфером при pH 7,4. Всего по десять животных включали в экспериментальную группу для гистоморфометрических исследований и эквивалентное число крыс использовали для биохимических определений. В обеих системах вырезали седалищные нервы из обеих конечностей; фрагменты сохраняли при -70°C до обработки. Образцы, взятые для гистологических и/или гистоморфометрических исследований, окрашивали гематоксилином/эозином и толуидиновым синим. По меньшей мере пять фрагментов одного и того же нерва исследовали количественно с использованием программы MADIP. Фрагменты заключали в блоки целлоидина и желатина и эти блоки нарезали горизонтально и в поперечном направлении. Оценивали следующие гистологические показатели:

Общее число кровеносных сосудов (эпиневральных/периневральных) в 10 микроскопических полях с использованием 10X в качестве постоянного увеличения на продольных срезах нерва.

Процент демиелинизированных волокон. Оценен по нахождению среднего по значениям для микроскопического поля (x20, по меньшей мере для пяти полей).

Процент миелинизированных или немиелинизированных волокон с повреждениями (расширенных или деформированных) на микроскопическое поле (x20, по меньшей мере для пяти полей).

Процент эндоневральной коллагенизации (умеренная: 25-50%; тяжелая: более 50% эндоневральной площади на поперечных срезах и по меньшей мере на трех различных срезах).

Результаты этого исследования показаны в таблице 6.

Таблица 6 Морфометрическое исследование, проведенное для фрагментов седалищного нерва
Экспериментальная группа	Число кровеносных сосудов	% демиелинизированных волокон	% волокон с повреждениями	% коллагенизи-рованной площади
Контроль с солевым раствором	87,65±17,8	64,77±19,72	81,5±9,73	58,93±28
Группа обработки 1	111,33±14,5	51,2±17,94	60,12±11	42,69±14,71
Группа обработки 3	158,6±26,12	35,56±12,18	41,38±10,26	13,45±11,82
Крысы без диабета	194,42±43,81	0	0	0

Документировали статистически значимые различия в числе кровеносных сосудов между группой животных с диабетом после обработки солевым раствором и здоровыми контрольными крысами (p=0,0023). Более того, обнаружили также статистические различия, когда сравнивали группу солевого раствора и группу после обработки 1 (p=0,031). Присутствовали также статистические различия (p=0,014), когда группу солевого раствора сравнивали с группой после обработки 3. Результаты анализировали посредством ANOVA с коррекцией по Бонферрони. Проценты сравнивали с помощью точного теста Фишера.

Обнаружили статистически значимые различия между группами обработки по трем параметрам: процент демиелинизированных волокон, процент волокон с повреждениями и процент коллагенизированных площадей. Обнаружили статистическую разницу между группой мышей с диабетом после обработки инсулином и животными после обработки 3 (p<0,05).

Частичные заключения. Обработка содержащей EGF композицией три раза в неделю в течение двух месяцев являлась способной предотвращать процесс демиелинизации, чтобы значительно уменьшать морфологическое изнашивание волокон седалищного нерва и, следовательно, предотвращать эндоневральную коллагенизацию. Подобным образом, пролонгированная обработка этой композицией значимо исключает атрофию и дегенерацию кровеносных сосудов, питающих нерв. Все эти обнаружения находятся в соответствии с функциональными тестами, проводимыми по отношению к проводимости чувствительных и моторных стимулов, и с исследованием перфузии с помощью системы лазера по Доплеру.

(5) Биохимическая характеризация фрагментов нерва.

По десять животных на экспериментальную группу использовали для проведения биохимических определений в собранных фрагментах седалищного нерва. Исследуемые биохимические параметры являлись следующими:

Профиль окисления-восстановления:

Общая ферментативная активность супероксиддисмутазы (tSOD).

Ферментативная активность каталазы.

Внутриаксональное накопление общих гидропероксидов (HPT).

Внутриаксональное накопление малонилдиальдегида (MDA).

Результаты этого исследования показаны в таблице 7.

Таблица 7 Оценка окислительно-восстановительного состояния фрагментов седалищного нерва
Экспериментальные группы	tSOD ^a,b	Каталаза	HPT ^c	MDA
Крысы без диабета	2267,05±202,9	26,40±5,95	18,66±1,43	0,06±0,01
Группа солевого раствора	433,55±95,21**	440,26±52,19**	208,62±11,3**	0,32±0,02**
Группа обработки 1	958,17±244,61*	274,60±52,3*	143,05±1,98*	0,24±0,04*
Группа обработки 3	2102,83±112,67	37,62±8,13	25,15±1,81	0,08±0,02
^аЗначения выражены как среднее и стандартное отклонение. ^bФерменты выражены как единицы на миллиграмм белка в минуту. ^c HPT и MDA в нмоль/мг белка.

Наблюдали значимые различия между животными с диабетом после обработки плацебо и животными с диабетом после обработки три раза в неделю содержащей EGF композицией (**p=0,0001). Присутствовали также различия между группами после обработки содержащим EGF составом один раз в неделю и три раза в неделю, а также при сравнении с животными без диабета (*p=0,003). Не обнаружили различий между здоровыми животными и животными после обработки три раза в неделю согласно двухстороннему T-тесту Стьюдента.

Поскольку накопление глюкозы вносит вклад, посредством нескольких биохимических механизмов, в увеличение уровня перекисного окисления липидов и, в свою очередь, в накопление внутри тканей конечных продуктов усиленного гликозилирования (AGE), необходимо оценивать маркеры, связанные с этим процессом. Как показывают результаты, показанные в таблице 7, обработка анализируемой фармацевтической композицией значительно снижает накопление метаболитов процесса перекисного окисления и зависит от частоты применения. Помимо этого, обработка способна предотвращать уменьшение уровня супероксиддисмутазы.

(6) Ферментативная активность липопротеинлипазы (LPL) в фрагментах седалищного нерва.

Фрагменты нерва от каждого животного инкубировали вместе с 3 мкг/мл гепарина в буфере Кребса-Рингера при 37°C в течение 50 минут. Затем аликвоты из этих образцов инкубировали в присутствии [¹⁴C]триолеин-фосфатидилхолина. Меченные ¹⁴C жирные кислоты оценивали количественно общепринятыми способами. Активность LPL выражали в наномолях высвобожденных жирных кислот (RFA) в минуту и на грамм ткани. Результаты показаны в таблице 8.

Таблица 8 Активность LPL в седалищном нерве
Экспериментальные группы	LPL (нмоль RFA/мин/г)
Крысы без диабета	6,18±1,05
Контроль с солевым раствором	2,24±0,97**
Группа обработки 1	3,75±2,2*
Группа обработки 3	5,41±1,83

Обнаружили значимые различия между крысами с диабетом после обработки солевым раствором и группой после обработки 3, так же как с группой крыс без диабета (**p<0,01, ANOVA и тест Тьюки). Присутствовали также различия (*p<0,05) между группой обработки 1 и контрольными животными. Не обнаружили статистически значимых различий между животными после обработки 3 и животными без диабета.

Настоящий анализ показал, что обработка содержащей EGF композицией обеспечивает сохранение ферментативной активности LPL, что в свою очередь улучшает способность нерва синтезировать миелин, благодаря релевантному вкладу фосфолипидов в эту функцию.

Пример 2. Эффект фармацевтической композиции на обращение развившейся диабетической невропатии

Целью этого исследования являлась оценка эффекта нейровосстановления фармацевтической композиции. Самцам крыс Wistar между 200-250 граммами массы тела вводили подкожную инъекцию стрептозотоцина при 75 мг/кг в буфере с цитратом натрия и позволяли развиваться до достижения 120 суток после индукции заболевания. Все крысы, используемые в этом эксперименте, обладали постоянными уровнями глюкозы выше 15 ммоль/л. Животных содержали и кормили, как описано ранее. Организовали параллельную контрольную группу, где животным вводили солевой раствор вместо стрептозотоцина. Животных обследовали в течение трех месяцев после введения стрептозотоцина. После этого периода выполняли электрофизиологическую оценку всех крыс и животных разделяли на две случайные группы обработки:

Группа I. Животные с введением солевого раствора (1 мл), 3 суток в неделю, внутрибрюшинным способом.

Группа II. Животные с введением фармацевтической композиции с 100 мкг EGF в 1 мл, 3 суток в неделю, внутрибрюшинным способом.

Группу из по меньшей мере 10 здоровых крыс без диабета из того же самого помета включали в качестве контроля для физиологических значений у животных без диабета. Результаты нейрофизиологической оценки животных перед началом обработки показаны в таблице 9. Способы, применяемые в этих исследованиях, описаны ранее.

Таблица 9 Нейрофизиологическая оценка животных перед началом обработки
Исследуемый параметр	С диабетом	Без диабета
Порог ноцицептивных реакций	55±5 граммов	115±15 граммов
Скорость моторной проводимости	20,53±8,44 м/с	66,18±4,32 м/с
Скорость чувствительной проводимости	26,88±13,27 м/с	69,94±11,8 м/с
Орошение нерва кровью	480,61±65,92 LDPI	1413,8±73,41 LDPI

(1) Определение ноцицептивного порога ноцицептивных реакций (NCT). Болевой тест.

Болевой тест, состоящий из воздействия постепенно увеличивающимся давлением на хвост и остальные исследования, описанные следующими, проводили на 120 сутки после индукции диабета и после месяца обработки. Использовали по меньшей мере по 10 животных на каждую из экспериментальных групп. Определение NCT проводили, как описано ранее, и результаты представлены в таблице 10.

Таблица 10 Результаты теста NCT
Экспериментальная группа	UNC (граммы)
С диабетом + солевой раствор	55±10**
С диабетом + обработка	80±5*
Крысы без диабета	115±10

Наблюдали значимые различия между группой крыс с диабетом после обработки солевым раствором и группой крыс после обработки, так же как с группой крыс без диабета (**p<0,01 ANOVA и коррекция по Бонферрони). Присутствовали также различия между группой обработки и интактными животными (*p<0,05).

Результаты показывают, что через три месяца после индукции диабета присутствует увеличение прогрессирования периферической невропатии, снижение порога болевой чувствительности более чем на 50% по сравнению со здоровыми животными. Присутствовала также заслуживающая внимания разница между группой крыс с диабетом и группой после обработки с помощью фармацевтической композиции три раза в неделю в течение одного месяца.

Для животных после обработки, как правило, показывали более высокую устойчивость к боли, это обнаружение позволяет предполагать, что обработка фармацевтической композицией корректирует или восстанавливает некоторым образом чувствительные волокна.

(2) Определение скорости проводимости импульса по моторным волокнам.

Для проверки эффекта фармацевтической композиции на восстановление чувствительных и моторных волокон скорость проводимости электрического импульса измеряли на 120 сутки после индукции диабета, после обработки животных фармацевтической композицией или солевым раствором. Пятнадцать животных использовали в каждой экспериментальной группе. Способ, которому следовали, уже описан для предыдущих исследований, и результаты показаны в таблице 11.

Таблица 11 Исследование скорости проводимости моторных волокон
Экспериментальная группа	Скорость, м/с
С диабетом + солевой раствор	23,62±18,7**
С диабетом + обработка	54,8±1,66*
Крысы без диабета	64,72±10,55

Обнаружили значимые различия между группой крыс с диабетом после обработки солевым раствором и группой крыс после введения композиции по изобретению, так же как с группой крыс без диабета (**p<0,01, ANOVA и коррекция по Бонферрони). Присутствовали также различия между группой после обработки содержащей EGF композицией и интактными животными без диабета (*p<0,05).

Результаты показывают, что через три месяца после индукции диабета присутствует увеличение прогрессирования периферической невропатии и снижение скорости проводимости стимула моторными волокнами, в частности, при сравнении со здоровыми животными. Однако важно признать, что обработка фармацевтической композицией приводит к большой разнице по сравнению с группой крыс с диабетом после введения солевого раствора три раза в неделю в течение одного месяца. Как правило, обработка фармацевтической композицией восстанавливает моторные нервные волокна, улучшая их способность к проводимости.

Другим исследуемым аспектом является скорость чувствительной проводимости (SCV), как отражено в таблице 12.

Таблица 12 Исследование скорости чувствительной проводимости (SCV)
Экспериментальная группа	Скорость, м/с
С диабетом + солевой раствор	31,27±10,6**
С диабетом + обработка	59,42±3,35*
Крысы без диабета	68,9±11,27

Обнаружили значимые различия между группой крыс с диабетом после обработки солевым раствором и группой крыс после введения содержащей EGF композиции, так же как с группой крыс без диабета (**p<0,01, ANOVA и коррекция по Бонферрони). Присутствовали также различия между группой после обработки композицией по изобретению и интактными животными без диабета (*p<0,05).

Результаты показывают, что через три месяца после индукции диабета присутствует увеличение прогрессирования периферической невропатии и снижение скорости проводимости стимула чувствительными волокнами, в частности, при сравнении со здоровыми животными. Ухудшение параметров составляет более 50%. Однако важно признать, что обработка фармацевтической композицией приводит к большой разнице по сравнению с группой крыс с диабетом после введения солевого раствора три раза в неделю в течение одного месяца. Как правило, обработка фармацевтической композицией восстанавливает чувствительные нервные волокна, что согласуется с тестированием порога ноцицептивных реакций.

(3) Влияние фармацевтической композиции на сохранность перфузии кровью периферического нерва.

Правый седалищный нерв крыс снова использовали в качестве модели. Использовали по десять животных на каждую из экспериментальных групп. Значения для крыс без диабета включали в качестве контроля. Эксперимент проводили, как описано ранее, хотя в этом контексте животные уже страдали диабетом в течение трех месяцев, и им проводили пролонгированную обработку в течение одного месяца содержащей EGF композицией или солевым раствором, в соответствии с экспериментальной группой. Результаты показаны в таблице 13.

Таблица 13 Результаты исследования, проведенного с помощью системы лазерной визуализации перфузии по Доплеру
Экспериментальная группа	Единицы LDPI
Контроль с солевым раствором	418,5±66,9**
Группа обработки	934±60,18*
Крысы без диабета	1397,3±101,55

Наблюдали значимые различия между группой с диабетом после обработки солевым раствором и группой после введения содержащей EGF композиции, так же как с контрольной группой из здоровых крыс (**p<0,01, ANOVA с коррекцией по Бонферрони). Обнаружили также значимые различия (*p<0,05) между группой после обработки композицией по изобретению и интактными животными без диабета.

Обработка композицией по изобретению явно улучшала уровень перфузии крови к нерву. Хотя значения еще не являлись сравнимыми со значениями для здоровых животных, они были намного выше по сравнению с крысами с диабетом после введения солевого раствора. Молекулярный механизм, лежащий в основе этого эффекта, еще не ясен.

(4) Посмертные определения и оценки.

Гистоморфометрическое исследование

Через месяц после завершения обработки либо содержащей EGF композицией, либо солевым раствором и через 120 суток после индукции заболевания животных умерщвляли посредством передозировки анестезии и проводили перфузию солевым буфером при pH 7,4. Всего по десять животных на экспериментальную группу включали для гистоморфометрических исследований и эквивалентное число крыс использовали для биохимических определений. В обеих системах вырезали седалищные нервы из обеих конечностей. Способы являлись сходными со способами, описанными для анализа предотвращения невропатического повреждения. Образцы, взятые для гистологических и/или гистоморфометрических исследований, окрашивали гематоксилином/эозином и толуидиновым синим. По меньшей мере пять фрагментов одного и того же нерва исследовали количественно с использованием программы MADIP. Фрагменты заключали в блоки OCT, затем фиксировали глутаральдегидом и нарезали горизонтально и в поперечном направлении. Оцениваемые гистологические показатели описаны выше, так же как способы, используемые для обработки и оценки:

общего числа кровеносных сосудов (эпиневральных/периневральных) в 10 микроскопических полях с использованием 10X в качестве постоянного увеличения на продольных срезах нерва;

процента демиелинизированных волокон; оценен по нахождению среднего по значениям для микроскопического поля (x20, по меньшей мере для пяти полей);

процента миелинизированных или немиелинизированных волокон с повреждениями (расширенных или деформированных) на микроскопическое поле (x20, по меньшей мере для пяти полей);

процента эндоневральной коллагенизации (умеренная: 25-50%; тяжелая: более 50% эндоневральной площади на поперечных срезах и по меньшей мере на трех различных срезах).

Результаты показаны в таблице 14. Документировали статистически значимые различия в числе кровеносных сосудов между обеими группами крыс с диабетом и интактными крысами (р<0,001). Обнаружили также статистические различия между крысами после обработки содержащей EGF композицией и животными после введения солевого раствора (p<0,05, ANOVA с коррекцией по Бонферрони).

Таблица 14 Морфометрическое исследование, проведенное для фрагментов седалищного нерва. Оценка через 30 суток
Экспериментальная группа	Число кровеносных сосудов	% демиелинизированных волокон	% волокон с повреждениями	% коллагенизи-рованной площади
Контроль с солевым раствором	43,2±9,8	71,5±22,7	83±7,5	64,1±16,4
Группа обработки	86,5±14,6	50,6±12,3	52,6±8,3	46,3±9,5
Крысы без диабета	178,1±44,2	0	0	0

Проценты демиелинизированных волокон, волокон с повреждениями и коллагенизированной эндоневральной площади у животных с диабетом значимо отличались (p<0,001) от значений, наблюдаемых у животных без диабета. Даже несмотря на то что обнаружили значимые различия (p<0,05) между здоровыми животными и животными после обработки содержащей EGF композицией, эффект ослабления повреждения является очевидным. Проценты сравнивали с использованием точного теста Фишера.

Частичные заключения. Обработка композицией по изобретению три раза в неделю в течение одного месяца и после развития диабетической невропатии значительно уменьшала морфологическое изнашивание волокон седалищного нерва. Обработка композицией также являлась способной уменьшать атрофию и дегенерацию кровеносных сосудов. И снова, все эти обнаружения согласуются с проводимыми функциональными тестами.

(5) Биохимическая оценка фрагментов нерва.

По десять животных из каждой группы использовали для биохимических определений в собранных фрагментах седалищного нерва. Исследовали следующие биохимические параметры:

Профиль окисления-восстановления:

Ферментативная активность каталазы.

Внутриаксональное накопление общих гидропероксидов (THP).

Результаты этого исследования показаны в таблице 15.

Таблица 15 Оценка окислительно-восстановительного состояния фрагментов седалищного нерва
Экспериментальная группа	tSOD ^a,b	Каталаза	THP ^c	MDA
Крысы без диабета	2108,3±109,7	31,8±3,22	21,1±1,11	0,08±0,005
С диабетом + солевой раствор	375,8±88,2	603,6±99,4	317,5±12,2	0,87±0,1
С диабетом + обработка	1988,4±101,6	86,1±6,5	55,8±12,7	0,1±0,03
Значения выражены как среднее^а и стандартное отклонение^b. Ферменты выражены как единицы на миллиграмм белка в минуту. ^c THP и MDA в нмоль/мг белка.

Обнаружили статистически значимые различия между животными с диабетом после обработки плацебо и группой крыс после обработки содержащей EGF композицией (p<0,01, двухсторонний T-тест Стьюдента). Как показано в таблице 15, обработка фармацевтической композицией значительно уменьшает присутствие метаболитов, показательных для процессов перекисного окисления в исследуемой нервной ткани. Помимо этого, показали, что эта обработка ослабляет дисфункцию фермента супероксиддисмутазы.

Целью этого исследования являлось сравнение ферментативной активности LPL после одного месяца обработки содержащей EGF композицией, по сравнению с животными с диабетом после обработки солевым раствором. Результаты показаны в таблице 16. Наблюдали значимые различия между группой с диабетом после обработки солевым раствором и группой с диабетом после обработки композицией по изобретению (**p<0,01, ANOVA и тесты Тьюки).

Таблица 16 Активность LPL в седалищном нерве
Экспериментальная группа	LPL (нмоль AGL/мин/г)
Крысы без диабета	7,02±1,24
С диабетом + солевой раствор	2,18±0,73**
С диабетом + обработка	6,29±1,67

Этот анализ показал, что обработка содержащей EGF фармацевтической композицией сохраняет ферментативную активность LPL, которая в результате улучшает способность нерва синтезировать миелин.

Пример 3. Демонстрация терапевтического эффекта содержащей EGF композиции при лечении пациентов с диабетической невропатией

Всего пять пациентов лечили содержащей EGF композицией. Эти пациенты обладали проявлениями сенсомоторной и болезненной невропатии, без ответа на предшествующее лечение. Доза вводимого EGF лежала в диапазоне между 20 и 25 мкг. Введение композиции, содержащей этот активный фармацевтический ингредиент, осуществляли посредством инфильтрации. Подвергаемые лечению случаи являлись следующими:

Пациент PCM . Пациент - женщина в возрасте пятидесяти лет, с диагнозом диабет I типа более 20 лет, проявлениями ишемической кардиопатии, гипертензии и нефропатии. Сенсомоторная невропатия и проявления болезненной невропатии с более чем 10 годами развития и без клинического ответа на предшествующее лечение в анамнезе. Проводили инфильтрацию в главный седалищный нерв композиции, содержащей 25 мкг EGF и 100 мг лидокаина на дозу. Эту процедуру повторяли еще 5 раз, всего до шести введений, всегда в седалищный нерв, два раза в неделю. После третьей инфильтрации боль исчезла. Через восемь недель после начала лечения сенсомоторные проявления прекратились и оставались такими же в течение периода последующих трех месяцев.

Пациент OZD. Пациент - женщина в возрасте семидесяти двух лет, страдающая от диабета, с тяжелыми артериальными окклюзиями и болью в покое. Она не могла ходить и обладала полным онемением ноги. Осуществляли три введения той же самой композиции, в той же самой анатомической локализации (главный седалищный нерв). Пациент сообщил, что онемение ноги не прекратилось после введения содержащей EGF композиции, однако боль в покое исчезла после трех введений этой композиции, и пациент мог ходить быстрее.

Пациент BCB. Пациент - женщина в возрасте шестидесяти лет, с диагнозом диабет I типа более 10 лет, болью в покое и онемением конечностей. Ей проводили шесть введений той же самой композиции посредством инфильтрации в главный седалищный нерв. После третьего введения боль исчезла и парестезии уменьшились. Через три недели после введения последней дозы боль появилась снова, таким образом, проводили новый цикл лечения.

Пациент GTC. Пациент - мужчина в возрасте пятидесяти семи лет, страдающий диабетом, с онемением конечностей. Проводили шесть введений той же самой композиции в той же самой анатомической локализации, с интервалами в 4 суток. По окончании упомянутого лечения симптомы онемения ноги исчезли, оставаясь такими же в течение периода последующих трех месяцев.

Пациент STL. Пациент - мужчина в возрасте шестидесяти восьми лет, страдающий диабетом I типа более 10 лет. Он обладал проявлениями онемения в нижних конечностях. Проводили шесть введений той же самой композиции в той же самой анатомической локализации, с частотой 2 введения в неделю. После первого цикла лечения (6 доз) онемение нижних конечностей исчезло, чтобы вернуться спустя 6 месяцев. Таким образом, проводили новый цикл лечения, следуя таким же процедурам, и проявления онемения уменьшились после третьей инфильтрации.

Как правило, наблюдали значительное улучшение неврологических функций пациентов, с прекращением спонтанной боли в покое и парестезических ощущений.

Пример 4. Получение фармацевтической композиции, содержащей микросферы PLGA с EGF

Получение и оценка нагруженных EGF микросфер.

Раствор полимолочной кислоты 5% (мас./об.) (Sigma, St. Louis, Missouri, США) получали растворением 1 г полимера в дихлорметане (DCM).

Три миллилитра раствора PLGA помещали в стеклянный контейнер и добавляли 100 мкл водного раствора EGF при 30 мг/мл.

Эту смесь перемешивали в течение 2 мин при 14000 об/мин посредством гомогенизатора Ultraturrax T8 (IKA Labortechnik, Германия). Полученную эмульсию выливали в 30 мл 1% поливинилового спирта и получали вторую эмульсию (вода/масло/вода) посредством энергичного перемешивания двух фаз при 14000 об/мин с использованием гомогенизатора T8 Ultraturrax (IKA Labortechnik, Германия). Двойную эмульсию выливали в 270 мл 1% поливинилового спирта 30000-70000 (Sigma, St. Louis, Missouri, США) и перемешивали в гомогенизаторе (IKA Labortechnik, Германия) при 300 об/мин в течение 1 ч для выпаривания дихлорметана. Наконец, микросферы собирали фильтрованием, промывали 5 раз с помощью 50 мл дистиллированной воды и лиофилизировали в лиофилизаторе (Edwards, Великобритания). Высушенные микросферы хранили при 4°C до их использования.

Полученные нагруженные EGF микрочастицы являлись сферическими и обладали равномерной пористой поверхностью (фиг.1). Выход процесса составлял 85%, с эффективностью инкапсуляции в диапазоне между 68 и 71%. Нагрузка микросфер лежала в диапазоне между 0,82 и 0,85%. Частицы были менее 30 мкм.

Высвобождение инкапсулированного EGF in vitro.

Пятьдесят мг нагруженных EGF микросфер суспендировали в 1 мл рецепторной жидкости (0,001% Tween 80 и 0,1% азид натрия в PBS, pH 7,2). Суспензию инкубировали при 37°C при осторожном перемешивании. Образцы центрифугировали в течение 5 мин при 5000 об/мин в микроцентрифуге Hettich (Tuttlingen, Германия) на 1, 3, 7 и 14 сутки. Супернатант собирали и добавляли такой же объем рецепторной жидкости. Концентрацию EGF в каждом образце оценивали способом с использованием бицинхониновой кислоты в формате микроанализа (анализ микроВСА).

Наблюдали профиль высвобождения EGF из микросфер со стадией всплеска высвобождения в течение первых суток и второй стадией непрерывного и постепенного высвобождения EGF до 14 суток. Приблизительно 30% общего белка высвобождалось в течение первой стадии, в то время как вплоть до 50% от содержащегося в частицах EGF высвобождалось в течение остального периода оценки при приблизительной скорости 7 мкг в сутки (фиг.2).

Пример 5. Демонстрация терапевтического эффекта содержащей EGF композиции, инкапсулированной в микросферы, для пациентов с диабетической невропатией

Далее авторы настоящего изобретения обобщили некоторые характеристики трех пациентов после лечения содержащей EGF композицией, инкапсулированной в микросферы, и информацию относительно применяемого для них лечения:

Пациент LNP. Пациент - женщина в возрасте сорока семи лет, с диагнозом диабет I типа более 10 лет, с проявлениями сенсомоторной и болезненной невропатии. Проводили инфильтрацию в главный седалищный нерв композиции, содержащей 20 мкг EGF на дозу. Эту процедуру повторяли три раза всего в течение четырех введений с частотой две дозы в неделю. Боль уменьшилась после третьей инфильтрации и исчезла после четвертого введения. Сенсомоторные проявления исчезли две недели спустя и оставались такими же в течение периода последующих трех месяцев.

Пациент JVR. Пациент - женщина в возрасте шестидесяти трех лет с диабетом типа I. Страдала болью в покое и онемением конечностей. Ей проводили шесть введений композиции, содержащей 25 мкг EGF на дозу, каждые 12 суток. Введение композиции осуществляли посредством инфильтрации в главный седалищный нерв. Боль исчезла, и парестезии уменьшились после третьего введения. Через шесть недель после последнего введения композиции боль появилась снова, и, таким образом, начали новый цикл лечения.

Пациент DGR. Пациент - мужчина в возрасте пятидесяти двух лет, с диабетом типа I, страдающий онемением конечностей. Ему вводили пять доз описанной выше содержащей EGF композиции, инкапсулированной в микросферы для замедленного высвобождения, в том же самом анатомическом участке и с интервалами в 14 суток. По окончании лечения EGF онемение ног уже исчезло, оставаясь таким же в течение периода последующих четырех месяцев.

Claims

1. Применение эпидермального фактора роста (EGF) для получения инъецируемой фармацевтической композиции, вводимой посредством инфильтрации на периферии нервных стволов и/или ганглиев, для морфофункционального восстановления периферических нервов, пораженных диабетической невропатией.

2. Применение эпидермального фактора роста (EGF) по п.1, где диабетическая невропатия относится к сенсомоторной болезненной невропатии или ишемическому невриту.

3. Применение EGF по п.2, где сенсомоторная болезненная невропатия или ишемический неврит поражают нижние конечности.

4. Применение EGF по п.1, где указанный фактор роста представляет собой рекомбинантный EGF человека.

5. Применение EGF по п.1, где указанный EGF инкапсулирован в микросферы.

6. Применение EGF по п.1, где указанная содержащая EGF фармацевтическая композиция является жидкой или лиофилизированной, предназначенной для разведения перед ее использованием.

7. Применение EGF по п.6, где указанная содержащая EGF фармацевтическая композиция представляет собой водную композицию, необязательно, забуференную, или лиофилизированную композицию, предназначенную для разведения водой или водным буферным раствором.

8. Применение EGF по п.1, где указанная фармацевтическая композиция содержит от 10 до 1000 микрограммов EGF/миллилитр.

9. Применение EGF по п.1, где указанная содержащая EGF фармацевтическая композиция дополнительно содержит от 10 микрограммов до 500 миллиграммов по меньшей мере одного местного анестетика или анальгетика, выбранного из группы, состоящей из лидокаина, бупивакаина и новокаина.

10. Применение EGF по п.9, где местный анестетик представляет собой 2% лидокаин.

11. Фармацевтическая композиция для лечения сенсомоторной болезненной диабетической невропатии или ишемического неврита, вводимая посредством инфильтрации на периферии нервных стволов и/или ганглиев для морфофункционального восстановления периферических нервов, содержащая EGF в сочетании с местным анестетиком или анальгетиком.

12. Фармацевтическая композиция по п.11, где EGF инкапсулирован в микросферы.

13. Фармацевтическая композиция по п.11, где анестетик представляет собой местный анестетик, выбранный из группы, состоящей из лидокаина, бупивакаина и новокаина.

14. Фармацевтическая композиция по п.11, где EGF лежит в диапазоне от 10 до 1000 микрограммов/миллилитр.

15. Применение фармацевтической композиции по пп.11-14 для морфофункционального восстановления периферических нервов при сенсомоторной болезненной диабетической невропатии или ишемическом неврите.

16. Применение фармацевтической композиции по п.15 для лечения любого вида повреждения моторного волокна, связанного с диабетической невропатией.

17. Применение фармацевтической композиции по п.15, где лечение проводят посредством инфильтрации на периферии нервных стволов и/или ганглиев.

18. Применение фармацевтической композиции по п.17, где проводят инфильтрацию в седалищный нерв.

19. Применение фармацевтической композиции по п.17, где инфильтрацию проводят от одного до трех раз в неделю и в течение 3-8 недель.

20. Применение фармацевтической композиции по п.15, где лечение проводят посредством местной инфильтрации в пораженные или нет зоны, связанные с интенсивной невропатической болью, связанные или нет с ишемией одной или обеих нижних конечностей, где указанное лечение проводят посредством местной инфильтрации композиции от одного до пяти раз в неделю и в течение 2-6 недель.