JP6377804B2 - 末端修飾rna - Google Patents
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Description
本出願は、2012年11月26日出願の米国仮特許出願第61/729,933号、表題「Terminially Optimized Modified RNAs」、2012年12月14日出願の米国仮特許出願第61/737,224号、表題「Terminally Optimized Modified RNAs」、2013年1月31日出願の米国仮特許出願第61/758,921号、表題「Differential Targeting Using RNA Constructs」、2013年3月14日出願の米国仮特許出願第61/781,139号、表題「Differential Targeting Using RNA Constructs」、2013年5月31日出願の米国仮特許出願第61/829,359号、表題「Differential Targeting Using RNA Constructs」、2013年6月27日出願の米国仮特許出願第61/839,903号、表題「Differential Targeting Using RNA Constructs」、2013年7月3日出願の米国仮特許出願第61/842,709号、表題「Differential Targeting Using RNA Constructs」、2013年7月23日出願の米国仮特許出願第61/857,436号、表題「Differential Targeting Using RNA Constructs」、2013年3月9日出願の米国仮特許出願第61/775,509号、表題「Heterologous Untranslated Regions for mRNA」、および2013年3月31日出願の米国仮特許出願第61/829,372号、表題「Heterologous Untranslated Regions for mRNA」に対する優先権を主張するものである。これら各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
配列表の参照
本出願は、配列表と共に電子書式で出願されている。配列表は、2013年10月1日に作成され、3,262,934バイトの大きさであるM39PCT2.txtと題されたファイルとして提供される。この配列表の電子書式での情報は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
発明の分野
本発明は、修飾mRNAおよび/または最適化mRNAの製造および使用のための組成物および方法、ならびにRNA結合タンパク質をコードする1つ以上の修飾mRNAまたは野生型mRNAと組み合わせたそれらの使用に関する。
く存在する。いったん細胞内に入ると、DNAは、それがRNA転写される核内に輸送されなければならない。その後、DNAから転写されたRNAは、それがタンパク質に翻訳される細胞質に入らなければならない。この複数の処理ステップを必要とするこにより目的とするタンパク質の生成前に遅れ時間差をもたらす。さらに、DNAが頻繁に細胞に入るが、発現されないか、または妥当な速度もしくは濃度で発現されないため、細胞におけるDNA発現を達成することは困難である。これは、DNAが一次細胞または修飾細胞株に導入されるときに特に問題になり得る。免疫刺激能、安定性、およびRNAの翻訳効率におけるヌクレオシド修飾の役割、ならびにタンパク質発現の増強および治療の作成のためのこの結果としての利点は、以前に研究されている。そのような研究は、公開された同時係属出願である、201年8月5日出願の国際公開第WO2012019168号、2011年10月3日出願の国際公開第WO2012045082号、2011年10月3日出願の国際公開第WO2012 045075号、2012年10月3日出願の国際公
開第WO2013052523号、および2012年12月14日出願の国際公開第WO2013090648号に詳述されており、これらの内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。
Vaccines」;2012年4月2日出願の米国仮特許出願第61/618,870号、表題「Modified Polunucleotides for the Production of Therapeutic Proteins and Peptides」;2012年8月10日出願の米国仮特許出願第61/681,649号、表題「Modified Polunucleotides for the Production of Therapeutic Proteins and Peptides」;2012年12月14日出願の米国仮特許出願第61/737,139号、表題「Modified Polunucleotides for the Production of Therapeutic Proteins and Peptides」;2012年4月2日出願の米国仮特許出願第61/618,873号、表題「Modified Polunucleotides for the Product
ion of Secreted Proteins」;2012年8月10日出願の米国仮特許出願第61/681,650号、表題「Modified Polunucleotides for the Production of Secreted Proteins」;2012年12月14日出願の米国仮特許出願第61/737,147号、表題「Modified Polunucleotides for the Production of Secreted Proteins」;2012年4月2日出願の米国仮特許出願第61/618,878号、表題「Modified Polunucleotides for the Production of Plasma Membrane Proteins」;2012年8月10日出願の米国仮特許出願第61/681,654号、表題「Modified Polunucleotides for the Production of Plasma Membrane Proteins」;2012年12月14日出願の米国仮特許出願第61/737,152号、表題「Modified Polunucleotides for the Production of Plasma Membrane Proteins」;2012年4月2日出願の米国仮特許出願第61/618,885号、表題「Modified Polunucleotides for the Production of Cytoplasmic and Cytoskeletal Proteins」;2012年8月10日出願の米国仮特許出願第61/681,658号、表題「Modified Polunucleotides for the Production of Cytoplasmic and Cytoskeletal Proteins」;2012年12月14日出願の米国仮特許出願第61/737,155号、表題「Modified Polunucleotides for the Production of Cytoplasmic and Cytoskeletal Proteins」;2012年4月2日出願の米国仮特許出願第61/618,896号、表題「Modified Polunucleotides for the Production of Intracellular Membrane Bound Proteins」;2012年7月5日出願の米国仮特許出願第61/668,157号、表題「Modified Polunucleotides for the Production of Intracellular Membrane Bound Proteins」;2012年8月10日出願の米国仮特許出願第61/681,661号、表題「Modified Polunucleotides for the Production of Intracellular Membrane Bound Proteins」;2012年12月14日出願の米国仮特許出願第61/737,160号、表題「Modified Polunucleotides for the Production of Intracellular Membrane Bound
Proteins」;2012年4月2日出願の米国仮特許出願第61/618,911号、表題「Modified Polunucleotides for the Production of Nuclear Proteins」;2012年8月10日出願の米国仮特許出願第61/681,667号、表題「Modified Polunucleotides for the Production of Nuclear Proteins」;2012年12月14出願の米国仮特許出願第61/737,168号、表題「Modified Polunucleotides for the
Production of Nuclear Proteins」;2012年4月2日出願の米国仮特許出願第61/618,922号、表題「Modified Polunucleotides for the Production of Proteins」;2012年8月10日出願の米国仮特許出願第61/681,675号、表題「Modified Polunucleotides for the Production of Proteins」;2012年12月14日出願の米国仮特許出願第61/737,174号、表題「Modified Polunucleotides for the Production of Proteins」;2012年4月2
日出願の米国仮特許出願第61/618,935号、表題「Modified Polunucleotides for the Production of Proteins Associated with Human Disease」;2012年8月10日出願の米国仮特許出願第61/681,687号、表題「Modified Polunucleotides for the Production of Proteins Associated with Human Disease」;2012年12月14日出願の米国仮特許出願第61/737,184号、表題「Modified Polunucleotides for the Production of
Proteins Associated with Human Disease」;2012年4月2日出願の米国仮特許出願第61/618,945号、表題「Modified Polunucleotides for the Production of Proteins Associated with Human Disease」;2012年8月10日出願の米国仮特許出願第61/681,696号、表題「Modified Polunucleotides for the Production of Proteins Associated with Human Disease」;2012年12月14日出願の米国仮特許出願第61/737,191号、表題「Modified Polunucleotides for the Production of Proteins Associated with Human
Disease」;2012年4月2日出願の米国仮特許出願第61/618,953号、表題「Modified Polunucleotides for the Production of Proteins Associated with Human Disease」;2012年8月10日出願の米国仮特許出願第61/681,704号、表題「Modified Polunucleotides for the
Production of Proteins Associated with Human Disease」;2012年12月14日出願の米国仮特許出願第61/737,203号、表題「Modified Polunucleotides for
the Production of Proteins Associated with Human Disease」;2012年8月10日出願の米国仮特許出願第61/681,720号、表題「Modified Polunucleotides for the Production of Cosmetic Proteins and Peptides」;2012年12月14日出願の米国仮特許出願第61/737,213号、表題「Modified Polunucleotides for the Production of Cosmetic Proteins and Peptides」;2012年8月10日出願の米国仮特許出願第61/681,742号、表題「Modified Polunucleotides for the Production of Oncology−Related Proteins and Peptides」;2013年3月9日出願の国際出願第PCT/US2013/030062号、表題「Modified Polunucleotides for
the Production of Biologics and Proteins Associated with Human Disease」;2013年3月9日出願の米国特許出願第13/791,922号、表題「Modified Polunucleotides for the Production of Biologics and Proteins Associated with Human Disease」;2013年3月9日出願の国際出願第PCT/US2013/03006
3号、表題「Modified Polunucleotides」;国際出願第PCT/US2013/030064号、表題「Modified Polunucleotides for the Production of Secreted Proteins」;2013年3月9日出願の米国特許出願第13/791,921号、表題「Modified Polunucleotides for the Producti
on of Secreted Proteins」;2013年3月9日出願の国際出願第PCT/US2013/030059号、表題「Modified Polunucleotides for the Production of Membrane Proteins」;2013年3月9日出願の国際出願第PCT/US2013/030066号、表題「Modified Polunucleotides for the Production of Cytoplasmic and Cytoskeletal Proteins」;2013年3月9日出願の国際出願第PCT/US2013/030067号、表題「Modified Polunucleotides for the Production of Nuclear Proteins」;2013年3月9日出願の国際出願第PCT/US2013/030060号、表題「Modified Polunucleotides for the Production of Proteins」;2013年3月9日出願の国際出願第PCT/US2013/030061号、表題「Modified Polunucleotides for the Production of Proteins Associated
with Human Disease」;2013年3月9日出願の米国特許出願第13/791,910号、表題「Modified Polunucleotides for the Production of Proteins Associated with Human Disease」;2013年3月9日出願の国際出願第PCT/US2013/030068号、表題「Modified Polunucleotides for the Production of Cosmetic Proteins and Peptides」;および2013年3月9日出願の国際出願第PCT/US2013/030070号、表題「Modified Polunucleotides for the Production of Oncology−Related Proteins and Peptides」、2013年3月15日出願の国際特許公開第PCT/US2013/031821号、表題「In Vivo Production of Proteins」に開示されている。これら各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
2の末端領域、および3’尾部領域を含む、末端最適化mRNAが本明細書に提供される。第1の末端領域は、例えば、限定されないが、TEE−001〜TEE−705といった表28に記載のTEE等の少なくとも1つの翻訳エンハンサー要素(TEE)を含んでいてもよいが、これらに限定されない。
、末端最適化mRNAはシュードウリジン類似体1−メチルシュードウリジンを含む。さらに別の実施形態において、末端最適化mRNAはシュードウリジン類似体1−メチルシュードウリジンを含み、修飾ヌクレオシド5−メチルシチジンを含む。
一実施形態において、生物体における抗原介在性免疫応答を、生物体と末端最適化mRNAを接触させることで減少させる方法が提供される。末端最適化mRNAは、第1の領域に対して5’側に位置する目的とするポリペプチドをコードする連結ヌクレオシドの第1の領域、第1の末端領域に対して3’側に位置する第2の末端領域、および3’尾部領域を含み得る。第2の末端領域は、少なくとも1つのマイクロRNA結合部位、シード配列、またはシード配列を有しないマイクロRNA結合部位を含み得る。一態様において、マイクロRNAは、mir−122、miR−142−3p、miR−142−5p、miR−146a、およびmiR−146b等の免疫細胞特異的マイクロRNAであるが、これらに限定されない。
5’非翻訳領域(UTR)および3’UTRを含む。コード領域の5’側または3’側を修飾することができ、これらに見出され得る他の特徴は、修飾mRNA(修飾RNA)の5’キャップおよびポリA尾部を含む。
Polynucleotides for the Production of Biologics」、2012年12月14日出願の米国仮特許出願第61/737,130号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Biologics」、2012年4月2日出願の米国仮特許出願第61/618,866号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Antibodies」、2012年8月10日出願の米国仮特許出願第61/681,647号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Antibodies」、2012年12月14日出願の米国仮特許出願第61/737,134号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Antibodies」、2012年4月2日出願の米国仮特許出願第61/618,868号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Vaccines」、2012年8月10日出願の米国仮特許出願第61/681,648号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Vaccines」、2012年12月14日出願の米国仮特許出願第61/737,135号、表題「Modified Polynucleotides for
the Production of Vaccines」、2012年4月2日出願の米国仮特許出願第61/618,870号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Therapeutic Proteins and Peptides」、2012年8月10日出願の米国仮特許出願第61/681,649号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Therapeutic
Proteins and Peptides」、2012年12月14日出願の米国仮特許出願第61/737,139号、「Modified Polynucleotides for the Production of Therapeutic Proteins and Peptides」、2012年4月2日出願の米国仮特許出願第61/618,873号、表題「Modified Polynucleotides
for the Production of Secreted Proteins」、2012年8月10日出願の米国仮特許出願第61/681,650号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Secreted Proteins」、2012年12月14日出願の米国
仮特許出願第61/737,147号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Secreted Proteins」、2012年4月2日出願の米国仮特許出願第61/618,878号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Plasma Membrane Proteins」、2012年8月10日出願の米国仮特許出願第61/681,654号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Plasma Membrane Proteins」、2012年12月14日出願の米国仮特許出願第61/737,152号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Plasma Membrane Proteins」、2012年4月2日出願の米国仮特許出願第61/618,885号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Cytoplasmic and Cytoskeletal Proteins」、2012年8月10日出願の米国仮特許出願第61/681,658号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Cytoplasmic and Cytoskeletal Proteins」、2012年12月14日出願の米国仮特許出願第61/737,155号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Cytoplasmic and Cytoskeletal Proteins」、2012年4月2日出願の米国仮特許出願第61/618,896号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Intracellular Membrane Bound Proteins」、2012年7月5日出願の米国仮特許出願第61/668,157号、表題「Modified Polynucleotides
for the Production of Intracellular Membrane Bound Proteins」、2012年8月10日出願の米国仮特許出願第61/681,661号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Intracellular Membrane Bound Proteins」、2012年12月14日出願の米国仮特許出願第61/737,160号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Intracellular Membrane Bound Proteins」、2012年4月2日出願の米国仮特許出願第61/618,911号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Nuclear Proteins」、2012年8月10日出願の米国仮特許出願第61/681,667号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Nuclear Proteins」、2012年12月14日出願の米国仮特許出願第61/737,168号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Nuclear Proteins」、2012年4月2日出願の米国仮特許出願第61/618,922号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Proteins」、2012年8月10日出願の米国仮特許出願第61/681,675号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Proteins」、2012年12月14日出願の米国仮特許出願第61/737,174号、表題「Modified
Polynucleotides for the Production of Proteins」、2012年4月2日出願の米国仮特許出願第61/618,935号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Proteins Associated with Human Disease」、2012年8月10日出願の米国仮特許出願第61/681,6
87号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Proteins Associated with Human Disease」、2012年12月14日出願の米国仮特許出願第61/737,184号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Proteins Associated with Human Disease」、2012年4月2日出願の米国仮特許出願第61/618,945号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Proteins Associated with Human Disease」、2012年8月10日出願の米国仮特許出願第61/681,696号、表題「Modified Polynucleotides
for the Production of Proteins Associated with Human Disease」、2012年12月14日出願の米国仮特許出願第61/737,191号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Proteins Associated with Human Disease」、2012年4月2日出願の米国特許出願第61/618,953号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Proteins Associated with Human Disease」、2012年8月10日出願の米国特許出願第61/681,704号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Proteins Associated with Human Disease」、2012年12月14日出願の米国特許出願第61/737,203号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Proteins Associated with Human Disease」、2013年3月9日出願の国際出願第PCT/US2013/030062号、表題「Modified
Polynucleotides for the Production of Biologics and Proteins Associated with Human Disease」;2013年3月9日出願の国際出願第PCT/US2013/030063号、表題「Modified Polynucloetides」;国際出願第PCT/US2013/030064号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Secreted
Proteins」;2013年3月9日出願の国際出願第PCT/US2013/030059号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Membrane Proteins」;2013年3月9日出願の国際出願第PCT/US2013/030066号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Cytoplasmic and Cytoskeletal Proteins」;2013年3月9日出願の国際出願第PCT/US2013/030067号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Nuclear Proteins」;2013年3月9日出願の国際出願第PCT/US2013/030060号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Proteins」;
2013年3月9日出願の国際出願第PCT/US2013/030061号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Proteins Associated with Human Disease」;2013年3月9日出願の国際出願第PCT/US2013/030068号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Cosmetic Proteins and Peptides」;2013年3月9日出願の国際出願第PCT/US2013/030070号、
表題「Modified Polynucleotides for the Production of Oncology−Related Proteins and Peptides」;および2013年3月15日出願の国際出願第PCT/US2013/031821号、表題「In Vivo Production of Proteins」、2013年1月17日出願の米国仮特許出願第US 61/753,661号、表題「Signal−Sensor Polynucleotides for the Alteration of Cellular Phenotypes and Microenvironments」、2013年1月18日出願の米国仮特許出願第US 61/754,159号、表題「Signal−Sensor Polynucleotides for the Alteration of Cellular Phenotypes and Microenvironments」、2013年3月14日出願の米国仮特許出願第US61/781,097号、表題「Signal−Sensor Polynucleotides for the Alteration of Cellular Phenotypes and Microenvironments」、2013年5月31日出願の米国仮特許出願第US 61/829,334号、表題「Signal−Sensor Polynucleotides for the Alteration of Cellular Phenotypes and
Microenvironments」、2012年11月26日出願の米国仮特許出願第61/729,933号、表題「Terminally Optimized Modified RNA」、2012年12月14日出願の米国仮特許出願第61/737,224号、表題「Terminally Optimized Modified RNA」、2013年1月31日出願の米国仮特許出願第US 61/758,921号、表題「Differential Targeting Using RNA Constructs」、2013年3月14日出願の米国仮特許出願第US 61/781,139号、表題「Differential Targeting Using RNA Constructs」、2013年5月31日に出願の米国仮出願第61/829,359号、表題「Differential Targeting Using RNA Constructs」に記載の目的とするポリペプチドといった、目的とするポリペプチドをコードする修飾核酸に用いることができ、これら各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本発明は、合成であってもよく、1つ以上の修飾ヌクレオシド(「修飾核酸」または「修飾核酸分子」と称される)およびポリヌクレオチド、一次構築物、および修飾mRNA
(mmRNA)を含有し、mRNAが導入される細胞の自然免疫応答の著しい誘導の欠如を含む、有用な特徴を有する、mRNA等のRNAを含む拡散分子を提供する。これらの修飾核酸は、タンパク質産生の効率、核酸の細胞内貯蔵、および接触した細胞の生存率を増強し、減少した免疫原性を有するので、これらの特徴を有するこれらの核酸は、本明細書において「エンハンスド」核酸または修飾RNAと称される。
翻訳可能領域、および1つ、2つ、または3つ以上の異なるヌクレオシド修飾を含有す
る修飾核酸が提供される。いくつかの実施形態において、修飾核酸は、対応する無修飾核酸に対して、核酸が導入される細胞における分解の減少を示す。
いくつかの実施形態において、化学修飾はヌクレオチドのリン酸骨格に位置していてもよい。
ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNA構造
本発明のポリヌクレオチドは、本明細書で証明されるように核酸系治療薬を用いた効果的なポリペプチド産生の既存の問題の打開に役立つそれらの機能的および/または構造的設計特徴において野生型mRNAと区別される。
ヌクレオチドの局所微小環境のリガンドに対する偽性受容体(または結合部位)として作動する。例えば、マイクロRNA結合部位またはmiRNAシードがポリヌクレオチドの環境下に存在する任意のマイクロRNAに対する偽性受容体として機能するように、それらをセンサーとして使用してもよい。
環状ポリヌクレオチド
本発明に従って、核酸、修飾RNA、または一次構築物は、環化またはコンカテマー化されて翻訳コンピテント分子を生成し、ポリA結合タンパク質と5’末端結合タンパク質との間の相互作用を補助し得る。環化またはコンカテマー化の機構は、少なくとも3つの異なる経路、すなわち1)化学的経路、2)酵素的経路、および3)リボザイム触媒経路を通って生じ得る。新たに形成された5’/3’連結は、分子内または分子間であり得る。
ポリヌクレオチド多量体
本発明に従って、複数のはっきりと異なる核酸、修飾RNA、または一次構築物は、3’末端で修飾されたヌクレオチドを用いて3’末端を介して結合され得る。化学的複合体形成を用いて、細胞への送達の化学量論を制御することができる。例えば、グリオキシル酸回路酵素、イソクエン酸リアーゼ、およびリンゴ酸シンターゼは、HepG2細胞に1:1の比率で供給されて細胞脂肪酸の代謝を変化させ得る。この比率は、一方の核酸または修飾RNA種に3’−アジド末端ヌクレオチドを用い、かつ反対側の核酸または修飾RNA種にC5−エチニルまたはアルキニル含有ヌクレオチドを用いて化学結合核酸または修飾RNAを化学結合させることによって制御され得る。この修飾されたヌクレオチドは、製造業者のプロトコルに従って末端トランスフェラーゼ(New England Biolabs、マサチューセッツ州イプスウィッチ)を用いて転写後に添加される。3’末端修飾ヌクレオチドの添加後、これら2個の核酸または修飾RNA種は、銅の存在下または不在下において水溶液中で合わせられて、文献内に記載のクリック化学機構を介して新たな共有結合を形成し得る。
修飾RNA複合体および組み合わせ
タンパク質産生をさらに亢進するために、本発明の核酸、修飾RNA、ポリヌクレオチド、または一次構築物は、他のポリヌクレオチド、染料、挿入剤(例えば、アクリジン)、架橋剤(例えば、プソラレン、マイトマイシンC)、ポルフィリン(TPPC4、テキサフィリン、サフィリン)、多環芳香族炭化水素(例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン)、人工エンドヌクレアーゼ(例えば、EDTA)、アルキル化剤、リン酸塩、アミノ、メルカプト、PEG(例えば、PEG−40K)、MPEG、[MPEG]2、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射標識マーカー、酵素、ハプテン(例えば、ビオチン)、輸送/吸収促進剤(例えば、アスピリン、ビタミンE、葉酸)、合成リボヌクレアーゼ、タンパク質、例えば、糖タンパク質、またはペプチド、例えば、コリガンドに特異的親和性を有する分子、または抗体、例えば、癌細胞、内皮細胞、または骨細胞等の特定の細胞型に結合する抗体、ホルモンおよびホルモン受容体、非ペプチド種、例えば、脂質、レクチン、炭水化物、ビタミン、共同因子、または薬物と複合体化されるように設計され得る。
DNA、tRNA、三重らせん形成を誘導するRNA、アプタマー、もしくはベクター等のうちの1つ以上とともに投与され得るか、またはこれらをさらにコードし得る。
二機能性ポリヌクレオチド
本発明の一実施形態は、二機能性ポリヌクレオチド(例えば、二機能性核酸、二機能性修飾RNA、または一次構築物)である。その名称が示すように、二機能性ポリヌクレオチドは、少なくとも2つの機能を有するか、または少なくとも2つの機能の能力があるポリヌクレオチドである。これらの分子は、慣例により、多機能性とも称され得る。
非コードポリヌクレオチド
本明細書に記載されるように、部分的または実質的に翻訳可能ではない配列、例えば、非コード領域を有する核酸、修飾RNA、ポリヌクレオチド、および一次構築物が提供される。そのような分子は、通常翻訳されないが、リボソームタンパク質または転移RNA(tRNA)等の1つ以上の翻訳機構成分への結合および隔離のうちの1つ以上によってタンパク質産生に影響を及ぼし、それによって、細胞におけるタンパク質発現を効果的に低下させるか、細胞における1つ以上の経路またはカスケードを調節し得、それが次いでタンパク質レベルを変化させる。核酸、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmRNAは、1個以上の長い非コードRNA(lncRNAもしくはlincRNA)もしくはその部分、低分子核RNA(sno−RNA)、マイクロRNA(miRNA)、低分子干渉RNA(siRNA)、またはPiwi干渉RNA(piRNA)を含有し得るか、あるいはこれらをコードし得る。
目的とするポリペプチド
本発明に従って、一次構築物は、1個以上の目的とするポリペプチドまたはその断片をコードするように設計される。目的とするポリペプチドは、全ポリペプチド、複数のポリペプチド、またはポリペプチドの断片を含み得るが、これらに限定されず、これらは、独立して、1個以上の核酸、複数の核酸、核酸の断片、または前述のうちのいずれかの変異形によってコードされ得る。本明細書で使用するとき、「目的とするポリペプチド」という用語は、選択されて本発明の一次構築物においてコードされる任意のポリペプチドを指す。本明細書で使用するとき、「ポリペプチド」とは、ほとんどの場合ペプチド結合によって結合されるアミノ酸残基(天然または非天然)のポリマーを意味する。この用語は、本明細書で使用するとき、任意の大きさ、構造、または機能を有するタンパク質、ポリペプチド、およびペプチドを指す。いくつかの例において、コードされたポリペプチドが約50個のアミノ酸よりも小さい場合、このポリペプチドは、ペプチドと称される。ポリペプチドがペプチドである場合、これは、少なくとも約2、3、4、または少なくとも5アミノ酸残基長である。したがって、ポリペプチドは、遺伝子産物、天然に存在するポリペプチド、合成ポリペプチド、相同体、オルソログ、パラログ、前述の断片および他の等価物、変異形、ならびに類似体を含む。ポリペプチドは、単一の分子であり得るか、または
二量体、三量体、もしくは四量体等の多分子複合体であり得る。それらは、抗体またはインスリン等の一本鎖または多本鎖ポリペプチドも含み得、会合または結合され得る。ほとんどの場合、ジスルフィド結合が多本鎖ポリペプチドに見られる。「ポリペプチド」という用語は、1個以上のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の人工化学的類似体であるアミノ酸ポリマーにも適用され得る。
「類似体」は、親または出発ポリペプチドの特性のうちの1つ以上を依然として維持する、1つ以上のアミノ酸改変、例えば、アミノ酸残基の置換、付加、または欠失によって異なるポリペプチド変異形を含むよう意図される。
列に基づく成分と定義される。本発明のmmRNAによってコードされるポリペプチドの特徴には、表面出現、局所立体配座形状、折り畳み、ループ、半ループ、ドメイン、半ドメイン、部位、末端、またはこれらの任意の組み合わせが含まれる。
本明細書で使用され、ポリペプチドについて言及するとき、「局所立体配座形状」という用語は、タンパク質の定義可能な空間内に位置するタンパク質のポリペプチド系構造の出現を意味する。
のアミノ酸を含むと特定された場合において、奇数のドメインの半ドメインは、ドメインの整数部分または次の整数部分(ドメインのアミノ酸の数/2+/−0.5個のアミノ酸)を含む。例えば、7アミノ酸ドメインと特定されたドメインは、3個のアミノ酸または4個のアミノ酸(7/2=3.5+/−0.5で3または4になる)の半ドメインをもたらし得る。サブドメインがドメインまたは半ドメイン内で特定され得、これらのサブドメインが、それらが由来するドメインまたは半ドメインで特定された構造特性または機能特性のすべてに満たない構造特性または機能特性を有することも理解される。本明細書のドメイン型のうちのいずれを含むアミノ酸もポリペプチドの骨格に沿って隣接している必要はない(すなわち、非隣接アミノ酸が構造的に折り畳まれて、ドメイン、半ドメイン、またはサブドメインをもたらし得る)ことも理解される。
ずれかと約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約95%、または約100%同一の一続きの約20、約30、約40、約50、または約100個のアミノ酸を含む任意のタンパク質が本発明に従って利用され得る。ある特定の実施形態において、本発明に従って利用されるポリペプチドは、本明細書に提供または参照される配列のうちのいずれかに示される2、3、4、5、6、7、8、9、10以上の変異を含む。目的とするコードされたポリペプチド
本発明の一次構築物、修飾核酸、またはmmRNAは、ペプチドおよびタンパク質などの目的とするポリペプチドをコードするように設計され得る。
Production of Biologics」、2012年8月10日出願の米国仮特許出願第61/681,645号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Biologics」、2012年12月14日出願の米国仮特許出願第61/737,130号、表題「Modified Polynucleotides for the Production
of Biologics」、2012年4月2日出願の米国仮特許出願第61/618,866号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Antibodies」、2012年8月10日出願の米国仮特許出願第61/681,647号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Antibodies」、2012年12月14日出願の米国仮特許出願第61/737,134号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Antibodies」、2012年4月2日出願の米国仮特許出願第61/618,868号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Vaccines」、2012年8月10日出願の米国仮特許出願第61/681,648号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Vaccines」、2012年12月14日出願の米国仮特許出願第61/737,135号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Vaccines」、2012年4月2日出願の米国仮特許出願第61/618,870号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Therapeutic Proteins and Peptides」、2012年8月10日出願の米国仮特許出願第61/681,649号、表題「Modified Polynucleotides for
the Production of Therapeutic Proteins and Peptides」、2012年12月14日出願の米国仮特許出願第61/737,139号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Therapeutic Proteins and Peptides」、2012年4月2日出願の米国仮特許出願第61/618,873号、表題「Modified Polynucleotides for the
Production of Secreted Proteins」、2012年8月10日出願の米国仮特許出願第61/681,650号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Secreted Proteins」、2012年12月14日出願の米国仮特許出願第61/737,147号、表題「Modified Polynucleotides fo
r the Production of Secreted Proteins」、2012年4月2日出願の米国仮特許出願第61/618,878号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of
Plasma Membrane Proteins」、2012年8月10日出願の米国仮特許出願第61/681,654号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Plasma Membrane Proteins」、2012年12月14日出願の米国仮特許出願第61/737,152号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Plasma Membrane Proteins」、2012年4月2日出願の米国仮特許出願第61/618,885号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Cytoplasmic and Cytoskeletal Proteins」、2012年8月10日出願の米国仮特許出願第61/681,658号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Cytoplasmic and Cytoskeletal Proteins」、2012年12月14日出願の米国仮特許出願第61/737,155号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Cytoplasmic and Cytoskeletal Proteins」、2012年4月2日出願の米国仮特許出願第61/618,896号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Intracellular Membrane Bound Proteins」、2012年7月5日出願の米国仮特許出願第61/668,157号、表題「Modified Polynucleotides for the
Production of Intracellular Membrane Bound Proteins」、2012年8月10日出願の米国仮特許出願第61/681,661号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Intracellular Membrane Bound Proteins」、2012年12月14日出願の米国仮特許出願第61/737,160号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Intracellular Membrane Bound Proteins」、2012年4月2日出願の米国仮特許出願第61/618,911号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Nuclear Proteins」、2012年8月10日出願の米国仮特許出願第61/681,667号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Nuclear Proteins」、2012年12月14日出願の米国仮特許出願第61/737,168号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Nuclear Proteins」、2012年4月2日出願の米国仮特許出願第61/618,922号、表題「Modified Polynucleotides for the Production
of Proteins」、2012年8月10日出願の米国仮特許出願第61/681,675号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Proteins」、2012年12月14日出願の米国仮特許出願第61/737,174号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Proteins」、2012年4月2日出願の米国仮特許出願第61/618,935号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Proteins Associated with Human Disease」、2012年8月10日出願の米国仮特許出願第61/681,687号、表題「Modified Polynucleotides for the Producti
on of Proteins Associated with Human Disease」、2012年12月14日出願の米国仮特許出願第61/737,184号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Proteins Associated with Human
Disease」、2012年4月2日出願の米国仮特許出願第61/618,945号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Proteins Associated with Human Disease」、2012年8月10日出願の米国仮特許出願第61/681,696号、表題「Modified Polynucleotides for the
Production of Proteins Associated with Human Disease」、2012年12月14日出願の米国仮特許出願第61/737,191号、表題「Modified Polynucleotides for
the Production of Proteins Associated with Human Disease」、2012年4月2日出願の米国特許出願第61/618,953号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Proteins Associated with Human Disease」、2012年8月10日出願の米国特許出願第61/681,704号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Proteins Associated with Human Disease」、2012年12月14日出願の米国特許出願第61/737,203号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Proteins Associated with Human Disease」、2013年3月9日出願の国際出願第PCT/US2013/030062号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Biologics
and Proteins Associated with Human Disease」;2013年3月9日出願の国際出願第PCT/US2013/030063号、表題「Modified Polynucloetides」;国際出願第PCT/US2013/030064号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Secreted Proteins」;2013年3月9日出願の国際出願第PCT/US2013/030059号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Membrane Proteins」;2013年3月9日出願の国際出願第PCT/US2013/030066号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Cytoplasmic and Cytoskeletal Proteins」;2013年3月9日出願の国際出願第PCT/US2013/030067号、表題「Modified
Polynucleotides for the Production of Nuclear Proteins」;2013年3月9日出願の国際出願第PCT/US2013/030060号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Proteins」;2013年3月9日出願の国際出願第PCT/US2013/030061号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Proteins Associated with Human Disease」;2013年3月9日出願の国際出願第PCT/US2013/030068号、表題「Modified Polynucleotides for the Production
of Cosmetic Proteins and Peptides」;2013年3月9日出願の国際出願第PCT/US2013/030070号、表題「Modified Polynucleotides for the Production o
f Oncology−Related Proteins and Peptides」;および2013年3月15日出願の国際出願第PCT/US2013/031821号、表題「In Vivo Production of Proteins」に列記されるタンパク質配列のうちのいずれかであり得、これら各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
Heinje,G.,Academic Press,1987、Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.and Devereux,J.,eds.,M.Stockton Press,New York,1991、およびCarillo et al.,SIAM J.Applied Math.48,1073(1988)に記載の方法が含まれるが、これらに限定されない。
F.Altschul,Thomas L.Madden,Alejandro A.Schaeffer,Jinghui Zhang,Zheng Zhang,Webb
Miller,and David J.Lipman(1997),“Gapped
BLAST and PSI−BLAST:a new generation of
protein databese search programs”,核酸 Res.25:3389−3402)。他のツールは、本明細書、具体的には、「同一性」の定義に記載される。
NAを使用して、対象における疾患、障害、および/または状態を治療することができる。
一実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、および/またはmmRNAを使用して、対象における少なくとも1つの癌の症状を減少および/または寛解させることができる。癌の症状として、限定されないが、衰弱、痛みおよび疼痛、発熱、疲労、体重減少、血液凝固、血中カルシウム濃度の増加、低白血球数、息切れ、眩暈、頭痛、色素沈着過剰、黄疸、紅斑(erthema)、そう痒症、多毛症、排便習慣の変化、膀胱機能の変化、持続性の痛み、口内の白斑、舌の白点、異常出血または分泌、身体の一部の肥厚または塊、消化不良、嚥下困難、疣贅または黒子の変化、新しい皮膚の変化、および持続性の咳または嗄声を挙げることができる。さらに、ポリヌクレオチド、一次構築物、修飾核酸、および/またはmmRNAは、ケモブレイン、末梢神経障害、疲労、うつ状態、吐き気、嘔吐、疼痛、貧血、リンパ浮腫、感染症、性機能への副作用、低受精率または不妊、オストミック(ostomics)、不眠、および脱毛等の、限定されないが、癌に関連する副作用を減少させることができる。
末端構造修飾:非翻訳領域(UTR)
遺伝子の非翻訳領域(UTR)は、転写されるが、翻訳されない。5’UTRが転写開始部位で始まり開始コドンに続くが、開始コドンを含まない一方で、3’UTRは、終止コドンの直後に始まり、転写終結シグナルまで続く。核酸分子および翻訳の安定性においてUTRが果たす制御的役割についての報告が相次いでいる。UTRの制御特徴は、本発明核酸または修飾RNAに組み込まれて、分子の安定性を高め得る。特定の特徴も組み込まれて、万が一それらが望ましくない器官部位に誤指向される場合には転写物の制御された発現低下を確保することができる。mRNAを産生することができるか、ならびに/または細胞、組織および/もしくは生物体に送達されて目的とするポリペプチドを産生することができるベクターシステムへ、非翻訳領域を組み込んでもよい。
5’UTRおよび翻訳開始
天然5’UTRは、翻訳開始に関与する特徴を有する。それらは、リボソームが多くの遺伝子の翻訳を開始するプロセスに関与することで一般に知られているコザック配列のような特徴を有する。コザック配列は、コンセンサスCCR(A/G)CCAUGGを有し、式中、Rは、開始コドン(AUG)の3塩基上流のプリン(アデニンまたはグアニン)であり、この後に別の「G」が続く。5’UTRは、伸長因子結合に関与する二次構造を形成することも知られている。
ミオゲニン、ヘルクリン(Herculin))、内皮細胞(Tie−1、CD36)、骨髄細胞(C/EBP、AML1、G−CSF、GM−CSF、CD11b、MSR、Fr−1、i−NOS)、白血球(CD45、CD18)、脂肪組織(CD36、GLUT4、ACRP30、アディポネクチン)、および肺上皮細胞(SP−A/B/C/D)において可能である。
5’UTR、3’UTR、および翻訳エンハンサー要素(TEE)
一実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、修飾核酸、および/またはmmRNAの5’UTRは、少なくとも1つの翻訳エンハンサーポリヌクレオチド、翻訳エン
ハンサー要素(translation enhancer element)、翻訳エンハンサー要素(translational enhancer elements)(一括して「TEE」と称される)を含み得る。非限定的な例として、TEEは転写プロモーターと開始コドンとの間に位置し得る。5’UTRに少なくとも1つのTEEを有するポリヌクレオチド、一次構築物、修飾核酸、および/またはmmRNAは、5’UTRにキャップを含み得る。さらに、少なくとも1つのTEEは、キャップ依存的またはキャップ非依存的翻訳を起こすポリヌクレオチド、一次構築物、修飾核酸、および/またはmmRNAの5’UTRに位置していてもよい。
element)」という用語(本明細書では一括して「TEE」と称する)は、mRNAから産生されるポリペプチドまたはタンパク質の量を増加させる配列を指す。
roc.Natl.Acad.Sci.USA 101:9590−9594,2004)、およびZhouら(PNAS 102:6273−6278,2005)、ならびに米国特許公開第US20070048776号、および同第US20110124100号、ならびに国際特許公開第WO2007025008号(これら各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)に記載のGtx配列(例えば、Gtx9−nt、Gtx8−nt、Gtx7−nt)を含み得るが、これらに限定されない。
を含み得る。
S6310197号、同第US6849405号、同第US7456273号、同第US7183395号(これら各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)に記載のTEE配列の5〜30ヌクレオチド断片、5〜25ヌクレオチド断片、5〜20ヌクレオチド断片、5〜15ヌクレオチド断片、5〜10ヌクレオチド断片を含み得る。
米国特許公開第US20090093049号、ならびに国際公開第WO2001055371号(これら各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)に記載の方法等の、当該技術分野において既知の方法によって特定することができる。
iR配列(例えば、miR結合部位およびmiRシード)等の、これらに限定されない本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、修飾核酸、および/またはmmRNAの翻訳を調節することができる、当該技術分野で既知の他の配列を含んでいてもよい。非限定的な例として、2つのTEE配列を分けるために用いられる各スペーサーは、異なるmiR配列またはmiR配列の構成要素(例えば、miRシード配列)を含み得る。
非相同5’UTR
5’UTRは、本発明の修飾核酸(mRNA)、エンハンスド修飾RNA、またはリボ核酸に隣接する領域として提供され得る。5’UTRは、本発明の修飾核酸(mRNA)、エンハンスド修飾RNA、またはリボ核酸中に見出されるコード領域と、相同または非相同であり得る。複数の5’UTRが隣接する領域に含まれていてもよく、同じ配列または異なる配列であってもよい。何も含まない場合も含め、隣接する領域の任意の部分はコドン最適化されていてもよく、いずれも1つ以上の異なる構造的または化学的修飾を、コドン最適化の前および/または後に、独立して含有することができる。
本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAの1つ以上の性質を変化させるために、本発明の修飾核酸(mRNA)、エンハンスド修飾RNA、またはリボ核酸のコード領域に非相同である5’UTRを、本発明の化合物中に操作する。その後、修飾核酸(mRNA)、エンハンスド修飾RNA、またはリボ核酸を、細胞、組織、または生物体に投与し、タンパク質レベル、局在性、および/または半減期等の結果を測定して、非相同5’UTRが本発明の修飾核酸(mRNA)、エンハンスド修飾RNA、またはリボ核酸に有し得る有益な効果を評価する。A、T、C、またはGを含む1つ以上のヌクレオチドが終端に添加されるかまたは除去される、5’UTRの変異形が有用であり得る。5’UTRはまた、コドン最適化されていても、または本明細書に記載されるいずれかの方法で修飾されていてもよい。
マイクロRNA結合部位の組み込み
一実施形態において、本発明の修飾核酸(mRNA)、エンハンスド修飾RNA、またはリボ核酸はポリペプチドをコードするだけでなく、センサー配列もまたコードする。センサー配列として、例えば、マイクロRNA結合部位、転写因子結合部位、構造化mRNA配列、および/またはモチーフ、内因性核酸結合分子に対する偽性受容体として働くように操作された人工的な結合部位が挙げられる。少なくとも1つのセンサー配列を含むポ
リヌクレオチドの非限定的な例は、同時係属および共同所有の、2013年1月17日出願の米国仮特許出願第US 61/753,661号、表題「Signal−Sensor Polynucleotide for the Alteration of Cellular Phenotypes and Microenvironments」、2013年1月18日出願の米国仮特許出願第US 61/754,159号、表題「Signal−Sensor Polynucleotide for the Alteration of Cellular Phenotypes and Microenvironments、2013年3月14日出願の米国仮特許出願第US61/781,097号、表題「Signal−Sensor Polynucleotide
for the Alteration of Cellular Phenotypes and Microenvironments」、2013年5月31日出願の米国仮特許出願第US 61/829,334、表題「Signal−Sensor Polynucleotide for the Alteration of Cellular Phenotypes and Microenvironments」、2013年6月27日出願の米国仮特許出願第US 61/839,893号、表題「Signal−Sensor Polynucleotide for the Alteration of Cellular Phenotypes and Microenvironments」、2013年7月3日出願の米国仮特許出願第US 61/842,733号、表題「Signal−Sensor Polynucleotide for the Alteration of Cellular Phenotypes and Microenvironment」、および2013年7月23日出願の米国仮特許出願第US 61/857,304号、表題「Signla−Sensor Polynucleotide for the Alteration of Cellular Phenotypes and Microenvironment」に記載されており、これら各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
マイクロRNA(またはmiRNA)は、核酸分子の3’UTRに結合し、かつ核酸分子安定性を低下させるか、または翻訳を阻害するかのいずれかによって遺伝子発現を下方制御する19〜25ヌクレオチド長の非コードRNAである。本発明の修飾核酸(mRNA)、エンハンスド修飾RNA、またはリボ核酸は、1つ以上のマイクロRNA標的配列、マイクロRNA配列、またはマイクロRNA種を含み得る。そのような配列は、米国特許公開第US2005/0261218号および米国特許公開第US2005/0059005号(これらの内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる)に教示されるもの等の任意の既知のマイクロRNAに対応し得る。非限定的な実施形態として、ヒトゲノムにおける既知のマイクロRNA、それらの配列、およびシード配列を、以下の表11に列挙する。
6;27(1):91−105を参照されたい。マイクロRNA種の塩基は、標的配列と完全な相補性を有する。マイクロRNA標的配列を操作して、本発明の核酸またはmRNAの3’UTRに入れることによって、分解または翻訳減少のためにこの分子を標的化することができるが、但し、対象となるマイクロRNAが利用可能であることを条件とする。このプロセスは、核酸分子送達時のオフターゲット効果の危険を低下させる。マイクロRNA、マイクロRNA標的領域、およびそれらの発現パターンの特定、ならびに生物学におけるそれらの役割が報告されている(それぞれ、参照により全体が本明細書に組み込まれる、Bonauer et al.,Curr Drug Targets 2010 11:943−949、Anand and Cheresh Curr Opin
Hematol 2011 18:171−176、Contreras and Rao Leukemia 2012 26:404−413(2011 Dec 20.doi:10.1038/leu.2011.356)、Bartel Cell 2009 136:215−233、Landgraf et al,Cell,2007 129:1401−1414、Gentner and Naldini,Tissue
Antigens.2012 80:393−403、ならびにこれらに記載の全ての参考文献)。
。マイクロRNA結合部位、または任意の組み合わせの除去または挿入の決定は、疾患におけるマイクロRNA発現パターンおよびそれらのプロファイリングに応じる。
R−151a−3p、miR−151a−5p、miR−152、miR−194−3p、miR−194−5p、miR−199a−3p、miR−199a−5p、miR−199b−3p、miR−199b−5p、miR−296−5p、miR−557、miR−581、miR−939−3p、miR−939−5pが挙げられる。任意の肝臓特異的マイクロRNAからのマイクロRNA結合部位をポリヌクレオチドに導入するか、またはポリヌクレオチドから取り除き、肝臓のポリヌクレオチドの発現を調節することができる。肝臓のタンパク質発現に対する免疫応答を防ぐために、肝臓特異的マイクロRNA結合部位を単独で、または免疫細胞(例えば、APC)マイクロRNA結合部位とさらに組み合わせて操作することができる。
−30d−5p、miR−329、miR−342−3p、miR−3665、miR−3666、miR−380−3p、miR−380−5p、miR−383、miR−410、miR−425−3p、miR−425−5p、miR−454−3p、miR−454−5p、miR−483、miR−510、miR−516a−3p、miR−548b−5p、miR−548c−5p、miR−571、miR−7−1−3p、miR−7−2−3p、miR−7−5p、miR−802、miR−922、miR−9−3p、およびmiR−9−5pが挙げられる。神経系に豊富なマイクロRNAとして、限定されないが、miR−132−3p、miR−132−3p、miR−148b−3p、miR−148b−5p、miR−151a−3p、miR−151a−5p、miR−212−3p、miR−212−5p、miR−320b、miR−320e、miR−323a−3p、miR−323a−5p、miR−324−5p、miR−325、miR−326、miR−328、miR−922を含む神経細胞で特異的に発現するもの、および限定されないが、miR−1250、miR−219−1−3p、miR−219−2−3p、miR−219−5p、miR−23a−3p、miR−23a−5p、miR−3065−3p、miR−3065−5p、miR−30e−3p、miR−30e−5p、miR−32−5p、miR−338−5p、miR−657を含むグリア細胞で特異的に発現するものがさらに挙げられる。任意のCNS特異的マイクロRNAからのマイクロRNA結合部位をポリヌクレオチドに導入するか、またはポリヌクレオチドから取り除き、神経系のポリヌクレオチドの発現を調節することができる。神経系のタンパク質発現に対する免疫応答を防ぐために、神経系特異的マイクロRNA結合部位を単独で、または免疫細胞(例えば、APC)マイクロRNA結合部位とさらに組み合わせて操作することができる。
々な細胞系譜の発生および/または分化を制御する(Kuppusamy KT et al.,Curr.Mol Med,2013,13(5),757−764;Vidigal JA and Ventura A,Semin Cancer Biol.2012,22(5−6),428−436;Goff LA et al.,PLoS One,2009,4:e7192;Morin RD et al.,Genome Res,2008,18,610−621;Yoo JK et al., Stem Cells Dev.2012,21(11),2049−2057、これら各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)。胚性幹細胞に豊富なマイクロRNAとして、限定されないが、let−7a−2−3p、let−a−3p、let−7a−5p、let7d−3p、let−7d−5p、miR−103a−2−3p、miR−103a−5p、miR−106b−3p、miR−106b−5p、miR−1246、miR−1275、miR−138−1−3p、miR−138−2−3p、miR−138−5p、miR−154−3p、miR−154−5p、miR−200c−3p、miR−200c−5p、miR−290、miR−301a−3p、miR−301a−5p、miR−302a−3p、miR−302a−5p、miR−302b−3p、miR−302b−5p、miR−302c−3p、miR−302c−5p、miR−302d−3p、miR−302d−5p、miR−302e、miR−367−3p、miR−367−5p、miR−369−3p、miR−369−5p、miR−370、miR−371、miR−373、miR−380−5p、miR−423−3p、miR−423−5p、miR−486−5p、miR−520c−3p、miR−548e、miR−548f、miR−548g−3p、miR−548g−5p、miR−548i、miR−548k、miR−548l、miR−548m、miR−548n、miR−548o−3p、miR−548o−5p、miR−548p、miR−664a−3p、miR−664a−5p、miR−664b−3p、miR−664b−5p、miR−766−3p、miR−766−5p、miR−885−3p、miR−885−5p、miR−93−3p、miR−93−5p、miR−941、miR−96−3p、miR−96−5p、miR−99b−3p、およびmiR−99b−5pが挙げられる。多くの予想された新規マイクロRNAは、ヒト胚性幹細胞において大規模によって発見されている(Morin RD et al.,Genome Res,2008,18,610−621;Goff LA et al.,PLoS One,2009,4:e7192;Bar M et al.,Stem cells,2008,26,2496−2505、これら各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)。
3640、WO2009/070653、US2010/0323357);皮膚T細胞リンパ腫(WO2013/011378);結腸直腸癌細胞(WO2011/0281756、WO2011/076142);癌陽性リンパ節(cancer positive lympho nodes)(WO2009/100430、US2009/0263803);上咽頭癌(EP2112235);慢性閉塞性肺疾患(US2012/0264626、US2013/0053263);甲状腺癌(WO2013/066678);卵巣癌細胞(US2012/0309645、WO2011/095623);乳癌細胞(WO2008/154098、WO2007/081740、US2012/0214699)、白血病およびリンパ腫(WO2008/073915、US2009/0092974、US2012/0316081、US2012/0283310、WO2010/018563にて差次的に発現し、これら各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)。
エンハンスド修飾RNA、またはリボ核酸中に組み込まれたマイクロRNA部位は、同一であっても、または異なるマイクロRNA部位であってもよい。別の実施形態において、修飾核酸、エンハンスド修飾RNA、またはリボ核酸に組み込まれたマイクロRNA部位は体内の同じまたは異なる組織を標的としてもよい。非限定的な例として、修飾核酸mRNAの3’UTRにおける組織特異的、細胞型特異的、または疾患特異的マイクロRNA結合部位の導入を介して、特定の細胞型(例えば、肝細胞、骨髄系細胞、内皮細胞、癌細胞等)の発現度を減少させることができる。
はコードされた死のシグナルによって影響されることがより少ない。反対に、細胞生存または細胞保護的シグナルが、miRNAが癌細胞にてより高い発現を有する癌細胞および非癌細胞を含有する組織に伝達され得る。すなわち、この結果は癌細胞のより低い生存シグナルおよび正常細胞のより大きな生存特徴である。以前のパラダイムに従って異なるシグナルを有する複数のポリヌクレオチドをデザインして投与することができる。
cl.D1[NT2/D1]、DMS 79、DMS 53、DMS 153、DMS
114、MSTO−211H、SW 1573[SW−1573、SW1573]、SW 1271[SW−1271、SW1271]、SHP−77、SNU−398、SNU−449、SNU−182、SNU−475、SNU−387、SNU−423、NL20、NL20−TA[NL20T−A]、THLE−2、HBE135−E6E7、HCC827、HCC4006、NCI−H23[H23]、NCI−H1299、NCI−H187[H187]、NCI−H358[H−358、H358]、NCI−H378[H378]、NCI−H522[H522]、NCI−H526[H526]、NCI−H727[H727]、NCI−H810[H810]、NCI−H889[H889]、NCI−H1155[H1155]、NCI−H1404[H1404]、NCI−N87[N87]、NCI−H196[H196]、NCI−H211[H211]、NCI−H220[H220]、NCI−H250[H250]、NCI−H524[H
524]、NCI−H647[H647]、NCI−H650[H650]、NCI−H711[H711]、NCI−H719[H719]、NCI−H740[H740]、NCI−H748[H748]、NCI−H774[H774]、NCI−H838[H838]、NCI−H841[H841]、NCI−H847[H847]、NCI−H865[H865]、NCI−H920[H920]、NCI−H1048[H1048]、NCI−H1092[H1092]、NCI−H1105[H1105]、NCI−H1184[H1184]、NCI−H1238[H1238]、NCI−H1341[H1341]、NCI−H1385[H1385]、NCI−H1417[H1417]、NCI−H1435[H1435]、NCI−H1436[H1436]、NCI−H1437[H1437]、NCI−H1522[H1522]、NCI−H1563[H1563]、NCI−H1568[H1568]、NCI−H1573[H1573]、NCI−H1581[H1581]、NCI−H1618[H1618]、NCI−H1623[H1623]、NCI−H1650[H−1650、H1650]、NCI−H1651[H1651]、NCI−H1666[H−1666、H1666]、NCI−H1672[H1672]、NCI−H1693[H1693]、NCI−H1694[H1694]、NCI−H1703[H1703]、NCI−H1734[H−1734、H1734]、NCI−H1755[H1755]、NCI−H1755[H1755]、NCI−H1770[H1770]、NCI−H1793[H1793]、NCI−H1836[H1836]、NCI−H1838[H1838]、NCI−H1869[H1869]、NCI−H1876[H1876]、NCI−H1882[H1882]、NCI−H1915[H1915]、NCI−H1930[H1930]、NCI−H1944[H1944]、NCI−H1975[H−1975、H1975]、NCI−H1993[H1993]、NCI−H2023[H2023]、NCI−H2029[H2029]、NCI−H2030[H2030]、NCI−H2066[H2066]、NCI−H2073[H2073]、NCI−H2081[H2081]、NCI−H2085[H2085]、NCI−H2087[H2087]、NCI−H2106[H2106]、NCI−H2110[H2110]、NCI−H2135[H2135]、NCI−H2141[H2141]、NCI−H2171[H2171]、NCI−H2172[H2172]、NCI−H2195[H2195]、NCI−H2196[H2196]、NCI−H2198[H2198]、NCI−H2227[H2227]、NCI−H2228[H2228]、NCI−H2286[H2286]、NCI−H2291[H2291]、NCI−H2330[H2330]、NCI−H2342[H2342]、NCI−H2347[H2347]、NCI−H2405[H2405]、NCI−H2444[H2444]、UMC−11、NCI−H64[H64]、NCI−H735[H735]、NCI−H735[H735]、NCI−H1963[H1963]、NCI−H2107[H2107]、NCI−H2108[H2108]、NCI−H2122[H2122]、Hs 573.T、 Hs 573.Lu、PLC/PRF/5、BEAS−2B、Hep G2、Tera−1、Tera−2、NCI−H69[H69]、NCI−H128[H128]、ChaGo−K−1、NCI−H446[H446]、NCI−H209[H209]、NCI−H146[H146]、NCI−H441[H441]、NCI−H82[H82]、NCI−H460[H460]、NCI−H596[H596]、NCI−H676B[H676B]、NCI−H345[H345]、NCI−H820[H820]、NCI−H520[H520]、NCI−H661[H661]、NCI−H510A[H510A、NCI−H510]、SK−HEP−1、A−427、Calu−1、Calu−3、Calu−6、SK−LU−1、SK−MES−1、SW 900[SW−900、SW900]、Malme−3M、およびCapan−1を含む、ATCC(ヴァージニア州マナッサス)からの細胞株が挙げられる。
はシード配列と100%未満の同一性を有するかのいずれかであるマイクロRNA結合領域部位を組み込むように、修飾メッセンジャーRNAをデザインすることができる。シード配列は部分的に変異してマイクロRNA結合親和性を減少させることができ、そのような変異はそのmRNA転写の減少した発現低下をもたらす。要するに、標的mRNAとマイクロRNAシードとの一致または不一致の程度は、タンパク質発現を調節するマイクロRNAの能力をより細かく調整するための加減抵抗器として働くことができる。くわえて、マイクロRNA結合部位の非シード領域における変異はまた、タンパク質発現を調節するマイクロRNAの能力に影響し得る。
別の実施形態において、miRシード配列はステムループの輪に組み込まれていてもよく、miR結合部位はステムループの5’または3’側基部に組み込まれていてもよい。
et al.A Pumilio−induced RNA structure switch in p27−3’UTR controls miR−221 and miR−22 accessibility.Nature Cell Biology.2010を参照されたく、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)。
et al.A Pumilio−induced RNA structure switch in p27−3’UTR controls miR−221 and miR−22 accessibility.Nature Cell Biology.2010を参照されたく、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)。
別の実施形態において、5’UTRにおけるマイクロRNA配列を用いて、限定されないが、開始コドン等の翻訳開始の部位の接触性を減少させることができる。Matsudaら(PLoS One.2010 11(5):e15057;参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)は、第1の開始コドン(AUG)への接触性を減少させるために、開始コドン(AUGコドンのAが+1である、−4〜+37)周辺のアンチセンスロックド核酸(LNA)オリゴヌクレオチド、およびエクソン−ジャンクション複合体(exon−junctino complexes)(EJC)を使用した。Matsudaは、LNAまたはEJCで開始コドン周辺の配列を変えることで、核酸またはmRNAの効率、長さ、および構造安定性が影響されることを示した。本発明の核酸またはmRNAは、Matsudaらによって記載されたLNAまたはEJC配列の代わりに、翻訳開
始部位の接触性を減少させるため、翻訳開始部位の付近にマイクロRNA配列を含むことができる。翻訳開始部位は、マイクロRNA配列の前、後、またはその内側であり得る。非限定的な例として、翻訳開始部位はシード配列または結合部位等のマイクロRNA配列中に位置し得る。別の非限定的な例として、翻訳開始部位はシード配列またはmir−122結合部位等のmiR−122配列の内側に位置し得る。
RNA結合タンパク質(RBP)は、限定されないが、RNAスプライシング、局在化、翻訳、代謝回転、ポリアデニル化、キャッピング、修飾、排出、および局在化等の、同時および転写後遺伝子発現の多数の側面を調節することができる。RNA結合ドメイン(RBD)、例えば、限定されないが、RNA認識モチーフ(RR)、およびhnRNP K相同性(KH)ドメインは、典型的にRBPとそれらのRNA標的との配列会合を調節する(Ray et al.Nature 2013.499:172−177;配列会合)。一実施形態において、基準のRBDは短いRNA配列を結合することができる。別の実施形態において、基準のRBDは構造RNAを認識することができる。
一実施形態において、目的とするmRNAの安定性を増加させるために、HuRをコードするmRNAを目的とするmRNAと共に細胞または組織内に同時導入または同時注入
することができる。これらのタンパク質はまた、目的のmRNAにインビトロで繋留し、その後細胞へ一緒に投与することができる。ポリA尾部結合タンパク質(PABP)は真核細胞翻訳開始因子eIF4Gと相互作用して、翻訳開始を刺激する。これらのRBPをコードするmRNAとmRNA薬剤との同時投与、ならびに/またはこれらのタンパク質とmRNA薬剤のインビトロでの繋留、およびタンパク質結合mRNAの細胞への投与は、mRNAの翻訳効率を増加させることができる。この同様の概念は、mRNAと、様々な翻訳因子をコードするmRNA、および促進剤、ならびにRNA安定性および/または翻訳効率に影響するタンパク質それら自身との同時投与にまで拡張することができる。
一実施形態において、RBDは、Ray et al.(Nature 2013.499:172−177;参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)によって記載されたRBD、それらの断片、または変異形のいずれかであり得る。
一実施形態において、RNA結合タンパク質モチーフにおけるマイクロRNA配列を使用して、限定されないが、開始コドン等の翻訳開始部位の接触性を減少させることができる。本発明の核酸またはmRNAは、Matsudaらによって記載されたLNAまたはEJC配列の代わりに、翻訳開始部位の接触性を減少させるため、翻訳開始部位の付近にマイクロRNA配列を含むことができる。翻訳開始部位は、マイクロRNA配列の前、後
、またはその内側であり得る。非限定的な例として、翻訳開始部位はシード配列または結合部位等のマイクロRNA配列中に位置し得る。別の非限定的な例として、翻訳開始部位はシード配列またはmir−122結合部位等のmiR−122配列の内側に位置し得る。
3’UTRにおけるその他の調節因子
マイクロRNA結合部位にくわえて、異なる組織と細胞でmRNA安定性および翻訳を調節する天然mRNAの3’−UTRにおけるその他の調節配列を除去するか、または修飾メッセンジャーRNAに組み込むことができる。そのようなcis−調節因子は、限定されないが、Cis−RNP(リボヌクレオタンパク質)/RBP(RNA結合タンパク質)調節因子、AU−リッチ領域(AUE)、構造化ステムループ、恒常的崩壊因子(CDE)、GC濃度、および他の構造化mRNAモチーフ(参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Parker BJ et al.,Genome Research,2011,21,1929−1943)を含み得る。例えば、CDEはそれらのロキン(Roquin)タンパク質との相互作用によってmRNA分解を媒介する、調節モチーフの分類である。特に、CDEは、発生および炎症の調節因子をコードしてマクロファージ中のサイトカイン産生を制限する多くのmRNAにおいて見出されている(Leppek K et al.,2013,Cell,153,869−881、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)。
栄養要求性mRNA
一実施形態において、本発明の核酸またはmRNAは栄養要求性であり得る。本明細書で使用するとき、「栄養要求性」という用語は、タンパク質発現が実質的に妨げられるかまたは減少するように、空間的または時間的キューに応じてmRNAの引き金となる、mRNAを促進する、またはmRNAを誘導する少なくとも1つの特徴を含むmRNAを指す。そのような空間的または時間的キューは、特定の組織、もしくは臓器、または細胞環境等の翻訳されるmRNAの位置を含む。温度、pH、イオン強度、含水量といったものを含むキューもまた予想される。
合部位、またはmiR−122結合部位をコードする本発明の核酸またはmRNAを投与する前に、miR−122濃度を、HeLa細胞、一次ヒト肝細胞、および一次ラット肝細胞にて測定することができる。投与の後、マイクロRNA配列を有する修飾核酸の発現を測定して、修飾核酸におけるmiR−122の減衰効果を決定することができる(例えば、実施例28、29、30、35、45、46、および47に概説の試験を参照のこと)。さらに別の非限定的な例として、限定されないが、最大の減衰効果等の所望の結果のための適切なUTRを決定するために、異なる3’UTRにおける、miR−122結合部位、miR−122シード、またはシードを有しないmiR−122結合部位の有効性を評価してもよい(例えば、実施例35および46に概説の試験を参照のこと)。
3’UTRおよびAU豊富な要素
3’UTRは、それらに包理される一続きのアデノシン(アデノシン)およびウリジン(ウリジン)を有することで知られている。これらのAU豊富な特徴は、特に高代謝回転率を有する遺伝子においてよく見られる。それらの配列特徴および機能特性に基づいて、AU豊富な要素(ARE)は、3つのクラスに分類され得る(Chen et al,1995):クラスIのAREは、U豊富な領域内にAUUUAモチーフのいくつかの分散したコピーを含有する。C−MycおよびMyoDは、クラスIのAREを含有する。クラスIIのAREは、2個以上の重複したUUAUUUA(U/A)(U/A)九量体を有する。この種のAREを含有する分子は、GM−CSFおよびTNF−aを含む。クラスIIIのAREは、あまり明確にされていない。これらのU豊富な領域は、AUUUAモチーフを含有しない。C−Junおよびミオゲニンが、十分に研究されたこのクラスの例の2つである。AREに結合する大半のタンパク質がメッセンジャーを不安定にすることで知られているが、ELAVファミリーのメンバー、中でも注目すべきHuRがmRNAの安定性を向上させることが実証されている。HuRは、これら3つのクラスのAREに結合する。HuR特異的結合部位を操作して核酸分子の3’UTRに入れることで、HuR結合、ひいてはインビボでのメッセージの安定化につながる。
性を低下させ、それによって、結果として生じるタンパク質の翻訳を抑制し、その産生を低減させ得る。同様に、AREは、特定および除去されるか、または変異されて、細胞内安定性を向上させ、ひいては結果として生じるタンパク質の翻訳および産生を増加させることができる。本発明の核酸またはmRNAを用いたトランスフェクション実験を関連細胞株において行うことができ、タンパク質産生をトランスフェクション後の様々な時点でアッセイすることができる。例えば、細胞を、異なるARE操作分子でトランスフェクトすることができ、関連タンパク質に対してELISAキットを用いてトランスフェクション後6時間、12時間、24時間、48時間、および7日時点で産生されたタンパク質をアッセイすることができる。
3’UTRおよび三重らせん
一実施形態において、本発明の核酸は、修飾核酸、エンハンスド修飾RNA、またはリボ核酸の3’末端に三重らせんを含み得る。本発明の核酸の3’末端は、三重らせん単独か、またはポリA尾部と組み合わせて含んでいてもよい。
2013;参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)。
であってもよい(例えば、実施例38の表37に記載のポリヌクレオチドを参照のこと)。
ステムループ
一実施形態において、本発明の核酸は、限定されないが、ヒストンステムループ等のステムループを含み得る。ステムループは、限定されないが、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際特許公開第WO2013103659号に記載の配列番号7〜17等の約25または約26ヌクレオチド長であるヌクレオチド配列であってもよい。ヒストンステムループはコード領域に対して3’側(例えば、コード領域の3’末端)に位置し得る。非限定的な例として、ステムループは本明細書に記載の核酸の3’末端に位置していてもよい。
び/または5’キャップ構造を含み得る。ヒストンステムループはポリA尾部配列の前および/または後に存在し得る。ヒストンステムループおよびポリA尾部配列を含む核酸は、本明細書に記載の鎖終結ヌクレオシドを含んでいてもよい。
一実施形態において、miR配列および/またはTEE配列の組み込みは、翻訳を増加および/または減少させ得るステムループ領域の形を変化させる。(例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Kedde et al.A Pumilio−induced RNA structure switch in p27−3’UTR
controls miR−221 and miR−22 accessibility.Nature Cell Biology.2010を参照のこと)。
mRNAの5’キャップ構造は、核外輸送に関与し、mRNAの安定性を向上させ、mRNAキャップ結合タンパク質(CBP)に結合し、これは、CBPのポリ(A)結合タンパク質との会合を介して細胞におけるmRNA安定性および翻訳適格性に関与し、成熟環状mRNA種を形成する。このキャップはさらに、mRNAスプライシング中に5’近
位のイントロンの除去を支援する。
et al.Bioorganic&Medicinal Chemistry 2013 21:4570−4574に記載の、様々なキャップ類似体およびキャップ類似体を合成する方法を参照のこと;これらの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)。別の実施形態において、本発明のキャップ類似体は4−クロロ/ブロモフェノキシエチル類似体である。
非限定的な例として、修飾5’キャップは、以下のキャップ依存翻訳に対して基質構造を有していてもよく、
表1
表2
表3
表4
炭素を産生した)糖環酸素とメチレン部分(CH2)との置換は、ホスホリラーゼに対してC−N結合のより大きな安定性を作り出し得る。メチレン部分はまた三リン酸架橋部分の安定性を増加させることもでき、したがってmRNAの安定性を増加させることができる。非限定的な例として、キャップ依存翻訳に対するキャップ基質構造は、限定されないが、CAP−014およびCAP−015等の構造、ならびに/または、限定されないが、CAP−123およびCAP−124等のワクシニアmRNAキャッピング酵素に対するキャップ基質構造を有していてもよい。別の例において、CAP−112〜CAP−122および/またはCAP−125〜CAP−225は、(環状炭素を産生した)糖環酸素とメチレン部分(CH2)との置換によって修飾することができる。
別の実施形態において、5’キャップ修飾はCF2修飾三リン酸部分を含み得る。
3’UTRおよびウイルス配列
大麦縞萎縮ウイルス(BYDV−PAV)の翻訳エンハンサー配列等であるが、これに限定されないさらなるウイルス配列は、本発明の核酸またはmRNAの3’UTRに操作および挿入され得、インビトロおよびインビボで構築物の翻訳を刺激し得る。トランスフェクション実験を関連細胞株において行うことができ、ELISAによってタンパク質産生をトランスフェクション後12時間、24時間、48時間、72時間、および7日時点でアッセイすることができる。
IRES配列
さらに、内部リボソーム進入部位(IRES)を含有する核酸が提供される。最初に特徴的なピコルナウイルスRNAと特定されたIRESは、5’キャップ構造の不在下でタンパク質合成を開始するときに重要な役割を果たす。IRESは、mRNAの唯一のリボ
ソーム結合部位として働き得るか、または複数のリボソーム結合部位のうちの1つの役割を果たし得る。2個以上の機能的リボソーム結合部位を含有する核酸またはmRNAは、リボソーム(「多シストロン性核酸分子」)によって独立して翻訳されるいくつかのペプチドまたはポリペプチドをコードし得る。核酸またはmRNAにIRESが提供されるとき、第2の翻訳可能な領域がさらに任意に提供される。本発明に従って用いられ得るIRES配列の例には、制限なく、ピコルナウイルス(例えば、FMDV)、ペストウイルス(CFFV)、ポリオウイルス(PV)、脳心筋炎ウイルス(ECMV)、口蹄疫ウイルス(FMDV)、C型肝炎ウイルス(HCV)、豚コレラウイルス(CSFV)、マウス白血病ウイルス(MLV)、サル免疫不全ウイルス(SIV)、またはコオロギ麻痺ウイルス(CrPV)由来のものが挙げられる。
末端構造修飾:ポリA尾部
RNA処理中、長いアデニンヌクレオチド鎖(ポリA尾部)は通常、分子の安定性を向上させるためにメッセンジャーRNA(mRNA)に付加される。転写直後、転写物の3’末端が切断されて3’ヒドロキシルを遊離させる。その後、ポリAポリメラーゼは、アデニンヌクレオチド鎖をRNAに付加する。ポリアデニル化と呼ばれるこのプロセスは、100〜250残基長であるポリA尾部を付加する。
概して、本発明のポリA尾部の長さは、30ヌクレオチド長を超える。別の実施形態において、ポリA尾部は、35ヌクレオチド長を超える。別の実施形態において、長さは少なくとも40ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも45ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも55ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも60ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも60ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも80ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも90ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも100ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも120ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも140ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも160ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも180ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも200ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも250ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも300ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも350ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも400ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも450ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも500ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも600ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも700ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも800ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも900ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも1000ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも1100ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも1200ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも1300ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも1400ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも1500ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも1600ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも1700ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも1800ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも1900ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも2000ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも2500ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少
なくとも3000ヌクレオチド長である。
一実施形態において、本発明の核酸またはmRNAは、ポリA〜G四重項を含むように設計される。G四重項は、DNAおよびRNAの両方においてG豊富な配列によって形成され得る4個のグアニンヌクレオチドの環状水素結合アレイである。この実施形態において、G四重項は、ポリA尾部の終端に組み込まれる。結果として生じる核酸またはmRNAは、安定性、タンパク質産生、および様々な時点での半減期他のパラメータについてアッセイされ得る。ポリA〜G四重項が、120個のヌクレオチドのポリA尾部を単独で用いてもたらされるタンパク質産生の少なくとも75%に相当するタンパク質産生をもたらすことが見出されている。
A−G Quartet)を含み得る。ポリA−G4分子を有する核酸および/またはmRNAは5’キャップ構造をさらに含み得る。
定量化
一実施形態において、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、修飾核酸、またはmmRNAは、1つ以上の体液由来のエクソソームにおいて定量化され得る。本明細書で使用するとき、「体液」には、末梢血、血清、血漿、腹水、尿、脳脊髄液(CSF)、痰、唾
液、骨髄、滑液、房水、羊水、耳垢、母乳、気管支肺胞洗浄液、精液、前立腺液、クーパー腺液または射精前液、汗、糞便、毛髪、涙液、嚢胞液、胸膜および腹水、心嚢液、リンパ液、粥状液、乳糜、胆汁、間質液、帯下、膿汁、皮脂、嘔吐物、膣分泌物、粘膜分泌物、水便、膵液、鼻腔からの洗浄液、気管支肺吸引物、胚盤胞腔液、および臍帯血が含まれる。あるいは、エクソソームは、肺、心臓、膵臓、胃、腸、膀胱、腎臓、卵巣、睾丸、皮膚、結腸、乳房、前立腺、脳、食道、肝臓、および胎盤からなる群から選択される器官から回収され得る。
II.ポリヌクレオチドの設計および合成
本発明に従って用いるポリヌクレオチド、一次構築物、修飾核酸、またはmmRNAは、化学合成、一般にインビトロ転写(IVT)と称される酵素合成、またはより長い前駆体の酵素的もしくは化学的切断等を含むが、これらに限定されない任意の利用可能な技法に従って調製され得る。RNAを合成する方法は、当技術分野において既知である(例えば、いずれも参照により本明細書に組み込まれる、Gait,M.J.(ed.)Oligonucleotide synthesis:a practical approach,Oxford[Oxfordshire],Washington,DC:IRL Press,1984、およびHerdewijn,P.(ed.)Oligonucleotide synthesis:methods and applications,Methods in Molecular Biology,v.288(Clifton,N.J.)Totowa,N.J.:Humana Press,2005を参照のこと)。
遺伝子構築
遺伝子構築ステップは、遺伝子合成、ベクター増幅、プラスミド精製、プラスミド線形化および浄化、ならびにcDNA鋳型合成および浄化を含み得るが、これらに限定されない。
遺伝子合成
目的とするポリペプチドまたは標的が産生のために選択された時点で、一次構築物が設計される。一次構築物内で、目的とするポリペプチドをコードする結合ヌクレオシドの第1の領域は、選択された核酸(DNAまたはRNA)転写物のオープンリーディングフレーム(ORF)を用いて構築され得る。ORFは、野生型ORF、アイソフォーム、変異形、またはその断片を含み得る。本明細書で使用するとき、「オープンリーディングフレーム」または「ORF」は、目的とするポリペプチドをコードすることができる核酸配列(DNAまたはRNA)を指すよう意図される。ORFは、多くの場合、開始コドンATGで始まり、ナンセンスまたは終止コドンもしくはシグナルで終わる。
表5.コドン選択肢
られるが、これらに限定されず、XbaI認識を有し得る複数のクローニング部位も挙げられ得る。
表6.5’非翻訳領域
まれる)。
表7.3’非翻訳領域
チドの交換もしくは転置によって変更され得る。「変更された」UTR(3’または5’にかかわらず)をもたらすこれらの変化のうちのいずれかは、変異形UTRを含む。
終止コドン
一実施形態において、本発明の一次構築物は、3’非翻訳領域(UTR)の前に少なくとも2つの終止コドンを含み得る。終止コドンは、TGA、TAA、およびTAGから選択され得る。一実施形態において、本発明の一次構築物は、終止コドンTGAおよびもう1つの終止コドンを含む。さらなる実施形態において、もう1つの終止コドンは、TAAであり得る。
ベクター増幅
一次構築物を含有するベクターは、その後、増幅され、Invitrogen PURELINK(商標)HiPure Maxiprepキット(カリフォルニア州カールスバッド)を用いたマキシプレップ等であるが、これらに限定されない当技術分野で既知の方法を用いてプラスミドが単離および精製される。
プラスミド線形化
プラスミドは、その後、制限酵素および緩衝液の使用等であるが、これらに限定されない当技術分野で既知の方法を用いて線形化され得る。線形化反応物は、例えば、InvitrogenのPURELINK(商標)PCRマイクロキット(カリフォルニア州カールスバッド)、ならびに強アニオン交換HPLC、弱アニオン交換HPLC、逆相HPLC(RP−HPLC)、および疎水性相互作用HPLC(HIC−HPLC)等であるが、これらに限定されないHPLCに基づく精製方法、ならびにInvitrogenの標準PURELINK(商標)PCRキット(カリフォルニア州カールスバッド)を含む方法を用いて精製され得る。精製方法は、もたらされた線形化反応物の大きさに応じて修正され得る。その後、線形化されたプラスミドを用いて、インビトロ転写(IVT)反応の
ためのcDNAを生成する。cDNA鋳型合成
cDNA鋳型は、線形化されたプラスミドにポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を経させることによって合成され得る。表8は、本発明のPCR反応において有用であり得るプライマーおよびプローブの一覧である。この一覧が網羅的ではなく、任意の増幅のためのプライマー−プローブ設計が当技術分野の技術の範囲内であることを理解されたい。プローブは、標的分子に対する塩基対合忠実性および塩基対合強度を高めるように化学的に修飾された塩基も含有し得る。そのような修飾には、5−メチル−シチジン、2、6−ジ−アミノ−プリン、2’−フルオロ、ホスホロ−チオエート、またはロックド核酸が含まれ得る。
表8.プライマーおよびプローブ
一実施形態において、cDNAは、転写を経る前に配列決定分析のために提出され得る。
ポリヌクレオチド産生
ポリヌクレオチド産生のプロセスは、インビトロ転写、cDNA鋳型除去およびRNA浄化、ならびにキャッピングおよび/またはテーリング反応を含み得るが、これらに限定されない。
インビトロ転写
先のステップで産生されたcDNAは、インビトロ転写(IVT)系を用いて転写され得る。この系は、典型的には、転写緩衝液、ヌクレオチドトリホスフェート(NTP)、RNase阻害剤、およびポリメラーゼを含む。NTPは、自家で製造され得るか、供給業者から選択され得るか、または本明細書に記載されるように合成され得る。NTPは、天然および非天然(修飾された)NTPを含む本明細書に記載のNTPから選択され得るが、これらに限定されない。ポリメラーゼは、T7 RNAポリメラーゼ、T3 RNAポリメラーゼ、および修飾された核酸に組み込むことができるポリメラーゼ等であるが、これらに限定されない変異体ポリメラーゼから選択され得るが、これらに限定されない。RNAポリメラーゼ
任意の数のRNAポリメラーゼまたは変異形が本発明の一次構築物の設計において用いられ得る。
認識されるように設計され得る。そうすることで、一次構築物は、野生型または親一次構築物由来の配列変化部位または領域を含有するように修飾され得る。
って置換され得る。別の非限定的な例において、その領域内のヌクレオチドがGGGAGAであるとき、グアニン塩基は、少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、もしくは少なくとも4個のチミン、および/または本明細書に記載のヌクレオチドのうちのいずれかによって置換され得る。
cDNA鋳型除去および浄化
cDNA鋳型は、デオキシリボヌクレアーゼI(DNase I)での処理等であるが、これに限定されない当技術分野で既知の方法を用いて除去され得る。RNA浄化は、Beckman Coulter(マサチューセッツ州ダンバース)のAGENCOURT(登録商標)CLEANSEQ(登録商標)システム;強アニオン交換HPLC、弱アニオン交換HPLC、逆相HPLC(RP−HPLC)、および疎水性相互作用HPLC(HIC−HPLC)等であるが、これらに限定されないHPLCに基づく精製方法等であるが、これらに限定されない精製方法も含み得る。
キャッピングおよび/またはテーリング反応
一次構築物またはmmRNAは、キャッピングおよび/またはテーリング反応も経り得る。キャッピング反応は、5’キャップを一次構築物の5’末端に付加する当技術分野で既知の方法を用いて行われ得る。キャッピングのための方法には、ワクシニアキャッピング酵素(New England Biolabs、マサチューセッツ州イプスウィッチ)の使用が含まれるが、これに限定されない。
精製
一次構築物またはmmRNA精製は、mRNAまたはmmRNA浄化、品質保証、および品質管理を含み得るが、これらに限定されない。mRNAまたはmmRNA浄化は、AGENCOURT(登録商標)ビーズ(Beckman Coulter Genomics、マサチューセッツ州ダンバース);ポリTビーズ;LNA(商標)オリゴT捕捉プローブ(EXIQON(登録商標)Inc、Vedbaek,Denmark);または
強アニオン交換HPLC、弱アニオン交換HPLC、逆相HPLC(RP−HPLC)、および疎水性相互作用HPLC(HIC−HPLC)等であるが、これらに限定されないHPLCに基づく精製方法等であるが、これらに限定されない当技術分野で既知の方法を用いて行われ得る。「精製されたmRNAまたはmmRNA」等の「精製された」という用語は、ポリヌクレオチドとの関連で用いられるとき、少なくとも1つの混入物質から分離されるものを指す。本明細書で使用するとき、「混入物質」とは、別の物質を不適切、不純、または劣性にする任意の物質である。したがって、精製されたポリヌクレオチド(例えば、DNAおよびRNA)は、天然に見られる形態もしくは環境とは異なる形態もしくは環境、またはそれを処理もしくは精製方法に供する前に存在した形態もしくは環境とは異なる形態もしくは環境において存在する。
別の実施形態において、mRNAまたはmmRNAは、逆転写PCRを含むが、これに限定されない方法を用いて配列決定され得る。
一次構築物またはmmRNAは、ポリペプチドの治療関連部位への輸送を促進するさらなる特徴もコードし得る。タンパク質輸送を支援するそのような特徴の1つに、シグナルペプチド配列がある。本明細書で使用するとき、「シグナル配列」または「シグナルペプチド」とは、それぞれ、コーディング領域またはコードされたポリペプチドの5’(またはN末端)に組み込まれる、それぞれ、約9〜200ヌクレオチド長(3〜60アミノ酸長)のポリヌクレオチドまたはポリペプチドである。これらの配列の付加は、1つ以上の分泌経路を通るコードされたポリペプチドの小胞体への輸送をもたらす。いくつかのシグナルペプチドは、タンパク質が輸送された後にシグナルペプチダーゼによってタンパク質から切断される。
表9.シグナルペプチド
に教示されるシグナル配列を含む。米国特許第8,124,379号、同第7,413,875号、および同第7,385,034号に記載のものも本発明の範囲内であり、これら各々の内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。
標的選択
本発明にしたがって、一次構築物は、少なくとも1つの目的とするポリペプチドをコードする連結ヌクレオシドの少なくとも第1の領域を含む。本発明の目的とするポリペプチドまたは「標的」またはタンパク質およびペプチドは、2012年4月2日出願の米国仮特許出願第61/618,862号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Biologics」;2012年8月10日出願の米国仮特許出願第61/681,645号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of
Biologics」;2012年12月14日出願の米国仮特許出願第61/737,130号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Biologics」;2012年4月2日出願の米国仮特許出願第61/618,866号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Antibodies」;2012年8月10日出願の米国仮特許出願第61/681,647号、表題「Modified Polynucleotides for the Production
of Antibodies」;2012年12月14日出願の米国仮特許出願第61/737,134号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Antibodies」;2012年4月2日出願の米国仮特許出願第61/618,868号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Vaccines」;2012年8月10日出願の米国仮特許出願第61/681,648号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Vaccines」;2012年12月14日出願の米国仮特許出願第61/737,135号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Vaccines」;2012年4月2日出願の米国仮特許出願第61/618,870号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Therapeutic Proteins and Peptides」;2012年8月10日出願の米国仮特許出願第61/681,649号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Therapeutic Proteins and Peptides」;2012年12月14日出願の米国仮特許出願第61/737,139号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Therapeutic Proteins and Peptides」;2012年4月2日出願の米国仮特許出願第61/618,873号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Secreted Prot
eins」;2012年8月10日出願の米国仮特許出願第61/681,650号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Secreted Proteins」;2012年12月14日出願の米国仮特許出願第61/737,147号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Secreted
Proteins」;2012年4月2日出願の米国仮特許出願第61/618,878号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Plasma Membrane Proteins」;2012年8月10日出願の米国仮特許出願第61/681,654号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Plasma Membrane Proteins」;2012年12月14日出願の米国仮特許出願第61/737,152号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Plasma Membrane Proteins」;2012年4月2日出願の米国仮特許出願第61/618,885号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Cytoplasmic and Cytoskeletal Proteins」;2012年8月10日出願の米国仮特許出願第61/681,658号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Cytoplasmic and Cytoskeletal Proteins」;2012年12月14日出願の米国仮特許出願第61/737,155号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Cytoplasmic and
Cytoskeletal Proteins」;2012年4月2日出願の米国仮特許出願第61/618,896号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Intracellular Membrane Bound Proteins」;2012年7月5日出願の米国仮特許出願第61/668,157号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Intracellular
Membrane Bound Proteins」;2012年8月10日出願の米国仮特許出願第61/681,661号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Intracellular Membrane Bound Proteins」;2012年12月14日出願の米国仮特許出願第61/737,160号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Intracellular Membrane Bound Proteins」;2012年4月2日出願の米国仮特許出願第61/618,911号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Nuclear
Proteins」;2012年8月10日出願の米国仮特許出願第61/681,667号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Nuclear Proteins」;2012年12月14日出願の米国仮特許出願第61/737,168号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Nuclear Proteins」;2012年4月2日出願の米国仮特許出願第61/618,922号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Proteins」;2012年8月10日出願の米国仮特許出願第61/681,675号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Proteins」;2012年12月14日出願の米国仮特許出願第61/737,174号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Proteins」;2012年4月2日出願の米国仮特許出願第61/618,
935号、表題「Modified Polynucleotides for the
Production of Proteins Associated with Human Disease」;2012年8月10日出願の米国仮特許出願第61/681,687号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Proteins Associated with Human Disease」;2012年12月14日出願の米国仮特許出願第61/737,184号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Proteins Associated with Human Disease」;2012年4月2日出願の米国仮特許出願第61/618,945号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Proteins Associated with Human Disease」;2012年8月10日出願の米国仮特許出願第61/681,696号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Proteins Associated with Human Disease」;2012年12月14日出願の米国仮特許出願第61/737,191号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Proteins Associated with Human Disease」;2012年4月2日出願の米国仮特許出願第61/618,953号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Proteins Associated with Human Disease」;2012年8月10日出願の米国仮特許出願第61/681,704号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Proteins Associated with Human Disease」;2012年12月14日出願の米国仮特許出願第61/737,203号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Proteins Associated with Human Disease」、米国仮特許出願第61/753,661号、表題「Polynucleotides For The Alteration Of Cellular Phenotypes
And Microenvironments」;2013年3月9日出願の国際出願第PCT/US2013/030062号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Biologics and Proteins Associated with Human Disease」;2013年3月9日出願の国際出願第PCT/US2013/030063号、表題「Modified Polynucloetides」;国際出願第PCT/US2013/030064号、表題「Modified Polynucleotides
for the Production of Secreted Proteins」;2013年3月9日出願の国際出願第PCT/US2013/030059号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Membrane Proteins」;2013年3月9日出願の国際出願第PCT/US2013/030066号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Cytoplasmic and Cytoskeletal Proteins」;2013年3月9日
出願の国際出願第PCT/US2013/030067号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Nuclear Proteins」;2013年3月9日出願の国際出願第PCT/US2013/030060号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Proteins」;2013年3月9日出願の国際出願第PCT/US2013/030061号、表題「Modified P
olynucleotides for the Production of Proteins Associated with Human Disease」;2013年3月9日出願の国際出願第PCT/US2013/030068号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Cosmetic Proteins and Peptides」;2013年3月9日出願の国際出願第PCT/US2013/030070号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of
Oncology−Related Proteins and Peptides」;および2013年3月15日出願の国際出願第PCT/US2013/031821号、表題「In Vivo Production of Proteins」に列挙され、これら各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
タンパク質切断シグナルおよび部位
一実施形態において、本発明のポリペプチドは、少なくとも1個のタンパク質切断部位を含有する少なくとも1個のタンパク質切断シグナルを含み得る。タンパク質切断部位は、N末端とC末端の真ん中、N末端と中間点との間、中間点とC末端との間、およびこれらの組み合わせ等であるが、これらに限定されないN末端とC末端との間の任意の空間で、N末端、C末端に位置し得る。
表10.タンパク質切断部位配列
プロホルモンコンバターゼ)、トロンビン、および/または第Xa因子タンパク質切断シグナルを含み得るが、これらに限定されない。当業者であれば、上の表5または他の既知の方法を用いて、本発明の一次構築物、修飾核酸、またはmmRNAに含める適切なコードされたタンパク質切断シグナルを決定することができる。例えば、表10のシグナルから始め、表5のコドンを考慮して、結果として生じるポリペプチドにおいてタンパク質シグナルを生成し得る一次構築物のシグナルを設計することができる。
非限定的な例として、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第7,374,930号および米国特許公開第20090227660号は、フーリン切断部位を用いて、発現産物におけるGLP−1のN末端メチオニンをその細胞のゴルジ装置から切断する。一実施形態において、本発明のポリペプチドは、少なくとも1個のタンパク質切断シグナルおよび/または部位を含むが、但し、ポリペプチドがGLP−1ではないことを条件とする。
一実施形態において、本発明の一次構築物、修飾核酸、またはmmRNAは、少なくとも1個のコードされたタンパク質切断シグナルおよび/または部位を含むが、但し、一次構築物、修飾核酸、またはmmRNAがGLP−1をコードしないことを条件とする。
表11.Mirおよびmir結合部位
表12.mis、組織/細胞発現、および疾患
DD et al,Blood,2010,116:e118−e127;Vaz C
et al.,BMC Genomics,2010,11,288、これら各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)。表13において、「HCC」は肝細胞癌を表し、「ALL」は急性リンパ性白血病を表し、「CLL」は慢性リンパ性白血病を表す。
表13.免疫細胞におけるマイクロRNA
本明細書における、ヌクレオチド、ヌクレオシド、ポリヌクレオチド(例えば、修飾RNA、修飾核酸分子、修飾RNA(複数)、核酸、および修飾核酸といった、本発明の核酸等)において、「修飾」または必要に応じて「修飾された」という用語は、A、G、U、またはCリボヌクレオチドに対する修飾を指す。概して、本明細書において、これらの用語は、天然に存在する5’末端mRNAキャップ部分におけるリボヌクレオチド修飾を指すようには意図されていない。ポリペプチドにおいて、「修飾」という用語は、基準の組の20個のアミノ酸と比較した修飾を指す。
域は、1つ、2つ、または2つ以上の(任意に異なる)ヌクレオシドまたはヌクレオチド修飾を含有し得る。いくつかの実施形態において、細胞に導入された修飾核酸または修飾RNAは、未修飾核酸または修飾RNAと比較して、細胞における分解の減少を呈し得る。
修飾mRNA分子
本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、核酸、または修飾RNAは、目的とするポリペプチドをコードする結合ヌクレオシドの第1の領域、第1の領域の5’末端に位置する第1の隣接領域、および第1の領域の3’末端に位置する第2の隣接領域を含む。結合ヌクレオチドの第1の領域は、翻訳可能な領域であり得る。
PCT/US12/58519号(代理人整理番号:M009.20)に記載の、式I〜IXまたはそれらの任意の下部構造のものを含むが、これらに限定されない、任意の塩基、糖、骨格、構成要素、または他の構造もしくは式を有する、n個の連結ヌクレオシドを含む。そのような構造は、糖、核酸塩基、ヌクレオシド間結合、またはそれらの組み合わせへの修飾を含む。
いくつかの実施形態において、修飾核酸塩基は、修飾ウラシルである。修飾ウラシルを有する例示の核酸塩基およびヌクレオシドには、シュードウリジン(ψ)、ピリジン−4−オンリボヌクレオシド、5−アザ−ウリジン、6−アザ−ウリジン、2−チオ−5−アザ−ウリジン、2−チオウリジン(s2U)、4−チオ−ウリジン(s4U)、4−チオ−シュードウリジン、2−チオ−シュードウリジン、5−ヒドロキシウリジン(ho5U)、5−アミノアリル−ウリジン、5−ハロ−ウリジン(例えば、5−ヨード−ウリジンまたは5−ブロモ−ウリジン)、3−メチルウリジン(m3U)、5−メトキシ−ウリジン(mo5U)、ウリジン5−オキシ酢酸(cmo5U)、ウリジン5−オキシ酢酸メチルエステル(mcmo5U)、5−カルボキシメチル−ウリジン(cm5U)、1−カルボキシメチル−シュードウリジン、5−カルボキシヒドロキシメチル−ウリジン(chm5U)、5−カルボキシヒドロキシメチル−ウリジンメチルエステル(mchm5U)、5−メトキシカルボニルメチル−ウリジン(mcm5U)、5−メトキシカルボニルメチル−2−チオ−ウリジン(mcm5s2U)、5−アミノメチル−2−チオ−ウリジン(nm5s2U)、5−メチルアミノメチル−ウリジン(mnm5U)、5−メチルアミノメチル−2−チオ−ウリジン(mnm5s2U)、5−メチルアミノメチル−2−セレノ−ウリジン(mnm5se2U)、5−カルバモイルメチル−ウリジン(ncm5U)、5−カルボキシメチルアミノメチル−ウリジン(cmnm5U)、5−カルボキシメチルアミノメチル−2−チオ−ウリジン(cmnm5s2U)、5−プロピニル−ウリジン、1−プロピニル−シュードウリジン、5−タウリノメチルウリジン(τm5U)、1−タウリノメチル−シュードウリジン、5−タウリノメチル−2−チオ−ウリジン(τm5s2U)、1−タウリノメチル−4−チオ−シュードウリジン、5−メチル−ウリジン(m5U、すなわち、核酸塩基デオキシチミンを有するもの)、1−メチル−シュードウリジン(m1ψ)、5−メチル−2−チオ−ウリジン(m5s2U)、1−メチル−4−チオ−シュードウリジン(m1s4ψ)、4−チオ−1−メチル−シュードウリジン、3−メチル−シュードウリジン(m3ψ)、2−チオ−1−メチル−シュードウリジン、1−メチル−1−デアザ−シュードウリジン、2−チオ−1−メチル−1−デアザ−シュードウリジン、ジヒドロウリジン(D)、ジヒドロシュードウリジン、5,6−ジヒドロウリジン、5−メチル−ジヒドロウリジン(m5D)、2−チオ−ジヒドロウリジン、2−チオ−ジヒドロシュードウリジン、2−メトキシウリジン、2−メトキシ−4−チオ−ウリジン、4−メトキシ−シュードウリジン、4−メトキシ−2−チオ−シュードウリジン、N1−メチル−シュードウリジン、3−(3−アミノ−3−カルボキシプロピル)ウリジン(acp3U)、1−メチル−3−(3−アミノ−3−カルボキシプロピル)シュードウ
リジン(acp3ψ)、5−(イソペンテニルアミノメチル)ウリジン(inm5U)、5−(イソペンテニルアミノメチル)−2−チオ−ウリジン(inm5s2U)、α−チオ−ウリジン、2’−O−メチル−ウリジン(Um)、5,2’−O−ジメチル−ウリジン(m5Um)、2’−O−メチル−シュードウリジン(ψm)、2−チオ−2’−O−メチル−ウリジン(s2Um)、5−メトキシカルボニルメチル−2’−O−メチル−ウリジン(mcm5Um)、5−カルバモイルメチル−2’−O−メチル−ウリジン(ncm5Um)、5−カルボキシメチルアミノメチル−2’−O−メチル−ウリジン(cmnm5Um)、3,2’−O−ジメチル−ウリジン(m3Um)、および5−(イソペンテニルアミノメチル)−2’−O−メチル−ウリジン(inm5Um)、1−チオ−ウリジン、デオキシチミジン、2’−F−アラ−ウリジン、2’−F−ウリジン、2’−OH−アラ−ウリジン、5−(2−カルボメトキシビニル)ウリジン、および5−[3−(1−E−プロペニルアミノ)ウリジンが挙げられる。
バリルカルバモイル−アデノシン(ms2hn6A)、N6−アセチル−アデノシン(ac6A)、7−メチルアデニン、2−メチルチオ−アデニン、2−メトキシ−アデニン、α−チオ−アデノシン、2’−O−メチル−アデノシン(Am)、N6,2’−O−ジメチル−アデノシン(m6Am)、N6,N6,2’−O−トリメチル−アデノシン(m6 2Am)、1,2’−O−ジメチル−アデノシン(m1Am)、2’−O−リボシルアデノシン(ホスフェート)(Ar(p))、2−アミノ−N6−メチル−プリン、1−チオ−アデノシン、8−アジド−アデノシン、2’−F−アラ−アデノシン、2’−F−アデノシン、2’−OH−アラ−アデノシン、およびN6−(19−アミノ−ペンタオキサノナデシル)−アデノシンが挙げられる。
5−トリフルオロメチルおよび他の5−置換ウラシルおよびシトシン、7−メチルグアニンおよび7−メチルアデニン、8−アザグアニンおよび8−アザアデニン、デアザグアニン、7−デアザグアニン、3−デアザグアニン、デアザアデニン、7−デアザアデニン、3−デアザアデニン、ピラゾロ[3,4−d]ピリミジン、イミダゾ[1,5−a]1,3,5トリアジノン、9−デアザプリン、イミダゾ[4,5−d]ピラジン、チアゾロ[4,5−d]ピリミジン、ピラジン−2−オン、1,2,4−トリアジン、ピリダジン、および1,3,5トリアジンを含む塩基の天然に存在する合成誘導体も含み得る。ヌクレオチドがA、G、C、T、またはUの略語を用いて示されるとき、各文字は、代表的な塩基および/またはその誘導体を指し、例えば、Aは、アデニン、または、例えば、7−デアザアデニンのようなアデニン類似体を含む。
ヌクレオシド間結合における修飾
核酸または修飾RNA分子に組み込まれ得る修飾ヌクレオチドは、ヌクレオシド間結合(例えば、リン酸骨格)において修飾され得る。本明細書において、ポリヌクレオチド、一次構築物、核酸、または修飾RNA骨格との関連で、「リン酸塩」および「ホスホジエステル」という表現は、同義に使用される。骨格リン酸基は、酸素原子のうちの1個以上を異なる置換基で置換することによって修飾され得る。さらに、修飾ヌクレオシドおよびヌクレオチドは、未修飾リン酸塩部分の別の本明細書に記載のヌクレオシド間結合との大規模な置換を含み得る。修飾リン酸基の例には、ホスホロチオエート、ホスホロセレナート、ボラノホスフェート、ボラノホスフェートエステル、水素ホスホネート、ホスホロラミデート、ホスホロジアミデート、アルキルまたはアリールホスホネート、およびホスホトリエステルが挙げられるが、これらに限定されない。ホスホロジチオエートは、硫黄で置換された両方の非結合酸素を有する。リン酸リンカーは、結合酸素の窒素(架橋ホスホロアミデート)、硫黄(架橋ホスホロチオエート)、および炭素(架橋メチレンホスホネート)での置換によっても修飾され得る。
修飾糖、核酸塩基、およびヌクレオシド間結合の組み合わせ
本発明の核酸または修飾RNAは、糖、核酸塩基、および/またはヌクレオシド間結合への修飾の組み合わせを含み得る。これらの組み合わせは、本明細書に記載のいずれか1つ以上の修飾を含み得る。例えば、式(Ia)、(Ia−1)〜(Ia−3)、(Ib)〜(If)、(IIa)〜(IIp)、(IIb−1)、(IIb−2)、(IIc−1)〜(IIc−2)、(IIn−1)、(IIn−2)、(IVa)〜(IVl)、および(IXa)〜(IXr)における本明細書に記載のヌクレオチドのうちのいずれかは、本明細書に記載の核酸塩基のうちのいずれ(例えば、式(b1)〜(b43)または本明細書に記載の任意の他のもの)とも組み合わせられ得る。
核酸または修飾RNA分子(修飾RNA)の合成
本発明に従った使用のための核酸は、化学合成、一般にインビトロ転写と称される酵素合成、より長い前駆体の酵素開裂または化学開裂等を含むが、これらに限定されない、本明細書に記載の任意の有用な技術、または任意の有用な技術に従って調製することができる。RNAを合成する方法は、当該技術分野において既知である(例えば、Gait,M.J.(ed.)Oligonucleotide synthesis:a practical approach,Oxford[Oxfordshire],Washington, DC:IRL Press,1984;and Herdewijn,P.(ed.)Oligonucleotide synthesis:methods and applications,Methods in Molecular Biology,v.288(Clifton,N.J.)Totowa,N.J.:Humana Press,2005を参照のこと;どちらの内容も参照により本明細書に組み込まれる)。
当業者によって決定され得る。
al.,J.Org.Chem.74:2585−2588(2009);Purmal et al.,Nucl.Acids Res.22(1):72−78,(1994);Fukuhara et al.,Biochemistry,1(4):563−568(1962);およびXu et al.,Tetrahedron,48(9):1729−1740(1992)に記載の合成方法に従って調製することができ、これら各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
al.,J.Org.Chem.74:2585−2588(2009);Purmal et al.,Nucl.Acids Res.22(1):72−78,(1994);Fukuhara et al.,Biochemistry,1(4):563−568(1962);およびXu et al.,Tetrahedron,48(9):1729−1740(1992)に記載の合成方法に従って調製することができ、これら各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ヌクレオチドの組み合わせ
修飾ヌクレオチドと修飾ヌクレオチドの組み合わせのさらなる例が以下の表14に提供される。修飾ヌクレオチドのこれらの組み合わせを用いて、本発明の核酸または修飾RNAを形成することができる。別途述べられない限り、修飾ヌクレオチドは、本発明の核酸または修飾RNAの天然ヌクレオチドと完全に置換され得る。非限定的な例として、天然ヌクレオチドウリジンは、本明細書に記載の修飾ヌクレオシドで置換され得る。別の非限定的な例において、天然ヌクレオチドウリジンは、本明細書に開示の修飾ヌクレオシドのうちの少なくとも1つで部分的に置換され得る(例えば、約0.1%、1%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、または99.9%)。表14.化学修飾
Uses Thereof」、2011年10月3日出願の国際特許公開第WO2012045075号、表題「Modified Nucleosides,Nucleotides,And Nucleic Acids,and Uses Thereof」
、2011年10月3日に出願の米国特許公開第US20120237975号、表題「Engineered Nucleic Acids and Method of Use Thereof」、および国際特許公開第WO2012045082号に記載されており、これらは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
表15.化学修飾
例えば、式(b10)または(b32)の化合物の、少なくとも約30%、少なくとも約35%、少なくとも約40%、少なくとも約45%、少なくとも約50%、少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、または約100%)。
リンカーおよびペイロードを含む修飾
ペイロード
本明細書に記載の方法および組成物は生物学的標的にペイロードを送達するのに有用である。ペイロードは、例えば、標識化(例えば、フルオロフォア等の検出可能な薬剤)に対して、または治療目的(例えば、細胞毒または他の治療薬)に対して使用することができる。
ペイロード:治療薬
いくつかの実施形態において、ペイロードは、細胞毒、放射性イオン、化学療法剤、または他の治療剤等の治療剤である。細胞毒または細胞傷害性薬剤には、細胞に有害であるいずれの薬剤も含まれる。例としては、タキソール、サイトカラシンB、グラミシジンD、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラセンジオン(dihydroxy anthracine dione)、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンD、1−デヒドロテストステロン、糖質コルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、ピューロマイシン、マイタンシノイド、例えば、マイタンシノール(米国特許第5,208,020号)、CC−1065(米国特許第5,475,092号、同第5,585,499号、同第5,846,545号を参照のこと)、ならびにこれらの類似体または相同体が挙げられる。放射性イオンには、ヨウ素(例えば、ヨウ素125またはヨウ素131)、ストロンチウム89、リン、パラジウム、セシウム、イリジウム、リン酸塩、コバルト、イットリウム90、サマリウム153、およびプラセオジミウムが含まれるが、これらに限定されない。他の治療剤には、代謝拮抗薬(例えば、メトトレキサート、6−メルカプトプリン、6−チオグアニン、シタラビン、5−フルオロウラシルダカルバジン(decarbazine))、アルキル化剤(例えば、メクロレタミン、チオテパクロラムブシル、CC−1065、メルファラン、カルムスチン(BSNU)、およびロムスチン(CCNU)、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンC、およびcis−ジクロロジアミン白金(II)(DDP)シスプラチ
ン)、アントラサイクリン(例えば、ダウノルビシン(かつてはダウノマイシン)およびdオキソルビシン)、抗生物質(例えば、ダクチノマイシン(かつてはアクチノマイシン)、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアントラマイシン(AMC))、および抗有糸分裂剤(例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、タキソール、およびマイタンシノイド)が含まれるが、これらに限定されない。
ペイロード:検出可能な薬剤
検出可能な物質の例として、種々の有機小分子、無機化合物、ナノ粒子、酵素もしくは酵素基質、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、化学発光物質、放射性物質、および造影剤が挙げられる。そのような光検出可能な標識には、例えば、制限なく、4−アセトアミド−4’−イソチオシアン酸スチルベン−2,2’ジスルホン酸;アクリジンおよび誘導体:アクリジンおよびアクリジンイソチオシアネート;5−(2’−アミノエチル)アミノナフタレン−1−スルホン酸(EDANS);4−アミノ−N−[3−ビニルスルホニル)フェニル]ナフタルイミド−3,5ジスルホン酸塩;N−(4−アニリノ−1−ナフチル)マレイミド;アントラニルアミド;BODIPY;ブリリアントイエロー;クマリンおよび誘導体;クマリン、7−アミノ−4−メチルクマリン(AMC、クマリン120)、7−アミノ−4−トリフルオロメチルクマリン(クマリン151);シアニン色素;シアノシン;4’,6−ジアミジノ−2−フェニルインドール(DAPI);5’5”−ジブロモピロガロール−スルホナフタレン(naphthalein)(ブロモピロガロールレッド);7−ジエチルアミノ−3−(4’−イソチオシアン酸フェニル)−4−メチルクマリン;ジエチレントリアミン五酢酸塩;4,4’−ジイソチオシアン酸ジヒドロ−スチルベン−2,2’−ジスルホン酸;4,4’−ジイソチオシアン酸スチルベン−2,2’−ジスルホン酸;5−[ジメチルアミノ]−ナフタレン−1−スルホニルクロリド(DNS、ダンシルクロリド);4−ジメチルアミノフェニルアゾフェニル−4’−イソチオシアネート(DABITC);エオシンおよび誘導体;エオシンおよびエオシンイソチオシアネート;エリスロシンおよび誘導体;エリスロシンB、エリスロシン、イソチオシアネート;エチジウム;フルオロセインおよび誘導体;5−カルボキシフルオロセイン(FAM)、5−(4,6−ジクロロトリアジン−2−イル)アミノフルオロセイン(DTAF)、2’,7’−ジメトキシ−4’5’−ジクロロ−6−カルボキシフルオロセイン、フルオロセイン、フルオロセインイソチオシアネート、QFITC(XRITC)、;フルオレスカミン;IR144;IR1446;マラカイトグリーンイソチオシアネート;4−メチルウンベリフェロンオルトクレゾールフタレイン;ニトロチロシン;パラローザニリン;フェノールレッド;B−フィコエリトリン;o−フタルジアルデヒド;ピレンおよび誘導体:ピレン、酪酸ピレン、スクシンイミジル1−ピレン;酪酸塩量子ドット;リアクティブレッド4(Cibacron(商標)ブリリアントレッド3B−A);ローダミンおよび誘導体:6−カルボキシ−X−ローダミン(ROX)、6−カルボキシローダミン(R6G)、リサミンローダミンBスルホニルクロリドローダミン(rhodarnine)(Rhod)、ローダミンB、ローダミン123、ローダミンXイソチオシアネート、スルホローダミンB、スルホローダミン101、スルホローダミン101のスルホニルクロリド誘導体(テキサスレッド)、N,N,N’,N’テトラメチル−6−カルボキシローダミン(TAMRA);テトラメチルローダミン;テトラメチルローダミンイソチオシアネート(TRITC);リボフラビン;ロゾール酸;テルビウムキレート誘導体;シアニン−3(Cy3);シアニン−5(Cy5);シアニン−5.5(Cy5.5)、シアニン−7(Cy7);IRD 700;IRD 800;Alexa 647;La Jolta Blue;フタロシアニン;ならびにナフタロシアニンが含まれる。いくつかの実施形態において、検出可能な標識は、Cy5およびCy3等の蛍光色素である。
好適な放射性物質の例として、直接的もしくは間接的のいずれかで、18F、67Ga
、81mKr、82Rb、111In、123I、133Xe、201Tl、125I、35S、14C、または3H、99mTc(例えば、過テクネチウム酸(テクネチウム酸塩(VII)、TcO4 −として)、または電波放射の直接計数によって、もしくはシンチレーション測定によって検出可能な他の放射性同位体が挙げられる。
ペイロード:細胞透過性ペイロード
いくつかの実施形態において、修飾ヌクレオチドおよび修飾核酸はまた、組成物の細胞内送達を促進する細胞透過性部分または薬剤を含み得るペイロードも含む。例えば、組成物は、細胞内空間への送達を容易にする細胞透過性ペプチド配列、例えば、HIV由来TATペプチド、ペネトラチン、トランスポータン、またはhCT由来細胞透過性ペプチドを含み得る(例えば、参照により全体が本明細書に組み込まれる、Caron et al.,Mol.Ther.3(3):310−8(2001)、Langel,Cell−Penetrating Peptides:Processes and Applications(CRC Press,Boca Raton FL,2002)、El−Andaloussi et al.,Curr.Pharm.Des.11(28):3597−611(2003)、およびDeshayes et al.,Cell.Mol.Life Sci.62(16):1839−49(2005)を参照のこと)。組成物は、組成物の細胞内空間への送達を向上させる細胞透過性薬剤、例えば、リポソームを含むように製剤化することもできる。
ペイロード:生物学的標的
本明細書に記載の修飾ヌクレオチドおよび修飾核酸を用いて、ペイロードを特定のリガンドが存在するか、または生成され得る任意の生物学的標的へ送達することができる。リガンドは生物学的標的へ共有結合的または非共有結合的のいずれかで結合することができ
る。
修飾ヌクレオチドの合成
本明細書に記載の修飾ヌクレオシドおよびヌクレオチドは、以下の一般的な方法および手順を用いて容易に入手可能な出発物質から調製することができる。典型的なまたは好適な作業条件(すなわち、反応温度、時間、反応物のモル比、溶媒、圧力等)が与えられる場合、他の作業条件もまた、別段に示されない限り使用することができることを理解されたい。最適な反応条件は特定の反応物または使用する溶媒に応じて変化し得るが、そのような条件は、当業者が通常の最適化手順によって決定することができる。
長さ
一般的に、本発明の修飾mRNAの長さは30ヌクレオチド長より長い。別の実施形態において、RNA分子は35ヌクレオチド長より長い。別の実施形態において、長さは少なくとも40ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも45ヌク
レオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも55ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも60ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも60ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも80ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも90ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも100ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも120ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも140ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも160ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも180ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも200ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも250ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも300ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも350ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも400ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも450ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも500ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも600ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも700ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも800ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも900ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも1000ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも1100ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも1200ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも1300ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも1400ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも1500ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも1600ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも1800ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも2000ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも2500ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも3000ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも4000ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは少なくとも5000ヌクレオチド長超である。別の実施形態において、長さは少なくとも5000ヌクレオチド長、または6000ヌクレオチド長超である。別の実施形態において、長さは少なくとも7000ヌクレオチド長、または7000ヌクレオチド長超である。別の実施形態において、長さは少なくとも8000ヌクレオチド長、または8000ヌクレオチド長超である。別の実施形態において、長さは少なくとも9000ヌクレオチド長、または9000ヌクレオチド長超である。別の実施形態において、長さは少なくとも10,000ヌクレオチド長、または10,000ヌクレオチド長超である。
修飾RNAの使用
自然細胞免疫応答活性の予防または減少
「自然免疫応答」という用語は、一般的にはウイルス起源または細菌起源の外因性一本鎖核酸に対する細胞応答を含み、これは、サイトカイン、特にインターフェロンの発現および放出、ならびに細胞死の誘導を含む。タンパク質合成はまた、自然細胞免疫応答の際にも減少する。細胞における自然免疫応答を排除することは有利である一方で、本発明は、そのような応答を完全に除去せず、インターフェロンシグナル伝達を含む、実質的に免疫応答を減少させる修飾mRNAを提供する。いくつかの実施形態において、免疫応答は、対応する非修飾核酸に誘導される免疫応答と比較して10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%、99.9%、または99.9%超低い。そのような低減は、1型インターフェロンの発現もしくは活性のレベル、またはトール様受容体(例えば、TLR7およびTLR8)等のインターフェロン制御遺伝子の発現により測定され得る。自然免疫応答の低減は、細胞集団への修飾RNAの1つ以上の投与に従って減少された細胞死を測定することによっても測定され得る。例えば、細胞死は、対応する非修飾核酸で観察された細胞死頻度よりも10%、25%、50%、
75%、85%、90%、95%、または95%超少ない。さらに、細胞死は、修飾核酸と接触した細胞の50%、40%、30%、20%、10%、5%、1%、0.1%、0.01%、または0.01%未満に影響し得る。
主溝相互作用パートナー
本明細書に記載されるように、「主溝相互作用パートナー」という表現は、ヌクレオチドまたは核酸の主溝の面との相互作用、例えば結合を通して、RNAリガンドを検出し、それに応答するRNA認識受容体を指す。したがって、本明細書に記載の修飾RNA等の修飾ヌクレオチドまたは核酸を含むRNAリガンドは、主溝結合パートナーとの相互作用を減少させ、ゆえに、自然免疫応答を減少させる。
RNA結合タンパク質
本発明のいくつかの実施形態において、RNA結合タンパク質が提供される。RNA結合タンパク質はタンパク質および/またはそのようなタンパク質をコードする核酸として提供され得る。RNA結合タンパク質はRNA安定性およびタンパク質翻訳の調節において多数の役割を果たす。mRNAの3’UTRにおけるA/Uリッチ要素は、増加したまたは減少したmRNA安定性をもたらすA/Uリッチ結合タンパク質(AREBP)によって結合する二次構造の形成を引き起こす(Fan,X.C.et al.,Overexpression of HuR,a nuclear−cytoplasmic shuttling protein,increases the in vivo stability of ARE−containing mRNAs.EMBO J 1998 Jun 15;17(12):3448−60)。HuRは安定化AREBPである。目的とするmRNAの安定性を増加させるために、HuRをコードするmRNAは目的とするmRNAと共に細胞内または組織内へ同時導入され得るか、または同時注入され得る。これらのタンパク質はまた、目的とするmRNAにインビトロで繋留することができ、その後細胞へ共に投与することができる。ポリA尾部結合タンパク質(PABP)は真核細胞翻訳開始因子eIF4Gと相互作用して、翻訳開始を刺激する。これらのRBPをコードするmRNAとmRNA薬剤との同時投与、および/またはこれらのタンパク質とmRNA薬剤のインビトロでの繋留、ならびにタンパク質結合mRNAの細胞内への投与は、mRNAの翻訳効率を増加させる。同一のコンセプトは、RNA安定性および/または翻訳効率に影響する、様々な翻訳因子および促進因子をコードするmRNAとm
RNAのと同時投与、ならびにタンパク質それら自身とmRNAとの同時投与にまで渡り得る。ポリペプチド変異形
参照ポリペプチド配列とある特定の同一性を有する様々なポリペプチドをコードする拡散が提供される。「同一性」という用語は、当該技術分野で既知であるように、2つ以上のペプチドの配列間の、配列を比較することで決定される関係を指す。当該技術分野において、「同一性」はまた、2つ以上のアミノ酸残基の紐間の一致数によって決定されるペプチド間の配列の関連性の程度を意味する。
Analysis Primer,Gribskov,M.and Devereux,J.,eds.,M.Stockton Press,New York,1991;およびCarillo et al.,SIAM J.Applied Math.48,1073(1988)に記載の方法が挙げられる。
ポリペプチドライブラリ
ヌクレオシド修飾を含有するポリヌクレオチドライブラリもまた提供され、ポリヌクレオチドは個々に、当該技術分野において既知である、抗体、タンパク質結合パートナー、
裏打ちタンパク質、および他のポリペプチド等のポリペプチドをコードする第1の核酸配列を含有する。好ましくは、ポリヌクレオチドは、標的細胞宿主への直接導入に適した形態であるmRNAであり、その宿主細胞は、次いでコードされたポリペプチドを合成する。
ポリペプチド核酸複合体
好適なタンパク質翻訳は、mRNAと関連するいくつかのポリペプチドおよび核酸の物理的集合が関与する。mRNAと結合した1つ以上のヌクレオシド修飾(例えば、少なくとも2つの異なるヌクレオシド修飾)、および1つ以上のポリペプチドを含有する、タンパク質および核酸の抱合体を含有する複合体が本発明に提供される。一般的に、タンパク質は、複合体が導入される細胞の自然免疫応答を妨げるまたは減少させるのに効果的な量で提供される。
標的部分
本発明の実施形態において、インビボもしくはインビトロのいずれかで、細胞を特定の組織空間に標的化するか、または特定の部分と相互作用する働きをする細胞の表面上のタンパク質結合パートナーまたは受容体を発現するように、修飾核酸が提供される。好適なタンパク質結合パートナーには、抗体およびその機能的断片、足場タンパク質、またはペプチドが含まれる。さらに、修飾核酸を用いて、脂質、炭水化物、または他の生物学的部分の合成および細胞外局在化を指向することができる。
)」であり得る。核酸を標的化する配列の非限定的な例は、国際特許公開第WO2013109713号に記載され、この内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ジップコードおよびマイクロRNAがどちらもmRNAの転写後調節における役割を有するため、ジップコード様配列およびmiR−1289は、微小胞中のmRNAを濃縮するようにBolukbasi et al.によって示される(Mol.Ther.Nuc.Acid 2012 1,e10;この内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)。
ワクチン
本明細書に記載されるように、実質的に翻訳可能ではない配列、有するmRNAが提供される。そのようなmRNAは、哺乳類対象に投与されたとき、ワクチンとして効果的である。
治療薬
本明細書に記載される、修飾核酸(修飾RNA)および修飾核酸から翻訳されるタンパク質は、治療剤または予防剤として使用することができる。例えば、本明細書に記載の修飾核酸は、対象に投与することができ、この修飾核酸は、インビボで翻訳されて、対象において治療的ペプチドを産生する。ヒトおよび他の哺乳動物における疾患または状態の治療または予防のための、組成物、方法、キット、および試薬が提供される。本発明の活性治療薬は、修飾核酸、修飾核酸またはこの修飾核酸から翻訳されるポリペプチドを含有する細胞、修飾核酸から翻訳されるポリペプチド、および修飾核酸またはこの修飾核酸から翻訳されるポリペプチドを含有する細胞と接触する細胞を含む。
る方法が、本明細書に提供される。そのような翻訳は、インビボ、エクスビボ、培養下、またはインビトロであり得る。細胞集団は、少なくとも1つのヌクレオシド修飾および組換えポリペプチドをコードする翻訳可能領域を有する核酸を含有する有効量の組成物と接触させられる。集団は、核酸が細胞集団の1つ以上の細胞内に局在化され、組換えポリペプチドが細胞内で核酸から翻訳されるような条件下で接触させられる。
または正常なレベルから過正常なレベルへと至らせ得る。
治療学
欠損したタンパク質活性の置換または異常なタンパク質活性の克服によって、タンパク質活性の欠損または異常を特徴とする疾患の症状を、治療または予防する方法が提供される。ウイルスDNAベクターと比較して、修飾mRNAの導入に続いてタンパク質産生が速やかに開始するため、本発明の化合物は、敗血症、脳卒中、および心筋梗塞等の急性疾患の治療に特に有利である。さらに、本発明の修飾mRNAの転写制御の欠失はタンパク質産生が達成できる正確な用量設定のために有利である。
症型βサラセミア、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ハーラー症候群、ハンター症候群、および血友病Aが含まれる。そのようなタンパク質は、存在しない場合があるか、または本質的に非機能的である。本発明は、本明細書に提供される修飾核酸を含有する核酸または細胞ベースの治療薬を導入することによって、対象においてそのような状態または疾患を治療するための方法を提供し、この修飾核酸は、対象の標的細胞から欠損したタンパク質活性を置き換える。機能不全のタンパク質の具体的な例としては、嚢胞性線維症を引き起こすCFTRタンパク質の非機能的なタンパク質変異形を産生する、嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス調節因子(CFTR)遺伝子のナンセンス突然変異変異形が挙げられる。
細胞運命の調節
標的哺乳類細胞における細胞運命の変化を誘導する方法が提供される。標的哺乳類細胞は前駆体細胞であってもよく、変化は分化を系譜内に推進すること、またはそのような分化を遮断することを含み得る。あるいは、標的哺乳類細胞は分化細胞であってもよく、細胞運命変化は、脱分化を多能性前駆体細胞内に推進すること、または癌幹細胞への癌細胞の脱分化等のそのような脱分化を遮断することを含む。細胞運命の変化が望まれる状況において、細胞運命誘導性ポリペプチドをコードする有効量のmRNAが、細胞運命の変化が誘導されるような条件下で標的細胞に導入される。いくつかの実施形態において、修飾mRNAは、第1の表現型から第2の表現型へ細胞の亜集団を再プログラムするのに有用である。そのような再プログラミングは、一時的または永久的であってもよい。
さらに、本発明の方法は、高い効率のトランスフェクション、細胞を再トランスフェクトする能力、および標的細胞内で産生される組換えポリペプチドの量の妥当性によって、
人工多能性幹細胞(iPS細胞)を生成するのに特に有用である。さらに、本明細書に記載の方法を用いて生成されたiPS細胞の使用は、テラトーマ形成の低減された発生率を有することが予期される。
病原性生物の標的化;生物材料の精製
細胞増殖抑制性または細胞傷害性ポリペプチドをコードする修飾mRNAを用いて、細菌、酵母、原虫、蠕虫等の病原性微生物を標的とするための方法が本明細書に提供される。好ましくは、導入されるmRNAは、治療の見込まれるオフターゲット効果を低減させるために、標的病原性生物において排他的または優先的に翻訳された修飾ヌクレオシドまたは他の核酸配列修飾を含む。そのような方法は、血液、精液、卵子、ならびに胚、組織、および器官を含む移植材料を含む生体材料から病原性生物を除去するのに有用である。疾患細胞の標的化
細胞増殖抑制性または細胞傷害性ポリペプチドをコードする修飾mRNAを用いて、病原性細胞または疾患細胞、具体的には癌細胞を標的とするための方法が本明細書に提供される。好ましくは、導入されるmRNAは、治療の見込まれるオフターゲット効果を低減させるために、標的病原性生物において排他的または優先的に翻訳された修飾ヌクレオシドまたは他の核酸配列修飾を含む。あるいは、本発明は修飾mRNAを標的化して、標的病原性細胞に優先的に結合し、かつ進入することができる標的部分を提供する。
タンパク質産生
本明細書に提供される方法は、細胞培養プロセスにおけるタンパク質産物収率を向上させるのに有用であり得る。複数の宿主細胞を含有する細胞培養において、本明細書に記載の修飾mRNAの導入は、対応する未修飾核酸と比べて増加したタンパク質産生効率をもたらす。そのような増加したタンパク質産生効率は、例えば、増加した細胞トランスフェクション、核酸からの増加したタンパク質翻訳、減少した核酸分解、および/または低減された宿主細胞の自然免疫応答を示すことによって実証することができる。タンパク質産生はELISAによって測定することができ、タンパク質活性は当技術分野で既知の様々な機能的アッセイによって測定することができる。タンパク質産生は、連続的または流加(batch−fed)哺乳類プロセスにおいて生成され得る。
率的な標的細胞および細胞培養条件の選択により、その最適化を可能にする。そのような方法は、しばしば効率的なタンパク質産生を複雑化する状況である、ポリペプチドが1つ以上の翻訳後修飾を含有するか、または実質的な三次構造を有する場合に、特に有用である。
遺伝子サイレンシング
本明細書に記載の修飾mRNAは、細胞集団における1つ以上の標的遺伝子の発現を発現停止させる(すなわち、予防するか、または大幅に低減させる)ために有用である。配列特異的ヒストンH3メチル化を指示することができる目的とするポリペプチドをコードする修飾mRNAが、ポリペプチドが翻訳され、ヒストンH3メチル化および続いてヘテロクロマチン形成を介して標的遺伝子の遺伝子転写が低減されるような条件下の集団における細胞内に導入される。いくつかの実施形態において、サイレンシング機構は、哺乳類対象中に存在する細胞集団上で行われる。非限定的な例として、有用な標的遺伝子は、その中で哺乳類対象が、異常なキナーゼ活性の結果である骨髄増殖性疾患から被る変異体標的遺伝子を発現する、変異ヤヌスキナーゼ−2ファミリーメンバーである。
生体経路の調節
細胞内に導入される修飾mRNAの急速翻訳は、標的生体経路を調節する所望の機構を提供する。そのような調節には、所与の経路のアンタゴニズムまたはアゴニズムが含まれる。一実施形態において、核酸が細胞内に局在化され、組換えポリペプチドが、核酸から細胞内で翻訳されることができ、その組換えポリペプチドが、生体経路におけるポリペプチド機能の活性を阻害するような条件下で、細胞を、組換えポリペプチドをコードする核酸を含む有効量の組成物と接触させることによって、細胞内の生体経路を拮抗するための方法が、提供される。例示の生体経路は、多発性硬化症、関節リウマチ、乾癬、狼瘡エリテマトーデス、強直性脊椎炎、大腸炎、またはクローン病等の自己免疫または炎症性障害において欠損しているものである。特に、IL−12およびIL−23シグナル伝達経路のアンタゴニズムは、特に有用性がある(参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Kikly K,Liu L,Na S,Sedgwick JD(2006)Curr.Opin.Immunol.18(6):670−5)を参照のこと)。
カイン受容体CXCR−4およびCCR−5は、例えば、HIVが宿主細胞内に進入するために必要とされる(参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Arenzana−Seisdedos F et al,(1996)Nature.Oct 3;383(6599):400)。
細胞核酸送達
本発明の方法は、インビボ、エキソビボ、または培養内での細胞集団への核酸送達を促進する。例えば、複数の宿主細胞(例えば、酵母または哺乳類細胞等の真核細胞)を含有する細胞培養を、少なくとも1つのヌクレオシド修飾、および任意に翻訳可能領域を有するエンハンスド核酸を含有する組成物と接触させる。組成物はまた、一般的に、トランスフェクション試薬または宿主細胞へのエンハンスド核酸取り込みの効率を増加させる他の化合物を含有する。エンハンスド核酸は、対応する無修飾核酸と比べて細胞集団における強化された保持率を示す。エンハンスド核酸の保持率は無修飾核酸の保持率よりも大きい。いくつかの実施形態において、無修飾核酸の保持率よりも、少なくとも約50%、75%、90%、95%、100%、150%、200%、または200%以上大きい。そのような保持率の優位性は1回のエンハンスド核酸のトランスフェクションによって達成することができるか、または続くトランスフェクションの数回の繰り返しによって得ることができる。
IV.医薬組成物
製剤化、投与、送達、および投薬
本発明は、1つ以上の薬剤的に許容される賦形剤と組み合わせた修飾核酸、エンハンスド修飾RNA、およびリボ核酸RNAの組成物および複合体を提供する。医薬組成物は、任意に、1つ以上のさらなる活性物質、例えば、治療上および/または予防上活性物質を含んでもよい。医薬品の製剤および/または製造における一般の考慮事項は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Remington:The Science and Practice of Pharmacy 21st ed.,Lippincott Williams&Wilkins,2005において見出され得る。
達対象の修飾核酸、エンハンスド核酸、またはリボ核酸を指す。
製剤化
本発明のポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾RNA、およびリボ核酸は、:(1)安定性を増加させ、(2)細胞トランスフェクションを増加させ、(3)(例えば、修飾核酸、エンハンスド修飾RNA、またはリボ核酸のデポー製剤からの)持続放出もしくは遅延放出を可能にし、(4)生体分布を変化させ(例えば、修飾核酸、エンハンスド修飾RNA、またはリボ核酸の標的を特定の組織または細胞型に定める)、(5)コードされたタンパク質の翻訳をインビボで増加させ、かつ/または(6)コードされたタンパク質の放出プロファイルをインビボで変化させるために、1つ以上の賦形剤を用いて製剤化することができる。ありとあらゆる溶媒、分散媒体、希釈剤、または他の液体ビヒクル、分散もしくは懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘剤もしくは乳化剤、防腐剤等の伝統的な賦形剤に加えて、本発明の賦形剤は、制限なく、リピドイド、リポソーム、脂質ナノ粒子、ポリマー、リポプレックス、コア−シェルナノ粒子、ペプチド、タンパク質、ポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾RNA、またはリボ核酸(例えば、対象への移植のために)でトランスフェクトされた細胞、ヒアルロニダーゼ、ナノ粒子模倣体、およびこれらの組み合わせを含むことができる。
せる、ポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾RNA、またはリボ核酸による細胞トランスフェクションを増加させる、ポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾RNA、またはリボ核酸によりコードされるタンパク質の発現を増加させる、および/またはポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾RNA、またはリボ核酸によりコードされるタンパク質の放出プロファイルを変化させる量である。さらに、本発明の修飾核酸、エンハンスド修飾RNA、またはリボ核酸は、自己集合性核酸ナノ粒子を用いて製剤化されてもよい。
薬学的製剤は、所望される特定の剤形に適している、本明細書で使用されるときにありとあらゆる溶媒、分散媒体、希釈剤、または他の液体ビヒクル、分散もしくは懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘剤もしくは乳化剤、防腐剤等を含むが、これらに限定されない、薬剤的に許容される賦形剤をさらに含んでもよい。医薬組成物を製剤化するための種々の賦形剤および組成物を調製するための技法は、当技術分野で知られている(参照により本明細書に組み込まれる、Remington:The Science and Practice of Pharmacy,21st Edition,A.R.Gennaro,Lippincott,Williams&Wilkins,Baltimore,MD,2006を参照のこと)。任意の従来の賦形剤媒体が任意の望ましくない生体影響を引き起こすか、またはさもなければ医薬組成物の任意の他の構成成分(複数可)と有害な様態で相互作用するといった、物質またはその誘導体と不適合性である場合を除いて、その使用が本開示の範囲内で企図され得る。
リピドイド
リピドイドの合成が詳細に記載されており、これらの化合物を含有する製剤は、ポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾RNA、およびリボ核酸の送達に特に適している(これらすべてが参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、Mahon et al.,Bioconjug Chem.2010 21:1448−1454、Schroeder et al.,J Intern Med.2010 267:9−21、Akinc et al.,Nat Biotechnol.2008 26:561−569、Love et al.,Proc Natl Acad Sci USA.2010 107:1864−1869、Siegwart et al.,Proc Natl Acad Sci USA.2011108:12996−3001を参照のこと)。
、種々の手段によって投与することができる。
Acad Sci USA.2010 107:1864−1869およびLiu and Huang,Molecular Therapy.2010 669−670によって開示されている。リピドイド製剤は、ポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾RNA、およびリボ核酸に加えて、3つもしくは4つのいずれかまたはそれよりも多い構成成分を含む粒子を含むことができる。例として、ある特定のリピドイドを有する製剤は、98N12−5を含むが、これらに限定されず、42%リピドイド、48%コレステロール、および10%PEG(C14アルキル鎖長)を含有してもよい。別の例として、ある特定のリピドイドを有する製剤は、C12−200を含むが、これらに限定されず、50%リピドイド、10%ジステアロイルホスファチジル(disteroylphosphatidyl)コリン、38.5%コレステロール、および1.5%PEG−DMGを含有してもよい。
07:1864−1869を参照のこと)。別の実施形態において、MD1リピドイド含有製剤を用いて、インビボでポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾RNA、またはリボ核酸を肝細胞に有効に送達し得る。筋肉内または皮下経路のために最適化されたリピドイド製剤の特性は、標的細胞型、および製剤が細胞外マトリックスを介して血流中に拡散する能力に応じて大きく異なり得る。内皮窓(fenestrae)のサイズに起因して、150nm未満の粒径が有効な肝細胞送達のために所望され得るが(参照により全体が本明細書に組み込まれる、Akinc et al.,Mol Ther.2009 17:872−879を参照のこと)、製剤を、内皮細胞、骨髄細胞、および筋肉細胞を含むが、これらに限定されない他の細胞型に送達するためのリピドイド製剤化ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAの使用は、同様にサイズ制限されない場合がある。siRNAをインビボで骨髄細胞および内皮等の他の非肝細胞に送達するためのリピドイド製剤の使用が報告されている(参照により全体が本明細書に組み込まれる、Akinc et al.,Nat Biotechnol.2008 26:561−569、Leuschner et al.,Nat Biotechnol.2011 29:1005−1010、Cho et al.Adv.Funct.Mater.2009 19:3112−3118、8th International Judah Folkman Conference,Cambridge,MA October 8−9,2010を参照のこと)。単球等の骨髄細胞への有効な送達、リピドイド製剤は、同様の構成成分モル比を有し得る。リピドイドと、ジステアロイルホスファチジル(disteroylphosphatidyl)コリン、コレステロール、およびPEG−DMGを含むが、これらに限定されない他の構成成分との異なる比率を用いて、ポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾RNA、またはリボ核酸の製剤を、肝細胞、骨髄細胞、筋肉細胞等を含むが、これらに限定されない異なる細胞型への送達のために最適化し得る。例えば、構成成分モル比は、50%のC12−200、10%のジステアロイルホスファチジル(disteroylphosphatidyl)コリン、38.5%のコレステロール、および1.5%のPEG−DMGを含み得るが、これらに限定されない(参照により全体が本明細書に組み込まれる、Leuschner et al.,Nat Biotechnol 2011 29:1005−1010を参照のこと)。皮下送達または筋肉内送達のいずれかを介した、核酸の細胞(脂肪細胞および筋肉細胞等であるが、これらに限定されない)への局所送達のためのリピドイド製剤の使用は、全身送達に所望される製剤構成成分のすべてを必要とするわけではない場合があり、したがって、リピドイドおよびポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾RNA、またはリボ核酸のみを含んでもよい。
リポソーム、リポプレックス、および脂質ナノ粒子
本発明のポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾RNA、またはリボ核酸は、1つ以上のリポソーム、リポプレックス、または脂質ナノ粒子を用いて製剤化することができる。一実施形態において、ポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾RNA、またはリボ核酸の医薬組成物は、リポソームを含む。リポソームは、主に脂質二重層から構成され得、栄養素および薬学的製剤の投与のための送達ビヒクルとして使用され得る、人工的に調製された小胞である。リポソームは、直径数百ナノメートルであり得、かつ狭い水性の区画によって分離される一連の同心状二重層を含有し得る多層小胞(MLV)、直径50nmよりも小さい場合がある小さい単細胞小胞(SUV)、および直径50〜5
00nmであり得る大きい単層小胞(LUV)等であるが、これらに限定されない、異なるサイズのものであり得る。リポソーム設計は、不健康な組織へのリポソームの結合を改善するため、またはエンドサイトーシス等であるが、これらに限定されない事象を活性化するための、オプソニンまたはリガンドを含むが、これらに限定されない。リポソームは、薬学的製剤の送達を改善するために低pHまたは高pHを含有してもよい。
et al.Gene Therapy.1999 6:271−281、Zhang
et al.Gene Therapy.1999 6:1438−1447、Jeffs et al.Pharm Res.2005 22:362−372、Morrissey et al.,Nat Biotechnol.2005 2:1002−1007、Zimmermann et al.,Nature.2006 441:111−114、Heyes et al.J Contr Rel.2005 107:276−287、Semple et al.Nature Biotech.2010 28:172−176、Judge et al.J Clin Invest.2009 119:661−673、deFougerollesHum Gene Ther.2008 19:125−132を参照のこと)。Wheelerらによる元の製造方法は、洗浄剤透析法(detergent dialysis method)であり、それは後にJeffsらによって改善され、自発的小胞形成法(spontaneous
vesicle formation method)と称される。リポソーム製剤は、ポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾RNA、またはリボ核酸に加えて、3〜4つの脂質構成成分から構成される。例としてリポソームは、Jeffsらによって記載されるように、55%のコレステロール、20%のジステアロイルホスファチジル(disteroylphosphatidyl)コリン(DSPC)、10%のPEG−S−DSG、および15%の1,2−ジオレイルオキシ−N,N−ジメチルアミノプロパン(DODMA)を含有することができるが、これらに限定されない。別の例として、ある特定のリポソーム製剤は、Heyesらによって記載されるように、48%のコレステロール、20%のDSPC、2%のPEG−c−DMA、および30%のカチオン性脂質を含有してもよいが、これらに限定されず、このカチオン性脂質は、1,2−ジステアリルオキシ(distearloxy)−N,N−ジメチルアミノプロパン(DSDMA)、
DODMA、DLin−DMA、または1,2−ジリノレニルオキシ−3−ジメチルアミノプロパン(DLenDMA)であり得る。
一実施形態において、ポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾RNA、またはリボ核酸は、脂質−ポリカチオン複合体中に製剤化されてもよい。脂質−ポリカチオン複合体の形成は、当技術分野で既知の方法によって、および/または参照により全体が本明細書に組み込まれる米国公開第20120178702号に記載されるように遂行されてもよい。非限定的な例として、ポリカチオンには、ポリリジン、ポリオルニチン、および/またはポリアルギニン等であるが、これらに限定されないカチオン性ペプチドまたはポリペプチドが含まれてもよい。別の実施形態において、ポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾RNA、またはリボ核酸は、コレステロールまたはジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)等であるが、これらに限定されない中性脂質をさらに含み得る、脂質−ポリカチオン複合体中に製剤化されてもよい。
、かつ/またはPEG脂質の炭素鎖長がC14からC18に修飾されて、LNP製剤の薬物動態および/もしくは生体分布を変化させ得る。非限定的な例として、LNP製剤は、カチオン性脂質、DSPC、およびコレステロールと比較して、1〜5%の脂質モル比のPEG−c−DOMGを含有してもよい。別の実施形態において、PEG−c−DOMGは、PEG−DSG(1,2−ジステアロイル−sn−グリセロール、メトキシポリエチレングリコール)またはPEG−DPG(1,2−ジパルミトイル−sn−グリセロール、メトキシポリエチレングリコール)等であるが、これらに限定されないPEG脂質と置き換えられてもよい。カチオン性脂質は、DLin−MC3−DMA、DLin−DMA、C12−200、およびDLin−KC2−DMA等であるが、これらに限定されない、当技術分野で既知の任意の脂質から選択されてもよい。
エン−7−アミン、N,N−ジメチルヘプタコサン−10−アミン、(20Z,23Z)−N−エチル−N−メチルノナコサ−20J23−ジエン−10−アミン、1−[(11Z,14Z)−1−ノニルイコサ−11,14−ジエン−1−イル]ピロリジン、(20Z)−N,N−ジメチルヘプタコサ−20−エン−10−アミン、(15Z)−N,N−ジメチルエプタコサ(eptacos)−15−エン−10−アミン、(14Z)−N,N−ジメチルノナコサ−14−エン−10−アミン、(17Z)−N,N−ジメチルノナコサ−17−エン−10−アミン、(24Z)−N,N−ジメチルトリトリアコンタ−24−エン−10−アミン、(20Z)−N,N−ジメチルノナコサ−20−エン−10−アミン、(22Z)−N,N−ジメチルヘントリアコンタ−22−エン−10−アミン、(16Z)−N,N−ジメチルペンタコサ−16−エン−8−アミン、(12Z,15Z)−N,N−ジメチル−2−ノニルヘニコサ−12,15−ジエン−1−アミン、(13Z,16Z)−N,N−ジメチル−3−ノニルドコサ−13,16−ジエン−1−アミン、N,N−ジメチル−1−[(lS,2R)−2−オクチルシクロプロピル]エプタデカン(eptadecan)−8−アミン、1−[(1S,2R)−2−ヘキシルシクロプロピル]−N,N−ジメチルノナデカン−10−アミン、Ν,Ν−ジメチル−1−[(1S,2R)−2−オクチルシクロプロピル]ノナデカン−10−アミン、N,N−ジメチル−21−[(1S,2R)−2−オクチルシクロプロピル]ヘニコサン−10−アミン,Ν,Ν−ジメチル−1−[(1S,2S)−2−{[(1R,2R)−2−ペンチルシクロプロピル]メチル}シクロプロピル]ノナデカン−10−アミン,Ν,Ν−ジメチル−1−[(1S,2R)−2−オクチルシクロプロピル]ヘキサデカン−8−アミン、Ν,Ν−ジメチル−[(1R,2S)−2−ウンデシルシクロプロピル]テトラデカン−5−アミン、N,N−ジメチル−3−{7−[(1S,2R)−2−オクチルシクロプロピル]ヘプチル}ドデカン−1−アミン、1−[(1R,2S)−2−ヘプチルシクロプロピル]−Ν,Ν−ジメチルオクタデカン−9−アミン、1−[(1S,2R)−2−デシルシクロプロピル]−N,N−ジメチルペンタデカン−6−アミン、N,N−ジメチル−1−[(lS,2R)−2−オクチルシクロプロピル]ペンタデカン−8−アミン、R−N,N−ジメチル−1−[(9Z,12Z)−オクタデカ−9,12−ジエン−1−イルオキシ]−3−(オクチルオキシ)プロパン−2−アミン、S−N,N−ジメチル−1−[(9Z,12Z)−オクタデカ−9,12−ジエン−1−イルオキシ]−3−(オクチルオキシ)プロパン−2−アミン、1−{2−[(9Z,12Z)−オクタデカ−9,12−ジエン−1−イルオキシ]−1−[(オクチルオキシ)メチル]エチル}ピロリジン、(2S)−N,N−ジメチル−1−[(9Z,12Z)−オクタデカ−9,12−ジエン−1−イルオキシ]−3−[(5Z)−オクタ−5−エン−1−イルオキシ]プロパン−2−アミン、1−{2−[(9Z,12Z)−オクタデカ−9,12−ジエン−1−イルオキシ]−1−[(オクチルオキシ)メチル]エチル}アゼチジン、(2S)−1−(ヘキシルオキシ)−N,N−ジメチル−3−[(9Z,12Z)−オクタデカ−9,12−ジエン−1−イルオキシ]プロパン−2−アミン、(2S)−1−(ヘプチルオキシ)−N,N−ジメチル−3−[(9Z,12Z)−オクタデカ−9,12−ジエン−1−イルオキシ]プロパン−2−アミン、Ν,Ν−ジメチル−1−(ノニルオキシ)−3−[(9Z,12Z)−オクタデカ−9,12−ジエン−1−イルオキシ]プロパン−2−アミン、Ν,Ν−ジメチル−1−[(9Z)−オクタデカ−9−エン−1−イルオキシ]−3−(オクチルオキシ)プロパン−2−アミン(化合物9);(2S)−N,N−ジメチル−1−[(6Z,9Z,12Z)−オクタデカ−6,9,12−トリエン−1−イルオキシ]−3−(オクチルオキシ)プロパン−2−アミン、(2S)−1−[(11Z,14Z)−イコサ−11,14−ジエン−1−イルオキシ]−N,N−ジメチル−3−(ペンチルオキシ)プロパン−2−アミン、(2S)−1−(ヘキシルオキシ)−3−[(11Z,14Z)−イコサ−11,14−ジエン−1−イルオキシ]−N,N−ジメチルプロパン−2−アミン、1−[(11Z,14Z)−イコサ−11,14−ジエン−1−イルオキシ]−Ν,Ν−ジメチル−3−(オクチルオキシ)プロパン−2−アミン、1−[(13Z,16Z)−ドコサ−l3,16−ジエン−1−イルオキシ]−N,N−ジメチル
−3−(オクチルオキシ)プロパン−2−アミン、(2S)−1−[(13Z,16Z)−ドコサ−13,16−ジエン−1−イルオキシ]−3−(ヘキシルオキシ)−N,N−ジメチルプロパン−2−アミン、(2S)−1−[(13Z)−ドコサ−13−エン−1−イルオキシ]−3−(ヘキシルオキシ)−N,N−ジメチルプロパン−2−アミン、1−[(13Z)−ドコサ−13−エン−1−イルオキシ]−N,N−ジメチル−3−(オクチルオキシ)プロパン−2−アミン、1−[(9Z)−ヘキサデカ−9−エン−1−イルオキシ]−N,N−ジメチル−3−(オクチルオキシ)プロパン−2−アミン、(2R)−N,N−ジメチル−H(1−メトイルオクチル)オキシ]−3−[(9Z,12Z)−オクタデカ−9,12−ジエン−1−イルオキシ]プロパン−2−アミン、(2R)−1−[(3,7−ジメチルオクチル)オキシ]−N,N−ジメチル−3−[(9Z,12Z)−オクタデカ−9,12−ジエン−1−イルオキシ]プロパン−2−アミン、N,N−ジメチル−1−(オクチルオキシ)−3−({8−[(1S,2S)−2−{[(1R,2R)−2−ペンチルシクロプロピル]メチル}シクロプロピル]オクチル}オキシ)プロパン−2−アミン、N,N−ジメチル−1−{[8−(2−オクチルシクロプロピル)オクチル]オキシ}−3−(オクチルオキシ)プロパン−2−アミン、および(11E,20Z,23Z)−N;N−ジメチルノナコサ−11,20,2−トリエン−10−アミン、またはそれらの薬剤的に許容される塩もしくは立体異性体から選択されてもよい。
al.,Nonviral delivery of self−amplifying RNA vaccines,PNAS 2012;PMID:22908294を参照のこと)。
一実施形態において、免疫応答が、ナノ化学種、ポリマー、および免疫原を含み得る脂質ナノ粒子を送達することによって、誘発され得る。(各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、米国公開第20120189700号および国際公開第WO2012099805号)。ポリマーは、ナノ化学種をカプセル封入しても、ナノ化学種を部分的にカプセル封入してもよい。免疫原は、本明細書に記載の組換えタンパク質、修飾RNAであってもよい。一実施形態において、脂質ナノ粒子は、病原体に対するもの等であるが、これらに限定されないワクチンにおいて使用するために製剤化されてもよい。
去され得る。低分子量ポリエチレングリコール(PEG)で密にコーティングされた大きいポリマーナノ粒子(直径200nm〜500nm)は、水中で拡散している同じ粒子よりもわずか4〜6倍低く、粘液を通って拡散した(各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、Lai et al.PNAS 2007 104(5):1482−487、Lai et al.Adv Drug Deliv Rev.2009 61(2):158−171)。ナノ粒子の輸送は、蛍光退色後回復測定(FRAP)および高解像度多数粒子追跡(MPT)を含むが、これらに限定されない、透過速度および/または蛍光顕微鏡技法を用いて決定され得る。
コポリマーでコーティングされるか、またはそれと会合されてもよい。コポリマーは、一般に安全と認められる(GRAS)ポリマーであってもよく、脂質ナノ粒子の形成は、新たな化学実体が何ら作り出されないような方式であってもよい。例えば、脂質ナノ粒子は、新たな化学実体を形成することなく、依然としてヒト粘液に急速に透過可能である、ポロキサマーコーティングPLGAナノ粒子を含んでもよい(参照により全体が本明細書に組み込まれる、Yang et al.Angew.Chem.Int.Ed.2011
50:2597−2600)。
et al.Int J Clin Pharmacol Ther 2012 50:76−78、Santel et al.,Gene Ther 2006 13:1
222−1234、Santel et al.,Gene Ther 2006 13:1360−1370、Gutbier et al.,Pulm Pharmacol.Ther.2010 23:334−344、Kaufmann et al.Microvasc Res 2010 80:286−293Weide et al.J Immunother.2009 32:498−507、Weide et al.J
Immunother.2008 31:180−188、Pascolo Expert Opin.Biol.Ther.4:1285−1294、Fotin−Mleczek et al.,2011 J.Immunother.34:1−15、Song et al.,Nature Biotechnol.2005,23:709−717、Peer et al.,Proc Natl Acad Sci USA.2007 6;104:4095−4100、deFougerollesHum Gene
Ther.2008 19:125−132)。
Biotechnol.2005 23:709−717、Judge et al.,J Clin Invest.2009 119:661−673、Kaufmann
et al.,Microvasc Res 2010 80:286−293、Santel et al.,Gene Ther 2006 13:1222−1234、Santel et al.,Gene Ther 2006 13:1360−1370、Gutbier et al.,Pulm Pharmacol.Ther.2010 23:334−344、Basha et al.,Mol.Ther.2011 19:2186−2200、Fenske and Cullis,Expert Opin Drug Deliv.2008 5:25−44、Peer et al.,Science.2008 319:627−630、Peer and Lieberman,Gene Ther.2011 18:1127−1133)。肝臓細胞に対する製剤の受動的な標的化の一例としては、DLin−DMA、DLin−KC2−DMA、およびMC3ベースの脂質ナノ粒子製剤が挙げられ、それらはアポリポタンパク質Eに結合し、インビボでこれらの製剤の結合および肝細胞中への取り込みを促進することが示されている(参照により全体が本明細書に組み込まれる、Akinc et al.Mol
Ther.2010 18:1357−1364)。製剤は、葉酸塩、トランスフェリン、N−アセチルガラクトサミン(GalNAc)、および抗体で標的を定めるアプローチにより例として示されるが、これらによって限定されない、それらの表面上の異なるリガンドの発現を介して選択的に標的を定めることもできる(すべてが参照により全体が本明細書に組み込まれる、Kolhatkar et al.,Curr Drug Discov Technol.2011 8:197−206、Musacchio and Torchilin,Front Biosci.2011 16:1388−1412、Yu et al.,Mol Membr Biol.2010 27:286−298、Patil et al.,Crit Rev Ther Drug Carrier Syst.2008 25:1−61、Benoit et al.,Biomacromolecules.2011 12:2708−2714、Zhao et al.,Expert Opin Drug Deliv.2008 5:309−319、Akinc et al.,Mol Ther.2010 18:1357−1364、Srinivasan et al.,Methods Mol Biol.2012 820:105−116、Ben−Arie et al.,Methods Mol Biol.2012 757:497−507、Peer 2010 J Control Release.20:63−68、Peer et al.,Proc Na
tl Acad Sci USA.2007 104:4095−4100、Kim et al.,Methods Mol Biol.2011 721:339−353、Subramanya et al.,Mol Ther.2010 18:2028−2037、Song et al.,Nat Biotechnol.2005 23:709−717、Peer et al.,Science.2008 319:627−630、Peer and Lieberman,Gene Ther.2011 18:1127−1133)。
al.,ACS Nano,2008,2(8),pp 1696−1702を参照のこと)。
薬組成物または化合物を指す。一定期間は、数時間、数日間、数週間、数ヶ月間、および数年間を含んでもよいが、これらに限定されない。非限定的な例として、持続放出ナノ粒子は、ポリマー、ならびに本発明のポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾RNA、またはリボ核酸等であるが、それらに限定されない治療剤を含んでもよい(各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第2010075072号、ならびに米国公開第US20100216804号、および同第US20110217377号を参照のこと)。
酸)、ポリ(メタクリル酸)、ポリシアノアクリレート、ならびにこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
一実施形態において、治療的ナノ粒子は、ポリリジン、ポリエチレンイミン、ポリ(アミドアミン)デンドリマー、およびこれらの組み合わせ等であるが、これらに限定されない少なくとも1つのアミン含有ポリマーを含んでもよい。
一実施形態において、治療的ナノ粒子は、水溶液中で製剤化されてもよく、それを用いて癌を標的としてもよい(各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第WO2011084513号および米国公開第US20110294717号を参照のこと)。
核酸を放出するように製剤化されてもよい(各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第WO2010138193号、および同第WO2010138194号、ならびに米国公開第US20110020388号、および同第US20110027217号を参照のこと)。
ポリマー、生分解性ナノ粒子、およびコア−シェルナノ粒子
本発明のポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾RNA、またはリボ核酸は、天然および/または合成ポリマーを用いて製剤化することができる。送達に使用され得るポリマーの非限定的な例としては、MIRUS(登録商標)Bio(ウィスコンシン州マディソン)およびRoche Madison(ウィスコンシン州マディソン)によるDynamic POLYCONJUGATETM製剤、制限なく、SMARTT POLYMER TECHNOLOGY(商標)(ワシントン州シアトル)等のPHASERX(商標)ポリマー製剤、DMRI/DOPE、ポロキサマー、Vical(カリフォルニ
ア州サンディエゴ)によるVAXFECTIN(登録商標)アジュバント、キトサン、Calando Pharmaceuticals(カリフォルニア州パサデナ)によるシクロデキストリン、デンドリマーおよびポリ(乳酸−co−グリコール酸)(PLGA)ポリマー、RONDEL(商標)(RNAi/オリゴヌクレオチドナノ粒子送達)ポリマー(Arrowhead Research Corporation、カリフォルニア州パサデナ)、ならびにPHASERX(商標)(ワシントン州シアトル)等であるが、これらに限定されないpH応答性ブロックコポリマー(co−block polymers)が挙げられる。
ハンスド修飾RNA、またはリボ核酸の安定性を増加させ得る。生分解性ポリマーが、修飾核酸、エンハンスド修飾RNA、またはリボ核酸以外の核酸を分解から保護するために以前に使用されており、インビボでペイロードの持続放出をもたらすことが示されている(参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Rozema et al.,Proc Natl Acad Sci USA.2007 104:12982−12887、Sullivan et al.,Expert Opin Drug Deliv.2010 7:1433−1446、Convertine et al.,Biomacromolecules.2010 Oct 1、Chu et al.,Acc Chem Res.2012 Jan 13、Manganiello et al.,Biomaterials.2012 33:2301−2309、Benoit et al.,Biomacromolecules.2011 12:2708−2714、Singha et al.,Nucleic Acid Ther.2011 2:133−147、deFougerolles Hum Gene Ther.2008 19:125−132、Schaffert and Wagner,Gene Ther.2008 16:1131−1138、Chaturvedi et al.,Expert Opin Drug Deliv.2011 8:1455−1468、Davis、Mol Pharm.2009 6:659−668、Davis,Nature 2010 464:1067−1070)。
発現を介して選択的に標的を定めることもできる(各々が参照により全体が本明細書に組み込まれる、Benoit et al.,Biomacromolecules.2011 12:2708−2714、Rozema et al.,Proc Natl Acad Sci USA.2007 104:12982−12887、Davis,Mol Pharm.2009 6:659−668、Davis,Nature 2010 464:1067−1070)。
ポリアミン誘導体を含んでもよい。
記載の方法を用いて作製されてもよい。PAGAポリマーは、共重合して、ポリ−L−リジン、ポリアルギン(polyargine)、ポリオルニチン、ヒストン、アビジン、プロタミン、ポリラクチド、およびポリ(ラクチド−co−グリコリド)等であるが、これらに限定されないポリマーとともにコポリマーまたはブロックコポリマーを形成してもよい。生分解性架橋カチオン性マルチブロックコポリマーは、当技術分野で既知の方法、ならびに/または各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第8,057,821もしくは米国公開第2012009145号に記載の方法によって作製されてもよい。例えば、マルチブロックコポリマーは、分岐状ポリエチレンイミンと比較して明確に異なるパターンを有する線状ポリエチレンイミン(LPEI)ブロックを用いて合成されてもよい。さらに、組成物または医薬組成物は、当技術分野で既知の方法、本明細書に記載の方法、または各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、米国公開第20100004315号もしくは米国特許第6,267,987号および同第6,217,912号に記載の方法によって作製されてもよい。
リ(リジン)、ポリ(ヒスチジン)、ポリ(アルギニン)、カチオン化ゼラチン、デンドリマー、キトサン、1,2−ジオレオイル−3−トリメチルアンモニウム−プロパン(DOTAP)、N−[1−(2,3−ジオレオイルオキシ)プロピル]−N,N,N−トリメチルアンモニウムクロリド(DOTMA)、1−[2−(オレオイルオキシ)エチル]−2−オレイル−3−(2−ヒドロキシエチル)イミダゾリニウムクロリド(DOTIM)、2,3−ジオレイルオキシ−N−[2(スペルミンカルボキサミド)エチル]−N,N−ジメチル−1−プロパンアミニウムトリフルオロ酢酸塩(DOSPA)、3B−[N−(N’,N’−ジメチルアミノエタン)−カルバモイル]コレステロール塩酸塩(DC−コレステロールHCl)ジヘプタデシルアミドグリシルスペルミジン(DOGS)、N,N−ジステアリル−N,N−ジメチルアンモニウムブロミド(DDAB)、N−(1,2−ジミリスチルオキシプロパ−3−イル)−N,N−ジメチル−N−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド(DMRIE)、N,N−ジオレイル−N,N−ジメチル塩化アンモニウムDODAC)、およびこれらの組み合わせが含まれてもよいが、これらに限定されない。
al.,Biomaterials.2008 29:1526−1532、DeKoker et al.,Adv Drug Deliv Rev.2011 63:748−761、Endres et al.,Biomaterials.2011 32:7721−7731、Su et al.,Mol Pharm.2011 Jun 6;8(3):774−87)。
Ther.2012 20:609−615)。この送達系は、siRNAの送達を改善するために、標的を定めたナノ粒子と、エンドソームからの脱出を向上させるための構成成分リン酸カルシウムとの両方を組み合わせる。
ナノ粒子を形成してもよい。PEG電荷変換型ポリマーは、酸性pHでポリカチオンへと切断され、それ故に、エンドソームからの脱出を向上させることによって、PEG−ポリアニオンブロックコポリマーを改善し得る。
50:7027−7031)。
ペプチドおよびタンパク質
本発明のポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾RNA、またはリボ核酸は、修飾核酸、エンハンスド修飾RNA、またはリボ核酸による細胞のトランスフェクションを増加させるために、ペプチドおよび/またはタンパク質とともに製剤化することができる。一実施形態において、細胞透過性ペプチドならびに細胞内送達を可能にするタンパク質およびペプチド等であるが、これらに限定されないペプチドを用いて、薬学的製剤を送達してもよい。本発明の薬学的製剤とともに使用され得る細胞透過性ペプチドの非限定的な例としては、細胞内空間への送達を容易にする、ポリカチオンに結合した細胞透過性ペプチド配列、例えば、HIV由来TATペプチド、ペネトラチン、トランスポータン、またはhCT由来細胞透過性ペプチドである(例えば、参照により全体が本明細書に組み込まれる、Caron et al.,Mol.Ther.3(3):310−8(2001)、Langel,Cell−Penetrating Peptides:Processes and Applications(CRC Press,Boca Raton FL,2002)、El−Andaloussi et al.,Curr.Pharm.Des.11(28):3597−611(2003)、およびDeshayes et al.,Cell.Mol.Life Sci.62(16):1839−49(2005)を参照のこと)。組成物は、組成物の細胞内空間への送達を向上させる細胞透過性薬剤、例えば、リポソームを含むように製剤化することもできる。本発明の修飾核酸、エンハンスド修飾RNA、またはリボ核酸は、細胞内送達を可能にするために、Aileron Therapeutics(マサチューセッツ州ケンブリッジ)およびPermeon Biologics(マサチューセッツ州ケンブリッジ)によるペプチドおよび/またはタンパク質等であるが、これらに限定されない、ペプチドおよび/またはタンパク質に複合体形成されてもよい(すべてが参照により全体が本明細書に組み込まれる、Cronican et al.,ACS Chem.Biol.2010 5:747−752、McNaughton et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2009 106:6111−6116、Sawyer,Chem Biol Drug Des.2009 73:3−6、Verdine and Hilinski,Methods Enzymol.2012;503:3−33)。
タンパク質結合パートナーを含み得る。本明細書で使用されるとき、「タンパク質結合パートナー」には、抗体およびその機能的断片、足場タンパク質、またはペプチドが含まれるが、これらに限定されない。細胞透過性ポリペプチドは、タンパク質結合パートナーのための細胞内結合パートナーをさらに含み得る。細胞透過性ポリペプチドは、修飾核酸、エンハンスド修飾RNA、リボ核酸が導入され得る細胞から分泌されることが可能であり得る。
細胞
本発明のポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾RNA、またはリボ核酸は、エクスビボで細胞中にトランスフェクトすることができ、それがその後、対象に移植される。非限定的な例として、医薬組成物は、修飾RNAを肝臓および骨髄細胞に送達するための赤血球、修飾RNAをウイルス様粒子(VLP)中で送達するためのビロソーム、ならびにMAXCYTE(登録商標)(メリーランド州ゲイザースバーグ)による細胞、およびERYTECH(登録商標)(フランス、リヨン)による細胞等であるが、これらに限定されない、修飾RNAを送達するためのエレクトロポレーション処理された細胞を含んでもよい。ポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾RNA、またはリボ核酸以外のペイロードを送達するための赤血球、ウイルス粒子、およびエレクトロポレーション処理された細胞の使用例が、文書化されている(すべてが参照により全体が本明細書に組み込まれる、Godfrin et al.,Expert Opin Biol Ther.2012 12:127−133、Fang et al.,Expert Opin Biol Ther.2012 12:385−389、Hu et al.,Proc Natl Acad Sci USA.2011 108:10980−10985、Lund et al.,Pharm Res.2010 27:400−420、Huckriede et al.,J Liposome Res.2007;17:39−47、Cusi,Hum Vaccin.2006 2:1−7、de Jonge et al.,Gene Ther.2006 13:400−411)。修飾RNAは、各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる国際公開第WO2011085231号および米国公開第20110171248号に記載の方法によって合成される合成VLP中で送達されてもよい。
細胞内への導入
ウイルスおよび非ウイルス媒介性技法を含む、核酸の細胞内への導入に好適である多様な方法が当技術分野で知られている。典型的な非ウイルス媒介性技法の例としては、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム媒介性移入、ヌクレオフェクション、ソノポレーション、熱ショック、マグネトフェクション、リポソーム媒介性移入、マイクロインジェクション、マイクロプロジェクタイル媒介性移入(ナノ粒子)、カチオン性ポリマー媒介性移入(DEAE−デキストラン、ポリエチレンイミン、ポリエチレングリコール(PEG)等)、または細胞融合が挙げられるが、これらに限定されない。
めに音(例えば、超音波周波数)を使用するものである。ソノポレーション法は、当業者に知られており、例えば、それが細菌に関する場合には、米国特許公開第20100196983号において、それが他の細胞型に関する場合には、例えば、米国特許公開20100009424号において教示され、これらの各々は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。
ヒアルロニダーゼ
本発明のポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾RNA,またはリボ核酸の筋肉内または皮下局所注入は、ヒアルロナンの加水分解を触媒する、ヒアルロニダーゼを含むことができる。介在性の関門の構成物質であるヒアルロナンの加水分解を触媒することによって、ヒアルロニダーゼは、ヒアルロナンの粘度を低下させて、それによって組織透過性を増加させる(参照により全体が本明細書に組み込まれる、Frost,Expert Opin.Drug Deliv.(2007)4:427−440)。それらの分散およびトランスフェクトされた細胞によって産生されるコードされたタンパク質の全身への分布を加速することが有用である。あるいは、ヒアルロニダーゼを用いて、筋肉内にまたは皮下に投与された本発明のポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾RNA、またはリボ核酸に曝露される細胞の数を増加させることができる。
ナノ粒子模倣体
本発明のポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾RNA、またはリボ核酸は、ナノ粒子模倣体内にカプセル封入されかつ/またはそれに吸収され得る。ナノ粒子模倣体は、病原体、ウイルス、細菌、真菌、寄生虫、プリオン、および細胞等であるが、これらに限定されない、生物または粒子の送達機能を模倣することができる。非限定的な例として、本発明のポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾RNA、またはリボ核酸は、ウイルスの送達機能を模倣することができる非バイロン(viron)粒子中にカプセル封入されてもよい(参照により全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第WO2012006376号を参照のこと)。
ナノチューブ
本発明のポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾RNA、またはリボ核酸は、ロゼットナノチューブ、リンカーを用いたツイン塩基(twin bases)を有するロゼットナノチューブ、カーボンナノチューブおよび/または単層カーボンナノチューブ等であるが、これらに限定されない、少なくとも1つのナノチューブに付着または結合され得る。ポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾RNA、またはリボ核酸は、立体(steric)力、イオン力、共有結合力、および/または他の力等であるが、これらに限定されない力を介してナノチューブに結合され得る。
あるが、これらに限定されないポリマーを含む送達向上化合物でコーティングされてもよい。別の実施形態において、少なくとも1つのナノチューブおよび/または修飾mRNAは、薬剤的に許容される賦形剤および/または送達ビヒクルと混合されてもよい。
複合体
本発明のポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾RNA、またはリボ核酸は、担体もしくは標的化基に共有結合された、または一緒に融合タンパク質を産生する2つのコード領域を含む(例えば、標的化基および治療的タンパク質またはペプチドを担持する)、修飾核酸、エンハンスド修飾RNA、またはリボ核酸等の複合体を含む。
2,830号、同第5,112,963号、同第5,214,136号、同第5,245,022号、同第5,254,469号、同第5,258,506号、同第5,262,536号、同第5,272,250号、同第5,292,873号、同第5,317,098号、同第5,371,241号、同第5,391,723号、同第5,416,203号、同第5,451,463号、同第5,510,475号、同第5,512,667号、同第5,514,785号、同第5,565,552号、同第5,567,810号、同第5,574,142号、同第5,585,481号、同第5,587,371号、同第5,595,726号、同第5,597,696号、同第5,599,923号、同第5,599,928号および同第5,688,941号、同第6,294,664号、同第6,320,017号、同第6,576,752号、同第6,783,931号、同第6,900,297号、同第7,037,646号が含まれるが、これらに限定されない。
MAPキナーゼの活性化因子であり得る。
Santarisによるもの等のロックト核酸(LNA)の調製を教示する、代表的な米国特許には、各々が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第6,268,490号、同第6,670,461号、同第6,794,499号、同第6,998,484号、同第7,053,207号、同第7,084,125号、および同第7,399,845号が含まれるが、これらに限定されない。
知られる)、すなわち、2’−O−−CH2−−O−−CH2−−N(CH2)2である。他の修飾は、2’−メトキシ(2’−OCH3)、2’−アミノプロポキシ(2’−OCH2CH2CH2NH2)、および2’−フルオロ(2’−F)を含む。同様の修飾は、他の位置、特に3’末端ヌクレオチド上の糖の3’位で、または2’−5’結合dsRNAにおいて、および5’末端ヌクレオチドの5’位で行われてもよい。本発明のポリヌクレオチドは、ペントフラノシル糖の代わりに、シクロブチル部分等の糖模倣体を有してもよい。そのような修飾糖構造の調製を教示する代表的な米国特許には、各々が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第4,981,957号、同第5,118,800号、同第5,319,080号、同第5,359,044号、同第5,393,878号、同第5,446,137号、同第5,466,786号、同第5,514,785号、同第5,519,134号、同第5,567,811号、同第5,576,427号、同第5,591,722号、同第5,597,909号、同第5,610,300号、同第5,627,053号、同第5,639,873号、同第5,646,265号、同第5,658,873号、同第5,670,633号、および同第5,700,920号が含まれるが、これらに限定されない。
自己集合性核酸ナノ粒子
自己集合性ナノ粒子は、核酸鎖が容易にリプログラミング可能であり得るように精密に制御され得る、明確に定義されたサイズを有する。例えば、20nm超の直径が、向上した透過性および保持効果により腎クリアランスを回避し、ある特定の腫瘍への送達を向上させるため、癌標的化ナノ送達担体のために最適な粒径は、20〜100nmである。自己集合性核酸ナノ粒子を用いて、向上した送達のために癌標的化リガンドの精密に制御された空間定位および密度を有する、サイズおよび形が均一な単一の集団。非限定的な例として、オリゴヌクレオチドナノ粒子が、短いDNA断片および治療的siRNAのプログラミング可能な自己集合を用いて調製された。これらのナノ粒子は、制御可能な粒径ならびに標的リガンド箇所および密度を有して、分子的に同一である。DNA断片およびsiRNAは、1ステップ反応へと自己集合して、標的を定めたインビボ送達のためにDNA/siRNA四面体ナノ粒子を生成した。(Lee et al.,Nature Nanotechnology 2012 7:389−393)。
賦形剤
薬学的製剤は、本明細書で使用されるとき、所望される特定の剤形に適している、ありとあらゆる溶媒、分散媒体、希釈剤、または他の液体ビヒクル、分散もしくは懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘剤もしくは乳化剤、防腐剤、固体結合剤、滑沢剤等を含む、薬剤的に許容される賦形剤をさらに含んでもよいが、これらに限定されない。医薬組成物を製剤化するための様々な賦形剤、およびその組成物を調製する技術は、当該技術分野において既知である(参照により本明細書に組み込まれる、Remington:The Science and Practice of Pharmacy,21st Edition,A.R.Gennaro,Lippincott,Williams & Wilkins,Baltimore,MD,2006を参照のこと)。従来の賦形剤媒体の使用は、任意の従来の賦形剤媒体が任意の望ましくない生体影響を引き起こし得るか、またはさもなければ医薬組成物の任意の他の構成成分(複数可)と有害な様態で相互作用するといった、物質またはその誘導体と不適合性である場合を除いて、本開示の範囲内で企図される。
くとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%純粋であり得る。いくつかの実施形態において、賦形剤は、ヒトにおける使用および獣医学的使用に対して認可され得る。いくつかの実施形態において、賦形剤は、米国食品医薬品局(United States Food and Drug Administration)によって認可され得る。いくつかの実施形態において、賦形剤は、医薬品等級である。いくつかの実施形態において、賦形剤は、米国薬局方(United States Pharmacopoeia(USP))、欧州薬局方(European Pharmacopoeia(EP))、英国薬局方(British Pharmacopoeia)、および/または国際薬局方(International Pharmacopoeia)の基準を満たし得る。
monostearate)、ジステアリン酸エチレングリコール、モノステアリン酸グリセリル、およびモノステアリン酸プロピレングリコール、ポリビニルアルコール)、カルボマー(例えば、カルボキシポリメチレン、ポリアクリル酸、アクリル酸ポリマー、およびカルボキシビニルポリマー)、カラギーナン、セルロース誘導体(例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、粉末化セルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース)、ソルビタン脂肪酸エステル(例えば、モノラウリル酸ポリオキシエチレンソルビタン
[TWEEN(登録商標)20]、ポリオキシエチレンソルビタン[TWEEN(登録商標)60]、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン[TWEEN(登録商標)80]、モノパルミチン酸ソルビタン[SPAN(登録商標)40]、モノステアリン酸ソルビタン[Span(登録商標)60]、トリステアリン酸ソルビタン[Span(登録商標)65]、モノオレイン酸グリセリル、モノオレイン酸ソルビタン[SPAN(登録商標)80])、ポリオキシエチレンエステル(例えば、モノステアリン酸ポリオキシエチレン[MYRJ(登録商標)45]、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリエトキシル化(polyethoxylated)ヒマシ油、ステアリン酸ポリオキシメチレン、およびSOLUTOL(登録商標))、ショ糖脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル(例えば、CREMOPHOR(登録商標))、ポリオキシエチレンエーテル、(例えば、ポリオキシエチレンラウリルエーテル[BRIJ(登録商標)30])、ポリ(ビニル−ピロリドン)、モノラウリル酸ジエチレングリコール、オレイン酸トリエタノールアミン、オレイン酸ナトリウム、オレイン酸カリウム、オレイン酸エチル、オレイン酸、ラウリル酸エチル、ラウリル硫酸ナトリウム、PLUORINC(登録商標)F 68、POLOXAMER(登録商標)188、臭化セトリモニウム、塩化セチルピリジニウム、塩化ベンザルコニウム、ドキュセートナトリウム等、ならびに/またはこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
、および/またはソルビン酸が含まれるが、これらに限定されない。例示のアルコール防腐剤には、エタノール、ポリエチレングリコール、フェノール、フェノール系化合物、ビスフェノール、クロロブタノール、ヒドロキシ安息香酸塩、および/またはフェニルエチルアルコールが含まれるが、これらに限定されない。例示の酸性防腐剤には、ビタミンA、ビタミンC、ビタミンE、β−カロテン、クエン酸、酢酸、ジヒドロ酢酸、アスコルビン酸、ソルビン酸、および/またはフィチン酸が含まれるが、これらに限定されない。他の防腐剤には、トコフェロール、酢酸トコフェロール、メシル酸デテロキシム(deteroxime mesylate)、セトリミド、ブチル化ヒドロキシアニソール(BHA)、ブチル化ヒドロキシトルエン(hydroxytoluened)(BHT)、エチレンジアミン、ラウリル硫酸ナトリウム(SLS)、ラウリルエーテル硫酸ナトリウム(SLES)、重亜硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、メタ重亜硫酸カリウム、GLYDANT PLUS(登録商標)、PHENONIP(登録商標)、メチルパラベン、GERMALL(登録商標)115、GERMABEN(登録商標)II、NEOLONE(商標)、KATHON(商標)、および/またはEUXYL(登録商標)が含まれるが、これらに限定されない。
送達
本開示は、薬物送達の科学進展の見込みを考慮した任意の適切な経路による、治療目的、薬学目的、診断目的、または撮像目的のうちのいずれのためのポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾RNA、またはリボ核酸の送達をも包含する。送達は、ネイキッドであっても製剤化されてもよい。
ネイキッド送達
本発明のポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾RNA、またはリボ核酸は、ネイキッドで細胞に送達されてもよい。本明細書で使用されるとき、「ネイキッド」とは、トランスフェクションをエンハンスドする薬剤を用いずにポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾RNA、またはリボ核酸を送達することを指す。例えば、細胞に送達されるポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾RNA、またはリボ核酸は、修飾を全く含有しない場合がある。ネイキッドポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾RNA、またはリボ核酸は、細胞に、当技術分野で既知であり、かつ本明細書に記載の投与経路を用いて送達されてもよい。
製剤化された送達
本発明のポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾RNA、またはリボ核酸は、本明細書に記載の方法を用いて製剤化されてもよい。製剤は、修飾されているかつ/または修飾されていない場合があるポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾RNA、またはリボ核酸を含有してもよい。製剤は、細胞透過剤、薬剤的に許容される担体、送達剤、生崩壊性または生体適合性ポリマー、溶媒、および持続放出送達デポーをさらに含むことができるが、これらに限定されない。製剤化されたポリヌクレオチド、修飾核酸、またはエンハンスド修飾RNAは、細胞に、当技術分野で既知であり、かつ本明細書に記載の投与経路を用いて送達されてもよい。
またはそれらの修飾された類似体(例えば、スペルミン修飾ペプチドもしくはタンパク質)、またはそれらの組み合わせを、リボ核酸と混合させ、複合体化させて、随意にトランスフェクション剤と混合されている細胞中に導入し、得られた混合物を使用して、細胞をトランスフェクトする。さらに、トランスフェクション剤(例えば、脂質、陽イオン性脂質、またはデンドリマー)の構成成分を、選択したペプチド、タンパク質、またはタンパク質断片と、直接、または結合もしくはスペーサー基を介して共有結合で複合体化させる。融合性、膜透過性、運送性または輸送性であるペプチドまたはタンパク質が、この実施形態における特定の目的であるか、または細胞標的化のために機能する。ペプチドまたはタンパク質トランスフェクション剤複合体はリボ核酸と結合させられ、トランスフェクションのために用いられる。
投与
本発明のポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾RNA、またはリボ核酸は、治療上有効成果をもたらす任意の経路によって投与されてもよい。これらには、経腸、経胃腸、硬膜外、経口、経皮、硬膜外(硬膜上)、脳内(大脳の中へ)、脳室内(脳室の中へ)、皮膚上(皮膚上への適用)、皮内、(皮膚自体の中へ)、皮下(皮膚の下)、経鼻投与(鼻を介して)、静脈内(静脈の中へ)、動脈内(動脈の中へ)、筋肉内(筋肉の中へ)、心臓内(心臓の中へ)、骨内輸注(骨髄の中へ)、髄腔内(脊柱管の中へ)、腹腔内(腹腔の中への輸注または注入)、膀胱内輸注、硝子体内(眼を介して)、空洞内注入(陰茎基部の中へ)、膣内投与、子宮内、羊膜外投与、経皮(全身への分布のための無傷の皮膚(intact skin)を介した拡散)、経粘膜(粘膜を介した拡散)、ガス注入(鼻からの吸引)、舌下、口唇下、浣腸、点眼(結膜上に)、または点耳におけるもの含まれるが、これらに限定されない。
されたリボ核酸が進入できる細胞を含む周辺組織へと操作されたリボ核酸の拡散を持続させることができる大きさまで、架橋マトリクスタンパク質のマトリクスの効果的な孔径を変化させる。
非経口および注入による投与
経口投与および非経口投与のための液体剤形には、薬剤的に許容されるエマルション、マイクロエマルション、溶液、懸濁液、シロップ、および/またはエリキシルが含まれるが、これらに限定されない。活性成分に加えて、液体剤形は、例えば、水または他の溶媒、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、ベンジル安息香酸塩、プロピレングリコール、1,3−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油(具体的には、綿実油、ラッカセイ油、トウモロコシ、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、およびゴマ油)、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ソルビタンのポリエチレングリコールおよび脂肪酸エステル等の可溶化剤および乳化剤、ならびにこれらの混合物等の、当技術分野で一般的に使用される不活性希釈剤を含んでもよい。不活性希釈剤の他に、経口組成物は、湿潤剤、乳化剤および懸濁化剤、甘味剤、香味剤、および/または芳香剤等のアジュバントを含むことができる。非経口投与のためのある特定の実施形態において、組成物は、CREMOPHOR(登録商標)、アルコール、油、変性油、グリコール、ポリソルベート、シクロデキストリン、ポリマー、および/またはこれらの組み合わせ等の可溶化剤と混合される。
直腸および膣内投与
直腸または膣内投与のための組成物は、典型的に坐剤であり、それは組成物を、周囲温度では固体であるが、体温では液体であり、したがって直腸または膣腔で溶解して活性成分を放出する、ココアバター、ポリエチレングリコール、または坐剤ワックス等の好適な非刺激性賦形剤と混合することによって調製することができる。
経口投与
経口投与のための固体剤形には、カプセル、錠剤、丸薬、粉剤、および顆粒が含まれる。そのような固体剤形において、活性成分は、クエン酸ナトリウムもしくはリン酸二カルシウム等の少なくとも1つの不活性な薬剤的に許容される賦形剤、および/または充填剤もしくは増量剤(例えば、デンプン、ラクトース、ショ糖、グルコース、マンニトール、およびケイ酸)、結合剤(例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリジノン、ショ糖、およびアカシア)、保水剤(例えば、グリセロール)、崩壊剤(例えば、寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモまたはタピオカデンプン、アルギン酸、ある特定のケイ酸塩、および炭酸ナトリウム)、溶解遅延剤(solution retarding agents)(例えば、パラフィン)、吸収促進剤(例えば、第四級アンモニウム化合物)、湿潤剤(例えば、セチルアルコールおよびモノステアリン酸グリセロール)、吸収剤(例えば、カオリンおよびベントナイト粘土)、ならびに滑沢剤(例えば、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム)、ならびにこれらの混合物と混合される。カプセル、錠剤、および丸薬の場合、剤形は、緩衝剤も含んでもよい。
局所または経皮投与
本明細書に記載されるように、本発明のポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾RNA、またはリボ核酸を含有する組成物は、局所的な投与のために製剤化されてもよい。皮膚は、それが容易に接触可能であるため、送達に理想的な標的であり得る。遺伝子発現は、皮膚に対してのみ制限され、非特異的な毒性を回避する可能性があるだけでなく、皮内の特定の層および細胞型にも制限され得る。
アプローチによって皮膚に送達することができる。非カチオン性リポソーム−DNA複合体、カチオン性リポソーム−DNA複合体の局所適用、粒子媒介性(遺伝子銃)、穿刺媒介性遺伝子トランスフェクション、およびウイルス送達アプローチ等であるが、これらに限定されない、ほとんどの局所送達アプローチが、DNAの送達に有効であることが示されている。核酸の送達後に、遺伝子産物が、基底角化細胞、皮脂腺細胞、真皮線維芽細胞、および真皮マクロファージを含むが、これらに限定されない、いくつかの異なる皮膚細胞型において検出されている。
一実施形態において、局所および/または経皮投与の前に、皮膚等の少なくとも1つの組織の領域が、透過性を増加させ得るデバイスおよび/または溶液に供されてもよい。一実施形態において、組織は、皮膚の透過性を増加させるために、研磨デバイスに供されてもよい(参照により全体が本明細書に組み込まれる、米国特許公開第20080275468号を参照のこと)。別の実施形態において、組織は、超音波強化デバイスに供されてもよい。超音波強化デバイスには、各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、米国公開第20040236268号ならびに米国特許第6,491,657号および同第6,234,990号に記載のデバイスが含まれてもよいが、これらに限定されない。組織の透過性を向上させる方法は、各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、米国公開第20040171980号および同第20040236268号ならびに米国特許第6,190,315号に記載されている。
る、本明細書に記載の修飾mRNAの製剤を送達する前に、組織の透過性を増加させてもよい。別の非限定的な例において、免疫応答を呼び起こす物質を含有する製剤は、各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、米国公開第20040171980号および同第20040236268号に記載の方法によって送達されてもよい。
デポー投与
本明細書に記載されるように、いくつかの実施形態において、組成物は、持続放出のためのデポー中に製剤化される。一般に、具体的な器官または組織(「標的組織」)が、投与のための標的とされる。
胞透過剤、および薬剤的に許容される担体を含有するが、「ネイキッド」核酸(細胞透過剤または他の薬剤を含まない核酸等)もまた企図される。
肺投与
医薬組成物は、口腔を介した肺投与に好適な製剤中に調製され、パッケージ化され、かつ/または販売されてもよい。そのような製剤は、活性成分を含み、かつ約0.5nm〜約7nmまたは約1nm〜約6nmの範囲の直径を有する、乾燥粒子を含んでもよい。そのような組成物は、好適には、噴射剤の流れが粉末を分散するようにそこに向けられ得る乾燥粉末リザーバを含むデバイスを用い、かつ/または密封容器中の低沸点噴射剤中に溶解および/もしくは懸濁させた活性成分を含むデバイス等の自己噴射溶媒/粉末分与容器を用いた投与のために、乾燥粉末の形態にある。そのような粉末は、粒子の少なくとも98重量%が0.5nm超の直径を有し、粒子の少なくとも95%(数量)が7nm未満の直径を有する、粒子を含む。あるいは、粒子の少なくとも95重量%は、1nm超の直径を有し、粒子の少なくとも90%(数量)は、6nm未満の直径を有する。乾燥粉末組成物は、糖等の固体微粉末希釈剤を含んでもよく、それは単位用量形態で好都合に提供される。
体噴射剤が含まれる。一般に、噴射剤は、組成物の50w/wv%〜99.9w/wv%を構成し得、活性成分は、組成物の0.1w/w%〜20w/w%を構成し得る。噴射剤は、液体非イオン性および/もしくは固体アニオン性界面活性剤ならびに/または固体希釈剤(活性成分を含む粒子と同じ規模の粒径を有し得る)等のさらなる成分をさらに含んでもよい。
鼻腔内、経鼻、および頬側投与
肺送達に有用であるとして本明細書に記載される製剤は、医薬組成物の鼻腔内送達に有用である。鼻腔内投与に好適な別の製剤は、活性成分を含み、約0.2μm〜500μmの平均粒子を有する、粗粉である。そのような製剤は、鼻からの吸入が行われる様態で、すなわち、鼻に近接して保持された粉末の容器からの鼻孔を通じた急速な吸入によって、投与される。
眼内投与
医薬組成物は、眼内投与に好適な製剤中に調製され、パッケージ化され、かつ/または販売されてもよい。そのような製剤は、例えば、水性または油性液体賦形剤中に、例えば、0.1/1.0w/w%の活性成分の溶液および/または懸濁液を含む、点眼の形態にあってもよい。そのような液滴は、緩衝剤、塩、および/または本明細書に記載の任意のさらなる成分のうちのもう1つ以上をさらに含んでもよい。有用である他の眼内投与可能な製剤には、微小結晶形態でおよび/またはリポソーム調製物中に活性成分を含むものが含まれる。点耳および/または点眼は、本発明の範囲内にあるものとして企図される。
ペイロード投与:検出可能な薬剤および治療剤
本明細書に記載のポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾RNA、またはリボ核酸は、物質(「ペイロード」)の生体標的への送達、例えば、標的の検出のための検出可能な物質の送達、または治療剤の送達が所望される、いくつかの異なるシナリオにおいて使用することができる。検出方法には、インビトロ画像法およびインビボ画像法の両方、例えば、免疫組織化学、生物発光画像法(BLI)、磁気共鳴画像法(MRI)、ポジトロン放出断層撮影法(PET)、電子顕微鏡法、X線コンピュータ断層撮影法、ラマン画像法、光干渉断層撮影法、吸収画像法、熱画像法、蛍光反射画像法、蛍光顕微鏡法、蛍
光分子トモグラフィー画像法、核磁気共鳴画像法、X線画像法、超音波画像法、光音響画像法、研究室アッセイ、またはタギング/染色/画像法が必要とされる任意の状況における方法が含まれ得るが、これらに限定されない。
A、またはリボ核酸ウイルス阻害性ペプチド(VIP)に結合され得る。切断可能リンカーは、VIPおよび色素を細胞内に放出することができる。別の例において、ポリヌクレオチド、修飾核酸、エンハンスド修飾RNA、またはリボ核酸は、リンカーを介して、コレラ毒素、ジフテリア毒素、および百日咳毒素等のいくつかの細菌毒素の作用に関与する、ADP−リボシレートに結合され得る。これらの毒素タンパク質は、ヒト細胞において標的タンパク質を修飾するADP−リボシルトランスフェラーゼである。例えば、コレラ毒素ADP−リボシレートGタンパク質は、致命的な下痢をもたらす、小腸の内壁からの大量の体液分泌を引き起こすことによって、ヒト細胞を変性させる。
オシアネート);5−(2’−アミノエチル)アミノナフタレン−1−スルホン酸(EDANS);4−アミノ−N−[3−ビニルスルホニル)フェニル]ナフタルイミド−3,5ジスルホン酸塩;N−(4−アニリノ−1−ナフチル)マレイミド;アントラニルアミド;BODIPY;ブリリアントイエロー;クマリンおよび誘導体(例えば、クマリン、7−アミノ−4−メチルクマリン(AMC、クマリン120)、および7−アミノ−4−トリフルオロメチルクマリン(クマリン151);シアニン色素;シアノシン;4’,6−ジアミジノ−2−フェニルインドール(DAPI);5’5”−ジブロモピロガロール−スルホナフタレン(naphthalein)(ブロモピロガロールレッド);7−ジエチルアミノ−3−(4’−イソチオシアン酸フェニル)−4−メチルクマリン;ジエチレントリアミン五酢酸塩;4,4’−ジイソチオシアン酸ジヒドロ−スチルベン−2,2’−ジスルホン酸;4,4’−ジイソチオシアン酸スチルベン−2,2’−ジスルホン酸;5−[ジメチルアミノ]−ナフタレン−1−スルホニルクロリド(DNS、ダンシルクロリド);4−ジメチルアミノフェニルアゾフェニル−4’−イソチオシアネート(DABITC);エオシンおよび誘導体(例えば、エオシンおよびエオシンイソチオシアネート);エリスロシンおよび誘導体(例えば、エリスロシンBおよびエリスロシンイソチオシアネート);エチジウム;フルオロセインおよび誘導体(例えば、5−カルボキシフルオロセイン(FAM)、5−(4,6−ジクロロトリアジン−2−イル)アミノフルオロセイン(DTAF)、2’,7’−ジメトキシ−4’5’−ジクロロ−6−カルボキシフルオロセイン、フルオロセイン、フルオロセインイソチオシアネート、X−ローダミン−5−(および−6)−イソチオシアネート(QFITCまたはXRITC)、およびフルオレスカミン);2−[2−[3−[[1,3−ジヒドロ−1,1−ジメチル−3−(3−スルホプロピル)−2H−ベンズ[e]インドール−2−イリデン]エチリデン]−2−[4−(エトキシカルボニル)−1−ピペラジニル]−1−シクロペンテン−1−イル]エテニル]−1,1−ジメチル−3−(3−スルホプロピル(sulforpropyl))−1H−ベンズ[e]インドリウム水酸化物、分子内塩、n,n−ジエチルエタンアミン(1:1)(IR144)との化合物;5−クロロ−2−[2−[3−[(5−クロロ−3−エチル−2(3H)−ベンゾチアゾール−イリデン)エチリデン]−2−(ジフェニルアミノ)−1−シクロペンテン−1−イル]エテニル]−3−エチルベンゾチアゾリウム過塩素酸塩(IR140);マラカイトグリーンイソチオシアネート;4−メチルウンベリフェロンオルトクレゾールフタレイン;ニトロチロシン;パラローザニリン;フェノールレッド;B−フィコエリトリン;o−フタルジアルデヒド;ピレンおよび誘導体(例えば、ピレン、酪酸ピレン、およびスクシンイミジル1−ピレン);酪酸塩量子ドット;リアクティブレッド4(Cibacron(商標)ブリリアントレッド3B−A);ローダミンおよび誘導体(例えば、6−カルボキシ−X−ローダミン(ROX)、6−カルボキシローダミン(R6G)、リサミンローダミンBスルホニルクロリドローダミン(rhodarnine)(Rhod)、ローダミンB、ローダミン123、ローダミンXイソチオシアネート、スルホローダミンB、スルホローダミン101、スルホローダミン101のスルホニルクロリド誘導体(テキサスレッド)、N,N,N’,N’テトラメチル−6−カルボキシローダミン(TAMRA)テトラメチルローダミン、およびテトラメチルローダミンイソチオシアネート(TRITC);リボフラビン;ロゾール酸;テルビウムキレート誘導体;シアニン−3(Cy3);シアニン−5(Cy5);シアニン−5.5(Cy5.5)、シアニン−7(Cy7);IRD 700;IRD 800;Alexa 647;La Jolta Blue;フタロシアニン;ならびにナフタロシアニンが含まれる。
識組成物が使用され得るインビトロアッセイには、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、免疫沈降アッセイ、免疫蛍光法、酵素免疫アッセイ(EIA)、放射免疫アッセイ(RIA)、およびウエスタンブロット分析が含まれるが、これらに限定されない。
修飾核酸、エンハンスド修飾RNA、またはリボ核酸は、1つ以上の他の治療剤、予防剤、診断剤、または撮像剤と組み合わせて使用されてもよい。「と組み合わせて」とは、薬剤が同時に投与されるかつ/または一緒に送達するために製剤化される必要があることを暗示するようには意図さないが、これらの送達方法は、本開示の範囲内にある。組成物は、1つ以上の他の所望の治療薬または医療処置と並行して、その前に、またはその後に投与することができる。一般に、各薬剤は、その薬剤のために決定された用量でおよび/または時間スケジュールに基づいて投与されるであろう。いくつかの実施形態において、本開示は、薬学的、予防的、診断的、または撮像組成物を、それらの生体利用能を改善し、それらの代謝を低減および/もしくは修飾し、それらの排泄を阻害し、かつ/またはそれらの体内分布を修飾し得る薬剤と組み合わせて、送達することを包含する。非限定的な例として、修飾核酸、エンハンスド修飾RNA、またはリボ核酸は、癌の治療のためまたは過剰増殖性細胞を制御するための医薬品と組み合わせて使用されてもよい。参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許第7,964,571号において、リポポリマーとともにインターロイキン−12をコードするDNAプラスミドを含む医薬組成物を使用し、また少なくとも1つの抗癌剤または化学療法剤を投与する、原発性または転移性固形腫瘍の治療のための併用療法が記載される。さらに、抗増殖性分子をコードする本発明の修飾核酸、エンハンスド修飾RNA、またはリボ核酸は、リポポリマーとともに医薬組成物中にあってもよい(例えば、抗増殖性分子をコードするDNAプラスミドおよびリポポリマーを含む医薬組成物を特許請求する、参照により全体が本明細書に組み込まれる、米国公開第20110218231号を参照のこと)、それは少なくとも1つの化学療法剤または抗癌剤とともに投与され得る。
ペイロード投与:細胞透過性ペイロード
いくつかの実施形態において、例えば、RNAまたはmRNAといった核酸中に組み込まれる、ポリヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、および修飾核酸分子はまた、組成物の細胞内送達を促進する細胞透過性部分または薬剤であり得るペイロードも含む。例えば、組成物は、限定されないが、細胞内空間への送達を容易にする細胞透過性ペプチド配列、例えば、HIV由来TATペプチド、透過因子(penetratins)、輸送因子(transportans)、またはhCT由来細胞透過ペプチドを含むことができる。例えば、Caron et al.,(2001)Mol Ther.3(3):310−8;Langel,Cell−Penetrating Peptides:Processes and Applications(CRC Press, Boca Raton FL 2002);El−Andaloussi et al.,(2005)Curr Pharm Des.11(28):3597−611;およびDeshayes et al.,(2005)Cell Mol Life Sci. 62(16):1839−49を参照のこと;これら各々の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。組成物はまた、細胞内空間への組成物の送達を促進する、例えばリポソーム等の細胞透過剤を含むように処方することができる。
ペイロード投与:生物学的標的
例えば、RNAまたはmRNAといった核酸に組み込まれる、本明細書に記載の修飾ヌクレオチドおよび修飾核酸分子を使用して、任意の生物学的標的へペイロードを送達することができ、これに対して特定のリガンドが存在するか、またはそれを作成することができる。リガンドは生物学的標的に共有結合または非共有結合のいずれかで結合することができる。
DNAなどの核酸、タンパク質、酵素が挙げられる。タンパク質の例として、限定されないが、酵素、受容体、およびイオンチャネルが挙げられる。いくつかの実施形態において、標的は、組織特異的または細胞型特異的マーカーであってもよく、例えば、選択された組織または細胞型に特異的に発現するタンパク質であり得る。いくつかの実施形態において、標的は、限定されないが、原形質膜受容体および各受容体等の受容体であり得る。より特定の例として、限定されないが、Gタンパク質共役型受容体、細胞ポアタンパク質、輸送タンパク質、表面発現抗体、HLAタンパク質、MHCタンパク質、および増殖因子受容体が挙げられる。
投薬
本発明は、本発明に従う修飾mRNAおよびそれらのコードされたタンパク質または複合体をそれを必要とする対象に投与することを含む方法を提供する。核酸、タンパク質、もしくは複合体、またはその薬学的、画像化、診断的、もしくは予防的組成物は、疾患、障害、および/または状態(例えば、記憶障害の取り組みに関連した疾患、障害、および/または状態)の予防、治療、診断、または画像化に有効な任意の量および任意の投与経路を用いて対象に投与することができる。必要とされる正確な量は、対象の種、年齢、および全身状態、疾患の重症度、特定の組成物、その投与方法、その活性方法等に応じて、対象によって異なる。本発明に従う組成物は、投与を容易にし、かつ投薬量を均一にするために、典型的には、単位剤形で製剤化される。しかしながら、本発明の組成物の総1日使用量は、適切な医学的判断の範囲内で担当医によって決定されてもよいことが理解される。任意の特定の患者の特定の治療上有効、予防上有効、または適切な画像化用量レベルは、治療される障害および障害の重症度;用いられる特定の化合物の活性;用いられる特定の組成物;患者の年齢、体重、全体的な健康状態、性別、および食生活;投与時間、投与経路、および用いられる特定の化合物の排泄速度;治療の持続期間;用いられる特定の化合物と組み合わせて、またはそれと同時に使用される薬物;医学分野で周知の要素等を含む様々な要素に依存する。
化されてもよい。
剤形
本明細書に記載の医薬組成物は、局所、鼻腔内、気管内、または注入用(例えば、静脈内、眼内、硝子体内、筋肉内、心臓内、腹腔内、皮下)等の本明細書に記載の剤形に製剤化され得る。
液体剤形
非経口投与用の液体剤形には、薬剤的に許容されるエマルション、マイクロエマルション、溶液、懸濁液、シロップ、および/またはエリキシルが含まれるが、これらに限定されない。活性成分に加えて、液体剤形は、水または他の溶媒、可溶化剤および乳化剤、例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、1,3−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油(具体的には、綿実油、ラッカセイ油、トウモロコシ、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、およびゴマ油)、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ソルビタンポリエチレングリコールおよび脂肪酸エステル、ならびにこれらの混合物を含むが、これらに限定されない当技術分野で一般に使用される不活性希釈剤を含んでもよい。非経口投与についてのある特定の実施形態において、組成物は、可溶化剤、例えば、CREMOPHOR(登録商標)、アルコール、油、修飾油、グリコール、ポリソルベート、シクロデキストリン、ポリマー、および/またはこれらの組み合わせと混合されてもよい。
注入物
注入用調製物、例えば、滅菌注入用水性または油性懸濁液は、既知の技術に従って製剤化されてもよく、好適な分散化剤、湿潤剤、および/または懸濁化剤を含んでもよい。滅菌注入用調製物は、非毒性の非経口的に許容される希釈剤および/または溶媒、例えば、1,3−ブタンジオール溶液中の滅菌注入用溶液、懸濁液、および/またはエマルションであり得る。用いられ得る許容されるビヒクルおよび溶媒の中には、水、リンガー溶液、U.S.P.、および等張性塩化ナトリウム溶液が含まれるが、これらに限定されない。無刺激固定油が溶媒または懸濁化媒体として慣習的に用いられる。この目的のために、合成モノグリセリドまたはジグリセリドを含む任意の無刺激固定油が用いられ得る。オレイン酸等の脂肪酸が注入物の調製において使用され得る。
肺
肺送達に有用であるとして本明細書に記載される製剤は、医薬組成物の鼻腔内送達にも使用され得る。鼻腔内投与に好適な別の製剤は、活性成分を含み、約0.2μm〜500
μmの平均粒子を有する粗粉であってもよい。そのような製剤は、鼻からの吸入が行われる様態で、すなわち鼻に近接して保持された粉末の容器からの鼻孔を通じた急速な吸入によって投与されてもよい。
コーティング剤またはシェル
錠剤、糖衣錠、カプセル、丸剤、および顆粒の固体剤形を、コーティング剤およびシェル、例えば、腸溶性コーティング剤および医薬品製剤化分野で周知の他のコーティング剤で調製することができる。それらは、任意に、乳白剤を含んでもよく、それらが、腸管のある特定の部分において、任意に、遅延様式で、活性成分(複数可)のみを放出するか、またはそれを優先的に放出する組成物であり得る。使用することができる包埋組成物の例としては、ポリマー物質およびワックスが挙げられる。同様の種類の固体組成物は、そのような賦形剤をラクトースまたは乳糖、ならびに高分子量ポリエチレングリコール等として使用した軟質および硬質充填ゼラチンカプセル中の充填剤として用いてもよい。
キット
本発明は、好都合におよび/または効果的に本発明の方法を行うための多様なキットを提供する。典型的には、キットは、使用者が対象の(複数可)複数の治療を実施する、および/または複数の実験を実施することを可能にするのに十分な量および/または数の構成成分を含む。
たは多様な条件下での緩衝液中における修飾RNAの安定性を増加させるようにも変更され得る。
デバイス
本発明は、目的とするポリペプチドをコードする修飾核酸、エンハンスド修飾RNA、またはリボ核酸を組み込み得るデバイスを提供する。これらのデバイスは、安定した製剤中に、ヒト患者等のそれを必要とする対象に即時に送達されることができる製剤中に核酸を合成するための試薬を含有する。そのような目的とするポリペプチドの非限定的な例としては、創傷治癒のための成長因子および/または血管形成刺激因子、感染制御を容易にするためのペプチド抗細菌剤、ならびに新たに確認されたウイルスに対する免疫応答を急速に刺激するための抗原が挙げられる。
て加熱または冷却されることも可能である。試料ブロックは、一般的に、少なくとも1つの試料ブロックのための1つ以上の電子制御装置を有するデバイス基部と通信している。試料ブロックは、好ましくは、試料容器およびその構成要素を約−20℃〜+100℃を超える温度に加熱および/または冷却することができるような加熱モジュールである、加熱モジュールを含む。デバイス基部は、電池または外部電圧源等の電圧源と通信している。デバイスは、RNA合成のための材料を貯蔵および分配するための手段も含む。
いくつかの実施形態において、デバイスは、ポンプであってもよく、または血液脳関門を横断する本発明の化合物または組成物の投与用のカテーテルを含む。そのようなデバイスには、加圧嗅覚送達デバイス、イオン泳動デバイス、多層微小流体デバイス等が挙げられるが、これらに限定されない。そのようなデバイスは、携帯型または固定型であってもよい。それらは、身体に埋め込み可能であるか、または身体に外的に係留されるか、またはそれらの組み合わせであってもよい。
治療剤を固体組織に送達するための方法は、Bahramiらによって説明されており、例えば、米国特許公開第20110230839号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Bahramiによると、一連の針はデバイス内に組み込まれ、各針の長さに沿ってその固体組織内の任意の箇所で実質的に同量の流体を送達する。
参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Dekkerによると、0〜1mmの露出された高さを持つ放出口を有する複数の針がデバイス内に組み込まれ、それが0.3mm〜2mmの深さで物質を送達することによって、薬物動態およびバイオアベイラビリティを改善する。
itsztaによると、少なくとも1つの中空型マイクロニードルがデバイス内に組み込まれ、0.025mm〜2mmの深さでワクチンを対象の皮膚に送達する。
ー内に位置する複数の中空針がデバイス内に組み込まれ、ローラーが回転すると、針を通してリザーバ内の内容物を送達する。
カテーテルおよび/またはルーメンを利用する方法およびデバイス
カテーテルおよびルーメンを使用する方法およびデバイスを用いて、単回、複数回、または分割された投薬スケジュールにおいて本発明の修飾核酸、エンハンスド修飾RNA、またはリボ核酸を投与することができる。そのような方法およびデバイスを、以下に記載する。
電流を利用する方法およびデバイス
本明細書に教示される単回、複数回、または分割された投薬レジメンに従って、電流を利用する方法およびデバイスを用いて、本発明の修飾核酸、エンハンスド修飾RNA、またはリボ核酸を送達することができる。そのような方法およびデバイスが、以下に記載される。
み込まれ、皮膚を繰り返し穿刺し、最初に皮膚に適用される物質の一部を皮膚部分に引き込む。
定義
本明細書中の種々の箇所で、本開示の化合物の置換基が、群においてまたは範囲において開示される。本開示は、そのような群および範囲のメンバーのありとあらゆる個々の部分的組み合わせを含むことが具体的に意図される。例えば、「C1−6アルキル」という用語は、メチル、エチル、C3アルキル、C4アルキル、C5アルキル、およびC6アルキルを個々に開示することが具体的に意図される。
動物:本明細書で使用されるとき、「動物」という用語は、動物界の任意のメンバーを指す。いくつかの実施形態において、「動物」は、任意の発達段階にあるヒトを指す。いくつかの実施形態において、「動物」は、任意の発達段階にある非ヒト動物を指す。ある特定の実施形態において、非ヒト動物は、哺乳動物(例えば、齧歯類、マウス、ラット、ウサギ、サル、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、霊長類、またはブタ)である。いくつかの実施形態において、動物には、哺乳動物、鳥類、爬虫類、両生類、サカナ、および蠕虫が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、動物は、トランスジェニック動物、遺伝子操作動物、またはクローンである。
生物学的に活性:本明細書で使用されるとき、「生物学的に活性」という表現は、生体
系および/または生物において活性を有する任意の物質の特徴を指す。例えば、生物に投与されるときに、その生物に対して生物学的効果を有する物質は、生物学的に活性であると見なされる。特定の実施形態において、本発明の核酸分子は、その核酸分子のほんの一部分でも、生物学的に活性であるか、生物学的に関連性があると見なされる活性を模倣する場合、生物学的に活性であると見なされ得る。
本明細書で使用されるとき、「アシル」という用語は、本明細書に定義されるカルボニル基を介して親分子基に結合される、本明細書に定義される水素またはアルキル基(例えば、ハロアルキル基)を表し、ホルミル(すなわち、カルボキシアルデヒド基)、アセチル、プロピオニル、ブタノイル等により例として示される。例示の非置換アシル基は、1〜7、1〜11、または1〜21個の炭素を含む。いくつかの実施形態において、アルキル基は、本明細書に記載の1、2、3、または4個の置換基でさらに置換される。
のアルキレン基)を介して親分子基に結合される、本明細書に定義されるシクロアルキル基を表す。いくつかの実施形態において、アルキレンおよびシクロアルキルは各々、それぞれの基について本明細書に定義される1、2、3、または4個の置換基でさらに置換され得る。
1−20アルコキシ−C1−20アルコキシ等の、2〜12または2〜20個の炭素)を含む。いくつかの実施形態において、各アルコキシ基は、本明細書に定義される1、2、3、または4個の置換基でさらに置換され得る。
6アルコキシ;(5)アジド;(6)ハロ;(7)(C2−9ヘテロシクリル)オキシ;(8)ヒドロキシ;(9)ニトロ;(10)オキソ(例えば、カルボキシアルデヒドまたはアシル);(11)C1−7スピロシクリル;(12)チオアルコキシ;(13)チオール;(14)−CO2RA’(式中、RA’は、(a)C1−20アルキル(例えば、C1−6アルキル)、(b)C2−20アルケニル(例えば、C2−6アルケニル)、(c)C6−10アリール、(d)水素、(e)C1−6アルク−C6−10アリール、(f)アミノ−C1−20アルキル、(g)−(CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR’のポリエチレングリコール(式中、s1は、1〜10(例えば、1〜6または1〜4)の整数であり、s2およびs3の各々は、独立して、0〜10(例えば、0〜4、0〜6、1〜4、1〜6、または1〜10)の整数であり、R’は、HまたはC1−20アルキルである)、および(h)−NRN1(CH2)s2(CH2CH2O)s1(CH2)s3NRN1のアミノ−ポリエチレングリコール(式中、s1は、1〜10(例えば、1〜6または1〜4)の整数であり、s2およびs3の各々は、独立して、0〜10(例えば、0〜4、0〜6、1〜4、1〜6、または1〜10)の整数であり、各RN1は、独立して、水素であるか、または任意に置換されるC1−6アルキルである)からなる群から選択される);(15)−C(O)NRB’RC’(式中、RB’およびRC’の各々は、独立して、(a)水素、(b)C1−6アルキル、(c)C6−10アリール、および(d)C1−6アルク−C6−10アリールからなる群から選択される);(16)−SO2RD’(式中、RD’は、(a)C1−6アルキル、(b)C6−10アリール、(c)C1−6アルク−C6−10アリール、および(d)ヒドロキシからなる群から選択される);(17)−SO2NRE’RF’(式中、RE’およびRF’の各々は、独立して、(a)水素、(b)C1−6アルキル、(c)C6−10アリール、および(d)C1−6アルク−C6−10アリールからなる群から選択される);(18)−C(O)RG’(式中、RG’は、(a)C1−20アルキル(例えば、C1−6アルキル)、(b)C2−20アルケニル(例えば、C2−6アルケニル)、(c)C6−10アリール、(d)水素、(e)C1−6アルク−C6−10アリール、(f)アミノ−C1−20アルキル、(g)−(CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR’のポリエチレングリコール(式中、s1は、1〜10(例えば、1〜6または1〜4)の整数であり、s2およびs3の各々は、独立して、0〜10(例えば、0〜4、0〜6、1〜4、1〜6、または1〜10)の整数であり、R’は、HまたはC1−20アルキルである)、および(h)−NRN1(CH2)s2(CH2CH2O)s1(CH2)s3NRN1のアミノ−ポリエチレングリコール(式中、s1は、1〜10(例えば、1〜6または1〜4)の整数であり、s2およびs3の各々は、独立して、0〜10(例えば、0〜4、0〜6、1〜4、1〜6、または1〜10)の整数であり、各RN1は、独立して、水素であるか、または任意に置換されるC1−6アルキルである)からなる群から選択される);(19)−NRH’C(O)RI’(式中、RH’は、(a1)水素および(b1)C1−6アルキルからなる群から選択され、RI’は、(a2)C1−20アルキル(例えば、C1−6アルキル)、(b2)C2−20アルケニル(例えば、C2−6アルケニル)、(c2)C6−10アリール、(d2)水素、(e2)C1−6アルク−C6−10アリール、(f2)アミノ−C1−20アルキル、(g2)−(CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR’のポリエチレングリコール(式中、s1は、1〜10(例えば、1〜6または1〜4)の整数であり、s2およびs3の各々は、独立して、0〜10(例えば、0〜4、0〜6、1〜4、1〜6、または1〜10)の整数であり、R’は、HまたはC1−20アルキルである)、および(h2)−NRN1(CH2)s2(CH2CH2O)s1(CH2)s3NRN1のアミノ−ポリエチレングリコール(式中、s1は、1〜10(例えば、1〜6または1〜4)の整数であり、s2およびs3の各々は、独立して、0〜10(例えば、0〜4、0〜6、1〜4、1〜6、または1〜10)の整数であり、各RN1は、独立して、水素であるか、または任意に置換されるC1−6アルキルである)からなる群から選択される);(20)−NRJ’C(O)ORK’(式中、RJ’は、(a1)水素および(b1)C1−6アル
キルからなる群から選択され、RK’は、(a2)C1−20アルキル(例えば、C1−6アルキル)、(b2)C2−20アルケニル(例えば、C2−6アルケニル)、(c2)C6−10アリール、(d2)水素、(e2)C1−6アルク−C6−10アリール、(f2)アミノ−C1−20アルキル、(g2)−(CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR’のポリエチレングリコール(式中、s1は、1〜10(例えば、1〜6または1〜4)の整数であり、s2およびs3の各々は、独立して、0〜10(例えば、0〜4、0〜6、1〜4、1〜6、または1〜10)の整数であり、R’は、HまたはC1−20アルキルである)、および(h2)−NRN1(CH2)s2(CH2CH2O)s1(CH2)s3NRN1のアミノ−ポリエチレングリコール(式中、s1は、1〜10(例えば、1〜6または1〜4)の整数であり、s2およびs3の各々は、独立して、0〜10(例えば、0〜4、0〜6、1〜4、1〜6、または1〜10)の整数であり、各RN1は、独立して、水素であるか、または任意に置換されるC1−6アルキルである)からなる群から選択される);ならびに(21)アミジン。いくつかの実施形態において、これらの基の各々は、本明細書に記載されるようにさらに置換され得る。例えば、C1−アルカリールのアルキレン基は、オキソ基でさらに置換されて、それぞれのアリーロイル(aryloyl)置換基をもたらすことができる。
ニル)である。例示のアルキニルオキシ基には、エチニルオキシ、プロピニルオキシ等が含まれる。いくつかの実施形態において、アルキニル基は、本明細書に定義される1、2、3、または4個の置換基(例えば、ヒドロキシ基)でさらに置換され得る。
本明細書で使用されるとき、「アミノ」という用語は、−N(RN1)2を表し、式中、各RN1は、独立して、H、OH、NO2、N(RN2)2、SO2ORN2、SO2RN2、SORN2、N−保護基、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アリール、アルカリール、シクロアルキル、アルクシクロアルキル、カルボキシアルキル、スルホアルキル、ヘテロシクリル(例えば、ヘテロアリール)、またはアルクヘテロシクリル(例えば、アルクヘテロアリール)であり、これらの列挙されるRN1基の各々は、各基について本明細書に定義されるように任意に置換され得るか、または2つのRN1が組み合わさって、ヘテロシクリルもしくはN保護基を形成し、各RN2は、独立して、H、アルキル、またはアリールである。本発明のアミノ基は、非置換アミノ(すなわち、−NH2)または置換アミノ(すなわち、−N(RN1)2)であり得る。好ましい実施形態において、アミノは、−NH2または−NHRN1であり、式中、RN1は、独立して、OH、NO2、NH2、NRN2 2、SO2ORN2、SO2RN2、SORN2、アルキル、カルボキシアルキル、スルホアルキル、またはアリールであり、各RN2は、H、C1−20アルキル(例えば、C1−6アルキル)、またはC6−10アリールであり得る。
s3NRN1のアミノ−ポリエチレングリコール(式中、s1は、1〜10(例えば、1〜6または1〜4)の整数であり、s2およびs3の各々は、独立して、0〜10(例えば、0〜4、0〜6、1〜4、1〜6、または1〜10)の整数であり、各RN1は、独立して、水素であるか、または任意に置換されるC1−6アルキルである)からなる群から選択される);(15)−C(O)NRB’RC’(式中、RB’およびRC’の各々は、独立して、(a)水素、(b)C1−6アルキル、(c)C6−10アリール、および(d)C1−6アルク−C6−10アリールからなる群から選択される);(16)−SO2RD’(式中、RD’は、(a)C1−6アルキル、(b)C6−10アリール、(c)C1−6アルク−C6−10アリール、および(d)ヒドロキシからなる群から選択される);(17)−SO2NRE’RF’(式中、RE’およびRF’の各々は、独立して、(a)水素、(b)C1−6アルキル、(c)C6−10アリール、および(d)C1−6アルク−C6−10アリールからなる群から選択される);(18)−C(O)RG’(式中、RG’は、(a)C1−20アルキル(例えば、C1−6アルキル)、(b)C2−20アルケニル(例えば、C2−6アルケニル)、(c)C6−10アリール、(d)水素、(e)C1−6アルク−C6−10アリール、(f)アミノ−C1−20アルキル、(g)−(CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR’のポリエチレングリコール(式中、s1は、1〜10(例えば、1〜6または1〜4)の整数であり、s2およびs3の各々は、独立して、0〜10(例えば、0〜4、0〜6、1〜4、1〜6、または1〜10)の整数であり、R’は、HまたはC1−20アルキルである)、および(h)−NRN1(CH2)s2(CH2CH2O)s1(CH2)s3NRN1のアミノ−ポリエチレングリコール(式中、s1は、1〜10(例えば、1〜6または1〜4)の整数であり、s2およびs3の各々は、独立して、0〜10(例えば、0〜4、0〜6、1〜4、1〜6、または1〜10)の整数であり、各RN1は、独立して、水素であるか、または任意に置換されるC1−6アルキルである)からなる群から選択される);(19)−NRH’C(O)RI’(式中、RH’は、(a1)水素および(b1)C1−6アルキルからなる群から選択され、RI’は、(a2)C1−20アルキル(例えば、C1−6アルキル)、(b2)C2−20アルケニル(例えば、C2−6アルケニル)、(c2)C6−10アリール、(d2)水素、(e2)C1−6アルク−C6−10アリール、(f2)アミノ−C1−20アルキル、(g2)−(CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR’のポリエチレングリコール(式中、s1は、1〜10(例えば、1〜6または1〜4)の整数であり、s2およびs3の各々は、独立して、0〜10(例えば、0〜4、0〜6、1〜4、1〜6、または1〜10)の整数であり、R’は、HまたはC1−20アルキルである)、および(h2)−NRN1(CH2)s2(CH2CH2O)s1(CH2)s3NRN1のアミノ−ポリエチレングリコール(式中、s1は、1〜10(例えば、1〜6または1〜4)の整数であり、s2およびs3の各々は、独立して、0〜10(例えば、0〜4、0〜6、1〜4、1〜6、または1〜10)の整数であり、各RN1は、独立して、水素であるか、または任意に置換されるC1−6アルキルである)からなる群から選択される);(20)−NRJ’C(O)ORK’(式中、RJ’は、(a1)水素および(b1)C1−6アルキルからなる群から選択され、RK’は、(a2)C1−20アルキル(例えば、C1−6アルキル)、(b2)C2−20アルケニル(例えば、C2−6アルケニル)、(c2)C6−10アリール、(d2)水素、(e2)C1−6アルク−C6−10アリール、(f2)アミノ−C1−20アルキル、(g2)−(CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR’のポリエチレングリコール(式中、s1は、1〜10(例えば、1〜6または1〜4)の整数であり、s2およびs3の各々は、独立して、0〜10(例えば、0〜4、0〜6、1〜4、1〜6、または1〜10)の整数であり、R’は、HまたはC1−20アルキルである)、および(h2)−NRN1(CH2)s2(CH2CH2O)s1(CH2)s3NRN1のアミノ−ポリエチレングリコール(式中、s1は、1〜10(例えば、1〜6または1〜4)の整数であり、s2およびs3の各々は、独立して、0〜10(例えば、0〜4、0〜6、1〜4、1〜6、または1〜10)の整数であり、各RN
1は、独立して、水素であるか、または任意に置換されるC1−6アルキルである)からなる群から選択される);ならびに(21)アミジン。いくつかの実施形態において、これらの基の各々は、本明細書に記載されるようにさらに置換され得る。
)C2−20アルキニル。いくつかの実施形態において、これらの基の各々は、本明細書に記載されるようにさらに置換され得る。例えば、C1−アルカリールまたはC1−アルクヘテロシクリルのアルキレン基は、オキソ基でさらに置換されて、それぞれのアリーロイルおよび(ヘテロシクリル)オイル置換基をもたらすことができる。
本明細書で使用されるとき、「二環式」という用語は、芳香族でも非芳香族でもあり得る2つの環を有する構造を指す。二環式構造には、本明細書に定義されるスピロシクリル基、および1つ以上の架橋を共有する2つの環が含まれ、そのような架橋は、1個の原子、または2個、3個、もしくはそれよりも多い原子を含む鎖を含むことができる。例示の二環式基には、二環式カルボシクリル基(その第1および第2の環は、本明細書に定義されるカルボシクリル基である);二環式アリール基(その第1および第2の環は、本明細書に定義されるアリール基である);二環式ヘテロシクリル基(その第1の環は、ヘテロシクリル基であり、第2の環は、カルボシクリル(例えば、アリール)またはヘテロシクリル(例えば、ヘテロアリール)基である);および二環式ヘテロアリール基(その第1の環は、ヘテロアリール基であり、第2の環は、カルボシクリル(例えば、アリール)またはヘテロシクリル(例えば、ヘテロアリール)基である)が含まれる。いくつかの実施形態において、二環式基は、シクロアルキル、ヘテロシクリル、およびアリール基について本明細書に定義される1、2、3、または4個の置換基で置換され得る。
ルキル基は、本明細書に記載の1、2、3、または4個の置換基でさらに置換され得る。
「カルボキシアルデヒド」という用語は、構造−CHOを有するアシル基を表す。
本明細書で使用されるとき、「カルボキシアルコキシ」という用語は、本明細書に定義されるカルボキシ基によって置換された、本明細書に定義されるアルコキシ基を表す。アルコキシ基は、アルキル基について本明細書に記載の1、2、3、または4個の置換基でさらに置換され得る。
「シクロアルコキシ」という用語は、式−ORの化学置換基を表し、式中、Rは、別途明記されない限り、本明細書に定義されるC3−8シクロアルキル基である。シクロアルキル基は、本明細書に記載の1、2、3、または4個の置換基でさらに置換され得る。例示の非置換シクロアルコキシ基は、3〜8個の炭素である。いくつかの実施形態において、シクロアルキル基は、本明細書に記載の1、2、3、または4個の置換基でさらに置換され得る。
CH2)qCO2RA’(式中、qは、0〜4の整数であり、RA’は、(a)C1−6アルキル、(b)C6−10アリール、(c)水素、および(d)C1−6アルク−C6−10アリールからなる群から選択される);(18)−(CH2)qCONRB’RC’(式中、qは、0〜4の整数であり、RB’およびRC’は、(a)水素、(b)C6−10アルキル、(c)C6−10アリール、および(d)C1−6アルク−C6−10アリールからなる群から独立して選択される);(19)−(CH2)qSO2RD’(式中、qは、0〜4の整数であり、RD’は、(a)C6−10アルキル、(b)C6−10アリール、および(c)C1−6アルク−C6−10アリールからなる群から選択される);(20)−(CH2)qSO2NRE’RF’(式中、qは、0〜4の整数であり、RE’およびRF’の各々は、独立して、(a)水素、(b)C6−10アルキル、(c)C6−10アリール、および(d)C1−6アルク−C6−10アリールからなる群から選択される);(21)チオール;(22)C6−10アリールオキシ;(23)C3−8シクロアルコキシ;(24)C6−10アリール−C1−6アルコキシ;(25)C1−6アルク−C1−12ヘテロシクリル(例えば、C1−6アルク−C1−12ヘテロアリール);(26)オキソ;(27)C2−20アルケニル;ならびに(28)C2−20アルキニル。いくつかの実施形態において、これらの基の各々は、本明細書に記載されるようにさらに置換され得る。例えば、C1−アルカリールまたはC1−アルクヘテロシクリルのアルキレン基は、オキソ基でさらに置換されて、それぞれのアリーロイルおよび(ヘテロシクリル)オイル置換基をもたらすことができる。
本明細書で使用されるとき、本明細書で使用される薬剤の「有効量」は、有益なまたは所望の結果、例えば、臨床結果をもたらすのに十分な量であり、したがって、「有効量」は、それが適用されている前後関係に依存する。例えば、癌を治療する薬剤を投与することの前後関係において、有効量の薬剤は、例えば、薬剤の投与を伴わずに得られる反応と比較して、本明細書に定義される癌の治療を達成するのに十分な量である。
本明細書で使用されるとき、「ハロアルコキシ」という用語は、ハロゲン基(すなわち、F、Cl、Br、またはI)によって置換された、本明細書に定義されるアルコキシ基を表す。ハロアルコキシは、1、2、3個のハロゲンで、または2個以上の炭素のアルキル基の場合には4個のハロゲンで置換されてもよい。ハロアルコキシ基には、ペルフルオロアルコキシ(例えば、−OCF3)、−OCHF2、−OCH2F、−OCCl3、−OCH2CH2Br、−OCH2CH(CH2CH2Br)CH3、および−OCHICH3が含まれる。いくつかの実施形態において、ハロアルコキシ基は、アルキル基について本明細書に記載の1、2、3、または4個の置換基でさらに置換され得る。
−CH2CH(CH2CH2Br)CH3、および−CHICH3が含まれる。いくつかの実施形態において、ハロアルキル基は、アルキル基について本明細書に記載の1、2、3、または4個の置換基でさらに置換され得る。
ミダゾリル(例えば、2,3,4,5−テトラヒドロ−2,4−ジオキソ−5−メチル−5−フェニル−1H−イミダゾリル);2,3−ジヒドロ−2−チオキソ−1,3,4−オキサジアゾリル(例えば、2,3−ジヒドロ−2−チオキソ−5−フェニル−1,3,4−オキサジアゾリル);4,5−ジヒドロ−5−オキソ−1H−トリアゾリル(例えば、4,5−ジヒドロ−3−メチル−4−アミノ5−オキソ−1H−トリアゾリル);1,2,3,4−テトラヒドロ−2,4−ジオキソピリジニル(例えば、1,2,3,4−テトラヒドロ−2,4−ジオキソ−3,3−ジエチルピリジニル);2,6−ジオキソ−ピペリジニル(例えば、2,6−ジオキソ−3−エチル−3−フェニルピペリジニル);1,6−ジヒドロ−6−オキソピリジミニル;1,6−ジヒドロ−4−オキソピリミジニル(例えば、2−(メチルチオ)−1,6−ジヒドロ−4−オキソ−5−メチルピリミジン−1−イル);1,2,3,4−テトラヒドロ−2,4−ジオキソピリミジニル(例えば、1,2,3,4−テトラヒドロ−2,4−ジオキソ−3−エチルピリミジニル);1,6−ジヒドロ−6−オキソ−ピリダジニル(例えば、1,6−ジヒドロ−6−オキソ−3−エチルピリダジニル);1,6−ジヒドロ−6−オキソ−1,2,4−トリアジニル(例えば、1,6−ジヒドロ−5−イソプロピル−6−オキソ−1,2,4−トリアジニル);2,3−ジヒドロ−2−オキソ−1H−インドリル(例えば、3,3−ジメチル−2,3−ジヒドロ−2−オキソ−1H−インドリルおよび2,3−ジヒドロ−2−オキソ−3,3’−スピロプロパン−1H−インドール−1−イル);1,3−ジヒドロ−1−オキソ−2H−イソ−インドリル;1,3−ジヒドロ−1,3−ジオキソ−2H−イソ−インドリル;1H−ベンゾピラゾリル(例えば、1−(エトキシカルボニル)−1H−ベンゾピラゾリル);2,3−ジヒドロ−2−オキソ−1H−ベンズイミダゾリル(例えば、3−エチル−2,3−ジヒドロ−2−オキソ−1H−ベンズイミダゾリル);2,3−ジヒドロ−2−オキソ−ベンゾオキサゾリル(例えば、5−クロロ−2,3−ジヒドロ−2−オキソ−ベンゾオキサゾリル);2,3−ジヒドロ−2−オキソ−ベンゾオキサゾリル;2−オキソ−2H−ベンゾピラニル;1,4−ベンゾジオキサニル;1,3−ベンゾジオキサニル;2,3−ジヒドロ−3−オキソ,4H−1,3−ベンゾチアジニル;3,4−ジヒドロ−4−オキソ−3H−キナゾリニル(例えば、2−メチル−3,4−ジヒドロ−4−オキソ−3H−キナゾリニル);1,2,3,4−テトラヒドロ−2,4−ジオキソ−3H−キナゾリル(例えば、1−エチル−1,2,3,4−テトラヒドロ−2,4−ジオキソ−3H−キナゾリル);1,2,3,6−テトラヒドロ−2,6−ジオキソ−7H−プリニル(例えば、1,2,3,6−テトラヒドロ−1,3−ジメチル−2,6−ジオキソ−7H−プリニル);1,2,3,6−テトラヒドロ−2,6−ジオキソ−1H−プリニル(例えば、1,2,3,6−テトラヒドロ−3,7−ジメチル−2,6−ジオキソ−1H−プリニル);2−オキソベンズ[c,d]インドリル;1,1−ジオキソ−2H−ナフト[1,8−c,d]イソチアゾリル;および1,8−ナフチレンジカルボキサミドが含まれる。さらなる複素環には、3,3a,4,5,6,6a−ヘキサヒドロ−ピロlo[3,4−b]ピロl−(2H)−イル、および2,5−ジアザビシクロ[2.2.1]ヘプタン−2−イル、ホモピペラジニル(またはジアゼパニル)、テトラヒドロピラニル、ジチアゾリル、ベンゾフラニル、ベンゾチエニル、オキセパニル、チエパニル、アゾカニル、オキセカニル、およびチオカニルが含まれる。複素環基は、式:
E’は、−N−および−CH−からなる群から選択され、F’は、−N=CH−、−NH−CH2−、−NH−C(O)−、−NH−、−CH=N−、−CH2−NH−、−C(O)−NH−、−CH=CH−、−CH2−、−CH2CH2−、−CH2O−、−OCH2−、−O−、および−S−からなる群から選択され、G’は、−CH−および−N−からなる群から選択される。本明細書で言及されるヘテロシクリル基のうちのいずれかは、次のものからなる群から独立して選択される1、2、3、4、または5個の置換基で任意に置換されてもよい:(1)C1−7アシル(例えば、カルボキシアルデヒド);(2)C1−20アルキル(例えば、C1−6アルキル、C1−6アルコキシ−C1−6アルキル、C1−6アルキルスルフィニル−C1−6アルキル、アミノ−C1−6アルキル、アジド−C1−6アルキル、(カルボキシアルデヒド)−C1−6アルキル、ハロ−C1−6アルキル(例えば、ペルフルオロアルキル)、ヒドロキシ−C1−6アルキル、ニトロ−C1−6アルキル、またはC1−6チオアルコキシ−C1−6アルキル);(3)C1−20アルコキシ(例えば、ペルフルオロアルコキシ等のC1−6アルコキシ);(4)C1−6アルキルスルフィニル;(5)C6−10アリール;(6)アミノ;(7)C1−6アルク−C6−10アリール;(8)アジド;(9)C3−8シクロアルキル;(10)C1−6アルク−C3−8シクロアルキル;(11)ハロ;(12)C1−12ヘテロシクリル(例えば、C2−12ヘテロアリール);(13)(C1−12ヘテロシクリル)オキシ;(14)ヒドロキシ;(15)ニトロ;(16)C1−20チオアルコキシ(例えば、C1−6チオアルコキシ);(17)−(CH2)qCO2RA’(式中、qは、0〜4の整数であり、RA’は、(a)C1−6アルキル、(b)C6−10アリール、(c)水素、および(d)C1−6アルク−C6−10アリールからなる群から選択される);(18)−(CH2)qCONRB’RC’(式中、qは、0〜4の整数であり、RB’およびRC’は、(a)水素、(b)C1−6アルキル、(c)C6−10アリール、および(d)C1−6アルク−C6−10アリールからなる群から独立して選択される);(19)−(CH2)qSO2RD’(式中、qは、0〜4の整数であり、RD’は、(a)C1−6アルキル、(b)C6−10アリール、および(c)C1−6アルク−C6−10アリールからなる群から選択される);(20)−(CH2)qSO2NRE’RF’(式中、qは、0〜4の整数であり、RE’およびRF’の各々は、独立して、(a)水素、(b)C1−6アルキル、(c)C6−10アリール、および(d)C1−6アルク−C6−10アリールからなる群から選択される);(21)チオール;(22)C6−10アリールオキシ;(23)C3−8シクロアルコキシ;(24)アリールアルコキシ;(25)C1−6アルク−C1−12ヘテロシクリル(例えば、C1−6アルク−C1−12ヘテロアリール);(26)オキソ;(27)(C1−12ヘテロシクリル)イミノ;(28)C2−20アルケニル;ならびに(29)C2−20アルキニル。いくつかの実施形態において、これらの基の各々は、本明細書に記載されるようにさらに置換され得る。例えば、C1−アルカリールまたはC1−アルクヘテロシクリルのアルキレン基は、オキソ基でさらに置換されて、それぞれのアリーロイルおよび(ヘテロシクリル)オイル置換基をもたらすことができる。
本明細書で使用されるとき、「ヒドロキシ」という用語は、−OH基を表す。
本明細書で使用されるとき、「N保護基」という用語は、合成手順中に、望ましくない反応に対してアミノ基を保護するよう意図される基を表す。一般的に使用されるN保護基は、参照により本明細書に組み込まれる、Greene,“Protective Groups in Organic Synthesis,” 3rd Edition(John Wiley & Sons,New York,1999)に開示されている。N保護基には、ホルミル、アセチル、プロピオニル、ピバロイル、t−ブチルアセチル、2−クロロアセチル、2−ブロモアセチル、トリフルオロアセチル、トリクロロアセチル、フタリル、o−ニトロフェノキシアセチル、α−クロロブチリル、ベンゾイル、4−クロロベンゾイル、4−ブロモベンゾイル、4−ニトロベンゾイル等の、アシル、アリーロイル、またはカルバミル基、および保護されたまたは保護されいないD、L、またはD等のキラル助剤、アラニン、ロイシン、フェニルアラニン等のL−アミノ酸;ベンゼンス
ルホニル、p−トルエンスルホニル等のスルホニル含有基;ベンジルオキシカルボニル、p−クロロベンジルオキシカルボニル、p−メトキシベンジルオキシカルボニル、p−ニトロベンジルオキシカルボニル、2−ニトロベンジルオキシカルボニル、p−ブロモベンジルオキシカルボニル、3,4−ジメトキシベンジルオキシカルボニル、3,5−ジメトキシベンジルオキシカルボニル、2,4−ジメトキシベンジルオキシカルボニル、4−メトキシベンジルオキシカルボニル、2−ニトロ−4,5−ジメトキシベンジルオキシカルボニル、3,4,5−トリメトキシベンジルオキシカルボニル、1−(p−ビフェニルyl)−1−メチルエトキシカルボニル、α,α−ジメチル−3,5−ジメトキシベンジルオキシカルボニル、ベンズヒドリルオキシカルボニル、t−ブチルオキシカルボニル、ジイソプロピルメトキシカルボニル、イソプロピルオキシカルボニル、エトキシカルボニル、メトキシカルボニル、アリルオキシカルボニル、2,2,2,−トリクロロエトキシカルボニル、フェノキシカルボニル、4−ニトロフェノキシカルボニル、フルオレニル−9−メトキシカルボニル、シクロペンチルオキシカルボニル、アダマンチルオキシカルボニル、シクロヘキシルオキシカルボニル、フェニルチオカルボニル等のカルバメート形成基、ベンジル、トリフェニルメチル、ベンジルオキシメチル等のアルカリール基、ならびにトリメチルシリル等のシリル基が含まれる。好ましいN保護基は、ホルミル、アセチル、ベンゾイル、ピバロイル、t−ブチルアセチル、アラニル、フェニルスルホニル、ベンジル、t−ブチルオキシカルボニル(Boc)、およびベンジルオキシカルボニル(Cbz)である。
本明細書で使用されるとき、「オキソ」という用語、=Oを表す。
本明細書で使用されるとき、「ペルフルオロアルキル」という用語は、アルキル基に結合した各水素ラジカルがフッ化物ラジカルによって置き換えられた、本明細書に定義されるアルキル基を表す。ペルフルオロアルキル基は、トリフルオロメチル、ペンタフルオロエチル等により例として示される。
によって置換された、本明細書に定義されるアルキル基を表す。いくつかの実施形態において、アルキル基は、本明細書に記載の1、2、3、または4個の置換基でさらに置換され得る。
本明細書で使用されるとき、「チオアルカリール」という用語は、式−SRの化学置換基を表し、式中、Rは、アルカリール基である。いくつかの実施形態において、アルカリール基は、本明細書に記載の1、2、3、または4個の置換基でさらに置換され得る。
化合物:本明細書で使用されるとき、「化合物」という用語は、描写される構造のすべての立体異性体、幾何異性体、互変異性体、および同位体を含むことが意図される。
媒和物および水和物を形成することにより調製することができる。
保存される:本明細書で使用されるとき、「保存される」という用語は、比較されている2つ以上の配列の同じ位置において変化することなく生じる残基である、それぞれ、ポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列のヌクレオチド残基またはアミノ酸残基を指す。比較的保存されているヌクレオチドまたはアミノ酸は、配列内の他の箇所に現れるヌクレオチドまたはアミノ酸よりも関連した配列の間で保存されているものである。
送達剤:本明細書で使用されるとき、「送達剤」は、標的とされる細胞への修飾核酸のインビボ送達を少なくとも部分的に容易にする、任意の物質を指す。
障害:本明細書で使用するとき、「障害」という用語は、身体の正常機能または確立されたシステムの混乱、またはそれらへの干渉を指す。
分へと分解することを意味する。ポリペプチドまたはタンパク質に言及するとき、消化は、ペプチドの産生をもたらす。
発現:本明細書で使用されるとき、核酸配列の「発現」は、次の事象のうちの1つ以上を指す:(1)DNA配列からのRNAテンプレートの生成(例えば、転写による)、(2)RNA転写のプロセシング(例えば、スプライシング、編集、5’キャップ形成、および/または3’末端プロセシングによる)、(3)RNAのポリペプチドまたはタンパク質への翻訳、および(4)ポリペプチドまたはタンパク質の翻訳後修飾。
製剤:本明細書で使用されるとき、「製剤」は、少なくとも修飾核酸と、送達剤とを含む。
非相同:本明細書で使用するとき、5’UTRまたは3’UTR等の非翻訳領域に関する「非相同」という用語は、同一のまたは本明細書のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAのコード領域で自然にはみられない、核酸の領域、特に非翻訳核酸を意味する。例えば、相同UTRは、野生型UTR等のmRNAのコード領域と関連して自然に見られるUTRを表す。
Molecular Biology,Lesk,A.M.,ed.,Oxford University Press,New York,1988;Biocomputing:Informatics and Genome Projects,Smith,D.W.,ed.,Academic Press,New York,1993、Sequence Analysis in Molecular Biology,von Heinje,G.,Academic Press,1987、Computer Analysis of Sequence Data,Part I,Griffin,A.M.,and Griffin,H.G.,eds.,Humana Press,New Jersey,1994、およびSequence Analysis Primer,Gribskov,M.and Devereux,J.,eds.,M
Stockton Press,New York,1991に記載の方法の等を用いて決定することができる。例えば、2つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、MeyersおよびMiller(CABIOS,1989,4:11−17)のアルゴリズムを用いて決定することができ、それはPAM120重量残基表、12のギャップ長ペナルティ、および4のギャップペナルティを用いてALIGNプログラム(第2.0版)に組み込まれている。2つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、あるいは、NWSgapdna.CMPマトリックスを使用するGCGソフトウェアパッケージにおけるGAPプログラムを用いて決定することができる。配列間の同一性パーセントを決定するために一般的に用いられる方法には、参照により本明細書に組み込まれるCarillo
,H.,and Lipman,D.,SIAM J Applied Math.,48:1073(1988)に開示の方法が含まれるが、これらに限定されない。同一性を決定するための技法は、公的に利用可能なコンピュータプログラムにおいて成文化されている。2つの配列間の相同性を決定するための例示のコンピュータソフトウェアには、GCGプログラムパッケージ、Devereux,J.,et al.,Nucleic Acids Research,12(1),387(1984))、BLASTP、BLASTN、およびFASTA、Atschul,S.F.et al.,J.Molec.Biol.、215、403(1990))が含まれるが、これらに限定されない。
単離された:本明細書で使用されるとき、「単離された」という用語は、それが会合された(自然にであるか、実験的設定であるかにかかわらず)構成成分のうちの少なくとも一部から分離された物質または実体を指す。単離された物質は、それが会合した物質に関して様々なレベルの純度を有し得る。単離された物質および/または実体は、それらが最初に会合されたその他の構成成分の少なくとも約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、またはそれよりも多くから分離され得る。いくつかの実施形態において、単離された薬剤は、約80%超、約85%超、約90%超、約91%超、約92%超、約93%超、約94%超、約95%超、約96%超、約97%超、約98%超、約99%超、または約99%超純粋である。本明細書で使用されるとき、物質は、他の構成成分が実質的にない場合、「純粋」である。実質的に単離される:「実質的に単離される」とは、化合物が、それが形成されたまたは検出された環境から実質的に分離されることを意味する。部分的分離には、例えば、本開示の化合物を豊富に含んだ組成物が含まれ得る。実質的な分離には、少なくとも約50重量%、少なくとも約60重量%、少なくとも約70重量%、少なくとも約80重量%、少なくとも約90重量%、少なくとも約95重量%、少なくとも約97重量%、または少なくとも約99重量%の本開示の化合物、またはその塩を含有する組成物が含まれ得る。化合物およびそれらの塩を単離するための方法は、当技術分野で通例である。
ミノ、エーテル、チオエーテル、エステル、アルキレン、ヘテロアルキレン、アリール、またはヘテロシクリルが挙げられるが、これらに限定されず、これらの各々は、本明細書に記載されるように任意に置換され得る。リンカーの例としては、不飽和アルカン、ポリエチレングリコール(例えば、エチレンまたはプロピレングリコールモノマー単位、例えば、ジエチレングリコール、ジプロピレングリコール、トリエチレングリコール、トリプロピレングリコール、テトラエチレングリコール、またはテトラエチレングリコール)、ならびにデキストランポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。他の例としては、還元剤または光分解を用いて切断され得る、例えば、ジスルフィド結合(−S−S−)またはアゾ結合(−N=N−)等の、リンカー内の切断可能部分が挙げられるが、これらに限定されない。選択的に切断可能な結合の非限定的な例としては、例えば、トリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)、または他の還元剤および/もしくは光分解の使用によって切断され得る、アミド結合、ならびに例えば、酸性または塩基性加水分解によって切断され得る、エステル結合が挙げられる。
オープンリーディングフレーム:本明細書で使用されるとき、「オープンリーディングフレーム」または「ORF」は、所与のリーディングフレーム内に終止コドンを含有しない配列を指す。
患者:本明細書で使用されるとき、「患者」は、治療を求め得るもしくは治療を必要とし得る、治療を要する、治療を受けている、治療を受けることになる、または特定の疾患もしくは状態のために訓練を受けた専門家の看護下にある、対象を指す。
薬剤的に許容される:「薬剤的に許容される」という表現は、本明細書で、健全な医療判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症を伴わずにヒトおよび動物の組織と接触して使用するのに好適であり、妥当な便益/危険性比率に見合った、化合物、材料、組成物、および/または剤形を指すように用いられる。
ceutical Sciences,17th ed.,Mack Publishing Company,Easton,Pa.,1985,p.1418、およびJournal of Pharmaceutical Science,66,2(1977)において見出される。
予防する:本明細書で使用されるとき、「予防する」という用語は、感染、疾患、障害、および/もしくは状態の発症を部分的もしくは完全に遅延させること;特定の感染、疾患、障害、および/もしくは状態の1つ以上の症状、特長、もしくは臨床徴候の発症を部分的もしくは完全に遅延させること;特定の感染、疾患、障害、および/もしくは状態の1つ以上の症状、特長、もしくは徴候の発症を部分的もしくは完全に遅延させること;感染からの、特定の疾患、障害、および/もしくは状態の進行を部分的もしくは完全に遅延させること;ならびに/または感染、疾患、障害、および/もしくは状態に関連した病理を発症する危険性を減少さることを指す。
a,“Pro−drugs as Novel Delivery Systems,”Vol.14 of the A.C.S.Symposium Seriesに、およびBioreversible Carriers in Drug Design,ed.Edward B.Roche,American Pharmaceutical
Association and Pergamon Press,1987で論じられている。
シュードウリジン:本明細書で使用されるとき、シュードウリジンは、ヌクレオシドウリジンのC−グリコシド異性体を指す。「シュードウリジン類似体」は、シュードウリジンの任意の修飾、変異形、アイソフォーム、または誘導体である。例えば、シュードウリジン類似体には、1−カルボキシメチル−シュードウリジン、1−プロピニル−シュードウリジン、1−タウリノメチル−シュードウリジン、1−タウリノメチル−4−チオ−シュードウリジン、1−メチル−シュードウリジン(m1ψ)、1−メチル−4−チオ−シュードウリジン(m1s4ψ)、4−チオ−1−メチル−シュードウリジン、3−メチル−シュードウリジン(m3ψ)、2−チオ−1−メチル−シュードウリジン、1−メチル−1−デアザ−シュードウリジン、2−チオ−1−メチル−1−デアザ−シュードウリジン、ジヒドロシュードウリジン、2−チオ−ジヒドロシュードウリジン、2−メトキシウリジン、2−メトキシ−4−チオ−ウリジン、4−メトキシ−シュードウリジン、4−メトキシ−2−チオ−シュードウリジン、N1−メチル−シュードウリジン、1−メチル−3−(3−アミノ−3−カルボキシプロピル)シュードウリジン(acp3ψ)、および2’−O−メチル−シュードウリジン(ψm)が含まれるが、これらに限定されない。
定されない、全生物、またはその組織、細胞、もしくは構成部分の部分集合、またはその画分もしくは一部分から調製される、ホモジネート、可溶化液、または抽出物がさらに含まれ得る。試料はさらに、タンパク質または核酸分子等の細胞構成成分を含有し得る、栄養ブロスまたはゲル等の培地を指す。
シグナルペプチド配列:本明細書で使用されるとき、「シグナルペプチド配列」という表現は、タンパク質の輸送または局在化を指示することができる配列を指す。
安定した:本明細書で使用されるとき、「安定した」は、反応混合物から有用な純度で単離後に残存するのに十分に強固であり、好ましくは効果的な治療剤へと製剤可能である、化合物を指す。
対象:本明細書で使用されるとき、「対象」または「患者」という用語は、本発明に従う組成物が、例えば、実験、診断、予防、および/または治療目的のために投与され得る、任意の生物を指す。典型的な対象には、動物(例えば、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類、およびヒト等の哺乳動物)および/または植物が含まれる。
実質的に同時に:本明細書で使用され、かつそれが複数の用量に関するとき、この用語は、15秒以内を意味する。
末端領域よりも改善することを意味する。
治療剤:「治療剤」という用語は、対象に投与されたときに、治療、診断、および/もしくは予防効果を有し、かつ/または所望の生物学的および/もしくは薬理学的効果を誘発する、任意の薬剤を指す。
転写因子:本明細書で使用されるとき、「転写因子」という用語は、例えば、転写の活性化または抑制によって、DNAのRNAへの転写を調節する、DNA結合タンパク質を指す。いくつかの転写因子は、転写の調節を単独でもたらす一方で、他の転写因子は、他のタンパク質と協働して作用する。いくつかの転写因子は、ある特定の条件下で、転写の活性化および抑制の両方を行うことができる。一般に、転写因子は、標的遺伝子の調節領域内の特定のコンセンサス配列に非常に類似した、特定の標的配列(単数または複数)に結合する。転写因子は、標的遺伝子の転写を単独でまたは他の分子と複合して調節し得る。
均等物および範囲
当業者であれば、ほんの日常的な実験を用いて、本明細書に記載の本発明に従う具体的な実施形態に対する多くの均等物を認識するか、解明することができる。本発明の範囲は、上記の説明に限定されるようには意図されず、むしろ添付の特許請求の範囲に記載されるように限定されることが意図される。
得る。群の1つ以上の構成員の間に「または」を含む特許請求項または記述は、それとは反対の指定があるか、または文脈から別途明白でない限り、その群の構成員のうちの1つ、2つ以上、またはすべてが、所与の生成物またはプロセスにおいて存在するか、それにおいて用いられるか、あるいはそれと関連性がある場合、満たされると見なされる。本発明は、群の厳密に1つの構成員が所与の生成物またはプロセスにおいて存在するか、それにおいて用いられるか、あるいはそれと関連性のある実施形態を含む。本発明は、群の構成員のうちの1つを超えるものまたはすべてが所与の生成物またはプロセスにおいて存在するか、それにおいて用いられるか、あるいはそれと関連性のある実施形態を含む。
範囲が与えられる場合、端点が含まれる。さらに、別途指定されるか、または文脈および当業者の理解から別途明白でない限り、範囲として表される値は、文脈上、そうでないとする明確な指示がない限り、本発明の異なる実施形態において定められる範囲内で、その範囲の下限の単位の10分の1までの任意の具体的な値または部分範囲をとることができることを理解されたい。
本発明に従う修飾mRNAは、標準的な実験室方法および材料を用いて作製する。
様々な上流または下流領域(β−グロビン、タグ等)を有するオープンリーディングフレームは、DNA2.0(カリフォルニア州メンローパーク)から購入することができ、XbaI認識を有する複数のクローニング部位も概して含有する。構築物を受容すると、それが再構築され、化学的にコンピテントな大腸菌に変換され得る。本発明には、NEB
DH5−αコンピテント大腸菌を使用する。典型的なクローンマップは図3に示す。変換は、NEBの指示に従って、100ngのプラスミドを用いて行う。プロトコルは次の通りである。
1. 氷上のNEB 5−αコンピテント大腸菌細胞の管を10分間解凍する。
2. 1pg〜100ngのプラスミドDNAを含有する1〜5μLを細胞混合物に添加する。管を慎重に4〜5回振り、細胞とDNAを混合する。ボルテックスしないこと。
3. 混合物を30分間氷上に置く。混ぜないこと。
4. 42℃で正確に30秒間熱ショックを与える。混ぜないこと。
5. 5分間氷上に置く。混ぜないこと。
6. 室温のSOCを950μLピペットで混合物に入れる。
7. 37℃で60分間置く。激しく振盪させる(250rpm)か、または回転させる。
8. 選択プレートを37℃に温める。
9. 管を振り、逆さにすることによって完全に細胞を混合する。
10. 50〜100μLの各希釈物を選択プレートに広げ、37℃で一晩インキュベートする。あるいは、30℃で24〜36時間または25℃で48時間インキュベートする。
表16.G−CSF配列
cDNAの調製のためのPCR手順を、Kapa Biosystems(Woburn,MA)による2×KAPA HiFi(商標)HotStart ReadyMixを用いて行う。このシステムには、2×KAPA ReadyMix12.5μL、順方向プライマー(10uM)0.75μL、逆方向プライマー(10uM)0.75μL、鋳型cDNA100ng、および25.0μLに希釈したdH20が含まれる。反応条件は、95℃で5分間、98℃で20秒間を25サイクル、その後58℃で15秒間、続いて72℃で45秒間、次いで72℃で5分間、次いで4℃で終了までである。
、mRNAにおけるポリ(A)尾部の長さを調節することができる。
実施例3.インビトロ転写(IVT)
インビトロ転写反応により、修飾ヌクレオチドまたは修飾RNAを含有するmRNAを生成する。投入するヌクレオチドトリホスフェート(NTP)混合物は、天然および非天然のNTPを用いてで自家作製したものである。
1. 鋳型cDNA 1.0μg
2. 10倍転写緩衝液(400mM Tris−HCl pH8.0、190mM MgCl2、50mM DTT、10mMスペルミジン)2.0μL
3. カスタムNTP(25mMずつ)7.2μL
4. RNase阻害剤 20U
5. T7 RNAポリメラーゼ 3000U
6. dH20 最大20.0μL
7. 37℃で3時間〜5時間のインキュベーション。
実施例4.mRNAの酵素キャッピング
mRNAのキャッピングを、次のように行い、混合物には、IVT RNAが60μg〜180μgおよびdH20が最大72μL含まれる。混合物を、65℃で5分間インキュベートしてRNAを変性させ、その後すぐに氷上に移す。
実施例5.ポリAテーリング反応
cDNAにポリTがない場合、最終産物を浄化する前に、ポリAテーリング反応を行う必要がある。これは、キャップされたIVT RNA(100μL)、RNase阻害剤(20U)、10倍テーリング緩衝液(0.5M Tris−HCl(pH8.0)、2.5M NaCl、100mM MgCl2)(12.0μL)、20mM ATP(6.0μL)、ポリAポリメラーゼ(20U)、dH20最大123.5μLを混合し、37℃で30分間インキュベートすることによって行う。ポリA尾部が既に転写物中に存在する場合、テーリング反応を省略し、直接AmbionのMEGAclear(商標)kit(最大500μg)での浄化に進んでもよい。ポリAポリメラーゼは、好ましくは、酵母に発現される組み換え酵素である。
実施例6.天然の5’キャップおよび5’キャップ類似体
修飾RNAの5’キャッピングは、製造業者のプロトコルに従って、次の化学的RNAキャップ類似体を用いたインビトロ転写反応の際に付随して完了し得、5’グアノシンキャップ構造が生成される:3’−O−Me−m7G(5’)ppp(5’)G、G(5’)ppp(5’)A、G(5’)ppp(5’)G、m7G(5’)ppp(5’)A、m7G(5’)ppp(5’)G(New England BioLabs、マサチューセッツ州イプスウィッチ)。修飾RNAの5’キャッピングは、ワクシニアウイルスキャッピング酵素を用いて転写後に完了し、「キャップ0」構造:m7G(5’)ppp(5’)G(New England BioLabs、マサチューセッツ州イプスウィッチ)を生成し得る。キャップ1構造は、ワクシニアウイルスキャッピング酵素および2’−Oメチルト−ランスフェラーゼの両方を用いて生成され得、m7G(5’)ppp(5’)G−2’−O−メチルが得られる。キャップ2構造は、2’−Oメチル−トランスフェラーゼを用いて、5’末端から3番目のヌクレオチドの2’−O−メチル化の後に、キャップ1構造から生成され得る。キャップ3構造は、2’−Oメチル−トランスフェラーゼを用いて、5’末端から4番目のヌクレオチドの2’−O−メチル化の後に、キャップ2構造から生成され得る。酵素は、好ましくは組み換え源に由来する。
実施例7.化学的キャップ対酵素的に抽出されたキャップタンパク質発現アッセイ
ARCAを含有するヒトG−CSFをコードする合成mRNAを、等濃度でヒト初代ケラチノサイトにトランスフェクトすることができる。トランスフェクションの6、12、24、および36時間後に、培養培地に分泌されたG−CSFの量を、ELISAによってアッセイすることができる。培地中により高レベルのG−CSFを分泌する合成mRNAは、より高度は翻訳的にコンピテントなキャップ構造を有する合成mRNAに対応する。
実施例8.化学的キャップ対酵素的に抽出されたキャップ純度分析
ARCAキャップ類似体またはキャップ1構造の粗製合成産物を含有する、ヒトG−CSFをコードする合成mRNAを、変性アガロース−尿素ゲル電気泳動またはHPLC分析を用いて、純度について比較することができる。電気泳動により単一の集約された帯域を有する合成mRNAは、複数の帯域または筋状の帯域を有する合成mRNAと比較して、より高い純度の産物に対応する。単一のHPLCピークを有する合成mRNAもより高
い純度の産物に対応する。より高効率のキャッピング反応により、より純粋なmRNA集団が得られる。
実施例9.化学的キャップ対酵素的に抽出されたキャップサイトカイン分析
ARCAキャップ類似体またはキャップ1構造を含有する、ヒトG−CSFをコードする合成mRNAを、複数の濃度でヒト初代ケラチノサイトにトランスフェクトすることができる。トランスフェクションの6、12、24、および36時間後に、培養培地に分泌されたTNF−αおよびIFN−β等の炎症促進性サイトカインの量を、ELISAによってアッセイすることができる。培地中により高レベルの炎症促進性サイトカインを分泌する合成mRNAは、免疫活性化キャップ構造を有する合成mRNAに対応する。
実施例10.化学的キャップ対酵素的に抽出されたキャップキャッピング反応効率
ARCAキャップ類似体またはキャップ1構造を含有する、ヒトG−CSFをコードする合成mRNAを、キャップされたmRNAのヌクレアーゼ処理の後に、LC−MSによってキャッピング反応効率について分析することができる。キャップされたmRNAのヌクレアーゼ処理により、LC−MSによって検出可能な遊離ヌクレオチドとキャップされた5’−5−トリホスフェートキャップ構造の混合物が得られる。LC−MSスペクトル上のキャップされた生成物の量は、反応からの全mRNAの割合(%)として表すことができ、キャッピング反応効率に対応するであろう。より高いキャッピング反応効率を有するキャップ構造は、LC−MSにより、より高い量のキャップされた生成物を有するであろう。
実施例11.修飾RNAまたはRT PCR産物のアガロースゲル電気泳動
個々の修飾RNA(20μL体積中200〜400ng)または逆転写されたPCR産物(200〜400ng)を、非変性1.2%アガロースE−ゲル(Invitrogen、カリフォルニア州カールスバッド)のウェルに充填し、製造業者のプロトコルに従って12〜15分間泳動させる。
実施例12.Nanodrop修飾RNAの定量化およびUVスペクトルデータ
TE緩衝液(1μL)中の修飾RNAを、Nanodrop UV吸光読み取りに使用して、インビトロ転写反応からの各RNAの収率を定量化する。
実施例13.変動するポリA尾部長さを含有する修飾RNAのインビトロ転写
修飾mRNAは、ヌクレオチド混合物が修飾ヌクレオチドを含有することを除いては、インビトロ転写のための標準の実験室方法および物質を用いて作成した。本実施例の修飾mRNAは5−メチシトシンおよびシュードウリジンを含んだ。目的とする遺伝子のオープンリーディングフレーム(ORF)は、アデノシン類似体を組み込まない修飾RNAに対するポリA尾部の鋳型付加のために、強力なコザック翻訳開始シグナルを含有する5’非翻訳領域(UTR)およびオリゴ(dT)配列で終結するα−グロビン3’UTRに隣接する。アデノシン含有修飾RNAを、転写後ポリ(A)ポリメラーゼポリ(A)尾部を可能にするようにオリゴ(dT)配列なしで合成される。0nts、80nts、120nts、160ntsのポリA尾部長さをヒトG−CSFに対して作成した。G−CSF配列は、cDNA配列(配列番号4257)、mRNA配列(配列番号4258)、およびタンパク質配列(配列番号4259)を含む。G−CSFの検出は、順方向プライマーTTG GAC CCT CGT ACA GAA GCT AAT ACG(配列番号4260)、鋳型ポリ(A)尾部T(120)CT TCC TAC TCA GGC TTT ATT CAA AGA CCA(配列番号4261)のための逆方向プライマー、および転写後ポリ(A)ポリメラーゼ尾部CTT CCT ACT CAG GCT
TTA TTC AAA GAC CA(配列番号4262)のための逆方向プライマーを含む、cDNAのためのプライマープローブセットによって実施してもよい。検出はまた、G−CSF修飾核酸分子逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)順方向プライマーTGG CCG GTC CCG CGA CCC AA(配列番号4263)および逆方向プライマーGCT TCA CGG CTG CGC AAG AT(配列番号4264)によって実施してもよい。
実施例14.マイクロRNA結合部位を有する修飾核酸の発現
ヒト胎児由来腎臓上皮細胞(HEK293A)および一次ヒト肝細胞(Hepatocytes)を、1ウェルあたり200,000個の細胞密度にて500μlの細胞培地(Celsis(イリノイ州シカゴ)のInVitro GRO培地)中に播種した。α−グロビン3’UTRを有するG−CSF mRNA(G−CSF α)(cDNA配列は配列番号4265に示される;mRNA配列は配列番号4266に示される;配列に示されていないおよそ160ヌクレオチド長のポリA尾部;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシチジンおよびシュードウリジンで完全修飾されている)、α−グロビン3’UTRおよびmiR−122結合部位を有するG−CSF mRNA(G−CSF miR−122)(cDNA配列は配列番号4267に示される;mRNA配列は配列番号4268に示される;配列に示されていないおよそ160ヌクレオチド長のポリA尾部;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシチジンおよびシュードウリジンで完全修飾されている)、またはシード欠失した4つのmiR−122結合部位を伴うα−グロビン3’UTRを有するG−CSF mRNA(シードなしG−CSF)(cDNA配列は配列番号4269に示される;mRNA配列は配列番号4270に示される;配列に示されないおよそ160ヌクレオチド長のポリA尾部;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシチジンおよびシュードウリジンで完全修飾されている)を、24ウェルプレートにて1ウェルにつき250ngの濃度で試験した。G−CSFの発現をELISAによって測定し、結果を表17に示す。
表17.miR−122結合部位
実施例15.シュードウリジンおよびN1−メチル−シュードウリジンの対象のSAR
ピリミジンヌクレオシドシュードウリジンへの最近の注目に伴い、一連の構造活性研究は、シュードウリジンまたはN1−メチル−シュードウリジン(pseudourdine)への修飾を含むmRNAを研究するように設計された。
われる場合の、鎖長の効果、増加した親油性、環構造の存在、および疎水性または親水性相互作用の変化を調査するために設計された。安定性も研究する。
表18.シュードウリジンおよびN1-メチルシュードウリジンSAR
天然および非天然ヌクレオシドを、目的とするポリペプチドをコードするmRNA内に組み込む。これらの例を表20および21に示す。ある特定の市販のヌクレオシドトリホスフェート(NTP)を本発明のポリヌクレオチド中で研究する。これらの選択肢を表20に示す。次いで、結果として得られるmRNAを、タンパク質を産生する、サイトカインを誘導する、および/または治療的成果を生じるその能力について検査する。
表20.天然および非天然ヌクレオシド
天然および非天然ヌクレオシドを、目的とするポリペプチドをコードするmRNA内に組み込む。核酸塩基および炭水化物(糖)の両方に対する修飾を有する市販のヌクレオシドおよびNTPを、mRNA内に組み込まれ、タンパク質を産生し、サイトカインを誘導し、かつ/または治療的成果を生み出すその能力について検査する。これらのヌクレオシドの例を表22および23に示す。
表22.組み合わせ修飾
実施例18.シグナル配列交換研究
ヒト顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)をコードするmmRNA(mRNA配列は配列番号4258に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)の複数の変異体を、修飾ヌクレオチドシュードウリジンおよび5−メチルシトシン(シュード−U/5mC)を用いて合成した。これらの変異体には、野生型N末端分泌シグナルペプチド配列(MAGPATQSPMKLMALQLLLWHSALWTVQEA;配列番号4271)、非分泌シグナルペプチド配列、または他
のmRNAから得た分泌シグナルペプチド配列のいずれかをコードするG−CSF構築物が含まれた。これらは、野生型G−CSFシグナルペプチド配列がヒトα−1−抗トリプシン(AAT)(MMPSSVSWGILLLAGLCCLVPVSLA;配列番号4272)、ヒト第IX因子(FIX)(MQRVNMIMAESPSLITICLLGYLLSAECTVFLDHENANKILNRPKR;配列番号4273)、ヒトプロラクチン(Prolac)(MKGSLLLLLVSNLLLCQSVAP;配列番号4274)、またはヒトアルブミン(Alb)(MKWVTFISLLFLFSSAYSRGVFRR;配列番号4275)のいずれかのシグナルペプチド配列で置換された配列を含んでいた。
表24.シグナルペプチド交換
3’UTRを隣接する領域に提供し得る。複数の3’UTRが隣接する領域に含まれていてもよく、同じ配列または異なる配列であってもよい。何も含まない場合も含め、隣接する領域の任意の部分はコドン最適化されていてもよく、いずれも1つ以上の異なる構造的または化学的修飾を、コドン最適化の前および/または後に、独立して含有することができる。
実施例20.ポリヌクレオチド輸送の変化:NLSおよびNES
本発明のポリヌクレオチドに組み込まれ得る2つの核外輸送シグナル(NES)として、Muller,et al(Traffic,2009,10:514−527)に報告されるものが挙げられ、これらは遺伝子COMMD1を介するシグナル伝達と関連する。これらは、NES1、PVAIIELEL(配列番号4276)およびNES2、VNQILKTLSE(配列番号4277)である。
細胞株またはマウスに、コードされたNLSまたはNESを有する1つ以上のポリヌクレオチドを投与する。投与の際、ポリヌクレオチドは代替的な位置、例えば、NLSを用いる核内へ輸送される。NLSを有するポリペプチドは、生存シグナルまたは死のシグナルのいずれかを核の微小環境に送達するであろう核に送達されるであろう。核に局在化され得るポリペプチドは、細胞、組織、または生物体に対する治療上有益な方法で細胞の発現プロファイルを変化させるように機能し得るDNAのための、変化した結合特性を有するものを含む。
2009;10:514−527)およびvan de Sluis et al,(J Clin Invest.2010;120(6):2119−2130)に従ってCOMMD1 mut1/mut2+NLS(例えば、両方の分裂したNESシグナル+加えられたNLS)をコードする。シグナル配列はポリペプチドまたは翻訳不可能な組換え配列をコードし得る。コードされたシグナル配列はHIF1−αと相互作用して、癌細胞のトランスクリトーム(transcritome)を変化させるであろう。
一度特定されると、HIF1−α依存性ポリヌクレオチドを癌細胞株中で試験し、クローン生存またはアポトーシスのマーカーを測定し、対照または偽治療細胞と比較する。
実施例21.ポリヌクレオチドにおけるセンサー配列として有用なmiRNA結合部位(BS)
miRNA結合部位を、特異的細胞(正常細胞および/または癌細胞)に対する細胞傷害性または細胞保護的mRNA治療薬を目的とする、mRNA治療薬の3’UTRにおいて使用する。
IFsh)を含む。
次いで、インビボでの動物試験を本明細書に開示されたモデルのいずれか、または市販の正所性HCCモデルを用いて実施する。
実施例22.ポリヌクレオチドの研究のための細胞株
本発明のまたは国際出願第PCT/US2012/69610号(参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)に記載のポリヌクレオチドを含む本発明のポリヌクレオチドおよび製剤が、多くの癌細胞株または正常細胞株において調査され得る。本発明において有用な細胞株はATCC(ヴァージニア州マナッサス)の細胞株を含み、表25に列挙される。
表25.細胞株
RNA結合タンパク質はタンパク質として、および/またはそのようなタンパク質をコードする核酸として提供され得る。RNA結合タンパク質は、RNA安定性およびタンパク質翻訳の調節において多数の役割を果たす。いくつかの実施形態において、RNA結合タンパク質は、本発明の要素を有するタンパク質および/または核酸形態で提供される。そのようなRNA結合タンパク質として、限定されないが、表26に列挙されるもの(ENSG数に加えて、対応遺伝子および1つ以上のENST数の同定、各々の転写性の変異形の特定)が挙げられる。
表26.RNA結合タンパク質
実施例24.マイクロRNA結合部位を有する修飾核酸の発現
ヒト胎児由来腎臓上皮細胞(HEK293A)、抗原提示細胞、または単球由来樹状細胞(MDDC)、もしくはPBMC等の高発現したmir−142/146を有する細胞株を、1ウェルあたり200,000の密度にて500μlの細胞培地(Celsis(イリノイ州シカゴ)のInVitro GRO培地)中に播種した。G−CSF mRNA(mRNA配列は配列番号4258に示される;配列に示されていない少なくとも140ヌクレオチド長のポリA尾部;5’キャップ、キャップ1)、miR−142−5p結合部位を有するG−CSF mRNA(G−CSF miR−142−5p)(cDNA配列は配列番号4985に示される;mRNA配列は配列番号4986に示され、配列にしめされていない少なくとも140ヌクレオチド長のポリA尾部;5’キャップ、キャップ1)、miR−142−5p結合部位由来のシード配列を有するG−CSF mRNA(G−CSF miR−142−5p−シード)(cDNA配列は配列番号4987に示される;mRNA配列は配列番号4988に示される;配列に示されていない少なくとも140ヌクレオチド長のポリA尾部;5’キャップ、キャップ1)、シード配列を有しないでmiR−142−5p結合部位を有するG−CSF mRNA(G−CSF miR−142−5p−シードレス)(cDNA配列は配列番号4989に示され、mRNA配列は配列番号4990に示される;配列に示されていない少なくとも140ヌクレオチド長のポリA尾部;5’キャップ、キャップ1)、miR−142−3p結合部位を有するG−CSF mRNA(G−CSF miR−142−3p)(cDNA配列は配列番号4991に示される;mRNA配列は配列番号4992に示される;配列に示されていない少なくとも140ヌクレオチド長のポリA尾部;5’キャップ、キャップ1)、miR−142−3p結合部位由来のシード配列を有するG−CSF mRNA(G−CSF miR−142−3p−シード)(cDNA配列は配列番号4993に示される;mRNA配列は配列番号4994に示される;配列に示されていない少なくとも140ヌクレオチド長のポリA尾部;5’キャップ、キャップ1)、シード配列を有しないが、miR−142−3p結合部位を有するG−CSF mRNA(G−CSF miR−142−3p−シードレス)(DNA配列は配列番号4995に示される;mRNA配列は配列番号4996に示される;配列に示されていない少なくとも140ヌクレオチド長のポリA尾部;5’キャップ、キャップ1)、miR−146a結合部位を有するG−CSF mRNA(G−CSF miR−146a)(cDNA配列は配列番号4997に示される;mRNA配列は配列番号4998に示される;配列に示されていない少なくとも140ヌクレオチド長のポリA尾部;5’キャップ、キャップ1)、miR−146a結合部位由来のシード配列を有するG−CSF mRNA(G−CSF miR−146a−シード)(cDNA配列は配列番号4999に示される;mRNA配列は配列番号5000に示される;配列に示されていない少なくとも140ヌクレオチド長のポリA尾部;5’キャップ、キャップ1)、またはシード配列を有しないが、miR−146a結合部位を有するG−CSF mRNA(G−CSF miR−146a−シードレス)(cDNA配列は配列番号5001に示される;mRNA配列は配列番号5002に示される;配列に示されていない少なくともヌクレオチド長のポリA尾部;5’キャップ、キャップ1)が、1ウェルあたり250ngの濃度にて24ウェルプレート中に播種される。mRNA配列を、5−メチルシチジンおよびシュードウリジンで完全修飾されているもの、5−メチルシチジンおよび1−メチルシュードウリジンで完全修飾されているもの、シュードウリジンで完全修飾されているもの、1−メチルシュードウリジンで完全修飾されているものを含む、本明細書に記載の、および/または当該技術分野において既知の様々な化学修飾で評価し、ここでウリジン残基の25%が2−チオウリジンで修飾され、シトシン残基の25%が5−メチルシチジンで修飾される。各試料におけるG−CSFの発現はELISAによって測定される。
表27.結合部位を有するG−CSF
実施例25.修飾核酸媒介免疫刺激を抑制するAPC特異的マイクロRNA結合部位
マイクロRNAに対する結合部位を、免疫細胞においてmRNA治療薬を選択的に分解するmRNA治療薬の3’UTRにおいて使用して、mRNA治療薬送達によって引き起こされる望まれない免疫原性応答を抑制する。
実施例26.miR結合部位を有するmRNAのインビトロ発現
ヒト胎児腎臓上皮細胞(HEK293A)、抗原提示細胞、または単球由来樹状細胞(MDDC)、もしくはPBMC等の高発現したmir−142/146を有する細胞株を、1ウェルあたり200,000個の密度にて500μlの細胞培地(Celsis(イリノイ州シカゴ)のInVitro GRO培地)中に播種する。培養された細胞を、実施例24に記載のようなマイクロRNA特徴を有するまたは有しないG−CSF mRNAでトランスフェクトする。細胞は、5日間連続でトランスフェクトする。トランスフェクション複合体を、各回のトランスフェクションの4時間に取り出す。
実施例27.自然免疫応答研究のインビボ検出
核酸またはmRNAタンパク質発現、およびインビボでの免疫応答を試験するため、メスのBALB/Cマウス(n=5)に、実施例24に記載のようなマイクロRNA特徴を有するまたは有しないG−CSF mRNAを筋肉内に注射する。血液を投与の8時間後に収集する。G−CSF、TNF−α、およびIFN−αのタンパク質レベルをELISAによって決定する。
実施例28.一次幹細胞におけるmiR−122の発現
ラットおよびヒト一次幹細胞における幹細胞特異的miR−122レベルを測定した。Hela細胞、ならびに一次ラットおよびヒト幹細胞を培養し、RNAを細胞可溶化物から抽出した。ラットおよびヒト一次幹細胞におけるmiR−122レベルを、Hela細胞におけるレベルと比較した。miR−122レベルは、Hela細胞におけるレベルと
比較してそれぞれ、一次ヒト幹細胞において約6倍、一次ラット幹細胞において約12倍増加している。
実施例29.miR−122結合部位を有する修飾核酸の、肝細胞における発現
一次ラットおよびヒト肝細胞、ならびにHela細胞を、1ウェルあたり200,000個の細胞密度にて500μlの細胞培地(Celsis(イリノイ州シカゴ)のInVitro GRO培地)中に播種した。miR−1223’UTRにおいて結合部位を有するG−CSF mRNA(G−CSF miR−122−1X)(mRNA配列は配列番号4268に示される;配列に示されていないおよそ140ヌクレオチド長のポリA尾部;5’キャップ、キャップ1)、5−メチルシチジンおよびシュードウリジン(5mC/pU)で完全修飾されたもの、またはシュードウリジン(pU)もしくはシードを欠失した4つのmiR−122結合部位を有するG−CSF mRNAで完全修飾されたもの(シードなしG−CSF)(mRNA配列は配列番号4270に示される;配列に示されていないおよそ140ヌクレオチド長のポリA尾部;5’キャップ、キャップ1)、5−メチルシチジンおよびシュードウリジン(5mC/pU)で完全修飾されたもの、またはシュードウリジン(pU)で完全修飾されたものを、24ウェルプレートにて1ウェルにつき250ngの濃度で試験した。トランスフェクションの24時間後に、G−CSFの発現をELISAによって測定し、結果を表28に示す。
表28.G−CSF mir122発現
翻訳抑制および/または標的メッセンジャーRNAの分解によるマイクロRNA対照遺伝子発現。G−CSF mRNAを含有するMir−122結合部位を、肝臓細胞において翻訳的に調節した。
c/pU)で完全修飾された、3’UTRにmiR−122結合部位を有するG−CSF
mRNA(G−CSF miR−122−1X)(mRNA配列は配列番号4268に示されない;配列に示されないおよそ140ヌクレオチド長のポリA尾部;5’キャップ、キャップ1)、または5−メチルシチジンおよびシュードウリジン(5mC/pU)で完全修飾された、欠失したシードを伴う4つのmiR−122結合部位を有するG−CSF mRNA(シードなしG−CSF)(mRNA配列は配列番号4270に示される;配列に示されないおよそ140ヌクレオチド長のポリA尾部;5’キャップ、キャップ1)を、24ウェルプレートにて1ウェルにつき250ngの濃度で試験した。トランスフェクションの24時間後に、G−CSFの発現をELISAによって測定した。G−CSF剤(mRNA)レベルおよびタンパク質レベルを表29に示す。
表29.G−CSF薬剤およびタンパク質濃度
コザックおよび/またはIRES配列を有するまたは有しないG−CSFをコードする修飾mRNA、ならびにそれらの対応するcDNA配列を、以下の表30に示す。表30において、各配列の開始コドンには下線を引いている。
表30.G−CSF配列
実施例32.α−グロビンUTRにおける修飾mRNA配列およびmiR−122配列
G−CSF、またはヒトもしくはマウスα−グロビン3’UTRにmir−122配列を有する第IX因子をコードする修飾mRNA、ならびにそれらの対応するcDNA配列を、以下表31に示す。表31において、各配列の開始コドンには下線を引いている。
表31.G−CSFおよびFIX配列
実施例33.微生理学的システム
本明細書に記載のポリヌクレオチド、一次構築物、および/またはmmRNAは、緩衝剤、脂質ナノ粒子、およびPLGA等の本明細書に記載の方法のうち1つを用いて処方される。その後、これらの製剤を、これら各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第WO2013086502号、同第WO2013086486号、および同第WO2013086505号に記載される臓器チップから作成された微生理学的システムに投与するかまたはそれと接触させる。
実施例34.非翻訳領域における翻訳エンハンス要素(TEE)
本明細書に記載のポリヌクレオチド、一次構築物、および/またはmmRNAにおける5’および/または3’非翻訳領域(UTR)は、少なくとも1つの翻訳エンハンス要素(TEE)を含み得る。5’UTRおよび/または3’UTR中に含まれ得るそのようなTEEは、限定されないが、それらの部分および/または断片を有する表32に列挙されるTEEを含む。TEE配列は、表28に開示されるTEE配列の少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、または99%以上を含んでいてもよく、および/またはTEE配列は、表32に開示されるTEE配列の5〜30ヌクレオチド長断片、5〜25ヌクレオチド長断片、5〜20ヌクレオチド長断片、5〜15ヌクレオチド長断片、5〜10ヌクレオチド長断片を含んでいてもよい。
表32.TEE配列
マイクロRNAは、翻訳抑制および/または標的メッセンジャーRNAの分解を介して、遺伝子発現を制御する。ヒトまたはマウスα−グロビン3’非翻訳領域(UTR)を有するG−CSF mRNAおよび第IX因子mRNAの発現を、3’UTRにてmiR−122配列を用いてヒト一次肝細胞内で下方制御した。
ヒトα−グロビン3’UTRを有するG−CSF mRNA(G−CSF Hs3’UTR;配列番号5716に示されるmRNA配列;配列に示されていないおよそ140ヌクレオチド長のポリA尾部;5’キャップ、キャップ1)、またはマウスα−グロビン3
’UTR(G−CSF Mm3’UTR;配列番号5717に示されるmRNA配列;配列に示されていないおよそ140ヌクレオチド長のポリA尾部;5’キャップ、キャップ1)を、5−メチルシチジンおよび1−メチルシュードウリジンで完全修飾した。3’UTRにmiR−122配列を有するヒト3’UTRを含有するG−CSF mRNA(G−CSF Hs3’UTR miR−122;配列番号5018に示されるmRNA配列;配列に示されていないおよそ140ヌクレオチド長のポリA尾部;5’キャップ、キャップ1)、または3’UTRにおけるmiR−122シード配列(G−CSF Hs3’UTR miR−122シード;配列番号5020に示されるmRNA配列;配列に示されていないおよそ140ヌクレオチド長のポリA尾部;5’キャップ、キャップ1)、または3’UTRにシード配列を有しない(G−CSF Hs3’UTR miR−122シードレス;配列番号5022に示されるmRNA配列;配列に示されていないおよそ140ヌクレオチド長のポリA尾部;5’キャップ、キャップ1)を、5−メチルシチジンおよび1−メチルシュードウリジンで完全修飾した。3’UTRにmiR−122配列を有するマウス3’UTRを含有するG−CSF mRNA(G−CSF Mm3’UTR
miR−122;配列番号5024に示されるmRNA配列;配列に示されていないおよそ140ヌクレオチド長のポリA尾部;5’キャップ、キャップ1)、または3’UTRにおけるmiR−122シード配列(G−CSF Mm3’UTR miR−122シード;配列番号5026に示されるmRNA配列;配列に示されていないおよそ140ヌクレオチド長のポリA尾部;5’キャップ、キャップ1)、または3’UTRにシード配列を有しないmiR−122配列(G−CSF Mm3’UTR miR−122シードレス;配列番号5028に示されるmRNA配列;配列に示されていないおよそ140ヌクレオチド長のポリA尾部;5’キャップ、キャップ1)を、5−メチルシチジンおよび1−メチルシュードウリジンで完全修飾した。
miR−122;配列番号5036に示されるmRNA配列;配列に示されていないおよそ140ヌクレオチド長のポリA尾部;5’キャップ、キャップ1)、または3’UTRにおけるmiR−122シード配列(第IX因子Mm3’UTR miR−122シード;配列番号5038に示されるmRNA配列;配列に示されていないおよそ140ヌクレオチド長のポリA尾部;5’キャップ、キャップ1)、または3’UTRにシード配列を有しないmiR−122配列(第IX因子Mm3’UTR miR−122シードレス;配列番号5040に示されるmRNA配列;配列に示されていないおよそ140ヌクレオチド長のポリA尾部;5’キャップ、キャップ1)を、5−メチルシチジンおよび1−メチルシュードウリジンで完全修飾した。
表33.G−CSFタンパク質発現
HeLaおよびRAW264細胞を、それぞれ1ウェルあたり17000の密度、および1ウェルあたり80000の密度で100μlの細胞培地(DMEM+10%FBS)に播種した。
miR−142−3p;配列番号4992に示されるmRNA配列;配列に示されていないおよそ140ヌクレオチド長のポリA尾部;5’キャップ、キャップ1)、または3’UTRにおけるmiR−142−3pシード配列(G−CSF miR−142−3pシード;配列番号4994に示されるmRNA配列;配列に示されていないおよそ140ヌクレオチド長のポリA尾部;5’キャップ、キャップ1)、または3’UTRにシード配列を有しないmiR−142−3p配列(G−CSF miR−142−3pシードレス;配列番号4996に示されるmRNA配列;配列に示されていないおよそ140ヌクレオチド長のポリA尾部;5’キャップ、キャップ1)を、5−メチルシチジンおよび1−メチルシュードウリジンで完全修飾した。
表35.G−CSF発現
HeLa細胞を1ウェルあたり17000個の細胞密度にて100μlの細胞培地(DMEM+10%FBS)に播種した。IRES配列およびコザック配列を有するG−CSF mRNA(G−CSF IRESコザック;配列番号5004に示されるmRNA配列;配列に示されていないおよそ140ヌクレオチド長のポリA尾部;5’キャップ、キャップ1)、IRES配列を有するがコザック配列を有しないG−CSF mRNA(G−CSF IRES;配列番号5006に示されるmRNA配列;配列に示されていないおよそ140ヌクレオチド長のポリA尾部;5’キャップ、キャップ1)、IRESまたはコザック配列を有しないG−CSF mRNA(コザックなしGCSF;配列番号5008に示されるmRNA配列;配列に示されていないおよそ140ヌクレオチド長のポリA尾部;5’キャップ、キャップ1)、またはコザック配列を有するG−CSF配列(G
−CSFコザック;配列番号5720に示されるmRNA配列;配列に示されていないおよそ140ヌクレオチド長のポリA尾部;5’キャップ、キャップ1)を、5−メチルシチジンおよび1−メチルシュードウリジンで完全に修飾されたもので完全に修飾され、1ウェルあたり75ngの濃度で24ウェルプレートにて試験した。トランスフェクションの24時間後、G−CSFの発現をELISAによって測定し、結果を表36に示す。
表36.G−CSF発現
ヒトまたはマウスMALAT1配列、およびそれらの対応するcDNA配列を有するG−CSFまたはmCherryをコードする修飾mRNAを、以下の表37に示す。表37において、各配列の開始コドンには下線を引き、MALAT1配列は太字にしてある。
表37.MALAT1構築物
実施例39.非相同5’UTRの利用
5’UTRが、本発明の核酸、修飾核酸、またはmmRNAに隣接する領域として提供され得る。5’UTRは、本発明の核酸、修飾核酸、またはmmRNA中に見出されるコード領域と、相同または非相同であり得る。複数の5’UTRが隣接する領域に含まれていてもよく、同じ配列または異なる配列であってもよい。何も含まない場合も含め、隣接する領域の任意の部分はコドン最適化されていてもよく、いずれも1つ以上の異なる構造的または化学的修飾を、コドン最適化の前および/または後に、独立して含有することができる。
実施例40.5’非翻訳領域のさらなる利用
5’UTRは、本発明の核酸、修飾核酸、またはmmRNAと隣接する領域として提供され得る。5’UTRは、本発明の核酸、修飾核酸、またはmmRNA中に見出されるコード領域と、相同または非相同であり得る。複数の5’UTRが隣接する領域に含まれていてもよく、同じ配列または異なる配列であってもよい。何も含まない場合も含め、隣接する領域の任意の部分はコドン最適化されていてもよく、いずれも1つ以上の異なる構造的または化学的修飾を、コドン最適化の前および/または後に、独立して含有することができる。
本発明の核酸、修飾核酸、またはmmRNAの1つ以上の性質を変化させるために、本発明の核酸、修飾核酸、またはmmRNAのコード領域に非相同である5’UTRを本発明の化合物内に操作する。その後、核酸、修飾核酸、またはmmRNAを、細胞、組織、または生物体に投与し、タンパク質レベル、局在性、および/または半減期等の結果を測定して、非相同5’UTRが本発明の核酸、修飾核酸、またはmmRNAに有し得る有益な効果を評価する。A、T、C、またはGを含む1つ以上のヌクレオチドが終端に添加されるかまたは除去される、5’UTRの変異形が使用され得る。5’UTRはまた、コドン最適化されていても、または本明細書に記載されるいずれかの方法で修飾されていてもよい。
表38.5′−非翻訳領域
トランスフェクションの前日、20,000個のHeLa細胞(ATCC番号CCL−2;ヴァージニア州マナッサス)を、Trypsin−EDTA溶液(LifeTechnologies、ニューヨーク州グランドアイランド)で処理することによって収集し、96ウェル細胞培養プレート(Corning、ヴァージニア州マナッサス)にて総体積1ウェルあたり100μlのEMEM培地(10%FCSおよび1×Glutamaxで補充)で播種した。細胞を37℃で5%のCO2雰囲気下において一晩育成した。翌日、37.5ng、75ng、または150ngの5UTR−001に対する核酸配列を含むG−CSF 修飾RNA(配列番号5に示されるmRNA配列;配列に示されていないおよそ140ヌクレオチド長のポリA尾部;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシチジンおよび1−メチルシュードウリジンで完全修飾した)、5UTR−68515に対す
る核酸配列を含むG−CSF修飾RNA(配列番号5732に示されるmRNA配列;配列に示されていないおよそ140ヌクレオチド長のポリA尾部;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシチジンおよび1−メチルシュードウリジンで完全修飾した)、5UTR−68516に対する核酸配列を含むG−CSF修飾RNA(配列番号5733に示されるmRNA配列;配列に示されていないおよそ140ヌクレオチド長のポリA尾部;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシチジンおよび1−メチルシュードウリジンで完全修飾した)、5UTR−68521に対する核酸配列を含むG−CSF修飾RNA(配列番号5738に示されるmRNA配列;配列に示されていないおよそ140ヌクレオチド長のポリA尾部;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシチジンおよび1−メチルシュードウリジンで完全修飾した)、または5UTR−68522に対する核酸配列を含むG−CSF修飾RNA(配列番号5739に示されるmRNA配列;配列に示されていないおよそ140ヌクレオチド長のポリA尾部;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシチジンおよび1−メチルシュードウリジンで完全修飾した)を、10μlの最終体積のOPTI−MEM(LifeTechnologies、ニューヨーク州グランドアイランド)中に希釈した。Lipofectamine 2000(LifeTechnologies、ニューヨーク州グランドアイランド)をトランスフェクション試薬として使用し、0.2μlを10μlの最終用量のOPTI−MEM中に希釈した。室温でインキュベートした5分後、両方の溶液を合わせ、さらに15分間室温でインキュベートした。その後、20μlの合わせた溶液を、HeLa細胞を含有する100μlの細胞培地に添加し、室温でインキュベートした。
表39.非相同5’UTRからのG−CSFタンパク質産生
HeLa細胞を1ウェルあたり15,000個の細胞密度にて100μlの細胞培地(DMEM+10%FBS)に播種した。コザック配列を有するG−CSF mRNA(G−CSFコザック;配列番号5004に示されるmRNA配列;配列に示されていないおよそ140ヌクレオチド長のポリA尾部;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシチジンおよび1−メチルシュードウリジンで完全修飾した)、またはコザック配列を有しないG−CSF mRNA(コザックなしG−CSF;配列番号5008に示されるmRNA配列;配列に示されていないおよそ140ヌクレオチド長のポリA尾部;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシチジンおよび1−メチルシュードウリジンで完全修飾した)、1ウェルあたり75ngの濃度にて96ウェルプレートで三重でトランスフェクトした。トランスフェクションの24時間、48時間、および72時間後に、上澄みを回収し、G
−CSFの発現をELISAによって測定し、結果を表40に示す。表40.G−CSF発現
目的とするポリペプチドをコードし、ポリA配列およびキャップを有するmRNAは、本明細書に記載の化学変化、および/または同時係属出願であり、この内容が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際公開第WO2013052523号に記載の化学変化のうち少なくとも1つで完全修飾され、mRNAは表41の5’UTRを含む。HeLa細胞を細胞培地に播種し、mRNAによって所定の濃度(1ウェルあたりのng)でウェルプレートにおいてトランスフェクトする。トランスフェクション後、所定の間隔(例えば、2時間、4時間、6時間、8時間、10時間、12時間、14時間、16時間、
18時間、20時間、22時間、24時間、36時間、48時間、60時間、および/または72時間)で、上澄みを回収し、タンパク質の発現をELISAによって測定する。表41.5’UTR
A.バイオアナライザー
20、40、80、100、120、140、もしくは160ヌクレオチド長のポリA尾部を有する、もしくはポリA尾部を有しない、修飾G−CSF mRNA(配列番号5745に示されるmRNA配列;5−メチルシチジンおよび1−メチルシュードウリジン(5mc/1mpU)で完全修飾した、または1−メチルシュードウリジン(1mpU)で完全修飾した5’キャップ、キャップ1)、修飾第IX因子(FIX)mRNA(配列
番号5746に示されるmRNA配列;5−メチルシチジンおよび1−メチルシュードウリジン(5mc/1mpU)で完全修飾した、または1−メチルシュードウリジン(1mpU)で完全修飾した5’キャップ、キャップ1)、修飾エリスロポエチン(EPO)mRNA(配列番号5747に示されるmRNA配列;5−メチルシチジンおよび1−メチルシュードウリジン(5mc/1mpU)で完全修飾した、または1−メチルシュードウリジン(1mpU)で完全修飾した5’キャップ、キャップ1)、または修飾mCherry mRNA(配列番号5748に示されるmRNA配列;5−メチルシチジンおよび1−メチルシュードウリジン(5mc/1mpU)で完全修飾した、または1−メチルシュードウリジン(1mpU)で完全修飾した5’キャップ、キャップ1)を、バイオアナライザー(Agilent 2100バイオアナライザー)によって分析した。全ての試料は、バイオマーカーによって決定して、mRNAの完全性を維持した。
ヒト一次包皮線維芽細胞(BJ線維芽細胞)をAmerican Type Culture Collection(ATCC)(カタログ番号CRL−2522)から入手し、5%のCO2下において37℃で、10%のウシ胎仔血清を補充したイーグルMinimum Essential培地(ATCC、カタログ番号11095−114)中で育成した。BJ線維芽細胞を24ウェルプレートにおいて1ウェルあたり100,000個の細胞密度で、0.5mlの培地中に播種した。20、40、80、100、120、140、もしくは160ヌクレオチド長のポリA尾部を有する、もしくはポリA尾部を有しない、250ngの修飾G−CSF mRNA(配列番号5745に示されるmRNA配列;5−メチルシチジンおよび1−メチルシュードウリジン(5mc/1mpU)で完全修飾した、または1−メチルシュードウリジン(1mpU)で完全修飾した5’キャップ、キャップ1)、修飾第IX因子(FIX)mRNA(配列番号5746に示されるmRNA配列;5−メチルシチジンおよび1−メチルシュードウリジン(5mc/1mpU)で完全修飾した、または1−メチルシュードウリジン(1mpU)で完全修飾した5’キャップ、キャップ1)、修飾エリスロポエチン(EPO)mRNA(配列番号5747に示されるmRNA配列;5−メチルシチジンおよび1−メチルシュードウリジン(5mc/1mpU)で完全修飾した、または1−メチルシュードウリジン(1mpU)で完全修飾した5’キャップ、キャップ1)、または修飾mCherry mRNA(配列番号5748に示されるmRNA配列;5−メチルシチジンおよび1−メチルシュードウリジン(5mc/1mpU)で完全修飾した、または1−メチルシュードウリジン(1mpU)で完全修飾した5’キャップ、キャップ1)を、説明書に従ってLipofectamine 2000を用いてトランスフェクトした。FIX、G−CSF、およびEPOは、3重でトランスフェクトした。
表42.G−CSFタンパク質発現
A.HeLa細胞
HeLa細胞を1ウェルあたり15,000個の細胞密度にて100μlの細胞培地(DMEM+10%FBS)に播種した。3’UTRにmiR−122配列を有するG−CSF mRNA(G−CSF miR122;配列番号5024に示されるmRNA配列;配列に示されていないおよそ140ヌクレオチド長のポリA尾部;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシチジンおよび1−メチルシュードウリジンで完全修飾した)、3’UTRにまたはシード配列を有しないが、miR−122配列を有するG−CSF mRNA(G−CSFシードレス;配列番号5028に示されるmRNA配列;配列に示されていないおよそ140ヌクレオチド長のポリA尾部;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシチジンおよび1−メチルシュードウリジンで完全修飾した)を、1ウェルあたり0
.3μlのLipofectamine 2000によって1ウェルあたり75ngの濃度のmRNAで96ウェルプレートにおいてトランスフェクトした。上澄みをトランスフェクションの16〜18時間後に回収し、G−CSFの発現をELISAによって測定し、結果を表46に示す。
表46.HeLaにおけるG−CSF発現
一次ヒトまたはラット肝細胞を、1ウェルあたり350,000個の細胞密度にて500μlの細胞培地(InvitroGRO CPおよびInVitroGRO HI Medium+2.2%Torpedo Antibiotic Mix)に播種した。3’UTRにmiR−122配列を有するG−CSF mRNA(G−CSF miR12
2;配列番号5024に示されるmRNA配列;配列に示されないおよそ140ヌクレオチド長のポリA尾部;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシチジンおよび1−メチルシュードウリジンで完全修飾されている)、または3’UTRにシード配列を有しないが、miR−122配列を有するG−CSF mRNA(G−CSFシードレス;配列番号5028に示されるmRNA配列;配列に示されないおよそ140ヌクレオチド長のポリA尾部;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシチジンおよび1−メチルシュードウリジンで完全修飾されている)を、一次ヒト肝細胞および一次ラット肝細胞について24ウェルプレートにて1ウェルあたり500ngのmRNA密度で、1ウェルあたり1μlのLipofectamine 2000を用いてトランスフェクトした。上澄みをトランスフェクションの16〜18時間後に回収し、G−CSFの発現をELISAによって測定し、結果を表47に示す。mRNAにおけるmir−122結合部位配列は、一次幹細胞でのG−CSF タンパク質発現を減衰させた。
表47.肝細胞におけるG−CSF発現
A.HeLa細胞
HeLa細胞を1ウェルあたり17,000個の細胞密度にて100μlの細胞培地(DMEM+10%FBS)に播種した。3’UTRにmiR−122配列を有しないG−CSF mRNA(G−CSF;配列番号5717に示されるマウス3’UTR mRNA配列;配列に示されていないおよそ140ヌクレオチド長のポリA尾部;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシチジンおよび1−メチルシュードウリジンで完全修飾した;配列番号5716に示されるヒト3’UTR mRNA配列;配列に示されていないおよそ140ヌクレオチド長のポリA尾部;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシチジンおよび1−メチルシュードウリジンで完全修飾した)、3’UTRにmiR−122配列を有する(G−CSF miR122;配列番号5024に示されるマウス3’UTR mRNA配列;配列に示されていないおよそ140ヌクレオチド長のポリA尾部;5’キ
ャップ、キャップ1;5−メチルシチジンおよび1−メチルシュードウリジンで完全修飾した;配列番号5018に示されるヒト3’UTR mRNA配列;配列に示されていないおよそ140ヌクレオチド長のポリA尾部;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシチジンおよび1−メチルシュードウリジンで完全修飾した)、3’UTRにmiR−122シード配列を有するG−CSF mRNA(G−CSFシード;配列番号5026に示されるマウス3’UTR mRNA配列;配列に示されていないおよそ140ヌクレオチド長のポリA尾部;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシチジンおよび1−メチルシュードウリジンで完全修飾した;配列番号5020に示されるヒト3’UTR mRNA配列;配列に示されていないおよそ140ヌクレオチド長のポリA尾部;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシチジンおよび1−メチルシュードウリジンで完全修飾した)、3’UTRにシード配列を有しないが、miR−122配列を有するG−CSF mRNA(G−CSFシードレス;配列番号5028に示されるマウス3’UTR mRNA配列;配列に示されていないおよそ140ヌクレオチド長のポリA尾部;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシチジンおよび1−メチルシュードウリジンで完全修飾した;配列番号5022に示されるヒト3’UTR mRNA配列;配列に示されていないおよそ140ヌクレオチド長のポリA尾部;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシチジンおよび1−メチルシュードウリジンで完全修飾した)、3’UTRにmiR−122配列を有しない第IX因子mRNA(FIX;配列番号5719に示されるマウス3’UTR mRNA配列;配列に示されていないおよそ140ヌクレオチド長のポリA尾部;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシチジンおよび1−メチルシュードウリジンで完全修飾した;配列番号5718に示されるヒト3’UTR mRNA配列;配列に示されていないおよそ140ヌクレオチド長のポリA尾部;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシチジンおよび1−メチルシュードウリジンで完全修飾した)、3’UTRにmiR−122配列を有する第IX因子mRNA(FIX miR122;配列番号5036に示されるマウス3’UTR mRNA配列;配列に示されていないおよそ140ヌクレオチド長のポリA尾部;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシチジンおよび1−メチルシュードウリジンで完全修飾した;配列番号5030に示されるヒト3’UTR mRNA配列;配列に示されていないおよそ140ヌクレオチド長のポリA尾部;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシチジンおよび1−メチルシュードウリジンで完全修飾した)、3’UTRにmiR−122シード配列を有する第IX因子mRNA(FIXシード;配列番号5038に示されるマウス3’UTR mRNA配列;配列に示されていないおよそ140ヌクレオチド長のポリA尾部;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシチジンおよび1−メチルシュードウリジンで完全修飾した;配列番号5032に示されるヒト3’UTR mRNA配列;配列に示されていないおよそ140ヌクレオチド長のポリA尾部;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシチジンおよび1−メチルシュードウリジンで完全修飾した)、または3’UTRにシード配列を有しないが、miR−122配列を有する第IX因子mRNA(FIXシードレス;配列番号5040に示されるマウス3’UTR
mRNA配列;配列に示されていないおよそ140ヌクレオチド長のポリA尾部;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシチジンおよび1−メチルシュードウリジンで完全修飾した;配列番号5034に示されるヒト3’UTR mRNA配列;配列に示されていないおよそ140ヌクレオチド長のポリA尾部;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシチジンおよび1−メチルシュードウリジンで完全修飾した)を、1ウェルあたり0.3μlのLipofectamine 2000によって1ウェルあたり75ngの濃度のmRNAで96ウェルプレートにおいてトランスフェクトした。上澄みをトランスフェクションの16〜18時間後に回収し、G−CSFの発現をELISAによって測定し、結果を表48に示す。
表48.HeLaにおける発現
一次ヒトまたはラット肝細胞を、1ウェルあたり350,000個の細胞密度にて500μlの細胞培地(InvitroGRO CPおよびInVitroGRO HI Medium+2.2%Torpedo Antibiotic Mix)に播種した。3’UTRにmiR−122配列を有しないG−CSF mRNA(G−CSF;配列番号5717に示されるマウス3’UTR mRNA配列;配列に示されないおよそ140ヌクレオチド長のポリA尾部;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシチジンおよび1−メチルシュードウリジンで完全修飾されている;配列番号5716に示されるヒト3’UTR mRNA配列;配列に示されないおよそ140ヌクレオチド長のポリA尾部;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシチジンおよび1−メチルシュードウリジンで完全修飾されている)、3’UTRにmiR−122配列を有するG−CSF mRNA(G−
CSF miR122;配列番号5024に示されるマウス3’UTR mRNA配列;配列に示されないおよそ140ヌクレオチド長のポリA尾部;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシチジンおよび1−メチルシュードウリジンで完全修飾されている;配列番号5018に示されるヒト3’UTR mRNA配列;配列に示されないおよそ140ヌクレオチド長のポリA尾部;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシチジンおよび1−メチルシュードウリジンで完全修飾されている)、3’UTRにmiR−122シード配列を有するG−CSF mRNA(G−CSFシード;配列番号5026に示されるマウス3’UTR mRNA配列;配列に示されないおよそ140ヌクレオチド長のポリA尾部;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシチジンおよび1−メチルシュードウリジンで完全修飾されている;配列番号5020に示されるヒト3’UTR mRNA配列;配列に示されないおよそ140ヌクレオチド長のポリA尾部;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシチジンおよび1−メチルシュードウリジンで完全修飾されている)、3’UTRにシード配列を有しないが、miR−122配列を有するG−CSF mRNA(G−CSFシードレス;配列番号5028に示されるマウス3’UTR mRNA配列;配列に示されないおよそ140ヌクレオチド長のポリA尾部;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシチジンおよび1−メチルシュードウリジンで完全修飾されている;配列番号5022に示されるヒト3’UTR mRNA配列;配列に示されないおよそ140ヌクレオチド長のポリA尾部;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシチジンおよび1−メチルシュードウリジンで完全修飾されている)、3’UTRにmiR−122配列を有しない第IX因子mRNA(FIX;配列番号5719に示されるマウス3’UTR mRNA配列;配列に示されないおよそ140ヌクレオチド長のポリA尾部;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシチジンおよび1−メチルシュードウリジンで完全修飾されている;配列番号5718に示されるヒト3’UTR mRNA配列;配列に示されないおよそ140ヌクレオチド長のポリA尾部;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシチジンおよび1−メチルシュードウリジンで完全修飾されている)、3’UTRにmiR−122配列を有する第IX因子mRNA(FIX miR122;配列番号5036に示されるマウス3’UTR mRNA配列;配列に示されないおよそ140ヌクレオチド長のポリA尾部;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシチジンおよび1−メチルシュードウリジンで完全修飾されている;配列番号5030に示されるヒト3’UTR mRNA配列;配列に示されないおよそ140ヌクレオチド長のポリA尾部;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシチジンおよび1−メチルシュードウリジンで完全修飾されている)、3’UTRにmiR−122シード配列を有する第IX因子mRNA(FIXシード;配列番号5038に示されるマウス3’UTR mRNA配列;配列に示されないおよそ140ヌクレオチド長のポリA尾部;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシチジンおよび1−メチルシュードウリジンで完全修飾されている;配列番号5032に示されるヒト3’UTR mRNA配列;配列に示されないおよそ140ヌクレオチド長のポリA尾部;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシチジンおよび1−メチルシュードウリジンで完全修飾されている)、または3’UTRにシード配列を有しないが、miR−122配列を有する第IX因子mRNA(FIXシードレス;配列番号5040に示されるマウス3’UTR mRNA配列;配列に示されないおよそ140ヌクレオチド長のポリA尾部;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシチジンおよび1−メチルシュードウリジンで完全修飾されている;配列番号5034に示されるヒト3’UTR mRNA配列;配列に示されないおよそ140ヌクレオチド長のポリA尾部;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシチジンおよび1−メチルシュードウリジンで完全修飾されている)を、一次ヒト肝細胞および一次ラット肝細胞について24ウェルプレートにて1ウェルあたり500ngの濃度で、1ウェルあたり1μlのLipofectamine 2000を用いてトランスフェクトした。上澄みを、トランスフェクションの24時間、48時間、72時間後に回収し、G−CSFの発現および第IX因子をELISAによって測定し、結果を表49に示す。mRNAにおけるmir−122結合部位配列は、一次肝細胞におけるG−CSFおよび第IX因子タンパク質発現を減衰させた。
表49.肝細胞におけるG−CSF発現
A.miR−122の基準レベル
ヒト肝細胞、ラット肝細胞、ヒト肝細胞癌細胞(Hep3B)、およびHeLa細胞におけるmir−122の基準レベルを、TAQMAN(商標)分析によって説明書を用いて決定した。レベルをU6に正規化し、結果を表50に示す。
表50.様々な細胞型におけるmiR−122濃度
一次ヒト肝細胞を1ウェルあたり50,000個の細胞密度にて100μlの細胞培地(InvitroGRO CPおよびInVitroGRO HI Medium+2.2%Torpedo Antibiotic Mix)に播種し、Hep3B細胞を1ウェルあたり20,000個の細胞密度にて100μlの細胞培地(DMEM+10%FBS)に播種した。3’UTRにmiR−122配列を有しないG−CSF mRNA(G−CSF;配列番号5745に示されるmRNA配列;配列に示されないおよそ140ヌクレオチド長のポリA尾部;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシチジンおよび1−メチルシュードウリジンで完全修飾されている)、3’UTRにmiR−122配列を有するG−CSF mRNA(G−CSF miR122;配列番号5018に示されるmRNA配列;配列に示されないおよそ140ヌクレオチド長のポリA尾部;5’キャップ
、キャップ1;5−メチルシチジンおよび1−メチルシュードウリジンで完全修飾されている)、3’UTRにmiR−122シード配列を有するG−CSF mRNA(G−CSFシード;配列番号5020に示されるmRNA配列;配列に示されないおよそ140ヌクレオチド長のポリA尾部;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシチジンおよび1−メチルシュードウリジンで完全修飾されている)、または3’UTRにシード配列を有しないが、miR−122配列を有するG−CSF mRNA(G−CSFシードレス;配列番号5022に示されるmRNA配列;配列に示されないおよそ140ヌクレオチド長のポリA尾部;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシチジンおよび1−メチルシュードウリジンで完全修飾されている)を、1ウェルあたり0.3μlのLipofectamine 2000によって1ウェルあたり75ngの濃度のmRNAで96ウェルプレートにおいて、一次ヒト肝細胞およびHep3B細胞についてトランスフェクトした。上澄みを、トランスフェクションの24時間、48時間、72時間後に回収し、G−CSFの発現をELISAによって測定し、結果を表51に示す。mRNAにおけるmir−122結合部位配列は、一次ヒト肝細胞におけるG−CSFタンパク質発現を減衰させたが、Hep3B細胞におけるG−CSFタンパク質発現は減衰させなかった。
表51.G−CSF発現
A.miR−143 3pの基準レベル
RAW264.7細胞およびHeLa細胞におけるのmiR−142 3p基準レベルを、TAQMAN(商標)分析によって説明書を用いて決定した。レベルをU6に正規化し、結果を表52に示す。
表52.様々な細胞型におけるmiR−142 3p濃度
HeLa細胞を1ウェルあたり17,000個の細胞密度にて100μlの細胞培地(DMEM+10%FBS)に播種し、RAW264.71をウェルあたり20,000個の細胞密度にて100μlの細胞培地(DMEM+10%FBS)に播種した。3’UTRにmiR−142 3p配列を有しないG−CSF mRNA(G−CSF;配列番号5749に示されるmRNA配列;配列に示されないおよそ140ヌクレオチド長のポリA尾部;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシチジンおよび1−メチルシュードウリジンで完全修飾されている)、3’UTRにmiR−142 3p配列を有するG−CSF mRNA(G−CSF miR142 3p;配列番号5750に示されるmRNA配列;配列に示されないおよそ140ヌクレオチド長のポリA尾部;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシチジンおよび1−メチルシュードウリジンで完全修飾されている)
、3’UTRにmiR−142 3pシード配列を有するG−CSF mRNA(G−CSFシード;配列番号5751に示されるmRNA配列;配列に示されないおよそ140ヌクレオチド長のポリA尾部;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシチジンおよび1−メチルシュードウリジンで完全修飾されている)、または3’UTRにシード配列を有しないが、miR−142 3p配列を有する(G−CSFシードレス;配列番号5752に示されるmRNA配列;配列に示されないおよそ140ヌクレオチド長のポリA尾部;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシチジンおよび1−メチルシュードウリジンで完全修飾されている)を、1ウェルあたり0.3μlのLipofectamine 2000によって1ウェルあたり75ngの濃度のmRNAで96ウェルプレートにおいて、RAW264.7細胞についてトランスフェクトした。上澄みをトランスフェクションの16〜18時間後に回収し、G−CSFの発現をELISAによって測定し、結果を表53に示す。G−CSFにおけるmiR−142 3p部位はRAW264.7細胞においてG−CSF発現を下方制御すると示された。
表53.発現
RAW264.7細胞を1ウェルあたり6,000個の細胞密度にて100μlの細胞培地(DMEM+10%FBS)に播種した。3’UTRにmiR−142 3p配列を有しないG−CSF mRNA(G−CSF;配列番号5749に示されるmRNA配列;配列に示されないおよそ140ヌクレオチド長のポリA尾部;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシチジンおよび1−メチルシュードウリジンで完全修飾されている)、3’UTRにmiR−142 3p配列を有するG−CSF mRNA(G−CSF miR142 3p;配列番号5750に示されるmRNA配列;配列に示されないおよそ140ヌクレオチド長のポリA尾部;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシチジンおよび1−メチルシュードウリジンで完全修飾されている)、3’UTRにmiR−142 3pシード配列を有するG−CSF mRNA(G−CSFシード;配列番号5751に
示されるmRNA配列;配列に示されないおよそ140ヌクレオチド長のポリA尾部;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシチジンおよび1−メチルシュードウリジンで完全修飾されている)、または3’UTRにシード配列を有しないが、miR−142 3p配列を有するG−CSF mRNA(G−CSFシードレス;配列番号5752に示されるmRNA配列;配列に示されないおよそ140ヌクレオチド長のポリA尾部;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシチジンおよび1−メチルシュードウリジンで完全修飾されている)を、1ウェルあたり0.3μlのLipofectamine 2000によって1ウェルあたり75ngの濃度のmRNAで96ウェルプレートにおいてトランスフェクトした。上澄みを、トランスフェクションの24時間、48時間、72時間後に回収し、G−CSFの発現をELISAによって測定し、結果を表54に示す。mRNAにおけるmir−142 3p結合部位配列は、時間経過と共にRAW264.7細胞におけるG−CSF発現の強い抑制を示した。
表54.G−CSF発現
末梢血単核球(PBMC)を1ウェルあたり15,000個の細胞密度にて100μlの細胞培地(DMEM+10%FBS、トランスフェクション後に10%FBSを添加)に播種した。3’UTRにmiR−142 3p配列を有するG−CSF mRNA(G−CSF miR142 3p;配列番号5750に示されるmRNA配列;配列に示されていないおよそ140ヌクレオチド長のポリA尾部肝細胞;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシチジンおよび1−メチルシュードウリジンで完全修飾した)、3’UTRにmiR−142 3pシード配列を有する(G−CSFシード;配列番号5751に示されるmRNA配列;配列に示されていないおよそ140ヌクレオチド長のポリA尾部肝細胞;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシチジンおよび1−メチルシュードウリジンで完全修飾した)、または3’UTRにシード配列を有しないが、miR−142 3
p配列を有するG−CSF mRNA(G−CSFシードレス;配列番号5752に示される配列;配列に示されていないおよそ140ヌクレオチド長のポリA尾部肝細胞;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシチジンおよび1−メチルシュードウリジンで完全修飾した)を、1ウェルあたり0.4μlのLipofectamine 2000によって1ウェルあたり500ngの濃度のmRNAで96ウェルプレートにおいて、2人または3人のドナーについて3重にトランスフェクトした。上澄みをトランスフェクションの24時間後に回収し、G−CSFの発現をELISAによって測定した。2人のドナーについての結果を表55に示し、3人のドナーについての結果を表56に示す。mRNAにおけるmir−142 3p結合部位配列は、ヒトPBMCにおけるG−CSF発現の下方制御を示した。
表55.発現PBMC(2人のドナー)
A.BALB/Cヌードマウス
BALB/cヌードマウスに、miR−122結合部位(「非標的化mRNA」;配列番号5753に示されるmRNA配列;配列に示されていないおよそ140ヌクレオチド長のポリA尾部肝細胞;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシチジンおよび1−メチルシュードウリジンで完全修飾されている)を有しない、表57に記載の脂質ナノ粒子中に処方された0.1mg/kgのルシフェラーゼ修飾mRNA、または表58に記載の脂質ナノ粒子中に処方された3’UTRにmiR−122結合部位を有するルシフェラーゼ
修飾mRNA(「miR−122標的化mRNA」;配列番号5754に示されるmRNA配列;配列に示されていないおよそ140ヌクレオチド長のポリA尾部肝細胞;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシチジンおよび1−メチルシュードウリジンで完全修飾されている)を静脈内に注射した。表57.非標的化mRNAに対する脂質ナノ粒子
表59.操作されたmiR122結合部位によって修飾された修飾mRNAのインビボ発現
BALB/cヌードマウスに2x106個の肝細胞癌Hep3B細胞を肝臓内に埋め込み、得られた正所性腫瘍を24日間成長させた。その後、腫瘍担持マウスに、表57または表58(上記)に記載の、miR−122結合部位(「非標的化mRNA」;配列番号5753に示されるmRNA配列;配列に示されていないおよそ140ヌクレオチド長のポリA尾部肝細胞;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシチジンおよび1−メチルシュードウリジンで完全修飾されている)を有しない、表57に記載の脂質ナノ粒子中に処方された0.1mg/kgのルシフェラーゼ修飾mRNA、または表58に記載の脂質ナノ粒子中に処方された3’UTRにmiR−122結合部位を有するルシフェラーゼ修飾mRNA(「miR−122標的化mRNA」;配列番号5754に示されるmRNA配列;配列に示されていないおよそ140ヌクレオチド長のポリA尾部肝細胞;5’キャッ
プ、キャップ1;5−メチルシチジンおよび1−メチルシュードウリジンで完全修飾されている)を静脈内に注射した。処置の24時間後、動物に麻酔をかけ、ルシフェラーゼ基質D−ルシフェリンを注射し、生きている動物からの生物発光画像(BLI)をIVISイメージャーにて20分後に評価した。隣接する正常肝臓と比較して所性腫瘍からのシグナルを定量し、脂質ナノ粒子によって全身へと送達されたmiR−122標的化mRNAは、正常な肝臓と比べて腫瘍内で2倍を超える濃縮を達成した。
実施例50.修飾核酸におけるコザック配列の影響
HeLa細胞を1ウェルあたり15,000個の細胞密度にて100μlの細胞培地(DMEM+10%FBS)に播種した。コザック配列を有するG−CSF mRNA(G−CSFコザック;配列番号5716に示されるmRNA配列;配列に示されていないおよそ140ヌクレオチド長のポリA尾部;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシチジンおよび1−メチルシュードウリジンで完全修飾した)、コザック配列を有しないG−CSF mRNA(コザックなしG−CSF;配列番号5008に示されるmRNA配列;配列に示されていないおよそ140ヌクレオチド長のポリA尾部;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシチジンおよび1−メチルシュードウリジンで完全修飾した)、開始コドン上流にある−3位のAがTに変換されたG−CSF mRNA(G−CSF 3t5’;配列番号5755(表60)に示されるmRNA配列;配列に示されていないおよそ140ヌクレオチド長のポリA尾部;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシチジンおよび1−メチルシュードウリジンで完全修飾した)、開始コドンの上流にある−9位のAがTに変換されたG−CSF mRNA(G−CSF 9t5’;配列番号5756(表60)に示されるmRNA配列;配列に示されていないおよそ140ヌクレオチド長のポリA尾部;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシチジンおよび1−メチルシュードウリジンで完全修飾した)、または開始コドン(AGAGCCACC)の9ヌクレオチド長上流が欠失したG−CSF mRNA(G−CSF 9del5’;配列番号5757(表60)に示されるmRNA配列;配列に示されていないおよそ140ヌクレオチド長のポリA尾部;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシチジンおよび1−メチルシュードウリジンで完全修飾した)、および1ウェルあたり37.5ngの濃度で96ウェルプレートにおいて3重でトランスフェクトした。トランスフェクションの24時間、48時間、および72時間後に、上澄みを回収し、G−CSFの発現をELISAによって測定し、結果を表61に示す。表60において、各配列の開始コドンには下線を引いている。表60において、G−CSF 3t5’について、開始コドン上流にある−3位のAは太字にし下線を引いてあり、G−CSF 9t5’について、開始コドンの上流にある−9位のAは太字にし下線を引いてある。
表60.G−CSF配列
BJ線維芽細胞T細胞を、1ウェルあたり100,000個の細胞密度にて500μlの細胞培地(DMEM+10%FBS)に播種した。合成5’UTRを有するG−CSF
mRNA(G−CSF;配列番号5716に示されるmRNA配列;配列に示されていないおよそ140ヌクレオチド長のポリA尾部;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシチジンおよび1−メチルシュードウリジンで完全修飾した)、またはGTX遺伝子のIRESから18ヌクレオチド長配列の5回の縦列反復を伴う5’UTRを含有するG−CSF mRNA(GTX G−CSF;配列番号5758(表62)に示されるmRNA配列;配列に示されていないおよそ140ヌクレオチド長のポリA尾部;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシチジンおよび1−メチルシュードウリジンで完全修飾した)、および1ウェルあたり250ngの濃度で24ウェルプレートにおいて3重でトランスフ
ェクトした。トランスフェクションの24時間、48時間、および72時間後に、上澄みを回収し、G−CSFの発現をELISAによって測定し、結果を表63に示す。表62において、各配列の開始コドンには下線を引いてあり、GTX遺伝子のIRESからの18ヌクレオチド長配列の5回の縦列反復は太字にしてあり、18ヌクレオチド長配列の1回目、3回目、および5回目の縦列反復にもまた下線を引いてある。
表62.GTX G−CSF配列
BJ線維芽細胞T細胞を1ウェルあたり100,000個の細胞密度にて500μlの細胞培地(DMEM+10%FBS)に播種した。合成5’UTRを有するG−CSF mRNA(G−CSF;配列番号5716に示されるmRNA配列;配列に示されていないおよそ140ヌクレオチド長のポリA尾部;5’キャップ、キャップ1;1−メチルシュードウリジンで完全修飾した)、またはGTX遺伝子のIRESから18ヌクレオチド長配列の5回の縦列反復を伴う5’UTRを含有するG−CSF mRNA(Gtx G−CSF;配列番号5758(表62)に示されるmRNA配列;配列に示されていないおよそ140ヌクレオチド長のポリA尾部;5’キャップ、キャップ1;1−メチルシュードウリジンで完全修飾した)、および1ウェルあたり250ngの濃度で24ウェルプレートにおいて3重でトランスフェクトした。トランスフェクションの24時間、48時
間、および72時間後に、上澄みを回収し、G−CSFの発現をELISAによって測定し、結果を表64に示す。
表64.5’UTR
修飾核酸における5’UTRの修飾の影響を試験するために、メスのBalb/cマウス(n=3;12週齢;Harlan Laboratories(マサチューセッツ州サウスイーストン))をリポプレックス化mRNAで処置した。
A(G−CSF;配列番号5716に示されるmRNA配列;配列に示されていないおよそ140ヌクレオチド長のポリA尾部;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシチジンおよび1−メチルシュードウリジンで完全修飾した)、または開始コドンの9ヌクレオチド長上流が欠失したG−CSF mRNA(G−CSF 9del5’;配列番号5757(表60)に示されるmRNA配列;配列に示されていないおよそ140ヌクレオチド長のポリA尾部;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシチジンおよび1−メチルシュードウリジンで完全修飾した)を、無菌および無血清DMEM(Life Technologies)で希釈して200μlの総体積を得た。3匹のマウスを処理するために、全部で8μlのLipofectamine2000(LifeTechnologies、11668019)を無菌および無血清DMEM(Life Technologies、ニューヨーク州グランドアイランド;11965−118)で希釈して、200μlの総体積を得た。インキュベーションの5分後、2つの溶液を合わせ、ピペットで慎重に混合した。20分後、mRNA−Lipofectamine2000リポプレックスの形成が完了した。リポプレックス溶液を、27ゲージ注射針(BD永久装着針(permanently attached needle)(カタログ番号305935)中に29G×1/2を備える0.3mL BD SafetyGlideインスリンシリンジ)を備える無菌の1mlシリンジ(BD Falcon)に移した。2μgのリポプレックス化mRNAを含有する100μlの尾静脈内注射の前に、Balb/Cマウスを太陽灯の下に5分間置いた。注射の6時間後、マウスを麻酔にかけ、血清採集のために心穿刺によって出血させた。その後、血清試料にG−CSF ELISA(R&Dシステムズ、カタログ番号SCS50)を実施し、結果を表65に示す。開始コドンの9ヌクレオチド長上流が欠失したG−CSF mRNAは、合成UTRを有するG−CSFと比べてより高いG−CSF発現レベルを6時間の時点で有した。
表65.インビボでのG−CSFコザック発現
修飾核酸における5’UTRの修飾の影響を試験するために、メスのBalb/cマウス(n=3;12週齢;Harlan Laboratories(マサチューセッツ州サウスイーストン))をリポプレックス化mRNAで処置した。
RNA(GTX G−CSF;配列番号5758(表62)に示されるmRNA配列;配列に示されていないおよそ140ヌクレオチド長のポリA尾部;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシチジンおよび1−メチルシュードウリジンで完全修飾した)を、無菌および無血清DMEM(Life Technologies)で希釈して200μlの総体積を得た。3匹のマウスを処理するために、全部で8μlのLipofectamine2000(LifeTechnologies、11668019)を無菌および無血清DMEM(Life Technologies、ニューヨーク州グランドアイランド;11965−118)で希釈して、200μlの総体積を得た。インキュベーションの5分後、2つの溶液を合わせ、ピペットで慎重に混合した。20分後、mRNA−Lipofectamine2000リポプレックスの形成が完了した。リポプレックス溶液を、27ゲージ注射針(BD永久装着針(カタログ番号305935)中に29G×1/2を備える0.3mL BD SafetyGlideインスリンシリンジ)を備える無菌の1mlシリンジ(BD Falcon)に移した。2μgのリポプレックス化mRNAを含有する100μlの尾静脈内注射の前に、Balb/Cマウスを太陽灯の下に5分間置いた。注射の6時間後、マウスを麻酔にかけ、血清採集のために心穿刺によって出血させた。その後、血清試料にG−CSF ELISA(R&Dシステムズ、カタログ番号SCS50)を実施し、結果を表66に示す。GTX遺伝子のIRESから18ヌクレオチド長配列の5回の縦列反復を伴う5’UTRを含有するG−CSF mRNAは、合成UTRを有するG−CSFと比べてより高いG−CSF発現レベルを6時間の時点で有した。
表66.インビボでのGTX G−CSF発現
修飾核酸における5’UTRの修飾の影響を試験するために、メスのBalb/cマウス(n=3;12週齢;Harlan Laboratories(マサチューセッツ州サウスイーストン))をリポプレックス化mRNAで処置した。
RNA(GTX G−CSF;配列番号5758(表62)に示されるmRNA配列;配列に示されていないおよそ140ヌクレオチド長のポリA尾部;5’キャップ、キャップ1;1−メチルシュードウリジンで完全修飾した)を、無菌および無血清DMEM(Life Technologies)で希釈して200μlの総体積を得た。3匹のマウスを処理するために、全部で8μlのLipofectamine2000(LifeTechnologies、11668019)を無菌および無血清DMEM(Life Technologies、ニューヨーク州グランドアイランド;11965−118)で希釈して、200μlの総体積を得た。インキュベーションの5分後、2つの溶液を合わせ、ピペットで慎重に混合した。20分後、mRNA−Lipofectamine2000リポプレックスの形成が完了した。リポプレックス溶液を、27ゲージ注射針(BD永久装着針(カタログ番号305935)中に29G×1/2を備える0.3mL BD
SafetyGlideインスリンシリンジ)を備える無菌の1mlシリンジ(BD Falcon)に移した。2μgのリポプレックス化mRNAを含有する100μlの尾静脈内注射の前に、Balb/Cマウスを太陽灯の下に5分間置いた。注射の6時間後、マウスを麻酔にかけ、血清採集のために心穿刺によって出血させた。その後、血清試料にG−CSF ELISA(R&Dシステムズ、カタログ番号SCS50)を実施し、結果を表67に示す。GTX遺伝子のIRESから18ヌクレオチド長配列の5回の縦列反復を伴う5’UTRを含有するG−CSF mRNAは、合成UTRを有するG−CSFと比べてより高いG−CSF発現レベルを6時間の時点で有した。
表67.インビボでのGTX G−CSF発現
使用した単語は、限定ではなく説明のための単語であり、その広範な態様において本発明の真の範囲と精神から逸脱することなく、添付の特許請求の範囲内で変更が行われ得ることが理解される。
Claims (41)
- 化学的に修飾されたmRNAであって、
(a)目的とするポリペプチドをコードする、連結ヌクレオシドの領域と、
(b)5’非翻訳領域(5’UTR)と、
(c)少なくとも1つのmiR−142−3pマイクロRNA結合部位を含む3’非翻訳領域(3’UTR)と、
(d)連結ヌクレオシドの3’尾部領域と、
を含み、
前記mRNAにおけるウリジンヌクレオシドの全てが修飾ウリジンヌクレオシドである、化学修飾mRNA。 - 前記修飾ウリジンヌクレオシドがシュードウリジン類似体である、請求項1記載の化学修飾mRNA。
- 前記シュードウリジン類似体が1−メチルシュードウリジンである、請求項2記載の化学修飾mRNA。
- 前記mRNAにおけるシチジンヌクレオシドの全てが5−メチルシチジンヌクレオシドである、請求項1記載の化学修飾mRNA。
- 前記化学修飾mRNAの少なくとも1つの領域がコドン最適化されている、請求項1記載の化学修飾mRNA。
- 前記目的とするポリペプチドをコードする連結ヌクレオシドの前記領域がコドン最適化されている、請求項5記載の化学修飾mRNA。
- 前記5’UTRが、前記目的とするポリペプチドと非相同である、請求項1記載の化学修飾mRNA。
- 前記5’UTRが、前記目的とするポリペプチドの天然5’UTRである、請求項1記載の化学修飾mRNA。
- 前記5’UTRが、コザック配列および配列内リボソーム侵入部位(IRES)からなる群から選択される翻訳開始配列を含む、請求項8記載の化学修飾mRNA。
- 少なくとも1つの5’キャップ構造をさらに含む、請求項1記載の化学修飾mRNA。
- 前記少なくとも1つの5’キャップ構造が、Cap0、Cap1、ARCA、イノシン、N1−メチル−グアノシン、2’フルオロ−グアノシン、7−デアザ−グアノシン、8−オキソ−グアノシン、2−アミノ−グアノシン、LNA−グアノシン、2−アジド−グアノシン、Cap2、Cap4、およびCAP−003〜CAP−225からなる群から選択される、請求項10記載の化学修飾mRNA。
- 連結ヌクレオシドの前記3’尾部領域が鎖終結ヌクレオシドをさらに含む、請求項1記載の化学修飾mRNA。
- 前記鎖終結ヌクレオシドが、3’−デオキシアデノシン(コルジセピン)、3’−デオキシウリジン、3’−デオキシシトシン、3’−デオキシグアノシン、3’−デオキシチミン、2’,3’−ジデオキシヌクレオシド、2’,3’−ジデオキシアデノシン、2’,3’−ジデオキシウリジン、2’,3’−ジデオキシシトシン、2’,3’−ジデオキシグアノシン、2’,3’−ジデオキシチミン、2’−デオキシヌクレオシド、および−O−メチルヌクレオシドからなる群から選択される、請求項12記載の化学修飾mRNA。
- 前記3’尾部領域がステムループ配列を含む、請求項1記載の化学修飾mRNA。
- 化学的に修飾されたmRNAを含む脂質ナノ粒子を含む組成物であって、前記化学修飾mRNAは、
(a)目的とするポリペプチドをコードする連結ヌクレオシドの領域と、
(b)5’非翻訳領域(5’UTR)と、
(c)少なくとも1つのmiR−142−3pマイクロRNA結合部位を含む、3’非翻訳領域(3’UTR)と、
(d)連結ヌクレオシドの3’尾部領域と、
を含み、
前記mRNAにおけるウリジンヌクレオシドの全てが修飾ウリジンヌクレオシドである、組成物。 - 前記修飾ウリジンヌクレオシドがシュードウリジン類似体である、請求項15記載の組成物。
- 前記シュードウリジン類似体が1−メチルシュードウリジンである、請求項16記載の組成物。
- 前記mRNAにおけるシチジンヌクレオシドの全てが5−メチルシチジンヌクレオシドである、請求項15記載の組成物。
- 前記化学修飾mRNAの少なくとも1つの領域がコドン最適化されている、請求項15記載の組成物。
- 前記目的とするポリペプチドをコードする連結ヌクレオシドの前記領域がコドン最適化されている、請求項19記載の組成物。
- 前記5’UTRが、前記目的とするポリペプチドと非相同である、請求項15記載の組成物。
- 前記5’UTRが、前記コードされた目的とするポリペプチドの天然5’UTRである、請求項15記載の組成物。
- 前記5’UTRが、コザック配列、配列内リボソーム侵入部位(IRES)、またはその断片からなる群から選択される少なくとも1つの翻訳開始配列を含む、請求項21記載の組成物。
- 前記5’UTRが少なくとも1つのIRESの断片を含む、請求項23記載の組成物。
- 前記5’UTRが5つのIRESの断片を含む、請求項24記載の組成物。
- 前記5’UTRが少なくとも1つの5’キャップ構造を含む、請求項15記載の組成物。
- 前記少なくとも1つの5’キャップ構造が、Cap0、Cap1、ARCA、イノシン、N1−メチル−グアノシン、2’フルオロ−グアノシン、7−デアザ−グアノシン、8−オキソ−グアノシン、2−アミノ−グアノシン、LNA−グアノシン、2−アジド−グアノシン、Cap2、Cap4、およびCAP−003〜CAP−225からなる群から選択される、請求項26記載の組成物。
- 前記3’尾部領域が鎖終結ヌクレオシドを含む、請求項15記載の組成物。
- 前記鎖終結ヌクレオシドが、3’−デオキシアデノシン(コルジセピン)、3’−デオキシウリジン、3’−デオキシシトシン、3’−デオキシグアノシン、3’−デオキシチミン、2’,3’−ジデオキシヌクレオシド、2’,3’−ジデオキシアデノシン、2’,3’−ジデオキシウリジン、2’,3’−ジデオキシシトシン、2’,3’−ジデオキシグアノシン、2’,3’−ジデオキシチミン、2’−デオキシヌクレオシド、および−O−メチルヌクレオシドからなる群から選択される、請求項28記載の組成物。
- 前記3’尾部領域がステムループ配列を含む、請求項15記載の組成物。
- miR−142−3pマイクロRNA結合部位が、配列番号1404で示される配列を含む、請求項1記載の化学修飾mRNA。
- 前記連結ヌクレオシドの3’尾部領域が、少なくとも100、少なくとも120、または少なくとも140ヌクレオシドのポリA尾部を含む、請求項1記載の化学修飾mRNA。
- miR−142−3pマイクロRNA結合部位が、配列番号1404で示される配列を含む、請求項15記載の組成物。
- 前記連結ヌクレオシドの3’尾部領域が、少なくとも100、少なくとも120、または少なくとも140ヌクレオシドのポリA尾部を含む、請求項15記載の組成物。
- 前記目的とするポリペプチドが、治療用のタンパク質、サイトカイン、成長因子、抗体、または融合タンパク質である、請求項15記載の組成物。
- 前記脂質ナノ粒子が、カチオン性脂質またはイオン化可能脂質を含む、請求項15記載の組成物。
- 前記カチオン性脂質が、DLin−MC3−DMA、DLin−DMA、C12−200、およびDLin−KC2−DMAからなる群から選択される、請求項36記載の組成物。
- 前記3’UTRが2つのmiR−142−3pマイクロRNA結合部位を含む、請求項1記載の化学修飾mRNA。
- 前記3’UTRが3つのmiR−142−3pマイクロRNA結合部位を含む、請求項1記載の化学修飾mRNA。
- 前記3’UTRが2つのmiR−142−3pマイクロRNA結合部位を含む、請求項15記載の組成物。
- 前記3’UTRが3つのmiR−142−3pマイクロRNA結合部位を含む、請求項15記載の組成物。
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