ES2240745T3 - Composicion farmaceutica que contiene un arnm estabilizado y optimizado para la traduccion, adecuada como vacuna y como regenerante de tejidos. - Google Patents

Composicion farmaceutica que contiene un arnm estabilizado y optimizado para la traduccion, adecuada como vacuna y como regenerante de tejidos.

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ES2240745T3
ES2240745T3 ES02732752T ES02732752T ES2240745T3 ES 2240745 T3 ES2240745 T3 ES 2240745T3 ES 02732752 T ES02732752 T ES 02732752T ES 02732752 T ES02732752 T ES 02732752T ES 2240745 T3 ES2240745 T3 ES 2240745T3
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Florian Von Der Mulbe
Ingmar Hoerr
Steve Pascolo
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Curevac AG
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Abstract

ARNm modificado que codifica, como mínimo, un péptido o polipéptido biológicamente efectivo o antígeno, caracterizado porque el contenido de G/C de la zona del ARNm que codifica el péptido o polipéptido está modificado de tal manera que resulta un contenido máximo de G/C en conexión con los codones que codifican ARNt''s relativamente frecuentes y porque la secuencia codificada de aminoácidos permanece sin modificar frente al tipo salvaje.

Description

Composición farmacéutica que contiene un ARNm estabilizado y optimizado para la traducción, adecuada como vacuna y como regenerante de tejidos.
La presente invención se refiere a una composición farmacéutica que contiene un ARNm estabilizado por modificaciones de secuencia en el campo traducido y optimizado para la traducción. La composición farmacéutica según invención es especialmente adecuada como vacuna y como sustancia terapéutica para la regeneración de tejidos. Además, se revela un procedimiento para la determinación de modificaciones de secuencias que sirven para la estabilización y la optimización de la traducción de ARNm.
La terapia genética y la vacunación genética son procedimientos médicos moleculares cuya aplicación en la terapia y la prevención de enfermedades tendrán considerables efectos sobre la práctica medica. Ambos procedimientos se basan en la introducción de ácidos nucleicos en células o bien tejidos del paciente así como en el siguiente procesamiento de la información codificada por los ácidos nucleicos introducidos, es decir la expresión de los polipéptidos deseados.
El método normal de procedimientos existentes hasta la fecha en la terapia genética y la vacunación genética es la utilización de ADN para introducir la información genética requerida en la célula. En este contexto se han desarrollado diferentes procedimientos para la introducción de ADN en células como por ejemplo la transfección de fosfato cálcico, la transfección de polipreno, la fusión de protoplastos, electroporación, microinyección y lipofección, donde especialmente la lipofección resultó ser un procedimiento adecuado.
Otro procedimiento que se ha propuesto especialmente en procedimientos de vacunación genética, es la utilización de virus de ADN como vehículo de ADN. Tales virus tienen la ventaja de que debido a sus características infecciosas se puede conseguir un coeficiente de transfección muy alto. Los virus utilizados se modifican genéticamente de manera que en la célula transfectada no se forman partículas infecciosas activas. A pesar de esta medida de precaución, sin embargo, no se puede excluir un cierto riesgo de la propagación incontrolada de los genes de efecto terapéutico genético así como virales debido a posibles incidencias de recombinación.
Normalmente, el ADN introducido en la célula se integra en cierta medida en el genoma de la célula transfectada. Por un lado, este fenómeno puede tener un efecto deseado debido a que se puede conseguir así una actividad de larga duración del ADN introducido. Por el otro lado, la integración en el genoma trae consigo un considerable riesgo de la terapia genética. Así, por ejemplo, se puede producir una inserción del ADN incorporado en un gen intacto, lo que representa una mutación que obstaculiza la función del gen endógeno o, incluso, la anula por completo. Debido a tales incidencias de integración se pueden anular, por un lado, sistemas de enzimas vitales para la célula y, por el otro lado, también existe el peligro de una transformación de la célula así modificada en un estado de degeneración si por la integración del ADN extraño se modifica un gen decisivo para la regulación del crecimiento de la célula. Por esta razón, al utilizar virus de ADN como agente terapéutico genético y vacuna no se puede excluir un riesgo de la formación de cáncer. En este contexto también se ha de tener en cuenta que para la expresión efectiva de los genes introducidos en la célula, los vehículos de ADN correspondientes también contienen un fuerte promotor o bien el promotor de CMV viral. La integración de tales promotores en el genoma de la célula tratada puede conducir a modificaciones no deseadas de la regulación de la expresión genética en la célula.
Otra desventaja de la utilización del ADN como agente terapéutico genético y vacuna es la inducción de anticuerpos anti ADN patógenos en el paciente provocando una reacción inmunológica posiblemente letal.
En contra del ADN, la utilización de ARN como agente terapéutico genético o vacuna se puede considerar considerablemente más segura. Especialmente, el ARN no presenta el peligro de integrarse de forma estable en el genoma de la célula transfectada. Además, no son necesarias secuencias virales como promotores para una traducción efectiva. Adicionalmente, el ARN se desintegra in vivo de forma considerablemente más sencilla. Quizás debido al período de semidesintegración relativamente corto del ARN frente al ADN en el sistema sanguíneo no se han detectado hasta la fecha anticuerpos de anti ARN. Por esta razón, el ARN puede considerarse la molécula de opción para procedimientos de terapia médica molecular.
No obstante, los procedimientos médicos que se basan en sistemas de expresión de ARN todavía requieren, antes de una aplicación más amplia, la solución de algunos problemas básicos. Uno de los problemas al utilizar el ARN es la transferencia segura, eficiente específicamente en cuanto a la célula o bien el tejido del ácido nucleico. Debido a que el ARN resulta, normalmente, muy inestable en forma de solución, por los procedimientos tradicionales que se utilizan para el ADN, hasta la fecha el ARN no ha podido utilizarse o se ha utilizado con una gran ineficacia como agente terapéutico o bien vacuna.
En cuanto a la inestabilidad son responsables enzimas de desintegración de ARN, las así llamadas RNasas (ribonuleasas). Incluso las impurezas más pequeñas de ribonucleasas bastan para desintegrar por completo el ARN en solución. La desintegración natural de ARNm en el citoplasma de células está sujeto a una regulación muy fina. En cuanto a esto se conocen varios mecanismos. Así para un ARNm funcional tiene una importancia decisiva la estructura terminal. En el extremo 5' se encuentra la así llamada estructura "cap" (caperuza) (un nucleótido de guanosina modificado) y en el extremo 3' una secuencia de hasta 100 nucleótidos de adenosina (la así llamada cola poli A). A través de estas estructuras se reconoce el ARN como ARNm y se regula la desintegración. Además, existen otros procesos que estabilizan o bien desestabilizan el ARN. Muchos de estos procesos todavía no son conocidos, sin embargo, con frecuencia parece decisivo para ello una interacción entre el ARN y las proteínas. Por ejemplo, se describió hace poco un "mRNA-Surveillance-System" (sistema de control del ARNm) (Hellerin und Parker, Amun.Rev.Genet 1999, 33: 229 a 260) en el que se conocen, debido a determinadas interacciones de proteínas de "feedback" (retroalimentación) en el citosol, ARNm incompletos o "nonsense" (sin sentido) a los que se proporciona acceso para la desintegración donde una parte principal de este proceso se realiza por exonucleasas.
Según la técnica actual se han propuesto algunas medidas para aumentar la estabilidad del ARN y por lo tanto hacer posible su utilización como sustancia terapéutica genética o bien vacuna de ARN.
La WO 97/48370 revela vacunas de ADN y ARN contra HIV (gen env) , en las que el uso de codón se optimizó con vistas a los receptores de la vacuna (hombre), es decir con vistas a la frecuencia de RNAts en la célula humana.
La observación de las instrucciones del protocolo de la página 51 conduce a un gen sintético en el que se aumenta el contenido de G/C. Se eliminan secuencias inestables no deseadas como ATTTA. Al mismo tiempo que el principio activo se puede administrar proteína de GM-CSF o IL-12. La WO 97/48370 no revela la posibilidad de maximizar el contenido de G/C debido a que el objetivo es la optimización del uso de codón.
En la EP-A-1083232 se propone para solución del problema arriba enunciado de la inestabilidad del ARN ex vivo un procedimiento para la introducción de ARN, especialmente ARNm, en células y organismos en los que el ARN existe en forma de un complejo con una proteína o un péptido catiónico.
La WO 99/14346 describe otros procedimientos para la estabilización del ARNm. Especialmente se proponen modificaciones del ARNm que estabilizan las especies de ARNm frente a la desintegración de RNasas. Tales modificaciones afectan, por un lado, la estabilización por modificaciones de secuencia, especialmente reducción del contenido de C y/o U mediante la eliminación o sustitución de bases. Por otro lado, se proponen modificaciones químicas, especialmente la utilización de análogos de nucleótidos, así como grupos de bloqueo de 5' y 3', una mayor longitud de la cola de poli-A así como la formación de complejos del ARNm con medios de estabilización y combinaciones de las medidas indicadas.
En las patentes de EE.UU US 5.580.859 y US 6.214.804 se revelan entre otros dentro del marco de la "terapia genética de transientes" (TGT) vacunas y sustancias terapéuticas de ARNm. Se describen diferentes medidas para aumentar la eficacia de la traducción y la estabilidad del ARNm, medidas que se refieren, sobre todo, a regiones de secuencias no traducidas.
Bieler y Wagner (en: Schleef (Hrsg.), Plasmids for Therapy and Vaccination [plásmidos para la terapia y la vacunación] capítulo 9, páginas 147 a 168, Wiley-VCH, Weinheim, 2001) informan sobre la utilización de genes sintéticos en conexión con métodos terapéuticos genéticos utilizando vacunas de ADN y vectores lentiverales. Se describe la construcción de un gen gag sintético derivado de HIV-1 en el que los codones se modificaron frente a la secuencia del tipo salvaje (utilización alternativa de codones, ingl. "codon usage") de manera que correspondía a la utilización de codones que se puede encontrar en genes altamente exprimidos de mamíferos. Así se reduce, especialmente, el contenido de A/T frente a la secuencia del tipo salvaje. Los autores observaron, especialmente, un mayor coeficiente de expresión del gen gag sintético en células transfectadas. Además, se observó en ratones una mayor formación de anticuerpos contra la proteína gag en el caso de ratones inmunizados con el constructo de ADN sintético y también una mayor liberación de citoquinas in vitro con células transfectadas del bazo de ratones. Finalmente, pudo observarse una inducción de una reacción inmunológica citotóxica en ratones inmunizados con el plásmido de expresión gag. Los autores de este artículo atribuyen las mejores características de esta vacuna de ADN esencialmente a una modificación del transporte núcleo-citoplasmático del ARNm exprimido de la vacuna de ADN, modificación provocada por la utilización optimizada de codones. Por el contrario, los autores consideran que el efecto de la utilización modificada de codones sobre la eficacia de traducción es pequeño.
El objetivo de la presente invención consiste, por lo tanto, en proporcionar un nuevo sistema para la terapia genética y vacunación genética que suprime las desventajas relacionadas con las características de sustancias terapéuticas y vacunas de ADN y aumenta la efectividad de sustancias terapéuticas sobre la base de especies de ARN.
Este objetivo se alcanza por los tipos de ejecución caracterizados en las reivindicaciones de la presente invención.
Especialmente, se propone un ARNm modificado así como un compuesto farmacéutico que contiene un ARNm modificado de este tipo en unión con un excipiente y/o vehículo farmacéuticamente compatible, donde el ARNm modificado codifica, como mínimo, un péptido o polipéptido biológicamente efectivo o antígeno, donde la secuencia del ARNm, especialmente en el campo que codifica, como mínimo, un péptido o polipéptido, muestra frente al ARNm del tipo salvaje las siguientes modificaciones que pueden existir bien alternativamente o en combinación.
Por un lado, el contenido de G/C del campo que codifica el péptido o polipéptido del ARNm modificado es mayor que el contenido de G/C del campo de codificación del ARNm del tipo salvaje que codifica el péptido o polipéptido, donde la secuencia del aminoácido codificada permanece sin modificar frente al tipo salvaje.
Esta modificación se basa sobre el hecho de que para una traducción eficiente de un ARNm el desarrollo de la secuencia del campo del ARNm a traducir es esencial. Aquí juegan un papel importante la composición y la secuencia de los diferentes nucleótidos. Especialmente, las secuencias con un mayor contenido de G(guanosina)/C(citosina) son más estables que las secuencias con un mayor contenido de A(adenosina)/U(uridina). Por lo tanto se varían los codones frente al ARNm del tipo salvaje según invención manteniendo la secuencia traducida del aminoácido, de forma que contienen una mayor cantidad de nucleótidos de G/C. Debido a que varios codones codifican uno y el mismo aminoácido (degeneración del código genético), es posible determinar los codones más favorables para la estabilidad (utilización alternativa de codones, ingl. "codon usage").
Dependiendo del aminoácido a codificar por el ARNm modificado son factibles diferentes posibilidades para la modificación de la secuencia de ARNm frente a la secuencia del tipo salvaje. En el caso de aminoácidos, codificados por codones, que contienen exclusivamente nucleótidos G ó C, no es necesaria ninguna modificación del codón. Así, los codones para Pro (CCC ó CCG), Arg (CGC ó CGG), Ala (GCC ó GCG) y Gly (GGC ó GGG) no requieren ninguna modificación ya que no existen ni A ni U.
En los siguientes casos se modifican los codones que contienen nucleótidos de A y/o U mediante la sustitución de otros codones que codifican los mismos aminoácidos pero no contienen ningún A y/o U. Ejemplos son:
-
Los codones para Pro pueden modificarse de CCU ó CCA a CCC ó CCG; los codones para Arg pueden modificarse de CGU ó CGA ó AGA ó AGG a CGC ó CGG;
-
los codones para Ala pueden modificarse de GCU ó GCA a GCC ó GCG;
-
los codones para Gly pueden modificarse de GGU ó GGA a GGC ó GGG.
Aunque, en otros casos los nucleótidos de A o bien U no pueden eliminarse de los codones, sin embargo es posible reducir el contenido de A y U mediante la utilización de codones que contienen menos nucleótidos A y/o U. Por ejemplo:
-
Los codones para Phe pueden modificarse de UUU a UUC;
-
los codones para Leu pueden modificarse de UUA, CUU ó CUA a CUC ó CUG;
-
los codones para Ser pueden modificarse de UCU ó UCA ó AGU a UCC, UCG ó AGC;
-
el codón para Tyr puede modificarse de UAU a UAC;
-
El codón de terminación UAA puede modificarse en UAG ó UGA;
-
el codón para Cys puede modificarse de UGU a UGC;
-
el codón His puede modificarse de CAU a CAC;
-
el codón para Gln puede modificarse de CAA a CAG;
-
los codones para Ile pueden modificarse de AUU ó AUA a AUC;
-
los codones para Thr pueden modificarse de ACU ó ACA a ACC ó ACG;
-
el codón para Asn puede modificarse de AAU a AAC;
-
el codón para Lys puede modificarse de AAA a AAG;
-
los codones para Val pueden modificarse de GUU ó GUA a GUC ó GUG;
-
el codón para Asp puede modificarse de GAU a GAC;
-
el codón para Glu puede modificarse de GAA a GAG.
En el caso de los codones para Met (AUG) y Trp (UGG), por el contrario, no existe ninguna posibilidad de modificación de la secuencia.
Las sustituciones arriba indicadas pueden utilizarse, naturalmente, por separado pero también en todas las combinaciones posibles para aumentar el contenido de G/C del ARNm modificado frente a la secuencia original. Así, por ejemplo, se pueden modificar todos los codones para Thr que se presentan en la secuencia (del tipo salvaje) original a ACC (o ACG). De preferencia, sin embargo, se utilizan combinaciones de las posibilidades anteriores de sustitución, como por ejemplo:
Sustitución de todos los codones que codifican el Thr en la secuencia original por ACC (ó ACG) y sustitución de todos los codones que codifican originalmente Ser por UCC (ó UCG ó AGC);
Sustitución de todos los codones que codifican Ile en la secuencia original por AUC y sustitución de todos los codones que codifican originalmente Lys por AAG y sustitución de todos los codones que codifican originalmente Tyr por UAC;
Sustitución de todos los codones que codifican Val en la secuencia original por GUC (ó GUG) y sustitución de todos los codones que codifican originalmente Glu por GAG y sustitución de todos los codones que codifican originalmente Ala por GCC (ó GCG) y sustitución de todos los codones que codifican originalmente Arg por CGC (ó CGG);
Sustitución de todos los codones que codifican Val en la secuencia original por GUC (ó GUG) y sustitución de todos los codones que codifican originalmente Glu por GAG y sustitución de todos los codones que codifican originalmente Ala por GCC (ó GCG) y sustitución de todos los codones que codifican originalmente Gly por GGC (ó GGG) y sustitución de todos los codones que codifican originalmente Asn por AAC;
Sustitución de todos los codones que codifican Val en la secuencia original por GUC (ó GUG) y sustitución de todos los codones que codifican originalmente Phe por UUC y sustitución de todos los codones que codifican originalmente Cys por UCG y sustitución de todos los codones que codifican originalmente Leu por CUG (ó CUC) y sustitución de todos los codones que codifican originalmente Gln por CAG y sustitución de todos los codones que codifican originalmente Pro por CCC (ó CCG); etc.
De preferencia el contenido de G/C del campo del ARNm modificado que codifica el péptido o bien polipéptido se incrementa en, como mínimo, 7%, de mayor preferencia, en como mínimo en un 15%, especialmente preferido en, como mínimo, un 20% al contenido de G/C del campo codificado del ARNm del tipo salvaje que codifica el polipéptido.
Especialmente preferido es, en este contexto, aumentar a un máximo el contenido de G/C del ARNm modificado, especialmente en el campo que codifica, como mínimo, un péptido o bien polipéptido, en comparación con la secuencia del tipo salvaje.
La otra modificación según invención del ARNm contenido en la composición farmacéutica caracterizada en la presente invención se basa sobre el conocimiento que la eficacia de traducción también queda determinada por una frecuencia diferente en la presencia de ARNt's en las células. Si, por lo tanto, en una secuencia de ARN existen en mayor cantidad los así llamados codones "raros" el ARNm correspondiente se traduce claramente peor que en el caso en el que para ARNt's relativamente "frecuente" existen codones de codificación.
Así, según invención en el ARNm modificado (incluido en la composición farmacéutica) el campo que codifica el péptido o bien polipéptido se modifica frente al correspondiente campo del ARNm de tipo salvaje de tal forma que, como mínimo, un codón de la secuencia del tipo salvaje que codifica un ARNt relativamente raro en la célula, se cambia por un codón que codifica un ARNt relativamente frecuente en la célula que lleva el mismo aminoácido que el ARNt relativamente raro.
Debido a esta modificación se modifican las secuencias de ARN de manera que se intercalan codones para los cuales están disponibles ARNt's frecuentes.
Cuáles son los ARNt's que se presentan con relativa frecuencia en la célula y cuáles son los que frente a éstos son relativamente raros es bien sabido por el técnico en la materia; véase por ejemplo Akashi, Curr. Opin. Genet. Dev. 2001, 11(6): 660-666.
Mediante esta modificación se pueden cambiar, según invención, todos los codones de la secuencia del tipo salvaje que codifican un ARNt relativamente raro en la célula, por, en cada caso, un codón que codifica un ARNt relativamente frecuente en la célula que lleva, en cada caso, el mismo aminoácido que el ARNt relativamente raro.
Según invención tiene especial preferencia vincular el contenido de G/C secuencial, especialmente máximo, incrementado según invención en el ARNm modificado con los codones "frecuentes" sin modificar la secuencia del aminoácido del péptido o bien polipéptido (uno o varios) codificado por el campo de codificación del ARNm. Este tipo de ejecución preferido proporciona un ARNm traducido y estabilizado de manera especialmente eficiente para la composición farmacéutica según invención.
En las secuencia de ARNm's eucarióticos existen elementos de secuencia desestabilizadoras (DSE) en los que se enlazan proteínas de señal que regulan la desintegración enzimática del ARNm in vivo: Por esta razón, para una mayor estabilización del ARNm modificado incluido en la composición farmacéutica según invención se realizan, en caso dado, para el campo de codificación de, como mínimo, un péptido o bien polipéptido, una o varias modificaciones frente al correspondiente campo del ARNm del tipo salvaje de manera que no está incluido ningún elemento de secuencia desestabilizadora. Naturalmente, según invención, también se prefiere eliminar del ARNm los DSE eventualmente presentes en los campos no traducidos (UTR de 3' y/ó 5').
Tales secuencias desestabilizadoras son, por ejemplo, secuencias ricas en AU ("AURES") presentes en segmentos de UTR 3' de múltiples ARNm inestables (Caput et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 1986, 83 : 1670 a 1674). Las moléculas de ARN incluidas en la composición farmacéutica según invención, se han modificado, por lo tanto y de preferencia, de tal forma frente al ARNm del tipo salvaje que no contienen ninguna de tales secuencias desestabilizadoras. Esto es aplicable también para tales motivos de secuencia que son reconocidos por posibles endonucleasas, por ejemplo la secuencia GAACAAG incluida en el segmento de 3' UTR del gen que codifica el receptor de transferina (Binder et al., EMBO J. 1994, 13: 1969 a 1980). También estos motivos de secuencia se eliminan, de preferencia, en el ARNm modificado de la composición farmacéutica según invención.
Un técnico en la materia conoce diferentes procedimientos adecuados para la sustitución de codones en el ARNm modificado según invención. En el caso de campos de codificación más cortos (que codifican péptidos de efecto biológico o antigénos) se puede sintetizar, por ejemplo, todo el ARNm de forma química utilizando técnicas
estándar.
De preferencia, sin embargo se introducen sustituciones de bases utilizando una matriz de ADN para la producción del ARNm modificado con ayuda de técnicas de la mutagénesis precisa usual; Maniatis et al., Molecular Cloning: A. Laboratory Manual, Cold spring Harbor Laboratory Press, 3ª edición, Cold Spring Harbor, NY, 2001.
En este procedimiento se transcribe, por lo tanto, in vitro una correspondiente molécula de ADN para la producción del ARNm. Esta matriz de ADN tiene un promotor adecuado, por ejemplo un promotor de T7 ó SP6, para la transcripción in vitro, al que siguen la secuencia de nucleótidos deseadas para el ARNm a producir y una señal de terminación para la transcripción in vitro. Según invención se produce la molécula del ADN que constituye la matriz del constructo del ARN a producir, por un crecimiento fermentativo y el siguiente aislamiento como parte de un plásmido replicable en bacterias. Como plásmidos adecuados para la presente invención se pueden nombrar, por ejemplo, los plásmidos pT7Ts (número de acceso al banco de genes U26404; Lai et al., Development 1995, 121: 2349 a 2360), serie pGEM®, por ejemplo pGEM®-1 (número de acceso al banco de genes X65300; de Promega) y pSP64 (número de acceso al banco de genes X65327); véase también Mezei und Storts, Purification of PCR Products (purificación de productos PCR) en: Griffin und Griffin (Hrsg.), PCR Technology (tecnología de PCR): Current Innovation , CRC Press, Boca Raton, FL, 2001.
Así es posible clonar, bajo utilización de oligonucleótidos de ADN sintéticos cortos, que tienen en las intersecciones que se producen transiciones cortas de un solo ramal, o por genes producidos por síntesis química según un método molecularbiológico, conocido por el técnico en la materia, la secuencia deseada de nucleótidos en un plásmido adecuado (véase Maniatis et al., s.o.).
El ARNm modificado incluido en la composición farmacéutica según invención puede tener, además, una estructura de "Cap" en 5' (un nucleótido modificado de guanosina). Como ejemplo de estructuras de "Cap" pueden nombrarse m7G(5')ppp (5'(A,G(5')A y G(5')ppp(5')G.
Según otro tipo de ejecución preferido de la presente invención, el ARNm modificado contiene una cola de poliA de, como mínimo, 50 nucleótidos, de preferencia, como mínimo 70 nucleótidos, de mayor preferencia, como mínimo, 100 nucleótidos, especialmente preferido, como mínimo, 200 nucleótidos.
Para una traducción eficiente del ARNm es necesaria, además, un enlace efectivo de los ribosomas en la posición de enlace de ribosomas (secuencia Kozak: GCCGCCACCAUGG, EL AUG es formado por el codón de inicio). En este sentido se ha detectado que un mayor contenido de A/U alrededor de esta posición hace posible un enlace más eficiente de los ribosomas con el ARNm.
Además, es posible incluir en el ARNm modificado uno o varios de los así llamados IRES (ingl. "internal ribosomal entry side" - sitio de entrada ribosomal interno). Un IRES puede actuar así como única posición de enlace para ribosomas, sin embargo, también puede servir para proporcionar un ARNm que codifica varios péptidos o bien polipéptidos que se han de traducir, por separado, por los ribosomas ("ARN multicistrónico"). Ejemplos de secuencias de IRES que se pueden utilizar según invención son aquellos de los virus de picorna (por ejemplo FMDV), virus de la peste (CFFV), virus de la poliomelitis (PV), virus de encefalo-miocarditis (ECMV), virus de la fiebre aftosa (FMDV), virus de la hepatitis C (HCV), virus clásicos de la fiebre porcina (CSFV), virus de murines-leucoma (MLV), virus de la inmunodeficiencia de Simean (SIV) o virus de la parálisis de cricket (CrPV).
Según otro tipo de ejecución preferido de la presente invención, el ARNm modificado tiene en las zonas no traducidas de 5' y/o 3' secuencias de estabilización que son capaces de aumentar el período de semidesintegración del ARNm en citosol.
Estas secuencias de estabilización pueden tener una homología de secuencias al 100% con secuencias de procedencia natural que se presentan en virus, bacterias y eucariotas, sin embargo, también pueden ser parcial o completamente de naturaleza sintética. Como ejemplo para secuencias de estabilización que se pueden utilizar en la presente invención, se pueden nombrar las secuencias no traducidas (UTR) del gen de globi \beta, por ejemplo del homo sapiens ó xenopus laevis. Otro ejemplo de una secuencia de estabilización tiene la fórmula general (C/U)CCAN_{X}CCC(U/A)Py_{X}UC(C/U)CC contenida en el UTR 3' del ARNm muy estable que codifica \alpha-globina, \alpha-(1)-colágeno, 15-lipoxigenasa o tirosin-hidroxilasa (véase Holcik et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997, 94: 2410 a 2414). Naturalmente, tales secuencias de estabilización pueden utilizarse por separado o en combinación entre sí o también en combinación con otras secuencias de estabilización conocidas por un técnico en la materia.
Para una mayor estabilización del ARNm modificado se prefiere, además, que éste tenga, como mínimo, un nucleótido análogo de procedencia natural. Esto se basa en el hecho de que las enzimas que desintegran el ARN y existen en las células reconocen como substrato, de preferencia, los nucleótidos de procedencia natural. Mediante la introducción de análogos de nucleótidos, por lo tanto, es posible dificultar la desintegración de ARN, donde la acción sobre la eficacia de traducción al introducir estos análogos, especialmente en la zona de codificación del ARNm, puede tener un efecto positivo o negativo sobre la eficacia de traducción.
En una enumeración, de ningún modo limitativa, se pueden nombrar como ejemplos de análogos de nucleótidos utilizables según invención, fosfo-amidatos, fosfo-tioatos, nucleótidos de péptidos, metil-fosfonatos, 7-deazaguanosina, 5-metil-citosina e inosina. La producción de tales análogos es conocida por el técnico en la materia por ejemplo de las patentes de EE.UU. 4.373.071, EE.UU. 4.401.796, EE.UU. 4.415.732, EE.UU. 4.458.066, EE.UU. 4.500.707, EE.UU. 4.668.777, EE.UU. 4.973.679, EE.UU. 5.047.524, EE.UU.5.132.418, EE.UU. 5.153.319, EE.UU. 5.262.530 y 5.700.642. Según invención tales análogos pueden estar presentes en zonas no traducidas y traducidas del ARNm modificado.
Además, es posible mejorar la transferencia efectiva del ARNm modificado a las células a tratar o bien el organismo a tratar mediante la asociación del ARNm modificado con una proteína o un péptido catiónico o la unión con los mismos. Aquí es especialmente efectiva la utilización de protamina como proteína policatiónica de enlace del ácido nucleico. Además, también es posible la utilización de otros péptidos o proteínas catiónicos, como la poli-L-lisina o las histonas. Este método para la estabilización del ARNm modificado se encuentra descrito en la EP-A-1083232 cuyo contenido de revelación en este sentido queda incluido en su totalidad en la presente invención. En la utilización de terapia genética de la composición farmacéutica según invención (o bien al utilizar el ARNm para la terapia genética o bien al utilizar el ARNm para la producción de una composición farmacéutica para terapia genética) el ARNm modificado codifica, como mínimo, un péptido o polipétido biológicamente activo que en el paciente a tratar, por ejemplo, no se forma o solamente se forma de manera insuficiente o defectuosa. Por esta razón, ejemplos del ARNm según invención son polipéptidos codificados, distrofina, el canal de cloruro que en caso de fibrosis cística está modificado de forma defectuosa, enzimas que están ausentes o defectuosas en caso de enfermedades metabólicas como la fenil-cetonuría, la galactosemia, la homocistinuría, deficiencia de adenosín-deaminasa etc., enzimas que participan en la síntesis de neutransmisores como la dopamina, la norepinefrina y GARA, especialmente la hidroxilasa de tirosina y decarboxilasa de DOPA, \alpha-antiripsina etc. Además, la composición farmacéutica se puede utilizar para proporcionar receptores de superficie de células y moléculas que enlazan con tales receptores, si el ARNm modificado, contenido en la composición farmacéutica codifica una proteína o bien un péptido de este tipo activo biológicamente. Ejemplos de tales proteínas que actúan extracelularmente o enlazan en receptores de superficie de célula son, por ejemplo, el activador plasminógeno del tejido (TPA), hormonas de crecimiento, insulina, interferonas, el factor de estimulación de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CFS), eritropietina (EPO) etc. Mediante la elección de factores adecuados de crecimiento es posible utilizar la composición farmacéutica de la presente invención, por ejemplo para la regeneración de tejidos. Así se pueden tratar enfermedades caracterizadas por una degeneración de los tejidos, como por ejemplo, enfermedades neurodegenerativas, como el Morbus Alzheimer, el Morbus Parkinson etc. y otras enfermedades degenerativas, por ejemplo la artrosis. En estos casos, el ARNm modificado, contenido especialmente en la composición farmacéutica de la presente invención, codifica, de preferencia, factores de crecimiento de la familia de TGF-\beta, donde se han de nombrar especialmente EGF, FGF, PDGF, BMP, GDNF, BDNF, GDF y factores neurotróficos como NGF, neutrofina etc.
Otro campo de aplicación de la presente invención es la vacunación, es decir la utilización del ARNm modificado para la vacunación o bien la utilización de la composición farmacéutica como vacuna o bien la utilización del ARNm modificado para la producción de la composición farmacéutica para la vacunación. La vacunación se base en la introducción en el organismo, especialmente en la célula, de un antígeno, en el presente caso de la información genética para el antígeno en forma del ARNm modificado que codifica el antígeno. El ARNm modificada, incluida en la composición farmacéutica se traduce en el antígeno, es decir se exprime el polipéptido o bien péptido antígeno codificado por el ARNm modificado debido a lo cual se estimula una reacción inmunológica dirigida contra este polipéptido o bien péptido antígeno. Con la vacunación contra un germen patológico, como por ejemplo un virus, una bacteria o un germen protozoológico se utiliza, por lo tanto un antígeno de superficie de un germen de este tipo para la vacunación con ayuda de la composición farmacéutica según invención que contiene el ARNm modificado que codifica el antígeno de superficie. En el caso de la utilización como vacuna genética para el tratamiento del cáncer, la reacción inmunológica se consigue por la introducción de la información genética para antígenos del tumor, especialmente proteínas que se exprimen, exclusivamente, en células cancerosas, administrando una composición farmacéutica según invención que contiene un ARNm de este tipo que codifica el antígeno del cáncer. Debido a ello se exprime el o los antígeno(s) del cáncer en el organismo por lo que se provoca una reacción inmunológica dirigida efectivamente contra las células cancerosas
En su utilización como vacuna, la composición farmacéutica según invención tiene aplicación especialmente para el tratamiento de enfermedades cancerosas (donde el ARNm modificado codifica un antígeno de superficie específico de tumores (TSSA), por ejemplo para el tratamiento de melanomas, carcinomas de colon, linfoma, sarcoma, carcinoma de pulmón de células pequeñas, blastoma etc. Ejemplos específicos de antígenos del tumor son, entre otros 707-AP, AFP, ART-4, BAGE, \beta-catenina/m, Bcr-abl, CAMEL, CAP-1, CASP-8, CDC27/m, CDK4/m, CEA, CT, Cyp-B, DAM, BLF2M, ETV6-AML1, G250, GAGE, GnT-V, Gp100, HAGE, HER-2/neu, HLA-A*0201-R170I, HPV-E7, HSP70-2M, HAST-2, hTERT 8 ó hTRT), iCE, KIAA0205, LAGE, LDLR/FUT, MAGE, MART-1/Melan-A, MC1R, Miosina/m, MUC1, MUM-1, -2, -3, NASE-A, NY-ESA-1, p190 minor bcr-abl, Pml/RAR\alpha, PRAME, PSA, PSM, RAGE, RU1 ó RU2, SAGE, SART-1 ó SART-3, TEL/AML1, TPI/m, TRP-1, TRP-2, TRP-2/INT2 y WT1.
La composición farmacéutica según invención se utiliza, además, contra enfermedades infecciosas (por ejemplo enfermedades infecciosas virales, como el SIDA (HIV), la hepatitis A, B ó C, el herpes, herpes Zoster (varicelas), rubéola (virus de rubéola), fiebre amarilla, dengue etc. (flavi-virus), la gripe (virus de influenza), enfermedades infecciosas hemorrágicas (virus Marburg o Ebola), enfermedades infecciosas bacterianas como la enfermedad del legionario (legionela), úlceras del estómago (helicobacter) el cólera (vibrio), infecciones de E.coli, infecciones por estafilococos, infecciones de salmonela o infecciones de estreptococos (tétano) o enfermedades infecciones protozoológicas (malaria, tripanosomiasis africana, leismaniasis, toxoplasmosa, es decir infecciones por plasmodio, tripanosomas, leismania y toxoplasmos).
De preferencia se codifican por el ARNm modificado también en el caso de enfermedades infecciosas los correspondientes antígenos de superficie con el mayor potencial antígeno. En los genes mencionados de gérmenes o bien organismos patógenos, especialmente en el caso de genes virales, esto es típicamente una forma segregada de un antígeno de superficie. Además, se utilizan según invención de preferencia ARNm's que codifican polipéptidos, donde se trata en los polipéptidos de poliepitopes, por ejemplo de los antígenos arriba mencionados, especialmente antígenos de superficie de gérmenes o bien organismos patógenos o células tumorales, de preferencia formas de proteínas segregadas.
Además, el ARNm modificado según invención puede contener, aparte del péptido o bien polipéptido antígeno o de efecto genético terapéutico, también, como mínimo, otro segmento funcional que codifica, por ejemplo, una citoquina que promociona la reacción inmunológica (monoquina, linfoquina, interleuquina ó chemoquina, como IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, INF-\alpha, INF-\gamma, GM-CFS, LT-\alpha o factores de crecimientos como hGH.
Además, para aumentar la inmunogenicidad, la composición farmacéutica según invención puede contener uno o varios adyuvantes. Bajo "adyuvante" se ha de entender aquí cualquier compuesto químico o biológico que favorece una reacción inmunológica específica. Dependiendo de los diferentes tipos de adyuvantes pueden tenerse en cuenta aquí diferentes mecanismos. Por ejemplo, los compuestos que promocionan una endocitosis por células dendríticas (DC) en el ARNm modificado incluido en la composición farmacéutica, forman una primera clase de adyuvantes utilizables. Otros compuestos que permiten la maduración de las DC, por ejemplo lipopolisacáridos, TNF-\alpha ó CD40-Ligando, son otra clase de adyuvantes adecuados. En general, se puede utilizar como adyuvante cualquier agente que actúa sobre el sistema inmunológico del tipo de una "señal de peligro" (LPS, GP96, oligonucleótidos con el motivo CpG) o citoquinas, como GM-CFS, que permiten reforzar una reacción inmunológica contra un antígeno codificado por el ARNm modificado y/o ejercer una influencia precisa sobre esta reacción. Se prefieren aquí, especialmente, las citoquinas arriba mencionadas. Otros adyuvantes conocidos son el hidróxido de aluminio, el adyuvante de Freud así como los péptidos o bien polipéptidos catiónicos de estabilización arriba mencionados, como la protamina. Además, son especialmente adecuados los lipopéptidos, como Pam3Cys, para ser utilizados como adyuvante en la composición farmacéutica de la presente invención, véase Deres et al, Nature 1989, 342: 561-
564.
La composición farmacéutica según invención contiene, además del ARNm modificado, un excipiente farmacéuticamente compatible y/o un vehículo farmacéuticamente compatibles. Los correspondientes métodos para una formulación adecuada y la producción de la composición farmacéutica según invención se encuentran revelados en "Remington's Pharmaceutical Sciences" (Mack Pub. Co, Easton, PA, 1980) cuyo contenido completo forma parte integrante de la revelación de la presente invención. Para la administración parenteral se pueden utilizar como excipiente, por ejemplo, agua esterilizada, soluciones de sal común esterilizadas, polialquilenglicoles, naftaleno hidrogenado y, especialmente, polímeros de lacturo biocompatibles, copolímeros de lacturo/glicoluro o copolímeros de polioxietileno/polioxipropileno. Las composiciones según invención pueden contener sustancias de carga o sustancias como la lactosa, el manitol, sustancias para una unión covalente de polímeros, como por ejemplo de polietilenglicol en inhibidores según invención, formación de complejo con iones de metal o inclusión de materiales en o sobre preparados especiales de compuestos polímeros, como por ejemplo polilactato, ácido poliglicólico, hidrogel o en liposomas, microemulsión, micelas, vesículos unilaminares o multilaminares, fragmentos de eritrocitos o esferoplastos. Las correspondientes formas de ejecución de las composiciones se seleccionan en función del comportamiento físico, por ejemplo con vistas a la solubilidad, la estabilidad, la biodisponibilidad o la posibilidad de desintegración. Una liberación controlada o constante del componente del principio activo según invención en la composición incluye formulaciones sobre la base de depósitos lipofílicos (por ejemplo ácidos grasos, ceras o aceites). Dentro del marco de la presente invención también se revelan recubrimientos de sustancias o composiciones según invención que contienen tales sustancias, es decir recubrimientos con polímeros (por ejemplo poloxameros o poloxaminas). Además, las sustancias o bien composiciones según invención pueden tener recubrimientos de protección, por ejemplo inhibidores de proteasa o reforzadores de la permeabilidad. Los excipientes preferidos son, de forma típica, sustancias acuosas de excipiente, utilizándose agua para la inyección (WFI) o agua, regulada con fosfato, citrato o acetato etc., y ajustándose el pH de forma típica en 5,0 a 8,0, de preferencia 6,0 z 7,0. El excipiente o bien el vehículo contiene, además y de preferencia, ingredientes de sal, como por ejemplo cloruro sódico, cloruro potásico u otros componentes que convierten la solución, por ejemplo, en isotónica. Además, el excipiente o bien el vehículo puede contener, aparte de los ingredientes arriba indicados, componentes como albúmina de suero humano (HSA), polisorbato 80, azúcar o aminoácidos.
La forma de administración y la dosificación de la composición farmacéutica según invención dependen de la enfermedad a tratar y de su estado de gravedad, como también del peso corporal, de la edad y del sexo del paciente.
La concentración del ARNm modificado en tales formulaciones puede variar, por lo tanto, en un amplio rango de 1 \mug hasta 100 mg/ml. La composición farmacéutica según invención se administra al paciente, de preferencia de forma parenteral, por ejemplo intravenosa, intra-arterial, subcutánea, intramuscular. También es posible administrar la composición farmacéutica de forma tópica u oral.
Así se proporciona según invención también un procedimiento para el tratamiento de las enfermedades arriba indicadas o bien un procedimiento de vacunación para prevenir las enfermedades arriba mencionadas, procedimiento que comprende la administración de la composición farmacéutica según invención a un paciente, especialmente un ser humano. Además, también se proporciona un procedimiento que sirve para averiguar la secuencia modificada del ARNm contenido en la composición farmacéutica según invención. Aquí se realiza, según invención, la adaptación de las secuencias de ARN con dos metas diferentes de optimización. Por un lado, uno con un contenido de G/C lo más alto posible, por el otro lado, teniendo en cuenta lo mejor posible la frecuencia de los ARNt's según Codon Usage. En el primer paso del procedimiento se realiza una traducción virtual de una secuencia cualquiera de ARN (o ADN) con el fin de generar la correspondiente secuencia de aminoácido. Partiendo de la secuencia de aminoácido se realiza una traducción virtual inversa que proporciona posibilidades para los correspondientes codones debido al código genético degenerado. Según la optimización o bien modificación requerida, se utilizan para la selección del codón apropiado listas correspondientes de selección y algoritmos de optimización. La realización de los algoritmos tiene lugar, de forma típica, con ayuda de un software apropiado en una computadora. Así se obtiene la secuencia optimizada de ARNm y puede editarse, por ejemplo, con ayuda de un correspondiente dispositivo de visualización y compararse con la secuencia original (del tipo salvaje). Lo mismo es aplicable también para la frecuencia de los distintos nucleótidos. Las modificaciones frente a la secuencia original de nucleótidos se destacan aquí de preferencia. Además, se dan entrada por lectura según un tipo de ejecución preferido a secuencias estables conocidas en la naturaleza, que pueden proporcionar la base para un ARN estabilizado según motivos naturales de secuencias. También se puede prever un análisis de estructura secundario que puede analizar, con ayuda de cálculos de la estructura, características de estabilización y de desestabilización o bien campos del ARN.
Las figuras muestran:
La figura 1 muestra secuencias del tipo salvaje y modificadas para la proteína de matriz de la influenza. Figura 1A muestra el gen del tipo salvaje y figura 1B muestra la secuencia de aminoácido derivada del mismo (código de una letra). Figura 1C muestra una secuencia de gen que codifica la proteína de matriz de la influenza, secuencia de gen cuyo contenido de G/C está incrementado frente a la secuencia del tipo salvaje. Figura 1D muestra la secuencia de un gen que codifica una forma segregada de la proteína de matriz de la influenza (incluida una secuencia de señal terminal de N) donde el contenido de G/C de la secuencia frente a la secuencia del tipo salvaje está incrementado. Figura 1E muestra un ARNm que codifica la proteína de matriz de la influenza, ARNm que contiene secuencias de estabilización si se compara con el ARNm del tipo salvaje. Figura 1F muestra un ARNm que codifica la proteína de matriz de la influenza, ARNm que tiene, además de las secuencias de estabilización, un mayor contenido de G/C.
La figura 1G muestra también un ARNm modificado que codifica la forma segregada de la proteína de matriz de la influenza y tiene, si se compara con el tipo salvaje, secuencias de estabilización y un mayor contenido de GC. En la figura 1A y figura 1C a 1C se han destacado en negrilla los codones de inicio y de detención. Los nucleótidos modificados frente a la secuencia del tipo salvaje de la figura 1A están representados en las figuras 1C a 1G con mayúsculas.
La figura 2 muestra secuencias del tipo salvaje y secuencias modificadas según invención que codifican el antígeno del tumor MAGE1.
La figura 2A muestra la secuencia del gen del tipo salvaje y figura 2B la secuencia de aminoácido derivada del mismo (código de tres letras). Figura 2C muestra un ARNm modificado que codifica el MAGE1, cuyo contenido de G/C está incrementado frente al tipo salvaje. Figura 2D muestra la secuencia de un ARNm modificado que codifica el MAGE1, ARNm en el que se optimizó la utilización del codón en cuando a la codificación de ARNt que se presentan lo más frecuentemente posible en la célula. Los codones de inicio y detención están marcados en negrilla.
Los siguientes ejemplos explican más en detalle la presente invención sin limitarla.
Ejemplo 1
Como tipo de ejecución a modo de ejemplo del procedimiento para averiguar la secuencia de un ARNm modificado según invención se preparó un programa de computador que modifica la secuencia de nucleótidos de un ARNm cualquiera con ayuda del código genético o bien su naturaleza degenerativa, de manera que resulta un contenido máximo de G/C en relación con la utilización de codones que codifican ARNt's que se presentan lo más frecuentemente posible en la célula, donde la secuencia de aminoácido codificada por el ARNm modificado es idéntica frente a la secuencia sin modificar. Alternativamente, también se puede modificar solamente el contenido de G/C o solamente la utilización de codones frente a la secuencia original.
El código fuente en Visual BAsic 6,0 (entorno de desarrollo utilizado: Microsofot Visual Studio Enterprise, 6,0 con Servicepack 3) está indicado en el anexo.
Ejemplo 2
Con ayuda del programa de computador del ejemplo 1 se preparó a partir de E.coli un constructo de ARN con una secuencia del lac-Z-gen optimizada en cuanto a la estabilización y la eficacia de traducción. Así se pudo conseguir un contenido de G/C del 69% (si se compara con la secuencia del tipo salvaje del 51%; véase Kalnins et al., EMBOJ. 1983, 2(4): 593-597). Por la síntesis de oligonucleótidos solapados que tienen la secuencia modificada, se obtuvo la secuencia optimizada según procedimientos conocidos en la técnica actual. Los oligonucleótidos terminales tenían las siguientes interfaces de restricción: En el extremo 5' un inferfaz EcoRV- así como en el extremo 3' un interfaz Bg/II. Mediante la digestión con Eco/RVBg/II se transforma la secuencia modificada 1acZ en el plásmido pT7Ts (número de acceso del banco de genes U 26404; véase Lai et al., s.o.). pT7Ts contiene como regiones no traducidas secuencias del gen de globina \beta de Xenopus levis en cada caso en 5' y 3'. El plásmido se cortó antes de introducir la secuencia modificada de 1acZ con las enzimas de restricción mencionadas.
El constructo de pT7Ts-lac-Z se multiplicó en bacterias y se purifico por extracción de fenol-cloroformo. Se transcribieron in vitro 2 \mug del constructo se por procedimientos conocidos por el técnico en la materia debido a lo cual se obtuvo el ARNm modificado.
Ejemplo 3
Con ayuda del programa de computador según invención del ejemplo 1, se optimizó el gen para la proteína de matriz de la influenza (secuencia del tipo salvaje véase figura 1A, secuencia de aminoácido derivada figura 1B). Con ello se obtuvo la variante de secuencia rica en G/C representada en la figura 1C. También se averiguó una secuencia rica en G/C que codifica la forma segregada de la proteína de matriz de la influenza y codifica una secuencia de señal terminal de N (véase figura 1D). La forma segregada de la proteína de matriz de la influenza tiene la ventaja de que tiene una mayor inmunogenicidad si se compara con la forma no segregada.
Partiendo de las secuencias optimizadas se diseñaron las moléculas de ARNm correspondientes. El ARNm optimizado en cuanto al contenido de G/C y la utilización de codones para la proteína de matriz de la influenza se equipó adicionalmente con secuencias de estabilización en el sitio de 5' y 3' (las secuencias de estabilización provienen de los UTRs de 5' o bien 3' del ARNm de \beta-globina de Xenupus laevis; véase vector pT7Ts en Lai et al., s.o.) (véase figura 1E y 1F). Igualmente también se optimizó la secuencia en la zona traducida del ARNm que codifica la forma segregada de la proteína de matriz de la influenza y se equipó con las secuencias de estabilización mencionadas (véase figura 1G).
Ejemplo 4
Con ayuda del programa de computador del ejemplo 1 se modificó el ARNm que codifica el antígeno de tumor MAG1. Así se averiguó la secuencia representada en la figura 2C que tiene un contenido de G/C mayor (351 G, 291 C) en un 24% si se compara con la secuencia de tipo salvaje (275 G, 244 G). Además, se mejoró la secuencia del tipo salvaje por utilización alternativa de codones en cuanto a la eficacia de traducción debido a la codificación de ARNt's que existen con mayor frecuencia en la célula (véase Figura 2D). Mediante la utilización alternativa de codones también se incrementó el contenido de G/C en un 24%.
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31
32
33
34
<110> Von der Muelbe, Florian
\hskip1cm
Hoerr, Igmar (solamente EE.UU.) 
\hskip1cm
Pascolo, Steve (solamente EE.UU:) 
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<120> Composición farmacéutica que contiene un ARNm optimizado estabilizado y que para la traducción en sus campos de codificación.
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<130> -CU01P003WO
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<140> PCT/EP02/06180
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<141> 2002-06-05
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<160> 13
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<170> PatentIn Ver. 2.1
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<210> 1
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<211> 774
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<213> Influenza virus
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<220>
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<223> Influenza-Matrix: Gen del tipo salvaje (para comparación)
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<220>
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<223> Códicos de inicio: atg (Nucleótidos 11 a 13), codón de parada:
\hskip1cm
tga (Nucleótidos 767 a 769) 
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<400> 1
35 
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<210> 2
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<211> 252
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<212> PRT
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<213> Influenza virus
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<400> 2
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36 
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<210> 3
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<211> 775
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<212> DNA
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<213> Artificial Sequence
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<220>
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<223> Description of Artificial Sequence:
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Influenza-Matrix: Gen con un mayor contenido de G/C 
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<220>
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<223> Codón de inicio: atg (Nucleótidos 11 a 13), codón de parada:
\hskip1cm
tag (Nucleótidos 767 a 769) 
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<400> 3
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37 
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<210> 4
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<211> 844
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<212> DNA
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<220>
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<223> Description of Artificial Sequence:
\hskip1cm
Influenza-Matrix: Gen para forma segregada (con secuencia de señal N-terminal) con un mayor contenido de G/C 
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<220>
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<223> Codón de inicio: atg (Nucleótidos 11 a 13), codón de parada
\hskip1cm
tga (Nucleótidos 836 a 838) 
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<400> 4
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38 
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<210> 5
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<211> 942
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<212> RNA
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<213> Artificial Sequence
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<220>
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<223> Description of Artificial Sequence:
\hskip1cm
Influenza-Matrix: ARNm con secuencias de estabilización 
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<220>
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<223> Las secuencias de estabilización provienen de los UTRs de 5' o bien 3' del ARNm de \beta-globina del Xenopus laevis 
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<220>
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<223> Codón de inicio: aug (Nucleótidos 56 a 58), Codón de parada:
\hskip1cm
uga (Nucleótidos 812 a 814) 
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<400> 5
39 
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<210> 6
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<211> 942
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<212> RNA
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<213> Artificial Sequence
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<220>
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<223> Description of Artificial Sequence:
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Influenza-Matrix: ARNm con un mayor contenido de G/C y secuencias de estabilización 
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<220>
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<223> Las secuencias de estabilización provienen de los UTRs de 5' o bien 3' del ARNm de \beta-globina del Xenopus laevis 
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<220>
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<223> Codón de inicio: aug (Nucleótidos 56 a 58), Codón de parada:
\hskip1cm
uga (Nucleótidos 812 a 814) 
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<400> 6
40 
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<210> 7
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<211> 1011
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<212> RNA
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<213> Artificial Sequence
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<220>
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<223> Description of Artificial Sequence:
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Influenza-Matrix: para ARNM con mayor contenido de G/C y secuencias de estabilización que codifica la forma segregada 
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<220>
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<223> Codón de inicio: aug (Nucleótidos 56 a 58), Codón de parada:
\hskip1cm
uga (Nucleótidos 881 a 883) 
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<400> 7
41 
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<210> 8
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<211> 940
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<212> ADN
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<213> Homo Sapiens 
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<220>
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<223> MAGE1: Gen del tipo salvaje (para comparación)
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<220>
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<223> Codón de inicio: atg (Nucleótidos 5 a 7), Codón de parada:
\hskip1cm
tga (Nucleótidos 932 a 934) 
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<400> 8
42 
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<210> 9
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<211> 308
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<212> PRT
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<213> Homo Sapiens 
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<220>
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<223> Tumorantigen MAGE1: secuencia de proteínas
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<400> 9
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43 
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<210> 10
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<211> 939
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<212> RNA
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<213> Artificial Sequence
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<220>
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<223> Description of Artificial Sequence: MAGE1: ARNm
\hskip1cm
con un mayor contenido de G/C 
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<220>
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<223> Codón de inicio: aug (Nucleótidos 1 a 3), codón de parada:
\hskip1cm
uga (Nucleótidos 937 a 939) 
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<400> 10
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44 
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<210> 11
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<211> 939
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<212> RNA
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<213> Artificial Sequence
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<220>
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<223> Description of Artificial Sequence: MAGE1: ARNm
\hskip1cm
con utilización alternativa de codón. 
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<220>
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<223> Codón de inicio: aug (Nucleótidos 1 a 3), codón de parada:
\hskip1cm
uga (Nucleótidos 937 a 939) 
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<400> 11
45 
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<210> 12
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<211> 7
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<212> RNA
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<213> Artificial Sequence
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<220>
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<223> Description of Artificial Sequence: Un motivo de secuencia reconocible para una endonucleasa, motivo de secuencia que está contenido en el segmento de UTR 3' del gen que codifica el receptor de transferina (p. 9 de la descripción)
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<400> 12
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\hskip-.1em\dddseqskip
gaacaag 
\hfill
7 
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<210> 13
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<211> 13
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<212> RNA
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<213> Artificial Sequence
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<220>
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<223> Description of Artificial Sequence: Secuencia Kozak, sitio de enlace de ribosomas (p. 11 de la descripción)
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<400> 13
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\hskip-.1em\dddseqskip
gccgccacca ugg 
\hfill
13 
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Claims (21)

1. ARNm modificado que codifica, como mínimo, un péptido o polipéptido biológicamente efectivo o antígeno, caracterizado porque el contenido de G/C de la zona del ARNm que codifica el péptido o polipéptido está modificado de tal manera que resulta un contenido máximo de G/C en conexión con los codones que codifican ARNt's relativamente frecuentes y porque la secuencia codificada de aminoácidos permanece sin modificar frente al tipo salvaje.
2. ARNm modificado según la reivindicación 1, caracterizado porque la zona del ARNM que codifica el péptido o polipéptido se encuentra modificado frente a la zona del ARNm del tipo salvaje que codifica el péptido o polipéptido que, como mínimo, un codón de la secuencia del tipo salvaje que codifica un ARNt relativamente raro en la célula se sustituye por un codón que codifica un ARNt relativamente frecuente en la célula que lleva el mismo aminoácido que el ARNt relativamente raro.
3. ARNm modificado según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque todos los codones de la secuencia del tipo salvaje, que codifican un ARNt relativamente raro en la célula, se han sustituido en cada caso por un codón que codifica un ARNt relativamente frecuente en la célula que lleva en cada caso el mismo aminoácido que el ARNt relativamente raro.
4. ARNm modificado según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la zona que codifica el péptido o polipéptido y/o la zona no traducida de 5' y/o 3' del ARNm modificado están modificados frente al ARNm del tipo salvaje de tal manera que no tiene elementos de secuencia ricos en AU o no tiene elementos de secuencia que causan la desintegración enzimática in vivo.
5. ARNm modificado según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el modificado tiene una IRES y/o una secuencia de estabilización de 5' y/o una secuencia de estabilización de 3'.
6. ARNm modificado según una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque el ARNm modificado tiene, como mínimo, un nucleótido análogo de procedencia natural.
7. ARNm modificado según la reivindicación 6, caracterizado porque el análogo ha sido seleccionado del grupo compuesto por fosfortioatos, fosforamidatos, peptidnucleótidos, metilfosfonatos, 7-deazaguanosina, 5-metilcitosina e inosina.
8. ARNm modificado según una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque el polipéptido ha sido seleccionado del grupo compuesto por factores de crecimiento, antígenos de tumores, antígenos de virus, bacterias y protozoes.
9. ARNm modificado según la reivindicación 8, caracterizado porque el antígeno viral, bacterial o protozoológico provine de una proteína segregada.
10. ARNm modificado según la reivindicación 8 ó 9, caracterizado porque el polipéptido es un poliepitopo de antígenos de tumores, virales, bacteriales o protozoológicos.
11. ARNm modificado según una de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque el ARNm codifica, además, como mínimo, una citoquina.
12. Composición farmacéutica caracterizada porque contiene el ARNm modificado según una de las reivindicaciones 1 a 11 en unión con un excipiente y/o vehículo farmacéuticamente compatible.
13. Composición farmacéutica según la reivindicación 12, caracterizada porque contiene, como mínimo, un adyuvante que estimula la reacción inmunológica.
14. Composición farmacéutica según una de las reivindicaciones 12 ó 13, caracterizada porque contiene, como mínimo, además una citoquina.
15. Utilización de una composición farmacéutica según una de las reivindicaciones 12 a 14 o un ARNm modificado según una de las reivindicaciones 1 a 11 para la preparación de una vacuna para la vacunación contra enfermedades infecciosas y cáncer.
16. Utilización de una composición farmacéutica según una de las reivindicaciones 12 a 14 para la preparación de un medicamento para el tratamiento de melanomas, carcinomas del colón, linfomas, carcomas ó blastomas.
17. Sustancia terapéutica genética caracterizada porque contiene una composición farmacéutica según una de las reivindicaciones 12 a 14 o un ARNm modificado según una de las reivindicaciones 1 a 11.
18. Utilización de una composición farmacéutica según una de las reivindicaciones 12 a 14 para la preparación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades degenerativas, especialmente enfermedades neurodegenerativas.
19. Utilización de una composición farmacéutica según una de las reivindicaciones 12 a 14 para la preparación de una vacuna para la vacunación contra enfermedades infecciosas virales, bacteriales o protozoológicas.
20. Utilización de una composición farmacéutica según una de las reivindicaciones 12 a 14 para la preparación de una vacuna para la vacunación contra el SIDA, la hepatitis A, B ó C, la fiebre amarilla, la gripe, infecciones por salmonela o estreptococos.
21. Procedimiento para la optimización del contenido de G/C de un ARNm del tipo salvaje para la producción de un ARNm modificado según una de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque (1) se realiza una traducción virtual de una secuencia de ARN del tipo salvaje para generar la correspondiente secuencia de aminoácido, (ii) se realiza una traducción virtual inversa para conseguir posibilidades de elección para los correspondientes codones, y (iii) entre las posibilidades de elección se seleccionan aquellos codones con un contenido máximo de G/C que codifican ARNt' relativamente frecuentes.
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