DE102013111099B4 - Permanente Genkorrektur mittels nukleotidmodifizierter messenger RNA - Google Patents
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Abstract
Nuklease-kodierende nukleotidmodifizierte messenger RNA (nec-mRNA) zur Korrektur einer genetischen Veränderung auf einer DNA in der Gentherapie, dadurch gekennzeichnet, dass bei der nec-mRNA zumindest ca. 10% der Uridinnukleotide durch Austausch von Uridin gegen 2-Thiouridin (s2U) und/oder zumindest ca. 10% der Cytidinnukleotide durch Austausch von Cytidin gegen 5-Methylcytidin (m5C) modifiziert sind, und dass die genetische Veränderung in dem Lungenprotein Surfactant-Protein B (SP-B) vorliegt.
Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft eine nukleotidmodifizierte messenger RNA zur permanenten Korrektur einer genetischen Veränderung auf einer DNA. Die Erfindung betrifft außerdem eine nukleotidmodifizierte messenger RNA in Kombination mit einem Reparaturtemplate. Sie betrifft schließlich eine pharmazeutische Zusammensetzung.
- Als Gentherapie bezeichnet man das Einfügen von Nukleinsäuren wie DNA oder RNA in die Körperzellen eines Individuums, um beispielsweise eine Krankheit zu behandeln. Typischerweise soll dabei ein intaktes Gen in das Genom der Zielzelle eingefügt werden, um ein defektes Gen zu ersetzen, welches ursächlich für die Entstehung der Krankheit ist. Eine Gentherapie hat im Wesentlichen nur bei solchen Erkrankungen Aussicht auf Erfolg, die auf einer Veränderung nur eines oder weniger Gene beruht.
- Surfactant-Protein-B-Defizienz und Cystische Fibrose (CF) sind schwere, angeborene fatale Krankheiten, für die es gegenwärtig keine zufriedenstellenden Therapien gibt. Surfactant-Protein-B-Defizienz ist selten und kommt in etwa einem von 100 Millionen Neugeborenen vor. Surfactant-Protein-B (SP-B) ist ein Lungensurfactantassoziiertes Protein, das eine wesentliche Rolle in der alveolaren Stabilität spielt, indem es die Oberflächenspannung an der Grenzfläche zwischen Luft und Flüssigkeit in der Lunge erniedrigt. Mutationen des SP-B-codierenden Gens (SFTPB) führen innerhalb des ersten Lebensjahres zu einem rapiden fatalen Atemwegsversagen verbunden mit alveolarer Proteinose. Die Cystische Fibrose ist die am häufigsten vorkommende lebensbegrenzende autosomal-rezessive Erkrankung in kaukasischen Populationen. Sie taucht bei einem von 2.500 Neugeborenen auf und betrifft mehr als 70.000 Menschen weltweit. Mutationen in dem Gen, das für den „Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator“ (CFTR), einem Chloridkanal, codiert, resultieren in einer beeinträchtigten Anionensekretion und Hyperabsorption von Natrium über das Epithel. Die chronische Lungenerkrankung ist der Hauptfaktor, der zur Mortalität und Morbidität in CF-Patienten führt. Selbst mit der gegenwärtigen Therapie, beträgt das mittlere Überleben nur zwischen 30 und 40 Jahren.
- Gegenwärtige gentherapeutische Bemühungen mit DNA-basierten oder viralen Vektoren sind in der Behandlung dieser fatalen Krankheiten weitgehend erfolglos. Da die Atemwege in direktem Kontakt mit der Umgebung stehen, stellen deren inhärente Abwehrmechanismen eine signifikante Barriere für die Zufuhr von fremden Vektoren in die Lunge dar. Die Verwendung der meisten viraler Vektoren ist darüber hinaus gesundheitlich bedenklich, da sie onkogen wirken können.
- Kormann et.al. (2011), Expression of therapeutic proteins after delivery of chemically modified mRNA in mice, Letters to Nature Biotechnology, Seiten 1-6, beschreiben einen therapeutischen Ansatz zur Behandlung von SP-B-Defizienz, in dem eine funktionale, nukleotidmodifizierte messenger RNA (mRNA) codierend für SP-B in Alveolarzellen der Maus eingebracht wird. Dies erfolgt intratracheal mittels Hochdruckapplikation der SP-B-mRNA. Durch die Nucleotidmodifikation wurden 25 % des Uridins und Cytidins mit 2-Thiouridin (s2U) bzw. 5-Methyl-cytidin (m5C) ersetzt. Die modifizierte mRNA ist dadurch weniger immunogen und stabiler als ihr unmodifiziertes Pendant. Dieser Ansatz hat jedoch den Nachteil, dass die nucleotidmodifizierte mRNA nur über begrenzte Zeit die SP-B-Defizienz ausgleichen, nämlich bis es zu ihrem Abbau zur RNasen kommt, so dass ein messbarer Effekt nach kurzer Zeit ausbleibt. Eine permanente Gensupplementation oder Genkorrektur gelingt nicht.
- McCaffrey et al., 2014, Targeted Genome Engineering with Zinc-finger Nucleases, TALENs and CRISPR, The Buzz on the Cut: From Dream to Reality, offenbart verschiedene Nuklease-kodierende nukleotidmodifizierte messenger RNAs (nec-mRNAs) zur Korrektur der Sequenz eines defekten Zielgens.
US 2013/0117870 - Vor diesem Hintergrund ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung eine neue Substanz bereitzustellen, die als Werkzeug im Rahmen der Gentherapie verwendet werden kann. Mit dieser Substanz sollen die Voraussetzungen für eine permanente Korrektur einer genetischen Veränderung auf einer DNA geschaffen werden.
- Diese Maßnahme wird durch die Bereitstellung einer Nucleasecodierenden nukleotidmodifizieren messenger RNA (nec-mRNA) gemäß Patentanspruch 1 gelöst.
- Die Erfinder haben überraschenderweise festgestellt, dass durch den gentherapeutischen Einsatz einer solchen nec-mRNA die Voraussetzungen geschaffen werden, eine genetische Veränderung auf einer DNA dauerhaft zu korrigieren. Dazu wird die nec-mRNA in das Cytoplasma einer Zielzelle transfiziert und dort in eine Nuklease translatiert. Die Nuklease wird dann in den Zellkern transportiert. Im Zellkern kann sie an die DNA binden, die die genetische Veränderung aufweist, und einen Doppelstrangbruch (DSB) auslösen. Der DSB stimuliert als Reparaturmechanismus eine homologe Rekombination und schafft so die Voraussetzung für den Austausch der genetischen Veränderung gegen bspw. die Wildtyp-Sequenz des entsprechenden DNA-Abschnitts. Dabei ist die nur temporär vorhandene Nucleaseaktivität vorteilhaft, insbesondere gegenüber viral kodierten Nukleaseaktivitäten, bei welchen die Gefahr einer Integration ins Genom des Wirtes besteht, und verschafft dem erfindungsgemäßen System zusätzliche therapeutische Sicherheit.
- Diese Erkenntnis war überraschend. So wird im Stand der Technik nukleotidmodifizierte mRNA bislang meist zur direkten Substitution des defekten Gens bzw. Proteins verwendet. So beschreiben bspw. Kormann et.al. (a.a.O.) eine nukleotidmodifizierte mRNA, die für das rot fluoreszierende Protein (RFP), für Maus-Erythropoetin (mEpo) oder das Surfactant-Protein-B codieren. Auch in der
WO 2011/012316 werden nukleotidmodifizierte mRNA beschrieben, die für das Surfactant-Protein-B codieren. - Karikó et.al. (2012), Increased Erythropoiesis in Mice Injected With Submicrogram Quantities of Pseudouridine-containing mRNA Encoding Erythropoitin, Molecular Therapy, Vol. 16, Nr. 11, Seiten 1833 - 1844 beschreiben die Verwendung von nukleotidmodifizierter mRNA zur Synthese von Erythropoietin in einem Mausmodell und schlagen den therapeutischen Einsatz nukleotidmodifizierter mRNA vor.
- Die Verwendung von nec-mRNA als molekulares Werkzeug zur Schaffung einer permanenten Genkorrektur gemäß Patentanspruch 1 wird im Stand der Technik nicht beschrieben.
- Erfindungsgemäß wird unter „nukleotidmodifizierter messenger RNA“ eine solche mRNA verstanden, bei der ein Teil der Nukleotide oder Nukleoside bzw. der Nukleobasen modifiziert, d.h. verändert ist. Insofern werden die Begriffe „Nukleotide“ und „Nukleoside“ in diesem Zusammenhang synonym verwendet. Vorzugsweise handelt es sich um eine chemische Modifizierung. Diese Modifizierung führt dazu, dass die mRNA stabiler und weniger immunogen ist. Nukleotidmodifizierte messenger RNA ist im Stand der Technik allgemein bekannt, vgl. bspw.
WO 2011/012316 . Der Inhalt der vorstehenden Publikation ist Bestandteil der Offenbarung. Beispiele für chemisch modifizierte Nukleotide bzw. Nukleoside sind Pseudouridin (Ψ), 5-Methylcytidin (m5C), N6-Methyladenosin (m6A), 5-Methyluridin (m5U) oder 2-Thiouridin (s2U). - Erfindungsgemäß fällt unter die Verwendung einer nec-mRNA auch die Verwendung verschiedener nec-mRNAs, bspw. eine Paars von nec-mRNAs, wobei jede nec-mRNA für verschiedene Nukleasen kodieren kann. So kann eine Nuklease bspw. stromaufwärts und die andere Nuklease stromabwärts der genetischen Veränderung binden und schneiden und somit die optimalen Voraussetzungen für eine homologe Rekombination schaffen.
- Unter einer „genetischen Veränderung“ wird jede Sequenzveränderung auf der DNA gegenüber dem Wildtyp verstanden, bspw. verursacht durch eine Mutation oder einen Polymorphismus. Vorzugsweise liegt die genetische Veränderung in einem Gen vor, wodurch das codierte Lungenprotein Surfactant-Protein B (SP-B) einem Funktionsverlust unterliegen oder sogar vollständig ausfallen kann.
- Unter „Korrektur“ einer genetischen Veränderung auf der DNA bzw. „Genkorrektur“ wird der dauerhafte Austausch der genetischen Veränderung bzw. des genetisch veränderten Gens gegen einen Nukleinsäureabschnitt ohne diese Veränderung, bspw. den Wildtyp, verstanden.
- Die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe wird hiermit vollkommen gelöst.
- Bei der nec-mRNA sind zumindest ca. 10% der Uridinnukleotide und/oder zumindest ca. 10% der Cytidinnukleotide modifiziert, und zwar durch Austausch von Uridin gegen 2-Thiouridin (s2U) und/oder durch Austausch von Cytidin gegen 5-Methylcytidin (m5C).
- Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass durch die geforderten Anteile von Nukleotidmodifizierungen ausreichend stabile und gering immunogene mRNA bereitgestellt wird. Mehr noch, die Erfinder konnten überraschenderweise feststellen, dass es ausreichend ist, wenn nur ca. 10 % der Cytidine gegen 5-Methylcytidin (m5C) ausgetauscht sind und/oder ca. 10 % der Uridine gegen 2-Thiouridin (s2U) ausgetauscht sind. Die Erfinder konnten nachweisen, dass auch derart gering modifizierte nec-mRNA stabil und wenig immunogen ist. Da die Nucleotidmodifizierung aufwändig ist, hat dies den Vorteil, dass die erfindungsgemäße nec-mRNA durch die lediglich geringe Konzentration von Nucleotidmodifizierungen günstig herstellbar ist. Die Erniedrigung des Anteils modifizierter Nukleotide hat neben der Kostenersparnis aber auch den Vorteil, dass die Translationseffizienz erhöht wird. So können sehr hohe Anteile bestimmter modifizierter Nukleotide, bspw. 2-Thiouridin (s2U), die Translation der modifizierten mRNA deutlich behindern. Bei niedrigeren Anteilen hingegen wird eine optimale Translation beobachtet.
- Die genetische Veränderung liegt in einem Lungenprotein vor, nämlich im Surfactant-Protein B (SP-B).
- Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass die erfindungsgemäße nec-mRNA als therapeutisch nutzbares Werkzeug in der Therapie von Lungenerkrankungen einsetzbar ist, für die derzeit keine zufriedenstellenden Therapieformen existieren.
- Nach einer bevorzugten Ausgestaltung kodiert die nec-mRNA für eine Nuklease, die derart ausgestaltet ist, dass sie stromaufwärts und/oder stromabwärts der genetischen Veränderung an die DNA binden kann.
- Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass die kodierte Nuklease neben der genetischen Veränderung bindet, dort einen Doppelstrangbruch (DSB) katalysiert, und so zelluläre Reparaturmechanismen einschließlich homologer Rekombination (HR) initiieren. Dadurch kann gezielt nur die genetische Veränderung bspw. gegen den Wildtyp ausgetauscht werden.
- Dabei ist die Nuclease vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Zink-Finger-Nucleasen (ZFNs), Transcription Activator-like Effector Nucleases (TALEN) und CRISPR/Cas9.
- Zink-Finger-Nucleasen (ZFNs) und Transcription Activator-like Effector Nucleasen (TALEN) sind artifizielle Endonucleasen, die über DNA-bindende Polypeptide an spezifische Sequenzen stromaufwärts und/oder stromabwärts der genetischen Veränderung auf der DNA binden können. Die zielgerichtete Ausgestaltung, der Aufbau und die Funktionalität dieser Nucleasen sind dem Fachmann bekannt. Verwiesen wird in diesem Zusammenhang auf das Dokument von Carlson et. al (2012), Trageting DNA with fingers and TALENs, Molecular Therapy-Nucleic Acids 1, e3. „Cas“ für „CRISPR assoziated“. CRISPR steht für „Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats“. Cas9 ist eine urspünglich in Bakterien entdeckte Nuklease, die über das CRISP/Cas-System mittels einer kurzen komplementären einzelsträngigen RNA an bestimmte Abschnitte der DNA zielgerichtet binden kann; vgl. Mali et al. (2013), RNA-guided human genome engineering via Cas9, Science 339(6121), Seiten 823-826 und Cong et al. (2013), Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems Science 339(6121), Seiten 819-823. Der Inhalt dieser Publikationen ist Bestandteil der vorliegenden Offenbarung.
- Nach einer bevorzugten Weiterentwicklung der Erfindung ist die nec-mRNA an ein Aptamer gekoppelt.
- Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass sich über die sequenzspezifische Ausgestaltung des Aptamers die Bindestelle der nec-mRNA auf definierte Zielzellen ausrichten lässt. Dadurch lässt sich sicherstellen, dass die nec-mRNA zielgerichtet die genetische Veränderung nur in bestimmten Zellen korrigiert, in denen es erforderlich ist. Wenn bspw. die Korrektur eines Lungenproteins beabsichtigt ist, werden solche Aptamere an die nec-mRNA gekoppelt, die selektiv an Zellen des Lungengewebes binden. Nicht von der genetischen Veränderung betroffene Zellen bleiben unberührt. Diese Maßnahme verschafft zusätzliche therapeutische Sicherheit. Über das sog. SELEX-Verfahren lassen sich solche Aptamersequenzen anreichern, die an die gewünschte Zelle bzw. die gewünschte Zellmembranstruktur binden.
- Nach einer bevorzugten Weiterentwicklung ist die nec-mRNA in Nanopartikeln verpackt.
- Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass die Aufnahme der nec-mRNA in die Zelle deutlich verbessert wird, insbesondere in Zellen des Lungengewebes. Beispiele für geeignete Nanopartikel sind das Lipid GL67/DOPE und biokompatible Chitosanbeschichtete Nanopartikel.
- Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft die erfindungsgemäße nec-mRNA in Kombination mit einem Reparaturtemplate.
- Unter einem „Reparaturtemplate“ wird ein Nukleinsäuremolekül, bspw. ein DNA-Fragment, verstanden, das einen Nukleotidabschnitt aufweist, der durch homologe Rekombination (HR) gegen den der die genetische Veränderung aufweisende Abschnitt auf der DNA ausgetauscht werden soll. Dieser Nukleotidabschnitt entspricht bspw. dem Wildtyp bzw. dem „gesunden Gen“, das die genetische Veränderung nicht aufweist. Das Reparaturtemplate weist stromauf- und -abwärts der genetischen Veränderung ausreichend homologe Abschnitte zu der DNA auf, so dass eine Hybridisierung und homologe Rekombination nach erfolgtem durch die Nuclease induziertem Doppelstrangbruch erfolgen kann.
- Die erfindungsgemäße Kombination zwischen der nec-mRNA und dem Reparaturtemplate ermöglicht eine dauerhafte Korrektur der genetischen Veränderung durch lebenslange Expression des korrekten Proteins. nec-mRNA und Reparaturtemplate stellen folglich eine Art erfindungsgemäßes „Genkorrekturset“ dar.
- Es versteht sich, dass das Reparaturtemplate einen induzierbaren Promotor aufweisen kann, über den sich die Expression des reparierten Gens zielgerichtet steuern lässt.
- Nach einer erfindungsgemäßen Weiterentwicklung wird das Reparaturtemplate in einem Adeno-assoziierten viralen Vektor (AAV) verpackt ist und/oder wird von einer Plasmid-DNA codiert.
- Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass auf ein etabliertes Prinzip des Einbringens genetischer Information in die Zelle zurückgegriffen wird. So haben sich AAV-Vektoren aufgrund fehlender gentoxischer Nebenwirkungen in der Praxis des Gentransfers bewährt.
- Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eine nec-mRNA, vorzugsweise die vorstehend genannte erfindungsgemäße nec-mRNA, und weiter bevorzugt außerdem ein Reparaturtemplate aufweist. Ferner ist die pharmazeutische Zusammensetzung erfindungsgemäß vorzugsweise zur Behandlung einer Lungenerkrankung vorgesehen, bei der es sich um Surfactant-Protein-B-Defizienz und/oder Cystische Fibrose (CF) handeln kann.
- Die Merkmale, Eigenschaften und Vorteile der erfindungsgemäßen nec-mRNA gelten für die erfindungsgemäße Zusammensetzung entsprechend.
- Offenbart wird ferner ein Verfahren zur Korrektur einer genetischen Veränderung an einer DNA, das folgende Schritte aufweist: (1.) Einschleusen eines Reparaturtemplates in eine DNA-enthaltende Zelle, die die zu korrigierende genetische Veränderung aufweist, (2) Einbringen einer nec-mRNA in die Zelle. Bei der Zelle kann es sich vorzugsweise um eine Lungenzelle handeln und das Einschleusen und Einbringen erfolgt vorzugsweise mittels Hochdruckapplikation des Reparaturtemplates und der nec-mRNA in die Lunge.
- Sowohl das Reparaturtemplate, vorzugsweise verpackt in einen AAV-Vektor, als auch die nec-mRNA, vorzugsweise nach Verpacken in Nanopartikel, können systemisch bzw. intravenös appliziert werden. Dies ist besonders vorteilhaft, wenn aufgrund einer verschleimten Lunge die Applikation in die Atemwege nicht möglich ist.
- Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in der jeweils angegebenen Kombination, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.
- Die Erfindung wird nun anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert, aus denen sich weitere Vorteile, Eigenschaften und Merkmale ergeben.
- Dabei wird auf die beigefügten Figuren Bezug genommen, in denen Folgendes gezeigt ist:
-
1 zeigt die Optimierung der nec-mRNA durch Variation des Anteils modifizierter Nukleotide; -
2 zeigt das Prinzip der permanenten Genkorrektur durch Verwendung von nec-mRNA; -
3 zeigt die in vivo Genkorrektur am SP-B-Lokus einer SP-B-knock-out-Maus durch nec-mRNA und die damit verbundene Erhöhung der Lebensdauer der Maus; und -
4 zeigt die homologiegerichtete Reparatur des SP-B-Lokus in Maus-Fibroblasten in vitro durch TALEN, codiert durch modifizierte mRNA. - Ausführungsbeispiele
- 1. Optimierung der nec-mRNA
- In Kormann et. al (2011; a.a.O.) ist beschrieben, dass der Austausch von jeweils 25 % von Uridin und Cytidin in der mRNA gegen 2-Thyiouridin und 5-Methyl-cytidin in der SP-B-defizienten Maus zu ausreichend stabiler und gering immunogener SP-B-mRNA führt. Die Erfinder haben in einem Experiment getestet, ob der Anteil modifizierter Nucleotide weiter erniedrigt werden kann. Das Ergebnis eines solchen Experimentes ist in
1 gezeigt. - In einem ersten Ansatz, haben die Erfinder eine für das Rot-Fluoreszierende-Protein (RFP) kodierende mRNA hergestellt, in der unterschiedlich hohe Anteile von Uridin und Cytidin gegen 2-Thiouridin (s2U) und 5-Methylcytidin (m5C) ausgetauscht wurden, nämlich jeweils 25%, jeweils 10% und 100 m5C und 10% s2U. Mit diesen mRNA-Molekülen wurden A-549-Zellen transfiziert und nach 24 Stunden wurde der Median der Fluoreszenzintensität (MIT) als Maß für die Transfektionseffizienz und eine positive Expression gemessen. Das Ergebnis ist in
1A gezeigt. Dabei zeigt sich, dass bei jeweils 25%iger oder 10%iger Substituierung eine optimale Expression feststellbar ist; vgl. 4. und 5. Säule. - In einem weiteren Ansatz wurde untersucht, wie immunogen die modifizierten mRNA- Moleküle sind. Dazu wurden neben s2U- und m5C-modifizierten mRNAs auch Pseudouridin- (Psi) modifizierte mRNA-Moleküle hergestellt, die allesamt für Zinkfingernukleasen (ZFN-5; beide Richtungen) kodieren. Mit den chemisch modifizierten mRNAs wurden PBMCs via Liposomenfusion (Lipofectamin-2000) transfiziert. Anschließend wurde in einem ELISA die Expression von IFN-alpha als Maß für die Immunogenität gemessen. Das Ergebnis ist in
1B dargestellt. Dabei zeigt sich, dass es bei Einsatz einer unmodifizierten mRNA zu einer sehr starken Immunreaktion kommt (Säule ganz rechts). Bei Verwendung von jeweils 10% m5C/ s2U (6. Ansatz) und 25% m5C/s2U (5. Ansatz) ist die Immunogenität deutlich reduziert. - Der geringe Austausch an modifizierten Nucleotiden hat den Vorteil, dass die nec-mRNA deutlich günstiger herstellbar ist als die nucleotidmodifizierten mRNAs aus dem Stand der Technik, bei denen wesentlich höhere Anteile der Nucleotide ausgetauscht wurden. Er hat ferner den Vorteil, dass die Translationseffizienz optimiert wird.
- 2. Prinzip der permanenten Genkorrektur durch die Verwendung von nec-mRNA
- Die Erfinder haben ein System entwickelt, um eine permanente Korrektur der Genloci zu erreichen, die in verschiedenen Krankheiten, wie schweren erblichen Lungenerkrankungen, mutiert vorliegen, um eine stabile, lebenslange Expression des korrigierten Proteins zu erlauben. Dieses System ist in der
2 dargestellt. Ein lungenwirksamer AAV-Vektor (1.) bringt das Reparaturtemplate in die Zelle und den Zellkern (2.). Anschließend wird eine modifizierte, Aptamer-gekoppelte mRNA, die für ein spezifisches Nukleasepaar codiert (3.) in das Zytoplasma der Zielzelle transfiziert (4.), wo sie in das Paar der Nukleaseproteine translatiert wird. Dabei kann die Expressionsdauer und - stärke mit Hilfe unterschiedlicher chemischer Modifikationen beeinflusst bzw. kontrolliert werden. (5.). Das Nukleasepaar wird in den Nucleus transportiert, wo es unter Vermittlung der Aptamere an die Zielregion bindet und ein Doppelstrangbruch (DSB) erzeugt (6.). Der DSB stimuliert eine homologe Rekombination (HR) als Reparaturmechanismus, was zum Austausch des genetischen Defektes mit dem korrekten Reparaturtemplate führt (7.). - 3. In vivo Genkorrektur am SP-B Lokus der Maus durch nec-mRNA
- Als nächstes wurde untersucht, ob modifizierte für eine Nuclease codierende mRNA eine wirksame Genkorrektur in der Lungenzelle der Maus in vivo katalysieren kann. Dazu wurden Versuche an der Maus mit SP-B-Defizienz durchgeführt. Das verwendete Mausmodell ist ausführlich beschrieben in Kormann et. al (2011; a.a.O.).
- Dazu entwickelten die Erfinder eine mRNA, die für ein TALEN-Paar codiert, das spezifisch ist für den SP-B Lokus. Ferner wurde ein Reparaturtemplate, das von einem Adeno-assoziierten viralen Vektor (AAV) codiert wird, entwickelt. Dieses weist einen konstitutiven Promotor stromaufwärts der SP-B-cDNA auf, um die Genexpression von Doxycyclin unabhängig zu machen. Das Reparaturtemplate ist schematisch in
3a dargestellt. Das Reparaturtemplate, das einen vollfunktionellen CAG-Promotor mit TetO7-CMV und eine trunkierte SP-B-cDNA als Homologiearme trägt, wird in das Genom über homologe Rekombination (HR) integriert, um die Doxycyclinabhängigkeit zu überwinden. - Die nukleotidmodifizierte mRNA (25 % s2u/m5C) und das vektorkodierte Reparaturtemplate wurden mittels einmaliger Hochdruckapplikation in die Lungen der Mäuse verabreicht. Anschließend wurde die Doxycyclinzufuhr beendet, was bei den Mäusen akutes Atemversagen verursacht, und in der Folge die Lebensdauer der Mäuse bestimmt. Das Ergebnis ist in
3b dargestellt. Dabei zeigt sich, dass Mäuse, die mit einer Kombination aus 25 % s2u/m5C-modifizierter SP-B-Lokus-spezifischer TALENmRNA und dem Reparaturtemplate behandelt wurden (n = 6), signifikant länger überleben als die Kontrollen; vgl. durchgezogene rechte Kurve im Vergleich zur linken gestrichelten Kurve. Die Kontrollen wurden mit einer entsprechend nucleotidmodifizierten mRNA behandelt, die für das Rot-fluoreszierende Protein (RFP) codiert (n = 5, Kaplan Meier-Überlebenskurven, Wilcoxon-Gehan-Test). - 4. TALEN-codierende nukleotidmodifizierte mRNA induziert homologiegerichtete Reparatur in vitro
- In einem weiteren Experiment sollte überprüft werden, ob bzw. in welchem Ausmaß es zu einem Austausch bzw. zu einer Korrektur der genetischen Veränderung auf der DNA kommt. Dazu wurde die DNA von SP-B-Fibroblasten mit TALEN, kodiert durch modifizierte mRNA, geschnitten und ein Reparaturtemplate mit einer Nhel-Schnittstelle eingebracht. Anschließend wurde das Maß der homologen Rekombination gemessen. Das Ergebnis ist in
4 dargestellt. Hier zeigt sich, dass eine 31%ige homologe Rekombination erreicht wurde, was die Eignung der erfindungsgemäßen Kombination aus nec-mRNA und Reparaturtemplate belegt. - 5. Fazit
- Die Erfinder konnten anhand eines Mausmodelles eindrucksvoll demonstrieren, dass unter Einsatz einer nukleasecodierenden nukleotidmodifizierten messenger RNA (nec-mRNA) eine genetische Veränderung auf einer DNA dauerhaft korrigiert werden kann. Die nec-mRNA wird zusammen mit einem Reparaturtemplate verabreicht, das die einzufügende bzw. auszutauschende genetische Information enthält.
Claims (13)
- Nuklease-kodierende nukleotidmodifizierte messenger RNA (nec-mRNA) zur Korrektur einer genetischen Veränderung auf einer DNA in der Gentherapie, dadurch gekennzeichnet, dass bei der nec-mRNA zumindest ca. 10% der Uridinnukleotide durch Austausch von Uridin gegen 2-Thiouridin (s2U) und/oder zumindest ca. 10% der Cytidinnukleotide durch Austausch von Cytidin gegen 5-Methylcytidin (m5C) modifiziert sind, und dass die genetische Veränderung in dem Lungenprotein Surfactant-Protein B (SP-B) vorliegt.
- nec-mRNA nach
Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die nec-mRNA für eine Nuklease codiert, die derart ausgestaltet ist, dass sie stromaufwärts und/oder stromabwärts der genetischen Veränderung auf der DNA binden kann. - nec-mRNA nach
Anspruch 1 oder2 , dadurch gekennzeichnet, dass die Nuklease ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Zink-Finger-Nucleasen (ZFNs), Transcription Activator-like Effector Nucleases (TALEN) und CRISPR/Cas9. - nec-mRNA nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die nec-mRNA an ein Aptamer gekoppelt ist.
- nec-mRNA nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die nec-mRNA in Nanopartikel verpackt ist.
- nec-mRNA nach einem der vorherigen Ansprüche kombiniert mit einem Reparaturtemplate.
- Kombination nach
Anspruch 6 , dadurch gekennzeichnet, dass das Reparaturtemplate einen Nukleotidabschnitt aufweist, der durch homologe Rekombination (HR) gegen den die genetische Veränderung aufweisenden Abschnitt auf der DNA austauschbar ist. - Kombination nach
Anspruch 6 oder7 , dadurch gekennzeichnet, dass das Reparaturtemplate in einem Adeno-assoziierten viralen Vektor (AAV) verpackt ist und/oder von einer Plasmid-DNA codiert wird. - Pharmazeutische Zusammensetzung, die eine Nuklease-kodierende nukleotidmodifizierte messenger RNA (nec-mRNA) nach
Anspruch 1 aufweist. - Pharmazeutische Zusammensetzung nach
Anspruch 9 , die außerdem ein Reparaturtemplate aufweist. - Pharmazeutische Zusammensetzung nach
Anspruch 9 oder10 zur Behandlung einer Lungenerkrankung. - Pharmazeutische Zusammensetzung nach
Anspruch 11 , dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Lungenerkrankung um Surfactant-Protein-B-Defizienz und oder Cystische Fibrose (CF) handelt. - Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der
Ansprüche 9 bis12 , die die nec-mRNA nach einem derAnsprüche 1 bis4 und/oder die Kombination nach einem derAnsprüche 6 bis8 aufweist.
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AU2015360502A1 (en) | 2014-12-10 | 2017-06-29 | Regents Of The University Of Minnesota | Genetically modified cells, tissues, and organs for treating disease |
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EP3235515A1 (de) * | 2016-04-21 | 2017-10-25 | Eberhard Karls Universität Tübingen | Gerichtete mrna zur in-vivo-anwendung |
US10767175B2 (en) | 2016-06-08 | 2020-09-08 | Agilent Technologies, Inc. | High specificity genome editing using chemically modified guide RNAs |
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US11795443B2 (en) | 2017-10-16 | 2023-10-24 | The Broad Institute, Inc. | Uses of adenosine base editors |
EP3942040A1 (de) | 2019-03-19 | 2022-01-26 | The Broad Institute, Inc. | Verfahren und zusammensetzungen zur editierung von nukleotidsequenzen |
MX2022014008A (es) | 2020-05-08 | 2023-02-09 | Broad Inst Inc | Métodos y composiciones para la edición simultánea de ambas cadenas de una secuencia de nucleótidos de doble cadena objetivo. |
EP4255457A1 (de) | 2020-12-03 | 2023-10-11 | University of Massachusetts | Entwicklung von neuen gentherapeutika für fibrodysplasia ossificans progressiva |
WO2022216536A1 (en) * | 2021-04-06 | 2022-10-13 | Animatus Biosciences, Inc. | Selective expression of mrnas in cardiomyocytes without cardiac fibroblast stimulation |
EP4085932A1 (de) | 2021-05-03 | 2022-11-09 | H.M.Z. Privatstiftung | Stabilisierte modifizierte rna zur verwendung bei der behandlung einer erkrankung, die mit dem transmembranleitfähigkeitsregulator (cftr) von cystischer fibrose assoziiert ist |
JP2024520462A (ja) * | 2021-05-24 | 2024-05-24 | サンガモ セラピューティクス,インコーポレイテッド | ジンクフィンガーヌクレアーゼを標的としたciita |
CA3230927A1 (en) | 2021-09-10 | 2023-03-16 | Agilent Technologies, Inc. | Guide rnas with chemical modification for prime editing |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2011012316A2 (de) | 2009-07-31 | 2011-02-03 | Ludwig-Maximilians-Universität | Rna mit einer kombination aus unmodifizierten und modifizierten nucleotiden zur proteinexpression |
US20130117870A1 (en) | 2011-02-25 | 2013-05-09 | Scott C. Fahrenkrug | Genetically modified animals and methods for making the same |
Family Cites Families (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP4332227A1 (de) * | 2005-08-23 | 2024-03-06 | The Trustees of the University of Pennsylvania | Rna-haltige modifizierte nukleoside und verfahren zur verwendung davon |
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JP2016528890A (ja) * | 2013-07-09 | 2016-09-23 | プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ | CRISPR/Cas系を用いるゲノム編集の治療用の使用 |
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Patent Citations (2)
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US20130117870A1 (en) | 2011-02-25 | 2013-05-09 | Scott C. Fahrenkrug | Genetically modified animals and methods for making the same |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
Cong et al. (2013), Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems Science 339(6121), Seiten 819-823 |
Karikó et.al. (2012), Increased Erythropoiesis in Mice Injected With Submicrogram Quantities of Pseudouridine-containing mRNA Encoding Erythropoitin, Molecular Therapy, Vol. 16, Nr. 11, Seiten 1833 - 1844 |
Mali et al. (2013), RNA-guided human genome engineering via Cas9, Science 339(6121), Seiten 823-826 |
McCAFFREY A.: Targeted Genome Engineering with Zinc-finger Nucleases, TALENs and CRISPR, The Buzz on the Cut: From Dream to Reality, 1. Juli 2013, Internet, URL: http://zon.trilinkbiotech.com/2013/07/01/the-buzz-on-the-cut-from-dream-to-reality/ (gedruckt als pdf-Dokument, recherchiert am 14.07.2014). |
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