KR20130006663A - 뉴클레오티드 전달을 높이기 위한 환원가능한 폴리(아미도 에틸렌이민)으로의 절단성 변형법 - Google Patents

뉴클레오티드 전달을 높이기 위한 환원가능한 폴리(아미도 에틸렌이민)으로의 절단성 변형법 Download PDF

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제임스 윌리엄 요크먼
조나단 에이취 브룸바취
김성완
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Abstract

폴리플렉스 포뮬레이션은, p(TETA/CBA)와 이의 페길화된 유사체인 p(TETA/CBA)-g-PEG2k를 이용하여 제조되며, 이들 2종이 각각 10/90 및 50/50 wt%인 혼합물이다. PEG wt%의 증가는 폴리플렉스 형성을 저해한다. 이러한 방법은, p(TETA/CBA)와 p(TETA/CBA)-g-PEG2k 산물의 혼합물을 이용하여 PEG wt%를 변경함으로써, 균질적인 폴리플렉스를 제조할 수 있음을 보여준다. 아울러, 한 단계로 이루어지는 p(TETA/CBA)-g-PEG2k의 제조 방법을 개시한다.

Description

뉴클레오티드 전달을 높이기 위한 환원가능한 폴리(아미도 에틸렌이민)으로의 절단성 변형법 {CLEAVABLE MODIFICATIONS TO REDUCIBLE POLY(AMIDO ETHYLENIMINE)S TO ENHANCE NUCLEOTIDE DELIVERY}
유전자 요법은, 기존 요법들이 현재 다루고 있는 유전자 질환을 치료하기 위한 실현가능한 대안책이다. 그러나, 안전하고 효과적인 핵산 캐리어를 개발하기에는 불확실한 설계와 제형 요건들로 인해 임상적인 성공을 거두지 못하고 있다. 최근 연구가 진전되어, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 및/또는 세포 특이적인 타겟팅 리간드를 이용하여 표면 전하 및/또는 조직 특이성을 변형시키는 캐리어 변형을 통해, 캐리어 안전성과 효능에 대한 개선이 이루어지고 있다 (1). 폴리머형의 비-바이러스성 유전자 캐리어는, 신중하게 설계되는 경우, 이들 캐리어가 비-면역원성이고, 다중 기능적 특성들을 나타내도록 쉽게 변형가능하기 때문에, 매우 유익하다 (2). 또한, 비-바이러스성 폴리양이온(polycation) 역시 비교적 비용 측면에서 효율적이며, 공업적으로 제조하기 용이하고, 다량의 치료학적 핵산을 운반할 수 있다 (3, 4).
선형, 분지형 또는 덴드론 구조로 구성된, 다수의 구조적으로 다양한 폴리머 및 코폴리머들을 대상으로, 시험관내 및 생체내 사용시 그 효능과 적합성이 조사되어 왔다. 폴리에틸렌이민 유전자 캐리어 (PEI: polyethylenimine gene carrier)에 대해 가장 많은 연구가 이루어졌으며, 이것은, 핵산을 혈청 뉴클레아제에 의한 분해로부터 보호하고 다수의 세포 타입들에서 시험관내 및 생체내에서 트랜스유전자를 상대적으로 고수준으로 전달 및 발현시키는, 핵산/폴리양이온 나노입자 (폴리플렉스)로 쉽게 DNA를 축합시키기 때문에, 당해 기술 분야의 표준 물질이다. 공교롭게도, PEI는 종종 비-분해성 폴리양이온의 세포내 축적으로 인해 세포 독성을 나타낸다 (3, 5). 폴리양이온의 전하 밀도에 영향을 주는, PEI의 분자량 및 분지(branching)의 증가는, 트랜스유전자의 발현 증가와 상관관계가 있지만, 또한 세포 독성을 나타낸다. 반대로, 저분자량의 PEI는 세포 독성이 낮지만, 트랜스유전자 발현 감소와 상관관계가 있다 (6, 7). 예측된 바와 같이, 폴리(아미도아민) (SS-PAA), 폴리(아미도에틸렌이민) (SS-PAEI) 및 폴리(b-아미노에스테르) 패밀리와 같은 분해가능한 유전자 캐리어 디자인이, PEI와 비교하여, 유사하거나 개선된 활성과 낮은 세포 독성을 나타내는 것으로 입증되었다 (8, 9, 10). 환원가능한 SS-PAEI는 PEI 패밀리의 합성 유사체이지만, 전술한 이점을 가진다 (11). 최근 과분지화된 SS-PAA에 대한 결과가 기술된 요약문에 의하면, 상기 SS-PAA는 플라스미드 DNA (pDNA)를 bPEI25kDa과 비슷한 크기를 가진 폴리플렉스로 축합시킬 수 있으며, 추가적인 기능 연구들이 촉진되었다 (12).
대개, 양이온성 폴리플렉스는 혈청에서 발견되는 음의 순하전(net charge)을 가진 단백질과 상호작용하여, 종종 입자 응집과 시험관내 및 생체내 효능 감소를 유발한다 (13, 14, 15). 이러한 문제를 해결하기 위해, 폴리양이온에 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG)를 접합시키는 방법이 채택되었으며, 연구를 통해 페길화가 혈청 존재시에 캐리어 기능을 대개 개선시키는 것으로 확인되었다. 그러나, 또한, 기존의 연구들에서, PEI, 특히 저분자량 (LMW)의 PEI (~5 kDa)에 대한 타겟 리간드 및/또는 PEG의 접합 증가가, 폴리플렉스 형성과 캐리어 기능에 부정적으로 작용하는 것으로 명확하게 확인된 바 있다 (16, 17).
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디자인, 보다 중요하게는, 과분지화된 SS-PAEI 및 이의 대응되는 그래프트 PEG 코폴리머의 포뮬레이션에 대한 이해를 개선시키기 위해, 수개의 SS-PAEI 폴리양이온성 유전자 캐리어를 합성하여, 폴리플렉스 형성, 크기, 표면 전하, 형태, 혈청 안정성 및 궁극적으로 생물학적 활성에 대한, PEG/폴리양이온 wt% 변화에 따른 영향을 연구하였고, 이를 본원에 기술한다. 컴플렉스 플라스미드 DNA 또는 siRNA과의 폴리플렉스 포뮬레이션을, SS-PAEI인 p(TETA/CBA)와 이의 페길화된 카운터파트(PEGylated counterpart)인 p(TETA/CBA)-g-PEG2k를 이용하거나, 또는 이들 2종의 각각 10/90 및 50/50 wt/wt%로 구성된 혼합물을 이용하여 제조하였다. 폴리플렉스 조성을 용이하게 변형할 수 있는 적합한 전략을 확인하고, 합성이 용이한 적정 포뮬레이션을 확인하기 위해, 다양한 wt/wt%를 사용하였다.
본 발명에 따른 예시적인 조성물은 폴리(TETA/CBA)과 폴리에틸렌 글리콜의 그래프트 코폴리머를 포함한다.
본 발명의 다른 예시적인 구현예는 핵산; 및 폴리(TETA/CBA)과 폴리에틸렌 글리콜의 그래프트 코폴리머를 포함하는 컴플렉스를 포함한다. 상기 핵산은 플라스미드 DNA 또는 siRNA를 예로 포함할 수 있다. 상기 컴플렉스는 상기 그래프트 코폴리머와 혼재되는 폴리(TETA/CBA)를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 예시적인 구현예는 폴리(TETA/CBA)와 폴리(TETA/CBA) 및 폴리에틸렌 글리콜의 그래프트 코폴리머로 이루어진 혼합체를 포함한다.
본 발명의 또 다른 예시적인 구현예는, 세포에 핵산과 폴리(TETA/CBA) 및 폴리에틸렌 글리콜의 그래프트 코폴리머를 포함하는 컴플렉스를 접촉시키는 단계를 포함하는, 세포의 형질전환 방법을 포함한다. 상기 핵산은 예로 플라스미드 DNA 또는 siRNA를 포함할 수 있다. 상기 컴플렉스는 상기 그래프트 코폴리머와 혼재되는 폴리(TETA/CBA)를 추가로 포함할 수 있다.
계획 1은 본 발명에 따른 p(TETA/CBA)1k 및 p(TETA/CBA)5k의 합성을 도식적으로 나타낸다.
계획 2는 본 발명에 따른 p(TETA/CBA)5k-g-PEG2k의 합성안을 나타낸다. 또한, 100 wt% p(TETA/CBA)5k, 10/90 wt% p(TETA/CBA)5k-g-PEG2k, 50/50 wt% p(TETA/CBA)5k-g-PEG2k, 100 wt% p(TETA/CBA)5k-g-PEG2k, 및 SS-PAEI + PEG2k가 도시된다.
계획 3은 본 발명에 따른 p(TETA/CBA)-g-PEG2k의 "단일 단계" 합성안을 나타낸다.
도 1A-D는, pCMVLuc와 여러가지 분자량의 p(TETA/CBA) 유사체들이 조합되어 형성된 폴리플렉스의, SVR (도 1A 및 1C) 및 HUVEC (도 1B 및 1D) 내피 세포에서의, 양성 대조군 (bPEI 25kDa) 대비, 형질전환 효율 (도 1A 및 1B)과 세포 생존성 (도 1C 및 1D)을 나타낸다. 시판용 bPEI 폴리플렉스는 N/P 10로 제조하였고, p(TETA/CBA) 폴리플렉스는 w/w 24로 제조하였다.
도 2A 및 2B는 여러가지 분자량의 p(TETA/CBA)의 형질전환 효율과 세포 생존성을 각각 나타낸다.
도 3은 배양 배지에 10% 혈청 첨가 (체크 막대) 및 혈청 무첨가 (가로줄 무늬 막대)시의 p(TETA/CBA)5k/pCMVLuc의 형질전환 효율을 비교한 것이다. 형질전환 효율은 루시퍼라제 트랜스유전자 발현에 의해 평가하였다. p(TETA/CBA)는 혈청이 첨가된 배지에서 bPEI 25kDa 보다 리포터 트랜스유전자를 더 강하게 발현시키지만, 혈청 무첨가시에는 교란된 성능이 확인된다.
도 4A 및 4B는 각각 기지량의 pDNA와 농도를 점차적으로 증가시킨 폴리머를 이용한, p(TETA/CBA)5k (체크 막대) 및 p(TETA/CBA)5k-g-PEG2k/pCMVLuc (가로줄 무늬 막대) 폴리플렉스의 입자 크기와 제타-전위 값을 나타낸 것이다.
도 5A는 p(TETA/CBA)5k, 폴리(TETA/CBA)5k-g-PEG2k, 및 p(TETA/CBA)5k-g-PEG2k 및 p(TETA/CBA)5k 각각에 대한 10/90 (10% PEG) 및 50/50 (50% PEG) wt/wt% 포뮬레이션의, 90% 토끼 혈청항 37℃에서의 폴리플렉스 안정성을 나타내며, 500 ng pCMVLuc를 각 포뮬레이션 (w/w 24)과 복합체화하였다.
도 5B는 0 시간 대조군 대비 경시적인 무손상 pBLuc의 상대적인 픽셀 강도 %를 나타낸다: (◇) 대조군 (유리형 pDNA); (■) p(TETA/CBA); (△) p(TETA/CBA)-PEG2kDa (10%); (▽) p(TETA/CBA)-PEG2kDa (50%); (●) p(TETA/CBA)-PEG2kDa (100%).
도 6A-D는 p(TETA/CBA)5k, 10% PEG, 50% PEG, 및 p(TETA/CBA)-PEG2k 폴리플렉스 포뮬레이션을 각각 TEM으로 가시화하여 나타낸 것이다.
도 6E는 bPEI, p(TETA/CBA), 10% PEG 및 50% PEG의 입자 크기 (소형 체크)와 제타 전위 (큰 체크)를 나타낸 것이다.
도 6F는 TME (큰 체크 막대) 및 다이나믹 광 산란 (DSL; 소형 체크 막대)으로 p(TETA/CBA), 10% PEG 및 50% PEG 폴리플렉스의 크기를 비교한 것이다.
도 7A 및 7B는 혈청 첨가 및 무첨가 조건에서의 p(TETA/CBA)5k, 10/90, 50/50, 및 0/100% p(TETA/CBA)5k/p(TETA/CBA)5k-g-PEG2k wt% 폴리플렉스 포뮬레이션들의 형질전환 효율 (도 7A)과 세포 생존성 (도 7B)을 나타낸 것이다.
도 8은 폴리머들을 여러가지 중량% 비율로, 그리고 여러가지 중량/중량 비율의 폴리머(들) : siRNA로 혼합하였을 때의, 나노복합체의 입자 크기를 나타낸 것이다.
도 9A-F는 넓은 중량% 범위에서의 p(TETA/CBA)-g-PEG2k와 PEG 포뮬레이션의 형질전환 효율을 나타낸 것이다.
도 10은 페길화율 증가가 90% 혈청에서의 복합체의 안정성을 감소시킴을 나타낸 것이다.
도 11A-C는 p(TETA/CBA)-g-PEG2k/p(TETA/CBA)와의 나노복합체로서 마우스 주사 후 플라스미드 DNA의 생물내 분포 패턴을 나타낸 것이다.
도 12는 siRNA/p(TETA/CBA)-g-PEG를 55 ㎍으로 정맥내 또는 국소 피하 주입한 후 mHIF-1a의 저해를 나타낸 것이다.
환원가능한 폴리(아미도 에틸렌이민) 및 방법에 대한 본원의 개선 사항을 기술 및 설명하기 전에, 본 발명이 본 발명에 기술된 특정한 구성, 제조 단계 및 재료로 한정되지 않으며, 그러한 구성, 제조 단계 및 재료가 다소 변경될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 본원에서 사용되는 용어는 단순히 구체적인 구현예를 설명하기 위한 목적으로 사용된 것일 뿐, 본 발명의 범위는 첨부된 청구항과 이와 등가의 내용으로만 정해질 것이므로 이를 제한하고자 하는 의도는 아닌 것으로 이해되어야 한다.
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본 발명을 기술하고 청구함에 있어서, 후술하는 정의에 따라 아래 용어들이 사용될 것이다.
본원에서, "포함하는", "비롯하여", "함유하는", "으로 특정되는" 및 이의 문법적으로 동일한 용어들은, 포괄적이거나, 또는 추가적인, 언급되지 않은 요소 또는 방법 단계들을 배제시키지 않는 비제한적인 용어이다. "포함하는"은 보다 제한적인 용어 "으로 구성된" 및 "으로 필수적으로 구성된"을 포괄하는 것으로 해석된다. 본원에서, "으로 구성된" 및 이의 문법상 동의어는 청구항에 명시되지 않은 임의의 요소, 단계 또는 구성 성분을 배제한다. 본원에서, "으로 필수적으로 구성된" 및 이의 문법상 동의어는 청구항의 범위를 명시된 물질 또는 단계와 청구된 본 발명의 기본적인 및 새로운 특징 또는 특징들에 실질적으로 작용하지 않는 것으로 한정된다.
폴리양이온 유전자 캐리어는 불명확한 디자인과 포뮬레이션 요건들로 인해 임상적인 진전을 이루기 어렵다. 본 연구에서, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)와 분지형 SS-PAEI의 그래프트 코폴리머를 합성할 수 있으며, 상대적인 PEG 중량%를 변경하는 포뮬레이션으로 폴리양이온 SS-PAEI와 함께 사용하였고, 그에 따라 유전자 캐리어 집단군의 물리화학적 특징들을, 유전자 캐리어의 생물학적 활성을 개선시키기 위한 디자인과 포뮬레이션 요건을 쉽게 연구할 수 있도록 변형시킬 수 있음을 보여준다. PEG 및/또는 타겟팅 리간드 접합체가 폴리플렉스의 포뮬레이션과 캐리어 기능을 방해할 수 있다는 것을 인지하여, 본 연구에서는, 기능적으로 수행가능한 p(TETA/CBA) 및 p(TETA/CBA)-g-PEG2k 산물들의 혼합물을 이용하여 PEG의 wt%를 변경함으로써, 이러한 문제점을 해결하고 균질적인 폴리플렉스를 제조할 수 있다는 실현 가능성을 입증한다.
본 연구에서, 혈청 존재시의 캐리어의 성능을 개선시키기 위해, 폴리에틸렌 글리콜이 조합된 효율적이고 무독성이며 생물환원성인 폴리양이온을 포함하는 새로운 유전자 캐리어를 개발하게 되었다. 아울러, PEG wt%를 변경하여 폴리양이온성-PEG 코폴리머 포뮬레이션을 맞춤 제작하고, 이상적인 유전자 캐리어 기능을 위한 최적의 물리화학적 특성을 획득하기 위한 실현가능한 용이한 방법을 제공한다. 이렇게 함으로써, 시험관내에서 사용하기에 바람직한 물리화학적 특성을 가진 유전자 캐리어가 설계된 경우, 유전자 전달용 코폴리머의 복수 합성을 방지할 수 있으며, 또한 용이한 생체내 평가에도 사용할 수 있다.
비스아크릴아미드기를 TETA와 함께 비통제적 미카엘-부가 반응을 수행한 후, p(TETA/CBA) PDI를 감소시키기 위해, 기존에 사용되는 것 (11) 보다 고분자량의 컷 오프 막 (5 kDa)을 이용하여 한외여과를 수행하였다. 예상된 바와 같이, 이러한 방식은 PDI를 낮추는데 유효하였으며, 분자량의 상대적인 증가와 관련있었다. 폴리에틸렌이민 분자량 증가 및 분지 형성 프로파일이 트랜스유전자의 발현 및 세포 독성과 관련있는 것으로 확인되고 있기 때문에, 본 연구에서는 p(TETA/CBA)를 이용하여 이러한 추정 효과를 조사하였고, 그 결과 초대 및 불멸화된 내피 세포주에서 이의 생물학적 활성에는 현저한 효과가 없음을 확하였다 (6, 7). 이러한 결과들은, 유전자 캐리어의 세포내 환원 전위 활용력과 비교적 고분자량의 폴리양이온 종들에 의한 세포내 기능 파괴 방지 능력에 의해 설명된다 (21).
p(TETA/CBA)는 혈청 첨가 배지에서 bPEI 25kDa 보다 현저하게 우수한 트랜스유전자 발현성을 나타내었지만, p(TETA/CBA) 전달 용량은 혈첨 무첨가 조건에서의 활성과 비교하여 매우 낮았다. 따라서, p(TETA/CBA)/pDNA 폴리플렉스와 혈청 단백질의 상호작용을 감소시켜, 혈청 무첨가 조건에서의 캐리어 기능을 개선시키기 위해, 폴리에틸렌 글리콜을 동일 몰 비로 p(TETA/CBA)5k와 접합하였고, 이를 정제한 다음 1H NMR로 검증하였다. 또한, 대응되는 상대적인 분자량도 AKTA FPLC에 의한 분석시, 동일 몰비의 접합체에서 예상되는 바와 일치하였다. p(TETA/CBA)5k에 폴리에틸글리콜을 접합시키면, 폴리플렉스의 표면 전하가 낮아져, 핵산 축합에 불리해진다 (16, 22). 세포 특이적인 유전자 전달을 위한 폴리에틸렌 글리콜 및/또는 리간드 접합체는 일반적으로 핵산의 축합을 감소시키기 때문에, 캐리어의 최대 성능에 가장 바람직한 비율을 확정하기 위해서는, 복수의 코폴리머 유전자 캐리어의 합성이 요구된다. 이러한 문제점을 해결하고, 스크리닝용 캐리어를 복수로 합성하여야 하는 필요성을 없애기 위한 시도로, 본 연구에서는 폴리양이온과 이의 대응되는 페길화된 카운터파트로 이루어진 혼합물들을 포뮬레이션함으로써, PEG/폴리양이온 wt%(또는 비율)을 최적화할 수 있는 실행가능성을 조사하였다. p(TETA/CBA)5k 단독, p(TETA/CBA)5k-PEG2k 단독, 및 10/90 또는 50/50 wt%의 p(TETA/CBA)5k-PEG2k/ p(TETA/CBA)5k 각각으로 구성된 폴리플렉스의, 혈청에서의 안정성을 본 연구에서 평가하였다. p(TETA/CBA) 및 10/90%로 제조된 폴리플렉스는 6시간 동안 혈청에서의 뉴클레아제에 의한 분해로부터 pDNA를 최대 70%로 충분히 보호한다. p(TETA/CBA)5k-PEG2k wt%를 50 및 100%로 높이면, 혈청에서의 상대적인 pDNA 보호성은 낮아지는데, 이러한 현상은 DLS 및 TEM에 의하면, 각 포뮬레이션의 pDNA를 나노 크기의 폴리플렉스로 축합시키는 능력과 관련있다.
루시퍼라제 트랜스유전자 발현과 세포 생존성을 전술한 제형을 이용하여 세포 배양으로 연구하여, 이의 생활성을 평가하였다. 폴리에틸렌 글리콜은 p(TETA/CBA) 단독에 비해 혈청이 첨가된 배지에서 유전자 전달을 향상시킬 수 있었지만, 이러한 향상은 특정한 폴리에틸렌 글리콜 비율에서만 관찰되었다. 이러한 결과는, 폴리에틸렌 글리콜/폴리양이온 비율을 변경하여, 캐리어의 기능을 개선시키기 위한 폴리에틸렌 글리콜의 비율을 용이하게 연구 및 최적화하고, 유전자 캐리어를 최적화하기 위해 현재 채택되는 여러가지 물리화학적 특징을 가진 생물환원성 코폴리머들의 복수개 합성을 방지할 수 있다.
실험 및 프로토콜
재료 및 방법
재료. 트리에틸렌테트라민 (TETA), 트리스(2-카르복시에틸)포스핀) (TCEP), N-에틸말레이미드 (NEM), 과분지화된 폴리에틸렌이민 (bPEI, Mw 25 000) 및 HPLC 등급의 메탄올은 시그마-알드리치(St. Louis, Missouri)로부터 구입하였다. 시스타민 비스아크릴아미드 (CBA)는 폴리사이언스 Inc. (Warrington, Pennsylvania)로부터 구입하였다. 한외여과 장치와 재생 셀룰로스 막 (1 kDa, 5 kDa 및 10 kDa)은 밀리포어 코포레이션 (Billerico, Massachusetts)으로부터 구입하였다. 리포터 유전자 플라스미드 pCMVLuc는 pCMV 프로모터에 의해 구동되는 pCI 플라스미드 (Promega, Madison, Wisconsin)에 루시퍼라제 cDNA를 삽입함으로써 구축하였고, 맥시프렙 (Invitrogen, Carlsbad, California) 프로토콜을 이용하여 정제하였다. 둘베코의 변형된 이글스 배지(DMEM : Dulbecco's Modified Eagle's Medium), 페니실린, 스트렙토마이신, 트립신 유사 유전자 (TrypLE Express), 및 둘베코 포스페이트 완충화된 염수는 Gibco BRL (Carlsbad, California)로부터 구입하였다. EBM-2와 EGM-2 싱글쿼트(singlequot)는 Lonza (Basel, Switzerland)로부터 구입하였다. 소 태아 혈청 (FBS)은 Hyclone Laboratories (Logan, Utah)로부터 구입하였다.
폴리머 합성. p(TETA/CBA). p(TETA/CBA)의 합성은 50℃에서 종래의 방법을 변형시켜 수행하였다 (1). 중합 반응물은 pH를 7.0으로 적정한 후 절반으로 분할한 다음, 한외여과 및 1 kDa 또는 5 kDa MWCO 재생 셀룰로스 막을 이용하여 정제하고, 동결건조하였다 (계획 1).
p(TETA/CBA)5k-g-2k. 메톡시 PEG 2k를 무수 톨루엔을 이용하여 건조한 다음, 무수 빙냉한 에테르 중에서 석출시켰다. 백색 석출물을 수집하여, 진공 건조하였다. 그런 후, 용매로서 DCM (디클로로메탄) 중에서 p-니트로페닐 클로로포르메이트를 이용하여 mPEG2k를 활성화시키고, 얼음 위에서 교반하면서 반응시켰다. 활성화된 PEG 산물을 무수 빙랭한 에테르 중에서 석출시켜 수집하여, 이를 진공 건조하였다. PEG 활성화도를 평가하기 위한 NMR 분석을 수행한 후, p(TETA/CBA)5k 및 동일 몰의 활성형 PEG2k를 용매로서 무수 피리딘/DMSO에 용해하고, 폴리(에틸렌 글리콜)-카보네이트 용액을 상기 용해시킨 p(TETA/CBA)5k에 점적 첨가하였다. 반응물을 실온에서 교반하고, UV-VIZ로 400 nm에서 모니터닝하였다. 반응은 약 16시간에 완료되었다. 이를 한외여과 (5kDa MWCO)하여 정제한 다음 동결건조하였다. 또한, PEG5k 및 PEG10k를 이용한 접합도 유사한 방식으로 수행하되, 각각 10 또는 20 kDa MWCO의 재생 셀룰로스 막을 이용하여 정제한 다음 동결건조하였다. 폴리(TETA/CBA)-g-PEG 코폴리머 접합체의 조성물을 1H NMR로 모니터링하여, 적정한 곡선 하 면적 (AUC)을 적분함으로써 PEG 접합체의 상대적인 양을 평가하였다. 1H NMR 스펙트럼은 Varian Inova 400 MHZ NMR spectrometer (Varian, Palo Alto, California)에서 표준 프로톤 파라미터를 이용하여 입수하였다. 화학적 쉬프트는 약 4.7 ppm의 잔류 H2O 공명을 참조하였다.
폴리머 특징 . p(TETA/CBA)1k, p(TETA/CBA)5k 및 p(TETA/CBA)5k-PEG2k를 대상으로 상대적인 분자량 분석을 AKTA/FPLC (Amersham Pharmacia Biotech Inc.)로 수행하였다. 슈퍼덱스 펩타이드 컬럼 HR 10/30을 이용하여, p(TETA/CBA)1k (2 mg/mL)을 분석하였다. 30% (v/v) 아세틸 니트릴 용리제가 첨가된 용리 완충제 (0.3 M NaAc, pH 4.4)를 사용 전에 0.2 mm 필터 (Nylon, Alltech)를 통해 여과하여 탈기하였다. 유속은 0.4 mL/분으로 설정하였다. 2 kDa - 10 kDa 범위의 표준물질 폴리(하이드록시프로필 메타크릴산) (폴리(HMPA))을 이용하여, 표준 곡선(calibration curve)을 제작하였다. 이와 동일한 조건에서 p(TETA/CBA)5k와 p(TETA/CBA)5k-PEG2k를 분석하였고, 이때 Superose 6 10/300 GL 컬럼과, 40 kDa - 150 kDa 범위의 폴리(HMPA) 표준물질을 사용하였다.
폴리양이온 분지형성(Branching). 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 하이드로클로라이드 (TCEP) 및 N-에틸말레이미드 (NEM) 각각을 이용한 이황화 결합의 환원 및 보호를 통해, 상대적인 분지형성도(relative degree of branching)를 측정하였다 (5). 폴리머 반복 단위 NEM 접합체를 대상으로 MALDI-TOF 분석을 수행하였다. MALDI-TOF 분석은 Voyager-DE STR Biospectrometry Workstation (PerSeptive Biosystems)에서 양이온 모드와 지연 추출(delayed extraction) 조건에서 수행하였다. 325 - 2465의 명목상 질량 범위를 포괄하는 펩타이드 표준 혼합물을 이용하여, 스펙트럼을 외연적으로 표준화하였다.
신-염기 타이트레이션(titration). 각 폴리양이온의 완충 용량을 기존에 확인된 방법을 이용하여 결정하였다 (14). 간략하게, 폴리머 6 mg을 (0.1 M) NaCl 용액 30 mL에 용해한 다음 먼저 0.1 M NaOH로 pH10으로 적정하였다. 그런 후, 0.1 M HCl을 첨가하여 pH를 낮추었다. 이들 폴리머에 대한 절대 분자량을 모르기 때문에, 타이트레이션 값은 폴리양이온 용액의 pH를 7.4 - 5.1로부터 낮추는데 필요한 HCl mmol로서 표시하며, 기준 대조군으로서 bPEIk 25 kDa을 사용한다.
광 산란 및 z-전위 측정. 표면 전하와 폴리머/pDNA 입자 (폴리플렉스)의 직경을 각각 Zetasizer 2000 장치 (DTS5001 cell)와 Malvern 4700 시스템의 다이나믹 광 산란 (DLS) 유닛을 이용하여 25℃에서 측정하였다. HEPES 완충액 (200 ml) 중의 원하는 농도의 15 mg pDNA와 더불어, HEPES 완충액 (20 mM, pH 7.4, 5% 글루코스) 중에 농도를 증가시키면서 동일 부피의 폴리머 용액 (200 ml)을 첨가함으로써, 폴리플렉스를 제조하였다. 폴리플렉스를 30분간 평형화시킨 후, milliQ 여과수에 최종 부피 2 mL로 희석하였다.
투과 전자 현미경 (TEM). 폴리플렉스를 HEPES 완충액(20 mM, pH 7.4, 5% 글루코스)에 0.05 mg/ml로 용해시켜 준비하여, 5 ml을 TEM 구리 그리드 플레이트에 올려 건조시켰다. 각 그리드를 여과한 탈이온수로 3번 조심스럽게 세척하여, 완충액의 잔류 염을 제거하였다. 그런 후, 샘플을 여과한 포스포텅스텐산 (PTA)으로 1분간 염색한 다음, 다시 여과한 탈이온수로 세척하였다. Technai T12 scope (EFM)에서 80 kV로 이미지를 가시화하였다. 배율은 20,000 - 200,000x를 이용하였고, 현미경 사진을 110,000x에서 촬영하였다.
90 % 토끼의 신선 혈청에서의 폴리플렉스의 안정성. 폴리플렉스의 혈청에서의 안정성을 최적화된 프로토콜로 평가하였다. 간략하게는, 500 ng의 유리형 pDNA 또는 폴리머/pDNA 폴리플렉스를, 폴리/pDNA 24 중량 대 중량 (w/w)로 동일 부피로 용액을 혼합하여, HEPES 완충액 중에서 형성시키고, 30분간 평형화되도록 하였다. 그런 다음, 사전 형성시킨 폴리플렉스를 90%의 신선한 토끼 혈청으로 희석하여, 경시적으로 37℃에서 인큐베이션하였다. 각 시간대에 분액 25 ml (125 ng pDNA)을 취하고, 그 각각에 10 ml의 정지 완충액 (250 mM NaCl, 25 mM EDTA, 2 % SDS)을 첨가하였다. 이 샘플은 추후 분석하기 전까지 -70℃에서 냉동시켰다. 샘플을 해동한 후, 밤새 60℃에서 인큐베이션하여, pDNA로부터 폴리양이온을 완전히 해리시키고, 각 샘플에 50 mM DTT 2 ml을 첨가한 다음 다시 30분간 37℃에서 인큐베이션하여, 완전한 탈착물화(decomplexation)가 이루어지도록 하였다. 마지막으로, 샘플을 에티듐 브로마이드(EtBr)로 염색된 2% 아가로스 겔에 로딩하여, TAE 완충액 (40 mM 트리스-아세테이트, 1 mM EDTA) 중에서 30분간 96 V로 정기 영동을 실시하였다. GelDoc 소프트웨어로 겔 이미지를 확인하였다.
세포 배양. 마우스 췌장 섬 내피세포 (SVR)와 결장 선암종 세포 (CT-26) (ATCC, Manasses, Virginia)를 10% FBS와 1% 페니실린-스트렙토마이신이 첨가된 DMEM에서, 5% (v/v) CO2 분위기의 가습 인큐베이터를 이용하여 37℃에서 배양하였다. 인간 제대 정맥 내피세포 (HUVEC) (Invitrogen)를 EBM-2 + EGM-2 싱글쿼트 배지에서, 5% (v/v) CO2 분위기의 가습 인큐베이터를 이용하여 37℃에서 배양하였다.
시험관내 트랜스유전자의 발현. 각 폴리머와 pCMVLuc 플라스미드 DNA를 이용하여 세포 배양시의 루시퍼라제 리포터 유전자 발현을 수행하였다. 세포를 배지 0.5 mL이 들어있는 24웰 플레이트에 접종하였다. 세포가 70% 컨플루언시에 도달하면, HEPES 완충액 중에서 0.5 mg의 pDNA를 중량 대 중량(w/w) 비 24로 이용하여, 폴리플렉스를 제조하였다. 폴리플렉스를 30분간 평형화시키고, 혈청 존재 하에 세포에 형질전환시켰다. 각 웰에 폴리플렉스 (0.5 mg pDNA) 20 ml을 첨가하여, 4시간 동안 인큐베이션하였다. 배양 배지는 신선한 혈청 첨가 배지로 교체하였으며, 세포가 인큐베이터에 머무르는 총 시간은 48시간이었다. 그 후, 세포를 1 ml PBS로 헹구고, 세포 배양물 용혈 완충액 (Promega, Madison, Wisconsin)을 처리하였다. Dynex Technologies, Inc. (Chantilly, Virginia) 사의 루미노미터에서 루시퍼라제 분석 시스템 (Promega)을 이용하여 루시퍼라제 정량을 수행하였다. 세포 용혈물에서의 단백질 양을 소 혈청 알부민의 표준 곡선 (Sigma, St. Louis, Missouri)과 BCA 단백질 분석 키트 (Pierce, Rockford, Illinois) (n=4)를 이용하여 결정하였다.
세포 생존성 분석. 세포를 24웰 플레이트에 접종하고, 세포의 컨플루언시가 약 70%에 도달하였을 때, 형질전환을 수행하였다. 폴리플렉스는 루시퍼라제 리포터 유전자 분석에서와 같이 제조하였다. 각 웰에 HEPES 완충 용액 중의 평형화된 폴리플렉스 (0.5 mg pDNA) 20 ml을 첨가하여, 혈청의 존재 하에 각 세포 배양물에 대한 형질전환을 수행하였다. 세포는 MTT 분석 (Sigma)으로 세포 생존성을 분석하기 전까지 총 18시간 동안 인큐베이션하였다. 세포 생존성 %는 무처리 세포 (n=4)를 기준으로 측정하였다.
결과
1. (TETA/CBA)5k의 2단계 합성 및 특정화
합성 및 특정화. p(TETA/CBA). p(TETA/CBA)는 매우 효과적인 유전자 캐리어인 것으로 입증되어 있으며, 과분지화된 구조를 조작하여 유의한 세포 독성이 없는 다양한 분지형 구조들을 만들 수 있다. 이후 테스트를 위해, 계획 1에 나타낸 바와 같이 샘플들을 합성하고, 정제하였다. 중합은 TETA 단량체에 존재하는 아민에 CBA 단량체를 미카겔 반응으로 부가하여 이루어진다. TETA 단량체에는 4개의 반응성 아민기들이 존재하기 때문에, 이들의 겔화 전에 고도로 분지화된 산물을 수득할 수 있다. 중합 반응은 100 % MeOH 중에서 여러가지 온도에서 수행하였고, 1H NMR로 모니터링하였다. 각 샘플에서의 분지 형성 수준은 합성 온도와 연관있는 것으로 확인되었다 (데이타 미기재함). 1 kDa, 5kDa 또는 10 kDa MWCO의 초미세 여과 막을 이용하여 샘플에서 올리고머 폴리양이온을 제외시키면, 예상된 바와 같이, 샘플의 다분산 지수(PDI)는 감소하였고, 이는 FPLC로 모니터링하였을 때 샘플의 상대적인 분자량과 또한 연관있었다. 또한, 비교를 위해 외부 대조군으로서 시판용 bPEI25k를 사용하였다. bPEI25K의 Mn 값과 Mw 값은 GPC 분석에서 낮게 추정되므로, 폴리(TET/CBA) 분자량을 추정하기 위한 외삽이 필요하다. 또한, p(TETA/CBA)5k는 오리지날 정제 방법으로 수득되는 샘플과 유사한 완충력을 가지고 있다 (표 1).
샘플 Mn (kDa)a Mw (kDa)a PDI (Mw/Mn) 타이트레이션b (μmol HCl) 분지화도c
p(TETA/CBA)1k 4.2 8.2 1.95 25.2 0.68
p(TETA/CBA)5k 5.8 8.85 1.53 27.6 0.91
p(TETA/CBA)5k-g-PEG2k 8.9 10.6 1.19 22.3 --
bPEI 25 kDa 16.4 21.0 1.28 32 --
a FPLC로 결정된, 수 평균 분자량 (Mn), 중량 평균 분자량 (Mw), 다분산 (Mw/Mn).
b 0.1 M NaCl 수용액에서 pH를 7.4에서 5.1로 바꾸는데 필요한 HCl 몰 수에 의해 결정되는 폴리머 분획의 완충력 타이트레이션.
c MALDI-TOF로 결정되는 분지화도.
p(TETA/CBA)5k-PEG2k. 페길화는 혈청 존재시 시험관내 및 생체내에서 폴리양이온 캐리어의 기능을 향상시킬 수 있으며, 이는 대부분 폴리플렉스의 표면 전하 때문이다. 그러나, 표면 순하전이 중성인 입자는 이의 이온 반발력 감소로 인해 용액에서 응집되는 경향이 있다. 따라서, 모델 시스템으로서 무독성의 분지형 폴리양이온의 입자 특징 및 기능성에 대한 효과를 평가하기 위해, PEG 대 p(TETA/CBA) 폴리양이온의 중량% (wt%)의 용이한 조절이 필요한 경우, p(TETA/CBA)5k와 함께 혼합할 수 있는 p(TETA/CBA)5k-페길화된 산물을 합성하였다 (계획 2). PEG와 폴리양이온의 접합은 표준 곡선을 이용하여 UV-VIZ 스펙트로포토미터에서 400 nm에서 모니터링하였다. 반응은 16시간까지 완료되었다. 또한, 전술한 바와 같이, mPEG5k와 mPEG10k를 접합시켰으나, 이들 그래프트 코폴리머는 나노크기의 입자를 형성할 수 없거나 또는 트래스유전자의 발현을 제공하지 못하였다 (데이타 미기재). NMR 분석과 피크의 AUC 비교를 통해, PEG:(TETA/CBA)5k는 약 0.96/1 mol로 추정되었으며, 이는 AKTA FPLC 분석 결과 (표 1)와 매우 일치되었다.
p(TETA/CBA) PDI 및 분자량의 생물 활성 효과. 앞서 언급한 바와 같이, LMW PEI는 낮은 N/P 비율에서 제한적인 pDNA 축합을 나타내는데, 이는 대개 PEG 접합에 의해 교란되므로, 불안정하게 만드는 올리고머를 제거하고 평균 분자량을 높이므로써 캐리어 성능을 교란하지 않으면서 p(TETA/CBA)의 PDI를 낮추는 것이 바람직하다 (17). 도 1A-D에 나타낸 바와 같이, p(TETA/CBA) PDI 감소와 상관관계를 보이는 분자량 증가는 캐리어 성능에 역효과를 나타내지 않는다. p(TETA/CBA)1k에 대한 오리지날 합성 및 정제 방법과 마찬가지로 수행하였다. 보다 구체적으로, p(TETA/CBA)5k는 초대 HUVEC 세포에서 현 표준물질 bPEI 25 kDa 보다 독성이 현저하게 낮을 뿐만 아니라, HUVEC 및 SVR 내피세포 둘다에서 루시퍼라제 트랜스유전자가 더 강하게 발현되게 하였다. 또한, 이는 p(TETA/CBA)10k와 비교하였을 때 H9C2 심근모세포에서도 마찬가지였다 (도 2A-B). bPEI 25kDa의 독성은 고분자량의 폴리양이온 종들이 세포내에 축적되기 때문일 가능성이 있다 (3). 이들 종들은 세포막과 상호작용하여 세포 막의 기능을 파괴하거나, 및/또는 세포내 단백질 및 핵산과 상호작용함으로써 세포 트래핑과 유전자 전사 및 번역과 같은 세포내 및 핵에서의 과정을 교란시킬 수 있다 (18, 19). 생물환원성 폴리양이온인 p(TETA/CBA)는 이러한 세포내 상호작용을 완화시킬 것임에 틀림없어 보이며, 따라서, 분해되지 않는 bPEI 25 kDa에 비해, 이의 상대적인 분자량과 무관하게, 초대 내피 세포에 대한 독성은 낮아질 것이다 (20). p(TETA/CBA) 분획 이용시 관찰되는 트랜스유전자의 높은 발현은 또한 세포내 핵산 방출과 관련된 현상으로 설명될 수 있다 (6, 9).
p(TETA/CBA)에 대한 혈청 효과. 혈청 첨가 배지와, 폴리플렉스를 생체내 투여하였을 때 직면하는 혈청은, 종종 입자의 불안정화 및 치료학적 유전자의 뉴클레아제에 의한 분해 또는 생체내 세망 내피(reticular endothelial) 시스템에 의한 흡수를 통해 폴리양이온의 성능을 약화시킨다. 본원에 제시된 데이타는 기존 결과와 일치된다. 구체적으로, 혈청 첨가 배지에서 결장 선암종 세포 (CT-26)에 대한 p(TETA/CBA)의 성능은 bPEI 25kDa 보다 현저하게 우수하지만, 혈청 무첨가 조건에서 수행된 형질전환과 비교하였을 때에는 낮으며(도 3), 따라서, 계획 2에 나타낸 바와 같이 핵산을 전달하기 위한 p(TETA/CBA)5k-g-PEG 코폴리머의 개발이 필요하다.
폴리플렉스의 특정화. 입자 크기 분석과 제타-전위 측정을 통해, p(TETA/CBA)5k 및 p(TETA/CBA)5k-g-PEG2k의 축합된 폴리플렉스를 형성하는 능력을 조사하였다. 실제, 이들 2종의 잠재적인 유전자 캐리어에 대해 직경 거의 200 nm 또는 그 미만의 나노크기의 입자가 형성되었지만, 예상된 바와 같이, 바람직하게는 낮은 폴리머 농도에서는 PEG 접합이 폴리플렉스의 형성을 방해하였다 (도 4A). PEG 접합은 pCMVLuc를 축합할 만큼 충분한 폴리머 농도에서 폴리플렉스 표면 전하를 감소시켰으며, 안정적인 것으로 보이지 않았다 (도 4B).
폴리플렉스 특징에 대한 PEG wt%의 영향. 페길화된 폴리에틸렌이민 캐리어를 이용한 이전 결과들은, p(TETA/CBA) 폴리양이온의 페길화가 핵산 축합을 파괴한다는 본 발명의 결과 (도 4A-B)와 일치한다. 이러한 문제를 해결하고, PEG/폴리양이온 wt/wt%를 조절하기 위해 폴리머/PEG-코폴리머 용액을 미리 혼합하는 가능성을 확인하고, 아울러 표면 전하가 감소된 균질한 안정적인 폴리플렉스를 유지하는 최적의 포뮬레이션을 동정하기 위해, p(TETA/CBA)5k-g-PEG2k, p(TETA/CBA)5k, 및 이들 2가지 분자가 각각 10/90 및 50/50 wt/wt %인 혼합물을, 총 폴리양이온/pDNA w/w 비율 24로 이용하여 폴리플렉스를 제조하였다 (계획 2).
혈청 안정성. 혈청 존재 시의 폴리플렉스 안정성에 대한 PEG wt%의 효과를 조사하기 위해, 폴리플렉스를 제조하여 30분간 평형화한 다음, 신선한 토끼 혈청에 최종 혈청 농도 90%가 되도록 37℃에서 첨가하였다. 분액을 아가로스 겔에서 전기영동하여, 0 시간에서의 무처리 대조군과 비교하여, 각 시간대별 무손상 pCMVLuc를 가시화하였다. 도 5A-B는 p(TETA/CBA)5k 및 10 % PEG가 6시간까지 pDNA를 뉴클레아제에 의한 분해로부터 80% 이상 보호함을 나타낸다. PEG wt%를 50 또는 100%로 높이면, 입자 안정성은 낮아지고 pDNA 보호도 감소하여, pDNA는 6시간 인큐베이션시 각각 60% 및 40%로 보존된다.
폴리플렉스 분석. 포뮬레이션 용이성과 캐리어 기능 개선을 위해, 여러가지 PEG wt%를 이용하여 제조한 안정적인 폴리플렉스는, 단일형의 폴리플렉스 크기와 균일한 형태의 표면 전하를 나타내어야 한다. 각 포뮬레이션의 폴리플렉스 크기를 TEM (도 6A-D)을 이용하여 가시화하였고, 폴리플렉스들을 분석하여 이의 크기와 분포를 다이나믹 광 산란 (DLS)에 의해 제공되는 폴리플렉스 측정값과 비교하였으며, 이는 서로, 긔고 결과와도 일치하였다 (도 6F). 도 6A-D는 PEG wt% 증가에 따른 형태학적 변화와 반투명한 외막을 가진 보다 조밀성이 낮은 폴리플렉스를 보여준다. p(TETA/CBA)5k-g-PEG2k는 (도 6D)에 나타낸 바와 같이 응집되었다. 또한, 이러한 응집은 DLS를 이용한 분석시에도 언급되었으며, 데이타에 부정적으로 작용하였다. 따라서, 이 포뮬레이션은 분석에서 제외시켰고, 도 6E에 나타내지 않았다. p(TETA/CBA)5k,10 및 50% PEG 포뮬레이션들은 용액 중에서 150nm 이하의 폴리플렉스를 형성하며, PEG wt%는 예상한 바와 같이 폴리플렉스 표면 전하와 반비례하였다 (도 6E).
캐리어 기능 및 생물학적 활성에 있어 PEG 포뮬레이션. 혈청 존재 하의 유전자 전달에 있어 PEG-코폴리머 포뮬레이션의 잠재적인 이점을 조사하기 위해, 루시퍼라제 트랜스유전자 분석을 결장 선암종 세포 (CT-26)를 이용하여 수행하였다. 10% 및 50% PEG로 제조된 폴리플렉스는 p(TETA/CBA) 폴리양이온 단독과 비교하여 혈청 존재 시에 향상된 트랜스유전자 발현을 보여주었다 (도 7A). 아울러, 이들 폴리플렉스는 세포에 무독성이다 (도 7B).
2. p(TETA/CBA)- g -PEG2k의 한 단계 합성
전통적인 페길화 합성 공정은 폴리머 제조에 필요한 합성 단계와 여과 단계인 2단계로서 시간이 소모되는 단계들이 요구된다 (계획 1 & 2 참조). 이에, p(TETA/CBA)-g-PEG2k에 대해, 최종 산물 제조에 소요되는 시간이 절반으로 단축된 단계 합성/여과 방법을 개발하였다 (계획 3). 제조되는 폴리머는, 기존에 비해 높은 분자량 (10kDa MWCO)으로 정제되는 경우, 저분자량 카운터파트에 비해 축합 및 보호 프로파일이 우수하기 때문에, 정맥내 투여시 우수한 독성 프로파일에 의해 입증되는 광범위한 치료 범위를 가진다.
합성 및 특정화. p(TETA/CBA)는 기존에 매우 유효한 유전자 캐리어로서 입증되었으며, 과분지화된 구조를 만들기 위한 다양한 분지 형성 구조들을 유의한 세포 독성없이 유도할 수 있다. p(TETA/CBA)-g-PEG2k 샘플들을 계획 3에 도시한 바와 같이 합성하고, 이후 평가를 위해 정제하였다. 중합은 TETA 단량체에 존재하는 아민에 CBA 단량체를 미카엘 부가함으로써 이루어지며, 그에 따란 고도로 분지화된 산물을 이의 겔화 이전에 수득할 수 있다. 이 폴리머는 CBA의 아크릴아미드 관능기에 기능성 아민을 포함하는 1차 및 2차 아민 모이어티의 (1:1 몰 비율) 미카엘 부가에 의해 합성된다. 중합은 용매로서 MeOH를 이용하여 질소 분위기 하 30℃에서 10시간 동안 광 민감성 플라스크에서 수행된다. 간략하게는, 교반 막대가 장착된 갈색 반응 용기에 TETA 및 CBA (1M)를 충전한다. 이 용기를 닫고, 30℃로 설정된 오일조에 넣는다. 중합은, pH 7의 수용액에서 8시간 동안 NHS 및 EDC로 활성화시킨 후, mPEG2k를 10 중량%로 반응에 점적 첨가하는 10시간 동안 계속될 수 있다. 그런 후, 모든 유리형 아크릴아미드기들의 퀀칭이 확보되도록, 반응을 다시 24시간 동안 진행한다. 제조되는 폴리머 산물은, 반응물을 초순수 탈이온수로 일차로 희석하고 pH 7로 적정함으로써, 한외여과 (MWCO 5000 또는 10000)에 의해 분리한다. 정제는 4 Barr에서 밤새 진행한 다음, 농축 및 동결건조함으로써 이루어진다. 1H NMR 분석 결과, 5 kDa으로 여과한 폴리머의 경우 9% 비율의 PEG2k/p(TETA/CBA)가 확인되었고, 10 kDa으로 여과한 폴리머의 경우 각 146-171 CBA 당 3-4% 또는 1 PEG 단위가 확인되었다. MALDI-TOF 분석에서, 폴리머의 91%가 분지화된 것으로 나타났고, 10 kDa으로 여과한 폴리머의 84.3%가 분지형인 것으로 확인되었다. 모든 PEG는 폴리머의 0 arm에 그래프트되는 것으로 보인다. AKTA FPLC 분석에서는, 5 kDa으로 여과한 p(TETA/CBA)-g-PEG2k의 평균 분자량은 10.89 kDa이지만 3 kDa - 30 kDa의 광범위한 분포가 확인되었다.
p(TETA/CBA)-g-PEG2k는 2단계 합성 유사체와 유사한 크기 특징을 가지지만, 10 kDa으로 여과된 산물은 작은 복합체들을 훨씬 낮은 중량% 비율로 포함한다 (도 8 및 도 4A).
모든 p(TETA/CBA)-g-PEG2k 제형들은 siRNA 캐리어로서 탁월한 형질전환 특징들을 가진다. 폴리머는 사용가능한 넓은 범위의 % PEG 포뮬레이션과 중량% 비율을 가진다 (도 9A-F). 폴리머를 p(TETA/CBA)5k와 혼합하고, 40 nM 농도에서 루시퍼라제를 타겟으로 하는 siRNA와 복합체를 형성하였다. 도 9F는 PC-3 세포에서의 폴리머 작용을 나타낸다. 특히, p(TETA/CBA)-g-PEG2k 100% 제형은 1/3 낮은 수준이기는 하지만 루시퍼라제를 저해할 수 있었다.
페길화된 폴리머 제형의 혈청 안정성을 90%의 신선한 랫 혈청에서 조사하였고, 2시간 씩 최대 6시간 동안 조사하였다. siRNA 분해는 50% p(TETA/CBA)-g-PEG2k 및 p(TETA/CBA) 혼합물에서 가장 최상으로 저해되었고, 6시간 후 10% 소실이 확인되었다 (도 10). 다른 비율에서는 6시간째에 40% 이상의 소실이 나타났다.
MW 5kDa 이하에서 여과된 폴리머는 페길화와 상관없이 160 ㎍ 용량에서 독성을 나타내는 것으로 확인되었다. 페길화는 PEI 접합체에서 표면 전하를 약화시키고 활성화를 보강하는 것으로 확인되었지만, 이 경우에서는 입증되지 않았다. 상기한 독성은 1 단계 및 2 단계 합성 둘다에서 명백하다. 이러한 폴리머로 형성되는 사용가능한 나노복합체로 전달할 수 있는 최대 양은 1.5 mg/kg 미만이다(6:1 중량/중량비는 ~27 ㎍의 siRNA/DNA임). 이 양은 생체내에 사용하기에는 매우 소량인 것으로 생각된다. 그래서, 2가지 (p(TETA/CBA) 및 p(TETA/CBA)-g-PEG2k) 폴리머를 센트리콘 원심분리 농축기를 이용하여 10,000 MWCO로 여과하였다. 고분자량 분획과 저분자량 분획을 수집하여 (농축기의 상부 [고분자량] 및 하부 [저분자량]에서 수집한 상층물), 특정화에 사용하였다. 저분자량 분획은 10:1 중량/중량 비 미만으로 혼합하였을 때에는 복합체를 형성하지 않았으며, 훨씬 높은 24:1 중량/중량 비에서 큰 입자 크기(1200 nm)를 포함하였다.
생체분포 연구를 위해, 플라스미드 DNA 총 40 ng을 다양한 중량 포뮬레이션의 p(TETA/CBA)-g-PEG2k/p(TETA/CBA)와 복합체를 형성시켰다. 나노복합체를 CT-26 종양을 가지고 있는 Balb/c 마우스에 꼬리 정맥을 통해 정맥내로 p(TETA/CBA)-g-PEG2k을 20% 글루코스 + 10 mM HEPES 200 ㎕ 중의 25, 50, 75 및 100 중량% 포뮬레이션으로 주입하였다. 48시간 후에 동물을 희생시키고, 장기 (및 종양)를 적출한 다음, 플라스미드의 F1 ori 영역에 대한 Taqman 프라이머를 이용한 qPCR에 의해 플라스미드 DNA를 분석하였다. 생체분포 패턴 결과는, 100% p(TETA/CBA)-g-PEG2k를 이용한 폴리머 : pDNA 3:1에서 종양에 대한 최대 전달이 달성되는 것으로 나타났다 (도 11A). 그러나, 복수의 다른 조직들에서 더 높은 수준의 플라스미드 DNA가 확인되었다. 또한, 이러한 생체분포 경향은, 수준은 낮지만 동일한 폴리머 중량/pDNA 중량 혼합물을 이용한 다른 %의 p(TETA/ CBA)-g-PEG2k 폴리머 포뮬레이션 혼합물에서 명백하게 나타났다. 0.5/1 폴리머 중량/pDNA 중량 혼합물은 차별적인 생체분포 패턴을 나타내었다 (도 11B). 종양에서는 다른 조직에 비해 플라스미드 DNA가 높은 수준으로 확인되었으며, 이는 75% p(TETA/CBA)-g-PEG2k 포뮬레이션에서 나타나는 가장 큰 차이가 나타났다. 생체분포 패턴들은 % p(TETA/CBA)-g-PEG2k 포뮬레이션과 무관하게 폴리머/pDNA w/w 혼합물들에서 동일하였기 때문에, 각각으로부터 한가지 포뮬레이션 혼합물을 취하여 그룹으로 제시하였다 (도 11C).
나노복합체의 최대 양은 침전, 물리력(유체역학적 효과) 및 용량-제한적인 독성에 의해 제한되므로, 제공될 수 있는 최대 양은 20% 글루코스+ 10 mM HEPES 275 ㎕ 중의, 3:1의 폴리머 중량/siRNA 중량비의 siRNA 55 ㎍인 것으로 현재 생각된다. 나노복합체를 CT-26 중양을 가지고 있는 Balb/c 마우스에 꼬리 종맥을 통해 정맥내로 또는 국소적으로 (종양부에) 75 중량%의 p(TETA/CBA)-g-PEG2k 포뮬레이션을 폴리머 : 마우스 HIF-1a 표적화된 siRNA 0.5/1 및 3/1 비율로 주입하였다. 마우스를 희생시키고, 장기와 종양을 각각으로부터 적출하였다. SV96 총 RNA 정제 키트를 이용하여 총 RNA를 분리하고, mRNA 수치를 RT-qPCR을 이용하여 20% 글루코스+10 mM HEPES를 정맥내 주사한 대조군 마우스와 국소 주입한 대조군 마우스들에서 비교하였다. 예비적인 비교 Ct RT-qPCR을 통해, 정맥내 주입 동물과 국소 주입 동물 각각의 종양 부위에서 mHIF-1a 값이 63% 및 70% 감소된 것으로 확인되었다 (도 12).
본 발명에 따른 p(TETA/CBA)-g-PEG2k의 합성은 생체환원성 분자 및 폴리아미도아민(PAA) 또는 폴리아미도 에틸렌이민(PAEI)을 이용한 기존 방법에 비해 개선된 방법이다. 기존 방법과 특징은 유사하지만, 50% 빠르며, 2단계 합성 방법과는 상이한 산물을 산출해낸다. p(TETA/CBA)-g-PEG2k는, 한외여과를 이용하여 10 kDa에서 정제하였을 때, 5 kDa에서 여과한 카운터파트 보다 우수한 물리화학적 특징을 가진다. 10 kDa 폴리머는 생체내 독성 프로파일이 보다 양호하며, 강화된 투과 및 체류 효과 (EPR)에 의해 제공될 가능성이 높은 탈선택적인 타겟팅을 통해 종양 부위에 대해 양호한 형질전환 효율을 유지한다. 저분자량 폴리머는, 복합체화 및 용량-제한성 독성 이슈로 인해, >50% 저해를 발생시키는데 필요한 양을 전달할 수 없다. %PEG 포뮬레이션 및 중량% 비율들 중에서, 75% p(TETA/CBA)-g-PEG2k는 0.5:1에서, 100% p(TETA/CBA)-g-PEG2k는 3:1 w/w에서, 종양내 단백질을 저해하기 위한 siRNA를 체내 정맥내로 전달하기 위한 최상의 후보 물질들인 것으로 보인다. 보다 높은 중량/중량 비율들을 조사하였지만, 용량-제한성 독성으로 인해 독성이 확인되었다. 시험관내 적용은 여러가지 % 포뮬레이션에서 더 높은 중량:중량 비율에서 이루어질 수 있으므로, 배제시켜서는 안된다. p(TETA/CBA)-g-PEG와 p(TETA/CBA)의 혼합물들은 상승 효과를 나타낸다.
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003

Claims (15)

  1. 폴리(TETA/CBA)와 폴리에틸렌 글리콜의 그래프트 코폴리머를 포함하는 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 폴리(TETA/CBA)와 폴리에틸렌 글리콜의 그래프트 코폴리머는 계획 2 또는 계획 3에 도시된 구조를 가지는 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 핵산; 및 폴리(TETA/CBA)와 폴리에틸렌 글리콜의 그래프트 코폴리머를 포함하는 복합체.
  4. 제3항에 있어서, 상기 핵산은 플라스미드 DNA를 포함하는 것을 특징으로 하는 복합체.
  5. 제3항에 있어서, 상기 핵산은 siRNA를 포함하는 것을 특징으로 하는 복합체.
  6. 제3항에 있어서, 상기 그래프트 코폴리머와 혼합된 폴리(TETA/CBA)를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 복합체.
  7. (a) 폴리(TETA/CBA), 및 (b) 폴리(TETA/CBA)와 폴리에틸렌 글리콜의 그래프트 코폴리머;의 혼합물을 포함하는 조성물.
  8. 핵산; 및 폴리(TETA/CBA)와 폴리에틸렌 글리콜의 그래프트 코폴리머를 포함하는 복합체를 세포에 접촉시키는 단계를 포함하는, 세포의 형질전환 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 핵산은 플라스미드 DNA를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제8항에 있어서, 상기 핵산은 siRNA를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제8항에 있어서, 상기 그래프트 코폴리머와 혼합된 폴리(TETA/CBA)를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 폴리(TETA/CBA)와 폴리에틸렌 글리콜의 그래프트 코폴리머의 제조 방법으로서,
    (A) TETA와 CBA를 혼합하여 1차 혼합물을 형성하고, 상기 1차 혼합물을 1차 선택된 기간 동안 반응시켜 폴리(TETA/CBA)를 제조하는 단계;
    (B) 상기 1차 혼합물에 폴리에틸렌 글리콜을 첨가하여 2차 혼합물을 제조하고, 상기 2차 혼합물을 2차 선택 기간 동안 반응시키는 단계; 및
    (C) 상기 폴리(TETA/CBA)와 폴리에틸렌 글리콜의 그래프트 코폴리머를 정제하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 제조 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 정제 단계는 한외여과(ultrafiltration)에 의해 이루어지는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 한외여과는 5 kDa MWCO를 포함하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  15. 제13항에 있어서, 상기 한외여과는 10 kDa MWCO를 포함하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
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