JP2013521805A

JP2013521805A - ヌクレオチド送達を高めるための還元性ポリ（アミドエチレンイミン）への切断可能な修飾

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Publication number: JP2013521805A
Application number: JP2013500183A
Authority: JP
Inventors: ウィリアムヨックマン，ジェイムズ; エイチ．ブランバッハ，ジョナスン; キム，ソンワン
Original assignee: ユニバーシティ・オブ・ユタ・リサーチ・ファウンデイション
Priority date: 2010-03-16
Filing date: 2011-03-16
Publication date: 2013-06-13
Also published as: CN102892809A; AU2011227264A1; US20130149783A1; WO2011116107A3; CA2793373A1; EP2547715A2; EP2547715A4; WO2011116107A2; KR20130006663A

Abstract

ｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）、そのＰＥＧ化類似体であるｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）−ｇ−ＰＥＧ２ｋ、ならびにこれら２種からなる１０／９０重量％および５０／５０重量％混合物をそれぞれ用いてポリプレックス調合物を調製した。ＰＥＧ重量％を増加させるとポリプレックスの形成が阻害された。本研究において、２つの生成物ｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）とｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）−ｇ−ＰＥＧ２ｋの混合物を用いてＰＥＧ重量％を変更することにより、均一なポリプレックスを調製できることを示す。さらに、ｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）−ｇ−ＰＥＧ２ｋを１段階で製造する方法も開示する。

Description

遺伝子治療は、現在のところ従来療法で対処している遺伝子疾患を治療するための実現可能な代替手段である。しかし、その臨床的な成功は、安全で効率的な核酸キャリアを開発するための設計および調合の要件が明確でないことにより妨げられている。近年、研究の進展により、表面電荷および／または組織特異性を変化させるようポリエチレングリコール（ＰＥＧ）および／または細胞特異的な標的リガンドを用いてキャリアを修飾することによって、キャリアの安全性および有効性の改善がなされている（１）。非ウイルス性のポリマー型遺伝子キャリアは、慎重に設計すれば、免疫原性を持たず、かつ多機能特性を示すような修飾が容易であることから、明らかに有利である（２）。また、非ウイルス性のポリカチオンは、費用対効果が比較的高く、産業的に生産が容易で、多くの量の治療用核酸を担持できる（３、４）。

直鎖構造、分岐構造または樹状構造からなる構造的に異なる多くの重合体および共重合体のｉｎｖｉｔｒｏおよびｉｎｖｉｖｏでの使用における有効性および適性が検討されている。ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）遺伝子キャリアは最も徹底的に検討が行われているキャリアであり、当該分野における標準物である。これは、ＰＥＩが容易にＤＮＡと縮合して核酸／ポリカチオンナノ粒子（ポリプレックス）を形成するためであり、このポリプレックスには血清ヌクレアーゼによる核酸の分解を防ぎ、ｉｎｖｉｔｒｏおよびｉｎｖｉｖｏにおいて様々な種類の細胞に比較的高い効率で導入遺伝子を送達して発現させるという特徴がある。しかし残念ながら、ＰＥＩはしばしば非分解性ポリカチオンの細胞内蓄積により細胞毒性を示す（３、５）。ＰＥＩの分子量および分岐の増加は、ポリカチオンの電荷密度に影響を与えるものであり、導入遺伝子の発現増加と相関するが、同時に細胞毒性とも相関する。逆に、低分子量のＰＥＩでは細胞毒性は低いが、細胞毒性の低さは導入遺伝子の発現の低さと相関する（６、７）。ポリ（アミドアミン）（ＳＳ−ＰＡＡ）ファミリー、ポリ（アミドエチレンイミン）（ＳＳ−ＰＡＥＩ）ファミリーおよびポリ（ｂ−アミノエステル）ファミリーなどの分解性遺伝子キャリアの設計により、予想された通り、ＰＥＩと比べて同等以上の活性が得られかつ細胞毒性も低くなることが確認されている（８、９、１０）。還元性ＳＳ−ＰＡＥＩは、ＰＥＩファミリーの合成類似体ではあるものの上記の利点を有する（１１）。最近、ある文献の要約において、超分岐ＳＳ−ＰＡＡはプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）と縮合して、ｂＰＥＩ２５ｋＤａと同等のサイズのポリプレックスを形成できるという結果が示されており、さらなる機能的な研究に拍車がかかっている（１２）。

カチオン性ポリプレックスは血清中に存在する正味の負電荷を持つタンパク質としばしば相互作用するため、これがしばしば、ｉｎｖｉｔｒｏおよびｉｎｖｉｖｏにおける粒子凝集や有効性の低下を招く（１３、１４、１５）。この問題を解決するために、ポリカチオンへのポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）修飾という手法が用いられており、これまでの研究により、ＰＥＧ化は血清存在下におけるキャリア機能をしばしば向上させることが示されている。しかし、これまでの研究から、ＰＥＩ、特に低分子量（ＬＭＷ）のＰＥＩ（５ｋＤａ以下のＰＥＩ）への標的リガンド修飾および／またはＰＥＧ修飾を増加させることは、ポリプレックス形成およびキャリア機能に対して悪影響を及ぼすことも明らかとなっている（１６、１７）。

超分岐ＳＳ−ＰＡＥＩおよびそれに対応するＰＥＧグラフト共重合体の設計、より重要なものとしてはその調合、における理解を進展させるために、数種のポリカチオン性ＳＳ−ＰＡＥＩ遺伝子キャリアを合成して、ＰＥＧ／ポリカチオンの重量％の変化がポリプレックスの形成、サイズ、表面電荷、形態、血清安定性、そして最終的には生物活性に与える影響について検討を行った。これを本明細書に記載する。プラスミドＤＮＡまたはｓｉＲＮＡとの複合体であるポリプレックス調合物は、ＳＳ−ＰＡＥＩ、ｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）、そのＰＥＧ化体であるｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）−ｇ−ＰＥＧ２ｋ、またはｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）−ｇ−ＰＥＧ２ｋとｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）との１０／９０重量％および５０／５０重量％混合物をそれぞれ用いて調製した。このように重量％を変えることによって、ポリプレックスの組成を容易に変更するのに適した方策を見出し、合成が容易な好適な調合物を見出した。

本発明による例示的な組成物は、ポリ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）−ポリエチレングリコールグラフト共重合体を含む。

本発明の別の例示的な実施形態は、核酸とポリ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）−ポリエチレングリコールグラフト共重合体とを含む複合体を包含する。核酸は、例えばプラスミドＤＮＡまたはｓｉＲＮＡを含みうる。この複合体は、上記グラフト共重合体と混合物を形成しているポリ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）をさらに含んでもよい。

本発明のさらに別の例示的な実施形態は、ポリ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）とポリ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）−ポリエチレングリコールグラフト共重合体との混合物を含む。

本発明のさらに別の例示的な実施形態は、細胞へのトランスフェクションを行う方法を含み、該方法は、細胞に核酸とポリ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）−ポリエチレングリコールグラフト共重合体とを含む複合体を接触させることを含む。核酸は、例えばプラスミドＤＮＡまたはｓｉＲＮＡを含みうる。この複合体は、上記グラフト共重合体と混合物を形成しているポリ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）をさらに含んでもよい。

スキーム１は、本発明におけるｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）１ｋおよびｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）５ｋの合成概略図を示す。スキーム２は、本発明におけるｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）５ｋ−ｇ−ＰＥＧ２ｋの合成スキームを示す。１００重量％ｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）５ｋ、１０／９０重量％ｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）５ｋ−ｇ−ＰＥＧ２ｋ、５０／５０重量％ｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）５ｋ−ｇ−ＰＥＧ２ｋ、１００重量％ｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）５ｋ−ｇ−ＰＥＧ２ｋ、およびＳＳ−ＰＡＥＩ＋ＰＥＧ２ｋの概略図も示す。スキーム３は、本発明におけるｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）−ｇ−ＰＥＧ２ｋの「１段階」合成のスキームを示す。図１Ａ〜Ｄは、内皮細胞であるＳＶＲ（図１Ａおよび１Ｃ）およびＨＵＶＥＣ（図１Ｂおよび１Ｄ）における、様々な分子量のｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）類似体とｐＣＭＶＬｕｃとを組み合わせて形成したポリプレックスによるトランスフェクション効率（図１Ａおよび１Ｂ）および細胞生存率（図１Ｃおよび１Ｄ）を陽性対照（ｂＰＥＩ２５ｋＤａ）と比較して示したグラフである。市販のｂＰＥＩを用いたポリプレックスはＮ／Ｐ＝１０で調製し、ｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）を用いたポリプレックスはｗ／ｗ＝２４で調製した。図２ＡおよびＢは、様々な分子量のｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）によるトランスフェクション効率および細胞生存率をそれぞれ示す。図３は、培地中に１０％血清を含む場合（チェック模様の棒グラフ）と含まない場合（横縞模様の棒グラフ）のｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）５ｋ／ｐＣＭＶＬｕｃによるトランスフェクション効率を比較したグラフである。トランスフェクション効率は、ルシフェラーゼ遺伝子の導入発現により評価した。ｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）は、血清含有培地においてｂＰＥＩ２５ｋＤａより高いレポーター遺伝子発現を示すが、血清非存在下と比べるとその性能は劣る。図４ＡおよびＢは、既知量のｐＤＮＡを用いてポリマー濃度を増加させたときのｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）５ｋ／ｐＣＭＶＬｕｃポリプレックス（チェック模様の棒グラフ）およびｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）５ｋ−ｇ−ＰＥＧ２ｋ／ｐＣＭＶＬｕｃポリプレックス（横縞模様の棒グラフ）の粒径およびゼータ電位測定値をそれぞれ示したグラフである。図５Ａは、３７℃、９０％ウサギ血清中における、ｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）５ｋ、ポリ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）５ｋ−ｇ−ＰＥＧ２ｋ、１０／９０重量％のｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）５ｋ−ｇ−ＰＥＧ２ｋ／ｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）５ｋ調合物（１０％ＰＥＧ）、および５０／５０重量％のｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）５ｋ−ｇ−ＰＥＧ２ｋ／ｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）５ｋ調合物（５０％ＰＥＧ）をそれぞれ用いたポリプレックスの安定性を示す。それぞれ５００ｎｇのｐＣＭＶＬｕｃと複合体を形成させた（ｗ／ｗ＝２４）。図５Ｂは、ピクセル強度をもとに、対照の０ｈ値を基準とした未分解のｐＢＬｕｃの相対百分率を経時的に示したグラフである。（ひし形）対照（フリーのｐＤＮＡ）；（黒四角）ｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）；（三角）ｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）−ＰＥＧ２ｋＤａ（１０％）；（逆三角）ｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）−ＰＥＧ２ｋＤａ（５０％）；（黒丸）ｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）−ＰＥＧ２ｋＤａ（１００％）。図６Ａ〜Ｄは、ｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）５ｋ、１０％ＰＥＧ、５０％ＰＥＧおよびｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）−ＰＥＧ２ｋをそれぞれ用いたポリプレックス調合物をＴＥＭにより視覚化した図である。図６Ｅは、ｂＰＥＩ、ｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）、１０％ＰＥＧおよび５０％ＰＥＧの粒径（小さいチェック模様の棒グラフ）およびゼータ電位（大きいチェック模様の棒グラフ）を示す。図６Ｆは、ＴＥＭ（大きいチェック模様の棒グラフ）および動的光散乱法（ＤＬＳ；小さいチェック模様の棒グラフ）による、ｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）、１０％ＰＥＧおよび５０％ＰＥＧをそれぞれ用いたポリプレックスのサイズを比較したグラフである。図７ＡおよびＢは、血清の存在下および非存在下における、ｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）５ｋ、ならびに１０／９０重量％、５０／５０重量％および０／１００重量％のｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）５ｋ／ｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）５ｋ−ｇ−ＰＥＧ２ｋをそれぞれ用いたポリプレックス調合物によるトランスフェクション効率（図７Ａ）および細胞生存率（図７Ｂ）を示す。図８は、各ポリマーを様々な重量パーセント比で混合し、さらにポリマーとｓｉＲＮＡとを様々な重量比で混合したナノ複合体の粒径を示す。図９Ａ〜Ｆは、様々な重量％と様々なＰＥＧ調合物を用いた場合のｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）−ｇ−ＰＥＧ２ｋによるトランスフェクション効率を示す。図１０は、９０％血清中における複合体の安定性がＰＥＧ化率の増加により低下することを示したグラフである。図１１Ａ〜Ｃは、ｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）−ｇ−ＰＥＧ２ｋ／ｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）を用いたナノ複合体をマウスに注射した後のプラスミドＤＮＡの体内分布パターンを示す。図１２は、５５μｇのｓｉＲＮＡ／ｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）−ｇ−ＰＥＧの静脈内注射または局所皮下注射によるｍＨＩＦ−１ａ阻害を示したグラフである。

本発明による還元性ポリ（アミドエチレンイミン）の改良およびその方法の開示および記載に先立ち、本明細書において開示する個々の構成、工程および材料はいくらか変更されうるものであるから、本発明はこれらの構成、工程および材料に限定されないものであることを理解されたい。また当然のことながら、本発明の範囲は添付の請求項およびその等価物によってのみ限定されるものであるから、本明細書で用いる用語は、個々の実施形態を説明する目的のためだけに使用されているものであり、本発明を限定することを意図するものではない。

本発明の背景を説明し、その実施に関するさらなる詳細情報を提供するために本明細書で引用した刊行物およびその他の参考資料は、参照により本明細書に組み込まれる。

文脈上明らかに別段の解釈がなされる場合を除き、本明細書および添付の請求項で使用される「ａ」、「ａｎ」および［ｔｈｅ」で示される単数形は複数の対象を包含することに留意されたい。

別段の定めがない限り、本明細書で使用する技術用語および科学用語はすべて、本発明が属する技術分野において通常の技能を有する者が一般に理解しているものと同じ意味を有する。

本発明の説明および請求の範囲の記載に際して、下記の用語は以下に述べる定義に従って用いられる。

本明細書において、「〜を含む」、「〜を包含する」、「〜を含有する」、「〜を特徴とする」およびそれらと文法的に等価な用語は、記載されていないその他の要素または工程を除外しない包括的な用語、すなわちオープンエンドな用語である。「〜を含む」は、より限定的な用語である「〜からなる」および「〜から本質的になる」を包含するものと解釈される。本明細書において、「〜からなる」およびそれと文法的に等価な用語は、請求項に明記されていない要素、工程または成分を除外する用語である。本明細書において、「〜から本質的になる」およびそれと文法的に等価な用語は、明記された材料または工程、および請求項に係る発明の基本的かつ新規な特徴に実質的に影響を与えない材料または工程に、請求項の範囲を限定する用語である。

ポリカチオン性遺伝子キャリアの臨床的な進展は、その設計・調合要件が明確でないことにより妨げられている。本研究において、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と分岐ＳＳ−ＰＡＥＩとのグラフト共重合体の合成が可能であること、調合の際にこれとポリカチオン性ＳＳ−ＰＡＥＩとを組み合わせてＰＥＧの相対重量％を変更できること、さらにそれによって遺伝子キャリア集団の生理化学的特性を変化させて、遺伝子キャリアの生物活性を向上させるための設計および調合の要件を容易に検討できることを示す。ＰＥＧおよび／または標的リガンドによる修飾がポリプレックス形成およびキャリア機能を阻害し得ることは知られているため、本研究では、この問題が解決可能であること、および機能的に実用可能な２つの生成物ｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）とｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）−ｇ−ＰＥＧ２ｋの混合物を用いてＰＥＧ重量％を変更することにより、均一なポリプレックスを調製できることを示す。

本研究において、血清存在下におけるキャリア性能を向上させるために、効率的で無毒な生体還元性ポリカチオンとポリエチレングリコールとを組み合わせた新規遺伝子キャリアを開発した。また、遺伝子キャリアの理想的な機能に最適な生理化学的特性を得るためにＰＥＧ重量％を変更したポリカチオン−ＰＥＧ共重合体調合物を調製する実現可能で簡便な方法を提供する。これにより、ｉｎｖｉｔｒｏでの使用に好適な生理化学的特性を備えると同時に簡便なｉｎｖｉｖｏ評価にも使用できる遺伝子キャリアを設計する上で、遺伝子送達用の共重合体を複数合成する必要性を回避できる。

ビスアクリルアミド基にＴＥＴＡが付加される非制御下のマイケル付加反応を行った後、ｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）の多分散性指数（ＰＤＩ）を低下させるために、参考文献１１で使用されたものより分画分子量の高い（５ｋＤａ）メンブレンを用いて限外濾過を行った。予想した通り、この方法はＰＤＩを低下させるのに効果的であり、ＰＤＩの低下は分子量の相対的な増加と相関した。ポリエチレンイミンの分子量および分岐の増加は、導入遺伝子の発現および細胞毒性と相関することが報告されていたため、本研究においても、この想定される作用をｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）を用いて調べたところ、初代培養内皮細胞および不死化内皮細胞株において、生物活性に対する有意な影響は見られなかった（６、７）。これらの結果は、この遺伝子キャリアには細胞内の酸化還元電位を利用する能力および比較的高い分子量のポリカチオン類が引き起こす細胞内機能の破綻を回避する能力があるということにより説明される（２１）。

ｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）は血清含有培地においてｂＰＥＩ２５ｋＤａより有意に高い導入遺伝子発現を示したものの、このｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）の送達能力は、血清非存在下における活性より顕著に低かった。そこで、ｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）／ｐＤＮＡポリプレックスと血清タンパク質との相互作用を低減させて血清存在下におけるキャリア機能を向上させるために、ｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）５ｋを等モルのポリエチレングリコールで修飾した。得られた生成物を精製した後、^１ＨＮＭＲで確認した。また、ＡＫＴＡＦＰＬＣで分析した結果、対応する相対分子量も等モル修飾から予想されるものと一致した。ｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）５ｋのポリエチレングリコールによる修飾は、ポリプレックスの表面電荷を低下させたが、同時に核酸との縮合に悪影響を与えた（１６、２２）。細胞特異的な遺伝子送達を目的とするポリエチレングリコールおよび／またはリガンドによる修飾は一般に核酸との縮合を抑制することから、最大のキャリア性能を得るための最適比率を決定する上で、共重合体型遺伝子キャリアを複数合成する必要がある。この問題を解決するために、スクリーニング用に複数のキャリアを合成する必要性を回避する試みとして、本研究において、ポリカチオンとそのＰＥＧ化体との混合物の調合によってＰＥＧ／ポリカチオンの重量％（重量比）を最適化するという手法の実現可能性を調べた。本研究では、ｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）５ｋ単独、ｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）５ｋ−ＰＥＧ２ｋ単独、ならびに１０／９０重量％および５０／５０重量％のｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）５ｋ−ＰＥＧ２ｋ／ｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）５ｋをそれぞれ含むポリプレックスの血清安定性を評価した。ｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）および１０／９０％のｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）５ｋ−ＰＥＧ２ｋ／ｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）５ｋからそれぞれ形成されるポリプレックスは、６時間にわたり最大７０％のｐＤＮＡを血清ヌクレアーゼによる分解から十分に保護する。ｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）５ｋ−ＰＥＧ２ｋの重量％を５０％および１００％に引き上げると、相対的に血清中におけるｐＤＮＡの保護力が低下した。この保護力は、ＤＬＳおよびＴＥＭを用いて調べられる、各調合物のｐＤＮＡと縮合してナノサイズのポリプレックスを形成する能力と相関する。

上記調合物を用いて、細胞培養系におけるルシフェラーゼ遺伝子の導入発現および細胞生存率を調べて、各調合物の生物活性を評価した。ポリエチレングリコールには、ｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）単独の場合と比較して血清含有培地における遺伝子送達を増大させる能力があったが、この増大が認められたのは、ポリエチレングリコールを特定の比率で用いた場合に限られた。これらの結果は、ポリエチレングリコール／ポリカチオン比率を変化させて、キャリア機能を向上させるポリエチレングリコール比率を容易に検討し最適化することが可能であること、および遺伝子キャリアの最適化のために現在行われている、生理化学的特性のそれぞれ異なる生体還元性共重合体を複数合成するという方法を回避できることを示す証拠となる。

実験およびプロトコール
材料および方法
材料
トリエチレンテトラミン（ＴＥＴＡ）、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、Ｎ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）、超分岐ポリエチレンイミン（ｂＰＥＩ、Ｍｗ２５，０００）およびＨＰＬＣ用メタノールは、シグマ・アルドリッチ社（セントルイス、ミズーリ州）より購入した。シスタミンビスアクリルアミド（ＣＢＡ）はポリサイエンス社（ウォリントン、ペンシルバニア州）より購入した。限外濾過装置および再生セルロースメンブレン（１ｋＤａ、５ｋＤａおよび１０ｋＤａ）は、ミリポア社（ビルエリカ、マサチューセッツ州）より調達した。レポーター遺伝子発現プラスミドｐＣＭＶＬｕｃは、ｐＣＭＶプロモーターで駆動するｐＣＩプラスミド（プロメガ社、マディソン、ウィスコンシン州）にルシフェラーゼｃＤＮＡを挿入することにより構築し、Ｍａｘｉｐｒｅｐ（インビトロジェン社、カールスバード、カリフォルニア州）のプロトコールを用いて精製した。ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ペニシリン・ストレプトマイシン、トリプシン様酵素（ＴｒｙｐＬＥＥｘｐｒｅｓｓ）およびダルベッコリン酸緩衝生理食塩水は、ＧｉｂｃｏＢＲＬ社（カールスバード、カリフォルニア州）より購入した。ＥＧＭ−２ＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔｓを添加したＥＢＭ−２はロンザ社（バーゼル、スイス）より購入した。ウシ胎児血清（ＦＢＳ）はハイクローンラボラトリーズ社（ローガン、ユタ州）より購入した。

ポリマーの合成
ｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）
ｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）の合成は、参考文献１に記載の方法に変更を加えて５０℃にて行った。重合反応液のｐＨを７．０に調整した後、これを２つに分けて、分画分子量１ｋＤａおよび５ｋＤａの再生セルロースメンブレンを用いた限外濾過によって精製し、凍結乾燥させた（スキーム１）。

ｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）５ｋ−ｇ−２ｋ
メトキシＰＥＧ２ｋ（ｍＰＥＧ２ｋ）を無水トルエンを用いて乾燥させた後、氷冷した無水エーテル中で沈殿させた。白色の沈殿物を回収し、減圧下で乾燥させた。次いで、溶媒としてのＤＣＭ（ジクロロメタン）中、クロロギ酸ｐ−ニトロフェニルを用いてｍＰＥＧ２ｋを活性化し、撹拌しながら氷上で一晩反応させた。活性化したＰＥＧ生成物を氷冷した無水エーテル中で沈澱させて回収し、減圧下で乾燥させた。ＮＭＲ分析によりＰＥＧの活性化度を調べた後、等モルのｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）５ｋおよび活性化ＰＥＧ２ｋを溶媒としての無水ピリジン／ＤＭＳＯに別々に溶解し、得られたポリ（エチレングリコール）−炭酸塩溶液をｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）５ｋの溶液に滴下した。室温で撹拌しながら、反応をＵＶ−ＶＩＺにより４００ｎｍでモニターした。反応は約１６時間で完了した。サンプルを限外濾過（分画分子量：５ｋＤａ）により精製した後、凍結乾燥させた。ＰＥＧ５ｋおよびＰＥＧ１０ｋを用いた修飾も同様に行ったが、精製はそれぞれ分画分子量が１０ｋＤａおよび２０ｋＤａの再生セルロースメンブレンを用いて行い、その後精製物を凍結乾燥に供した。ポリ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）−ｇ−ＰＥＧ共役共重合体の組成を^１ＨＮＭＲでモニターし、適切なピークの曲線下面積（ＡＵＣ値）を積分して相対的なＰＥＧ修飾量を評価した。^１ＨＮＭＲスペクトルの測定は、ＶａｒｉａｎＩｎｏｖａ４００ＭＨＺ核磁気共鳴分光装置（バリアン社、パロアルト、カリフォルニア州）で標準的なプロトンパラメーターを用いて実施した。化学シフトは約４．７ｐｐｍに現れる残存するＨ_２Ｏの共鳴を基準とした。

ポリマーの特性
ｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）１ｋ、ｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）５ｋおよびｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）５ｋ−ＰＥＧ２ｋの相対分子量の分析は、ＡＫＴＡ／ＦＰＬＣ（アマシャムファルマシアバイオテック社）を用いて行った。ｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）１ｋ（２ｍｇ／ｍＬ）の分析にはＳｕｐｅｒｄｅｘＰｅｐｔｉｄｅカラムＨＲ１０／３０を用いた。３０％（ｖ／ｖ）アセチルニトリル溶離剤を含む溶離緩衝液（０．３ＭＮａＡｃ、ｐＨ４．４）を０．２ｍｍのフィルター（ナイロン、オルテック社）でろ過し、使用前に脱気した。流速は０．４ｍＬ／分に設定した。検量線は、標準物質として２〜１０ｋＤａのポリ（ヒドロキシプロピルメタクリル酸）（ポリ（ＨＭＰＡ））を用いて作成した。ｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）５ｋおよびｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）５ｋ−ＰＥＧ２ｋの分析は、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ６１０／３００ＧＬカラムを使用し、標準物質として４０〜１５０ｋＤａのポリ（ＨＭＰＡ）を使用した以外は上記と同じ条件で行った。

ポリカチオンの分岐
相対分岐度は、参考文献５に記載の通り、ジスルフィド結合をトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）を用いて還元し、Ｎ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）を用いて保護することによって求めた。ＮＥＭで修飾したポリマーの繰り返し単位をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦで分析した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析は、Ｖｏｙａｇｅｒ−ＤＥＳＴＲ生体分光分析用ワークステーション（パーセプティブバイオシステムズ社）を用いて、陽イオンモードおよび遅延抽出モードで行った。スペクトルの外部補正は、公称質量が３２５〜２，４６５の標準ペプチド混合物を用いて行った。

酸塩基滴定
各ポリカチオンの緩衝能は、既に確立されている方法（１４）を用いて測定した。簡潔に述べると、６ｍｇのポリマーを３０ｍＬのＮａＣｌ溶液（０．１Ｍ）に溶解し、まず０．１ＭＮａＯＨで滴定してｐＨ１０とした。次いで、０．１ＭＨＣｌを加えてｐＨを降下させた。これらのポリマーの絶対分子量は既知でないため、滴定値は、ポリカチオン溶液のｐＨを７．４から５．１に降下させるのに必要なＨＣｌのｍｍｏｌ数として示される。比較対照としてｂＰＥＩｋ２５ｋＤａを用いた。

光散乱法およびゼータ電位測定
表面電荷およびポリマー／ｐＤＮＡ粒子（ポリプレックス）の直径は、Ｍａｌｖｅｒｎ４７００ｓｙｓｔｅｍのＺｅｔａｓｉｚｅｒ２０００装置（ＤＴＳ５００１セル）および動的光散乱（ＤＬＳ）ユニットをそれぞれ用いて２５℃で測定した。各ポリプレックスは、所望の濃度に調製した１５ｍｇのｐＤＮＡを含有するＨＥＰＥＳ緩衝液（２００ｍＬ）に、ＨＥＰＥＳ緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ７．４、５％ブドウ糖）中に漸増濃度のポリマーを含有する溶液（２００ｍＬ）を同量加えることにより調製した。ポリプレックスの平衡化を３０分間行った後、濾過したｍｉｌｌｉＱで希釈して、最終容量２ｍＬとした。

透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）
各ポリプレックスをＨＥＰＥＳ緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ７．４、５％ブドウ糖）を用いて０．０５ｍｇ／ｍＬに調製し、そのうち５ｍＬをＴＥＭ用の銅製グリッドプレートに載せて乾燥させた。各グリッドを、濾過した脱イオン水で３回注意深くすすいで、残った緩衝塩を除去した。次いで、各サンプルを、濾過したリンタングステン酸（ＰＴＡ）で１分間染色した後、濾過した脱イオン水で再度洗浄した。ＴｅｃｈｎａｉＴ１２ｓｃｏｐｅ（ＥＦＭ）を用いて８０ｋＶで粒子像を視覚化した。２０，０００〜２００，０００倍の拡大倍率を使用し、顕微鏡写真の撮影を１１０，０００倍で行った。

９０％新鮮なウサギ血清中におけるポリプレックスの安定性
血清中のポリプレックスの安定性は最適化されたプロトコールを用いて評価した。以下簡潔に述べる。ポリマー溶液とｐＤＮＡ溶液を同量混合することにより、ポリマーとｐＤＮＡの重量比（ｗ／ｗ）が２４であるポリマー／ｐＤＮＡポリプレックスをＨＥＰＥＳ緩衝液中に形成させ、これを３０分間平衡化させた。一方、５００ｎｇのフリーのｐＤＮＡをＨＥＰＥＳ緩衝液中に含有するものも準備した。次いで、形成させたポリプレックスを新鮮なウサギ血清で希釈して血清濃度が９０％になるように調製し、３７℃で数時間にわたってインキュベーションを行った。所定の各時点でインキュベーション液から２５ｍＬ（１２５ｎｇｐＤＮＡ）ずつ取り、それぞれに１０ｍＬの停止用緩衝液（２５０ｍＭＮａＣｌ、２５ｍＭＥＤＴＡ、２％ＳＤＳ）を加えた。これらのサンプルは分析に使用するまで−７０℃で凍結して保存した。一旦解凍したサンプルは、ポリカチオンとｐＤＮＡとを完全に分離するために６０℃で一晩インキュベーションを行った。次いで、５０ｍＭＤＴＴを２ｍＬずつ各サンプルに加え、複合体をすべて確実に解離させるために３７℃でさらに３０分間インキュベーションを行った。最後に、エチジウムブロミド（ＥｔＢｒ）で染色した２％アガロースゲルに各サンプルをロードし、ＴＡＥ（４０ｍＭトリス酢酸塩、１ｍＭＥＤＴＡ）緩衝液を用いて、９６Ｖで３０分間電気泳動を行った。ＧｅｌＤｏｃソフトウェアを用いてゲル画像を確認した。

細胞培養
マウス膵ランゲルハンス島内皮細胞（ＳＶＲ）および大腸腺癌細胞（ＣＴ−２６）（ＡＴＣＣ、マナセ、ヴァージニア州）は、３７℃、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ_２に設定した加湿インキュベーター内で、１０％ＦＢＳおよび１％ペニシリン・ストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭを用いて培養した。ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）（インビトロジェン社）は、３７℃、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ_２に設定した加湿インキュベーター内で、ＥＧＭ−２ＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔｓを添加したＥＢＭ−２培地を用いて培養した。

ｉｎｖｉｔｒｏ遺伝子導入発現
細胞培養系におけるルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現は、各ポリマーおよびｐＣＭＶＬｕｃプラスミドＤＮＡを用いて行った。細胞は０．５ｍＬの培地を含む２４穴プレートに播種した。細胞数が７０％コンフルエントに達したところで、０．５ｍｇのｐＤＮＡを用いてＨＥＰＥＳ緩衝液中に重量比（ｗ／ｗ）が２４のポリプレックスを調製した。ポリプレックスの平衡化を３０分間行った後、細胞へのトランスフェクションを血清存在下で行った。具体的には、２０ｍＬのポリプレックス（０．５ｍｇｐＤＮＡ）を各ウェルに加えてインキュベーションを４時間行った後、培地を新しい血清含有培地と交換して、細胞をインキュベーター内に合計４８時間静置した。次いで、細胞を１ｍＬのＰＢＳで洗浄し、細胞培養用溶解緩衝液（プロメガ社、マディソン、ウィスコンシン州）で処理した。ルシフェラーゼの定量は、ルシフェラーゼアッセイシステム（プロメガ社）とダイネックス・テクノロジーズ社（シャンティリー、ヴァージニア州）のルミノメーターとを用いて行った。細胞溶解液中のタンパク量は、ウシ血清アルブミン（シグマ社、セントルイス、ミズーリ州）の検量線およびＢＣＡプロテインアッセイキット（ピアス社、ロックフォード、イリノイ州）を用いて測定した（ｎ＝４）。

細胞生存率アッセイ
細胞を２４穴プレートに播種し、細胞数が約７０％コンフルエントに達したところでトランスフェクションを行った。ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイの場合と同様に、ポリプレックスを調製した。平衡化ポリプレックス（０．５ｍｇｐＤＮＡ）を含むＨＥＰＥＳ緩衝液２０ｍＬを各ウェルに加えて、各細胞培養物に血清存在下でトランスフェクションを行った。細胞を合計１８時間インキュベートした後、ＭＴＴアッセイ（シグマ社）を用いて細胞生存率を調べた。細胞生存率（％）は、未処理の細胞を基準として求めた（ｎ＝４）。

結果
１．ｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）５ｋの２段階合成および性状分析
合成および性状分析
ｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）
ｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）は非常に効果的な遺伝子キャリアであることが確認されており、また、有意な細胞毒性を示さない超分岐構造を作製する上で、様々な分岐構造へと派生させることができる。スキーム１に示すようにサンプルを合成、精製した後、試験に用いた。重合は、マイケル付加反応によって、ＴＥＴＡモノマーのアミン基にＣＢＡモノマーが付加されることにより起こる。ＴＥＴＡモノマーには４つの反応性アミン基が存在するので、高度に分岐した生成物をゲル化前に得ることができる。重合反応は１００％ＭｅＯＨ中、様々な温度で実施し、それぞれ^１ＨＮＭＲでモニターした。合成温度はサンプルの分岐度と相関することが示された（データ示さず）。分画分子量が１ｋＤａ、５ｋＤａまたは１０ｋＤａの限外濾過膜を用いてサンプルからオリゴマーポリカチオンを排除した結果、予想した通り、サンプルの多分散性指数（ＰＤＩ）が低下した。このＰＤＩは、ＦＰＬＣでモニターしたサンプルの相対分子量とも相関する。市販のｂＰＥＩ２５ｋも比較用の外部対照として分析した。ＧＰＣ分析では、ｂＰＥＩ２５ＫのＭｎおよびＭｗの値が過小評価されるので、ポリ（ＴＥＴ／ＣＢＡ）の分子量を推定するためには外挿法を用いる必要がある。さらに、ｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）５ｋは、従来の精製方法に従って得られたサンプルと同等の緩衝能を有する（表１）。

ａ：ＦＰＬＣで測定した数平均分子量（Ｍｎ）、重量平均分子量（Ｍｗ）、多分散性（Ｍｗ／Ｍｎ）。
ｂ：０．１ＭＮａＣｌ水溶液におけるｐＨを７．４から５．１にシフトさせるのに必要なＨＣｌのｍｏｌ数により求められるポリマー画分の緩衝能滴定値。
ｃ：分岐度はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦにより測定した。

ｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）５ｋ−ＰＥＧ２ｋ
ＰＥＧ化は血清存在下のポリカチオン性キャリアの機能をｉｎｖｉｔｒｏでもｉｎｖｉｖｏでも向上させることが可能であるが、これは主としてポリプレックスの表面電荷に起因する。しかし、ほぼ中性の電荷を持つ粒子はイオン性の反発力が小さいため、溶液中で凝集しやすい。そこで、必要に応じてｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）５ｋと混合することによりｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）ポリカチオンに対するＰＥＧの重量百分率（重量％）を容易に調整することができ、無毒な分岐ポリカチオンの粒子の特性および機能性に対する影響を検討することができるｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）５ｋ−ＰＥＧ化体を、１つのモデルシステムとして合成した（スキーム２）。ポリカチオンへのＰＥＧ修飾は、ＵＶ−ＶＩＺ分光光度計により検量線を用いて４００ｎｍでモニターした。反応は１６時間で完了した。先に記載した通り、ｍＰＥＧ５ｋおよびｍＰＥＧ１０ｋによる修飾も行ったが、これらのグラフト共重合体はナノサイズの粒子を形成することも、導入遺伝子を発現させることもできなかった（データ示さず）。ＮＭＲ分析およびピークのＡＵＣ値の比較から、ＰＥＧ：（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）５ｋのモル比は約０．９６／１であることが示された。これはＡＫＴＡＦＰＬＣによる分析（表１）とよく一致している。

ｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）のＰＤＩおよび分子量が生物活性に与える影響
上述した通り、低分子量（ＬＭＷ）のＰＥＩはＮ／Ｐ比が低い場合にｐＤＮＡとの縮合が制限され、該縮合はＰＥＧ修飾によってもしばしば阻害されることから、不安定化要因であるオリゴマーを排除することによって、キャリア性能を妨げることなく平均分子量を増大させ、ｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）のＰＤＩを低下させることが好ましい（１７）。図１Ａ〜Ｄから分かるように、ｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）のＰＤＩが低下して相関的に分子量が増大しても、キャリア性能に対する悪影響は生じず、ｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）１ｋに対して実施した従来の合成・精製方法を用いた場合と同等であった。より具体的には、ｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）５ｋは、現行の標準であるｂＰＥＩ２５ｋＤａより、ＨＵＶＥＣ初代培養細胞において毒性が有意に低く、ＨＵＶＥＣおよびＳＶＲのいずれの内皮細胞においても導入したルシフェラーゼ遺伝子の発現が高かった。また、この結果は、心筋芽細胞Ｈ９Ｃ２を用いてｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）１０ｋと比較した場合の結果（図２Ａ〜Ｂ）とも一致した。ｂＰＥＩ２５ｋＤａの毒性は、高分子量ポリカチオン類の細胞内蓄積によるものであると考えられている（３）。これらのポリカチオン類は、細胞膜と相互作用してその機能を破綻させる可能性があり、かつ／または細胞内のタンパク質および核酸と相互作用して細胞内輸送および遺伝子の転写・翻訳などの細胞内プロセスおよび核内プロセスを阻害する可能性がある（１８、１９）。非分解性のｂＰＥＩ２５ｋＤａと比較すると、生体還元性ポリカチオンであるｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）はこれらの細胞内相互作用が弱く、その結果その相対分子量に関係なく初代培養内皮細胞において低毒性を示すと考えられる（２０）。ｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）画分で観察された導入遺伝子の高発現も、この現象と核酸の細胞内放出とを結びつけることにより説明できるだろう（６、９）。

ｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）に対する血清の影響
血清含有培地、およびｉｎｖｉｖｏで投与された場合にポリプレックスが遭遇する血清は、粒子の不安定化および治療用遺伝子のヌクレアーゼ分解またはｉｎｖｉｖｏの細網内皮系による貪食により、ポリカチオンの性能をしばしば低下させる。ここに示すデータは、過去の所見と一致している。具体的には、血清含有培地中の大腸腺癌細胞（ＣＴ−２６）におけるｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）の性能は、ｂＰＥＩ２５ｋＤａより有意に優れているが、血清を含まない培地中でトランスフェクションを行った場合と比較すると低い（図３）。そのため、スキーム２に示すような核酸送達用のｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）５ｋ−ｇ−ＰＥＧ共重合体を開発する必要がある。

ポリプレックスの性状分析
ｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）５ｋおよびｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）５ｋ−ｇ−ＰＥＧ２ｋそれぞれの核酸と縮合してポリプレックスを形成する能力を、粒径分析およびゼータ電位測定により調べた。確かに、いずれの遺伝子キャリア候補でも２００ｎｍ未満かそれに近い直径を持つナノサイズの粒子が形成されたが、好ましい低ポリマー濃度では、予想した通り、ＰＥＧ修飾によりポリプレックスの形成が阻害された（図４Ａ）。また、ｐＣＭＶＬｕｃとの縮合に十分なポリマー濃度では、ＰＥＧ修飾によりポリプレックスの表面電荷が低下し、ポリプレックスは安定した状態にはなかったと考えられる（図４Ｂ）。

ポリプレックスの特性に対するＰＥＧ重量％の影響
ＰＥＧ化ポリエチレンイミンキャリアを使用して得られた過去の所見と、ｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）ポリカチオンのＰＥＧ化が核酸との縮合を阻害することを示した今回の所見（図４Ａ〜Ｂ）は一致する。この問題を解決し、ポリマー溶液とＰＥＧ共重合体溶液との混合により検討用にＰＥＧ／ポリカチオンの重量％を調整することが可能か否かを確認することを目的として、かつ表面電荷が低く均一で安定したポリプレックスを維持する最適な調合物を同定することを目的として、ｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）５ｋ−ｇ−ＰＥＧ２ｋ、ｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）５ｋ、ならびにこれら２つの分子種からなる１０／９０重量％および５０／５０／重量％混合物をそれぞれ用いて、ポリカチオン／ｐＤＮＡの総重量比が２４となるポリプレックスを調製した（スキーム２）。

血清安定性
血清存在下のポリプレックスの安定性に対するＰＥＧ重量％の影響を調べるために、形成後３０分間平衡化したポリプレックスを新鮮なウサギ血清に加えて、最終血清濃度が９０％となるように３７℃で調製した。採取したサンプルをアガロースゲルを用いた電気泳動に供し、所定の各時点における未分解のｐＣＭＶＬｕｃ量を、未処理である対照の０時間を基準として視覚化した。図５Ａ〜Ｂより、ｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）５ｋおよび１０％ＰＥＧは、６時間の時点で８０％以上のｐＤＮＡをヌクレアーゼ分解から保護していることが分かる。ＰＥＧ重量％を５０％および１００％に引き上げると、粒子の安定性の低下およびｐＤＮＡ保護力の減弱が起こり、ｐＤＮＡ保護力に関しては、インキュベーション開始から６時間の時点でそれぞれ６０％および４０％のｐＤＮＡしか保護されない。

ポリプレックスの分析
調合の簡便性およびキャリア機能の向上のためには、様々なＰＥＧ重量％で構成される安定したポリプレックスがそれぞれ均一の形態を持ち、ポリプレックスのサイズおよび表面電荷はそれぞれ単峰型の分布を示すことが必須である。各調合物のポリプレックスのサイズをＴＥＭにより視覚化した（図６Ａ〜Ｄ）。各ポリプレックスのサイズおよび分布を、動的光散乱法（ＤＬＳ）により得られた各ポリプレックスの測定値と比較して分析したところ、互いに一致しており、過去の所見とも一致した（図６Ｆ）。図６Ａ〜Ｄはポリプレックスの形態変化を示しており、ＰＥＧ重量％の増加につれてポリプレックスがコンパクトでなくなり、半透明の外殻を伴うことが分かる。この半透明の外殻は、ＰＥＧ重量％の増加によるものと考えられる。図６Ｄに示すように、ｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）５ｋ−ｇ−ＰＥＧ２ｋでは凝集が起こった。この凝集はＤＬＳによる分析でも認められ、データに悪影響を及ぼした。したがって、この調合物は分析から除外し、図６Ｅには示していない。ｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）５ｋ、１０％ＰＥＧおよび５０％ＰＥＧをそれぞれ用いた調合物は、溶液中で１５０ｎｍ未満のポリプレックスを生成する。また、ＰＥＧ重量％は予想通り、ポリプレックスの表面電荷と逆相関する（図６Ｅ）。

キャリア機能および生物活性に対するＰＥＧ調合物の影響
遺伝子送達用ＰＥＧ共重合体調合物の血清存在下における潜在的な利点を調べるために、大腸腺癌細胞（ＣＴ−２６）を用いてルシフェラーゼ遺伝子導入アッセイを行った。１０％ＰＥＧを用いて調合したポリプレックスおよび５０％ＰＥＧを用いて調合したポリプレックスでは、ｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）ポリカチオン単独よりも、血清存在下において導入遺伝子の発現が高かった（図７Ａ）。さらに、これらのポリプレックスはＣＴ−２６細胞に対して毒性を示さない（図７Ｂ）。

２．ｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）−ｇ−ＰＥＧ２ｋの１段階合成
従来のＰＥＧ化合成は、ポリマー生成物を得るのに２回の合成・濾過工程が必要であるため、時間のかかる工程を要すると言える（スキーム１および２を参照のこと）。そこで、最終生成物を得るまでの時間を半減させる１段階の合成・濾過方法をｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）−ｇ−ＰＥＧ２ｋ用に開発した（スキーム３）。この方法で得られたポリマーは、先の記載よりも高分子量（分画分子量：１０ｋＤａ）で精製した場合、低分子量の精製物より優れた縮合・保護プロファイルを持つことから静脈内投与時の毒性プロファイルに優れており、よってより広い治療濃度域を有する。

合成および性状分析
ｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）は非常に効果的な遺伝子キャリアであることが既に確認されており、また、有意な細胞毒性を示さない超分岐構造を作製する上で、様々な分岐構造へと派生させることができる。スキーム３に示すようにｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）−ｇ−ＰＥＧ２ｋサンプルを合成、精製した後、試験に用いた。重合は、マイケル付加反応によって、ＴＥＴＡモノマーのアミン基にＣＢＡモノマーが付加されることにより起こる。上述したように、ＴＥＴＡモノマーには４つの反応性アミン基が存在するので、高度に分岐した生成物をゲル化前に得ることができる。このポリマーは、マイケル付加反応によって、第１級アミン基および第２級アミン基を含む機能性アミンがＣＢＡのアクリルアミド官能基へ付加される（モル比１：１）ことにより合成される。この重合反応は、遮光フラスコ（ｌｉｇｈｔｓｅｎｓｉｔｉｖｅｆｌａｓｋ）内で、溶媒としてＭｅＯＨを用い、窒素雰囲気下、３０℃で１０時間行う。簡潔に述べると、撹拌棒を備えた褐色の反応器にＴＥＴＡおよびＣＢＡ（１Ｍ）を入れ、反応器を密閉して３０℃に設定したオイルバス中に静置し、１０時間継続して重合反応を行う。その後、ｐＨ７の水溶液中で８時間かけてＮＨＳおよびＥＤＣを用いて活性化したｍＰＥＧ２ｋを１０重量％、反応液に滴下する。次いで、さらに２時間反応させ、１００％を超えるＴＥＴＡを加えて反応を停止する。次いで、遊離のアクリルアミド基をすべて確実にクエンチするために、さらに２４時間そのまま反応させる。得られたポリマー生成物は、まず脱イオン化した超純水で反応液を希釈した後ｐＨ７に調整し、これを限外濾過（分画分子量：５，０００または１０，０００）することにより単離する。４Ｂａｒｒで一晩、精製を行った後、濃縮および凍結乾燥を行う。^１ＨＮＭＲ分析の結果から、５ｋＤａで濾過したポリマーのＰＥＧ２ｋ／ｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）比は９％であり、１０ｋＤａで濾過したポリマーのＰＥＧ２ｋ／ｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）比は３〜４％、すなわちＣＢＡ１４６〜１７１分子あたりＰＥＧユニットが１つ存在することが分かった。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析から、ポリマーの９１％が分岐しており、１０ｋＤａで濾過したポリマーの８４．３％が分岐していることが分かった。ＰＥＧはすべて、ポリマーのＯアームと結合しているものと考えられる。ＡＫＴＡＦＰＬＣ分析から、５ｋＤａで濾過したｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）−ｇ−ＰＥＧ２ｋの平均分子量は１０．８９ｋＤａであるが、その分布は広く、３〜３０ｋＤａであることが分かった。

このｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）−ｇ−ＰＥＧ２ｋのサイズ特性は、２段階合成法によって得られる類似体と同様であるが、１０ｋＤａで濾過した生成物は該類似体よりはるかに低い重量％比でより小さい複合体を形成する（図８および図４Ａ）。

ｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）−ｇ−ＰＥＧ２ｋの調合物はすべて、ｓｉＲＮＡキャリアとして優れたトランスフェクション特性を示した。このポリマーは、様々なパーセンテージのＰＥＧ調合物および様々な重量％比で使用できる（図９Ａ〜Ｆ）。このポリマーをｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）５ｋと混合して、ルシフェラーゼを標的とするｓｉＲＮＡ（濃度：４０ｎＭ）と複合体を形成させた。図９Ｆは、ＰＣ−３細胞における上記ポリマーの作用を示す。１００％ｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）−ｇ−ＰＥＧ２ｋ調合物が３分の１少ない量ではあるものの、ルシフェラーゼを阻害することができたことは注目すべき点である。

ＰＥＧ化ポリマー調合物の血清安定性を９０％新鮮なラット血清中で測定し、２時間毎に試験開始後６時間まで調査した。ｓｉＲＮＡ分解を最も阻害したのはｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）−ｇ−ＰＥＧ２ｋとｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）との５０％混合物であったが、６時間後の阻害率では１０％の減少が見られた（図１０）。他の比率では、６時間後の阻害率は４０％以上の減少が見られた。

分画分子量５ｋＤａ以下で濾過したポリマーは、ＰＥＧ化に関係なく、用量１６０μｇで毒性を示すことが分かった。ＰＥＧ化がＰＥＩとの複合体における表面電荷を低下させて補体活性化を抑制することはこれまで報告されているが、今回に限って言えばそのような結果は確認されていない。この毒性は１段階合成でも２段階合成でも確認される。このポリマーで形成可能なナノ複合体（重量比６：１はｓｉＲＮＡまたはＤＮＡの量に換算すると２７μｇ以下である）で送達できる最大用量は１．５ｍｇ／ｋｇ未満である。この用量はｉｎｖｉｖｏでの使用としてはかなり低い。そこで、２つのポリマー（ｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）およびｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）−ｇ−ＰＥＧ２ｋ）を、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ遠心濃縮機を用いて、分画分子量１０，０００で濾過した。高分子量画分および低分子量画分（濃縮機の上部に回収された上清（高分子量画分）および下部に回収された上清（低分子量画分））をそれぞれ回収し、性状分析に用いた。低分子量画分は、重量比１０：１未満で混合した場合では十分に複合体を形成せず、重量比を２４：１とかなり高くしても粒径は大きかった（１，２００ｎｍ）。

様々な重量比で構成されるｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）−ｇ−ＰＥＧ２ｋ／ｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）調合物を、全量４０ｎｇのプラスミドＤＮＡと複合体を形成させて、体内分布研究に用いた。２５、５０、７５および１００重量％のｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）−ｇ−ＰＥＧ２ｋを含む調合物で構成されるナノ複合体をそれぞれ２０％ブドウ糖を含む１０ｍＭＨＥＰＥＳ２００μＬ中に形成させ、これをＣＴ−２６担癌Ｂａｌｂ／ｃマウスの尾静脈に静脈内注射した。４８時間後にマウスを屠殺して臓器（および腫瘍）を摘出し、プラスミドＤＮＡを、該プラスミドのＦ１ｏｒｉ領域をターゲットにしたＴａｑｍａｎプライマーを用いてｑＰＣＲにより分析した。体内分布パターンの結果から、１００％ｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）−ｇ−ＰＥＧ２ｋを用いてポリマー：ｐＤＮＡ比３：１で構成した場合に、腫瘍に対する遺伝子送達が最大となることが示された（図１１Ａ）。しかし、それより高レベルのプラスミドＤＮＡが複数の他の組織で認められた。この体内分布傾向は、他のパーセンテージのｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）−ｇ−ＰＥＧ２ｋを含むポリマー調合物を用いたポリマー／ｐＤＮＡの重量比が同じ複合体でも見られたが、プラスミドＤＮＡ量は低値であった。重量比が０．５／１のポリマー／ｐＤＮＡ複合体は異なる体内分布パターンを示した（図１１Ｂ）。この重量比では、腫瘍において他の組織よりも高レベルのプラスミドＤＮＡが認められ、７５％ｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）−ｇ−ＰＥＧ２ｋ調合物では最も差が見られた。いずれの比率のポリマー／ｐＤＮＡ複合体でも、調合物中のｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）−ｇ−ＰＥＧ２ｋのパーセンテージに関係なく体内分布パターンは同じであったため、それぞれ１つの調合物を選択してグループの代表とした（図１１Ｃ）。

ナノ複合体の最大用量は、沈澱生成、物理的力（流体力学作用）および用量制限毒性によって制限される。したがって現時点では、２０％ブドウ糖を含む１０ｍＭＨＥＰＥＳ２７５μＬ容量において、ポリマー／ｓｉＲＮＡ重量比が３：１の場合、投与可能な最大用量はｓｉＲＮＡとして５５μｇであると考えられる。７５重量％ｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）−ｇ−ＰＥＧ２ｋ調合物を用いて、ポリマーとマウスＨＩＦ−１ａを標的とするｓｉＲＮＡとの比が０．５／１および３／１となるように調製されたナノ複合体を、尾静脈または局所的に（腫瘍部位に）ＣＴ−２６担癌Ｂａｌｂ／ｃマウスに静脈内注射した。その後、マウスを屠殺して、各個体から臓器および腫瘍を回収した。ＳＶ９６ＴｏｔａｌＲＮＡ精製キットを用いて全ＲＮＡを単離し、ＲＴ−ｑＰＣＲにより、２０％ブドウ糖を含む１０ｍＭＨＥＰＥＳを静脈内注射または局所注射した対照マウスとｍＲＮＡ値を比較した。ＲＴ−ｑＰＣＲでＣｔ値を予備比較したところ、マウスの腫瘍部位におけるｍＨＩＦ−１ａ値は静脈内注射で６３％、局所注射で７０％減少することが示された（図１２）。

本発明によるｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）−ｇ−ＰＥＧ２ｋの合成は、生体還元性分子とポリアミドアミン（ＰＡＡ）またはポリアミドエチレンイミン（ＰＡＥＩ）とを用いる従来の方法を改良したものである。いずれの方法も特徴は類似しているが、本発明の方法は、合成速度が従来法より５０％速く、２段階合成法とは異なる生成物が得られる。限外濾過により１０ｋＤａで精製したｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）−ｇ−ＰＥＧ２ｋは、５ｋＤａで濾過したものより優れた生理化学的特性を有する。この１０ｋＤａポリマーは、ＥＰＲ効果（ｅｎｈａｎｃｅｄｐｅｒｍｅａｔｉｏｎａｎｄｒｅｔｅｎｔｉｏｎｅｆｆｅｃｔ：透過性および滞留性の亢進効果）がもたらすと考えられる受動的（ｄｅｓｅｌｅｃｔｉｖｅ）ターゲッティングにより、より優れたｉｎｖｉｖｏ毒性プロファイルを有し、腫瘍部位において良好なトランスフェクション効率を維持する。これより低分子量のポリマーでは、複合体形成および用量制限毒性の問題から、５０％より高い阻害率を示すのに必要な量を送達することができない。様々なパーセンテージのＰＥＧ調合物および様々な重量％比の中でも、７５％ｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）−ｇ−ＰＥＧ２ｋを重量比０．５：１で使用したもの、および１００％ｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）−ｇ−ＰＥＧ２ｋを重量比３：１で使用したものは、腫瘍内のタンパク質を阻害するｓｉＲＮＡを静脈経由でｉｎｖｉｖｏ送達する上で、最も優れた候補であると考えられる。これより高い重量比についても検討を行ったが、用量制限毒性により毒性が現れた。様々なパーセンテージの調合物を用いて高い重量比で構成した場合のｉｎｖｉｔｒｏでの使用の可能性は残されており除外すべきでない。ｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）−ｇ−ＰＥＧとｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）との混合物により相乗効果が得られる。

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Claims

ポリ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）−ポリエチレングリコールグラフト共重合体を含む組成物。
前記ポリ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）−ポリエチレングリコールグラフト共重合体がスキーム２またはスキーム３に示す構造を有する請求項１に記載の組成物。
核酸とポリ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）−ポリエチレングリコールグラフト共重合体とを含む複合体。
前記核酸がプラスミドＤＮＡを含む請求項３に記載の複合体。
前記核酸がｓｉＲＮＡを含む請求項３に記載の複合体。
前記グラフト共重合体と混合物を形成しているポリ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）をさらに含む、請求項３に記載の複合体。
（ａ）ポリ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）と（ｂ）ポリ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）−ポリエチレングリコールグラフト共重合体との混合物を含む組成物。
細胞に核酸とポリ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）−ポリエチレングリコールグラフト共重合体とを含む複合体を接触させることを含む、細胞へのトランスフェクションを行う方法。
前記核酸がプラスミドＤＮＡを含む請求項８に記載の方法。
前記核酸がｓｉＲＮＡを含む請求項８に記載の方法。
前記グラフト共重合体と混合物を形成しているポリ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）をさらに含むことを特徴とする、請求項８に記載の方法。
（Ａ）ＴＥＴＡとＣＢＡとを混合して第１の混合物を形成し、該第１の混合物を第１の選択時間反応させてポリ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）を得る工程、
（Ｂ）次いで、前記第１の混合物にポリエチレングリコールを付加して第２の混合物を形成し、該第２の混合物を第２の選択時間反応させる工程、および
（Ｃ）得られたポリ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）−ポリエチレングリコールグラフト共重合体を精製する工程
を含む、ポリ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）−ポリエチレングリコールグラフト共重合体を製造する方法。
前記精製が限外濾過によるものである、請求項１２に記載の方法。
前記限外濾過の分画分子量が５ｋＤａである、請求項１３に記載の方法。
前記限外濾過の分画分子量が１０ｋＤａである、請求項１３に記載の方法。