KR20140119197A

KR20140119197A - 단백질 발현을 위한 비변형된 뉴클레오티드 및 변형된 뉴클레오티드의 조합을 가진 ｒｎａ

Info

Publication number: KR20140119197A
Application number: KR1020147025597A
Authority: KR
Inventors: 카르슈텐 루돌프; 미하엘 코르만
Original assignee: 에트리스 게엠베하
Priority date: 2009-07-31
Filing date: 2010-07-30
Publication date: 2014-10-08
Also published as: JP5785168B2; EP2459231B1; CN105255881A; US20160177295A1; DK3165234T3; EP3165234A1; ZA201201514B; US10745698B2; EA201200217A1; EP3165234B1; CA2769670C; AU2010278309B2; JP2013500704A; US20120195936A1; US20150290288A1; CN102695525B; US20210095272A1; CN102695525A; WO2011012316A3; DK2459231T3

Abstract

본 발명은 폴리리보뉴클레오티드가 비변형된 뉴클레오티드 및 변형된 뉴클레오티드의 조합을 함유하고, 여기서, 5 내지 50%의 우리딘 뉴클레오티드 및 5 내지 50%의 시티딘 뉴클레오티드가 변형된 우리딘 뉴클레오티드 및 변형된 시티딘 뉴클레오티드인, 단백질 또는 단백질 단편을 코딩하는 서열을 가진 폴리리보뉴클레오티드에 관한 것이다.

Description

단백질 발현을 위한 비변형된 뉴클레오티드 및 변형된 뉴클레오티드의 조합을 가진 ＲＮＡ{RNA WITH A COMBINATION OF UNMODIFIED AND MODIFIED NUCLEOTIDES FOR PROTEIN EXPRESSION}

본 발명은 단백질 발현을 위한 비변형된 뉴클레오티드 및 변형된 뉴클레오티드의 조합을 함유하는 폴리리보뉴클레오티드, 특히, 메신저 RNA, 및 질환 치료 및 진단 방법을 위한 상기 RNA의 용도에 관한 것이다.

메신저 RNA (mRNA)는 주로 뉴클레오시드로서 아데노신, 시티딘, 우리딘 및 구아노신을 함유하는 뉴클레오시드 인산염 빌딩 블록으로 구성된 중합체인데, 이는 중간 캐리어로서, 유전 정보를 세포 핵 중에 있는 DNA로부터, 단백질 번역이 일어나는 세포질로 전달한다. 따라서, 상기 메신저 RNA는 유전자 발현을 위한 대안으로서 적합하다.

세포내에서의 생화학적 프로세스에 대한 해명 및 인간 게놈의 해명을 통해 결핍 유전자와 질환 사이의 관련성이 밝혀졌다. 그러므로, 결핍 유전자에 기인한 질환을 유전자 요법에 의해 치유하려는 바람이 장기간 동안 이어졌다. 기대치는 없었지만, 대체로 그에 대한 시도는 실패로 끝이 났다. 최초의 유전자 요법에 대한 접근법은, 온전한 유전자가 발현됨으로써 손실 또는 결손 단백질이 제공될 수 있도록 결핍 또는 결손 유전자의 온전한 DNA를 벡터내 세포 핵 내로 전달하는 데에 있었다. 이러한 시도들은 대체로 성공을 거두지 못했고, 성공도가 낮은 시도는 상당한 부작용, 특히, 종양발생 증가로 부담을 안고 있었다.

추가로, 유전적 결함이 원인이 아니라, 단백질 부족 또는 단백질 결함에 기인하는 것인 질환이 존재한다. 이러한 경우에는 또한 DNA를 투여함으로써 생체내에서 관련 단백질을 제조할 수 있도록 하는 것이 고려시 된다. 대사에 관여하고, 병적 또는 비-병적 이유에서 파괴되거나 억제되는 인자를 제공할 경우에도 또한 부작용이 전혀 없거나, 낮은 핵산 요법을 얻을 수 있다.

질환을 유발하는 유전자 결함을 치료하기 위한 유전병 치료를 위해 mRNA를 사용하는 것은 이미 제안된 바 있다. 이러한 경우 장점은, mRNA는 오직 세포의 세포질 내로만 도입되어야 할 뿐, 핵 내로 삽입될 필요는 없다는 점이다. 핵 내로의 삽입은 어렵고 비효율적이며; 또한 벡터 또는 그의 일부가 게놈 내로 삽입될 경우에는 염색체 DNA가 변경될 위험도 상당하다.

사실상 시험관내에서 전사된 메신저 RNA가 포유동물 조직에서 발현될 수는 있지만, 질환 치료를 위해 mRNA를 사용하고자 한 시도에는 추가의 난관들도 발생하였다는 것을 명백히 알 수 있다. mRNA의 안정성이 부족함에 따라 포유동물 조직에서 원하는 단백질이 충분한 양으로 이용될 수 없게 되는 결과가 초래되었다. 상당한 추가의 단점은 mRNA가 많은 면역학적 반응을 유발한다는 사실로부터 발생되었다. 예측컨대, 이러한 강력한 면역 반응은 Toll-유사 수용체, 예를 들어, TLR3, TLR7, TLR8 및 헬리카제 RIG-1에의 결합을 통해 일어나는 것으로 가정할 수 있다.

WO 2007/024708에서는 면역학적 반응을 막기 위해 4개의 리보뉴클레오티드 중 하나가 변형된 뉴클레오티드로 대체된 RNA를 사용하는 것이 제안되었다. 특히, 우리딘이 전체적으로 슈도우리딘으로 치환된 경우에는 mRNA가 어떠한 반응을 보이는지에 대해 조사하였다. 상기 RNA 분자는 면역원성이 현저히 낮은 것으로 밝혀졌다. 그러나, 이들 생성물의 생물학적 활성은 성공적인 요법을 위해서는 아직 충분한 것은 아니었다. 또한, 변형에 의해 적어도 두 유형의 뉴클레오티드가 전체적으로 대체된 RNA 서열은 단지 어렵게 제조될 수 있거나, 또는 전혀 제조될 수 없는 것으로 밝혀졌다.

필요하거나 유익한 단백질을 신체에 제공하고/거나, 손실 또는 결핍 단백질에 기인한 질환을 핵산을 사용하여 치료할 수 있도록 하기 위해서는 세포를 형질감염시킬 수 있고, 충분히 장기간 동안 세포내에서 안정적으로 남아 충분량의 단백질을 제공함으로써 과도하게 자주 투여될 필요가 없게 만드는 핵산을 이용하는 것이 바람직할 수 있다. 그러나, 동시에 상기와 같은 핵산은 유의적인 정도로 면역학적 반응을 유발하지도 않아야 한다.

따라서, 본 발명의 목적은 결핍 또는 결손 유전자에 의해 유발된 질환 또는 손실 또는 결손 단백질에 의해 유발된 질환 치료에 적합하거나, 필요하거나 유익한 단백질을 생체내에서 제조할 수 있고, 면역 반응을 현저하게 감소시키거나 또는 어떤 면역 반응도 일으키지 않으며, 생리학적 환경하에서 안정적이고, 즉, 투여 후 즉시 분해되지 않으며, 전반적으로 치료용 제제로서 적합한 제제를 제공하고자 하는 것이었다. 추가로, 본 발명의 목적은 단백질의 생체내 제조를 통해 긍정적인 영향을 얻을 수 있는 질환 치료용 제제를 제공하고자 하는 것이었다.

본 문제는 청구항 제1항에서 정의된 폴리리보뉴클레오티드를 통해 해결된다. 그의 결함 또는 부족이 신체에 불리하거나, 그의 발현이 신체에 유리한 것인 단백질 또는 단백질 단편을 코딩하는 mRNA가 특히 적합하다. 하기에서 "폴리리보뉴클레오티드" 또는 "mRNA"가 사용될 경우, 문맥상 달리 언급되지 않는 한, 이는 상기 기술된 바와 같이 질병 또는 부족과 관련이 있는 단백질 또는 단백질 단편을 코딩하거나, 신체에 유익하거나, 신체를 지지하는 단백질 또는 단백질 단편을 코딩하는 폴리리보뉴클레오티드 또는 mRNA인 것으로 항상 간주되어야 한다.

놀랍게도, 상기 언급한 문제들은 비변형된 뉴클레오티드 및 변형된 뉴클레오티드, 이 둘 모두를 함유하는 RNA가 사용될 경우 (여기서, 소정의 함량의 우리딘 및 시티딘 뉴클레오티드가 각각 변형된 형태로 존재한다는 것이 필수적이다), 리보핵산 또는 폴리리보뉴클레오티드 (이는 또한 일반적으로 하기에서는 RNA로서 지칭된다)의 사용을 통해, 특히, 메신저 RNA (mRNA)의 사용을 통해 해결될 수 있다는 것이 밝혀졌다.

추가로, 두 유형의 뉴클레오티드가 각각 부분적으로 변형된 뉴클레오티드로 대체된 RNA의 번역률 및 형질감염률은 높으며, 즉, 상기 RNA가 공지된 RNA를 통해 가능했던 것보다 더 많은 세포를 형질감염시키고, 세포 1개당 더 많은 코딩된 단백질을 제조한다는 놀라운 관찰 결과를 얻게 되었다. 추가로, 본 발명에 따라 변형된 RNA는 당업계에 최신 동향으로부터 공지된 RNA 또는 비변형된 RNA보다 더 장기간 동안 활성을 띤다.

본 발명에 따른 RNA를 통해 달성된 장점은 비변형된 RNA를 통해서도, 또는 전체적으로 변형된 RNA를 통해서도 얻을 수 없다. mRNA 중 변형된 우리딘 및 시티딘 뉴클레오티드의 함량이 구체적 설정되고, 각각의 함량이 5% 이상 내지 50% 이하일 경우, 면역원성 감소 및 안정성 증가라는 2가지 모두가 달성될 수 있다는 것으로 밝혀졌다. 어떤 변형도 없는 mRNA가 사용될 경우, 이는 극도의 면역원성을 띠는 반면, 모든 우리딘 및 시티딘 뉴클레오티드가 변형된 형태로 존재하는 경우에는 생물학적 활성이 너무 낮기 때문에 치료학적 목적을 위해서는 사용이 불가능할 수 있다. 변형된 뉴클레오티드의 함량이 매우 높은 RNA는 매우 어려운 조건하에서 제조될 수 있거나, 또는 제조가 전혀 불가능할 수 있다. 따라서, 우리딘 대신 오직 슈도우리딘만, 및 오직 변형된 시토신 및/또는 변형된 아데노신만을 함유하는 뉴클레오티드 혼합물을 통해서는 어떤 RNA 서열도 수득할 수 없다는 것이 확립되었다. 그러나, 놀랍게도, 본 발명에 따른 방식으로 변형된 RNA 서열은 적당한 효율로 쉽게 제조될 수 있다.

추가로, 변형의 성질이 중요하다는 것이 밝혀졌다. 본 발명에 따라 변형된 mRNA는 면역원성이 낮고, 수명이 긴 것으로 밝혀졌다.

본 발명에 따른 RNA의 안정성은 기존에 사용되었던 핵산과 비교하였을 때 현저히 증가한 것으로 밝혀졌다. 따라서, 본 발명에 따른 mRNA는 형질감염 후 10일이 경과한 후에도 비변형된 RNA보다 10배 더 많은 양으로 검출될 수 있다는 것이 확립되었다. 형질감염률이 높은 것 뿐만 아니라, 무엇보다도 수명이 연장되었다는 점에서 본 발명에 따른 mRNA는 치료학적 목적을 위해 사용될 수 있는데, 그 이유는 높은 안정성과 그에 따른 장기간의 수명으로 인해 환자에게 허용될 수도 있는 장기간의 간격을 두고도 투여될 수 있기 때문이다.

따라서, 본 발명에 따라 치료학적 목적으로 특히 유익한 제제를 제공한다. 본 발명에 따른 RNA는 치료를 위해 사용되는 제품에 대해 제시되는 요건을 이행한다: RNA는 그의 활성의 발생을 위해서는 세포 핵 내로 도입되는 것이 아니라, 오직 세포질로만 도입되어야 하는 바, 게놈 내로의 통합에 대한 위험은 존재하지 않으며, 본 발명의 따른 변형 유형은 대개 면역 반응을 방해하고, 추가로 그러한 변형은 RNA가 신속하게 분해되지 못하도록 보호한다. 그러므로, 본 발명에 따른 RNA를 통해 조직에서 생리학적 기능을 생성 또는 재생시킬 수 있고, 예를 들어, 결핍 또는 결손 유전자로 인해 실패하였던 생체내 기능을 회복시킬 수 있으며, 이에 결핍 또는 결손 유전자에 의해 유발된 질환을 치료할 수 있다. 추가로, 놀랍게도 질환의 진행 과정에 직접 또는 간접적으로 영향을 줄 수 있는 단백질이 생체내에서 제조된다는 점에서 본 발명에 따른 폴리리보뉴클레오티드는 질환에 바람직하게 영향을 미친다는 것이 밝혀졌다. 그러므로, 일반적으로 또는 특정 상황하에서 신체에 유익하거나 신체를 지지하는 인자, 예를 들어, 성장 인자, 혈관형성 인자, 자극인자, 유도제, 효소 또는 다른 생물학상 활성인 분자를 코딩하는 본 발명에 따른 폴리리보뉴클레오티드 또한 제공할 수 있다.

본 발명은 하기 설명 및 첨부된 도면에서 더욱 상세하게 설명된다.

도 1은 상이한 뉴클레오티드 변형이 각종 mRNA의 면역원성 및 안정성에 미치는 효과를 나타낸 것이다. 도 1a는 상이하게 변형된 뉴클레오티드를 가진 각종 RNA 투여 이후의 TNF-α 수준을 플롯팅한 다이어그램이다. 비변형된 RNA 및 최대 25%까지 단일 변형된 RNA는 고수준의 염증성 마커를 유도하였고, 상기 RNA의 높은 면역원성을 나타낸 반면, 본 발명에 따라 이중으로 변형된 RNA의 경우, 염증성 마커는 허용가능한 양으로 존재하였다. 도 1b 및 1c는 인간 세포 및 마우스 세포에서 각종 방식으로 변형된 mRNA의 생물학적 활성 (형질감염률 및 발현)을 나타내는 것으로서, 이는 적색 형광 단백질 (RFP) 양성 세포의 비율(%) 및 세포 1개당 RFP의 양으로 표시하였다. 본 다이어그램은 비변형된 RNA, 단일 변형된 RNA 및 완전하게 변형된 RNA에 의해 코딩된 단백질은 단지 보다 낮은 비율의 함량으로 검출될 수 있는 반면, 본 발명에 따라 부분적으로 이중으로 변형된 RNA는 그의 뛰어난 안정성에 기인하여 유의적으로 더 높은 양으로 수득된 것으로 나타났다.
도 2는 다중 변형된 mRNA의 경우 안정성이 더 높고, 발현 지속 기간은 더 길다는 것을 나타낸다. 도 2a 및 2b는 각각 각종 변형된 mRNA 및 비변형된 mRNA의 발현 지속 기간을 플롯팅한 다이어그램을 나타낸 것이다. 도 2c는 비변형된 RNA, 단일 변형된 RNA 및 다중 변형된 RNA의 RNA 면역침전에 대한 데이터를 나타낸 것이다. 도 2d는 생체내에서의 정맥 투여 이후 각종 mRNA의 면역원성을 플롯팅한 다이어그램을 나타낸 것이다. 본 데이터를 통해 본 발명에 따라 이중으로 변형된 RNA가 높은 안정성 및 낮은 면역원성을 조합적으로 나타내었다는 것이 제시되었다.
도 3은 SP-B 조건부 결핍 마우스에서 변형된 SP-B mRNA를 기관내 에어로졸로 적용한 후에 수득된 각종 시험 결과를 나타낸 것이다. 도 3a는 비변형된 RNA 및 다중 변형된 RNA로 처리된 마우스의 폐를 촬영한 생물 발광 영상을 나타낸 것이다. 오직 본 발명에 따라 변형된 RNA에 의해서만 5일 후에도 여전히 계속하여 충분량의 단백질이 발현된 반면, 비변형된 RNA의 경우에는 발현이 이미 3시간 후에도 낮게 나타났다는 것을 뚜렷하게 관찰할 수 있었다. 도 3b는 플럭스를 형질감염 후 경과 시간에 대해 플롯팅한 다이어그램을 나타낸 것이다. 본 발명에 따른 변형이 발현 지속 시간을 연장시켰다는 것을 뚜렷하게 알 수 있었다. 도 3c는 SP-B mRNA의 투약 계획안을 나타낸 것이다. 도 3d는 변형된 mRNA로 처리된 마우스의 생존율을 대조군 mRNA로 처리된 마우스의 것과 비교하여 제시한 다이어그램을 나타내는데, 여기서, 본 발명에 따른 RNA로 처리된 마우스의 생존율이 현저하게 더 긴 것으로 나타났다. 도 3e는 SP-B를 코딩하는 본 발명에 따른 RNA로 처리하였을 때, SP-B 결핍 마우스에서 SP-B가 재구성될 수 있다는 알 수 있는 면역염색을 나타낸 것이다. 도 3f는 무세포 BALF 상등액 중 단백질 분포에 대한 반정량적 웨스턴 블롯 분석의 결과를 나타낸 것이다. 도 3g 및 3h는 3c에 따라 처리된 마우스로부터 얻은 폐 조직학적 표본 및 기관지 폐포 세척액 표본의 영상을 나타낸 것이다. 대조군 RNA를 투여받은 마우스로부터 유래된 폐 및 세척 표본은 SP-B 결핍증에 대해 일반적인 폐 손상을 나타낸 반면, 본 발명에 따른 RNA로 처리된 마우스로부터 유래된 표본은 비-병적이었다. 도 3i는 시간 경과에 따른 폐 허용에 관한 다이어그램을 나타낸 것이다. 본 발명에 따른 RNA로 처리하였을 때에는 폐 기능이 장기간 동안 유지된 반면, 대조군 RNA로 처리된 동물에서는 폐 손상이 발견되었다.
도 4는 제조된 RFP의 형광 강도를 비변형된 mRNA 및 상이하게 변형된 mRNA에 대해 플롯팅한 다이어그램을 나타낸 것이다. 변형된 mRNA는 비변형된 mRNA와 비교하여 더 늦은 시간에 덜 강력하게 번역되었다.
도 5는 상이한 mRNA로 처리된 마우스에 대한 염증성 마커를 플롯팅한 3개의 다이어그램을 나타낸 것이다. 본 발명에 따라 변형된 RNA는 어떤 염증성 반응도 유발하지 않는 반면, 비변형된 RNA는 강력한 면역 반응을 일으킨다는 것을 뚜렷하게 알 수 있었다.
도 6은 상이한 전형적인 폐 파라미터를 본 발명에 따른 상이한 mRNA로 처리된 마우스에 대해 플롯팅한 다이어그램을 나타낸 것이다. 파라미터는 조직 탄성도 (HL), 조직 충격 완화 (GL), 조직 무력증, 기도 저항 (Rn) 및 폐 조직 조성 Eta (GL/HL)이다. 본 발명에 따른 RNA의 경우, 양성 대조군과 비교하였을 때 파라미터 중 어느 것도 악화되지는 않았다.
도 7은 RFP 양성 세포의 함량(%)을 변형된 뉴클레오티드를 상이한 함량으로 함유하는 mRNA에 대해 플롯팅한 다이어그램으로 나타낸, 상이하게 변형된 mRNA의 발현능을 나타낸 것이다. 상기 비교를 통해 오직 본 발명에 따라 변형된 mRNA만이 장기간 지속적으로 발현이 일어났고, 본 발명에 따라 변형된 것이 아닌 mRNA는 인간 세포 및 마우스 세포, 둘 모두에서 그보다는 작은 정도로 발현이 일어난 것으로 밝혀졌다.
도 8은 RFP 양성 세포의 함량(%)을 상이하게 변형된 뉴클레오티드를 함유하는 mRNA에 대해 플롯팅한 다이어그램으로 나타낸, 상이하게 변형된 mRNA의 발현능을 나타낸 것이다. 상기 비교를 통해 오직 본 발명에 따라 변형된 mRNA만이 장기간 지속적으로 발현이 일어났고, 본 발명에 따라 변형된 것이 아닌 mRNA는 인간 세포 및 마우스 세포, 둘 모두에서 그보다는 작은 정도로 발현이 일어난 것으로 밝혀졌다.
도 9는 본 발명에 따른 냉동 건조된 RNA의 안정성을 나타낸 것이다.
도 10a는 형질감염률을 각종 변형된 뉴클레오티드에 대해 플롯팅한 다이어그램으로 나타낸 것이다. 10%의 우리딘 뉴클레오티드 및 10%의 시티딘 뉴클레오티드 및 임의로는 또한 5%의 추가로 뉴클레오티드가 변형된 RNA를 통해 가장 높은 형질감염률을 얻을 수 있다는 것을 뚜렷하게 알 수 있었다. 도 10b는 면역학적 반응에 대한 마커로서 TNF-α 제조를 상이하게 변형된 뉴클레오티드를 함유하는 RNA에 대해 플롯팅한 다이어그램을 나타낸 것이다. 이는 각각 5 ㎍의 mRNA로 형질감염된 인간 PBMC의 ELISA의 결과이다. 달리 언급하지 않는 한, 각각의 변형률은 10%였다.
5 내지 50% 사이의 우리딘 뉴클레오티드 및 시티딘 뉴클레오티드가 변형된 RNA는 비변형된 RNA와 비교하였을 때, 현저하게 감소된 면역원성을 가진다는 것을 뚜렷하게 알 수 있다.
도 11은 본 발명에 따라 변형된 EPO 코딩 mRNA의 안정성 및 면역원성을 측정한 각종 시험의 결과를 나타낸 것이다. 다이어그램 11(a)는 상이한 방식으로 변형된 EPO 코딩 mRNA를 투여한 후 14일이 경과하였을 때에도 검출가능한 에리트로포이에틴의 함량을 나타낸 것이다. 본 발명에 따라 변형된 mRNA를 주사맞은 마우스에서의 EPO의 함량은 주사 후 14일이 경과하였을 때, 비처리 마우스에서의 함량보다 4.8배 더 높았고, 비변형된 RNA로 처리된 마우스에서의 함량보다 4.8배 더 높았으며, 또한 단일 변형된 RNA로 처리된 마우스에서의 함량보다는 2.5배 더 높았다는 것을 뚜렷하게 알 수 있다.
다이어그램 11(b)는 상이하게 변형된 EPO 코딩 mRNA를 투여한 후 14일 및 28일이 경과하였을 때의 헤마토크릿 값을 나타낸 것이다. 다이어그램을 통해 본 발명에 따라 변형된 mRNA로 처리된 마우스의 헤마토크릿 값이 상당 수준 더 높다는 것이 뚜렷하게 나타났다.
도 11(c)의 다이어그램에는 면역학적 반응에 전형적인 인자의 생산을 플롯팅한 것이 제시되어 있다. 비변형된 mRNA를 투여한 경우에는 염증성 마커 4개 모두가 증가한 반면, 본 발명에 따라 변형된 RNA로 처리한 경우에는 면역학적 반응에 대해서는 검출이 거의 불가능한 것으로 나타났다.
도 11(d)의 다이어그램은, 이 또한 염증성 마커인 IFN-α 및 IL-12에 대한 상응하는 값을 나타낸 것이다. 여기서도 또한 본 발명에 따라 변형된 mRNA는 비변형된 mRNA와는 대조적으로 실제로는 어떤 면역학적 반응도 유발하지 않은 것으로 나타났다.
도 12는 본 발명에 따라 변형된 SP-B mRNA를 1주 이내에 2회에 걸쳐 (B) 또는 28일 동안 주당 2회에 걸쳐 (C) 투여받은 마우스, 또는 비교군인 변형된 EGFPLuc mRNA (A)를 투여받은 마우스로 이루어진 3개의 군으로 생존율을 플롯팅한 다이어그램을 나타낸 것이다. SP-B mRNA를 투여받은 한은 마우스가 유일하게 살아남은 것으로 나타났다 (B, C). SP-B mRNA를 제공받지 못한 경우에는 마우스가 사망하였다 (A).
도 13은 비변형된 SP-B mRNA, 본 발명에 따라 변형된 SP-B mRNA 또는 SP-B 플라스미드 DNA 투여 후 8시간이 경과하였을 때, 마우스의 기관지 폐포 세척액 중 시토카인의 수준을 나타낸 것이다. 본 결과를 통해 비변형된 mRNA 또는 플라스미드 DNA를 기관내 투여한 경우에는 이들 각각에서 염증성 마커인 IFN-γ 및 IL-12가 현저하게 증가한 것과는 대조적으로, 본 발명에 따라 변형된 SP-B mRNA를 투여한 경우, 염증성 마커는 비처리군과 비교하거나, 퍼플루오로카본으로 처리된 군과 비교하였을 때, 사실상 증가하지 않는 것으로 나타났다.
도 14는 본 발명에 따라 변형된 mEPO mRNA를 반복 투여한 후 수득한 헤마토크릿 값을 나타낸 것이다. 본 결과를 통해 본 발명에 따라 변형된 mEPO mRNA의 반복 투여의 내성은 우수하며, 그 결과, 헤마토크릿이 장기간 동안 지속적으로 증가한 것으로 나타났다.
도 15는 상이한 형태의 본 발명에 따라 변형된 RNA를 함유하는 코팅을 제공받은 티타늄 임플란트와 함께 인큐베이션된 세포의 루시퍼라제 발현을 나타낸 것이다. 티타늄 플레이트 상에 적용된 지연 방출형 중합체인 코팅 중에 함유되어 있고, 그로부터 서서히 방출된 본 발명에 따라 변형된 RNA는 그의 활성을 상실하지 않는 것으로 나타났다.
도 16은 변형된 mRNA를 함유하는, 티타늄 플레이트 상에 적용된 코팅에 대한 루시퍼라제 발현을 나타낸 것이다. 본 발명에 따라 변형된 mRNA에 대한 단백질 발현이 비처리된 RNA에 대한 것보다 훨씬 더 높았고, 플라스미드 DNA에 대한 것보다도 높은 것으로 나타났다.
도 17a 및 17b는 각각 RFP-양성 세포의 상대적인 함량, 및 마이크로-RNA 142-3p에 대한 마이크로-RNA 결합 부위를 가진 mRNA의 상대적인 RFP 발현을 나타낸 것이다. 마이크로-RNA 결합 부위를 가진 RNA의 RFP-양성 세포의 함량이 더 낮았고, 코딩된 단백질의 발현은 상응하는 마이크로-RNA 142-3p를 함유하는 세포에서 상당 수준 더 낮은 것으로 나타났다.
도 18은 마이크로-RNA 결합 부위의 혼입에 의해 변형된 RFP 코딩 RNA의 서열을 나타낸 것이다. RFP 서열은 회색 바탕으로 표시되어 있다. 이격 서열 (바탕없이 표시)과 함께 마이크로-RNA 142-3p에 대한 마이크로-RNA 결합 부위(밝은 회색 바탕으로 표시)의 4중 직렬 반복부는 밑줄로 표시되어 있다.

본 발명에 따라, 부분적으로 다중 변형된 뉴클레오티드를 가진 폴리리보뉴클레오티드 분자, 부분적으로 다중 변형된 mRNA, IVT mRNA, 및 결핍 또는 결손 유전자에 기인한 질환 치료용 약물 또는 생체내에서 예를 들어, 인자, 자극인자, 유도제 또는 효소와 같은 단백질의 제공에 의해 완화될 수 있거나 치유될 수 있는 질환 치료용 약물의 제조를 위한 상기 RNA 분자의 용도를 제공한다. 추가의 실시양태에서, 본 발명에 따른 mRNA는 오직 관련 세포에서만 원하는 mRNA의 활성을 허용하기 위해 표적 결합 부위, 표적화 서열 및/또는 마이크로-RNA 결합 부위와 조합된다. 추가의 실시양태에서, 본 발명에 따른 RNA는 3' 폴리A 테일 하류의 마이크로-RNA 또는 shRNA와 조합된다. 추가의 실시양태에서, 그의 작용 지속 시간이 추가의 특이적인 변형에 의해 조절되거나 연장되는 것인 RNA를 제공한다.

따라서, 본 발명의 대상은 안정성이 증가되고 면역원성이 감소된 RNA이다. 본 발명에 따른 RNA는 그 자체가 공지된 방식으로 제조될 수 있다. 대체로, 질병에 영향을 줄 수 있거나, 그의 부족 또는 결핍 형태가 질환을 유발하는 것인 온전한 또는 원하는 단백질을 코딩하는 DNA의 전사에 의해 제조된다.

본 발명과 관련하여, RNA라는 것은 그가 세포에 도입된 경우, 단백질 또는 그의 단편을 발현하는 데 적합하거나, 단백질 또는 그의 단편으로 번역될 수 있는 임의의 폴리리보뉴클레오티드 분자를 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 본원에서 "단백질"이라는 용어는 임의 종류의 아미노산 서열, 즉, 2가지 이상의 아미노산 각각이 펩티드 결합으로 연결되어 있는 쇄를 함유하며, 이는 또한 펩티드 및 융합 단백질도 포함한다.

본 발명에 따른 RNA는, 세포에서 또는 세포 주변에서 그의 작용을 필요로 하거나, 그에 대해 그의 작용이 유익한 것인 단백질 또는 그의 단편, 예를 들어, 그의 부족 또는 결손 형태가 질환 또는 질병에 대한 촉발제가 되거나, 그의 제공을 통해 질환 또는 질병을 완화 또는 예방할 수 있는 것인 단백질, 또는 세포에서 또는 세포 주변에서 신체에 유익한 프로세스를 촉진시킬 수 있는 단백질을 코딩하는 리보뉴클레오티드 서열을 함유한다. 대체로, 본 발명에 따른 RNA는 완전한 단백질 또는 그의 작용성 변이체에 대한 서열을 함유한다. 추가로, 리보뉴클레오티드 서열은 인자, 유도제, 조절인자, 자극인자 또는 효소로서 작용하는 단백질, 또는 그의 작용성 단편을 코딩할 수 있는데, 여기서, 상기 단백질은 그의 작용이 장애, 특히, 대사 장애를 치료하는 데, 또는 예를 들어, 새로운 혈관, 조직 형성 등과 같은 생체내 프로세스를 개시하는 데 필요한 것이다. 여기서, 작용성 변이체는 세포에서 그의 작용을 필요로 하는 것이거나, 그의 부족 또는 결손 형태가 병적인 것인 단백질의 기능을 세포에서 착수할 수 있는 것인 단편을 의미하는 것으로서 이해하여야 한다. 추가로, 본 발명에 따른 RNA는 또한 작용성 영역 및/또는 3' 또는 5' 비코딩 영역을 추가로 가질 수 있다. 3' 및/또는 5' 비코딩 영역은 코딩된 단백질의 측면에 천연적으로 위치하는 영역, 또는 RNA의 안정화에 기여하는 다른 인공 서열일 수 있다. 당업자는 각 경우에서 통상의 실험에 의해 상기 목적에 적합한 서열을 찾아낼 수 있다.

바람직한 실시양태에서, RNA는 특히 번역을 개선시키기 위해 m7GpppG 캡, 내부 리보솜 진입 부위 (IRES) 및/또는 3' 말단에 폴리A 테일을 함유한다. RNA는 번역을 촉진시키는 추가 영역을 가질 수 있다. 변형된 뉴클레오티드의 그의 함량은 본 발명에 따른 RNA에 중요하다.

안정성이 증가되고, 면역원성이 감소된 본 발명에 따른 RNA는 변형된 시티딘 뉴클레오티드 및 변형된 우리딘 뉴클레오티드의 함량이 설정된 뉴클레오티드 혼합물을 상기 RNA의 제조를 위해 사용함으로써 수득될 수 있다. 본 발명에 따른 RNA는 비변형된 뉴클레오티드 및 변형된 뉴클레오티드, 둘 모두를 함유하며, 여기서, 5 내지 50%의 시티딘 뉴클레오티드 및 5 내지 50%의 우리딘 뉴클레오티드가 변형된 것인 뉴클레오티드 혼합물을 사용하여 제조하는 것이 바람직하다. 아데노신- 및 구아노신-함유 뉴클레오티드는 비변형된 뉴클레오티드일 수 있다. ATP 및/또는 GTP 중 일부가 또한 변형된 것이고, 그의 함량은 20%를 초과하지 않아야 하며, 존재할 경우, 그의 함량은 바람직하게는 0.5 내지 10% 범위에 함유되어야 하는 것인 뉴클레오티드 혼합물 또한 사용될 수 있다.

따라서, 바람직한 실시양태에서, 5 내지 50%의 변형된 시티딘 뉴클레오티드 및 5 내지 50%의 우리딘 뉴클레오티드 및 50 내지 95%의 비변형된 시티딘 뉴클레오티드 및 50 내지 95%의 비변형된 우리딘 뉴클레오티드를 가지며, 아데노신 및 구아노신 뉴클레오티드는 비변형된 것이거나, 부분적으로 변형된 것일 수 있으며, 바람직하게는 비변형된 형태로 존재하는 것인 mRNA를 제공한다.

바람직하게는, 10 내지 35%의 시티딘 및 우리딘 뉴클레오티드는 변형된 것이고, 특히 바람직하게는 변형된 시티딘 뉴클레오티드의 함량은 7.5 내지 25% 범위에 함유되어 있고, 변형된 우리딘 뉴클레오티드의 함량은 7.5 내지 25% 범위에 함유되어 있다. 실제로는 상대적으로 낮은 함량, 예를 들어, 각각 단지 10%의 변형된 시티딘 및 우리딘 뉴클레오티드는 본 발명에 따른 변형이라는 전제 조건하에서 원하는 특성을 달성할 수 있는 것으로 나타났다.

뉴클레오시드 변형이 가진 성질은 안정성에 영향을 미치며, 이를 통해 mRNA의 수명 및 생물학적 활성에도 영향을 미친다. 적합한 변형은 하기 표에 기재되어 있다:

본 발명에 따른 RNA의 경우, 모든 우리딘 뉴클레오티드 및 시티딘 뉴클레오티드가 각각 동일한 형태로 변형될 수 있거나, 또는 다르게는 변형된 뉴클레오티드의 혼합물이 각각의 경우에 대해 사용될 수 있다. 변형된 뉴클레오티드는 천연적으로 또는 비천연적으로 발생된 변형을 가질 수 있다. 각종 변형된 뉴클레오티드의 혼합물이 사용될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 변형된 뉴클레오티드의 일부는 천연 변형을 가질 수 있고, 동시에 또 다른 부분은 천연적으로는 발생되지 않는 변형을 가지며, 천연적으로 발생된 것인 변형된 뉴클레오티드 및/또는 비천연적으로 발생된 것인 변형된 뉴클레오티드의 혼합물이 사용될 수 있다. 또한, 변형된 뉴클레오티드의 일부는 염기 변형을 가지고, 또 다른 부분은 당 변형을 가질 수 있다. 동일한 방식으로, 모든 변형은 염기 변형이거나, 모든 변형은 당 변형일 수 있거나, 또는 그의 임의의 적합한 혼합물을 수 있다. 다양한 변형을 통해 본 발명에 따른 RNA의 안정성 및/또는 작용 지속 기간은 선택적으로 조절될 수 있다.

본 발명의 한 실시양태에서, 한 유형의 뉴클레오티드에 대해 2가지 이상의 상이한 변형이 사용되는데, 여기서, 한 유형의 뉴클레오티드는 추가의 기가 그를 통해 부착될 수 있도록 하는 것인 관능기를 가진다. 상이한 기의 부착을 위한 결합 부위를 제공하기 위해 상이한 관능기를 가진 뉴클레오티드 또한 사용될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 변형된 뉴클레오티드의 일부는 아지도기, 아미노기, 히드록시기, 티올기, 또는 미리 정의된 조건하에서 반응에 적합한 일부 다른 반응기를 가질 수 있다. 관능기는 또한 결합능이 있는 천연적으로 존재하는 기를 특정 조건하에서 활성화시켜 그러한 관능기를 가진 분자가 커플링할 수 있도록 하는 것일 수 있다. 결합 부위를 제공하도록 변형된 뉴클레오티드 또한 아데노신 또는 구아노신 변형으로서 도입될 수 있다. 특히 적합한 변형을 선택하는 것, 및 이용가능한 결합 부위를 선택하는 것은 어떤 기가 도입되는지에 따라서, 및 그가 존재하는 빈도에 따라서 달라진다. 따라서, 관능기 및/또는 활성화 기를 제공받은 뉴클레오티드의 함량은 그와 커플링되는 기의 함량이 얼마나 높은지에 따라 달라지며, 이는 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있다. 대체로, 관능기 및/또는 활성화 기를 통해 변형된 뉴클레오티드가 존재할 경우, 그의 함량은 1 내지 25%의 변형된 뉴클레오티드이다. 필요에 따라 당업자는 통상의 실험에 의해 각 경우에서 가장 적합한 기 및 그의 최적의 함량을 결정할 수 있다.

본 발명에 따른 RNA가 변형된 우리딘-함유 뉴클레오티드로서 2'-티오우리딘을 함유할 때에 특히 우수한 결과를 얻을 수 있다는 것이 밝혀졌다. 추가로, 본 발명에 따른 RNA가 변형된 시티딘 뉴클레오티드로서 5'-메틸시티딘을 함유하는 것이 바람직하다. 따라서, 상기 두 뉴클레오티드가 바람직하다. 상기 두 변형의 조합 또한 바람직하다. 특히 바람직한 실시양태에서, 상기 두 뉴클레오티드는 각각 10 내지 30%의 함량으로 존재한다. 변형된 뉴클레오티드의 총 함량이 50%의 특정 변형된 뉴클레오티드 유형을 초과하지 않는 한, 또 다른 방식으로 변형된 뉴클레오티드 또한 임의로 존재할 수 있다.

5 내지 50%, 특히 바람직하게는 5 내지 30% 및 특히 7.5 내지 25%의 우리딘 뉴클레오티드가 2'-티오우리딘 뉴클레오티드, 및 5 내지 50%, 특히 바람직하게는 5 내지 30% 및 특히 7.5 내지 25%의 시티딘 뉴클레오티드가 5'-메틸시티딘 뉴클레오티드이며, 여기서, 아데노신 및 구아노신 뉴클레오티드는 비변형된 뉴클레오티드이거나, 부분적으로 변형된 뉴클레오티드일 수 있는 것인 폴리리보뉴클레오티드가 바람직하다. 바람직한 실시양태에서, 상기와 같은 본 발명에 따른 mRNA는 7'-메틸구아노신 캡 및/또는 폴리(A) 말단을 가진다. 따라서, 바람직한 실시양태에서, mRNA는 그의 성숙한 형태, 즉, GppG 캡, IRES 및/또는 폴리A 테일을 가진 형태로 제조된다.

특정의 RNA를 위한 변형된 우리딘 뉴클레오티드 및 시티딘 뉴클레오티드의 최적의 유형 및 함량은 통상의 실험을 통해 결정될 수 있다. 이와 관련하여, 그의 면역원성이 매우 낮기 때문에 치료받은 유기체는 스트레스를 받지 않고, 소정의 안정성을 가지며, 이에 소정의 발현 지속 시간을 가진 mRNA가 최적인 것으로 기술된다. 이러한 특성을 시험하고 측정하는 방법은 당업자에게 공지되어 있으며, 하기의 본 실시예에 기술되어 있다.

본 발명에 따른 RNA는 그 자체가 공지되어 있는 방식으로 제조될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 mRNA가 ATP, CTP, GTP 및 UTP의 혼합물로부터의 시험관내 전사에 의해 제조되고, 여기서, 5 내지 50%, 바람직하게는 5 내지 30% 및 특히 7.5 내지 25%의 시티딘 뉴클레오티드 및 5 내지 50%, 바람직하게는 5 내지 30% 및 특히 7.5 내지 25%의 우리딘 뉴클레오티드가 변형된 것이고, 그 나머지는 비변형된 것인 방법이 적합하다. 구아노신 및 아데노신 뉴클레오시드, 특히, 아데노신 또한 임의로 변형될 수 있다. 그러나, 언급한 범위에서의 UTP 및 CTP의 변형은 본 발명에 중요하다. 변형된 UTP 및/또는 변형된 CTP의 함량이 보다 낮거나, 또는 보다 높을 경우, 유리한 특성은 더 이상 달성될 수 없다. 따라서, 청구된 범위 밖의 mRNA는 더 이상 안정적인 것이 아니라는 것이 밝혀졌다. 또한, 변형의 함량이 낮을수록 면역학적 반응이 기대된다. 비변형된 뉴클레오티드 및 변형된 뉴클레오티드를 적합한 비로 설정하기 위해, 뉴클레오티드 혼합물을 사용하여 RNA를 적절히 제조하고, 그의 뉴클레오시드 함량은 원하는 비에 따라 부분적으로 변형되고, 부분적으로 비변형되며, 여기서, 본 발명에 따라 5% 이상의 우리딘 뉴클레오시드 및 5% 이상의 시티딘 뉴클레오시드는 변형된 것이지만, 각각 총 50% 이하의 우리딘 뉴클레오시드 및 시티딘 뉴클레오시드가 변형된 것이다. 추가로, 즉, 아데노신 및 구아노신이 변형될 수 있지만, 이들 뉴클레오시드에 대해 변형이 또한 상한인 50%를, 바람직하게는 20%를 초과하지도 않아야 한다. 오직 적절한 함량의 우리딘 뉴클레오시드 및 시티딘 뉴클레오시드만이 변형된 것이 바람직하다.

변형되는 뉴클레오시드는 변형을 가질 수 있고, 예를 들어, 이는 또한 예를 들어, 메틸화 또는 결합 변이와 같이 천연적으로 발생된 뉴클레오시드에서 발견될 수 있으며, "합성" 변형, 즉, 자연 상태에서는 발생되지 않는 변형을 가질 수 있거나, 또는 천연 변형 및/또는 합성 변형을 가진 뉴클레오시드의 혼합물이 사용될 수 있다. 따라서, 적어도 한 유형의 천연적으로 변형된 뉴클레오시드가 같은 유형 또는 또 다른 유형의 합성적으로 변형된 뉴클레오시드와 조합될 수 있거나, 또는 다르게는 천연적으로 및 합성적으로 변형된 뉴클레오시드가 또 다른 유형의 오직 천연적으로만, 오직 합성적으로만 또는 혼합형의 천연적으로/합성적으로 변형된 뉴클레오시드와 조합될 수 있으며, 여기서, "유형"이란 뉴클레오시드의 종류, 즉, ATP, GTP, CTP 또는 UTP를 의미하는 것이다. 다수의 경우에서, 상기 언급한 바와 같이, 면역원성 및 안정성의 개선을 위해 또는 특성을 조절하기 위해서는 결합 부위를 제공하는 관능기를 가진 변형된 뉴클레오시드를 비-작용상 변형된 뉴클레오시드와 조합하는 것이 유리할 수 있다. 가장 적합한 유형 또는 조합은 통상의 실험을 통해 당업자에 의해 쉽게 발견될 수 있다. 예를 들어, 하기에서 언급되는 것이다. 특히 바람직하게는, 2-티오우리딘 및 5-메틸시티딘이 변형된 뉴클레오시드로서 사용된다. 작용상 변형된 뉴클레오시드를 원하는 경우, 바람직하게는 2'-아지도 및 2'-아미노 뉴클레오시드가 고려시 된다.

본 발명에 따라 사용되는 mRNA의 길이는 제공하고자 하거나 보충하고자 하는 유전자 생성물, 또는 단백질 또는 단백질 단편에 따라 달라질 수 있다. 그러므로, mRNA는 매우 짧은 단쇄일 수 있고, 예를 들어, 단지 20 또는 30개의 뉴클레오티드만을 가질 수 있거나, 또는 다르게는 유전자의 길이에 상응하여 수천개의 뉴클레오티드를 가질 수도 있다. 당업자는 매번 일반적인 방식으로 적합한 서열을 선택할 수 있다.

본질적인 것은 질환을 유발하는 단백질, 질환을 완화 또는 예방하는 단백질, 또는 유익한 특성을 조절하는 단백질을 위해 mRNA가 사용되는 것인 단백질의 작용이 제공될 수 있다는 점이다.

본 발명에 따른 RNA의 제조를 위해 변형된 우리딘-함유 뉴클레오티드로서 2'-티오우리딘이 사용되는 것이 바람직하다. 추가로, 변형된 시티딘 뉴클레오티드로서 5'-메틸시티딘을 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 그러므로, 본 발명에 따른 RNA의 제조를 위해서는 ATP 및 GTP 뿐만 아니라, 각각 95 내지 50%의 비변형된 CTP 및 95 내지 50%의 비변형된 UTP 및 5 내지 50%의 2'-티오우리딘 뉴클레오티드 및 5 내지 50%의 메틸시티딘 뉴클레오티드를 함유하는 뉴클레오티드를 사용하는 것이 바람직하다. 그러므로, 5 내지 50%, 바람직하게는 5 내지 30% 및 특히 7.5 내지 25%의 우리딘 뉴클레오티드가 2'-티오우리딘 뉴클레오티드이고, 5 내지 50%, 바람직하게는 5 내지 30% 및 특히 7.5 내지 25%의 시티딘 뉴클레오티드가 5'-메틸시티딘 뉴클레오티드이며, 아데노신 및 구아노신 뉴클레오티드가 비변형된 뉴클레오티드인 것인 폴리리보뉴클레오티드가 특히 바람직하다. 상기와 같은 조합을 통해 안정성이 특히 고도로 높은 것을 특징으로 하는 부분적으로 변형된 RNA를 제조할 수 있다. CTP 및 UTP로서 각각 5 내지 50%의 2-티오우리딘 및 5-메틸시티딘 뉴클레오티드를 함유하는 뉴클레오티드 혼합물로 제조된 RNA는 특히 안정적이며, 즉, 비변형된 RNA 또는 공지된 방식으로 변형된 RNA와 비교하였을 때, 수명이 최대 10배까지 증가된 것을 알 수 있었다.

추가의 바람직한 실시양태에서, 1 내지 50%, 바람직하게는 2 내지 25%, 또는 5 내지 50%의 변형된 우리딘 또는 시티딘 뉴클레오티드가 뉴클레오티드는 변형으로서 결합 부위-생성 또는 활성화 기를 가진 뉴클레오티드이며, 즉, 0.5 내지 20%, 바람직하게는 1 내지 10%의 시티딘 뉴클레오티드 및/또는 우리딘 뉴클레오티드는 결합 부위를 생성하는 변형, 예를 들어, 아지도, NH, SH 또는 OH 기를 가질 수 있다. 상기와 같은 조합을 통해, 특히 안정적이면서도 다용도로 쓸 수 있는 RNA를 제공한다.

추가로, 비변형된 뉴클레오티드 및 변형된 뉴클레오티드로 구성된 폴리리보뉴클레오티드 분자는 7'-메틸구아노신 캡 및/또는 폴리(A) 말단을 가지는 것이 바람직하다. 추가로, RNA는 또한 추가의 서열, 예를 들어, 비-번역 영역 및 작용성 핵산을 가질 수 있으며, 예를 들어, 이는 당업자에게 주지되어 있다.

본 발명에 따른 RNA는 시험관내에서 전사된 RNA (IVT RNA)로서 제공되는 것이 바람직하다. 시험관내 전사를 수행하는 데 필요한 물질은 당업자에게 알려져 있고, 상업적으로 이용가능하며, 특히, 완충액, 효소, 뉴클레오티드 혼합물이 있다. 또한, 본 발명에 따른 RNA를 제조하는 데 사용되는 DNA의 성질은 중요하지 않다; 대체로 이는 클로닝된 DNA이다.

상기 언급한 바와 같이, 소정 함량의 변형된 우리딘 뉴클레오시드 및 변형된 시티딘 뉴클레오시드를 가진 RNA, 특히, mRNA를 제공한다. 특정 mRNA에 대해 최적인 변형된 우리딘 뉴클레오시드 및 시티딘 뉴클레오시드의 최적 함량은 당업자에게 주지되어 있는 통상의 실험에 의해 결정될 수 있다.

본 발명에 따른 RNA는 질환 치료를 위해, 또는 신체에 유익한 단백질을 제공하기 위해 사용되는 것이 바람직하다. 본 발명에 따른 RNA가 질환 치료를 위해 사용되는 경우에는, 그의 결함 또는 부족이 질환 상태를 유발할 수 있거나, 또는 그의 제공을 통해 질병이 완화될 수 있는 것인 단백질 또는 단백질 단편에 대한 시험관내 전사체를 가지는 것이 바람직하다. 본 발명에 따른 RNA의 제조를 위해서는, 그의 결함 또는 부족이 질환을 일으키거나, 또는 질병과 관련이 있는 것인 단백질 또는 단백질 단편을 코딩하는 DNA를 사용하는 것이 바람직하다. 한 실시양태에서, 그의 결함 또는 부족이 질환 또는 질병을 일으키는 것인 유전자의 DNA가 본 발명에 따른 RNA의 제조를 위해 사용된다. 또 다른 실시양태에서, 그의 존재, 아마도 일시적인 존재가 유기체에게 유익하거나 치유력이 있는 것인 단백질을 코딩하는 DNA가 본 발명에 따른 RNA의 제조를 위해 사용된다. 여기서, 신체적 및/또는 정신적/심리적 장애 또는 변화가 주관적으로 및/또는 객관적으로 존재하거나, 신체적, 정신적 또는 심리적 프로세스의 비정상적인 진행 과정으로 인해 의료가 필요하고, 작업 불능을 일으킬 수 있는 임의의 상태가 질환 또는 질병으로서 간주된다.

여기서, 그의 존재가 질병을 완화시킬 수 있거나, 신체에 유익하거나, 신체를 지지하는 단백질 또는 단백질 단편이란, 단백질 또는 단백질 단편에 유전적 결함은 존재하지 않으면서, 상기 단백질 또는 단백질 단편이 여러 종류의 장애로 인해, 또는 자연 환경으로 인해 손실된 것이기 때문에, 또는 특정 조건하에서는, 예를 들어, 결함 치료 또는 체내이식과 관련해서는 신체에 유익할 수 있기 때문에 전체적으로 또는 일시적으로 신체에 이용될 수 있는 단백질 또는 단백질 단편을 의미하는 것으로 이해된다. 이는 또한 변경된 형태의 단백질 또는 단백질 단편, 즉, 대사 진행 과정에서 변경된 형태의 단백질, 예를 들어, 성숙한 형태의 단백질 등을 포함한다. 성장 과정 및 혈관형성에서 중요한 역할을 하고, 예를 들어, 조절형 재생에 필요하며, 이어서 본 발명에 따른 mRNA의 도입에 의해 특이적으로 형성될 수 있는 단백질 또한 제공될 수 있다. 이는 예를 들어, 성장 과정에서, 골 결함, 조직 결함 치료를 위해, 및 체내이식 및 이식과 관련하여 유용할 수 있다.

삽입된 보철물의 내성장을 촉진시키기 위해 본 발명에 따라 변형된 mRNA가 유리하게 사용될 수 있다는 것이 밝혀졌다. 삽입된 보철물, 예를 들어, 치아 임플란트, 엉덩이 관내 인공삽입물, 무릎 관내 인공삽입물 또는 척추용 융합체의 표면상에서 이용가능할 경우, 본 발명에 따른 mRNA는 내성장, 새로운 혈관형성, 및 새로 삽입된 보철물에 필요한 다른 작용을 촉진시킬 수 있는 인자를 방출시킬 수 있다. 따라서, 예를 들어, 보철물 체내이식과 관련하여, 또는 그 이후에 생물학상 활성인 물질, 예를 들어, 성장 인자, 예를 들어, BMP-2 또는 혈관형성 인자를 투여하는 것이 공지되어 있다. 생물학적 물질의 반감기는 매우 자주 극도로 짧기 때문에 이전에는 초고도 용량으로 사용하여야 했는데, 이는 환자에게 심각한 부작용이라는 부담을 준다. 본 발명에 따라, 이러한 단점은 회피할 수 있는데, 그 이유는 본 발명에 따른 RNA를 사용할 경우, 원하고/거나 필요한 단백질이 선택적으로 사용될 수 있고, 적합하게 투여될 수 있기 때문이다. 이를 통해 환자에서 부작용은 감소하게 되거나, 심지어는 부작용을 완전히 면할 수 있게 된다. 이러한 실시양태에서, 원하고/거나 필요한 물질, 예를 들어, 성장 인자, 혈관형성 인자 등을 코딩하는 본 발명에 따른 RNA는 측정된 방식으로 RNA를 방출하는 코팅 중에서 임플란트 상에 적용될 수 있고, 이어서, 측정된 방식으로 그로부터 점차적으로 방출될 수 있으며, 이로써 임플란트 주변의 세포는 원하는 인자를 연속적으로 또는 간헐적으로 생산하고, 필요한 경우에는 방출할 수 있다. 대체로, 생체적합성, 합성, 천연 또는 혼합형 천연-합성 중합체인 캐리어의 방출 특성은 특이적으로 조절될 수 있고, 주지되어 있으며, 따라서 본원에서 더 상세하게 설명될 필요는 없다. 예를 들어, 폴리락티드 또는 폴리락티드/글리콜리드 중합체가 사용된다. 이러한 방식으로 선택적 방식에 따라 보다 장기간 또는 보다 단기간 동안 원하는 부위에서 원하는 인자를 연속적으로 또는 간헐적으로 원하는 인자를 방출할 수 있다.

본 발명과 관련하여, 결핍 또는 결손 유전자 또는 결핍증 또는 부족이란 발현되지 않거나, 부정확하게 발현되거나 또는 적절한 양으로 발현되지 못함으로써 그 결과 대사 장애 유발과 같이, 질환 또는 질병을 유발하는 것인 유전자를 의미하는 것으로 이해된다.

본 발명에 따른 RNA는, 천연적으로는 신체내에 존재하지만, 유전자 결함 또는 질환으로 인해 존재하지 않거나, 결핍 형태로 존재하거나, 또는 극소량으로 존재하는 것인 단백질을 신체에 제공하고자 하는 경우에는 언제든지 적절하게 사용될 수 있다. 단백질 및 그를 코딩하는 유전자, 그의 결핍증 또는 결함은 공지된 질환과 연관이 있다. 그가 부족한 경우에 본 발명에 따른 RNA가 사용될 수 있는 것인 각종의 단백질 및 유전자는 하기에 열거되어 있다:

<표 2>

결손 유전자에 기초하여 발생하는 다른 질환을 하기에서 언급한다:

따라서, 상기 표는 그 결함이 질환을 유발하며, 이러한 질환은 본 발명에 따른 RNA를 사용한 전사체 대체 요법에 의해 치료될 수 있는 것인 유전자의 일례를 제시한다. 특히, 여기서, 예를 들어, 폐가 이환되도록 하는 유전병, 예를 들어, SPB 결핍증, ABCA3 결핍증, 낭포성 섬유증 및 α1-항트립신 결핍증, 혈장 단백질이 이환되도록 하고, 응고 결함 및 보체 결함, 면역 결함을 유발하는 유전병, 예를 들어, SCID, 패혈성 육아종증 및 축적병을 언급할 수 있다. 이러한 모든 질환에서, 예를 들어, 효소와 같은 단백질은 결손되어 있고, 이는 본 발명에 따른 RNA 처리를 통해 치료될 수 있으며, 이로써 결손 유전자에 의해 코딩된 단백질 또는 그의 작용성 단편은 이용가능하게 된다.

따라서, 본 발명에 따른 RNA에 의해 코딩될 수 있는 단백질의 예로는 에리트로포이에틴 (EPO), 성장 호르몬 (소마토트로핀, hGH), 낭포성 섬유증 막투과 전도 조절인자 (CFTR), 성장 인자, 예를 들어, GM-SCF, G-CSF, MPS, 단백질 C, 헵시딘, ABCA3 및 계면활성제 단백질 B가 있다. 본 발명에 따른 RNA로 치료될 수 있는 질환에 대한 추가적인 예로는 혈우병 A/B, 파브리병, CGD, ADAMTS13, 헐러병, X 염색체-매개성 A-γ-글로불린혈증, 아데노신 데아미나제-관련 면역결핍증 및 SP-B와 연관된 신생아의 호흡 곤란 증후군이 있다. 본 발명에 따른 mRNA가 계면활성제 단백질 B (SP-B)에 대한 서열 또는 에리트로포이에틴에 대한 서열을 함유하는 것이 특히 바람직하다. 본 발명에 따라 변형된 RNA에 의해 코딩될 수 있는 단백질에 대한 추가적인 예로는 성장 인자, 예를 들어, BMP-2 또는 혈관형성 인자가 있다.

본 발명에 따른 RNA의 추가의 사용 분야는 예를 들어, 기관의 기능 상실 때문에 단백질이 신체 내에는 더 이상 없거나, 신체 내에서는 더 이상 형성되지 않는 것인 질환 또는 질병에 대해서도 존재한다. 현재, 상기와 같은 질환에서 재조합 단백질이 대체를 위해 투여된다. 이에, 본 발명에 따라, 손실 단백질의 대체가 전사체 수준으로 발생할 수 있도록 RNA가 제공된다. 이 경우 수개의 장점이 있다. 단백질이 당화를 가질 경우, 이때 전사체 수준의 대체는 인간에서 전형적인 당화가 신체에서 일어나는 효과를 가지게 된다. 재조합 단백질, 즉, 보통은 미생물에서 제조된 단백질의 경우, 대체로 당화는 대체가 일어나는 신체내 존재하는 것과는 다르다. 이 때문에 부작용이 일어날 수 있다. 일반적으로는 본 발명에 따른 RNA로부터 발현된 단백질은 구조 및 당화와 관련하여 내인성 단백질과 동일한데, 이는 대체로 재조합 단백질을 사용한 경우에는 그러하지 않다.

그의 대체 또는 도입이 바람직할 수 있는 것인 단백질의 예로는 작용성 단백질, 예를 들어, 에리트로포이에틴 및 성장 인자, 예를 들어, 소마토트로핀 (hGH), G-CSF, GM-CSF 및 트롬보포이에틴이 있다.

본 발명에 따른 RNA가 사용될 수 있는 추가 분야는 재생 의약 분야이다. 질환이 진행되는 동안 또는 노화가 진행되는 동안, 퇴행성 질환이 발생하는데, 이는 상기 질환 또는 노화의 진행으로 인해 너무 적은 양으로 생산되거나 전혀 생산되지 않는 단백질의 도입에 의해 치료되고 완화될 수 있거나, 심지어는 치유될 수 있다. 이러한 단백질을 코딩하는 관련 RNA를 도입함으로써 퇴행 과정은 중단될 수 있거나, 심지어는 재생이 개시될 수 있다. 이러한 단백질의 예로는 예를 들어, 성장 장애에서, 퇴행성 질환, 예를 들어, 예를 들어, 골다공증, 관절증에서 사용될 수 있는 조직 재생을 위한, 또는 손상된 상처 치유를 위한 성장 인자가 있다. 여기서, 본 발명에 따른 RNA는 손실 단백질이 선택적으로 및 정확한 용량으로 제공될 수 있다는 장점을 제공할 뿐만 아니라, 이는 추가로 상기 단백질을 일정 시간 구간으로 제공할 수도 있다. 따라서, 예를 들어, 손상된 상처를 치유하는 경우, 관련된 치유 인자 또는 성장 인자는 제한된 시간 동안 RNA 투여에 의해 제공될 수 있다. 추가로, 추후 설명되는 기전을 통해 RNA는 선택적으로 그의 원하는 작용 부위로 전달되도록 할 수 있다.

재생 작용을 갖도록 하기 위해 본 발명에 따른 RNA와 함께 발현될 수 있는 인자의 예로는 섬유아세포 성장 인자 (FGF), 예를 들어, FGF-1-23, 형질전환 성장 인자 (TGF), 예를 들어, TGF-α 및 TGF-β BMP (골 형태형성 단백질), 예를 들어, BMP1 내지 7, 8a & b, 10 & 15, 혈소판-유래 성장 인자 (PDGF), 예를 들어, PDGF-A, PDGF-B, PDGF-C 및 PDGF-D, 표피 성장 인자 (EGF), 과립구-대식세포 콜로니 인자 (GM-CSF), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF-A 내지 F 및 PIGF), 인슐린-유사 성장 인자, 예를 들어, IgF1 및 IgF2, 간세포 성장 인자 (HGF), 인터루킨, 예를 들어, 인터루킨-1B, IL-8 및 IL-1 내지 31, 신경 성장 인자 (NGF) 및 적혈구, 호중구, 혈관 등의 형성을 자극하는 다른 인자가 있다.

본 발명에 따른 RNA는 또한 암 질환 분야에서 선택적으로 사용될 수 있다. 특이적인 종양-관련 항원을 인식하는 T 림프구 중의 맞춤식 T 세포 수용체의 발현을 통해서 이는 보다 더 효과적일 수 있다. 원칙적으로는 mRNA가 상기 분야에서 성공적으로 사용될 수 있다는 것이 이미 밝혀져 있다. 그러나, 현재까지는 그의 사용이 상기에서 이미 기술하였던 것과 같은 면역원성 효과로 인해 이루어지지 못했다. 이에, 본 발명에 따라 제공되는, 면역원성은 더 작고 안정성은 고도로 높은 RNA를 통해 T 세포 수용체를 적절하게 발현시킬 수 있다.

본 발명에 따른 RNA는 또한 체세포가 배아 줄기 세포로 재프로그래밍될 수 있도록 하는 전사 인자를 발현시키는 데에도 사용될 수 있다. 그의 예로는 O-cp3/4, Sox2, KLF4 및 c-MYC가 있다. 따라서, 이러한 전사 인자를 코딩하는, 본 발명에 따른 안정한 RNA, 특히 mRNA는 기존에 중요하게 생각되었던 바이러스 또는 비-바이러스 벡터를 통한 유전자 전달시에 발생할 수 있는 부작용없이 줄기 세포를 생산할 수 있다.

본 발명에 따른 RNA를 사용함으로써 얻게 되는 장점은, DNA 벡터 사용과는 달리, 처리 기간이 조정가능하다는 점이다. 줄기 세포가 유도되는 경우, 대체로는 체세포가 배아 줄기 세포로 재프로그래밍될 수 있도록 하기 위해 전사 인자가 단지 일시적으로만 활성을 띠는 것이 바람직할 수 있다. 전사 인자를 코딩하는 관련 RNA의 투여를 통해 활성은 시간 경과에 따라 조절될 수 있다. 이와는 대조적으로, 기존의 공지된 방법을 사용할 경우, 투여된 유전자가 통합될 위험이 있으며, 이를 통해 합병증, 예를 들어, 종양발생이 일어날 수 있고, 추가로는 지속 기간 조절이 불가능해질 수 있다.

백신 분야에서도 본 발명에 따른 RNA는 또한 새로운 가능성을 제시한다. 백신의 표준 개발은 사멸된 또는 약화된 병원체에 따라 달라진다. 더욱 최근에는, 병원체의 단백질을 코딩하는 DNA 또한 고려되고 있다. 이러한 백신 생산은 힘든 일이며, 많은 시간이 소요된다. 종종 부작용이 발생하며, 백신화는 거절된다. 본 발명에 따른 mRNA를 통해, 병원체 또는 DNA와 관련된 문제가 없는 백신을 제공할 수 있다. 추가로, 병원체의 항원 서열을 알게 되면 바로 매우 신속하게 상기 백신을 제조할 수 있다. 이는 범유행병의 위협하에서는 특히 이롭다. 따라서, 본 발명의 한 실시양태에서, 질환 병원체의 항원부, 예를 들어, 표면 항원을 코딩하는 RNA를 제공한다. 임의로는 스페이서 섹션에 의해 연결된 수개의 에피토프 조합을 가진 아미노산 서열을 코딩하는 mRNA 또한 제공할 수 있다. 융합 단백질을 코딩하는 RNA를 통해, 또는 핵산 조합물로서 면역조절 물질의 조합물 또한 가능한다.

추가로, 본 발명에 따른 RNA는, 인자, 자극인자, 유도제 등과 같이 질환의 진행 과정에 영향을 미치는 단백질 또한 코딩할 수 있다. 예를 들어, 유전자 결함이 질환의 직접적인 원인은 아니지만, 질환 진행 과정이 mRNA 발현에 의해 긍정적인 영향을 받을 수 있다. 예로는 적혈구 형성을 자극하는 에리트로포이에틴, 호중구 형성을 위한 G-CSF 또는 GM-SCF, 새로운 혈관형성을 위한 성장 인자, "조직 공학 처리"를 위한 인자로서의 골 및 상처 치유를 위한 성장 인자, 아포프토시스 유도에 의한 또는 단백질성 세포 독, 예를 들어, 디프테리아 독소 A의 형성에 의한, 다능성 줄기 세포 (iPS) 유도에 의한 종양 치료를 위한 성장 인자 등이 있다.

오직 소정 함량의 변형된 뉴클레오티드 및 비변형된 뉴클레오티드를 가진, 본 발명에 따른 폴리리보뉴클레오티드만이 낮은 면역원성을 가지며, 동시에 높은 안정성도 가지는 것으로 밝혀졌다. 특정 폴리리보뉴클레오티드를 위한 변형된 뉴클레오티드와 비변형된 뉴클레오티드의 최적의 조합을 결정할 수 있도록 하기 위해, 면역원성 및 안정성은 그 자체가 공지되어 있는 방식으로 측정될 수 있다. RNA의 면역원성을 측정하기 위해서는 당업자에게 주지되어 있는 각종 방법이 사용될 수 있다. 매우 적합한 방법은 RNA 투여에 대한 반응으로서 나타나는 세포 중의 염증성 마커를 측정하는 것이다. 상기 방법은 실시예에 기술되어 있다. 보통은 염증과 관련이 있는 시토카인, 예를 들어, TNF-α, IFN-α, IFN-β, IL-8, IL-6, IL-12 또는 당업자에게 공지되어 있는 다른 시토카인을 측정한다. DC 활성화 마커의 발현 또한 면역원성을 예측하는 데 사용될 수 있다. 면역학적 반응에 대한 추가의 지표는 Toll-유사 수용체 TLR-3, TLR-7 및 TLR-8에의 결합 및 헬리카제 RIG-1에의 결합 검출이다.

대체로 면역원성은 대조군과 관련하여 상대적인 값으로 측정된다. 보편적인 방법으로, 본 발명에 따른 RNA를, 또는 비변형된 또는 변형된 RNA를 또 다른 방식으로 세포에 투여하고, RNA 투여에 대한 반응으로서 나타나는 염증성 마커의 분비를 정의된 시간 간격을 두고 측정한다. 비교를 위해 사용되는 표준으로서 비변형된 RNA가 사용될 수 있는데, 이러한 경우, 면역 반응은 더 낮아야 하고, 또는 면역 반응을 거의 일으키지 않거나, 전혀 일으키지 않는 것으로 알려져 있는 RNA도 사용될 수 있는데, 이러한 경우, 본 발명에 따른 RNA에 대해 나타나는 염증 반응은 같은 범위 내에 함유되어 있고, 상승되지 않은 상태여야 한다. 본 발명에 따른 RNA를 사용할 경우, 비변형된 RNA와 비교하여 면역 반응을 적어도 30% 만큼, 대체로는 적어도 50% 또는 심지어는 75% 만큼 반응을 저하시키거나, 또는 심지어는 면역 반응이 일어나지 못하도록 완전하게 막을 수 있다.

면역원성은 상기 언급한 인자의 측정에 의해, 특히, TNF-α 및 IL-8 수준 측정, 및 TLR-3, TLR-7, TLR-8 및 헬리카제 RIG-1에의 결합능 측정에 의해 측정할 수 있다. 상기 측정에 의해서 mRNA가 원하는 바와 같이 낮은 면역원성을 가지는지 여부를 확립하기 위해서, 관심이 가는 폴리리보뉴클레오티드를 투여한 후 상기 언급된 인자 중 하나 이상의 양을 측정할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 일정량의 시험하고자 하는 mRNA를 꼬리 정맥 또는 i.p.를 통해 마우스에 투여한 후, 사전 정의된 기간이 경과한 후, 예를 들어, 7 또는 14일 경과 후, 상기 언급된 인자 중 하나 이상을 측정할 수 있다. 이어서, 인자의 양을 비처리 동물의 혈중에 존재하는 인자의 양과 관련시켜 나타낸다. 면역원성의 측정을 위해, TLR-3, TLR-7, TLR-8 및 헬리카제 RIG-1에의 결합능을 측정하는 것이 가치가 매우 큰 것으로 나타났다. TNF-α 수준 및 IL-8 수준 또한 매우 우수한 지표를 제공한다. 본 발명에 따른 mRNA를 사용할 경우, 비변형된 RNA와 비교하여 TLR-3, TLR-7, TLR-8 및 RIG-1에의 결합능을 적어도 50% 만큼 저하시킬 수 있다. 대체로는 상기 인자에의 결합을 적어도 75% 만큼, 또는 심지어 80% 만큼 저하시킬 수 있다. 바람직한 실시양태에서, TLR-3, TLR-7, TLR-8 및 RIG-1에의 결합능은 본 발명에 따른 mRNA 및 어떤 mRNA도 투여받지 않은 동물에서 같은 범위 내에 함유되어 있다. 다시 말해, 본 발명에 따른 mRNA는 실제로 어떤 염증성 또는 면역학적 반응도 일으키지 않는다.

모든 경우에서, 본 발명에 따른 RNA는 환자의 일반적인 상태에는 어떤 영향도 미치지 않는 낮은 면역원성을 가진다. 따라서, 상기 언급된 인자의 미세한 증가로도 결과적으로는 일반적인 상태가 악화되지 않는 한, 상기와 같은 미세한 증가는 허용될 수 있다. 본 발명에 따른 mRNA의 추가적인 특성은 그의 효율과 안정성이다. 이를 위해, 전사율, 형질감염률, 번역률 및 단백질 발현 지속 기간이 중요하며, 이는 그 자체가 공지되어 있는 방법에 의해 측정될 수 있다.

전사율은 RNA가 DNA로부터 얼마나 효율적으로 생산될 수 있는지를 시사한다. 여기서, 변형된 뉴클레오티드를 고함량으로 사용할 경우에 문제가 발생할 수 있다. 전사율이 높은 본 발명에 따라 변형된 RNA를 생산할 수 있다.

RNA에 의해 안정적이며 적절하게 발현된 단백질을 수득하기 위해서는 충분한 RNA가 원하는 세포에 도달하는 것이 중요하다. 이는 표지된 RNA를 투여한 후, 표지 측정을 통해 세포에 도달한 RNA의 함량을 측정함으로써 측정이 가능하다. 표지 측정을 위해서는 유동 세포측정법을 사용할 수 있다. 형광 분자를 사용하여 표지한 경우에는 예를 들어, 오직 PBS만으로 처리된 대조군 세포와 비교하였을 때 형광 강도가 더 높은 세포 군집의 비율(%)로서 형질감염률을 계산할 수 있다. 적어도 두 유형의 뉴클레오티드가 변형된 뉴클레오티드에 의해 100% 대체된 RNA와 달리 본 발명에 따라 변형된 RNA는 효율적으로 생산될 수 있고, 단지 뉴클레오티드의 일부만이 변형된 것인 본 발명에 따른 RNA의 형질감염률은 어느 하나의 뉴클레오티드 유형이 100% 변형된 RNA보다 훨씬 더 높은 것으로 밝혀졌다.

번역률은 RNA가 얼마나 효율적으로 단백질로 번역되는지를 나타낸다. 번역률이 높을수록, 치료를 위해 사용되어야 하는 RNA의 투여량은 더 낮아질 수 있다. 번역률은 본 발명에 따라 변형된 RNA에 대한 번역 비율과 비변형된 RNA에 대한 번역 비율을 비교함으로써 측정될 수 있다. 대체로, 본 발명에 따라 변형된 RNA를 사용할 경우의 번역률은 비변형된 RNA의 경우보다 다소 더 낮다. 그러나, 이는 단백질 발현이 지속되는 기간으로 보여지는 바, 보다 더 높은 안정성을 통해 훨씬 더 많이 보상된다.

본 발명에 따른 RNA는 특히 높은 안정성을 제공하는 데, 이를 통해 단백질 발현은 장기간 동안 연속적으로 진행될 수 있다. 특히, 본 발명에 따라 변형된 RNA를 유전자 결함으로 인한 질환 치료에 사용하고자 하는 경우, 세포에 남아 있는 시간이 길수록, 그 가치는 더욱 커지게 된다. RNA가 더 빠르게 분해될수록, 단백질 발현은 더 빠르게 종결되며, 더 자주 RNA를 투여하여야 한다. 반대로, 장기간 동안 세포에 남아 있는 안정한 RNA의 경우, 투약 빈도는 현저하게 감소할 수 있다. 본 발명에 따라 변형된 RNA는 최대 4주 동안 안정적으로 발현될 수 있는 것으로 밝혀졌다.

다른 실시양태의 경우, 즉, RNA가 일시적으로만 발현되기를 원하는 경우에는 안정성에 영향을 줌으로써 단백질 발현 지속 기간을 조절할 수 있다.

따라서, 본 발명에 따른 RNA의 가치가 큰 추가의 특성은 안정성을 통해 작용 지속 기간이 선택적으로 조절될 수 있고, 이로써 단백질 발현 지속 기간은 단백질이 원하는 시간 구간에 발현될 수 있도록 맞춤화될 수 있다는 점이다. 두번째로는, 필요한 경우에는 매우 장기간 동안 RNA가 사용될 수 있다는 점이다. 본 발명에 따라 변형된 RNA, 그의 발현 최대 4주까지 지속될 수 있으며, 따라서, 여기서, RNA는 단지 매 4주마다 제공되어야 하기 때문에 만성 질환의 치료에 이상적으로 적합화될 수 있다. RNA가, 질환의 완화 또는 예방을 위해 장기간 동안에 걸쳐 체내 공급되는 인자를 코딩하는 실시양태의 경우, 예를 들어, 에리트로포이에틴을 코딩하는 RNA를 사용하는 경우 높은 안정성과 장기간 지속되는 단백질 발현 또한 유리하다. 본 발명에 따른 RNA는 또한 특히 혈우병을 치료하는 데 특히 유리하게 사용될 수 있다. 여기서, 종래에는 손실 인자를 매주 투여하여야 했다. 본 발명에 따른 RNA를 제공함으로써 투여 빈도는 감소될 수 있고, 이로써 상기 인자를 코딩하는 RNA는 단지 매 2주마다, 또는 심지어는 매 4주마다 투여되어야 한다.

본 발명에 따른 mRNA의 안정성은 그 자체가 공지되어 있는 방법에 의해 측정될 수 있다. 비변형된 RNA 또는 전체적으로 변형된 RNA를 함유하는 세포와의 비교로, 예를 들어, 비변형된 RNA 또는 공지의 방식으로 변형된 RNA를 함유하는 세포와의 비교로 본 발명에 따라 변형된 RNA를 함유하는 세포의 생존가능성을 측정하는 방법이 특히 적합하다. 시간 경과에 따른 코딩된 단백질의 생산 또한 모니터링할 수 있다. 여기서, RNA의 안정성이란, RNA가 세포 내로 도입되었을 때, 원하는 단백질을 발현할 수 있거나, 그러한 단백질 또는 그의 작용성 단편으로 번역될 수 있는 RNA가 즉시 발현되지 않고, 불활성화되지도 않으면서, 장기간 동안에 걸쳐 발현할 수 있다는 것을 의미하는 것으로 이해된다.

따라서, 세포에서 RNA의 안정성 및 생존 시간을 시험하는 방법은 RNA에 의해 코딩되는 단백질이 세포에서 얼마나 오랫동안 검출될 수 있는지 또는 얼마나 오랫동안 그의 작용을 수행할 수 있는지를 측정하는 것으로 구성된다. 이러한 방법은 본 실시예에 기술되어 있다. 따라서, 예를 들어, 임의로 원하는 단백질을 코딩하는 RNA와 함께 리포터 분자를 코딩하는 서열을 함유하는 mRNA를 세포 내로 도입할 수 있고, 사전 정의된 기간이 경과한 후, 이어서, 리포터 분자 및 임의로 단백질의 존재에 대해 측정한다. 적합한 리포터 분자는 당업계의 최신 동향에 주지되어 있고, 통상적으로 사용되는 리포터 분자를 본원에서도 사용할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, RFP라는 적색 형광 단백질이 리포터 분자가 사용된다.

상기 언급한 바와 같이, 본 발명에 따른 RNA는 천연적으로는 원하는 정도로 발현되지 않거나, 또는 전혀 발현되지 않는 단백질이, RNA가 그 안으로 도입된 세포에서는 형성될 수 있도록 하는 요법을 위해 사용될 수 있다. 여기서, 본 발명에 따른 RNA는 단백질이 유전자 결핍증에 기인하여 형성되지 못하는 경우에, 및 질환으로 인해 단백질이 형성되지 못하는 경우 또는 단백질 도입이 그러한 신체에 대해서 유리한 경우와 같은 두 경우 모두에서 사용될 수 있다. 또한 RNA는 적절한 정도로 발현되지 못한 단백질을 보충하는 데에도 사용될 수 있다. 각각의 경우에 사용되는 용량은 RNA가 이행하는 작용에 따라 달라질 것이다. 상기 언급한 바와 같이, 본 발명에 따른 RNA의 작용 지속 기간은 의도적으로 조정될 수 있다. 치료 기간은 특정 징후에 따라 달라질 수 있다. 결핍 유전자에 기인한 질환의 만성 요법을 위해 RNA가 사용되는 경우, 작용 지속 기간은 가능한 장기간 동안 지속될 것이고, 반면에 다른 징후에 대해서는 시간 구간에 맞게 의도적으로 조정될 수 있다.

특히 바람직한 실시양태에 따라, 계면활성제 단백질 B를 코딩하는 IVT mRNA가 RNA로서 사용된다. 포유동물에서 상기 단백질이 결핍된 경우, 미숙아 및 신생아의 호흡 곤란 증후군이 발생하게 된다. 신생아의 상기 증후군은 대개 폐 질환으로 인해 사망으로 이어진다. 5 내지 50%의 우리딘 뉴클레오시드 및 5 내지 50%의 시티딘 뉴클레오시드가 변형된 것으로서, SP-B를 코딩하는 다중 변형된 시험관내에서 전사된 mRNA를 사용하면 상기 단백질이 형성되고, 질환은 완화되거나 치유된다.

추가의 바람직한 실시양태에 따라, 에리트로포이에틴을 코딩하는 IVT mRNA가 RNA로서 사용된다. 에리트로포이에틴은 예를 들어, 신장 질환에서는 더이상 적절한 양으로 이용할 수 없고, 따라서, 공급되어야 하는 신체에 매우 중요한 단백질이다. 미생물 또는 동물 세포에서 생산되고, 이에 당화가 천연적으로 일어나지 않은 재조합 에리트로포이에틴이 현재 이를 위해 사용되고 있다. 재조합 EPO를 사용할 경우, 드물게는 중증 부작용, 예를 들어, 적혈구 무형성이 발생하였다.

본 발명에 따라 제공하는 IVT mRNA는 5 내지 50%의 우리딘 뉴클레오티드 및 5 내지 50%의 시티딘 뉴클레오티드가 변형된, 에리트로포이에틴 코딩 리보핵산을 함유한다. 특히 바람직한 실시양태에서, 15 내지 25%의 우리딘 뉴클레오티드 및 15 내지 25%의 시티딘 뉴클레오티드가 변형된, EPO-코딩 mRNA를 제공한다. 상기 mRNA는 비변형된 RNA와 비교하였을 때 현저히 감소된 면역원성을 가지는 것으로 밝혀졌다. 동시에, 이는 90% 초과의 형질감염률 및 안정성을 보였으며, 이로써 헤마토크릿 값은 14일 후에도 여전히 상승된 상태로 남아 있었다. 체내에서 본 발명에 따른 RNA에 의해 생산된 EPO은 정확하게 당화되는 바, 부작용이 발생할 것으로 예측되지는 않는다. 본 발명에 따라 변형된 EPO-코딩 RNA의 표적화된 간헐적 투여를 통해 헤마토크릿 값은 장기간 동안 원하는 수준 그대로 유지될 수 있다.

본 발명에 따라, 포유동물의 생체내에서 이용가능하고, 천연적으로 존재하는 내인성 단백질과 일치하지 않을 경우에는 매우 유사한, 특히 내인성 당화를 가진 형태로 필요한 단백질을 제공하는 비-면역원의 안정한 RNA를 제공한다.

본 발명에 따른 mRNA 그 자체가 직접 사용될 수 있다. 그러나, 추가의 유익한 특성을 도입하기 위해 mRNA를 추가로 변형시킬 수도 있다. 첫번째로, 다른 코딩 또는 비-코딩 서열을 코딩 스트랜드에 부착시켜 mRNA를 변형시킬 수 있다. 두번째로, 추가 분자를, 변형된 뉴클레오티드에서 제공받은 관능기에 결합시켜 변형시킬 수 있다.

한 실시양태에서, 본 발명에 따른 mRNA는 표적 세포에 특이적인 표면 수용체에 결합하는 표적화 리간드와 조합됨으로써 표적 세포의 수용체-매개 형질감염도 일어날 수 있다. 이를 위해 먼저 mRNA를 세포 내로 도입하는 데 적합한 비히클, 또는 다르게는 mRNA 그 자체를 리간드로 변형시킬 수 있다. mRNA를 세포 내로 도입하는 데 적합한 비히클의 예로는 양이온제가 있다. 이는 양이온성 지질, 양이온성 중합체 또는 나노입자, 나노캡슐, 자기 나노입자 및 나노에멀젼을 포함한다. 적합한 비히클은 당업자에게 공지되어 있으며, 전문가의 문헌에 기술되어 있다. 적합한 리간드 또한 당업자에게 주지되어 있고, 문헌에 기술되어 있으며, 이용가능하다. 리간드, 예를 들어, 트랜스페린, 락토페린, 클렌부테롤, 당, 유론산, 항체, 압타머 등이 사용될 수 있다.

그러나, mRNA 그 자체도 리간드로 변형될 수 있다. 이러한 경우, 리보스의 2' 위치에 1차 아미노기 또는 아지도기를 보유하는, 변형된 뉴클레오시드를 함유하는 mRNA가 바람직하다. 일례들은 상기 표에서 살펴볼 수 있다. 그러한 변형이 생물학적 활성에 기여하기 때문에 특히 바람직하다. 이러한 변형을 통해 리간드는 아미드 형성 또는 "클릭" 화학에 의해, 예를 들어, 생체접합 기법에 의해 쉽게 혼입될 수 있다.

추가의 실시양태에서, 단백질, 예를 들어, 수용체 (압타머)에 결합하는 RNA 서열은 mRNA의 5' 말단에 도입된다. 이러한 방법은 리간드가 이미 DNA 수준으로 매트릭스 내로 직접 도입되어 있을 수 있으며, IVT에 의해 클로닝되고 mRNA 내로 도입될 수 있다는 이점을 가지고 있다. 이에, mRNA를 리간드로 변형시키는 후속 작업은 더 이상 필요없다.

추가의 실시양태에서, mRNA는 불활성 중합체, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)에 의한 추가의 변형을 통해 변형된다. 이러한 방법은 당업자에게 주지되어 있고, 예를 들어, 리간드에 대해서 공지된 공정도 사용될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 전사 후에 PEG가 결합하는, 폴리에틸렌 글리콜에 대한 결합 부위는 본 발명에 따른 mRNA에 사용되는 변형된 뉴클레오티드 중 작은 부분으로 제공될 수 있다. 폴리에틸렌 글리콜은 mRNA의 세포외 안정화를 위해 중요한 역할을 하며, 즉, 폴리리보뉴클레오티드 분자가 세포에 도달할 때까지 이를 보호한다. 세포 내로 진입할 때, PEG는 절단된다. 따라서, PEG와 RNA 사이의 결합은 세포 내로의 진입시 일어나는 절단이 쉽게 진행될 수 있도록 디자인된 것이 바람직하다. 이를 위해, 예를 들어, pH에 의존하는 방식으로 절단되는 관능기를 제공할 수 있다. 변형된 뉴클레오티드 상의 적절한 활성 부위를 통해 RNA를 안정화시키는 다른 분자 또한 제공할 수 있다. 이러한 경우, 효소 분해로부터 입체적 안정화, 및 생체 유체 성분과의 상호작용의 방해를 통해 mRNA를 보호할 수 있다. 상기와 같은 변형을 통해 mRNA는 "스텔스(stealth)" mRNA로서 지정될 수 있다.

RNA의 보호 및 안정화를 위해 바람직한 방법은 EP 11 98 489에 기술되어 있고, 상기 내용이 본원에서 명백하게 참조된다. 본 발명에 따른 RNA는 바람직하게는 EP 11 98 489에 기술된 방법에 의해 보호된다. 첫번째로는 발명에 따라 변형된 RNA가 상기 방법에 의해 유리하게 안정화되고 보호될 수 있으며, 두번째로는 그렇게 처리된 본 발명에 따른 RNA의 활성은 제한을 받지 않거나, 또는 유의적인 제한을 받지 않음이 밝혀져 있다. 따라서, 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따라 변형된 RNA는 EP 11 98 489에 따라 처리된다.

세포-특이 조절의 예로는 조혈 세포에서는 발현되지만, 다른 기관의 세포에서는 발현되지 않는 마이크로-RNA 142-3p에 대한 마이크로-RNA 결합 부위를 혼입시키는 것이다. 그 결과, 다른 세포와 비교하여 조혈 세포에서의 mRNA 번역은 현저히 감소될 수 있도록 발현은 조절된다. 유사하게, 다른 세포 유형에서의 발현은 관련된 적합한 마이크로-RNA 결합 부위의 혼입에 의해 선택적으로 조절될 수 있으며, 이는 당업자에게 주지되어 있다.

추가의 실시양태에서, 본 발명에 따른 mRNA는 질환에 의해 이환된 세포에서 존재하지 않고, 오직 건강한 세포에만 존재하는 1개 이상의 마이크로-RNA에 대한 표적 또는 결합 부위와 조합된다. 그 결과, mRNA에 의해 코딩되는 단백질은 오직 단백질을 필요로 하는 세포에서만 생산된다. 적합한 표적을 선택하는 것은 당업자에게 주지된 통상의 방법을 통해 이루어진다. DNA 수준에서 수행될 수 있는 통상의 방법으로는 마이크로-RNA 결합 부위를 3'UTR로 클로닝하는 것이 있다 (문헌 ([Gu et al, Nat Struct Mol Biol. 2009 Feb; 16(2): 144-50], [Brown et al, Nat Biotechnol. 2007 Dec; 25(12): 1457-67], [Brown et al, Nat Med. 2006 May; 12(5): 585-91], WO 2007000668)). 바람직한 실시양태에서, 마이크로-RNA에 대한 결합 부위가 장착된 RNA는 RNA가 세포독소를 코딩할 때에 사용된다. 이러한 경우에는 오직 그의 작용을 효율적으로 사용하고자 하는 경우에만 단백질이 세포에 대해 독성을 띠도록 하는 것이 특히 바람직할 수 있다. 이러한 실시양태를 위해서는 또한 RNA를 특이적으로 변형시켜 그의 안정성이 사전 정의된 시간 구간 내에 함유되도록 함으로써 RNA의 작용 지속 기간을 조절하는 것 또한 유리할 수 있다.

추가로, 본 발명에 따른 RNA는 3' 폴리A 테일 하류의 마이크로-RNA 또는 shRNA와 조합될 수 있다. 이는 mRNA-마이크로-RNA/shRNA 하이브리드가 다이서(Dicer)에 의해 세포내에서 절단될 수 있고, 이로써 상이한 병원성 캐스케이드에 개입하는 2개의 활성 분자가 유리될 수 있도록 한다는 장점을 가지고 있다. 상기와 같은 하이브리드는 질환, 예를 들어, 암 또는 천식 치료를 위해 제공될 수 있다. 그러므로, 본 발명에 따른 RNA는 결핍 mRNA를 보충하면서, 동시에 결손 마이크로-RNA 캐스케이드에 개입하는 데 적합하다.

따라서, 본 발명에 따라, 리포터 단백질, 예를 들어, 적색 형광 단백질 (RFP)을 코딩하는 서열이 사용되는 스크리닝 방법으로 시험될 수 있는 유익한 특성을 가진 RNA가 제공된다. 그의 면역원성 및 형질감염률을 위해 비변형된 뉴클레오티드, 단일 변형된 뉴클레오티드 또는 상이한 변형을 가진 다중 뉴클레오티드를 함유하는 리포터 유전자 서열의 독성 및 안정성을 시험하였을 때, 오직 우리딘 뉴클레오시드 및 시티딘 뉴클레오시드 각각 5% 이상이 변형된 뉴클레오시드에 의해 대체된 본 발명에 따른 mRNA만이, 즉, 다중 변형된 mRNA만이 혈중 인간의 1차 단핵구에 대한 면역원성을 현저하게 감소시켰고, 동시에 80% 초과의 높은 형질감염률을 얻을 수 있는 것으로 나타났다. 이는 예를 들어, 인간 또는 마우스에서 II형 폐포 상피 세포에서 시험될 수 있다. 또한, 본 발명에 따라 변형된 RNA에 대한 RNA 발현 지속 기간은 공지의 RNA에 대한 것보다 현저하게 더 길다. 대개는 본 발명에 따라 다중 변형된 mRNA의 안정성이 보다 더 높고, 면역원성이 보다 낮은 것에 기인하여 발현이 공지의 제제보다 더 장기간 동안 지속될 수 있다는 것이 밝혀졌다. 정량적 평가에서, 본 발명에 따라 변형된 유도체는 형질감염 후 10일 경과한 후에도 발현 생성물의 양이 비변형된 RNA 또는 단지 단일 변형된 RNA보다 10배 더 높은 것으로 나타났다.

본 발명의 추가의 대상은, mRNA 서열을 TLR3, TLR3, TLR8 및 헬리카제 RIG-1로부터 선택되는 1개 이상의 수용체와 접촉시키고, 결합능을 측정하여 대조군 서열과 비교하는 것인, 면역원성 및 발현의 질을 시험하기 위해 뉴클레오티드 서열을 스크리닝하는 방법이다. 대조군 서열로서는 그의 결합능이 공지되어 있는 것인 서열이 사용된다. 상기 수용체들 중 1개 이상에의 결합이 약할수록 서열은 더욱더 유망한 서열이 된다.

본 발명에 따른 mRNA, 특히, IVT mRNA의 특성은 리포터 단백질을 발현하는 RNA에 대해 수행되는 스크리닝 방법으로 시험될 수 있다. 리포터 단백질로서 적색 형광 단백질 (RFP)이 바람직하다. 상이한 변형을 가진 뉴클레오티드를 함유하는, 상기 단백질 코딩 서열은 그의 면역원성 및 형질감염률에 대해 시험될 수 있다. 따라서, 시험을 위해 mRNA의 각종 변형을 사용할 수 있고, 예를 들어, 우리딘 뉴클레오시드를 2-티오우리딘 뉴클레오시드 (이는 또한 하기에서는 s2U로 언급된다)에 의해 부분적으로 대체할 수 있고, 시티딘 뉴클레오시드를 5-메틸시티딘 뉴클레오시드 (이는 또한 하기에서는 m5C로 언급된다)에 의해 부분적으로 대체할 수 있다.

도 1a, 1b, 1c, 2a 및 2b는 상기 스크리닝 방법을 수행하였을 때 수득한 결과를 나타낸 것이다. 본 실시예에서 보다 더 상세한 설명이 있을 것이다. 상기 도면에 제시되어 있는 결과는 RFP RNA에 대해 수행된 실험에 기초한 것이며, 이는 단지 각각 5% 이상의 우리딘 뉴클레오시드 및 5% 이상의 시티딘 뉴클레오시드가 변형된 다중 변형된 mRNA만이 생체외 및 생체내 둘 모두에서 혈중 인간 1차 단핵구에 대한 면역원성을 현저하게 감소시켰고, 동시에 인간 뿐만 아니라, 마우스의 II형 폐포 상피 세포에서도, 이 둘 모두에서 80% 초과의 높은 형질감염률을 얻었다는 것을 나타낸다. 또한, 본 발명에 따라 변형된 mRNA의 발현 지속 기간은 비변형된 mRNA에 대한 것보다 유의적으로 더 길다.

추가의 실시양태에서, mRNA 면역침전 시험 (RIP)을 사용함으로써 고려 중에 있는 RNA가 요법에 적합한지 여부에 대해 시험하는 방법을 제공한다. 적합한 RIP 시험은 본 실시예에서 보다 상세하게 기술한다. 면역계의 세포는 Toll-유사 수용체 (TLR) 3, TLR7, TLR8 및 헬리카제 RIG-1에의 RNA 결합을 통해 비변형된 리포터 mRNA에 의해 활성화된다는 것이 연구를 통해 밝혀졌다. 비변형된 mRNA와 비교하여 시험된 mRNA의 TLR3, TLR7, TLR8 및/또는 RIG-1에의 결합이 현저하게 감소하였다는 결과가 나왔다면, 이는 면역원성이 감소하였음을 시사하는 것이다. 이와 관련하여 본 발명에 따라 사용된 다중 변형은 단일 s2U 변형보다 유의적으로 더 효과적인 것을 알 수 있다. 본 실시예에서는 RNA를 마우스에 정맥내로 주사한 후, RNA가 IFN-γ, IL-12 및 IFN-α 수준에 미치는 영향을 연구하였다. 다중 변형된 s2U_(0.25)m5C_(0.25) RFP mRNA가 면역 반응을 방해한 것으로 나타났다. 함께 본 실시예에서 얻은 결과를 통해 다중 변형된 mRNA는 TLR 및 RIG-1 결합을 유의적으로 감소시키고, 이로써 면역 반응을 저하시키며, 동시에 발현을 상승시키고 장기화시키는 것으로 나타났다. 따라서, 다중 변형된 RNA, 특히, IVT mRNA는 결핍 유전자에 기인한 질환의 생체내 치료를 위한 적합한 후보 물질이다. 특히 유망한 후보 물질에 대해서는 하기에서 간단하게 설명할 것이며, 본 실시예에서 보다 상세하게 기술될 것이다.

폐 치료를 위해 본 발명에 따라 변형된 RNA가 사용될 수 있는지 여부를 시험하기 위해, 증강된 녹색 형광 단백질 및 루시퍼라제로 이루어진 융합 단백질 (EGFPLuc)을 코딩하는 다중 변형된 mRNA를 마우스의 폐 내로 직접 도입하고, 비변형된 EGFPLuc RNA와의 비교로 루시퍼라제가 발현되는지 여부를 시험하였다. 비록 전체 발광 플럭스는 처리 24시간 후에는 매우 신속하게, 처리 후 5일까지 매우 낮은 비율로 감소하였지만, 폐에서 루시퍼라제 발현이 3시간 후에 최대치에 도달하였다. 이와는 대조적으로, 다중 변형된 EGFPLuc mRNA로 처리된 마우스에서는 처리 후 최대 5일까지 높은 발현 값이 관찰되었다.

특히 바람직한 실시양태에서, SP-B 결핍증으로 인한 질환을 치료할 수 있는 치료학적 잠재능을 가진 RNA, 즉, s2U_(0.25)m5C_(0.25) SP-B mRNA를 제공한다. SP-B는 단일 유전자에 의해 코딩되고, 폐포를 덮고 있는 II형 폐포 상피 세포에서 단백질분해성 프로세싱을 통해 381개의 아미노산을 가진 전구체를 생성하는 상대적으로 작은 양쪽성 펩티드이다. 이는 폐포에서 표면 장력을 감소시키는 데 필요한 계면활성제 지질의 분포, 흡착성, 및 안정성을 개선시킨다. SP-B 결핍증이 있는 경우, 예를 들어, 폐포벽의 비후, 세포 침윤 및 간질성 부종과 같은 증상이 발생한다. 이러한 폐 손상은 울혈을 동반하며, 즉, 기관지 폐포 세척액 중 적혈구 개수의 증가, 대식세포, 호중구 및 상응하는 비율로 염증성 시토카인의 개수 증가를 동반한다. 인간에서의 울혈성 결핍증, 및 트랜스제닉 마우스에서의 연구를 통해 SP-B는 생후 생존에서 필수적인 역할을 한다는 것이 입증되었다. SP-B 유전자의 돌연변이를 통해 발생하는 것인 울혈성 SP-B 결핍증은 계면활성제의 대체에 중요하며, 이는 생후 처음 1개월 동안 신생아의 치명적인 기도 기능 상실을 일으킨다. 따라서, 폐 이식이 현재 유일하게 이용가능한 치료적 개입법이다. 그러므로, 본 발명에 따른 RNA의 사용으로 가능해진 SP-B 결핍증에 대한 mRNA 요법은 중요한 대체 치료법이다.

바람직하게는 퍼플루오로카본을 비히클로서 사용하면서 상기 질환 치료를 위해 본 발명에 따른 RNA를 사용할 수 있다. 그러므로, 바람직한 실시양태에서, 퍼플루오로카본 및 s2U_(0.25)m5C_(0.25) SP-B mRNA를 포함하는 제약 제제를 제공한다. 이러한 조합물은 SP-B 결핍증을 앓는 환자의 폐에서 SP-B를 재구성할 수 있고, 이로써 생존 기회는 증가하게 된다. 본 발명에 따른 RNA의 안정성은 높기 때문에, 이를 위해서는 일정한 간격을 두고, 예를 들어 주 1 내지 3회에 걸쳐 투여하는 것이면 충분하다. 바람직하게는, SP-B mRNA는 이를 위해 에어로졸로서 고압 분무에 의해 기관내로 투여된다. 본 발명에 따른 mRNA는 상기 기술된 증상들을 호전시킬 수 있고, 이로써 본 실시예에서 상세하게 기술되는 것과 같은 폐 파라미터에 대한 시험을 통해 입증될 수 있는, 폐 기능을 개선시킬 수 있다는 것이 밝혀졌다.

본 발명에 따른 mRNA는 치료 방법에서 효과적으로 사용될 수 있고, 손실 또는 결손 단백질에 기인한 질환이 치료될 수 있도록 한다. 다중 변형된 mRNA를 전신 투여할 수 있다. 원치않는 부작용이 발생할 수 있는 바, 유전자 결함에 의해서는 어떤 영향도 받지 않은 세포에서의 mRNA 번역이 비바람직한 경우도 있을 수 있다. 코딩된 단백질을 필요로 하는 세포, 예를 들어, 유전자 결함이 존재하는 세포에서만 유일하게 mRNA가 선택적으로 번역될 수 있도록 하기 위해, 예를 들어, 리간드를 통해 이환 조직이 어드레싱될 수 있도록 하는 서열로 상응하는 벡터를 보충할 수 있다. 추가의 실시양태에서, 표적 세포에서는 발현되지 않는 내인성 마이크로-RNA가 그에 결합하는 것인 서열을 mRNA를 함유하는 벡터에 첨가할 수 있고, 이로써 관련 내인성 마이크로-RNA을 함유하는 모든 세포에서는 mRNA가 분해되지만, 표적 세포에서는 유지된다. 따라서, 부작용은 최소화될 수 있다.

예를 들어, 결핍 유전자에 기인하여 질환을 앓고 있기 때문에 RNA에 의해 코딩되는 단백질 또는 단백질 단편을 필요로 하는 환자에게 자체 공지된 방식으로 본 발명에 따른 RNA를 투여할 수 있다. 이를 위해, RNA를 일반 제약상 허용되는 첨가제와 함께 제약 제제로서 제제화할 수 있다. 제제의 형태는 투여 위치 및 성질에 따라 달라질 수 있다. 본 발명에 따른 RNA는 특히 고도한 안정성을 특징으로 하는 바, 사용되는 위치 및 그의 형태에 따라 다르게 여러 방식으로 제제화될 수 있다. 본 발명에 따른 RNA는 매우 안정적인 바, 이로써 냉동 건조될 수 있고, 상기 형태로 프로세싱될 수 있으며, 예를 들어, 으깨지거나 제분될 수 있고, 보관될 수 있으며, 이어서, 필요시에는 재구성될 수 있고, 그의 생물학적 활성을 보유하는 것으로 밝혀졌다.

RNA가 전신 투여된 경우, 보통은 일반 첨가제, 예를 들어, 긴장성 조정제 및 안정화제와 함께 주사용액으로서, 바람직하게는 단위 투여 형태로 제제화된다. 안정화제로는 일반적으로 알려져 있는 것, 예를 들어, 지질, 중합체 및 나노시스템 또는 리포솜이 사용된다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따라 변형된 EPO 코딩 RNA를 함유하는, 비경구 투여에 적합한 조성물을 제공한다.

바람직한 실시양태에서, 특히 RNA가 SP-B 단백질을 코딩할 경우, 본 발명에 따른 RNA는 예를 들어, 흡입에 의한 것과 같이 폐를 통한 흡수에 적합한 형태로 제공된다. 이에 적합한 제형은 당업자에게 공지되어 있다. 이러한 경우, 제제는 일반 분무기 또는 흡입기를 통해 기도로 도입될 수 있는 형태, 예를 들어, 분무용 액제로서 또는 분제로서의 형태를 띤다. 액제 투여 장치는 공지되어 있으며, 초음파 분무기, 또는 노즐 제트 분무기와 비교하여 낮은 전단력으로 작동하는, 다공성 진동막을 가진 분무기가 적합하다. 분말 에어로졸 또한 적합하다. 양이온성 지질과 함께 복합체를 형성한 mRNA 뿐만 아니라, 나형 mRNA는 당 수크로스와 함께 분제로서 냉동 건조시킨 후, 흡입할 수 있는 크기로 으깬 후에도 이용가능하며, 추가로 생물학적 활성을 보인다.

바람직한 실시양태에서, 폐 투여용 제약 조성물은 퍼플루오로카본과 병용되는데, 이는 형질감염률 증가를 위해 제약 조성물보다 이전에 또는 그와 동시에 투여된다.

추가의 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따라 변형된 RNA는 임플란트 코팅을 위한 캐리어로서 지연 방출형 중합체 중에서 제공된다. 이를 위해 본 발명에 따라 변형된 RNA는 그 자체로서 사용될 수 있거나, 또는 다르게 RNA는 코팅 중합체 및/또는 중합체 복합체로 보호될 수 있다.

본 발명의 추가의 대상은 임플란트의 내성장에 유익한 인자를 코딩하는 RNA를 함유하는 지연 방출형 중합체의 코팅이 그의 표면상에 존재하는 것인 임플란트이다. 본 발명에 따라, 단 1가지의 인자만을 코딩하는 mRNA를 함유하는 코팅 및 수개의 인자, 예를 들어, 각종 성장 인자 또는 성장 인자 및 혈관형성 인자 또는 내성장을 촉진시키는 추가 인자를 코딩하는 mRNA를 함유하는 코팅, 이 둘 모두 본원에서 가능하다. 또한 각종 인자는 시차를 둔 간격으로 방출될 수 있도록 하는 형태로 제공될 수 있다.

추가로, "하나 이상의 성장 인자 및 하나 이상의 혈관형성 인자를 코딩하는 RNA"라는 표현은 1 초과의 단백질을 단일로 또는 융합 단백질로서 코딩하는 RNA 서열 및 상이한 단백질을 코딩하는 상이한 RNA 서열의 혼합물 (여기서, 각 RNA 서열은 하나의 단백질을 코딩한다), 둘 모두를 의미하는 것으로 이해되어야 한다.

본 발명은 하기 실시예에 의해 추가로 설명된다.

실시예 1

IVT mRNA의 치료학적 유용성을 평가하기 위해, 비-면역원성 IVT mRNA가 생체내에서의 사용을 위해 수득될 수 있는지 여부를 평가하였다. 이에, 제1 단계에서는 변형된 뉴클레오시드를 가진, 적색 형광 단백질 (RFP)에 대한 시험관내에서 전사된 mRNA를 면역원성 및 형질감염률에 관하여 조사하였다. 그 결과, 25%의 우리딘이 2-티오우리딘 (s2U)에 의해 대체되고, 25%의 시티딘이 5-메틸시티딘 (m5C)에 의해 대체된 것인 다중 변형된 mRNA를 통해 s2U_(0.25)m5C_(0.25) IVT mRNA를 수득하였고, 이는 도 1a에 나타낸 바와 같이 인간 1차 단핵 혈액 세포에 대한 현저히 감소된 면역원성을 가지며, 인간 (도 1b) 뿐만 아니라, 마우스 (도 1c)의 II형 폐포 상피 세포에서 80% 초과의 높은 형질감염률을 얻은 것으로 나타났다. 또한, mRNA의 발현 지속 기간은 유의적으로 더 길었다 (도 2a). 본 결과, 상기와 같이 장기화된 발현은 주로 본 발명에 따라 다중 변형된 mRNA의 보다 고도한 안정성에 기인하는 것으로 나타났다. 절대량 평가를 통해 형질감염 후 7일째에도 s2U_(0.25)m5C_(0.25) RFP mRNA는 대략 10배를 초과하는 양으로 나타났다 (도 2b). 변형된 RFP mRNA의 경우 번역률은 다소 감소하였는데, 따라서 보다 고도하고, 보다 장기간 동안 유지되는 활성에 기여할 수는 없다 (도 4).

다음 단계에서는 변형된 RNA 면역침전 시험 (RIP 분석법)을 사용하여 감소된 면역 반응의 기초가 되는 기전에 대하여 조사하였다. 면역계의 세포는 Toll-유사 수용체 (TLR) 3 (2), TLR7 (3), TLR8 (4) 및 헬리카제 RIG-1 (5)에의 RNA 결합에 의해서 비변형된 리포터 mRNA (1)에 의해 활성화된다는 것이 연구를 통해 밝혀졌다. 비변형된 RFP mRNA와 비교하여 본 발명에 따라 다중 변형된 mRNA의 TLR3, TLR7, TLR8 및 RIG-1에의 결합이 현저하게 감소되었다는 결과가 나타났다. 이와 관련하여, 다중 변형이 단일 s2U 변형보다 상당히 더 효과적인 것이었다 (도 2c). 결합 연구로부터 예측된 바와 같이, 비변형된 RFP mRNA는 마우스 정맥 내로 주사된 경우에 IFN-γ, IL-12 및 IFN-α를 상당한 정도로 증가시킨 반면, 다중 변형된 s2U_(0.25)m5C_(0.25) RFP mRNA는 면역 반응을 방해하였다 (도 2d). 전반적으로, 이러한 결과는 본 발명에 따라 다중 변형된 mRNA가 TLR 및 RIG-1 결합을 현저하게 감소시키고, 이로써 면역 반응도 감소시키며, 동시에 발현은 증가시키고 연장시키는 바, 이로써 mRNA는 생체내 시험에 대해 매우 유망한 후보 물질인 것으로 나타났다.

따라서, 마우스의 폐 내로 직접 도입된, 증강된 녹색 형광 단백질 및 루시퍼라제로 이루어진 융합 단백질 (EGFPLuc)을 코딩하는 s2U_(0.25)m5C_(0.25) mRNA가 비변형된 EGFPLuc mRNA와 비교하였을 때 생체내에서 루시퍼라제의 발현을 강화시키고 연장시켰는지 여부를 시험하였다. 이러한 목적을 위해, 예를 들어, (6)에 기술되어 있는 바와 같이 그 자체가 공지된 기관내 투여를 위한 고압 분무 장치를 사용하였으며, 형질감염률을 증가시키기 위해 미리 퍼플루오로카본 (플루오린화된 FC-77)을 투여하였다 (7). 비록 전체 발광은 처리 24시간 후에는 매우 신속하게, 처리 후 5일까지 매우 낮은 수준으로 감소하였지만, 생체내 폐에서의 루시퍼라제 발현은 3시간 후에 최대치에 도달하였다 (도 3a 및 3b). 이와는 대조적으로, s2U_(0.25)m5C_(0.25) EGFPLuc mRNA로 처리된 마우스에서는 처리 후 최대 5일째까지 높은 발현 값이 관찰되었다 (도 3a 및 3b).

이는 치료를 위한 본 발명에 따라 다중 변형된 mRNA의 치료학적 잠재능은 매우 유망하다는 것을 나타낸다. 따라서, 본 발명에 따라 다중 변형된 2U_(0.25)m5C_(0.25) SP-B mRNA를 SP-B 결핍 마우스 치료에 대해 시험하였다. SP-B는 단일 유전자에 의해 코딩되고, 폐포를 덮고 있는 II형 폐포 상피 세포에서 단백질분해성 프로세싱에 의해 381개의 아미노산을 가진 전구체로 전환되는 상대적으로 작은 양쪽성 펩티드이다 (8, 9). 이는 폐포에서 표면 장력을 감소시키는 데 필요한 계면활성제 지질의 분포, 흡착성, 및 안정성을 개선시킨다. 상기 단백질에 대한 유전자가 결핍된 경우, 출생 후 기도 장애가 발생하게 되고, 이는 빠르게 사망에 이르게 된다. 인간 및 트랜스제닉 마우스에서의 유전적 결함은 사후생존에서 중요한 역할을 하는 것으로 관찰되었다 (10). SP-B 유전자의 돌연변이를 통해 발생하는 것인 유전적 SP-B 결핍증은 계면활성 지질의 형성을 방해하며, 이를 통해 생후 처음 1개월 동안 기도 기능 상실을 일으킨다 (11). 폐 이식이 현재 유일하게 이용가능한 치료적 개입법이다 (12). 그러므로, 상기 결핍증을 가진 경우의 생존가능성을 보장하기 위한 SP-B 결핍증에 대한 mRNA 요법은 대안적 치료법이 될 것이다.

따라서, 본 발명에 따라 다중 변형된 SP-B의 mRNA를 사용한 유전자 요법을 시험하기 위해 SP-B 결핍증에 대한 넉아웃 마우스 모델을 선택하였다. 이를 위해, SP-B cDNA가 SP-B^-/- 넉아웃 마우스에서 외인성 독시시클린의 제어하에 발현된 마우스 모델을 선택하였다. SP-B^-/- 성체 마우스에서 독시시클린 제공을 중단하자, 폐에서의 SP-B의 함량은 감소하였고, SP-B 농도가 정상 수준의 25% 아래로 까지 떨어진 경우에는 호흡 기능 상실이 발생하였다. 독시시클린을 투여받은 조건부 트랜스제닉 마우스는 정상적으로 생존하였다 (13, 14). 사용되는 치료학적 전략법은 하기를 포함하였다: (i) 발현 증가를 위해 SP-B mRNA 도입 이전에 퍼플루오로카본으로 마우스를 사전 처리, 및 (ii) 4주 동안 매 3일 또는 4일마다 주당 2회씩 SP-B mRNA를 반복 사용 (도 3c). 이러한 원리를 입증하는 실험을 수행하기 위해, 조건부 SP-B^-/- 마우스 기관내로 s2U_(0.25)m5C_(0.25) SP-B mRNA를 에어로졸로서 고압 분무기를 사용하여 투여하였다. 이러한 처리를 통해 마우스는 호흡 기능 상실로부터 생존하게 되었고, 그의 평균 수명은 28.8 ± 1.1일로 (도 3d), 최대의 정의된 연구 종결 시점까지 연장되었다. 이와는 대조적으로, 독시시클린 제공 중단 후, 비처리 SP-B^-/- 마우스에서는 3 내지 4일 이내에 급성 호흡 곤란의 증상들이 나타났다. 이는 퍼플루오로카본을 단독으로, 또는 대조군으로서 s2U_(0.25)m5C_(0.25) EGFPLuc mRNA를 퍼플루오로카본과 함께 투여한 후에 마우스는 3.8 ± 0.4일 이내에 사망한 것으로 관찰되었다 (도 3d, 데이터를 나타내지 않음). 또한, SP-B에 대한 면역염색법 (도 3e) 및 반정량적 웨스턴 블롯 분석법 (도 3f)에 의해 s2U_(0.25)m5C_(0.25) SP-B mRNA로 처리된 마우스의 폐에서 SP-B가 성공적으로 재구성되었는지를 확인하였다. 4주 동안 s2U_(0.25)m5C_(0.25) SP-B mRNA로 처리받은 마우스에서 폐 조직학적 성질은 정상인 반면, s2U_(0.25)m5C_(0.25) EGFPLuc 대조군 mRNA를 투여받은 마우스의 폐에서는 4일 후 폐포벽의 비후, 세포 침윤 및 간질성 부종이 나타났다 (도 3g). 이러한 폐 손상은 울혈 (적혈구 개수의 증가), 기관지 폐포 세척액 (BALF) 중 대식세포 및 호중구 개수의 증가 및 염증성 시토카인의 수준 증가 (도 3h 및 도 4)를 동반한 반면, 이러한 현상은 SP-B mRNA로 처리된 마우스에서는 대체로 방해되어 일어나지 못했다. 독시시클린 제공을 중단하자, 처리받지 못한 경우에는 폐 기능이 악화된 것으로 나타났다 (14, 15). 독시시클린을 투여받은 SP-B^-/- 마우스에서와 같이, s2U_(0.25)m5C_(0.25) SP-B mRNA로 SP-B^-/- 마우스를 장기간 처리하였을 때 정상적인 폐 기능이 유지된 것이 관찰되었다 (도 3i 및 도 5).

요약컨대, 이러한 결과는 폐에서 SP-B 결핍증의 모든 기능적 및 병적 파라미터가 실질적으로 개선되었으며, 이는 독시시클린을 투여받은 조건부 SP-B^-/- 마우스와 유사하였다는 것을 나타낸다.

본 결과는 치명적인 폐 질환에 대한 마우스 모델에서 다중 변형된 mRNA의 치료학적 효능을 나타낸다. 그러나, 하기와 같은 경우 mRNA 요법의 추가 적용은 계속적으로 개선될 수 있다: (i) 비이환 조직의 세포에서 원치않는 mRNA 번역은 표적 영역 바깥쪽에 원치않는 영향력을 발휘할 수 있고, (ii) 다중 변형된 mRNA가 또한 비이환 조직에 도달한 경우, 적절한 양의 mRNA가 제공되어야 하고, (iii) 단기간 지속된 mRNA 활성을 위해서는 반복 투약이 필요하다. 이를 개선시키기 위해서는 상기 질환으로는 비이환된 세포에서의 원치않는 mRNA 번역이 일어나지 못하도록 하기 위해서는 마이크로-RNA 생물학적 성질이 요청될 수 있다. 표적 세포에서는 발현되지 않는, 내인성 마이크로-RNA를 표적 서열 내로 혼입시킴으로써, 상기 질환으로는 비이환된 세포에서는 mRNA 분해가 선택적으로 일어날 수 있고, 그러나, 상기 기간 동안 mRNA는 표적 세포에서 유지되고, 그 결과, 부작용은 최소화된다 (16, 17).

추가의 접근법인 방출 시스템에서, 특이적인 수용체를 세포 표면에 결합시키는 표적화 리간드는 표적 세포가 수용체를 매개로 하여 형질감염될 수 있도록 하기 위해 조합될 수 있다. 이에 mRNA가 대량으로 생산될 수 있고 (18), 심지어는 다중 변형된 mRNA를 대규모로 생산할 수 있는 효율적인 생산 방법도 가능한 바, 본 발명에 따른 mRNA를 임상적으로 사용할 수 있고, 이로써 특이적으로 각 질환에 대한 맞춤식 mRNA 시스템을 개발할 수 있으며 (19, 20), 이를 통해서 투약 빈도 및 단기간 활성은 최소도 유지될 수 있는데, 이는 공지의 현 요법으로는 불가능하다. 이러한 방식으로, 본 발명에 따라 유전자 결핍증에 기인한 질환 치료에 효과적인 분자 요법을 제공한다.

실시예 2

SP-B 결핍 마우스에서 본 발명에 따라 변형된 SP-B 코딩 mRNA의 사용으로 병증이 호전되고, 예상 수명이 연장된다는 것을 밝혀내기 위해, 추가 실험을 수행하였다. 실시예 1에 기술된 마우스 모멜 및 병증을 사용하였다.

3개의 마우스 군으로 설정하였다. 첫번째 SP-B 결핍 마우스 군은 1주 이내에 2회에 걸쳐 본 발명에 따라 변형된 mRNA를 투여받았고 (B), 두번째 군은 28일 동안 주당 2회에 걸쳐 본 발명에 따라 변형된 mRNA를 투여받았고 (C), 비교를 위해 세번째 군의 마우스는 변형된 EGFP-Luc mRNA를 투여받았다 (A).

본 발명에 따라 변형된 SPB mRNA를 투여받지 못한 마우스는 단기간 후 사망한 것으로 나타났다. 오직 본 발명에 따른 SP-B RNA를 투여받은 한, 본 발명에 따른 RNA를 투여받은 마우스는 생존하였다. 이는 본 발명에 따른 RNA가 생물학상 활성이고, 필수 단백질을 대체할 수 있다는 것을 입증한다.

상세하게 설명하면, 본 실험은 하기와 같이 수행하였다. 실시예 1에 기술된 SP-B KO 마우스에 변형된 EGFP-Luc mRNA를 (A) (n = 10) 또는 1주 이내에 2회에 걸쳐 변형된 SP-B mRNA를 (B) (n = 4) 또는 28일 동안 주당 2회에 걸쳐 변형된 SP-B mRNA를 (C) (n = 4) 투여하였다. 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 생존 곡선을 플롯팅하고, 윌콕슨-게한(Wilcoxon-Gehan) 시험을 수행하였다. 음용수 중 독시시클린의 첨가로 SP-B 유전자가 조절되는 트랜스제닉 SP-B 마우스의 폐로 이중 변형된 SP-B mRNA를 1주 이내에 2회에 걸쳐 기관내 투여한 경우 (B), 처리 개시 전에 음용수로부터 독시시클린 제공을 중단한 후, 마우스의 평균 생존 시간은, EGFP-Luc 대조군 mRNA 투여 후 3.4±0.2일인 것과 비교하여, 10.2±0.5일 (B)로 연장되었다.

본 결과는 도 12의 다이어그램에 제시되어 있다. 본 발명에 따라 이중 변형된 SP-B mRNA의 기관내 투여가 생명을 구조하는 것으로 나타났다. 본 발명에 따른 mRNA를 첨가하지 않은 경우, 마우스는 단기간 후 사망하였다. 본 실험은 또한 첫번째로는 SP-B mRNA가 생명에 필수적인 SP-B를 생체내에서 생산하고, 두번째로는 실험용 동물을 사망으로부터 보호하기 위해서는 SP-B mRNA가 계속적으로 투여되어야 한다는 것을 보여준다.

실시예 3

실시예 1에 기술된 마우스로서 이들 모두가 독시시클린을 제공받은 것인 마우스가 사용된 추가 실험에서는, 본 발명에 따른 RNA가 투여 후 조기에 염증성 반응을 유발하는지 여부를 조사하였다. 이를 위해, 5개의 군으로 설정하고, 상이한 제제를 투여한 후 8시간이 경과하였을 때 마우스의 기관지 폐포 세척액에 존재하는 시토카인 수준, IFNγ 및 IL-12를 측정하였다. 6개의 군에 하기 제제를 투여하였다: a) 비처리 대조군 (즉, 퍼플루오로카본도 RNA도 투여받지 못한 것), b) 대조군 (퍼플루오로카본을 투여받은 것), c) 대조군 (퍼플루오로카본 및 비변형된 SP-B mRNA를 투여받은 것), d) 본 발명 (퍼플루오로카본 및 변형된 s2U_(0.25)m5C_(0.25) SP-B mRNA를 투여받은 것), 및 e) 대조군 (퍼플루오로카본 및 SP-B 플라스미드 DNA를 투여받은 것) (n = 4). 각각의 경우, 20 ㎍ (50 ㎕)의 제제를 투여하였다. 본 결과는 도 13에 제시되어 있다. 도 13에는 평균값±표준 오차가 명시되어 있다. 도 13에서는 하기와 같은 약어를 사용하였다: Doxy - 독시시클린, Pfc - 퍼플루오로카본, pDNA - 플라스미드 DNA (*P < 0.05 비처리군과 비교한 것).

본 결과를 통해, 비변형된 mRNA 또는 플라스미드 DNA를 기관내 투여한 경우에는 기관지 폐포 세척액 중 염증성 마커 IL-12가 현저하게 상승한 반면, 이중 변형된 mRNA를 투여한 경우에는 비처리 마우스와 비교하여 IL-12가 전혀 상승하지 않은 것으로 나타났다. 이중 변형된 mRNA를 투여한 경우, 염증성 마커 IFNγ의 수준은 퍼플루오로카본 투여 후에도 관찰되는 정도까지 미세하게 증가하였다. 이와는 대조적으로, 비변형된 mRNA를 투여한 경우, 또는 플라스미드 DNA를 투여한 경우에는 또한 IFNγ 수준이 현저하게 증가한 것으로 나타났다. 따라서, 본 발명에 따라 변형된 mRNA의 사용으로 염증성 반응이 일어날 수 있다고는 예측할 수 없는 반면, 비변형된 mRNA, 또는 심지어는 플라스미드 DNA의 투여는 염증성 반응을 매우 빠르게 유발한다.

실시예 4

본 발명에 따라 변형된 mRNA의 사용 가능성을 입증하기 위해 각종 유형이 변형 및 그가 형질감염 및 번역률에 미치는 효과, 및 면역원성에 미치는 효과를 연구하였다. 각 경우의 200 ng의 mRNA로 A459 세포를 형질감염시킨 후, 몇개의 세포가 형질감염되었는지, 및 몇개의 세포에서 형광 단백질이 번역되었는지를 조사하였다. 이는 평균 형광 강도 (MFI)를 사용하여 평가하였다. 결과는 도 10a에 제시되어 있다. 본 발명에 따라 변형된 mRNA를 시험하였으며, 우리딘 뉴클레오티드에 대한 2개의 상이한 변형이 사용된, 본 발명과 다르게 변형된 mRNA 및 비-변형된 mRNA가 비교로 사용되었다. 본 발명에 따라 변형된 mRNA 분자는:

s2U/m5C 및 s4U/m5C로서, 여기서, 변형된 뉴클레오티드의 함량은 각각 10%이고, 10%/10% s2U/m5C 및 s2U/5mC 이외에도 각각 추가로 5%의 변형된 뉴클레오티드를 함유하는 것인, 즉, C₂'NH₂ 한번 및 5% G'N₃ 한번을 함유하는 것인 s2U/m5C 및 s4U/m5C이다. 본 결과를 통해 본 발명에 따라 변형된 mRNA의 매우 높은 형질감염률을 보인 반면, 비변형된 mRNA 및 본 발명과 다르게 변형된 mRNA는 각각 훨씬 더 낮은 형질감염 및 번역률을 보인 것으로 나타났다.

각각의 mRNA를 5 ㎍씩 투여한 후, TNF-α 수준이 인간 PBMC에 미치는 효과를 조사함으로써 앞서 기술된 변형된 mRNA에 대한 면역원성 또한 시험하였다. 결과는 도 10b에 제시되어 있다. 명확하게 알 수 있는 바, 비변형된 mRNA 또는 두 유형의 변형된 우리딘 뉴클레오티드가 사용된 mRNA 투여시에는 TNF-α수준이 현저하게 상승하였다. 본 발명에 따라 변형된 RNA를 투여한 경우 TNF-α수준은 비변형된 RNA를 투여한 경우와 비교하였을 때보다 50% 이상만큼 낮았다.

실시예 5

본 발명에 따라 다중 변형된 mRNA 제조 방법

a) 시험관내 전사를 위한 구성물

RFP cDNA (678 bp)의 시험관내 전사를 위해, SP6 프로모터를 함유하는 플라스미드, pCS2+DsRedT4를 사용하였다. SP-B cDNA (1,146 bp)의 시험관내 전사를 위해, T7 프로모터을 함유하는 pVAX1 플라스미드 (인비트로겐(Invitrogen))를 사용하였다. EGFPLuc (2.4 kb)의 시험관내 전사를 위한 벡터를 제작하기 위해, (19)에 기술되어 있는 바와 같이 수득된 T7 프로모터를 함유하는 pST1-2β-글로빈-UTR-A-(120) 구성물을 사용하였다. 분자 생물학의 표준 기법을 사용하여 구성물을 클로닝하였다.

변형된 mRNA 제조

시험관내 전사를 위한 주형을 제작하기 위해, XbaI를 사용하여 pCS2+DsRed.T4, EGFPLuc 및 SP-B 플라스미드를 선형화하였다. 선형화된 벡터 DNA를 뉴클레오스핀 엑스트랙트 II 키트(NucleoSpin Extract II 키트) (마슈레-나겔(Macherey-Nagel))를 정제하고, 분광광도법에 의해 평가하였다. mMESSAGE-mMACHINE SP6 또는 T7 울트라키트(Ultrakit) (앰비온(Ambion))를 사용하여 시험관내 전사를 수행하였다. SP-6 키트는 7-메틸GpppG를 사용하여 mRNA를 캡핑한 반면, T7 키트는 전사 반응에서 초고도의 수율로 유사한 안티리버스 캡 (ARCA; 7-메틸-(3'-O-메틸)GpppGm⁷G(5')ppp(5')G을 생성하였다. RNA 변형을 생성하기 위해 하기 변형된 리보핵산 트리포스페이트를 언급한 비율로 반응 시스템에 첨가하였다: 2'-티오우리딘 5'-트리포스페이트, 5'-메틸시티딘 5'-트리포스페이트, 슈도-우리딘 5'-트리포스페이트 및 N⁶-메틸아데노신 5'-트리포스페이트 (이들 모두는 트리링크 바이오테크놀러지스(TriLink BioTechnologies)로부터 입수한 것이며, HPLC 및 ³¹P NMR을 사용하여 순도 체크된 것이다). 시험관내 전사 이후, 폴리(A) 테일 키트 (앰비온)를 사용하여 pVAX1 SP-B 플라스미드로부터의 RNA를 효소적으로 폴리아데닐화시켰다. 폴리(A) 테일의 길이는 대략 200 nt였다. MEGAclear 키트 (앰비온)를 사용하여 캡핑된 모든 mRNA (RFP, EGFPLuc 및 SP-B)를 정제하고, 바이오애널리시스 인스트루먼트 2100(Bioanalysis Instrument 2100) (애질런트 테크놀러지스(Agilent Technologies)) 상에서 애질런트 RNA 6000 나노 에세이(Agilent RNA 6000 Nano Assay)를 사용하여 크기와 순도에 대하여 분석하였다.

세포 형질감염

폐 세포 형질감염

각각 인간 및 마우스로부터 유래된 II형 폐포 상피 세포주인 A549 및 MLE12를 10% 우태아 혈청 (FCS), 1% 페니실린-스트렙토마이신 및 0.5% 겐타마이신으로 보충된 최소 필수 배지(Minimal Essential Medium) (인비트로겐) 중에서 배양하였다. 형질감염 1일 전, 웰당 80,000개의 세포를 24-웰 플레이트에 플레이팅시켰다. 제조사의 설명서에 따라 리포펙타민 2000 (인비트로겐)을 사용하여 200 ng의 mRNA로 (90% 초과의 융합성(confluence)을 가진) 세포를 형질감염시켰다. 4시간 후, 세포를 PBS로 세척하고, 혈청-함유 배지를 첨가하였다. 장기 발현에 대한 분석을 위해 (융합성이 > 90%일 때) 세포를 규칙적으로 세분화하였다.

인간 PBMC 형질감염

CTL 안티-어그리게이트 세척 보충제(CTL Anti-Aggregate Wash Supplement)를 사용하여 액체 질소 중에 냉동 보존된 인간 PBMC (CTL-유럽 GmbH(CTL-Europe GmbH))를 37℃에서 주의하여 해동시키고, 그 기간 동안 멸균-여과된 RPMI-1640 (인비트로겐)을 천천히 첨가하였다. 기술된 모든 실험에 대해서는 데이터가 재현가능하도록 하기 위해 단일 특징화된 PBMC 배취를 사용하였다.

유동 세포측정법

상기 기술된 바와 같이, RFP mRNA로 형질감염된 A549 및 MLE12 세포 상에서 유동 세포측정법을 수행하였다. 0.25% 트립신/EDTA를 사용하여 플레이트 표면으로부터 세포를 제거하고, PBS를 사용하여 3회에 걸쳐 세척하고, FACSCalibur (BD 바이오사이언시즈(BD Biosciences))를 사용하여 형광을 측정하기 위해 다시 PBS 중에 현탁시켰다. 오직 PBS로만 처리된 대조군 세포의 형광 강도를 초과하는 세포 군집의 비율로부터 형질감염률을 계산하였다. 튜브 1개당 2,500개 이상의 세포가 계수되었다. 셀퀘스트 프로(Cellquest Pro)를 사용하여 데이터를 분석하였다.

시토카인 검출

인간 IL-8 및 TNF-α키트 (레이바이오(RayBio)), 마우스 IFN-γ 및 IL-12 (P40/P70) 키트 (레이바이오) 및 마우스 IFN-α 키트 (RnD 시스템즈(RnD Systems))를 사용하여 효소-결합 면역흡착 분석법 (ELISA)을 수행하였다.

실시간 시험관내 번역

레틱 라이세이트 IVT(Retic Lysate IVT) (앰비온)를 사용하여 500 ng의 RFP mRNA를 시험관내에서 번역시켰다. 최종 농도 50 μM로 메티오닌을 첨가하였다. 혼합물을 30℃ 수조에서 인큐베이션시키고, 다양한 시점에서 샘플을 채취하고, 왈락 빅토르² 1420 멀티라벨 계수기(Wallac Victor² 1420 Multilabel Counter)(퍼킨 엘머(Perkin Elmer)) 상에서 590 nm에서의 형광 강도를 측정하였다.

정량적 RT - PCR

RNeasy 미니키트(RNeasy Minikit) (퀴아젠(Qiagen))을 사용하여 A549 세포로부터, 또는 인간 PBMC로부터 (하기 RIP 프로토콜 참조) 전체 RNA를 추출하고, 제품 매뉴얼에 따라 i스크립트(iScript) cDNA 합성 키트(바이오-래드(Bio-Rad))를 사용하여 20 ㎕의 배취에서 역전사 (RT) 시켰다. 하기 프라이머: RFP: 5'-GCACCCAGACCGCCAAGC (전향) 및 RFP: 5'-ATCTCGCCCTTCAGCACGC (역향)를 사용하여 이중 배취 중에서 iQ SYBR 그린 슈퍼믹스(iQ SYBR Green Supermix) 및 i사이클러(iCycler) (바이오-래드)를 사용하여 cDNA를 증폭시켰다. 기준선 사이클 및 역치값을 자동 계산하는 i사이클러 IQ 소프트웨어 3.1(iCycler IQ software 3.1) (바이오-래드)을 사용하여 C_t 값을 수득하였다.

RNA 면역침전 ( RIP )

1 ml의 옵티멤(Optimem) 1 중 12.8 ㎕의 리포펙타민 2000을 사용하여 5 ㎍의 mRNA으로 1 x 10⁶개의 인간 PBMC (CTL-유럽 GmbH)를 형질감염시켰다. 4시간 후, 배지를 10% FCS를 보충하였다. 24시간 후, 세포 현탁액을 튜브로 옮겨 놓고, 세포를 350 rpm으로 10분 동안 원심분리하여 펠릿화하였다. 이어서, RIP를 수행하기 위해 변형된 버전의 ChIP-IT 발현 프로토콜(ChIP-IT Express protocol) (액티브모티브(ActiveMotive))을 사용하였다. 모든 필요한 시약의 침전을 위해 DEPC-처리된 물 (세르바 일렉트로포레시스(Serva Electrophoresis))을 사용하였다. ChIP-IT 매뉴얼에 따라 고정 용액, 및 이어서, 글리신 중단-고정 용액 및 빙냉 1 x PBS를 세포에 첨가하고, 4℃에서 세포를 펠릿화하였다. 이어서, 프로테아제 억제제 PIC 및 PMSF가 첨가되어 있는 용해 완충액 중에 세포를 다시 현탁시키고, 얼음 상에서 30 min 동안 인큐베이션시켰다. 4℃에서 2,400 rpm으로 10분 동안 원심분리한 후, 상등액에서 포획 반응이 일어나도록 하였다. 밤새도록 TLR-mRNA/RIG-mRNA 복합체를 ChIP-IT 익스프레스(ChIP-IT Express) 매뉴얼에 기술된 바와 같이, 8-웰 PCR 스트립트 중 자기 비드 상에 포획시켰다. 추가로, SUPERase RNase 억제제 (어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems)/앰비온)를 최종 농도 1 U/㎕로 첨가하였다. 항-인간 TLR3 마우스 IgG1, TLR7 래빗 IgG1, TLR8 마우스 IgG1 (이들 모두는 임게넥스(Imgenex))로부터 입수) 및 RIG-1 래빗 IgG1 (ProSci 인코포레이티드(ProSci Incorporated))를 항체로서 사용하였다. ChIP-IT 익스프레스 프로토콜에 따라 자기를 세척한 후, TLR-mRNA/RIG-mRNA 항체 복합체를 용리시키고, 역 가교결합시키고, 프로테이나제 K로 처리하였다. 최종적으로, 상기 기술된 바와 같이 용리된 mRNA를 역전사 및 정량적 RT-PCR 시켰다.

생체내 생물 발광

D-루시페린 기질을 물에 용해시키고, pH를 pH 7로 조정하고, 농도가 30 mg/ml에 도달하도록 최종 부피를 조정하였다. 마취시킨 마우스의 비공에 50 ㎕의 상기 용액을 적용시키고, 비성 호흡에 의해 흡수시켰다 (1.5 mg 루시페린/마우스). 10 min 후, 하기 카메라 설정: 시야 10, f1 f-스톱, 고해상도 및 조명 시간 1 내지 10 min인 것을 사용하여 (21)에 기술된 바와 같이 IVIS100 영상 시스템 (제고겐(Xenogen))을 사용하여 생물 발광을 측정하였다. 라이빙 이미지 소프트웨어 버전 2.50(Living Image Software Version 2.50) (제고겐)을 사용하여 폐 영역의 신호를 정량적으로 평가하고, 분석하였으며, 배경 값은 감산되었다.

동물 연구

6 내지 8주령된 암컷 BALB/C 마우스 (찰스 리버 라보라토리즈(Charles River Laboratories))를 특정 무병원체 조건하에서 유지시키고, 12시간 명기:12시간 암기 사이클로 개별적으로 환기되는 우리 안에서 사육하면서 임의대로 음식물과 음용수를 공급하였다. 실험 개시 이전에 적어도 7일 동안 동물을 순응시켰다. 모든 동물에 대한 조작에 대해서는 허가를 받았으며, 지방 윤리 위원회의 감독하에 독일 동물 보호법(German Animal Protection Law) 지침에 따라 수행하였다. 꼬리 정맥 내로 주사하는 것을 제외한 모든 실험에서, 메데토미딘 (0.5 mg/kg), 미다졸람 (5 mg/kg) 및 펜타닐 (50 ㎍/kg)의 혼합물을 i.p.로 투여하여 동물을 마취시켰다. 각 실험 후, 아티파메졸 (50 ㎍/kg), 플루마제닐 (10 ㎍/kg) 및 날록손 (24 ㎍/kg)로 구성된 해독제를 동물에게 s.c.로 투여하였다. ELISA 시험을 위한 혈액은 각종 시점에서 헤파린 처리된 1.3 mm짜리 모세관 (마리엔펠트(Marienfeld))를 사용하여 안구후 정맥을 천자시켜 수득하였다.

꼬리 정맥으로의 주사

25 ㎍의 RFP mRNA을 메가펙틴(Megafectin) (MP 바이오메디칼스 유럽(MP Biomedicals Europe))과 지질에 대한 mRNA의 비가 0.25가 되도록 혼합하고, 제조사의 권고에 따라 인핸서-3(Enhancer-3)을 첨가하였다. 제타-팔스(Zeta-PALS)/제타 전위 분석기 (부루크하벤 인스트루벤츠 코포레이션(Brookhaven Instruments Corp.))를 사용하여 동적 광산란법 (DLS)으로 주사된 복합체의 통합성 및 입자 크기를 측정하였다. 마우스를 구속 장치에 눕히고, 27 게이지 니들 및 1 ml 시린지를 사용하여 30초 이내에 100 ㎕의 mRNA/메가펙틴 용액 (5 ㎍의 mRNA에 등가)을 꼬리 정맥으로 주사하였다.

고압 분무에 의한 기관내 투여

BALB/c 및 SP-B^-/- 마우스를 (14)에 기술된 바와 같이 마취시키고, 상악 치아가 45° 각도에 놓이도록 플레이트 시스템 (할로웰 (Halowell) EMC) 상에 고정시켰다. 인두에 최적으로 조명하기 위해 변형된 냉광 검이경 베타 200 (하이네 옵토테크니크)을 사용하였다. 소형 스파튤라를 사용하여 하악골을 열고, 뭉뚝한 핀셋을 사용하여 혀를 한쪽으로 밀어 인두 중앙부를 최대로 노출시켰다. 모델 FMJ-250 고압 시린지에 연결된 모델 1A-1C 마이크로 분무기 (둘 모두 펜센츄리 인크.(PennCentury Inc.)로부터 입수)를 기관내 삽입하고, 25 ㎕의 플루오리너트(Fluorinert) FC-77 (시그마(Sigma)) 및 25 ㎕의 루시퍼라제 mRNA 용액 (10 ㎍) 또는 50 ㎕의 SP-B mRNA 용액 (20 ㎍)을 연속하여 적용시켰다. 5 sec 후, 마이크로분무기 시린지를 빼내고, 5 min 후 버팀대로부터 마우스를 꺼냈다.

폐 기능 측정

동형접합성 SP-B^-/- 마우스±독시시클린±변형된 mRNA를 상기 기술된 바와 같이 마취시켰다. 자발 호흡을 막기 위해 베쿠로니움 브로마이드 (0.1 mg/kg)를 복강내로 주사하였다. (22)에 기술된 바와 같이 폐의 기계적 측정을 수행하였다. 간략하면, 기관절개술을 통해 기도에 뭉툭한 스틸 캐뉼러 (외부 직경 1 mm)를 기관에 삽입하였다. 피스톤 펌프 인공호흡기가 인공호흡기로서, 및 측정 장치로서의 2가지 역할을 모두하였다 (플렉시벤트(flexiVent), SAV). 1회 호흡 환기 동안, 호흡량 조절형- 및 압력-제한 환기로 설정하였다 (Vt = 10 ㎕/g, P최대 = 30 cm H₂O, PEEP 2 - 3 cm H₂O (2.5 Hz에서) 및 100% 산소). 사용된 Vt는 독시시클린을 투여받은 동물에서는 8.4±1.4 ㎕/g이고, 독시시클린 및 mRNA (N.S.)을 투여받은 동물에서는 8.9±0.4 ㎕/g BW이었다. 표준 부피 히스토리를 작성하기 위해 1 sec 동안 15 ㎕/g로 2회에 걸쳐 흡입법을 실시한 후 동물에서 5분 간격으로 호흡계의 동적-기계적 특성, 및 폐 유입 임피던스를 측정하였다. 진동 측정을 위해, PEEP 수준에서 환기를 중단하였다. 8 sec의 의사 무작위 추출 진동 신호로 구성된 강제 진동 (FOT)에 의해 호흡계 임피던스 (Zrs)를 측정하기 위해 3 ml/g의 진폭을 사용하였다. 강제 신호의 주파수는 1.75 내지 19.6 Hz 사이였다 (23, 24). 256 Hz에서 데이터를 수집하고, 66% 중복되는 4 sec 구간으로 분석하였다. 폐 임피던스 데이터는 주파수 영역내 호흡계의 저항 (실수 부분) 및 반응성 (허수 부분)으로 나타내었다. 한토스(Hantos) 등에 의해 제안된 바와 같이 (25), 폐의 정위상 모델을 사용하여 폐 임피던스 데이터 (Zrs)를 세분하였다. 상기 모델에서 Zrs는 하기 등식에 따라 호흡 저항 (Rn), 기도 무력증 (무력증), 조직 탄성도 (H_L) 및 조직 충격 완화 (G_L)로 구성되었다:

Zrs = Raw + jωlaw + (G_L - jH_L)/ω^α

여기서, ω는 각주파수이고, ω는 Zrs의 주파수 의존성이다 (ω= (2/ωtan^-1(1/ω). 폐 이력 현상(hysteresivity ) (eta = G_L/H_L)은 폐 조직 조성을 나타내는 측정값으로서, 여기서, 조직 충격 완화 및 조직 탄성도, 둘 모두가 포함된다 (26, 27). 각 측정값에 대해서는 맞춤을 위해 정위상 모델을 자동으로 시험하였다. 맞춤 등급은 측정값의 일관도 (COD)로서 제시되며, COD가 0.85보다 작을 경우, 그 데이터는 거부된다.

계면활성제 단백질 분석

바이오-래드 단백질 분석 키트 (바이오-래드)를 사용하여 세척 상등액의 총 단백질 함량을 측정하였다. NOVEX Xcell II 미니-셀 시스템(NOVEX Xcell II mini-cell system) (노벡스(Novex))을 사용하여 누페이지(NuPage) 10% 비스-트리스 겔 상에서 비-환원 조건하에 10 ㎍의 총 단백질을 분리하였다. 전기영동 후, 누페이지 블롯 모듈 (노벡스)로 PVDF 막 (임모비론P(ImmobilonP))으로 단백질을 옮겨 놓았다. SP-B에 대한 폴리크로날 래빗 항혈청 (c329, 알타나 아게(Altana AG)의 W. 스테인힐베르(W. Steinhilber) 박사로부터 기증받음)으로 계면활성제 단백질 B (SP-B)를 검출한 후, 호스래디쉬 퍼옥시다제 접합된 폴리클로날 염소 항-래빗 항-IgG (1:10,000, 디아노바(Dianova))를 사용하여 개선 화학발광 시험 (아머샴 바이오사이언시즈(Amersham Biosciences))을 수행하였다. 이러한 조건 하에, 시험은 트랙 (28) 당 약 2.5 ng의 SP-B를 검출할 수 있었다. 화학발광 검출 시스템으로서, 아이다(Aida) 영상 분석기 (레이 테스트 이소토펜메스게레이트 게엠베하(Ray test Isotopenmessgeraete GmbH))가 장착된 DIANA III dev. 1.0.54를 사용하고, 퀀티티 원 4.6.7(Quantity One 4.6.7) (바이오-래드)을 사용하여 데이터를 정량적으로 평가하였다.

형광 현미경 분석

고정되고 (3% 파라포름알데히드), 파라핀 왁스 중에 포매된 절편을 제조사가 권고하는 바와 같이 면역조직화학법에 사용하였다 (Abcam, www.abcam.com/technica). 슬라이드를 항-인간 항-마우스 SP-B 항체 및 텍사스 레드에 접합된 항-래빗 IgG 항체 (2가지 모두 압캠(Abcam)으로부터 입수, 1:500)와 함께 인큐베이션시키고, DAPI로 대조염색시켰다. 자이스 액시오베라트 135(Zeiss Axiovert 135)에 의해 형광 영상을 수득하였다.

통계학상 분석

REST 2005 소프트웨어를 사용하여 쌍별 고정 재할당 무작위화 검정에 의해 각 군들 사이의 mRNA 발현상의 차이를 분석하였다 (29). 프리즘 5.0(Prism 5.0)을 사용하여 생물 발광 붕괴에 대한 반감기를 계산하였다. SPSS 15 (SPSS 인크.(SPSS Inc.))를 이용하여 윌콕슨-만-위트니 검정(Wilcoxon-Mann-Whitney test)을 사용함으로써 모든 다른 분석도 수행하였다. 데이터는 평균값±SEM (평균값의 표준 오차)으로서, 또는 중앙값±IQR (사분위수 범위)로 명시하고, P < 0.05 (양측)인 것을 통계학상 유의적인 것으로 간주하였다.

실시예 6

본 발명에 따라 다중 변형된 EPO 코딩 mRNA

본질적으로는 실시예 3에 기술되는 것과 같은 방법을 사용하여, EPO-코딩부를 함유하는 변형된 mRNA를 생산하였다. 상기 mRNA의 발현율에 대해 시험하였다. 이를 위해 5 ㎍의 본 발명에 따라 변형된 mRNA 또는 비-변형된 mRNA를 마우스에 i.m.로 주사하였다. 각 군은 4마리의 구성원으로 구성되었다. RNA 투여 후 14일째 및 28일째, ELISA 시험을 사용하여 혈청 중 EPO의 함량을 정량적으로 평가하였다. 같은 실험에서 마우스로부터 유래된 전혈 중 헤마토크릿 값을 평가하였다. 첨부된 도 11 각각에 제시된 데이터는 평균값±SEM을 나타낸다. 산포 블롯을 개별 헤마토크릿 값을 나타낸다. 막대 그래프는 중앙값을 나타낸다. *P < 0.05 각 시점에 비처리군과 비교한 것; +P < 0.05 각 시점에 비변형된 mEPO 군과 비교한 것.

(c) 데이터는 평균값±SEM을 나타낸다. 인간 PBMC를 5 ㎍의 비변형된 또는 변형된 RFP mRNA로 형질감염시키고, TLR-3, TLR-7 및 TLR-8에 특이적인 항체를 사용하여 RIP로 회수율을 측정하였다. 박스 모양은 평균값±IQR을 의미한다. 라인은 최소값 및 최대값을 나타낸다. *P < 0.5, **P < 0.01, ***P < 0.001 비변형된 mEPO 군과 비교한 것.

(d) 5 ㎍의 비변형된 mEPO mRNA 및 변형된 mEPO mRNA를 마우스 정맥내로 주사하였다 (각각 n = 4). 24시간 후, ELISA에 의해 혈청 중 인터페론-γ, IL-12 및 인터페론-α 수준을 정량적으로 평가하였다.

다이어그램으로부터 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따라 변형된 RNA의 경우, 염증성 마커는 비-병적 범위에 있는 반면, 비변형된 RNA 또는 단지 변형된 우리딘 뉴클레오티드만을 함유하는 변형된 RNA의 경우, 염증성 마커는 현저히 상승하였다.

따라서, 본 발명에 따라, 매우 안정적이며, 동시에 면역학적 반응을 거의 일으키지 않거나, 전혀 일으키지 않는 EPO 코딩 mRNA를 제공한다. 상기 mRNA는 에리트로포이에틴 결핍증 치료에 유리하게 사용될 수 있다. 이는 안정성이 높기 때문에 단지 매 2주 내지 매 4주마다만 투여될 필요가 있다.

실시예 7

본 발명에 따라 변형된 EPO-코딩 mRNA의 반복 투여가 어떻게 헤마토크릿 값에 영향을 줄 수 있는지에 대하여 조사하였다. 이는 본 발명에 따라 변형된 mRNA가 또한 체내로 투여되었을 때에 장기간 동안에 걸쳐 활성 상태로 남아 있는지 여부를 알기 위한 것이었다. 예를 들어, 본 발명에 따른 mRNA에 대한 면역학적 반응은 활성을 감소시킬 것이다.

이에, (실시예 6에 기술된 것과 같은) 10 ㎍의 변형된 mEPO mRNA를 0, 21 및 34일째 마우스 근육내로 투여하였다 (n = 10). 이어서, 헤마토크릿 값은 0, 21, 34, 42 및 51일째 마우스로부터 유래된 전혈 중에서 측정하였다. 결과는 도 14에 제시되어 있다. 다이어그램 상의 데이터는 평균±표준 오차를 나타낸다. *P < 0.05 0일째의 헤마토크릿 값과 비교한 것.

본 결과를 통해 본 발명에 따라 변형된 mRNA의 반복 투여가 헤마토크릿 값을 장기간 지속적으로 상승된 상태로 유지시킨다는 것을 확인하였다. 이는 mRNA가 심지어 다회에 걸쳐 투여된 후에도 활성 상태로 남아 있음을 나타낸다.

실시예 8

본 발명에 따라 변형된 mRNA는 치유 또는 내성장을 촉진시키는 단백질을 임플란트 주변으로 가져옴으로써 치유 과정 또는 내성장을 촉진시킬 수 있도록 하는 데 적합하다. 본 발명에 따라 변형된 mRNA가 티타늄 표면 상의 코팅 형태로 적용된 경우에 안정적으로 장기간 지속적으로 발현된다는 것을 보여주기 위해, 루시퍼라제 코딩 mRNA를 함유하는 코팅을 티타늄 플레이트 상에 적용시켰다. 이어서, 루시퍼라제가 세포 주변에서, 세포가 없는 곳에서, 또는 세포에서 검출될 수 있는지 여부, 또는 그의 검출 기간에 대하여 조사하였다.

상이한 단백질을 코딩하는 2개의 서열, 즉, 주변으로 방출되는 단백질, 예를 들어, 성장 인자 또는 혈관형성 인자에 대한 모델로서, 루시퍼라제를 발현하는 세포로부터 분비된 루시퍼라제에 대한 RNA를 본 실험을 위해 사용하였다. 추가로, 세포에서의 몇몇 종류의 효과를 발휘하도록 하는 단백질에 대한 모델로서 세포에서 분비되지는 않고, 세포에 그대로 남아있는 루시퍼라제를 코딩하는 RNA를 사용하였다. 분비 모델을 위해, 야생형과 비교하여 25%의 우리딘 단위가 s2U로 대체되고, 25%의 시티딘 단위가 m5C로 대체된 것인 메트리디아(Metridia) 루시퍼라제를 코딩하는 RNA를 사용하였다. 비-분비 단백질 모델을 위해, 유사하게 25%의 우리딘 단위가 s2U로 대체되고, 25%의 시티딘 단위가 m5C로 대체된 것인 반딧불이 루시퍼라제-코딩 mRNA를 사용하였다.

중합체와의 복합체로서 보호된, 본 발명에 따른 mRNA 제제는 코팅 물질로부터 유리된 후에도 활성 상태로 남아 있었고, 장기간 동안에 걸쳐 발현된 것으로 나타났다. 본 발명에 따라 변형된 mRNA에 의해 코딩된 각각의 단백질이 장기간 동안에 걸쳐 검출될 수 있는 것으로 나타났다.

상기 시험을 위해, 중합체 복합체에 의해 보호된 본 발명에 따라 변형된 mRNA를 티타늄 플레이트 상의 층으로서 적용된 캐리어 물질 중에 포매시켰다. 캐리어 물질은 상기 목적용으로서 주지된 물질인 폴리락티드 (PDLLA)였는데, 이는 함유된 mRNA를 선택적으로 서서히 방출시킬 수 있다. 상기 코팅이 가지는 장점은 방출이 특이적으로 조절될 수 있다는 점이다. 결과를 통해 분해시에 유리된 폴리락티드 단편은 mRNA의 활성을 손상시키지 않으며, 이로써 상기 시스템이 매우 적합한 것으로 나타났다. mRNA 그 자체가 코팅 중합체에 의해 안정화되었다.

본 실험을 위해, 메트리디아 루시퍼라제-코딩 플라스미드 DNA (pDNA) 또는 변형된 mRNA를 사용하였다. 200 ㎕의 H₂O (+ 필요한 경우, 500 ㎍의 락토스) 중 각각 9 ㎍씩의 메트리디아 루시퍼라제 pDNA 또는 이중 변형된 s2U_(0.25)m5C_(0.25) mRNA를 200 ㎕의 H₂O 중 9.4 ㎍의 L-PEI (L-폴리에틸렌이민)와 복합체를 형성하도록 만들었다. 이후, 복합체를 100 ㎕의 코팅 중합체 용액 (2.4 ㎕의 409.1 mM P6YE5C)으로 도입하고, 밤새도록 동결건조시켰다 (코팅 중합체 P6YE5C는 EP 11 98 489에 기술되어 있는 바와 같이 제조하였다). 이후, 복합체를 얼음 상의 72 ㎕의 PDLLA (폴리-DL 락티드)/EtOAc (50 mg/ml PDLLA) 혼합물 중에 현탁시키고, 마이크로포터에 의해 분산시켰다. 96-웰 플레이트 중의 오토클레이브된 티타늄 플레이트 (각각 r = 3 mm, 18 ㎕)를 상기 분산액으로 코팅시켰다. 추가로 밤새도록 동결건조시킨 후, 200 ㎕의 RPMI-1640 배지 중 A549 세포를 첨가하였다 (5,000개의 세포/200 ㎕). 이틀째부터 각 경우에서 50 ㎕의 상등액을 채취하고, 배지를 교체하고, 그 다음날 각각에 대해 100 ㎕의 코엘렌테라진 용액 (0.003 mM 최종 농도)을 수단으로 하여 메트리디아 루시퍼라제 발현을 측정하였다.

추가의 실험에서, 인산칼슘 입자에 증착되고, 이러한 형태로 코팅으로 도입된, 본 발명에 따라 변형된 메트리디아 루시퍼라제-코딩 mRNA의 활성을 시험하였다. 이를 위해, 600 ㎕의 1 x HBS 중 4 ㎍의 메트리디아 루시퍼라제 s2U_(0.25)m5C_(0.25) mRNA를 매번 33 ㎕의 2.5M CaCl₂와 혼합하였다. 30분 후, 96-웰 플레이트 중의 오토클레이브된 티타늄 플레이트 (각각 r = 3 mm, 18 ㎕)를 상기의 것으로 코팅시켰다. 밤새도록 동결건조시킨 후, 200 ㎕의 RPMI-1640 배지 중 A549 세포를 첨가하였다 (5,000개의 세포/200 ㎕). 이틀째부터 50 ㎕의 상등액을 채취하고, 배지를 교체하고, 그 다음날 각각에 대해 100 ㎕의 코엘렌테라진 용액 (0.003 mM 최종 농도)을 수단으로 하여 메트리디아 루시퍼라제 발현을 측정하였다.

상기 결과를 도 15의 다이어그램에서 알 수 있었다. 본 결과를 통해 본 발명에 따라 변형된 mRNA는 중합체 코팅으로 보호되고, 지연 방출형 매트릭스 내로 도입된 후, 티타늄 임플란트 상에 적용된 후에도 여전히 활성을 띤다는 것이 명확하게 나타났다. 추가로, 본 발명에 따라 변형된 mRNA는 생물학상 활성인 상태로 남아 있었고, 이는 연속하여 코딩되는 단백질로 번역되었다. 분비능 또한 유지되었는데, 이는 (분비된 골 성장 인자, 예를 들어, BMP-2에 대한 모델로서) 메트리디아 루시퍼라제가 세포 배양 배지에서 검출될 수 있다는 사실로부터 알 수 있었다. 추가로, 본 결과는 놀랍게도 변형된 mRNA로 이루어진 코팅을 통해 유사한 플라스미드 DNA로 이루어진 티타늄 임플란트 코팅보다 더 높은 단백질 발현을 얻었다는 것을 나타내었다. mRNA/PEI 복합체가 티타늄 임플란트 코팅으로 혼입되기 이전에 코팅 중합체를 제공받을 경우, 코팅 중합체없이 동일한 복합체만을 사용한 경우 (도면에서, 변형된 mRNA/IPEI-P6YE5C로 표시된 것)보다 훨씬 더 높게 단백질 발현이 이루어졌다. 추가로, 그의 생물학적 활성을 상실한 변형된 mRNA 없이 첨가제로서 락토스를 첨가할 수 있다는 것이 밝혀졌다.

본 결과를 통해 인산칼슘 입자 상에 침착된 변형된 mRNA는 그의 활성을 보유하며, 티타늄 임플란트 코팅 중에서 그의 유익한 특성을 발휘할 수 있다는 것도 나타났다. 생물학적 활성이 유지되었다. 인산칼슘은 직접 골 내로 혼입될 수 있기 때문에 특히 중요하다.

상기 언급한 바와 같이, 반딧불이 루시퍼라제-코딩 DNA 또는 RNA를 사용하여 추가의 실험을 수행하였다. 이를 위해, 200 ㎕의 H₂O 중 각각 9 ㎍씩의 반딧불이 루시퍼라제 pDNA 또는 변형된 s2U_(0.25)m5C_(0.25) mRNA를 200 ㎕의 H₂O 중 9.4 ㎍의 L-PEI와 복합체를 형성하도록 만들었다. 이후, 복합체를 100 ㎕의 코팅 중합체 용액 (2.4 ㎕의 409.1 mM P6YE5C)으로 도입하고, 밤새도록 동결건조시켰다. 이후, 복합체를 얼음 상의 72 ㎕의 폴리-DL-락트산(PDLLA)/에틸 아세테이트 (EtOAc) (50 mg/ml PDLLA) 혼합물 중에 용해시키고, 마이크로포터에 의해 분산시켰다. 96-웰 플레이트 중의 오토클레이브된 티타늄 플레이트 (각각 r = 3 mm, 18 ㎕)를 상기 분산액으로 코팅시켰다. 추가로 밤새도록 동결건조시킨 후, 200 ㎕의 RPMI-1640 배지 중 A549 세포를 첨가하였다 (5,000개의 세포/200 ㎕). 이틀째, 1 ㎕의 350 μM D-루시페린을 각 웰에 첨가하고, 20분 동안 인큐베이션시키고, 바이오-영상에 의해 루시퍼라제 발현을 측정하였다. 결과는 도 16에 제시되어 있다. 도 16의 다이어그램으로부터 알 수 있는 바와 같이, 티타늄 임플란트은 본 발명에 따라 변형된 mRNA로 코팅될 수 있으며, 그 기간 동안 mRNA는 또한 추가로 생물학상 활성 상태로 남아 있으며, 코딩되는 단백질로 번역될 수 있었다. 형성된 단백질은 세포내 남아 있고, 세포내에서 검출될 수 있다. 추가로, 본 결과를 통해 변형된 mRNA로 이루어진 코팅을 통해 유사한 플라스미드 DNA로 이루어진 티타늄 임플란트 코팅보다 더 높게 단백질 발현이 이루어진 것으로 나타났다.

실시예 9

본 발명에 따라 변형된 mRNA의 발현을 제어하여 코딩된 단백질이 오직 원하는 세포에서만 발현이 되고, 다른 세포에서는 발현되지 않도록 하기 위해, mRNA 발현이 세포 특이적으로 조절될 수 있도록 마이크로-RNA 결합 부위를 mRNA 내로 혼입시켰다.

이를 위해, 10% FCS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신을 함유하는 MEM에서 HEK293 세포를 배양하였다. 형질감염 24 hr 이전에, 100,000개의 세포/웰을 24웰 플레이트에 파종하였다. 형질감염 직전에 배지를 400 ㎕의 옵티멤 (인비트로겐)으로 대체하였다. 10% FCS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신을 함유하는 RPMI-1640 중에서 U937 세포를 배양하였다. 형질감염 직전에 웰당 400 ㎕의 옵티멤 배지중 800,000개의 U937 세포를 24웰 플레이트에 파종하였다. 옵티멤을 사용하여 각 웰에 대해 100 ng의 EGFP mRNA 및 250 ng의 RFP miRNA-BS mRNA(하기 참조)를 50 ㎕로 희석시켰다. 옵티멤을 사용하여 2 ㎕의 리포펙타민 2000을 50 ㎕로 만들고, 실온에서 5분 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, mRNA 용액을 리포펙타민 2000 용액으로 피펫팅하고, 실온에서 추가의 20분 동안 인큐베이션시켰다. 생성된 용액을 세포를 함유하는 웰로 피펫팅하고, 4 hr 후 페니실린-스트렙토마이신 (5 ㎕)을 첨가하고, 인큐베이터에서 밤새도록 인큐베이션시켰다. 이후, HEK293 세포를 PBS로 세척하고, 300 G로 5 min 동안 원심분리 전 트립신을 첨가하여 웰 바닥으로부터 분리시켰다. U937 세포를 또한 300 G로 5 min 동안 원심분리하였다. 상등액을 제거한 후, 이어서, 각 세포를 PBS로 2회에 걸쳐 세척하였다. 이어서, FACS 분석을 위해 세포를 500 ㎕의 PBS 중에 재현탁시켰다. 도 17의 2개의 다이어그램에서, EGFP 발현 대 RFP 발현의 비를 양성 세포의 개수 (도 17a) 및 평균 RFP 형광 강도 (도 17b)로 나타내었다.

그 결과, 마이크로-RNA 결합 부위를 시험관내에서 전사된 mRNA 내로 혼입함으로써 발현은 세포 특이적으로 조절될 수 있는 것으로 나타났다. RFP miRNA-BS mRNA에서, 짧은 이격 서열에 의해 서로 분리되어 있는 마이크로-RNA 결합 부위 중 4중으로 반복되는 비번역 서열은 RFP 서열로부터 3' 및 폴리A 테일로부터 5'에 위치하였다 (서열 1). 마이크로-RNA 142-3p에 결합하는 마이크로-RNA 결합 부위를 사용하였다. 상기 마이크로-RNA는 조혈 세포, 예를 들어, U937 세포에서는 발현되지만, 다른 기원의 세포, 예를 들어, HEK-293 세포에서는 발현되지 않았다. 예를 들어, U937 세포에서 마이크로-RNA 142-3p가 RFP miRNA-BS mRNA에 결합하였을 때, RNA 간섭에 의해 mRNA의 분해가 개시된다. 그 결과, RFP의 형성은 감소하게 되고, 즉, 보다 소수의 세포가 마이크로-RNA 142-3p가 존재하지 않는 세포에서보다 더 낮은 강도로 RFP를 발현한다. 상기 원리는 또한 본 발명에 따라 변형된 mRNA를 통해 잘 진행된다는 것을 보여주기 위해, U937 및 HEK-293 세포를 각각 EGFP mRNA (마이크로-RNA 결합 부위 함유하지 않음) 및 RFP miRNA-BS mRNA (마이크로-RNA 142-3p에 대한 마이크로-RNA 결합 부위의 4중 직렬 반복부 포함)으로 공-형질감염시킨 후, EGFP 및 RFP 발현을 FACS에 의해 측정하였다. RFP miRNA-BS mRNA는 RNA 간섭에 의해서 HEK-293 세포에서보다는 U937 세포에서 더욱 빠르게 분해된 반면, EGFP mRNA는 2가지 세포 모두에서 동등하게 안정적이었고, EGFP 대 RFP의 비는 U937 세포에서보다는 HEK-293 세포에서 더 높을 것으로 기대된다. 이는 수행된 실험에서 확인할 수 있었다. 다이어그램은 EGFP-양성 세포의 개수에 대해 정규화한 후, RFP-양성 U937 세포의 개수가 HEK-293 세포에서보다도 더 현저하게 낮다는 것을 명백하게 나타내고 있다. 세포 1개당 형성되는 RFP의 양에 대해서도 동일하게 적용된다. 그렇게 얻은 결과는 또한 시험관내에서 전사된 mRNA의 생물학적 활성 규모는 마이크로-RNA 결합 부위의 혼입에 의해 세포에서의 형질감염 후 조절될 수 있다고 명백하게 나타내고 있다. 따라서, mRNA 번역은 mRNA 번역을 원하지 않는 세포에서는 억제될 수 있다. 그를 통해 부작용 또한 감소될 수 있다.

본 실시예의 실험에 사용된 mRNA은 하기 서열 (서열 1)을 가졌다. RFP 서열은 회색 바탕으로 표시되어 있다. 밑줄로 표시된 서열은 이격 서열과 함께 마이크로-RNA 142-3p에 대한 마이크로-RNA 결합 부위의 4중 직렬 반복부를 표시한다. 합성 후, BamHI-EcoRv를 사용하여 서열을 벡터 pVAX1로 클로닝하였다.

참조문헌

SEQUENCE LISTING <110> Ludwig-Maximilians-Universit? <120> RNA mit einer Kombination aus unmodifizierten und modifizierten Nucleotiden zur Proteinexpression <130> LMU100701PCT <140> PCT/EP2010/004681 <141> 2010-07-30 <160> 3 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 868 <212> DNA <213> Artificial, for in vitro transcription <400> 1 ggatccatgg cctcctccga ggacgtcatc aaggagttca tgcgcttcaa ggtgcgcatg 60 gagggctccg tgaacggcca cgagttcgag atcgagggcg agggcgaggg ccgcccctac 120 gagggcaccc agaccgccaa gctgaaggtg accaagggcg gccccctgcc cttcgcctgg 180 gacatcctgt ccccccagtt ccagtacggc tccaaggtgt acgtgaagca ccccgccgac 240 atccccgact acaagaagct gtccttcccc gagggcttca agtgggagcg cgtgatgaac 300 ttcgaggacg gcggcgtggt gaccgtgacc caggactcct ccctgcagga cggctgcttc 360 atctacaagg tgaagttcat cggcgtgaac ttcccctccg acggccccgt aatgcagaag 420 aagactatgg gctgggagcc ctccaccgag cgcctgtacc cccgcgacgg cgtgctgaag 480 ggcgagatcc acaaggccct gaagctgaag gacggcggcc actacctggt ggagttcaag 540 tccatctaca tggccaagaa gcccgtgcag ctgcccggct actactacgt ggactccaag 600 ctggacatca cctcccacaa cgaggactac accatcgtgg agcagtacga gcgcgccgag 660 ggccgccacc acctgttcct gtagctagag tcgactccat aaagtaggaa acactacacg 720 attccataaa gtaggaaaca ctacaaccgg ttccataaag taggaaacac tacatcactc 780 cataaagtag gaaacactac acaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 840 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aagatatc 868 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> artificial, fw primer <400> 2 gcacccagac cgccaagc 18 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> artificial, rv primer <400> 3 atctcgccct tcagcacgc 19

Claims

폴리리보뉴클레오티드가 비변형된 뉴클레오티드 및 변형된 뉴클레오티드의 조합을 함유하고, 여기서, 5 내지 50%의 우리딘 뉴클레오티드 및 5 내지 50%의 시티딘 뉴클레오티드가 각각 변형된 우리딘 뉴클레오티드 및 변형된 시티딘 뉴클레오티드이고, 변형된 우리딘 뉴클레오티드가 2-티오우리딘 또는 4-티오우리딘이고 변형된 시티딘 뉴클레오티드가 5-메틸시티딘인, 단백질 또는 단백질 단편을 코딩하는 서열을 가진 폴리리보뉴클레오티드를 이용한 치료 방법.