KR102426487B1 - 5'-시클로-포스포네이트 변형된 뉴클레오티드 - Google Patents

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Abstract

5'-시클로-포스포네이트 변형된 뉴클레오티드 및 5'-시클로-포스포네이트 변형된 뉴클레오티드를 함유하는 올리고뉴클레오티드, 예컨대 간섭 (RNAi) 작용제가 기재된다. 5'시클로-포스포네이트 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 본원에 기재된 이중-가닥 또는 단일-가닥 올리고뉴클레오티드를 갖는 RNAi 작용제는 유전자 발현의 조정뿐만 아니라 치료, 진단, 표적 검증 및 게놈 발견 응용분야에서 유용하다. 5'-시클로-포스포네이트 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 RNAi 작용제 및 단일-가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드는 세포, 조직 또는 유기체에서 유전자 발현 또는 활성의 억제에 대해 반응하는 질환 또는 상태의 치료에 유용하다.

Description

5'-시클로-포스포네이트 변형된 뉴클레오티드
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2016년 6월 6일에 출원된 미국 가특허 출원 일련 번호 62/346,304를 우선권 주장하며, 그의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
발명의 분야
올리고머 화합물, 예컨대 RNAi 작용제 내에 혼입하기에 유용한 5'-시클로-포스포네이트 변형된 뉴클레오티드가 본원에 개시된다.
표적 핵산에 대해 적어도 부분적으로 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 올리고머 화합물은, 시험관내 및 생체내 둘 다에서 표적의 기능 및 활성을 변경시키는 것으로 제시된 바 있다. 표적 핵산 (예컨대 메신저 RNA(mRNA))을 함유하는 세포에 전달되는 경우, 올리고머 화합물은 표적의 발현을 조정하여 표적 핵산의 변경된 전사 또는 번역을 일으키는 것으로 나타났다. 특정 경우에, 올리고머 화합물은 핵산 표적을 억제하고/거나 표적 핵산의 분해를 촉발시킴으로써 유전자의 발현을 감소시킬 수 있다.
표적 핵산이 mRNA인 경우, 발현-억제 올리고머 화합물이 mRNA 표적의 발현을 조정할 수 있는 하나의 메카니즘은 RNA 간섭 (RNAi)을 통한 것이다. RNAi는 RNA 또는 RNA-유사 분자 (예컨대 화학적으로 변형된 RNA 분자)가 분해를 통해 유전자 발현을 침묵시킬 수 있는 생물학적 과정이다. 전사후 유전자 침묵의 과정은 외래 유전자의 발현을 방지하는 데 사용되는 진화적 보존된 세포 방어 메카니즘인 것으로 생각된다.
RNAi 반응 메카니즘은, 그의 표적에 대해 상보적인 RNA 또는 RNA-유사 분자의 단일 가닥을 자신의 구조 내에 혼입시키는 것인, 통상적으로 RNA-유도 침묵화 복합체 (RISC)로 지칭되는 엔도뉴클레아제 복합체를 특색으로 하는 것으로 여겨진다. RISC는 단일 가닥 RNA (즉, mRNA)의 절단을, RISC 내로 혼입되는 단일 가닥 RNA 또는 RNA-유사 분자의 상기 mRNA와의 상보성에 의해 매개하는 것으로 이해된다.
합성 RNA 및 RNA-유사 분자는 시험관내 및 생체내에서 RNA 간섭을 도출하는 것으로 제시된 바 있다. 예를 들어, 문헌 [Elbashir et al., (Nature 2000, 411,494-98)]에는 배양된 포유동물 세포 중 합성 21-뉴클레오티드 RNA 분자의 듀플렉스의 도입에 의해 유도된 RNAi가 기재되어있다. RISC와 상호작용할 수 있고 RNAi 반응 메카니즘을 촉발할 수 있는 합성 RNA 또는 RNA-유사 분자의 유형은 변형된 뉴클레오티드 및/또는 1개 이상의 비-포스포디에스테르 연결로 구성될 수 있다.
추가로, 변형된 뉴클레오티드를 또한 포함할 수 있고 1개 이상의 비-포스포디에스테르 연결을 갖는 단일-가닥 RNA 및 RNA-유사 분자는 또한 표적화 mRNA의 발현을 변경시킬 수 있다.
특정 공지된 변형된 뉴클레오티드는 올리고머 화합물 내로 혼입되었을 때 생체내에서 투여되는 경우 발현-억제 올리고머 화합물의 지속기간 및/또는 활성을 증진시키는 것으로 제시된 바 있다.
올리고머 화합물, 예컨대 RNAi 작용제에 대해 개선 또는 증진된 안정성 및/또는 효력을 제공할 수 있는 신규한 변형된 뉴클레오티드에 대한 필요성이 존재한다. 예를 들어, RNAi 작용제의 5' 말단부 상의 말단 뉴클레오티드 상의 포스페이트 모이어티의 증진된 안정화를 제공할 수 있는 신규 변형된 뉴클레오티드에 대한 필요성이 존재한다.
신규 5'-시클로-포스포네이트 변형된 뉴클레오티드 및 5'-시클로-포스포네이트 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 올리고머 화합물, 예컨대 RNAi 작용제가 본원에 기재된다. 기재된 5'-시클로-포스포네이트 변형된 뉴클레오티드는 이중-가닥 올리고뉴클레오티드 (예컨대 짧은 간섭 RNA) 또는 단일-가닥 올리고뉴클레오티드 (예컨대 안티센스 올리고뉴클레오티드) 내에 혼입될 수 있다. 1개 이상의 5'-시클로-포스포네이트 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 올리고머 화합물, 예컨대 RNAi 작용제는 또한 RNAi 작용제에 연결된 표적화 리간드, 예컨대 n-아세틸-갈락토사민 클러스터 또는 펩티드를 가질 수 있다. 1개 이상의 5'-시클로-포스포네이트 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 올리고머 화합물, 예컨대 RNAi 작용제는 또한 RNAi 작용제에 연결된 약동학적 조정제, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 모이어티 또는 지질을 가질 수 있다.
본원에 기재된 5'-시클로-포스포네이트 뉴클레오티드는 RNAi 작용제의 개선된 안정성 및/또는 효력을 제공할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 5'-시클로-포스포네이트 뉴클레오티드는 생체내에서 올리고뉴클레오티드 쇄의 포스포디에스테르 결합을 절단할 수 있는 엔도뉴클레아제 및 엑소뉴클레아제에 대한 증가된 안정성 및 내성을 제공할 수 있다. 추가적으로, 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, RNAi 작용제의 말단부의 5'-인산화 상태는 RISC 내로의 가닥 혼입을 위한 인자인 것으로 여겨진다. 따라서, 안티센스 가닥의 5' 말단부에 위치한 5'-시클로-포스포네이트 변형된 뉴클레오티드는, 올리고뉴클레오티드의 5' 말단부가 인산화되어 유지될 가능성을 증대시킬 수 있다. 이는 특정 가닥을 RISC 내로 로딩하는 것의 가능성을 증가시킬 수 있고, 그에 의해 RNAi 작용제가 RNAi 경로에 진입할 수 있게 하여, 개선 및 증진된 녹다운 및 유전자 침묵 활성을 유발한다.
본원에 개시된 5'-시클로-포스포네이트 변형된 뉴클레오티드는 뉴클레오티드의 당의 5' 탄소 (또는 당 대용물 대체 모이어티의 유사한 위치)에 위치하는 시클릭 기 또는 시클릭 모이어티를 갖는다. 본원에 개시된 5'-시클로-포스포네이트 변형된 뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 포스포네이트 기 (또는 본원에 기재된 바로는, 예를 들어, 5'-C-말로닐 기를 혼입함으로써 포스포네이트 모방체 기)를 형성한다.
일부 실시양태에서, 개시된 5'-시클로-포스포네이트 변형된 뉴클레오티드 화합물은 화학식 A에 의해 나타내어진 구조를 갖고:
Figure 112018120553379-pct00001
여기서
시클로는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 탄소 원자를 갖는 임의로 치환된 2가 시클릭 모이어티, 예컨대 시클로알킬 (예를 들면, 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 시클로헥실, 또는 시클로헵틸), 시클로알케닐 (예를 들면, 시클로펜테닐, 시클로부테닐, 시클로펜테닐, 시클로헥세닐, 또는 시클로헵테닐), 아릴 (예를 들면, 페닐), 헤테로아릴 (예를 들면, 피리딜, 피리미디닐, 피리다지닐, 피롤, 피라졸, 이미다졸, 티오펜, 벤조티오펜, 티아졸, 벤조티아졸, 푸란, 옥사졸, 이속사졸, 벤조푸란, 인돌, 인다졸, 벤즈이미다졸, 옥사디아졸, 1,2,3-트리아졸, 1,2,4-트리아졸, 테트라졸, 퀴놀리닐, 이소퀴놀리닐, 또는 퀴녹살리닐) 또는 헤테로시클릴 (예를 들면, 테트라히드로푸란, 테트라히드로피란, 피페리딘, 피롤리딘, 디옥산 또는 디옥솔란)이고;
X'는
Figure 112018120553379-pct00002
이거나 또는 당 대용물 대체 모이어티를 포함하고;
X"는 (i) 5'-시클로-포스포네이트 변형된 뉴클레오티드를 RNAi 작용제의 나머지 부분에 연결하는 뉴클레오시드간 연결이거나, 또는 (ii) 포스포르아미다이트 기이고;
D는 O, S, CH2-CH2, CH=CH, OCH2, N(R1), C(R2)(R3), C(R2)(R3)C(R4)(R2), C(R2)=C(R4), OC(R2)(R3), OC(H)(X3) 또는 OC(R2)(X3)이고;
R1은 H, C1-C6 알킬, 치환된 C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, 치환된 C1-C6 알콕시, C2-C6 알케닐, 치환된 C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, 또는 치환된 C2-C6 알키닐이고;
R2, R3, 및 R4는 각각, 독립적으로, H, 할로겐, C1-C6 알킬, 치환된 C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, 치환된 C1-C6 알콕시, C2-C6 알케닐, 치환된 C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, 또는 치환된 C2-C6 알키닐이고;
D가 O, S, CH2-CH2, CH=CH, OCH2, N(R1), C(R2)(R3), C(R2)(R3)C(R4)(R2), C(R2)=C(R4), OC(R2)(R3)인 경우에, X는 헤테로시클릭 염기 모이어티이고;
D가 OC(H)(X3) 또는 OC(R2)(X3)인 경우에, X는 H, 할로겐, C1-C6 알킬, 치환된 C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, 치환된 C1-C6 알콕시, C2-C6 알케닐, 치환된 C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐 또는 치환된 C2-C6 알키닐이고 X3은 헤테로시클릭 염기 모이어티이고;
Z는 H, -OH, F, OCH3, -O-(CH2)2-OCH3; 할로겐; -OCH2F, -OCHF2, -OCF3, -OCH2CH3, -O(CH2)2F, -OCH2CHF2, -OCH2CF3, -OCH2-CH=CH2, -O(CH2)2-OCH3, -O(CH2)2-SCH3, -O(CH2)2-OCF3, -O(CH2)2-O(CH2)2-N(CH3)2, -OCH2C(=O)-N(H)CH3, -OCH2C(=O)-N(H)-(CH2)2-N(CH3)2, -O(CH2)2-N(H)-C(=NH)(NH2), -O(CH2)3-N(R5)(R6), -O(CH2)2-ON(R5)(R6), -O(CH2)2-O(CH2)2-N(R5)(R6), -OCH2C(=O)-N(R5)(R6), -OCH2C(=O)-N(R7)-(CH2)2-N(R5)(R6) -O(CH2)2-N(R7)-C(=R8)[N(R5)(R6)], 임의로 치환된 C1-C6 알킬, 임의로 치환된 C1-C6 알콕시, 임의로 치환된 C2-C6 알케닐, 또는 임의로 치환된 C2-C6 알키닐이고, 여기서 R5, R6, R7 및 R8은 각각, 독립적으로, H 또는 C1-C6 알킬이고;
Y1, Y2, Y3, 및 Y4는 각각, 독립적으로, H, 할로겐, C1-C6 알킬, 치환된 C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, 치환된 C1-C6 알콕시, C2-C6 알케닐, 치환된 C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, 또는 치환된 C2-C6 알키닐이거나; 또는 대안적으로, Y4는 Y1 또는 Y2 중 하나에 연결되고, 여기서 연결은 O, S, NR9, C(R10)(R11), C(R10)=C(R11), C[=C(R10)(R11)] 및 C(=O)로부터 선택된 2가 기를 포함하고, Y1, Y2, 및 Y3 중 나머지 2개는 각각, 독립적으로, H, 할로겐, 임의로 치환된 C1-C6 알킬, 임의로 치환된 C1-C6 알콕시, 임의로 치환된 C2-C6 알케닐, 또는 임의로 치환된 C2-C6 알키닐이고, 여기서 각각의 R9, R10 및 R11은 독립적으로, H, C1-C6 알킬, 치환된 C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, 치환된 C1-C6 알콕시, C2-C6 알케닐, 치환된 C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, 또는 치환된 C2-C6 알키닐이고;
J는 O, S, NR12, N-N(R13)2, 또는 N-OR13이고, 여기서,
R12는 H, OH, 할로겐, C1-C10 알킬, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, 아릴, 또는
Figure 112018120553379-pct00003
이고, 여기서 R14는 H, 또는 독립적으로 SH, S-(C1-C4 알킬), 히드록실로 임의로 치환된 아릴, 히드록실로 임의로 치환된 헤테로아릴, 아미노, 히드록실, 옥소, 또는 NH-C=(NH)NH2로부터 선택된 1 내지 3개의 치환기로 임의로 치환된 C1-C4 알킬로부터 선택되고, 여기서 R15는 H, C1-C18 알킬, 또는 아릴로부터 선택되고;
여기서 R13은 H, C1-C10 알킬, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, 아릴, 또는
Figure 112018120553379-pct00004
이고, 여기서 R14는 H 또는 독립적으로 SH, S-(C1-C4 알킬), 히드록실로 임의로 치환된 아릴, 히드록실로 임의로 치환된 헤테로아릴, 아미노, 히드록실, 옥소, 또는 NH-C=(NH)NH2로부터 선택된 1 내지 3개의 치환기로 임의로 치환된 C1-C4 알킬로부터 선택되고, 여기서 R15는 H, C1-C18 알킬, 또는 아릴로부터 선택되고;
K 및 L은 각각 독립적으로 OH, OR16, SR16, 또는 NR16으로부터 선택되고, 여기서 R16은 H, C1-C10 알킬, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, 아릴 또는
Figure 112018120553379-pct00005
로부터 선택되고, 여기서 R14는 H 또는 독립적으로 SH, S-(C1-C4 알킬), 히드록실로 임의로 치환된 아릴, 히드록실로 임의로 치환된 헤테로아릴, 아미노, 히드록실, 옥소, 또는 -NH-C=(NH)NH2로부터 선택된 1 내지 3개의 치환기로 임의로 치환된 C1-C4 알킬로부터 선택되고, R15는 H, C1-C18 알킬, 또는 아릴로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 화학식 A의 구조에서 시클로는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
Figure 112018120553379-pct00006
일부 실시양태에서, 화학식 A의 구조에서 시클로는 시클릭 관능기이고 여기서 시클릭 관능기는 표준 IUPAC 명명법을 사용하여 나타낸 시클릭 관능기의 하기 위치에서 화학식 A의 포스포네이트 모이어티 및 X'에 연결된다: 1,2; 1,3; 1,4; 1,5; 1,6; 1,7; 2,3; 2,4; 2,5; 2,6; 2,7; 3,4; 3,5; 3,6; 3,7; 4,5; 4,6; 4,7; 5,6; 5,7; 또는 6,7.
일부 실시양태에서, 화학식 A의 구조에서 시클로는 치환된다. 일부 실시양태에서, 화학식 A의 구조에서 시클로는 표준 IUPAC 명명법을 사용하여 나타낸 시클릭 관능기의 하기 위치에서 화학식 A의 포스포네이트 모이어티 및 X'에 연결된 치환된 시클릭 모이어티이다: 1,2; 1,3; 1,4; 1,5; 1,6; 1,7; 2,3; 2,4; 2,5; 2,6; 2,7; 3,4; 3,5; 3,6; 3,7; 4,5; 4,6; 4,7; 5,6; 5,7; 또는 6,7.
일부 실시양태에서, 화학식 A의 X'는 당 대용물 대체 모이어티이거나 또는 이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학식 A의 X'는 모르폴리노인 당 대용물 대체 모이어티이거나 또는 이러한 당 대용물 대체 모이어티를 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학식 A의 X'는 시클로헥세닐인 당 대용물 대체 모이어티이거나 또는 이러한 당 대용물 대체 모이어티를 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학식 A의 X'는 시클로헥시톨인 당 대용물 대체 모이어티이거나 또는 이러한 당 대용물 대체 모이어티를 포함한다.
일부 실시양태에서, 화학식 A의 X'는 비-시클릭인 당 대용물 대체 모이어티이거나 또는 이러한 당 대용물 대체 모이어티를 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학식 A의 X'는 비잠금 핵염기 유사체 (UNA)이거나 또는 이를 당 대용물 대체 모이어티로서 포함한다 (예를 들어, 미국 특허 번호 8,314,227 참조). 일부 실시양태에서, 화학식 A의 X'는 글리세롤 핵산 구조이거나 또는 이를 당 대용물 대체 모이어티로서 포함한다 (예를 들어, WO 2016/028649 참조).
일부 실시양태에서, 화학식 A의 X'는 잠금 핵산이거나 또는 이를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 화합물은 화학식 I-b 또는 화학식 II-b를 갖는 5'-시클로프로필 포스포네이트 기를 가지며:
Figure 112018120553379-pct00007
여기서,
D는 O, S, CH2-CH2, CH=CH, OCH2, N(R1), C(R2)(R3), C(R2)(R3)C(R4)(R2), C(R2)=C(R4), OC(R2)(R3), OC(H)(X3) 또는 OC(R2)(X3)이고;
R1은 H, C1-C6 알킬, 치환된 C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, 치환된 C1-C6 알콕시, C2-C6 알케닐, 치환된 C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, 또는 치환된 C2-C6 알키닐이고;
R2, R3, 및 R4는 각각, 독립적으로, H, 할로겐, C1-C6 알킬, 치환된 C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, 치환된 C1-C6 알콕시, C2-C6 알케닐, 치환된 C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, 또는 치환된 C2-C6 알키닐이고;
D가 O, S, CH2-CH2, CH=CH, OCH2, N(R1), C(R2)(R3), C(R2)(R3)C(R4)(R2), C(R2)=C(R4), OC(R2)(R3)인 경우에, X는 헤테로시클릭 염기 모이어티이고;
D가 OC(H)(X3) 또는 OC(R2)(X3)인 경우에, X는 H, 할로겐, C1-C6 알킬, 치환된 C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, 치환된 C1-C6 알콕시, C2-C6 알케닐, 치환된 C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐 또는 치환된 C2-C6 알키닐이고 X3은 헤테로시클릭 염기 모이어티이고;
Z는 H, -OH, F, OCH3, -O-(CH2)2-OCH3; 할로겐; -OCH2F, -OCHF2, -OCF3, -OCH2CH3, -O(CH2)2F, -OCH2CHF2, -OCH2CF3, -OCH2-CH=CH2, -O(CH2)2-OCH3, -O(CH2)2-SCH3, -O(CH2)2-OCF3, -O(CH2)2-O(CH2)2-N(CH3)2, -OCH2C(=O)-N(H)CH3, -OCH2C(=O)-N(H)-(CH2)2-N(CH3)2, -O(CH2)2-N(H)-C(=NH)(NH2), -O(CH2)3-N(R5)(R6), -O(CH2)2-ON(R5)(R6), -O(CH2)2-O(CH2)2-N(R5)(R6), -OCH2C(=O)-N(R5)(R6), -OCH2C(=O)-N(R7)-(CH2)2-N(R5)(R6) -O(CH2)2-N(R7)-C(=R8)[N(R5)(R6)], 임의로 치환된 C1-C6 알킬, 임의로 치환된 C1-C6 알콕시, 임의로 치환된 C2-C6 알케닐, 또는 임의로 치환된 C2-C6 알키닐이고, 여기서 R5, R6, R7 및 R8은 각각, 독립적으로, H 또는 C1-C6 알킬이고;
Y1, Y2, Y3, 및 Y4는 각각, 독립적으로, H, 할로겐, C1-C6 알킬, 치환된 C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, 치환된 C1-C6 알콕시, C2-C6 알케닐, 치환된 C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, 또는 치환된 C2-C6 알키닐이거나; 또는 대안적으로, Y4는 Y1 또는 Y2 중 하나에 연결되고, 여기서 연결은 O, S, NR9, C(R10)(R11), C(R10)=C(R11), C[=C(R10)(R11)] 및 C(=O)로부터 선택된 2가 기를 포함하고, Y1, Y2, 및 Y3 중 나머지 2개는 각각, 독립적으로, H, 할로겐, 임의로 치환된 C1-C6 알킬, 임의로 치환된 C1-C6 알콕시, 임의로 치환된 C2-C6 알케닐, 또는 임의로 치환된 C2-C6 알키닐이고, 여기서 각각의 R9, R10 및 R11은 독립적으로, H, C1-C6 알킬, 치환된 C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, 치환된 C1-C6 알콕시, C2-C6 알케닐, 치환된 C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, 또는 치환된 C2-C6 알키닐이고;
J는 O, S, NR12, N-N(R13)2, 또는 N-OR13이고, 여기서,
R12는 H, OH, 할로겐, C1-C10 알킬, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, 아릴, 또는
Figure 112018120553379-pct00008
이고, 여기서 R14는 H 또는 독립적으로 SH, S-(C1-C4 알킬), 히드록실로 임의로 치환된 아릴, 히드록실로 임의로 치환된 헤테로아릴, 아미노, 히드록실, 옥소, 또는 NH-C=(NH)NH2로부터 선택된 1 내지 3개의 치환기로 임의로 치환된 C1-C4 알킬로부터 선택되고, 여기서 R15는 H, C1-C18 알킬, 또는 아릴로부터 선택되고;
여기서 R13은 H, C1-C10 알킬, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, 아릴, 또는
Figure 112018120553379-pct00009
이고, 여기서 R14는 H 또는 독립적으로 SH, S-(C1-C4 알킬), 히드록실로 임의로 치환된 아릴, 히드록실로 임의로 치환된 헤테로아릴, 아미노, 히드록실, 옥소, 또는 NH-C=(NH)NH2로부터 선택된 1 내지 3개의 치환기로 임의로 치환된 C1-C4 알킬로부터 선택되고, 여기서 R15는 H, C1-C18 알킬, 또는 아릴로부터 선택되고;
K 및 L은 각각 독립적으로 OH, OR16, SR16, 또는 NR16으로부터 선택되고, 여기서 R16은 H, C1-C10 알킬, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, 아릴 또는
Figure 112018120553379-pct00010
로부터 선택되고, 여기서 R14는 H 또는 독립적으로 SH, S-(C1-C4 알킬), 히드록실로 임의로 치환된 아릴, 히드록실로 임의로 치환된 헤테로아릴, 아미노, 히드록실, 옥소, 또는 -NH-C=(NH)NH2로부터 선택된 1 내지 3개의 치환기로 임의로 치환된 C1-C4 알킬로부터 선택되고, R15는 H, C1-C18 알킬, 또는 아릴로부터 선택되고;
Q는 O, S, N(R30), 또는 C(R31)(R32)로부터 선택된 2가 모이어티이고, 여기서 R30은 H, 임의로 치환된 C1-C6 알킬, 임의로 치환된 C1-C6 알콕시, 임의로 치환된 C2-C6 알케닐, 또는 임의로 치환된 C2-C6 알키닐이고, R31 및 R32는 각각, 독립적으로, H, 할로겐, 임의로 치환된 C1-C6 알킬, 임의로 치환된 C1-C6 알콕시, 임의로 치환된 C2-C6 알케닐, 또는 임의로 치환된 C2-C6 알키닐이고;
A는 (i) 화학식 I의 5'-시클로-포스포네이트 변형된 뉴클레오티드를 RNAi 작용제의 나머지 부분에 연결하는 뉴클레오시드간 연결이거나, 또는 (ii) 포스포르아미다이트 기이고;
G1, G2, G3 및 G4는 각각 독립적으로 H, F, 할로겐, C1-C6 알킬, CN, CH2(R33), CH2-O-(R33), C(=O)(R33), C(=S)(R33), 또는 (R34)(R33)으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 R33은 O(R35), S(R35), N(R35)(R36)이고, 여기서 R34, R35, 및 R36은 각각 독립적으로 H, 할로겐, 또는 C1-C6 알킬로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 화합물은 5-시클로프로필 포스포네이트 기를 포함하고 이는 하기 화학식 III 또는 화학식 IV를 갖는 RNAi 작용제에 연결되며:
Figure 112020057517056-pct00112
여기서,
X는 헤테로시클릭 염기 모이어티이고;
Z는 H, -OH, F, OCH3, -O-(CH2)2-OCH3; 할로겐; -OCH2F, -OCHF2, -OCF3, -OCH2CH3, -O(CH2)2F, -OCH2CHF2, -OCH2CF3, -OCH2-CH=CH2, -O(CH2)2-OCH3, -O(CH2)2-SCH3, -O(CH2)2-OCF3, -O(CH2)2-O(CH2)2-N(CH3)2, -OCH2C(=O)-N(H)CH3, -OCH2C(=O)-N(H)-(CH2)2-N(CH3)2, -O(CH2)2-N(H)-C(=NH)(NH2), -O(CH2)3-N(R5)(R6), -O(CH2)2-ON(R5)(R6), -O(CH2)2-O(CH2)2-N(R5)(R6), -OCH2C(=O)-N(R5)(R6), -OCH2C(=O)-N(R7)-(CH2)2-N(R5)(R6) -O(CH2)2-N(R7)-C(=R8)[N(R5)(R6)], 임의로 치환된 C1-C6 알킬, 임의로 치환된 C1-C6 알콕시, 임의로 치환된 C2-C6 알케닐, 또는 임의로 치환된 C2-C6 알키닐이고, 여기서 R5, R6, R7 및 R8은 각각, 독립적으로, H 또는 C1-C6 알킬이고;
J 및 J'는 각각 독립적으로, O 또는 S이고;
L, L', 및 K는 각각 독립적으로 OH, OR16, SR16, 또는 NR16으로부터 선택되고, 여기서 R16은 H, C1-C10 알킬, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, 아릴 또는
Figure 112018120553379-pct00012
로부터 선택되고, 여기서 R14는 H 또는 독립적으로 SH, S-(C1-C4 알킬), 히드록실로 임의로 치환된 아릴, 히드록실로 임의로 치환된 헤테로아릴, 아미노, 히드록실, 옥소, 또는 -NH-C=(NH)NH2로부터 선택된 1 내지 3개의 치환기로 임의로 치환된 C1-C4 알킬로부터 선택되고, R15는 H, C1-C18 알킬, 또는 아릴로부터 선택되고;
Figure 112020057517056-pct00113
는 RNAi 작용제의 나머지 부분을 포함한다.
일부 실시양태에서, 개시된 5-시클로-포스포네이트 변형된 뉴클레오티드 화합물은 포스포르아미다이트 화합물이다.
일부 실시양태에서, 개시된 5-시클로-포스포네이트 변형된 뉴클레오티드 화합물은 화학식 I-b-5 또는 화학식 II-b-5를 갖는 포스포르아미다이트 화합물이고:
Figure 112018120553379-pct00014
여기서,
D는 O, S, CH2-CH2, CH=CH, OCH2, N(R1), C(R2)(R3), C(R2)(R3)C(R4)(R2), C(R2)=C(R4), OC(R2)(R3), OC(H)(X3) 또는 OC(R2)(X3)이고;
R1은 H, C1-C6 알킬, 치환된 C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, 치환된 C1-C6 알콕시, C2-C6 알케닐, 치환된 C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, 또는 치환된 C2-C6 알키닐이고;
R2, R3, 및 R4는 각각, 독립적으로, H, 할로겐, C1-C6 알킬, 치환된 C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, 치환된 C1-C6 알콕시, C2-C6 알케닐, 치환된 C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, 또는 치환된 C2-C6 알키닐이고;
D가 O, S, CH2-CH2, CH=CH, OCH2, N(R1), C(R2)(R3), C(R2)(R3)C(R4)(R2), C(R2)=C(R4), OC(R2)(R3)인 경우에, X는 헤테로시클릭 염기 모이어티이고;
D가 OC(H)(X3) 또는 OC(R2)(X3)인 경우에, X는 H, 할로겐, C1-C6 알킬, 치환된 C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, 치환된 C1-C6 알콕시, C2-C6 알케닐, 치환된 C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐 또는 치환된 C2-C6 알키닐이고 X3은 헤테로시클릭 염기 모이어티이고;
Z는 H, -OH, F, OCH3, -O-(CH2)2-OCH3; 할로겐; -OCH2F, -OCHF2, -OCF3, -OCH2CH3, -O(CH2)2F, -OCH2CHF2, -OCH2CF3, -OCH2-CH=CH2, -O(CH2)2-OCH3, -O(CH2)2-SCH3, -O(CH2)2-OCF3, -O(CH2)2-O(CH2)2-N(CH3)2, -OCH2C(=O)-N(H)CH3, -OCH2C(=O)-N(H)-(CH2)2-N(CH3)2, -O(CH2)2-N(H)-C(=NH)(NH2), -O(CH2)3-N(R5)(R6), -O(CH2)2-ON(R5)(R6), -O(CH2)2-O(CH2)2-N(R5)(R6), -OCH2C(=O)-N(R5)(R6), -OCH2C(=O)-N(R7)-(CH2)2-N(R5)(R6) -O(CH2)2-N(R7)-C(=R8)[N(R5)(R6)], 임의로 치환된 C1-C6 알킬, 임의로 치환된 C1-C6 알콕시, 임의로 치환된 C2-C6 알케닐, 또는 임의로 치환된 C2-C6 알키닐이고, 여기서 R5, R6, R7 및 R8은 각각, 독립적으로, H 또는 C1-C6 알킬이고;
Y1, Y2, Y3, 및 Y4는 각각, 독립적으로, H, 할로겐, C1-C6 알킬, 치환된 C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, 치환된 C1-C6 알콕시, C2-C6 알케닐, 치환된 C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, 또는 치환된 C2-C6 알키닐이거나; 또는 대안적으로, Y4는 Y1 또는 Y2 중 하나에 연결되고, 여기서 연결은 O, S, NR9, C(R10)(R11), C(R10)=C(R11), C[=C(R10)(R11)] 및 C(=O)로부터 선택된 2가 기를 포함하고, Y1, Y2, 및 Y3 중 나머지 2개는 각각, 독립적으로, H, 할로겐, 임의로 치환된 C1-C6 알킬, 임의로 치환된 C1-C6 알콕시, 임의로 치환된 C2-C6 알케닐, 또는 임의로 치환된 C2-C6 알키닐이고, 여기서 각각의 R9, R10 및 R11은 독립적으로, H, C1-C6 알킬, 치환된 C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, 치환된 C1-C6 알콕시, C2-C6 알케닐, 치환된 C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, 또는 치환된 C2-C6 알키닐이고;
J는 O, S, NR12, N-N(R13)2, 또는 N-OR13이고, 여기서,
R12는 H, OH, 할로겐, C1-C10 알킬, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, 아릴 또는
Figure 112018120553379-pct00015
이고, 여기서 R14는 H 또는 독립적으로 SH, S-(C1-C4 알킬), 히드록실로 임의로 치환된 아릴, 히드록실로 임의로 치환된 헤테로아릴, 아미노, 히드록실, 옥소, 또는 NH-C=(NH)NH2로부터 선택된 1 내지 3개의 치환기로 임의로 치환된 C1-C4 알킬로부터 선택되고, 여기서 R15는 H, C1-C18 알킬, 또는 아릴로부터 선택되고;
여기서 R13은 H, C1-C10 알킬, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, 아릴, 또는
Figure 112018120553379-pct00016
이고, 여기서 R14는 H 또는 독립적으로 SH, S-(C1-C4 알킬), 히드록실로 임의로 치환된 아릴, 히드록실로 임의로 치환된 헤테로아릴, 아미노, 히드록실, 옥소, 또는 NH-C=(NH)NH2로부터 선택된 1 내지 3개의 치환기로 임의로 치환된 C1-C4 알킬로부터 선택되고, 여기서 R15는 H, C1-C18 알킬, 또는 아릴로부터 선택되고;
K 및 L은 각각 독립적으로 OH, OR16, SR16, 또는 NR16으로부터 선택되고, 여기서 R16은 H, C1-C10 알킬, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, 아릴 또는
Figure 112018120553379-pct00017
로부터 선택되고, 여기서 R14는 H 또는 독립적으로 SH, S-(C1-C4 알킬), 히드록실로 임의로 치환된 아릴, 히드록실로 임의로 치환된 헤테로아릴, 아미노, 히드록실, 옥소, 또는 -NH-C=(NH)NH2로부터 선택된 1 내지 3개의 치환기로 임의로 치환된 C1-C4 알킬로부터 선택되고, R15는 H, C1-C18 알킬, 또는 아릴로부터 선택되고;
G1, G2, G3 및 G4는 각각 독립적으로 H, F, 할로겐, C1-C6 알킬, CN, CH2(R33), CH2-O-(R33), C(=O)(R33), C(=S)(R33), 또는 (R34)(R33)로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 R33은 O(R35), S(R35), N(R35)(R36)이고, 여기서 R34, R35, 및 R36은 각각 독립적으로 H, 할로겐, 또는 C1-C6 알킬로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 5'-시클로프로필 포스포네이트 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 포스포르아미다이트-함유 화합물은 하기 구조를 갖는다:
Figure 112018120553379-pct00018
일부 실시양태에서, 개시된 5'-시클로-포스포네이트 변형된 뉴클레오티드 화합물은 화학식 B에 의해 나타내어진 구조를 갖고:
Figure 112018120553379-pct00019
여기서,
시클로 및 X'는 각각 상기 화학식 A와 관련하여 정의된 바와 같고;
화학식 B의 M은 5'-포스포네이트 모방체 기이거나 또는 이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학식 B의 M은 5'-C-말로닐 기이다. 일부 실시양태에서, 화학식 B의 M은 카르복시산, 술폰산, 또는 보론산이다. 일부 실시양태에서, 화학식 B의 M은 디-카르복시산, 디-술폰산, 또는 디-보론산이다. 일부 실시양태에서, 화학식 B의 M은 카르복시산, 술폰산, 보론산, 및 인산의 혼합물로부터 선택된 디-산이다. 일부 실시양태에서, 포스포네이트 모방체 기 (즉, 화학식 B의 M)은 단일 결합을 통해 화학식 B의 시클로에 부착된다. 일부 실시양태에서, 포스포네이트 모방체 기는 1개 초과의 결합을 통해 화학식 B의 시클로에 부착된다.
일부 실시양태에서, 개시된 화학식 B의 화합물은 하기 구조에 의해 나타내어진 구조를 갖고:
Figure 112018120553379-pct00020
여기서, 시클로 및 X'는 각각 상기 화학식 A와 관련하여 정의된 바와 같다.
일부 실시양태에서, 개시된 화학식 B의 화합물은 하기 구조에 의해 나타내어진 구조를 갖고:
Figure 112018120553379-pct00021
여기서, 시클로, D, X, 및 Z는 각각 상기 화학식 A와 관련하여 정의된 바와 같다.
본원에 사용된 용어 "연결된"은 2개의 분자 사이의 연결을 지칭하는 경우에 2개의 분자가 공유 결합에 의해 연결되거나 또는 2개의 분자가 분자간 힘 (예를 들어, 수소 결합, 반 데르 발스 힘 또는 이온 결합)을 통해 회합됨을 의미한다. 일부 실시양태에서, 용어 "연결된"이 분자간 힘을 통한 2개의 분자 사이의 회합을 지칭하는 경우, 2개의 상이한 분자 사이의 회합은 생리학상 허용되는 완충제 (예를 들어, 포스페이트 완충 염수) 중에서 1 x 10-4 M 미만 (예를 들어, 1 x 10-5 M 미만, 1 x 10-6 M 미만, 또는 1 x 10-7 M 미만)의 KD를 갖는다.
본원에 사용된 용어 "직접 연결된"은 임의의 개재 원자 또는 원자단 없이 제2 화합물 또는 기에 연결된 제1 화합물 또는 기를 지칭한다. 본원에 사용된 용어 "간접 연결된"은 중간 원자, 기, 화합물 또는 분자, 예컨대 예를 들어 연결기를 통해 제2 화합물 또는 기에 연결된 제1 화합물을 지칭한다. 달리 언급되지 않는 한, 본원에 사용된 용어 "연결된"은 본원에 정의된 바와 같은 "직접 연결된" 및 "간접 연결된" 둘 다를 포함한다.
본원에 사용된 "올리고머 화합물"은 약 10-50개 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 염기 쌍을 함유하는 뉴클레오티드 서열이다. 일부 실시양태에서, 올리고머 화합물은 세포 내의 발현된 표적 핵산 또는 표적 유전자 내의 코딩 서열에 적어도 부분적으로 상보적인 핵염기 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, 올리고머 화합물은, 유전자를 발현하는 세포에 전달 시, 기저 유전자의 발현을 억제할 수 있고, 본원에서 "발현-억제 올리고머 화합물"로 지칭된다. 유전자 발현은 시험관내 또는 생체내 억제될 수 있다. "올리고머 화합물"은 올리고뉴클레오티드, 단일-가닥 올리고뉴클레오티드, 단일-가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드, 짧은 간섭 RNA (siRNA), 이중-가닥 RNA (dsRNA), 마이크로 RNA (miRNA), 짧은 헤어핀 RNA (shRNA), 리보자임, 간섭 RNA 분자 및 다이서 기질을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 용어 "올리고뉴클레오티드" 및 "폴리뉴클레오티드"는 연결된 뉴클레오시드의 중합체를 의미하며, 이들 각각은 독립적으로 변형 또는 비변형될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "단일-가닥 올리고뉴클레오티드"는 포유동물 생리학적 조건 (또는 시험관내 유사한 조건) 하에 수소 결합을 통해 표적 mRNA에 혼성화할 수 있는, 표적 mRNA에 적어도 부분적으로 상보적인 서열을 갖는 단일-가닥 올리고머 화합물을 의미한다. 일부 실시양태에서, 단일-가닥 올리고뉴클레오티드는 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드이다. 본원에 개시된 5'-시클로-포스포네이트 변형된 뉴클레오티드는 단일-가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드 내에 혼입될 수 있다. 일부 실시양태에서, 5'-시클로-포스포네이트 변형된 뉴클레오티드는 단일-가닥 올리고뉴클레오티드의 5' 말단 상의 말단 뉴클레오티드로서 위치한다.
본원에 사용된 "RNAi 작용제"는 서열 특이적 방식으로 표적 mRNA의 메신저 RNA (mRNA) 전사체의 번역을 저하 또는 억제할 수 있는 RNA 또는 RNA-유사 (예를 들어, 화학적으로 변형된 RNA) 올리고뉴클레오티드 분자를 함유하는 작용제를 의미한다. 본원에 사용된 RNAi 작용제는 RNA 간섭 메카니즘을 통해 작동할 수 있거나 (즉, 포유동물 세포의 RNA 간섭 경로 기구 (RNA-유도 침묵화 복합체 또는 RISC)와의 상호 작용을 통해 RNA 간섭을 유도함), 또는 임의의 대안적 메카니즘(들) 또는 경로(들)에 의해 작동할 수 있다. RNAi 작용제는 이 용어가 본원에 사용되는 경우에, 주로 RNA 간섭 메카니즘을 통해 작동하는 것으로 여겨지지만, 개시된 RNAi 작용제는 임의의 특정한 작용 경로 또는 메카니즘에 의해 얽매이거나 또는 이에 제한되지 않는다. RNAi 작용제는 하기를 포함하나, 이에 제한되지 않는다: 단일-가닥 올리고뉴클레오티드, 단일-가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드, 짧은 간섭 RNA (siRNA), 이중-가닥 RNA (dsRNA), 마이크로 RNA (miRNA), 짧은 헤어핀 RNA (shRNA) 및 다이서 기질. 본원에 기재된 RNAi 작용제는 표적화되는 mRNA에 대해 적어도 부분적으로 상보적인 가닥을 갖는 올리고뉴클레오티드로 구성된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 RNAi 작용제는 이중-가닥이고, 안티센스 가닥, 및 안티센스 가닥에 대해 적어도 부분적으로 상보적인 센스 가닥으로 구성된다. RNAi 작용제는 변형된 뉴클레오티드 및/또는 1개 이상의 비-포스포디에스테르 연결로 구성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 RNAi 작용제는 단일-가닥이다.
본원에 사용된 용어 "침묵하다", "감소하다", "억제하다", "하향 조절하다" 또는 "녹다운하다"는 소정의 유전자의 발현을 지칭하는 경우에 유전자가 전사되는 세포, 세포 군, 조직, 기관 또는 대상체에서 유전자로부터 전사된 RNA의 수준 또는 mRNA로부터 번역된 폴리펩티드, 단백질 또는 단백질 서브유닛의 수준에 의해 측정되는 바와 같은 유전자의 발현이, 세포, 세포 군, 조직, 기관 또는 대상체가 올리고머 화합물, 예컨대 RNAi 작용제로 처리된 경우에 그렇게 처리되지 않은 제2의 세포, 세포 군, 조직, 기관 또는 대상체에 비해 감소되는 것을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "서열" 또는 "뉴클레오티드 서열"은 표준 뉴클레오티드 명명법을 사용하여 일련의 문자로 기재된 핵염기 또는 뉴클레오티드의 연속 또는 순서를 의미한다.
본원에 사용된 "뉴클레오티드 염기" 또는 "핵염기"는 모든 핵산의 표준 구성성분인 헤테로시클릭 피리미딘 또는 퓨린 화합물이고, 뉴클레오티드 아데닌 (A), 구아닌 (G), 시토신 (C), 티민 (T) 및 우라실 (U)를 형성하는 염기를 포함한다. 핵염기는 제한 없이 범용 염기, 소수성 염기, 무차별 염기, 크기-확장된 염기, 및 플루오린화 염기를 포함하도록 추가로 변형될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "헤테로시클릭 염기 모이어티"는 본원에 정의된 바와 같은 핵염기 또는 변형된 핵염기이다. 일부 실시양태에서, 헤테로시클릭 염기 모이어티는 피리미딘, 치환된 피리미딘, 퓨린 또는 치환된 퓨린이다. 일부 실시양태에서, 헤테로시클릭 염기 모이어티는 자연 발생 퓨린 또는 치환된 퓨린이다. 일부 실시양태에서, 헤테로시클릭 염기 모이어티는 비-자연 발생 퓨린 또는 치환된 퓨린이다. 일부 실시양태에서, 헤테로시클릭 염기 모이어티는 자연 발생 피리미딘 또는 치환된 피리미딘이다. 일부 실시양태에서, 헤테로시클릭 염기 모이어티는 비-자연 발생 피리미딘 또는 치환된 피리미딘이다. 일부 실시양태에서, 특히 본원에 개시된 5'-시클로-포스포네이트 변형된 뉴클레오티드가 포스포르아미다이트 화합물인 경우, 헤테로시클릭 염기 모이어티는 1개 이상의 보호기를 포함한다.
본원에 사용된 "당 대용물 대체 모이어티"는 자연 발생 리보뉴클레오티드의 5-원 푸라노스 고리를 대체할 수 있는 구조를 지칭한다.
달리 나타내지 않는 한, 본원에 사용된 용어 "상보적"은, 제1 뉴클레오티드 서열 (예를 들어, RNAi 작용제 센스 가닥 또는 표적화 mRNA)을 제2 뉴클레오티드 서열 (예를 들어, 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 이중-가닥 RNAi 작용제 안티센스 가닥)과 관련하여 기재하기 위해 사용되는 경우에, 제1 뉴클레오티드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드가 제2 뉴클레오티드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드와 혼성화하고 (포유동물 생리학적 조건 (또는 시험관내 유사한 조건) 하에 염기쌍 수소 결합을 형성하고) 특정 조건 하에 듀플렉스 또는 이중 나선 구조를 형성하는 능력을 의미한다. 상보적 서열은 왓슨-크릭(Watson-Crick) 염기쌍 또는 비-왓슨-크릭 염기쌍을 포함하며, 적어도 상기 혼성화 요건이 충족되는 정도까지 천연 또는 변형된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 모방체를 포함한다. 서열 동일성 또는 상보성은 변형과 독립적이다. 예를 들어, 동일성 또는 상보성을 결정하기 위해, a 및 Af는 U (또는 T)에 상보적이고 A에 대해 동일하다.
본원에 사용된 "완벽하게 상보적인" 또는 "완전히 상보적인"은 제1 폴리뉴클레오티드의 인접 서열 내의 염기의 전부 (100%)가 제2 폴리뉴클레오티드의 인접한 서열에서 동일한 수의 염기와 혼성화할 것임을 의미한다. 연속 서열은 제1 또는 제2 뉴클레오티드 서열의 전부 또는 일부를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 "부분적으로 상보적인"은 혼성화된 쌍의 핵염기 서열에서, 제1 폴리뉴클레오티드의 인접한 서열 내의 염기의 적어도 70% (전부는 아니지만)가 제2 폴리뉴클레오티드의 인접한 서열에서 동일한 수의 염기와 혼성화될 것임을 의미한다.
본원에 사용된 "실질적으로 상보적인"은 혼성화된 쌍의 핵염기 서열에서, 제1 폴리뉴클레오티드의 인접한 서열 내의 염기의 적어도 85% (전부는 아니지만)가 제2 폴리뉴클레오티드의 연속 서열 내의 동일한 수의 염기와 혼성화될 것임을 의미한다. 본원에서 용어 "상보적인", "완전히 상보적인" 및 "실질적으로 상보적인"은 이중-가닥 RNAi 작용제의 센스 가닥과 안티센스 가닥 사이, 이중-가닥 RNAi 작용제의 안티센스 가닥과 표적 mRNA의 서열 사이, 또는 단일-가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드와 표적 mRNA의 서열 사이의 염기 매칭과 관련하여 사용될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "치료하다", "치료" 등은 대상체에서 질환 또는 상태의 하나 이상의 증상의 수, 중증도, 및/또는 빈도로부터의 경감 또는 완화를 제공하기 위한 방법 또는 단계를 의미한다.
본원에 사용된 어구 "세포 내로 도입하는"은 5'-시클로-포스포네이트 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 RNAi 작용제를 언급하는 경우에 RNAi 작용제를 세포 내에 기능적으로 전달하는 것을 의미한다. 어구 "기능적 전달"은 RNAi 작용제가 예상된 생물학적 활성, 예를 들어, 유전자 발현의 서열-특이적 억제를 갖는 것을 가능하게하는 방식으로 RNAi 작용제를 세포에 전달하는 것을 의미한다.
달리 언급되지 않는 한, 본원에 사용된 기호
Figure 112018120553379-pct00022
의 사용은 임의의 기 또는 기들이 본원에 기재된 본 발명의 범주에 따라 그에 연결될 수 있음을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "이성질체"는 동일한 분자식을 갖지만, 그 원자의 결합의 성질 또는 순서 또는 그의 원자의 공간 배열이 상이한 화합물을 지칭한다. 그 원자의 공간 배열이 상이한 이성질체는 "입체이성질체"로 지칭된다. 서로 거울상이 아닌 입체이성질체는 "부분입체이성질체"로 칭해지고, 서로 비-중첩가능한 거울상인 입체이성질체는 "거울상이성질체" 또는 때때로 광학 이성질체로 지칭된다. 4개의 동일하지 않은 치환기에 결합된 탄소 원자는 "키랄 중심"으로 지칭된다.
본원에 사용되는 경우, 특정 입체 형태를 갖는 것으로 구조에서 구체적으로 확인되지 않는 한, 비대칭 중심이 존재하고 따라서 거울상이성질체, 부분입체이성질체 또는 다른 입체이성질체 배위를 발생시키는 각각의 구조에 대해 본원에 개시된 각각의 구조는 그의 광학적으로 순수한 및 라세미 형태를 포함한 모든 이러한 가능한 이성질체를 나타내는 것으로 의도된다. 예를 들어, 본원에 개시된 구조는 부분입체이성질체 뿐만아니라 단일 입체이성질체의 혼합물을 포괄하도록 의도된다. 본원에 기재된 5'-시클로-포스포네이트 변형된 뉴클레오티드는 1개 이상의 비대칭 중심을 함유하고, 따라서 절대 입체화학, (R) 또는 (S), α 또는 β로서 (예컨대, 당 아노머), 또는 (D) 또는 (L) (예컨대, 아미노산)로서 정의될 수 있는 거울상이성질체, 부분입체이성질체, 및 다른 입체이성질체 배위를 발생시킨다. 본원에 기재된 5'-시클로-포스포네이트 변형된 뉴클레오티드는 그의 라세미 및 광학적으로 순수한 형태를 비롯한 모든 이러한 가능한 이성질체이다. 달리 명시되지 않는 한, 본원에 기재된 화합물이 이중 결합을 함유하는 경우에 (예를 들어, 알켄 또는 이민), 화합물은 E 및 Z 기하 이성질체 또는 시스-및 트랜스-이성질체 둘 다를 포함하는 것으로 의도된다. 마찬가지로, 모든 호변이성질체 형태가 또한 포함되는 것으로 의도된다. 본원에서 나타나는 임의의 결합의 배위는 오로지 편의상 선택되고, 달리 언급하지 않는 한, 특정한 구성을 제한하도록 의도되지 않는다.
본원에 사용된 용어 "치환된"은 지정된 원자, 통상적으로 탄소, 산소, 또는 질소 원자 상의 임의의 1개 이상의 수소가 본원에 정의된 바와 같은 임의의 기로 대체된 것을 의미하며, 단 지정된 원자의 정상 원자가는 초과되지 않고, 치환은 안정한 화합물을 생성한다. 치환기가 케토 또는 옥소 (즉, =O)인 경우에, 원자 상의 2개의 수소가 대체된다. 본원에 사용된 고리 이중 결합은 2개의 인접한 고리 원자 사이에 형성된 이중 결합 (예를 들어, C=C, C=N, N=N 등)이다. 일부 실시양태에서, 시클릭 관능기의 치환기 기는 추가의 시클릭 또는 아릴 기이다. 본원에 사용된 비시클릭 기는 치환된 시클릭 관능기로 간주된다. 유기 관능기의 예는 하기를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다; 수소; 할로 (예를 들면, F, Cl, Br, I); 시아노; -CO2Ra; -CONRaRa; 독립적으로 선택된 1-2개의 Ra로 임의로 치환된 C1-6 알킬; C1-4 할로알킬; C1-4 알콕시; C1-4 할로알콕시; 독립적으로 선택된 1-4개의 Ra로 임의로 치환된 시클로알킬; 1-3개의 고리 원자가 각각 독립적으로 N(Ra), O, 및 S로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 5-8개의 고리 원자를 포함하고, 독립적으로 선택된 1-4개의 Ra로 임의로 치환된 헤테로시클릴; 1-4개의 Ra로 임의로 치환된 C6-10 아릴; 1-4개의 고리 원자가 각각 독립적으로 N, N(Ra), O, 및 S로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 5-10개의 고리 원자를 포함하고, 1-3개의 Ra로 임의로 치환된 헤테로아릴; -N3; -CO2H; -OH; -SO1-2(Ra); -NRaRa; -SO1-2(NRaRa); 및 티오알콕시; 여기서 각각의 Ra는 독립적으로 C1-6 알킬, -OH, -할로, -NH2, -N(C1-4 알킬)2, C1-4 알콕시, C1-4 할로알콕시, -C(=O)O(C1-4 알킬), -C(=O)(C1-4 알킬), -C(=O)OH, -CON(C1-4 알킬)2, -S(O)1-2(C1-4 알킬)2, 및 시아노로부터 선택된다.
본 개시내용의 일부 화합물은 또한 본 개시내용의 범주 내에 포함되도록 의도된 호변이성질체 형태로 존재할 수 있다. "호변이성질체"는 그 구조가 원자의 배열 면에서 현저하게 상이하지만, 용이하고 신속한 평형으로 존재하는 화합물을 지칭한다. 본 개시내용의 화합물은 상이한 호변이성질체로서 묘사될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 또한 화합물이 호변이성질체 형태를 갖는 경우에, 모든 호변이성질체 형태가 본 개시내용의 범주에 포함되는 것으로 의도되고, 화합물의 명칭이 어떠한 호변이성질체 형태도 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
본 개시내용의 화합물 및 제약상 허용되는 염은 케톤-엔올, 아미드-니트릴, 락탐-락팀, 아미드-이미드 산 (예를 들어, 핵염기 구아닌, 티민 및 시토신), 아민-엔아민 및 엔아민-엔아민 및 기하학적 이성질체 및 그의 혼합물을 비롯한 하나 이상의 호변이성질체 형태로 존재할 수 있다. 글루코스 및 다른 당에 의해 나타나는 고리-쇄 호변이성질현상은 고리-쇄 호변이성질체현상은 당 쇄 분자 내의 알데히드 기 (-CHO)가 동일한 분자 내의 히드록시 기 (-OH) 중 1개와 반응하여 시클릭 (고리-형상의) 형태를 제공하는 것의 결과로서 발생한다. 이러한 모든 호변이성질체 형태가 본 개시내용의 범주 내에 포함된다. 호변이성질체는 용액 중 호변이성질체 세트의 혼합물로서 존재한다. 고체 형태에서, 통상적으로 1종의 호변이성질체가 우세하다. 하나의 호변이성질체가 기재될 수 있지만, 본 개시내용은 본원에 개시된 화합물의 모든 호변이성질체를 포함한다. 호변이성질체화에 의해 상호전환가능한 호변이성질체의 개념은 호변이성질현상으로 지칭된다. 호변이성질현상에서는, 전자와 수소 원자의 동시 이동이 일어난다.
염기에 의해 촉매된 호변이성질체화는 하기에 의해 일어난다: 1) 탈양성자화; 2) 비국재화 음이온 (예를 들어 엔올레이트)의 형성; 및 3) 음이온의 상이한 위치에서의 양성자화. 산에 의해 촉매된 호변이성질체화는 1) 양성자화; 2) 비국재화 양이온의 형성; 및 3) 양이온에 인접한 상이한 위치에서의 탈양성자화에 의하여 일어난다.
본원에 사용된 "보호기"는 반응성 기 (예를 들어, 히드록실, 아미노, 카르복실, 및 술프히드릴 기)가 합성 절차 동안 목적하지 않는 반응을 겪는 것을 방지하기 위해 관련 기술분야에 공지된 불안정한 화학적 모이어티를 지칭한다. 보호기는 전형적으로 부위를 다른 반응성 부위에서의 반응 동안 보호하기 위해 선택적으로 및/또는 직교성으로 사용되고, 이어서 제거되어 비보호된 기를 그대로 또는 추가의 반응에 이용가능하게 남길 수 있다. 일부 실시양태에서, "치환된" 기 또는 치환기 기는 보호기를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "알킬"은 달리 명시되지 않는 한, 1 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 분지형 포화 지방족 탄화수소 기를 지칭한다. 예를 들어, "C1-C6 알킬"은 선형 또는 분지형 배열로 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 탄소를 갖는 알킬 기를 포함한다. 본원에 사용된 용어 "아미노알킬"은 정상 원자가에 의해 허용되는 바와 같은 1개 이상의 아미노 기로 임의의 위치에서 치환된 상기 정의된 바와 같은 알킬 기를 지칭한다. 아미노 기는 비치환, 일치환 또는 이치환될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "시클릭 관능기"는 고리 구조를 형성하는 관능기를 의미하는 것으로 의도된다. 시클릭 관능기는 시클로알킬, 시클로알케닐, 시클로알키닐, 헤테로시클릴, 헤테로아릴 및 아릴을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 용어 "시클로알킬"은, 달리 명시되지 않는 한, 3 내지 14개의 탄소 원자를 갖는 포화 또는 불포화 비방향족 탄화수소 고리기를 의미한다. 시클로알킬 기의 예는 시클로프로필, 메틸-시클로프로필, 2,2-디메틸-시클로부틸, 2-에틸-시클로펜틸 또는 시클로헥실을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 시클로알킬은 다중 스피로- 또는 융합된 고리를 포함할 수 있다. 시클로알킬 기는 정상적인 원자가에 의해 허용되는 바와 같이 임의의 위치에 임의로 일치환, 이치환, 삼치환, 사치환, 또는 오치환된다.
본원에 사용된 용어 "알케닐"은 달리 명시되지 않는 한 적어도 1개의 탄소-탄소 이중 결합을 함유하고, 2 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 직쇄형 또는 분지형 비-방향족 탄화수소 라디칼을 지칭한다. 최대 5개의 탄소-탄소 이중 결합이 이러한 기에 존재할 수 있다. 예를 들면, "C2-C6" 알케닐은 2 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 알케닐 라디칼로 정의된다. 알케닐 기의 예는 에테닐, 프로페닐, 부테닐 및 시클로헥세닐을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 알케닐 기의 직쇄형, 분지형 또는 시클릭 부분은 이중 결합을 함유할 수 있고, 정상 원자가에 의해 허용되는 바와 같이 임의의 위치에서 임의로 일치환, 이치환, 삼치환, 사치환, 또는 오치환된다. 용어 "시클로알케닐"은 명시된 수의 탄소 원자 및 적어도 1개의 탄소-탄소 이중 결합을 갖는 모노시클릭 탄화수소 기를 의미한다.
본원에 사용된 용어 "알키닐"은 달리 명시되지 않는 한 2 내지 10개의 탄소 원자를 함유하고, 적어도 1개의 탄소-탄소 삼중 결합을 함유하는 직쇄형 또는 분지형 탄화수소 라디칼을 지칭한다. 최대 5개의 탄소-탄소 삼중 결합이 존재할 수 있다. 따라서, "C2-C6 알키닐"은 2 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 알키닐 라디칼을 의미한다. 알키닐 기의 예는 에티닐, 2-프로피닐 및 2-부티닐을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 알키닐 기의 직쇄형 또는 분지형 부분은 정상 원자가에 의해 허용되는 바와 같이 삼중 결합을 함유할 수 있고, 정상 원자가에 의해 허용되는 바와 같이 임의의 위치에서 임의로 일치환, 이치환 또는 삼치환된다.
본원에 사용된 "알콕실" 또는 "알콕시"는 산소 가교를 통하여 부착되어 있는, 명시된 수의 탄소 원자를 함유하는 상기에 정의된 바와 같은 알킬 기를 지칭한다. 예를 들면, C1-6 알콕시는 C1, C2, C3, C4, C5 및 C6 알콕시 기를 포함하도록 의도된다. 예를 들면, C1-8 알콕시는 C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7 및 C8 알콕시 기를 포함하도록 의도된다. 알콕시의 예는 메톡시, 에톡시, n-프로폭시, i-프로폭시, n-부톡시, s-부톡시, t-부톡시, n-펜톡시, s-펜톡시, n-헵톡시 및 n-옥톡시를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 "케토"는 카르보닐 가교를 통하여 부착되어 있는, 본원에 정의된 임의의 알킬, 알케닐, 알키닐, 시클로알킬, 시클로알케닐, 헤테로시클릴, 헤테로아릴 또는 아릴 기를 지칭한다. 케토 기의 예는 알카노일 (예를 들면, 아세틸, 프로피오닐, 부타노일, 펜타노일, 헥사노일), 알케노일 (예를 들면, 아크릴로일), 알키노일 (예를 들면, 에티노일, 프로피노일, 부티노일, 펜티노일, 헥시노일), 아릴로일 (예를 들면, 벤조일), 헤테로아릴로일 (예를 들면, 피롤로일, 이미다졸로일, 퀴놀리노일, 피리디노일)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 "알콕시카르보닐"은 카르보닐 가교 (즉, -C(O)O-알킬)를 통하여 부착되어 있는, 상기 본원에 정의된 임의의 알콕시 기를 지칭한다. 알콕시카르보닐 기의 예는 메톡시카르보닐, 에톡시카르보닐, 이소-프로폭시카르보닐, n-프로폭시카르보닐, t-부톡시카르보닐, 벤질옥시카르보닐 또는 n-펜톡시카르보닐을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 "아릴옥시카르보닐"은 옥시카르보닐 가교 (즉, -C(O)O-아릴)을 통하여 부착되어 있는, 본원에 정의된 임의의 아릴 기를 지칭한다. 아릴옥시카르보닐 기의 예는 페녹시카르보닐 및 나프틸옥시카르보닐을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 "헤테로아릴옥시카르보닐"은 옥시카르보닐 가교 (즉, -C(O)O-헤테로아릴)를 통하여 부착되어 있는, 본원에 정의된 임의의 헤테로아릴 기를 지칭한다. 헤테로아릴옥시카르보닐 기의 예는 2-피리딜옥시카르보닐, 2-옥사졸릴옥시카르보닐, 4-티아졸릴옥시카르보닐 또는 피리미디닐옥시카르보닐을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 "아릴"은 적어도 1개의 고리가 방향족이며, 각각의 고리에 7개 이하의 원자를 갖는 임의의 안정한 모노시클릭 또는 폴리시클릭 탄소 고리를 의미한다. 아릴 기의 예는 페닐, 나프틸, 안트라세닐, 테트라히드로나프틸, 인다닐 및 비페닐을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 아릴 치환기는 비시클릭이고 1개의 고리는 비-방향족인 경우에, 부착이 방향족 고리를 통해 이루어지는 것으로 이해된다. 아릴 기는 정상 원자가에 의해 허용되는 바와 같이 임의의 위치에 임의로 일치환, 이치환, 삼치환, 사치환, 또는 오치환된다.
본원에 사용된 용어 "헤테로아릴"은 각각의 고리에 7개 이하의 원자를 갖는 안정한 모노시클릭 또는 폴리시클릭 고리계를 나타내고, 여기서 적어도 1개의 고리는 방향족이고, O, N 및 S로 이루어진 군으로부터 선택된 1 내지 4개의 헤테로원자를 함유한다. 헤테로아릴 기의 예는 아크리디닐, 카르바졸릴, 신놀리닐, 퀴녹살리닐, 피라졸릴, 인돌릴, 벤조트리아졸릴, 푸라닐, 티에닐, 벤조티에닐, 벤조푸라닐, 벤즈이미다졸로닐, 벤족사졸로닐, 퀴놀리닐, 이소퀴놀리닐, 디히드로이소인돌로닐, 이미다조피리디닐, 이소인돌로닐, 인다졸릴, 옥사졸릴, 옥사디아졸릴, 이속사졸릴, 인돌릴, 피라지닐, 피리다지닐, 피리디닐, 피리미디닐, 피롤릴, 테트라히드로퀴놀린을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. "헤테로아릴"은 또한 임의의 질소-함유 헤테로아릴의 N-옥시드 유도체를 포함하는 것으로 이해된다. 헤테로아릴 치환기가 비시클릭이고 1개의 고리가 비-방향족이거나, 또는 어떤 헤테로원자도 함유하지 않는 경우에, 부착은 방향족 고리 또는 헤테로원자 함유 고리를 통해 이루어지는 것으로 이해된다. 헤테로아릴 기는 정상 원자가에 의해 허용되는 바와 같이 임의의 위치에서 임의로 일치환 또는 이치환된다.
본원에 사용된 용어 "헤테로사이클", "헤테로시클릭" 또는 "헤테로시클릴"은 폴리시클릭 기를 포함하여, O, N 및 S로 이루어진 군으로부터 선택된 1 내지 4개의 헤테로원자를 함유하는 3- 내지 14-원 방향족 또는 비방향족 헤테로사이클을 의미한다. 본원에 사용된 용어 "헤테로시클릭"은 또한 용어 "헤테로사이클" 및 "헤테로시클릴"과 동의어인 것으로 간주되고, 또한 본원에 제시된 바와 동일한 정의를 갖는 것으로 이해된다. "헤테로시클릴"은 상기 언급된 헤테로아릴, 뿐만 아니라 그의 디히드로 및 테트라히드로 유사체를 포함한다. 헤테로시클릴 기의 예는 아제티디닐, 벤조이미다졸릴, 벤조푸라닐, 벤조푸라자닐, 벤조피라졸릴, 벤조트리아졸릴, 벤조티오페닐, 벤족사졸릴, 카르바졸릴, 카르볼리닐, 신놀리닐, 푸라닐, 이미다졸릴, 인돌리닐, 인돌릴, 인돌라지닐, 인다졸릴, 이소벤조푸라닐, 이소인돌릴, 이소퀴놀릴, 이소티아졸릴, 이속사졸릴, 나프트피리디닐, 옥사디아졸릴, 옥소옥사졸리디닐, 옥사졸릴, 옥사졸린, 옥소피페라지닐, 옥소피롤리디닐, 옥소모르폴리닐, 이속사졸린, 옥세타닐, 피라닐, 피라지닐, 피라졸릴, 피리다지닐, 피리도피리디닐, 피리다지닐, 피리딜, 피리디노닐, 피리미딜, 피리미디노닐, 피롤릴, 퀴나졸리닐, 퀴놀릴, 퀴녹살리닐, 테트라히드로피라닐, 테트라히드로푸라닐, 테트라히드로티오피라닐, 테트라히드로이소퀴놀리닐, 테트라졸릴, 테트라졸로피리딜, 티아디아졸릴, 티아졸릴, 티에닐, 트리아졸릴, 1,4-디옥사닐, 헥사히드로아제피닐, 피페라지닐, 피페리디닐, 피리딘-2-오닐, 피롤리디닐, 모르폴리닐, 티오모르폴리닐, 디히드로벤조이미다졸릴, 디히드로벤조푸라닐, 디히드로벤조티오페닐, 디히드로벤족사졸릴, 디히드로푸라닐, 디히드로이미다졸릴, 디히드로인돌릴, 디히드로이소옥사졸릴, 디히드로이소티아졸릴, 디히드로옥사디아졸릴, 디히드로옥사졸릴, 디히드로피라지닐, 디히드로피라졸릴, 디히드로피리디닐, 디히드로피리미디닐, 디히드로피롤릴, 디히드로퀴놀리닐, 디히드로테트라졸릴, 디히드로티아디아졸릴, 디히드로티아졸릴, 디히드로티에닐, 디히드로트리아졸릴, 디히드로아제티디닐, 디옥시도티오모르폴리닐, 메틸렌디옥시벤조일, 테트라히드로푸라닐 및 테트라히드로티에닐 및 그의 N-옥시드를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 헤테로시클릴 치환기의 부착은 탄소 원자를 통해 또는 헤테로원자를 통해 일어날 수 있다. 헤테로시클릴 기는 임의로 정상 원자가에 의해 허용되는 바와 같이 임의의 위치에 일치환, 이치환, 삼치환, 사치환, 또는 오치환된다.
본원의 청구범위에 사용된 어구 "이루어진"은 청구범위에 명시되지 않은 임의의 요소, 단계 또는 성분을 배제한다. 본원의 청구범위에 사용된 어구 "본질적으로 이루어진"은 청구범위의 범주를 특정한 물질 또는 단계 및 기본적이고 신규한 특징(들)에 실질적으로 영향을 미치지 않는 것들로 제한한다.
관련 기술분야의 통상의 기술자는 화합물 또는 조성물이 위치하는 환경에 따라, 본원에 개시된 화합물 및 조성물이 특정 원자 (예를 들어, N, O 또는 S 원자)를 양성자화 또는 탈양성자화된 상태로 가질 수 있음을 용이하게 이해하고 인지할 것이다. 따라서, 본원에 사용된 바와 같이, 본원에 개시된 구조는 특정 관능기, 예컨대, 예를 들어, OH, SH, 또는 NH가 양성자화 또는 탈양성자화될 수 있음을 고려한다. 본원의 개시 내용은 관련 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 용이하게 이해되는 바와 같이, 환경의 pH에 기초하여 그의 양성자화 상태와 무관하게 개시된 화합물 및 조성물을 포괄하도록 의도된다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 과학 용어는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 등가의 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 물질이 하기 기재된다. 본원에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허, 및 다른 참고문헌은 그 전문이 참조로 포함된다. 상충하는 경우에, 정의를 포함하는 본 명세서가 우선할 것이다. 또한, 물질, 방법 및 예는 단지 예시적이며, 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
본 발명의 기타 특징 및 이점은 하기 상세한 설명 및 청구범위로부터 명백할 것이다.
도 1. 인자 12에 대해 지시된 서열을 갖는 RNAi 작용제의 투여 후 시노몰구스 원숭이에서의 상대 cF12 발현을 나타내는 그래프. AD04443만이 안티센스 가닥의 5' 말단에 위치하는 5'-시클로프로필 포스포네이트 변형된 뉴클레오티드를 포함하였다.
도 2. HBV에 대해 지시된 서열을 갖는 RNAi 작용제의 투여 후 pHBV 모델 마우스에서의 처리-전 및 염수 대조군에 대해 정규화된 평균 HBsAg를 나타내는 그래프. AD04580만이 안티센스 가닥의 5' 말단에 위치하는 5'-시클로프로필 포스포네이트 변형된 뉴클레오티드를 포함하였다.
5'-시클로-포스포네이트 변형된 뉴클레오티드, 및 5'-시클로-포스포네이트 변형된 뉴클레오티드를 함유하는 RNAi 작용제 (또한 RNAi 촉발제로 지칭됨)가 본원에 기재된다. 일부 실시양태에서, 1개 이상의 5'-시클로-포스포네이트 변형된 뉴클레오티드는 RNAi 작용제의 말단에 연결되고, RNAi 작용제의 말단 뉴클레오티드를 형성한다. 일부 실시양태에서, 5'-시클로-포스포네이트 변형된 뉴클레오티드는 RNAi 작용제의 5' 말단 또는 5' 말단부에 연결되고, RNAi 작용제의 5' 말단 상에 말단 뉴클레오티드를 형성한다. 일부 실시양태에서, 5'-시클로-포스포네이트 변형된 뉴클레오티드는 이중-가닥 RNAi 작용제의 안티센스 가닥의 5' 말단에 연결되고, 이중-가닥 RNAi 작용제의 안티센스 가닥의 5' 말단 상에 말단 뉴클레오티드를 형성한다.
본원에 개시된 5'-시클로-포스포네이트 변형된 뉴클레오티드는 뉴클레오티드의 당의 5' 탄소에 (또는 당 대용물 대체 모이어티의 유사한 위치에) 시클릭 기 또는 시클릭 모이어티를 갖는다.
일부 실시양태에서, RNAi 작용제의 5' 말단 뉴클레오티드는 5'-시클로-포스포네이트 변형된 뉴클레오티드이거나 또는 이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 이중-가닥 RNAi 작용제의 안티센스 가닥의 5' 말단 뉴클레오티드는 5'-시클로-포스포네이트 변형된 뉴클레오티드이거나 또는 이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 올리고머 화합물, 예컨대 단일-가닥 RNAi 작용제의 말단 5' 말단에 또는 이중-가닥 RNAi 작용제의 안티센스 가닥 상에 위치한 5'-시클로-포스포네이트 변형된 뉴클레오티드는 RNAi 메카니즘을 수행하기 위해 그가 부착되어 있는 올리고머 화합물의 RISC 내로의 로딩을 용이하게 한다.
일부 실시양태에서, 1개 이상의 5'-시클로-포스포네이트 변형된 뉴클레오티드는 단일-가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드의 말단에 연결되고, 단일-가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드의 말단 뉴클레오티드를 형성한다. 일부 실시양태에서, 5'-시클로-포스포네이트 변형된 뉴클레오티드는 단일-가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 연결되고, 단일-가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드의 5' 말단 상에 말단 뉴클레오티드를 형성한다.
일부 실시양태에서, 개시된 화합물은 상기 개요 부분에 제시된 화학식 A에 의해 나타내어진 구조를 갖는다.
일부 실시양태에서, 개시된 화학식 A의 화합물은 화학식 I에 의해 나타내어진 5'-시클로-포스포네이트 구조를 갖는다:
Figure 112018120553379-pct00023
여기서
시클로는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 탄소 원자를 갖는 임의로 치환된 2가 시클릭 모이어티, 예컨대 시클로알킬 (예를 들면, 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 시클로헥실, 또는 시클로헵틸), 시클로알케닐 (예를 들면, 시클로펜테닐, 시클로부테닐, 시클로펜테닐, 시클로헥세닐, 또는 시클로헵테닐), 아릴 (예를 들면, 페닐), 헤테로아릴 (예를 들면, 피리딜, 피리미디닐, 피리다지닐, 피롤, 피라졸, 이미다졸, 티오펜, 벤조티오펜, 티아졸, 벤조티아졸, 푸란, 옥사졸, 이속사졸, 벤조푸란, 인돌, 인다졸, 벤즈이미다졸, 옥사디아졸, 1,2,3-트리아졸, 1,2,4-트리아졸, 테트라졸, 퀴놀리닐, 이소퀴놀리닐, 또는 퀴녹살리닐) 또는 헤테로시클릴 (예를 들면, 테트라히드로푸란, 테트라히드로피란, 피페리딘, 피롤리딘, 디옥산 또는 디옥솔란)이고;
D는 O, S, CH2-CH2, CH=CH, OCH2, N(R1), C(R2)(R3), C(R2)(R3)C(R4)(R2), C(R2)=C(R4), OC(R2)(R3), OC(H)(X3) 또는 OC(R2)(X3)이고;
R1은 H, C1-C6 알킬, 치환된 C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, 치환된 C1-C6 알콕시, C2-C6 알케닐, 치환된 C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, 또는 치환된 C2-C6 알키닐이고;
R2, R3, 및 R4는 각각, 독립적으로, H, 할로겐, C1-C6 알킬, 치환된 C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, 치환된 C1-C6 알콕시, C2-C6 알케닐, 치환된 C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, 또는 치환된 C2-C6 알키닐이고;
D가 O, S, CH2-CH2, CH=CH, OCH2, N(R1), C(R2)(R3), C(R2)(R3)C(R4)(R2), C(R2)=C(R4), OC(R2)(R3)인 경우에, X는 헤테로시클릭 염기 모이어티이고;
D가 OC(H)(X3) 또는 OC(R2)(X3)인 경우에, X는 H, 할로겐, C1-C6 알킬, 치환된 C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, 치환된 C1-C6 알콕시, C2-C6 알케닐, 치환된 C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐 또는 치환된 C2-C6 알키닐이고 X3은 헤테로시클릭 염기 모이어티이고;
Z는 H, -OH, F, OCH3, -O-(CH2)2-OCH3; 할로겐; -OCH2F, -OCHF2, -OCF3, -OCH2CH3, -O(CH2)2F, -OCH2CHF2, -OCH2CF3, -OCH2-CH=CH2, -O(CH2)2-OCH3, -O(CH2)2-SCH3, -O(CH2)2-OCF3, -O(CH2)2-O(CH2)2-N(CH3)2, -OCH2C(=O)-N(H)CH3, -OCH2C(=O)-N(H)-(CH2)2-N(CH3)2, -O(CH2)2-N(H)-C(=NH)(NH2), -O(CH2)3-N(R5)(R6), -O(CH2)2-ON(R5)(R6), -O(CH2)2-O(CH2)2-N(R5)(R6), -OCH2C(=O)-N(R5)(R6), -OCH2C(=O)-N(R7)-(CH2)2-N(R5)(R6) -O(CH2)2-N(R7)-C(=R8)[N(R5)(R6)], 임의로 치환된 C1-C6 알킬, 임의로 치환된 C1-C6 알콕시, 임의로 치환된 C2-C6 알케닐, 또는 임의로 치환된 C2-C6 알키닐이고, 여기서 R5, R6, R7 및 R8은 각각, 독립적으로, H 또는 C1-C6 알킬이고;
Y1, Y2, Y3, 및 Y4는 각각, 독립적으로, H, 할로겐, C1-C6 알킬, 치환된 C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, 치환된 C1-C6 알콕시, C2-C6 알케닐, 치환된 C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, 또는 치환된 C2-C6 알키닐이거나; 또는 대안적으로, Y4는 Y1 또는 Y2 중 하나에 연결되고, 여기서 연결은 O, S, NR9, C(R10)(R11), C(R10)=C(R11), C[=C(R10)(R11)] 및 C(=O)로부터 선택된 2가 기를 포함하고, Y1, Y2, 및 Y3 중 나머지 2개는 각각, 독립적으로, H, 할로겐, 임의로 치환된 C1-C6 알킬, 임의로 치환된 C1-C6 알콕시, 임의로 치환된 C2-C6 알케닐, 또는 임의로 치환된 C2-C6 알키닐이고, 여기서 각각의 R9, R10 및 R11은 독립적으로, H, C1-C6 알킬, 치환된 C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, 치환된 C1-C6 알콕시, C2-C6 알케닐, 치환된 C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, 또는 치환된 C2-C6 알키닐이고;
J는 O, S, NR12, N-N(R13)2, 또는 N-OR13이고, 여기서,
R12는 H, OH, 할로겐, C1-C10 알킬, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, 아릴 또는
Figure 112018120553379-pct00024
이고, 여기서 R14는 H 또는 독립적으로 SH, S-(C1-C4 알킬), 히드록실로 임의로 치환된 아릴, 히드록실로 임의로 치환된 헤테로아릴, 아미노, 히드록실, 옥소, 또는 NH-C=(NH)NH2로부터 선택된 1 내지 3개의 치환기로 임의로 치환된 C1-C4 알킬로부터 선택되고, 여기서 R15는 H, C1-C18 알킬, 또는 아릴로부터 선택되고;
여기서 R13은 H, C1-C10 알킬, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, 아릴, 또는
Figure 112018120553379-pct00025
이고, 여기서 R14는 H 또는 독립적으로 SH, S-(C1-C4 알킬), 히드록실로 임의로 치환된 아릴, 히드록실로 임의로 치환된 헤테로아릴, 아미노, 히드록실, 옥소, 또는 NH-C=(NH)NH2로부터 선택된 1 내지 3개의 치환기로 임의로 치환된 C1-C4 알킬로부터 선택되고, 여기서 R15는 H, C1-C18 알킬, 또는 아릴로부터 선택되고;
K 및 L은 각각 독립적으로 OH, OR16, SR16, 또는 NR16으로부터 선택되고, 여기서 R16은 H, C1-C10 알킬, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, 아릴 또는
Figure 112018120553379-pct00026
로부터 선택되고, 여기서 R14는 H 또는 독립적으로 SH, S-(C1-C4 알킬), 히드록실로 임의로 치환된 아릴, 히드록실로 임의로 치환된 헤테로아릴, 아미노, 히드록실, 옥소, 또는 -NH-C=(NH)NH2로부터 선택된 1 내지 3개의 치환기로 임의로 치환된 C1-C4 알킬로부터 선택되고, R15는 H, C1-C18 알킬, 또는 아릴로부터 선택되고;
Q는 O, S, N(R30), 또는 C(R31)(R32)로부터 선택된 2가 모이어티이고, 여기서 R30은 H, 임의로 치환된 C1-C6 알킬, 임의로 치환된 C1-C6 알콕시, 임의로 치환된 C2-C6 알케닐, 또는 임의로 치환된 C2-C6 알키닐이고, R31 및 R32는 각각, 독립적으로, H, 할로겐, 임의로 치환된 C1-C6 알킬, 임의로 치환된 C1-C6 알콕시, 임의로 치환된 C2-C6 알케닐, 또는 임의로 치환된 C2-C6 알키닐이고;
A는 (i) 화학식 I의 5'-시클로-포스포네이트 변형된 뉴클레오티드를 RNAi 작용제의 나머지 부분에 연결하는 뉴클레오시드간 연결이거나 또는 (ii) 포스포르아미다이트 기이다.
일부 실시양태에서, A가 포스포르아미다이트 기인 경우에, Q와 포스포르아미다이트 형성 시약을 커플링함으로써 A가 화학식 I의 Q에 연결되고, 따라서 포스포르아미다이트 화합물을 형성한다.
일부 실시양태에서, 화학식 I의 Q는 O이다.
일부 실시양태에서, 개시된 화합물은 화학식 II에 의해 나타내어진 5'-시클로-포스포네이트 구조를 갖고:
Figure 112018120553379-pct00027
여기서, 시클로, D, X, Z, Y1, Y2, Y3, Y4, J, K, L, Q 및 A는 각각 화학식 I와 관련하여 상기 정의된 바와 같다.
일부 실시양태에서, 구조 화학식 I 및 화학식 II에서 Y1, Y2, Y3 및 Y4는 각각 H이다.
일부 실시양태에서, 화학식 I 및 화학식 II의 구조에서 시클로는 3, 4, 5, 6 또는 7개의 탄소 원자를 포함하는 시클로알킬이다.
일부 실시양태에서, 화학식 I 및 화학식 II의 구조에서 시클로는 4, 5, 6 또는 7개의 탄소 원자를 포함하는 시클로알케닐이다.
일부 실시양태에서, 화학식 I 및 화학식 II의 구조에서 시클로는 5, 6 또는 7개의 탄소 원자를 포함하는 시클로알키닐이다.
일부 실시양태에서, 화학식 I 및 화학식 II의 구조에서 시클로는 3, 4, 5, 6 또는 7개의 탄소 원자를 포함하는 아릴이다.
일부 실시양태에서, 화학식 I 및 화학식 II의 구조에서 시클로는 2, 3, 4, 5 또는 6개의 탄소 원자 및 1개 이상의 비-탄소 원자를 포함하는 헤테로시클릴 기이다.
일부 실시양태에서, 화학식 I 및 화학식 II의 구조에서 시클로는 2, 3, 4, 5 또는 6개의 탄소 원자 및 1개 이상의 비-탄소 원자를 포함하는 아릴 또는 헤테로시클릴 기이다.
일부 실시양태에서, 화학식 I 및 화학식 II의 구조에서 시클로는 비시클릭 기이다.
일부 실시양태에서, 화학식 I 및 화학식 II의 구조에서 시클로는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
Figure 112018120553379-pct00028
일부 실시양태에서, 화학식 I 및 화학식 II의 구조에서 시클로는 시클릭 관능기가 표준 IUPAC 명명법을 사용하여 나타낸 시클릭 관능기의 하기 위치에서 화학식 I 및 II의 포스포네이트 모이어티 및 당 고리에 연결되는 시클릭 관능기이다: 1,2; 1,3; 1,4; 1,5; 1,6; 1,7; 2,3; 2,4; 2,5; 2,6; 2,7; 3,4; 3,5; 3,6; 3,7; 4,5; 4,6; 4,7; 5,6; 5,7; 또는 6,7.
일부 실시양태에서, 화학식 I 및 화학식 II의 구조에서 시클로는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
Figure 112018120553379-pct00029
일부 실시양태에서, 화학식 I 및 화학식 II의 구조에서 시클로는 치환된다. 일부 실시양태에서, 화학식 I 및 화학식 II의 구조에서 시클로는 표준 IUPAC 명명법을 사용하여 나타낸 치환된 시클릭 관능기의 하기 위치에서 화학식 I 및 화학식 II의 포스포네이트 모이어티 및 당 고리에 연결되는 치환된 시클릭 모이어티이다: 1,2; 1,3; 1,4; 1,5; 1,6; 1,7; 2,3; 2,4; 2,5; 2,6; 2,7; 3,4; 3,5; 3,6; 3,7; 4,5; 4,6; 4,7; 5,6; 5,7; 또는 6,7.
일부 실시양태에서, 화학식 I 및 화학식 II의 구조에서 시클로는 특정 입체화학을 갖는 시클로프로필 기, 예컨대:
Figure 112018120553379-pct00030
이다.
일부 실시양태에서, 화학식 I 및 화학식 II의 구조에서 시클로는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 치환된 시클로프로필 관능기이다:
Figure 112018120553379-pct00031
일부 실시양태에서, 개시된 화합물은 화학식 I-a 또는 화학식 II-a에 의해 나타내어진 구조를 갖고:
Figure 112018120553379-pct00032
여기서, 시클로, D, X, Z, Y1, Y2, Y3, Y4, J, K, L 및 A는 각각 화학식 I 및 화학식 II와 관련하여 상기 정의된 바와 같다.
달리 나타내지 않는 한, 본원에 사용된 화학식 I에 대한 언급은 화학식 I-a 및 화학식 I-b에 대한 언급을 포함하고 화학식 II에 대한 언급은 화학식 II-a 및 화학식 II-b에 대한 언급을 포함하며, 단 이러한 언급은 본원의 개시내용을 고려하여 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 적용가능한 것으로 이해될 것이다.
일부 실시양태에서, 헤테로시클릭 염기 모이어티 (예를 들면, 화학식 I-VIII (모든 화학식 하위군 또는 종 (예를 들면, 화학식 I-b-5)을 포함하여) 중 임의의 구조에서 X)는 피리미딘, 치환된 피리미딘, 퓨린 또는 치환된 퓨린이다. 일부 실시양태에서, 헤테로시클릭 염기 모이어티는 자연 발생 퓨린 또는 치환된 퓨린이다. 일부 실시양태에서, 헤테로시클릭 염기 모이어티는 비-자연 발생 퓨린 또는 치환된 퓨린이다. 일부 실시양태에서, 헤테로시클릭 염기 모이어티는 자연 발생 피리미딘 또는 치환된 피리미딘이다. 일부 실시양태에서, 헤테로시클릭 염기 모이어티는 비-자연 발생 피리미딘 또는 치환된 피리미딘이다.
일부 실시양태에서, 헤테로시클릭 염기 모이어티 (예를 들면, 화학식 I-VIII (모든 화학식 하위군 또는 종 (예를 들면, 화학식 I-b-5)을 포함하여) 중 임의의 구조에서 X)는 우라실, 티민, 시토신, 5-메틸시토신, 아데닌, 구아닌 또는 이노신이다.
일부 실시양태에서, 헤테로시클릭 염기 모이어티 (예를 들면, 화학식 I-VIII (모든 화학식 하위군 또는 종 (예를 들면, 화학식 I-b-5)을 포함하여) 중 임의의 구조에서 X)는 치환된 우라실, 치환된 티민, 치환된 시토신, 5-메틸시토신, 치환된 아데닌, 치환된 구아닌 또는 치환된 이노신이다. 일부 실시양태에서, 치환된 기는 보호기이다.
일부 실시양태에서, 수소의 동위원소, 예컨대 중수소 또는 삼중수소는 수소가 존재하는 1개 이상의 위치에 혼입될 수 있다. 일부 실시양태에서, 다른 원자의 동위원소가 존재한다 (예를 들면, C, N, O, 또는 F).
일부 실시양태에서, 개시된 화합물은 화학식 I-b 또는 화학식 II-b에 의해 나타내어진 5'-시클로프로필 포스포네이트 구조를 갖고:
Figure 112018120553379-pct00033
여기서
D는 O, S, CH2-CH2, CH=CH, OCH2, N(R1), C(R2)(R3), C(R2)(R3)C(R4)(R2), C(R2)=C(R4), OC(R2)(R3), OC(H)(X3) 또는 OC(R2)(X3)이고;
R1은 H, C1-C6 알킬, 치환된 C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, 치환된 C1-C6 알콕시, C2-C6 알케닐, 치환된 C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, 또는 치환된 C2-C6 알키닐이고;
R2, R3, 및 R4는 각각, 독립적으로, H, 할로겐, C1-C6 알킬, 치환된 C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, 치환된 C1-C6 알콕시, C2-C6 알케닐, 치환된 C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, 또는 치환된 C2-C6 알키닐이고;
D가 O, S, CH2-CH2, CH=CH, OCH2, N(R1), C(R2)(R3), C(R2)(R3)C(R4)(R2), C(R2)=C(R4), OC(R2)(R3)인 경우에, X는 헤테로시클릭 염기 모이어티이고;
D가 OC(H)(X3) 또는 OC(R2)(X3)인 경우에, X는 H, 할로겐, C1-C6 알킬, 치환된 C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, 치환된 C1-C6 알콕시, C2-C6 알케닐, 치환된 C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐 또는 치환된 C2-C6 알키닐이고 X3은 헤테로시클릭 염기 모이어티이고;
Z는 H, -OH, F, OCH3, -O-(CH2)2-OCH3; 할로겐; -OCH2F, -OCHF2, -OCF3, -OCH2CH3, -O(CH2)2F, -OCH2CHF2, -OCH2CF3, -OCH2-CH=CH2, -O(CH2)2-OCH3, -O(CH2)2-SCH3, -O(CH2)2-OCF3, -O(CH2)2-O(CH2)2-N(CH3)2, -OCH2C(=O)-N(H)CH3, -OCH2C(=O)-N(H)-(CH2)2-N(CH3)2, -O(CH2)2-N(H)-C(=NH)(NH2), -O(CH2)3-N(R5)(R6), -O(CH2)2-ON(R5)(R6), -O(CH2)2-O(CH2)2-N(R5)(R6), -OCH2C(=O)-N(R5)(R6), -OCH2C(=O)-N(R7)-(CH2)2-N(R5)(R6) -O(CH2)2-N(R7)-C(=R8)[N(R5)(R6)], 임의로 치환된 C1-C6 알킬, 임의로 치환된 C1-C6 알콕시, 임의로 치환된 C2-C6 알케닐, 또는 임의로 치환된 C2-C6 알키닐이고, 여기서 R5, R6, R7 및 R8은 각각, 독립적으로, H 또는 C1-C6 알킬이고;
Y1, Y2, Y3, 및 Y4는 각각, 독립적으로, H, 할로겐, C1-C6 알킬, 치환된 C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, 치환된 C1-C6 알콕시, C2-C6 알케닐, 치환된 C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, 또는 치환된 C2-C6 알키닐이거나; 또는 대안적으로, Y4는 Y1 또는 Y2 중 하나에 연결되고, 여기서 연결은 O, S, NR9, C(R10)(R11), C(R10)=C(R11), C[=C(R10)(R11)] 및 C(=O)로부터 선택된 2가 기를 포함하고, Y1, Y2, 및 Y3 중 나머지 2개는 각각, 독립적으로, H, 할로겐, 임의로 치환된 C1-C6 알킬, 임의로 치환된 C1-C6 알콕시, 임의로 치환된 C2-C6 알케닐, 또는 임의로 치환된 C2-C6 알키닐이고, 여기서 각각의 R9, R10 및 R11은 독립적으로, H, C1-C6 알킬, 치환된 C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, 치환된 C1-C6 알콕시, C2-C6 알케닐, 치환된 C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, 또는 치환된 C2-C6 알키닐이고;
J는 O, S, NR12, N-N(R13)2, 또는 N-OR13이고, 여기서,
R12는 H, OH, 할로겐, C1-C10 알킬, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, 아릴 또는
Figure 112018120553379-pct00034
이고, 여기서 R14는 H 또는 독립적으로 SH, S-(C1-C4 알킬), 히드록실로 임의로 치환된 아릴, 히드록실로 임의로 치환된 헤테로아릴, 아미노, 히드록실, 옥소, 또는 NH-C=(NH)NH2로부터 선택된 1 내지 3개의 치환기로 임의로 치환된 C1-C4 알킬로부터 선택되고, 여기서 R15는 H, C1-C18 알킬, 또는 아릴로부터 선택되고;
여기서 R13은 H, C1-C10 알킬, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, 아릴, 또는
Figure 112018120553379-pct00035
이고, 여기서 R14는 H 또는 독립적으로 SH, S-(C1-C4 알킬), 히드록실로 임의로 치환된 아릴, 히드록실로 임의로 치환된 헤테로아릴, 아미노, 히드록실, 옥소, 또는 NH-C=(NH)NH2로부터 선택된 1 내지 3개의 치환기로 임의로 치환된 C1-C4 알킬로부터 선택되고, 여기서 R15는 H, C1-C18 알킬, 또는 아릴로부터 선택되고;
K 및 L은 각각 독립적으로 OH, OR16, SR16, 또는 NR16으로부터 선택되고, 여기서 R16은 H, C1-C10 알킬, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, 아릴, 또는
Figure 112018120553379-pct00036
로부터 선택되고, 여기서 R14는 H 또는 독립적으로 SH, S-(C1-C4 알킬), 히드록실로 임의로 치환된 아릴, 히드록실로 임의로 치환된 헤테로아릴, 아미노, 히드록실, 옥소, 또는 -NH-C=(NH)NH2로부터 선택된 1 내지 3개의 치환기로 임의로 치환된 C1-C4 알킬로부터 선택되고, R15는 H, C1-C18 알킬, 또는 아릴로부터 선택되고;
Q는 O, S, N(R30), 또는 C(R31)(R32)로부터 선택된 2가 모이어티이고, 여기서 R30은 H, 임의로 치환된 C1-C6 알킬, 임의로 치환된 C1-C6 알콕시, 임의로 치환된 C2-C6 알케닐, 또는 임의로 치환된 C2-C6 알키닐이고, R31 및 R32는 각각, 독립적으로, H, 할로겐, 임의로 치환된 C1-C6 알킬, 임의로 치환된 C1-C6 알콕시, 임의로 치환된 C2-C6 알케닐, 또는 임의로 치환된 C2-C6 알키닐이고;
G1, G2, G3 및 G4는 각각 독립적으로 H, F, 할로겐, C1-C6 알킬, CN, CH2(R33), CH2-O-(R33), C(=O)(R33), C(=S)(R33), 또는 (R34)(R33)로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 R33은 O(R35), S(R35), N(R35)(R36)이고, 여기서 R34, R35, 및 R36은 각각 독립적으로 H, 할로겐, 또는 C1-C6 알킬로부터 선택되고;
A는 (i) 화학식 I-b 또는 화학식 II-b의 5'-시클로-포스포네이트 변형된 뉴클레오티드를 RNAi 작용제의 나머지 부분에 연결하는 뉴클레오시드간 연결이거나, 또는 (ii) 포스포르아미다이트 기이다.
달리 나타내지 않는 한, 본원에 사용된 화학식 I-b에 대한 언급은 화학식 I-b-1, 화학식 I-b-2, 화학식 I-b-3, 화학식 I-b-4, 화학식 I-b-5에 대한 언급을 포함하고 화학식 II-b에 대한 언급은 화학식 II-b-1, 화학식 II-b-2, 화학식 II-b-3, 화학식 II-b-4, 및 화학식 II-b-5에 대한 언급을 포함하고, 단 이러한 언급은 본원의 개시내용을 고려하여 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 적용가능한 것으로 이해될 것이다.
일부 실시양태에서, 개시된 화합물은 화학식 I-b-1 또는 화학식 II-b-1에 의해 나타내어진 5'-시클로프로필 포스포네이트 구조를 갖고:
Figure 112018120553379-pct00037
여기서, D, X, Z, Y1, Y2, Y3, Y4, J, K, L, A 및 Q는 각각 화학식 I-b 및 화학식 II-b와 관련하여 상기 정의된 바와 같다.
일부 실시양태에서, 개시된 화합물은 화학식 I-b-2 또는 화학식 II-b-2에 의해 나타내어진 구조를 갖고:
Figure 112018120553379-pct00038
여기서, D, X, Z, Y1, Y2, Y3, Y4, J, K, L, G1, G2, G3, G4 및 A는 각각 화학식 I-b 및 화학식 II-b와 관련하여 상기 정의된 바와 같다.
일부 실시양태에서, 개시된 화합물은 화학식 I-b-3 또는 화학식 II-b-3에 의해 나타내어진 구조를 갖고:
Figure 112018120553379-pct00039
여기서, D, X, Z, Y1, Y2, Y3, Y4, J, K, L, 및 A는 각각 화학식 I-b 및 화학식 II-b와 관련하여 상기 정의된 바와 같다.
일부 실시양태에서, 개시된 화합물은 화학식 I-b-4 또는 화학식 II-b-4에 의해 나타내어진 구조를 갖고:
Figure 112018120553379-pct00040
여기서, D, X, Z, Y1, Y2, Y3, Y4, J, K, L, Q, A, G1, G2, G3, 및 G4는 각각 화학식 I-b 및 화학식 II-b와 관련하여 상기 정의된 바와 같다.
일부 실시양태에서, 이중-가닥 RNAi 작용제의 안티센스 가닥의 5' 말단 (또는 말단 뉴클레오티드)은 하기 화학식 III 또는 화학식 IV에 의해 나타내어진 5'-시클로프로필 포스포네이트 변형된 뉴클레오티드이고:
Figure 112020057517056-pct00114
여기서,
X는 헤테로시클릭 염기 모이어티이고;
Z는 H, -OH, F, OCH3, -O-(CH2)2-OCH3; 할로겐; -OCH2F, -OCHF2, -OCF3, -OCH2CH3, -O(CH2)2F, -OCH2CHF2, -OCH2CF3, -OCH2-CH=CH2, -O(CH2)2-OCH3, -O(CH2)2-SCH3, -O(CH2)2-OCF3, -O(CH2)2-O(CH2)2-N(CH3)2, -OCH2C(=O)-N(H)CH3, -OCH2C(=O)-N(H)-(CH2)2-N(CH3)2, -O(CH2)2-N(H)-C(=NH)(NH2), -O(CH2)3-N(R5)(R6), -O(CH2)2-ON(R5)(R6), -O(CH2)2-O(CH2)2-N(R5)(R6), -OCH2C(=O)-N(R5)(R6), -OCH2C(=O)-N(R7)-(CH2)2-N(R5)(R6) -O(CH2)2-N(R7)-C(=R8)[N(R5)(R6)], 임의로 치환된 C1-C6 알킬, 임의로 치환된 C1-C6 알콕시, 임의로 치환된 C2-C6 알케닐, 또는 임의로 치환된 C2-C6 알키닐이고, 여기서 R5, R6, R7 및 R8은 각각, 독립적으로, H 또는 C1-C6 알킬이고;
J 및 J'는 각각 독립적으로, O 또는 S이고;
L, L', 및 K는 각각 독립적으로 OH, OR16, SR16, 또는 NR16으로부터 선택되고, 여기서 R16은 H, C1-C10 알킬, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, 아릴 또는
Figure 112018120553379-pct00042
로부터 선택되고, 여기서 R14는 H 또는 독립적으로 SH, S-(C1-C4 알킬), 히드록실로 임의로 치환된 아릴, 히드록실로 임의로 치환된 헤테로아릴, 아미노, 히드록실, 옥소, 또는 -NH-C=(NH)NH2로부터 선택된 1 내지 3개의 치환기로 임의로 치환된 C1-C4 알킬로부터 선택되고, R15는 H, C1-C18 알킬, 또는 아릴로부터 선택되고;
Figure 112020057517056-pct00115
은 RNAi 작용제의 나머지 부분을 포함한다.
일부 실시양태에서, 이중-가닥 RNAi 작용제의 안티센스 가닥의 5' 말단 (또는 말단 뉴클레오티드)은 하기 화학식 III-a 또는 화학식 IV-a에 의해 나타내어진 5'-시클로프로필 포스포네이트 변형된 뉴클레오티드이고:
Figure 112020057517056-pct00116
여기서, X, Z, J, K, L, J', L' 및
Figure 112020057517056-pct00117
은 각각 화학식 III 및 화학식 IV와 관련하여 상기 정의된 바와 같다.
일부 실시양태에서, 이중-가닥 RNAi 작용제의 안티센스 가닥의 5' 말단 (또는 말단 뉴클레오티드)은 하기 화학식 III-b 및 화학식 IV-b에 의해 나타내어진 5'-시클로프로필 포스포네이트 변형된 뉴클레오티드이고:
Figure 112020057517056-pct00118
여기서, X, Z, J, J' 및
Figure 112020057517056-pct00119
는 각각 화학식 III 및 화학식 IV와 관련하여 상기 정의된 바와 같다.
일부 실시양태에서, 하기 구조 i에 의해 나타내어진 바와 같이, 이중-가닥 RNAi 작용제의 안티센스 가닥의 5' 말단 (또는 말단 뉴클레오티드)은 5'-시클로프로필 포스포네이트 변형된 뉴클레오티드이며, 여기서 변형된 뉴클레오티드는 티민 헤테로시클릭 염기 모이어티 및 2'-메톡시에틸 (2'-O-2-메톡시에틸 또는 "2'-MOE") 변형 (cPrpTM)을 포함한다:
Figure 112020057517056-pct00120
일부 실시양태에서, 하기 구조 ii에 의해 나타내어진 바와 같이, 이중-가닥 RNAi 작용제의 안티센스 가닥의 5' 말단 (또는 말단 뉴클레오티드)은 5'-시클로프로필 포스포네이트 변형된 뉴클레오티드이며, 여기서 변형된 뉴클레오티드는 티민 헤테로시클릭 염기 모이어티 및 2'-메톡시에틸 (2'-O-2-메톡시에틸 또는 "2'-MOE") 변형 (cPrpTM)을 포함한다:
Figure 112020057517056-pct00121
일부 실시양태에서, 하기 구조 iii에 의해 나타내어진 바와 같이, 이중-가닥 RNAi 작용제의 안티센스 가닥의 5' 말단 (또는 말단 뉴클레오티드)은 5'-시클로프로필 포스포네이트 변형된 뉴클레오티드이며, 여기서 변형된 뉴클레오티드는 티민 헤테로시클릭 염기 모이어티 및 2'-H 변형 (cPrpdT)을 포함한다:
Figure 112020057517056-pct00122
일부 실시양태에서, 하기 구조 iv에 의해 나타내어진 바와 같이 이중-가닥 RNAi 작용제의 안티센스 가닥의 5' 말단 (또는 말단 뉴클레오티드)은 5'-시클로프로필 포스포네이트 변형된 뉴클레오티드이며, 여기서 변형된 뉴클레오티드는 우라실 헤테로시클릭 염기 모이어티 및 2'-메톡시에틸 (2'-O-2-메톡시에틸 또는 "2'-MOE") 변형 (cPrpUMs)을 포함한다:
Figure 112020057517056-pct00123
일부 실시양태에서, 하기 구조 v에 의해 나타내어진 바와 같이 이중-가닥 RNAi 작용제의 안티센스 가닥의 5' 말단 (또는 말단 뉴클레오티드)은 5'-시클로프로필 포스포네이트 변형된 뉴클레오티드이며, 여기서 변형된 뉴클레오티드는 우라실 헤테로시클릭 염기 모이어티 및 2'-O-메틸 변형 (cPrpu)을 포함한다:
Figure 112020057517056-pct00124
일부 실시양태에서, 하기 구조 vi에 의해 나타내어진 바와 같이 이중-가닥 RNAi 작용제의 안티센스 가닥의 5' 말단 (또는 말단 뉴클레오티드)은 5'-시클로프로필 포스포네이트 변형된 뉴클레오티드이며, 여기서 변형된 뉴클레오티드는 우라실 헤테로시클릭 염기 모이어티 및 2'-O-메틸 변형 (cPrpus)을 포함한다:
Figure 112020057517056-pct00125
일부 실시양태에서, 하기 구조 vii에 의해 나타내어진 바와 같이 이중-가닥 RNAi 작용제의 안티센스 가닥의 5' 말단 (또는 말단 뉴클레오티드)은 5'-시클로프로필 포스포네이트 변형된 뉴클레오티드이며, 여기서 변형된 뉴클레오티드는 우라실 헤테로시클릭 염기 모이어티 및 2'-데옥시 변형 (cPrpdU)을 포함한다:
Figure 112020057517056-pct00126
일부 실시양태에서, 하기 구조 viii에 의해 나타내어진 바와 같이 이중-가닥 RNAi 작용제의 안티센스 가닥의 5' 말단 (또는 말단 뉴클레오티드)은 5'-시클로프로필 포스포네이트 변형된 뉴클레오티드이며, 여기서 변형된 뉴클레오티드는 우라실 헤테로시클릭 염기 모이어티 및 2'-O-메틸 변형 (cPrpdUs)을 포함한다:
Figure 112020057517056-pct00127
일부 실시양태에서, 하기 구조 ix에 의해 나타내어진 바와 같이 이중-가닥 RNAi 작용제의 안티센스 가닥의 5' 말단 (또는 말단 뉴클레오티드)은 5'-시클로프로필 포스포네이트 변형된 뉴클레오티드이며, 여기서 변형된 뉴클레오티드는 아데닌 헤테로시클릭 염기 모이어티 및 2'-O-메틸 변형 (cPrpa)을 포함한다:
Figure 112020057517056-pct00128
일부 실시양태에서, 하기 구조 x에 의해 나타내어진 바와 같이 이중-가닥 RNAi 작용제의 안티센스 가닥의 5' 말단 (또는 말단 뉴클레오티드)은 5'-시클로프로필 포스포네이트 변형된 뉴클레오티드이며, 여기서 변형된 뉴클레오티드는 아데닌 헤테로시클릭 염기 모이어티 및 2'-O-메틸 변형 (cPrpas)을 포함한다:
Figure 112020057517056-pct00129
일부 실시양태에서, 구조 i, ii, iii, iv, v, vi, vii, viii, ix 또는 x는 이중-가닥 RNAi 작용제의 안티센스 가닥의 5' 말단 (말단 뉴클레오티드)에 위치할 수 있다.
일부 실시양태에서, 구조 i, ii, iii, iv, v, vi, vii, viii, ix 또는 x는 단일-가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드의 5' 말단 (말단 뉴클레오티드)에 위치할 수 있다.
구조 i-x는 사실상 단지 예시이다. 본원의 다른 곳에 논의된 바와 같이, 예를 들면, 상기 구조와 관련하여 당 대용물 대체 모이어티를 사용하여 5-원 푸라노스 고리를 5-원 푸라노스 고리를 대체가능한 상이한 구조, 예컨대 모르폴리노, 시클로헥세닐, 시클로헥시톨, 또는 비-시클릭 구조로 바꿀 수 있다. 이러한 변화는 본원에 개시된 본 발명의 범주 내인 것으로 고려된다.
일부 실시양태에서, 하기 화학식 V 및 VI에 의해 나타내어진 바와 같이 5'-포스포네이트 모방체, 예컨대 5'-C-말로닐 기는 시클로프로필 기이고 RNAi 작용제의 안티센스 가닥의 말단 (또는 말단 뉴클레오티드)은 5'-시클로프로필-C-말로닐 변형된 뉴클레오티드이고:
Figure 112020057517056-pct00130
여기서,
X는 헤테로시클릭 염기 모이어티이고;
Z는 H, -OH, F, OCH3, -O-(CH2)2-OCH3; 할로겐; -OCH2F, -OCHF2, -OCF3, -OCH2CH3, -O(CH2)2F, -OCH2CHF2, -OCH2CF3, -OCH2-CH=CH2, -O(CH2)2-OCH3, -O(CH2)2-SCH3, -O(CH2)2-OCF3, -O(CH2)2-O(CH2)2-N(CH3)2, -OCH2C(=O)-N(H)CH3, -OCH2C(=O)-N(H)-(CH2)2-N(CH3)2, -O(CH2)2-N(H)-C(=NH)(NH2), -O(CH2)3-N(R5)(R6), -O(CH2)2-ON(R5)(R6), -O(CH2)2-O(CH2)2-N(R5)(R6), -OCH2C(=O)-N(R5)(R6), -OCH2C(=O)-N(R7)-(CH2)2-N(R5)(R6) -O(CH2)2-N(R7)-C(=R8)[N(R5)(R6)], 임의로 치환된 C1-C6 알킬, 임의로 치환된 C1-C6 알콕시, 임의로 치환된 C2-C6 알케닐, 또는 임의로 치환된 C2-C6 알키닐이고, 여기서 R5, R6, R7 및 R8은 각각, 독립적으로, H 또는 C1-C6 알킬이고;
J 및 J'는 각각 독립적으로 O 또는 S이고;
L'는 OH, OR16, SR16, 또는 NR16으로부터 선택되고, 여기서 R16은 H, C1-C10 알킬, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, 아릴 또는
Figure 112018120553379-pct00059
로부터 선택되고, 여기서 R14는 H 또는 독립적으로 SH, S-(C1-C4 알킬), 히드록실로 임의로 치환된 아릴, 히드록실로 임의로 치환된 헤테로아릴, 아미노, 히드록실, 옥소, 또는 -NH-C=(NH)NH2로부터 선택된 1 내지 3개의 치환기로 임의로 치환된 C1-C4 알킬로부터 선택되고, R15는 H, C1-C18 알킬, 또는 아릴로부터 선택되고;
Figure 112020057517056-pct00131
는 RNAi 작용제의 나머지 부분을 포함한다.
관련 기술분야의 통상의 기술자는 충분한 염기성 조건 하에, 화학식 I, II, III, IV, V, VI, VII 및/또는 VIII (화학식 하위군 또는 종 (예를 들면, 화학식 I-b-5)을 포함하여) 및/또는 구조 i, ii, iii, iv, v, vi, vii, viii, ix, x, xi, xii, 및/또는 xiii의 양성자성 기는 부분적으로 또는 완전히 탈양성자화된 상태로 존재하는 것을 용이하게 인지하고 이해할 것이다. 마찬가지로, 충분한 산성 조건 하에, 염기 부위 또는 원자를 포함하는 기는 양성자화된다. 본원에 개시된 기의 모든 이러한 양성자화 및 탈양성자화된 버전은 실시양태의 범주 내에 포함된다. 예를 들면, 카르복실 기가 한 실시양태 또는 청구항의 범주 내에 포함되는 예에서, 상응하는 카르복실레이트는 또한 실시양태 또는 청구항의 범주 내이다. 예를 들면, 아미노 기가 한 실시양태 또는 청구항의 범주 내에 포함되는 예에서, 상응하는 암모늄 기는 또한 실시양태 또는 청구항의 범주 내이다.
일부 실시양태에서, 개시된 화합물은 화학식 I-b-5 또는 화학식 II-b-5에 의해 나타내어진 구조를 갖는 포스포르아미다이트 화합물이고:
Figure 112018120553379-pct00061
여기서
D는 O, S, CH2-CH2, CH=CH, OCH2, N(R1), C(R2)(R3), C(R2)(R3)C(R4)(R2), C(R2)=C(R4), OC(R2)(R3), OC(H)(X3) 또는 OC(R2)(X3)이고;
R1은 H, C1-C6 알킬, 치환된 C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, 치환된 C1-C6 알콕시, C2-C6 알케닐, 치환된 C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, 또는 치환된 C2-C6 알키닐이고;
R2, R3, 및 R4는 각각, 독립적으로, H, 할로겐, C1-C6 알킬, 치환된 C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, 치환된 C1-C6 알콕시, C2-C6 알케닐, 치환된 C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, 또는 치환된 C2-C6 알키닐이고;
D가 O, S, CH2-CH2, CH=CH, OCH2, N(R1), C(R2)(R3), C(R2)(R3)C(R4)(R2), C(R2)=C(R4), OC(R2)(R3)인 경우에, X는 헤테로시클릭 염기 모이어티이고;
D가 OC(H)(X3) 또는 OC(R2)(X3)인 경우에, X는 H, 할로겐, C1-C6 알킬, 치환된 C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, 치환된 C1-C6 알콕시, C2-C6 알케닐, 치환된 C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐 또는 치환된 C2-C6 알키닐이고 X3은 헤테로시클릭 염기 모이어티이고;
Z는 H, -OH, F, OCH3, -O-(CH2)2-OCH3; 할로겐; -OCH2F, -OCHF2, -OCF3, -OCH2CH3, -O(CH2)2F, -OCH2CHF2, -OCH2CF3, -OCH2-CH=CH2, -O(CH2)2-OCH3, -O(CH2)2-SCH3, -O(CH2)2-OCF3, -O(CH2)2-O(CH2)2-N(CH3)2, -OCH2C(=O)-N(H)CH3, -OCH2C(=O)-N(H)-(CH2)2-N(CH3)2, -O(CH2)2-N(H)-C(=NH)(NH2), -O(CH2)3-N(R5)(R6), -O(CH2)2-ON(R5)(R6), -O(CH2)2-O(CH2)2-N(R5)(R6), -OCH2C(=O)-N(R5)(R6), -OCH2C(=O)-N(R7)-(CH2)2-N(R5)(R6) -O(CH2)2-N(R7)-C(=R8)[N(R5)(R6)], 임의로 치환된 C1-C6 알킬, 임의로 치환된 C1-C6 알콕시, 임의로 치환된 C2-C6 알케닐, 또는 임의로 치환된 C2-C6 알키닐이고, 여기서 R5, R6, R7 및 R8은 각각, 독립적으로, H 또는 C1-C6 알킬이고;
Y1, Y2, Y3, 및 Y4는 각각, 독립적으로, H, 할로겐, C1-C6 알킬, 치환된 C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, 치환된 C1-C6 알콕시, C2-C6 알케닐, 치환된 C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, 또는 치환된 C2-C6 알키닐이거나; 또는 대안적으로, Y4는 Y1 또는 Y2 중 하나에 연결되고, 여기서 연결은 O, S, NR9, C(R10)(R11), C(R10)=C(R11), C[=C(R10)(R11)] 및 C(=O)로부터 선택된 2가 기를 포함하고, Y1, Y2, 및 Y3 중 나머지 2개는 각각, 독립적으로, H, 할로겐, 임의로 치환된 C1-C6 알킬, 임의로 치환된 C1-C6 알콕시, 임의로 치환된 C2-C6 알케닐, 또는 임의로 치환된 C2-C6 알키닐이고, 여기서 각각의 R9, R10 및 R11은 독립적으로, H, C1-C6 알킬, 치환된 C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, 치환된 C1-C6 알콕시, C2-C6 알케닐, 치환된 C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, 또는 치환된 C2-C6 알키닐이고;
J는 O, S, NR12, N-N(R13)2, 또는 N-OR13이고, 여기서,
R12는 H, OH, 할로겐, C1-C10 알킬, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, 아릴 또는
Figure 112018120553379-pct00062
이고, 여기서 R14는 H 또는 독립적으로 SH, S-(C1-C4 알킬), 히드록실로 임의로 치환된 아릴, 히드록실로 임의로 치환된 헤테로아릴, 아미노, 히드록실, 옥소, 또는 NH-C=(NH)NH2로부터 선택된 1 내지 3개의 치환기로 임의로 치환된 C1-C4 알킬로부터 선택되고, 여기서 R15는 H, C1-C18 알킬, 또는 아릴로부터 선택되고;
여기서 R13은 H, C1-C10 알킬, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, 아릴, 또는
Figure 112018120553379-pct00063
이고, 여기서 R14는 H 또는 독립적으로 SH, S-(C1-C4 알킬), 히드록실로 임의로 치환된 아릴, 히드록실로 임의로 치환된 헤테로아릴, 아미노, 히드록실, 옥소, 또는 NH-C=(NH)NH2로부터 선택된 1 내지 3개의 치환기로 임의로 치환된 C1-C4 알킬로부터 선택되고, 여기서 R15는 H, C1-C18 알킬, 또는 아릴로부터 선택되고;
K 및 L은 각각 독립적으로 OH, OR16, SR16, 또는 NR16으로부터 선택되고, 여기서 R16은 H, C1-C10 알킬, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, 아릴 또는
Figure 112018120553379-pct00064
로부터 선택되고, 여기서 R14는 H 또는 독립적으로 SH, S-(C1-C4 알킬), 히드록실로 임의로 치환된 아릴, 히드록실로 임의로 치환된 헤테로아릴, 아미노, 히드록실, 옥소, 또는 -NH-C=(NH)NH2로부터 선택된 1 내지 3개의 치환기로 임의로 치환된 C1-C4 알킬로부터 선택되고, R15는 H, C1-C18 알킬, 또는 아릴로부터 선택되고;
G1, G2, G3 및 G4는 각각 독립적으로 H, F, 할로겐, C1-C6 알킬, CN, CH2(R33), CH2-O-(R33), C(=O)(R33), C(=S)(R33), 또는 (R34)(R33)로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 R33은 O(R35), S(R35), N(R35)(R36)이고, 여기서 R34, R35, 및 R36은 각각 독립적으로 H, 할로겐, 또는 C1-C6 알킬로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 화학식 I-b-5 및 화학식 II-b-5의 X는 1개 이상의 보호기를 포함한다.
일부 실시양태에서, 화학식 I-b-5 및 화학식 II-b-5에 의해 나타내어지는 개시된 화합물은 하기 구조를 갖는다:
Figure 112018120553379-pct00065
(2-시아노에틸 ((2R,3R,4R,5R)-2-(2-(디에톡시포스포릴)시클로프로필)-5-(2,4-디옥소-3,4-디히드로피리미딘-1(2H)-일)-4-메톡시테트라히드로푸란-3-일) 디이소프로필포스포르아미다이트);
Figure 112018120553379-pct00066
(디메틸 [2-[(2R,3R,4R,5R)-3-([[비스(프로판-2-일)아미노](2-시아노에톡시)포스파닐]옥시)-4-(2-메톡시에톡시)-5-(5-메틸-2,4-디옥소-1,2,3,4-테트라히드로피리미딘-1-일)옥솔란-2-일]시클로프로필]포스포네이트); 또는
Figure 112018120553379-pct00067
(2R,3R,4R,5R)-5-(6-벤즈아미도-9H-퓨린-9-일)-2-(2-(디에톡시포스포릴)시클로프로필)-4-메톡시테트라히드로푸란-3-일 (2-시아노에틸) 디이소프로필포스포르아미다이트).
일부 실시양태에서, 구조 xi, xii 또는 xiii는 이중-가닥 RNAi 작용제의 안티센스 가닥의 5' 말단 (말단 뉴클레오티드)에 첨가될 수 있다.
일부 실시양태에서, 구조 xi, xii 또는 xiii는 단일-가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드의 5' 말단 (말단 뉴클레오티드)에 첨가될 수 있다.
구조 xi, xii 및 xiii는 사실상 단지 예시이다. 본원의 다른 곳에 논의된 바와 같이, 예를 들면, 상기 구조와 관련하여 당 대용물 대체 모이어티를 사용하여 5-원 푸라노스 고리를 5-원 푸라노스 고리를 대체가능한 상이한 구조, 예컨대 모르폴리노, 시클로헥세닐, 시클로헥시톨, 또는 비-시클릭 구조로 바꿀 수 있다. 추가적으로, 본원의 다른 곳에 논의된 바와 같이, 변형된 뉴클레오티드의 2' 또는 3' 위치에서의 변형은 관련 기술분야에 공지된 다양한 변형으로 변경될 수 있고/거나 헤테로시클릭 염기 모이어티는 본원에 도시된 구체적 구조로부터 변형될 수 있다. 이러한 변화는 본원에 개시된 본 발명의 범주 내인 것으로 고려된다.
5'-시클로-포스포네이트 변형된 뉴클레오티드가 본원에 개시된 바와 같이 포스포르아미다이트 화합물의 형태인 경우에 올리고뉴클레오티드의 포스포르아미다이트 합성을 위해 관련 기술분야에 일반적으로 공지된 방법을 사용하여 5'-시클로-포스포네이트 변형된 뉴클레오티드를 부착시키는데 유용할 수 있다. 5'-시클로-포스포네이트 변형된 뉴클레오티드는 커플링 (예를 들면, 포스피틸화) 반응을 통하여 포스포르아미다이트 형성 시약의 인 원자를 연결하고, 따라서 포스포르아미다이트 화합물을 형성함으로써 포스포르아미다이트 화합물로서 제조될 수 있다.
일부 실시양태에서, 5'-시클로-포스포네이트 변형된 뉴클레오티드-포스포르아미다이트 화합물이, 5'-시클로-포스포네이트 변형된 뉴클레오티드를 이중-가닥 RNAi 작용제의 안티센스 가닥의 5' 말단부에 연결하는데 사용된다. 일부 실시양태에서, 5'-시클로-포스포네이트 변형된 뉴클레오티드-포스포르아미다이트 화합물이, 5'-시클로-포스포네이트 변형된 뉴클레오티드를 단일-가닥 RNAi 작용제의 5' 말단부에 연결하는데 사용된다.
본원에 사용된, 본원에 기재된 5'-시클로프로필 포스포네이트 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 RNAi 작용제 및 단일-가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드는 1개 이상의 비대칭 중심을 함유하고, 따라서 거울상이성질체, 부분입체이성질체 및 다른 입체이성질체 배위를 생성한다. 달리 언급되지 않는 한, 본원에서 나타나는 임의의 결합의 배위는 단지 편의상 선택되고 특정 배위를 제한하도록 의도되지 않는다.
일부 실시양태에서, 개시된 화합물은 화학식 IX 또는 화학식 X에 의해 나타내어진 화학식 B의 구조를 갖고:
Figure 112018120553379-pct00068
여기서, 시클로, D, X, Z, Y1, Y2, Y3, Y4, J, K, L, Q 및 A는 각각 화학식 I 및 화학식 II와 관련하여 상기 정의된 바와 같다.
RNAi 작용제, 표적화 리간드, 및 전달 중합체
표적 핵산에 대해 적어도 부분적으로 상보적인 서열을 갖는 올리고머 화합물, 예컨대 RNAi 작용제는 시험관내 및 생체내 둘 다에서 표적 핵산의 기능 및 활성을 변경시키는 것으로 제시된 바 있다. 본원에 개시된 바와 같이, RNAi 작용제는 1개 이상의 5'-시클로-포스포네이트 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 5'-시클로-포스포네이트 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 RNAi 작용제는 이중-가닥이다. 이중-가닥 RNAi 작용제의 경우, 본원에 기재된 RNAi 작용제 센스 및 안티센스 가닥의 길이는 독립적으로 16 내지 30개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 이중-가닥 RNAi 작용제는 서로에 대해 적어도 부분적으로 상보적 (적어도 70% 상보적)인 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함한다. 안티센스 가닥은 표적 mRNA의 서열에 대해 완벽히 상보적 (100% 상보적)이거나 적어도 실질적으로 상보적 (적어도 85% 상보적)인 서열을 갖는 영역을 함유한다. 이중-가닥 RNAi 작용제 센스 가닥 및 안티센스 가닥의 길이는 각각 16 내지 30개 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 센스 및 안티센스 가닥은 또한 동일한 길이일 수 있거나 또는 상이한 길이일 수 있다. 일부 실시양태에서, 센스 및 안티센스 가닥은 각각 독립적으로 17 내지 26개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 센스 및 안티센스 가닥은 각각 독립적으로 17-21개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 센스 및 안티센스 가닥은 둘 다 각각 21-26개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥은 약 19개 뉴클레오티드 길이이고, 반면 안티센스 가닥은 약 21개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥은 약 21개 뉴클레오티드 길이이고, 반면 안티센스 가닥은 약 23개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 센스 및 안티센스 가닥은 둘 다 각각 26개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, RNAi 작용제 센스 및 안티센스 가닥은 각각 독립적으로 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 또는 26개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 이중-가닥 RNAi 작용제는 약 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24개 뉴클레오티드의 듀플렉스 길이를 갖는다. 센스 가닥과 안티센스 가닥 사이의 완벽한 또는 실질적인 상보성의 이러한 영역은 전형적으로 15-25개 (예를 들면, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개) 뉴클레오티드 길이이고 안티센스 가닥의 5' 말단에서 또는 그 근처에서 발생한다 (예를 들어, 이 영역은 완벽히 상보적인 것이 아닌, 또는 실질적으로 상보적인 것이 아닌 1, 2, 3, 또는 4개의 뉴클레오티드만큼 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 분리됨). 일부 실시양태에서, 5'-시클로포스포네이트 변형된 뉴클레오티드는 이중-가닥 RNAi 작용제의 안티센스 가닥의 5' 말단의 말단 뉴클레오티드이다.
일부 실시양태에서, 5'-시클로-포스포네이트 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 RNAi 작용제는 단일-가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 단일-가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드의 길이는 각각 독립적으로 약 8 내지 약 40개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 5'-시클로-포스포네이트 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 RNAi 작용제는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 갖는 이중-가닥 분자이다. 일부 실시양태에서, 5'-시클로-포스포네이트 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 RNAi 작용제는 단일-가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드이다.
일부 실시양태에서, 5'-시클로-포스포네이트 변형된 뉴클레오티드는 RNAi 작용제의 말단에 연결되고, RNAi 작용제의 뉴클레아제 안정성을 증진시킨다. 일부 실시양태에서, 말단에 5'-시클로-포스포네이트 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 본원에 개시된 RNAi 작용제는, 세포에 전달 시에, RNA 간섭 (RNAi)의 생물학적 과정을 통하여 표적화된 유전자의 발현을 시험관내 또는 생체내 억제하거나 또는 녹다운할 수 있다.
이중-가닥 RNAi 작용제의 경우, 센스 가닥 및/또는 안티센스 가닥은 코어 서열의 3' 말단, 5' 말단 또는 3' 및 5' 말단 둘 다에서 추가의 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 뉴클레오티드 (연장부)를 임의로 및 독립적으로 함유할 수 있다. 존재하는 경우에 추가의 센스 가닥 뉴클레오티드는 표적화된 mRNA 내의 상응하는 서열과 동일하거나 또는 동일하지 않을 수 있다. 존재하는 경우에 추가의 안티센스 가닥 뉴클레오티드는 존재하는 경우에, 상응하는 센스 가닥의 추가의 뉴클레오티드에 대해 상보적이거나 또는 상보적이지 않을 수 있다. 존재하는 경우에 단일-가닥 RNAi 작용제의 경우, 추가의 뉴클레오티드는 표적화된 mRNA 내의 상응하는 서열에 대해 상보적이거나 또는 상보적이지 않을 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 말단 5'-시클로포스포네이트 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 이중-가닥 RNAi 작용제의 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 동일한 수의 뉴클레오티드를 함유한다. 일부 실시양태에서 본원에 기재된 RNAi 작용제의 센스 및 안티센스 가닥은 상이한 수의 뉴클레오티드를 함유한다. 일부 실시양태에서, RNAi 작용제의 센스 가닥 5' 말단과 안티센스 가닥 3' 말단은 평활 말단을 형성한다. 일부 실시양태에서, RNAi 작용제의 센스 가닥 3' 말단과 안티센스 가닥 5' 말단은 평활 말단을 형성한다. 일부 실시양태에서, RNAi 작용제의 양 말단은 평활 말단을 형성한다. 일부 실시양태에서, RNAi 작용제의 어느 말단도 평활 말단이 아니다. 본원에 사용된 용어 "평활 말단"은 2개의 어닐링된 가닥의 말단 뉴클레오티드가 상보적인 이중 가닥 RNAi 작용제의 말단을 지칭한다 (상보적 염기쌍을 형성한다).
일부 실시양태에서, RNAi 작용제의 센스 가닥 5' 말단과 안티센스 가닥 3' 말단은 프레이드 말단(frayed end)를 형성한다. 일부 실시양태에서, RNAi 작용제의 센스 가닥 3' 말단과 안티센스 가닥 5' 말단은 프레이드 말단을 형성한다. 일부 실시양태에서, RNAi 작용제의 양 말단은 프레이드 말단을 형성한다. 일부 실시양태에서, RNAi 작용제의 어느 말단도 프레이드 말단이 아니다. 본원에 사용된 프레이드 말단은 2개의 어닐링된 가닥의 말단 뉴클레오티드가 쌍을 형성하지만 (즉, 오버행을 형성하지 않음), 상보적이지 않은 (즉, 비-상보적 쌍을 형성함) 이중 가닥 촉발제 분자의 말단을 지칭한다. 본원에 사용된 오버행은 이중 가닥 RNAi 작용제의 하나의 가닥의 말단에 있는 하나 이상의 쌍이 아닌 뉴클레오티드의 스트레치이다. 쌍이 아닌 뉴클레오티드는 또한 3' 또는 5' 오버행을 만드는 센스 가닥 또는 안티센스 가닥 상에 있을 수 있다. 일부 실시양태에서 RNAi 작용제는 하기를 포함한다: 평활 말단 및 프레이드 말단, 평활 말단 및 5' 오버행 말단, 평활 말단 및 3' 오버행 말단, 프레이드 말단 및 5' 오버행 말단, 프레이드 말단 및 3' 오버행 말단, 2개의 5' 오버행 말단, 2개의 3' 오버행 말단, 5' 오버행 말단 및 3' 오버행 말단, 2개의 프레이드 말단, 또는 2개의 평활 말단.
일부 실시양태에서, RNAi 작용제는 변형된 백본 (본원에서 뉴클레오시드간 연결으로도 지칭됨)을 갖는 적어도 1개의 뉴클레오티드를 함유한다. 일부 실시양태에서, 변형된 백본 또는 뉴클레오시드간 연결은 하나 이상의 포스포로티오에이트 연결이다.
일부 실시양태에서, RNAi 작용제의 센스 가닥은 1 내지 4개의 포스포로티오에이트 연결을 함유한다. 다른 실시양태에서, 기재된 RNAi 작용제의 안티센스 가닥은 1 내지 4개의 포스포로티오에이트 연결을 함유한다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 둘 다 1 내지 4개의 포스포로티오에이트 연결을 함유한다.
RNAi 작용제가 단일-가닥인 일부 실시양태에서, RNAi 작용제는 분자의 뉴클레오티드 또는 변형된 뉴클레오티드의 모든 또는 거의 모든 연결에 대해 포스포로티오에이트 연결을 함유한다.
일부 실시양태에서, (모든 화학식 하위군 또는 종 (예를 들면, 화학식 I-b-5)을 포함하여) 화학식 I, 화학식 II, 화학식 III, 화학식 IV, 화학식 V, 화학식 VI, 화학식 VII 및/또는 화학식 VIII의 구조 및/또는 구조 i, 구조 ii, 구조 iii, 구조 iv, 구조 v, 구조 vi, 구조 vii, 구조 viii, 구조 ix, 구조 x, 구조 xi, 구조 xii, 및/또는 구조 xiii를 갖는, 5'-시클로-포스포네이트 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 RNAi 작용제는 이중-가닥이다. 이중-가닥 RNAi 작용제는 센스 가닥과 안티센스 가닥의 어닐링에 의해 형성될 수 있다. 일부 실시양태에서, (모든 화학식 하위군 또는 종 (예를 들면, 화학식 I-b-5)을 포함하여) 화학식 I, 화학식 II, 화학식 III, 화학식 IV, 화학식 V, 화학식 VI, 화학식 VII 및/또는 화학식 VIII의 구조 및/또는 구조 i, 구조 ii, 구조 iii, 구조 iv, 구조 v, 구조 vi, 구조 vii, 구조 viii, 구조 ix, 구조 x, 구조 xi, 구조 xii, 및/또는 구조 xiii를 갖는 5'-시클로-포스포네이트 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 RNAi 작용제는 단일-가닥 올리고뉴클레오티드이다. 본원에 기재된 RNAi 작용제는 관련 기술분야에 통상적으로 사용되는 방법을 사용하여 합성된다.
일부 실시양태에서, RNAi 작용제는 1개 이상의 변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 본원에 사용된 "변형된 뉴클레오티드"는 리보뉴클레오티드 (2'-히드록실 뉴클레오티드) 이외의 뉴클레오티드이다. 본원에 사용된 데옥시-리보뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드의 한 유형으로 간주된다. 일부 실시양태에서, RNAi 작용제의 뉴클레오티드의 적어도 50%, 예를 들면, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%는 변형된다. 본원에 사용된 변형된 뉴클레오티드는 데옥시-리보뉴클레오티드, 뉴클레오티드 모방체, 무염기성 뉴클레오티드 (X, Ab로서 본원에 표시됨), 2'-변형된 뉴클레오티드, 3' - 3' 연결 (역전된) 뉴클레오티드 (invdN, invN, invn, invX, invAb로서 본원에 표시됨), 비-천연 염기-포함 뉴클레오티드, 가교된 뉴클레오티드, 펩티드 핵산 (PNA), 2',3'-세코 뉴클레오티드 모방체 (비잠금 핵염기 유사체, NUNA 또는 NUNA로 본원에 표시됨), 잠금 뉴클레오티드 (NLNA 또는 NLNA로 본원에 표시됨), 3'-O-메톡시 (2' 뉴클레오시드간 연결) 뉴클레오티드 (3'-OMen로 본원에 표시됨), 2'-F-아라비노 뉴클레오티드 (NfANA 또는 NfANA로 본원에 표시됨), 5'-Me, 2'-플루오로 뉴클레오티드 (5Me-Nf로서 본원에 표시됨), 모르폴리노 뉴클레오티드, 비닐 포스포네이트 데옥시리보뉴클레오티드 (vpdN으로서 본원에 표시됨), 비닐 포스포네이트 함유 뉴클레오티드 및 시클로프로필 포스포네이트 함유 뉴클레오티드 (cPrpN)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 2'-변형된 뉴클레오티드 (즉, 5원 당 고리의 2' 위치에 히드록실 기 이외의 기를 갖는 뉴클레오티드)는 2'-O-메틸 뉴클레오티드 (뉴클레오티드 서열 중에 소문자 'n'으로서 본원에 표시됨), 2'-데옥시-2'-플루오로 뉴클레오티드 (Nf로서 본원에 표시되고, 또한 2'-플루오로 뉴클레오티드로서 본원에 표시됨), 2'-데옥시 뉴클레오티드 (dN으로서 본원에 표시됨), 2'-메톡시에틸 (2'-O-2-메톡시에틸) 뉴클레오티드 (NM 또는 2'-MOE로서 본원에 표시됨), 2'-아미노 뉴클레오티드, 및 2'-알킬 뉴클레오티드를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 주어진 화합물 내의 모든 위치가 균일하게 변형될 필요는 없다. 반대로, 1개 초과의 변형이 단일 RNAi 작용제에 또는 심지어 그의 단일 뉴클레오티드에 혼입될 수 있다. RNAi 작용제는 관련 기술분야에 공지된 방법에 의해 합성되고/거나 변형된다. 1개의 뉴클레오티드에서의 변형은 또 다른 뉴클레오티드에서의 변형과 독립적이다.
변형된 핵염기는 합성 및 천연 핵염기, 예컨대 5-치환된 피리미딘, 6-아자피리미딘 및 N-2, N-6 및 O-6 치환된 퓨린, (예를 들어, 2-아미노프로필아데닌, 5-프로피닐우라실, 또는 5-프로피닐시토신), 5-메틸시토신 (5-me-C), 5-히드록시메틸 시토신, 크산틴, 하이포크산틴, 2-아미노아데닌, 아데닌 및 구아닌의 6-알킬 (예를 들어, 6-메틸, 6-에틸, 6-이소프로필, 또는 6-n-부틸) 유도체, 아데닌 및 구아닌의 2-알킬 (예를 들어, 2-메틸, 2-에틸, 2-이소프로필, 또는 2-n-부틸) 및 다른 알킬 유도체, 2-티오우라실, 2-티오티민, 2-티오시토신, 5-할로우라실, 시토신, 5-프로피닐 우라실, 5-프로피닐 시토신, 6-아조 우라실, 6-아조 시토신, 6-아조 티민, 5-우라실 (슈도우라실), 4-티오우라실, 8-할로, 8-아미노, 8-술프히드릴, 8-티오알킬, 8-히드록실 및 다른 8-치환된 아데닌 및 구아닌, 5-할로 (예를 들어, 5-브로모), 5-트리플루오로메틸, 및 다른 5-치환된 우라실 및 시토신, 7-메틸구아닌 및 7-메틸아데닌, 8-아자구아닌 및 8-아자아데닌, 7-데아자구아닌, 7-데아자아데닌, 3-데아자구아닌, 및 3-데아자아데닌을 포함한다.
일부 실시양태에서, RNAi 작용제의 모든 또는 실질적으로 모든 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드이다.
일부 실시양태에서, RNAi 작용제의 하나 이상의 뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드이다. 본원에 사용된 리보뉴클레오티드는 "N" (추가적 표기법 없이 대문자)으로서 본원에 표시된다.
본원에 기재된 RNAi 작용제의 뉴클레오티드는 포스페이트-함유 또는 비-포스페이트-함유 공유 뉴클레오시드간 연결에 의해 연결될 수 있다. 변형된 뉴클레오시드간 연결 또는 백본은, 5'-포스포로티오에이트 기 (sN, sn, sNf, 또는 sdN에서와 같이 뉴클레오티드 앞에 소문자 's'로서 본원에 표시됨), 키랄 포스포로티오에이트, 티오포스페이트, 포스포로디티오에이트, 포스포트리에스테르, 아미노알킬-포스포트리에스테르, 알킬 포스포네이트 (예를 들어, 메틸 포스포네이트 또는 3'-알킬렌 포스포네이트), 키랄 포스포네이트, 포스피네이트, 포스포르아미데이트 (예를 들어, 3'-아미노 포스포르아미데이트, 아미노알킬포스포르아미데이트, 또는 티오노포스포르아미데이트), 티오노알킬-포스포네이트, 티오노알킬포스포트리에스테르, 모르폴리노 연결, 정상 3'-5' 연결을 갖는 보라노포스페이트, 보라노포스페이트의 2'-5' 연결된 유사체, 또는 역극성을 갖는 보라노포스페이트 (여기서 뉴클레오시드 단위의 인접한 쌍은 3'-5'에서 5'-3' 또는 2'-5'에서 5'-2'로 연결됨)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 변형된 뉴클레오시드간 연결 또는 백본은 인 원자가 결여된다. 인 원자가 결여된 변형된 뉴클레오시드간 연결은, 단쇄 알킬 또는 시클로알킬 당간 연결, 혼합 헤테로원자 및 알킬 또는 시클로알킬 당간 연결, 또는 1개 이상의 단쇄 헤테로원자 또는 헤테로시클릭 당간 연결을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 변형된 뉴클레오시드간 백본은 실록산 백본, 술피드 백본, 술폭시드 백본, 술폰 백본, 포름아세틸 및 티오포름아세틸 백본, 메틸렌 포름아세틸 및 티오포름아세틸 백본, 알켄-함유 백본, 술파메이트 백본, 메틸렌이미노 및 메틸렌히드라지노 백본, 술포네이트 및 술폰아미드 백본, 아미드 백본, 및 혼합 N, O, S, 및 CH2 성분을 갖는 다른 백본을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 5'-시클로-포스포네이트 변형된 뉴클레오티드를 포함한는 RNAi 작용제는 세포, 세포 군, 조직 또는 대상체 중의 표적 mRNA의 발현을 억제한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 5'-시클로-포스포네이트 변형된 뉴클레오티드를 포함하는, 치료 유효량의 RNAi 작용제가 대상체에게 투여되고, 이에 의해 대상체에서 표적 mRNA의 발현을 억제한다.
일부 실시양태에서, 기재된 RNAi 작용제는 표적 mRNA의 발현과 연관된 임상 제시를 치료, 예방 또는 관리하는데 사용된다. 일부 실시양태에서, 치료 또는 예방 유효량의 1종 이상의 RNAi 작용제가 이러한 치료, 예방 또는 관리를 필요로 하는 대상체에게 투여된다.
5'-시클로-포스포네이트 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 기재된 RNAi 작용제 및 방법은 표적 mRNA의 발현 감소 또는 억제로부터 이익을 얻을 질환 또는 장애를 갖는 대상체에서 적어도 하나의 증상을 치료 또는 예방하는데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 대상체에게 치료 유효량의 1종 이상의 RNAi 작용제를 투여하여, 적어도 하나의 증상을 치료한다. 다른 실시양태에서, 대상체에게 예방 유효량의 1종 이상의 RNAi 작용제를 투여하여, 적어도 하나의 증상을 예방한다.
일부 실시양태에서, 발현-억제 올리고머 화합물에 접합된 기재된 표적화 리간드가 투여되는 대상체에서 표적의 유전자 발현 수준 및/또는 mRNA 수준은, 투여 전의 대상체 또는 표적화 리간드 접합체를 투여받지 않은 대상체에 비해 적어도 약 5%, 예컨대 적어도 약 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 98%만큼 감소될 수 있다. 대상체에서의 유전자 발현 수준 및/또는 mRNA 수준은 대상체의 세포, 세포 군, 및/또는 조직에서 감소될 수 있다. 일부 실시양태에서, 발현-억제 올리고머 화합물에 접합된 기재된 표적화 리간드가 투여된 대상체에서 단백질 수준은, 표적화 리간드 접합체를 투여 받기 전의 대상체 또는 표적화 리간드 접합체를 투여받지 않은 대상체에 비해 적어도 약 5%, 예컨대 적어도 약 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 98%만큼 감소된다. 대상체에서 단백질 수준은 세포, 세포 군, 조직, 혈액, 및/또는 대상체의 다른 유체에서 감소될 수 있다. 유전자 발현, mRNA, 또는 단백질 수준의 감소는 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해 평가될 수 있다. mRNA 수준 및/또는 단백질 수준의 저하 또는 감소는 집합적으로 표적화된 유전자의 발현의 억제, 저하 또는 감소를 지칭한다.
5'-시클로-포스포네이트 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 본원에 개시된 RNAi 작용제, 및 본원에 기재된 RNAi 작용제를 포함하는 조성물은 관련 기술분야에 공지된 올리고뉴클레오티드 전달 기술을 사용하여 세포, 세포 군, 종양, 조직 또는 대상체에 전달될 수 있다. 일반적으로, 핵산 분자를 전달하기 위해 관련 기술 분야에 인지된 임의의 적합한 방법 (시험관내 또는 생체내)은 본원에 기재된 바와 같은 1개 이상의 5'-시클로-포스포네이트 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 RNAi 작용제와 사용하기 위해 적합화할 수 있다. 예를 들어, 전달은 국소 투여 (예를 들어, 직접 주사, 이식, 또는 국소 투여), 전신 투여, 또는 피하, 정맥내, 경구, 복강내, 또는 비경구 경로, 예컨대 두개내 (예를 들어, 뇌실내, 실질내 및 뇌척수강내), 근육내, 경피, 기도 (에어로졸), 비강, 직장 또는 국소 (협측 및 설하 포함) 투여에 의한 것일 수 있다. 특정 실시양태에서, 조성물은 피하 또는 정맥내 주입 또는 주사에 의해 투여된다.
RNAi 작용제가 이중 가닥인 일부 실시양태에서, RNAi 작용제는 센스 가닥 또는 안티센스 가닥의 3' 또는 5' 말단에 부착된 비-뉴클레오티드 기를 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적화 리간드 또는 표적화 기, 연결 기, 또는 전달 비히클은 센스 가닥에 공유 연결된다. 일부 실시양태에서, 표적화 리간드, 연결 기 및/또는 전달 비히클은 센스 가닥의 3' 말단 및/또는 5' 말단에 연결된다. 일부 실시양태에서, 표적화 리간드, 연결 기 및/또는 전달 비히클은 센스 가닥의 5' 말단에 연결된다. 일부 실시양태에서, 표적화 리간드, 연결 기 및/또는 전달 비히클은 센스 가닥의 3' 또는 5' 말단에 직접 또는 링커를 통해 간접적으로 연결된다. 일부 실시양태에서, 표적화 리간드는 불안정성, 절단 가능한 또는 가역적 결합 또는 링커/스페이서를 통해 RNAi 작용제에 연결된다.
RNAi 작용제가 단일-가닥인 일부 실시양태에서, RNAi 작용제는 말단 5'-시클로-포스포네이트 변형된 뉴클레오티드가 존재하지 않는 말단에 부착된 표적화 리간드 또는 표적화 기, 연결기 또는 전달 비히클을 함유할 수 있다. RNAi 작용제가 단일-가닥인 일부 실시양태에서, 5'-시클로포스포네이트 변형된 뉴클레오티드는 RNAi 작용제의 5' 말단에 부착되고, 표적화 리간드, 연결 기 또는 전달 비히클은 RNAi 작용제의 3' 말단에 부착된다.
일부 실시양태에서, 전달 비히클은 RNAi 작용제를 세포 또는 조직에 전달하기 위해 사용될 수 있다. 전달 비히클은 세포 또는 조직 내로의 RNAi 작용제의 전달을 개선시키는 화합물이다. 전달 비히클은 하기를 포함할 수 있거나, 또는 이로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다: 중합체, 예컨대 양친매성 중합체, 막 활성 중합체, 펩티드, 멜리틴 펩티드, 멜리틴-유사 펩티드, 지질, 가역적으로 변형된 중합체 또는 펩티드, 또는 가역적으로 변형된 막 활성 폴리아민.
5'-시클로-포스포네이트 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 RNAi 작용제는 지질, 나노입자, 중합체, 리포솜, 미셀, 다이나믹 폴리접합체(DPC) 또는 관련 기술분야에서 이용 가능한 다른 전달 시스템과 조합될 수 있다. RNAi 작용제는 또한 표적화 기 또는 표적화 모이어티, 지질 (콜레스테롤 및 콜레스테릴 유도체를 포함하나 이에 제한되지 않음), 나노입자, 중합체, 리포솜, 미셀, DPC (예를 들어, WO 2000/053722, WO 2008/0022309, WO 2011/104169 및 WO 2012/083185, WO 2013/032829, WO 2013/158141 참조 (이들 각각은 본원에 참조로 포함됨)), 또는 관련 기술 분야에서 이용가능한 다른 전달 시스템)에 화학적으로 접합될 수 있다.
일부 실시양태에서, RNAi 작용제에 연결된 1개 이상의 5'-시클로-포스포네이트 변형된 뉴클레오티드는 생체내 세포로의 전달을 위한 제약 조성물에 포함된다. 이러한 제약 조성물은 RNAi 촉발제-전달 중합체 접합체를 형성하도록 전달 중합체에 접합된 1개 이상의 5'-시클로-포스포네이트 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 RNAi 작용제를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 전달 중합체는 막 활성 폴리아민이다. 일부 실시양태에서, 전달 중합체는 가역적으로 변형된 막 활성 폴리아민이다.
일부 실시양태에서, 표적화 리간드 또는 표적화 기는 1개 이상의 5'-시클로-포스포네이트 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 RNAi 작용제에 부착되는 갈락토스 클러스터이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 RNAi 작용제는 갈락토스 클러스터에 연결된다. 본원에 사용된 갈락토스 클러스터는 2 내지 4개의 말단 갈락토스 유도체를 갖는 분자를 포함한다. 본원에 사용된 용어 갈락토스 유도체는 갈락토스 및 갈락토스와 동일하거나 그보다 더 큰 친화성을 갖는 갈락토스의 유도체 둘 다를 포함한다. 말단 갈락토스 유도체는 전형적으로 그의 C-1 탄소를 통해 분자에 부착된다. 일부 실시양태에서, 갈락토스 클러스터는 각각 아시알로당단백질 수용체에 대한 친화성을 갖는 3개의 말단 갈락토사민 또는 갈락토사민 유도체 (예컨대 N-아세틸-갈락토사민)를 갖는다. 일부 실시양태에서, 갈락토스 클러스터는 3개의 말단 N-아세틸-갈락토사민을 갖는다. 관련 기술 분야에서 통상적인 다른 용어는 트리-안테나 갈락토스, 삼-원자가 갈락토스 및 갈락토스 삼량체를 포함한다. 트리-안테나 갈락토스 유도체 클러스터는 이중-안테나 또는 단일-안테나 갈락토스 유도체 구조보다 더 큰 친화성으로 ASGPr에 결합되는 것으로 공지되어있다 (문헌 [Baenziger and Fiete, Cell, 1980, 22, 611-620]; [Connolly et al., J. Biol. Chem. 1982, 257, 939-945]).
일부 실시양태에서, 갈락토스 클러스터는 각각 중심 분지점에 연결된 3개의 갈락토스 유도체를 함유한다. 일부 실시양태에서, 갈락토스 클러스터는 각각 중심 분지점에 연결된 4개의 갈락토스 유도체를 함유한다. 갈락토스 유도체는 사카라이드의 C-1 탄소를 통해 중심 분지점에 부착된다. 일부 실시양태에서, 갈락토스 유도체는 링커 또는 스페이서를 통해 분지점에 연결된다.
일부 실시양태에서, 갈락토스 유도체는 N-아세틸-갈락토사민 (GalNAc 또는 NAG)를 포함한다. 아시알로당단백질 수용체에 대한 친화성을 갖는 다른 사카라이드는 하기 목록으로부터 선택된다: 갈락토스, 갈락토사민, N-포르밀-갈락토사민, N-프로피오닐-갈락토사민, N-n-부타노일갈락토사민 및 N-이소-부타노일갈락토사민. 아시알로당단백질 수용체를 대한 수많은 갈락토스 유도체의 친화성은 연구된 바 있거나 (예를 들어 참조: Iobst, S.T. 및 Drickamer, K. J.B.C. 1996, 271, 6686) 또는 관련 기술분야에 널리 공지되고 통상적으로 사용되는 방법을 사용하여 용이하게 결정된다.
5'-시클로-포스포네이트 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 RNAi 작용제를 표적화하는데 적합한 공지된 표적화 리간드는 관련 기술분야에, 예를 들어 미국 특허 출원 일련 번호 14/452,626, 15/452,324, 15/452,423 및 62/415,752 (그의 전체 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 공지되어 있다.
제약 조성물 및 제제
본원에 개시된 5'-시클로-포스포네이트 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 올리고머 화합물, 예컨대 RNAi 작용제는 화합물의 투여로부터 이익을 얻을 질환 또는 장애를 갖는 대상체 (예를 들어, 인간 또는 동물, 예를 들어 포유동물, 예컨대 유인원, 원숭이, 돼지, 양, 염소, 소, 말, 개, 고양이, 토끼, 래트, 또는 마우스)를 치료하는데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 5'-시클로-포스포네이트 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 기재된 RNAi 작용제 중 적어도 하나는 유전자 발현에서의 감소 또는 억제로부터 이익을 얻을 대상체의 치료를 위한 제약 조성물 (즉, 의약)의 제조에 사용된다. 이러한 제약 조성물은 세포, 조직 또는 유기체에서의 유전자 발현의 억제에 유용하다. 일부 실시양태에서, 기재된 제약 조성물은 유전자 발현의 감소 또는 억제로부터 이익을 얻을 질환 또는 장애를 갖는 대상체를 치료하는데 사용된다.
일부 실시양태에서, 5'-시클로-포스포네이트 변형된 뉴클레오티드(들)를 포함하는 RNAi 작용제는 표적 mRNA의 발현에서의 감소 또는 억제로부터 이익을 얻을 질환 또는 장애를 갖는 대상체 (예를 들어, 인간)를 치료하는데 사용될 수 있다. 대상체에게 치료 유효량의 임의의 1종 이상의 RNAi 작용제를 투여한다. 대상체는 인간, 환자 또는 인간 환자일 수 있다. 대상체는 성인, 청소년, 어린이 또는 유아일 수 있다. 발현-억제 올리고머 화합물에 연결된 표적화 리간드를 포함하는 기재된 제약 조성물은 질환의 치유적 치료 방법을 제공하는데 사용될 수 있다. 이러한 방법은 본원에 기재된 제약 조성물의 인간 또는 동물에 대한 투여를 포함한다.
따라서, 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 제약 조성물은 1종 이상의 제약상 허용되는 부형제를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 제약 조성물은 대상체에게 투여하기 위해 제제화될 수 있다.
본원에 사용된 제약 조성물 또는 의약은 약리학상 유효량의 본원에 기재된 RNAi 작용제 및/또는 RNAi 작용제-접합체 중 적어도 하나 및 1종 이상의 제약상 허용되는 부형제를 포함한다. 제약상 허용되는 부형제 (부형제)는 안전성을 위해 적절하게 평가된 활성 제약 성분 (API, 치료 제품, 예를 들어 RNAi 작용제 또는 RNAi 촉발제) 이외의 물질이고, 의도적으로 약물 전달 시스템에 포함된다. 부형제는 의도된 투여량에서 치료 효과를 발휘하지 않거나 또는 발휘하는 것으로 의도되지 않는다. 부형제는 a) 제조 동안 약물 전달 시스템의 프로세싱을 보조하는 것, b) API의 안정성, 생체이용률 또는 환자 허용성을 보호, 지지 또는 증진시키는 것, c) 제품 확인을 보조하는 것, 및/또는 d) 저장 또는 사용 동안 API의 전체 안전성, 유효성, 또는 전달 중 하나 이상을 증진시키는 것으로 작용할 수 있다. 제약상 허용되는 부형제는 불활성 물질이거나 또는 아닐 수 있다.
부형제는 흡수 증진제, 부착방지제, 소포제, 항산화제, 결합제, 완충제, 담체, 코팅제, 착색제, 전달 증진제, 덱스트란, 덱스트로스, 희석제, 붕해제, 유화제, 증량제, 충전제, 향미제, 활택제, 함습제, 윤활제, 오일, 중합체, 보존제, 염수, 염, 용매, 당, 현탁화제, 지속 방출 매트릭스, 감미제, 증점제, 등장화제, 비히클, 발수제 및 습윤제를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
제약 조성물은 제약 조성물에서 통상적으로 발견되는 다른 추가의 성분을 함유할 수 있다. 이러한 추가의 성분은 항-소양제, 수렴제, 국부 마취제, 항염증제 또는 항히스타민제 (예를 들어, 디펜히드라민, 독실아민, 아크리바스틴 또는 세티리진)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 5'-시클로-포스포네이트 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 본원에 정의된 RNAi 촉발제를 발현하거나 또는 이를 포함하는 세포, 조직 또는 단리된 기관이 "제약 조성물"로서 사용될 수 있는 것으로 고려된다. 본원에 사용된 "약리학상 유효량", "치료 유효량", 또는 간단히 "유효량"은 의도된 약리학적, 치료적 또는 예방적 결과를 생성하는 RNAi 작용제의 양을 지칭한다.
일부 실시양태에서, 기재된 RNAi 촉발제는 제2 RNAi 촉발제 또는 다른 RNAi 작용제, 소분자 약물, 항체, 항체 단편, 및/또는 백신을 포함하나 이에 제한되지 않은 1종 이상의 추가의 치료제 또는 치료와 조합된다.
5'-시클로-포스포네이트 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 기재된 RNAi 촉발제 및 본원에 개시된 RNAi 촉발을 포함하는 제약 조성물은 키트, 용기, 팩 또는 디스펜서에 포장되거나 또는 포함될 수 있다. RNAi 촉발제 및 상기 RNAi 촉발제를 포함하는 제약 조성물은 미리 충전된 시린지 또는 바이알에 포장될 수 있다.
본원에 기재된 5'-시클로-포스포네이트 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 적어도 1종의 RNAi 촉발제를 포함하는 세포, 조직 및 비-인간 유기체가 고려된다. 세포, 조직 또는 비-인간 유기체는 RNAi 촉발제를 관련 기술 분야에서 이용가능한 임의의 수단에 의해 세포, 조직 또는 비-인간 유기체로 전달함으로써 제조된다. 일부 실시양태에서, 세포는 인간 세포를 포함하나 이에 제한되지 않은 포유동물 세포이다. 세포, 조직 또는 비-인간 유기체는 연구 또는 연구 도구 (예를 들어, 약물 시험 또는 진단)로서 유용하다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 5'-시클로-포스포네이트 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 RNAi 작용제는 표적화된 유전자의 발현의 감소 또는 억제로부터 이익을 얻을 질환 또는 장애를 갖는 대상체를 치료하는데 사용된다. 일부 실시양태에서, 기재된 RNAi 작용제는 표적화된 유전자의 발현에서의 감소 또는 억제로부터 이익을 얻을 질환 또는 장애를 갖는 대상체에서 적어도 하나의 증상을 치료 또는 예방하는데 사용된다. 대상체에게 치료 유효량의 본원에 기재된 RNAi 작용제 중 1종 이상을 투여하여 증상을 치료한다.
일부 실시양태에서, 5'-시클로-포스포네이트 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 RNAi 작용제는 임상 제시를 치료 또는 관리하는데 사용되며, 여기서 이러한 치료, 예방 또는 관리를 필요로 하는 대상체에게 치료 또는 예방 유효량의 1종 이상의 본원에 기재된 RNAi 작용제를 투여한다. 일부 실시양태에서, 방법은 치료할 포유동물, 예를 들어 인간에게 본원에 기재된 RNAi 촉발제 분자를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 5'-시클로-포스포네이트 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 RNAi 촉발제를 사용하여 대상체에서 세포, 세포 군 또는 조직 중 표적화된 유전자의 발현을 억제할 수 있다. 일부 실시양태에서, RNAi 촉발제는 세포, 세포 군, 또는 조직, 예를 들어 대상체에서 표적화된 유전자의 발현을 억제하기 위한 조성물을 제제화하는데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 치료 유효량의 하나의 유형 (또는 여러 상이한 유형)의 본원에 기재된 RNAi 작용제가 대상체에게 투여되고, 그에 의해 대상체에서 표적화된 유전자의 발현을 억제한다 (예를 들어, 대상체에서 표적화된 유전자의 발현을 억제하는데 효과적인 양).
일부 실시양태에서, 5'-시클로-포스포네이트 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 기재된 RNAi 촉발제가 투여된 대상체에서 표적의 유전자 발현 수준 및/또는 mRNA 수준은 RNAi 촉발제 투여 전의 대상체 또는 투여 받지 않은 대상체에 비해 적어도 약 5%, 예를 들어 적어도 약 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 98%만큼 감소될 수 있다. 대상체에서의 유전자 발현 수준 및/또는 mRNA 수준은 대상체의 세포, 세포 군, 및/또는 조직에서 감소될 수 있다. 일부 실시양태에서, 5'-시클로-포스포네이트 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 기재된 RNAi 촉발제가 투여된 대상체에서의 단백질 수준은 RNAi 촉발제 투여 전의 대상체 또는 RNAi 촉발제가 투여되지 않은 대상체에 비해 적어도 약 5%, 예를 들어, 적어도 약 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%만큼 감소될 수 있다. 대상체에서의 단백질 수준은 대상체의 세포, 세포 군, 조직, 혈액 및/또는 다른 유체 중에서 감소될 수 있다. 유전자 발현, mRNA 또는 단백질 수준의 감소는 관련 기술 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 평가될 수 있다. mRNA 수준 및/또는 단백질 수준의 감소 또는 저하는 집합적으로 본원에서 표적화된 유전자 또는 표적 mRNA의 발현을 억제, 감소 또는 저하시키는 것으로 지칭된다.
투여 경로는 5'-시클로-포스포네이트 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 RNAi 촉발제가 신체와 접촉되는 경로이다. 일반적으로, 대상체의 치료를 위한 약물 및 핵산을 투여하는 방법은 관련 기술 분야에 널리 공지되어 있고, 본원에 기재된 조성물의 투여에 적용될 수 있다. 본원에 기재된 화합물은 특정 경로에 적절하게 제조된 제제로 임의의 적합한 경로를 통해 투여될 수 있다. 따라서, 본원에 기재된 화합물은 주사에 의해, 예를 들어 정맥내로, 근육내로, 피내로, 피하로, 또는 복강내로 투여될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 RNAi 촉발제 분자 또는 조성물은 관련 기술 분야에 공지된 올리고뉴클레오티드 전달 기술을 사용하여 세포, 세포 군, 조직 또는 대상체에 전달될 수 있다. 일반적으로, 핵산 분자를 전달하기 위해 (시험관내 또는 생체내) 관련 기술분야에 인지된 임의의 적합한 방법이 본원에 기재된 5'-시클로-포스포네이트 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 RNAi 촉발제와 함께 사용하기 위해 적합화될 수 있다. 예를 들어, 전달은 국소 투여 (예를 들어, 직접 주사, 이식 또는 국소 투여), 전신 투여, 또는 피하, 정맥내, 경구, 복강내, 또는 비경구 경로, 예컨대 두개내 (예를 들어, 뇌실내, 실질내 및 뇌척수강내), 근육내, 경피, 기도 (즉, 에어로졸), 비강, 직장 또는 국소 (협측 및 설하 포함) 투여에 의할 수 있다. 특정 실시양태에서, 조성물은 피하 또는 정맥내 주입 또는 주사에 의해 투여된다.
일반적으로, 활성 화합물의 유효량은 약 0.1 내지 약 100 mg/kg 체중/일, 예를 들어 약 1.0 내지 약 50 mg/kg 체중/일의 범위일 것이다. 일부 실시양태에서, 활성 화합물의 유효량은 용량당 약 0.25 내지 약 5 mg/kg 체중의 범위일 것이다. 일부 실시양태에서, 유효 성분의 유효량은 용량당 약 0.5 내지 약 3 mg/kg 체중의 범위일 것이다. 투여되는 양은 또한 환자의 전반적 건강 상태, 전달되는 화합물의 상대 생물학적 효능, 약물의 제제, 제제 중 부형제의 존재 및 유형, 및 투여 경로와 같은 변수에 따라 달라질 가능성이 있다. 또한, 투여되는 최초 투여량은 목적하는 혈액-수준 또는 조직 수준을 신속하게 달성하기 위해 상기 상위 수준을 넘어 증가될 수 있거나, 또는 초기 투여량은 최적의 것보다 더 작을 수 있음을 이해해야한다.
질환의 치료를 위해 또는 질환의 치료를 위한 의약 또는 조성물의 형성을 위해, 1개 이상의 5'-시클로-포스포네이트 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 발현-억제 올리고머 화합물, 예컨대 RNAi 작용제를 포함하는 본원에 기재된 제약 조성물은, 제2 또는 다른 발현-억제 올리고머 화합물, 소분자 약물, 항체, 항체 단편 및/또는 백신을 포함하나 이에 제한되지는 않는 제2 치료제 또는 치료와 또는 부형제와 조합될 수 있다.
1개 이상의 5'-시클로-포스포네이트 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 기재된 RNAi 작용제는 제약상 허용되는 부형제 또는 아주반트에 첨가될 경우, 키트, 용기, 팩 또는 디스펜서 내에 포장될 수 있다. 본원에 기재된 제약 조성물은 미리 충전된 시린지 또는 바이알에 포장될 수 있다.
상기 제공된 실시양태 및 항목은 이제 하기의 비-제한적인 실시예로 예시된다.
실시예
하기 실시예는 본원에 개시된 특정 실시양태를 제한하지 않고 예시하도록 의도된다.
실시예의 합성의 하기 실험 세부사항에 사용된 약어의 일부는 하기에 정의된다: h 또는 hr = 시간; min = 분; mol = 몰(mole); mmol = 밀리몰; M = 몰(molar); μM = 마이크로몰; g = 그램; μg = 마이크로그램; rt 또는 RT = 실온; L= 리터; mL = 밀리리터; wt = 중량; Et2O = 디에틸 에테르; THF = 테트라히드로푸란; DMSO = 디메틸 술폭시드; EtOAc = 에틸 아세테이트; Et3N 또는 TEA = 트리에틸아민; i-Pr2NEt 또는 DIPEA 또는 DIEA = 디이소프로필에틸아민; CH2Cl2 또는 DCM = 메틸렌 클로라이드; CHCl3 = 클로로포름; CDCl3 = 중수소화 클로로포름; CCl4 = 사염화탄소; MeOH = 메탄올; EtOH = 에탄올; DMF = 디메틸포름아미드; BOC = t-부톡시카르보닐; CBZ = 벤질옥시카르보닐; TBS = t-부틸디메틸실릴; TBSCl 또는 TBDMSCl = t-부틸디메틸실릴 클로라이드; TFA = 트리플루오로아세트산; DMAP = 4-디메틸아미노피리딘; NaN3 = 아지드화나트륨; Na2SO4 = 황산나트륨; NaHCO3 = 중탄산나트륨; NaOH = 수산화나트륨; MgSO4 = 황산마그네슘; K2CO3 = 탄산칼륨; KOH = 수산화칼륨; NH4OH = 수산화암모늄; NH4Cl = 염화암모늄; SiO2 = 실리카; Pd-C = 탄소 상 팔라듐; HCl = 염화수소 또는 염산; NMM = N-메틸모르폴린; H2 = 수소 기체; KF = 플루오린화칼륨; EDC-HCl = N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카르보디이미드 히드로클로라이드; MTBE = 메틸-tert-부틸 에테르; MeOH = 메탄올; Ar = 아르곤; N2 = 질소; SiO2 = 실리카; RT = 체류 시간.
추가적으로, 본원에 개시된 5'-시클로-포스포네이트 변형된 뉴클레오티드와 사용하는데 적절한 RNAi 작용제의 예는 하기 실시예의 다양한 표에 제시된다.
하기 표기법은 본원에 개시된 표에서 제시된 서열에서 변형된 뉴클레오티드를 나타내는데 사용된다. 관련 기술분야의 통상의 기술자가 용이하게 이해하는 바와 같이, 올리고뉴클레오티드 중에 존재하는 경우에, 달리 나타내지 않는 한 단량체는 서로 5'-3'-포스포디에스테르 결합에 의해 연결된다:
N = 2'-OH (비변형된) 리보뉴클레오티드 (f 또는 d 표시 없이 대문자)
n = 2'-OMe 변형된 뉴클레오티드
Nf = 2'-플루오로 변형된 뉴클레오티드
dN = 2'-데옥시 뉴클레오티드
NUNA = 2',3'-세코 뉴클레오티드 모방체 (비잠금 핵염기 유사체)
NLNA = 잠금 뉴클레오티드
NfANA = 2'-F-아라비노 뉴클레오티드
NM = 2'-메톡시에틸 뉴클레오티드
X 또는 Ab = 무염기성 리보스
R = 리비톨
(invdN) = 역전된 데옥시리보뉴클레오티드 (3'-3' 연결된 뉴클레오티드)
(invAb) = 역전된 무염기성 뉴클레오티드
(invX) = 역전된 무염기성 뉴클레오티드
(invn) = 역전된 2'-OMe 뉴클레오티드
s = 포스포로티오에이트 연결된 뉴클레오티드
vpdN = 비닐 포스포네이트 데옥시리보뉴클레오티드
(3'OMen) = 3'-OMe 뉴클레오티드
(5Me-Nf) = 5'-Me, 2'-플루오로 뉴클레오티드
cPrp = 시클로프로필 포스포네이트
본 개시내용의 화합물은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 합성 화학 기술을 사용하여 본원에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다.
실시예 1. 화합물 4 (디메틸 [2-[(2R,3R,4R,5R)-3-([[비스(프로판-2-일)아미노](2-시아노에톡시)포스파닐]옥시)-4-(2-메톡시에톡시)-5-(5-메틸-2,4-디옥소-1,2,3,4-테트라히드로피리미딘-1-일)옥솔란-2-일]시클로프로필]포스포네이트)의 합성
A. 화합물 2 (디메틸 [2-[(2R,3R,4R,5R)-3-[(tert-부틸디페닐실릴)옥시]-4-(2-메톡시에톡시)-5-(5-메틸-2,4-디옥소-1,2,3,4-테트라히드로피리미딘-1-일)옥솔란-2-일]시클로프로필]포스포네이트)의 합성.
Figure 112018120553379-pct00069
화합물 1 (디메틸 [(E)-2-[(2R,3R,4R,5R)-3-[(tert-부틸디페닐실릴)옥시]-4-(2-메톡시에톡시)-5-(5-메틸-2,4-디옥소-1,2,3,4-테트라히드로피리미딘-1-일)옥솔란-2-일]에테닐]포스포네이트)를 문헌 [Whittaker, B. et al., Tetrahedron Lett. 49, 6984-6987 (2008) 및 Abbas, S. et al., Org. Lett., 3(21), 3365-3367 (2001)]의 절차와 유사한 절차에 따라 합성하였다.
질소의 불활성 분위기로 퍼징하고 유지한 1000-mL 3구 둥근 바닥 플라스크에 디메틸 술폭시드 (500 mL) 중 수소화나트륨 (8.2 g, 341.67 mmol, 3.00 당량)의 용액을 넣었다. 이어서, 트리메틸술폭소늄 아이오다이드의 용액 (45 g, 204.48 mmol, 3.00 당량)을 첨가하였다. 생성된 용액을 25℃에서 0.5시간 동안 교반하였다. 이어서, 디메틸 술폭시드 (50 mL) 중 화합물 1 (45 g, 68.31 mmol, 1.00 당량)의 용액을 25℃에서 교반하면서 적가하였다. 생성된 용액을 25℃에서 20시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응물을 포화 수성 염화암모늄 50 mL를 첨가하여 켄칭하였다.
생성된 용액을 디클로로메탄 1000 mL로 3회 추출하고, 유기 층을 합하였다. 합한 유기부를 포화 수성 염화나트륨 2000 mL로 1회 세척하였다. 유기 층을 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 진공 하에 농축시켰다. 잔류물을 실리카 겔 상에서 플래쉬 크로마토그래피하고 디클로로메탄/메탄올 (100:1-10:1)로 용리하였다. 화합물 2 (디메틸 [2-[(2R,3R,4R,5R)-3-[(tert-부틸디페닐실릴)옥시]-4-(2-메톡시에톡시)-5-(5-메틸-2,4-디옥소-1,2,3,4-테트라히드로피리미딘-1-일)옥솔란-2-일]시클로프로필]포스포네이트) 4.4 g (10%)이 백색 고체로서 생성되었다. (H-NMR: (CDCl3, 400 MHz, ppm): δ 8.55 (s, 1H), 7.71 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 7.66 (d, J = 6.8 Hz, 2H), 7.38-7.64 (m, 6H), 7.03 (s, 1H), 5.86 (d, 3.6 Hz, 1H), 4.11 (t, J = 5.2 Hz, 1H), 3.70-3.77 (m, 6H), 3.55-3.61 (m, 2H), 3.34-3.47 (m, 4H), 3.30 (s, 3H), 1.87 (s, 3H), 1.40-1.50 (m, 1H), 1.10 (s, 9H), 0.98-1.05(m, 1H), 0.80-0.90 (m, 1H), 0.61-0.71 (m, 1H)).
B. 화합물 3 (디메틸 [2-[(2R,3R,4R,5R)-3-히드록시-4-(2-메톡시에톡시)-5-(5-메틸-2,4-디옥소-1,2,3,4-테트라히드로피리미딘-1-일)옥솔란-2-일]시클로프로필]포스포네이트)의 합성.
Figure 112018120553379-pct00070
질소의 불활성 분위기로 퍼징하고 유지된 100-mL 3구 둥근 바닥 플라스크에 테트라히드로푸란 (60 mL) 중 화합물 2 (디메틸 [2-[(2R,3R,4R,5R)-3-[(tert-부틸디페닐실릴)옥시]-4-(2-메톡시에톡시)-5-(5-메틸-2,4-디옥소-1,2,3,4-테트라히드로피리미딘-1-일)옥솔란-2-일]시클로프로필]포스포네이트) (6.0 g, 8.92 mmol, 1.00 당량) 및 트리에틸아민 (4.18 g, 41.31 mmol, 3.00 당량)의 용액을 넣었다. 이어서, 0℃에서 교반하면서 트리에틸아민 트리히드로플루오라이드 (13.34 g, 82.86 mmol, 6.00 당량)를 적가하였다. 생성된 용액을 25℃에서 18시간 동안 교반하였다. 생성된 혼합물을 진공 하에 농축시키고, 디클로로메탄 60 mL로 희석하였다.
생성된 용액을 포화 수성 중탄산나트륨 100 mL 및 포화 수성 염화나트륨 100 mL로 세척하였다. 유기 용액을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 진공 하에 농축시켰다. 잔류물을 실리카 겔 상에서 플래쉬 크로마토그래피하고 디클로로메탄/메탄올 (100:1-10:1)로 용리히였다. 화합물 3 (디메틸 [2-[(2R,3R,4R,5R)-3-히드록시-4-(2-메톡시에톡시)-5-(5-메틸-2,4-디옥소-1,2,3,4-테트라히드로피리미딘-1-일)옥솔란-2-일]시클로프로필]포스포네이트) 3 g (77%)이 백색 고체로서 생성되었다. (LC-MS: (ES, m/z): [M+H]+ = 435. H-NMR: (CDCl3, 300 MHz, ppm): δ 9.53 (s, 1H), 8.28 (s, 1H), 7.17 (s, 1H), 5.75 (s, 1H), 3.95-4.10 (m, 3H), 3.61-3.85 (m, 7H), 3.51-3.58 (m, 2H), 3.41 (s, 4H), 1.93 (s, 3H), 1.67-1.78 (m, 1H), 1.19-1.28 (m, 1H), 1.03-1.05 (m, 2H)).
C. 화합물 4 (디메틸 [2-[(2R,3R,4R,5R)-3-([[비스(프로판-2-일)아미노](2-시아노에톡시)포스파닐]옥시)-4-(2-메톡시에톡시)-5-(5-메틸-2,4-디옥소-1,2,3,4-테트라히드로피리미딘-1-일)옥솔란-2-일]시클로프로필]포스포네이트)의 합성.
Figure 112018120553379-pct00071
질소의 불활성 분위기로 퍼징된 50-mL 3구 둥근 바닥 플라스크에 디클로로메탄 (50 mL) 중 화합물 3 (디메틸 [2-[(2R,3R,4R,5R)-3-히드록시-4-(2-메톡시에톡시)-5-(5-메틸-2,4-디옥소-1,2,3,4-테트라히드로피리미딘-1-일)옥솔란-2-일]시클로프로필]포스포네이트) (2.5 g, 5.76 mmol, 1.00 당량) 및 4,5-디시아노이미다졸 (810 mg, 6.86 mmol, 1.20 당량)의 용액을 넣었다. 이어서, 0℃에서 교반하면서 3-(비스(디이소프로필아미노)포스피노옥시)프로판니트릴 (2.25 g, 7.46 mmol, 1.30 당량)을 적가하였다. 생성된 용액을 25℃에서 3시간 동안 교반하였다. 생성된 용액을 디클로로메탄 25 mL로 희석하였다.
생성된 용액을 포화 수성 중탄산나트륨 50 mL로 2회, 포화 수성 염화나트륨 50 mL로 세척하였다. 유기 용액을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 진공 하에 농축시켰다. 잔류물을 실리카 겔 상에서 플래쉬 크로마토그래피하고 디클로로메탄/에틸 아세테이트 (5:1-1:5) (0.5% 트리에틸아민 함유)로 용리하였다. 화합물 4 (디메틸 [2-[(2R,3R,4R,5R)-3-([[비스(프로판-2-일)아미노](2-시아노에톡시)포스파닐]옥시)-4-(2-메톡시에톡시)-5-(5-메틸-2,4-디옥소-1,2,3,4-테트라히드로피리미딘-1-일)옥솔란-2-일]시클로프로필]포스포네이트) 2.1 g (57%)이 백색 고체로서 생성되었다. (LC-MS: (ES, m/z): [M+H]+ = 635. H-NMR: (CD3COCD3, 400 MHz, ppm): δ 10.11(s, 1H), 7.55-7.58 (m, 1H), 5.94-5.99 (m, 1H), 4.42-4.48 (m, 2H), 3.77-3.86 (m, 3H), 3.69-3.76 (m, 9H), 3.51-3.56 (m, 3H), 3.30 (d, J = 2.8 Hz, 3H), 2.81-2.86 (m, 2H), 1.86 (s, 3H), 1.60-1.80 (m, 1H), 1.21-1.27 (m, 12H), 1.04-1.09 (m, 3H). P-NMR: (CD3COCD3, 161 MHz, ppm): δ 149.67, 149.51, 149.21, 31.59, 31.55, 31.41, 31.29.)
상기 화합물 4는 이중-가닥 RNAi 작용제 및/또는 단일-가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드의 말단을 형성하기 위해 5'-시클로프로필 포스포네이트-2'-MOE 변형된 뉴클레오티드를 첨가하는데 사용될 수 있는 포스포르아미다이트 화합물이다. 일반적으로, 개시된 이중-가닥 RNAi 작용제 및/또는 단일-가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드의 말단을 형성하기 위해 본원에 개시된 5'시클로-포스포네이트 변형된 뉴클레오티드를 첨가하는데 사용될 수 있는 포스포르아미다이트를 제조하기 위해 유사한 합성 공정이 사용될 수 있다. 예를 들면, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 실시예 1의 화합물 1이 2' 위치에서 상이한 기, 예컨대 2'-F, 2'-H 또는 2'-O-메틸 기를 사용하여 합성될 수 있음을 인지하고 이해할 것이다. 유사하게, 비-제한적인 예로서, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 상이한 헤테로시클릭 염기 모이어티 (예를 들면, 우라실, 시토신, 구아닌, 5-메틸시토신 등)가 실시예 1에 제시된 바와 같이, 티민 대신에 사용될 수 있음을 인지할 것이다.
실시예 2. 화합물 15 (2-시아노에틸 ((2R,3R,4R,5R)-2-(2-(디에톡시포스포릴)시클로프로필)-5-(2,4-디옥소-3,4-디히드로피리미딘-1(2H)-일)-4-메톡시테트라히드로푸란-3-일) 디이소프로필포스포르아미다이트)의 합성.
A. 화합물 6 (1-((2R,3R,4R,5R)-5-((비스(4-메톡시페닐)(페닐)메톡시)메틸)-4-히드록시-3-메톡시테트라히드로푸란-2-일)피리미딘-2,4(1H,3H)-디온)의 합성.
Figure 112018120553379-pct00072
화합물 5를 상업적으로 입수가능한 채널을 통해 구매하였다. 피리딘 (1.5 L) 중 화합물 5 (200 g, 775 mmol)의 용액에 DMT-Cl (276 g, 813 mol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 N2 분위기 하에 25℃에서 8시간 동안 교반하였다. TLC (석유 에테르/에틸 아세테이트 = 1/1, Rf = 0.2)는 반응이 완결되었음을 나타내었다. 용매를 감압 하에 제거하였다. 잔류물을 EtOAc (4 L)로 희석하고, 물 (1 L x 2) 및 염수 (1 L)로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에 농축시켰다. 최종 잔류물을 칼럼 크로마토그래피 (SiO2, 석유 에테르/에틸 아세테이트 = 5:1 내지 에틸 아세테이트)에 의해 정제하여 화합물 6 (448 g, EtOAc 함유)을 담황색 검으로서 수득하였다. (1H NMR: 400 MHz CDCl3. 9.01 (br s, 1H), 8.05 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.36-7.42 (m, 2H), 7.27-7.34 (m, 6H), 7.22-7.27 (m, 1H), 6.81-6.89 (m, 4H), 5.98 (d, J = 1.3 Hz, 1H), 5.28 (dd, J = 1.9, 8.2 Hz, 1H), 4.48 (dt, J = 5.3, 8.5 Hz, 1H), 4.00 (br d, J = 8.0 Hz, 1H), 3.81 (d, J = 0.8 Hz, 7H), 3.65 (s, 3H), 3.50-3.61 (m, 2H), 2.64 (br d, J = 9.0 Hz, 1H)).
B. 화합물 7 (1-((2R,3R,4R,5R)-5-((비스(4-메톡시페닐)(페닐)메톡시)메틸)-4-((tert-부틸디메틸실릴)옥시)-3-메톡시테트라히드로푸란-2-일)피리미딘-2,4(1H,3H)-디온)의 합성.
Figure 112018120553379-pct00073
DCM (2.8 L) 중 화합물 6 (448 g, 799 mmol)의 용액에 이미다졸 (163 g, 2.4 mol) 및 TBSCl (241 g, 1.6 mol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 25℃에서 8시간 동안 교반하였다. TLC (석유 에테르/에틸 아세테이트 = 1/1, Rf = 0.8)는 반응이 완결되었음을 나타내었다. 생성된 혼합물을 물 (4.5 L)로 희석하고, DCM (5 L x 3)으로 추출하였다. 합한 유기 층을 염수 (5 L)로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에 농축시켜 화합물 7 (620 g, 조 물질)을 무색 검으로서 수득하였다. 조 생성물을 후속 단계에 추가 정제 없이 사용하였다.
C. 화합물 8 (1-((2R,3R,4R,5R)-4-((tert-부틸디메틸실릴)옥시)-5-(히드록시메틸)-3-메톡시테트라히드로푸란-2-일)피리미딘-2,4(1H,3H)-디온)의 합성.
Figure 112018120553379-pct00074
H2O (1L) 중 화합물 7 (620 g, 919 mmol) 및 AcOH (4 L)의 혼합물을 탈기하고 N2로 3회 퍼징하고 이어서 혼합물을 N2 분위기 하에 25℃에서 16시간 동안 교반하였다. TLC (석유 에테르/에틸 아세테이트 = 1/1, Rf = 0.2)는 반응이 완결되었음을 나타내었다. 반응 혼합물을 MeOH (50 mL) 및 Et3SiH (25 mL)를 첨가하여 켄칭하였다. pH = 7~8이 될 때까지 생성된 혼합물에 NaHCO3를 첨가한 다음, EtOAc (5 L x 3)로 추출하였다. 합한 유기 층을 염수 (5 L)로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고 감압 하에 농축시켰다. 잔류물을 칼럼 크로마토그래피 (SiO2, 석유 에테르/에틸 아세테이트 = 5:1에서 1:1)에 의해 정제하여 화합물 8 (296 g, 87% 수율)을 백색 고체로서 수득하였다. (1H NMR: 400 MHz CDCl3. δ 9.27 (s, 1H), 7.72 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 5.74 (dd, J = 1.3, 8.0 Hz, 1H), 5.69 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 4.36 (t, J = 5.3 Hz, 1H), 4.04-4.09 (m, 1H), 3.93-4.03 (m, 2H), 3.75-3.76 (m, 1H), 3.49 (s, 3H), 2.85 (dd, J = 3.5, 6.5 Hz, 1H), 0.92 (s, 9H), 0.11 (d, J = 5.3 Hz, 6H)).
D. 화합물 9 ((2S,3S,4R,5R)-3-((tert-부틸디메틸실릴)옥시)-5-(2,4-디옥소-3,4-디히드로피리미딘-1(2H)-일)-4-메톡시테트라히드로푸란-2-카르브알데히드)의 합성.
Figure 112018120553379-pct00075
DCM (3 L) 중 화합물 8 (60 g, 161 mmol)의 용액에 0℃에서 데스-마르틴 퍼아이오디난 (95.7 g, 226 mmol) 및 NaHCO3 (1.35 g 16.1 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 0℃에서 1시간 동안 교반한 다음, 25℃에서 3시간 동안 교반하였다. TLC (석유 에테르/에틸 아세테이트 = 1/1, Rf = 0.16)는 반응이 완결되었음을 나타내었다. 생성된 혼합물을 포화 Na2S2O3 및 포화 NaHCO3의 4 L 용액 (1:1)으로 켄칭하고, EtOAc (5 L x 3)로 추출하였다. 합한 유기 층을 염수 (5 L)로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고 감압 하에 농축시켜 화합물 9 (48 g, 조 물질)를 오렌지색 오일로서 수득하였다. 조 생성물을 후속 단계에 추가 정제 없이 사용하였다.
E. 화합물 10의 합성.
Figure 112018120553379-pct00076
THF (2.4 L) 중 화합물 10-1 (231 g, 647 mmol)의 슬러리에 LiHMDS (THF 중 1 M, 723 mL)을 첨가하였다. 황색 용액을 25℃에서 15분 동안 교반한 다음, 5℃로 냉각시켰다. 용액을 화합물 10-2 (110 g, 583 mmol)로 처리하고, 25℃로 가온되도록 하고, 이 온도에서 유지하였다. 이어서, 용액을 5℃로 냉각시키고, 추가의 LiHMDS (THF 중 1M, 723 mL)로 처리하고, 2℃로 가온되도록 하였다. 용액을 5℃에서 H2O (50 mL)를 첨가하여 켄칭하고, EtOAc (1.5 L)로 희석하였다. 이후에 유기부를 분리하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 감압 하에 농축시켜 화합물 10-3을 오일로서 수득하였다. 조 오일을 THF (2.4 L) 중에 용해시키고, 5℃로 냉각시켰다. 이어서, 용액을 NaH (57 g, 1.43 mol, 미네랄 오일 중 60% 분산액)로 처리하고, 25℃로 가온되도록 하였다. 슬러리를 25℃에서 18시간 동안 교반하였다. TLC (석유 에테르/에틸 아세테이트 = 1/1, Rf = 0.3)는 반응이 완결되었음을 나타내었다. NaH을 셀라이트 패드에 의해 제거하고, 케이크를 THF (600 mL x 2)로 헹구었다. 여과물을 농축시켜 화합물 10 (250 g, 조 물질)을 황색 오일로서 수득하였다.
F. 화합물 11 (O,O-디에틸 ((E)-2-((2R,3R,4R,5R)-3-((tert-부틸디메틸실릴)옥시)-5-(2,4-디옥소-3,4-디히드로피리미딘-1(2H)-일)-4-메톡시테트라히드로푸란-2-일)비닐)포스포노티오에이트)의 합성.
Figure 112018120553379-pct00077
THF (1.6 L) 중 화합물 9 (165 g, 445 mmol)의 용액에 THF (0.8 L) 중 화합물 10의 용액 (250 g, 583 mmol)을 5℃에서 적가하였다. 이어서, 반응물을 25℃로 가온되도록 하고, 1시간 동안 교반하였다. TLC (석유 에테르/에틸 아세테이트 = 1/1, Rf = 0.6)는 반응이 완결되었음을 나타내었다. 반응 혼합물을 감압 하에 농축시켰다. 잔류물을 칼럼 크로마토그래피 (SiO2, 석유 에테르/에틸 아세테이트 = 10:1에서 1:1)에 의해 정제하여 화합물 11 (89 g, 85% 순도; 72 g, 65% 순도; 59 g, 48% 순도, 65% 수율)을 투명한 오일로서 수득하였다 (불순물은 트리페닐포스핀 옥시드 (Ph3P=O)로 확인되었다). (1H NMR: 400 MHz CDCl3. δ 8.46 (br s, 1H), 7.30 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 6.76-6.89 (m, 1H), 6.18-6.30 (m, 1H), 5.85 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 5.79 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 4.51-4.59 (m, 1H), 4.07-4.18 (m, 4H), 3.98 (dd, J = 5.0, 7.5 Hz, 1H), 3.73 (dd, J = 2.4, 5.1 Hz, 1H), 3.54 (s, 3H), 1.33 (dt, J = 2.3, 7.0 Hz, 6H), 0.92 (s, 9H), 0.11 (s, 6H)).
G. 화합물 12 (O,O-디에틸 (2-((2R,3R,4R,5R)-3-((tert-부틸디메틸실릴)옥시)-5-(2,4-디옥소-3,4-디히드로피리미딘-1(2H)-일)-4-메톡시테트라히드로푸란-2-일)시클로프로필)포스포노티오에이트)의 합성.
Figure 112018120553379-pct00078
DMSO (800 mL) 중 Me3SOI (95.9 g, 436 mmol)의 용액에 수소화나트륨 (17.4 g, 436 mmol, 미네랄 오일 중 60% 분산액)을 THF 슬러리로서 첨가하였다. 생성된 백색 발포성 슬러리를 25℃에서 15분 동안 교반하고, 생성된 백색 용액을 화합물 11 (89 g, 85% 순도, 145 mmol)이 들은 플라스크에 충전하였다. 온도를 22℃에서 26℃로 증가시키고 황색 용액을 2시간 동안 교반한 다음 50℃로 2시간 동안 가열하였다. LCMS는 반응이 완결되었음을 나타내었다. 반응 혼합물을 5℃로 냉각시키고, 내부 온도를 30℃ 미만으로 유지하면서 얼음으로 켄칭하였다. 생성물을 에틸 아세테이트 (3 L)로 추출하고, 유기 층을 물 (5 x 1 L)로 세척하였다. 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고 감압 하에 농축시켜 화합물 12 (206 g, 조 물질)를 백색 고체로서 수득하였다 (불순물은 Ph3P=O로 확인되었고; 조 생성물을 후속 단계에 추가 정제 없이 사용하였다.
H. 화합물 13 (O,O-디에틸 (2-((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-디옥소-3,4-디히드로피리미딘-1(2H)-일)-3-히드록시-4-메톡시테트라히드로푸란-2-일)시클로프로필)포스포노티오에이트)의 합성.
Figure 112018120553379-pct00079
THF (1.3 L) 중 화합물 12 (206 g, 385 mmol)의 교반 용액에 12M HCl (340 mL, 4.1 mol)을 적가하였다. 생성된 혼합물을 25℃에서 1.5시간 동안 교반하였다. TLC (DCM/에틸 아세테이트 = 1/1, Rf = 0.2)는 반응이 완결되었음을 나타내었다. 반응 혼합물을 빙조로 냉각시키고, 중탄산나트륨의 포화 용액으로 pH = 8이 될 때까지 켄칭하였다. 생성물을 EtOAc (3.9 L x 2)로 추출하고, 이어서 합한 유기 층을 염수 (1.3 L)로 세척하였다. 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 잔류물을 칼럼 크로마토그래피 (SiO2, DCM/에틸 아세테이트 = DCM에서 1:1)에 의해 정제하여 화합물 13 (76 g, 47% 수율)을 백색 고체로서 수득하였다. (1H NMR: 400 MHz CDCl3. δ 8.37 (br. s., 1H), 7.41 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 5.75-5.86 (m, 2H), 4.00-4.18 (m, 5H), 3.79-3.85 (m, 1H), 3.56-3.64 (m, 3H), 3.41-3.53 (m, 1H), 2.65-2.74 (m, 1H), 1.49-1.62 (m, 1H), 1.24-1.34 (m, 8H), 0.97-1.09 (m, 1H)).
I. 화합물 14 (디에틸 (2-((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-디옥소-3,4-디히드로피리미딘-1(2H)-일)-3-히드록시-4-메톡시테트라히드로푸란-2-일)시클로프로필)포스포네이트)의 합성.
Figure 112018120553379-pct00080
5℃로 냉각시킨 1.4 L THF:H2O (1:1) 중 화합물 13 (76 g, 181 mmol)의 용액에 옥손® (194 g, 316 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 5℃에서 2시간 동안 교반하였다. LCMS는 반응이 완결되었음을 나타내었다. 반응 혼합물을 200 mL H2O로 희석하고, 2.5 L DCM으로 추출하였다. 유기 층을 수집하고, 수성 층을 추가로 DCM (2.5 L x 4)으로 추출하였다. 유기 층을 합한 다음, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 잔류물을 칼럼 크로마토그래피 (SiO2, DCM/MeOH = DCM에서 10:1)에 의해 정제하여 화합물 14 (Cy3P-U-OMe-3-OH) (40 g, 조 물질)을 백색 고체로서 수득하였다. 최종적으로, 조 생성물을 정제용 HPLC (제미니150*4.6mm(루나200*25mm(C18,10um,100Å)+제미니150*30(c18,5um,110Å), 0.1%TFA/CH3CN/H2O, 20mL/분)에 의해 정제하여 화합물 14 (20.02 g, 99% 순도, 27% 수율)를 투명한 고체로서 수득하였다. (1H NMR: 400 MHz CDCl3. δ 9.54 (br. s., 1H), 7.40-7.48 (m, 1H), 5.75-5.89 (m, 2H), 3.98-4.23 (m, 5H), 3.84 (dd, J = 2.5, 5.3 Hz, 1H), 3.56-3.64 (m, 3H), 3.40 (td, J = 7.9, 16.5 Hz, 1H), 1.58 - 1.70 (m, 1H), 1.30-1.40 (m, 6H), 1.20-1.29(m, 1H), 0.92-1.09 (m, 2H)).
J. 화합물 15 (2-시아노에틸 ((2R,3R,4R,5R)-2-(2-(디에톡시포스포릴)시클로프로필)-5-(2,4-디옥소-3,4-디히드로피리미딘-1(2H)-일)-4-메톡시테트라히드로푸란-3-일) 디이소프로필포스포르아미다이트)의 합성.
Figure 112018120553379-pct00081
DCM (6 mL) 중 화합물 14 (463 mg, 1.1 mmol)의 용액에 4,5-디시아노이미다졸 (54 mg, 0.46 mmol)에 이어서 디클로르메탄 (3 mL) 중 2-시아노에틸 N,N,N',N'-테트라이소프로필포스포로디아미다이트 (518 mg, 1.7 mmol, 1.5 당량)의 용액을 첨가하였다. 반응 혼합물을 밤새 교반하였다. HPLC로 모든 출발 물질이 소모되었음을 확인한 후, 반응 혼합물을 감압 하에 ~2 mL의 부피로 농축시켰다. 조 용액을 실리카 칼럼 상에 로딩하고, 등용매 구배 (DCM: EtOAc: 트리에틸아민: 메탄올 (6:4:0.1:0.05), Rf= 0.25)를 사용하여 정제하였다. 수율: 시클로프로필 및 포스포르아미다이트 부분입체이성질체 (총 4종)의 혼합물로서 421 mg (61%). (1H NMR: 400 MHz DMSO-d6. δ 11.41 (s, 1H), 7.82 - 7.72 (m, 1H), 5.73 - 5.64 (m, 1H), 5.82 - 5.76 (m, 1H), 4.49 - 4.18 (m, 2H), 4.11 - 3.91 (m, 4H), 3.88 - 3.50 (m, 4H), 3.42 - 3.32 (m, 4H), 2.79 (m, 2H), 1.73 - 1.53 (m, 1H), 1.30 - 1.11 (m, 18H), 1.10 - 0.79 (m, 3H)).
상기 화합물 15는 5'-시클로프로필 포스포네이트-2'-O-Me 변형된 뉴클레오티드를 첨가하여 이중-가닥 RNAi 작용제 및/또는 단일-가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드의 말단을 형성하는데 사용될 수 있는 포스포르아미다이트 화합물이다. 일반적으로, 본원에 개시된 5'시클로-포스포네이트 변형된 뉴클레오티드를 첨가하여 개시된 이중-가닥 RNAi 작용제 및/또는 단일-가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드의 말단을 형성하는데 사용될 수 있는 포스포르아미다이트를 제조하기 위해 유사한 합성 공정이 사용될 수 있다. 예를 들면, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 실시예 2의 화합물 5가 2' 위치에서 상이한 기, 예컨대 2'-F, 2'-데옥시 기를 사용하여 합성될 수 있음을 인지하고 이해할 것이다. 유사하게, 비-제한적인 예로서, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 상이한 헤테로시클릭 염기 모이어티 (예를 들면, 티민, 시토신, 구아닌, 5-메틸시토신 등)가 실시예 2에 제시된 바와 같이, 우라실 대신에 사용될 수 있음을 인지할 것이다.
실시예 3. RNAi 작용제 합성.
RNAi 작용제의 합성은 센스 가닥 및 안티센스 가닥의 개별 합성으로부터 출발하였다. 2개의 상보적 가닥을 먼저 고체 지지체 수지 상에서 합성한 다음, 절단 및 탈보호하고, 이어서 역상 또는 이온 교환 크로마토그래피로 정제하고, 최종적으로 어닐링하여 RNAi 작용제를 형성하였다.
A) 고체 상 합성. 올리고뉴클레오티드 합성에 사용된 고체 상 상에서 포스포르아미다이트 기술에 따라 RNAi 작용제를 합성하였다. 규모에 따라, MerMade96E® (바이오오토메이션(Bioautomation)), MerMade12® (바이오오토메이션), 또는 AKTA 올리고파일롯 (GE) 등의 상업적으로 입수 가능한 자동화 올리고머화기를 사용하였다. 서열의 3' 말단으로부터 고체 상 합성을 시작하고, 필요한 순서에 따라 올리고머를 성장시키기 위해 포스포르아미다이트 빌딩 블록을 각각의 합성 사이클에 걸쳐 순차적으로 첨가하였다. 각각의 합성 사이클은 4개의 화학적 단계를 포함하였다: 1) 탈블록킹 또는 탈트리틸화; 2) 커플링; 3) 산화; 4) 캡핑. 포스포르아미다이트는 자연 발생 또는 화학적으로 변형된 뉴클레오티드, 또는 소분자, 예컨대 N-아세틸 갈락토사민 표적화 리간드로부터 유도되었다. 합성은 제어된 세공 유리 (프라임 신테시스 (Prime Synthesis), 미국 펜실베니아주 아스톤으로부터 입수한 CPG, 500 Å 또는 600Å)로 제작된 고체 지지체 상에서 수행되었다. 모든 RNA 및 2'-변형된 RNA 포스포르아미다이트는 써모 피셔 사이언티픽 (Thermo Fisher Scientific, 미국 위스콘신주 밀워키)으로부터 구입하였다. 구체적으로, 하기 2'-O-메틸 포스포르아미다이트가 사용되었다: (5'-O-디메톡시트리틸-N6-(벤조일)-2'-O-메틸-아데노신-3'-O-(2-시아노에틸-N,N-다이소프로필아미노)포스포르아미다이트, 5'-O-디메톡시-트리틸-N4-(아세틸)-2'-O-메틸-시티딘-3'-O-(2-시아노에틸-N,N-디이소프로필-아미노)포스포르아미다이트, (5'-O-디메톡시트리틸-N2-(이소부티릴)-2'-O-메틸-구아노신-3'-O-(2-시아노-에틸-N,N-디이소프로필아미노)포스포르아미다이트 및 5'-O-디메톡시-트리틸-2'-O-메틸-우리딘-3'-O-(2-시아노에틸-N,N-디이소프로필아미노)포스포르아미다이트. 2'-데옥시-2'-플루오로-포스포르아미다이트는 2'-O-메틸 RNA 아미다이트와 동일한 보호기를 보유한다. 표적화 리간드 함유 포스포르아미다이트를 무수 디클로로메탄 또는 무수 아세토니트릴 (50 mM) 중에 용해시키고, 한편 다른 모든 아미다이트를 무수 아세토니트릴 (50 mM) 중에 용해시키고 분자체 (3 Å)를 첨가하였다. 5-벤질티오-1H-테트라졸 (BTT, 아세토니트릴 중 250 mM) 또는 5-에틸티오-1H-테트라졸 (ETT, 아세토니트릴 중 250 mM)을 활성화제 용액으로서 사용하였다. 커플링 시간은 10분 (RNA), 15분 (표적화 리간드), 90초 (2'OMe), 및 60초 (2'F)였다. 포스포로티오에이트 연결을 도입하기 위해, 무수 아세토니트릴 중 3-페닐 1,2,4-디티아졸린-5-온 (POS, 폴리오르그, 인크. (PolyOrg, Inc.), 미국 매사추세츠주 레오민스터)의 100 mM 용액을 사용하였다.
B) 5'-시클로프로필 포스포네이트 변형된 뉴클레오티드의 가수분해.
5'-시클로프로필 포스포네이트 지지체-결합 올리고뉴클레오티드의 가수 분해를 AKTA 올리고파일롯 (GE) 합성기 상에서 수행하였다. 트리메틸실릴 아이오다이드/피리딘/아세토니트릴 (1:13:40 v/v)의 혼합물을 반응기 칼럼에 반응 규모에 따라 30분 내지 90분 동안 2mL/분의 유량으로 통과시켰다. 이어서, 칼럼을 아세토니트릴로 세척하고, 합성기로부터 제거하고, 지지체-결합 올리고뉴클레오티드를 깔때기로 옮기고, 아세토니트릴/물 (1:1 v/v)로 세척하였다.
C) 지지체 결합 올리고뉴클레오티드의 절단 및 탈보호. 5'-시클로프로필포스포네이트 지지체-결합 올리고뉴클레오티드의 고체상 합성 및 탈보호의 완료 후에, 건조된 고체 지지체를 물 중 40 중량% 수성 메틸아민 및 28 중량% 수성 수산화암모늄 용액의 1:1 부피 용액 (알드리치)으로 30℃에서 2시간 동안 처리하였다. 용액을 증발시키고, 고체 잔류물을 물 중에서 재구성하였다 (하기 참조).
D) 정제. 조 올리고뉴클레오티드를 역상 HPLC 또는 이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 생성물-함유 분획을 모으고, 각각의 단일 가닥의 순도 및 동일성을 LCMS에 의해 확인하였다. 올리고뉴클레오티드의 농도 및 수율을 이론적으로 도출된 흡광 계수로 UV (260nm)에 의해 평가하였다.
E) 어닐링. 상보적 가닥을 센스 가닥 및 안티센스 가닥의 등몰 용액을 합함으로써 혼합하였다. 이들 용액을 주위 온도에서 정치시키거나, 또는 70℃에서 열혼합기에 넣고, 95℃로 가열하고, 95℃에서 5분 동안 유지하고, 실온으로 천천히 냉각시켰다. 일부 RNAi 작용제를 동결건조시키고, -15 내지 -25℃에서 보관하였다. 듀플렉스 농도는 UV-Vis 분광계 상에서 260 nm에서의 용액 흡광도를 측정함으로써 결정하였다. 달리 언급되지 않는 한, 모든 전환 인자는 0.037 mg/(mL·cm)였다. 일부 실험에서, 실험적으로 결정된 흡광 계수로부터 전환 인자를 계산하였다.
실시예 4. LP(a) (인간 아포(a) 유전자)를 표적화하는 5'-시클로-포스포네이트 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 예시적인 RNAi 작용제 서열
하기 표 1에 열거된 하기 서열은 단지 예시적인 것이다. 본원에 개시된 5'-시클로-포스포네이트 변형된 뉴클레오티드는 임의의 유전자를 표적화하는 임의의 RNAi 작용제 또는 단일-가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드 내로 혼입될 수 있다
표 1. LP(a) (인간 아포(a) 유전자)를 표적화하는 변형된 RNAi 작용제 서열
Figure 112018120553379-pct00082
상기 표 1의 RNAi 작용제를 실시예 3에 기재된 합성에 따라 제조하였다. 본원의 표에 사용된 2'-O-메틸 뉴클레오티드는 뉴클레오티드 서열에서 소문자 'n'으로 표시되고; 2'-데옥시-2'-플루오로 뉴클레오티드는 Nf로 표시되고; 2'-데옥시 뉴클레오티드는 dN으로 본원에 표시되고; 2'-메톡시에틸 (2'-O-2-메톡시에틸) 뉴클레오티드는 NM으로 본원에 표시되고; 3' - 3' 연결 (역전된) 뉴클레오티드는 invdN, invN, invn, invX 또는 invAb로서 본원에 표시되고; 5'-시클로프로필 포스포네이트는 cPrpN, cPrpn, cPrpNf, cPrpdN 또는 cPrpNM에서와 같이, 뉴클레오티드 앞에 cPrp로서 본원에 표시되고; 무염기성 뉴클레오티드는 Ab로서 본원에 표시되고; n-아세틸-갈락토사민 클러스터 표적화 리간드는 NAG로 표시되고; 5'-포스포로티오에이트 기는 sN, sn, sNf 또는 sdN에서와 같이, 뉴클레오티드 앞에 소문자 's'로서 본원에 표시된다.
실시예 5. 트랜스제닉 마우스에서의 LP(a) (인간 아포(a) 유전자)를 표적화하는 RNAi 작용제의 생체내 분석.
A) 생체내에서의 LP(a) RNAi 작용제의 효능을 평가하기 위해, 아포(a) 트랜스제닉 마우스를 사용하였다 (Frazer KA et al., Nature Genetics 9:424-431 (1995)). 이 마우스는 전체 LPA 유전자 (아포(a) 단백질을 코딩)와 5' 및 3' 둘 다의 추가의 서열을 함유하는 YAC로부터 인간 아포(a)를 발현한다. 센스 가닥의 5' 말단부에 연결된 N-아세틸-갈락토사민 표적화 리간드에 접합된 RNAi 작용제를 제1일에 마우스에게 투여하였다. 각각의 마우스는 염수 (n=4) 또는 각각의 처리군 (모든 처리군에 대해 n=3)의 단일 피하 (SC) 주사를 받았다. 대조군 혈청 (처리전) 샘플을 제-1일에 주사전에 마우스로부터 채취하였다. 제8일, 제15일, 제22일, 제29일, 및 제36일에 마우스로부터 주사후 혈청 샘플을 채취하였다.
B) 아포(a) 단백질 수준. 아포(a)에 대해 ELISA를 사용하여 마우스로부터의 혈청을 검정함으로써 혈청 중 인간 아포(a) 단백질 수준을 모니터링하였다 (압캠 Abcam)). 정규화를 위해, 어느 시점에서의 각각의 동물에 대한 아포(a) 수준을 동물에서의 발현의 처리전 수준 (이 경우 제-1일에)으로 나누어 "제-1일에 대해 정규화된" 발현 비를 결정하였다. 이어서, 특정 시점에서의 발현을 개별 동물에 대한 "제-1일에 대해 정규화된" 비를 염수 대조군에서 모든 마우스의 평균 "제-1일에 대해 정규화된" 비로 나눔으로써 염수 대조군에 대해 정규화하였다. 이는 표 2에 제시된 바와 같이 대조군에서의 발현에 대해 정규화된 각 시점에 대한 발현을 유도하였다.
표 2. 제1일에 투여된 0.5 mg/kg RNAi 작용제의 단일 용량에 의한 트랜스제닉 마우스에서의 아포(a) 녹다운 (KD).
Figure 112018120553379-pct00083
상기 표 2에 나타낸 바와 같이, AD03541에 대한 최저점은 제8일에 도달하였고, AD03158에 대한 최저점은 제22일까지 도달하지 않았다. 추가로, AD03541은 모든 시점에 걸쳐 더 큰 녹다운을 달성하였다.
실시예 6. 시노몰구스 원숭이에서의 인자 12 녹다운 (KD).
인자 12 (F12)에 대해 지시된 서열을 갖고, 센스 가닥의 5' 말단부에서 N-아세틸-갈락토사민 표적화 리간드에 연결된 RNAi 작용제를 합성하고, 피하 (SC) 주사를 위해 관련 기술분야에 공지된 바와 같은 제약상 허용되는 완충제 중에서 합하였다.
제1일에, 시노몰구스 마카크 (마카카 파시쿨라리스) 영장류에게 3 mg/kg의 F12 RNAi 작용제 AD04254 또는 AD04443을 피하 주사하였다. 2마리의 원숭이에게 처리군 AD04443을 투여하고, 3마리의 원숭이에게 처리군 AD04254를 투여하였다.
표 3. 실시예 6의 F12 RNAi 작용제.
Figure 112018120553379-pct00084
상기 표 3에 제시된 바와 같이, AD04254 및 AD04443은 동일한 센스 가닥으로 구성되고, 상기 RNAi 작용제들에서의 유일한 차이는 안티센스 가닥의 5' 말단부가 2'-O-메틸 u 변형된 뉴클레오티드 (AD04254), 또는 2'-O-메틸 u 변형을 또한 포함하는 5'-시클로프로필 포스포네이트 변형된 뉴클레오티드 (AD04443)를 포함하는 것이다.
처리된 시노몰구스 원숭이로부터의 혈청 샘플을 제-29일, 제-7일 및 제1일에 (투여전), 및 제8일, 제15일 및 제22일, 및 제29일에 채취하여 녹다운을 모니터링하였다. 녹다운은 인간 F12 ELISA 키트 (몰레큘라 이노베이션즈 (Molecular Innovations))에 의해 혈청 중 순환 시노 F12 단백질 (cF12) 수준을 정량함으로써 측정하였다. 각각의 시점에서의 각각의 동물에 대한 cF12 수준을 해당 동물에서의 발현의 처리전 수준 (제-29일, 제-7일, 및 제1일의 평균)으로 나누어 "투여전에 대해 정규화된" 발현 비를 결정하였다.
cF12의 평균 정규화 상대적 발현을 도 1에 나타내었다. 도 1에 제시된 바와 같이, 단일 용량 투여에 기초하여, 본 발명의 5'-시클로프로필포스포네이트 변형된 뉴클레오티드를 서열의 안티센스 가닥의 5' 말단부에 포함하는 F12 RNAi 작용제는, 5'-시클로프로필 포스포네이트 변형된 뉴클레오티드를 포함하지 않은 동일한 F12 RNAi 작용제와 비교하여 수치적으로 증가된 효력 및 약간 더 빠른 녹다운을 제공하였다.
실시예 7. 야생형 마우스에서의 인자 12 녹다운 (KD).
센스 가닥의 5' 말단부에서 N-아세틸-갈락토사민 표적화 리간드에 접합된 F12 이중-가닥 RNAi 작용제를 제조하였다. 각각의 이중-가닥 RNAi 작용제는 F12에 대해 지시되었고, 피하 (SC) 주사용으로 관련 기술분야에 공지된 바와 같은 제약상 허용되는 완충제 중에서 합하였다.
F12 RNAi 작용제 (AD04162 및 AD04649)를 SC 주사를 통해 야생형 마우스에 전달하였다. 제1일에, SC 주사를 염수, 완충 염수 중 1종의 RNAi 작용제 0.5 mg/kg (mpk) 용량, 또는 완충 염수 중 1종의 RNAi 작용제 1.0 mg/kg (mpk) 용량을 함유하는 200 μl 용액/20g 마우스를 어깨 사이의 배부 상의 느슨한 피부에 투여하였다. 5개의 처리군 각각당 4마리의 야생형 마우스가 존재하였다.
표 4. 실시예 7의 F12 RNAi 작용제
Figure 112018120553379-pct00085
상기 표 4에 제시된 바와 같이, AD04162 및 AD04649는 동일한 센스 가닥으로 구성되고, RNAi 작용제들 사이의 유일한 차이는 안티센스 가닥의 5' 말단부가 2'-O-메틸 우라실 변형된 뉴클레오티드 (AD04162), 또는 2'-데옥시 변형을 갖는 5'-시클로프로필 포스포네이트 우라실 변형된 뉴클레오티드 (AD04649)를 포함하는 것이다.
처리된 마우스로부터의 혈청 샘플을 제-1일 (투여전), 제8일, 제15일 및 제22일, 및 제29일에 채취하여 녹다운을 모니터링하였다. 녹다운을, 내부적으로 개발된 mF12 알파LISA® (퍼킨 엘머 (Perkin Elmer))에 의해 혈청 중 순환 마우스 F12 단백질 (mF12) 수준을 정량화함으로써 측정하였다. 각각의 시점에서의 각각의 동물에 대한 mF12 수준을 동물에서의 처리전 발현 수준으로 나누어 "투여전에 대해 정규화된" 발현 비를 결정하였다. 이어서, 특정한 시점에서의 발현은 개별 동물에 대한 "투여전 일에 대해 정규화된" 비를 염수 대조군에서의 모든 마우스의 평균 "투여전에 대해 정규화된" 비로 나눔으로써 염수 대조군에 대해 정규화하였다. 이는 대조군에서의 발현에 대해 정규화된 각 시점에 대한 발현을 유도하였다. 실험 오차는 표 5에 제시된 바와 같이 표준 편차로서 제공되었다.
표 5. 제1일에 투여된 RNAi 작용제의 단일 용량에 의한 야생형 마우스에서의 mF12 녹다운 (KD) 백분율
Figure 112018120553379-pct00086
상기 표 5에 제시된 바와 같이, 상기 데이터는 본 발명의 5'-시클로-포스포네이트 변형된 뉴클레오티드의 첨가가 야생형 마우스에서, 특히 1.0 mg/kg 용량에서 이들 F12 RNAi 작용제에 대한 증가된 효능을 제공할 수 있다는 것을 지지한다
실시예 8. pHBV 모델 마우스에서의 HBsAg 감소.
pHBV 모델 마우스를 사용하여 HBV 표면 항원 (HBsAg) 감소를 평가하였다. 6 내지 8 주령의 암컷 NOD.CB17-Prkdscid/NcrCrl (NOD-SCID) 마우스를, HBV RNAi 작용제 또는 대조군의 투여전 30 내지 45일에 투여된 유체 역학적 꼬리 정맥 주사에 의해 생체내에서 MC-HBV1.3으로 일시적으로 형질감염시켰다 (Yang PL et al. "Hydrodynamic injection of viral DNA: a mouse model of acute hepatitis B virus infection," PNAS USA 2002 Vol. 99: p. 13825-13830). MC-HBV1.3은 HBV1.3.32 트랜스제닉 마우스에서와 동일한 말단 중복 인간 B형 간염 바이러스 서열 HBV1.3을 함유하는 플라스미드-유래 미니 서클이다. (GenBank accession #V01460) (Guidotti LG et al., "High-level hepatitis B virus replication in transgenic mice," J Virol 1995 Vol. 69, p6158-6169.). 동물의 체중의 10%의 총 부피로 링거 용액 중의 5 μg MC-HBV1.3을 꼬리 정맥을 통해 마우스에 주사하여 만성 HBV 감염의 pHBV 모델을 생성하였다. 용액을 27-게이지 바늘을 통해 이전에 기재된 바와 같이 5-7초 내에 주사하였다. (Zhang G et al., "High levels of foreign gene expression in hepatocytes after tail vein injection of naked plasmid DNA." Human Gene Therapy 1999 Vol. 10, p1735-1737.). 제-1일에, 혈청 중 B형 간염 표면 항원 (HBsAg) HBsAg 발현 수준을 ELISA에 의해 측정하고, 마우스를 평균 HBsAg 발현 수준에 따라 그룹화하였다.
i) 혈청 수집: 마우스를 2-3% 이소플루란으로 마취시키고, 혈액 샘플을 하악하 영역으로부터 혈청 분리 튜브 (자르슈테트 아게 앤 코. (Sarstedt AG & Co.), 독일 눔브레트)로 수집하였다. 혈액을 주위 온도에서 20분 동안 응고되도록 하였다. 튜브를 8,000 xg에서 3분 동안 원심 분리하여 혈청을 분리하고, 4℃에서 보관하였다.
ii) 혈청 B형 간염 표면 항원 (HBsAg) 수준: 혈청을 수집하고 5% 탈지 분유를 함유하는 PBS 중에서 10 내지 2000-배 희석하였다. 탈지유 용액에 희석된 2차 HBsAg 표준물을 10 μg HBsAg-발현 플라스미드 pRc/CMV-HBs (알데브론 (Aldevron), 노스 다코타주 파르고)로 형질감염시킨 ICR 마우스 (하를란 스프라그 돌리)의 혈청으로부터 제조하였다. HBsAg 수준은 제조업체에 의해 기재된 바와 같이 GS HBsAg EIA 3.0 키트 (바이오-래드 래보러토리즈, 인크. (Bio-Rad Laboratories, Inc.), 워싱턴주 레드몬드)로 결정하였다. PBS 중 탈지유에 또한 희석된 재조합 HBsAg 단백질, ayw 하위 유형을 1차 표준물 (알데브론)로서 사용하였다.
각각의 동물에 대한 HBsAg 발현을 MC-HBV1.3 발현에서의 비-처리 관련 감소를 설명하기 위해 염수 주사한 마우스의 대조군에 대해 정규화하였다. 먼저, "처리전에 대해 정규화된" 발현 비를 결정하기 위해 어느 시점에서의 각각의 동물에 대한 HBsAg 수준을 그 동물에서의 처리전 발현 수준 (제-1일)으로 나누었다. 이어서, 특정한 시점에서의 발현은 "처리전에 대해 정규화된" 비를 생리 염수 대조군에서의 모든 마우스의 평균 "처리전에 대해 정규화된" 비로 나누어, 대조군에 대해 정규화하였다.
제1일에, 각각의 마우스에게, 센스 가닥의 5' 말단부 상에서 N-아세틸-갈락토사민 표적화 리간드에 연결된 HBV 이중-가닥 RNAi 작용제 2 mg/kg (mpk)을 함유하는 200 μl, 또는 대조군으로서 사용되는 HBV RNAi 작용제가 없는 200 μl의 포스페이트 완충 염수의 단일 피하 투여를 투여하였다. 투여된 HBV RNAi 작용제는 포스페이트 완충 염수 중에 제제화된 AD04580 (안티센스 가닥의 5' 말단부에 위치하는 2'-O-메틸 변형을 갖는 5'-시클로프로필 포스포네이트 우라실 변형된 뉴클레오티드를 포함) 및 AD04178 (안티센스 가닥의 5' 말단부에 위치하는 2'-O-메틸 우라실 변형된 뉴클레오티드를 포함)을 포함하였다. RNAi 작용제 AD04580 및 AD04178는 그 이외에는 동일하였고; 이들 2종의 RNAi 작용제 사이의 유일한 차이는 안티센스 가닥의 5' 말단부에서 AD04580에는 5'-시클로프로필 포스포네이트 모이어티를 포함시키는 반면, AD04178은 표준 뉴클레오티드에 공통적인 안티센스 가닥의 5' 말단부에서의 포스페이트 기를 가졌다.
주사는 목부 및 어깨 영역 위의 느슨한 피부 내로 피부와 근육 사이 (즉, 피하 주사)에 수행되었다. 각 군에서 3마리의 마우스를 시험하였다 (n= 3). 혈청을 제8일, 제15일, 제22일, 및 제29일에 수집하고, 혈청 B형 간염 표면 항원 (HBsAg) 수준을 결정하였다.
실험으로부터의 데이터는 도 2에 제시되며, 평균 HBsAg는 HBsAg의 정규화된 평균 값을 반영한다. 도 2에 제시된 바와 같이, 5'-시클로프로필 포스포네이트 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 RNAi 작용제 (AD04580)는 pHBV 모델 마우스에서 변형 없는 RNAi 작용제 (AD04178)를 상당히 능가하였다.
다른 실시양태
본 발명이 그의 상세한 설명과 함께 기재되었지만, 상기 기재는 첨부된 청구범위의 범주에 의해 정의되는 본 발명의 범주를 예시하고 제한하지 않는 것으로 의도된다는 것이 이해되어야 한다. 다른 측면, 이점 및 변형은 하기 청구범위의 범주 내에 있다.
SEQUENCE LISTING <110> Arrowhead Pharmaceuticals, Inc. Zhen Li Tao Pei Michael Lawler <120> 5'-Cyclo-Phosphonate Modified Nucleotides <130> 30644-WO1 <150> US 62/346,304 <151> 2016-06-06 <160> 12 <210> 1 <211> 21 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> RNAi agent sense strand <400> 1 gccccuuauu guuauacgau u 21 <210> 2 <211> 21 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> RNAi agent antisense strand <400> 2 ucguauaaca auaaggggcu u 21 <210> 3 <211> 21 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> RNAi agent sense strand <400> 3 gccccuuauu guuauacgau u 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> RNAi agent antisense strand with 5'-cyclopropyl phosphonate modified nucleotide <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "2'-MOE-5'-cyclopropyl phosphonate nucleoside" <400> 4 tcguauaaca auaaggggcu u 21 <210> 5 <211> 21 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> RNAi agent sense strand <400> 5 acucaauaaa gugcuuugaa a 21 <210> 6 <211> 21 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> RNAi agent antisense strand <400> 6 uuucaaagca cuuuauugag u 21 <210> 7 <211> 21 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> RNAi agent sense strand <400> 7 acucaauaaa gugcuuugaa a 21 <210> 8 <211> 21 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> RNAi agent antisense strand with 5'-cyclopropyl phosphonate modified nucleotide <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "2'-O-methyl-5'-cyclopropyl phosphonate nucleoside" <400> 8 uuucaaagca cuuuauugag u 21 <210> 9 <211> 21 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> RNAi agent sense strand <400> 9 aacucaauaa agugcuuuga a 21 <210> 10 <211> 21 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> RNAi agent antisense strand <400> 10 uucaaagcac uuuauugagu u 21 <210> 11 <211> 21 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> RNAi agent sense strand <400> 11 aacucaauaa agugcuuuga a 21 <210> 12 <211> 21 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> RNAi agent antisense strand with 5'-cyclopropyl phosphonate modified nucleotide <220> <221> modified_base <222> 1 <223> /mod_base = "2'-deoxy-5'-cyclopropyl phosphonate nucleoside" <400> 12 uucaaagcac uuuauugagu u 21

Claims (30)

  1. 하기 화학식 A를 갖는 화합물:
    Figure 112021152479173-pct00134

    여기서
    시클로는
    Figure 112021152479173-pct00135
    이고;
    X'는
    Figure 112021152479173-pct00136
    (s-i), 또는
    Figure 112021152479173-pct00137
    (s-ii)이고;
    X"는 RNAi 작용제의 포스페이트 또는 포스포로티오에이트 모이어티로부터 유도된 치환기를 포함하고;
    D는 O 또는 S;
    X는 9-퓨리닐 또는 1-피리미디닐 염기이고;
    Z는 H, -OH, F, OCH3, -O-(CH2)2-OCH3 또는 할로겐이고;
    Y1, Y2, Y3, 및 Y4는 각각, 독립적으로, H, 할로겐, C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, C2-C6 알케닐, 또는 C2-C6 알키닐이고;
    J는 O 또는 S이고;
    K 및 L은 각각 독립적으로 OR16, SR16, 또는 NR16으로부터 선택되고, 여기서 R16은 H, C1-C10 알킬, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, 아릴 또는
    Figure 112021152479173-pct00138
    로부터 선택되고, 여기서 R14는 H 또는 독립적으로 SH, S-(C1-C4 알킬), 아미노, 히드록실, 옥소, 또는 -NH-C=(NH)NH2로부터 선택된 1 내지 3개의 치환기로 임의로 치환된 C1-C4 알킬로부터 선택되고, R15는 H, 또는 C1-C18 알킬로부터 선택된다.
  2. 제1항에 있어서, 화학식 I 또는 화학식 II를 갖는 화합물:
    Figure 112021152479173-pct00139

    여기서,
    Q는 O, S, N(R30), 또는 C(R31)(R32)로부터 선택된 2가 모이어티이고, 여기서 R30은 H, C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, C2-C6 알케닐, 또는 C2-C6 알키닐이고, R31 및 R32는 각각, 독립적으로, H, 할로겐, C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, C2-C6 알케닐, 또는 C2-C6 알키닐이고; 및
    A는 RNAi 작용제의 포스페이트 또는 포스포로티오에이트 모이어티로부터 유도된 치환기이다.
  3. 제2항에 있어서, Q는 O인 화합물.
  4. 제1항에 있어서, 시클로는
    Figure 112021152479173-pct00140
    인 화합물.
  5. 제2항에 있어서, 화학식 I-b 또는 화학식 II-b를 갖는 화합물:
    Figure 112021152479173-pct00141

    여기서,
    D는 O 또는 S이고;
    X는 9-퓨리닐 또는 1-피리미디닐 염기이고;
    Z는 H, -OH, F, OCH3, -O-(CH2)2-OCH3 또는 할로겐이고;
    Y1, Y2, Y3, 및 Y4는 각각, 독립적으로, H, 할로겐, C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, C2-C6 알케닐, 또는 C2-C6 알키닐이고;
    J는 O 또는 S이고;
    K 및 L은 각각 독립적으로 OR16, SR16, 또는 NR16으로부터 선택되고, 여기서 R16은 H, C1-C10 알킬, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, 또는
    Figure 112021152479173-pct00142
    로부터 선택되고, 여기서 R14는 H 또는 독립적으로 SH, S-(C1-C4 알킬), 히드록실로 임의로 치환된 아릴, 히드록실로 임의로 치환된 헤테로아릴, 아미노, 히드록실, 옥소, 또는 -NH-C=(NH)NH2로부터 선택된 1 내지 3개의 치환기로 임의로 치환된 C1-C4 알킬로부터 선택되고, R15는 H, 또는 C1-C18 알킬로부터 선택되고;
    Q는 O, S, N(R30), 또는 C(R31)(R32)로부터 선택된 2가 모이어티이고, 여기서 R30은 H, C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, C2-C6 알케닐, 또는 C2-C6 알키닐이고, R31 및 R32는 각각, 독립적으로, H, 할로겐, C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, C2-C6 알케닐, 또는 C2-C6 알키닐이고;
    A는 RNAi 작용제의 포스페이트 또는 포스포로티오에이트 모이어티로부터 유도된 치환기이고;
    G1, G2, G3 및 G4는 각각 H이다.
  6. 제5항에 있어서, Q는 O인 화합물.
  7. 제1항에 있어서, D는 O인 화합물.
  8. 제1항에 있어서, RNAi 작용제는 이중-가닥인 화합물.
  9. 제1항에 있어서, X는 1-우라실릴, 1-티미닐, 1-시토시닐, 5-메틸-1-시토시닐, 9-아데니닐, 9-구아니닐, 또는 9-하이포크산티닐인 화합물.
  10. 화학식 I-b-5 또는 화학식 II-b-5를 갖는 화합물:
    Figure 112021152479173-pct00143

    여기서,
    D는 O 또는 S이고;
    X는 9-퓨리닐 또는 1-피리미디닐 염기이고;
    Z는 H, -OH, F, OCH3, -O-(CH2)2-OCH3 또는 할로겐이고;
    Y1, Y2, Y3, 및 Y4는 각각, 독립적으로, H, 할로겐, C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, C2-C6 알케닐, 또는 C2-C6 알키닐이고;
    J는 O 또는 S이고,
    K 및 L은 각각 독립적으로 OR16, SR16, 또는 NR16으로부터 선택되고, 여기서 R16은 H, C1-C10 알킬, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, 아릴 또는
    Figure 112021152479173-pct00144
    로부터 선택되고, 여기서 R14는 H 또는 독립적으로 SH, S-(C1-C4 알킬), 아미노, 히드록실, 옥소, 또는 -NH-C=(NH)NH2로부터 선택된 1 내지 3개의 치환기로 임의로 치환된 C1-C4 알킬로부터 선택되고, R15는 H, 또는 C1-C18 알킬로부터 선택되고;
    G1, G2, G3 및 G4는 각각 H이다.
  11. 제10항에 있어서, 하기 구조를 갖는 화합물:
    Figure 112021152479173-pct00145
  12. 화학식 III-b 또는 화학식 IV-b를 갖는 RNAi 작용제:
    Figure 112021152479173-pct00146

    여기서,
    X는 9-퓨리닐 또는 1-피리미디닐 염기이고;
    Z는 H, -OH, F, OCH3, -O-(CH2)2-OCH3 또는 할로겐이고;
    J 및 J'는 각각 독립적으로 O 또는 S이고;
    Figure 112021152479173-pct00147
    는 RNAi 작용제로부터 유래된 치환기를 포함한다.
  13. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 화합물 중 하나 이상을 포함하는 조성물.
  14. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 화합물 중 하나 이상을 포함하는 RNAi 작용제를 포함하는 조성물.
  15. 제14항에 있어서, RNAi 작용제가 이중-가닥인 조성물.
  16. 치료 유효량의 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 화합물 중 하나 이상을 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 B형 간염 바이러스를 치료하기 위한 제약 조성물.
  17. 제1항에 있어서, 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 화학식을 갖는 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염:
    Figure 112021152479173-pct00148
    ,
    Figure 112021152479173-pct00149
    ,
    Figure 112021152479173-pct00150
    ,
    Figure 112021152479173-pct00151
    및
    Figure 112021152479173-pct00152
    .
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