CN104024328A - 用于体内核酸递送的聚(乙烯基酯)聚合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及膜活性的聚(乙烯基酯)聚合物，和用于体内递送RNA干扰(RNAi)多核苷酸至细胞的组合物。将RNAi多核苷酸与所述聚(乙烯基酯)聚合物偶联，并且所述聚合物经可逆修饰以能够进行体内靶向递送。所述聚(乙烯基酯)的膜活性将所述RNAi多核苷酸从所述细胞外移动至所述细胞内。可逆修饰提供生理应答性。

Description

用于体内核酸递送的聚(乙烯基酯)聚合物
背景技术
将多核苷酸和其它基本不能穿透细胞膜的化合物递送到活细胞受到细胞复杂膜系统的高度限制。反义、RNAi和基因治疗中使用的药物是相对高亲水性的聚合物，且通常带较高负电荷。这些物理特征均阻止其直接扩散穿过细胞膜。出于该原因，多核苷酸递送的主要障碍是将多核苷酸递送穿过细胞膜到达细胞质或细胞核。
一种已经用于体内递送小核酸的方法是使所述核酸与小靶向分子或脂质或固醇结合。虽然已在这些偶联物中观察到一些递送和活性，但是就实际应用而言，这些方法需要的核酸剂量非常大。
已开发多种转染试剂，其能实现在体外将多核苷酸相当有效地递送至细胞。然而，采用这些相同转染试剂在体内递送多核苷酸很复杂，并且由于体内毒性、血清相互作用和弱靶向而变得无效。体外作用良好的转染试剂，阳离子聚合物和脂质，通常形成大的静电颗粒并使细胞膜失稳。体外转染试剂的正电荷有助于通过电荷之间(静电)的相互作用与核酸结合，因此形成核酸/转染试剂复合物。正电荷也有利于载剂与细胞非特异性结合以及膜融合、去稳定化或破坏。膜的去稳定化有利于递送基本不能渗透细胞膜的多核苷酸穿过细胞膜。虽然这些特性有利于核酸体外转移，但它们会造成体内毒性和靶向失效。阳离子电荷导致与血清组分相互作用，这造成多核苷酸转染试剂相互作用的不稳定和较低的生物利用度和靶向。在体外能够有效的转染试剂的膜活性在体内常导致毒性。
就体内递送而言，所述载剂(核酸和相关联的递送剂)应较小，直径小于100nm，且优选低于50nm。甚至更小的复合物(小于20nm或小于10nm)会更加有用。大于100nm的递送载剂在体内很难到达血管细胞之外的细胞。由静电相互作用形成的复合物在暴露于生理盐浓度或血清组分时倾向于聚集或瓦解。此外，体内递送载剂上的阳离子电荷导致不良血清相互作用并因此导致生物利用度差。有趣的是，高的负电荷还可通过干扰靶向所需的相互作用来抑制体内递送。因此，体内分布和靶向需要接近中性的载剂。若不细致调控，膜的破坏或失稳活性在体内利用时有毒。采用核酸递送平衡载剂毒性在体外比在体内更容易实现。
Rozema等在美国专利公开20040162260示范了一种通过将伯胺可逆转化成羧基基团对(2-丙酸-3-甲基马来酸酐的β羧基和γ羧基)来可逆调节膜活化多胺的膜干扰活性的方法。Rozema等(Bioconjugate Chem.2003,14,51-57)报道了β羧基不变现完全明显的负电荷且其自身不能抑制膜活性。经报道，就有效膜活性抑制而言，添加γ羧基基团是必需的。然而，因为所述载剂带有较高负电荷，且核酸和经修饰的聚合物都具有高负电荷密度，所以就体内递送而言，该系统无效。
通过用中性亲水靶向基团(半乳糖)和位阻稳定基团(PEG)替代2-丙酸-3-甲基马来酸酐的γ羧基，Rozema等能够保留全部水溶性和膜活性的可逆抑制，同时加入有效的的体内肝实质细胞靶向(美国专利公开20080152661)。
我们在此描述新型膜活化聚合物，以及用所述聚合物制备的组合物，其用于在体内将核酸递送至细胞。这些新型聚合物具有优于前述那些的改进的治疗潜力。
发明内容
在一个优选实施方式中，本发明的特征在于两性阳离子聚(乙烯基酯)无规共聚物，所述两性阳离子聚(乙烯基酯)无规共聚物特别适合用于在体内递送多核苷酸至细胞。本发明的两性阳离子聚(乙烯基酯)无规共聚物包含多种含胺乙烯基酯单体和多种第一疏水性乙烯基酯单体。所述含胺单体包含伯胺侧基。所述疏水性单体包含具有2～20个碳原子的疏水性侧基，所述疏水性侧基选自下组：烃基、烷基、烯基、炔基、烷氧基烷基、芳香基和芳基。所述聚合物还可包含多种第二含胺乙烯基酯单体或多种第二疏水性乙烯基酯单体。第二含胺乙烯基酯单体包含胺侧基，所述胺侧基选自下组：伯胺、仲胺、叔胺、季胺、经保护的胺、氮杂环、醛亚胺、酰肼、腙和咪唑。本发明的聚(乙烯基酯)无规共聚物除了是两性的以外，还具有膜活化性。优选的聚(乙烯基酯)无规共聚物包含含伯胺单体和丁酰乙烯基酯单体。本发明的聚(乙烯基酯)无规共聚物可由两种、三种或四种不同单体合成。所述单体可选自下组：经保护的乙烯基胺酯（amine vinyl ester）、咪唑乙烯基酯、烷基乙烯基酯、烯基乙烯基酯、炔基乙烯基酯、芳香族乙烯基酯和芳基乙烯基酯。经保护的乙烯基胺酯单体包括，但不限于：含有叔丁氧基羰基(Boc)保护的胺的乙烯基酯。经保护的伯胺单体用烷基乙烯基酯单体共聚合。然后，在聚合反应之后去除所述胺保护基团以形成水溶性、两亲性的无规共聚物。脂族疏水性基团可以是线性、分支或环状的，并且可包含一种或多种杂原子取代。
在一个优选实施方式中，聚(乙烯基酯)无规共聚物通过可逆加成-断裂链转移(RAFT)聚合来合成。在一个实施方式中，所述RAFT聚合反应采用丙二酸N,N-二苯基二硫代氨基甲酸酯(MDP-DTC)进行。采用RAFT聚合，并可任选地分馏，可使聚合物的多分散性小于1.5，或更优选地小于1.4或1.3。
就体内递送多核苷酸至细胞而言，所述两亲性聚(乙烯基酯)无规共聚物经可逆修饰。可逆修饰包括使如本文定义的多种掩蔽剂通过多个可逆生理学不稳定共价键结合聚合物伯胺。可逆的生理学不稳定性共价键可选自下组：pH不稳定性键和酶可切割键。如本文所用，可逆修饰指在连接所述掩蔽剂和所述聚合物的生理学不稳定共价键被切割后，聚合物伯胺恢复。在一个优选实施方式中，通过掩蔽剂的可逆结合来修饰多于50%、多于60%、多于70%、多于80%或多于90%的聚合物伯胺。掩蔽剂可选自下组：位阻稳定剂和靶向基团。所述掩蔽剂改善体内生物分散性或所述聚合物的靶向或聚合物-多核苷酸偶联物。掩蔽剂可抑制所述聚合物与血清成分或非靶细胞的非特异性相互作用。掩蔽剂可降低所述聚合物或聚合物-多核苷酸偶联物的聚集。包含靶向基团的掩蔽剂通过将所述偶联系统靶向至细胞表面受体来增强细胞特异性靶向或细胞内化。可在所述聚合物与多核苷酸偶联之前或之后使所述掩蔽剂与所述聚合物偶联。
在另一个优选实施方式中，多核苷酸通过第二生理学不稳定共价键与本发明的聚合物连接。一种或多种多核苷酸可通过所述第二生理学不稳定共价键连接所述聚合物。第一不稳定键（连接掩蔽剂和聚合物的不稳定键）和第二不稳定键（连接多核苷酸和聚合物的不稳定键）可在相同或相似的条件下被切割，或者其可在不同的条件下被切割，即，其可以是正交不稳定键。所述多核苷酸可选自下组：DNA、RNA、阻断性多核苷酸、寡核苷酸、RNA干扰多核苷酸、siRNA、微小RNA、mRNA和shRNA。第二生理学不稳定共价键可选自下组：pH不稳定键、酶可切割键、二硫键和核酸酯键。在一个优选的实施方式中，描述一种组合物，所述组合物包括：两亲性聚(乙烯基酯)无规共聚物，其与a)一种或多种靶向基团和或位阻稳定剂通过可逆生理学不稳定共价键共价连接；和b)一种或多种多核苷酸通过正交第二生理学不稳定共价键共价连接。给予哺乳动物药学上可接受的运载体或稀释剂内的所述多核苷酸-聚合物偶联物。
在一个优选实施方式中，描述了用于将膜可穿透性分子递送至细胞并在所述细胞内释放所述分子的聚合物偶联系统。所述聚合物偶联系统包含与本发明的经可逆修饰的聚(乙烯基酯)可逆连接的膜可穿透性分子。优选的膜可穿透分子包括多核苷酸。优选的多核苷酸包括RNA干扰多核苷酸。优选的RNA干扰多核苷酸包括siRNA或miRNA。给予哺乳动物药学上可接受的运载体或稀释剂内的所述聚合物或多核苷酸-聚合物偶联物。
在另一个优选实施方式中，本发明的特点是用于体内递送RNA干扰多核苷酸至肝脏细胞的组合物，所述组合物包括：两亲性聚(乙烯基酯)无规共聚物，其与一种或多种靶向基团和/或位阻稳定剂通过可逆生理学不稳定共价键共价连接，并且与和多核苷酸靶向基团偶联的RNA干扰多核苷酸(多核苷酸偶联物)共价连接。优选的多核苷酸靶向基团是含有至少20个碳原子的疏水基团。另一个优选的多核苷酸靶向基团是三价半乳糖胺。分别合成所述聚(乙烯基酯)和所述多核苷酸-偶联物，并且可在分开的容器或单个容器中提供。在该组合物中，所述多核苷酸不与所述聚合物偶联。给予哺乳动物药学上可接受的运载体或稀释剂内的经修饰的聚合物和多核苷酸-偶联物。在一个实施方式中，所述递送聚合物和RNAi多核苷酸偶联物在给予所述哺乳动物前可在溶液中合并。在另一实施方式中，所述递送聚合物和所述RNAi多核苷酸偶联物可在单独的溶液中共给予所述哺乳动物。在另一实施方式中，所述递送聚合物和所述RNAi多核苷酸偶联物可依次给予所述哺乳动物。对于依次给予，所述递送聚合物可在给予所述RNAi多核苷酸偶联物之前给予。或者，对于依次给予，所述RNAi多核苷酸偶联物可在给予所述递送聚合物之前给予。
在另一个实施方式中，所述两亲性聚(乙烯基酯)无规共聚物适合用于体外递送多核苷酸至哺乳动物细胞。就体外细胞递送而言，所述两亲性聚(乙烯基酯)无规共聚物可如上所述经可逆修饰，或不经可逆修饰使用。其还可与脂质或其它聚合物结合。
附图说明
图1.显示不同两亲性聚(乙烯基酯)无规共聚物的结构的示意图，其中：
N是具有-NH2形式的伯胺，
N'是具有-NR5H、-NR5R6或-NR5R6R7形式(其中R5、R6和R7独立地选自–CH3和-CH2-CH3)的仲胺、叔胺或季胺，或者N′可以是氮杂环、醛亚胺、酰肼、腙或咪唑，
Y和Y'是接头基团，
R和R'是独立地具有2-20个碳原子的疏水基团，
R1、R2、R3和R4独立地选自氢(-H)和甲基(-CH3)，
m和p是大于零(0)的整数，
n和q是大于或等于零(0)的整数，且
(m+n)/(p+q)的比是1-9。
图2.显示不同二肽掩蔽剂结构的示意图。
具体实施方式
本发明涉及用于递送生物活性物质(例如核酸、肽和蛋白质)的两亲性聚(乙烯基酯)无规共聚物及其偶联系统。将核酸和其它基本不能穿透细胞膜的化合物递送到活细胞受到细胞复杂膜系统的限制。就体内递送而言，所述两亲性聚(乙烯基酯)无规共聚物经掩蔽剂通过生理学不稳定连接共价结合来可逆修饰。
在一个实施方式中，本发明涉及式(I)的膜活性聚(乙烯基酯)无规共聚物：
其中：
N是具有-NH2形式的伯胺，
N'是具有-NR5H、-NR5R6或-NR5R6R7形式(其中R5、R6和R7独立地选自–CH3和-CH2-CH3)的仲胺、叔胺或季胺，或者N′可以是氮杂环、醛亚胺、酰肼、腙或咪唑，
Y和Y'是接头基团，
R和R'是如本文定义的独立具有2-20个碳原子的疏水基团或烷氧基乙基基团，–(CH2)l-O-CH2-CH3，其中l是2、3或4(优选的烷氧基乙基基团是2-乙氧基乙基基团、–(CH2)2-O-CH2-CH3)，
R1、R2、R3和R4独立地选自氢(-H)和甲基(-CH3)，
m和p是大于零(0)的整数，
n和q是大于或等于零(0)的整数，且
(m+n)/(p+q)的比例是1-9(50-90%的胺)，且更优选是1.5-4(60-80%的胺)。
优选的R基团是具有2-6个碳原子的疏水基团。
接头基团Y和Y'是不带电的，并且通过1-24个碳原子使氮连接乙烯基酯，所述碳原子中的一个或多个可被杂原子取代。在一个优选实施方式中，Y和Y'独立地包含1-12个碳原子，所述碳原子中的一个或多个可被杂原子取代。在一个实施方式中，Y和Y'独立地选自-(CH2)x-和-(CH2-CH2-O)z-(CH2)x-，其中x和z独立地是1、2、3、4、5或6。
在一个实施方式中，本发明涉及式(Ia)的乙烯基酯无规共聚物：
其中：
N是具有-NH2形式的伯胺，
Y是如上所述的接头基团，
R是如本文定义的具有2-6个碳原子的疏水基团或烷氧基乙基基团，–(CH2)l-O-CH2-CH3，其中l是2、3或4(优选2-乙氧基乙基)，
R1和R3独立地选自氢(-H)和甲基(-CH3)，
m是大于零(0)的整数，
p是大于零(0)的整数，
m/p的比例是1-9(50-90%的胺)且更优选1.5-4(60-80%的胺)。
本发明所述的聚合物一般可按本文所述，并使用有机化学或药物化学领域普通技术人员已知的方法获得。所述聚合物由含疏水基团的乙烯基酯单体和经保护的含胺乙烯基酯单体聚合。形成本发明聚合物的聚合反应优选使用可逆加成-断裂链转移(RAFT)聚合来进行。在一个实施方式中，所述RAFT聚合反应采用丙二酸N,N-二苯基二硫代氨基甲酸酯(MDP-DTC)进行。聚合物的合成使用经保护的胺单体实行。胺的去保护产生式(I)或(Ia)的含胺聚合物，其中N是-NH2。作为一个试剂，式(Ia)的化合物(其中Y是-(CH2)3-，R1是氢，R3是氢，且R是-(CH2)3-CH3)可以使用化合物3和8作为起始材料来获得。
乙烯基酯单体3和8的合成如下所述。
可逆加成-断裂链转移(RAFT)聚合是一种受控的基团聚合形式。更具体地，RAFT是一种活性聚合类型，其涉及可逆链转移剂存在下的常规基团聚合。RAFT聚合允许合成广泛的聚合物，所示聚合物带有受控的分子量和低多分散性(PDI)(就多数单体而言是1.05～1.6)。本发明的聚(乙烯基酯)的多分散性优选低于1.5且更优选低于1.4或1.3。可采用分馏以进一步降低多分散性。RAFT聚合在以下文献中有描述：WO9504026、WO9801478、WO9905099、WO9931144、WO10083569、美国专利6,291,620、美国专利6,376,626、美国专利6,642,318和美国专利6,747,111。分子量大于20,000且多分散性低的聚合物也能采用RAFT聚合，并且优选用于体内递送。为使大分子通过血液有效循环，并且不被肾脏清除，一般优选分子量大于30,000–50,000。
本发明的未经修饰的两亲性聚(乙烯基酯)无规共聚物的基本特征是：它们具有膜活性；即，它们能够破坏质膜或溶酶体/内吞体膜。然而，在体内给予所述聚合物时，膜活性可导致毒性。多胺还容易与许多阴离子组分体内相互作用，导致不合需要的生物分布。因此，就体内应用而言，对所述多胺的膜活性采用可逆抑制。该抑制通过掩蔽剂与聚合物的胺的可逆生理学不稳定结合以形成可逆掩蔽的膜活性多(乙烯基酯)(即，本文也称作递送聚合物)来完成。除了抑制膜活性外，所述掩蔽剂使聚合物免于非特异相互作用，减少血清相互作用，增加循环时间并提供细胞特异性相互作用(即靶向)。可逆修饰方法还降低正电荷以形成电荷接近中性的聚合物。如本文所用，不稳定指所述掩蔽剂和所述聚合物的连接在一定条件下易于被剪切，所述条件通常存在于生理条件下。如本文所用，可逆指连接所述掩蔽剂和所述聚合物的键的切割导致所述聚合物的胺恢复至修饰前状态，即，伯胺。
优选的可逆生理学不稳定连接包括：生理学不稳定的共价键或在哺乳动物细胞内条件下可被切割的共价键。优选的不稳定共价键包括pH不稳定键。优选的pH不稳定生理学不稳定连接包括马来酰胺酸。其它优选的生理学不稳定连接包括酶可切割连接。优选的酶可切割连接是肽(酰胺)键。优选的肽连接包括如美国专利申请13/326,433所述的二肽-酰胺苄基-碳酸酯，其通过引用纳入本文。
掩蔽剂的基本特征总体为：抑制聚合物的膜活性、使聚合物免于非特异相互作用(降低血清相互作用、增加循环时间)和提供体内细胞靶向。本发明的膜活性聚(乙烯基酯)在未经修饰(未掩蔽)状态下具有膜活性，但在经修饰(掩蔽)状态下不具膜活性(失活)。使足够数量的掩蔽剂连接聚合物以实现所需水平的失活。使用合适的膜活性试验容易测定通过掩蔽剂结合的聚(乙烯基酯)的所需修饰水平。例如，如果所述聚(乙烯基酯)在给定试验中具有膜活性，则在该试验中，有足够水平的掩蔽剂连接至所述聚合物以达到所需的膜活性抑制水平。掩蔽需要修饰所述聚合物上≥50%、≥60%、≥70%或≥80%的胺基团，以不存在任何掩蔽剂时所述聚合物上的胺的量来确定。掩蔽剂的另一个优选特征是其与所述聚合物的结合会降低所述聚合物的净电荷，因此形成更中性的递送聚合物。理想上所述掩蔽聚合物保持水溶性。
如本文所用，若经修饰的聚合物在体内不显示膜活性但显示细胞特异性(即肝实质细胞)靶向，则本发明的膜活性多(乙烯基酯)被掩蔽。若使所述掩蔽剂和所述聚合物结合的连接被切割导致所述聚(乙烯基酯)上的胺恢复，从而恢复膜活性，则本发明的膜活性聚(乙烯基酯)是被可逆掩蔽的。
另一个基本特征是，所述掩蔽剂通过可逆生理学不稳定的共价键连接所述膜活性聚(乙烯基酯)。通过使用可逆生理学不稳定连接或键，可在体内从聚合物切割掩蔽剂，从而所所述聚合物失去掩蔽并恢复未掩蔽聚合物的活性。通过选择合适的可逆连接，可在所述膜活性聚合物被递送或靶向至所需细胞类型或细胞位置之后形成恢复其活性的偶联物。所述连接的可逆性提供所述膜活性多胺的选择性激活。含有可逆不稳定键的合适的可逆共价连接可选自下组：生理不稳定键、细胞生理上不稳定键、蛋白酶敏感性连接、pH不稳定键、pH极不稳定键和极端pH不稳定键。
如本文所用，掩蔽剂包含具有细胞靶向基团或位阻稳定剂和胺反应基团的化合物，其中，所述胺反应基团与聚(乙烯基酯)上的胺之间的反应导致所述靶向基团或位阻稳定剂通过可逆生理学不稳定共价键连接所述聚合物。优选地，所述掩蔽剂是电荷呈中性的。优选的靶向基团是去唾液酸糖蛋白受体(ASGPr)靶向基团。ASGPr靶向基团是对去唾液酸糖蛋白受体有亲和性的基团，通常是糖。优选的位阻稳定剂是聚乙二醇(PEG)。本发明优选的掩蔽剂能修饰水溶液中的本发明的聚(乙烯基酯)(与该聚合物形成可逆键)。
优选的胺反应基团包括双取代的马来酸酐。优选的掩蔽剂由如下结构表示：
其中R1是烷基基团，例如甲基基团(-CH3)、乙基基团(-CH2CH3)或丙基基团(-CH2CH2CH3)，且R2包含中性靶向基团或中性位阻稳定剂。更优选地，所述靶向剂和位阻稳定剂不带电。单取代的马来酸酐(其中R1或R2是氢)产生的连接不适于本发明描述。虽然马来酸酐和胺反应产生β羧基基团，但该β羧基不显示完全明显的负电荷(Rozema等.Bioconjugate Chem.2003,14,51-57)。因此，可使用基于马来酸酐的其中R1和R2呈电荷中性的掩蔽剂来中和多胺而不引入高负电荷。
在一个实施方式中，本发明的聚(乙烯基酯)多胺可通过和多种双取代的马来酸酐反应来被可逆修饰。因此，本发明提供下式的无规共聚物：
其中N′、Y、Y′、R、R′、R1、R2、R3、R4、m、n、p、q具有上式(I)和(Ia)给定的含义，
m1是≥零并≤式(I)或(Ia)的m的整数，
m3是≥零并≤式(I)或(Ia)的m的整数，
m1+m2+m3=式(I)或(Ia)的m，
m1+m3是≥m2的整数[即，≥0.5×式(I)或(Ia)的m且≤式(I)或(Ia)的m]，
R7是烷基基团且R8包含中性靶向基团，或者R8是烷基基团且R7包含中性靶向基团，和
R9是烷基基团且R10包含中性位阻稳定剂，或者R10是烷基基团且R9包含中性位阻稳定剂。
另一个优选的掩蔽剂包含蛋白酶敏感性的二肽-酰胺苄基-碳酸酯，其由如下结构表示：
其中，R4包含优选不带电的中性靶向配体或位阻稳定剂，R3包含胺反应性碳酸酯基团，且R1和R2是氨基酸侧链。在一个优选的二肽中，R1是疏水性氨基酸侧链且R2是不带电的亲水性氨基酸侧链。优选的疏水性氨基酸是苯丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、丙氨酸或色氨酸。优选的不带电亲水性氨基酸是天冬氨酸、谷氨酰胺或瓜氨酸。更优选的疏水性氨基酸是苯丙氨酸或缬氨酸。更优选的不带电亲水性氨基酸是瓜氨酸。优选的活化的碳酸酯是对-硝基苯酚。然而，本领域所知的其它胺反应性碳酸酯也容易取代对-硝基苯酚。所述活化的碳酸酯与胺的反应使所述靶向配体或位阻稳定剂通过肽酶可切割的二肽-酰胺苄基氨基甲酸酯连接来连接所述膜活性多胺。所述氨基酸和所述酰胺苄基基团之间的二肽的酶切割从所述聚合物去除R4，并触发消除反应，该消除反应导致所述聚合物的胺再生。
二肽-酰胺苄基-碳酸酯掩蔽剂和所述聚(乙烯基酯)的胺的反应导致所述聚(乙烯基酯)的可逆修饰。因此，本文提供包含本文所述的两亲性膜活性聚(乙烯基酯)的偶联物，所述两亲性膜活性聚(乙烯基酯)通过采用二肽-酰胺苄基-碳酸酯掩蔽剂修饰来掩蔽。如此掩蔽的聚合物具有下式：
式(III)
其中：
X是–NH-、-O-或-CH2-
Y是–NH-或-O-
R1优选是
-(CH2)k-苯基(k是1、2、3、4、5、6；k=1个苯丙氨酸)，
-CH-(CH3)2(缬氨酸)，
-CH-(CH3)2(亮氨酸)，
-CH-(CH3)2(异亮氨酸)，
-CH3(丙氨酸)，
-(CH2)2-COOH(谷氨酸)，
或者
(色氨酸)；
R2优选是
氢(甘氨酸)
-(CH2)3-NH-C(O)-NH2(瓜氨酸)，
-(CH2)4-N-(CH3)2(赖氨酸(CH3)2)，
-(CH2)k-C(O)-NH2；(k是1、2、3、4、5、6)，
-(CH2)3-NH-C(O)-NH2(瓜氨酸)，
-(CH2)2-C(O)-NH2(谷氨酰胺)，
-CH2-C(O)-NR1R2(天冬氨酸酰胺)，
-(CH2)2-C(O)-NR1R2(谷氨酸酰胺)，
-CH2-C(O)-OR1(天冬氨酸酯)，或
-(CH2)2-C(O)-OR1(谷氨酸酯)，
R1和R2是烷基基团
R4包含中性聚乙二醇或靶向配体；并且
所述多胺是两亲性膜活性聚(乙烯基酯)。
虽然上述结构指示单个二肽掩蔽剂连接所述聚合物，但在本发明的实践中，有50%～90%或更多的聚合物的胺通过二肽掩蔽剂修饰。
可使本发明的膜活性聚(乙烯基酯)在过量掩蔽剂存在下与掩蔽剂偶联。在给予所述递送聚合物之前，可从所述偶联的递送聚合物去除过量掩蔽剂。
在一个实施方式中，所述膜活性聚(乙烯基酯)多胺通过使所述多胺上的≥50%、≥60%、≥70%或≥80%的胺与靶向基团掩蔽剂或位阻稳定剂掩蔽剂结合来可逆掩蔽。在另一个实施方式中，所述膜活性多胺通过使所述多胺上的≥50%、≥60%、≥70%或≥80%的胺与靶向基团掩蔽剂和位阻稳定剂掩蔽剂的组合结合来可逆掩蔽。在另一个实施方式中，所述靶向基团掩蔽剂包含通过PEG接头与胺反应性基团连接的靶向基团。就采用靶向基团掩蔽剂和位阻稳定剂掩蔽剂掩蔽的膜活性多胺而言，位阻稳定剂与靶向基团的比例为约0-4:1，更优选约0.5-2:1。在另一个实施方式中，约有1.3-2的位阻稳定剂掩蔽剂至约1的靶向基团剂。
在本发明的另一个实施方式中，提供式(I)或(Ia)的聚合物与生物学活性化合物(优选RNA干扰多核苷酸)共价结合的偶联物。优选地，所述聚合物通过生理学不稳定连接与所述多核苷酸共价连接。优选的生理学不稳定连接与所述掩蔽剂生理学不稳定连接正交。合适的生理学不稳定连接可选自下组：生理学不稳定键、细胞生理学不稳定键、pH不稳定键、pH极不稳定键、极端pH不稳定键、酶可切割键(包括合适的酯、酰胺和磷酸二酯键)，和二硫键。
我们发现，通过使多核苷酸通过可逆接头与所述聚合物结合，所述可逆接头在所述多核苷酸递送至细胞之后断裂，能够体内递送功能性活性多核苷酸至细胞。选择所述不稳定接头，使得其存在于某生理环境中(例如，胞质减少环境)时发生化学转化(例如，切割)。使多核苷酸结合本发明的聚(乙烯基酯)增强所述多核苷酸至细胞的体内递送。通过切割所述不稳定连接来从所述聚合物释放所述多核苷酸促进所述多核苷酸与合适的细胞成分在活性方面的相互作用。
所述RNAi多核苷酸-聚合物偶联物通过使所述RNAi多核苷酸通过生理学不稳定共价键连接所述聚合物来形成。合成或修饰所述多核苷酸使其含有反应基团A。还合成或修饰所述聚合物使其含有反应基团B。选择反应基团A和B，从而能够采用本领域已知的方法通过生理学不稳定共价连接使其相连。可将所述聚合物连接至所述RNAi多核苷酸的3′或5′端。就siRNA多核苷酸而言，可使所述靶向基团连接至正义链或反义链，尽管优选正义链。
使RNAi多核苷酸和聚合物(I)或(Ia)的侧链伯胺偶联产生(IV)或(IVa)的聚合物。
其中N′、Y、Y′、R、R′、R1、R2、R3、R4、m、n、p、q具有上式(I)和(Ia)给定的含义，
m1是1、2、3或4，
m1+m2=式(I)或(Ia)的m；并且
所示接头包含生理学不稳定接头。
在另一个实施方式中，使所述RNAi多核苷酸与式(V)和(Va)所描述的聚合物主链末端偶联。所述多核苷酸还可结合其它末端。
其中N、N′、Y、Y′、R、R′、R1、R2、R3、R4、m、n、p、q具有上式(I)和(Ia)给定的含义，并且所述接头包括生理学不稳定接头。
在本发明的另一个实施方式中，提供式(II)、(IIa)和(III)与生物活性化合物(优选RNA干扰多核苷酸)共价结合的偶联物，如上方针对未修饰聚合物所示。优选地，所述聚合物通过生理学不稳定连接与所述多核苷酸共价连接。
可使所示多核苷酸在过量聚合物的存在下与所述聚合物结合。所述过量的聚合物可协助制备所述多核苷酸-聚合物偶联物。所述过量的聚合物可减少所述偶联物制备过程中的偶联物聚集。可在给予细胞或器官所述偶联物之前从所述过量的聚合物分离多核苷酸-聚合物偶联物。或者，可向所述细胞或器官共给予所述多核苷酸-聚合物偶联物和所述过量的聚合物。所述过量的聚合物可与所述聚合物相同或不同，协助性聚合物或加强性聚合物。
在另一个实施方式中，用于体内递送RNA干扰多核苷酸至肝脏细胞的本发明特征组合物包含：式(II)、(IIa)或(III)的聚合物，和与多核苷酸靶向基团偶联的RNA干扰多核苷酸。所述多核苷酸靶向基团可以是包含至少20个碳原子的疏水基团，或如美国专利公开20110207799所述的三价ASPGr靶向基团。分别合成所述可逆修饰的聚(乙烯基酯)和所述siRNA-偶联物，并且可贮备在分开的容器或单个容器中。所述RNA干扰多核苷酸没有偶联所述聚合物。
我们发现RNAi多核苷酸和多核苷酸靶向基团(疏水基团或半乳糖簇)的偶联以及上述RNAi多核苷酸偶联物和经修饰的聚(乙烯基酯)聚合物的共给予能够有效、功能性地体内递送RNAi多核苷酸至肝细胞，尤其是肝实质细胞。功能性递送表示所述RNAi多核苷酸递送到细胞并预期具有生物学活性、基因表达的序列特异性抑制。给予哺乳动物脉管系统的许多分子(包括多核苷酸)通常由肝脏从身体中清除。肝脏对多核苷酸的清除中所述多核苷酸发生降解或另外加工以从身体中去除且其中所述多核苷酸没有引起基因表达的序列特异性抑制，所述清除不视作功能性递送。
所述RNAi多核苷酸-多核苷酸靶向基团偶联物与本发明的可逆修饰的聚(乙烯基酯)共给予。共给予表示将RNAi多核苷酸和递送聚合物给予哺乳动物，从而两者同时存在于该哺乳动物内。所述RNAi多核苷酸-靶向基团偶联物和所述递送聚合物可被同时给予或其可被依次递送。就同时给予而言，其可在给予之前预混合。就依次给予而言，可先给予所述RNAi多核苷酸-靶向基团偶联物或所述递送聚合物。
就RNAi多核苷酸-疏水性靶向基团偶联物而言，所述RNAi偶联物可给予至多30分钟，之后给予所述递送聚合物。同样，就RNAi多核苷酸-疏水性靶向基团偶联物而言，所述递送聚合物可给予至多两小时，之后给予所述RNAi偶联物。
就RNAi多核苷酸-半乳糖簇靶向基团偶联物而言，所述RNAi偶联物可给予至多15分钟，之后给予所述递送聚合物。同样，就RNAi多核苷酸-半乳糖簇靶向基团偶联物而言，所述递送聚合物可给予至多15分钟，之后给予所述RNAi偶联物。
两亲性
本发明的聚(乙烯基酯)无规共聚物是两亲性的。两亲性或两亲的聚合物具有亲水性(极性、水溶性)和疏水性(非极性、亲脂性、水不溶性)基团或部分。
如本文所用，涉及两亲性聚合物时，部分定义为当一个共价键断裂并由氢代替时衍生的分子。例如，在丁胺中，碳和氮键间断裂并由氢替代会产生氨(亲水性)和丁烷(疏水性)。若在氮-碳键处切割1,4-二氨基丁烷并用氢替代，所得分子再次是氨(2×)和丁烷。然而，1,4,-二氨基丁烷不被视作两亲性，因为疏水部分的的形成需要两个键的断裂。
膜活性
如本文所用，膜活性聚合物是具有表面活性、两亲性的聚合物，其能在生物膜上诱导一种或多种下述影响：膜的变化或破坏使膜不透性分子进入细胞或穿过膜，在膜上形成孔，膜分裂，或使所述膜破坏或溶解。如本文所用，膜或细胞膜包括脂双层。膜的变化或破坏可通过至少一个下述试验中的聚合物活性来进行功能性定义：红血细胞裂解(溶血)、脂质体渗漏、脂质体融合、细胞融合、细胞裂解、和内吞体释放。可引起细胞膜裂解的膜活性聚合物也称为膜裂解聚合物。认为优先在质膜上引起内吞体或溶酶体的破坏的聚合物是内吞体裂解聚合物。膜活性聚合物对细胞膜的影响可以是短暂的。膜活性聚合物具有对膜的亲和性，并引起双层结构的变性或变形。膜活性聚合物可以是合成的或非天然的两亲性聚合物。
将多核苷酸递送到细胞中由膜活性聚合物介导，其破坏或使质膜或内囊泡膜(如内吞体或溶酶体)不稳定，包括在膜上形成孔、或破坏内吞体或溶酶体囊泡，从而允许所述囊泡的内含物释放到细胞胞质中。
内吞体裂解
内吞体裂解聚合物是响应pH变化的聚合物，其能引起内吞体的破坏或裂解，或者使通常细胞膜不透性的化合物如多核苷酸或蛋白质从细胞内膜包裹的囊泡如内吞体或溶酶体中释放。内吞体裂解聚合物在生理学相关的pH范围内(通常pH5.5-8)的理化性质会发生变化。该变化可以是电荷、疏水性或亲水性的改变引起的所述聚合物的溶解度或与其它化合物或膜相互作用的能力的变化。示例性的内吞体裂解聚合物具有pH不稳定基团或键。因此，其中掩蔽剂通过pH不稳定键结合所述聚合物的可逆掩蔽的膜活性聚(乙烯基酯)可被认为是内吞体裂解聚合物。
亲水基团
亲水基团定性地指示偏好水的化学基团。此类化学基团通常是水溶性的，并且是水的氢键供体或受体。亲水基团可以带电荷或不带电荷。带电基团可带正电(阴离子)或带负电(阳离子)或二者(两性离子)。亲水基团的例子包括以下化学部分：碳水化合物、聚氧乙烯、某些肽、寡核苷酸、胺、酰胺、烷氧基酰胺、羧酸、硫磺和羟基。
疏水基团
疏水基团定性地指示避水性化学基团。此类化学基团通常是非水溶性的，并且不倾向于形成氢键。疏水基团溶解于脂肪、油、脂质和非极性溶剂，并且几乎没有或没有形成氢键的能力。含两个(2)或更多个碳原子的烃类、某些经取代的烃类、胆固醇和胆固醇衍生物是疏水基团和化合物的示例。
疏水基团优选仅包含碳和氢原子的烃类。然而，可允许保持疏水性且包括例如氟的非极性取代或非极性杂原子。所述术语包括脂族基团、芳族基团、酰基、烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、芳烯基和芳炔基，其各可为直链、支链或环形。所述术语疏水基团还包括：固醇、类固醇、胆固醇和类固醇及胆固醇的衍生物。本文中所用的低疏水性单体或基团包括具有二(2)-六(6)个碳原子的疏水基团。本文中所用的中等疏水性单体或基团包括具有七(7)-十一(11)个碳原子的疏水基团。本文中所用的高疏水性单体或基团包括具有十二(12)-三十六(36)个或更多碳原子的疏水基团。
靶向基团
靶向基团或部分提高其结合的偶联物的药物动力学或生物分布性质，以改良所述偶联物的细胞特异性分布和细胞特异性摄取。靶向基团增强分子和靶细胞的结合。因此，靶向基团可增强其结合的偶联物的药物动力学或生物分布性质，以改善所述偶联物的细胞分布和细胞摄取。靶向基团(例如配体)与细胞或细胞受体的结合可引发内吞。靶向基团可以是单价的、二价的、三价的、四价的或具有更高价。靶向基团可选自下组：对细胞表面分子有亲和性的化合物、细胞受体配体，以及抗体、抗体片段，以及对细胞表面分子具有亲和性的抗体模拟物。优选的靶向基团包括细胞受体配体。已使用多种配体来将靶药物和基因靶向至细胞和特异性细胞受体。细胞受体配体可选自下组：碳水化合物、多糖、糖类(包括但不限于半乳糖、半乳糖衍生物、甘露糖和甘露糖衍生物)、维生素、叶酸、生物素、适体和肽(包括但不限于含RGD的肽、胰岛素、EGF和转铁蛋白)。
ASGPr靶向基团
已使用半乳糖和半乳糖衍生物通过与肝实质细胞表面表达的去唾液酸糖蛋白受体(ASGPr)结合来使分子体内靶向肝实质细胞。本文中所用的ASGPr靶向基团包含半乳糖和对ASGPr的亲和性等于或大于半乳糖的半乳糖衍生物(结构类似物)。半乳糖靶向部分与ASGPr的结合有助于细胞特异性地将所述递送聚合物靶向至肝实质细胞，并使所述递送聚合物被内吞到肝实质细胞中。
ASGPr靶向部分可以选自下组：乳糖、半乳糖、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、半乳糖胺、N-甲酰半乳糖胺、N-乙酰基-半乳糖胺、N-丙酰半乳糖胺、N-正丁酰基半乳糖胺、N-异丁酰基半乳糖胺、寡糖、糖簇(例如：Tyr-Glu-Glu-(氨基己基GalNAc)3、基于赖氨酸的半乳糖簇和基于胆烷的半乳糖簇)(Iobst,S.T.和Drickamer,K.J.B.C.1996,271,6686)。ASGPr靶向部分可为单体(如具有单半乳糖胺)或多亚基(如具有多半乳糖胺)。其它合适的偶联物可包括能与唾液酸糖蛋白受体(ASGP-R)上发现的碳水化合物识别结构域(CRD)结合的寡糖。示例性偶联物部分包括美国专利号6,525,031中提供的寡糖和/或碳水化合物复合物。
在一些实施方式中，ASGPr靶向基团通过PEG接头连接胺反应性基团(例如马来酸酐)，所示PEG接头如以下结构所示：
其中，n是1-19的整数(含端点)。
在一个实施方式中，ASGPr靶向基团包含半乳糖簇(半乳糖簇靶向基团)。本文中所用的半乳糖簇包含具有2-4个末端半乳糖衍生物的分子。末端半乳糖衍生物通过其C-1碳来结合分子。优选的半乳糖簇具有各自对去唾液酸糖蛋白受体具有亲和性的3种末端半乳糖胺或半乳糖胺衍生物。更优选的半乳糖簇具有3种末端N-乙酰-半乳糖胺。本领域其它常见术语包括三触角型(tri-antennary)半乳糖、三价半乳糖和半乳糖三聚体。已知三触角型半乳糖衍生物簇以比二触角型或单触角型半乳糖衍生物结构更强的亲和性结合ASGPr(Baenziger和Fiete,1980,Cell,22,611-620；Connolly等,1982,J.Biol.Chem.,257,939-945)。
半乳糖
半乳糖簇包含各自连接中央分支点的三种半乳糖衍生物。所述半乳糖衍生物通过所述糖的C-1碳结合中央分支点。半乳糖衍生物优选通过接头或间隔子连接所述分支点。优选的间隔子是灵活的亲水性间隔子(美国专利5885968；Biessen等J.Med.Chem.1995第39卷，第1538-1546页)。优选的灵活亲水性间隔子是PEG间隔子。优选的PEG间隔子是PEG3间隔子。分支点可以是任何小分子，其允许所述三种半乳糖衍生物结合，还允许所述分支点结合RNAi多核苷酸。示例性分支点基团是二赖氨酸。二赖氨酸分子含三种胺基(可通过其结合三种半乳糖衍生物)和羧基反应基团(二赖氨酸可通过其结合RNAi多核苷酸)。
分支点和核酸之间有PEG间隔子的半乳糖簇
位阻稳定剂
如本文所用，位阻稳定剂是非离子亲水性聚合物(天然、合成或非天然)，相比不含位阻稳定剂的聚合物，其阻止或抑制结合其的聚合物的分子内或分子间相互作用。位阻稳定剂阻碍与其结合的聚合物参与静电相互作用。静电相互作用是两种或更多物质之间由于正电荷和负电荷之间的吸引力产生的非共价结合。位阻稳定剂能抑制与血液组分的相互作用，以及因而的调理作用、噬菌作用以及被网状内皮系统摄入。因此位阻稳定剂能提高结合其的分子循环时间。位阻稳定剂还能抑制聚合物的聚集。优选的位阻稳定剂是聚乙二醇(PEG)或PEG衍生物。如本文所用，PEG优选具有约1-500个乙二醇单体、2-20个乙二醇单体、5-15个乙二醇单体或约10个乙二醇单体。如本文所用，PEG的平均分子量优选为约85-20,000道尔顿(Da)、约200-1000Da、约200-750Da或约550Da。如本文所用，相对不含位阻稳定剂的聚合物，位阻稳定剂阻止或抑制水溶液中结合其的聚合物的分子间或分子内相互作用。
结构类似物是与另一种物质结构相似，但某一成分不同的化合物。其可在一个或多个原子、官能团、或亚结构上存在差异，其可由其它原子、基团或亚结构替代。结构类似物通常以单个元件的替代(即，一个原子或官能团被不同元件的另一个原子或官能团替代)为区别。结构类似物可以在想象中从其它化合物形成(至少基于理论)。如此，结构类似物与所述另一种化合物具有高度化学相似性。如本领域中通常所用，除结构相似性以外，结构类似物可具有非常不同的物理、化学或生物化学性质。然而，如本文所用，就其确定的性质而言，结构类似物具有相似的物理、化学或生物化学性质。
表面电荷
ζ电位是悬浮颗粒所表现的物理特性，与表面电荷密切相关。在水性介质中，样品pH是影响ζ电位的最重要因素之一。当电荷是基于碱/酸的质子化/去质子化时，所述电荷是pH依赖性。因此，ζ电位值必需包括溶液条件，特别是pH才有意义。对于一般颗粒，ζ电位幅度表明胶体系统的电位稳定性。若所有悬浮颗粒都具有较大负或正ζ电位，则其倾向于排斥彼此，且颗粒没有聚集的趋势。然而，若颗粒具有低ζ电位值，则没有阻止颗粒聚集并絮凝的力。一般颗粒稳定和不稳定悬浮之间的一般分界线常为+30或-30mV。ζ电位大于+30mV或小于-30mV的颗粒通常被认为稳定。本发明所述的递送聚合物在生理盐和pH8下表现出20mV到-20mV的ζ电位，但其在水溶液中为胶体稳定且不絮凝。
膜活性多胺的正电荷或ζ电位通过掩蔽剂修饰而降低。聚合物电荷特别是正电荷会导致与血清组分或非靶细胞发生不想要的相互作用。表面正电荷还通过提高聚合物与带负电细胞膜的相互作用而在膜活性中起作用。因此，优选带有中性净电荷或ζ电位的体内siRNA递送载剂。本发明的递送聚合物，通过与ASGPr靶向基团掩蔽剂和位阻稳定剂掩蔽剂可逆结合而被修饰的膜活性多胺，具有明显接近中性的表面电荷并在血清中稳定。更具体地，本发明的递送聚合物在pH8时测量的ζ电位为+30--30mV、+20--20mV、+10--10mV、或+5--5mV。预期所述偶联物在pH7时的净电荷比pH8时更正。净电荷或表面电荷是体内应用的重要因素。
不稳定连接
连接或接头是两种原子之间的联系，所述联系通过一种或多种共价键将一种化学基团或感兴趣的区段连接另一种化学基团或感兴趣的区段。例如，连接可使修饰剂或掩蔽剂与聚合物联合。连接的形成可将两种单独分子联为单一分子或其可将两种原子联到相同分子上。所述连接的电荷可为中性或带有正或负电荷。可逆或不稳定连接包括可逆或不稳定键。连接可任选地包括增加两种相连原子之间距离的间隔子。间隔子还可增加连接的灵活性和/或长度。间隔子可包括但不限于：烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、芳烯基、芳炔基，其各可包括一种或多种杂原子、杂环、氨基酸、核苷酸和糖。间隔基团为本领域熟知，前述列表不意在限制本发明的范围。
可逆键或不稳定键是除了与氢原子共价键之外的共价键，其能在不破坏或切割同一分子中其他共价键的条件下被选择性破坏或切割。更具体地，可逆或不稳定键是在合适条件下比同一分子中其他不稳定共价键更不稳定(热力学)或更快速破坏(动力学)的共价键。分子内不稳定键的切割会形成两个分子。对于本领域技术人员，键的切割或不稳定通常用术语键切割的半衰期(t1/2)(切割一半键所需的时间)来讨论。因此，可逆或不稳定键涵盖能比分子中其它键更快地被选择性切割的键。
合适的条件由不稳定键的类型决定且为有机化学领域熟知。不稳定键可对pH、氧化或还原条件或试剂、温度、盐浓度、存在酶(如酯酶，包括核酸酶和蛋白酶)或存在添加试剂敏感。例如，提高或降低pH是pH不稳定键的合适条件。
不稳定基团发生转化的比例可由改变含所述不稳定基团的分子的化学成分来控制。例如，在不稳定基团旁添加具体化学部分(如电子受体或供体)可影响会发生化学转化的具体条件(如pH)。
如本文所用，生理不稳定键是在哺乳动物体内正常遇到或类似于遇到的那些条件下能切割的不稳定键。选择生理不稳定键从而其在存在于某些生理条件时发生化学转化(如切割)。
如本文所用，细胞生理学不稳定键是在哺乳动物细胞内条件下可切割的不稳定键。哺乳动物细胞内条件包括哺乳动物细胞内发现的或类似其内所遇到的化学条件如pH、温度、氧化或还原条件或试剂和盐浓度。哺乳动物细胞内条件还包括存在哺乳动物中正常具有的酶活性如蛋白水解酶或水解酶。合适条件下切割生理不稳定键的半衰期少于45分钟被认为非常不稳定。合适条件下切割生理不稳定键的半衰期少于15分钟被认为极度不稳定。
当包含不稳定键的分子到达合适的细胞内和/或细胞外环境时发生化学转化(所述不稳定键的切割)。例如，pH不稳定键可在分子进入酸化内吞体中时被切割。因此，pH不稳定键可视作内吞体可切割的键。酶可切割的键可在暴露于酶如内吞体或溶酶体或胞质中存在的那些酶时被切割。二硫键可在分子进入细胞质的更高还原性环境时被切割。因此，二硫键可视作胞质可切割键。
如本文所用，pH不稳定键是在酸性条件下(pH<7)选择性断裂的不稳定键。该键还可称为内吞体不稳定键，因为细胞内吞体和溶酶体的pH小于7。术语pH不稳定包括pH不稳定键、pH极不稳定键和极端pH不稳定键。
胺与环酐的反应形成酰胺酸。
形成胺和酐的酰胺酸切割是pH依赖性且在酸性pH下显著加速。可利用该pH依赖性反应以形成可逆pH不稳定键和接头。
pH极不稳定键：pH极不稳定键在pH5时的切割半衰期小于45分钟。pH极不稳定键的构造在化学领域熟知。
极端pH不稳定键：极端pH不稳定键在pH5时的切割半衰期小于15分钟。极端pH不稳定键的构造在化学领域熟知。
双取代的环酐特别有用于使掩蔽剂修饰或结合至本发明的膜活性聚(乙烯基酯)聚合物。其提供生理pH不稳定键，容易修饰胺并在细胞内吞体和溶酶体内所见pH减少下切割后恢复所述胺。第二，与胺反应后产生的α或β羧酸基团似乎仅构成聚合物预期负电荷的约1/20(Rozema等，Bioconjugate Chemistry2003)。因此，用双取代马来酸酐修饰多胺能有效中和多胺的正电荷，而不是产生具有高负电荷的多胺。接近中性的聚合物优选用于体内递送。
RNAi多核苷酸-多核苷酸靶向基团偶联物
通过使所述RNAi多核苷酸和所述多核苷酸靶向基团共价连接来形成所述RNAi多核苷酸-多核苷酸靶向基团偶联物。合成或修饰所述多核苷酸使其含有反应基团A。还合成或修饰所述多核苷酸靶向基团使其含有反应基团B。选择反应基团A和B，从而其能用本领域已知的方法通过共价键而连接。
可使所述多核苷酸靶向基团连接所述RNAi多核苷酸的3’或5’端。就siRNA多核苷酸而言，可使所述靶向基团连接至正义链或反义链，尽管优选正义链。
在一个实施方式中，所述多核苷酸靶向基团由疏水基团组成。更具体地，所述多核苷酸靶向基团由具有至少20个碳原子的疏水基团组成。用作多核苷酸靶向部分的疏水基团在本文中指疏水靶向部分。示例性合适疏水基团可选自下组：胆固醇、二胆固醇、生育酚、二生育酚、二癸基、双十二烷基、双十八烷基、双十二烷基、双十八烷基、类异戊二烯、和胆酰胺（choleamide）。
还可使用本领域已知的方法使所述疏水靶向基团连接所述RNAi多核苷酸的3′或5′末端。就具有两条链的RNAi多核苷酸(例如siRNA)而言，所述疏水基团可结合任一链。
所述半乳糖簇还可用本领域已知方法连接所述RNAi多核苷酸的3′或5′末端。就具有两条链的RNAi多核苷酸(例如siRNA)而言，所述半乳糖簇可连接任一链。
多核苷酸
术语多核苷酸，或核酸或多聚核酸为本领域术语，指含有至少两种核苷酸的聚合物。核苷酸是多核苷酸聚合物的单体单元。具有少于120个单体单元的多核苷酸常称为寡核苷酸。天然核酸具有去氧核醣-或核糖-磷酸盐主链。非天然或合成的多核苷酸是体外或在无细胞系统中聚合的多核苷酸且含有相同或相似的碱基但可含有天然核糖或脱氧核糖磷酸盐主链以外的主链类型。多核苷酸可用本领域已知的任何方法合成。本领域已知的多核苷酸主链包括：PNA(肽核酸)、硫代磷酸酯、磷酸二酰胺(phosphorodiamidates)、吗啉代、和天然核酸的其他磷酸主链变体。碱基包括嘌呤和嘧啶，其还包括天然化合物腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、肌苷和天然类似物。嘌呤和嘧啶的合成类似物包括但不限于将新反应基团置于核苷酸上的修饰,例如但不限于胺、乙醇、硫醇、羧酸盐/酯和卤代烷。术语碱基包含任何已知的DNA和RNA碱基类似物。多核苷酸还可包括核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、合成的核苷酸或任何合适组合。多核苷酸可体外聚合，其可为重组体，包括嵌合序列或这些基团的衍生物。多核苷酸还可包括在5′端和3′端、或5′和3′端均有的末端帽基团。所述帽基团可为但不限于倒置的脱氧脱碱基基团、倒置的脱氧胸腺嘧啶基团、胸腺嘧啶基团或3′甘油修饰。
RNA干扰(RNAi)多核苷酸是能诱导RNA干扰的分子，其通过与哺乳动物细胞的RNA干扰通路组成部分相互作用以序列特异方式降解或抑制转基因的信使RNA(mRNA)转录本翻译。两种主要RNAi多核苷酸是小(或短)干扰RNA(siRNA)和微RNA(miRNA)。RNAi多核苷酸可选自下组：siRNA、miRNA、双链RNA(dsRNA)、短发夹RNA(shRNA)和编码能诱导RNA干扰的表达盒。siRNA包括的双链结构通常含15-50个碱基对，优选21-25个碱基对，并具有与细胞内所表达靶基因或RNA中编码序列相同(完美互补的)或几乎相同(部分互补的)的核苷酸序列。siRNA还具有3′双核苷酸突出。siRNA可由形成发夹结构的两个退火多核苷酸或单核苷酸组成。本发明的siRNA分子包含有义区域和反义区域。在一个实施方式中，偶联物的siRNA从两种寡核苷酸片段中组装，其中一种片段包含所述siRNA分子反义链的核苷酸序列，且第二片段包含所述siRNA分子有义链的核苷酸序列。在另一实施方式中，有义链通过接头分子如多核苷酸接头或非核苷酸接头连接反义链。微小RNA（miRNA）是约22核苷酸长的非编码小RNA基因产物，指导其mRNA靶标的破坏或翻译抑制。若miRNA和靶mRNA之间是部分互补，则所述靶mRNA的翻译被抑制。若广泛互补，则所述靶mRNA被切割。对于miRNA，所述复合物结合通常位于mRNA3′UTR的靶位点，其通常仅与所述miRNA部分同源。种子区域摂为miRNA5′末端的一段约七(7)个连续核苷酸，与其靶标形成完美碱基配对-在miRNA特异性中起关键作用。RISC/miRNA复合物与mRNA的结合可导致蛋白质翻译抑制或mRNA的切割和降解。近期数据表明若沿着全长miRNA和其靶标有完美同源性而不是仅在种子区域显示完美碱基配对，则mRNA切割优选发生(Pillai等，2007)。
RNAi多核苷酸表达盒可在细胞中转录产生小发夹RNA，其能作为siRNA、分离的有义和反义链线性siRNA或miRNA行使功能。RNA聚合酶III转录的DNA含有选自下表的启动子：U6启动子、H1启动子和tRNA启动子。RNA聚合酶II启动子包括U1、U2、U4和U5启动子、snRNA启动子、微RNA启动子和mRNA启动子。
已知miRNA序列的列表可在研究组织维护的数据库中找到，如维尔康姆基金会桑格研究所(Wellcome Trust Sanger Institute)、宾州生物信息中心(Penn Center forBioinformatics)、斯隆凯特林癌症纪念纪念中心(Memorial Sloan Kettering CancerCenter)和欧洲分子生物实验室等。已知的有效siRNA序列和关联结合位点也在相关文献中充分记述。RNAi分子容易用本领域已知的技术设计和生产。此外，计算工具可用于增加发现有效和特异性序列基序的可能性(Pei等2006，Reynolds等2004，Khvorova等2003，Schwarz等2003，Ui-Tei等2004，Heale等2005，Chalk等2004，Amarzguioui等2004)。
本发明的多核苷酸可被化学修饰。该化学修饰的非限制性示例包括：硫代磷酸酯核苷酸间连接、2′-O-甲基核糖核苷酸、2′-脱氧-2′-氟核糖核苷酸、2′-脱氧核糖核苷酸、“通用碱基”核苷酸、5-C-甲基核苷酸、和倒置脱氧脱碱基残基掺入。用于各种多核苷酸结构时，这些化学修饰显示在细胞中保持多核苷酸活性，同时增加这些化合物的血清稳定性。化学修饰的siRNA还可使人中干扰素活性激活的可能性最小化。
在一个实施方式中，本发明的化学修饰RNAi多核苷酸包括具有两条链的双链体，其一或二者可化学修饰，其中各链为约19～约29核苷酸。在一个实施方式中，本发明的RNAi多核苷酸包括一种或多种修饰的核苷酸，同时保持在细胞内介导RNAi或体外系统重建的能力。RNAi多核苷酸可经修饰，其中化学修饰包括一个或多个(例如约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多)核苷酸。本发明的RNAi多核苷酸可包括修饰的核苷酸，其占RNAi多核苷酸中所存在核苷酸总数的某一百分比。同样，本发明的RNAi多核苷酸通常可在约5～约100%(如5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%的核苷酸位置)的核苷酸位置上包括修饰的核苷酸。给定RNAi多核苷酸中存在的修饰核苷酸的实际百分比取决于所述RNAi多核苷酸中存在的核苷酸总数。若RNAi多核苷酸是单链，则修饰百分比可基于单链RNAi多核苷酸中存在的核苷酸总数。同样，若RNAi多核苷酸是双链，则修饰百分比可基于有义链、反义链或有义和反义链二者中存在的核苷酸总数。此外，给定RNAi多核苷酸中存在的修饰核苷酸的实际百分比还可取决于所述RNAi多核苷酸中存在的嘌呤和嘧啶核苷酸总数。例如，其中RNAi多核苷酸中存在的所有嘧啶核苷酸和/或所有嘌呤核苷酸经过修饰。
RNAi多核苷酸调控基因编码的RNA表达。由于多种基因可彼此共有一定程度的序列同源性，所以RNAi多核苷酸可设计为靶向具有足够序列同源性的一类基因。因此，RNAi多核苷酸可包括与不同基因靶标之间共有或对特异基因靶标独特的序列互补的序列。因此，RNAi多核苷酸可设计为靶向具有数种基因之间同源性的RNA序列的保守区域，从而靶向基因家族中的数种基因(如不同基因同种型、剪接变体、突变基因等)。在另一个实施方式中，RNAi多核苷酸可设计为靶向对单一基因中特异RNA序列独特的序列。
术语互补性指多核苷酸与另一个多核苷酸序列通过传统的沃森克里克或其它非传统类型形成氢键的能力。涉及本发明的多核苷酸分子时，多核苷酸分子与其靶标(有效结合位点)或互补序列的结合游离能量足以推进所述多核苷酸的相关功能，如酶的mRNA切割或翻译抑制。对核酸分子的结合游离能量的测定为本领域熟知(Frier等1986，Turner等1987)。互补性百分比指示能与第二多核苷酸序列形成氢键(例如，沃森克里克碱基配对)的第一核苷酸分子中的毗连链中的碱基百分数(如十分之五、六、七、八、九、十即50%、60%、70%、80%、90%和100%互补性)。完全互补性表示多核苷酸序列的毗连链中所有碱基与第二多核苷酸序列中相同数量的毗连碱基形成氢键。
通过抑制、下调或敲减基因表达，指通过转录自所述基因的RNA水平或翻译自所述RNA的多肽、蛋白质或蛋白质亚基水平检测，所述基因的表达低于没有阻断本发明的多核苷酸偶联物时观察到的水平。用本发明组合物所递送多核苷酸进行的基因表达抑制、下调或敲减优选低于对照失活核酸(序列杂乱的核酸或钝化错配的核酸)存在时或所述多核苷酸未偶联掩蔽聚合物时观察到的水平。
体内给予
药理学和毒理学中，给予途径是使药物、液体、毒剂或其它物质接触身体的途径。通常，用于治疗哺乳动物的药物和核酸给予方法为本领域熟知，且可用于给予本发明组合物。本发明化合物可通过任何合适途径在根据所述途径适当调整的制剂中应用，最优选肠胃外。因此，可通过注射，例如静脉内、肌内、皮内、皮下或腹膜内注射给予本发明化合物。因此，本发明还提供含有药学上可接受载体或赋形剂的药物组合物。
给予的肠胃外途径包括脉管内(静脉内、动脉内)、肌肉内、实质内、皮内、真皮下(subdermal)、皮下(subcutaneous)、肿瘤内、腹膜内、鞘内、硬膜下、硬膜外和淋巴内注射，使用注射器和针或导管。本文所述脉管内表示在称为脉管的管状结构内，其连接体内的组织或器官。所述管状结构的腔内，体液流向或流自身体部分。体液的示例包括血液、脑脊液(CSF)、淋巴液或胆汁。脉管的示例包括冠状动脉、细动脉、毛细管、小静脉、窦状小管、静脉、淋巴管、胆管和唾液腺管或其他外分泌腺管。脉管内途径包括通过诸如动脉或静脉等血管的递送。血液循环系统提供药物的全身扩散。
所述组合物在药学上可接受载体溶液中注射。药学上可接受指药理学/毒理学角度上哺乳动物可以接受的那些特性和/或物质。短语药学上可接受指给予哺乳动物时生理上可耐受且通常不产生过敏或其他不利或毒性反应的分子实体、组合物和特性。本文所用术语药学上可接受摂优选指被联邦或州政府管理机构批准，或美国药典或其它公认药典所列用于动物应用，更具体用于人。
治疗效果
RNAi多核苷酸可递送用于研究目的或用于在治疗细胞中产生变化。RNAi多核苷酸的体内递送用于研究试剂和各种治疗、诊断、靶标确认、基因组开发、基因工程改造和药物基因组应用。我们公开的RNAi多核苷酸递送引起肝实质细胞中内源基因表达的抑制。多核苷酸递送后测量的报告(标记)基因表达水平指示其它多核苷酸递送后基因表达水平相似的合理预期。本领域普通技术人员认为有益的治疗水平在疾病之间不同。例如，血友病A和B分别由X连锁的凝结因子VIII和IX缺陷引起。其临床过程受到因子VIII或IX的正常血清水平百分比极大影响：<2%、严重；2-5%，中度，和5-30%轻度。因此，严重患者中循环因子的正常水平从1%增加到2%可视为有益。高于6%的水平阻止自发流血但不阻止那些手术或损伤的继发性流血。相似地，提供治疗益处不必100%的基因抑制。基因治疗领域普通技术人员能基于标记基因结果的充分水平来合理预期疾病特异性基因表达的有益水平。血友病示例中，若标记基因以与因子VIII正常水平的2%体积相当的水平表达产生蛋白质，则可合理预期编码因子VIII的基因还会以相似水平表达。因此，报告或标记基因通常用作细胞内蛋白质表达的有用范例。
肝脏是RNAi治疗的重要靶组织，因为其在代谢(如各种血胆脂醇过多中的脂蛋白代谢)和循环蛋白(如血友病中的凝结因子)分泌中起关键作用。此外，获得性疾病(如慢性肝炎和硬化)是常见的，并且也可能通过RNAi疗法治疗。影响肝脏或受肝脏影响的多种疾病或病症都可能通过敲减(抑制)肝脏中的基因表达来治疗。此类肝脏疾病和病症可选自下组：肝癌(包括肝细胞癌,HCC)、病毒感染(包括肝炎)、代谢紊乱(包括高脂血症和糖尿病)、纤维症和急性肝损伤。
待给予的递送聚合物和RNAi-多核苷酸偶联物的量(剂量)可通过常规实验来确定。已显示用0.05-20mg/kg动物体重的siRNA-偶联物和1.5-60mg/kg动物体重的递送聚合物能有效敲减基因表达。小鼠中的优选量为0.25-2.5mg/kgsiRNA-偶联物和1-40mg/kg递送聚合物。更优选地，给予约2-20mg/kg递送组合物。
如本文所用，体内表示生物体内部发生且更具体的表示与部分或死亡个体相反的完整、活的多细胞生物体(动物)如哺乳动物的活组织中或活组织上进行的过程。
转染试剂
本文所述的聚(乙烯基酯)可作为体外转染试剂使用。体外递送多核苷酸至细胞的方法通常称为转染或转染过程。本文所用的术语转染指将多核苷酸从细胞外引入细胞内，从而所述多核苷酸具有生物学活性。所述多核苷酸可用于研究目的，或可用以在治疗细胞中产生变化。多核苷酸的递送可导致所述靶细胞中存在的遗传物质的修饰。
体外转染试剂是与寡核苷酸或多核苷酸结合或复合，并且体外介导所述寡核苷酸或多核苷酸进入细胞(通常是哺乳动物细胞)的化合物或化合物的组合物。体外转染试剂的示例包括但不限于，蛋白质和聚合物复合物(多聚复合体)、脂质和脂质体(脂复合体)、聚合物和脂质的组合(脂多聚复合体(lipopolyplexes))、磷酸钙沉淀和枝状聚合物。所述体外转染试剂通常具有代净正电荷的成分，其通过静电相互作用与寡核苷酸或多核苷酸的负电荷相关联或复合。阳离子体外转染试剂也可浓缩大型核酸。除其体外递送能力以外，本文所述的聚(丙烯酸酯)还可作为体外转染试剂使用。就作为体外转染试剂使用而言，所述聚(丙烯酸酯)可被掩蔽或不被掩蔽。
实施例
实施例1。聚合物单体的合成。
A.材料。乙酸乙烯(VAc)、丁酸乙烯(VBu)、乙酸Pd(II)、γ-(Boc-氨基)丁酸(Boc-GABA)、5-(Boc-氨基)戊酸(Boc-5-Ava-OH)、戊酸、二硫化碳、氢化钠、四氢呋喃(THF)、二甲亚砜(DMSO)、二苯胺、氯代丙二酸二乙酯和硫酸镁(MgSO4)，上述这些物质购自西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)，并且不经纯化即可使用。单体3-叔-丁氧基羰基氨基-丙酸乙烯基酯(BAPVE)购自西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)，然后溶解于乙酸乙酯并通过氧化铝塞以去除抑制剂。
B.4-叔-丁氧基羰基氨基-丁酸乙烯基酯(BABVE)3保护的乙烯基胺酯单体。使γ-(Boc-氨基)丁酸2(Boc-GABA,10g,49.20mmol,CAS57294-38-9)在室温(RT)下溶解于乙酸乙烯1(450mL,4920mmol,CAS108-05-4)。一旦溶解，添加乙酸Pd(II)(2.21g,9.84mmol,CAS3375-31-3)和KOH(276mg,4.92mmol,CAS1310-58-3)，然后使所述反应混合物在室温搅拌过夜。然后，将所述反应混合物转移至大幅过量的二乙醚，以使黑色Pd副产物沉淀。然后，将所述溶液加沉淀物通过硅藻土(celite)过滤以去除所述黑色沉淀物。然后，将所得溶液浓缩至干，并采用内含15%乙酸乙酯的己烷洗脱液，使产物3在二氧化硅柱上纯化。一般产率为70～90%。分子量：229.28。
C.5-叔-丁氧基羰基氨基-戊酸乙烯基酯(BAVVE)6保护的胺单体。使5-(Boc-氨基)戊酸5(Boc-5-Ava-OH,10g,46.03mmol,CAS27219-07-4)在室温下溶解于乙酸乙烯1(424mL,4603mmol)。一旦溶解，添加乙酸Pd(II)(2.07g,9.21mmol)和KOH(258mg,4.60mmol)，并使所述反应混合物在室温下搅拌过夜。然后，将所述反应混合物转移至大幅过量的二乙醚，以使黑色Pd副产物完全沉淀。然后，将所述溶液加沉淀物通过硅藻土(celite)过滤以去除所述黑色沉淀物。然后，将所得溶液浓缩至干，并采乙酸乙酯/己烷洗脱液，使产物6在二氧化硅柱上纯化。一般产率为70～90%。分子量243.31。
D.戊酸乙烯酯(VV)8疏水性单体(CAS5873-43-8)。使戊酸7(5g,48.96mmol,CAS109-52-4)在室温下溶解于乙酸乙烯1(450mL,4896mmol)。一旦溶解，添加乙酸Pd(II)(2.20g,9.79mmol)和KOH(275mg,4.89mmol)，然后使所述反应混合物在室温下搅拌过夜。然后，将所述反应混合物转移至大幅过量的二乙醚，以使黑色Pd化合物完全沉淀。然后，将所述溶液加沉淀物通过硅藻土(celite)过滤以去除所述黑色沉淀物。然后，将所得溶液浓缩至干，并采乙酸乙酯/己烷洗脱液，使产物在二氧化硅柱上纯化。一般产率约为30%。分子量128.17。
E.3-(2-叔-丁氧基羰基氨基-乙氧基)-丙酸乙烯基酯(BEPVE)的合成。
1)3-(2-叔-丁氧基羰基氨基-乙氧基)-丙酸叔丁酯的合成。使Boc-乙醇胺(10mL,64.64mmol)和丙烯酸叔丁酯(18.82mL,129.28mmol)溶解于用氩气吹扫的火焰干燥的圆底烧瓶中的二噁烷(25mL)中，并加热至25℃。
添加60%KOH溶液(1.5mL)，并使所述反应很混合物在25℃搅拌过夜。
通过TLC监督所述反应，然后添加更多的KOH溶液直至大部分的起始Boc-乙醇胺消耗。然后，使所述反应混合物与DCM混合，然后用去离子水清洗三次，并用盐水清洗一次。回收有机层，用Na2SO4干燥，并通过旋转蒸发去除溶剂。所得油状物使用乙酸乙酯/己烷洗脱液在二氧化硅柱上纯化。产率＝70%。
2)3-(2-氨基-乙氧基)-丙酸。使3-(2-叔-丁氧基羰基氨基-乙氧基)-丙酸叔丁基酯(10g)溶解于三氟乙酸(TFA)/DCM的1:1混合物(100mL)中，并在室温下搅拌1小时。然后，在旋转蒸发仪上去除溶剂，并使所得油状物重新溶解于DCM中并浓缩至干。重复该方法直至将TFA气味残留减至最小，然后使所述油状物高真空干燥数小时。
3)3-(2-叔-丁氧基羰基氨基-乙氧基)-丙酸。使3-(2-氨基-乙氧基)-丙酸溶解于最小量的去离子水，然后通过小心添加1M的NaOH将pH提高至8.5。pH调节后，向所述溶液逐滴添加Boc2O(THF中1M，2当量)并在室温下搅拌过夜。通过旋转蒸发去除THF，并使反应混合物溶解于1:1乙酸乙酯/甲醇，然后用10%的柠檬酸溶液清洗。水层用乙酸乙酯萃取三次，用DCM萃取两次。合并有机层，用Na2SO4干燥，并在真空下浓缩至干。所得的粗制油状物使用乙酸乙酯/己烷洗脱液，通过二氧化硅凝胶色谱纯化。产率＝30%。
4)3-(2-叔-丁氧基羰基氨基-乙氧基)-丙酸乙烯基酯。使3-(2-叔-丁氧基羰基氨基-乙氧基)-丙酸(3.72g,15.95mmol)溶解于乙酸乙烯(147mL,1595mmol)中。向所述反应混合物添加乙酸Pd(II)(716mg,3.19mmol)和KOH(89mg,1.59mmol)并搅拌过夜。将所述反应混合物转移至大幅过量的二乙醚以使黑色Pd副产物完全沉淀。然后，将所述溶液加沉淀物通过硅藻土(celite)过滤以去除所述黑色沉淀物。然后，将所得溶液浓缩至干，并采乙酸乙酯/己烷洗脱液，使产物在二氧化硅柱上纯化。产率＝60%。
F.丙二酸酯N,N-二苯基二硫代氨基甲酸酯(MDPD)的合成。按照Shipp等所述的方法合成MDPD。简言之，使NaH(1.24g,0.0520mol)悬浮于THF(10mL)中并使用冰浴冷却至0℃。添加内含二苯胺(3.38g,0.0200mol)的DMSO(18mL)和THF(9mL)溶液，并在0℃搅拌1小时。添加二硫化碳(2.84mL,0.0472mol)，并使所述溶液在0℃另搅拌30分钟。然后，使用乙二醇/CO2浴使所述溶液冷却，之后添加氯代丙二酸二乙酯(3.23mL,0.0200mol)并在室温下另搅拌2小时。
用甲醇水解任何剩余的NaH，并用二乙醚萃取产物。然后去除挥发物质，并用二氧化硅柱(乙酸乙酯:己烷混合物10:90以去除二苯胺杂质，之后用30:70洗脱产物)纯化产物。使所述产物真空干燥以获得黄色固体(产率72%)。
实施例2。乙烯基酯单体的RAFT共聚化以形成两亲性阳离子聚(乙烯基酯)无规共聚物。
A.按照Shipp等.2009，使用丙二酸酯N,N-二苯基二硫代氨基甲酸酯9(MDP-DTC)进行可逆加成-断裂链转移(RAFT)聚合。
Vidyasagar Malepu等.“RAFT Polymerization of Vinyl Acetate,Styrene andAcrylates Using N,N-Dithiocarbamates(使用N,N-二硫代氨基甲酸酯类的乙酸乙烯、苯乙烯和丙烯酸酯类的RAFT聚合)”刊于Controlled/Living RadicalPolymerization:Progress in RAFT,DT,NMP&OMRP(《可控/活性自由基聚合：RAFT、DT、NMP和OMRP的进展》),Matyjaszewski K编；ACS研讨会丛书，第1024卷,第3章,第37–47页;美国化学协会(American Chemical Society),华盛顿D.C.,2009。
B.聚合物计算：聚合物理论分子量(Mn,th)、单体摩尔数、链转移剂摩尔数、引发剂摩尔数。
从单体A和B合成聚合物P的一般反应
A=亲水性单体
B=疏水性单体
P=聚合物
C=链转移剂(CTA)
I=引发剂
聚合物P的单体平均分子量的计算
[ % A &times; MW A ] + [ % B &times; MW B ] = MW &OverBar; AB
%A=聚合物P中亲水性单体A的百分比
%B=聚合物P中的疏水性单体B的百分比
MWA=亲水性单体A的分子量
MWB=疏水性单体B的分子量
具有所需(理论)分子量Mn,th(下方等式中的Mn)的聚合物P中的单体数量的计算：
M n / MW &OverBar; AB = n AB
nAB=具有理论分子量Mn,th的聚合物P中的单体数量
具有理论分子量Mn,th的x克聚合物P中的单体A和B的摩尔数计算：
摩尔数A=亲水性单体A的摩尔数
摩尔数B=疏水性单体B的摩尔数
用于合成具有理论分子量Mn,th的x克聚合物P的链转移剂摩尔数计算：
摩尔数A/[nAB×％A]＝摩尔数B[nAB×％B]＝摩尔数C
摩尔数C=链转移剂的摩尔数
用于合成具有理论分子量Mn,th的x克聚合物P的引发剂摩尔数计算：
%I×摩尔数C=摩尔数I
摩尔数I=引发剂的摩尔数
C.用于受保护的乙烯基胺酯无规共聚物的RAFT聚合的一般方法。使CTA和引发剂在反应容器中合并，并在高真空下干燥。添加亲水性单体，并通过通入N2鼓泡来使所述混合物脱气1小时。相似地，对过量疏水性单体的另一小瓶进行脱气。向反应容器添加检测量的脱气的疏水性单体，并使该混合物在95℃搅拌过夜。约16小时后，将所述反应容器从热源移出，并使所述溶液冷却至室温。使所得凝胶溶解于二氯甲烷(DCM)并通过添加己烷(约8×体积)使所述聚合物沉淀。离心后，将所述溶液轻轻倒出，并用己烷漂洗所述聚合物。使所述经漂洗的聚合物重新溶解于DCM，并再次用己烷(约8×体积)沉淀。离心后，将所述溶液轻轻倒出，并使所述聚合物在高真空下干燥。
D.NMR分析。在CDCl3中制备7.5mg/ml的所述聚合物的样品。在Varian400Hz MR仪上采用2秒驰豫延迟和32-64扫描来获取1H-NMR光谱。所述广谱用人工定相分析，随后进行积分校正和基线校正。
E.MALS(多角度光散射)分子量分析。所述聚合物的样品以10mg/ml加入用0.02μm沃特曼(Whatman)阿诺迪斯(anodisc)过滤的缓冲液(DCN，20%THF，5%CAN)中。然后，通过0.1μm的沃特曼安妥(anotop)滤器过滤所述溶液。使所述样品在上述缓冲液中以0.75ml/分钟通过Jordi凝胶DVB混合床分析柱。然后，使所述样品通过HELEOS光散射检测仪和optilab REX RI检测仪。收集数据并采用ASTRA V软件，使用先前测定的0.63ml/gm的dn/dc进行分析。所述ASTRA V分析提供Mw和Mn。
实施例3。聚(5-叔-丁氧基羰基氨基戊酸乙烯基酯-共聚-丁酸乙烯)，P(BAVVE-共聚-VBu)的合成。
A.胺保护的DAN-41947-106聚(乙烯基酯)无规共聚物合成。使丙二酸酯N,N-二苯基二硫代氨基甲酸酯(MDPC,2.56mg,0.0066mmol)和过氧化苯甲酰(BPO,0.795mg,0.00328mmol)在反应容器中干燥，并添加5-叔-丁氧基羰基氨基-戊酸乙烯基酯3(1.00g,4.11mmol)。通过通入N2鼓泡使所述混合物脱气1小时。
相似地，对另一小瓶的丁酸乙烯(VBu)进行脱气。向所述反应容器添加VBu(345μL,2.74mmol,CAS123-20-6)并使所述混合物在95℃搅拌过夜。约16小时后，将所述反应容器从热源移出，并使所述溶液冷却至室温(RT)。使所得凝胶溶解于5mL DCM中，并通过添加40mL的己烷使所述聚合物沉淀。离心后，将所述溶液轻轻倒出，并用5mL己烷漂洗所述聚合物。使经漂洗的聚合物重新溶解于5mL DCM，并再次用40mL己烷沉淀。离心后，将所述溶液轻轻倒出，并使所述聚合物在高真空下干燥。1H NMR(CDCl3):δ7.4,4.7-5.25,3.1,2.15-2.4,1.45-1.95,0.95.
B.聚合物的沉淀。干燥后，使所述聚合物以100mg/mL的浓度溶解于DCM中，并通过添加己烷来完全或分级沉淀。
(共)聚合物的完全沉淀和分级沉淀。聚合化之后，使所述反应溶液冷却至室温，并转移至50mL离心管。使用DCM(2mL)清洗出所述反应容器并协助转移所述反应溶液，之后向该溶液添加己烷(35mL)。以4,400rpm离心该溶液2分钟。轻轻倒出上清液层，并用己烷漂洗底部(粘性液体或固体)层。使该底部层重新溶于DCM(7mL)，在己烷(35mL)中沉淀并再离心一次。轻轻倒出上清，用己烷冲洗底部层，然后使聚合物减压干燥数小时。
(共)聚合物的分级沉淀。聚合化之后，使所述反应溶液冷却至室温，并转移至50mL离心管。使用DCM(2mL)清洗出所述反应容器并协助转移所述反应溶液，之后向该溶液添加己烷(35mL)。以4,400rpm离心该溶液2分钟。轻轻倒出上清液层，并用己烷漂洗底部(粘性液体或固体)层。使所述底部层重新溶解于DCM(100mg/mL聚合物)，之后添加己烷。在该情况下，添加足够的己烷以使总聚合物的一半沉淀－通常所述己烷的量需要使所述溶液刚过浊点。达到这一点的己烷添加量视所述共聚物溶液的类型和分子量而不同。将所述浑浊混合物离心(以4,400rpm离心3分钟)，形成两个液层。用玻璃移液器移出较稠厚的底部层，用DCM(5mL)稀释，然后通过添加己烷(30mL)来完全沉淀以获得部分1。向所述顶部层添加己烷以获得50mL的总体积和完全沉淀部分2。将两种沉淀物离心(以4,400rpm离心2分钟)，然后通过轻轻倒出上清液，用己烷漂洗沉淀的聚合物并最终减压干燥数小时来回收不同部分。
C.聚合物的去保护。使干燥的聚合物溶解于5-10mL的内含2M HCl的乙酸溶液，并在室温下搅拌1小时。所述反应混合物用40mL去离子H2O(dH2O)稀释，置于含约3500的标称MWCO的透析袋中，并在高盐(NaCl)中透析两次(8-16小时)，然后在dH2O中透析两次(8-16小时)。然后，将所述聚合物冻干。
按照类似的方法进行BAVVE和VAc、VPr、VBu或VV的共聚合。在一些情况下，在脱气之前向所述反应混合物添加0～3mL乙酸丁酯。改变MDPD相对浓度、引发剂和单体。
表1.示例性的基于BAVVE的聚(乙烯基酯)共聚物。
实施例4。聚(5-叔-丁氧基羰基氨基丙酸乙烯基酯-共聚-乙烯基丁酸酯)，P(BAPVE-VBu共聚物)的合成。向20mL小瓶添加丙二酸酯N,N-二苯基二硫代氨基甲酸酯(MDPD,0.00876g,0.0217mmol)、AIBN(0.89mg,0.00542mmol)、BAPVE(0.800g,0.00374mol)和乙酸丁酯(BuAc,1mL)溶液，并通入N2鼓泡脱气1小时。相似地，对另一个小瓶的丁酸乙烯(VBu)进行脱气，然后通过注射器添加(0.316mL,0.00249mmol)。使所述混合物在80℃搅拌4小时，然后冷却至室温。使所得的粘性溶液溶解于5mL DCM中，并通过添加40mL的己烷使所述聚合物沉淀。离心后，将上层溶剂轻轻倒出，并用5mL己烷漂洗所述聚合物。使经漂洗的聚合物重新溶解于5mL DCM，并用40mL己烷再沉淀一次。离心后，将上层溶剂层轻轻倒出，并使所述聚合物在高真空下干燥。1H NMR(CDCl3):δ7.4,5.3-5.6,4.7-5.1,3.35,2.5,2.25,1.55-1.9,1.45,0.95.13C NMR(CDCl3):δ171.5,170.5,155,79,66-68.5,39-41.5,37,35.5,29.5,19.5,15.Mn27,400(Mw/Mn1.34).产率74%。
表2.示例性的基于BAPVE的聚(乙烯基酯)共聚物
a–Mn,th
按照类似的方法进行BAPVE和VAc、VPr、VBu或VV的所有共聚合。在一些情况下，向所述反应混合物添加0～3mL BuAc，然后脱气，同时还使用替代引发剂(例如BPO和ADMV)。改变MDPD相对浓度、引发剂和单体。
实施例5。聚(4-叔-丁氧基羰基氨基丁酸乙烯基酯-共聚-丁酸乙烯)，P(BABVE-共聚-VBu)的合成。向20mL小瓶添加丙二酸酯N,N-二苯基二硫代氨基甲酸酯(MDPD,2.56mg,0.00634mmol)和过氧化苯甲酰(0.767mg,0.00317mmol)的THF溶液并真空干燥30分钟，之后添加BABVE(0.800mg,0.00351mol)。通过通入N2鼓泡使所述混合物脱气1小时。类似地，对另一小瓶丁酸乙烯脱气。向所述反应容器添加丁酸乙烯(296μL,0.00234mol)并使所述混合物在95℃搅拌过夜。约16小时后，将所述反应容器从热源移出，并使所述溶液冷却至室温。使所得凝胶溶解于5mL DCM中，并通过添加40mL的己烷使所述聚合物沉淀。离心后，将所述溶液轻轻倒出，并用5mL己烷漂洗所述聚合物。使经漂洗的聚合物重新溶解于5mL DCM，并再用40mL己烷沉淀一次。离心后，将所述溶液轻轻倒出，并使所述聚合物在高真空下干燥。1H NMR(CDCl3):δ7.4,5.05-5.45,4.7-5.05,3.15,2.15-2.45,1.55-1.9,1.45,0.95.
按照类似的方法进行BAPVE和VAc、VPr、VBu或VV的共聚合。在一些情况下，在脱气之前向所述反应混合物添加0～3mL乙酸丁酯。改变MDPD相对浓度、引发剂和单体。
表3.示例性的基于BABVE的聚(乙烯基酯)共聚物。
实施例6。聚3-(2-叔-丁氧基羰基氨基乙氧基)丙酸乙烯基酯-共聚-丁酸乙烯共聚物)，P(BEPVE-共聚-VBu)。向20mL小瓶添加丙二酸酯N,N-二苯基二硫代氨基甲酸酯(MDPD,2.14mg,0.0134mmol)、偶氮二异丁腈(AIBN,1.09mg,0.00665mmol)和BEPVE(505mg,0.00214mol)溶液，并通入N2鼓泡脱气1小时。类似地，对另一小瓶丁酸乙烯脱气。向所述反应容器添加丁酸乙烯(162mg,0.00143mol)并使所述混合物在95℃搅拌过夜。约16小时后，将所述反应容器从热源移出，并使所述溶液冷却至室温。使所得的粘性溶液溶解于5mL DCM中，并通过添加40mL的己烷使所述聚合物沉淀。离心后，将所述溶液轻轻倒出，并用5mL己烷漂洗所述聚合物。使经漂洗的聚合物重新溶解于5mL DCM，并用40mL己烷再沉淀一次。离心后，将所述溶液轻轻倒出，并使所述聚合物在高真空下干燥。1H NMR(CDCl3):δ7.4,5.1-5.5,4.75-5.1,3.65,3.5,3.28,2.55,2.25,1.55-1.9,1.45,0.95.13C NMR(CDCl3):δ171.5,169.5,155,79,70.5,66.5,41,40,37,35.5,29.5,19.5,15.Mn23,100(Mw/Mn1.33).产率64%。
按照类似的方法进行BEPVE和VAc、VPr、VBu或VV的共聚合。在一些情况下，在脱气之前向所述反应混合物添加0～3mL乙酸丁酯。改变MDPD相对浓度、引发剂和单体。
实施例7。掩蔽剂
A.半乳糖双取代的马来酸酐掩蔽剂。
1)化合物10
其中
Y是中性接头，例如但不限于：-(CH2)a-(O-CH2-CH2)b-NH-CO-(CH2)c-，其中a、b和c独立地是1-6的整数，并且
R是半乳糖衍生物，其对选自下组的去唾液酸糖蛋白受体具有亲和性：
OH(半乳糖)，
NH2(D-半乳糖胺)，
NH-CO-H(N-甲酰基-D-半乳糖胺)，
NH-CO-CH3(N-乙酰基-D-半乳糖胺(GalNAc))，
NH-CO-CH2CH3(N-丙酰基-D-半乳糖胺)，
NH-CO-CH2CH2CH3(N-n-丁酰基-D-半乳糖胺)，和
NH-CO-CH(CH3)2(N-异-丁酰基-D-半乳糖胺)。
马来酸酐与所述聚合物上的胺基团反应导致形成所述半乳糖和聚合物的胺之间的pH不稳定连接。
2)化合物11
其中
Y是中性接头，例如但不限于：-NH-(CH2-CH2-O)b-(CH2)a-，其中b和c独立地是1～6的整数，并且
R如上文对于化合物10的定义。
3)化合物12
其中n是1～6的整数，且R如上文针对化合物10的定义。
4)化合物13：N-乙酰基-半乳糖胺-PEG-甲基马来酸酐
其中n是1～6的整数。
5)也可如化合物14中所示地使用烷基间隔子基团。
其中n是0～10的整数，并且R如上文对于化合物10的定义。
B.聚乙二醇双取代的马来酸酐掩蔽剂。
1)化合物15
其中R是中性的，并且包含聚乙二醇。
马来酸酐与所述聚合物上的胺基团反应导致形成所述PEG和聚合物的胺之间的pH不稳定连接。
2)化合物16
其中
n是1～500的整数，并且
R选自下组：–H、-CH3和–CH2-CH3。
优选地，n是2～100的整数。更优选地，所示PEG包含5～20个乙烯单元(n是5～20的整数)。更优选地，PEG包含10～14个乙烯单元(n是10～14的整数)。PEG可具有不同长度，且平均长度为5～20或10～14个乙烯单元。或者，PEG可为单分散、均匀或分开的；具有例如精确的11或13个乙烯单元。
C.二肽掩蔽剂，化合物16
R1和R2是氨基酸的R基团，
R4是位阻稳定剂的靶向配体，
X是–NH-、-O-或-CH2-，
Y是–NH-或-O-
R5是位于2、4或6位的-CH2-O-C(O)-O-Z，其中Z是碳酸酯，和
R6独立是各位于2、3、4、5或6位(R5占据的位置除外)的氢、烷基或卤素。
实施例8。siRNA和聚(乙烯基酯)无规共聚物通过二硫键的偶联。在典型哺乳动物细胞内的还原性环境中，可采用不同切割动力学来生成二硫键。
A.SATA/SMPT连接。N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基硫代乙酸酯(SATA)修饰的多核苷酸通过使5′胺修饰的siRNA和1重量当量(wt.eq.)的SATA试剂(皮尔斯公司(Pierce))和0.36wt.eq.的NaHCO3在水中于4℃反应16小时来合成。通过添加9体积的乙醇并在-78℃孵育2小时来使经保护的硫醇修饰的siRNA沉淀。所述沉淀物经分离并溶解于1×siRNA缓冲液(达马可公司(Dharmacon))中，并通过在260nm波长处检测吸光度来定量。
另外，通过添加1.5重量%的4-琥珀酰亚胺基氧基羰基-α-甲基-α-[2-吡啶基二硫]-甲苯(SMPT，皮尔斯公司(Pierce))来修饰5mM TAPS pH9中的聚合物。在添加SMPT后1小时，向含有5mM TAPS pH9的等张葡萄糖溶液添加SMPT-聚合物。向该溶液添加SATA修饰的siRNA。使所得多核苷酸-聚合物偶联的二硫键在细胞质还原性环境中是可逆的。
通过向所述溶液添加HEPES游离碱，然后添加CDM-NAG和/或CDM-PEG混合物来掩蔽所述siRNA-聚合物偶联物。然后，所述溶液在注射之前在室温(RT)下孵育1小时。
B.SATA/SPDP连接。使有义链上的具有5′-氨基基团的siRNA在HEPES碱(pH7.5)的存在下与SATA反应。另外，使聚合物在HEPES(pH7.5)的存在下与3-(2-吡啶基二硫)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SPDP)反应。然后，使经修饰的siRNA和经修饰的聚合物结合以使所述siRNA共价连接至所述聚合物。
C.5-甲基-2-亚氨基四氢噻吩连接。使具有链末端氨基基团的siRNA与S-乙酰基基团反应以生成siRNA-Sac。使所述聚合物在5,5'-二硫代-双-(2-硝基苯甲酸)DTNB的存在下与5-甲基-2-亚氨基四氢噻吩(M2IT)反应以生成具有经活化的二硫键的聚合物。
然后，使上述经修饰的聚合物与siRNA-SAc反应以形成siRNA-聚合物偶联物。
C.马来酸酐连接。使具有链末端氨基基团的siRNA在碱性缓冲液(例如，HEPES，pH7.9)的存在下与同样包含额外的胺反应基团(例如，CDM-硫酯)的双取代的马来酸酐衍生物(例如，2-丙酸-3-甲基马来酸酐)反应。向所述siRNA-马来酸酐添加所述聚(乙烯基酯)。然后，使所述马来酸酐与所述聚合物上的胺反应。
实施例9。膜活性的聚(乙烯基酯)无规共聚物的可逆修饰(掩蔽)。
A.采用基于马来酸酐的掩蔽剂修饰。在修饰之前，从0.1%冰醋酸的水性溶液冻干出5-7×mg的双取代马来酸酐掩蔽剂(例如，CDM-NAG)。向所述干燥的双取代马来酸酐掩蔽剂添加内含×mg聚合物的0.2×mL的整张葡萄糖溶液和10×mg的HEPES游离碱。在酐完全溶解之后，使所述溶液在室温下孵育至少30分钟，然后给予动物。双取代马来酸酐掩蔽剂和所述聚合物反应生成：
其中R是聚(乙烯基酯)聚合物，且R1包含靶向配体或位阻稳定剂。所述酐和聚合物的胺之间的反应中产生的羧基酐表现出约1/20的预期电荷(Rozema等Bioconjugate Chemistry2003)。因此，膜活性多胺被有效中和而不是转变为带有高负电荷的聚阴离子。
在一些应用中，所述聚合物以两步法修饰。将带有遮蔽基团(PEG)和靶向基团的基于CDM的第一掩蔽剂以遮蔽:靶向剂为2:1(重量:重量)的比例混合。所述聚合物用2×mg的所述CDM掩蔽剂混合物修饰30分钟，然后连接siRNA。然后，用5×mg的所述CDM掩蔽剂混合物进一步修饰所述聚合物-siRNA偶联物。然后，使所述溶液在室温(RT)下至少孵育1小时，之后再给动物注射。
B.采用蛋白酶切割掩蔽剂的修饰。使活化的(胺反应性)对酰胺苄醇衍生物的碳酸酯与两亲膜活性多胺的氨基基团在H2O中(pH>8)反应以生成对酰胺苄基氨基甲酸酯。
R1包含靶向基团配体(经保护的或未经保护的)或PEG，
R2是两亲性膜活性的聚(乙烯基酯)，
AA是二肽(经保护的或未经保护的)，和
Z是胺反应性碳酸酯。
向×mg聚合物添加含10～12×mg的HEPES游离碱的等张葡萄糖。向缓冲的聚合物溶液添加含2×～16×mg200mg/ml二肽掩蔽剂的DMF。在一些应用中，所述聚合物用2×mg二肽掩蔽剂修饰，然后连接siRNA。然后，用6×～8×mg二肽掩蔽剂进一步修饰所述聚合物-siRNA偶联物。然后，使所述溶液在室温(RT)下至少孵育1小时，之后再给动物注射。在一些应用中，所述聚合物用2×mg PEG二肽掩蔽剂修饰，然后连接siRNA。然后，所述聚合物-siRNA偶联物进一步用6×～8×mg靶向配体二肽掩蔽剂修饰。然后，使所述溶液在室温(RT)下至少孵育1小时，之后再给动物注射。
在一些应用中，所述聚合物用2×mg二肽掩蔽剂修饰，然后连接siRNA。然后，所述聚合物-siRNA偶联物进一步用6×～8×mg的基于CDM的掩蔽剂修饰。然后，使所述溶液在室温下孵育至少1小时，之后再给动物注射。在一些应用中，所述聚合物用2×mg PEG二肽掩蔽剂修饰，然后连接siRNA。然后，所述聚合物-siRNA偶联物进一步用6×～8×mg的基于靶向配体CDM的掩蔽剂修饰。然后，使所述溶液在室温(RT)下至少孵育1小时，之后再给动物注射。
实施例10。偶联物形成–掩蔽和多核苷酸连接。
A)用SMPT修饰聚合物。1小时后，在HEPES碱的存在下向所述聚合物添加2重量当量的CDM-NAG(N-乙酰基半乳糖胺)和/或CDM-PEG(平均11个单元)。向该溶液添加SATA-siRNA。孵育过夜之后，向所述偶联物添加CDM-NAG和/或CDM-PEG。
B)用SMPT修饰聚合物。1小时后，在HEPES碱的存在下向所述聚合物添加2重量当量的PheCit-NAG(N-乙酰基半乳糖胺)和/或PheCit-PEG(平均11个单元)。向该溶液添加SATA-siRNA。孵育过夜之后，向所述偶联物添加PheCit-NAG和/或PheCit-PEG。
实施例10。siRNA。siRNA具有下述序列：
因子VII-啮齿类
有义:5′GfcAfaAfgGfcGfuGfcCfaAfcUfcAf(invdT)3′(SEQ ID1)
反义:5′pdTsGfaGfuUfgGfcAfcGfcCfuUfuGfcdTsdT3′(SEQ ID2)
或
有义5′GGAUfCfAUfCfUfCfAAGUfCfUfUfACfdTsdT3′(SEQ ID3)
反义5′GUfAAGACfUfUfGAGAUfGAUfCfCfdTsdT3′(SEQ ID4)
因子VII=灵长类
有义5′uuAGGfuUfgGfuGfaAfuGfgAfgCfuCfaGf(invdT)3′(SEQ ID5)
反义5′pCfsUfgAfgCfuCfcAfuUfcAfcCfaAfcdTsdT3′(SEQ ID6)
ApoB siRNA:
有义5′GGAAUCuuAuAuuuGAUCcAsA3′(SEQ ID7)
反义5′uuGGAUcAAAuAuAAGAuUCcscsU3′(SEQ ID8)
siLUC
有义5′-uAuCfuUfaCfgCfuGfaGfuAfcUfuCfgAf(invdT)-3′(SEQ ID9)
反义5′-UfcGfaAfgUfaCfuCfaGfcGfuAfaGfdTsdT-3′(SEQ ID10)
小写字母=2′-O-CH3取代
s=硫逐磷酸酯连接
核苷酸后的f=2′-F取代
核苷酸前的d=2′-脱氧
用常规亚磷酰胺化学法在固相上进行RNA合成，使用 Oligopilot100(德国弗赖堡的通用电气医疗集团(GE Healthcare))和可控多孔玻璃(CPG)作为固体支持物。
实施例11。氨基修饰的RNA的合成。有义链5′-末端含C-6-氨基接头的RNA用标准亚磷酰胺化学法在固相上以1215μmol的量级生成，使用 Oligopilot100(德国弗赖堡的通用电气医疗集团)和可控多孔玻璃作为固体支持物(美国宾夕法尼亚州阿斯顿的引物合成公司(Prime Synthesis))。使用相应的亚膦酰胺、2′-O-甲基亚膦酰胺和TFA-己基氨基接头酰胺(德国汉堡的西格玛-艾尔德里奇(Sigma-Aldrich)SAFC公司)生成含2′-O-甲基核苷酸的RNA。用本领域已知方法(Wincott F.,等,NAR1995,23,14,2677-84)完成切割和去保护以及纯化。
实施例12。使用聚(乙烯基酯)递送聚合物来体内递送RNAi多核苷酸。如上所述合成RNAi多核苷酸偶联物和掩蔽的聚(乙烯基酯)聚合物。6-8周龄小鼠(C57BL/6或ICR品系，各约18～20g)获自HSD公司(Harlan Sprague Dawley，印第安纳州印第安纳波利斯)。注射前至少饲养小鼠2天。用哈兰(Harlan)Teklad啮齿动物饲料进行自由进食(哈兰公司(Harlan)，威斯康星州麦迪逊)。通过将0.4mL递送聚合物-siRNA偶联物的溶液输注进入尾部静脉来注射小鼠(输入尾部静脉，除非另有说明)。所述组合物在生理条件下可溶且不聚集。预计注射到其它脉管中(如眼球后注射)是等效的。
175-200g的Wistar Han大鼠获自查尔斯河实验室(Charles River)(马萨诸塞州威尔明顿)。注射前饲养大鼠至少一(1)周。对大鼠注射的体积通常是1mL。
通过使用22～25号静脉留置针向大隐静脉内注射来对猕猴(Cynomolgusmacaque)(食蟹猴(Macaca fascicularis))灵长类动物(雄性，3.0～8.0kg)给予指示量的聚合物-siRNA偶联物。作为对照，对另一组灵长类动物注射等张葡萄糖。在Cobas Integra400(罗氏诊断公司(Roche Diagnostics))上按照生产商的介绍，针对血尿素氮(BUN)、丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)和肌酸酐进行血液测试。
使小鼠、大鼠和灵长类动物在注射前经历4小时、16小时或过夜禁食。灵长类动物在血液收集或组织获取之前经历禁食过夜。就小鼠而言，通过下颌下出血收集血液样品，就大鼠而言，从颈静脉收集血液样品，就灵长类动物而言，从股静脉收集血液样品。就小鼠和大鼠而言，除非另有说明，在注射聚合物之后两天采样。就灵长类动物而言，在第2天(注射后24小时)和第4天(注射后72小时)收集血样。此外，就灵长类动物而言，进行血样收集至多至第81天。收集用于Western试验的血清，并添加至等体积的含EDTA的完全蛋白酶抑制剂混合物(Complete Protease Inhibitor Cocktail)(印第安纳州印第安纳波利斯的罗氏公司(Roche))，并在-20℃贮备。在获取肝脏之后，使用TRI-按照生产商说明(美国俄亥俄州辛辛那提的分子研究中心(Molecular Research Center))直接从肝脏分离总RNA。
血清ApoB水平的测定。用标准夹心ELISA方法测定血清ApoB蛋白水平。简言之，多克隆山羊抗小鼠ApoB抗体和兔抗小鼠ApoB抗体(生物设计国际公司(Biodesign International))分别用作捕获和检测抗体。之后应用HRP偶联的山羊抗兔IgG抗体(西格玛(Sigma))以结合ApoB/抗体复合物。然后通过Tecan Safire2（欧洲奥地利）酶标仪测量450nm处四甲基联苯胺（TMB，西格玛）比色显影的吸光度。
血浆因子VII(F7)活性检测。(小鼠通过下颌下出血或大鼠通过颈静脉)收集血液(9体积)制备动物的血浆样品，按照标准程序装入含0.109mol/L柠檬酸钠抗凝血剂(1体积)的微量离心管中。血浆F7活性使用BIOPHEN VII试剂盒(俄亥俄州梅森的海丰生物医药公司(Hyphen BioMed)/阿尼拉公司(Aniara))用生色法按照生产商推荐测量。比色显影的吸光度通过Tecan Safire2酶标仪在405nm处测量。
实施例13。通过P(BAVVE-共聚-VBu)聚合物递送因子VII siRNA之后的小鼠、大鼠和非人灵长类中的因子VII的敲减。P(BAVVE-共聚-Vbu-)聚合物(DAN-41947-106-1或DAN-41947-129-1)用2.3重量当量的CDM-NAG和4.7重量当量的CDM-PEG可逆修饰，并如上所述与因子VII siRNA(SEQ ID3和4的双链体)偶联。如上所述测定对因子VII水平的影响。使用约0.5mg/kg～近16mg/kgP(BAVVE-共聚-VBu聚合物观察到因子VII活性的有效敲减，而引起的血尿素氮(BUN)、丙氨酸转氨酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(ALT)或肌酸酐水平增加不多于三倍。
表4.用与因子VII-siRNA偶联的CDM-NAG/CDM-PEG掩蔽的P(BAVVE-共聚-VBu)聚合物处理的动物内的正常肝脏细胞中因子VII活性的抑制。
实施例14。在使用含不同单体比例成分的聚(乙烯基酯)递送聚合物递送siRNA之后的小鼠内的靶基因敲减。含不同胺单体的P(BAVVE-VBu共聚物)或P(BAPVE-共聚-VBu共聚物)聚合物：疏水性单体组合物用2.3重量当量的CDM-NAG和4.7重量当量的CDM-PEG可逆修饰，并如上所述与因子VII siRNA(上述SEQ ID3和4的双链体)偶联。向各小鼠注射7.5mg/kg聚合物和2mg/kgsiRNA。如上所述测定对因子VII水平的影响。结果证明，采用具有56-80%胺含量的聚合物观察到有效敲减。然而，具有56-60%胺含量的聚合物是最有效的。
表5.通过靶基因敲减测定的对于采用掩蔽的P(BAVVE-共聚-VBu)或P(BAPVE-共聚-VBu)递送聚合物处理的小鼠内的正常肝脏细胞的siRNA递送。
实施例15。在使用由不同胺单体形成的聚(乙烯基酯)递送聚合物递送siRNA之后的小鼠内的靶基因敲减。P(BAPVE-VBu共聚物)、P(BABVE-共聚-VBu共聚物)和P(BAVVE-共聚-VBu共聚物)聚合物用2.3重量当量的CDM-NAG和4.7重量当量的CDM-PEG可逆修饰，并如上所述与因子VII siRNA(上述SEQ ID3和4的双链体)偶联。向各小鼠注射7.5mg/kg聚合物和2mg/kg siRNA。如上所述测定对因子VII水平的影响。结果证明，采用各测试胺单体都观察到了有效敲减。
表6.通过靶基因敲减测定的对于采用掩蔽的P(BAPVE-共聚-VBu共聚物)、P(BABVE-共聚-VBu共聚物)和P(BAVVE-VBu共聚物)递送聚合物处理的小鼠内的正常肝脏细胞的siRNA递送。
实施例16。在使用含不同疏水性单体的聚(乙烯基酯)递送聚合物递送siRNA之后的小鼠内的靶基因敲减。含不同疏水性单体的P(BAVVE-共聚物)聚合物用2.3重量当量的CDM-NAG和4.7重量当量的CDM-PEG可逆修饰，并如上所述与因子VII siRNA(上述SEQ ID3和4的双链体)偶联。向各小鼠注射7.5mg/kg聚合物和2mg/kg siRNA。如上所述测定对因子VII水平的影响。结果证明，采用丁酰基和戊酰基疏水性单体观察到了有效敲减。具有丁酰基疏水性单体的聚合物更有效。
表7.通过靶基因敲减测定的对于采用掩蔽的P(BAVVE-共聚-疏水性乙烯基酯)递送聚合物处理的小鼠内的正常肝脏细胞的siRNA递送。
实施例17。在使用具有不同分子量的聚(乙烯基酯)递送聚合物递送siRNA之后的小鼠内的靶基因敲减。具有不同分子量的P(BAVVE-共聚-VBu)聚合物用2.3重量当量的CDM-NAG和4.7重量当量的CDM-PEG可逆修饰，并如上所述用因子VII siRNA(上述SEQ ID3和4的双链体)偶联。向各小鼠注射7.5mg/kg聚合物和2mg/kg siRNA。如上所述测定对因子VII水平的影响。结果证明，采用具有23k-200k Mn,th的P(BAVVE-共聚-VBu)聚合物观察到了有效敲减。具有大于67kDa(70kDa Mw)的Mn,th的聚合物更有效。最优选具有100-150kDa(67-86kDa Mw)的聚合物。
表8.通过靶基因敲减测定的对于采用不同分子量的掩蔽的P(BAVVE-共聚-VBu)递送聚合物处理的小鼠内的正常肝脏细胞的siRNA递送。
实施例18。两亲性阳离子聚(乙烯基酯)无规共聚物对体外转染试剂有效。使指示的共聚物(500mg)溶解于内含2N HCl的乙酸(5mL)溶液中，并搅拌1小时。所述溶液用水(30mL)稀释，并用水性NaCl溶液透析，然后用去离子水透析超过两天。然后，将所述溶液冻干并重新溶解于H2O以配制20mg/mL的溶液。按照指示，将Hep3B-SEAP(肝细胞癌)、MCF7(乳腺癌)、HT29(结肠癌)、HepG2-SEAP(肝细胞癌)或A375(黑素瘤)细胞以10,000个细胞/孔的密度在96孔培养板中铺板。细胞用1.5μg/mL或3μg/mL的共聚物和500ng/mL的Aha1siRNA(在OPTI-MEM血清减少的培养基(吉布可公司(Gibco))中制备)转染。转染后24小时，裂解并处理所述细胞以供于使用TaqMan基因表达细胞-CT试剂盒(TaqMan Gene Expression Cells-to-CT)(生命技术公司(Life Technologies))的定量实时PCR(qRT-PCR)。采用针对人Aha1(产品#Hs00201602_m1)和人CycA(产品#4326316E)的TaqMan试验，在StepOne实时PCR系统(生命技术公司(LifeTechnologies))上进行Biplex qRT-PCR。采用相对基因表达定量的ΔΔCT法进行分析。
表9.用于体外转染的聚(乙烯基酯)聚合物。
a–kDa
表10.在通过聚(乙烯基酯)聚合物递送Aha1siRNA之后的体外Aha1敲减。聚合物以相同顺序列于表9。
a–μg/mL
实施例19。在使用NAG/PEG-AA-对硝基苯基-氨基甲酸酯聚(乙烯基酯)DPC皮下注射后的siRNA体内递送。
内含聚乙烯基酯DAN-41947-129-1的100mM pH7.5HEPES缓冲液用0.5重量%的活化的二硫化试剂琥珀酰亚胺基氧基羰基-α-甲基-α(2-吡啶基二硫)甲苯(SMPT)(购自皮尔斯公司(Pierce)修饰。所述硫醇反应性聚合物在60mg/mLHEPES碱中稀释至5mg/mL。向该溶液添加10mg/mL PEG(12单元)-Phe-Cit-对硝基苯基-碳酸酯掩蔽剂。一小时后，向聚合物溶液添加乙酸盐/酯保护的硫醇因子VII siRNA(聚合物与siRNA的比例范围是5-10～1)。孵育过夜后，添加NAG-Ala-Cit-对硝基苯基-碳酸酯掩蔽试剂(图2)至30mg/mL。孵育至少60分钟但不超过4小时之后，将所述DPC在颈后区域皮下注射进入20g ICR小鼠。在注射后不同时间，获取血清样品并检测因子VII的水平。作为对照，血管内注射类似制备的DAN-41947-129-1-siRNA偶联物。
表11.用PEG12-Phe-Cit/NAG-Ala-Cit-对硝基苯基-氨基甲酸酯DPC处理的小鼠内的因子VII的体内敲减。
a mg聚合物或siRNA/kg动物体重
b相对于未处理对照
实施例20。共给予胆固醇-siRNA和经掩蔽的两亲性聚(乙烯基酯)无规共聚物之后的内源性基因体内表达的抑制。所述聚(乙烯基酯)聚合物DAN-41947-129-1通过双取代的马来酸酐掩蔽剂或上述二肽掩蔽剂掩蔽。然后，将所述经掩蔽的聚合物与胆固醇-siRNA(ApoB或因子VII)共注射进入小鼠，并测定对靶基因表达的影响。
表12.将用CDM-PEG和CDM-NAG或PEG(12)-PheCit和NAG-AlaCit掩蔽的DAN-41947-129-1(15mg/kg)与胆固醇siRNA偶联物共注射小鼠。注射后48小时，检测ApoB的敲减。
a相对于等张葡萄糖注射对照

Claims (20)

1.一种聚(乙烯基酯)无规共聚物，其具有如下结构：
其中：
N是-NH2或-N-CO-O-C-(CH3)3，
N'是-NR5H、-NR5R6、–NR5R6R7、氮杂环、醛亚胺、酰肼、腙或咪唑，其中R5、R6和R7独立地选自–CH3和-CH2-CH3，
Y和Y'独立地是-(CH2)a-或-(CH2-CH2-O)b-(CH2)c-，其中a、b和c独立地是1、2、3、4、5或6，
R是具有1～7个碳原子的疏水基团或烷氧基乙基基团，
R'是具有12～20个碳原子的疏水基团，
R1、R2、R3和R4独立地选自氢(-H)和甲基(-CH3)，
m和p独立地是大于零(0)的整数，
n和q独立地是大于或等于零(0)的整数，且
(m+n)/(p+q)的比是1～9。
2.如权利要求1所述的聚(乙烯基酯)无规共聚物，其特征在于，(m+n)/(p+q)的比是1.5～4。
3.如权利要求1所述的聚(乙烯基酯)无规共聚物，其特征在于，所述聚合物的多分散性低于1.5。
4.如权利要求1所述的聚(乙烯基酯)无规共聚物，其特征在于，Y是-(CH2)a-，其中a是2、3或4。
5.如权利要求1所述的聚(乙烯基酯)无规共聚物，其特征在于，Y是-CH2-CH2-O-CH2-CH2-。
6.如权利要求1所述的聚(乙烯基酯)无规共聚物，其特征在于，R是–(CH2)k-CH3，其中k是1、2、3、4或6。
7.如权利要求1所述的聚(乙烯基酯)无规共聚物，其特征在于，n是零。
8.如权利要求7所述的聚(乙烯基酯)无规共聚物，其特征在于，q是零。
9.如权利要求1所述的聚(乙烯基酯)无规共聚物，其特征在于，R1、R2、R3和R4各自是氢。
10.如权利要求1所述的聚(乙烯基酯)无规共聚物，其特征在于：Y是–(CH2)4-R是–(CH2)2-CH3
R1和R3各自是氢，并且n和p各自是零。
11.如权利要求10所述的聚(乙烯基酯)无规共聚物，其特征在于，m/p的比是1.3～2.3。
12.如权利要求1所述的聚(乙烯基酯)无规共聚物，其特征在于：
Y是–(CH2)2-
R是–(CH2)2-CH3
R1和R3各自是氢，并且
n和p各自是零。
13.如权利要求1所述的聚(乙烯基酯)无规共聚物，其特征在于：
Y是–(CH2)2-
R是–(CH2)3-CH3
R1和R3各自是氢，并且
n和p各自是零。
14.如权利要求1所述的聚(乙烯基酯)无规共聚物，其特征在于，所述聚合物与RNA干扰多核苷酸偶联。
15.如权利要求1所述的聚(乙烯基酯)无规共聚物，其特征在于，大于50%的N通过与双取代的马来酸酐掩蔽剂、二肽-酰胺基苄基-碳酸酯掩蔽剂或双取代的马来酸酐掩蔽剂和二肽-酰胺基苄基-碳酸酯掩蔽剂的组合反应来可逆修饰。
16.一种用于抑制体内基因表达的组合物，所述组合物含有药学上可接受的运载体内的如权利要求16所述的聚(丙烯酸酯)无规共聚物和RNA干扰多核苷酸。
17.如权利要求16所述的组合物，其特征在于，所述RNA干扰多核苷酸与所述聚(乙烯基酯)无规共聚物共价连接。
18.如权利要求16所述的组合物，其特征在于，所述RNA干扰多核苷酸与含有至少20个碳原子的疏水基团偶联。
19.一种聚(乙烯基酯)无规共聚物，其具有如下结构：
其中：
N是具有-NH2形式的伯胺，
Y是-(CH2)a-或-(CH2-CH2-O)b-(CH2)c-，其中a、b和c独立地是1、2、3、4、5或6，
R是具有1～7个碳原子的疏水基团，R1和R2独立地选自氢(-H)和甲基(-CH3)，m是大于零(0)的整数，
p是大于零(0)的整数，并且
m/p的比是1～9。
20.如权利要求19所述的聚(乙烯基酯)无规共聚物，其特征在于，所述m/p的比是1.5～4。
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