ES2936387T3 - Formulaciones de anticuerpos anti-il13 - Google Patents

Abstract

Se proporcionan formulaciones que comprenden un anticuerpo anti-IL-13, incluidas formulaciones farmacéuticas y métodos para usar tales formulaciones. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Formulaciones de anticuerpos anti-il13

Campo

Se proporcionan formulaciones que comprenden un anticuerpo anti-IL-13, que incluyen formulaciones farmacéuticas y procedimientos de uso de dichas formulaciones.

Listado de secuencias

La presente solicitud contiene un Listado de Secuencias que ha sido presentado en formato ASCII a través de EFS-Web. Dicha copia ASCII, creada el 4 de octubre de 2012, se denomina P4786R1W.txt y tiene un tamaño de 22.776 bytes.

Antecedentes

La interleucina (IL)-13 es una citocina pleiotrópica de la subclase 2 de células T helper (Th2). Se ha postulado que la IL13 puede desempeñar un papel más importante que otras citocinas Th2 en las funciones efectoras asociadas a los síntomas del asma (Corry, Curr. Opinión Immunol., 11: 610(1999). Se han descrito anticuerpos humanizados anti-IL-13. Véase, por ejemplo, Intn'1 Pub. Número 2005/062967. Un anticuerpo anti-IL13 concreto, el lebrikizumab, se ha investigado clínicamente para el tratamiento de pacientes con asma mal controlada. Algunos de esos resultados se han descrito en el documento Corren et al., N Engl J Med 365(12): 1088-98 (2011).

Dado que las proteínas, incluidos los anticuerpos, son más grandes y complejas que los fármacos orgánicos e inorgánicos tradicionales (por ejemplo, poseen múltiples grupos funcionales además de estructuras tridimensionales complejas), la formulación de dichas proteínas plantea problemas especiales. A fin de que una proteína siga siendo biológicamente activa, una formulación debe preservar intacta la integridad conformacional de al menos una secuencia central de los aminoácidos de la proteína y, al mismo tiempo, proteger de la degradación los múltiples grupos funcionales de la proteína. Las vías de degradación de las proteínas pueden implicar inestabilidad química (por ejemplo, cualquier proceso que implique la modificación de la proteína por medio de la formación de enlaces o la escisión que dé lugar a una nueva entidad química) o inestabilidad física (por ejemplo, cambios en la estructura de orden superior de la proteína). La inestabilidad química se puede deber a la desamidación, racemización, hidrólisis, oxidación, eliminación beta o intercambio de disulfuros. La inestabilidad física se puede deber, por ejemplo, a la desnaturalización, la agregación, la precipitación o la adsorción. Las tres vías más comunes de degradación de las proteínas son la agregación, la desamidación y la oxidación. Cleland et al Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 10(4): 307-377 (1993).

Las formulaciones líquidas de anticuerpos de alta concentración (por ejemplo, > 100 mg/mL) son deseables, por ejemplo, para vías de administración terapéutica o para aplicaciones terapéuticas en las que son aconsejables pequeños volúmenes de producto farmacológico, por ejemplo, para inyección subcutánea. Sin embargo, las formulaciones de anticuerpos de alta concentración plantean numerosos retos y problemas. Uno de los problemas es la inestabilidad debida a la formación de partículas. En el caso de las formulaciones líquidas reconstituidas, este problema se ha abordado mediante el uso de tensioactivos (por ejemplo, un polisorbato), pero a veces se considera que los tensioactivos no son adecuados para las formulaciones líquidas, porque dificultan el procesamiento posterior. Además, los tensioactivos tampoco reducen el aumento de viscosidad provocado como resultado de las numerosas interacciones intermoleculares derivadas de la naturaleza macromolecular de los anticuerpos.

Aunque se ha demostrado que los tensioactivos reducen significativamente el grado de formación de partículas de proteínas, no abordan el problema del aumento de la viscosidad que dificulta la manipulación y administración de formulaciones concentradas de anticuerpos. Los anticuerpos tienden a formar soluciones viscosas a altas concentraciones debido a su naturaleza macromolecular y al potencial de interacciones intermoleculares. Además, a menudo se utilizan azúcares farmacéuticamente aceptables como estabilizantes. Estos azúcares pueden potenciar las interacciones intermoleculares, para de este modo aumentar la viscosidad de la formulación. Las formulaciones muy viscosas son difíciles de fabricar, introducir en una jeringa e inyectar por vía subcutánea. El uso de la fuerza en la manipulación de las formulaciones viscosas conduce a una formación excesiva de espuma, lo que puede provocar la desnaturalización e inactivación de los biológicos activos.

Se han descrito ciertas formulaciones para anticuerpos de alta concentración. Véase, por ejemplo, Intn'1 Pub. Nros. 2006/065746 y 2002/30463. Estas publicaciones no describen específicamente los anticuerpos anti-IL13 de alta concentración. El documento WO2007/076062 desvela una formulación estable de anticuerpo anti-IL13 que comprende 100 mg/ml del anticuerpo y que tiene una viscosidad de menos de 15 cP a 25°C en una formulación de 20 mM de histidina, 10 % de sacarosa pH 6,0. La secuencia de aminoácidos del anticuerpo como se define en la Fig 9 y SEC ID NO:7 y 8 es diferente de la secuencia de aminoácidos de los anticuerpos comprendidos en las formulaciones de la presente invención. El documento WO2006/044908 desvela formulaciones farmacéuticas de un anticuerpo IgG1.

Sería muy ventajoso disponer de formulaciones que comprendan un anticuerpo anti-IL-13 con estabilidad prolongada y baja viscosidad a altas concentraciones de anticuerpo. Las formulaciones de alta concentración de anticuerpos que tienen tales propiedades serían muy ventajosas para ciertas vías de administración, por ejemplo, para la administración subcutánea. Las fórmulas presentadas en el presente documento responden a estas necesidades y aportan otras ventajas útiles.

Sumario

Las formulaciones de la invención se basan, al menos en parte, en el descubrimiento de que el anticuerpo anti-IL13 descrito en el presente documento, lebrikizumab, se puede formular a alta concentración (> 100 mg/mL) en un tampón de histidina que contiene poliol y tensioactivo y que dicha formulación de alta concentración de anticuerpo es de baja viscosidad, tiene estabilidad física y química prolongada y mantiene la potencia. Las formulaciones de la invención son útiles para, por ejemplo, el tratamiento del asma y otros trastornos pulmonares tales como la fibrosis pulmonar idiopática y ciertos trastornos alérgicos, autoinmunes y otros trastornos inflamatorios. Además, dicha formulación se puede envasar en dispositivos de administración subcutánea como los descritos en el presente documento, manteniendo, por ejemplo, la estabilidad del producto y otros atributos deseables.

Por consiguiente, en un aspecto, se proporciona una formulación que comprende un anticuerpo anti-IL13 en la que la concentración de anticuerpo en la formulación es de al menos 100 mg/mL y la viscosidad de la formulación es inferior a 15 centipoise (cP) a 25°C, en la que el anticuerpo anti-IL13 comprende una cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 10 y una cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID Núm.: 14, y en el que la formulación comprende un tampón de acetato de histidina, pH 5,4 a 6,0, y la concentración de acetato de histidina en el tampón está comprendida entre 5 mM y 40 mM, y un poliol y un tensioactivo y la concentración del poliol en la formulación está comprendida entre 100 mM y 200 mM y la concentración del tensioactivo en la formulación está comprendida entre 0,01% y 0,1%, siendo el poliol sacarosa y el tensioactivo polisorbato 20. En ciertas realizaciones, el tampón de acetato de histidina tiene un pH de 5,7 y la concentración de acetato de histidina en el tampón es de 20 mM, y la concentración de sacarosa en la formulación es de 175 mM y la concentración de polisorbato 20 es del 0,03%. En una realización, la concentración de anticuerpo es de 125 mg/mL o 150 mg/mL.

El anticuerpo anti-IL 13 comprende tres cadenas pesadas CDR, CDR-H1 que tienen la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID Núm.: 1, CDR-H2 con la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID Núm.: 2, y CDR-H3 con la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID Núm.: 3 y una cadena ligera CDR, CDR-L1 que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID Núm.: 4, CDR-L2 con la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID Núm.: 5, y CDR-L3 con la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID Núm.: 6.

El anticuerpo anti-IL 13 comprende una cadena pesada de región variable que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID Núm.: 7. El anticuerpo anti-IL13 comprende una cadena ligera de región variable que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID Núm.: 9. El anticuerpo anti-IL13 comprende una cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID Núm.: 10. El anticuerpo anti-IL13 que comprende una cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID Núm.: 14. El anticuerpo anti-IL 13 comprende una cadena pesada de región variable que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID Núm.: 7 y una cadena ligera de región variable que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID Núm.: 9.

Las formulaciones de la invención tienen una estabilidad prolongada. En una realización, el anticuerpo anti-IL13 es estable durante al menos un año a 5°C. En una realización, el anticuerpo anti-IL13 es estable durante al menos dos años a 5°C. En una realización, el anticuerpo anti-IL13 es estable durante tres años a 5°C. En una realización, el anticuerpo anti-IL13 es estable durante al menos cuatro semanas a 25°C, o al menos 8 semanas a 25°C, o al menos 12 semanas a 25°C, o durante 26 semanas a 4°C.

En otro aspecto más, la formulación de la presente invención comprende el anticuerpo anti-IL13 que comprende una cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 10 y una cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID Núm.: 14, en la que el anticuerpo está en una concentración de al menos 100 mg/ml, teniendo el anticuerpo una estabilidad prolongada en tampón de acetato de histidina 20 mM, pH 5,7, sacarosa 175 mM, polisorbato 20 al 0,03%, en la que la viscosidad de la formulación es inferior a 15 centipoise (cP) a 25°C. En una realización, la concentración de anticuerpo en la formulación es de 125 mg/mL. En una realización, la concentración de anticuerpo en la formulación es de 150 mg/mL.

En otro aspecto más, se proporciona un artículo de fabricación que comprende la formulación de la invención y un dispositivo de administración subcutánea. En ciertas realizaciones, el dispositivo de administración subcutánea suministra a un paciente una dosis plana de un anticuerpo anti-IL13. En una realización, la dosis plana es de 37,5 mg de anticuerpo anti-IL13. En una realización, la dosis plana es de 75 mg de anticuerpo anti-IL13. En una realización, la dosis plana es de 125 mg de anticuerpo anti-IL13. En una realización, la dosis plana es de 150 mg de anticuerpo anti-IL13. En ciertas realizaciones, el anticuerpo anti-IL13 es el lebrikizumab. El anticuerpo anti-IL 13 en el dispositivo de administración subcutánea se formula en un tampón y otros excipientes como se ha descrito anteriormente, de forma que se proporciona en una formulación farmacéutica estable. En ciertas realizaciones, el dispositivo de administración subcutánea es una jeringa precargada que comprende un cilindro de vidrio, un vástago de émbolo que comprende un tapón de émbolo y una aguja. En ciertas realizaciones, el dispositivo de administración subcutánea comprende además un protector de aguja y, opcionalmente, un dispositivo protector de aguja. En ciertas realizaciones, el volumen de formulación contenido en la jeringa precargada es de 0,3 mL, 1 mL, 1,5 mL o 2,0 mL. En ciertas realizaciones, la aguja es una aguja estacada que comprende una punta de 3 biseles o una punta de 5 biseles. En ciertas realizaciones, la aguja tiene un calibre de entre 25 (G) y 30G y una longitud de entre 1/2 pulgada y 5/8 pulgadas. En una realización, el dispositivo de administración subcutánea comprende una jeringa precargada de 1,0 mL de vidrio de borosilicato de bajo contenido en tungsteno (tipo I) y una aguja de acero inoxidable de 5 biseles 27G de 1/2 pulgada de longitud y pared fina estacada. En ciertas realizaciones, el dispositivo de administración subcutánea comprende un protector de aguja rígido. En ciertas realizaciones, el protector rígido de la aguja comprende una formulación de caucho con bajo contenido de zinc. En una realización, el escudo de la aguja es rígido y comprende un componente elastomérico, FM27/0, y un escudo rígido de polipropileno. En ciertas realizaciones, el vástago del émbolo comprende un tapón de émbolo de caucho. En ciertas realizaciones, el tapón del émbolo de caucho comprende caucho 4023/50 y revestimiento de etileno-tetrafluoroetileno (ETFE) FluroTec®. En ciertas realizaciones, el dispositivo de administración subcutánea comprende un dispositivo de seguridad de la aguja. Algunos ejemplos de dispositivos de seguridad para agujas son, entre otros, Ultrasafe Passive® Needle Guard X100L (Safety Syringes, Inc.) y Rexam Safe n Sound™ (Rexam).

En otro aspecto más, se proporciona una formulación para su uso en el tratamiento del asma en un paciente. En ciertas realizaciones, se administra una cantidad eficaz de cualquiera de las formulaciones anteriores. En ciertas realizaciones, la cantidad eficaz es de 0,3 mL, medio mL, un mL o dos mL. En otro aspecto, se proporciona una formulación para su uso en el tratamiento de la fibrosis pulmonar idiopática en un paciente. En ciertas realizaciones, se administra una cantidad eficaz de cualquiera de las formulaciones anteriores. En ciertas realizaciones, la cantidad efectiva es medio ml, un ml o dos ml.

Las formulaciones que comprenden un anticuerpo anti-IL13 se pueden administrar por vía subcutánea mediante el uso de, por ejemplo, un dispositivo de administración subcutánea de acuerdo con cualquiera de los dispositivos descritos anteriormente.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra la tasa de degradación de monómeros de anticuerpos anti-IL13 por semana en función del pH, tal como se describe en el Ejemplo 1.

La Figura 2 muestra los aumentos en la turbidez de la solución a 350 nm de soluciones de anticuerpos anti-IL13 en función del pH durante el almacenamiento a 30°C como se describe en el Ejemplo 1.

La Figura 3 muestra los cambios en los fragmentos solubles de bajo peso molecular (LMW) y los agregados de alto peso molecular (HMW) medidos por CE-SDS no reducido durante el almacenamiento a 30°C en función del pH, tal como se describe en el Ejemplo 1.

La Figura 4 muestra las tasas de formación de variantes ácidas (AV) y variantes básicas (pico 1) (BV) a 30°C en función del pH, tal como se describe en el Ejemplo 1. La tasa de formación de variantes de carga se expresa en %/semana y se muestra en el eje vertical.

La Figura 5 muestra las velocidades de formación de la variante básica (pico 2) (BV2) y de pérdida del pico principal (MP) a 30°C en función del pH, tal como se describe en el Ejemplo 1. La tasa de formación de variantes de carga se expresa en %/semana y se muestra en el eje vertical.

La Figura 6 muestra una caracterización reológica del anticuerpo anti-IL13 en función de la concentración de anticuerpo y del pH de la solución, tal como se describe en el Ejemplo 1. La viscosidad de la solución se expresa en centipoise (cP) a 25°C en el eje vertical.

La Figura 7 muestra una caracterización reológica de diferentes anticuerpos monoclonales en una amplia gama de concentraciones, tal como se describe en el Ejemplo 1. La viscosidad de la solución se expresa en centipoise (cP) a 25°C en el eje vertical.

La Figura 8 muestra la cuantificación del aspecto visual de las soluciones de anticuerpos anti-IL13 y anti-CD20 en función de la concentración mediante el uso de nefelometría de 90 grados, tal como se describe en el Ejemplo 1.

La Figura 9 muestra mediciones de turbidez (A350) para soluciones de anticuerpos anti-IL13 y anti-CD20 en función de la concentración de mAb como se describe en el Ejemplo 1.

La Figura 10 muestra la turbidez de la solución de anticuerpo anti-IL13 en función de la concentración y del pH, tal como se describe en el Ejemplo 1.

La Figura 11 muestra el recuento de partículas subvisibles en soluciones de anticuerpos anti-IL13 y anti-CD20 en función de la concentración de mAb, tal como se describe en el Ejemplo 1.

La Figura 12 muestra mediciones de dispersión de luz nefelométrica, turbidimétrica y estática de una solución de 125 mg/mL de anticuerpo anti-IL13 como se describe en el Ejemplo 1.

La Figura 13 resume la dependencia de la temperatura de la opalescencia de la solución a diferentes condiciones de pH para el anticuerpo anti-IL13 a 125 mg/mL y a 204 mg/mL como se describe en el Ejemplo 1. La Figura 14 resume los picos de transición térmica de fusión observados para dos picos parcialmente resueltos en el DSC capilar en función de la composición de la formulación anti-IL13 y del pH de la solución, tal como se describe en el Ejemplo 1.

La Figura 15 resume los coeficientes osomóticos de segundo virial (B2) medidos para el anticuerpo anti-IL13 en función del pH de la solución con muestras en tampones simples como se indica y medidos de 0,1 -1,0 mg/mL como se describe en el Ejemplo 1.

La Figura 16 muestra los coeficientes osmóticos de segundo virial medidos para el anticuerpo anti-IL13 como una función de la composición de la formulación y el pH sobre el intervalo de 1,0-10 mg/mL como se describe en el Ejemplo 1.

La Figura 17 muestra la intensidad de dispersión de luz estática medida frente a la concentración para cada uno de los anticuerpos anti-IL13 y anti-CD20 en comparación con el modelo de esfera dura (HS) descrito en el Ejemplo 1.

La Figura 18 muestra datos de dispersión de luz estática para el anticuerpo anti-IL13 como una función del pH de la formulación representado como pesos moleculares aparentes observados a concentraciones de hasta 200 mg/mL como se describe en el Ejemplo 1.

La Figura 19 muestra los pesos moleculares aparentes de los anticuerpos anti-IL13 y anti-CD20 en solución a altas concentraciones de hasta 200 mg/mL como se describe en el Ejemplo 1.

La Figura 20 muestra la viscosidad de cizallamiento medida para anti-IL13 y anti-CD20 en condiciones de formulación respectivas a 25°C como se describe en el Ejemplo 1.

Descripción detallada

A menos que se definan de otro modo, los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que comúnmente entiende una persona con conocimientos ordinarios en la técnica a la que pertenece esta invención. Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed., J. Wiley & Sons (Nueva York, N.Y. 1994), y March, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 4a ed., John Wiley & Sons (Nueva York, N.Y. 1992), proporcionan a los expertos en la técnica una guía general de muchos de los términos utilizados en la presente solicitud.

Cualquier referencia en la descripción a procedimientos de tratamiento del cuerpo humano o animal se refiere a la formulación de la invención para su uso en dichos procedimientos y no a los procedimientos en sí.

Ciertas definiciones

A efectos de interpretación de la presente memoria descriptiva, se aplicarán las siguientes definiciones y, cuando proceda, los términos utilizados en singular incluirán también el plural y viceversa.

Como se utilizan en esta memoria descriptiva y en las reivindicaciones anexas, las formas singulares "un", "una" y "el" incluyen referentes plurales a menos que el contexto dicte claramente lo contrario. De este modo, por ejemplo, la referencia a "una proteína" o un "anticuerpo" incluye una pluralidad de proteínas o anticuerpos, respectivamente; la referencia a "una célula" incluye mezclas de células, y similares.

El término "formulación farmacéutica" se refiere a una preparación que tiene una forma tal que permite que la actividad biológica del ingrediente activo sea eficaz, y que no contiene componentes adicionales que sean inaceptablemente tóxicos para un sujeto al que se le administraría la formulación. Estas fórmulas son estériles. Los excipientes (vehículos, aditivos) "farmacéuticamente aceptables" son aquellos que se pueden administrar razonablemente a un mamífero para proporcionarle una dosis eficaz del principio activo empleado.

Una formulación "estéril" es aséptica o está libre o esencialmente libre de todos los microorganismos vivos y sus esporas.

Una formulación "congelada" es aquella que se encuentra a una temperatura inferior a 0°C. Por lo general, la formulación congelada no se liofiliza ni se somete a liofilización previa o posterior. En ciertas realizaciones, la formulación congelada comprende sustancia farmacológica congelada para almacenamiento (en tanque de acero inoxidable) o producto farmacológico congelado (en configuración de vial final).

Una formulación "estable" es aquella en la que la proteína que contiene conserva esencialmente su estabilidad física y/o química y/o su actividad biológica tras el almacenamiento. En determinadas realizaciones, la formulación conserva esencialmente su estabilidad física y química, así como su actividad biológica tras el almacenamiento. El periodo de almacenamiento se suele seleccionar en función de la vida útil prevista de la formulación.

Como se utiliza en el presente documento, una formulación con "estabilidad prolongada" significa aquella en la que la proteína que contiene conserva esencialmente su estabilidad física, estabilidad química y actividad biológica tras su almacenamiento a 5°C durante un año o más. En ciertas realizaciones, el almacenamiento es a 5°C durante dos años o más. En determinadas realizaciones, el almacenamiento se efectúa a 5°C durante un máximo de tres años. Una proteína "conserva su estabilidad física" en una formulación farmacéutica si no muestra signos, o muy pocos, de agregación, precipitación y/o desnaturalización en el examen visual del color y/o la claridad, o según se mida por dispersión de luz UV o por cromatografía de exclusión por tamaño.

Una proteína "conserva su estabilidad química" en una formulación farmacéutica, si la estabilidad química en un momento dado es tal que se considera que la proteína aún conserva su actividad biológica tal como se define a continuación. La estabilidad química se puede evaluar al detectar y cuantificar formas químicamente alteradas de la proteína. La alteración química puede implicar una modificación del tamaño (por ejemplo, recorte) que se puede evaluar mediante el uso de cromatografía de exclusión por tamaño, SDS-PAGE y/o espectrometría de masas por desorción láser asistida por matriz/espectrometría de masas por tiempo de vuelo (MAL^d I/TOF MS), por ejemplo. Otros tipos de alteración química incluyen la alteración de la carga (por ejemplo, como resultado de la desamidación), que se puede evaluarse por medio de cromatografía de intercambio iónico o enfoque isoeléctrico capilar por imágenes (icIEF), por ejemplo.

Un anticuerpo "conserva su actividad biológica" en una formulación farmacéutica, si la actividad biológica del anticuerpo en un momento dado está dentro del 10% (dentro de los errores del ensayo) de la actividad biológica exhibida en el momento en que se preparó la formulación farmacéutica, según se determine en un ensayo de unión a antígeno o en un ensayo de potencia, por ejemplo.

En el presente documento, la "actividad biológica" de un anticuerpo monoclonal se refiere a la capacidad del anticuerpo de unirse al antígeno. Además, puede incluir la unión del anticuerpo al antígeno y dar lugar a una respuesta biológica mensurable que se puede medir in vitro o in vivo. Dicha actividad puede ser antagonista o agonista.

Un anticuerpo monoclonal "desamidado" es aquel en el que uno o más residuos de asparagina del mismo se han derivitizado, por ejemplo a un ácido aspártico o a un ácido iso-aspártico.

Un anticuerpo que es "susceptible a la deamidación" es aquel que comprende uno o más residuos que se ha descubierto que son propensos a la deamidación.

Un anticuerpo "susceptible a la agregación" es aquel que se ha descubierto que se agrega con otra(s) molécula(s) de anticuerpo, especialmente tras la congelación y/o agitación.

Un anticuerpo que es "susceptible a la fragmentación" es aquel que se ha descubierto que se escinde en dos o más fragmentos, por ejemplo en una región bisagra del mismo.

Por "reducir la desamidación, agregación o fragmentación" se entiende prevenir o disminuir la cantidad de desamidación, agregación o fragmentación en relación con el anticuerpo monoclonal formulado a un pH diferente o en un tampón diferente.

El anticuerpo formulado es esencialmente puro y, deseablemente, esencialmente homogéneo (por ejemplo, libre de proteínas contaminantes, etc.). Un anticuerpo "esencialmente puro" significa una composición que comprende al menos el 90% en peso del anticuerpo, en base al peso total de la composición, o al menos el 95% en peso. Se entiende por "anticuerpo esencialmente homogéneo" una composición que comprende al menos un 99% en peso de anticuerpo, en base al peso total de la composición.

Se entiende por "isotónica" que la formulación de interés tiene esencialmente la misma presión osmótica que la sangre humana. Las formulaciones isotónicas tendrán generalmente una presión osmótica de 250 a 350 mOsm. La isotonicidad se puede medir, por ejemplo, con un osmómetro de presión de vapor o de congelación.

Como se utiliza en el presente documento, "tampón" se refiere a una solución tamponada que resiste los cambios de pH por la acción de sus componentes conjugados ácido-base.

Un "tampón de histidina" es un tampón que contiene iones de histidina. Ejemplos de tampones de histidina incluyen cloruro de histidina, acetato de histidina, fosfato de histidina, sulfato de histidina, succinato de histidina, etc. La formulación de la presente invención comprende acetato de histidina a una concentración entre 5 mM y 40 mM, pH 5,4 a 6,0. En una realización, el tampón de acetato de histidina se prepara titulando L-histidina (base libre, sólida) con ácido acético (líquido). En una realización, el tampón histidina o el tampón histidina-acetato tiene un pH de 5,6. En una realización, el tampón tiene un pH de 5,7. En una realización, el tampón tiene un pH de 5,8.

En el presente documento, un "tensioactivo" se refiere a un agente tensioactivo, normalmente un tensioactivo no iónico. Algunos ejemplos de tensioactivos son polisorbato (por ejemplo, polisorbato 20 y polisorbato 80); poloxámero (p. ej. poloxámero 188); Tritón; dodecil sulfato sódico (SDS); lauril sulfato sódico; octil glicósido sódico; lauril-, miristilo-, linoleil-, o estearil-sulfobetaína; lauril-, miristilo-, linoleil- o estearil-sarcosina; linoleil-, miristilo- o cetilbetaína; lauroamidopropil-, cocamidopropil-, linoleamidopropil-, miristamidopropil-, palmidopropil- o isostearamidopropil-betaína (p. ej., lauroamidopropil-, linoleamidopropil-, palmidopropil- o isostearamidopropilbetaína).por ejemplo, lauroamidopropil); miristamidopropil-, palmidopropil-, o isostearamidopropil-dimetilamina; metil cocoil-, o metil oleil-taurato disódico de sodio; y la serie MONAQUAT™ (Mona Industries, Inc., Paterson, N.J.); polietilglicol, polipropilglicol y copolímeros de etileno y propilenglicol (por ejemplo, Pluronics, PF68, etc.); etc. La formulación de la presente invención comprende polisorbato 20 en una concentración entre 0,01 y 0,1%.

Un "conservante" es un compuesto que se puede incluir opcionalmente en la formulación para reducir esencialmente la acción bacteriana en la misma, para de este modo facilitar la producción de una formulación multiuso, por ejemplo. Algunos ejemplos de posibles conservantes son el cloruro de octadecildimetilbencilamonio, el cloruro de hexametonio, el cloruro de benzalconio (una mezcla de cloruros de alquilbencildimetilamonio en la que los grupos alquilo son compuestos de cadena larga) y el cloruro de bencetonio. Otros tipos de conservantes son los alcoholes aromáticos tales como el fenol, el alcohol butílico y el bencílico, los alquilparabenos tales como el metil o el propilparabeno, el catecol, el resorcinol, el ciclohexanol, el 3-pentanol y el m-cresol. En una realización, el conservante en el presente documento es alcohol bencílico.

Un "poliol" es una sustancia con múltiples grupos hidroxilo, e incluye azúcares (reductores y no reductores), alcoholes de azúcar y ácidos de azúcar. En determinadas realizaciones, los polioles en el presente documento tienen un peso molecular inferior a 600 kD (por ejemplo, en el intervalo de 120 a 400 kD). Un "azúcar reductor" es aquel que contiene un grupo hemiacetal que puede reducir iones metálicos o reaccionar covalentemente con la lisina y otros grupos amino de las proteínas y un "azúcar no reductor" es aquel que no tiene estas propiedades de un azúcar reductor. Ejemplos de azúcares reductores son la fructosa, la manosa, la maltosa, la lactosa, la arabinosa, la xilosa, la ribosa, la ramnosa, la galactosa y la glucosa. Entre los azúcares no reductores se encuentran la sacarosa, la trehalosa, la sorbosa, la melezitosa y la rafinosa. El manitol, el xilitol, el eritritol, el treitol, el sorbitol y el glicerol son ejemplos de alcoholes de azúcar. En cuanto a los ácidos de azúcar, se incluyen el L-gluconato y sus sales metálicas. Cuando se desea que la formulación sea estable a la congelación-descongelación, el poliol es típicamente uno que no cristaliza a temperaturas de congelación (por ejemplo -200C) de forma que desestabiliza el anticuerpo en la formulación. La formulación de la presente invención comprende sacarosa en una concentración comprendida entre 100 mM y 200 mM.

Como se utiliza en el presente documento, "asma" se refiere a un trastorno complejo caracterizado por síntomas variables y recurrentes, obstrucción reversible del flujo aéreo (por ejemplo, mediante broncodilatador) e hiperreactividad bronquial que puede o no estar asociada a una inflamación subyacente. Entre los ejemplos de asma se incluyen el asma sensible a la aspirina/exacerbada, el asma atópica, el asma grave, el asma leve, el asma de moderada a grave, el asma ingenua a los corticoesteroides, el asma crónica, el asma resistente a los corticoesteroides, el asma refractaria a los corticoesteroides, el asma de reciente diagnóstico y no tratada, el asma debida al tabaquismo, el asma no controlada con corticoesteroides y otros asmas como se menciona en el documento J Allergy Clin Immunol (2010) 126(5):926-938.

Como se usa aquí, "tratamiento" se refiere a la intervención clínica en un intento de alterar el curso natural del individuo o célula que se está tratando, y se puede llevar a cabo antes o durante el curso de la patología clínica. Los efectos deseables del tratamiento incluyen la prevención de la aparición o recurrencia de una enfermedad o de una afección o síntoma de la misma, el alivio de una afección o síntoma de la enfermedad, la disminución de cualquier consecuencia patológica directa o indirecta de la enfermedad, la disminución de la tasa de progresión de la enfermedad, la mejora o paliación del estado de la enfermedad y el logro de la remisión o la mejora del pronóstico. Una "cantidad eficaz" se refiere a una cantidad eficaz, a las dosis y durante los periodos de tiempo necesarios, a fin de lograr el resultado terapéutico o profiláctico deseado. Una "cantidad terapéuticamente efectiva" del agente terapéutico puede variar de acuerdo con factores tales como el estado de la enfermedad, la edad, el sexo y el peso del individuo, y la capacidad del anticuerpo para provocar una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad terapéuticamente efectiva es también aquella en la que cualquier efecto tóxico o perjudicial del anticuerpo es superado por los efectos terapéuticos beneficiosos.

Un "individuo", "sujeto" o "paciente" es un vertebrado. En ciertas realizaciones, el vertebrado es un mamífero. Los mamíferos incluyen, entre otros, a los primates (incluidos los primates humanos y no humanos) y los roedores (por ejemplo, ratones y ratas). En ciertas realizaciones, un mamífero es un ser humano.

Un "medicamento" es un fármaco activo para tratar una enfermedad, trastorno y/o afección.

"Anticuerpos" (Abs) e "inmunoglobulinas" (Igs) se refieren a glicoproteínas que tienen características estructurales similares. Mientras que los anticuerpos presentan especificidad de unión a un antígeno específico, las inmunoglobulinas incluyen tanto anticuerpos como otras moléculas similares a los anticuerpos que generalmente carecen de especificidad antigénica. Los polipéptidos de este último tipo son producidos, por ejemplo, a niveles bajos por el sistema linfático y a niveles elevados por los mielomas.

Los términos "anticuerpo" e "inmunoglobulina" se utilizan indistintamente en el sentido más amplio e incluyen anticuerpos monoclonales (p. ej., anticuerpos monoclonales de longitud completa o intactos), anticuerpos policlonales, anticuerpos monovalentes, anticuerpos multivalentes, anticuerpos multiespecíficos (p. ej., anticuerpos biespecíficos siempre que presenten la actividad biológica deseada) y también pueden incluir ciertos fragmentos de anticuerpos (como se describe con mayor detalle en el presente documento). Un anticuerpo puede ser quimérico, humano, humanizado y/o madurado por afinidad. El anticuerpo empleado en la presente invención es un anticuerpo anti-IL13 que comprende una cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 10 y una cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID Núm.: 14.

Los términos "anticuerpo de longitud completa", "anticuerpo intacto" y "anticuerpo entero" se utilizan en el presente documento indistintamente para referirse a un anticuerpo en su forma sustancialmente intacta, no a fragmentos de anticuerpo como se define a continuación. Los términos se refieren particularmente a un anticuerpo con cadenas pesadas que contienen la región Fc.

Los "fragmentos de anticuerpo" comprenden una porción de un anticuerpo intacto, que comprende preferentemente la región de unión al antígeno del mismo. Algunos ejemplos de fragmentos de anticuerpos son los fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, y Fv; los diabodies; los anticuerpos lineales; las moléculas de anticuerpo de cadena simple; y los anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos.

La digestión con papaína de los anticuerpos produce dos fragmentos idénticos de unión al antígeno, denominados fragmentos "Fab", cada uno con un único sitio de unión al antígeno, y un fragmento residual "Fc", cuyo nombre refleja su capacidad para cristalizar fácilmente. El tratamiento con pepsina produce un fragmento F(ab')2 que tiene dos sitios de combinación de antígenos y sigue siendo capaz de reticular antígenos.

"Fv" es un fragmento mínimo de anticuerpo que contiene un sitio completo de unión al antígeno. En una realización, una especie Fv de dos cadenas consiste en un dímero de un dominio variable de cadena pesada y otro de cadena ligera en asociación estrecha no covalente. En conjunto, las seis CDR de un Fv confieren al anticuerpo especificidad de unión al antígeno. Sin embargo, incluso un único dominio variable (o la mitad de un Fv que comprenda sólo tres CDR específicas para un antígeno) tiene la capacidad de reconocer y unirse al antígeno, aunque con una afinidad menor que el sitio de unión completo.

El fragmento Fab contiene los dominios variables de las cadenas pesada y ligera y también contiene el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab' se diferencian de los Fab por la adición de unos pocos residuos en el extremo carboxi del dominio CH1 de la cadena pesada, que incluyen una o más cisteínas de la región bisagra del anticuerpo. Fab'-SH es la designación que se da en el presente documento a Fab' en el que el residuo o residuos de cisteína de los dominios constantes llevan un grupo tiol libre. Los fragmentos de anticuerpos F(ab') 2 se produjeron originalmente como pares de fragmentos Fab' que tienen cisteínas bisagra entre ellos. También se conocen otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpos.

El término "anticuerpo monoclonal", como se utiliza en el presente documento, se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que componen la población son idénticos excepto por posibles mutaciones, por ejemplo, mutaciones naturales, que pueden estar presentes en cantidades menores. De este modo, el modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo como no siendo una mezcla de anticuerpos discretos. En ciertas realizaciones, dicho anticuerpo monoclonal incluye típicamente un anticuerpo que comprende una secuencia polipeptídica que se une a una diana, en la que la secuencia polipeptídica de unión a la diana se obtuvo mediante un proceso que incluye la selección de una única secuencia polipeptídica de unión a la diana a partir de una pluralidad de secuencias polipeptídicas. Por ejemplo, el proceso de selección puede consistir en la selección de un clon único a partir de una pluralidad de clones, tales como un conjunto de clones de hibridoma, clones de fagos o clones de ADN recombinante. Debe entenderse que una secuencia de unión a diana seleccionada puede alterarse aún más, por ejemplo, para mejorar la afinidad por la diana, para humanizar la secuencia de unión a diana, para mejorar su producción en cultivo celular, para reducir su inmunogenicidad in vivo, para crear un anticuerpo multiespecífico, etc., y que un anticuerpo que comprende la secuencia de unión a diana alterada es también un anticuerpo monoclonal comprendido en la formulación de la presente invención. A diferencia de los preparados de anticuerpos policlonales, que suelen incluir diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal de un preparado de anticuerpos monoclonales está dirigido contra un único determinante de un antígeno. Además de su especificidad, los preparados de anticuerpos monoclonales presentan la ventaja de no estar contaminados por otras inmunoglobulinas.

El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo como obtenido de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no se debe interpretar como que requiere la producción del anticuerpo por un procedimiento particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales comprendidos en las formulaciones de la presente invención se pueden fabricar por medio de una variedad de técnicas, que incluyen, por ejemplo, el procedimiento del hibridoma (por ejemplo, Kohler et al., Nature, 256: 495 (1975) Harlow et al., Ann. A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a ed. 1988) Hammerling et al: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)), procedimientos de ADN recombinante (véase, por ejemplo Patente estadounidense n.° 4.816.567), tecnologías de visualización de fagos (véase, por ejemplo, Clackson et al., Nature, 352: 624 a 628 (1991); Marks, et al., J. Mol. Biol. 222: 581 a 597 (1992); Sidhu, et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299 a 310 (2004); Lee, et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467­ 12472 (2004); y Lee et al., J. Immunol. Procedimientos 284(1-2): 119-132(2004), y tecnologías para producir anticuerpos humanos o similares a los humanos en animales que tienen partes o todos los loci de inmunoglobulina humana o genes que codifican secuencias de inmunoglobulina humana (véase, p. ej, WO98/24893 WO96/34096 WO96/33735 WO91/10741 Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2551 (1993) Jakobovits et al., Nature 362: 255-258 (1993) Bruggemann et al., Year in Immunol. 7:33 (1993) Patente de EE.UU. n° 5.545.8075,545,8065,569,8255,625,1265,633,4255,661,016 Marks y otros, Bio.Technology 10: 779­ 783 (1992); Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994) Morrison, Nature 368: 812-813 (1994) Fishwild et al., Nature Biotechnol. 14: 845-851 (1996) Neuberger, Nature Biotechnol. 14: 826 (1996) y Lonberg y Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93 (1995).

Los anticuerpos monoclonales del presente documento incluyen específicamente anticuerpos "quiméricos" en los que una parte de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homóloga a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o pertenecientes a una clase o subclase particular de anticuerpos, mientras que el resto de la(s) cadena(s) es idéntico u homólogo a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otra especie o pertenecientes a otra clase o subclase de anticuerpos, así como fragmentos de tales anticuerpos, siempre que presenten la actividad biológica deseada (Patente estadounidense n° 4.816.567y Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6855-9855 (1984)). La formulación de la presente invención comprende un anticuerpo anti-IL13 que comprende una cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 10 y una cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID Núm.: 14.

Los "anticuerpos nativos" se refieren a moléculas de inmunoglobulina de origen natural con estructuras variables. Por ejemplo, los anticuerpos IgG nativos son glicoproteínas heterotetraméricas de 150.000 daltons, compuestas por dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas unidas por disulfuro. Del N- al C-terminal, cada cadena pesada tiene una región variable (VH), también llamada dominio pesado variable o dominio variable de cadena pesada, seguida de tres dominios constantes (CH1, CH2 y CH3). Del mismo modo, desde el N- al C-terminal, cada cadena ligera tiene una región variable (VL), también llamada dominio de luz variable o dominio variable de cadena ligera, seguida de un dominio de luz constante (CL). La cadena ligera de un anticuerpo se puede asignar a uno de dos tipos, denominados kappa (^k) y lambda (A), en función de la secuencia de aminoácidos de su dominio constante.

El término "región variable" o "dominio variable" se refiere al dominio de una cadena pesada o ligera de anticuerpo que interviene en la unión del anticuerpo al antígeno. Los dominios variables de la cadena pesada y la cadena ligera (VH y VL, respectivamente) de un anticuerpo nativo suelen tener estructuras similares, y cada dominio comprende cuatro regiones marco conservadas (FR) y tres regiones hipervariables (HVR). (Véase, por ejemplo Kindt et al. Inmunología Kuby, 6a ed., W.H. Freeman and Co., página 91 (2007).) Un solo dominio VH o VL puede ser suficiente para conferir especificidad de unión al antígeno. Además, los anticuerpos que se unen a un antígeno concreto se pueden aislar mediante el uso de un dominio VH o VL de un anticuerpo que se une al antígeno para cribar una biblioteca de dominios VL o VH complementarios, respectivamente. Véase, por ejemplo Portolano et al., J. Immunol.

150:880-887 (1993) Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991).

Un anticuerpo "humanizado" se refiere a un anticuerpo quimérico que comprende residuos de aminoácidos de HVR no humanos y residuos de aminoácidos de FR humanos. En ciertas realizaciones, un anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente la totalidad de al menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en los que todos o sustancialmente todos los HVR (por ejemplo, CDR) corresponden a los de un anticuerpo no humano, y todos o sustancialmente todos los FR corresponden a los de un anticuerpo humano. Un anticuerpo humanizado puede comprender opcionalmente al menos una porción de una región constante de anticuerpo derivada de un anticuerpo humano. Una "forma humanizada" de un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo no humano, se refiere a un anticuerpo que ha sido humanizado.

El término "región hipervariable" o "HVR", como se utiliza en el presente documento, se refiere a cada una de las regiones de un dominio variable de anticuerpo que son hipervariables en secuencia y/o forman bucles estructuralmente definidos ("bucles hipervariables"). Generalmente, los anticuerpos nativos de cuatro cadenas comprenden seis HVR; tres en la VH (Hl, H2, H3), y tres en la VL (L1, L2, L3). Los HVR comprenden generalmente residuos de aminoácidos de los bucles hipervariables y/o de las "regiones determinantes de la complementariedad" (CDR), siendo estas últimas las de mayor variabilidad de secuencia y/o implicadas en el reconocimiento del antígeno. Los bucles hipervariables ejemplares se encuentran en los residuos de aminoácidos 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (Hl), 53-55 (H2) y 96-101 (H3). (Chothia y Lesk, J. Mol. Biol. 196:901 a 901 (1987). Las CDR ejemplares (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3) se encuentran en los residuos de aminoácidos 24-34 de L1, 50-56 de L2, 89-97 de L3, 31-35B de Hl, 50-65 de H2 y 95-102 de H3. (Kabat et al., Secuencias de proteínas de interés inmunológico, 5a Ed. Servicio de Salud Pública, Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, MD (1991).) A excepción de la CDR1 en VH, las CDR comprenden generalmente los residuos de aminoácidos que forman los bucles hipervariables. Los CDR también incluyen "residuos determinantes de la especificidad" o "SDR", que son residuos que entran en contacto con el antígeno. Las SDR se encuentran en regiones de las CDR denominadas CDR abreviadas o CDRa. Los a-CDR ejemplares (a-CDR-Ll, a-CDR-L2, a-CDR-L3, a-CDR-H1, a-CDR-H2 y a-CDR-H3) se encuentran en los residuos de aminoácidos 31-34 de L1, 50-55 de L2, 89-96 de L3, 31-35B de Hl, 50-58 de ^h2 y 95-102 de H3. (Véase Almagro y Fransson, Front. Biosci. 13:1619 a 1633 (2008). A menos que se indique lo contrario, los residuos HVR y otros residuos en el dominio variable (por ejemplo, residuos FR) se numeran en el presente documento de acuerdo con Kabat et al., supra.

Un "anticuerpo humano" es aquel que comprende una secuencia de aminoácidos correspondiente a la de un anticuerpo producido por un ser humano y/o que se ha fabricado mediante el uso de cualquiera de las técnicas para fabricar anticuerpos humanos descritas en el presente documento. Dichas técnicas incluyen el cribado de bibliotecas combinatorias derivadas de humanos, como las bibliotecas de visualización de fagos (véase, por ejemplo, Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991) y Hoogenboom et al., Nucl. Acids Res., 19: 4133-4137 (1991)); la utilización de líneas celulares de mieloma humano y de heteromieloma ratón-humano para la producción de anticuerpos monoclonales humanos (véase, por ejemplo, Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984) Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 55-93 (Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1987); y Boerner et al., J. Immunol, 147. (1994): 86 (1991)); y la generación de anticuerpos monoclonales en animales transgénicos (por ejemplo, ratones) capaces de producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en ausencia de producción endógena de inmunoglobulinas (véase, por ejemplo, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 90: 2551 (1993) ; Jakobovits et al., Nature, 362: 255 (1993) Bruggermann y otros, Year in Immunol, 7: 33(1993). Esta definición de anticuerpo humano excluye específicamente un anticuerpo humanizado que comprenda residuos de unión a antígeno procedentes de un animal no humano.

Un anticuerpo "madurado por afinidad" es aquel con una o más alteraciones en una o más CDRs del mismo que resultan en una mejora de la afinidad del anticuerpo por el antígeno, en comparación con un anticuerpo progenitor que no posee dicha(s) alteración(es). En una realización, un anticuerpo madurado por afinidad tiene afinidades nanomolares o incluso picomolares por el antígeno diana. Los anticuerpos madurados por afinidad se producen por medio de procedimientos conocidos en la técnica. Marks et al. Bio/Technology 10:779-783 (1992) describe la maduración de la afinidad por medio de la reorganización de los dominios VH y v L. La mutagénesis aleatoria de los residuos HVR y/o del armazón se describe a continuación: Barbas et al. Proc Nat. Acad. Sci. USA 91:3809-3813 (1994) ; Schier et al. Gene 169:147-155 (1995); Yelton et al. J. Immunol. 1912 a 2004 (1995) Wu XR, et al., J. Surg.155:1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995); and Hawkins et al, J. Mol. Biol.

226:889 a 896 (1992).

Un "anticuerpo bloqueante" o un "anticuerpo antagonista" es aquel que inhibe o reduce una actividad biológica del antígeno al que se une. Ciertos anticuerpos bloqueantes o anticuerpos antagonistas inhiben parcial o totalmente la actividad biológica del antígeno.

La "clase" de un anticuerpo se refiere al tipo de dominio constante o región constante que posee su cadena pesada. Existen cinco clases principales de anticuerpos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de ellas se pueden dividir a su vez en subclases (isotipos), por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2. Los dominios constantes de la cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas se denominan a, 8, £, y y M, respectivamente. Como se utiliza en la presente memoria, el "anticuerpo anti-IL13", también denominado lebrikizumab, significa un anticuerpo IgG4 humanizado que se une a la IL13 humana. El anticuerpo anti-IL13 en la formulación de la presente invención comprende tres Cd R de cadena pesada, CDR-H1 (SEC ID No .: 1), CDR-H2 (SEC ID NO.: 2), and CDR-H3 (SEC ID NO.: 3). El anticuerpo anti-IL13 en la formulación de la presente invención comprende tres CDR de cadena ligera, CDR-L1 (SEC ID NO.: 1), CDR-H2 (SEC ID NO.: 2), and CDR-H3 (SEC ID NO.: 6). Por lo tanto, el anticuerpo anti-IL13 empleado comprende tres CDRs de cadena pesada y tres CDRs de cadena ligera, CDR-H1 (SEC ID NO.: 1), CDR-H2 (SEC ID NO.: 1), CDR-H2 (SEC ID NO.: 1), CDR-H2 (SEC ID NO.: 1), CDR-H2 (SEC ID NO.: 2), and CDR-H3 (SEC ID NO.: 6). El anticuerpo anti-IL13 de la formulación proporcionada comprende una región de cadena pesada variable, VH, que tiene una secuencia de aminoácidos de SEC ID NO. 7. El anticuerpo anti-IL13 de la formulación proporcionada comprende una región de cadena ligera variable, VL, que tiene la secuencia de aminoácidos de s Ec ID NO.: 9. Por lo tanto, el anticuerpo anti-IL13 de la formulación proporcionada comprende una región de cadena pesada variable, VH, que tiene una secuencia de aminoácidos de SEC ID NO. 7 y una cadena de región ligera variable (VL) que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID Núm.: 9. El anticuerpo anti-IL13 en la formulación de la presente invención comprende una cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO.: 10 y una cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID Núm.: 14. Los anticuerpos anti-IL13 se describen con más detalle en Intn'1 Pub. Número 2005/062967. Una molécula biológica "aislada", tal como un ácido nucleico, un polipéptido o un anticuerpo, es aquella que ha sido identificada y separada y/o recuperada de al menos un componente de su entorno natural.

Un "dispositivo de administración subcutánea" se refiere a un dispositivo que está adaptado o diseñado para administrar un fármaco, por ejemplo un anticuerpo terapéutico, o una formulación farmacéutica por vía subcutánea. Los dispositivos de administración subcutánea ejemplares incluyen, entre otros, una jeringa, incluida una jeringa precargada, un dispositivo de inyección, una bomba de infusión, una pluma inyectora, un dispositivo sin aguja y un sistema de administración de parches. Un dispositivo de administración subcutánea administra un volumen determinado de la formulación farmacéutica, por ejemplo 1,0 mL, 1,25 mL, 1,5 mL, 1,75 mL o 2,0 mL.

Un "prospecto" o "etiqueta" se utiliza para referirse a las instrucciones incluidas habitualmente en los envases comerciales de productos terapéuticos o medicamentos, que contienen información sobre las indicaciones, uso, dosificación, administración, contraindicaciones, otros productos terapéuticos que se deben combinar con el producto envasado, y/o advertencias relativas al uso de dichos productos terapéuticos o medicamentos y similares. Un "kit" es cualquier fabricación (por ejemplo, un envase o contenedor) que comprenda al menos un reactivo, por ejemplo, un medicamento para el tratamiento del asma u otro trastorno pulmonar.

Un "público objetivo" es un grupo de personas o una institución a la que se promociona o se pretende promocionar un medicamento concreto, por ejemplo por medio de marketing o publicidad, especialmente para usos, tratamientos o indicaciones concretos, tales como pacientes individuales, poblaciones de pacientes, lectores de periódicos, literatura médica y revistas, telespectadores o internautas, oyentes de radio o internet, médicos, empresas farmacéuticas, etc.

El término "muestra de suero" se refiere a cualquier muestra de suero obtenida de un individuo. Los procedimientos para obtener sueros de mamíferos son bien conocidos en la técnica.

El término "sangre total" se refiere a cualquier muestra de sangre total obtenida de un individuo. Normalmente, la sangre total contiene todos los componentes sanguíneos, por ejemplo, los componentes celulares y el plasma. Los procedimientos para obtener sangre total de mamíferos son bien conocidos en la técnica.

La "cantidad" o "nivel" de un biomarcador asociado con un mayor beneficio clínico para un paciente que padece una determinada enfermedad o trastorno, o predictivo de la respuesta a un agente terapéutico o régimen de tratamiento concreto, es un nivel detectable en una muestra biológica. Estos se pueden medir por medio de procedimientos conocidos por los expertos en la técnica y que también se describen en el presente documento. El nivel de expresión o la cantidad de biomarcador evaluado se puede utilizar para determinar la respuesta o la respuesta prevista a un tratamiento o agente terapéutico.

Los términos "nivel de expresión" o "nivel de expresión" en general se utilizan indistintamente y generalmente se refieren a la cantidad de un producto aminoácido o proteína en una muestra biológica. "Expresión" se refiere generalmente al proceso por el cual la información codificada por genes se convierte en estructuras presentes y operativas en la célula. Por lo tanto, como se utiliza en el presente documento, la "expresión" de un gen se puede referir a la transcripción en un polinucleótido, la traducción en una proteína o incluso la modificación postraduccional de la proteína.

Asma y otras enfermedades pulmonares y determinadas enfermedades alérgicas, autoinmunes y otras enfermedades inflamatorias

El asma se describe como una enfermedad pulmonar crónica que implica inflamación, hiperreactividad y obstrucción de las vías respiratorias. Fisiológicamente, la hiperreactividad de las vías respiratorias se documenta por la disminución del flujo bronquial tras la broncoprovocación con metacolina o histamina. Otros desencadenantes que provocan la obstrucción de las vías respiratorias son el aire frío, el ejercicio, las infecciones víricas de las vías respiratorias altas, el humo del tabaco y los alérgenos respiratorios. La provocación bronquial con alérgenos induce una rápida disminución del flujo de aire bronquial mediada por inmunoglobulina E (IgE) en la fase inicial, seguida en muchos pacientes por una reacción mediada por IgE en la fase tardía con una disminución del flujo de aire bronquial durante 4-8 horas. La respuesta temprana está causada por la liberación aguda de sustancias inflamatorias, tales como histamina, PGD-2-, leucotrieno, triptasa y factor activador de plaquetas (PAF), mientras que la respuesta tardía está causada por citocinas proinflamatorias sintetizadas de novo (por ejemplo, TNFa, IL4, IL13) y quimiocinas (por ejemplo, MCP-1 y MIP-1a) (Busse et al. En: Alergia: Principios y práctica, Ed. Middleston 1173 (1998). En los pacientes asmáticos crónicos, los síntomas pulmonares persistentes están mediados por la respuesta aumentada de las células Th2. Se cree que las citocinas Th2 desempeñan un papel vital en la enfermedad (Larche et al., J. Allergy Clin. Immunol., 111: 450 (2003)), en particular, IL13 e IL4 producidas por células Th2 con fenotipo NK (NKT) en las vías respiratorias, como se indica en un modelo de asma en roedores (Akbari et al., Nature Med., 9: 582(2003). La patología macroscópica de las vías respiratorias asmáticas muestra hiperinsuflación pulmonar, hipertrofia del músculo liso, engrosamiento de la lámina reticular, edema de la mucosa, descamación de las células epiteliales, alteración de las células ciliadas e hipersecreción de las glándulas mucosas. Microscópicamente, el asma se caracteriza por la presencia de un mayor número de eosinófilos, neutrófilos, linfocitos y células plasmáticas en los tejidos bronquiales, las secreciones bronquiales y el moco. Inicialmente, se produce un reclutamiento de leucocitos del torrente sanguíneo a las vías respiratorias por parte de linfocitos T CD4+ activados. Los linfocitos T activados también dirigen la liberación de mediadores inflamatorios procedentes de eosinófilos, mastocitos y linfocitos. Además, las células Th2 producen IL4, IL5, IL9 e IL13. La IL4, junto con la IL13, señala el cambio de anticuerpos IgM a IgE.

La reticulación de las moléculas de IgE unidas a la membrana por el alérgeno hace que los mastocitos degranulen, liberando histamina, leucotrienos y otros mediadores que perpetúan la inflamación de las vías respiratorias. La IL5 activa el reclutamiento y la activación de los eosinófilos. Los mastocitos y eosinófilos activados también generan sus citocinas que contribuyen a perpetuar la inflamación. Estos ciclos repetidos de inflamación en los pulmones con lesión de los tejidos pulmonares seguida de reparación pueden producir cambios estructurales a largo plazo ("remodelación") de las vías respiratorias.

El asma moderada se trata actualmente con un antiinflamatorio-corticosteroide inhalado diario o un inhibidor de mastocitos, tal como cromoglicato sódico o nedocromilo, más un agonista beta2 inhalado según sea necesario (3-4 veces al día) para aliviar los síntomas iniciales o el asma inducida por alérgenos o ejercicio. El cromoglicato sódico y el nedocromilo bloquean el broncoespasmo y la inflamación, pero suelen ser eficaces sólo para el asma asociada a alérgenos o al ejercicio y, por lo general, sólo para los asmáticos juveniles. Los corticosteroides inhalados mejoran la inflamación, la hiperreactividad de las vías respiratorias y la obstrucción, y reducen el número de exacerbaciones agudas. Sin embargo, los efectos tardan al menos un mes en manifestarse y hasta un año en producirse una mejora notable. Los efectos secundarios más frecuentes son la ronquera y la infección oral por hongos, es decir, la candidiasis. Se han notificado efectos secundarios más graves, por ejemplo, supresión suprarrenal parcial, inhibición del crecimiento y reducción de la formación ósea, pero sólo con el uso de dosis más altas. La beclometasona, la triamcinolona y la flunisolida tienen probablemente una potencia similar, mientras que la budesonida y la fluticasona son más potentes y, al parecer, tienen menos efectos secundarios sistémicos.

Incluso los pacientes con enfermedad leve muestran inflamación de las vías respiratorias, incluida la infiltración de la mucosa y el epitelio con células T activadas, mastocitos y eosinófilos. Los linfocitos T y los mastocitos liberan citocinas que promueven el crecimiento y la maduración de los eosinófilos y la producción de anticuerpos IgE, y éstos, a su vez, aumentan la permeabilidad microvascular, alteran el epitelio y estimulan los reflejos neurales y las glándulas secretoras de moco. El resultado es una hiperreactividad de las vías respiratorias, broncoconstricción e hipersecreción, que se manifiesta por sibilancias, tos y disnea.

Tradicionalmente, el asma se ha tratado con broncodilatadores orales e inhalados. Estos agentes alivian los síntomas del asma, pero no hacen nada contra la inflamación subyacente. El reconocimiento durante la última década de la importancia de la inflamación en la etiología del asma ha llevado a un mayor uso de corticosteroides, pero muchos pacientes siguen padeciendo asma no controlada.

Además del asma, otras enfermedades que pueden tratarse con las formulaciones de la invención incluyen alergia, enfermedad autoinmune u otras enfermedades inflamatorias. Otras enfermedades alérgicas incluyen la rinitis alérgica, la dermatitis atópica, la hipersensibilidad alimentaria y la urticaria; las enfermedades cutáneas inmunomediadas incluyen las enfermedades cutáneas bullosas, el eritema multiforme y la dermatitis de contacto; las enfermedades autoinmunes incluyen la psoriasis, la artritis reumatoide, la artritis crónica juvenil; las enfermedades inflamatorias intestinales (es decir, colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn); otras enfermedades asociadas a la IL13 incluyen la neumonía intersticial idiopática, la metaplasia de células caliciformes, enfermedades pulmonares inflamatorias y fibróticas como la fibrosis quística, la enteropatía sensible al gluten y la enfermedad de Whipple; enfermedades inmunológicas del pulmón como neumonía eosinofílica, fibrosis pulmonar idiopática y neumonitis por hipersensibilidad; enfermedad pulmonar obstructiva crónica, infección por VRS, uvelitis, esclerodermia, osteoporosis y linfoma de Hodgkin.

La fibrosis pulmonar idiopática (FPI) es un trastorno susceptible de tratamiento con las formulaciones de la invención. La FPI es una enfermedad pulmonar restrictiva caracterizada por la fibrosis intersticial progresiva del parénquima pulmonar, que afecta aproximadamente a 100.000 pacientes en Estados Unidos (Raghu et al., Am J Respir Crit Care Med 174:810-816 (2006)). Esta fibrosis intersticial asociada a la FPI conduce a una pérdida progresiva de la función pulmonar, lo que provoca la muerte por insuficiencia respiratoria en la mayoría de los pacientes. La mediana de supervivencia desde el momento del diagnóstico es de 2-3 años (Raghu et al., Am J Respir Crit Care Med 183:788-824 (2011)). Se desconocen la etiología y los principales factores moleculares y fisiopatológicos de la FPI. El único tratamiento que ha demostrado prolongar la supervivencia de los pacientes con FPI es el trasplante de pulmón (Thabut et al., Annals of internal medicine 151:767-774 (2009)). Sin embargo, el trasplante de pulmón se asocia a una morbilidad considerable, no todos los pacientes con FPI son candidatos apropiados para ello y existe una relativa escasez de pulmones de donantes adecuados. A pesar de los numerosos intentos, hasta la fecha ningún tratamiento farmacológico ha demostrado prolongar sustancialmente la supervivencia en un ensayo de intervención aleatorizado y controlado con placebo en pacientes con FPI, aunque algunas intervenciones han parecido ralentizar el ritmo de deterioro de la función pulmonar en algunos pacientes (Raghu et al., Am J Respir Crit Care Med 183:788-824 (2011); Richeldi et al., The New England J. of Med. 365:1079 a 1087 (2011)).

Aunque el pronóstico para todos los pacientes con FPI es nefasto, existe una considerable heterogeneidad en la trayectoria de la enfermedad (Raghu et al., Am J Respir Crit Care Med 183:788-824 (2011)). Algunos pacientes presentan un curso relativamente indolente, perdiendo la función pulmonar a un ritmo relativamente constante durante 10 años o más, mientras que otros experimentan un deterioro más rápido de la función pulmonar, sucumbiendo a la muerte en uno o dos años tras el diagnóstico. Además, algunos pacientes sufren exacerbaciones agudas de la enfermedad, que suelen caracterizarse por descensos drásticos y repentinos de la función pulmonar. Por lo general, estos pacientes no se recuperan totalmente tras el episodio agudo y a menudo fallecen durante o poco después de una exacerbación. Esta heterogeneidad en la trayectoria de la enfermedad sugiere que diferentes pacientes con FPI pueden tener diferentes factores fisiopatológicos subyacentes a su enfermedad, que pueden ser diferencialmente susceptibles a terapias molecularmente dirigidas como las formulaciones de la invención.

La inflamación eosinofílica se asocia a diversas enfermedades, tanto alérgicas como no alérgicas (Gonlugur (2006) Immunol. Investigación. 35(1):29-45). La inflamación es una respuesta reparadora de los tejidos vivos a las lesiones. Una característica de las reacciones inflamatorias es la acumulación de leucocitos en el tejido lesionado debido a determinadas sustancias químicas producidas en el propio tejido. Los leucocitos eosinófilos se acumulan en una amplia variedad de afecciones, tales como trastornos alérgicos, infecciones por helmintos y enfermedades neoplásicas (Kudlacz et al., (2002) Inflammation 26: 111-119). Los leucocitos eosinófilos, un componente del sistema inmunitario, son elementos defensivos de las superficies mucosas. No sólo responden a los antígenos, sino también a los parásitos, las sustancias químicas y los traumatismos.

La eosinofilia tisular se produce en enfermedades cutáneas tales como el eccema, el pénfigo, la urticaria aguda y la necrólisis epidérmica tóxica, así como en la dermatitis atópica ([Rzany et al., 1996]). Los eosinófilos se acumulan en el tejido y vacían las proteínas de los gránulos en las reacciones alérgicas cutáneas mediadas por IgE ([Nielsen et al., 2001]). Es probable que los eosinófilos combinados con mastocitos causen inflamación articular (Miossec et al., 1997). La inflamación eosinofílica acompaña a veces a los traumatismos articulares. La eosinofilia del líquido sinovial puede asociarse a enfermedades tales como la artritis reumatoide, las enfermedades parasitarias, el síndrome hipereosinofílico, la enfermedad de Lyme y los procesos alérgicos, así como a la hemartrosis y la artrografía ([Atañes et al., 1996]). La inflamación eosinofílica también puede afectar a los huesos ([Yetiser et al., 2002]). Algunos ejemplos de enfermedad muscular eosinofílica son la perimiositis eosinofílica, la polimiositis eosinofílica y la miositis eosinofílica focal ([Lakhanpal et al., 1988]). Las inflamaciones eosinofílicas que afectan a los músculos esqueléticos pueden estar asociadas a infecciones por parásitos o fármacos o a características de algunos trastornos sistémicos de hipereosinofilia (por ejemplo, el síndrome hipereosinofílico idiopático y el síndrome eosinofilia-mialgia. Los eosinófilos participan en la respuesta inflamatoria a los epítopos reconocidos por los anticuerpos autoinmunes ([Engineer et al., 2001]). Las enfermedades del tejido conjuntivo pueden dar lugar a inflamaciones vasculares neutrófilas, eosinofílicas o linfocíticas ([Chen et al., 1996]). La eosinofilia tisular y en sangre periférica puede aparecer en enfermedades reumáticas activas. La elevación de los niveles séricos de ECP en la espondilitis anquilosante, un tipo de enfermedad del tejido conjuntivo, sugiere que los eosinófilos también están implicados en el proceso subyacente (Feltelius et al., 1987). La granulomatosis de Wegener puede presentarse raramente con nódulos pulmonares, derrame pleural y eosinofilia en sangre periférica ([Krupsky et al., 1993]).

La eosinofilia en sangre periférica de al menos 400/mm3 puede darse en el 7% de los casos de esclerosis sistémica, en el 31% de los casos de esclerodermia localizada y en el 61% de los casos de fascitis eosinofílica ([Falanga y Medsger, 1987]). La esclerodermia produce un proceso inflamatorio muy parecido a los plexos de Meissner y de Auerbach y consiste en mastocitos y leucocitos eosinófilos en el sistema gastrointestinal. Las neurotoxinas derivadas de los eosinófilos pueden contribuir a la disfunción motora gastrointestinal, como ocurre en la esclerodermia ([de Schryver Kecskemeti y Clouse, 1989]).

Los eosinófilos pueden acompañar a la proliferación localizada ([Varga y Kahari, 1997]) o sistémica ([Bouros et al., 2002]) del tejido conjuntivo. Pueden incitar a la fibrosis inhibiendo la degradación del proteoglicano en los fibroblastos ([Hernnas et al., 1992]), y los fibroblastos median en la supervivencia de los eosinófilos secretando GM-CSF ([Vancheri et al., 1989]). Los eosinófilos pueden encontrarse en tejidos de pólipos nasales ([Bacherct et al., 2001]), bronquiales ([Arguelles y Blanco, 1983]) y gastrointestinales ([Assarian y Sundareson, 1985]). Asimismo, los eosinófilos pueden localizarse en pseudotumores inflamatorios (tumor miofibroblástico). Los eosinófilos suelen acompañar a los pseudotumores inflamatorios en la región orbitaria, en cuyo caso la afección puede simular un angioedema o una rinoconjuntivitis alérgica ([Li et al., 1992]).

La inflamación eosinofílica puede encontrarse en traumatismos tisulares (por ejemplo, como resultado de una cirugía o lesión). La inflamación eosinofílica también puede asociarse a enfermedades cardiovasculares (por ejemplo, miocarditis eosinofílica, arteritis coronaria eosinofílica, cardiopatía isquémica, infarto agudo de miocardio, rotura cardiaca). Los procesos inflamatorios necróticos también pueden implicar inflamación eosinofílica (polimiositis, disección de arterias coronarias, lesiones necrotizantes de la enfermedad de neuro-Behcet, demencia, infarto cerebral).

Determinados agentes terapéuticos

El agente terapéutico para el tratamiento del asma y otras enfermedades pulmonares puede ser un anticuerpo anti-IL13, también denominado lebrikizumab. El lebrikizumab es un anticuerpo IgG4. El anticuerpo anti-IL13 comprende tres CDR de cadena pesada, CDR-H1 (SEC ID NO.: 1), CDR-H2 (SEC ID NO.: 2), y CDR-H3 (SEC ID NO.: 3). El anticuerpo anti-IL13 comprende tres CDR de cadena ligera, CDR-L1 (SEC ID NO.: 1), CDR-L2 (SEC ID NO.: 2), y CDR-L3 (SEC ID NO.: 6). Por lo tanto, el anticuerpo anti-IL13 comprende tres CDR de cadena pesada y tres CDR de cadena ligera, CDR-H1 (SEC ID NO.: 1), CDR-H2 (SEC ID NO.: 1), CDR-H3 (SEC ID NO.: 1), CDR-L1 (SEC ID NO.: 1), CDR-L2 (SEC ID NO.: 2), y CDR-L3 (SEC ID NO.: 6). El anticuerpo anti-IL13 presente en la formulación proporcionada comprende una región de cadena pesada variable, VH, que tiene una secuencia de aminoácidos de SEC ID NO. 7. El anticuerpo anti-IL13 presente en la formulación proporcionada comprende una región de cadena ligera variable, VL, que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO.: 9. El anticuerpo anti-IL13 presente en la formulación proporcionada comprende una región de cadena pesada variable, VH, que tiene una secuencia de aminoácidos de SEC ID NO. 7 y una cadena de región ligera variable (VL) que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID Núm.: 9. El anticuerpo anti-IL13 presente en la formulación de la invención comprende una cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO.: 10 y una cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID Núm.: 14. Los anticuerpos anti-IL13 se describen con más detalle en Intn'1 Pub. Nro.

2005/062967.

Ciertos biomarcadores moleculares

En ciertos casos, los biomarcadores, por ejemplo, biomarcadores séricos, se cuantifican en una muestra biológica obtenida de un paciente como medio de seleccionar pacientes para el tratamiento con un agente terapéutico dado. Las Solicitudes de EE.UU. n° 61/459760, 61/465425, 61/484650y 61/574485 ("Diagnóstico y tratamientos relacionados con la inhibición de TH2") describen un ensayo de periostina y procedimientos de selección de pacientes para el tratamiento con las formulaciones de anticuerpos anti-IL13 descritas en la presente memoria. Técnicas generales de formulación

Las formulaciones que comprenden anticuerpos anti-IL13 pueden prepararse y analizarse mediante el uso de ciertos excipientes y técnicas conocidos en la técnica y como se describe más adelante. En ciertas realizaciones, el anticuerpo a formular no ha sido sometido a liofilización previa y la formulación de interés en el presente documento es una formulación acuosa. La cantidad terapéuticamente eficaz de anticuerpo presente en la formulación se determina teniendo en cuenta los volúmenes de dosis deseados y el modo o modos de administración, por ejemplo. La formulación de la presente invención comprende al menos 100 mg/ml del anticuerpo anti-IL13. De 100 mg/mL a 250 mg/mL, o de 100 mg/mL a 200 mg/mL o de 100 mg/mL a 175 mg/mL es una concentración ejemplar de anticuerpo en la formulación. En una realización, el anticuerpo anti-IL13 se formula a una concentración de 125 mg/mL. En una realización, el anticuerpo anti-IL13 se formula a una concentración de 150 mg/mL.

Se prepara una formulación acuosa que comprende el anticuerpo en una solución de pH tamponado. La formulación de la invención contiene acetato de histidina en una concentración de 5 mM a 40 mM. En una realización, el tampón es acetato de histidina 20 mM, pH 5,7.

En la formulación de anticuerpos se incluye un tensioactivo. Los tensioactivos ejemplares incluyen tensioactivos no iónicos tales como polisorbatos (por ejemplo, polisorbatos 20, 80, etc.) o poloxámeros (por ejemplo, poloxámero 188). La cantidad de tensioactivo añadido es tal que reduce la agregación del anticuerpo formulado y/o minimiza la formación de partículas en la formulación y/o reduce la adsorción. La formulación de anticuerpos de la presente invención incluye polisorbato 20 como tensioactivo a una concentración de entre el 0,01% y el 0,1%. En una realización, el tensioactivo es polisorbato 20 presente en la formulación en una cantidad del 0,03%.

En una realización, la formulación contiene los agentes identificados anteriormente (por ejemplo, anticuerpo, tampón y tensioactivo) y está esencialmente libre de uno o más conservantes, tales como alcohol bencílico, fenol, m-cresol, clorobutanol y Cl de bencetonio. En una realización, la formulación no contiene conservantes. En otra realización, puede incluirse un conservante en la formulación, especialmente cuando se trata de una formulación multidosis. La concentración de conservante puede oscilar entre el 0,1% y el 2%, o entre el 0,5% y el 1%. Uno o más portadores, excipientes o estabilizantes farmacéuticamente aceptables tales como los descritos en Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edición, Osol, A. Ed. (1980) podrán incluirse en la formulación siempre que no afecten negativamente a las características deseadas de la misma. Los portadores, excipientes o estabilizadores aceptables no son tóxicos para los receptores en las dosis y concentraciones empleadas e incluyen: agentes tamponadores adicionales; co­ solventes; antioxidantes incluyendo ácido ascórbico y metionina; agentes quelantes como EDTA; complejos metálicos (por ejemplo, complejos Zn-proteína); polímeros biodegradables como poliésteres; y/o contraiones formadores de sal.

Aunque las diversas descripciones de los quelantes expuestas en la presente memoria se centran a menudo en el EDTA, se apreciará que también se incluyen otros quelantes de iones metálicos. Los quelantes de iones metálicos son bien conocidos por los expertos en la técnica e incluyen, entre otros, aminopolicarboxilatos, EDTA (ácido etilendiaminotetraacético), EGTA (ácido etilenglicolbis(beta-aminoetil éter)-N,N,N',N'-tetraacético), NTA (ácido nitrilotriacético), EDDS (disuccinato de etilendiamina), PDTA (ácido 1,3-propilendiaminotetraacético), DTPA (ácido dietilentriaminopentaacético), ADA (ácido beta-alaninediacético), MGCA (ácido metilglicinediacético), etc. Además, algunas realizaciones del presente documento comprenden quelantes de fosfonatos/ácidos fosfónicos. En ciertas realizaciones, la formulación contiene metionina.

Los agentes de tonicidad, a veces conocidos como "estabilizadores", están presentes para ajustar o mantener la tonicidad de una composición líquida. Cuando se utilizan con biomoléculas grandes y cargadas, tales como proteínas y anticuerpos, suelen denominarse "estabilizadores" porque pueden interactuar con los grupos cargados de las cadenas laterales de aminoácidos, para de este modo reducir el potencial de interacciones inter e intramoleculares. Los agentes tonificantes pueden estar presentes en cualquier cantidad comprendida entre el 0,1% y el 25% en peso, o entre el 1 y el 5%, teniendo en cuenta las cantidades relativas de los demás ingredientes. Los agentes tonificantes incluyen alcoholes de azúcar polihídricos, alcoholes de azúcar trihídricos o superiores, tales como la glicerina, el eritritol, el arabitol, el xilitol, el sorbitol y el manitol.

Los estabilizantes adicionales incluyen una amplia gama de excipientes cuya función varía desde agentes de volumen a potenciadores de la solubilidad, pasando por agentes que evitan la desnaturalización o la adherencia a la pared del envase. Los estabilizadores pueden estar presentes en un intervalo de 0,1 a 10.000 partes por peso de proteína activa o anticuerpo. Los estabilizantes típicos incluyen: alcoholes de azúcar polihídricos (enumerados anteriormente); aminoácidos tales como alanina, glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, lisina, ornitina, leucina, 2-fenilalanina, ácido glutámico, treonina, etc.azúcares orgánicos o alcoholes de azúcar tales como sacarosa, lactosa, lactitol, trehalosa, estaquiosa, manosa, sorbosa, xilosa, ribosa, ribitol, mioinisitosa, mioinisitol, galactosa, galactitol, glicerol, ciclitoles (p. ej., inositol), polietilenglicol; agentes reductores que contengan azufre, tales como urea, glutatión, ácido tióctico, tioglicolato de sodio, tioglicerol, a-monototioglicerol y tiosulfato de sodio; proteínas de bajo peso molecular, tales como seroalbúmina humana, seroalbúmina bovina, gelatina u otras inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos, tales como polivinilpirrolidona; monosacáridos (por ejemplo, xilosa, manosa, fructosa, glucosa; disacáridos (por ejemplo, lactosa, maltosa, sacarosa); trisacáridos tales como la rafinosa; y polisacáridos tales como la dextrina o el dextrano.

Los tensioactivos o detergentes no iónicos (también conocidos como "agentes humectantes") están presentes para ayudar a solubilizar el agente terapéutico, así como para proteger la proteína terapéutica contra la agregación inducida por la agitación, lo que también permite que la formulación esté expuesta a la tensión superficial de cizallamiento sin causar la desnaturalización de la proteína terapéutica activa o anticuerpo. Los tensioactivos no iónicos están presentes en un intervalo de 0,05 mg/ml a 1,0 mg/ml, preferentemente de 0,07 mg/ml a 0,2 mg/ml. Entre los tensioactivos no iónicos adecuados se incluyen polisorbatos (20, 40, 60, 65, 80, etc.), polioxámeros (184, 188, etc.), polioles Pluronic®, Triton®, monoéteres de sorbitán polioxietilenados (Tween®-20, Tween®-80, etc.), lauromacrogol 400, estearato de polioxilo 40, aceite de ricino hidrogenado 10, 50 y 60, monoestearato de glicerol, ácido graso de sacarosa, aceite de ricino hidrogenado 10, 50, 60, etc.), lauromacrogol 400, estearato de polioxilo 40, aceite de ricino hidrogenado polioxietilenado 10, 50 y 60, monoestearato de glicerol, éster de ácidos grasos de sacarosa, metilcelulosa y carboximetilcelulosa. La formulación de anticuerpos de la presente invención incluye polisorbato 20 como tensioactivo a una concentración de entre el 0,01% y el 0,1% . Entre los detergentes aniónicos que pueden utilizarse se encuentran el lauril sulfato sódico, el sulfosuccinato dioctil sódico y el sulfonato dioctil sódico. Los detergentes catiónicos incluyen el cloruro de benzalconio o el cloruro de bencetonio.

Existen varias técnicas analíticas para medir la estabilidad de las proteínas y se revisan en el documento Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Pubs. (1991) y Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90 (1993), por ejemplo. La estabilidad puede medirse a una temperatura seleccionada durante un período de tiempo seleccionado. En ciertas realizaciones, la formulación es estable a 40°C durante al menos 2-4 semanas, y/o estable a 5°C durante al menos 3 meses, y/o estable a 5°C durante al menos 6 meses, y/o estable a 5°C durante al menos 12 meses y/o estable a -20°C durante al menos 3 meses o al menos 1 año. En ciertas realizaciones, la formulación es estable a 25°C durante al menos 6 meses y/o estable a 25°C durante 12 meses, y/o estable a 5°C durante 6 meses, y/o estable a 5°C durante 12 meses, y/o estable a -20°C durante al menos 6 meses, y/o estable a -20°C durante al menos 12 meses, y/o estable a 5°C o -20°C durante al menos dos años. En ciertas realizaciones, la formulación es estable tras la congelación (a, por ejemplo, -70°C) y descongelación de la formulación, por ejemplo tras 1, 2 o 3 ciclos de congelación y descongelación. La estabilidad puede evaluarse cualitativa y/o cuantitativamente de diversas maneras, incluida la evaluación de la formación de agregados (por ejemplo, por medio de cromatografía de exclusión por tamaño, midiendo la turbidez y/o mediante inspección visual); por medio de la evaluación de la heterogeneidad de carga utilizando cromatografía de intercambio catiónico, enfoque isoeléctrico capilar por imagen (icIEF) o electroforesis de zona capilar; análisis de la secuencia aminoterminal o carboxi-terminal; análisis de espectrometría de masas; análisis SDS-PAGE para comparar el anticuerpo reducido y el intacto; análisis del mapa peptídico (por ejemplo tríptico o LYS-C); evaluación de la actividad biológica o de la función de unión al antígeno del anticuerpo; etc. La inestabilidad puede implicar uno o más de los siguientes factores: agregación, desamidación (por ejemplo, desamidación de Asn), oxidación (por ejemplo, oxidación de Met), isomerización (por ejemplo, isomerización de Asp), recorte/hidrólisis/fragmentación (por ejemplo, fragmentación de la región bisagra), formación de succinimida, cisteína(s) no apareada(s), extensión N-terminal, procesamiento C-terminal, diferencias de glicosilación, etc.

Las formulaciones que se utilicen para la administración in vivo deben ser estériles. Esto se consigue fácilmente por filtración a través de membranas de filtración estériles, antes o después de la preparación de la formulación.

Un agente terapéutico puede administrarse de acuerdo con procedimientos conocidos, tales como la administración intravenosa en bolo o por infusión continua durante un periodo de tiempo, por vía intramuscular, intraperitoneal, intracerobrospinal, subcutánea, intraarticular, intrasinovial, intratecal, oral, tópica o por inhalación. Opcionalmente, la administración se puede llevar a cabo por medio de infusión con minibomba mediante el uso de diversos dispositivos disponibles en el mercado.

La presente formulación también puede contener más de un compuesto activo según sea necesario para la indicación particular que se esté tratando, preferentemente aquellos con actividades complementarias que no se afecten adversamente entre sí. Alternativamente, o además, la composición puede comprender un agente citotóxico, una citocina o un agente inhibidor del crecimiento. Dichas moléculas están convenientemente presentes en combinación en cantidades que son eficaces para el fin previsto.

Los principios activos también pueden quedar atrapados en microcápsulas preparadas, por ejemplo, por medio de técnicas de coacervación o por medio de polimerización interfacial, por ejemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulosa o gelatina y microcápsulas de poli(metilmetacilato), respectivamente, en sistemas coloidales de administración de fármacos (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Dichas técnicas se describen en el documento Remington's Pharmaceutical Sciences 18th edition, supra.

Pueden prepararse preparados de liberación sostenida. Ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el anticuerpo, cuyas matrices se presentan en forma de artículos moldeados, por ejemplo películas, o microcápsulas. Entre los ejemplos de matrices de liberación sostenida se incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli(2-hidroxietilmetacrilato) o poli(vinilalcohol)), polilactidas (Patente estadounidense n.° 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutámico y Y-etil-L-glutamato, etilvinilacetato no degradable, copolímeros degradables de ácido láctico y ácido glicólico como el LUPRON DEPOTTM (microesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido láctico y ácido glicólico y acetato de leuprolida), y poli-D-(-)-3-ácido hidroxibutírico. La microencapsulación de proteínas recombinantes para su liberación sostenida se ha llevado a cabo con éxito con la hormona del crecimiento humano (rhGH), el interferón (rhIFN-), la interleucina-2 y la MN rpg 120. Johnson et al., Nat. Med. 2: 795-799 (1996); Yasuda et al., Biomed. Ther.

27: 1221-1223 (1993); Hora et al., Bio/Technology 8: 755-758 (1990) Cleland, "Design and Production of Single Immunization Vaccines Using Polylactide Polyglycolide Microsphere Systems", en Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach, Powell y Newman, eds., (Plenum Press: Nueva York, 1995), pp. 439-462 WO 97/03692 WO 96/40072 WO 96/07399y U.S. Pat. N° 5.654.010.

Las formulaciones de liberación sostenida de estas proteínas pueden desarrollarse mediante el uso de polímero de ácido poli-láctico-coglicólico (PLGA) debido a su biocompatibilidad y amplia gama de propiedades biodegradables. Los productos de degradación del PLGA, los ácidos láctico y glicólico, pueden eliminarse rápidamente en el cuerpo humano. Además, la degradabilidad de este polímero puede ajustarse de meses a años en función de su peso molecular y composición. Lewis, "Controlled release of bioactive agents from lactide/glycolide polymer", en Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems (Marcel Dekker; New York, 1990), M. Chasin y R. Langer (Eds.) pp. 1-41.

Mientras que polímeros como el etilvinilacetato y el ácido láctico-glicólico permiten la liberación de moléculas durante más de 100 días, ciertos hidrogeles liberan proteínas durante periodos de tiempo más cortos. Cuando los anticuerpos encapsulados permanecen en el cuerpo durante mucho tiempo, pueden desnaturalizarse o agregarse como resultado de la exposición a la humedad a 37°C, lo que resulta en una pérdida de actividad biológica y posibles cambios en la inmunogenicidad. Se pueden concebir estrategias racionales de estabilización en función del mecanismo de que se trate. Por ejemplo, si se descubre que el mecanismo de agregación es la formación de enlaces intermoleculares S-S a través del intercambio de tiodisulfuro, la estabilización puede lograrse modificando los residuos de sulfhidrilo, liofilizando a partir de soluciones ácidas, controlando el contenido de humedad, mediante el uso de aditivos apropiados y el desarrollo de composiciones específicas de matriz polimérica.

También pueden utilizarse composiciones liposomales o proteinoides para formular las proteínas o anticuerpos aquí divulgados. Véanse los documentos Patentes de EE.UU. n° 4.925.673 y 5,013,556.

La estabilidad de las proteínas y anticuerpos descritos en la presente memoria puede mejorarse mediante el uso de "sales metálicas polivalentes solubles en agua" no tóxicas. Algunos ejemplos son Ca2+, Mg2+, Zn2+, Fe2+, Fe3+, Cu2+, Sn2+, Sn4+, Al2+ y Al3+. Entre los aniones de ejemplo que pueden formar sales solubles en agua con los cationes metálicos polivalentes anteriores se incluyen los formados a partir de ácidos inorgánicos y/o ácidos orgánicos. Dichas sales hidrosolubles tienen una solubilidad en agua (a 20°C) de al menos 20 mg/ml, alternativamente al menos 100 mg/ml, alternativamente al menos 200 mg/ml.

Los ácidos inorgánicos adecuados que pueden utilizarse para formar las "sales metálicas polivalentes solubles en agua" incluyen el ácido clorhídrico, acético, sulfúrico, nítrico, tiociánico y fosfórico. Entre los ácidos orgánicos adecuados que pueden utilizarse se encuentran el ácido carboxílico alifático y los ácidos aromáticos. Dentro de esta definición, los ácidos alifáticos pueden definirse como ácidos carboxílicos C2-9 saturados o insaturados (por ejemplo, ácidos alifáticos mono-, di- y tri-carboxílicos). Por ejemplo, los ácidos monocarboxílicos ejemplares dentro de esta definición incluyen los ácidos monocarboxílicos saturados C2-9 acético, propriónico, butírico, valérico, caproico, enántico, pelargónico caprílico y capriónico, y los ácidos monocarboxílicos insaturados C2-9 acrílico, metacrílico propriólico, crotónico e isocrotónico. Los ácidos dicarboxílicos ejemplares incluyen los ácidos dicarboxílicos C2-9 saturados malónico, succínico, glutárico, adípico y pimélico, mientras que los ácidos dicarboxílicos C2-9 insaturados incluyen los ácidos maleico, fumárico, citracónico y mesacónico. Los ácidos tricarboxílicos ejemplares incluyen los ácidos tricarboxílicos saturados C2-9 tricarbalílico y 1,2,3-butanotricarboxílico. Además, los ácidos carboxílicos de esta definición también pueden contener uno o dos grupos hidroxilo para formar ácidos hidroxicarboxílicos. Los ácidos hidroxicarboxílicos ejemplares incluyen el ácido glicólico, láctico, glicérico, tartrónico, málico, tartárico y cítrico. Los ácidos aromáticos incluidos en esta definición son el benzoico y el salicílico.

Las sales metálicas polivalentes solubles en agua empleadas habitualmente que pueden utilizarse para ayudar a estabilizar los polipéptidos encapsulados incluyen, por ejemplo: (1) las sales metálicas de ácidos inorgánicos de haluros (por ejemplo, cloruro de zinc, cloruro de calcio), sulfatos, nitratos, fosfatos y tiocianatos; (2) las sales metálicas de ácidos carboxílicos alifáticos (por ejemplo, acetato de calcio, acetato de zinc, proprionato de calcio, glicolato de zinc, lactato de calcio, lactato de zinc y tartrato de zinc); y (3) las sales metálicas de ácidos carboxílicos aromáticos de benzoatos (por ejemplo, benzoato de zinc) y salicilatos.

En ciertas realizaciones, un anticuerpo anti-IL13 se administra mediante el uso de, por ejemplo, un dispositivo autoinyectable, un dispositivo autoinyector u otro dispositivo diseñado para la autoadministración. En ciertas realizaciones, un anticuerpo anti-IL13 se administra mediante el uso de un dispositivo de administración subcutánea. Varios dispositivos de autoinyección y de administración subcutánea, incluidos los dispositivos autoinyectores, son conocidos en la técnica y están disponibles comercialmente. Los dispositivos ejemplares incluyen, entre otros, jeringas precargadas (tales como BD H^y PAK SCF®, READYFILL™ y STERIFILL SCF™ de Becton Dickinson; jeringas precargadas de copolímero CLEARSHOT™ de Baxter; y jeringas precargadas Daikyo Seiko CRYSTAL ZENITH® disponibles en West Pharmaceutical Services); dispositivos de inyección con pluma desechables tales como BD Pen de Becton Dickinson; dispositivos ultraagudos y de microagujas (tales como INJECT-EASE™ y dispositivos microinfusores de Becton Dickinson; y H-PATCH™ disponible en Valeritas), así como dispositivos de inyección sin aguja (tales como BIOJECTOR® e IJECT® disponibles en Bioject; y SOF-SERTER® y dispositivos de parche disponibles en Medtronic). Ciertas formas de realización de dispositivos de administración subcutánea se describen más adelante. Se prevén coformulaciones o coadministraciones con dichos dispositivos de autoinyección o dispositivos de administración subcutánea de un anticuerpo anti-IL13 con al menos un segundo compuesto terapéutico.

Procedimientos recombinantes

Los anticuerpos pueden producirse mediante el uso de procedimientos y composiciones recombinantes, p. ej., como se describe en Patente estadounidense n.° 4.816.567. El ácido nucleico aislado que codifica un anticuerpo anti-IL13 descrito en el presente documento puede codificar una secuencia de aminoácidos que comprende la VL y/o una secuencia de aminoácidos que comprende la VH del anticuerpo (por ejemplo, las cadenas ligera y/o pesada del anticuerpo). Se describen uno o más vectores (por ejemplo, vectores de expresión) que comprenden dicho ácido nucleico, así como una célula huésped que comprende dicho ácido nucleico. Una célula huésped puede comprender (por ejemplo, ha sido transformada con): (1) un vector que comprende un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende la VL del anticuerpo y una secuencia de aminoácidos que comprende la VH del anticuerpo, o (2) un primer vector que comprende un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende la VL del anticuerpo y un segundo vector que comprende un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende la VH del anticuerpo. La célula huésped puede ser eucariota, por ejemplo, una célula de ovario de hámster chino (CHO) o una célula linfoide (por ejemplo, una célula Y0, NS0 o Sp20). Un procedimiento de fabricación de un anticuerpo anti-IL13 puede comprender el cultivo de una célula huésped que comprende un ácido nucleico que codifica el anticuerpo, como se ha descrito anteriormente, en condiciones adecuadas para la expresión del anticuerpo, y opcionalmente la recuperación del anticuerpo a partir de la célula huésped (o medio de cultivo de la célula huésped).

A fin de la producción recombinante de un anticuerpo anti-IL13, el ácido nucleico que codifica un anticuerpo, por ejemplo, como se ha descrito anteriormente, se aísla y se inserta en uno o más vectores para su posterior clonación y/o expresión en una célula huésped. Dicho ácido nucleico puede aislarse y secuenciarse fácilmente por medio de procedimientos convencionales (por ejemplo, mediante el uso de sondas de oligonucleótidos capaces de unirse específicamente a los genes que codifican las cadenas pesada y ligera del anticuerpo).

Las células huésped adecuadas para la clonación o expresión de vectores codificadores de anticuerpos incluyen células procariotas o eucariotas descritas en el presente documento. Por ejemplo, los anticuerpos pueden producirse en bacterias, en particular cuando la glicosilación y la función de efector Fc no son necesarias. Para la expresión de fragmentos de anticuerpos y polipéptidos en bacterias, véanse, por ejemplo los documentos, Patentes de EE.UU. Nos. 5.648.237, 5,789,199y 5,840,523. (Véase también Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254que describe la expresión de fragmentos de anticuerpos en E. coli) Tras la expresión, el anticuerpo puede aislarse de la pasta celular bacteriana en una fracción soluble y puede purificarse aún más.

Además de los procariotas, los microbios eucariotas, tales como los hongos filamentosos o las levaduras, son huéspedes de clonación o expresión adecuados para los vectores de codificación de anticuerpos, incluidas las cepas de hongos y levaduras cuyas vías de glicosilación se han "humanizado", lo que da lugar a la producción de un anticuerpo con un patrón de glicosilación parcial o totalmente humano. Véase Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004), y Li et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006).

Las células huésped adecuadas para la expresión del anticuerpo glicosilado también se derivan de organismos multicelulares (invertebrados y vertebrados). Algunos ejemplos de células invertebradas son las células de plantas e insectos. Se han identificado numerosas cepas de baculovirus que pueden utilizarse junto con células de insectos, en particular para la transfección de células de Spodoptera frugiperda.

Los cultivos de células vegetales también pueden utilizarse como huéspedes. Véanse, por ejemplo los documentos Patentes estadounidenses n° 5.959.177, 6,040,498, 6,420,548, 7,125,978y 6,417,429 (describen la tecnología PLANTIBODIESTM para producir anticuerpos en plantas transgénicas).

Las células de vertebrados también pueden utilizarse como huéspedes. Por ejemplo, pueden ser útiles las líneas celulares de mamíferos adaptadas para crecer en suspensión. Otros ejemplos de líneas celulares hospedadoras de mamíferos útiles son la línea CV1 de riñón de mono transformada por SV40 (COS-7); la línea de riñón embrionario humano (células 293 o 293 como se describe, por ejemplo, en Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); células de riñón de hámster bebé (BHK); células de sertoli de ratón (células TM4 descritas, por ejemplo, en Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); células de riñón de mono (CV1); células de riñón de mono verde africano (VERO-76); células de carcinoma cervical humano (HELA); células de riñón canino (MDCK; células de hígado de rata búfala (BRL 3A); células de pulmón humano (W138); células de hígado humano (Hep G2); tumor mamario de ratón (MMT 060562); células TRI, como se describe, por ejemplo, en Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982); células MRC 5; y células FS4. Otras líneas celulares huéspedes de mamíferos útiles son las células de ovario de hámster chino (CHO), incluidas las células DHFR-CHO (Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); y líneas celulares de mieloma tales como Y0, NS0 y Sp2/0. Para una revisión de ciertas líneas de células huésped de mamíferos adecuadas para la producción de anticuerpos, véanse, por ejemplo, Yazaki y Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003).

Ensayos

Los anticuerpos anti-IL13 pueden identificarse, cribarse o caracterizarse por sus propiedades físico-químicas y/o actividades biológicas por medio de diversos ensayos conocidos en la técnica.

Ensayos de unión y otros ensayos

Un anticuerpo anti-IL13 puede probarse para su actividad de unión a antígeno, por ejemplo, por procedimientos conocidos como ELISA, Western blot, etc.

Los ensayos de competencia pueden utilizarse para identificar un anticuerpo que compita con el anticuerpo anti-IL13 para unirse a IL13. Un anticuerpo competidor puede unirse al mismo epítopo (por ejemplo, un epítopo lineal o conformacional) que está unido por lebrikizumab u otro anticuerpo anti-IL13 especificado en el presente documento. Los procedimientos detallados para cartografiar un epítopo al que se une un anticuerpo se encuentran en Morris (1996) "Epitope Mapping Protocols," en Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ).

En un ensayo de competencia ejemplar, la IL13 inmovilizada se incuba en una solución que comprende un primer anticuerpo marcado que se une a la IL13 (p. ej., lebrikizumab) y un segundo anticuerpo no marcado que se está probando por su capacidad de competir con el primer anticuerpo para unirse a la IL13. El segundo anticuerpo puede estar presente en un sobrenadante de hibridoma. Como control, la IL13 inmovilizada se incuba en una solución que contiene el primer anticuerpo marcado pero no el segundo anticuerpo no marcado. Tras la incubación en condiciones permisivas para la unión del primer anticuerpo a la IL13, se elimina el exceso de anticuerpo no unido y se mide la cantidad de etiqueta asociada a la IL13 inmovilizada. Si la cantidad de etiqueta asociada a la IL13 inmovilizada se reduce sustancialmente en la muestra de ensayo en relación con la muestra de control, eso indica que el segundo anticuerpo está compitiendo con el primer anticuerpo por la unión a la IL13. Véase Harlow y Lane (1988) Anticuerpos: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).

Ensayos de actividad

La actividad biológica de un anticuerpo anti-IL-13 puede incluir, por ejemplo, actividad en el asma. También se proporcionan formulaciones que contienen anticuerpos con dicha actividad biológica in vivo y/o in vitro .

Artículos de fabricación y kits

Un artículo de fabricación puede contener la formulación de la invención e instrucciones para su uso. El artículo de fabricación comprende un recipiente. Entre los recipientes adecuados se incluyen, por ejemplo, botellas, viales (por ejemplo, viales de doble cámara), jeringuillas (tales como jeringuillas de una o dos cámaras) y tubos de ensayo. El recipiente puede estar hecho de diversos materiales, tales como vidrio o plástico. El envase contiene la formulación y la etiqueta del envase, o asociada a él, puede indicar las instrucciones de reconstitución y/o uso. La etiqueta puede indicar además que la formulación es útil o está destinada a la administración subcutánea. El recipiente que contiene la formulación puede ser un vial multiuso, que permite administraciones repetidas (por ejemplo, de 2 a 6 administraciones) de la formulación reconstituida. El artículo de fabricación puede comprender además un segundo recipiente que contenga un diluyente adecuado (por ejemplo, BWFI). Tras mezclar el diluyente y la formulación liofilizada, la concentración final de proteína en la formulación reconstituida será generalmente de al menos 50 mg/ml. El artículo de fabricación puede incluir además otros materiales deseables desde el punto de vista comercial y del usuario, incluidos otros tampones, diluyentes, filtros, agujas, jeringas y prospectos con instrucciones de uso. En ciertas realizaciones, se proporciona un artículo de fabricación que comprende un dispositivo de administración subcutánea que suministra a un paciente una dosis plana de un anticuerpo anti-IL13, en el que la dosis plana es, por ejemplo, pero no se limita a, 37,5 mg, 75 mg, o 125 mg, o 150 mg. En ciertas realizaciones, el anticuerpo anti-Ó3 es lebrikizumab. El anticuerpo anti-IL 13 en el dispositivo de administración subcutánea se formula en un tampón, por ejemplo, histidina pH 5,7, y otros excipientes, por ejemplo, sacarosa y polisorbato, de forma que se proporciona en una formulación farmacéutica estable. En ciertas realizaciones, el dispositivo de administración subcutánea es una jeringa precargada que comprende un cilindro de vidrio con aguja y, opcionalmente, un protector de aguja y también opcionalmente, un dispositivo protector de aguja. En ciertas realizaciones, el volumen contenido en la jeringa es de 0,5 mL, 1 mL, 1,5 mL o 2,0 mL. En ciertas realizaciones, la aguja es una aguja estacada que comprende una punta de 3 biseles o una punta de 5 biseles. En determinadas realizaciones, la aguja tiene un calibre (G) comprendido entre 25 y 30G. En ciertas realizaciones, la aguja tiene una longitud de entre 1/2 pulgada y 5/8 pulgadas. En una realización, el dispositivo de administración subcutánea comprende una jeringa precargada de 1,0 mL de vidrio de borosilicato de bajo contenido en tungsteno (tipo I) y una aguja de acero inoxidable de 5 biseles 27G de 1/2 pulgada de longitud y pared fina estacada. En ciertas realizaciones, el dispositivo de administración subcutánea comprende un protector de aguja rígido. En ciertas realizaciones, el escudo rígido de la aguja comprende una formulación de caucho con bajo contenido de zinc, por ejemplo, FM27/0 (Daetwyler) y comprende un escudo rígido de polipropileno. En ciertas realizaciones, el vástago del émbolo comprende un tapón de émbolo de caucho. En ciertas realizaciones, el tapón del émbolo de caucho comprende caucho 4023/50 y revestimiento de etileno-tetrafluoroetileno (ETFE) FluroTec® (West Pharmaceutical Services, Inc.). En ciertas realizaciones, el dispositivo de administración subcutánea comprende un dispositivo de seguridad de la aguja. Algunos ejemplos de dispositivos de seguridad para agujas son, entre otros, Ultrasafe Passive® Needle Guard X100L (Safety Syringes, Inc.) y Rexam Safe n Sound™ (Rexam).

Los dispositivos adicionales adecuados para la administración subcutánea incluyen, por ejemplo, entre otros, un dispositivo de inyección tal como los dispositivos INJECT-EASE™ y GENJECT™; una bomba de infusión tal como ACCU-CHECK™; una pluma inyectora tal como GENPEN™; un dispositivo sin aguja tal como MEDDCTOR™ y BIOJECTOR™; un autoinyector y un sistema de administración de parches subcutáneos.

Los kits comprenderán típicamente el contenedor descrito anteriormente y uno o más contenedores que contengan materiales deseables desde el punto de vista comercial y del usuario, incluyendo tampones, diluyentes, filtros, agujas, jeringas y prospectos con instrucciones de uso. Puede haber una etiqueta en el envase para indicar que la composición se utiliza para una terapia específica.

Ejemplos

Los siguientes son ejemplos de formulaciones de la invención. Se entiende que pueden practicarse varias otras realizaciones, dada la descripción general proporcionada anteriormente.

Ejemplo 1

Materiales y procedimientos

Material y procedimientos de preparación de muestras

A excepción del anti-IL13, que es un anticuerpo monoclonal IgG4 humanizado, todos los demás anticuerpos utilizados en los experimentos descritos a continuación eran anticuerpos monoclonales IgG1 humanizados. Los anticuerpos monoclonales se expresaron en líneas celulares de ovario de hámster chino (CHO) y se purificaron por medio de una serie de etapas cromatográficas estándar, incluidos los procedimientos de cromatografía de proteína A y de intercambio iónico. Los anticuerpos purificados se obtuvieron como soluciones concentradas de filtración de flujo tangencial con soluciones tampón y estabilizadores añadidos. Estas fueron las soluciones madre de anticuerpos utilizadas como materiales de partida para los estudios que se describen a continuación.

Estos materiales de partida mAb stock se almacenaron a 2-8°C hasta su uso posterior. La preparación adicional de las soluciones de mAb incluyó la diálisis contra tampón de baja fuerza iónica y la filtración a través de filtros de PVDF (fluoruro de polivinilideno) modificados de 0,22 pm (Millipore Steriflip, Millipore Corp., MA) para eliminar partículas grandes. Típicamente, se obtuvieron concentraciones de mAb de 140- 150 mg/mL después de la diálisis. A fin de obtener mayores concentraciones de mAb, se concentraron 10 mL de mAb con concentradores Amicon YM30 Centriprep (Millipore Corp, MA) centrifugados a 2700 rpm. Las concentraciones finales de mAb en las preparaciones dializadas y concentradas por centrifugación se determinaron por medio de diluciones gravimétricas y absorbancias a 280 nm (A280) y medición de la absorción UV a 280 nm mediante el uso de un espectrofotómetro Agilent de matriz de diodos modelo 8453 con una cubeta de cuarzo de 1 cm de longitud de paso. Los coeficientes de extinción se determinaron por medio de análisis cuantitativo de aminoácidos.

Las soluciones de anticuerpos monoclonales para experimentos de dispersión de luz se prepararon en viales de centelleo de 20 mL sobre 0,5- 275 mg/mL por dilución gravimétrica de concentraciones de solución madre conocidas en una campana de flujo laminar. Todos los viales de centelleo se limpiaron cuidadosamente con agua desionizada y se secaron en una corriente de gas nitrógeno comprimido filtrado. Antes de añadirlas a las soluciones proteínicas, todas las soluciones tampón y reactivas se filtraron adicionalmente a través de filtros Whatman Anotop 25 de 0,10 um. Tras la preparación o dilución de las muestras, las soluciones de mAb se mezclaron hasta alcanzar la homogeneidad y se dejaron alcanzar el equilibrio térmico y químico a temperatura ambiente controlada durante 2 horas. Las soluciones de proteínas se centrifugaron a temperatura ambiente durante 20-30 minutos a 3000 rpm para eliminar el polvo adventicio y las burbujas de las soluciones antes de utilizarlas para la dispersión de luz. Las soluciones de mayor concentración (mAb > 170 mg/mL) se centrifugaron durante más tiempo hasta que la señal de dispersión de la luz mostró un mínimo de ruido. Las superficies exteriores de los viales de centelleo se recubrieron ligeramente con aceite de silicona para reducir la dispersión no deseada de los defectos de la superficie del vial. Las muestras preparadas como se ha indicado anteriormente se colocaron directamente en el instrumento de dispersión de luz para realizar las mediciones.

Determinación de B ² por medio de dispersión multiángulo de la luz

Para la preparación de las muestras para la dispersión de luz se utilizaron viales de 20 mL con tapa septum revestidos de Teflon® que se limpiaron con agua MilliQ y se secaron bajo una corriente de gas nitrógeno filtrado. Se prepararon muestras de varias concentraciones tomando un volumen apropiado de la solución madre de mAb a aproximadamente 80 mg/mL, diluyendo primero a aproximadamente 8 mg/mL con el tampón apropiado y realizando después una dilución final con 20 mL de tampón filtrado a 0,2 pm. Un total de ocho concentraciones de proteína (0,05-1,1 mg/mL mAb) para cada condición de tampón se equilibraron durante 14-18 horas a temperatura ambiente antes de iniciar las mediciones. Todas las mediciones se realizaron como una serie de soluciones de concentraciones crecientes de proteína, y cada experimento se llevó a cabo por triplicado. Se utilizaron un desgasificador de disolventes y una bomba isocrática Agilent (Agilent, Palo Alto, CA), con un filtro de disolvente Millipore (Millipore, Billerica, mA) de 25 mm (PVDF, 0,1 |jm), con un caudal continuo de 0,5 mL/min. La inyección de muestras se automatizó con una unidad de manipulación de líquidos Gilson GX281 (Gilson, Inc., Middleton WI) configurada con un bucle de inyección de 2 mL y un microfiltro en línea Wyatt Technology Deutschland con membrana de PVDF de 0,1 jm, 10 mM. Las mediciones de concentración y dispersión de la luz se llevaron a cabo en serie, con un detector UV Agilent MWD midiendo a 280 nm, seguido del detector EOS MALS de 18 ángulos (Wyatt Technology Corporation, Santa Barbara, CA) con ganancia reducida a 21x. Los datos se adquirieron y procesaron en el software Astra™ 4.90.07 (WTC), y el análisis posterior se llevó a cabo exportando los resultados de los cortes. Las parcelas de K*c/R(0=0)/K*c/ o 1/Mwapp frente a la concentración con ajuste de regresión lineal de los datos dan una pendiente = 2B2, y una intercepción de 1/Mw0, el peso molecular medio ponderal a dilución infinita. Dispersión de luz estática (SLS) multiángulo de alta concentración

Se utilizó un detector de dispersión de luz Dawn EOS de 18 ángulos con un láser de estado sólido de 30 mW (A = 690 nm) de Wyatt Technology (Santa Barbara, CA) para todas las mediciones de dispersión de luz estática con un controlador de temperatura Peltier refrigerado por agua ajustado a 23°C. El instrumento se calibró con tolueno al 99,9% (grado cromatográfico). Para un experimento típico con frascos de centelleo, se utilizó un ajuste de ganancia del detector de 1x para todos los fotodiodos, en ángulos fijos de 38° a 148°. Dado que el radio de giro (Rg) del anti-CD11a es inferior a 10 nm, se utilizó una solución diluida (1-2 mg/mL) de anti-CD 11a en cada concentración de sal para normalizar la dependencia angular de los fotodiodos con respecto al detector de 90° mediante el uso de un ajuste de ganancia del fotodiodo detector de 21x al final de cada experimento. La medición de la intensidad de la dispersión de la luz estática se llevó a cabo en función de la concentración de mAb de 0,5 mg/mL a 275 mg/mL, y en función de la concentración de NaCl (0 - 600 mM). Los datos de dispersión de cada muestra/vial se recogieron durante un intervalo de 5-10 minutos con una frecuencia de recogida de datos de 12 puntos/minuto. Se utilizó el software Astra 4.90.07 (Wyatt Technology Corporation, Santa Barbara, CA) para adquirir y procesar los datos de dispersión de luz estática, con un valor dn/dc de 0,185 aplicado a los cálculos que podían exportarse como resultados de cortes. Los análisis y cálculos posteriores con los resultados exportados se llevaron a cabo en Microsoft Excel, Origin v7.5 y MATLAB R14. Para los datos de dispersión de luz de alta concentración, a menudo era más fácil interpretar los resultados en el formato de MWapp frente a la concentración de mAb, en la que los aumentos en el peso molecular correspondían a la presencia de autoasociación reversible dependiente de la concentración. (Véase, por ejemplo Scherer, T. M., et al. Revista de Química Física B 114(40): 12948-12957 (2010) Minton, A. P., J Pharm Sci 96(12): 3466-9 (2007) Minton, A. P. Biophysical Journal 93(4): 1321-1328 (2007).

Turbidez por espectroscopia UV

Las turbideces para las soluciones de proteína probadas de los experimentos de dispersión de luz de alta concentración y para las soluciones de proteína del experimento de Pantalla de pH (cada una, como se describe más adelante) se midieron a temperatura ambiente mediante el uso de un Espectrofotómetro Agilent 8453. La turbidez se calculó como la media de la absorbancia a la longitud de onda de 350 nm, dividiendo por 5 la suma de los valores de absorbancia en el intervalo de longitudes de onda de 340 nm a 360 nm con incrementos de 5 nm. Las mediciones de las soluciones de proteínas se llevaron a cabo en una cubeta de cuarzo de pequeño volumen con una longitud de paso de 1 cm. También se registró la absorbancia a 690 nm.

Calorimetría diferencial de barrido (DSC) capilar Caracterización de la temperatura de fusión (Tm)

La estabilidad conformacional térmica de la proteína se evaluó mediante el uso de un calorímetro de barrido diferencial capilar MicroCal. Los MAbs se diluyeron a 1 mg/mL en tampón. Se cargaron 500 microlitros de la proteína y su tampón correspondiente en una placa de 96 pocillos. Se controló la capacidad calorífica a medida que se aumentaba la temperatura de 15 a 95 °C a una velocidad de barrido de 60 °C/hora. Se utilizó VPViewer 2000 Cap DSC para adquirir los datos y MicroCal, LLC DSC Data Analysis para analizarlos. Véase el documento Yadav, S. et al., J Pharm Sci. 99(3): 1152-68 (2010).

Nefelometría

Las mediciones nefelométricas se llevaron a cabo mediante el uso de un instrumento turbidímetro de laboratorio HACH (Modelo 2100AN IS) con detección de 90 grados de la intensidad dispersa. El detector se calibró con una solución madre de estándar de formacina de 4000 unidades nefelométricas de turbidez (NTU), con una concentración de estándar de turbidez relativa de 0-0,5. Las muestras se colocaron en cubetas y se midieron por duplicado informando del NTU medio de la muestra.

Reología

Las viscosidades de las muestras se midieron con un reómetro MCR300 (Anton Paar, Ashland, VA) mediante el uso de un sistema de medición de cono y placa. Las muestras se cargaron en la placa de medición inferior y se dejaron alcanzar el equilibrio térmico a 25 °C. Se utilizó una trampa de disolvente para evitar la evaporación del disolvente. La muestra se sometió a dos ciclos de barridos de velocidad de cizallamiento (cada ciclo incluye una rampa ascendente de 10 sec1 a 1000 sec1, un mantenimiento a 1000 sec1 durante 1 minuto y una rampa descendente de 1000 sec-1 a 10 sec-1). Hay un tiempo de descanso de 1 minuto entre los ciclos. El valor indicado es la media de los dos barridos de velocidad de cizallamiento de una muestra a 1000 seg-1. La barra de error representa la desviación estándar de las dos carreras en unidades de miliPascal-segundo (mPas). La muestra se sometió a esfuerzo cortante durante 2 minutos en total a 1000 seg-1. Elegimos 1000 sec-1 porque la viscosidad es relativamente independiente de las velocidades de cizallamiento en este intervalo (200 sec-1 < velocidad de cizallamiento < 2000 sec-1). La diferencia de viscosidad entre dos alícuotas de una muestra fue de ±0,5mPa a 1000 seg-1. La duración de la medición a cada velocidad de cizallamiento se optimizó mediante el uso del software US200 (Anton Paar, Ashland, VA).

Determinación de la temperatura de las nubes

Para un sistema que experimenta separación de fases líquido-líquido (LLPS), la disminución de la temperatura resulta en la formación de gotas de una fase líquida en la otra fase. La temperatura a la que se forman estas gotas se denomina temperatura de nube, y puede determinarse experimentalmente por medio de microscopía o el control de la transmisibilidad de la solución. Para los experimentos descritos en la presente memoria, la temperatura de la nube se determinó controlando la pérdida de transmisibilidad a 600 nm en función de la temperatura en un espectrofotómetro Aviv 14DS (Aviv Biomedical, Lakewood, NJ). Se llenó una cubeta cuadrada de 5 mm con aproximadamente 0,6 mL de la solución de anticuerpos. La temperatura se redujo de 25°C a 0°C en pasos de 0,5°C mediante el uso de un enfriador termoeléctrico. La muestra se equilibró durante 10 minutos a cada temperatura antes de registrar la transmisión. La temperatura de nube se designó como la temperatura a la que él % de transmisibilidad disminuía al 50% del valor inicial (Asherie, 2004). La Tc para la separación de fases anti-IL13 a diferentes concentraciones de proteína y en diferentes soluciones de estudio se midieron mediante el uso de un Espectrofotómetro UV-Vis Aviv Biomedical Modelo 14S. Los datos de transmitancia porcentual frente a la temperatura se recogieron con un barrido de temperatura de 25°C a 0°C con un tamaño de paso de - 0,5°C, un tiempo de equilibrio de 600 segundos y una longitud de onda de 600 nm. Las mediciones de las soluciones de proteínas se llevaron a cabo en una cubeta de cuarzo con una longitud de paso de 1 cm.

Cromatografía de exclusión por tamaño

Se utilizó cromatografía de exclusión por tamaño para cuantificar agregados y fragmentos. Para este ensayo se utilizó una columna TSK G3000 SWXLTM, 7,8X300 mm, y se ejecutó en un sistema HPLC HP 1100TM a 25°C. Las muestras se diluyeron a 2 mg/mL con la fase móvil y el volumen de inyección fue de 25 pl. La fase móvil fue 0,2 M K2HPO4, 0,25 M KCl, a pH 6,2 y la proteína se eluyó a un caudal constante de 0,5 mL/min durante 30 minutos. La absorbancia del eluyente se controló a 280 nm. La integración se llevó a cabo mediante el uso del software HP CHEMSTATIONM™.

Enfoque isoeléctrico capilar con imagen (icIEF)

Las muestras se ensayaron mediante el uso de icIEF para cuantificar las variantes de carga (ácida y básica) de las muestras de estabilidad de anticuerpos anti-IL13. Este procedimiento utilizó un capilar recubierto de fluorocarbono (Convergent Bioscience) en un analizador iCE280 (Convergent Bioscience) con un microinyector PrinCE. Las soluciones de anolito y catolito se adquirieron a GE Healthcare Biosciences; las soluciones de marcadores de pl se adquirieron a Convergent Bioscience).

Electroforesis capilar-Sulfato de dodecil sodio (CE-SDS)

La CE-SDS se llevó a cabo mediante el uso de un sistema de electroforesis capilar Beckman P/ACE MDQ o PA800, capaz de controlar la temperatura capilar de 20 a 40 2°C, con detector LIF a 488 nm de excitación.

Ensayo de potencia del anticuerpo anti-IL13

La actividad biológica o potencia de las soluciones de anticuerpos anti-IL13 se evaluó mediante el uso de un ensayo de cultivo celular que midió la capacidad de las soluciones de anticuerpos anti-IL13 para inhibir la expresión de luciferasa inducida por IL-13 en la línea celular epitelial bronquial humana, células L-Beas-2B (disponible en ATCC, ATCC Cat. N° CRL-9609™). Se mezclaron concentraciones variables de anticuerpo anti-IL13 estándar, control y muestras con una concentración fija de IL-13 (por ejemplo, rhu-IL13, Peprotech, Cat. N° 200-13) y se añadieron a una placa de 96 pocillos sembrada con células L-Beas-2B a una concentración de 2 ><105 células/mL. Tras la incubación, se cuantificó la expresión de luciferasa mediante el uso de un sustrato de luciferasa luminiscente de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Bright-Glo™ Luciferase Assay System, Promega Cat. N° E2620, E2650, o Brite-Lite Plus, Perkin Elmer Cat. N° 6016761). Se generaron curvas de dilución para cada solución de anticuerpo y se compararon con el material de referencia. Los resultados se expresaron en unidades de luminiscencia relativa (RLU). Se calculó una estimación de la potencia relativa mediante el uso del procedimiento de los mínimos cuadrados y un programa de análisis de líneas paralelas. El % de actividad específica se calculó multiplicando la estimación de potencia relativa por la actividad específica del material de referencia.

Secuencias de aminoácidos del anticuerpo anti-IL13 (lebrikizumab)

La siguiente tabla muestra las secuencias de aminoácidos de las regiones CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 de lebrikizumab, junto con las secuencias VH, VL, de cadena pesada y de cadena ligera. Como se indica en la Tabla 1 a continuación, VH y la cadena pesada pueden incluir una glutamina N-terminal y la cadena pesada también puede incluir una lisina C-terminal. Como es bien sabido en la técnica, los residuos N-terminales de glutamina pueden formar piroglutamato y los residuos C-terminales de lisina pueden recortarse durante los procesos de fabricación.

Tabla 1. Secuencias de aminoácidos del anticuerpo anti-IL13 (lebrikizumab)

Resultados

Estabilidad física y química de las formulaciones de anticuerpos anti-IL13 a distintos pH

Se prepararon tampones con pH variable mediante el uso de 20 mM de acetato de histidina o 20 mM de fosfato de sodio para cubrir el intervalo de pH 5,4 - 7,8. Los tampones de acetato de histidina cubrían el intervalo de pH de 5,4 a 6,0 y los de fosfato sódico el de 6,6 a 7,8. Para cada tampón pH, se mantuvieron constantes: la concentración de anticuerpo anti-IL13 a 150 mg/ml, 175 mM de sacarosa y 0,3 mg/mL (0,03%) de polisorbato 20.

Las soluciones de anticuerpos se almacenaron en viales durante los periodos de tiempo y a las temperaturas indicadas en la Tabla 2 a continuación. En distintos momentos, indicados con una "X" en la Tabla 2, las muestras se analizaron por medio de diversos procedimientos para evaluar la estabilidad física, incluyendo SEC, turbidez A350 y CE-SDS no reductora, y la estabilidad química, incluyendo icIEF.

Tabla 2. Puntos temporales de estabilidad y condiciones utilizadas para determinar la estabilidad física y química de las soluciones de anticuerpos anti-IL13.

La Figura 1 muestra el porcentaje de pérdida de monómero por semana en tampones al pH indicado, determinado por medio de SEC. Como se muestra en la Fig. 1, el % de pérdida de monómero fue menor en el intervalo de pH más bajo que en el intervalo de pH más alto, con el menor % de pérdida de monómero a pH 5,7, que mostró un % de pérdida de monómero/semana de 0,056.

Otro ensayo de estabilidad física midió los cambios de turbidez (determinados por A350) con el tiempo a 30°C en función del pH. Como se muestra en la Fig. 2, las turbideces iniciales y los cambios son mayores para los tampones entre pH5,4 - 6,0 que en los intervalos de pH más altos. En la Fig. 2, la turbidez neta es A350 = 1/T donde T es la intensidad de luz transmitida a 350 nm con una longitud de trayectoria especificada de 1 cm.

Un tercer ensayo de estabilidad física midió los aumentos de fragmentos solubles de bajo peso molecular (LMW) y agregados de alto peso molecular (HMW) en soluciones de anticuerpos anti-IL13 durante seis semanas de almacenamiento a 30°C en función del pH. Como se muestra en la Fig. 3, los índices de fragmentación y agregación fueron más bajos en el intervalo de pH más bajo, pH 5,4 - 6,6.

También evaluamos la estabilidad química mediante el uso de icIEF para determinar cambios en la tasa de formación de variantes ácidas y básicas con el tiempo a 30°C como función del pH (Fig. 4) y cambios en la tasa de pérdida de variantes básicas y pico principal con el tiempo a 30°C como función del pH (Fig. 5). Como se muestra en la Fig. 4, la tasa de la variante ácida fue más baja en el intervalo de pH bajo y más alta en el intervalo de pH alto, mientras que la tasa de la variante básica (pico BV1) fue más baja en el intervalo de pH alto y más alta en el intervalo de pH bajo. Los resultados mostrados en la Fig. 5 indican que la pérdida del pico principal se minimizó entre pH 5,4 - 6,0.

A fin de determinar si el pH afectaba a la viscosidad de la solución, realizamos la caracterización reológica de diferentes concentraciones de anticuerpo anti-IL13 (de 0 a 200 mg/mL de anticuerpo) a pH variable (de pH 5,5 - 7,2). Cada solución contenía 175mM de sacarosa y 0,3 mg/mL de polisorbato 20. Los resultados se muestran en la Figura 6. Estos resultados indican que se mantuvo un perfil de viscosidad constante independientemente del pH de la solución para una concentración de anticuerpo dada. En particular, los resultados mostraron que la viscosidad a concentraciones más elevadas de anticuerpos no se veía influida por el pH.

En conjunto, los datos presentados en las Figs. 1-6 muestran que hubo un gradiente poco profundo para la mayoría de los cambios físicos y químicos a pH 5,4 - 6,0. Por lo tanto, se eligió el tampón de acetato de histidina 20mM a pH 5,7 para los estudios posteriores y la evaluación de la formulación.

Caracterización reológica de soluciones de anticuerpos monoclonales de alta concentración

A fin de explorar si la viscosidad observada (< 15 cP a 25°C) para el anticuerpo anti-IL13 formulado a 150 mg/mL en acetato de histidina 20 mM pH 5.7, sacarosa 175 mM, polisorbato 200.3 mg/mL se observaría generalmente para varios anticuerpos diferentes, probamos la viscosidad de tres anticuerpos adicionales en formulaciones similares a 150 mg/mL. Un perfil de viscosidad como el observado para el anticuerpo anti-IL13 es deseable para la fabricación a alta concentración de anticuerpo y para ciertas vías de administración del fármaco, por ejemplo, la inyección subcutánea. Como se muestra en la Fig. 7, el anticuerpo anti-IL13 mantuvo un perfil de viscosidad similar al anticuerpo anti-CD 11a, con una viscosidad de < 15 cP a 25°C. Por el contrario, el anticuerpo anti-CD20 y el anticuerpo mAb-1 mostraron perfiles de viscosidad bastante diferentes. La viscosidad del anticuerpo anti-CD20 a 150 mg/mL fue > 15 cP a 25°C, mientras que mAb-1 no pudo formularse a 150 mg/mL en esta formulación tampón debido a problemas significativos de viscosidad, como puede verse en la Fig. 7. La Fig. 7 muestra que la viscosidad de mAb-1 a 125 mg/mL fue > 45 cP a 25°C. Por consiguiente, queda claro a partir de estos datos que los diferentes anticuerpos tienen diferentes características reológicas cuando se formulan a 150 mg/mL en acetato de histidina 20 mM pH 5,7, sacarosa 175 mM, polisorbato 200,3 mg/mL.

Caracterización de la apariencia visual y la opalescencia

Caracterizamos el aspecto visual y la opalescencia de la formulación de anticuerpo anti-IL13 en comparación con una formulación de anticuerpo anti-CD20 utilizando nefelometría de 90 grados y mediciones de turbidez A350. La Figura 8 muestra la cuantificación del aspecto visual de las dos formulaciones diferentes de anticuerpos en unidades nefelométricas de turbidez (NTU). En la Figura 8, R1, R2, R3 y R4 se refieren a patrones de referencia, en los que R4 tiene el mayor grado de opalescencia visual y R1 el menor. Las mediciones de la turbidez A350 para los anticuerpos anti-IL13 y anti-CD20 se muestran en la Fig. 9. Como se muestra en la Fig. 9, para cada formulación de anticuerpo, la turbidez aumentaba con el incremento de la concentración de proteína. Los resultados mostrados en estas figuras demuestran que dos mediciones diferentes del aspecto visual para dos anticuerpos tienen tendencias diferentes, especialmente a concentraciones de proteína más altas debido a diferencias en lo que se mide intrínsecamente. Los datos también muestran que las tendencias de medición son coherentes entre estos dos anticuerpos que parecen tener una elevada opalescencia de la solución.

También examinamos la concentración del anticuerpo anti-IL13 en función de la concentración y del pH. Los resultados se muestran en la Figura 10. Las soluciones que mostraban mayor turbidez se encontraban en las proximidades del punto isoeléctrico (pI) del mAb.

Sin estar limitados por la teoría, interpretamos que estos resultados indican que la absorbancia a 350 nm de longitud de onda (turbidez) aumentó con el aumento de la concentración de proteína debido a la absorción de luz por la banda de absorción de proteína, con máximos alrededor de 280 nm debido a la cola ancha de este pico. Un segundo factor que contribuyó al aumento de A350 frente a la concentración de las soluciones de mAb fue el aumento no lineal de la dispersión de la luz, lo que redujo la luz total transmitida.

Además, evaluamos los recuentos de partículas subvisibles como una función de la concentración de mAb y esos resultados se muestran en la Fig. 11. No se observó un aumento significativo de partículas subvisibles > 2 pm de tamaño por medio del análisis de oscurecimiento por luz HIAC, lo que indica que las partículas > 2 pm no contribuyen a la opalescencia o turbidez de las soluciones de anticuerpos anti-IL13. La Figura 12 muestra las mediciones de dispersión de luz nefelométrica, turbidimétrica y estática de una solución de 125 mg/mL de anticuerpo anti-IL13 cuando las soluciones de anticuerpo se filtraron con tamaños de poro cada vez más pequeños (hasta 0,1 pm o 100 nm). Estos resultados se muestran en las Figs. 11 y 12 indican colectivamente que el aspecto de la solución de anticuerpo anti-IL13 y de la formulación del producto farmacéutico no está determinado por partículas subvisibles o submicrónicas que induzcan una dependencia de la concentración de la dispersión de la luz.

A continuación, investigamos la dependencia del aspecto de la solución en función del pH de la solución a 125 mg/mL y 204 mg/mL. El aspecto de la solución se evaluó por medio de un barrido de temperatura de la intensidad de la luz transmitida a 600 nm. Los resultados se muestran en la Fig. 13 e indican que la opalescencia de la solución del anticuerpo anti-IL13, que se mantuvo constante en función de la disminución de la temperatura, no se debió a fenómenos críticos tales como la separación de fases líquido-líquido, en la que los componentes de la solución tienen solubilidad divergente y forman dos fases separadas de composición distinta. Esto sugiere que la homogeneidad de la solución (separación de fases) a lo largo de una gama de temperaturas típicas de almacenamiento y/o exposición no se ve influida por la temperatura a pesar de la opalescencia/apariencia visual inicial de la solución (a temperatura ambiente).

Estudios de estabilidad térmica (T ^meit )

Medimos los picos de transición térmica de fusión de dos picos parcialmente resueltos en el calorímetro capilar de barrido diferencial en función de la composición de la formulación y del pH de la solución. Los resultados se muestran en la Figura 14. Como se muestra en la Fig. 14, se observó un máximo en el comportamiento de la transición de fusión para el anti-IL13 en función del pH entre pH 6,0 -7,5. La opinión científica predominante es que cuanto más baja se produzca la transición de fusión, menor será la estabilidad física esperada del sistema en caso de almacenamiento de cualquier duración. Véase, por ejemplo Chi et al., Protein Science 12(5):903-913 (2003) Chi et al., Pharmaceutical Research 20(9): 1325 a 1336 (2003) Goldberg, et al., J. Pharm. Sciences 100(4):1306-1315 (2011). Por lo tanto, los datos de estabilidad física mostrados en el presente documento para la formulación del anticuerpo anti-IL13 (pH 5,7) fueron sorprendentes e inesperados.

Estabilidad coloidal

La estabilidad coloidal se midió por medio de dispersión de luz estática mediante el uso de soluciones diluidas de anticuerpo (entre 0,10 -1 mg/mL) así como dispersión de luz a concentraciones de anticuerpo superiores a 200 mg/mL. La estabilidad coloidal se refiere al comportamiento en solución de macromoléculas suspendidas en solución, y permite investigar las interacciones en equilibrio, promediadas en el tiempo, entre macromoléculas tales como los anticuerpos monoclonales. Sin estar atados por la teoría, cuando las interacciones son repulsivas, se puede esperar que la composición de la solución permanezca estable. Sin embargo, se producen interacciones atractivas netas entre las moléculas de soluto, que generalmente se asocian a transiciones de fase y problemas de solubilidad de las proteínas.

Medimos los coeficientes osmóticos de segundo virial (B2) para el anticuerpo anti-IL13 (a concentraciones que van de 0,1 a 1,0 mg/mL) en función del pH de la solución con muestras en tampones simples. Obsérvese que en las Figs. 15 y 16, los valores superiores a 0 son coeficientes osmóticos de segundo virial positivos que indican interacciones repulsivas netas y los valores inferiores a 0 son coeficientes osmóticos de segundo virial negativos que indican interacciones intermoleculares atractivas netas. Los datos de la Fig. 15 muestran que el anticuerpo anti-IL13 tenía interacciones atractivas en todo el intervalo de pH, pero que las interacciones atractivas más fuertes se producían entre pH 5,5- 6,5. A fin de obtener los resultados mostrados en la Fig. 16, se añadieron aditivos de formulación a las soluciones a diferentes pH. Como puede observarse en la Fig. 16, los coeficientes osmóticos de segundo virial medidos a pH 5,5-6,5 siguieron siendo negativos y, por tanto, atractivos. Las mediciones de dispersión de luz con un detector de dispersión de luz multiángulo a través del intervalo de concentraciones 1- 200 mg/mL extrapolando las intensidades al ángulo de dispersión de 0 se muestran en la Fig. 17. Estos datos revelaron que el perfil de intensidad dispersa era muy similar al observado en el nefelómetro HACH (compárese la Fig. 8 con la Fig. 17). Ambos instrumentos miden la intensidad de la luz dispersa y, por tanto, la dispersión Rayleigh. Esta dispersión domina en las soluciones libres de partículas y está causada por pequeñas fluctuaciones de densidad y concentración de la solución que también dependen de las interacciones entre las moléculas dispersoras. La disminución de la intensidad de la luz dispersa se produce cuando las moléculas están cada vez más en estrecho contacto entre sí y sus posiciones en el tiempo/espacio se correlacionan dando lugar a una interferencia destructiva de la luz dispersa (Véase, por ejemplo, Bettelheim et al., Biophysical Journal 41(1): 29-33 (1983) Xia et al., Biophysical Journal 66(3_Pt_1): 861-872 (1994); y Xia et al., Biophysical Journal 41(1): 29-33 (1996). La Figura 18 muestra los datos de dispersión de luz estática para el anticuerpo anti-IL13 en función del pH de la formulación. Los datos de la Fig. 18 se representan como pesos moleculares aparentes observados a concentraciones de anticuerpos de hasta 200 mg/mL. Los datos mostrados en la Fig. 18 indicaron interacciones coloidales de débiles (pH 7,2) a moderadamente atractivas (pH 6,5) y autoasociación del anticuerpo anti-IL13 en todo el intervalo de concentraciones, en relación con la dispersión teórica para un modelo de especie de esfera dura simple del volumen excluido del mAb (línea discontinua en la Fig. 18).

Tanto el anti-IL13 como el anti-CD20 mostraron niveles comparables de turbidez causada por interacciones coloidales atractivas y auto asociación de mAb como se muestra en la Fig. 19. Sorprendentemente, tales interacciones coloidales atractivas no se manifestaron como viscosidades altas (por ejemplo, > 15 cP a 150 mg/mL) o problemas reológicos con la formulación para el anticuerpo anti-IL13 como se muestra en la Fig. 20. Las interacciones coloidales para el anticuerpo anti-CD20, sin embargo, sí tuvieron un efecto sobre la reología de la solución, resultando no sólo en la opalescencia de la solución (Fig. 8), sino también en altas viscosidades de > 15 cP a 25°C y 150 mg/mL (Fig. 20).

Estabilidad física, química y de potencia a largo plazo

A fin de probar la estabilidad y potencia a largo plazo, el anticuerpo anti-IL13 se formuló a 125 mg/mL en acetato de histidina 20mM pH 5.7, sacarosa 175 mM y polisorbato 20 0.3 mg/mL y luego se sometió a varias condiciones de almacenamiento. Los viales se almacenaron a 5°C o 25°C durante el número de semanas indicado en la Tabla 3 (hasta 156 semanas a 5°C y hasta 26 semanas a 25°C). En cada punto temporal indicado en la Tabla 3, se analizaron las muestras para determinar el aspecto del color y la claridad (CAC), el pH y la medida de estabilidad química o física indicada. Además, también se evaluó la actividad biológica (potencia) en cada punto temporal. Como indican los datos de la Tabla 3, el anticuerpo anti-IL13 formulado a 125 mg/mL en acetato de histidina 20mM pH 5,7, sacarosa 175 mM y polisorbato 20 0,3 mg/mL mantuvo la potencia y demostró una buena estabilidad química y física a 5°C durante 156 semanas (tres años) y a 25°C durante 26 semanas. Estos datos confirman que esta formulación mantiene los atributos químicos, físicos y de potencia deseados del anticuerpo anti-IL13 durante un periodo de tiempo prolongado.

Tabla 3. Estabilidad y condiciones utilizadas para determinar la estabilidad física, química y de potencia a largo plazo del anticuerpo anti-IL13.

Conclusiones

Hemos demostrado que el anticuerpo anti-IL13 se ha formulado con éxito en condiciones de pH y solución con excipientes que promueven la estabilidad química y física a largo plazo y mantienen la potencia. Específicamente, esa formulación comprendía anticuerpo en concentraciones de 100 mg/mL y superiores, incluyendo 125 mg/mL y 150 mg/mL, en acetato de histidina 20mM pH5,7, sacarosa 175 mM y polisorbato 20 0,3 mg/mL. Sorprendentemente, descubrimos que la formulación tenía un perfil de viscosidad deseable de < 15 cP a 25°C. Tal perfil de viscosidad es deseable para la fabricación y también para la facilidad de administración, por ejemplo, para la inyección subcutánea, en la que una alta concentración de producto farmacológico en un pequeño volumen es óptima por varias razones, incluyendo la comodidad del paciente y el cumplimiento. Observamos que otros anticuerpos de la misma formulación o de una formulación similar presentaban un perfil de viscosidad indeseable de > 15 cP a 25°C, lo que pone de manifiesto la imprevisibilidad del perfil de viscosidad de las formulaciones de anticuerpos anti-IL13.

Además, dos criterios utilizados a menudo para la selección de la formulación proteica incluyen la estabilidad térmica y la estabilidad coloidal (Véase Chi et al., Protein Science 12(5):903-913 (2003) Chi et al., Pharmaceutical Research 20(9): 1325 - 1336 (2003)). El análisis térmico de las temperaturas de desdoblamiento de las soluciones del anticuerpo anti-IL13 sugirió que la estabilidad física en condiciones de pH 5,4- 6,0 no sería óptima para la estabilidad física de la formulación del anticuerpo. El análisis de la estabilidad coliodal de las soluciones de anticuerpos anti-IL13 también sugirió que las condiciones de formulación en el intervalo de pH 5,5- 6,5 serían las menos deseables para mantener bajas las tasas de agregación. Sin embargo, sorprendentemente, como muestran los datos presentados en la presente memoria, el anticuerpo anti-IL13 formulado a pH 5,7 demostró una buena estabilidad física durante un largo periodo de tiempo a 5°C y también en condiciones aceleradas. También resultó sorprendente que la estabilidad del producto en estas condiciones fuera superior a la observada a pH más elevados, tanto física como químicamente, a pesar de que las transiciones térmicas de fusión y la estabilidad coloidal fueran inferiores. Aunque el aspecto (y la turbidez) de la solución de anticuerpo anti-IL13 formulada era más opalescente en las condiciones de formulación seleccionadas que en ciertas condiciones no seleccionadas, las propiedades moleculares y la composición de la formulación mantuvieron una estabilidad óptima tanto en condiciones de tiempo real como de almacenamiento acelerado, mantuvieron la potencia y proporcionaron las propiedades reológicas de la solución deseadas para la administración de altas concentraciones de producto farmacológico en un volumen pequeño.

Dispositivo de administración subcutánea

Se seleccionó un dispositivo de administración subcutánea que comprende una jeringa precargada con aguja, un émbolo con tapón de émbolo, un protector de aguja y un dispositivo de seguridad de aguja para la administración de la formulación anti-IL13 descrita anteriormente por medio de la evaluación de una variedad de componentes disponibles comercialmente. Por ejemplo, los componentes evaluados incluían cañas de vidrio, jeringuillas conformadas con aguja estacada, émbolos y tapones de émbolo, protectores rígidos de aguja y dispositivos de seguridad de aguja.

Los diversos componentes se evaluaron en varias combinaciones según procedimientos conocidos por un experto en la técnica para determinar los efectos sobre las propiedades de la formulación, incluyendo, pero sin limitarse a, la estabilidad, y otras consideraciones tales como la comodidad y conveniencia del paciente, que incluye factores tales como el impacto del calibre de la aguja y el diámetro interno de la aguja sobre el tiempo de inyección y las fuerzas de deslizamiento cuando la formulación tiene ciertas viscosidades como se describe en el presente documento. Estos estudios nos llevaron a seleccionar como dispositivo de administración subcutánea óptimo para la administración de lebrikizumab formulado a alta concentración, tal como se describe en el presente documento, una jeringa precargada de 1,0 mL de vidrio de borosilicato con bajo contenido en tungsteno (tipo I) y una aguja estacada de acero inoxidable de 5 biseles 27G y 1/2 pulgada de pared delgada con un protector rígido de aguja compuesto por FM27/0 (Daetwyler) y un protector rígido de polipropileno. Además, el vástago del émbolo comprendía un tapón de émbolo de caucho compuesto por caucho 4023/50 y revestimiento de etileno-tetrafluoroetileno (ETFE) FluroTec® (West Pharmaceutical Services, Inc.). El dispositivo de administración subcutánea también incluía un dispositivo de seguridad de la aguja, Ultrasafe Passive® Needle Guard X100L (Safety Syringes, Inc.). El dispositivo de administración subcutánea detallado anteriormente se denomina a continuación jeringa precargada con aguja estacada o "SIN PFS"

A fin de demostrar una estabilidad comparable del producto farmacéutico lebrikizumab en un vial al SIN PFS seleccionado, evaluamos la sustancia farmacéutica ^g M^p llenada a mano en viales de 2 cc o 1 mL de SIN PFS a 40°C/humedad relativa ambiente. Se evaluaron las tasas de degradación caracterizadas por cambios en el monómero por medio de cromatografía de exclusión por tamaño (SEC), así como cambios en el porcentaje del pico principal mediante enfoque isoeléctrico capilar por imágenes (ICIEF) y electroforesis capilar con dodecil sulfato sódico (CE-SDS).

Estos estudios revelaron que después del almacenamiento a 40°C durante 4 semanas, no hubo diferencias significativas en la disminución de monómero medida por SEC entre viales y SIN PFS (cada uno mostrando disminución de 0.6%-0.9%) o en la disminución del porcentaje de pico principal (cada uno mostrando disminución de 18-21% medida por ICIEF y disminución de 0.9%-1.5% medida por CE-SDS). Además, los perfiles cromatográficos eran comparables entre sí y no se observaron nuevos picos en las muestras SIN PFS en comparación con las muestras de vial.

Hubo ligeras diferencias en las tasas de degradación (0.5%-0.6% de aumento en especies de alto peso molecular para el vial vs. 0.8% de aumento en especies de alto peso molecular para el SIN PFS después de 4 semanas a 40°C). Se consideró improbable que esta ligera diferencia afectara a la calidad del producto durante el almacenamiento en tiempo real.

En consecuencia, concluimos que los datos descritos anteriormente muestran que la estabilidad del producto farmacéutico lebrikizumab de alta concentración formulado como se describe anteriormente en viales es comparable a la del SIN PFS seleccionado descrito anteriormente.

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Yadav, S.; Shire, S. J.; Kalonia, D. S. Investigación farmacéutica 2011, 28, 1973.

Claims (18)

REIVINDICACIONES

1. Una formulación que comprende un anticuerpo anti-IL13, en la que la concentración de anticuerpo en la formulación es de al menos 100 mg/mL y la viscosidad de la formulación es inferior a 15 centipoise (cP) a 25°C, en la que el anticuerpo anti-IL13 comprende una cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO : 10 y una cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID Núm.: 14, y en la que la formulación comprende entre 5 mM y 40 mM de tampón de acetato de histidina, ph 5,4 a 6,0, y un poliol y un tensioactivo, en el que la concentración del poliol en la formulación es entre 100 mM y 200 mM y la concentración del tensioactivo en la formulación es entre 0,01% y 0,1%, en el que el poliol es sacarosa y el tensioactivo es polisorbato 20.

2. La formulación de la reivindicación 1, en la que la concentración de anticuerpo es de 125 mg/mL.

3. La formulación de la reivindicación 1, en la que la concentración de anticuerpo es de 150 mg/mL.

4. La formulación de la reivindicación 1, en la que el tampón de acetato de histidina tiene un pH de 5,7 y la concentración de acetato de histidina en el tampón es de 20 mM, y en la que la concentración de sacarosa en la formulación es de 175 mM y la concentración de polisorbato 20 es de 0,03%.

5. La formulación de la reivindicación 4, en la que la concentración de anticuerpo es de 125 mg/mL.

6. La formulación de la reivindicación 4, en la que la concentración de anticuerpo es de 150 mg/mL.

7. Un artículo de fabricación que comprende la formulación de cualquiera de las reivindicaciones 1-6 y un dispositivo de administración subcutánea.

8. El artículo de fabricación de la reivindicación 7, en el que el dispositivo de administración subcutánea comprende una jeringa precargada.

9. El artículo de fabricación de la reivindicación 8, en el que la jeringa precargada comprende un cilindro de vidrio, una aguja y un protector de aguja.

10. El artículo de fabricación de la reivindicación 9 comprende además un vástago de émbolo y un tapón de émbolo.

11. El artículo de fabricación de la reivindicación 10, que además comprende un dispositivo de seguridad de la aguja.

12. El artículo de fabricación de cualquiera de las reivindicaciones 9-11, en el que el barril de vidrio comprende vidrio de borosilicato y contiene 0,3 mL, 1,0 mL o 2,0 mL de la formulación.

13. El artículo de fabricación de cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, en el que la aguja está clavada, es de acero inoxidable, de pared delgada 27G, de 1/2 pulgada de largo y punta de 5 biseles.

14. Una formulación de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para su uso en el tratamiento del asma.

15. La formulación para uso de acuerdo con la reivindicación 14, en la que la formulación se administra en una cantidad de 0,3 mL, un mL o dos mL.

16. Una formulación de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para su uso en el tratamiento de la fibrosis pulmonar idiopática.

17. La formulación para uso de acuerdo con la reivindicación 16, en la que la formulación se administra en una cantidad de 0,3 mL, un mL o dos mL.

18. Una formulación de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para su uso en el tratamiento de la dermatitis atópica.