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Composicion farmaceutica que contiene un arnm estabilizado y optimizado para la traduccion, adecuada como vacuna y como regenerante de tejidos.
ES2240745T3
Spain
- Other languages
English - Inventor
Florian Von Der Mulbe Ingmar Hoerr Steve Pascolo - Current Assignee
- Curevac SE
Worldwide applications
2002
EP
DE
AT
EP
AT
ES
WO
ES
ES
ES
EP
AT
ES
DK
AT
CA
EP
DE
DE
PT
DE
EP
CA
EP
AT
EP
DE
EP
2003
US
2007
AU
2009
AU
2010
US
US
2011
US
2014
US
2016
US
US
US
US
US
US
US
US
2018
US
2021
FR
FR
Application ES02732752T events
2002-06-05
2005-10-16
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2005-10-16
2022-06-05
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Expired - Lifetime
Description
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Composición farmacéutica que contiene un ARNm
estabilizado y optimizado para la traducción, adecuada como vacuna y
como regenerante de tejidos.
La presente invención se refiere a una
composición farmacéutica que contiene un ARNm estabilizado por
modificaciones de secuencia en el campo traducido y optimizado para
la traducción. La composición farmacéutica según invención es
especialmente adecuada como vacuna y como sustancia terapéutica para
la regeneración de tejidos. Además, se revela un procedimiento para
la determinación de modificaciones de secuencias que sirven para la
estabilización y la optimización de la traducción de ARNm.
La terapia genética y la vacunación genética son
procedimientos médicos moleculares cuya aplicación en la terapia y
la prevención de enfermedades tendrán considerables efectos sobre la
práctica medica. Ambos procedimientos se basan en la introducción de
ácidos nucleicos en células o bien tejidos del paciente así como en
el siguiente procesamiento de la información codificada por los
ácidos nucleicos introducidos, es decir la expresión de los
polipéptidos deseados.
El método normal de procedimientos existentes
hasta la fecha en la terapia genética y la vacunación genética es la
utilización de ADN para introducir la información genética requerida
en la célula. En este contexto se han desarrollado diferentes
procedimientos para la introducción de ADN en células como por
ejemplo la transfección de fosfato cálcico, la transfección de
polipreno, la fusión de protoplastos, electroporación,
microinyección y lipofección, donde especialmente la lipofección
resultó ser un procedimiento adecuado.
Otro procedimiento que se ha propuesto
especialmente en procedimientos de vacunación genética, es la
utilización de virus de ADN como vehículo de ADN. Tales virus tienen
la ventaja de que debido a sus características infecciosas se puede
conseguir un coeficiente de transfección muy alto. Los virus
utilizados se modifican genéticamente de manera que en la célula
transfectada no se forman partículas infecciosas activas. A pesar de
esta medida de precaución, sin embargo, no se puede excluir un
cierto riesgo de la propagación incontrolada de los genes de efecto
terapéutico genético así como virales debido a posibles incidencias
de recombinación.
Normalmente, el ADN introducido en la célula se
integra en cierta medida en el genoma de la célula transfectada. Por
un lado, este fenómeno puede tener un efecto deseado debido a que se
puede conseguir así una actividad de larga duración del ADN
introducido. Por el otro lado, la integración en el genoma trae
consigo un considerable riesgo de la terapia genética. Así, por
ejemplo, se puede producir una inserción del ADN incorporado en un
gen intacto, lo que representa una mutación que obstaculiza la
función del gen endógeno o, incluso, la anula por completo. Debido a
tales incidencias de integración se pueden anular, por un lado,
sistemas de enzimas vitales para la célula y, por el otro lado,
también existe el peligro de una transformación de la célula así
modificada en un estado de degeneración si por la integración del
ADN extraño se modifica un gen decisivo para la regulación del
crecimiento de la célula. Por esta razón, al utilizar virus de ADN
como agente terapéutico genético y vacuna no se puede excluir un
riesgo de la formación de cáncer. En este contexto también se ha de
tener en cuenta que para la expresión efectiva de los genes
introducidos en la célula, los vehículos de ADN correspondientes
también contienen un fuerte promotor o bien el promotor de CMV
viral. La integración de tales promotores en el genoma de la célula
tratada puede conducir a modificaciones no deseadas de la regulación
de la expresión genética en la célula.
Otra desventaja de la utilización del ADN como
agente terapéutico genético y vacuna es la inducción de anticuerpos
anti ADN patógenos en el paciente provocando una reacción
inmunológica posiblemente letal.
En contra del ADN, la utilización de ARN como
agente terapéutico genético o vacuna se puede considerar
considerablemente más segura. Especialmente, el ARN no presenta el
peligro de integrarse de forma estable en el genoma de la célula
transfectada. Además, no son necesarias secuencias virales como
promotores para una traducción efectiva. Adicionalmente, el ARN se
desintegra in vivo de forma considerablemente más sencilla.
Quizás debido al período de semidesintegración relativamente corto
del ARN frente al ADN en el sistema sanguíneo no se han detectado
hasta la fecha anticuerpos de anti ARN. Por esta razón, el ARN puede
considerarse la molécula de opción para procedimientos de terapia
médica molecular.
No obstante, los procedimientos médicos que se
basan en sistemas de expresión de ARN todavía requieren, antes de
una aplicación más amplia, la solución de algunos problemas básicos.
Uno de los problemas al utilizar el ARN es la transferencia segura,
eficiente específicamente en cuanto a la célula o bien el tejido del
ácido nucleico. Debido a que el ARN resulta, normalmente, muy
inestable en forma de solución, por los procedimientos tradicionales
que se utilizan para el ADN, hasta la fecha el ARN no ha podido
utilizarse o se ha utilizado con una gran ineficacia como agente
terapéutico o bien vacuna.
En cuanto a la inestabilidad son responsables
enzimas de desintegración de ARN, las así llamadas RNasas
(ribonuleasas). Incluso las impurezas más pequeñas de ribonucleasas
bastan para desintegrar por completo el ARN en solución. La
desintegración natural de ARNm en el citoplasma de células está
sujeto a una regulación muy fina. En cuanto a esto se conocen varios
mecanismos. Así para un ARNm funcional tiene una importancia
decisiva la estructura terminal. En el extremo 5' se encuentra la
así llamada estructura "cap" (caperuza) (un nucleótido de
guanosina modificado) y en el extremo 3' una secuencia de hasta 100
nucleótidos de adenosina (la así llamada cola poli A). A través de
estas estructuras se reconoce el ARN como ARNm y se regula la
desintegración. Además, existen otros procesos que estabilizan o
bien desestabilizan el ARN. Muchos de estos procesos todavía no son
conocidos, sin embargo, con frecuencia parece decisivo para ello una
interacción entre el ARN y las proteínas. Por ejemplo, se describió
hace poco un
"mRNA-Surveillance-System"
(sistema de control del ARNm) (Hellerin und Parker, Amun.Rev.Genet
1999, 33: 229 a 260) en el que se conocen, debido a determinadas
interacciones de proteínas de "feedback" (retroalimentación) en
el citosol, ARNm incompletos o "nonsense" (sin sentido) a los
que se proporciona acceso para la desintegración donde una parte
principal de este proceso se realiza por exonucleasas.
Según la técnica actual se han propuesto algunas
medidas para aumentar la estabilidad del ARN y por lo tanto hacer
posible su utilización como sustancia terapéutica genética o bien
vacuna de ARN.
La WO 97/48370 revela vacunas de ADN y ARN contra
HIV (gen env) , en las que el uso de codón se optimizó con vistas a
los receptores de la vacuna (hombre), es decir con vistas a la
frecuencia de RNAts en la célula humana.
La observación de las instrucciones del protocolo
de la página 51 conduce a un gen sintético en el que se aumenta el
contenido de G/C. Se eliminan secuencias inestables no deseadas como
ATTTA. Al mismo tiempo que el principio activo se puede administrar
proteína de GM-CSF o IL-12. La WO
97/48370 no revela la posibilidad de maximizar el contenido de G/C
debido a que el objetivo es la optimización del uso de codón.
En la
EP-A-1083232 se propone para
solución del problema arriba enunciado de la inestabilidad del ARN
ex vivo un procedimiento para la introducción de ARN,
especialmente ARNm, en células y organismos en los que el ARN existe
en forma de un complejo con una proteína o un péptido catiónico.
La WO 99/14346 describe otros procedimientos para
la estabilización del ARNm. Especialmente se proponen modificaciones
del ARNm que estabilizan las especies de ARNm frente a la
desintegración de RNasas. Tales modificaciones afectan, por un lado,
la estabilización por modificaciones de secuencia, especialmente
reducción del contenido de C y/o U mediante la eliminación o
sustitución de bases. Por otro lado, se proponen modificaciones
químicas, especialmente la utilización de análogos de nucleótidos,
así como grupos de bloqueo de 5' y 3', una mayor longitud de la cola
de poli-A así como la formación de complejos del
ARNm con medios de estabilización y combinaciones de las medidas
indicadas.
En las patentes de EE.UU US 5.580.859 y US
6.214.804 se revelan entre otros dentro del marco de la "terapia
genética de transientes" (TGT) vacunas y sustancias terapéuticas
de ARNm. Se describen diferentes medidas para aumentar la eficacia
de la traducción y la estabilidad del ARNm, medidas que se refieren,
sobre todo, a regiones de secuencias no traducidas.
Bieler y Wagner (en: Schleef (Hrsg.), Plasmids
for Therapy and Vaccination [plásmidos para la terapia y la
vacunación] capítulo 9, páginas 147 a 168,
Wiley-VCH, Weinheim, 2001) informan sobre la
utilización de genes sintéticos en conexión con métodos terapéuticos
genéticos utilizando vacunas de ADN y vectores lentiverales. Se
describe la construcción de un gen gag sintético derivado de
HIV-1 en el que los codones se modificaron frente a
la secuencia del tipo salvaje (utilización alternativa de codones,
ingl. "codon usage") de manera que correspondía a la
utilización de codones que se puede encontrar en genes altamente
exprimidos de mamíferos. Así se reduce, especialmente, el contenido
de A/T frente a la secuencia del tipo salvaje. Los autores
observaron, especialmente, un mayor coeficiente de expresión del gen
gag sintético en células transfectadas. Además, se observó en
ratones una mayor formación de anticuerpos contra la proteína
gag en el caso de ratones inmunizados con el constructo de
ADN sintético y también una mayor liberación de citoquinas in
vitro con células transfectadas del bazo de ratones. Finalmente,
pudo observarse una inducción de una reacción inmunológica
citotóxica en ratones inmunizados con el plásmido de expresión
gag. Los autores de este artículo atribuyen las mejores
características de esta vacuna de ADN esencialmente a una
modificación del transporte núcleo-citoplasmático
del ARNm exprimido de la vacuna de ADN, modificación provocada por
la utilización optimizada de codones. Por el contrario, los autores
consideran que el efecto de la utilización modificada de codones
sobre la eficacia de traducción es pequeño.
El objetivo de la presente invención consiste,
por lo tanto, en proporcionar un nuevo sistema para la terapia
genética y vacunación genética que suprime las desventajas
relacionadas con las características de sustancias terapéuticas y
vacunas de ADN y aumenta la efectividad de sustancias terapéuticas
sobre la base de especies de ARN.
Este objetivo se alcanza por los tipos de
ejecución caracterizados en las reivindicaciones de la presente
invención.
Especialmente, se propone un ARNm modificado así
como un compuesto farmacéutico que contiene un ARNm modificado de
este tipo en unión con un excipiente y/o vehículo farmacéuticamente
compatible, donde el ARNm modificado codifica, como mínimo, un
péptido o polipéptido biológicamente efectivo o antígeno, donde la
secuencia del ARNm, especialmente en el campo que codifica, como
mínimo, un péptido o polipéptido, muestra frente al ARNm del tipo
salvaje las siguientes modificaciones que pueden existir bien
alternativamente o en combinación.
Por un lado, el contenido de G/C del campo que
codifica el péptido o polipéptido del ARNm modificado es mayor que
el contenido de G/C del campo de codificación del ARNm del tipo
salvaje que codifica el péptido o polipéptido, donde la secuencia
del aminoácido codificada permanece sin modificar frente al tipo
salvaje.
Esta modificación se basa sobre el hecho de que
para una traducción eficiente de un ARNm el desarrollo de la
secuencia del campo del ARNm a traducir es esencial. Aquí juegan un
papel importante la composición y la secuencia de los diferentes
nucleótidos. Especialmente, las secuencias con un mayor contenido de
G(guanosina)/C(citosina) son más estables que las
secuencias con un mayor contenido de
A(adenosina)/U(uridina). Por lo tanto se varían los
codones frente al ARNm del tipo salvaje según invención manteniendo
la secuencia traducida del aminoácido, de forma que contienen una
mayor cantidad de nucleótidos de G/C. Debido a que varios codones
codifican uno y el mismo aminoácido (degeneración del código
genético), es posible determinar los codones más favorables para la
estabilidad (utilización alternativa de codones, ingl. "codon
usage").
Dependiendo del aminoácido a codificar por el
ARNm modificado son factibles diferentes posibilidades para la
modificación de la secuencia de ARNm frente a la secuencia del tipo
salvaje. En el caso de aminoácidos, codificados por codones, que
contienen exclusivamente nucleótidos G ó C, no es necesaria ninguna
modificación del codón. Así, los codones para Pro (CCC ó CCG), Arg
(CGC ó CGG), Ala (GCC ó GCG) y Gly (GGC ó GGG) no requieren ninguna
modificación ya que no existen ni A ni U.
En los siguientes casos se modifican los codones
que contienen nucleótidos de A y/o U mediante la sustitución de
otros codones que codifican los mismos aminoácidos pero no contienen
ningún A y/o U. Ejemplos son:
- -
- Los codones para Pro pueden modificarse de CCU ó CCA a CCC ó CCG; los codones para Arg pueden modificarse de CGU ó CGA ó AGA ó AGG a CGC ó CGG;
- -
- los codones para Ala pueden modificarse de GCU ó GCA a GCC ó GCG;
- -
- los codones para Gly pueden modificarse de GGU ó GGA a GGC ó GGG.
Aunque, en otros casos los nucleótidos de A o
bien U no pueden eliminarse de los codones, sin embargo es posible
reducir el contenido de A y U mediante la utilización de codones que
contienen menos nucleótidos A y/o U. Por ejemplo:
- -
- Los codones para Phe pueden modificarse de UUU a UUC;
- -
- los codones para Leu pueden modificarse de UUA, CUU ó CUA a CUC ó CUG;
- -
- los codones para Ser pueden modificarse de UCU ó UCA ó AGU a UCC, UCG ó AGC;
- -
- el codón para Tyr puede modificarse de UAU a UAC;
- -
- El codón de terminación UAA puede modificarse en UAG ó UGA;
- -
- el codón para Cys puede modificarse de UGU a UGC;
- -
- el codón His puede modificarse de CAU a CAC;
- -
- el codón para Gln puede modificarse de CAA a CAG;
- -
- los codones para Ile pueden modificarse de AUU ó AUA a AUC;
- -
- los codones para Thr pueden modificarse de ACU ó ACA a ACC ó ACG;
- -
- el codón para Asn puede modificarse de AAU a AAC;
- -
- el codón para Lys puede modificarse de AAA a AAG;
- -
- los codones para Val pueden modificarse de GUU ó GUA a GUC ó GUG;
- -
- el codón para Asp puede modificarse de GAU a GAC;
- -
- el codón para Glu puede modificarse de GAA a GAG.
En el caso de los codones para Met (AUG) y Trp
(UGG), por el contrario, no existe ninguna posibilidad de
modificación de la secuencia.
Las sustituciones arriba indicadas pueden
utilizarse, naturalmente, por separado pero también en todas las
combinaciones posibles para aumentar el contenido de G/C del ARNm
modificado frente a la secuencia original. Así, por ejemplo, se
pueden modificar todos los codones para Thr que se presentan en la
secuencia (del tipo salvaje) original a ACC (o ACG). De preferencia,
sin embargo, se utilizan combinaciones de las posibilidades
anteriores de sustitución, como por ejemplo:
Sustitución de todos los codones que codifican el
Thr en la secuencia original por ACC (ó ACG) y sustitución de todos
los codones que codifican originalmente Ser por UCC (ó UCG ó
AGC);
Sustitución de todos los codones que codifican
Ile en la secuencia original por AUC y sustitución de todos los
codones que codifican originalmente Lys por AAG y sustitución de
todos los codones que codifican originalmente Tyr por UAC;
Sustitución de todos los codones que codifican
Val en la secuencia original por GUC (ó GUG) y sustitución de todos
los codones que codifican originalmente Glu por GAG y sustitución de
todos los codones que codifican originalmente Ala por GCC (ó GCG) y
sustitución de todos los codones que codifican originalmente Arg por
CGC (ó CGG);
Sustitución de todos los codones que codifican
Val en la secuencia original por GUC (ó GUG) y sustitución de todos
los codones que codifican originalmente Glu por GAG y sustitución de
todos los codones que codifican originalmente Ala por GCC (ó GCG) y
sustitución de todos los codones que codifican originalmente Gly por
GGC (ó GGG) y sustitución de todos los codones que codifican
originalmente Asn por AAC;
Sustitución de todos los codones que codifican
Val en la secuencia original por GUC (ó GUG) y sustitución de todos
los codones que codifican originalmente Phe por UUC y sustitución de
todos los codones que codifican originalmente Cys por UCG y
sustitución de todos los codones que codifican originalmente Leu por
CUG (ó CUC) y sustitución de todos los codones que codifican
originalmente Gln por CAG y sustitución de todos los codones que
codifican originalmente Pro por CCC (ó CCG); etc.
De preferencia el contenido de G/C del campo del
ARNm modificado que codifica el péptido o bien polipéptido se
incrementa en, como mínimo, 7%, de mayor preferencia, en como mínimo
en un 15%, especialmente preferido en, como mínimo, un 20% al
contenido de G/C del campo codificado del ARNm del tipo salvaje que
codifica el polipéptido.
Especialmente preferido es, en este contexto,
aumentar a un máximo el contenido de G/C del ARNm modificado,
especialmente en el campo que codifica, como mínimo, un péptido o
bien polipéptido, en comparación con la secuencia del tipo
salvaje.
La otra modificación según invención del ARNm
contenido en la composición farmacéutica caracterizada en la
presente invención se basa sobre el conocimiento que la eficacia de
traducción también queda determinada por una frecuencia diferente en
la presencia de ARNt's en las células. Si, por lo tanto, en una
secuencia de ARN existen en mayor cantidad los así llamados codones
"raros" el ARNm correspondiente se traduce claramente peor que
en el caso en el que para ARNt's relativamente "frecuente"
existen codones de codificación.
Así, según invención en el ARNm modificado
(incluido en la composición farmacéutica) el campo que codifica el
péptido o bien polipéptido se modifica frente al correspondiente
campo del ARNm de tipo salvaje de tal forma que, como mínimo, un
codón de la secuencia del tipo salvaje que codifica un ARNt
relativamente raro en la célula, se cambia por un codón que codifica
un ARNt relativamente frecuente en la célula que lleva el mismo
aminoácido que el ARNt relativamente raro.
Debido a esta modificación se modifican las
secuencias de ARN de manera que se intercalan codones para los
cuales están disponibles ARNt's frecuentes.
Cuáles son los ARNt's que se presentan con
relativa frecuencia en la célula y cuáles son los que frente a éstos
son relativamente raros es bien sabido por el técnico en la materia;
véase por ejemplo Akashi, Curr. Opin. Genet. Dev. 2001,
11(6): 660-666.
Mediante esta modificación se pueden cambiar,
según invención, todos los codones de la secuencia del tipo salvaje
que codifican un ARNt relativamente raro en la célula, por, en cada
caso, un codón que codifica un ARNt relativamente frecuente en la
célula que lleva, en cada caso, el mismo aminoácido que el ARNt
relativamente raro.
Según invención tiene especial preferencia
vincular el contenido de G/C secuencial, especialmente máximo,
incrementado según invención en el ARNm modificado con los codones
"frecuentes" sin modificar la secuencia del aminoácido del
péptido o bien polipéptido (uno o varios) codificado por el campo de
codificación del ARNm. Este tipo de ejecución preferido proporciona
un ARNm traducido y estabilizado de manera especialmente eficiente
para la composición farmacéutica según invención.
En las secuencia de ARNm's eucarióticos existen
elementos de secuencia desestabilizadoras (DSE) en los que se
enlazan proteínas de señal que regulan la desintegración enzimática
del ARNm in vivo: Por esta razón, para una mayor
estabilización del ARNm modificado incluido en la composición
farmacéutica según invención se realizan, en caso dado, para el
campo de codificación de, como mínimo, un péptido o bien
polipéptido, una o varias modificaciones frente al correspondiente
campo del ARNm del tipo salvaje de manera que no está incluido
ningún elemento de secuencia desestabilizadora. Naturalmente, según
invención, también se prefiere eliminar del ARNm los DSE
eventualmente presentes en los campos no traducidos (UTR de 3' y/ó
5').
Tales secuencias desestabilizadoras son, por
ejemplo, secuencias ricas en AU ("AURES") presentes en
segmentos de UTR 3' de múltiples ARNm inestables (Caput et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 1986, 83 : 1670 a 1674). Las
moléculas de ARN incluidas en la composición farmacéutica según
invención, se han modificado, por lo tanto y de preferencia, de tal
forma frente al ARNm del tipo salvaje que no contienen ninguna de
tales secuencias desestabilizadoras. Esto es aplicable también para
tales motivos de secuencia que son reconocidos por posibles
endonucleasas, por ejemplo la secuencia GAACAAG incluida en el
segmento de 3' UTR del gen que codifica el receptor de transferina
(Binder et al., EMBO J. 1994, 13: 1969 a 1980). También estos
motivos de secuencia se eliminan, de preferencia, en el ARNm
modificado de la composición farmacéutica según invención.
Un técnico en la materia conoce diferentes
procedimientos adecuados para la sustitución de codones en el ARNm
modificado según invención. En el caso de campos de codificación más
cortos (que codifican péptidos de efecto biológico o antigénos) se
puede sintetizar, por ejemplo, todo el ARNm de forma química
utilizando técnicas
estándar.
estándar.
De preferencia, sin embargo se introducen
sustituciones de bases utilizando una matriz de ADN para la
producción del ARNm modificado con ayuda de técnicas de la
mutagénesis precisa usual; Maniatis et al., Molecular
Cloning: A. Laboratory Manual, Cold spring Harbor Laboratory
Press, 3ª edición, Cold Spring Harbor, NY, 2001.
En este procedimiento se transcribe, por lo
tanto, in vitro una correspondiente molécula de ADN para la
producción del ARNm. Esta matriz de ADN tiene un promotor adecuado,
por ejemplo un promotor de T7 ó SP6, para la transcripción in
vitro, al que siguen la secuencia de nucleótidos deseadas para
el ARNm a producir y una señal de terminación para la transcripción
in vitro. Según invención se produce la molécula del ADN que
constituye la matriz del constructo del ARN a producir, por un
crecimiento fermentativo y el siguiente aislamiento como parte de un
plásmido replicable en bacterias. Como plásmidos adecuados para la
presente invención se pueden nombrar, por ejemplo, los plásmidos
pT7Ts (número de acceso al banco de genes U26404; Lai et al.,
Development 1995, 121: 2349 a 2360), serie pGEM®, por ejemplo
pGEM®-1 (número de acceso al banco de genes X65300; de Promega) y
pSP64 (número de acceso al banco de genes X65327); véase también
Mezei und Storts, Purification of PCR Products (purificación de
productos PCR) en: Griffin und Griffin (Hrsg.), PCR Technology
(tecnología de PCR): Current Innovation , CRC Press, Boca Raton, FL,
2001.
Así es posible clonar, bajo utilización de
oligonucleótidos de ADN sintéticos cortos, que tienen en las
intersecciones que se producen transiciones cortas de un solo ramal,
o por genes producidos por síntesis química según un método
molecularbiológico, conocido por el técnico en la materia, la
secuencia deseada de nucleótidos en un plásmido adecuado (véase
Maniatis et al., s.o.).
El ARNm modificado incluido en la composición
farmacéutica según invención puede tener, además, una estructura de
"Cap" en 5' (un nucleótido modificado de guanosina). Como
ejemplo de estructuras de "Cap" pueden nombrarse
m7G(5')ppp (5'(A,G(5')A y
G(5')ppp(5')G.
Según otro tipo de ejecución preferido de la
presente invención, el ARNm modificado contiene una cola de poliA
de, como mínimo, 50 nucleótidos, de preferencia, como mínimo 70
nucleótidos, de mayor preferencia, como mínimo, 100 nucleótidos,
especialmente preferido, como mínimo, 200 nucleótidos.
Para una traducción eficiente del ARNm es
necesaria, además, un enlace efectivo de los ribosomas en la
posición de enlace de ribosomas (secuencia Kozak: GCCGCCACCAUGG, EL
AUG es formado por el codón de inicio). En este sentido se ha
detectado que un mayor contenido de A/U alrededor de esta posición
hace posible un enlace más eficiente de los ribosomas con el
ARNm.
Además, es posible incluir en el ARNm modificado
uno o varios de los así llamados IRES (ingl. "internal ribosomal
entry side" - sitio de entrada ribosomal interno). Un IRES puede
actuar así como única posición de enlace para ribosomas, sin
embargo, también puede servir para proporcionar un ARNm que codifica
varios péptidos o bien polipéptidos que se han de traducir, por
separado, por los ribosomas ("ARN multicistrónico"). Ejemplos
de secuencias de IRES que se pueden utilizar según invención son
aquellos de los virus de picorna (por ejemplo FMDV), virus de la
peste (CFFV), virus de la poliomelitis (PV), virus de
encefalo-miocarditis (ECMV), virus de la fiebre
aftosa (FMDV), virus de la hepatitis C (HCV), virus clásicos de la
fiebre porcina (CSFV), virus de murines-leucoma
(MLV), virus de la inmunodeficiencia de Simean (SIV) o virus de la
parálisis de cricket (CrPV).
Según otro tipo de ejecución preferido de la
presente invención, el ARNm modificado tiene en las zonas no
traducidas de 5' y/o 3' secuencias de estabilización que son capaces
de aumentar el período de semidesintegración del ARNm en
citosol.
Estas secuencias de estabilización pueden tener
una homología de secuencias al 100% con secuencias de procedencia
natural que se presentan en virus, bacterias y eucariotas, sin
embargo, también pueden ser parcial o completamente de naturaleza
sintética. Como ejemplo para secuencias de estabilización que se
pueden utilizar en la presente invención, se pueden nombrar las
secuencias no traducidas (UTR) del gen de globi \beta, por ejemplo
del homo sapiens ó xenopus laevis. Otro ejemplo de una
secuencia de estabilización tiene la fórmula general
(C/U)CCAN_{X}CCC(U/A)Py_{X}UC(C/U)CC
contenida en el UTR 3' del ARNm muy estable que codifica
\alpha-globina,
\alpha-(1)-colágeno,
15-lipoxigenasa o
tirosin-hidroxilasa (véase Holcik et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997, 94: 2410 a 2414). Naturalmente,
tales secuencias de estabilización pueden utilizarse por separado o
en combinación entre sí o también en combinación con otras
secuencias de estabilización conocidas por un técnico en la
materia.
Para una mayor estabilización del ARNm modificado
se prefiere, además, que éste tenga, como mínimo, un nucleótido
análogo de procedencia natural. Esto se basa en el hecho de que las
enzimas que desintegran el ARN y existen en las células reconocen
como substrato, de preferencia, los nucleótidos de procedencia
natural. Mediante la introducción de análogos de nucleótidos, por lo
tanto, es posible dificultar la desintegración de ARN, donde la
acción sobre la eficacia de traducción al introducir estos análogos,
especialmente en la zona de codificación del ARNm, puede tener un
efecto positivo o negativo sobre la eficacia de traducción.
En una enumeración, de ningún modo limitativa, se
pueden nombrar como ejemplos de análogos de nucleótidos utilizables
según invención, fosfo-amidatos,
fosfo-tioatos, nucleótidos de péptidos,
metil-fosfonatos, 7-deazaguanosina,
5-metil-citosina e inosina. La
producción de tales análogos es conocida por el técnico en la
materia por ejemplo de las patentes de EE.UU. 4.373.071, EE.UU.
4.401.796, EE.UU. 4.415.732, EE.UU. 4.458.066, EE.UU. 4.500.707,
EE.UU. 4.668.777, EE.UU. 4.973.679, EE.UU. 5.047.524,
EE.UU.5.132.418, EE.UU. 5.153.319, EE.UU. 5.262.530 y 5.700.642.
Según invención tales análogos pueden estar presentes en zonas no
traducidas y traducidas del ARNm modificado.
Además, es posible mejorar la transferencia
efectiva del ARNm modificado a las células a tratar o bien el
organismo a tratar mediante la asociación del ARNm modificado con
una proteína o un péptido catiónico o la unión con los mismos. Aquí
es especialmente efectiva la utilización de protamina como proteína
policatiónica de enlace del ácido nucleico. Además, también es
posible la utilización de otros péptidos o proteínas catiónicos,
como la poli-L-lisina o las
histonas. Este método para la estabilización del ARNm modificado se
encuentra descrito en la
EP-A-1083232 cuyo contenido de
revelación en este sentido queda incluido en su totalidad en la
presente invención. En la utilización de terapia genética de la
composición farmacéutica según invención (o bien al utilizar el ARNm
para la terapia genética o bien al utilizar el ARNm para la
producción de una composición farmacéutica para terapia genética) el
ARNm modificado codifica, como mínimo, un péptido o polipétido
biológicamente activo que en el paciente a tratar, por ejemplo, no
se forma o solamente se forma de manera insuficiente o defectuosa.
Por esta razón, ejemplos del ARNm según invención son polipéptidos
codificados, distrofina, el canal de cloruro que en caso de fibrosis
cística está modificado de forma defectuosa, enzimas que están
ausentes o defectuosas en caso de enfermedades metabólicas como la
fenil-cetonuría, la galactosemia, la homocistinuría,
deficiencia de adenosín-deaminasa etc., enzimas que
participan en la síntesis de neutransmisores como la dopamina, la
norepinefrina y GARA, especialmente la hidroxilasa de tirosina y
decarboxilasa de DOPA, \alpha-antiripsina etc.
Además, la composición farmacéutica se puede utilizar para
proporcionar receptores de superficie de células y moléculas que
enlazan con tales receptores, si el ARNm modificado, contenido en la
composición farmacéutica codifica una proteína o bien un péptido de
este tipo activo biológicamente. Ejemplos de tales proteínas que
actúan extracelularmente o enlazan en receptores de superficie de
célula son, por ejemplo, el activador plasminógeno del tejido (TPA),
hormonas de crecimiento, insulina, interferonas, el factor de
estimulación de colonias de granulocitos-macrófagos
(GM-CFS), eritropietina (EPO) etc. Mediante la
elección de factores adecuados de crecimiento es posible utilizar la
composición farmacéutica de la presente invención, por ejemplo para
la regeneración de tejidos. Así se pueden tratar enfermedades
caracterizadas por una degeneración de los tejidos, como por
ejemplo, enfermedades neurodegenerativas, como el Morbus Alzheimer,
el Morbus Parkinson etc. y otras enfermedades degenerativas, por
ejemplo la artrosis. En estos casos, el ARNm modificado, contenido
especialmente en la composición farmacéutica de la presente
invención, codifica, de preferencia, factores de crecimiento de la
familia de TGF-\beta, donde se han de nombrar
especialmente EGF, FGF, PDGF, BMP, GDNF, BDNF, GDF y factores
neurotróficos como NGF, neutrofina etc.
Otro campo de aplicación de la presente invención
es la vacunación, es decir la utilización del ARNm modificado para
la vacunación o bien la utilización de la composición farmacéutica
como vacuna o bien la utilización del ARNm modificado para la
producción de la composición farmacéutica para la vacunación. La
vacunación se base en la introducción en el organismo, especialmente
en la célula, de un antígeno, en el presente caso de la información
genética para el antígeno en forma del ARNm modificado que codifica
el antígeno. El ARNm modificada, incluida en la composición
farmacéutica se traduce en el antígeno, es decir se exprime el
polipéptido o bien péptido antígeno codificado por el ARNm
modificado debido a lo cual se estimula una reacción inmunológica
dirigida contra este polipéptido o bien péptido antígeno. Con la
vacunación contra un germen patológico, como por ejemplo un virus,
una bacteria o un germen protozoológico se utiliza, por lo tanto un
antígeno de superficie de un germen de este tipo para la vacunación
con ayuda de la composición farmacéutica según invención que
contiene el ARNm modificado que codifica el antígeno de superficie.
En el caso de la utilización como vacuna genética para el
tratamiento del cáncer, la reacción inmunológica se consigue por la
introducción de la información genética para antígenos del tumor,
especialmente proteínas que se exprimen, exclusivamente, en células
cancerosas, administrando una composición farmacéutica según
invención que contiene un ARNm de este tipo que codifica el antígeno
del cáncer. Debido a ello se exprime el o los antígeno(s) del
cáncer en el organismo por lo que se provoca una reacción
inmunológica dirigida efectivamente contra las células
cancerosas
En su utilización como vacuna, la composición
farmacéutica según invención tiene aplicación especialmente para el
tratamiento de enfermedades cancerosas (donde el ARNm modificado
codifica un antígeno de superficie específico de tumores (TSSA), por
ejemplo para el tratamiento de melanomas, carcinomas de colon,
linfoma, sarcoma, carcinoma de pulmón de células pequeñas, blastoma
etc. Ejemplos específicos de antígenos del tumor son, entre otros
707-AP, AFP, ART-4, BAGE,
\beta-catenina/m, Bcr-abl, CAMEL,
CAP-1, CASP-8, CDC27/m, CDK4/m, CEA,
CT, Cyp-B, DAM, BLF2M, ETV6-AML1,
G250, GAGE, GnT-V, Gp100, HAGE,
HER-2/neu,
HLA-A*0201-R170I,
HPV-E7, HSP70-2M,
HAST-2, hTERT 8 ó hTRT), iCE, KIAA0205, LAGE,
LDLR/FUT, MAGE, MART-1/Melan-A,
MC1R, Miosina/m, MUC1, MUM-1, -2, -3,
NASE-A, NY-ESA-1,
p190 minor bcr-abl, Pml/RAR\alpha, PRAME, PSA,
PSM, RAGE, RU1 ó RU2, SAGE, SART-1 ó
SART-3, TEL/AML1, TPI/m, TRP-1,
TRP-2, TRP-2/INT2 y WT1.
La composición farmacéutica según invención se
utiliza, además, contra enfermedades infecciosas (por ejemplo
enfermedades infecciosas virales, como el SIDA (HIV), la hepatitis
A, B ó C, el herpes, herpes Zoster (varicelas), rubéola (virus de
rubéola), fiebre amarilla, dengue etc.
(flavi-virus), la gripe (virus de influenza),
enfermedades infecciosas hemorrágicas (virus Marburg o Ebola),
enfermedades infecciosas bacterianas como la enfermedad del
legionario (legionela), úlceras del estómago (helicobacter) el
cólera (vibrio), infecciones de E.coli, infecciones por
estafilococos, infecciones de salmonela o infecciones de
estreptococos (tétano) o enfermedades infecciones protozoológicas
(malaria, tripanosomiasis africana, leismaniasis, toxoplasmosa, es
decir infecciones por plasmodio, tripanosomas, leismania y
toxoplasmos).
De preferencia se codifican por el ARNm
modificado también en el caso de enfermedades infecciosas los
correspondientes antígenos de superficie con el mayor potencial
antígeno. En los genes mencionados de gérmenes o bien organismos
patógenos, especialmente en el caso de genes virales, esto es
típicamente una forma segregada de un antígeno de superficie.
Además, se utilizan según invención de preferencia ARNm's que
codifican polipéptidos, donde se trata en los polipéptidos de
poliepitopes, por ejemplo de los antígenos arriba mencionados,
especialmente antígenos de superficie de gérmenes o bien organismos
patógenos o células tumorales, de preferencia formas de proteínas
segregadas.
Además, el ARNm modificado según invención puede
contener, aparte del péptido o bien polipéptido antígeno o de efecto
genético terapéutico, también, como mínimo, otro segmento funcional
que codifica, por ejemplo, una citoquina que promociona la reacción
inmunológica (monoquina, linfoquina, interleuquina ó chemoquina,
como IL-1, IL-2,
IL-3, IL-4, IL-5,
IL-6, IL-7, IL-8,
IL-9, IL-10, IL-12,
INF-\alpha, INF-\gamma,
GM-CFS, LT-\alpha o factores de
crecimientos como hGH.
Además, para aumentar la inmunogenicidad, la
composición farmacéutica según invención puede contener uno o varios
adyuvantes. Bajo "adyuvante" se ha de entender aquí cualquier
compuesto químico o biológico que favorece una reacción inmunológica
específica. Dependiendo de los diferentes tipos de adyuvantes pueden
tenerse en cuenta aquí diferentes mecanismos. Por ejemplo, los
compuestos que promocionan una endocitosis por células dendríticas
(DC) en el ARNm modificado incluido en la composición farmacéutica,
forman una primera clase de adyuvantes utilizables. Otros compuestos
que permiten la maduración de las DC, por ejemplo lipopolisacáridos,
TNF-\alpha ó CD40-Ligando, son
otra clase de adyuvantes adecuados. En general, se puede utilizar
como adyuvante cualquier agente que actúa sobre el sistema
inmunológico del tipo de una "señal de peligro" (LPS, GP96,
oligonucleótidos con el motivo CpG) o citoquinas, como
GM-CFS, que permiten reforzar una reacción
inmunológica contra un antígeno codificado por el ARNm modificado
y/o ejercer una influencia precisa sobre esta reacción. Se prefieren
aquí, especialmente, las citoquinas arriba mencionadas. Otros
adyuvantes conocidos son el hidróxido de aluminio, el adyuvante de
Freud así como los péptidos o bien polipéptidos catiónicos de
estabilización arriba mencionados, como la protamina. Además, son
especialmente adecuados los lipopéptidos, como Pam3Cys, para ser
utilizados como adyuvante en la composición farmacéutica de la
presente invención, véase Deres et al, Nature 1989, 342:
561-
564.
564.
La composición farmacéutica según invención
contiene, además del ARNm modificado, un excipiente
farmacéuticamente compatible y/o un vehículo farmacéuticamente
compatibles. Los correspondientes métodos para una formulación
adecuada y la producción de la composición farmacéutica según
invención se encuentran revelados en "Remington's Pharmaceutical
Sciences" (Mack Pub. Co, Easton, PA, 1980) cuyo contenido
completo forma parte integrante de la revelación de la presente
invención. Para la administración parenteral se pueden utilizar como
excipiente, por ejemplo, agua esterilizada, soluciones de sal común
esterilizadas, polialquilenglicoles, naftaleno hidrogenado y,
especialmente, polímeros de lacturo biocompatibles, copolímeros de
lacturo/glicoluro o copolímeros de polioxietileno/polioxipropileno.
Las composiciones según invención pueden contener sustancias de
carga o sustancias como la lactosa, el manitol, sustancias para una
unión covalente de polímeros, como por ejemplo de polietilenglicol
en inhibidores según invención, formación de complejo con iones de
metal o inclusión de materiales en o sobre preparados especiales de
compuestos polímeros, como por ejemplo polilactato, ácido
poliglicólico, hidrogel o en liposomas, microemulsión, micelas,
vesículos unilaminares o multilaminares, fragmentos de eritrocitos o
esferoplastos. Las correspondientes formas de ejecución de las
composiciones se seleccionan en función del comportamiento físico,
por ejemplo con vistas a la solubilidad, la estabilidad, la
biodisponibilidad o la posibilidad de desintegración. Una liberación
controlada o constante del componente del principio activo según
invención en la composición incluye formulaciones sobre la base de
depósitos lipofílicos (por ejemplo ácidos grasos, ceras o aceites).
Dentro del marco de la presente invención también se revelan
recubrimientos de sustancias o composiciones según invención que
contienen tales sustancias, es decir recubrimientos con polímeros
(por ejemplo poloxameros o poloxaminas). Además, las sustancias o
bien composiciones según invención pueden tener recubrimientos de
protección, por ejemplo inhibidores de proteasa o reforzadores de la
permeabilidad. Los excipientes preferidos son, de forma típica,
sustancias acuosas de excipiente, utilizándose agua para la
inyección (WFI) o agua, regulada con fosfato, citrato o acetato
etc., y ajustándose el pH de forma típica en 5,0 a 8,0, de
preferencia 6,0 z 7,0. El excipiente o bien el vehículo contiene,
además y de preferencia, ingredientes de sal, como por ejemplo
cloruro sódico, cloruro potásico u otros componentes que convierten
la solución, por ejemplo, en isotónica. Además, el excipiente o bien
el vehículo puede contener, aparte de los ingredientes arriba
indicados, componentes como albúmina de suero humano (HSA),
polisorbato 80, azúcar o aminoácidos.
La forma de administración y la dosificación de
la composición farmacéutica según invención dependen de la
enfermedad a tratar y de su estado de gravedad, como también del
peso corporal, de la edad y del sexo del paciente.
La concentración del ARNm modificado en tales
formulaciones puede variar, por lo tanto, en un amplio rango de 1
\mug hasta 100 mg/ml. La composición farmacéutica según invención
se administra al paciente, de preferencia de forma parenteral, por
ejemplo intravenosa, intra-arterial, subcutánea,
intramuscular. También es posible administrar la composición
farmacéutica de forma tópica u oral.
Así se proporciona según invención también un
procedimiento para el tratamiento de las enfermedades arriba
indicadas o bien un procedimiento de vacunación para prevenir las
enfermedades arriba mencionadas, procedimiento que comprende la
administración de la composición farmacéutica según invención a un
paciente, especialmente un ser humano. Además, también se
proporciona un procedimiento que sirve para averiguar la secuencia
modificada del ARNm contenido en la composición farmacéutica según
invención. Aquí se realiza, según invención, la adaptación de las
secuencias de ARN con dos metas diferentes de optimización. Por un
lado, uno con un contenido de G/C lo más alto posible, por el otro
lado, teniendo en cuenta lo mejor posible la frecuencia de los
ARNt's según Codon Usage. En el primer paso del procedimiento se
realiza una traducción virtual de una secuencia cualquiera de ARN (o
ADN) con el fin de generar la correspondiente secuencia de
aminoácido. Partiendo de la secuencia de aminoácido se realiza una
traducción virtual inversa que proporciona posibilidades para los
correspondientes codones debido al código genético degenerado. Según
la optimización o bien modificación requerida, se utilizan para la
selección del codón apropiado listas correspondientes de selección y
algoritmos de optimización. La realización de los algoritmos tiene
lugar, de forma típica, con ayuda de un software apropiado en una
computadora. Así se obtiene la secuencia optimizada de ARNm y puede
editarse, por ejemplo, con ayuda de un correspondiente dispositivo
de visualización y compararse con la secuencia original (del tipo
salvaje). Lo mismo es aplicable también para la frecuencia de los
distintos nucleótidos. Las modificaciones frente a la secuencia
original de nucleótidos se destacan aquí de preferencia. Además, se
dan entrada por lectura según un tipo de ejecución preferido a
secuencias estables conocidas en la naturaleza, que pueden
proporcionar la base para un ARN estabilizado según motivos
naturales de secuencias. También se puede prever un análisis de
estructura secundario que puede analizar, con ayuda de cálculos de
la estructura, características de estabilización y de
desestabilización o bien campos del ARN.
Las figuras muestran:
La figura 1 muestra secuencias del tipo salvaje y
modificadas para la proteína de matriz de la influenza. Figura 1A
muestra el gen del tipo salvaje y figura 1B muestra la secuencia de
aminoácido derivada del mismo (código de una letra). Figura 1C
muestra una secuencia de gen que codifica la proteína de matriz de
la influenza, secuencia de gen cuyo contenido de G/C está
incrementado frente a la secuencia del tipo salvaje. Figura 1D
muestra la secuencia de un gen que codifica una forma segregada de
la proteína de matriz de la influenza (incluida una secuencia de
señal terminal de N) donde el contenido de G/C de la secuencia
frente a la secuencia del tipo salvaje está incrementado. Figura 1E
muestra un ARNm que codifica la proteína de matriz de la influenza,
ARNm que contiene secuencias de estabilización si se compara con el
ARNm del tipo salvaje. Figura 1F muestra un ARNm que codifica la
proteína de matriz de la influenza, ARNm que tiene, además de las
secuencias de estabilización, un mayor contenido de G/C.
La figura 1G muestra también un ARNm modificado
que codifica la forma segregada de la proteína de matriz de la
influenza y tiene, si se compara con el tipo salvaje, secuencias de
estabilización y un mayor contenido de GC. En la figura 1A y figura
1C a 1C se han destacado en negrilla los codones de inicio y de
detención. Los nucleótidos modificados frente a la secuencia del
tipo salvaje de la figura 1A están representados en las figuras 1C a
1G con mayúsculas.
La figura 2 muestra secuencias del tipo salvaje y
secuencias modificadas según invención que codifican el antígeno del
tumor MAGE1.
La figura 2A muestra la secuencia del gen del
tipo salvaje y figura 2B la secuencia de aminoácido derivada del
mismo (código de tres letras). Figura 2C muestra un ARNm modificado
que codifica el MAGE1, cuyo contenido de G/C está incrementado
frente al tipo salvaje. Figura 2D muestra la secuencia de un ARNm
modificado que codifica el MAGE1, ARNm en el que se optimizó la
utilización del codón en cuando a la codificación de ARNt que se
presentan lo más frecuentemente posible en la célula. Los codones de
inicio y detención están marcados en negrilla.
Los siguientes ejemplos explican más en detalle
la presente invención sin limitarla.
Como tipo de ejecución a modo de ejemplo del
procedimiento para averiguar la secuencia de un ARNm modificado
según invención se preparó un programa de computador que modifica la
secuencia de nucleótidos de un ARNm cualquiera con ayuda del código
genético o bien su naturaleza degenerativa, de manera que resulta un
contenido máximo de G/C en relación con la utilización de codones
que codifican ARNt's que se presentan lo más frecuentemente posible
en la célula, donde la secuencia de aminoácido codificada por el
ARNm modificado es idéntica frente a la secuencia sin modificar.
Alternativamente, también se puede modificar solamente el contenido
de G/C o solamente la utilización de codones frente a la secuencia
original.
El código fuente en Visual BAsic 6,0 (entorno de
desarrollo utilizado: Microsofot Visual Studio Enterprise, 6,0 con
Servicepack 3) está indicado en el anexo.
Con ayuda del programa de computador del ejemplo
1 se preparó a partir de E.coli un constructo de ARN con una
secuencia del lac-Z-gen optimizada
en cuanto a la estabilización y la eficacia de traducción. Así se
pudo conseguir un contenido de G/C del 69% (si se compara con la
secuencia del tipo salvaje del 51%; véase Kalnins et al.,
EMBOJ. 1983, 2(4): 593-597). Por la síntesis
de oligonucleótidos solapados que tienen la secuencia modificada, se
obtuvo la secuencia optimizada según procedimientos conocidos en la
técnica actual. Los oligonucleótidos terminales tenían las
siguientes interfaces de restricción: En el extremo 5' un inferfaz
EcoRV- así como en el extremo 3' un interfaz Bg/II.
Mediante la digestión con Eco/RVBg/II se transforma la
secuencia modificada 1acZ en el plásmido pT7Ts (número de acceso del
banco de genes U 26404; véase Lai et al., s.o.). pT7Ts
contiene como regiones no traducidas secuencias del gen de globina
\beta de Xenopus levis en cada caso en 5' y 3'. El plásmido
se cortó antes de introducir la secuencia modificada de 1acZ con las
enzimas de restricción mencionadas.
El constructo de
pT7Ts-lac-Z se multiplicó en
bacterias y se purifico por extracción de
fenol-cloroformo. Se transcribieron in vitro
2 \mug del constructo se por procedimientos conocidos por el
técnico en la materia debido a lo cual se obtuvo el ARNm
modificado.
Con ayuda del programa de computador según
invención del ejemplo 1, se optimizó el gen para la proteína de
matriz de la influenza (secuencia del tipo salvaje véase figura 1A,
secuencia de aminoácido derivada figura 1B). Con ello se obtuvo la
variante de secuencia rica en G/C representada en la figura 1C.
También se averiguó una secuencia rica en G/C que codifica la forma
segregada de la proteína de matriz de la influenza y codifica una
secuencia de señal terminal de N (véase figura 1D). La forma
segregada de la proteína de matriz de la influenza tiene la ventaja
de que tiene una mayor inmunogenicidad si se compara con la forma no
segregada.
Partiendo de las secuencias optimizadas se
diseñaron las moléculas de ARNm correspondientes. El ARNm optimizado
en cuanto al contenido de G/C y la utilización de codones para la
proteína de matriz de la influenza se equipó adicionalmente con
secuencias de estabilización en el sitio de 5' y 3' (las secuencias
de estabilización provienen de los UTRs de 5' o bien 3' del ARNm de
\beta-globina de Xenupus laevis; véase
vector pT7Ts en Lai et al., s.o.) (véase figura 1E y 1F).
Igualmente también se optimizó la secuencia en la zona traducida del
ARNm que codifica la forma segregada de la proteína de matriz de la
influenza y se equipó con las secuencias de estabilización
mencionadas (véase figura 1G).
Con ayuda del programa de computador del ejemplo
1 se modificó el ARNm que codifica el antígeno de tumor MAG1. Así se
averiguó la secuencia representada en la figura 2C que tiene un
contenido de G/C mayor (351 G, 291 C) en un 24% si se compara con la
secuencia de tipo salvaje (275 G, 244 G). Además, se mejoró la
secuencia del tipo salvaje por utilización alternativa de codones en
cuanto a la eficacia de traducción debido a la codificación de
ARNt's que existen con mayor frecuencia en la célula (véase Figura
2D). Mediante la utilización alternativa de codones también se
incrementó el contenido de G/C en un 24%.
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(Anexo pasa a página
siguiente)
<110> Von der Muelbe, Florian
\hskip1cmHoerr, Igmar (solamente EE.UU.)
\hskip1cmPascolo, Steve (solamente EE.UU:)
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<120> Composición farmacéutica que contiene
un ARNm optimizado estabilizado y que para la traducción en sus
campos de codificación.
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<130> -CU01P003WO
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\vskip0.400000\baselineskip
<140> PCT/EP02/06180
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
2002-06-05
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 774
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<213> Influenza virus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Influenza-Matrix: Gen
del tipo salvaje (para comparación)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Códicos de inicio: atg (Nucleótidos
11 a 13), codón de parada:
\hskip1cmtga (Nucleótidos 767 a 769)
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
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<210> 2
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<211> 252
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Influenza virus
\newpage
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<400> 2
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
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<211> 775
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<212> DNA
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<213> Artificial Sequence
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Description of Artificial
Sequence:
\hskip1cmInfluenza-Matrix: Gen con un mayor contenido de G/C
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
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<223> Codón de inicio: atg (Nucleótidos 11
a 13), codón de parada:
\hskip1cmtag (Nucleótidos 767 a 769)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
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<210> 4
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<211> 844
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<212> DNA
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<220>
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<223> Description of Artificial
Sequence:
\hskip1cmInfluenza-Matrix: Gen para forma segregada (con secuencia de señal N-terminal) con un mayor contenido de G/C
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Codón de inicio: atg (Nucleótidos 11
a 13), codón de parada
\hskip1cmtga (Nucleótidos 836 a 838)
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<400> 4
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\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 5
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<211> 942
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<212> RNA
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<213> Artificial Sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Description of Artificial
Sequence:
\hskip1cmInfluenza-Matrix: ARNm con secuencias de estabilización
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Las secuencias de estabilización
provienen de los UTRs de 5' o bien 3' del ARNm de
\beta-globina del Xenopus laevis
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Codón de inicio: aug (Nucleótidos 56
a 58), Codón de parada:
\hskip1cmuga (Nucleótidos 812 a 814)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
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<210> 6
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<211> 942
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<212> RNA
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<213> Artificial Sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Description of Artificial
Sequence:
\hskip1cmInfluenza-Matrix: ARNm con un mayor contenido de G/C y secuencias de estabilización
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Las secuencias de estabilización
provienen de los UTRs de 5' o bien 3' del ARNm de
\beta-globina del Xenopus laevis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Codón de inicio: aug (Nucleótidos 56
a 58), Codón de parada:
\hskip1cmuga (Nucleótidos 812 a 814)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1011
\vskip0.400000\baselineskip
<212> RNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial Sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Description of Artificial
Sequence:
\hskip1cmInfluenza-Matrix: para ARNM con mayor contenido de G/C y secuencias de estabilización que codifica la forma segregada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Codón de inicio: aug (Nucleótidos 56
a 58), Codón de parada:
\hskip1cmuga (Nucleótidos 881 a 883)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 940
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> MAGE1: Gen del tipo salvaje (para
comparación)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Codón de inicio: atg (Nucleótidos 5 a
7), Codón de parada:
\hskip1cmtga (Nucleótidos 932 a 934)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 308
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Tumorantigen MAGE1: secuencia de
proteínas
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 939
\vskip0.400000\baselineskip
<212> RNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial Sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Description of Artificial Sequence:
MAGE1: ARNm
\hskip1cmcon un mayor contenido de G/C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Codón de inicio: aug (Nucleótidos 1 a
3), codón de parada:
\hskip1cmuga (Nucleótidos 937 a 939)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 939
\vskip0.400000\baselineskip
<212> RNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial Sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Description of Artificial Sequence:
MAGE1: ARNm
\hskip1cmcon utilización alternativa de codón.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Codón de inicio: aug (Nucleótidos 1 a
3), codón de parada:
\hskip1cmuga (Nucleótidos 937 a 939)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> RNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial Sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Description of Artificial Sequence:
Un motivo de secuencia reconocible para una endonucleasa, motivo de
secuencia que está contenido en el segmento de UTR 3' del gen que
codifica el receptor de transferina (p. 9 de la descripción)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaacaag
\hfill7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> RNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial Sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Description of Artificial Sequence:
Secuencia Kozak, sitio de enlace de ribosomas (p. 11 de la
descripción)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgccgccacca ugg
\hfill13
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (21)
Hide Dependent
translated from
Claims (21)
Hide Dependent
translated from
1. ARNm modificado que codifica, como mínimo, un
péptido o polipéptido biológicamente efectivo o antígeno,
caracterizado porque el contenido de G/C de la zona del ARNm
que codifica el péptido o polipéptido está modificado de tal manera
que resulta un contenido máximo de G/C en conexión con los codones
que codifican ARNt's relativamente frecuentes y porque la secuencia
codificada de aminoácidos permanece sin modificar frente al tipo
salvaje.
2. ARNm modificado según la reivindicación 1,
caracterizado porque la zona del ARNM que codifica el péptido
o polipéptido se encuentra modificado frente a la zona del ARNm del
tipo salvaje que codifica el péptido o polipéptido que, como mínimo,
un codón de la secuencia del tipo salvaje que codifica un ARNt
relativamente raro en la célula se sustituye por un codón que
codifica un ARNt relativamente frecuente en la célula que lleva el
mismo aminoácido que el ARNt relativamente raro.
3. ARNm modificado según la reivindicación 1 ó 2,
caracterizado porque todos los codones de la secuencia del
tipo salvaje, que codifican un ARNt relativamente raro en la célula,
se han sustituido en cada caso por un codón que codifica un ARNt
relativamente frecuente en la célula que lleva en cada caso el mismo
aminoácido que el ARNt relativamente raro.
4. ARNm modificado según una de las
reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la zona que
codifica el péptido o polipéptido y/o la zona no traducida de 5' y/o
3' del ARNm modificado están modificados frente al ARNm del tipo
salvaje de tal manera que no tiene elementos de secuencia ricos en
AU o no tiene elementos de secuencia que causan la desintegración
enzimática in vivo.
5. ARNm modificado según una de las
reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el modificado
tiene una IRES y/o una secuencia de estabilización de 5' y/o una
secuencia de estabilización de 3'.
6. ARNm modificado según una de las
reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque el ARNm
modificado tiene, como mínimo, un nucleótido análogo de procedencia
natural.
7. ARNm modificado según la reivindicación 6,
caracterizado porque el análogo ha sido seleccionado del
grupo compuesto por fosfortioatos, fosforamidatos,
peptidnucleótidos, metilfosfonatos,
7-deazaguanosina, 5-metilcitosina e
inosina.
8. ARNm modificado según una de las
reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque el polipéptido
ha sido seleccionado del grupo compuesto por factores de
crecimiento, antígenos de tumores, antígenos de virus, bacterias y
protozoes.
9. ARNm modificado según la reivindicación 8,
caracterizado porque el antígeno viral, bacterial o
protozoológico provine de una proteína segregada.
10. ARNm modificado según la reivindicación 8 ó
9, caracterizado porque el polipéptido es un poliepitopo de
antígenos de tumores, virales, bacteriales o protozoológicos.
11. ARNm modificado según una de las
reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque el ARNm
codifica, además, como mínimo, una citoquina.
12. Composición farmacéutica caracterizada
porque contiene el ARNm modificado según una de las reivindicaciones
1 a 11 en unión con un excipiente y/o vehículo farmacéuticamente
compatible.
13. Composición farmacéutica según la
reivindicación 12, caracterizada porque contiene, como
mínimo, un adyuvante que estimula la reacción inmunológica.
14. Composición farmacéutica según una de las
reivindicaciones 12 ó 13, caracterizada porque contiene, como
mínimo, además una citoquina.
15. Utilización de una composición farmacéutica
según una de las reivindicaciones 12 a 14 o un ARNm modificado según
una de las reivindicaciones 1 a 11 para la preparación de una vacuna
para la vacunación contra enfermedades infecciosas y cáncer.
16. Utilización de una composición farmacéutica
según una de las reivindicaciones 12 a 14 para la preparación de un
medicamento para el tratamiento de melanomas, carcinomas del colón,
linfomas, carcomas ó blastomas.
17. Sustancia terapéutica genética
caracterizada porque contiene una composición farmacéutica
según una de las reivindicaciones 12 a 14 o un ARNm modificado según
una de las reivindicaciones 1 a 11.
18. Utilización de una composición farmacéutica
según una de las reivindicaciones 12 a 14 para la preparación de un
medicamento para el tratamiento de enfermedades degenerativas,
especialmente enfermedades neurodegenerativas.
19. Utilización de una composición farmacéutica
según una de las reivindicaciones 12 a 14 para la preparación de una
vacuna para la vacunación contra enfermedades infecciosas virales,
bacteriales o protozoológicas.
20. Utilización de una composición farmacéutica
según una de las reivindicaciones 12 a 14 para la preparación de una
vacuna para la vacunación contra el SIDA, la hepatitis A, B ó C, la
fiebre amarilla, la gripe, infecciones por salmonela o
estreptococos.
21. Procedimiento para la optimización del
contenido de G/C de un ARNm del tipo salvaje para la producción de
un ARNm modificado según una de las reivindicaciones 1 a 11,
caracterizado porque (1) se realiza una traducción virtual de
una secuencia de ARN del tipo salvaje para generar la
correspondiente secuencia de aminoácido, (ii) se realiza una
traducción virtual inversa para conseguir posibilidades de elección
para los correspondientes codones, y (iii) entre las posibilidades
de elección se seleccionan aquellos codones con un contenido máximo
de G/C que codifican ARNt' relativamente frecuentes.