ES2587963T3

ES2587963T3 - ARN con una combinación de nucleótidos no modificados y modificados para la expresión de proteínas

Info

Publication number: ES2587963T3
Application number: ES10742089.5T
Authority: ES
Inventors: Carsten Rudolph; Michael Kormann
Original assignee: Ethris GmbH
Current assignee: Ethris GmbH
Priority date: 2009-07-31
Filing date: 2010-07-30
Publication date: 2016-10-27
Anticipated expiration: 2030-07-30
Also published as: JP5785168B2; EP2459231B1; CN105255881A; US20160177295A1; DK3165234T3; EP3165234A1; ZA201201514B; US10745698B2; EA201200217A1; EP3165234B1; KR20140119197A; CA2769670C; AU2010278309B2; JP2013500704A; US20120195936A1; US20150290288A1; CN102695525B; US20210095272A1; CN102695525A; WO2011012316A3

Abstract

Polirribonucleótido con una secuencia que codifica una proteína o un fragmento de proteína, en el que el polirribonucleótido contiene una combinación de nucleótidos no modificados y modificados, en el que del 5 al 50 % de los nucleótidos de uridina y del 5 al 50 % de los nucleótidos de citidina son nucleótidos de uridina modificados o nucleótidos de citidina modificados y en el que los nucleótidos de uridina modificados son 2-tiouridina y los nucleótidos de citidina modificados son 5-metilcitidina.

Description

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Preferentemente, del 10 % al 35 % de los nucleótidos de citidina y uridina están modificados y de manera especialmente preferente se encuentra la proporción de los nucleótidos de citidina modificados en un intervalo del 7,5 % al 25 % y la proporción de los nucleótidos de uridina modificados en un intervalo del 7,5 % al 25 %. Se encontró que realmente una proporción relativamente baja, por ejemplo solo en cada caso el 10 % de nucleótidos de

5 citidina y uridina modificados, puede conseguir las propiedades deseadas, con la condición previa de que se trata de las modificaciones de acuerdo con la invención.

El tipo de modificación de los nucleósidos tiene influencia sobre la estabilidad y con ello la vida útil y actividad biológica del ARNm. Las modificaciones adecuadas están expuestas en la siguiente tabla:

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Designación: Modificación de base (posición 5) Modificación de azúcar (posición 2’) De manera natural en ARNm

Uridina

5-metiluridin-5’-trifosfato (m5U): CH3 - no

5-yodouridin-5’-trifosfato (I5U): J - no

5-bromouridin-5’-trifosfato (Br5U): Br - no

2-tiouridin-5’-trifosfato (S4U): S (en posición 2) - no

4-tiouridin-5’-trifosfato (S2U): S (en posición 4) - no

2’-metil-2’-desoxiuridin-5’trifosfato (U2’m): - CH3 sí

2’-amino-2’-desoxiuridin-5’trifosfato (U2’NH2): - NH2 no

2’-azido-2’-desoxiuridin-5’trifosfato (U2’N3): - N3 no

2’-fluoro-2’-desoxiuridin-5’trifosfato (U2’F): - F no

Citidina

5-metilcitidin-5’-trifosfato (m5C): CH3 - sí

5-yodocitidin-5’-trifosfato (I5C): J - no

5-bromocitidin-5’-trifosfato (BrSC): Br - no

2-tiocitidin-5’-trifosfato (S2C): S (en posición 2) - no

2’-metil-2’-desoxicitidin-5’trifosfato (C2’m): - CH3 sí

2’-amino-2’-desoxicitidin-5’trifosfato (C2’NH2): - NH2 no

2’-azido-2’-desoxicitidin-5’trifosfato (C2’N3): - N3 no

2’-fluoro-2’-desoxicitidin-5’trifosfato (C2’F): - F no

Adenosina

N6-metiladenosin-5’-trifosfato (m6A): CH3 (en posición 6) - sí

N1-metiladenosin-5’-trifosfato (m1A): CH3 (en posición 1) - no

2’-O-metiladenosin-5’-trifosfato (A2’m): - CH3 sí

2’-amino-2’-desoxiadenosin-5’trifosfato (A2’NH2): - NH2 no

2’-azido-2’-desoxiadenosin-5’trifosfato (A2’N3): - N3 no

2’-fluoro-2’-desoxiadenosin-5’trifosfato (A2’F): - F no

Guanosina

N1-metilguanosin-5’-trifosfato (m1G): CH3 (en posición 1) - no

2’-O-metilguanosin-5’-trifosfato (G2’m): - CH3 sí

2’-amino-2’-desoxiguanosin-5’trifosfato (G2’NH2): - NH2 no

2’-azido-2’-desoxiguanosin-5’trifosfato (G2’N3): - N3 no

2’-fluoro-2’-desoxiguanosin-5’trifosfato (G2’F): - F no

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Además se prefiere que la molécula de polirribonucleótidos constituida por nucleótidos no modificados y modificados presente una caperuza de 7’-metilguanosina y/o un extremo de poli(A). Además puede presentar el ARN aún secuencias adicionales, por ejemplo zonas no traducidas y ácidos nucleicos funcionales, tal como los conoce bien el experto en la materia.

5 El ARN de acuerdo con la invención puede facilitarse, por ejemplo, como ARN transcrito in-vitro (IVT-ARN). Los materiales necesarios para la realización de la transcripción in-vitro los conoce el experto en la materia y pueden obtenerse en el comercio, en particular tampones, enzimas y mezclas de nucleótidos. El tipo del ADN usado para la preparación del ARN de acuerdo con la invención es igualmente no crítico, siendo éste por regla general ADN clonado.

Tal como se ha expuesto anteriormente, se facilita un ARN, en particular ARNm que presenta nucleósidos de uridina modificados y nucleósidos de citidina modificados en una proporción predeterminada, tal como se indica en la reivindicación 1. La proporción óptima para un ARNm específico de nucleósidos de uridina modificados o

15 nucleósidos de citidina modificados puede determinarse con ensayos rutinarios, que el experto en la materia conoce bien.

El ARN de acuerdo con la invención se usa preferentemente para la terapia de enfermedades o para la facilitación de proteínas útiles para el organismo. Cuando se usa el ARN de acuerdo con la invención para la terapia de enfermedades, éste presenta preferentemente el transcrito in-vitro para una proteína o fragmento de proteínas, cuyo defecto o deficiencia conduce a un estado patológico o cuya facilitación conduce a un alivio de una dolencia. Para la preparación del ARN de acuerdo con la invención se usa preferentemente un ADN que codifica una proteína o un fragmento de proteína, cuyo defecto o deficiencia está relacionado con una enfermedad o una dolencia. En una forma de realización se usa para la preparación del ARN de acuerdo con la invención el ADN de un gen, cuyo

25 defecto o deficiencia conduce a una enfermedad o a una dolencia. En otra forma de realización se usa para la preparación del ARN de acuerdo con la invención una ADN que codifica una proteína, cuya presencia, eventualmente temporal, es útil o curativa para un organismo. Como enfermedad o dolencia se considera a este respecto cualquier estado en el que existan alteraciones o modificaciones espirituales-mentales y/o corporales de manera subjetiva y/u objetiva, o en el que se hace necesario el desarrollo contrario a las reglas de procesos de vida corporales, mentales o espirituales de asistencia a enfermos y eventualmente puede tener como consecuencia la incapacidad laboral.

Por una proteína o fragmento de proteína, cuya presencia puede aliviar una dolencia o que puede ser útil o favorecedor para el organismo, se entiende a este respecto aquellas proteínas o fragmentos de proteínas que deben

35 facilitarse al organismo completa o temporalmente, sin que exista un defecto génico, que éstas faltan o bien debido a cualquier alteración o debido a hechos naturales o ya que éstas pueden aprovechar el organismo en determinadas circunstancias, por ejemplo en el tratamiento de defectos o en el contexto de implantes. A esto pertenecen también formas modificadas de proteínas o fragmentos de proteínas, es decir formas de proteínas que se modifican en el transcurso del metabolismo, por ejemplo formas maduradas de una proteína etc. Pueden facilitarse también proteínas que desempeñan un papel para procesos de crecimiento y angiogénesis, que son necesarias por ejemplo en caso de una regeneración controlada y entonces pueden producirse de manera dirigida mediante la introducción del ARN de acuerdo con la invención. Esto puede ser útil por ejemplo en procesos de crecimiento o para el tratamiento de defectos óseos, defectos de tejidos y en el contexto de implantes y trasplantes.

45 Se encontró que el ARNm modificado de acuerdo con la invención puede usarse ventajosamente para favorecer la encarnación de prótesis implantada. El ARNm de acuerdo con la invención, cuando éste se encuentra a disposición en la superficie de prótesis que van a colocarse, tales como implantes dentales, endoprótesis coxales, endoprótesis de rodilla o cuerpos de fusión vertebrales, puede liberar factores que pueden favorecer la encarnación, la nueva formación de vasos y otras funciones que son útiles para la prótesis colocadas de nuevo. Así se conoce por ejemplo administrar sustancias de acción biológica, tales como factores de crecimiento como BMP-2 o factores de angiogénesis en el contexto de un implante de prótesis o después de esto. Dado que las sustancias biológicas tienen muy frecuentemente tiempos de vida medio sumamente cortos, era necesario hasta ahora dosificarlas de manera muy elevada, lo que carga al paciente con efectos secundarios fuertes. De acuerdo con la invención se evita este inconveniente, dado que usando el ARN de acuerdo con la invención pueden usarse las proteínas deseadas y/o

55 necesarias dosificadas de manera dirigida y adecuada. Esto reduce o ahorra incluso al paciente los efectos secundarios. En esta forma de realización puede aplicarse el ARN de acuerdo con la invención, que codifica sustancias deseadas y/o necesarias, tales como factores de crecimiento, factores de angiogénesis etc., en un revestimiento que emite de manera dosificada el ARN sobre el implante y puede emitirse a partir de esto entonces de manera dosificada poco a poco, de modo que de manera continua o intermitente pueden generar y eventualmente liberar las células al entorno del implante los factores deseados. Los soportes, por regla general polímeros biocompatibles, sintéticos, naturales o de manera mixta naturales-sintéticos, cuyas propiedades de emisión pueden ajustarse de manera dirigida, se conocen bien y no necesitan por tanto explicarse de manera detallada en el presente documento. Se usan por ejemplo polímeros de polilactida o polilactida/glicolida. De esta manera es posible emitir los factores deseados de manera continua, intermitente, durante un tiempo más largo o

65 más corto y de manera dirigida al sitio deseado.

Por un gen deficiente o defectuoso o una deficiencia o carencia se entiende en el contexto de la presente invención aquellos genes que no se expresan, no se expresan correctamente o no se expresan en volumen suficiente y debido a ello causan enfermedades o dolencias, por ejemplo causando éstos alteraciones metabólicas.

5 El ARN de acuerdo con la invención puede usarse de manera adecuada en cualquier caso, en el que debe facilitarse al organismo una proteína que de manera natural existiría en el organismo, sin embargo debido a defectos génicos o enfermedades no existe, existe en forma deficiente o existe en cantidad demasiado baja. Se conocen las proteínas o los genes que codifican éstas, cuya deficiencia o defecto se relaciona con una enfermedad. A continuación se exponen distintas proteínas y genes, en cuya falta puede usarse el ARN de acuerdo con la invención.

10 Tabla 2

Enfermedades, para las que puede indicarse la administración de ARNm de acuerdo con la invención:

Órgano: Defecto

Pulmón: Deficiencia en proteína B de surfactante

Pulmón: Deficiencia en ABCA3

Pulmón: Fibrosis quística

Pulmón: Deficiencia en alfa-1antitripsina

Proteínas plasmáticas: Defectos de coagulación tal como Hemofilia A y B

Proteínas plasmáticas: Defectos de complementos tal como deficiencia en proteína C

Proteínas plasmáticas: Púrpura trombótica, trombocitopénica (deficiencia en TPP, ADAMTS 13)

Proteínas plasmáticas: Hemocromatosis congénita (p. ej.: carencia de Hepcidina)

Defectos inmunitarios combinados graves (SCID) (linfocitos T, B y NK)

Defectos inmunitarios combinados hereditarios X-cromosómicos (X-SCID)

ADA-SCID (SCID como consecuencia de la carencia de adenosindesaminasa)

SCID con mutación de RAG1

SCID con mutación de RAG2

SCID con mutación de JAK3

SCID con mutación de IL7R

SCID con mutación de CD45

SCID con mutación de CD3

SCID con mutación de CD3

SCID con carencia de purinnucleósido-fosforilasa (carencia de PNP)

Granulomatosis séptica (granulocitos)

Enfermedad: Defecto o mutación

CGD recesiva-X-cromosómica: Mutación del gen gp91-phox

CGD positivo para citocromo b tipo 1: Mutación del gen p47-phox

CGD positivo para citocromo b tipo 2: Mutación del gen p67-phox

CGD negativo para citocromo b: Mutación del gen p22-phox

Otras enfermedades de almacenamiento

Mutación en el gen de glucocerebrosidasa: Enfermedad de Gaucher

Mutación en el gen de GALC: Enfermedad de Krabbe

Enfermedades de almacenamiento lisosómicas: Mucopolisacaridosis

Enfermedades de almacenamiento de glucógeno

Tipo: Defecto Nombre propio

I (a-d): Ia: glucosa-6-fosfatasa Ib, Ic, Id: glucosa-6-fosfato-translocasa Enfermedad de Gierke

II: -glucosidasa lisosómica Enfermedad de Pompe

III: Enzima desrramificadora de glucógeno Enfermedad de Cori

Enfermedades de almacenamiento de glucógeno

Tipo: Defecto Nombre propio

IV: Enzima ramificadora de 1,4--glucano Enfermedad de Andersen

V: Glucogenofosforilasa del músculo Enfermedad de McArdle

VI: Sistema glucogenofosforilasa/fosforilasa cinasa (hígado y músculo) Enfermedad de Hers

VII: Fosfofructocinasa (músculo) Enfermedad de Tarui

VIII: Fosforilasa del hígado

IX (a-c): Fosforilasa del hígado

X: Fosforilasa act. A AMPc

XI: Defecto de GLUT-2 Síndrome de Fanconi-Bickel

0: UDP-glucógeno-sintasa

Otras enfermedades de almacenamiento

Mutación en el gen de glucocerebrosidasa: Enfermedad de Gaucher

Mutación en el gen de GALC: Enfermedad de Krabbe

Enfermedades de almacenamiento lisosómicas: Mucopolisacaridosis

Otras enfermedades que se basan en genes defectuosos se indican a continuación:

Tipo: Variante Características clínicas Enzima defectuosa

I-H: Síndrome de Hurler-Pfaundler Dismorfia (gargolismo), retardo cognitivo, malformación del esqueleto (disostosis), enturbiamiento de la córnea, crecimiento reducido, hernias, hepatomegalia -L-Iduronidasa

I-S: Enfermedad de Scheie Mentalmente no limitado, malformación de esqueleto (disostosis), enturbiamiento de la córnea, lesión valvular -L-Iduronidasa

I-H/S: Variante de Hurler/Scheie Mentalmente entre I-H y I-S -L-Iduronidasa

II: Síndrome de Hunter Retardo cognitivo moderado, malformación del esqueleto (disostosis), modificaciones somáticas considerables, sordera prematura Iduronatosulfatosilfatasa

III: Síndrome de Sanfilippo Tipo A Retardo cognitivo, dismorfia, enturbiamiento de la córnea puede estar ausente, con frecuencia sordera, caminar con paso rápido Heparansulfatosulfamidasa

Tipo B: -N-acetilglucosamidasa

Tipo C: acetil-CoA: -glucosaminid-Nacetiltransferasas

Tipo D: N-acetilglucosamin-6sulfatosulfatasa

IV: Síndrome de Morquio Tipo A Desarrollo cognitivo habitual, malformación del esqueleto (disostosis) muy acusado, enturbiamiento de la córnea está ausente N-acetilglucosamin-6sulfatosulfatasa

Tipo B: Forma de desarrollo leve del tipo A -galactosidasa

V: ahora: tipo I-S, véase anteriormente

VI: Síndrome de Maroteaux-Lasny Desarrollo cognitivo habitual, grave malformación del esqueleto (disostosis), enturbiamiento de la córnea, crecimiento reducido N-acetilgalactosamin-4sulfatosulfatasa

VII: Síndrome de Sly Dismorfia moderada y malformaciones del esqueleto, enturbiamiento de la córnea, inteligencia de habitual a limitada -glucuronidasa

5 La tabla anterior muestra por consiguiente ejemplos de genes, cuyo defecto conduce a una enfermedad que puede tratarse mediante terapia de sustitución de transcrito con el ARN de acuerdo con la invención. En particular pueden mencionarse en este caso enfermedades hereditarias que afecten por ejemplo al pulmón, tales como deficiencia de SP-B, deficiencia de ABCA3, fibrosis quística y deficiencia de 1-antitripsina; que afectan a proteínas plasmáticas y generan defectos de coagulación y defectos de complemento; defectos inmunitarios, tales como por ejemplo SCID;

10 granulomatosis séptica y enfermedades de almacenamiento. En todas estas enfermedades se encuentra una proteína, por ejemplo una enzima, defectuosa, que puede tratarse mediante tratamiento con el ARN de acuerdo con la invención, que facilita la proteína o un fragmento funcional de la misma codificada por el gen defectuoso.

Ejemplos de proteínas que pueden codificarse por el ARN de acuerdo con la invención son por tanto eritropoyetina

15 (EPO), hormona del crecimiento (somatotropina, hGH), regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística (CFTR), factores de crecimiento tales como GM-CSF, G-CSF, MPS, proteína C, hepcidina, ABCA3 y

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con un ARN que codifica una proteína deseada y tras espacios de tiempo predeterminados puede determinarse entonces la presencia de la molécula indicadora y eventualmente la proteína. Se conocen bien en el estado de la técnica moléculas indicadoras adecuadas y pueden usarse también en el presente documento aquéllas usadas habitualmente. En una forma de realización preferente se usa RFP, proteína de fluorescencia roja, como molécula

5 indicadora. Tal como se ha explicado anteriormente, puede usarse el ARN de acuerdo con la invención para la terapia, de modo que en la célula a la que se lleva el ARN puede formarse una proteína que no se expresa de manera natural o no se expresa en volumen deseado. El ARN de acuerdo con la invención puede usarse a este respecto tanto cuando la proteína no se forma debido a una deficiencia de un gen, como también en los casos en los que no se forma una proteína debido a una enfermedad o en aquellos casos en los que la alimentación de la proteína sea ventajosa para el organismo. El ARN puede usarse también para completar una proteína expresada en volumen no suficiente. La dosis empleada en cada caso depende de la función que debe cumplir el ARN. Tal como se ha explicado anteriormente, la duración de la acción del ARN de acuerdo con la invención puede ajustarse de manera dirigida. La duración del tratamiento depende de la respectiva indicación. Si se usa el ARN para la terapia crónica de una

15 enfermedad que se basa en un gen deficiente, será la duración de la acción tan larga como sea posible, mientras que pueda ajustarse ésta con otras indicaciones de manera dirigida en un intervalo de tiempo.

De acuerdo con una forma de realización especialmente preferente se usa como ARN un IVT-ARNm que codifica la proteína B del surfactante. Cuando esta proteína es deficiente en mamíferos se produce la formación del síndrome de disnea de prematuros y neonatos, también denominado síndrome de dificultad respiratoria. Este síndrome conduce debido a una enfermedad pulmonar en neonatos con frecuencia a la muerte. El uso de un ARNm modificado de manera múltiple transcrito in vitro que codifica SP-B, en el que están modificados del 5 % al 50 % de los nucleósidos de uridina y del 5 % al 50 % de los nucleósidos de citidina, tal como se indica en la reivindicación 1, conduce a que se forme la proteína y se atenúe o se cure la enfermedad.

25 De acuerdo con otra forma de realización preferente se usa como ARN un IVT-ARNm, que codifica eritropoyetina. La eritropoyetina es una proteína muy importante para el organismo, que por ejemplo en enfermedades renales ya no está a disposición en cantidad suficiente y por tanto debe alimentarse. Actualmente se usa para ello eritropoyetina recombinante, que se generó en microorganismos o células animales y por tanto presenta una glicosilación que no ocurre de manera natural. Con el uso de la EPO recombinante se producían en muy pocos casos efectos secundarios graves, por ejemplo una aplasia eritrocitaria.

El IVT-ARNm facilitado de acuerdo con la invención contiene un ácido ribonucleico que codifica eritropoyetina, en el que están modificados del 5 % al 50 % de los nucleótidos de uridina y del 5 % al 50 % de los nucleótidos de citidina,

35 tal como se indica en la reivindicación 1. En una forma de realización especialmente preferente se facilita un ARNm que codifica EPO, en el que están modificados del 15 % al 25 % de los nucleótidos de uridina y del 15 % al 25 % de los nucleótidos de citidina, tal como se indica en la reivindicación 1. Se encontró que este ARNm presenta una inmunogenicidad fuertemente reducida en comparación con ARN no modificado. Al mismo tiempo muestra éste una eficacia de la transfección superior al 90 % y una estabilidad tal que el valor de hematocrito es elevado todavía tras 14 días. Dado que la EPO formada por el ARN de acuerdo con la invención en el organismo presenta la correcta glicosilación, no ha de temerse por efectos secundarios. Mediante la administración intermitente dirigida del ARN modificado de acuerdo con la invención, que codifica EPO, pudo mantenerse el valor de hematocrito durante mucho más tiempo al nivel deseado.

45 De acuerdo con la invención se facilita un ARN estable no inmunógeno, que puede emplearse in vivo en mamíferos y que facilita la proteína necesaria en una forma que es muy similar a la proteína propia del organismo existente de manera natural, si no es idéntica y en particular presenta la glicosilación propia del organismo.

El ARNm de acuerdo con la invención puede usarse directamente así, tal como está. Sin embargo existe también la posibilidad de modificar ARNm adicionalmente para introducir propiedades útiles adicionales. El ARNm puede modificarse por un lado, añadiéndose a la cadena codificante otras secuencias codificantes o no codificantes. Éste puede modificarse por otro lado también, uniéndose otras moléculas a grupos funcionales previstos en los nucleótidos modificados.

55 El ARNm de acuerdo con la invención puede combinarse con ligandos determinados que se unen a receptores de superficie específicos para las células diana, de modo que es posible una transfección mediada por receptor de la célula diana. Para ello pueden modificarse por un lado vehículos que son adecuados para la introducción de ARNm en células, o sin embargo el propio ARNm con un ligando. Ejemplos de vehículos adecuados para la introducción de ARNm en células son agentes catiónicos. A esto pertenecen lípidos catiónicos, polímeros catiónicos o también nanopartículas, nanocápsulas, nanopartículas magnéticas y nanoemulsiones. El experto en la materia conoce vehículos adecuados y se han descrito en la bibliografía. El experto en la materia también conoce bien ligandos adecuados y se han descrito en la bibliografía y pueden obtenerse. Como ligandos pueden usarse por ejemplo: transferrina, lactoferrina, clembuterol, azúcar, ácidos urónicos, anticuerpos, aptámeros etc.

65 El ARNm puede modificarse sin embargo también incluso con un ligando. Para ello son adecuados preferentemente ARNm con nucleósidos modificados que llevan en la posición 2’ de la ribosa un grupo amino primario o un grupo

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Ejemplo 2

Para demostrar que en ratones deficientes en SP-B se consigue una mejora del estado o un aumento de la esperanza de vida solo mediante uso del ARNm modificado de acuerdo con la invención, que codifica SP-B, se 5 realizó otro ensayo. Se usaron el modelo de ratón y las condiciones tal como se describieron en el ejemplo 1.

Se formaron tres grupos de ratones. Un grupo de ratones deficientes en SP-B recibió dos veces en una semana ARNm modificado de acuerdo con la invención (B), un segundo grupo recibió durante 28 días dos veces por semana ARNm modificado de acuerdo con la invención (C), y para la comparación recibió un tercer grupo de ratones ARNm de EGFPLuc modificado (A).

Se mostró que los ratones que no recibieron SPB-ARNm modificado de acuerdo con la invención, murieron tras breve tiempo. Los ratones que recibieron el ARN de acuerdo con la invención sobrevivieron solo mientras que recibían el ARN de SP-B de acuerdo con la invención. Esto confirma que el ARN de acuerdo con la invención es

15 biológicamente activo y puede sustituir una proteína necesaria.

En detalle se realizó el ensayo tal como sigue. Los ratones noqueados para SP-B, tal como se ha descrito en el ejemplo 1, recibieron o bien ARNm de EGFP-Luc modificado (A) (n = 10) o ARNm de SP-B modificado dos veces en una semana (B) (n = 4) o ARNm de SP-B modificado durante 28 días dos veces por semana (C) (n = 4). Se trazaron curvas de supervivencia de Kaplan-Meier y se realizó un ensayo de Wilcoxon-Gehan. Se encontró que la administración intratraqueal de ARNm de SP-B doblemente modificado dos veces en el intervalo de una semana en el pulmón de ratones SP-B transgénicos (B), en los que se controla el gen de SP-B mediante la adición de doxiciclina en agua potable, prolonga el tiempo de supervivencia promedio de los ratones tras la retirada de doxiciclina del agua potable antes del inicio del tratamiento hasta 10,2  0,5 días (B), en comparación con 3,4  0,2

25 días tras administración de un ARNm de EGFP-Luc control.

Los resultados están representados en el diagrama de la figura 12. Se muestra que la administración intratraqueal del ARNm de SP-B doblemente modificado de acuerdo con la invención es realmente salvadora de vidas. Sin adición del ARNm de acuerdo con la invención mueren los ratones tras breve tiempo. Este ensayo muestra también que por un lado ARNm de SP-B genera in vivo la SP-B necesaria para la vida y por otro lado que el ARNm de SP-B debe aplicarse continuamente para proteger a los animales de experimentación de la muerte.

Ejemplo 3

35 En otro ensayo, en el que se usaron los ratones descritos en el ejemplo 1, que recibieron todos doxiciclina, se sometió a estudio si el ARN de acuerdo con la invención provocaba en una fase temprana tras la administración reacciones inflamatorias. Para ello se formaron 5 grupos y se midieron el nivel de citocina, IFN y IL-12, 8 horas tras la administración de distintos preparados en el lavado broncoalveolar de ratones. Los seis grupos recibieron los siguientes preparados: a) comparación, no tratados, es decir ni perfluorocarbono ni ARN; b) comparación, perfluorocarbono; c) comparación, perfluorocarbono y ARNm de SP-B no modificado; d) invención, perfluorocarbono y s2U(0,25)m5C(0,25)ARNm de SP-B modificado; e) comparación, perfluorocarbono y ADN de plásmido de SP-B; (n = 4). Se administraron en cada caso 20 g (50 l) de un preparado. Los resultados están mostrados en la figura 13. En la figura 13 se muestra el valor medio  error estándar. Se usan las siguientes abreviaturas en la figura 13: Doxi doxiciclina, Pfc -perfluorocarbono, pDNA -ADN de plásmido (*P < 0,05 en comparación con el grupo no tratado).

45 Los resultados muestran que en la administración intratraqueal de ARNm no modificado o ADN de plásmido se eleva mucho el marcador de inflamación IL-12 en el lavado broncoalveolar, mientras que la administración de ARNm doblemente modificado en comparación con ratones no tratados no conduce a ningún aumento de IL-12. La administración de ARNm doblemente modificado si bien eleva el nivel del marcador de inflamación IFN fácilmente, sin embargo solo en tanto que se observe éste también tras administración de perfluorocarbono. A diferencia de esto, la administración de ARNm no modificado o la administración de ADN de plásmido conduce también a un claro aumento del nivel de INF. Con el uso del ARNm modificado de acuerdo con la invención no ha de temerse por consiguiente una reacción inflamatoria, mientras que la administración de ARNm no modificado o también de ADN de plásmido provoca rápidamente reacciones de inflamación.

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Ejemplo 4

Para mostrar las posibilidades de uso del ARNm modificado de acuerdo con la invención se sometieron a estudio distintos tipos de modificaciones y su influencia sobre la eficacia de la transfección y eficacia de la traducción así como sobre la inmunogenicidad. Se transfectaron células A459 con en cada caso 200 ng de ARNm y después se sometió a estudio cuántas de las células se habían transfectado y en cuántas células se había traducido la proteína fluorescente. Esta evaluación se realizó a través de la intensidad de fluorescencia media (MFI). Los resultados están mostrados en la figura 10A. Se sometió a ensayo ARNm modificado de acuerdo con la invención y en comparación con esto un ARNm modificado no de acuerdo con la invención, en el que se usaron dos modificaciones distintas de

65 nucleótidos de uridina así como ARNm no modificado. Las moléculas de ARNm modificado de acuerdo con la

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B (SP-B) se detectó con antisuero de conejo policlonal, que estaba dirigido contra SP-B (c329, realizado por Dr. W. Steinhilber, Altana AG) y a continuación se realizó un ensayo de quimioluminiscencia mejorada (Amersham Biosciences) con anti-IgG de cabra anti-conejo policlonal conjugada con peroxidasa de rábano (1:10.000; Dianova). Con estas condiciones pudo detectar el ensayo aproximadamente 2,5 ng de SP-B por carril (28). Como sistema de

5 detección de la quimioluminiscencia se usó DIANA III dev. 1.0.54 con el analizador de imágenes Aida (Ray test Isotopenmessgeräte GmbH) y los datos se evaluaron cuantitativamente con Quantity One 4.6.7 (Bio-Rad).

Análisis microscópico de la fluorescencia

Se sometieron secciones fijadas (3 % de paraformaldehído) e incrustadas en parafina a una inmunohistoquímica, tal como se recomienda por el fabricante (Abcam, www.abcam.com/technica). Los soportes se incubaron con anticuerpo de anti-SP-B de ratón anti-humano y anticuerpo anti-IgG de conejo conjugado con rojo Texas (los dos de Abcam, 1:500) y se contratiñeron con DAPI. Se obtuvieron imágenes de fluorescencia de Zeiss Axiovert 135.

15 Estadística

Se analizaron las diferencias en la expresión de ARNm entre grupos mediante ensayos de reasignaciónaleatorización fijados por parejas con el software REST 2005 (29). Los tiempos de vida medio para la disminución de la bioluminiscencia se calcularon con Prism 5.0. Todos los otros análisis se realizaron usando el ensayo de Wilcoxon-Mann-Whitney con SPSS 15 (SPSS Inc.). Los datos están indicados como valor medio  SEM (error estándar del valor medio) o como mediana  IQR (rangos intercuartílicos) y P < 0,05 (bilateral) se considera como estadísticamente significativo.

Ejemplo 6

25 ARNm modificado de manera múltiple de acuerdo con la invención que codifica EPO.

Con un procedimiento esencialmente, tal como se ha descrito en el ejemplo 3, se preparó ARNm modificado, que contenía una parte codificante para EPO. Este ARNm se sometió a ensayo para determinar su eficacia de la expresión. Para ello se inyectaron i.m. en cada caso 5 g de ARNm modificado de acuerdo con la invención o ARNm no modificado en ratones. Cada grupo de ratones tenía cuatro miembros. En el día 14 y en el día 28 tras la administración del ARN se evaluó cuantitativamente la proporción de EPO en el suero con un ensayo ELISA. El valor de hematocrito se evaluó en sangre completa de ratones en el mismo ensayo. Los datos mostrados en la figura 11 adjunta representan en cada caso el valor medio  SEM. El diagrama de dispersión muestra los valores de

35 hematocrito individuales, las barras muestran valores medios. *P < 0,05 en comparación con el grupo no tratado en el respectivo momento; +P < 0,05 en comparación con el grupo mEPO no modificado en el respectivo momento.

(c): Los datos muestran el valor medio  SEM. Las PBMC humanas se transfectaron con 5 g de ARNm para RFP no modificado o modificado y las tasas de recuperación se determinaron con RIP usando anticuerpos específicos para TLR-3, TLR-7 y TLR-8. Las cuadrículas significan valores medios  IQR. Las rayas muestran los valores mínimos o máximos. *P < 0,5, **P < 0,01, ***P < 0,001 en comparación con el grupo mEPO no modificado.

(d): Se inyectaron 5 g de ARNm de mEPO no modificado y modificado a ratones por vía intravenosa (en cada caso

n = 4). Tras 24 horas se evaluaron el nivel de interferón-, IL-12 e interferón- en suero cuantitativamente con 45 ELISA.

Tal como puede deducirse de los diagramas, para el ARN modificado de acuerdo con la invención están los marcadores de inflamación en un intervalo poco llamativo, mientras que para ARN no modificado o ARN modificado solo con nucleótidos de uridina modificados son muy elevados los marcadores de inflamación.

De acuerdo con la invención se facilita por consiguiente un ARNm que codifica EPO, que es muy estable y al mismo tiempo no provoca a provoca pocas reacciones inmunológicas. Un ARNm de este tipo puede usarse ventajosamente para el tratamiento de carencia de eritropoyetina. Debido a la alta estabilidad es necesaria una dosificación solo de 2 a 4 semanas.

55

Ejemplo 7

Se sometió a estudio cómo repercute la administración repetida de ARNm modificado de acuerdo con la invención que codifica EPO en los valores de hematocrito. Mediante esto debe mostrarse si el ARNm modificado de acuerdo con la invención permanece activo durante un tiempo más largo, cuando se administra éste al organismo. Una reacción inmunológica al ARNm de acuerdo con la invención reduciría por ejemplo la actividad.

Se administraron por tanto 10 g de ARNm de mEPO modificado (tal como se ha descrito en el ejemplo 6) en los días 0, 21 y 34 a ratones por vía intramuscular (n = 10). El valor de hematocrito se determinó entonces en la sangre 65 completa de los ratones en los días 0, 21, 34, 42 y 51. Los resultados están mostrados en la figura 14. Los datos en

el diagrama muestran el promedio  error estándar * P < 0,05 en comparación con el valor de hematocrito en el día

0.

Los resultados demuestran que la administración repetida del ARNm modificado de acuerdo con la invención 5 conduce a un aumento duradero por mucho tiempo del valor de hematocrito. Esto muestra que el ARNm permanece activo aunque se administre éste múltiples veces.

Ejemplo 8

El ARNm modificado de acuerdo con la invención es también adecuado para llevar al entorno de implantes proteínas que favorecen la curación o el arraigo, para favorecer debido a ello el proceso de curación o el arraigo. Para demostrar que el ARNm modificado de acuerdo con la invención se expresa de manera estable y permanente, cuando se aplica éste en forma de un revestimiento sobre superficies de titanio, se aplicó sobre placas de titanio un revestimiento que contenía ARNm que codificaba para luciferasa. Se comprobó entonces si pudo determinarse

15 luciferasa en el entorno, libre o en células, y cuánto tiempo.

Se usaron para el ensayo dos secuencias que codifican dos proteínas distintas, concretamente un ARN para luciferasa, que se secreta por la célula que expresa ésta como modelo para aquellas proteínas que deben emitirse en el entorno, tales como por ejemplo factores de crecimiento o factores de angiogénesis. Además se usó ARN que codifica una luciferasa, que no se secreta, sino que permanece en la célula como modelo para aquellas proteínas que deben provocar algo en la célula. Para el modelo de secreción se usó ARN que codificaba para luciferasa de Metridia, en el que en comparación con el tipo natural estaban sustituidas el 25 % de las unidades de uridina por s2U y estaban sustituidas el 25 % de las unidades de citidina por m5C. Para el modelo de proteína de no secreción se usó un ARNm que codifica una luciferasa de luciérnaga, en el que igualmente estaban sustituidas el 25 % de las

25 unidades de uridina por s2U y estaban sustituidas el 25 % de las unidades de citidina por la m5C modificada.

Se encontró que los preparados de ARNm de acuerdo con la invención, que estaba protegido como complejo con polímero, tras la emisión del material de revestimiento permanecían activos y se expresaban durante un tiempo mucho más largo. Se mostró que la proteína codificada en cada caso por el ARNm modificado de acuerdo con la invención pudo detectarse durante un tiempo más largo.

Para los ensayos se incrustó el ARNm modificado de acuerdo con la invención, protegido mediante un complejo de polímero, en un material de soporte que se aplicó como capa sobre placas de titanio. El material de soporte era polilactida (PDLLA), un material bien conocido para este fin, que puede liberar el ARNm contenido de manera

35 dirigida paulatinamente. La ventaja de un revestimiento de este tipo es que la emisión puede ajustarse de manera dirigida. Los resultados muestran que los fragmentos de polilactida que se liberan durante la degradación no alteran la actividad del ARNm, de modo que este sistema es muy adecuado. El propio ARNm se estabilizó mediante un polímero de envoltura.

Para los ensayos se usó ARNm modificado o ADN de plásmido (pDNA) que codifica luciferasa de Metridia. Se complejaron en cada caso 9 g de ADNp de luciferasa de Metridia o s2U(0,25)5C(0,25)ARNm doblemente modificado en 200 l de H2O (+ eventualmente 500 g de lactosa) con 9,4 g de L-PEI (L-polietilenimina) en 200 l de H2O. Después se añadieron los complejos en 100 l de una solución de polímero de envoltura (2,4 l de P6YE5C 409,1 mM) y se liofilizaron durante la noche (el polímero de envoltura P6YE5C se preparó tal como se describe en el

45 documento EP 11 98 489). Después se suspendieron los complejos en 72 l de una mezcla de PDLLA (poli-DLlactida)/EtOAc (50 mg/ml de PDLLA) en hielo y se dispersaron con ayuda de un microhomogeneizador Potter. Con esta dispersión se revistieron placas de titanio sometidas a autoclave (r = 3 mm, en cada caso 18 l) en una placa de 96 pocillos. Tras otra liofilización durante la noche se añadieron células A549 en 200 l de medio RPMI-1640 (5000 células/200 l). A partir del segundo día se quitaron en cada caso 50 l de sobrenadante, se cambió el medio y con ayuda de en cada caso 100 l de solución de coelenterazina (0,003 mM de concentración final) se determinó en los siguiente días la expresión de la luciferasa de Metridia.

En otro ensayo se sometió a prueba la actividad del ARNm modificado de acuerdo con la invención que codifica luciferasa de Metridia, cuando éste se depositó sobre partículas de fosfato de calcio y se introdujo en esta forma en

55 el revestimiento. Para ello se mezclaron en cada caso 4 g de s2U(0,25)m5C(0,25)ARNm de luciferasa de Metridia en 600 l de 1 x HBS con 33 l de CaCl2 2,5 M. Tras 30 min se revistieron con esto placas de titanio sometidas a autoclave (r = 3 mm, en cada caso 18 l) en una placa de 96 pocillos. Tras liofilización durante la noche se añadieron células A549 en 200 l de medio RPMI-1640 (5000 células/200 l). A partir del segundo día se quitaron en cada caso 50 l de sobrenadante, se cambió el medio y con ayuda de en cada caso 100 l de solución de coelenterazina (0,003 mM de concentración final) se determinó en los siguiente días la expresión de la luciferasa de Metridia.

Los resultados pueden sacarse del diagrama en la figura 15. Los resultados aclaran que el ARNm modificado de acuerdo con la invención permanece aún activo también cuando se protege éste con una envoltura de polímero, se 65 introduce en una matriz de liberación retardada y se aplica sobre implantes de titanio. El ARNm modificado de

acuerdo con la invención permanece además biológicamente activo y se traduce continuamente en la proteína codificada. También permanece la capacidad de secreción, lo que se muestra en que puede detectarse la luciferasa de Metridia en el medio de cultivo celular (como modelo para factores de crecimiento de hueso secretados, tales como por ejemplo BMP-2). Los resultados muestran además sorprendentemente que el revestimiento con ARNm

5 modificado proporciona una expresión de proteínas más alta que el revestimiento de implantes de titanio con el ADN de plásmido análogo. Cuando los complejos de ARNm/PEI se dotan de un polímero de envoltura antes de la incorporación en el revestimiento de implante de titanio, se obtiene una expresión de proteínas aún más alta que con el uso de los mismos complejos, sin embargo sin polímero de envoltura (en la figura ARNm mod./IPEI-P6YE5C). Además se encontró que la adición de lactosa como coadyuvante es posible sin que el ARNm modificado pierda su actividad biológica.

Los resultados muestran también que el ARNm modificado precipitado sobre partículas de fosfato de calcio conserva su actividad y puede ejercer sus propiedades ventajosas en el revestimiento de implante de titanio. La actividad biológica permanece. Esto es especialmente importante, dado que puede incorporarse fosfato de calcio

15 directamente en los huesos.

Tal como se ha indicado anteriormente, se realizó otro ensayo con ARN o ADN que codifica luciferasa de luciérnaga. Para ello se complejaron en cada caso 9 g de ADNp de luciferasa de luciérnaga o s2U0,25m5C0,25ARNm modificado en 200 l de H2O con 9,4 g de L-PEI en 200 l de H2O. Después se añadieron los complejos en 100 l de una solución de polímero de envoltura (2,4 l, P6YE5C 409,1 mM) y se liofilizaron durante la noche. A continuación se disolvieron los complejos en 72 l de una mezcla de poli-DL-ácido láctico (PDLLA)/acetato de etilo (EtOAc) (50 mg/ml de PDLLA) en hielo y se dispersaron con ayuda de un microhomogeneizador Potter. Con esta dispersión se revistieron placas de titanio sometidas a autoclave (r = 3 mm, en cada caso 18 l) en una placa de 96 pocillos. Tras otra liofilización durante la noche se añadieron células A549 en 200 l de medio RPMI-1640 (5000

25 células/200 l). En el segundo día se añadió a los pocillos en cada caso 1 l de D-luciferina 350 mM, se incubó durante 20 min y se determinó la expresión de luciferasa por Bio-Imaging. Los resultados están mostrados en la figura 16. Tal como puede deducirse del diagrama en la figura 16, pueden revestirse implantes de titanio con ARNm modificado de acuerdo con la invención, permaneciendo biológicamente activo también además el ARNm y traduciendo la proteína codificada. La proteína formada permanece en la célula y puede detectarse intracelularmente. Además muestran los resultados que el revestimiento con ARNm modificado conduce a una expresión de proteínas más alta que el revestimiento de implantes de titanio con el ADN de plásmido análogo.

Ejemplo 9

35 Para controlar la expresión del ARNm modificado de acuerdo con la invención de modo que se exprese la proteína codificada solo en células en las que se desea esto, sin embargo en otras células no, se insertó un sitio de unión a micro-ARN en el ARNm para permitir una regulación específica de célula de la expresión de ARNm.

Para ello se cultivaron células HEK293 en MEM con un 10 % de FCS y un 1 % de penicilina-estreptomicina. 24 h antes de la transfección se sembraron 100.000 células/pocillo en una placa de 24 pocillos. Inmediatamente antes de la transfección se sustituyó el medio por 400 l de Optimem (Invitrogen). Se cultivaron células U937 en medio RPMI1640 con un 10 % de FCS y un 1 %de penicilina-estreptomicina. Inmediatamente antes de la transfección se sembraron 800.000 células U937 en 400 l de medio Optimem (Invitrogen) por pocillo en una placa de 24 pocillos. Para cada pocillo se diluyeron 100 ng de ARNm de EGFP y 250 ng de miARN de ARNm de RFP de BS (véase a 45 continuación) con Optimem hasta 50 l. Se completaron 2 l de Lipofectamine 2000 hasta 50 l con Optimem y se incubó durante 5 min a temperatura ambiente. A continuación se pipeteó la solución de ARNm en la solución de Lipofectamine-2000 y se incubó durante otros 20 min a temperatura ambiente. La solución resultante se pipeteó en los pocillos con las células y tras 4 h se añadió penicilina-estreptomicina (5 l) y se continuó la incubación en la incubadora durante la noche. Después se lavaron las células HEK293 con PBS y mediante adición de tripsina se desprendieron del fondo de los pocillos, antes de que se centrifugaran durante 5 min a 300 G. Las células U937 se centrifugaron igualmente durante 5 min a 300 G. Se sacó el sobrenadante y se lavaron las células a continuación en cada caso dos veces con PBS. A continuación se resuspendieron las células en 500 l de PBS para el análisis de FACS. En los dos diagramas de la figura 17 está representada la proporción de la expresión de EGFP con respecto a la expresión de RFP como número de células positivas (figura 17a) y como intensidad de fluorescencia promedio

55 de RFP (figura 17b).

Los resultados muestran que mediante la incorporación de un sitio de unión a micro-ARN en ARNm transcrito in vitro puede regularse la expresión de manera específica de célula. En el miARN de ARNm de RFP de BS se encuentra en el sentido 3’ de la secuencia de RFP y en el sentido 5’ de la cola de poliA la secuencia no traducida de una repetición cuádruple de un sitio de unión a micro-ARN, que están separados entre sí mediante secuencias espaciadoras cortas (SEQ ID N.º 1). Se usó un sitio de unión a micro-ARN, que se une al micro-ARN 142-3p. Este micro-ARN se expresa en células hematopoyéticas, como células U937, sin embargo no en células de otro origen, como células HEK-293. Cuando se une micro-ARN 142-3p al mi-ARN de ARNm de RFP de BS, por ejemplo en las células U937, se conduce la degradación del ARNm a través de la interferencia de ARN. Debido a ello se reduce la 65 formación de RFP, es decir menos células expresan RFP con más baja intensidad que aquellas células en las que

no está presente micro-ARN 142-3p. Para mostrar que este principio funciona bien también con el ARNm modificado de acuerdo con la invención, se cotransfectaron células U937 y HEK-293 en cada caso con ARNm de EGFP (sin sitio de unión a micro-ARN) y miRNA de ARNm de RFP de BS (con repetición en tándem cuadriplicada del sitio de unión a micro-ARN para el micro-ARN 142-3p) y a continuación se midió la expresión de EGFP y RFP por medio de 5 FACS. Ya que el miRNA de ARNm de RFP de BS en células U937 se degrada debido a la interferencia de ARN más rápidamente que en las células HEK-293, mientras que el ARNm de EGFP es igualmente estable en las dos células, se espera que la proporción de EGFP con respecto a RFP en células HEK-293 sea más alta que en células U937. Esto pudo confirmarse en los ensayos realizados. La figura muestra claramente el número de células U937 positivas para RFP tras la normalización con respecto al número de células positivas para EGFP es claramente más bajo que

10 en las células HEK-293. Los mismo vale para la cantidad de RFP formada por célula. Los resultados muestran con ello también claramente que puede controlarse la extensión de la actividad biológica de ARNm transcrito in vitro mediante la incorporación de sitios de unión a micro-ARN tras la transfección en células. Mediante esto puede suprimirse la traducción de ARNm en aquellas células en las que es indeseable la traducción de ARNm. Debido a ello pueden reducirse también los efectos secundarios.

15 El ARNm usado para los ensayos en este ejemplo tiene la siguiente secuencia (SEQ ID N.º 1). Sombreado en gris está representada la secuencia de RFP. La secuencia subrayada muestra la cuádruple repetición en tándem del sitio de unión a micro-ARN para el micro-ARN 142-3p con secuencias espaciadoras. La secuencia se clonó tras la síntesis por medio de BamHI-EcoRv en el vector pVAX1.

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Bibliografía

25

1.: K. Kariko et al., Mol Ther (16 de septiembre, 2008)

2.: L. Alexopoulou, A.C. Holt, R. Medzhitov, R.A. Flavell, Nature 413, 732 (18 de octubre, 2001)

3.: S.S. Diebold, T. Kaisho, H. Hemmi, S. Akira, C. Reis e Sousa, Science 303, 1529 (5 de marzo, 2004)

4.: F. Heil et al., Science 303, 1526 (5 de marzo, 2004)

30 5. M. Yoneyama et al., Nat Immunol 5, 730 (julio, 2004)

6.: M. Bivas-Benita, R. Zwier, H.E. Junginger, G. Borchard, Eur J Pharm Biopharm 61, 214 (octubre, 2005)

7.: D.J. Weiss et al., Mol Ther 8, 927 (diciembre, 2003)

8.: T.E. Weaver, J.A. Whitsett, Am J Physiol 257, L100 (agosto, 1989)

9. S.W. Glasser et al., Proc Natl Acad Sci USA 84, 4007 (junio 1987) 35 10. J.A. Whitsett, T.E. Weaver, N Engl J Med 347, 2141 (26 de diciembre, 2002)

11.: L.M. Nogee, D.E. de Mello, L.P. Dehner, H.R. Colten, N Engl J Med 328, 406 (11 de febrero, 1993)

12.: A. Hamvas et al., J Pediatr 130, 231 (febrero, 1997)

13.: J.C. Clark et al., Proc Natl Acad Sci USA 92, 7794 (15 agosto, 1995)

14.: K.R. Melton et al., Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 285, L543 (septiembre, 2003)

40 15. M. Ikegami, J.A. Whitsett, P.C. Martis, T.E. Weaver, Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 289, L962 (diciembre, 2005)

16.: B.D. Brown, M.A. Venneri, A. Zingale, L. Sergi Sergi, L. Naldini, Nat Med 12, 585 (mayo, 2006)

17.: B.D. Brown et al., Nat Biotechnol 25, 1457 (diciembre, 2007)

18.: S.A. McKenna et al., Nat Protoc 2, 3270 (2007)

19.: S. Holtkamp et al., Blood 108, 4009 (15 de diciembre, 2006)

20.: M.L.Read et al., Nucleic Acids Res 33, e86 (2005)

21.: M.K. Aneja, R. Imker, C. Rudolph, J Gene Med 9, 967 (noviembre 2007)

5 22. P. Dames et al., Nat Nanotechnol 2, 495 (agosto 2007)

23.: J.J. Pillow, T.R. Korfhagen, M. Ikegami, P.D. Sly, J Appl Physiol 91, 2730 (diciembre 2001)

24.: T.F. Schuessler, J.H. Bates, IEEE Trans Biomed Eng 42, 860 (septiembre 1995)

25.: Z. Hantos, A. Adamicza, E. Govaerts, B. Daroczy, J Appl Physiol 73, 427 (agosto 1992)

26. C.M. Alleyne, I.D. Frantz, 3rd, J.J. Fredberg, J Appl Physiol 66, 542 (febrero 1989) 10 27. P.D. Sly, R.A. Collins, C. Thamrin, D.J. Turner, Z. Hantos, J Appl Physiol 94, 1460 (abril 2003)

28.: M. Griese et al., Respir Res 6, 80 (2005)

29.: M.W. Pfaffl, G.W. Horgan, L. Dempfle, Nucleic Acids Res 30, e36 (1 de mayo, 2002)

Claims

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