JP2015211676A - タンパク質発現用未修飾および修飾ヌクレオチドの組み合わせを有するｒｎａ - Google Patents

Abstract

【課題】未修飾ヌクレオチドおよび修飾ヌクレオチドの組み合わせを含有するタンパク質発現用メッセンジャーＲＮＡならびに疾患の治療および診断方法のための前記ＲＮＡを提供する。【解決手段】タンパク質またはタンパク質断片をコードする配列を有し、未修飾ヌクレオチドと修飾ヌクレオチドの組み合わせを含み、ウリジンヌクレオチドの５〜５０％およびシチジンヌクレオチドの５〜５０％が修飾ウリジンヌクレオチドまたは修飾シチジンヌクレオチドであるポリリボヌクレオチド。【選択図】図１Ａ

Description

本発明は、ポリリボヌクレオチド、具体的には、未修飾ヌクレオチドおよび修飾ヌクレ
オチドの組み合わせを含有するタンパク質発現用メッセンジャーＲＮＡならびに疾患の治
療および診断方法のための前記ＲＮＡの使用に関する。

メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）は、ヌクレオシドとして主にアデノシン、シチジン
、ウリジンおよびグアノシンを有するヌクレオシドリン酸ビルディングブロックで組み立
てられており、中間担体として細胞核内のＤＮＡからＤＮＡがタンパク質へと翻訳される
細胞質へと遺伝情報を運ぶポリマーである。よって、前記メッセンジャーＲＮＡは、遺伝
子発現のための代替手段として適する。

細胞内の生化学的過程の解明およびヒトゲノムの解明は、欠損遺伝子と疾患との間の関
係を明らかにしてきた。従って、遺伝子治療によって欠損遺伝子による疾患を治療するこ
とが長い間望まれている。期待は高かったが、これに対する試みは概して失敗した。遺伝
子治療についての最初のアプローチは、欠損遺伝子または欠陥遺伝子の無傷のＤＮＡの発
現を達成するために、ベクターで前記無傷のＤＮＡを細胞核へと持ち込んで、存在しない
または欠陥のあるタンパク質を供給することにある。これらの試みは概して成功せず、成
功しないこれらの試みは実質的な副作用、具体的には腫瘍発生の増加に阻まれた。

さらに、遺伝子欠損に起因しないタンパク質の不足またはタンパク質欠陥による疾患が
存在する。そのような事例でも、考えられるのは、ＤＮＡの投与により生体内（ｉｎ ｖ
ｉｖｏ）で関連タンパク質を生産することである。代謝において役割を果たし且つ病理的
または非病理的な理由で破壊されるまたは阻害される因子の供給も、副作用の無いまたは
低い核酸療法によってもたらされ得る。

疾患につながる遺伝子欠損の治療のための、遺伝性疾患治療法へのｍＲＮＡの使用もす
でに提案されている。これにおける利点は、ｍＲＮＡのみが細胞の細胞質へと導入され、
核内へは導入されないことである。核内への挿入は困難であり、効率的でない。さらに、
ベクターまたはその一部がゲノム内へ組み込まれるならば、染色体ＤＮＡの変化が生じる
、かなりのリスクが存在する。

確かに、生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で転写したメッセンジャーＲＮＡを実際に哺乳動
物組織中で発現させることができることは示されているが、疾患の治療にｍＲＮＡを使用
する試みにはさらなる障害が生じる。ｍＲＮＡの安定性の欠如は、哺乳動物組織中で所望
のタンパク質が充分な量で利用できなくなるという問題を生じる。さらに、ｍＲＮＡがか
なりの免疫反応の引き金となる事実から、実質的な欠点が生じる。これらの強い免疫応答
はＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８およびヘリカーゼＲＩＧ−１などのＴｏｌｌ様レセプタ
ーとの結合を通じて生じることが推測される。

免疫反応を防ぐために、国際公開第２００７／０２４７０８号では、４つのリボヌクレオチドのうちの１つが修飾ヌクレオチドにより置き換えられたＲＮＡを使用することが提案された。具体的には、ウリジンがシュードウリジンにすべて置き換えられた場合にｍＲＮＡがどのようにふるまうかが研究された。そのようなＲＮＡ分子は、免疫原性が著しく低いことが見出された。しかしながら、これらの産物の生物学的活性は成功する治療には、未だ不充分であった。さらに、修飾により２つ以上の種類のヌクレオチドが完全に置き換えられたＲＮＡ配列は、苦労して作製できるまたは少しも作製できないことが見出された。

核酸を用いて、必要なもしくは有益なタンパク質を身体に供給することおよび／または
存在しないもしくは不足しているタンパク質による疾患を治療することを可能にするため
に、細胞にトランスフェクションできて、長期間細胞内に安定にとどまり充分な量のタン
パク質を供給して過度に頻繁な投与が避けられる核酸を利用可能にすることが望ましい。
しかしながら、同時に、その核酸は有意な程度の免疫応答を引き起してはならない。

国際公開第２００７／０２４７０８号明細書

従って、本発明の目的は、免疫応答の著しい減少を引き起こすか、または免疫応答の引
き金とならず生理的環境下で安定な、欠損遺伝子もしくは欠陥遺伝子によって引き起こさ
れる疾患または存在しないもしくは欠陥のあるタンパク質によって引き起こされる疾患の
治療に適するか、または必要もしくは有益なタンパク質をｉｎ ｖｉｖｏで生産できる薬
剤、すなわち、投与後ただちに分解されずに全体が治療用薬剤として適切である薬剤を提
供することであった。さらに、本発明の目的は、タンパク質のｉｎ ｖｉｖｏ生産により
プラスに影響され得る疾患の治療用薬剤を提供することであった。

この課題は、請求項１に規定するようなポリリボヌクレオチドを用いて解決される。特
に適するのは、その欠陥もしくは欠如が身体にとって不利である、またはその発現が身体
にとって有利である、タンパク質またはタンパク質断片をコードするｍＲＮＡである。用
語「ポリリボヌクレオチド」または「ｍＲＮＡ」が以下で用いられる場合は、文脈上他の
意味が提示される場合を除き、ポリリボヌクレオチドまたはｍＲＮＡが、病気もしくは上
述したような欠陥に関連したタンパク質もしくはタンパク質断片をコードするか、または
身体にとって有益もしくは支援的なタンパク質もしくはタンパク質断片をコードする、ポ
リリボヌクレオチドまたはｍＲＮＡであることを、常に前提とすべきである。

驚くべきことに、先に述べた課題が、次記のような場合に、リボ核酸またはポリリボヌ
クレオチド（以下では一般にＲＮＡとも呼ぶ）、具体的にはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲ
ＮＡ）を用いて解決できることが見出された。すなわち、未修飾ヌクレオチドと修飾ヌク
レオチドの両方を含有し、所定の含量のウリジンヌクレオチドおよびシチジンヌクレオチ
ドがそれぞれ修飾形態で存在するＲＮＡが用いられる場合である。

さらに驚くべきことに、２種類のヌクレオチドが各々修飾ヌクレオチドで部分的に置き
換えられたＲＮＡは、高い翻訳およびトランスフェクション効率を示すこと、すなわち、
前記ＲＮＡは既知のＲＮＡを用いて可能であったよりも多くの細胞に感染して１細胞当た
りより多くのコード化タンパク質を生産することが観察された。加えて、本発明に従って
修飾したＲＮＡは、最先端技術に由来する既知の修飾ＲＮＡまたは未修飾ＲＮＡよりも長
時間活性を持つ。

本発明のＲＮＡで達成される効果は、未修飾ＲＮＡであっても完全に修飾したＲＮＡであっても得られない。ｍＲＮＡ中の修飾ウリジンヌクレオチドおよび修飾シチジンヌクレオチドの含量は特異的に設定され、各々につき５％以上５０％以下である場合に、低下した免疫原性と上昇した安定性との双方が達成できることを見出した。修飾なしでｍＲＮＡを用いる場合は、そのｍＲＮＡは極端に高い免疫原性を示し、一方、すべてのウリジンヌクレオチドおよびシチジンヌクレオチドが修飾形態で存在する場合には、治療目的を可能にするための使用としては、生物学的活性が低くなりすぎる。修飾ヌクレオチドの含量が非常に高いＲＮＡは、非常に困難な条件下で生産することができるか、少しも生産できない。例えば、ウリジンの代わりのシュードウリジンのみと修飾シトシンおよび／または修飾アデノシンのみを含有するヌクレオチド混合物は、いずれのＲＮＡ配列も生じることができないことが実証されている。しかしながら、驚くべきことに、本発明の様式で修飾されたＲＮＡ配列は、妥当な効率で容易に生産することができる。

加えて、修飾の性質が重要であることを見出した。本発明に従って修飾したｍＲＮＡは
、低い免疫原性を示し、長い存続期間を有する。

本発明のＲＮＡの安定性が以前に使用された核酸に比べて著しく上昇していることが見
出された。このように、本発明のｍＲＮＡは、トランスフェクション後、１０日間未修飾
ＲＮＡよりも１０倍も多い量で検出可能であることが実証された。治療目的のための本発
明のｍＲＮＡの使用は、高いトランスフェクション率だけでなく、中でも存続期間の延長
を可能にし、高い安定性とそれによる長い存続期間が、患者に許容可能なさらに長時間間
隔での投与を達成することを可能にする。

このように、本発明は、治療目的で特に有用な薬剤を提供する。本発明のＲＮＡは、Ｒ
ＮＡが細胞質へのみ導入されて細胞核へ導入されずにその活性を発揮することが必要であ
り、ゲノムへの組み込みの危険性が存在せず、本発明の種類の修飾が免疫反応を幅広く予
防し、加えて前記修飾が本発明のＲＮＡを急速な分解から保護するという、治療に用いら
れる生成物に存在する要求を満足する。従って、本発明のＲＮＡを用いて、組織中の生理
的機能を生じさせることまたは再生させること、例えば、欠損遺伝子もしくは欠陥遺伝子
のせいで機能していなかったｉｎ ｉｖｏの機能を回復させ、よって欠損遺伝子もしくは
欠陥遺伝子によって引き起こされた疾患を治療することを可能にする。さらに、驚くべき
ことに、本発明のポリリボヌクレオチドは、疾患の経過に直接的にまたは間接的に影響を
有することができるタンパク質がｉｎ ｖｉｖｏで生産されることから、疾患に好都合に
影響を与えることができることを見出した。従って、本発明によると、一般的なまたは特
異的な状況で身体に有益または支援的である因子、例えば増殖因子、血管形成因子、刺激
物質、誘導物質、酵素または他の生物学的活性分子をコードするポリリボヌクレオチドを
提供することもできる。

次の記載および添付図面において、本発明をより詳細に説明する。

図１は、種々のｍＲＮＡの免疫原性および安定性に対する異なるヌクレオチド修飾の効果を表す。図１Ａは、様々に修飾されたヌクレオチドを有する種々のＲＮＡの投与後のＴＮＦ−αレベルをプロットした図である。未修飾ＲＮＡおよび２５％以下の一重修飾ＲＮＡは高レベルの炎症マーカーをもたらし、そのＲＮＡの高い免疫原性を示すが、一方、本発明の二重に修飾したＲＮＡについては炎症マーカーが許容量で存在する。 図１は、種々のｍＲＮＡの免疫原性および安定性に対する異なるヌクレオチド修飾の効果を表す。図１Ｂは、種々の方法で修飾したｍＲＮＡの生物学的活性（トランスフェクション効率および発現）を、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）について陽性である細胞のパーセンテージおよび１細胞あたりのＲＦＰ量として、ヒト細胞およびマウス細胞において表す。この図は、未修飾ＲＮＡ、一重修飾ＲＮＡおよび完全修飾ＲＮＡによってコードされたタンパク質が低い含有率でのみ検出できた一方で、本発明に従って部分的に二重に修飾したＲＮＡはその高い安定性のおかげで著しく高いタンパク質量を生じることを示す。 図１は、種々のｍＲＮＡの免疫原性および安定性に対する異なるヌクレオチド修飾の効果を表す。図１Ｃは、種々の方法で修飾したｍＲＮＡの生物学的活性（トランスフェクション効率および発現）を、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）について陽性である細胞のパーセンテージおよび１細胞あたりのＲＦＰ量として、ヒト細胞およびマウス細胞において表す。この図は、未修飾ＲＮＡ、一重修飾ＲＮＡおよび完全修飾ＲＮＡによってコードされたタンパク質が低い含有率でのみ検出できた一方で、本発明に従って部分的に二重に修飾したＲＮＡはその高い安定性のおかげで著しく高いタンパク質量を生じることを示す。 図２は、多重修飾ｍＲＮＡについての発現の高い安定性および長い持続期間を表す。図２Ａは、種々の修飾ｍＲＮＡおよび未修飾ｍＲＮＡの発現の持続期間がプロットされた図を表す。データは、本発明に従って二重修飾したＲＮＡが高い安定性と低い免疫原性との組み合わせを示すことを表す。 図２は、多重修飾ｍＲＮＡについての発現の高い安定性および長い持続期間を表す。図２Ｂは、種々の修飾ｍＲＮＡおよび未修飾ｍＲＮＡの発現の持続期間がプロットされた図を表す。データは、本発明に従って二重修飾したＲＮＡが高い安定性と低い免疫原性との組み合わせを示すことを表す。 図２は、多重修飾ｍＲＮＡについての発現の高い安定性および長い持続期間を表す。図２Ｃは、未修飾ＲＮＡ、一重修飾ＲＮＡおよび多重修飾ＲＮＡについてのＲＮＡ免疫沈降のデータを表す。データは、本発明に従って二重修飾したＲＮＡが高い安定性と低い免疫原性との組み合わせを示すことを表す。 図２は、多重修飾ｍＲＮＡについての発現の高い安定性および長い持続期間を表す。図２Ｄは、種々のｍＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏ静脈内投与後の免疫原性をプロットした図を表す。データは、本発明に従って二重修飾したＲＮＡが高い安定性と低い免疫原性との組み合わせを示すことを表す。 図３は、ＳＰ−Ｂ条件的欠損マウスにおける修飾ＳＰ−ＢｍＲＮＡの気管内エアゾール散布後に得られた種々のテスト結果を表す。図３Ａは、未修飾ＲＮＡおよび多重修飾ＲＮＡで処理したマウスの肺の生物発光画像を表す。本発明に従って修飾したＲＮＡによってのみ５日後も充分な量のタンパク質が依然として発現しており、一方で未修飾ＲＮＡを用いた発現は３日後すでに低下していることを明らかに示すことができる。 図３は、ＳＰ−Ｂ条件的欠損マウスにおける修飾ＳＰ−ＢｍＲＮＡの気管内エアゾール散布後に得られた種々のテスト結果を表す。図３Ｂは、トランスフェクション後の時間に対する流量（フラックス）のプロット図を表す。本発明の修飾は発現の持続期間を延長することを明らかに理解することができる。 図３は、ＳＰ−Ｂ条件的欠損マウスにおける修飾ＳＰ−ＢｍＲＮＡの気管内エアゾール散布後に得られた種々のテスト結果を表す。図３Ｃは、ＳＰ−ＢｍＲＮＡの投与計画を表す。 図３は、ＳＰ−Ｂ条件的欠損マウスにおける修飾ＳＰ−ＢｍＲＮＡの気管内エアゾール散布後に得られた種々のテスト結果を表す。図３Ｄは、コントロールｍＲＮＡで処理したマウスと比較した修飾ｍＲＮＡで処理したマウスの生存率を表し、本発明のＲＮＡで処理したマウスにおける生存率が顕著に長いことを示している。 図３は、ＳＰ−Ｂ条件的欠損マウスにおける修飾ＳＰ−ＢｍＲＮＡの気管内エアゾール散布後に得られた種々のテスト結果を表す。図３Ｅは、ＳＰ−Ｂをコードする本発明のＲＮＡを用いてＳＰ−Ｂ欠損マウスでＳＰ−Ｂを再構成できたことを示すことができる免疫染色を表す。 図３は、ＳＰ−Ｂ条件的欠損マウスにおける修飾ＳＰ−ＢｍＲＮＡの気管内エアゾール散布後に得られた種々のテスト結果を表す。図３Ｆは、細胞を含まないＢＡＬＦ上清中のタンパク質の分布を解析する半定量的ウエスタンブロットの結果を表す。 図３は、ＳＰ−Ｂ条件的欠損マウスにおける修飾ＳＰ−ＢｍＲＮＡの気管内エアゾール散布後に得られた種々のテスト結果を表す。図３Ｇは、図３Ｃに従って処理したマウス由来の肺組織検査標本および気管支肺胞洗浄標本の画像を表す。コントロールＲＮＡを与えられたマウス由来の肺標本および洗浄標本はＳＰ−Ｂ欠損のために通常の肺損傷を示したが、本発明のＲＮＡで処理したマウス由来の標本は病的でなかった。 図３は、ＳＰ−Ｂ条件的欠損マウスにおける修飾ＳＰ−ＢｍＲＮＡの気管内エアゾール散布後に得られた種々のテスト結果を表す。図３Ｈは、図３Ｃに従って処理したマウス由来の肺組織検査標本および気管支肺胞洗浄標本の画像を表す。コントロールＲＮＡを与えられたマウス由来の肺標本および洗浄標本はＳＰ−Ｂ欠損のために通常の肺損傷を示したが、本発明のＲＮＡで処理したマウス由来の標本は病的でなかった。 図３は、ＳＰ−Ｂ条件的欠損マウスにおける修飾ＳＰ−ＢｍＲＮＡの気管内エアゾール散布後に得られた種々のテスト結果を表す。図３Ｉは、経時的な肺の耐性に関する図を表す。本発明のＲＮＡでの処理に対して長期間にわたり肺機能が保持されていたが、一方、コントロールＲＮＡで処理した動物では肺損傷が見られた。 図４は、未修飾ｍＲＮＡおよび様々に修飾したｍＲＮＡについて、産生したＲＦＰの蛍光強度を時間に対するプロット図を表す。修飾ｍＲＮＡは、未修飾ｍＲＮＡと比較して、遅れて弱く翻訳される。 図５は、異なるｍＲＮＡで処理したマウスの炎症マーカーをプロットした３つの図を示す。本発明に従って修飾したＲＮＡは炎症反応を引き起こさないが、一方で未修飾ＲＮＡは強い免疫反応をもたらすことを明らかに理解することができる。 図６は、本発明の異なるｍＲＮＡで処理したマウスの異なる種類の肺標本がプロットされた図を表す。パラメータは、組織弾性（ＨＬ）、組織減衰(tissue damping)（ＧＬ）、組織慣性 (tissue inertia)、気道抵抗（Ｒｎ）および肺組織組成Ｅｔａ（ＧＬ／ＨＬ）である。本発明のＲＮＡについて、ポジティブコントロール群と比較して悪化したパラメータはなかった。 図７は、異なる含量の修飾ヌクレオチドを有するｍＲＮＡについてＲＦＰ陽性細胞の含有率をプロットした図で、異なる含量の修飾ヌクレオチドを有するｍＲＮＡの発現能力を表す。この比較は、本発明に従って修飾したｍＲＮＡのみが長期にわたる発現をもたらし、一方、本発明に従って修飾していないｍＲＮＡはヒト細胞でもマウス細胞でもより少ない程度で発現することを示している。 図８は、様々に修飾したヌクレオチドを有するｍＲＮＡについてＲＦＰ陽性細胞の含有率をプロットした図で、様々に修飾したｍＲＮＡの発現能力を表す。この比較は、本発明に従って修飾したｍＲＮＡのみが長期にわたる発現をもたらし、一方で、本発明に従って修飾していないｍＲＮＡはヒト細胞でもマウス細胞でもより少ない程度で発現することを示している。 図９は、凍結乾燥した本発明のｍＲＮＡの安定性を表す。 図１０Ａは、種々の修飾ヌクレオチドについてトランスフェクション効率をプロットした図を表す。最高のトランスフェクション効率は１０％のウリジンヌクレオチドと１０％のシチジンヌクレオチドと任意により５％のさらなるヌクレオチドも修飾したＲＮＡで実現されることが明らかに理解できる。 図１０Ｂは、免疫反応のマーカーとしてのＴＮＦ−α産生を様々に修飾したヌクレオチドを有するＲＮＡについてプロットした図を表す。これらは、各々５μｇのｍＲＮＡでトランスフェクションしたヒトＰＢＭＣのＥＬＩＳＡの結果である。他に明記しない限り、各々における修飾率は１０％であった。５％〜５０％のウリジンヌクレオチドおよびシチジンヌクレオチドが修飾されたＲＮＡは未修飾ＲＮＡと比較して顕著に低下した免疫原性を有することが明らかに理解できる。 図１１は、本発明に従って修飾したＥＰＯをコードするｍＲＮＡの安定性および免疫原性を測定した種々の試験結果を表す。図１１（ａ）は、異なる方法で修飾したＥＰＯをコードするｍＲＮＡの投与後１４日目に検出可能なエリスロポエチンの含量を表す。本発明に従って修飾したｍＲＮＡを注射したマウスでの１４日後のＥＰＯ含量は、未処理マウスにおけるよりも４．８倍高いが、未修飾ＲＮＡで処理したマウスにおけるよりも４．８倍高く且つ一重修飾ＲＮＡで処理したマウスにおけるよりも依然として２．５倍高いことが明らかに理解できる。 図１１は、本発明に従って修飾したＥＰＯをコードするｍＲＮＡの安定性および免疫原性を測定した種々の試験結果を表す。図１１（ｂ）は、異なる修飾を有するＥＰＯコードｍＲＮＡの投与後１４日目および２８日目のヘマトクリット値を表す。この図は、本発明に従って修飾したｍＲＮＡで処理したマウスがかなり高いヘマトクリット値を有することを明らかに示している。 図１１は、本発明に従って修飾したＥＰＯをコードするｍＲＮＡの安定性および免疫原性を測定した種々の試験結果を表す。図１１（ｃ）の図において、免疫反応に典型的な因子の産生をプロットする。未修飾ｍＲＮＡの投与で４つの炎症マーカーがすべて上昇しているが、一方で、本発明に従って修飾したＲＮＡでは免疫反応がほとんど検出不可能であったことが分かる。 図１１は、本発明に従って修飾したＥＰＯをコードするｍＲＮＡの安定性および免疫原性を測定した種々の試験結果を表す。図１１（ｄ）の図は、炎症マーカーでもあるＩＦＮ−αおよびＩＬ−１２についての対応する値を表す。ここで、本発明に従って修飾したｍＲＮＡは、未修飾ｍＲＮＡと対照的に、ほとんど免疫反応を引き起こさないことも分かる。 図１２は、本発明に従って修飾されたＳＰ−Ｂ ｍＲＮＡを１週間で２回（Ｂ）もしくは２８日間のうち１週間あたり２回（Ｃ）与えられた、または修飾ＥＧＦＰＬｕｃ ｍＲＮＡを与えられた比較群（Ａ）の３群のマウスの生存率をプロットした図を表す。ＳＰ−Ｂ ｍＲＮＡを与えられた間のみマウスが生存していることが分かる（Ｂ、Ｃ）。ＳＰ−Ｂ ｍＲＮＡの供給がなければ、マウスは死亡する（Ａ）。 図１３は、未修飾ＳＰ−Ｂ ｍＲＮＡ、本発明に従って修飾したＳＰ−Ｂ ｍＲＮＡまたはＳＰ−ＢプラスミドＤＮＡの投与８時間後のマウスの気管支肺胞洗浄でのサイトカインレベルを表す。この結果は、各々が炎症マーカーＩＦＮγおよびＩＬ−１２の顕著な上昇をもたらす未修飾ｍＲＮＡまたはプラスミドＤＮＡの気管内投与と対照的に、本発明に従って修飾したＳＰ−Ｂ ｍＲＮＡの投与ではそれらの炎症マーカーは、パーフルオロカーボン処理群または未処理群と比較して実際には上昇しなかったことを示している。 図１４は、本発明に従って修飾したｍＥＰＯ ｍＲＮＡの反復投与後に得られたヘマトクリット値を表す。この結果は、本発明に従って修飾したｍＥＰＯ ｍＲＮＡの反復投与が充分に許容され、ヘマトクリットの長期持続的な上昇をもたらすことを示している。 図１５は、本発明に従って修飾した異なる形態のＲＮＡを含有するコーティングが与えられたチタンインプラントと共にインキュベーションした細胞のルシフェラーゼ発現を表す。チタンプレート上に塗布された遅延放出ポリマーのコーティング中に含まれ且つ前記コーティングから徐々に放出された本発明に従って修飾したＲＮＡは、その活性を失わなかったことが分かった。 図１６は、チタンインプラント上に塗布したコーティングに含まれる修飾ｍＲＮＡのルシフェラーゼ発現を表す。本発明に従って修飾したｍＲＮＡのタンパク質発現は未処理ＲＮＡのタンパク質発現よりもはるかに多かったが、またプラスミドＤＮＡのタンパク質発現よりも多かったことが分かった。 図１７Ａおよびそれぞれ、マイクロＲＮＡ１４２−３ｐに対するマイクロＲＮＡ結合部位を有するｍＲＮＡについてのＲＦＰ陽性細胞の相対含量を表す。マイクロＲＮＡ結合部位を有するＲＮＡについてＲＦＰ陽性細胞の含量が低かったことが分かった。 図１７Ｂは、マイクロＲＮＡ１４２−３ｐに対するマイクロＲＮＡ結合部位を有するｍＲＮＡの相対ＲＦＰ発現を表す。対応するマイクロＲＮＡ１４２−３ｐを含有する細胞でのコードタンパク質の発現がかなり低かったことが分かった。 図１８は、マイクロＲＮＡ結合部位の組み込みによって修飾した、ＲＦＰをコードするＲＮＡの配列を表す。ＲＦＰ配列は、灰色の背景で示す。スペーシング配列を有するマイクロＲＮＡ１４２−３ｐに対するマイクロＲＮＡ結合部位（薄灰色の背景を有する）の４回縦列反復に下線を引く。

本発明によると、部分的に多重修飾したヌクレオチドを有するポリリボヌクレオチド分
子、部分的に修飾したｍＲＮＡ、ＩＶＴ ｍＲＮＡ、および 欠損遺伝子もしくは欠陥遺
伝子による疾患の治療用または因子、刺激物質、誘導物質または酵素などのタンパク質の
ｉｎ ｖｉｖｏ供給により緩和もしくは治癒することができる疾患の治療用薬剤の製造の
ためのＲＮＡ分子の使用が提供される。さらなる態様において、本発明のｍＲＮＡは、関
連する細胞においてのみ所望のｍＲＮＡの作用を可能にするために、標的結合部位、標的
とする配列および／またはマイクロＲＮＡ結合部位と組み合わされる。さらなる態様にお
いて、本発明のＲＮＡは、３’ポリＡ尾部の下流のマイクロＲＮＡまたはｓｈＲＮＡと組
み合わされる。さらなる態様において、さらに特異的な修飾によって、作用の持続期間が
調節されたまたは延長されたＲＮＡが提供される。

このように、本発明の主題は、上昇した安定性と低下した免疫原性とを有するＲＮＡで
ある。本発明のＲＮＡは、それ自体が既知の様式で作製することができる。概して、前記
ＲＮＡは、病気に影響を与えることができるか、またはその不足もしくは欠損形態が疾患
を引き起こす、無傷のタンパク質または所望のタンパク質をコードするＤＮＡの転写によ
って作製される。

本発明の文脈上、ＲＮＡとは、細胞内へ入った場合に、タンパク質もしくはタンパク質
断片の発現に適するか、またはタンパク質もしくはタンパク質断片へ翻訳可能である、ポ
リリボヌクレオチド分子を意味すると理解すべきである。本明細書中の用語「タンパク質
」は、いずれもの種類のアミノ酸配列、すなわち、各々がペプチド結合を介して連結され
た２個以上のアミノ酸の鎖を包含し、ペプチドおよび融合タンパク質も含む。

本発明のＲＮＡは、細胞内または細胞の近傍で機能が必要とされるか、もしくは有益で
ある、タンパク質またはタンパク質断片、例えば、細胞内もしくは細胞の近傍で、その不
足もしくは欠陥形態が疾患もしくは病気を引き起こすタンパク質、または身体にとって有
益な過程を促進することができるタンパク質、をコードするリボヌクレオチド配列を含む
。概して、本発明のＲＮＡは、完全なタンパク質またはその機能性変異体の配列を含む。
さらに、前記リボヌクレオチド配列は、因子、誘導物質、刺激物質もしくは酵素またはそ
れらの機能性断片として働くタンパク質であって、疾患、特には代謝性疾患を治療するた
めまたは新しい血管の形成などのｉｎ ｖｉｖｏの過程などを開始するためにその機能が
必要なものであるタンパク質をコードすることができる。本明細書中、機能性変異体とは
、細胞内での機能が必要とされるか、またはその不足もしくは欠陥形態が病理的であるタ
ンパク質の機能を、細胞内で発揮できる断片を意味すると理解される。加えて、本発明の
ＲＮＡは、さらなる機能性領域および／または３’もしくは５’非コード領域も有するこ
とができる。前記３’および／または５’非コード領域は、コードタンパク質に天然に隣
接する領域またはＲＮＡの安定化に貢献するその他の人工配列とすることができる。当業
者であれば、各事例においてこの目的に適切な配列をありふれた実験によって発見するこ
とができる。

好ましい態様において、ＲＮＡは、特に翻訳を向上させるために、ｍ７ＧｐｐｐＧキャ
ップ、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）および／または３’末端のポリＡ尾部を含む
。ＲＮＡは、翻訳を促進する領域をさらに含むことができる。本発明のＲＮＡにとって重
要なのは、その修飾ヌクレオチドの含量である。

上昇した安定性と低下した免疫原性とを有する本発明のＲＮＡは、その生産のために修
飾シチジンヌクレオチドおよび修飾ウリジンヌクレオチドの含量が設定されたヌクレオチ
ド混合物を用いることによって得られる。本発明のＲＮＡは、好ましくは、未修飾ヌクレ
オチドと修飾ヌクレオチドとの両方を含むヌクレオチド混合物を用いて生成し、該ヌクレ
オチド混合物においては、５％〜５０％のシチジンヌクレオチドおよび５％〜５０％のウ
リジンヌクレオチドが修飾されている。アデノシン含有ヌクレオチドおよびグアノシン含
有ヌクレオチドを用いることもできる。いくらかのＡＴＰおよび／またはＧＴＰをも修飾
されたヌクレオチド混合物を用いることもできるが、、その修飾が存在する場合、その含
量は２０％を超えるべきでなく、好ましくは０．５％〜１０％の範囲内とすべきである。

従って、好ましい態様において、５％〜５０％の修飾シチジンヌクレオチドおよび５％
〜５０％のウリジンヌクレオチドおよび５０％〜９５％の未修飾シチジンヌクレオチドお
よび５０％〜９５％の未修飾ウリジンヌクレオチドを有するｍＲＮＡが提供され、アデノ
シンヌクレオチドおよびグアノシンヌクレオチドは、未修飾であってもまたは部分的に修
飾されていてもよく、好ましくは 未修飾形態で存在する。

好ましくは１０％〜３５％のシチジンヌクレオチドおよびウリジンヌクレオチドが修飾
され、特に好ましくは修飾シチジンヌクレオチドの含量が７．５％〜２５％の範囲内であ
り、修飾ウリジンヌクレオチドの含量が７．５％〜２５％の範囲内である。本発明の修飾
が存在する前提条件下で、相対的に低い含量の、例えば各１０％のみの修飾シチジンおよ
びウリジンヌクレオチドは実際に所望の特性を達成できることが見出された。

ヌクレオシドの修飾の性質は安定性に対する効果を有し、従って、ｍＲＮＡの存続期間
および生物学的活性に効果を有する。適切な修飾を下記の表に提示する。

本発明のＲＮＡについて、ウリジンヌクレオチドとシチジンヌクレオチドのいずれか一
方の全てを、同じ形態へと各々修飾することもでき、各々について、修飾ヌクレオチドの
他の混合物を用いることもできる。修飾ヌクレオチドは、天然に存在する修飾を有するこ
ともでき、または天然に存在しない修飾を有することもできる。種々の修飾ヌクレオチド
の混合物を用いることができる。このように、例えば、修飾ヌクレオチドのある部分が天
然の修飾を有することもでき、一方で別の部分が天然に存在しない修飾を有するか、また
は天然に存在する修飾ヌクレオチドおよび／もしくは天然に存在しない修飾ヌクレオチド
の混合物を用いることができる。また、修飾ヌクレオチドの一部が塩基修飾を有すること
ができ、別の部分が糖修飾を有することもできる。同様に、全ての修飾が塩基修飾である
、または全ての修飾が糖修飾である、またはそれらの適切な混合物のいずれかであること
が可能である。修飾のバリエーションによって、本発明のＲＮＡの作用の安定性および／
または持続期間を選択的に調節することができる。

本発明の一態様において、少なくとも２つの異なる修飾が１つの種類のヌクレオチドに
用いられ、その１つの種類の修飾ヌクレオチドは官能基を有し、該官能基を介してさらな
る基が付着される。異なる基の付着のための結合部位を提供するために、異なる官能基を
有するヌクレオチドを用いることもできる。従って、例えば、一部の修飾ヌクレオチドが
、アジド基、アミノ基、ヒドロキシ基、チオール基または所定の条件下での反応に適切な
他の反応基を持つことができる。官能基は、天然に存在する結合可能な基をある種の条件
下で活性化することができるものであって、よって機能を有する分子を結合することがで
きるものとしてもよい。結合部位を提供するように修飾されたヌクレオチドを、アデノシ
ンまたはグアノシン修飾として導入することもできる。特定の適切な修飾の選択および利
用可能となる結合部位の選択は、どのような基が導入されるか、およびどのような頻度で
存在するかに依存する。従って、官能基および／または活性化基を提供されるヌクレオチ
ドの含量は、結合される基がどの程度高い含量で存在するかに依存し、当業者が容易に決
定することができる。概して、官能基および／または活性化基で修飾されたヌクレオチド
の含量は、存在するならば、修飾ヌクレオチドの１％〜２５％である。当業者であれば、
必要に応じて、各事例における最も適切な基およびその最適含量を、通常なし得る実験に
よって決定することができる。

本発明のＲＮＡが、修飾ウリジン含有ヌクレオチドとして２’-チオウリジンを用いた
場合に特に良好な結果を達成することができることが見出された。さらに、本発明のＲＮ
Ａは、修飾シチジンヌクレオチドとして、５’-メチルシチジンを含有することが好まし
い。従って、これら２つのヌクレオチドが好適である。また、これら２つの修飾の組み合
わせが好ましい。特に好ましい態様においては、これら２つのヌクレオチドが、各々１０
％〜３０％の含量で存在する。修飾ヌクレオチドの総含量が特定のヌクレオチド種の５０
％を超えない限りは、別の方法で修飾したヌクレオチドが任意に存在してもよい。

５％〜５０％。特に好ましくは５％〜３０％、特には７．５％〜２５％のウリジンヌク
レオチドが２’−チオウリジンヌクレオチドであり、５％〜５０％、特に好ましくは５％
〜３０％、特には７．５％〜２５％のシチジンヌクレオチドが５’−メチルシチジンヌク
レオチドであり、アデノシンヌクレオチドおよびグアノシンヌクレオチドは未修飾または
部分的に修飾されたヌクレオチドとして存在し得るポリリボヌクレオチドが好ましい。好
ましい態様において、この本発明のｍＲＮＡはさらに７’−メチルグアノシンキャップお
よび／またはポリ(Ａ)末端を有する。従って、好ましい態様において、前記ｍＲＮＡは、
その成熟形態で、すなわちＧｐｐＧキャップ、ＩＲＥＳおよび／またはポリＡ尾部を有し
て生成される。

特定のＲＮＡに対する修飾ウリジンヌクレオチドおよび修飾シチジンヌクレオチドの最
適な種類および含量は、通常なし得る実験を用いて決定することができる。この文脈上、
その免疫原性が非常に低くて処置した生物がストレスを受けず、所定の安定性を有し従っ
て所定の発現持続期間を有するｍＲＮＡを、最適なものとして記載する。これらの特性を
試験および測定するための方法は、当業者に知られており、下記および実施例において記
載されている。

本発明のＲＮＡは、それ自体既知の様式で生成することができる。本発明のｍＲＮＡは
、例えば５％〜５０％、好ましくは５％〜３０％、特には７．５％〜２５％のシチジンヌ
クレオチドおよび５％〜５０％、好ましくは５％〜３０％、特には７．５％〜２５％のウ
リジンヌクレオチドが修飾されて残りが未修飾であるＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰおよびＵＴ
Ｐの混合物からｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によって生成される方法を好適に採用できる。グア
ノシンヌクレオシドおよびアデノシンヌクレオシド、特にアデノシンを任意に修飾するこ
ともできる。しかしながら、ＵＴＰおよびＣＴＰの規定した範囲内の修飾が本発明には必
須である。修飾ＵＴＰおよび／または修飾ＣＴＰの含量が低いまたは高い場合、有利な特
性はもはや達成されない。このように、主張した範囲外のｍＲＮＡはもはやそれほど安定
でないことが見出された。さらに、低い含量の修飾では免疫反応が予想される。未修飾ヌ
クレオチドと修飾ヌクレオチドとの適切な比率を設定するために、ヌクレオチド混合物を
用いてＲＮＡが適切に作製され、前記ヌクレオチド混合物のヌクレオシド含量は、本発明
に従って少なくとも５％のウリジンヌクレオシドおよび少なくとも５％のシチジンヌクレ
オシドが修飾されているが、全部でウリジンヌクレオチドおよびシチジンヌクレオシドの
それぞれ５０％以下が修飾されている所望の比率に従って部分的に修飾され部分的に未修
飾である。さらに、ヌクレオシド、すなわちアデノシンおよびグアノシンは修飾すること
ができ、しかしながら、また、これらのヌクレオシドについて修飾が５０％の上限、好ま
しくは２０％を超えるべきでない。好ましくは、ウリジンヌクレオシドおよびシチジンヌ
クレオシドの適切な含量のみを修飾する。

修飾されるヌクレオシドは、天然に存在するヌクレオシドに見出されるような修飾、例
えばメチル化または結合変異を有することができるが、「合成的な」、すなわち天然に存
在しない修飾も有することができ、あるいは天然のおよび／または合成的な修飾を有する
ヌクレオチドの混合物を用いることができる。従って、少なくとも１種類の天然に修飾さ
れたヌクレオシドを、同じ種類もしくは別の種類の合成的に修飾されたヌクレオシドと、
または別の種類の天然に修飾されたヌクレオシドのみと、別の種類の合成的に修飾された
ヌクレオシドのみともしくは別の種類の天然に／合成的に修飾された混合ヌクレオシドと
組み合わせることができる。ここで、本明細書中「種類」とはヌクレオシドの種類、すな
わち、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰまたはＵＴＰを指す。数多くの事例において、上で明記す
るように、免疫原性および安定性の改良のため、または特性の調整のため、結合部位を供
給する官能基を有する修飾ヌクレオシドと機能的に修飾されていないヌクレオシドとを組
み合わせることが有益であり得る。もっとも適切な種類または組み合わせは、例えば下に
も記載するような実験などの、通常なし得る実験によって、当業者が容易に見出すことが
できる。特に好ましくは、修飾ヌクレオシドとして２−チオウリジンおよび５−メチルシ
チジンが用いられる。機能的に修飾したヌクレオシドが所望される場合は、２’−アジド
ヌクレオシドおよび２'−アミノヌクレオシドが好ましいと考えられる。

本発明で用いるｍＲＮＡの長さは、供給される、または補充される遺伝子産物、または
タンパク質もしくはタンパク質断片に依存する。従って、ｍＲＮＡは非常に短く、例えば
２０〜３０ヌクレオチドのみを有するものであってもよく、あるいは数千ヌクレオチドを
有する遺伝子の長さに対応するものであってもよい。当業者であれば、その都度、通常の
手法で適切な配列を選択することができる。

用いるｍＲＮＡにとって必須であるのは、疾患を引き起こすタンパク質、疾患を緩和す
るもしくは予防するタンパク質、または有益な特性を制御するタンパク質の機能を提供で
きることである。

本発明のＲＮＡの生成のため、修飾ウリジン含有ヌクレオチドとして、好ましくは２'
−チオウリジンが用いられる。さらに、修飾シチジンヌクレオチドとして、５’−メチル
シチジンを用いることが好ましい。従って、本発明のＲＮＡの生成のため、好ましくはＡ
ＴＰおよびＧＴＰに加えて９５％〜５０％の未修飾ＣＴＰおよび９５％〜５０％の未修飾
ＵＴＰおよび５％〜５０％の２'−チオウリジンヌクレオチドおよび５％〜５０％のメチ
ルシチジンヌクレオチドをそれぞれ含むヌクレオチド混合物を用いる。従って、５％〜５
０％、好ましくは５％〜３０％、特には７．５％〜２５％のウリジンヌクレオチドが２’
−チオウリジンヌクレオチドであり、５％〜５０％、好ましくは５％〜３０％、特には７
．５％〜２５％のシチジンヌクレオチドが５’−メチルシチジンヌクレオチドであり、ア
デノシンヌクレオチドおよびグアノシンヌクレオチドは未修飾ヌクレオチドであるポリリ
ボヌクレオチドが特に好ましい。このような組み合わせは、特に高い安定性によって特徴
づけられる部分的修飾ＲＮＡの生成をもたらす。ＣＴＰおよびＵＴＰとしてそれぞれ５％
〜５０％の２−チオウリジンヌクレオチドおよび５−メチルシチジンヌクレオチドを含ん
だヌクレオチド混合物を用いて生成したＲＮＡが、特に安定である、すなわち、未修飾Ｒ
ＮＡまたは既知の様式で修飾したＲＮＡと比較して最大１０倍までの長い存続期間を有す
ることが示された。

さらに好ましい態様において、５％〜５０％の修飾ウリジンヌクレオチドまたは修飾シ
チジンヌクレオチドのうちの１％〜５０％、好ましくは２％〜２５％が修飾として結合部
位作製基または活性化基を有するヌクレオチドである、すなわち、０．５％〜２０％、好
ましくは１％〜１０％のシチジンヌクレオチドおよび／またはウリジンヌクレオチドが、
例えばアジド基、ＮＨ基、ＳＨ基またはＯＨ基などの結合部位を作製する修飾を有するこ
とができる。この組み合わせを通じて、特に安定であり多用途でもあるＲＮＡが提供され
る。

さらに、未修飾ヌクレオチドおよび修飾ヌクレオチドからできているポリリボヌクレオ
チド分子は、７'−メチルグアノシンキャップおよび／またはポリ(Ａ)尾部を有すること
が好ましい。加えて、ＲＮＡは、当業者に周知の付加的な配列など、例えば、非翻訳領域
および機能性核酸を有することもできる。

本発明のＲＮＡは、好ましくはｉｎ ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡ（ＩＶＴ ＲＮＡ）として
提供される。Ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写を行うために必要な材料、具体的には緩衝液、酵素お
よびヌクレオチド混合物は、当業者に既知であり、市販されている。本発明のＲＮＡの生
成のために使用されるＤＮＡの性質も重要でなく、一般にはクローン化ＤＮＡである。

上に明記したように、所望の含量の修飾ウリジンヌクレオシドおよび修飾シチジンヌク
レシチドを有するＲＮＡ、具体的にはｍＲＮＡが提供される。特異的ｍＲＮＡについての
修飾ウリジンヌクレオシドおよび修飾シチジンヌクレオシドの最適含量は、当業者に周知
のありふれた実験によって決定することができる。

本発明のＲＮＡは、好ましくは、疾患の治療のためまたは身体にとって有益なタンパク
質の供給のために使用される。疾患の治療のために本発明のＲＮＡが用いられる場合、本
発明のＲＮＡは、好ましくは、その欠陥もしくは不足が疾患状態をもたらす、またはその
供給が病気の緩和をもたらす、タンパク質またはタンパク質断片のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写
を有する。本発明のＲＮＡの生成のために、好ましくは、その欠陥もしくは不足が疾患を
もたらす、または病気と関係のある、タンパク質またはタンパク質断片をコードするＤＮ
Ａが用いられる。一態様において、その欠陥または欠如により疾患または病気が生じる遺
伝子のＤＮＡが、本発明のＲＮＡの生成のために用いられる。別の態様において、その存
在（おそらくは一時的な）が生物にとって有益であるまたは治癒をもたらすタンパク質を
コードするＤＮＡが、本発明のＲＮＡの生成のために用いられる。本明細書において、身
体的なおよび／もしくは精神的／心理的な障害もしくは変化が主観的におよび／もしくは
客観的に存在するか、または身体的、精神的もしくは心理的な過程の異常な経過が医療を
必要とし働けないことをもたらす、いずれもの状態を疾患または病気と呼ぶ。

本明細書において、その存在が病気を緩和することができる、または身体にとって有益
もしくは支援的であり得る、タンパク質またはタンパク質断片とは、ある種類の障害のた
め、もしくは自然環境のために失われることから、またはある種の条件下、例えば欠陥の
治療もしくは埋込みという状況で身体にとって有益であり得ることから、身体にとって完
全にまたは一時的に遺伝的な欠陥が存在することなく利用可能とされる、タンパク質また
はタンパク質断片を意味すると理解される。これらは、変化した形態のタンパク質または
タンパク質断片、すなわち代謝の経過で変化するタンパク質の形態、例えば、タンパク質
の成熟形態なども含む。成長過程の一部および血管形成を担い、例えば制御された再生に
必要であり、そして本発明のｍＲＮＡの導入によって特異的に形成することができるタン
パク質も提供できる。これは、例えば成長過程において、または骨欠損、組織欠損の治療
に、また埋込みおよび移植の状況において、有用であり得る。

埋込み型プロテーゼの内殖を促進するために、本発明に従って修飾したｍＲＮＡを有利
に用いることができることを見出した。歯のインプラント、股関節内部プロテーゼ、膝関
節内部プロテーゼまたは脊椎椎体固定物（ｖｅｒｔｅｂｒａｌ ｆｕｓｉｏｎ ｂｏｄｙ
）などの挿入されるプロテーゼの表面上に適用する場合、本発明のｍＲＮＡは、内殖、血
管の新生、および新たに挿入されたプロテーゼに必要なその他の機能を促進することがで
きる因子を放出することができる。このように、例えば、プロテーゼの埋め込みの状況下
またはその後において、ＢＭＰ-２などの増殖因子または血管形成因子などの生物学的活
性物質の投与が知られている。生体物質は極端に短い半減期を有することが非常に多いこ
とから、患者に重篤な副作用を生ぜしめる、非常に高い用量を予め使用する必要があった
。本発明によれば、本発明のＲＮＡを使用して所望のおよび／または必要なタンパク質が
選択的に使用され適切に投与されることから、この欠点が回避される。これは、副作用を
低減するか、あるいは患者に副作用を与えない。この態様において、増殖因子、血管形成
因子その他などの所望のおよび／または必要な物質をコードする本発明のＲＮＡは、規則
的な様式でＲＮＡを放出するコーティングとしてインプラント上に施すことができ、次い
で規則的な様式で前記コーティングから放出することができ、前記インプラントの近傍の
細胞は、所望の因子を連続的にまたは断続的に産生する、または必要に応じて放出するこ
とができる。その放出特性が特異的に調節できる担体、通常は生体適合性である、合成、
天然または天然−合成混合のポリマーは周知であるため、本明細書中でより詳細な説明は
省略する。例えばポリラクチドポリマーまたはポリラクチド／グリコリドポリマーが用い
られる。このようにして、所望の部位に、より長い時間またはより短い時間をかけて、連
続的または断続的に所望の因子を選択的に放出することが可能である。

本発明の文脈上、欠損遺伝子もしくは欠陥遺伝子または欠損もしくは欠如とは、発現さ
れない、不正確に発現される、または適切な量で発現されず、結果として、例えば代謝障
害を引き起こすことによって、疾患または病気を引き起こす遺伝子を意味すると理解され
る。

本発明のＲＮＡは、タンパク質が、身体内に天然に存在するはずであるが、遺伝子の欠
陥または疾患のために存在しないか、または欠損型もしくは不足量で存在して身体に供給
される、いずれもの事例において、適切に使用することができる。その欠損または欠陥が
疾患と関連しているタンパク質およびそれらをコードするＤＮＡが既知である。その欠如
の事例に本発明のＲＮＡを使用することができる種々のタンパク質および遺伝子を以下に
列挙する。

欠陥遺伝子に基づく他の疾患を下記に明記する。

このように、上記の表は、その欠陥により生じる疾患が、本発明のＲＮＡを用いる転写
置換療法によって治療可能である、遺伝子の例を示す。特に本明細書において、例えば、
ＳＰＢ欠損症、ＡＢＣＡ３欠損症、嚢胞性線維症およびα１−アンチトリプシン欠損症な
どの肺に影響を与える遺伝性疾患、血漿タンパク質に影響を与えて凝固不能および補体不
全を引き起こす遺伝性疾患、例えばＳＣＩＤなどの免疫不全、肺血性肉芽腫、ならびに蓄
積症を挙げることができる。これらの疾患すべてにおいて、タンパク質、例えば酵素が、
欠陥性であり、欠陥遺伝子によってコードされるタンパク質、またはその機能性断片を利
用可能にする本発明のＲＮＡを用いる療法によって治療することができる。

このように、本発明のＲＮＡによってコードすることができるタンパク質の例は、エリ
スロポエチン（ＥＰＯ）、成長ホルモン（ソマトトロピン、ｈＧＨ）、嚢胞性線維症膜コ
ンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）、ＧＭ−ＳＣＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＭＰＳ、プロテインＣ
、ヘプシジン、ＡＢＣＡ３およびサーファクタントタンパク質Ｂなどの増殖因子類である
。本発明のＲＮＡを用いて治療することができる疾患のさらなる例は、血友病Ａ／Ｂ、フ
ァブリー病、ＣＧＤ、ＡＤＡＭＴＳ１３、ハーラー病、Ｘ染色体仲介性Ａ−γ−グロブリ
ン血症、アデノシンデアミナーゼ関連免疫不全症、およびＳＰ−Ｂに関連する新生児の呼
吸窮迫症候群である。特に好ましくは、本発明のｍＲＮＡがサーファクタントタンパク質
Ｂ（ＳＰ−Ｂ）またはエリスロポエチンについての配列を含む。本発明に従って修飾され
たＲＮＡによってコードすることができるタンパク質のさらなる例は、ＢＭＰ−２などの
増殖因子または血管形成因子である。

本発明のＲＮＡのさらなる使用分野は、例えば臓器不全のために、タンパク質が身体内
にもはや存在しない、または身体内で形成されない疾患または病気について生じる。現在
のところ、そのような疾患において、置換のために組み換えタンパク質が投与される。本
発明によると、存在しないタンパク質の置換が転写レベルで生じることができるようにＲ
ＮＡが直ちに提供される。これはいくつもの利点を有する。そして、タンパク質がグリコ
シル化を有する場合、前記転写レベルでの置換は、典型的にはヒトのグリコシル化が身体
内で行われるという効果を有する。組み換え体である、すなわち、微生物内で正常に産生
されたタンパク質を用いると、通常、そのグリコシル化は、置換が達成される身体内での
ものとは異なる。これは、副作用をもたらし得る。一般に、本発明のＲＮＡから発現され
たタンパク質は、構造およびグリコシル化に関して内因性タンパク質と同一であることが
予想でき、これは組み換えタンパク質を用いる事例では一般的でない。

置換または導入が所望され得るタンパク質の例は、エチスロポエチンなどの機能性タン
パク質類ならびにソマトトロピン（ｈＧＨ）、Ｇ−ＣＳＦおよびトロンボポエチンなどの
増殖因子類である。

本発明のＲＮＡを用いることができるさらなる分野は再生医療の分野である。疾患過程
を通じてまたは老化を通じて生じる変性疾患は、疾患または老化の過程のために不足量の
み生産される、または全く生産されないタンパク質の導入によって、治療することおよび
緩和することができる、または治癒するもできる。これらのタンパク質をコードする関連
ＲＮＡの導入によって、変性過程を停止させることができるか、または再生を開始するこ
ともできる。その例としては、成長障害において、骨粗鬆症、関節症または障害性創傷治
癒などの変性疾患において用いることができる組織再生のための増殖因子類である。ここ
で、本発明のＲＮＡは、存在しないタンパク質を選択的に且つ正確な用量で供給すること
ができるという利点だけでなく、更に時間窓でタンパク質を供給することが可能であると
いう利点も提供する。従って、例えば障害性創傷治癒に対して、ＲＮＡの用量設定した（
ｄｏｓｅｄ）投与によって、関連する治癒因子または増殖因子を限られた時間の間に供給
することができる。加えて、後で説明する機序を介して、ＲＮＡがその所望される作用の
部位に選択的に運ばれるようにアレンジすることができる。

本発明のＲＮＡを用いて再生作用を有するように発現され得る因子の例は、繊維芽細胞
増殖因子（ＦＧＦ）、例えばＦＧＦ−１−２３、形質転換増殖因子（ＴＧＦ）、例えばＴ
ＧＦ-αおよびＴＧＦ−β、ＢＭＰ（骨形成タンパク質）、例えばＢＭＰ１〜ＢＭＰ７、
ＢＭＰ８ａ、ＢＭＰ８ｂ、ＢＭＰ１０およびＢＭＰ１５、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ
）、例えばＰＤＧＦ−Ａ、ＰＤＧＦ−Ｂ、ＰＤＧＦ−ＣおよびＰＤＧＦ−Ｄ、上皮増殖因
子（ＥＧＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、血管内皮増殖
因子（ＶＥＧＦ−Ａ〜ＶＥＧＦ−ＦおよびＰＩＧＦ）、インシュリン様増殖因子、例えば
ＩｇＦ１およびＩｇＦ２、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、インターロイキン類、例えばイン
ターロイキン−１Ｂ、ＩＬ−８およびＩＬ−１〜ＩＬ−３１、神経増殖因子（ＮＧＦ）、
ならびに赤血球、好中球、血管などの形成を刺激する他の因子である。

本発明のＲＮＡは、腫瘍疾患の分野で選択的に用いることもできる。特異的な腫瘍関連
抗原を認識するＴリンパ球におけるテーラーメイドＴ細胞レセプターの発現を通じて、本
発明のＲＮＡは一層効果的となり得る。原理上は、この分野においてｍＲＮＡをうまく使
用することができることはすでに示されている。しかしながら、現在まで、その使用は、
すでに上述した免疫原性効果によって妨げられていた。本発明によって供給される低免疫
原性且つ高安定性のＲＮＡを用いて、Ｔ細胞レセプターを適切に発現することが可能とな
る。

本発明のＲＮＡは、体細胞が胚性幹細胞へ再プログラムされるのを確実にする転写因子
を発現することにも使用することができる。そのような転写因子の例は、Ｏ−ｃｐ３／４
、Ｓｏｘ２、ＫＬＦ４およびｃ−ＭＹＣである。従って、これらの転写因子をコードする
本発明の安定なＲＮＡ、特にｍＲＮＡは、以前に考えられたウイルス性または非ウイルス
性のベクターを介する遺伝子導入で起こり得る副作用を引き起こすことなく、幹細胞の生
成をもたらすことができる。

本発明のＲＮＡを使用することの利点は、ＤＮＡベクターの使用とは対照的に、処理の
持続期間が調節可能であることである。幹細胞の誘導の事例においては、概して、体細胞
を幹細胞へ再プログラムするために転写因子が一時的にのみ活性であることが望まれる。
転写因子をコードする関連するＲＮＡの用量設定した投与を通じて、活性を経時的に制御
することができる。これと対照的に、以前の既知の方法を用いると、投与された遺伝子の
組み込みの危険性が存在し、合併症、例えば腫瘍形成をもたらし、さらには持続期間の制
御を不可能にする。

ワクチン分野においても、本発明のＲＮＡは、新たな可能性を提案する。ワクチンの標
準的な開発は、殺した病原体または弱体化させた病原体に依存する。より近年では、病原
体のタンパク質をコードするＤＮＡも検討されてきた。これらのワクチンの生産は、骨が
折れ、非常に時間がかかる。頻繁に副作用が生じ、ワクチン接種において拒絶を生じる。
本発明のｍＲＮＡを用いると、病原体またはＤＮＡに関連する問題を有さないワクチンを
提供することが可能である。加えて、そのようなワクチンは、病原体の抗原配列が分かり
次第非常に素早く生産することができる。これは世界的流行病の治療下で特に有利である
。このように、本発明の一態様において、疾患病原体の抗原性部分、例えば表面抗原をコ
ードするＲＮＡが提供される。任意によりスペーサー部分によって連結された、数個のエ
ピトープの組み合わせを有するアミノ酸配列をコードするｍＲＮＡを提供することも可能
である。融合タンパク質をコードするＲＮＡを通じて、または核酸の組み合わせとして、
免疫調節物質との組み合わせも可能である。

さらに、本発明のＲＮＡは、因子、刺激物質、誘導物質などとして疾患の経過に影響を
与えるタンパク質をコードすることもできる。そのような疾患の例は、遺伝子欠陥に直接
に起因しないがｍＲＮＡ発現によって疾患過程がプラスに影響され得る疾患である。例と
しては、赤血球の形成の刺激のためのエリスロポエチン、好中球の形成のためのＧ−ＣＳ
ＦまたはＧＭ−ＳＣＦ、新たな欠陥の形成のための増殖因子類、骨および創傷治療のため
の「生体組織工学」用因子としての増殖因子類、アポトーシスの導入によるまたはタンパ
ク質性細胞毒、例えばジフテリア毒素Ａの形成によるまたは多能性幹細胞（ｉＰＳ）など
の誘導による腫瘍の治療のための増殖因子類である。

所定の含量の修飾ヌクレオチドおよび未修飾ヌクレオチドを有する本発明のポリリボヌ
クレオチドのみが高い安定性と低い免疫原性とを同時に有することを見出した。ある種の
ポリリボヌクレオチドについて最適な修飾ヌクレオチドと未修飾ヌクレオチドとの組み合
わせを決定することを可能にするために、それ自体既知の様式で免疫原性および安定性を
決定することができる。ＲＮＡの免疫原性の決定のため、当業者に周知の種々の方法を用
いることができる。非常に適切な方法は、ＲＮＡの投与に対する反応としての細胞内の炎
症マーカーの測定である。そのような方法は、実施例に記載する。例えばＴＮＦ-α、Ｉ
ＦＮ-α、ＩＦＮ-β、ＩＬ−８、ＩＬ−６、ＩＬ−１２または当業者に既知の他のサイト
カイン類などの炎症に関連するサイトカイン類が普通に測定される。ＤＣ活性化マーカー
の発現も免疫原性の評価のために用いることができる。免疫反応のさらなる指標は、Ｔｏ
ｌｌ様レセプター類ＴＬＲ−３、ＴＬＲ−７およびＴＬＲ−８に対する結合ならびにヘリ
カーゼＲＩＧ−１に対する結合の検出である。

免疫原性は一般にコントロールとの関連で決定される。通常の方法において、本発明の
ＲＮＡと未修飾ＲＮＡもしくは別の手法で修飾したＲＮＡのいずれかを細胞に投与して、
規定した時間間隔での炎症マーカーの分泌がＲＮＡの投与に対する反応として測定される
。比較のために使用される標準物として、未修飾ＲＮＡが用いられ得る場合は、免疫応答
が低いであろうし、少しの免疫応答を引き起こすか、または免疫応答を引き起こさないこ
とが知られているＲＮＡが用いられ得る場合は、本発明のＲＮＡに対する免疫応答が同じ
範囲内にあるかまたは上昇しないであろう。本発明のＲＮＡを用いると、未修飾ＲＮＡと
比較して免疫応答を少なくとも３０％、一般的には少なくとも５０％または７０％低下さ
せることが可能であり、あるいは免疫応答を完全に防ぐことさえ可能である。

免疫原性は、上述の因子の測定によって、具体的にはＴＮＦ−αレベル、ＩＬ−８レベ
ル、ＴＬＲ−３、ＴＬＲ−７、ＴＬＲ−８およびヘリカーゼＲＩＧ−１に対する結合能力
の測定によって決定することができる。これによって、ｍＲＮＡが所望の低い免疫原性を
有するかどうかを立証するために、関係するポリリボヌクレオチドの投与後に１以上の上
述の因子の量を測定することができる。従って、例えば、ある量の試験するｍＲＮＡを尾
静脈またはｉ．ｐ．を介してマウスに投与することができ、次いで所定の期間後、例えば
７または１４日後に１以上の上述の因子を血液で測定することができる。そして、その因
子の量は、未処理動物の血液中に存在する因子の量と相関している。免疫原性の決定につ
いて、ＴＬＲ−３、ＴＬＲ−７、ＴＬＲ−８および／またはヘリカーゼＲＩＧ−１に対す
る結合能力を測定することが非常に有益であることを見出した。ＴＮＦ−αレベルおよび
ＩＬ−８レベルも非常に良好な指標を提供する。本発明のｍＲＮＡを用いると、ＴＬＲ−
３、ＴＬＲ−７、ＴＬＲ−８およびヘリカーゼＲＩＧ−１に対する結合能力を未修飾ＲＮ
Ａと比較して少なくとも５０％低下させることが可能である。概して、これらの因子に対
する結合を少なくとも７５％低下させまたは８０％低下させることまでも可能である。好
ましい態様において、ＴＬＲ−３、ＴＬＲ−７、ＴＬＲ−８およびＲＩＧ−１に対する結
合能力は、本発明のｍＲＮＡについてと、またはｍＲＮＡが全く投与されていない動物に
ついてと同じ範囲である。言い換えると、本発明のｍＲＮＡは、炎症反応または免疫反応
を事実上引き起こさない。

各事例において、本発明のＲＮＡはそのような非常に低い免疫原性を有し、患者の全身
状態に影響しない。従って、上述の因子の僅かな増加は、その結果として全身状態が悪化
しない限りは許容することができる。本発明のｍＲＮＡのさらなる特性は、その効率およ
び安定性である。このために、転写効率、トランスフェクション効率、翻訳効率およびタ
ンパク質発現の持続期間が、重要であり、それ自体既知の方法によって決定することがで
きる。

転写効率は、ＤＮＡからどの程度効率的にＲＮＡを産生することができるかを示す。こ
こで、高含量の修飾ヌクレオチドの使用により問題が生じ得る。本発明に従って修飾した
ＲＮＡは、高い転写効率で生成することができる。

ＲＮＡによってコードされるタンパク質の安定かつ適切な発現を得るため、充分なＲＮ
Ａが所望の細胞に到達することが重要である。これは、標識したＲＮＡの投与後、標識の
測定によって細胞まで到達したＲＮＡの含量を測定することによって決定することができ
る。標識の測定のためにフローサイトメトリーを用いることができる。標識が蛍光分子を
用いて達成される場合、転写効率は、例えば、ＰＢＳでのみ処理したコントロール細胞と
比較して蛍光強度が高い細胞集団のパーセンテージとして算出することができる。本発明
に従って修飾したＲＮＡは、２つ以上の種類のヌクレオチドを修飾ヌクレオチドで１００
％置き換えたＲＮＡとは対照的に、効率的に産生することができ、一部のヌクレオチドの
みが修飾された本発明のＲＮＡの転写効率がいずれか１種類のヌクレオチドを１００％修
飾したＲＮＡを用いるよりもはるかに高いことを見出した。

翻訳効率は、ＲＮＡがタンパク質へ翻訳される効率を示す。翻訳効率が高くなるにつれ
て、治療のために使用しなければならないＲＮＡの用量を低減することができる。翻訳効
率は、本発明に従って修飾したＲＮＡの翻訳の割合を未修飾ＲＮＡの翻訳率と比較するこ
とによって決定することができる。一般に、本発明のＲＮＡでの翻訳効率は、未修飾ＲＮ
Ａでのものよりもいくらか低い。しかしながら、これは、タンパク質発現の持続期間に現
れる、はるかに高い安定性によって補償されて余りある。

本発明のＲＮＡは、長期持続的なタンパク質発現をもたらす高い安定性を特に提供する
。特に本発明に従って修飾したＲＮＡが遺伝子欠陥による疾患の治療を提供するよう意図
される場合、細胞内に長くとどまるほど、より有益となる。ＲＮＡが急速に分解されるほ
ど、タンパク質発現は急速に終了し、ＲＮＡをさらに頻繁に投与しなければならない。反
対に、細胞内に長時間とどまる安定なＲＮＡを用いると、投与の頻度を大いに減らすこと
ができる。本発明に従って修飾したＲＮＡは最高４週間まで安定に発現されたことを見出
した。

他の態様について、すなわち、ＲＮＡが一時的な発現についてのみ意図される場合、タ
ンパク質発現の持続期間は、安定性に影響を与えることによって調節することができる。

従って、本発明のＲＮＡのさらなる有益な特性は、作用の持続期間が安定性を介して選
択的に調節することができ、タンパク質発現を所望の時間窓で行うようにタンパク質発現
の持続期間を調整することができるということである。第二に、必要な場所で非常に長く
作用するＲＮＡを用いることができる。本発明に従って修飾したＲＮＡは、その発現が最
長４週間持続でき、従って、４週間ごとにのみ与える必要があるから、慢性疾患の治療に
理想的に適している。ＲＮＡが疾患を緩和する、または予防するために長期間にわたり身
体に供給される因子をコードする態様について、例えばエリスロポエチンをコードするＲ
ＮＡの使用については、高い安定性および長期持続的なタンパク質発現も有利である。本
発明のＲＮＡは、血友病の治療にも特に有利に用いることができる。ここで、以前は、欠
如している因子を毎週投与することが必要であった。本発明のＲＮＡの提供で、投与の頻
度を低減することができ、これからは因子をコードするＲＮＡを２週間ごとにのみまたは
さらには４週間ごとにのみ与える必要があるようになる。

本発明のｍＲＮＡの安定性は、それ自体既知の方法によって決定することができる。特
に適切なのは、未修飾ＲＮＡまたは完全修飾ＲＮＡを含む細胞と比較して、例えば未修飾
のまたは既知の様式で修飾したＲＮＡと比較して、本発明に従って修飾したＲＮＡを含む
細胞の生存能力を決定する方法である。コードタンパク質の産生を経時的にモニターする
こともできる。本発明において、ＲＮＡの安定性とは、そのＲＮＡが、細胞内に導入され
た場合に、所望のタンパク質を発現できるまたは所望のタンパク質またはその機能性断片
へ翻訳可能であり、長期間にわたる発現が可能であり、直ちに分解されず不活性化されな
いことを意味するものと理解される。

従って、細胞内におけるＲＮＡの安定性および生存時間を試験するための方法は、その
ＲＮＡによってコードされたタンパク質が、どのくらいの期間細胞内で検出可能であるか
、またはその機能を果たすかを決定することにある。そのための方法は実施例に記載する
。よって、例えばレポーター分子をコードする配列を有するｍＲＮＡを、任意により所望
のタンパク質をコードするＲＮＡと一緒に、細胞内に導入することができ、次いで所定の
期間の後、レポーター分子および任意のタンパク質の存在を決定する。適切なレポーター
分子は本技術分野の現状で周知であり、それらは本発明についても一般的に用いることが
できる。好ましい態様において、ＲＦＰ、すなわち赤色蛍光タンパク質がレポーター分子
として用いられる。

上述するように、本発明のＲＮＡは、そのＲＮＡが導入される細胞内において、自然に
は所望の程度には発現されない、または全く発現されないタンパク質を形成することがで
きるようにして、治療に用いることができる。本発明において、本発明のＲＮＡは、タン
パク質が遺伝子の欠損のせいで形成されない場合と、疾患のせいでタンパク質が形成され
ない事例またはタンパク質の導入が身体にとって有益である事例との両方で用いることが
できる。本発明のＲＮＡは、適切な程度に発現されないタンパク質を補充するためにも用
いることができる。各事例において使用する用量は、ＲＮＡが果たす機能に依存する。上
述するように、本発明のＲＮＡの作用の持続期間は、意図的に調節することができる。治
療の持続期間は、具体的な適応症に依存する。欠損遺伝子による疾患の長期治療のために
ＲＮＡが使用される場合は、作用の持続期間は可能な限り長くなるであろうし、一方で他
の適応症については意図的に時間窓に合わせることができる。

特に好ましい態様について、サーファクタントタンパク質ＢをコードするＩＶＴ ｍＲ
ＮＡをＲＮＡとして用いる。このタンパク質が哺乳動物において欠損している場合、早産
児および新生児の呼吸窮迫症候群の発生をもたらす。新生児においては、この症候群は、
肺疾患による死亡につながることが多い。５％〜５０％のウリジンヌクレオチドおよび５
％〜５０％のシチジンヌクレオチドが修飾されているＳＰ−Ｂをコードする複数のｉｎ
ｖｉｔｒｏ転写した修飾ｍＲＮＡの使用は、タンパク質を形成し、疾患を緩和または治癒
することをもたらす。

さらに好ましい態様によると、エリスロポエチンをコードするＩＶＴ ｍＲＮＡをＲＮ
Ａとして用いる。エリスロポエチンは、身体にとって非常に重要なタンパク質であり、例
えば腎臓疾患においてもはや適切な量で利用できず、したがって補充しなければならない
。このために、現時点では、微生物または動物細胞で産生され従って天然に存在しないグ
リコシル化を有する組み換えエリスロポエチンが用いられる。この組み換えＥＰＯの使用
には、稀な事例において、例えば赤血球無形成症といった重篤な副作用が存在した。

本発明に従って提供されるＩＶＴ ｍＲＮＡは、エリスロポエチンをコードし５％〜５
０％のウリジンヌクレオチドおよび５％〜５０％のシチジンヌクレオチドが修飾されてい
るリボ核酸を含む。特に好ましい態様において、１５％〜２５％のウリジンヌクレオチド
および１５％〜２５％のシチジンヌクレオチドが修飾されているＥＰＯコードｍＲＮＡが
提供される。このｍＲＮＡは未修飾ＲＮＡと比較して顕著に低下した免疫原性を有するこ
とを見出した。同時に、このｍＲＮＡは９０％を超えるトランスフェクション効率と１４
日後も依然としてヘマトクリット値が高められる安定性を示す。本発明のＲＮＡによって
身体内で生成したＥＰＯは、グリコシル化が正しく、副作用が予測されない。本発明に従
って修飾したＥＰＯコードｍＲＮＡの標的化した断続的な投与により、ヘマトクリット値
を長期間所望のレベルで維持することができた。

本発明によると、哺乳動物においてｉｎ ｖｉｖｏで使用可能であり、天然に存在する
内因性タンパク質と同一ではないが非常に類似する形態であって特に内因性グリコシル化
を有する形態で必要なタンパク質を提供する、非免疫原性で安定なＲＮＡが提供される。

本発明のｍＲＮＡは、このようにして直接的に用いることができる。しかしながら、さ
らに有益な特性を導入するために、ｍＲＮＡのさらなる修飾の可能性も存在する。第一に
、コード鎖に他のコード配列または非コード配列を付け加えることによって、ｍＲＮＡを
修飾することができる。第二に、修飾ヌクレオチドに提供される官能基にさらなる分子を
結合することによっても、ｍＲＮＡを修飾することができる。

一態様において、本発明のｍＲＮＡは、標的細胞に特異的な表面レセプターと結合する
ターゲティングリガンドと組み合わせることができ、よって標的細胞のレセプター介在性
トランスフェクションが可能である。第一にこの媒体は細胞内へのｍＲＮＡの導入に適し
ており、あるいはｍＲＮＡ自体がリガンドを用いて修飾することができる。細胞内へのｍ
ＲＮＡの導入に適切な媒体の例は、カチオン剤である。カチオン剤としては、カチオン資
質、カチオンポリマー、またはナノ粒子、ナノカプセル、磁性ナノ粒子およびナノエマル
ジョンが挙げられる。適切な媒体は、当業者に知られており、専門書に記載されている。
適切なリガンドも、当業者に周知であり、専門書に記載されており、利用可能である。リ
ガンドとして、例えば、トランスフェリン、ラクトフェリン、クレンブテロール、糖、ウ
ロン酸、抗体、アプタマーなどを用いることができる。

しかしながら、ｍＲＮＡ自体もリガンドを用いて修飾することができる。このために、
リボースの２’位に一級アミノ基またはアジド基を持つ修飾ヌクレオシドを有するｍＲＮ
Ａが好まれる。その例は、上記表に見出すことができる。そのような修飾が、生物学的活
性に貢献するために、特に好まれる。これらの修飾を介して、アミド形成または「クリッ
ク」ケミストリー、例えばバイオコンジュゲートによって、リガンドを容易に組み込むこ
とができる。

更なる態様において、タンパク質、例えばレセプターと結合することができるＲＮＡ配
列（アプタマー）が、ｍＲＮＡの５’末端に導入される。この手段は、リガンドを予めＤ
ＮＡレベルで基質へ直接的に導入してクローニングしＩＶＴによってｍＲＮＡへ導入する
ことができるという利点を有する。従って、リガンドを有するｍＲＮＡの後に続く修飾は
、もはや必要でない。

更なる態様において、ｍＲＮＡは、不活性なポリマー類、例えばポリエチレングリコー
ル（ＰＥＧ）を用いる付加的な修飾によって修飾される。この方法は当業者に周知であり
、用いることができるリガンドについてのそのようなプロセスは既知である。従って、例
えば、転写の後にポリエチレングリコールが結合されるＰＥＧ用の結合部位を、本発明の
ｍＲＮＡに使用される修飾ヌクレオチドの小部分で提供することができる。ポリエチレン
グリコールはｍＲＮＡの細胞外安定化に役立つ、すなわち、ポリエチレングリコールは細
胞内に到達するまでポリリボヌクレオチド分子を保護する。細胞内に侵入すると、ＰＥＧ
は切断される。従って、好ましくは、ＰＥＧとＲＮＡの間の結合は、細胞内への侵入時の
切断が容易にされるように設計される。これについて、例えば、ｐＨ依存的に切断される
官能基を提供することができる。ＲＮＡを安定化する他の分子を、修飾ヌクレオチド上の
適切な活性部位を介して提供することもできる。この方法では、ｍＲＮＡを、酵素分解に
対する立体安定性および体液の構成成分との相互作用の防止によって保護することができ
る。このように修飾したｍＲＮＡを、「ステルス」ｍＲＮＡと呼ぶことができる。

ＲＮＡの保護および安定化のために好まれる方法は、欧州特許第１１９８４８９号明細
書に記載されており、前記明細書の内容を本明細書に明確に援用する。好ましくは、本発
明のＲＮＡは、欧州特許第１１９８４８９号明細書に記載された方法によって保護される
。第一に、この方法によって本発明に従って修飾したＲＮＡも有利に安定化および保護す
ることができたこと、第二に、このように処理した本発明のＲＮＡの活性が制限されない
か、または実質的に制限されないことを見出した。従って、本発明の好ましい態様におい
て、本発明に従って修飾したＲＮＡを欧州特許第１１９８４８９号明細書に従って処理す
る。

細胞特異的制御の例は造血細胞で発現されるが、他の起源の細胞では発現されない、マ
イクロＲＮＡ１４２−３ｐのためのマイクロＲＮＡ結合部位の組み込みである。結果とし
て、発現は、造血細胞内でのｍＲＮＡ翻訳が他の細胞と比較して顕著に減少するように制
御される。同様に、他の細胞腫での発現は、当業者に既知の関連する適切なマイクロＲＮ
Ａ結合部位の組み込みによって、選択的に制御することができる。

更なる態様において、本発明のｍＲＮＡは、健康な細胞にのみ存在し、疾患により影響
された細胞には存在しない、少なくとも１つのマイクロＲＮＡの標的、または結合部位と
組み合わされる。結果として、ｍＲＮＡによってコードされたタンパク質は、そのタンパ
ク質を必要とする細胞でのみ産生される。適切な標的の選択は、当業者に周知のありふれ
た方法によって行われる。ＤＮＡレベルで行われる一般的な方法は、マイクロＲＮＡ結合
部位の３’ＵＴＲへのクローニングである（ＧＵ ｅｔ ａｌ, Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｍｏ
ｌ Ｂｉｏｌ. ２００９ Ｆｅｂ； １４１６（２）； １４４−５０, Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａ
ｌ, Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ. ２００７ Ｄｅｃ； ２５（１２): １４５７−６７,
Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ, Ｎａｔ Ｍｅｄ. ２００６ Ｍａｙ； １２（５）； ５８５−９１
, 国際公開第２００７／０００６６８号）。好ましい態様において、ＲＮＡが細胞毒素を
コードする場合は、マイクロＲＮＡの結合部位を備えたＲＮＡが用いられる。この事例に
おいて、毒性タンパク質がその作用を配備することが意図された細胞にのみ運ばれること
が特に望ましい。この態様については、ＲＮＡをその安定性が所定の時間窓で存在するよ
うに特異的に修飾することによって、ＲＮＡの作用の持続期間を調節することも有利であ
り得る。

更に、本発明のＲＮＡは、３’ポリＡ尾部の下流でマイクロＲＮＡまたはｓｈＲＮＡと
組み合わせることができる。これは、ｍＲＮＡ−マイクロＲＮＡ／ｓｈＲＮＡハイブリッ
ドをダイサーによって細胞内で切断することができ、これによって、異なる病理的カスケ
ードに干渉する２つの活性分子を放出することができる。そのようなハイブリッドを、癌
や喘息などの疾患の治療のために提供することができる。従って、本発明のＲＮＡは、欠
損ｍＲＮＡを補完することおよび欠陥マイクロＲＮＡカスケードで干渉することに対し同
時に適切である。

このように、本発明によると、レポータータンパク質、例えば赤色蛍光タンパク質（Ｒ
ＦＰ）をコードする配列が用いられるスクリーニング方法を用いて試験することができる
、有利な特性を有するＲＮＡが提供される。未修飾のヌクレオチド、一重修飾ヌクレオチ
ドまたは異なる複数の修飾を有する多重修飾ヌクレオチドを有するレポーター遺伝子の配
列の毒性および安定性を、その免疫原性およびトランスフェクション効率について試験す
ると、本発明のｍＲＮＡ、すなわちウリジンヌクレオシドおよびシチジンヌクレオシドの
それぞれ少なくとも５％が修飾ヌクレオチドによって置き換えられた多重に修飾されたｍ
ＲＮＡは、血液中のヒト初代単球に対して顕著に低下した免疫原性をもたらすと同時に、
８０％を超える高いトランスフェクション率を得られることを見出した。これは、例えば
ヒトまたはマウスのＩＩ型肺胞上皮細胞で試験することができる。更に、本発明に従って
修飾したＲＮＡについてのＲＮＡ発現の持続期間は、既知のＲＮＡを用いるよりも著しく
長い。主として本発明に従って修飾したｍＲＮＡの高い安定性および低い免疫原性のため
に、その発現は既知の標本を用いるよりも長く持続する。定量的評価において、本発明に
従って修飾した誘導体では、トランスフェクションから１０日後に、未修飾ＲＮＡまたは
一重修飾のみのＲＮＡよりも１０倍高い発現量の生成物が見られた。

本発明の更なる主題は、免疫原性および発現量を試験するためのヌクレオチド配列のス
クリーニング方法であって、その方法では、ＴＬＲ３、ＴＬＲ３、ＴＬＲ８およびヘリカ
ーゼＲＩＧ−１から選択される少なくとも１つのレセプターとｍＲＮＡ配列を接触させて
、その結合能力をコントロール配列と比較して測定する。コントロール配列としては、結
合能力が既知の配列を用いる。少なくとも１つのこれらのレセプターとの結合が弱いほど
、その配列は有望である。

本発明のｍＲＮＡ、特にＩＶＴ ｍＲＮＡの特性は、レポータータンパク質を発現する
ＲＮＡに対するスクリーニング方法を用いて試験することができる。赤色蛍光タンパク質
（ＲＦＰ）がレポータータンパク質として好ましい。このタンパク質をコードする異なる
修飾を有する配列を、その免疫原性およびトランスフェクション効率について試験するこ
とができる。従って、ｍＲＮＡの種々の修飾を試験のために用いることができ、例えばウ
リジンヌクレオシドを２−チオウリジンヌクレオシド（以下でｓ２Ｕとも呼ぶ）によって
部分的に置き換えることができ、シチジンヌクレオシドを５−メチルシチジンヌクレオシ
ド（以下でｍ５Ｃとも呼ぶ）によって部分的に置き換えることができる。

図１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、２Ａおよび２Ｂは、そのようなスクリーニング方法を行って得ら
れた結果を表す。より詳細な事項は、実施例で見出される。これらの図で示される結果は
、ＲＦＰ ＲＮＡについて行った実験に基づき、少なくとも５％のウリジンヌクレオシド
および少なくとも５％のシチジンヌクレオシドがそれぞれ修飾されている多重修飾ｍＲＮ
Ａのみが血液中のヒト初代単球に対してｅｘ ｖｉｖｏとｉｎ ｖｉｖｏの両方で顕著に
低下した免疫原性をもたらすと同時にヒトとマウスの両方のＩＩ型肺胞上皮細胞で８０％
を超える高いトランスフェクション率をもたらすことができることを示す。さらに、本発
明に従って修飾したｍＲＮＡの発現の持続期間は未修飾ｍＲＮＡの場合よりも著しく長い
。

さらなる態様において、ｍＲＮＡ免疫沈降試験（ＲＩＰ）の使用により、検討中のＲＮ
Ａが治療に適するか否かを試験するための方法を提供する。適切なＲＩＰ試験は、実施例
でより詳細に記載する。この研究は、Ｔｏｌｌ様レセプター（ＴＬＲ）３、ＴＬＲ７、Ｔ
ＫＲ８およびヘリカーゼＲＩＧ−１に対するＲＮＡ結合を介して、未修飾レポーターｍＲ
ＮＡによって免疫系の細胞が活性化されることを示している。この結果が、試験したｍＲ
ＮＡのＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８および／またはＲＩＧ−１に対する結合が未修飾ｍ
ＲＮＡと比較して顕著に減少したことを示す場合には、減少した免疫原性の指標である。
この点で、本発明に従って用いる多重修飾が一重ｓ２Ｕ修飾よりも著しく効果的であるこ
とが示された。実施例において、ＲＮＡをマウスへ静脈内注射した後に、ＩＦＮ−γ、Ｉ
Ｌ−１２およびＩＦＮ−αのレベルについてＲＮＡの影響を調べた。多重修飾ｓ２Ｕ_{(０
．２５)}ｍ５Ｃ_{(０．２５)} ＲＦＰ ｍＲＮＡが免疫応答を防いだことを見出した。この
実施例で得られた結果は、多重修飾ｍＲＮＡがＴＬＲおよびＲＩＧ−１結合を著しく減少
させ、従って高い且つ持続した発現を有すると同時に免疫応答を低下させることを、一緒
に示す。従って、多重修飾ＲＮＡ、特にＩＶＴ ｍＲＮＡは、欠損遺伝子による疾患のｉ
ｎ ｖｉｖｏ治療のための適切な候補である。特に有望な候補は、以下で簡単に説明し、
実施例でより詳細に記載する。

本発明に従って修飾したＲＮＡを肺内の治療に使用することが可能か否かを試験するた
めに、高感度緑色蛍光タンパク質およびルシフェラーゼ（ＥＧＦＰＬｕｃ）の融合タンパ
ク質をコードする多重修飾ｍＲＮＡを、マウスの肺に直接導入して、未修飾ＥＧＦＰＬｕ
ｃと比較して、ルシフェラーゼが発現するか否かについて試験した。未修飾ＥＧＦＰＬｕ
ｃのルシフェラーゼの発現は肺内で３時間後に最大に達したが、総発光量は、処理後２４
時間後に急速に下降し、処理後５日には非常に低い比率にまで下降した。これと対照的に
、多重修飾ＥＧＦＰＬｕｃ ｍＲＮＡで処理したマウスでは処理後最大５日まで高発現値
が観察された。

特に好ましい態様において、治療可能性がＳＰ−Ｂ欠損に起因する疾患の治療を可能に
するＲＮＡ、すなわちｓ２Ｕ_{(０．２５)}ｍ５Ｃ_{(０．２５)} ＳＰ−Ｂ ｍＲＮＡが提供さ
れる。ＳＰ−Ｂは、単独遺伝子によってコードされている比較的小型の両親媒性ペプチド
であり、ＩＩ型肺胞上皮細胞内でタンパク質分解プロセッシングを通じて３８１アミノ酸
を有する前駆体を作り出して、肺胞を覆う。これは、肺胞内の表面張力の低減に必要な表
面脂質の分布、吸着および安定性を改善する。ＳＰ−Ｂの欠損で、肺胞壁の肥厚化、細胞
浸潤および間質浮腫などの症状が引き起こされる。この肺損傷は、鬱血、すなわち、気管
支肺胞洗浄液における赤血球数の増加、マクロファージおよび好中球の数の増加、それに
対応する割合の炎症性サイトカインを伴う。ヒトの先天性欠損症およびトランスジェニッ
クマウスでの研究は、ＳＰ−Ｂが誕生後の生存に必須の役割を果たすことを証明している
。ＳＰ−Ｂ遺伝子の突然変異を通じて起こる先天性ＳＰ−Ｂ欠損症は、サーファクタント
の交換にとって重要であり、寿命の最初の数ヶ月間に新生児の気道の致命的な欠陥をもた
らす。従って、肺移植が現在利用可能な唯一の治療的介入である。従って、本発明のＲＮ
Ａで可能にされるＳＰ−Ｂ欠損症のｍＲＮＡ治療は、重要な代替療法である。

本発明のＲＮＡは、この疾患の治療のために、好ましくは媒体としてのパーフルオロカ
ーボンと共に、用いることができる。従って、好ましい態様において、パーフルオロカー
ボンおよびｓ２Ｕ_{(０．２５)}ｍ５Ｃ_{(０．２５)} ＳＰ−Ｂ ｍＲＮＡを含む医薬品が提供
される。この組み合わせは、ＳＰ−Ｂ欠損を有する患者の肺でＳＰ−Ｂを再構成すること
を可能にし、よって生存の可能性が増す。本発明のＲＮＡの高い安定性のため、この患者
については一定間隔で、例えば１週間に１〜３回の投与で充分である。好ましくは、ＳＰ
−Ｂ ｍＲＮＡが、高圧でスプレーすることによってエアゾールとしてこの患者の気管内
に投与される。本発明のｍＲＮＡは上記症状を寛解させて肺機能を向上させることができ
ることが見出され、このことは、実施例で詳細に記載するように、肺のパラメータを試験
することによって実証することができた。

本発明のｍＲＮＡは、治療的手法に効果的に用いることができ、欠如したタンパク質ま
たは欠陥タンパク質による疾患の治療を可能にする。多重修飾ｍＲＮＡの全身投与が可能
である。例えば、望ましくない副作用が起こるために、遺伝子欠陥の影響を受けない細胞
でのｍＲＮＡ翻訳が望ましくない事例があり得る。コードタンパク質を必要とする細胞、
例えば遺伝子欠陥が存在する細胞でのみ本発明のｍＲＮＡを選択的に発現させるために、
いずれか対応するベクターに、例えばリガンドを介して、罹患した組織に宛てることが可
能な配列を補うことができる。更なる態様において、標的細胞では発現されない内因性マ
イクロＲＮＡが結合する配列を本発明のｍＲＮＡを含有するベクターに付加することがで
き、よって本発明のｍＲＮＡは、関連する内因性マイクロＲＮＡを含有する全ての細胞に
おいて分解され、一方で標的細胞では保持される。従って副作用を最小限にすることがで
きる。

本発明のＲＮＡは、例えば欠損遺伝子による疾患を有するために、ＲＮＡにコードされ
るタンパク質またはタンパク質断片を必要とする患者に、それ自体既知の様式で投与する
ことができる。このために、本発明のＲＮＡは、通常の薬剤として許容される添加剤を用
いて、医薬品として調剤される。その医薬品の形態は、投与の場所および性質に依存する
。本発明のＲＮＡは、特に高い安定性によって特徴づけられるため、用いられる場所およ
び形態に依存して、数多くの方法で調剤することができる。本発明のＲＮＡは、非常に安
定で、凍結乾燥して、その形態で加工、例えば破砕または粉砕して保存することができ、
その後必要とされるときに再構成することができ、その生物学的活性を保持することがで
きることを見出した。

本発明のＲＮＡが全身に投与される場合、大抵は、浸透圧を調節する薬剤および安定化
剤などの通常の添加剤と共に注射液として、好ましくは単位剤形として調剤される。安定
化剤としては、例えば、脂質、ポリマーおよびナノシステムまたはリポソームなどの通常
知られているものが用いられる。好ましい態様において、ＥＰＯをコードする本発明に従
って修飾したＲＮＡを含有する、非経口投与に適した組成物が提供される。

好ましい態様において、特にＲＮＡがＳＰ−Ｂタンパク質をコードする場合は、本発明
のＲＮＡが肺による取り込みに適切な形態で、例えば吸入で提供される。このために適切
な配合は、当業者に既知である。この事例において、医薬品は、通常のネブライザーまた
はインヘイラーによって気道へ導入することができる形態、例えば噴霧用液剤や散剤であ
る。液材として投与するために装置は既知であり、ノズルジェットネブライザーと比較し
て低いせん断力で動作する超音波ネブライザーまたは穴あき振動膜を有するネブライザー
が適切である。粉末エアゾール剤も適切である。カチオン脂質と複合したｍＲＮＡと裸の
ｍＲＮＡの両方とも、糖スクロースと共に凍結乾燥した後、次いで呼吸できるサイズに破
砕することができ更に生物学的活性を示す粉末として利用可能である。

好ましい態様において、肺内投与用の薬剤組成物は、トランスフェクション効率を増加
させるために、薬剤組成物に先立って、または薬剤組成物と同時に投与されるパーフルオ
ロカーボンと組み合わされる。

さらに好ましい態様において、本発明に従って修飾したＲＮＡは、インプラントのコー
ティング用の担体としての遅延放出ポリマーに含まれて提供される。このために、本発明
に従って修飾したＲＮＡは、コーティングポリマーおよび／またはポリマー複合体で保護
されたＲＮＡ、それ自体としてまたはそのようなＲＮＡと共に用いることができる。

本発明の更なる主題は、インプラントの内殖に有益な因子をコードするＲＮＡを含有す
る遅延放出ポリマーのコーティングが表面上に存在するインプラントである。本発明によ
ると、１つの因子のみをコードするｍＲＮＡを含有するコーティングと、いくつかの因子
、例えば種々の増殖因子、または増殖因子と血管形成因子、または内殖を促進する更なる
因子、をコードするｍＲＮＡを含有するコーティングの両方ともがここで可能である。種
々の複数の因子は、それらが時差間隔をおいて放出される形態で提供することもできる。

さらに、「１つ以上の増殖因子および１つ以上の血管形成因子をコードするＲＮＡ」と
いう表現は、２つ以上のタンパク質を一つずつまたは融合タンパク質としてコードするＲ
ＮＡと、各ＲＮＡ配列が１つのタンパク質をコードしている異なるタンパク質をコードす
る異なるＲＮＡ配列の混合物との両方を意味することが理解されるべきである。

以下の実施例によって、本発明をさらに説明する。

ＩＶＴ ｍＲＮＡの治療的有用性を評価することができるように、ｉｎ ｖｉｖｏ用途
のために非免疫原性ＩＶＴ ｍＲＮＡを得ることができるか否かを評価した。従って、第
一段階において、修飾ヌクレオシドと共に赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）についてｉｎ
ｖｉｔｒｏ転写したｍＲＮＡを免疫原性およびトランスフェクション効率に関して調べた
。この結果は、２５％のウリジンが２−チオウリジン（ｓ２Ｕ）によって置き換えられ２
５％のシチジンが５−メチルシチジン（ｍ５Ｃ）によって置き換えられた多重修飾ｍＲＮ
Ａが、図１Ａに示すようにヒト初代単核血球に対して顕著に低下した免疫原性を有し、ヒ
ト（図１Ｂ）とマウス（図１Ｃ）の両方のＩＩ型肺胞上皮細胞で８０％を超える高いトラ
ンスフェクション率を有するｓ２Ｕ_{(０．２５)}ｍ５Ｃ_{(０．２５)} ＩＶＴ ｍＲＮＡを生
じることを示す。さらに、そのｍＲＮＡ発現の持続期間は著しく延長した（図２Ａ）。こ
の結果は、この延長した発現が、主として、本発明に従って多重修飾したｍＲＮＡの高い
安定性によるものであることを示す。絶対量評価は、トランスフェクション後７日目にお
よそ１０倍多い両のｓ２Ｕ_{(０．２５)}ｍ５Ｃ_{(０．２５)} ＲＦＰ ｍＲＮＡを示した（図
２Ｂ）。修飾ＲＦＰ ｍＲＮＡのトランスフェクション効率はいくらか低下し、従って高
く長い活性に貢献できなかった（図４）。

次の段階において、修飾ＲＮＡ免疫沈降試験（ＲＩＰアッセイ）を用いて、低下した免
疫応答の基礎となるメカニズムを調べた。この研究により、Ｔｏｌｌ様レセプター（ＴＬ
Ｒ）３（２）、ＴＬＲ７（３）、ＴＬＲ８（４）およびヘリカーゼＲＩＧ−１（５）に対
するＲＮＡ結合により、未修飾レポーターｍＲＮＡ（１）によって免疫系の細胞が活性化
されることが示された。この結果は、本発明の多重修飾ＲＦＰ ｍＲＮＡのＴＬＲ３、Ｔ
ＬＲ７、ＴＬＲ８およびＲＩＧ−１に対する結合が未修飾ＲＦＰ ｍＲＮＡと比較して顕
著に低下したことを示す。この点において、多重修飾は一重ｓ２Ｕ修飾よりもかなり効果
的であった（図２Ｃ）。結合研究から予測されたように、未修飾ＲＦＰ ｍＲＮＡはマウ
スへ静脈内注射されたときにかなりの程度までＩＦＮ−γ、ＩＬ−１２およびＩＦＮ−α
を増加させたが、一方で多重修飾ｓ２Ｕ_{(０．２５)}ｍ５Ｃ_{(０．２５)} ＲＦＰ ｍＲＮＡ
は免疫応答を防いだ（図２Ｄ）。全体として、これらの結果は、本発明に従って多重修飾
したｍＲＮＡがＴＬＲおよびＲＩＧ−１結合を顕著に減少させることによって免疫応答を
顕著に減少させると同時に発現を増加および延長させ、そのようなｍＲＮＡがｉｎ ｖｉ
ｖｏ試験にとって非常に有望な候補であることを示す。

従って、高感度緑色蛍光タンパク質およびルシフェラーゼ（ＥＧＦＰＬｕｃ）の融合タ
ンパク質をコードさせたｓ２Ｕ_{(０．２５)}ｍ５Ｃ_{(０．２５)} ｍＲＮＡをマウスの肺へ直
接導入して未修飾ＥＧＦＰＬｕｃ ｍＲＮＡと比較してｉｎ ｖｉｖｏでルシフェラーゼ
発現を強化し延長させることができるか否かを試験した。この目的のために、例えば（６
）に記載されるようなそれ自体既知の高圧スプレー装置を用い、トランスフェクション効
率を増加させるためにパーフルオロカーボン（フッ素化ＦＣ−７７）を予め投与した（７
）。３時間後にｉｎ ｖｉｖｏで肺内のルシフェラーゼ発現は最大に達したが、総発光量
は処理後２４時間で急速に減少し処理後５日目で低レベルまで減少した（図３Ａおよび３
Ｂ）。これと対照的に、ｓ２Ｕ_{(０．２５)}ｍ５Ｃ_{(０．２５)} ＥＧＦＰＬｕｃ ｍＲＮＡ
で処理したマウスでは処理後最長５日目まで高い発現値が観察された。

これは、治療用の本発明の多重修飾ｍＲＮＡの治療可能性が非常に有望であることを示
す。従って、本発明に従って多重修飾したｓ２Ｕ_{(０．２５)}ｍ５Ｃ_{(０．２５)} ＳＰ−Ｂ
ｍＲＮＡをＳＰ−Ｂ欠損マウスの治療について試験した。ＳＰ−Ｂは、単独遺伝子によ
ってコードされている比較的小型の両親媒性ペプチドであり、ＩＩ型肺胞上皮細胞内でタ
ンパク質分解プロセッシングによって３８１アミノ酸を有する前駆体へ転換されて、肺胞
を覆う（８、９）。これは、肺胞内の表面張力の低減に必要な表面脂質の分布、吸着およ
び安定性を改善する。このタンパク質の遺伝子が欠損していると、誕生後に気道内に疾患
が引き起こされ急速に死に至り得る。ヒトおよびトランスジェニックマウスにおいて、遺
伝性欠陥は事後生存に重要な役割を果たすことが観察されている（１０）。遺伝性ＳＰ−
Ｂ欠損症は、ＳＰ−Ｂ遺伝子の突然変異を通じて生じ、表面活性脂質の形成を妨げ、誕生
後の最初の数ヶ月間に呼吸不全をもたらす（１１）。肺移植が現在利用可能な唯一の治療
的介入である（１２）。従って、ＳＰ−Ｂ欠損症のｍＲＮＡ治療は、この欠損症で生存能
力を確保する代替治療となるであろう。

従って、本発明のＳＰ−Ｂの多重修飾ｍＲＮＡでの遺伝子治療を試験するために、ＳＰ
−Ｂ欠損症のノックアウトマウスモデルを選択した。このために、ＳＰ−Ｂ^−／−ノック
アウトマウスで外因性ドキシサイクリンマウスの制御下でＳＰ−Ｂ ｃＤＮＡを発現した
マウスモデルを選択した。成体ＳＰ−Ｂ^−／−マウスでのドキシサイクリンの使用中止は
、肺のＳＰ−Ｂ含量の減少をもたらし、ＳＰ−Ｂ濃度が正常レベルの２５％未満に下がっ
たときに呼吸不全をもたらした。ドキシサイクリンを投与した条件付きトランスジェニッ
クマウスは正常に生存した（１３、１４）。用いた治療ストラテジーは、次のことを含ん
でいた：（ｉ）ＳＰ−Ｂ ｍＲＮＡの導入前のパーフルオロカーボンでのマウスの前処理
、および（ｉｉ）４週間 、３日毎または４日毎の週２回のＳＰ−Ｂ ｍＲＮＡの反復使
用（図３Ｃ）。この原理を実証する実験を行うため、高圧ネブライザーを用いて、ｓ２Ｕ
_{(０．２５)}ｍ５Ｃ_{(０．２５)} ＳＰ−Ｂ ｍＲＮＡをエアゾールとして条件付きＳＰ−Ｂ
^−／−マウスへ気管内投与した。この処理は、マウスを呼吸不全から救い、マウスの平均
寿命を２８．８±１．１日まで延ばし（図３Ｄ）、最長で規定した研究終了まで延ばした
。これと対照的に、ドキシサイクリンの使用中止後、未処理ＳＰ−Ｂ^−／−マウスは３〜
４日以内に急性の呼吸障害の症状を呈した。これは、パーフルオロカーボン単独、または
コントロールとしてのｓ２Ｕ_{(０．２５)}ｍ５Ｃ_{(０．２５)} ＥＧＦＰＬｕｃ ｍＲＮＡと
一緒のパーフルオロカーボンの投与後にも観察され、そのときマウスは３．８±０．４日
以内に死亡した（図３Ｄ、データは示さず）。さらに、ｓ２Ｕ_{(０．２５)}ｍ５Ｃ_{(０．２
５)} ＳＰ−Ｂ ｍＲＮＡで処理したマウスの肺におけるＳＰ−Ｂの再構成の成功を、Ｓ
Ｐ−Ｂについての免疫染色（図３Ｅ）および半定量的ウエスタンブロット分析（図３Ｆ）
によって確かめた。４週間ｓ２Ｕ_{(０．２５)}ｍ５Ｃ_{(０．２５)} ＳＰ−Ｂ ｍＲＮＡで処
理したマウスにおける肺組織像は正常であったが、一方でｓ２Ｕ_{(０．２５)}ｍ５Ｃ_{(０．
２５)} ＥＧＦＰＬｕｃコントロールｍＲＮＡを投与したマウスの肺は４日後に肺胞壁の
肥厚化、細胞浸潤および間質浮腫を呈した（図３Ｇ）。この肺損傷は、鬱血（赤血球数の
増加）、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）におけるマクロファージおよび
好中球の数の増加、ならびに炎症性サイトカインレベルの上昇を伴ったが（図３Ｈおよび
図Ｓ４）、一方でＳＰ−Ｂ ｍＲＮＡで処理したマウスではこの肺損傷を広範に防いだ。
ドキシサイクリンの使用中止は処置なしで肺機能を悪化させたことが示されている（１４
、１５）。ｓ２Ｕ_{(０．２５)}ｍ５Ｃ_{(０．２５)} ＳＰ−Ｂ ｍＲＮＡでのＳＰ−Ｂ^−／−
マウスの持続的処理は、ドキシサイクリンを投与したＳＰ−Ｂ^−／−マウスのように、正
常な肺機能を維持したことを観察した（図３Ｉおよび図Ｓ５）。

まとめると、これらの結果は、肺におけるＳＰ−Ｂ欠損症の全ての機能的および病理的
パラメータが実質的に改善し、ドキシサイクリンを投与した条件付きＳＰ−Ｂ^−／−マウ
スに匹敵したことを示す。

この結果は、致命的な肺疾患のマウスモデルでの多重修飾ｍＲＮＡの治療有効性を示す
。しかしながら、ｍＲＮＡ治療の更なる適用は、依然として次の点について改善すること
ができる：（ｉ）非罹患組織の細胞での望ましくないｍＲＮＡ翻訳が標的領域外部で望ま
しくない効果をもたらすこと、（ｉｉ）多重修飾ｍＲＮＡが非罹患組織に到達した場合も
、適切な量のｍＲＮＡが提供されてしまうこと、（ｉｉｉ）短い持続期間のｍＲＮＡ活性
については反復した投薬が必要であること。これを改善するために、罹患していない細胞
内での望ましくないｍＲＮＡ翻訳を防ぐために、マイクロＲＮＡバイオロジーを利用する
ことができる。標的細胞では発現されていない内因性マイクロＲＮＡの標的配列を組み込
むことによって、疾患に冒されていない細胞でｍＲＮＡ分解を選択的に引き起こすことが
でき、しかしながら、その間に本発明のｍＲＮＡは標的細胞内に保持され、結果として副
作用を最小限にする（１６、１７）。

更なるアプローチにおいて、放出システムや、細胞表面の特異的レセプターに結合する
ターゲティングリガンドを組み合わせることができ、標的細胞のレセプター介在性トラン
スフェクションが可能とされる。今日ではｍＲＮＡを大量に生成することができて（１８
）多重修飾ｍＲＮＡについてすら大規模な生成のための効率的な生成プロセスが可能であ
ることから、本発明のｍＲＮＡの臨床的使用が可能であり、それは各疾患について特異的
にテーラーメイドしたｍＲＮＡシステムを開発することを可能にし（１９、２０）、よっ
て投薬頻度および短期間活性を最小限とすることができ、これは現在既知の治療では不可
能である。このように、本発明によると、遺伝子欠損による疾患の治療のための効果的な
分子療法が提供される。

ＳＰ−Ｂ欠損マウスの病状の改善または平均寿命の増加が、ＳＰ−Ｂをコードする本発
明の修飾ｍＲＮＡの使用によってのみ達成されることを示すために、更なる実験を行った
。実施例１に記載したマウスモデルおよび条件を用いた。

３群のマウスを用意した。１群のＳＰ−Ｂ欠損マウスに本発明に従って修飾したｍＲＮ
Ａを２回１週間にわたって投与し（Ｂ）、第２群に本発明に従って修飾したｍＲＮＡを１
週間に２回２８日間にわたって投与し（Ｃ）、比較のための第３群のマウスに修飾ＥＧＦ
Ｐ−Ｌｕｃ ｍＲＮＡを投与した（Ａ）。

本発明に従って修飾したＳＰＢ ｍＲＮＡを投与しなかったマウスは短期間の後に死亡
したことが分かった。本発明のＲＮＡを投与したマウスは、本発明のＳＰ−Ｂ ｍＲＮＡ
を与えた間だけは生存した。これは、本発明のＲＮＡが、生物学的に活性であり、必要な
タンパク質と置き換わることができることを証明する。

詳細には、この実験は次のように行った。実施例１で記載したＳＰ−Ｂ ＫＯマウスに
、２回１週間にわたって修飾ＥＧＦＰ−Ｌｕｃ ｍＲＮＡ（Ａ）（ｎ＝１０）もしくは修
飾ＳＰ−Ｂ ｍＲＮＡ（Ｂ）（ｎ＝４）、または１週間に２回２８日間にわたって修飾Ｓ
Ｐ−Ｂ ｍＲＮＡ（Ｃ）（ｎ＝４）を投与した。カプラン-マイヤー生存曲線をプロット
し、ウィルコクソン-ゲーハン試験を行った。飲料水中のドキシサイクリンの添加によっ
て、ＳＰ−Ｂ遺伝子を制御していたトランスジェニックＳＰ−Ｂマウスの肺への１週間以
内２回の二重修飾ＳＰ−Ｂ ｍＲＮＡの気管内投与（Ｂ）は、処理開始前の飲料水からの
ドキシサイクリンの使用中止後マウスの平均生存期間を、ＥＧＦＰ−Ｌｕｃコントロール
ｍＲＮＡの投与後３．４±０．２日と比較して、１０．２±０．５日まで延長した（Ｂ）
ことが分かった。

この結果は図１２の図に表してある。本発明の二重修飾ＳＰ−Ｂ ｍＲＮＡの気管内投
与が実際に救命することが分かる。本発明のｍＲＮＡの添加なしでは、マウスは短期間の
後に死亡する。この実験は、第一にＳＰ−Ｂ ｍＲＮＡがｉｎ ｖｉｖｏで生存に必要な
ＳＰ−Ｂを生成したこと、第二に実験動物を死から守るためにはＳＰ−Ｂ ｍＲＮＡを連
続的に投与しなければならないことも示す。

更なる実験において、全てドキシサイクリンを投与している実施例１で記載したマウス
を用いて、本発明のＲＮＡが投与後の初期に炎症反応を引き起こすか否かを調べた。この
ために、５群を用意して、異なる調製物の投与から８時間後のマウスの気管支肺胞洗浄で
サイトカインレベル、ＩＥＮγおよびＩＬ−１２を測定した。６つの群に次の調製物を投
与した（ｎ＝４）：（ａ）コントロール群、未処理、すなわちパーフルオロカーボンもＲ
ＮＡも投与せず、（ｂ）コントロール群、パーフルオロカーボン、（ｃ）コントロール群
、パーフルオロカーボンおよび未修飾ＳＰ−Ｂ ｍＲＮＡ、（ｄ）本発明群、パーフルオ
ロカーボンおよびｓ２Ｕ_{(０．２５)}ｍ５Ｃ_{(０．２５)} ＳＰ−Ｂ ｍＲＮＡ、（ｅ）コン
トロール群、パーフルオロカーボンおよびＳＰ−ＢプラスミドＤＮＡ。各事例で２０μｇ
（５０μＬ）の調製物を投与した。この結果を図１３に示す。図１３では、平均値±標準
誤差を示す。図１３では次の略称を用いる：Ｄｏｘｙ−ドキシサイクリン、Ｐｆｃ−パー
フルオロカーボン、ｐＤＮＡ−プラスミドＤＮＡ（^＊未処理群と比較してＰ＜０．０５）

この結果は、未修飾ｍＲＮＡまたはプラスミドＤＮＡの気管内投与に対し気管支肺胞洗
浄液の炎症マーカーＩＬ−１２が顕著に上昇し、一方で二重修飾ｍＲＮＡの投与は未処理
マウスと比較してＩＬ−１２の上昇をもたらさないことを示す。二重修飾ｍＲＮＡの投与
は炎症マーカーＩＦＮγのレベルを著しく増加させたが、それはパーフルオロカーボンの
投与後に限ってのみ観察された。これに対して、未修飾ｍＲＮＡの投与またはプラスミド
ＤＮＡの投与もＩＦＮγレベルの顕著な増加をもたらす。よって、本発明に従って修飾し
たｍＲＮＡの使用で炎症反応は予測されず、一方で未修飾ｍＲＮＡの投与またはプラスミ
ドＤＮＡの投与でさえ炎症反応を非常に急速に引き起こす。

本発明に従って修飾したｍＲＮＡの使用の可能性を実証するために、さまざまな種類の
修飾ならびにそれらのトランスフェクションおよび翻訳効率に対する効果について研究し
た。各事例において２００ｎｇのｍＲＮＡでＡ４５９細胞をトランスフェクションして、
何個の細胞がトランスフェクションされたか、そのうち何個の細胞で蛍光タンパク質が翻
訳されたか、について調べた。これは、平均蛍光強度（ＭＦＩ）を用いて評価した。この
結果を図１０Ａに示す。２つの異なるウリジン修飾を用いた本発明に従っていない修飾ｍ
ＲＮＡおよび未修飾ｍＲＮＡと比較して、本発明に従って修飾したｍＲＮＡを試験した。
本発明に従って修飾したｍＲＮＡ分子は、次の通りである。

ｓ２Ｕ／ｍ５Ｃおよびｓ４Ｕ／ｍ５Ｃでは各修飾ヌクレオチドが１０％の含量であり、
ＲＮＡ分子は１０％／１０％のｓ２Ｕ／ｍ５Ｃおよびｓ２Ｕ／５ｍＣに加えて、各々更な
る５％の修飾ヌクレオチド、すなわち１つはＣ_２’ＮＨ_２および１つは５％Ｇ’Ｎ_３を含
んでいた。その結果は、本発明に従って修飾したｍＲＮＡが非常に高いトランスフェクシ
ョン効率を示し、一方で未修飾ｍＲＮＡおよび本発明に従わない修飾ｍＲＮＡが各々遥か
に低いトランスフェクションおよび翻訳効率を示すことを示している。

先に記載した修飾ｍＲＮＡについて、５μｇの各ｍＲＮＡの投与後のヒトＰＢＭＣでの
ＴＮＦ−αレベルを調べることにより、免疫原性も試験した。その結果を図１０Ｂに示す
。明らかに示されるように、未修飾ｍＲＮＡまたは２種類の修飾ウリジンヌクレオチドを
用いたｍＲＮＡの投与についてＴＮＦ−αレベルが顕著に上昇している。本発明に従って
修飾したＲＮＡでのＴＮＦ−αレベルは、未修飾ＲＮＡよりも少なくとも５０％低かった
。

本発明の多重修飾ｍＲＮＡの生成方法

［(ａ) ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写用コンストラクト］
ＲＦＰ ｃＤＮＡ（６７８ｂｐ）のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写のため、ＳＰ６プロモーター
を含むプラスミドｐＣＳ２＋ＤｓＲｅｄＴ４を用いた。ＳＰ−Ｂ ｃＤＮＡ（１１４６ｂ
ｐ）のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写のため、Ｔ７プロモーターを含むｐＶＡＸ１プラスミド（イ
ンビトロジェン社）を用いた。ＥＧＦＰＬｕｃのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写用ベクターを作製
するため、Ｔ７プロモーターを含むｐＳＴ１−２β−ｇｌｏｂｉｎ−ＵＴＲ−Ａ−(１２
０)コンストラクト（１９）を用いた。標準的な分子生物学的手法を用いて、これらのコ
ンストラクトをクローニングした。

［修飾ｍＲＮＡの生成］
ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写用の鋳型を作製するために、ＸｂａＩでｐＣＳ２＋ＤｓＲｅｄ．Ｔ４、ＥＧＦＰＬｕｃおよびＳＰ−Ｂプラスミドを線状化した。線状化したベクターＤＮＡを、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔ ＩＩキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ社）で精製して、分光光度法により評価した。ｍＭＥＳＳＡＧＥ−ｍＭＡＣＨＩＮＥ ＳＰ６またはＴ７ウルトラキット（Ａｍｂｉｏｎ社）を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏ転写を行った。前記ＳＰ６キットは７−メチルＧｐｐｐＧでｍＲＮＡをキャッピングし、一方前記Ｔ７キットは転写反応中にアンチリバースキャップアナログ（ＡＲＣＡ；７−メチル−(３’−Ｏ−メチル)）ＧｐｐｐＧｍ７Ｇ(５’)ｐｐｐ(５’)Ｇを超高収率で作り出した。ＲＮＡ修飾体を生成するために、次の修飾リボ核酸三リン酸を、規定した比率で反応系に添加した：２'−チオウリジン５'−三リン酸、５’−メチルシチジン５’−三リン酸、シュードウリジン５'−三リン酸およびＮ^６−メチルアデノシン５’−三リン酸（全てＴｒｉＬｉｎｋ ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社から入手し、ＨＰＬＣおよび^３１Ｐ ＮＭＲで純度をチェックした）。ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写の後、ｐｏｌｙ(Ａ)ｔａｉｌキット（Ａｍｂｉｏｎ社）を用いてｐＶＡＸ１ ＳＰ−Ｂプラスミド由来のＲＮＡを酵素的にポリアデニル化した。そのポリ(Ａ)尾部はおよそ２００ｎｔの長さであった。キャッピングしたｍＲＮＡ（ＲＦＰ、ＥＧＦＰＬｕｃおよびＳＰ−Ｂ）全てを、ＭＥＧＡｃｌｅａｒキット（Ａｍｂｉｏｎ社）で精製して、Ａｇｌｉｅｎｔ ＲＮＡ ６０００ Ｎａｎｏ Ａｓｓａｙを用いてＢｉｏａｎａｌｙｓｉｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ ２１００（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ社）でサイズおよび純度を分析した。

［細胞トランスフェクション］
［肺細胞トランスフェクション］
ヒト由来およびマウス由来のＩＩ型肺胞上皮細胞株、それぞれＡ５４９およびＭＬＥ１
２を、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、１％ペニシリン-ストレプトマイシンおよび０．
５％ゲンタマイシンを補充した最小必須培地（インビトロジェン社）中で増殖させた。ト
ランスフェクション１日前、１ウェルあたり８０,０００個の細胞を２４ウェルプレート
に蒔いた。その細胞（９０％コンフルエントを超える）を、リポフェクトアミン２０００
（インビトロジェン社）を製造者の指示に従って使用して、２００ｎｇのｍＲＮＡでトラ
ンスフェクションした。４時間後、その細胞をＰＢＳで洗浄し、血清含有培地を加えた。
長期発現の分析のため、その細胞を規則的に再分配した（コンフルエンスが９０％を超え
る場合）。

［ヒトＰＢＭＣトランスフェクション］
液体窒素中で凍結保存したヒトＰＢＭＣ（ＣＴＬ−Ｅｕｒｏｐｅ ＧｍｂＨ）を、３７
℃でＣＴＬ Ａｎｔｉ−Ａｇｇｒｅｇａｔｅ Ｗａｓｈ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔを用いて
注意深く解凍し、その間に滅菌ろ過したＲＰＭＩ−１６４０（インビトロジェン社）をゆ
っくり添加した。データを再現可能にするために、記載した全ての実験について、単一特
徴のバッチのＰＢＭＣを用いた。

［フローサイトメトリー］
上述したようにＲＦＰ ｍＲＮＡでトランスフェクションしたＡ５４９細胞およびＭＬ
Ｅ１２細胞に対して、フローサイトメトリー分析を行った。ＦＡＣＳキャリバー（ＢＤ
Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いて蛍光を測定するために、これらの細胞を、０．２５％
トリプシン／ＥＤＴＡで取り外して、ＰＢＳで３回洗浄して、ＰＢＳ中に再懸濁させた。
トランスフェクション効率は、ＰＢＳでのみ処理したコントロール細胞の蛍光強度を超え
た細胞集団のパーセンテージから算出した。１本のチューブあたり少なくとも２５００個
の細胞が数えられた。このデータをＣｅｌｌｑｕｅｓｔ Ｐｒｏで分析した。

［サイトカイン検出］
ヒトＩＬ−８およびＴＮＦ−αキット（ＲａｙＢｉｏ社）、マウスＩＦＮ−γおよびＩ
Ｌ−１２（Ｐ４０／Ｐ７０）キット（ＲａｙＢｉｏ社）、マウスＩＦＮ−αキット（Ｒｂ
Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ社）を用いて、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）を行った。

［リアルタイムｉｎ ｖｉｔｒｏ転写］
Ｒｅｔｉｃ Ｌｙｓａｔｅ ＩＶＴ（Ａｍｂｉｏｎ社）を用いて、５００ｎｇのＲＦＰ
ｍＲＮＡをｉｎ ｖｉｔｒｏ転写した。メチオニンを最終濃度５０μＭで添加した。こ
の混合物を水浴中で３０℃にてインキュベーションして、サンプルを種々の時間で取り出
して、Ｗａｌｌａｃ Ｖｉｃｔｏｒ^２ １４２０ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｃｏｕｎｔｅ
ｒ（パーキンエルマー社）で５９０ｎｍにて蛍光強度を測定した。

［定量的ＲＴ−ＰＣＴ］
ＲＮｅａｓｙミニキット（キアゲン社）を用いてＡ５４９細胞またはヒトＰＢＭＣから
総ＲＮＡを抽出して（下記ＲＩＰプロトコールを参照）、製品マニュアルに従いｉＳｃｒ
ｉｐｔ ｃＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓキット（バイオ・ラッド社）を用いて、２０μＬ
のバッチで逆転写（ＲＴ）を行った。ｉＱ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘお
よびｉＣｙｃｌｅｒ（バイオ・ラッド社）を用いて、２つのバッチ内で次のプライマーを
用いてｃＤＮＡを増幅した。ＲＦＰ：５’−ＧＣＡＣＣＣＡＧＡＣＣＧＣＣＡＡＧＣ（フ
ォワードプライマー）、およびＲＦＰ：５’−ＡＴＣＴＣＧＣＣＣＴＴＣＡＧＣＡＣＧＣ
（リバースプライマー）。ｉＣｙｃｌｅｒ ＩＱ ｓｏｆｔｗａｒｅ ３．１（バイオ・
ラッド社）を用いて、ベースラインサイクルおよび閾値を自動的に計算して、Ｃ_ｔ値を得
た。

［ＲＮＡ免疫沈降（ＲＩＰ）］
１２．８μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ ２０００を含む１ｍＬのＯｐｔｉＭＥＭ
１を用いて、５μｇのｍＲＮＡで１×１０^６個のヒトＰＢＭＣ（ＣＴＬ−Ｅｕｒｏｐｅ
ＧｍｂＨ）をトランスフェクションした。４時間後、培地に１０％ＦＣＳを補充した。２
４時間後、その細胞懸濁液をチューブに移し、１０分間の３５０ｒｐｍでの遠心分離によ
って細胞をペレットにした。次に、ＲＩＰを行うために、ＣｈＩＰ−ＩＴ Ｅｘｐｒｅｓ
ｓプロトコール（アクティブ・モティフ社）の変形バージョンを用いた。全ての必要な試
薬の調製のために、ＤＥＰＣ処理水（Ｓｅｒｖａ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ社）
を用いた。ＣｈＩＰ−ＩＴマニュアルに従って、細胞に固定液を添加し、次いでグリシン
停止-固定液および氷冷した１×ＰＢＣを加えて、その細胞を４℃にてペレットにした。
次に、細胞を溶解緩衝液に再懸濁してプロテアーゼインヒビターＰＩＣおよびＰＭＳＦを
添加し、３０分間氷上でインキュベーションした。１０分間、４℃にて２４００ｒｐｍで
の遠心分離の後、上清に捕獲反応を行った。ＣｈＩＰ−ＩＴ Ｅｘｐｒｅｓｓマニュアル
に記載された通り、８連ＰＣＲストリップチューブ内で一晩ＴＬＲ−ｍＲＮＡ／ＲＩＧ−
ｍＲＮＡ複合体を磁気ビーズに捕獲した。更に、ＳＵＰＥＲａｓｅ ＲＮａｓｅインヒビ
ター（アプライドバイオシステムズ／Ａｍｂｉｏｎ社）を最終濃度１Ｕ／μＬで添加した
。抗体として、抗ヒトＴＬＲ３マウスＩｇＧ１、ＴＬＲ７ウサギＩｇＧ１およびＴＬＲ８
マウスＩｇＧ１（これらはすべてＩｍｇｅｎｅｘ社から入手）ならびにＲＩＧ−１ウサギ
ＩｇＧ１（ＰｒｏＳｃｉ社）を用いた。ＣｈＩＰ−ＩＴ Ｅｘｐｒｅｓｓプロトコールに
従って、磁気ビーズの洗浄後に、ＴＬＲ−ｍＲＮＡ／ＲＩＧ−ｍＲＮＡ抗体複合体を溶離
して、逆交差結合（ｒｅｖｅｒｓｅ ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋ）させて、プロテイナーゼＫ
で処理した。最後に、溶離したｍＲＮＡに、上述したように、逆転写および定量ＲＴ−Ｐ
ＣＲを行った。

［Ｉｎ ｖｉｖｏ生物発光］
濃度が３０ｍｇ／ｍＬに達するように、Ｄ−ルシフェリン基質を水に溶解して、ｐＨを
７に調整し、最終容積を調整した。この溶液５０μＬを、麻酔したマウスの鼻孔に塗布し
、鼻呼吸により吸収させた（１．５ｍｇルシフェリン／マウス）。１０分後、次のカメラ
設定を用いて、（２１）に記載されたようにＩＶＩＳ１００ ｉｍａｇｉｎｇ ｓｙｓｔ
ｅｍ（Ｘｅｎｏｇｅｎ社）で生物発光を測定した：視野１０、ｆ１ ｆ−ｓｔｏｐ、高分
解能、照明時間１〜１０分。Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｖｅｒｓｉ
ｏｎ ２．５０（Ｘｅｎｏｇｅｎ社）を用いてバックグラウンドを差し引き、肺領域での
シグナルを定量的に評価および分析した。

［動物実験］
６〜８週齢のメスのＢＡＬＢ／Ｃマウス（チャールズ・リバー・ラボラトリーズ）を、
特定の病原体非存在条件下で維持し、１２時間照明１２時間消灯サイクルで個別の換気し
たケージ内で維持し、適宜に食糧および水を補給した。実験の開始前少なくとも７日間、
実験動物を気候順化させた。全ての動物の操作は、地方倫理委員会によって承認および点
検され、ドイツ動物保護法のガイドラインに従って行った。尾静脈への注射を除くすべて
の実験について、実験動物を、メデトミジン（０．５ｍｇ／ｋｇ）、ミダゾラム（５ｍｇ
／ｋｇ）およびフェンタニル（５０μｇ／ｋｇ）の混合物でｉ．ｐ．(腹腔内)麻酔した。
各実験の後、アチパメゾール（５０μｇ／ｋｇ）、フルマゼニル（１０μｇ／ｋｇ）およ
びナロキソン（２４μｇ／ｋｇ）からなる解毒剤を実験動物にｓ．ｃ．(皮下)投与した。
ＥＬＩＳＡ試験のための血液は、へパリン処置した１．３ｍｍキャピラリー（Ｍａｒｉｅ
ｎｆｅｌｄ社）を用いて、眼球後方静脈の穿刺によって、様々なときに得た。

［尾静脈への注射］
２５μｇのＲＦＰ ｍＲＮＡを、Ｍｅｇａｆｅｃｔｉｎ（ＭＰバイオメディカルヨーロ
ッパ）とｍＲＮＡの脂質に対する比率０．２５でｉｎ ｖｉｖｏで混合し、製造者の推奨
に従ってＥｎｈａｎｃｅｒ−３を添加した。注射複合物の完全性および粒子サイズは、Ｚ
ｅｔａ−ＰＡＬＳ／ｚｅｔａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｂｒｏｏｋｈａ
ｖｅｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社）を用いて動的光散乱（ＤＬＳ）で決定した。マウスを
固定器に置いて、２７ゲージ針および１ｍＬシリンジを用いて、１００μＬのｍＲＮＡ／
ｍｅｇａｆｅｃｔｉｎ溶液（５μｇのｍＲＮＡに相当）を３０秒間以内に尾静脈へ注射し
た。

［高圧噴霧による気管内投与］
ＢＡＬＢ／ｃマウスおよびＳＰ−Ｂ^−／−マウスを、（１４）に記載されたように麻酔
し、プレートシステム（Ｈａｌｏｗｅｌｌ ＥＭＣ）上に固定して、上側の歯を４５°の
角度にした。咽頭を最適に照らすために、改良冷光オトスコープＢｅｔａ ２００（Ｈｅ
ｉｎｅ Ｏｐｔｏｔｅｃｈｎｉｋ社）を用いた。小型のスパチュラでマウスの下あごを開
けて、尖っていない鉗子を用いて舌を横へよけて中咽頭を最大に露出させた。ＦＭＪ−２
５０型高圧シリンジに接続した１Ａ−１Ｃ型ミクロ噴霧機（両方ともＰｅｎｎＣｅｎｔｕ
ｒｙ社から入手）を気管内に挿入し、２５μＬのフロリナートＦＣ−７７（シグマ社）お
よび２５μＬのルシフェラーゼｍＲＮＡ溶液（１０μｇ）または５０μＬのＳＰ−Ｂ ｍ
ＲＮＡ溶液（２０μｇ）をうまく投与した。５秒後にミクロ噴霧機を引き抜き、５分後に
はマウスを支持台から外した。

［肺機能測定］
上に記載したように、ホモ接合型ＳＰ−Ｂ^−／−マウス±ドキシサイクリン±修飾ｍＲ
ＮＡを麻酔した。自発呼吸を予防するため、臭化ベクロニウム（０．１ｍｇ／ｋｇ）を腹
腔内に注射した。（２２）に記載されるように、肺機能測定を行った。簡単に言うと、尖
っていないスチールカニューレ（外径１ｍｍ）を気管切開術で気管内へ挿入した。ピスト
ンポンプレスピレーターがレスピレーターとしても測定装置としても役立った（ｆｌｅｘ
ｉＶｅｎｔ、ＳＡＶ）。周期的な換気の間、レスピレーターは、制御した容積および圧力
の制限換気（Ｖｔ＝１０μＬ／ｇ、Ｐｍａｘ＝３０ｃｍＨ_２Ｏ、２．５ＨｚでのＰＥＥＰ
２〜３ｃｍＨ_２Ｏ、１００％酸素）に設定した。用いたＶｔは、ドキシサイクリンを投与
していた動物１匹あたり８．４±１．４μＬ／ｇであり、ドキシサイクリンおよびｍＲＮ
Ａ（Ｎ．Ｓ．）を投与していた動物１匹あたり８．９±０．４μＬ／ｇであった。標準換
気量履歴を作成するために、１秒間に２回の１５μＬ／ｇの送気の後、５分間隔で呼吸器
系の動的機械的特性および肺エントリーインピーダンスを測定した。振動測定のために、
ＰＥＥＰレベルで換気を停止した。８秒の疑似ランダム振動シグナルで構成される強制振
動（ＦＯＴ）により呼吸器系のインピーダンス（Ｚ_ｒｓ）を決定するために、３ｍＬ／ｇ
の振幅を用いた。強制シグナルは１．７５〜１９．６Ｈｚの間の振動数を有していた（２
３、２４）。データは、２５６Ｈｚで収集し、６６％オーバーラップを有する４秒のウイ
ンドウで分析した。肺インピーダンスデータは、周波数領域内で呼吸器系の抵抗（実数部
）および反応性（虚数部）として表された。Ｈａｎｔｏｎｓら（２５）によって提案され
たように、肺の定位相モデルを用いて肺インピーダンスデータ（Ｚｒｓ）を再分割した。
このモデルでは、Ｚｒｓが、次の方程式に従って、呼吸抵抗（Ｒｎ）、気道慣性（慣性）
、組織弾性（ＨＬ）および組織減衰（Ｇ_Ｌ）で構成される：
Ｚｒｓ ＝ Ｒａｗ ＋ ｊωｌａｗ ＋ （Ｇ_Ｌ−ｊＨ_Ｌ）／ω^α
（式中、ωは角周波数であり、ωはＺｒｓの周波数依存である（ω＝（２／ωｔａｎ^−１
(１／ω)）） ）。肺ヒステリシス性（ｈｓｔｅｒｉｓｉｖｉｔｙ）（ｅｔａ＝Ｇ_Ｌ／Ｈ
_Ｌ）は、組織減衰および組織弾性の両方が含まれる肺組織組成の尺度である（２６、２７
）。各測定について、定位相モデルを適合について自動的に試験した。適合の質は測定の
干渉性（ＣＯＤ）として表され、ＣＯＤが０．８５未満の場合にデータは拒否される。

［サーファクタントタンパク質の分析］
Ｂｉｏ−Ｒａｓタンパク質アッセイキット（バイオ・ラッド社）で、気管支肺胞洗浄上
清の総タンパク質含量を測定した。ＮＯＶＥＸ Ｘｃｅｌｌ ＩＩミニセルシステム（Ｎ
ｏｖｅｘ社）を用いてＮｕＰａｇe１０％ビス-トリスゲル上で非還元条件下１０μｇの総
タンパク質を分離した。電気泳動の後、タンパク質をＮｕＰａｇｅブロットモジュール（
Ｎｏｖｅｘ社）でＰＶＤＦメンブレン（イモビロンＰ）上に移した。ＳＰ−Ｂ（ｃ３２９
、Ａｌｔａｎａ ＡＧ社のＷ．Ｓｔｅｉｎｈｉｌｂｅｒ博士より供与）に対して検出され
たポリクローナルウサギ抗血清でサーファクタントタンパク質Ｂ（ＳＰ−Ｂ）を検出し、
次に西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートポリクロナルヤギ抗ウサギ抗ＩｇＧ（１
：１０,０００、Ｄｉａｎｏｖａ社）で改良化学発光試験（アマシャムバイオサイエンス
社）を行った。これらの条件下で、この試験は１気道あたり約２．５ｎｇのＳＰ−Ｂを検
出できた（２８）。化学発光検出システムとして、ＡｄｉｎａイメージアナライザーでＤ
ＩＡＮＡ ＩＩＩ ｄｅｖ.１.０.５４（Ｒａｙ ｔｅｓｔ Ｉｓｏｔｏｐｅｎｍｅｓｓ
ａｇｅｒａｅｔｅ ＧｍｂＨ）を用い、データはＱｕａｎｔｉｔｙ Ｏｎｅ ４.６.７（
バイオ・ラッド社）で定量的に評価した。

［蛍光顕微鏡分析］
固定（３％パラホルムアルデヒド）してパラフィンワックス中に包埋した切片に、製造
者（Ａｂｃａｍ社、ｗｗｗ.ａｂｃａｍ.ｃｏｍ／ｔｅｃｈｎｉｃａ）に推奨される通りに
、免疫組織化学検査を行った。スライドを、抗ヒト抗マウスＳＰ−Ｂ抗体およびテキサス
レッドコンジュゲート抗ウサギＩｇＧ抗体（両方ともＡｂｃａｍ社から入手、１：５００
）と共にインキュベーションして、ＤＡＰＩで対比染色した。Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｅ
ｒｔ １３５により蛍光像を得た。

［統計］
複数群の間のｍＲＮＡ発現の差は、ＲＥＳＴ２００５ソフトウエアを用いてペアワイズ
固定再分配無作為化検定（ｐａｉｒｗｉｓｅ ｆｉｘｅｄ ｒｅａｌｌｏｃａｔｉｏｎ
ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ ｔｅｓｔ）によって分析した（２９）。生物発光の減衰の
半減期は、Ｐｒｉｓｍ ５.０で算出した。他の分析は全て、ＳＰＳＳ １５（ＳＰＳＳ
社）でウィルコクソン-マン-ホイットニー検定を用いて行った。データは、平均値±ＳＥ
Ｍ（平均値の標準偏差）または中央値±ＩＱＲ（四分位範囲）として示し、Ｐ＜０．０５
（両側）を統計的有意とみなした。

本発明にしたがってＥＰＯをコードするｍＲＮＡを多重修飾した。

実施例３に記載した方法を本質的に用いて、ＥＰＯコード部分を含有する修飾ｍＲＮＡ
を生成した。このｍＲＮＡの発現効率を試験した。このために、５μｇの本発明に従って
修飾したｍＲＮＡまたは未修飾ｍＲＮＡをマウスへ筋肉内（ｉ．ｍ．）注射した。マウス
の各群は４匹であった。ＲＮＡの投与後１４日目と２８日目に、血清中のＥＰＯの含量を
ＥＬＩＳＡ法で定量的に評価した。同じ実験でマウスの全血中のヘマトクリット値を評価
した。添付した図１１に示すデータは其々平均値±ＳＥＭを表す。スキャッターブロット
は、個々のヘマトクリット値を示す。バーは中央値を示す。^＊Ｐ＜０．０５：各時点で未
処理群と比較；＋Ｐ＜０．０５：各時点で未修飾ｍＥＰＯ群と比較。

（ｃ）データは、平均値±ＳＥＭを示す。ヒトＰＢＭＣを５μｇの未修飾ＲＦＰ ｍＲ
ＮＡまたは修飾ＲＦＰ ｍＲＮＡでトランスフェクションし、回収率をＴＬＲ−３、ＴＬ
Ｒ−７およびＴＬＲ−８に特異的な抗体を用いてＲＩＰで測定した。四角形は平均値±Ｉ
ＱＲを示す。線は、最小値および最大値を示す。未修飾ｍＥＰＯ群と比較して^＊Ｐ＜０．
５、^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊Ｐ＜０．００１。

（ｄ）５μｇの未修飾ｍＥＰＯ ｍＲＮＡおよび修飾ｍＥＰＯ ｍＲＮＡをマウスへ静
脈内注射した（各群につきｎ＝４）。２４時間後、血清中のインターフェロン−γ、ＩＬ
−１２およびインターフェロン−αのレベルをＥＬＩＳＡによって評価した。

図からわかるように、本発明に従って修飾したＲＮＡについては炎症マーカーが非病的
な範囲内であり、一方で未修飾ＲＮＡまたは修飾ウリジンヌクレオチドのみを有する修飾
ＲＮＡについては炎症マーカーが顕著に上昇した。

このように、本発明によると、非常に安定であると同時に免疫反応を少し引き起こすか
または全く引き起こさない、ＥＰＯをコードするｍＲＮＡが提供される。このようなｍＲ
ＮＡは、エリスロポエチン欠損症の治療のために有利に用いることができる。その高い安
定性のため、投与は２〜４週間ごとのみ必要である。

本発明に従って修飾したＥＰＯコードｍＲＮＡの反復投与がヘマトクリット値にどのよ
うに影響するかを調べた。これは、本発明に従って修飾したｍＲＮＡが、身体へ投与され
た場合にも長期間にわたり活性なままでいるか否かを示すものであった。本発明のｍＲＮ
Ａに対する免疫反応は、例えばその活性を低下させるであろう。

従って、１０μｇの修飾ＥＰＯ ｍＲＮＡ（実施例６に記載）を０日目、２１日目およ
び３４日目にマウスに筋肉内投与した（ｎ＝１０）。次いで、０日目、２１日目、３４日
目、４２日目および５１日目にマウスから採取した全血中のヘマトクリット値を測定した
。その結果を図１４に示す。図のデータは平均値±標準偏差を示す。＊Ｐ＜０．０５：０
日目のヘマトクリット値と比較。

これらの結果は、本発明に従って修飾したｍＲＮＡの反復投与がヘマトクリット値の長
期にわたる上昇をもたらすことを裏付けている。このことは、前記ｍＲＮＡが、多数回投
与された場合でも活性なままであることを示している。

本発明に従って修飾したｍＲＮＡは、治癒またはインプラントの近傍への内殖を促進す
ることによって治癒過程または内殖を促進するためのタンパク質を運ぶことにも適する。
本発明に従って修飾したｍＲＮＡがコーティングの形態でのチタン表面に塗布された場合
に安定且つ持続的に発現されることを示すため、ルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡを
含有するコーティングをチタンプレート上に塗布した。次いで、ルシフェラーゼが細胞の
近傍、細胞の非存在下または細胞内で検出可能か否か、またどの位の長さ検出可能かにつ
いて調べた。

細胞の近傍へ放出されるタンパク質、例えば増殖因子または血管形成因子などのモデル
として、異なるタンパク質をコードする２つの配列、すなわち、発現している細胞から分
泌されるルシフェラーゼのＲＮＡを実験のために用いた。さらに、分泌されないが細胞内
にとどまるルシフェラーゼをコードするＲＮＡを、細胞内でいくつかの種類の効果を有す
ることとなるタンパク質のモデルとして用いた。分泌モデルのために、メトリジア（Ｍｅ
ｔｒｉｄｉａ）ルシフェラーゼをコードし、野生型と比較して２５％のウリジン単位がｓ
２Ｕで置き換えられ２５％のシチジン単位がｍ５Ｃで置き換えられたＲＮＡを用いた。非
分泌タンパク質モデルのために、同様に、２５％のウリジン単位がｓ２Ｕで置き換えられ
２５％のシチジン単位がｍ５Ｃで置き換えられたホタルルシフェラーゼコードｍＲＮＡを
用いた。

本発明のｍＲＮＡ調製物は、ポリマーとの複合体として保護され、コーティング材料か
らの放出後も活性なままであり長期間にわたり発現したことが分かった。本発明に従って
修飾したｍＲＮＡによってコードされた個々のタンパク質は、長期間にわたり検出可能で
あったことが分かった。

この試験のため、本発明に従って修飾したｍＲＮＡを、ポリマー複合体によって保護し
、チタンプレート上の層として施した担体材料中に組み込んだ。担体材料は、この目的の
ために周知の材料であり、含有したｍＲＮＡを徐々に選択的に放出することができるポリ
ラクチド（ＰＤＬＬＡ）であった。このようなコーティングの利点は、放出を特異的に調
節することができることである。この結果は、分解に伴って放出されたポリラクチド断片
がｍＲＮＡの活性を損なわず、このシステムが非常に適切であることを示している。ｍＲ
ＮＡ自体は、コーティングポリマーによって安定化されている。

この実験のため、メトリジアルシフェラーゼコードプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）また
は修飾ｍＲＮＡを用いた。２００μＬのＨ_２Ｏ中のそれぞれ９μｇのメトリジアルシフェ
ラーゼｐＤＮＡまたは二重修飾ｓ２Ｕ_{(０．２５)}ｍ５Ｃ_{(０．２５)} ｍＲＮＡ（＋必要に
応じて５００μｇのラクトース）を、２００μＬのＨ_２Ｏ中の９．４μｇのＬ−ＰＥＩ（
Ｌ−ポリエチレンイミン）と複合体を形成させた。この後、この複合体を１００μＬのコ
ーティングポリマー溶液（４０９．１ｍＭのＰ６ＹＥ５Ｃ、２．４μＬ）へ導入して、一
晩凍結乾燥させた（コーティングポリマーＰ６ＹＥ５Ｃは、欧州特許第１１９８４８９号
明細書に記載された通りに調製した）。この後、この複合体を氷上で７２μＬのＰＤＬＬ
Ａ（ポリ−ＤＬラクチド）／ＥｔＯＡｃ（５０ｍｇ／ｍＬ ＰＤＬＬＡ）混合物に懸濁さ
せ、マイクロポッター（ｍｉｃｒｏｐｏｔｔｅｒ）によって分散させた。９６ウェルプレ
ート中の高圧滅菌チタンプレート（ｒ＝３ｍｍ、それぞれ１８μＬ）をこの分散液でコー
ティングした。もう一晩の凍結乾燥の後、Ａ５４９細胞を含む２００μＬのＲＰＭＩ−１
６４０培地を添加した（５０００細胞／２００μＬ）。２日目から、各ウェルにつき５０
μＬの上清を取り、培地を変えて、メトリジアルシフェラーゼ発現を各々につき１００μ
Ｌのセレンテラジン溶液（最終濃度０．００３ｍＭ）の手法によって翌日から測定した。

更なる実験において、リン酸カルシウム粒子上に付着させてその形態でコーティングへ
導入した場合の、本発明に従って修飾したメトリジアルシフェラーゼコードｍＲＮＡの活
性を試験した。このために、４μｇのメトリジアルシフェラーゼｓ２Ｕ_{(０．２５)}ｍ５Ｃ
_{(０．２５)} ｍＲＮＡを含む６００μＬの１×ＨＢＳを、毎回３３μＬの２．５Ｍ Ｃａ
Ｃｌ_２と混合した。３０分後、９６ウェルプレート中の高圧滅菌チタンプレート（ｒ＝３
ｍｍ、それぞれ１８μＬ）をこの溶液でコーティングした。一晩の凍結乾燥の後、Ａ５４
９細胞を含む２００μＬのＲＰＭＩ−１６４０培地を添加した（５０００細胞／２００μ
Ｌ）。２日目から、５０μＬの各上清をとり、培地を変えて、メトリジアルシフェラーゼ
発現を各々につき１００μＬのセレンテラジン溶液（最終濃度０．００３ｍＭ）の手法に
よって翌日から測定した。

この結果は図１５の図にみることができる。この結果は、本発明に従って修飾したｍＲ
ＮＡが、ポリマーコーティングによって保護され、遅延放出マトリックスへ導入されて、
チタンインプラント上に塗布された場合でも活性を有したままでいることを明らかに示し
ている。さらに、本発明に従って修飾したｍＲＮＡは、生物学的に活性なままであり、連
続してコードタンパク質へ翻訳される。分泌能力も保持されており、それはメトリジアル
シフェラーゼが細胞培養液中で（例えばＢＭＰ−２などの分泌型骨増殖因子のモデルとし
て）検出することができる事実からわかる。加えて、この結果は驚くべきことに、修飾ｍ
ＲＮＡを含むコーティングが、類似プラスミドＤＮＡを含むチタンインプラントコーティ
ングよりも高いタンパク質発現を生じたことを示している。ｍＲＮＡ／ＰＥＩ複合体がチ
タンインプラントコーティングへの組み込みの前にコーティングポリマーと共に提供され
る場合、コーティングポリマー無しで同じ複合体を使用する場合（図では、修飾ｍＲＮＡ
／ＩＰＥＩ−Ｐ６ＹＥ５Ｃ）よりも依然として高いタンパク質発現が得られる。さらに、
修飾ｍＲＮＡがその生物学的活性を失うことなく、添加剤としてのラクトースの添加が可
能であることが分かった。

この結果は、リン酸カルシウム粒子上に沈着した修飾ｍＲＮＡが、その活性を保持し、
チタンインプラントコーティングでその有利な特性を発揮できることも示している。その
生物学的活性は保持されている。リン酸カルシウムは骨へ直接組み込むことができるため
、これは非常に重要である。

上で示したように、ホタルルシフェラーゼをコードするＤＮＡまたはＲＮＡを用いて、
更なる実験を行った。このために、２００μＬのＨ_２Ｏ中のそれぞれ９μｇのホタルルシ
フェラーゼｐＤＮＡまたは修飾ｓ２Ｕ_{(０．２５)}ｍ５Ｃ_{(０．２５)} ｍＲＮＡを、２００
μＬのＨ_２Ｏ中の９．４μｇのＬ−ＰＥＩと複合体を形成させた。この後、この複合体を
１００μＬのコーティングポリマー溶液（４０９．１ｍＭのＰ６ＹＥ５Ｃ、２．４μＬ）
へ導入して、一晩凍結乾燥させた。次に、この複合体を氷上で７２μＬのポリ−ＤＬ−乳
酸（ＰＤＬＬＡ）／酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）（５０ｍｇ／ｍＬ ＰＤＬＬＡ）混合物に
溶解させ、マイクロポッターによって分散させた。９６ウェルプレート中の高圧滅菌チタ
ンプレート（ｒ＝３ｍｍ、それぞれ１８μＬ）をこの分散液でコーティングした。もう一
晩の凍結乾燥の後、Ａ５４９細胞を含む２００μＬのＲＰＭＩ−１６４０培地を添加した
（５０００細胞／２００μＬ）。２日目から、各ウェルにつき１０μＬの３５０μＭ Ｄ
−ルシフェリンを添加し、２０分間インキュベーションして、バイオイメージングにより
ルシフェラーゼ発現を測定した。その結果を図１６に示す。図１６の図からわかるように
、チタンインプラントを本発明に従って修飾したｍＲＮＡでコーティングした間も、その
ｍＲＮＡはさらに生物学的活性を保持してコードタンパク質を翻訳することができる。形
成したタンパク質は細胞内にとどまり、細胞内で検出することができる。加えて、この結
果は、修飾ｍＲＮＡを含むコーティングが類似プラスミドＤＮＡを含むチタンインプラン
トコーティングよりも高いタンパク質発現をもたらすことを示している。

本発明に従って修飾したｍＲＮＡの発現を、コードタンパク質が必要とされる細胞内で
のみ発現されて他の細胞では発現されないように制御するために、前記ｍＲＮＡ発現の細
胞特異的調節を可能にするためのマイクロＲＮＡ結合部位を前記ｍＲＮＡ中に組み込んだ
。

このために、１０％ＦＣＳおよび１％ペニシリン−ストレプトマイシンを含むＭＥＭ中
でＨＥＫ２９３細胞を培養した。トランスフェクションの２４時間前、２４ウェルプレー
トへ１ウェルあたり１００，０００個の細胞を蒔いた。トランスフェクション直前、培地
を４００μＬのＯｐｔｉｍｅｍ（インビトロジェン社）で置き換えた。１０％ＦＣＳおよ
び１％ペニシリン−ストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ−１６４０培地中でＵ９３７細胞
を培養した。トランスフェクション直前、２４ウェルプレートへ１ウェルあたり８００，
０００個のＵ９３７細胞を含む４００μＬのＯｐｔｉｍｅｍ培地（インビトロジェン社）
を播いた。各ウェルのために、１００ｎｇのＥＧＦＰ ｍＲＮＡおよび２５０ｎｇのＲＦ
Ｐ ｍｉＲＮＡ−ＢＳ ｍＲＮＡ（下記を参照）をＯｐｔｉｍｅｍで５０μＬに希釈した
。２μＬのリポフェクトアミン２０００をＯｐｔｉｍｅｍで５０μＬとし、室温で５分間
インキュベーションした。次に、ｍＲＮＡ溶液をピペットでリポフェクトアミン２０００
溶液へ移し、さらに２０分間室温でインキュベーションした。得られた溶液をピペットで
細胞と共にウェルへ移し、４時間後にペニシリン−ストレプトマイシン（５μＬ）を添加
して、インキュベーター内で一晩インキュベーションを続けた。この後、ＨＥＫ２９３細
胞を、ＰＢＳで洗浄し、トリプシンの添加によってウェルの底からはがした後、３００Ｇ
にて５分間遠心分離を行った。Ｕ９３７細胞も３００Ｇにて５分間遠心分離を行った。上
清を除去した後、それぞれの細胞をＰＢＳで２回洗浄した。次に、ＦＡＣＳ分析のために
、細胞を５００μＬのＰＢＳに再懸濁させた。図１７の２つの図では、ＥＧＦＰ発現のＲ
ＦＰ発現に対する比率が、陽性細胞の数として（図１７ａ）および平均ＲＦＰ蛍光強度と
して（図１７ｂ）示されている。

この結果は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写ｍＲＮＡへのマイクロＲＮＡ結合部位への組み込み
によって、ｍＲＮＡの発現を細胞特異的に調節できることを示している。ＲＦＰ ｍｉＲ
ＮＡ−ＢＳ ｍＲＮＡにおいて、互いに短いスペーシング配列によって隔てられているマ
イクロＲＮＡ結合部位の４回反復の非翻訳配列が、ＲＦＰ配列の３’末端側でポリＡ尾部
の５’末端側に位置している（配列番号１）。マイクロＲＮＡ１４２−３ｐに結合するマ
イクロＲＮＡ結合部位を用いた。このマイクロＲＮＡは、Ｕ９３７細胞などの造血細胞で
発現されるが、ＨＥＫ−２９３細胞などのその他起源の細胞では発現されない。マイクロ
ＲＮＡ１４２−３ｐがＲＦＰ ｍｉＲＮＡ−ＢＳ ｍＲＮＡと結合する（例えばＵ９３７
細胞において）場合、ｍＲＮＡの分解はＲＮＡ干渉によって開始される。結果としてＲＦ
Ｐの形成は低減され、すなわち、少ない細胞が、マイクロＲＮＡ１４２−３ｐが存在しな
い細胞よりも低い強度でＲＦＰを発現する。本発明に従って修飾したｍＲＮＡでこの原理
も充分に機能していることを示すため、Ｕ９３７細胞およびＨＥＫ−２９３細胞をそれぞ
れＥＧＦＰ ｍＲＮＡ（マイクロＲＮＡ結合部位が無い）およびＲＦＰ ｍｉＲＮＡ−Ｂ
Ｓ ｍＲＮＡ（マイクロＲＮＡ１４２−３ｐに対するマイクロＲＮＡ結合部位の４回縦列
反復を有する）でコトランスフェクションし、次いでＥＧＦＰおよびＲＦＰの発現をＦＡ
ＣＳによって測定した。ＲＦＰ ｍｉＲＮＡ−ＢＳ ｍＲＮＡはＲＮＡ干渉のためにＨＥ
Ｋ−２９３細胞よりもＵ９３７細胞においてより急速に分解されたがＥＧＦＰ ｍＲＮＡ
は両方の細胞内で同等に安定であることから、ＥＧＦＰのＲＦＰに対する比率はＵ９３７
細胞よりもＨＥＫ−２９３細胞において高いであろうことが予測される。これは、行った
実験で確かめることができた。その図は、ＥＧＦＰ陽性細胞数に対する標準化の後のＲＦ
Ｐ陽性Ｕ９３７細胞数が、ＨＥＫ−２９３細胞のものよりも顕著に低いことを明らかに示
している。１細胞あたりで形成されたＲＦＰの量についても同じことが当てはまる。従っ
て、この結果は、マイクロＲＮＡ結合部位の組み込みにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写ｍＲ
ＮＡの生物学的活性の規模を細胞へのトランスフェクション後に制御できることも明らか
に示している。このように、ｍＲＮＡ翻訳は、ｍＲＮＡ翻訳が望ましくない細胞内で抑制
することができる。これにより、副作用も低減することができる。

この実施例で実験のために用いたｍＲＮＡは、次の配列（配列番号１）を有する。ＲＦＰ配列は、灰色の背景で示される。下線付き配列は、スペーシング配列を有するマイクロＲＮＡ１４２−３ｐに対するマイクロＲＮＡ結合部位の４回縦列反復を示している。合成後に、この配列をＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲｖを用いてベクターｐＶＡＸ１へクローニングした。

[参考文献]

Claims (30)

1. タンパク質またはタンパク質断片をコードする配列を有するポリリボヌクレオチドであって、
   未修飾ヌクレオチドと修飾ヌクレオチドの組み合わせを含有し、ウリジンヌクレオチドの５〜５０％およびシチジンヌクレオチドの５〜５０％がそれぞれ修飾ウリジンヌクレオチドおよび修飾シチジンヌクレオチドである、ポリリボヌクレオチド。
2. ヌクレオチドＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰおよびＵＴＰのヌクレオチド混合物から得ることができ、シチジンヌクレオチドの５％〜５０％およびウリジンヌクレオチドの５％〜５０％が修飾されている、タンパク質またはタンパク質断片をコードする配列を有するポリリボヌクレオチド。
3. ポリリボヌクレオチドがｍＲＮＡであることを特徴とする、請求項１または２記載のポリリボヌクレオチド。
4. ｍＲＮＡが生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で転写されたｍＲＮＡ（ＩＶＴ ｍＲＮＡ）であることを特徴とする、請求項３記載のポリリボヌクレオチド。
5. 前記ＲＮＡが、その欠陥または不足が疾患を引き起こし、病気を緩和、予防もしくは治療することができる、または有益なもしくは必要な機能に貢献することができる、タンパク質またはタンパク質断片をコードすることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリリボヌクレオチド。
6. ウリジンヌクレオシドの１５％〜３０％、好ましくは７．５％〜２５％、およびシチジンヌクレオシドの１５％〜３０％、好ましくは７．５％〜２５％が修飾されていることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリリボヌクレオチド。
7. 少なくとも２種類の修飾ウリジンヌクレオシドおよび／または少なくとも２種類の修飾シチジンヌクレオシドを含むことを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリリボヌクレオチド。
8. 少なくとも１種の修飾ウリジンヌクレオシドおよび／またはシチジンヌクレオシドが、１つ以上の機能運搬体の付着のための官能基を修飾として有することを特徴とする、請求項７記載のポリリボヌクレオチド。
9. 修飾ウリジンが、２−チオウリジン、５−メチルウリジン、シュードウリジン、５−メチルウリジン５’−三リン酸（ｍ５Ｕ）、５−ヨードウリジン５’−三リン酸（Ｉ５Ｕ）、４−チオウリジン５’−三リン酸（Ｓ４Ｕ）、５−ブロモウリジン５’−三リン酸（Ｂｒ５Ｕ）、２’−メチル−２’−デオキシウリジン５’−三リン酸（Ｕ２’ｍ）、２’−アミノ−２’−デオキシウリジン５’−三リン酸（Ｕ２’ＮＨ２）、２’−アジド−２’−デオキシウリジン５’−三リン酸（Ｕ２’Ｎ３）および２’−フルオロ−２’−デオキシウリジン５’−三リン酸（Ｕ２’Ｆ）から選択されることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか１項に記載のポリリボヌクレオチド。
10. 修飾シチジンが、５−メチルシチジン、３−メチルシチジン、２−チオシチジン、２’−メチル−２’−デオキシシチジン５’−三リン酸（Ｃ２'ｍ）、２’−アミノ−２’−デオキシシチジン５’−三リン酸（Ｃ２'ＮＨ２）、２’−フルオロ−２’−デオキシシチジン５’−三リン酸（Ｃ２'Ｆ）、５−ヨードシチジン５’−三リン酸（Ｉ５Ｕ）、５−ブロモシチジン５'−三リン酸（Ｂｒ５Ｕ）および２’−アジド−２’−デオキシシチジン５’−三リン酸（Ｃ２'Ｎ３）から選択されることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか１項に記載のポリリボヌクレオチド。
11. ｍ７ＧｐｐｐＧキャップおよび／または少なくとも１つのＩＲＥＳおよび／またはポリＡ尾部を５’末端に有することを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のポリリボヌクレオチド。
12. 転写置換療法の使用のための請求項１〜１１のいずれか１項に記載のポリリボヌクレオチド。
13. 一般的な状況または特異的な状況において、身体に有益且つ支援的な少なくとも１つの因子をコードするｍＲＮＡ配列を含むことを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のポリリボヌクレオチド。
14. 増殖因子、血管形成因子、刺激物質、誘導物質、酵素または他の生物学的活性分子をコードするＲＮＡを含むことを特徴とする、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のポリリボヌクレオチド。
15. サーファクタントタンパク質Ｂ（ＳＰ−Ｂ）、ＥＰＯ、ＡＢＣＡ３、ＢＭＰ−２またはそれらの断片をコードするｍＲＮＡ配列を含むことを特徴とする、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のポリリボヌクレオチド。
16. 新生児における呼吸窮迫症候群の治療に使用するための、ＳＰ−Ｂをコードする配列を含む請求項１３記載のポリリボヌクレオチド。
17. ＥＰＯ欠損症の治療に使用するための、ＥＰＯをコードする配列を含む、請求項１３記載のポリリボヌクレオチド。
18. インプラントのコーティングに使用するための、増殖因子、血管形成因子、刺激物質、誘導物質または酵素をコードする少なくとも１つの配列を含む、請求項１３記載のポリリボヌクレオチド。
19. 標的細胞内で発現されない内因性マイクロＲＮＡの少なくとも１つの標的配列またはターゲティング配列をさらに含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載のポリリボヌクレオチド。
20. 機能運搬体が、標的配列、ＰＥＧ群および／またはターゲティングリガンドである、請求項８記載のポリリボヌクレオチド。
21. 薬剤として許容される添加剤と一緒に、請求項１〜２０のいずれか１項に記載のＲＮＡを少なくとも１つ含有する、薬剤組成物。
22. 気管内投与用および／もしくは経肺投与用の形態またはインプラントへの塗布用形態である、請求項２１記載の薬剤組成物。
23. ＲＮＡ含有組成物の投与前または投与の間に投与するための少なくとも１つのパーフルオロカーボンを付加的に含む、請求項２２記載の薬剤組成物。
24. パーフルオロカーボンおよびｓ２Ｕ_{(０．２５)}ｍ５Ｃ_{(０．２５)} ＳＰ−Ｂ ｍＲＮＡを含有する、請求項２３記載の薬剤組成物。
25. 担体としての遅延放出ポリマーに含まれる請求項１〜２０のいずれか１項に記載の修飾ＲＮＡのコーティングを有する、インプラント。
26. 歯のインプラント、股関節内部プロテーゼ、膝関節内部プロテーゼまたは脊椎椎体固定物である、請求項２５記載のインプラント。
27. 担体ポリマーが少なくとも１種の修飾ＲＮＡを含有する、請求項２５または２６記載のインプラント。
28. 担体ポリマーが、埋め込み術に関連して有益な少なくとも１つのタンパク質をコードするＲＮＡを含有する、請求項２５〜２７のいずれか１項に記載のインプラント。
29. 担体ポリマーが、１以上の増殖因子および１以上の血管形成因子をコードするＲＮＡを含有する、請求項２５〜２８のいずれか１項に記載のインプラント。
30. ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８およびヘリカーゼＲＩＧ−１から選択される少なくとも１つのレセプターとＲＮＡ配列を接触させて、その結合能力を測定する、免疫原性および発現品質を試験するためのヌクレオチド配列のスクリーニング方法。