JP6909157B2

JP6909157B2 - エンドキャップされた核酸分子

Info

Publication number: JP6909157B2
Application number: JP2017532176A
Authority: JP
Inventors: バーンズ−シーマン，デイビッド; ルイスコーヘン，スコット; ルイスディーナー，ジョン; ガンプ，クリスチャン; ローチ，ジェイムズ; ホワイト，エイミー; ウィリアムズ，サラー; ユアン，ジュン; ゼクリ，フレデリック
Original assignee: ノバルティスアーゲー
Priority date: 2014-12-16
Filing date: 2015-12-16
Publication date: 2021-07-28
Anticipated expiration: 2035-12-16
Also published as: WO2016098028A1; US11466048B2; JP2020183399A; US10676499B2; EP3904366A1; US20230183286A1; US20200190132A1; JP2018502076A; US20180002368A1; EP3233880A1; CN111848712A; CN107223128A

Description

背景技術
単離された核酸、特にタンパク質をコードする核酸は、様々な臨床適用の魅力的な候補物質である。特に、ｍＲＮＡなどの、タンパク質をコードするＲＮＡは、臨床適用の可能性のある、いくつかの利点を提供する。例えば、ＲＮＡを、インビボ、インビトロ、または生体外で細胞にトランスフェクトして、疾患の治療または診断のための所望の療法用または診断用タンパク質の発現を誘発することができる。しかしながら、ＲＮＡ療法の可能性は、ＲＮＡの安定性および半減期により、ならびにコードされるタンパク質の発現レベルにより限定される。

天然のｍＲＮＡは５’キャップ構造を含有し、これはＲＮＡの安定化を補助し、真核生物遺伝子発現に必須である（Shuman, S. et al Mol. Microbiol. 1995, 17, 405-410）。これらのｍＲＮＡはさらに、３’ポリＡ尾部も含有する。両方の改変は、コードされるタンパク質の翻訳を安定化し、改善する。５’キャップ構造は、真核生物メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の５’末端に見られ、多くのウイルスＲＮＡは、５’−５’三リン酸結合によりプレｍＲＮＡの５’末端ヌクレオシドに結合したＮ^７−メチルグアノシンヌクレオシドからなる（Shatkin, A. J. Cell 1976, 2, 645-53、Shuman, S. Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 2001, 66, 1-40、Decroly, E. et al PLoS Pathog. 2011, 7, e1002059）。このキャップ構造は、最終的にｍＲＮＡ翻訳をもたらす多くの役割を果たす。また、ＲＮＡキャッピングは、ＲＮＡスプライシングおよび核からのエクスポートなどの他のプロセスのために、ならびに細胞の生来の免疫機構によるｍＲＮＡの認識を避けるために重要である（Daffis, S. et al Nature 2010, 468, 452-6、Zust, R. et al Nat. Immunol. 2011, 12, 137-43）。いくつかの合成キャップアナログが説明されている。例えば、国際公開第２００９／１４９２５３号パンフレット、同第２０１１／０１５３４７号パンフレットを参照のこと。

合成ｍＲＮＡは典型的に、ＲＮＡポリメラーゼおよびＤＮＡ鋳型を用いる酵素合成、続いて５’キャップおよび３’末端の酵素付加により調製される（Peyrane, F. et al Nucleic Acids Res. 2007, 35, e26）。しかしながら、プロセスは高価で制御困難であり、それゆえ、商業的スケールでの生産に望ましくない。

したがって、効率的に生産することができ、ＲＮＡによりコードされる生成物（例えばタンパク質）の発現を改善し、免疫原性を低下させ、および／または安定性を改善する、５’末端、３’末端、または５’末端および３’末端で改変されたＲＮＡが求められている。

本開示は、５’末端、３’末端、または５’末端および３’末端の両方に改変を含有する核酸分子（例えばＲＮＡおよびＤＮＡ分子）に関する。核酸分子は好ましくは、生成物、例えばポリペプチドまたは核酸をコードするＲＮＡ分子であり、より好ましくはＣＲＩＳＰＲゲノム編集技術のためのＣａｓ９タンパク質をコードするｍＲＮＡ、および／またはＣＲＩＳＰＲゲノム編集技術のためのｓｇＲＮＡ（またはｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ）の３’末端を含む、ｍＲＮＡである。

一態様では、本開示は、式Ｉの化合物およびその塩（好ましくは薬学的に許容される塩）：

に関し、式中、
Ｚ_１は、

、キャップ０、キャップ１、

であり；
ただしＺ_１が

、キャップ０、またはキャップ１である場合、−Ａ_１−Ｒ^５および−Ａ_３−Ｒ^８の両方ともが−ＯＨであることはないか、またはＡ_２は無ではなく；
Ｚ_２は、無、または−Ｏ−、−Ｓ−、任意選択で置換された低級アルキル、任意選択で置換されたアミノアルキル、任意選択で置換されたアリール、任意選択で置換されたヘテロアリール、任意選択で置換されたシクロアルキル、任意選択で置換されたシクロアルケニル、任意選択で置換されたヘテロシクリル、

からなる群から選択される結合部分であり；
Ａ_１およびＡ_３は独立して、無、ＮＨ、Ｓ、およびＯからなる群から選択され；
Ａ_２は、無、または＞ＣＲ^６Ｒ^７、＞ＮＲ^６、＞ＮＮＲ^６Ｒ^７、＞ＮＯＲ^６、＞Ｓ、および＞Ｏからなる群から選択され；
Ｙは、無、または任意選択で置換された低級アルキル、任意選択で置換されたアルケニル、任意選択で置換されたアルキニル、−（ＣＨ_２）_ｎＯＲ^１５、−（ＣＨ_２）_ｎＣＯＯＲ^１５、および−（ＣＨ_２）_ｎＣ（Ｏ）ＮＲ^１２からなる群から選択される結合部分であり；
Ｒ^１は、Ｈ、任意選択で置換されたシクロアルキル、任意選択で置換されたシクロアルケニル、任意選択で置換されたアリール、任意選択で置換されたヘテロアリール、および任意選択で置換されたヘテロシクリルからなる群から選択され；
Ｒ^２は、Ｈ、−ＯＨ、任意選択で置換されたアルキル、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ^１２Ｒ^１３、および−ＮＲ^１２Ｒ^１３からなる群から選択され；
Ｒ^５、Ｒ^６、およびＲ^８は独立して、Ｈ、任意選択で置換されたアルキル、ポリアミン、ＰＥＧ、−（ＣＨ_２）_ｎ１ＮＲ^１２Ｒ^１３、−（ＣＨ_２）_ｎ１ＮＲ^１４Ｃ（Ｏ）Ｒ^１５、−（ＣＨ_２）_ｎ１ＯＲ^１５、−（ＣＨ_２）_ｎ１Ｃ（Ｏ）ＯＲ^１５、−（ＣＨ_２）_ｎ１Ｃ（Ｏ）Ｒ^１５、−（ＣＨ_２）_ｎ１Ｃ（Ｏ）ＮＲ^１２Ｒ^１３、−Ｏ−（ＣＨ_２）_ｎ３−Ｃ（Ｏ）−（ＮＲ^１２）_２−Ｃ（Ｏ）−Ｘ_２、−Ｏ−（ＣＨ_２）_ｎ３−Ｃ（Ｏ）−［ＮＲ^１２−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ_２）_ｎ３］_１〜３−Ｘ_２からなる群から選択されるか、またはＲ^６およびＲ^８は一緒になって環を形成し、ここで該環は任意選択で置換され、かつ１０〜８０個の環原子を含有し、その中の１０〜４０個の環原子はヘテロ原子であってもよく、もしくはＲ^６およびＲ^７は一緒になって３〜８員環を形成し、ここで該環は任意選択で置換され、かつその中の１〜６個の環原子はヘテロ原子であってもよく；
Ｒ^７、Ｒ^１１、Ｒ^１２、Ｒ^１３、Ｒ^１４、Ｒ^１５、およびＲ^１６は独立して、Ｈ、任意選択で置換された低級アルキル、および任意選択で置換されたアシルからなる群から選択され；
Ｒ^９は、Ｈおよび任意選択で置換された低級アルキルからなる群から選択され；
Ｒ^１０は、Ｈ、−ＮＲ^１２Ｒ^１３、および−ＯＲ^１６からなる群から選択され；
ｎは、１〜４であり；
ｎ１は、０〜１０であり；
ｎ２は、１〜１２であり；
ｎ３は、１〜８であり；
Ｘは、Ｏ、Ｓ、ＮＨ、および任意選択で置換されたアルカンジイルからなる群から選択され；
Ｘ_１は、

からなる群から選択され；
Ｒ^３およびＲ^４は独立して、Ｈおよび−ＯＲ^１６からなる群から選択されるか、またはＲ^３およびＲ^４は一緒になってＯ−Ｑ−Ｏを形成し；
Ｑは、−ＣＨ_２−および−Ｃ（Ｍｅ）_２−からなる群から選択され；
Ｘ_２は、親和性部分および検出部分からなる群から選択され；
Ｘ_ｎは、核酸塩基である。

いくつかの態様では、式Ｉの化合物は、５’末端および３’末端の両方で改変され、式ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶの化合物、またはそれらの塩（好ましくは薬学的に許容される塩）、

である。式ＩＩ、ＩＩＩ、およびＩＶの変数は、式Ｉで定義されるとおりであり、ただし−Ａ_１−Ｒ^５および−Ａ_３−Ｒ^８の両方ともが−ＯＨであることはないか、またはＡ_２は無ではない。いくつかの実施形態では、上記化合物は、式ＩＩ、ＩＩＩ、またはＩＶの化合物であり、ただし−Ａ_１−Ｒ^５および−Ａ_３−Ｒ^８の両方ともが−ＯＨであることはないか、またはＡ_２は無ではない。

他の態様では、式Ｉの化合物は、５’末端で改変され、３’末端では改変されず、式ＶＩ、式ＶＩＩ、式ＶＩＩＩの化合物、またはそれらの塩（好ましくは薬学的に許容される塩）、

である。式ＶＩ、ＶＩＩ、およびＶＩＩＩの変数は、式Ｉで定義されるとおりであり、ただし−Ａ_１−Ｒ^５および−Ａ_３−Ｒ^８は両方とも−ＯＨであり、かつＡ_２は無である。

ある特定の好ましい実施形態では、上記化合物は、式Ｉ〜ＩＶおよびＶＩ〜ＶＩＩＩのいずれかの化合物であり、式中、Ｙは、アルキル結合部分、好ましくは低級アルキル結合部分、例えば（−ＣＨ_２−）であり；Ｒ^１は、置換アリールまたは置換ヘテロアリール、例えばフェニルで置換されたアリールまたはフェニルで置換されたヘテロアリールである。特に好ましい実施形態では、−Ｙ−Ｒ^１は、

であってもよい。

他の態様では、式Ｉの化合物は、３’末端で改変され、５’末端では改変されず、式Ｖの化合物またはその塩（好ましくは薬学的に許容される塩）、

である。式Ｖで、^＊Ｚ_１は、

、キャップ０、およびキャップ１からなる群から選択され、他の変数は、式Ｉで説明されるとおりであり、ただしＡ_２は無ではないか、または−Ａ_１−Ｒ^５および−Ａ_３−Ｒ^８の両方ともが−ＯＨであることはない。

式Ｉ〜ＶＩＩＩの化合物は、核酸塩基、Ｘ_ｎを含有し、これは任意の所望の核酸塩基、例えばアデニン、グアニン、シトシン、ウラシル、または改変核酸塩基、例えばシュードウラシルであってもよい。好ましい核酸塩基は、アデニンである。

式Ｉ〜ＶＩＩＩの化合物中のＲＮＡは、任意の所望のＲＮＡ分子であってもよいが、好ましいものは、生成物、例えばタンパク質をコードする。

他の態様では、本開示は、本明細書で開示される５’末端改変核酸（例えばＲＮＡ）を調製するために使用され得るグアノシンまたはプリン誘導体に関する。特定の態様では、本開示は、式ＩＸ、Ｘ、ＸＩの化合物、またはそれらの塩（薬学的に許容される塩）、

に関する。式ＩＸ、Ｘ、およびＸＩの各々で、
Ｚは−ＯＨ、

からなる群から選択され、
ｎ４は、０〜２であり、他の変数は式Ｉで定義されるとおりである。本態様のある特定の好ましい実施形態では、Ｙは、アルキル結合部分、好ましくは低級アルキル結合部分、例えば（−ＣＨ_２−）であり；Ｒ^１は、置換アリールまたは置換ヘテロアリール、例えばフェニルで置換されたアリールまたはフェニルで置換されたヘテロアリールである。特に好ましい実施形態では、−Ｙ−Ｒ^１は、

であってもよい。

また、本発明は、本明細書で開示される化合物の使用方法および製造方法に関する。

発明の詳細な説明
本発明は以下に詳細に説明されるが、本明細書で説明する特定の方法論、プロトコル、および試薬は変動することができるので、本発明はこれらに限定されないことが理解されるべきである。また、本明細書で使用する用語は特定の実施形態を説明する目的のためのみであり、本発明の範囲を限定するとは意図されず、本発明の範囲は付属の特許請求の範囲によってのみ限定されることが理解されるべきである。別に定義されない限り、本明細書で使用する全ての技術用語および科学用語は、当業者により通常理解されるのと同じ意味を有する。

本開示は、５’末端、３’末端、または５’末端および３’末端の両方に改変を含有する核酸分子（例えばＲＮＡおよびＤＮＡ分子）に関する。上記核酸分子は好ましくは、生成物、例えばポリペプチドまたは核酸をコードするＲＮＡ分子であり、より好ましくはｍＲＮＡである。本明細書で開示されるように改変したＲＮＡまたはｍＲＮＡは、任意の所望の方法、例えば酵素合成または化学合成を用いて生産することができる。５’末端改変は、ＲＮＡによりコードされる生成物（例えばタンパク質）の発現を増大させ、免疫原性を低下させ、かつ／またはＲＮＡの安定性を改善する、グアノシンまたはプリンに基づくキャップ構造を含む。３’末端改変は、ＲＮＡの末端リボースの３’および２’位置で、例えばこれらの位置の間に環原子を挿入すること、または１つもしくは両方のヒドロキシル基を他の置換基で置換することにより、シス−ジオールを改変して、ＲＮＡによりコードされる生成物（例えばタンパク質）の発現を増大させ、かつ／または（例えば分解速度を遅延させることにより）ＲＮＡの安定性を改善することを含む。所望の場合、３’末端改変は、様々な官能部分、例えば親和性部分または検出部分を含むことができる。かかる部分を含有する化合物は、例えば画像化、生化学分析、および生体共役反応に特に有用である。

本明細書で説明および例示するように、本明細書で開示されるグアノシンまたはプリンに基づく５’末端キャップ構造を含有するＲＮＡを調製した。これらの改変ＲＮＡは、ｅＩＦ４Ｅに結合すること、および細胞内で翻訳されることが示された。また、３’末端ＲＮＡが調製され、改変されていないＲＮＡと比較して半減期および発現の増大を有した。

一態様では、本開示は、５’末端キャップ構造、３’末端改変、または５’末端キャップ構造および３’末端改変を含有するＲＮＡ分子に関する。かかるＲＮＡ分子は、式Ｉの化合物およびその塩（好ましくは薬学的に許容される塩）、

であり、式中、
Ｚ_１は、

、キャップ０、キャップ１、

であり；
ただしＺ_１が

からなる群から選択される結合部分であり；
Ａ_１およびＡ_３は独立して、無、ＮＨ、Ｓ、およびＯからなる群から選択され；
Ａ_２は、無、または＞ＣＲ^６Ｒ^７、＞ＮＲ^６、＞ＮＮＲ^６Ｒ^７、＞ＮＯＲ^６、＞Ｓ、および＞Ｏからなる群から選択され；
Ｙは、無、または任意選択で置換された低級アルキル、任意選択で置換されたアルケニル、任意選択で置換されたアルキニル、−（ＣＨ_２）_ｎＯＲ^１５、−（ＣＨ_２）_ｎＣＯＯＲ^１５、および−（ＣＨ_２）_ｎＣ（Ｏ）ＮＲ^１２からなる群から選択される結合部分であり；
Ｒ^１は、Ｈ、任意選択で置換されたシクロアルキル、任意選択で置換されたシクロアルケニル、任意選択で置換されたアリール、任意選択で置換されたヘテロアリール、および任意選択で置換されたヘテロシクリルからなる群から選択され；
Ｒ^２は、Ｈ、−ＯＨ、任意選択で置換されたアルキル、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ^１２Ｒ^１３、および−ＮＲ^１２Ｒ^１３からなる群から選択され；
Ｒ^５、Ｒ^６、およびＲ^８は独立して、Ｈ、任意選択で置換されたアルキル、ポリアミン、ＰＥＧ、−（ＣＨ_２）_ｎ１ＮＲ^１２Ｒ^１３、−（ＣＨ_２）_ｎ１ＮＲ^１４Ｃ（Ｏ）Ｒ^１５、−（ＣＨ_２）_ｎ１ＯＲ^１５、−（ＣＨ_２）_ｎ１Ｃ（Ｏ）ＯＲ^１５、−（ＣＨ_２）_ｎ１Ｃ（Ｏ）Ｒ^１５、−（ＣＨ_２）_ｎ１Ｃ（Ｏ）ＮＲ^１２Ｒ^１３、−Ｏ−（ＣＨ_２）_ｎ３−Ｃ（Ｏ）−（ＮＲ^１２）_２−Ｃ（Ｏ）−Ｘ_２、−Ｏ−（ＣＨ_２）_ｎ３−Ｃ（Ｏ）−［ＮＲ^１２−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ_２）_ｎ３］_１〜３−Ｘ_２からなる群から選択されるか、またはＲ^６およびＲ^８は一緒になって環を形成し、ここで該環は、任意選択で置換され、かつ１０〜８０個の環原子を含有し、その中の１０〜４０個の環原子はヘテロ原子であってもよく、もしくはＲ^６およびＲ^７は一緒になって３〜８員環を形成し、ここで該環は、任意選択で置換され、かつその中の１〜６個の環原子はヘテロ原子であってもよく；
Ｒ^７、Ｒ^１１、Ｒ^１２、Ｒ^１３、Ｒ^１４、Ｒ^１５、およびＲ^１６は独立して、Ｈ、任意選択で置換された低級アルキル、および任意選択で置換されたアシルからなる群から選択され；
Ｒ^９は、Ｈおよび任意選択で置換された低級アルキルからなる群から選択され；
Ｒ^１０は、Ｈ、−ＮＲ^１２Ｒ^１３、および−ＯＲ^１６からなる群から選択され；
ｎは、１〜４であり；
ｎ１は、０〜１０であり；
ｎ２は、１〜１２であり；
ｎ３は、１〜８であり；
Ｘは、Ｏ、Ｓ、ＮＨ、および任意選択で置換されたアルカンジイルからなる群から選択され；
Ｘ_１は、

ある特定の好ましい実施形態では、上記化合物は式Ｉの化合物であり、式中、
Ｚ_１は、

であり；
Ｙは、アルキル結合部分、好ましくは低級アルキル結合部分、例えば（−ＣＨ_２−）であり；
Ｒ^１は、置換アリールまたは置換ヘテロアリール、例えばフェニルで置換されたアリールまたはフェニルで置換されたヘテロアリールである。特に好ましい実施形態では、−Ｙ−Ｒ^１は、

であってもよい。

他の好ましい実施形態では、上記化合物は、式Ｉの化合物であり、式中、−Ａ_１−Ｒ^５および−Ａ_３−Ｒ^８の両方ともが−ＯＨであることはないか、またはＡ_２は無ではない。別の好ましい実施形態では、−Ａ_１−Ｒ^５および−Ａ_３−Ｒ^８の両方ともが−ＯＨであることはなく、かつＡ_２は無ではない。

いくつかの態様では、式Ｉの化合物は、５’末端および３’末端の両方で改変され、式ＩＩ、ＩＩＩ、もしくはＩＶの化合物、またはそれらの塩、

この態様のある特定の好ましい実施形態では、Ｙは、アルキル結合部分、好ましくは低級アルキル結合部分、例えば（−ＣＨ_２−）であり；Ｒ_１は、置換アリールまたは置換ヘテロアリール、例えばフェニルで置換されたアリールまたはフェニルで置換されたヘテロアリールである。特に好ましい実施形態では、−Ｙ−Ｒ^１は、

であってもよい。

他の態様では、式Ｉの化合物は、５’末端で改変され、３’末端では改変されず、式ＶＩ、式ＶＩＩ、式ＶＩＩＩの化合物、またはそれらの塩、

である。式ＶＩ、ＶＩＩ、およびＶＩＩＩの変数は、式Ｉで定義されるとおりであり、ただし−Ａ_１−Ｒ^５および−Ａ_３−Ｒ^８は両方とも−ＯＨであり、かつＡ_２は無である。この態様のある特定の好ましい実施形態では、Ｙは、アルキル結合部分、好ましくは低級アルキル結合部分、例えば（−ＣＨ_２−）であり；Ｒ_１は、置換アリールまたは置換ヘテロアリール、例えばフェニルで置換されたアリールまたはフェニルで置換されたヘテロアリールである。特に好ましい実施形態では、−Ｙ−Ｒ^１は、

であってもよい。

他の態様では、式Ｉの化合物は、３’末端で改変され、５’末端では改変されず、式Ｖの化合物またはその塩、

である。式Ｖで、^＊Ｚ_１は、

式Ｉ〜ＶＩＩＩの化合物のＲＮＡは、任意の所望のＲＮＡ分子であってもよいが、好ましいものは、生成物、例えばタンパク質をコードする。好適なタンパク質は、療法用タンパク質、例えば抗体またはその抗原結合断片、受容体、サイトカイン、および増殖因子；抗原、例えば病原体または腫瘍細胞からの抗原を含む。ＲＮＡ、例えばｍＲＮＡは、リボース−リン酸骨格を含有してもよく、リボース環の１”位置に結合した通常の核酸塩基アデニン、シトシン、グアニン、およびウラシルを伴う。所望の場合、１つまたは複数の改変塩基が、所望の程度までＲＮＡに含まれてもよい。例えば、核酸塩基の０．１％〜１００％が、改変塩基、例えばシュードウラシルであってもよい。所望の場合、ＲＮＡ分子は、１つまたは複数のアミド亜リン酸エステル、チオリン酸エステル、メチルホスホン酸、ホスホロセレノ酸、または他の好適な結合を含有してもよい。

他の態様では、本開示は、本明細書で開示される５’末端改変核酸（例えばＲＮＡ）を調製するために使用され得るグアノシンまたはプリン誘導体に関する。

特定の態様では、本開示は、式ＩＸ、Ｘ、ＸＩの化合物、またはそれらの塩（薬学的に許容される塩）、

に関する。式ＩＸ、Ｘ、およびＸＩの各々で、
Ｚは、−ＯＨ、

からなる群から選択され；
ｎ４は、０〜２であり；他の変数は、式Ｉで定義されるとおりである。この態様のある特定の好ましい実施形態では、Ｙは、アルキル結合部分、好ましくは低級アルキル結合部分、例えば（−ＣＨ_２−）であり；Ｒ^１は、置換アリールまたは置換ヘテロアリール、例えばフェニルで置換されたアリールまたはフェニルで置換されたヘテロアリールである。特に好ましい実施形態では、−Ｙ−Ｒ^１は、

であってもよい。

式ＩＸの好ましい化合物で、Ｒ^２は好ましくは、任意選択で置換されたアミノであり；Ｘは好ましくは、Ｏであり；かつ／またはＸ_１は好ましくは、

であり、式中、Ｒ^３およびＲ^４は、式Ｉで定義されるとおりである。

エンドキャップされた核酸を使用する方法
本明細書で開示されるエンドキャップされた核酸は、診断または療法目的のために細胞による所望のタンパク質の生産を誘発することを含む、様々な目的のために使用することができる。例えば、タンパク質をコードするエンドキャップされたｍＲＮＡは、インビボまたはインビトロで細胞にトランスフェクトすることができる。ｍＲＮＡのトランスフェクションの好適な方法は本分野で周知であり、例えばカチオン性ポリマー、リン酸カルシウム、またはカチオン性脂質を使用して、トランスフェクションを促進する方法、ならびに直接注入、微粒子銃による粒子送達、電気穿孔法、レーザー照射、ソノポーレーション、および磁気ナノ粒子法を含む。例えばKim et al, Anal Bioanal Chem. 397:3173-3178 (2010)を参照のこと。

トランスフェクトされるべき細胞は好ましくは、例えば哺乳類、魚類、鳥類、より好ましくはヒトからの、動物細胞である。好適な動物被験体は、例えばウシ、ブタ、ウマ、シカ、ヒツジ、ヤギ、バイソン、ウサギ、ネコ、イヌ、ニワトリ、アヒル、シチメンチョウなどを含む。

また、本発明のエンドキャップされたＲＮＡ分子は、個々の患者から外植した細胞（例えばリンパ球、骨髄穿刺液、組織生検）などの細胞に生体外で送達し、続いて通常、エンドキャップされたＲＮＡ分子をトランスフェクトされた細胞の選択後、上記細胞を患者に再移植することができる。患者に送達する細胞の適切な量は、患者の状態、および所望の効果により変動し、これは熟練した当業者が決定することができる。好ましくは、使用される細胞は自家性である、すなわち、細胞は治療される患者から得られる。

エンドキャップされた核酸（例えばｍＲＮＡ）は、ＣＲＩＳＰＲ（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄｒｅｇｕｌａｒｌｙｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄｓｈｏｒｔｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃｒｅｐｅａｔｓ）として知られるゲノム編集技術で使用することができ、これは細菌抗ウイルス防御システムの部分であり、真核細胞における標的化ゲノム編集を誘発するために使用することができる。ゲノム編集のためのツールとして使用される場合、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムは典型的に、２個または３個の構成要素：ＲＮＡ依存性ＤＮＡエンドヌクレアーゼであるＣａｓ９タンパク質、およびＤＮＡ鎖切断部位当たり１つまたは２つのいずれかのＲＮＡからなる（天然の２つのＲＮＡシステムは、ＣＲＩＳＰＲ−ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびトランス活性化ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含み、一方、単一のＲＮＡシステムでは、２つのｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡが、シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）と呼ばれる単一の機能的転写産物に再設計される）。ＣＲＩＳＰＲ編集の標準システムは、レンチウイルスベクター内でｓｇＲＮＡまたは多数のＲＮＡおよびＣａｓ９タンパク質をコードすることができる。しかしながら、ウイルスベクターでの問題は、それらがコードすることができる追加の遺伝子のサイズには限界があり、サイズが長さ約１０００〜２０００アミノ酸に及ぶ大きなＣａｓ９タンパク質はウイルスベクター内でコードすることが困難であり得ることである。インビトロで転写されたｓｇＲＮＡ（またはｃｒＲＮＡ＋ｔｒａｃｒＲＮＡ）と共に調合されたインビトロで転写されたＣａｓ９ｍＲＮＡを用いた全ＲＮＡＣＲＩＳＰＲシステムを、インビボ、インビトロ、または生体外での細胞へのトランスフェクションのために共に調合して、トランスフェクトされた細胞のゲノムを特異的に編集することができる。本明細書で開示されるエンドキャップされたｍＲＮＡは、この用途によく適している。

また、エンドキャップされた核酸は、様々な生化学目的および分析目的のために使用することができる。例えば、エンドキャップされた核酸は、ＲＮＡ代謝を研究するために、およびＲＮＡの他の生体分子との相互作用を研究するために、画像化研究に使用することができる。

合成スキーム
本発明の化合物は、以下のスキームまたは実施例で説明する経路により調製することができる。

スキーム１：式ＶＩで定義される、一般構造Ｉの化学キャップされたｍＲＮＡは、ｍＲＮＡ−５’一リン酸を、好適に緩衝した水性生理食塩水（緩衝液：ＨＥＰＥＳ、ＴＲＩＳ、ＭＥＳ、ＰＢＳ）中で、５．５〜７．５の範囲の好適なｐＨにて、有機溶媒、例えばＤＭＦおよびＤＭＳＯの存在下または不在下で、好適なルイス酸性アクチベータ、例えばＭｎＣｌ_２、ＮｉＣｌ_２、ＺｎＣｌ_２の存在下にて、一般構造ＩＩのイミダゾール活性化キャップ構造と反応させることにより得ることができる。

スキーム２：一般構造ＩＩの化合物は、ＹおよびＲ^１が式Ｉと同様に定義され、リン酸塩ＩＩＩ（トリブチルアンモニウム塩）を、好適な溶媒、例えばＤＭＦ、ＤＭＳＯ、ＮＭＰ、リン酸トリメチル中で、好適な温度、例えば室温にて、イミダゾールまたはＮ−メチル−イミダゾール、好適な三級ホスフィン、例えばトリフェニルホスフィン、好適なオキシダント、例えば２，２’−ジピリジルジスルフィド、および好適な塩基、例えばトリエチルアミンで処理することにより調製することができる。（ａ）M. Lewdorowicz, Y. Yoffe, J. Zuberek, J. Jemielity, J. Stepinski, R. Kierzek, R. Stolarski, M. Shapira, E. Darzynkiewicz, RNA 2004, 10, 1469、ｂ）R. Worch, J. Stepinski, A. Niedzwiecka, M. Jankowska-Anyszka, C. Mazza, S. Cusack, R. Stolarski, E. Darzynkiewicz, Nucleosides Nucleotides and Nucleic Acids 2005, 24, 1131、ｃ）M. Warminski, J. Kowalska, J. Buck, J. Zuberek, M. Lukaszewicz, C. Nicola, A. N. Kuhn, U. Sahin, E. Darzynkiewicz, J. Jemielity, Bioorg. Med. Chem., 2013, 23, 3753）。

スキーム３：一般構造ＩＩＩの化合物は、ＹおよびＲ^１が式Ｉと同様に定義され、活性化リン酸塩ＩＶを、好適な溶媒、例えばＤＭＦ、ＤＭＳＯ、または水中で、ルイス酸、例えば塩化亜鉛、塩化マグネシウム、または塩化マンガンの存在下にて、好適な温度、例えば室温で、トリエチルアンモニウムリン酸塩または同様のリン酸塩と反応させることにより調製することができる。（ａ）M. Lewdorowicz, Y. Yoffe, J. Zuberek, J. Jemielity, J. Stepinski, R. Kierzek, R. Stolarski, M. Shapira, E. Darzynkiewicz, RNA 2004, 10, 1469、ｂ）R. Worch, J. Stepinski, A. Niedzwiecka, M. Jankowska-Anyszka, C. Mazza, S. Cusack, R. Stolarski, E. Darzynkiewicz, Nucleosides Nucleotides and Nucleic Acids 2005, 24, 1131、ｃ）M. Warminski, J. Kowalska, J. Buck, J. Zuberek, M. Lukaszewicz, C. Nicola, A. N. Kuhn, U. Sahin, E. Darzynkiewicz, J. Jemielity, Bioorg. Med. Chem., 2013, 23, 3753）。

一般構造ＩＩＩの化合物は、ＹおよびＲ^１が式Ｉと同様に定義され、Ｖを、好適な溶媒、例えばＤＭＦ、ＤＭＳＯ、またはＮＭＰ中で、室温〜６０℃の範囲の好適な反応温度にて、好適なアルキル化試薬、例えばハロゲン化アルキル、トリフレート、またはメシル酸塩を用いてアルキル化することにより調製することができる。

また、Ｘ＝Ｏである場合、一般構造ＩＩＩの化合物は、ＹおよびＲ^１が式Ｉと同様に定義され、ＶＩを、好適な溶媒、例えばリン酸トリメチル中で、０℃〜室温の範囲の好適な温度にて、二リン酸テトラクロリドと反応させることにより調製することができる（J. Emsley, J. Moore, P.B. Udy, J. Chem. Soc. (A) Inorg. Phys. Theor. 1971, 2863）。

また、Ｘ＝ＮＨである場合、一般構造ＩＩＩの化合物は、ＹおよびＲ^１が式Ｉと同様に定義され、ＩＶを、好適な溶媒、例えばリン酸トリメチル中で、０℃〜室温の範囲の好適な温度にて、イミド−ビス（ホスホリルジクロリド）と反応させることにより調製することができる（A. M. Rydzik, M. Kulis, M. Lukaszewicz, J. Kowalska, J. Zuberek, Z. M. Darzynkiewicz, E. Darzynkiewicz, J. Jemielity, Bioorganic & Med. Chem. 2012, 20, 1699）。

また、Ｘ＝ＣＨ_２である場合、一般構造ＩＩＩの化合物は、ＹおよびＲ^１が式Ｉと同様に定義され、ＩＶを、好適な溶媒、例えばリン酸トリメチル中で、好適な温度、例えば０℃または室温にて、メチレンビス（ホスホン酸ジクロリド）と反応させることにより調製することができる（ａ）M. Honcharenko, M. Zytek, B. Bestas, P. Moreno, J. Jemielity, E. Darzynkiewicz, C. I. E. Smith, R. Stroemberg, Bioorg. Med. Chem., 2013 ,21, 7921、ｂ）M. Kalek, J. Jemielity, Z. M. Darzynkiewicz, E. Bojarska, J. Stepinski, R. Stolarski, R. E. Davis, E. Darzynkiewic, Bioorg. Med. Chem. 2006, 14, 3223、ｃ）M. Kalek, J. Jemielity, J. Stepinski, R. Stolarski, E. Darzynkiewics, Tetrahedron Lett. 2005, 46, 2417）。

スキーム４：一般構造ＩＶの化合物は、ＹおよびＲ^１が式Ｉと同様に定義され、リン酸塩ＶＩＩ（トリブチルアンモニウム塩）を、好適な溶媒、例えばＤＭＦまたはＤＭＳＯ中で、好適な温度、例えば室温にて、イミダゾール、好適な三級ホスフィン、例えばトリフェニルホスフィン、好適なオキシダント、例えば２，２’−ジピリジルジスルフィド、および好適な塩基、例えばトリエチルアミンで処理することにより調製することができる（P. C. Joshi, M. F. Aldersley, D. V. Zagorevskii, J. P. Ferris, Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids 2012, 31, 7, 536）。

スキーム５：一般構造ＶＩＩの化合物は、ＹおよびＲ^１が式Ｉと同様に定義され、ＶＩＩＩを、好適な溶媒、例えばＤＭＦまたはＤＭＳＯ中で、室温〜５０℃の範囲の好適な反応温度にて、好適なアルキル化試薬、例えばハロゲン化アルキル、トリフレート、またはメシル酸塩を用いてアルキル化することにより調製することができる。
一般構造ＶＩＩＩの化合物は、ＹおよびＲ^１が式Ｉと同様に定義され、Ｘを、好適な溶媒、例えばリン酸トリメチル中で、０℃または室温の範囲の好適な温度にて、好適なリン酸化剤、例えば塩化ホスホリルと反応させることにより得ることができる。
また、一般構造ＶＩＩの化合物は、ＹおよびＲ^１が式Ｉと同様に定義され、ＩＸを、好適な溶媒、例えばリン酸トリメチル中で、０℃〜室温の範囲の好適な温度にて、好適なリン酸化剤、例えば塩化ホスホリルと反応させることにより調製することができる。
一般構造ＩＸの化合物は、ＹおよびＲ^１が式Ｉと同様に定義され、Ｘを、好適な溶媒、例えばＤＭＦまたはＤＭＳＯ中で、室温〜５０℃の範囲の好適な反応温度にて、好適なアルキル化試薬、例えばハロゲン化アルキル、トリフレート、またはメシル酸塩を用いてアルキル化することにより調製することができる。

スキーム６：一般構造ＶＩの化合物は、ＹおよびＲ^１が式Ｉと同様に定義され、Ｘを、好適な溶媒、例えばＤＭＦまたはＤＭＳＯ中で、室温〜５０℃の範囲の好適な反応温度にて、好適なアルキル化試薬、例えばハロゲン化アルキル、トリフレート、またはメシル酸塩を用いてアルキル化することにより調製することができる。

スキーム７：Ｘ＝Ｂｒ、Ｃｌ、Ｉ、およびＡ＝ＣＨ_３である場合、一般構造ＸＩおよびＸＩＩの化合物は、それぞれ、ＸＩＩＩおよびＸＩＶから、好適な溶媒、例えば四塩化炭素中で、好適な反応温度、例えば８５℃にて、好適なラジカル開始剤、例えばアゾジイソブチロニトリル、およびハロゲン化ドナー、例えばＮ−ブロモスクシンイミド、Ｎ−ブロモアセトアミド、Ｎ−クロロスクシンイミド、Ｎ−ヨードスクシンイミド、臭化物、塩化物、またはヨウ化物を用いたラジカルハロゲン化により調製することができる（ａ）K. Ziegler, A. Spath, E. Schaaf, W. Schumann, E. Winkelmann, Ann. 1942, 551, 80、ｂ）A. Nechvatal, Advances in Free-Radical Chemistry (London) 1972, 4, 175）。

Ｘ＝Ｂｒ、Ｃｌ、Ｉ、およびＡ＝ＣＨ_２ＯＨである場合、一般構造ＸＩおよびＸＩＩの化合物は、それぞれ、ＸＩＩＩおよびＸＩＶから、好適な溶媒、例えばジクロロメタン中で、好適な反応温度、例えば室温にて、好適なホスフィン、例えばトリフェニルホスフィン、および好適なオキシダント、例えば四臭化炭素、四塩化炭素、Ｎ−ヨードスクシンイミドと反応させることにより調製することができる（ａ）R. Appel, Angew. Chem. Int. Ed. 1979, 14, 801、ｂ）Cadogan, J, ed. (1979). Organophosphorus Reagents in Organic Synthesis. London: Academic Press）。

Ｘ＝Ｂｒ、Ｃｌ、Ｉ、およびＡ＝ＣＨ_２ＯＨである場合、一般構造ＸＩおよびＸＩＩの化合物は、それぞれ、ＸＩＩＩおよびＸＩＶから、好適な酸、例えばＨＢｒ（４８％水性）、ＨＣｌ（１２Ｍ水性）、またはＨＩ（水性）で処理することにより調製することができる（ａ）M. Uchida, F. Tabusa, M. Komatsu, S. Morita, T. Kanbe, K. Nakagawa, Chem. Pharm. Bull. 1985, 33, 3775、ｂ）V. Boekelheide, G. K. Vick, J. Am. Chem. Soc. 1956, 78, 653、ｃ）K. M. Doxsee, M. Feigel, K. D. Stewart, J. W. Canary, C. B. Knobler, D. J. Cram, J. Am. Chem. Soc. 1987, 109, 3098.）。

Ｘ＝ＯＭｓ、ＯＴｆ、およびＡ＝ＣＨ_２ＯＨである場合、一般構造ＸＩおよびＸＩＩの化合物は、それぞれ、ＸＩＩＩおよびＸＩＶから、好適な塩基、例えば三級アミン、例えばトリエチルアミンの存在下で、好適な溶媒、例えばジクロロメタン中にて、好適な試薬、例えばＭｓＣｌ、（Ｍｓ）_２Ｏ、（Ｔｆ）_２Ｏと反応させることにより調製することができる。

Ａ＝ＣＨ_２ＯＨである場合、一般構造ＸＩＩＩの化合物は、対応する酸（Ａ＝ＣＯＯＨ）から、好適な溶媒、例えばテトラヒドロフラン中で、好適な反応温度、例えば室温にて、好適な還元剤、例えばボランジメチルスルフィド付加物または水素化アルミニウムリチウムと反応させることにより調製することができる（ａ）N. G. Gaylord, Reduction with Complex Metal Hydrides, Wiley, NY, .1956, 322、ｂ）H. C. Brown, W. Korytnyk, J. Am. Chem. Soc. 1960, 82, 3866）。

Ａ＝ＣＨ_３、ＣＨ_２ＯＨである場合、一般構造ＸＩＩＩおよびＸＩＶの化合物は、鈴木クロスカップリング反応により、好適なアリール基質ＸＶ〜ＸＶＩＩを出発物質として用いて調製することができる（N. Miyaura, A. Suzuki, Chem. Rev. 1995, 95, 2457）。

Ｂ＝Ｂｒ、Ｉ、ＯＴｆである場合、クロスカップリング反応は、ＸＶまたはＸＶＩを、好適な溶媒混合物、例えばＤＭＦ／Ｈ_２Ｏ中で、好適な温度、例えば室温、５０℃、または８０℃にて、好適な触媒、例えばＳｐｈｏｓｐａｌｌａｄａｃｙｃｌｅＧ２（クロロ（２−ジシクロヘキシルホスフィノ−２’，６’−ジメトキシ−１，１’−ビフェニル）［２−（２’−アミノ−１，１’−ビフェニル）］パラジウム（ＩＩ））および好適な塩基、例えばＫ_２ＣＯ_３を用いて、ボロン試薬ＸＶＩＩ（Ｃ＝Ｂ（ＯＨ）_２、Ｂｐｉｎ）と反応させることを含む（T. E. Barder, S. D. Walker, J. R. Martinelli, S. L. Buchwald, S. L. J. Am. Chem. Soc. 2005, 127 4685、ｂ）R. A. Altman, S. L. Buchwald, Nature Protocols 2007, 2, 3115-3121）。

Ｂ＝Ｂ（ＯＨ）_２、Ｂｐｉｎである場合、クロスカップリング反応は、ＸＶまたはＸＶＩを、好適な溶媒混合物、例えばＤＭＦ／Ｈ_２Ｏ中で、好適な温度、例えば室温、５０℃、または８０℃にて、好適な触媒、例えばＳｐｈｏｓｐａｌｌａｄａｃｙｃｌｅＧ２（クロロ（２−ジシクロヘキシルホスフィノ−２’，６’−ジメトキシ−１，１’−ビフェニル）［２−（２’−アミノ−１，１’−ビフェニル）］パラジウム（ＩＩ））、および好適な塩基、例えばＫ_２ＣＯ_３を用いて、試薬ＸＶＩＩ（Ｃ＝Ｂｒ、Ｉ、ＯＴｆ）と反応させることを含む。化合物ＸＶＩ〜ＸＶＩＩは市販されている。

スキーム８：式Ｖで定義される、一般構造ＸＶＩＩＩの化学的に３’改変したｍＲＮＡは、ＲＮＡを、好適に緩衝した水溶液（緩衝液：ＮａＯＡｃ、ＴＲＩＳ、ＰＢＳ、ＭＥＳ、ＨＥＰＥＳ）中で、５．０〜７．５の範囲の好適なｐＨにて、０℃〜室温の範囲の温度で、ＮａＩＯ_４と共に、一般構造ＸＸと反応させ、続いて好適な求核試薬、例えばヒドラジン、アシルヒドラゾン、ヒドロキシルアミン、１，２−アミノチオール、アミンで処理することにより得ることができる。

式Ｖで定義される、一般構造ＸＶＩＩＩの化学的に３’改変したｍＲＮＡは、ＲＮＡを、好適に緩衝した水溶液（緩衝液：ＮａＯＡｃ、ＴＲＩＳ、ＰＢＳ、ＭＥＳ、ＨＥＰＥＳ）中で、５．０〜７．５の範囲の好適なｐＨにて、０℃〜室温の範囲の温度で、ＮａＩＯ_４と共に、一般構造ＸＸと反応させ、続いて好適なアミン求核試薬、例えばヒドラジン、アシルヒドラゾン、ヒドロキシルアミン、アミンで処理し、続いて室温〜３７℃の範囲の温度にて、好適な還元剤、例えばＮａＣＮＢＨ_３で処理することにより得ることができる。

式Ｉで定義される、一般構造ＸＩＸのＲＮＡは、ＲＮＡを、好適に緩衝した水溶液（緩衝液：ＮａＯＡｃ、ＴＲＩＳ、ＰＢＳ、ＭＥＳ、ＨＥＰＥＳ）中で、５．０〜７．５の範囲の好適なｐＨにて、０℃〜室温の範囲の温度で、ＮａＩＯ_４と共に、一般構造ＸＸと反応させ、続いて好適な求核試薬、例えばメルドラム酸で処理することにより得ることができる。

スキーム９：以下に定義される、一般構造ＸＸＩおよびＸＸＩＩの５’３’ビス改変ＲＮＡは、それぞれ、構造ＸＸＩＩＩおよびＸＸＩＶの３’改変ＲＮＡから、スキーム１で説明する条件下で、グアノシン誘導体ＩＩと反応させることにより得ることができる。

スキーム１０：一般構造ＸＸＶの化学キャップされたｍＲＮＡは、ｍＲＮＡ−５’一リン酸を、好適に緩衝した水性生理食塩水（緩衝液：ＨＥＰＥＳ、ＴＲＩＳ、ＭＥＳ、ＰＢＳ）中で、５．５〜７．５の範囲の好適なｐＨにて、有機溶媒、例えばＤＭＦおよびＤＭＳＯの存在下または不在下で、好適なルイス酸性アクチベータ、例えばＭｎＣｌ_２、ＮｉＣｌ_２、ＺｎＣｌ_２の存在下にて、一般構造ＸＸＶＩのイミダゾール活性化キャップ構造と反応させることにより得ることができる。

調製され得る例示的な５’キャップ構造は、

を含む。

スキーム１１：一般構造ＸＸＶＩの化合物は、ＹおよびＲ^１が式Ｉと同様に定義され、リン酸塩ＸＸＶＩＩ（トリブチルアンモニウム塩）を、好適な溶媒、例えばＤＭＦ、ＤＭＳＯ、ＮＭＰ、リン酸トリメチル中で、好適な温度、例えば室温にて、イミダゾールまたはＮ−メチル−イミダゾール、好適な三級ホスフィン、例えばトリフェニルホスフィン、好適なオキシダント、例えば２，２’−ジピリジルジスルフィド、および好適な塩基、例えばトリエチルアミンで処理することにより調製することができる（ａ）M. Lewdorowicz, Y. Yoffe, J. Zuberek, J. Jemielity, J. Stepinski, R. Kierzek, R. Stolarski, M. Shapira, E. Darzynkiewicz, RNA 2004, 10, 1469、ｂ）R. Worch, J. Stepinski, A. Niedzwiecka, M. Jankowska-Anyszka, C. Mazza, S. Cusack, R. Stolarski, E. Darzynkiewicz, Nucleosides Nucleotides and Nucleic Acids 2005, 24, 1131、ｃ）M. Warminski, J. Kowalska, J. Buck, J. Zuberek, M. Lukaszewicz, C. Nicola, A. N. Kuhn, U. Sahin, E. Darzynkiewicz, J. Jemielity, Bioorg. Med. Chem., 2013, 23, 3753）。

スキーム１２：一般構造ＸＸＶＩＩの化合物は、Ｙ、Ｒ^１、およびＺ_２が式Ｉと同様に定義され、活性化リン酸塩ＸＸＩＸを、好適な溶媒、例えばＤＭＦ、ＤＭＳＯ、または水中で、ルイス酸、例えば塩化亜鉛、塩化マグネシウム、または塩化マンガンの存在下にて、好適な温度、例えば室温で、トリエチルアンモニウムリン酸塩または同様のリン酸塩と反応させることにより調製することができる（ａ）M. Lewdorowicz, Y. Yoffe, J. Zuberek, J. Jemielity, J. Stepinski, R. Kierzek, R. Stolarski, M. Shapira, E. Darzynkiewicz, RNA 2004, 10, 1469、ｂ）R. Worch, J. Stepinski, A. Niedzwiecka, M. Jankowska-Anyszka, C. Mazza, S. Cusack, R. Stolarski, E. Darzynkiewicz, Nucleosides Nucleotides and Nucleic Acids 2005, 24, 1131、ｃ）M. Warminski, J. Kowalska, J. Buck, J. Zuberek, M. Lukaszewicz, C. Nicola, A. N. Kuhn, U. Sahin, E. Darzynkiewicz, J. Jemielity, Bioorg. Med. Chem., 2013, 23, 3753）。

また、Ｘ＝Ｏである場合、一般構造ＸＸＶＩＩの化合物は、Ｙ、Ｒ^１、およびＺ_２が式Ｉと同様に定義され、ＸＸＶＩＩＩを、好適な溶媒、例えばリン酸トリメチル中で、０℃〜室温の範囲の好適な温度にて、二リン酸テトラクロリドと反応させることにより調製することができる（J. Emsley, J. Moore, P.B. Udy, J. Chem. Soc. (A) Inorg. Phys. Theor. 1971, 2863）。

また、Ｘ＝ＮＨである場合、一般構造ＸＸＶＩＩの化合物は、Ｙ、Ｒ^１、およびＺ_２が式Ｉと同様に定義され、ＸＸＶＩＩＩを、好適な溶媒、例えばリン酸トリメチル中で、０℃〜室温の範囲の好適な温度にて、イミド−ビス（ホスホリルジクロリド）と反応させることにより調製することができる（A. M. Rydzik, M. Kulis, M. Lukaszewicz, J. Kowalska, J. Zuberek, Z. M. Darzynkiewicz, E. Darzynkiewicz, J. Jemielity, Bioorganic & Med. Chem. 2012, 20, 1699）。

また、Ｘ＝ＣＨ_２である場合、一般構造ＸＸＶＩＩの化合物は、Ｙ、Ｒ^１、およびＺ_２が式Ｉと同様に定義され、ＸＸＶＩＩＩを、好適な溶媒、例えばリン酸トリメチル中で、好適な温度、例えば０℃または室温にて、メチレンビス（ホスホン酸ジクロリド）と反応させることにより調製することができる（ａ）M. Honcharenko, M. Zytek, B. Bestas, P. Moreno, J. Jemielity, E. Darzynkiewicz, C. I. E. Smith, R. Stroemberg, Bioorg. Med. Chem., 2013 ,21, 7921、ｂ）M. Kalek, J. Jemielity, Z. M. Darzynkiewicz, E. Bojarska, J. Stepinski, R. Stolarski, R. E. Davis, E. Darzynkiewic, Bioorg. Med. Chem. 2006, 14, 3223、ｃ）M. Kalek, J. Jemielity, J. Stepinski, R. Stolarski, E. Darzynkiewics, Tetrahedron Lett. 2005, 46, 2417）。

一般構造ＸＸＩＸの化合物（Ｚ＝イミダゾール、Ｎ−メチルイミダゾリウム）は、Ｙ、Ｒ^１、およびＺ_２が式Ｉと同様に定義され、リン酸塩ＸＸＩＸ（Ｚ＝ＯＨ、トリブチルアンモニウム塩）を、好適な溶媒、例えばＤＭＦ、ＤＭＳＯ、ＮＭＰ、リン酸トリメチル中で、好適な温度、例えば室温にて、イミダゾールまたはＮ−メチル−イミダゾール、好適な三級ホスフィン、例えばトリフェニルホスフィン、好適なオキシダント、例えば２，２’−ジピリジルジスルフィド、および好適な塩基、例えばトリエチルアミンで処理することにより調製することができる（ａ）M. Lewdorowicz, Y. Yoffe, J. Zuberek, J. Jemielity, J. Stepinski, R. Kierzek, R. Stolarski, M. Shapira, E. Darzynkiewicz, RNA 2004, 10, 1469、ｂ）R. Worch, J. Stepinski, A. Niedzwiecka, M. Jankowska-Anyszka, C. Mazza, S. Cusack, R. Stolarski, E. Darzynkiewicz, Nucleosides Nucleotides and Nucleic Acids 2005, 24, 1131、ｃ）M. Warminski, J. Kowalska, J. Buck, J. Zuberek, M. Lukaszewicz, C. Nicola, A. N. Kuhn, U. Sahin, E. Darzynkiewicz, J. Jemielity, Bioorg. Med. Chem., 2013, 23, 3753）。

また、一般構造ＸＸＩＸの化合物（Ｚ＝ＯＨ）は、Ｙ、Ｒ^１、およびＺ_２が式Ｉと同様に定義され、ＸＸＶＩＩＩを、好適な溶媒、例えばリン酸トリメチル中で、０℃〜室温の範囲の好適な温度にて、好適なリン酸化剤、例えば塩化ホスホリルと反応させることにより調製することができる。

また、一般構造ＸＸＶＩＩの化合物は、Ｙ、Ｒ^１、およびＺ_２が実施形態式Ｉと同様に定義され、クロスカップリング反応により、好適なアリール基質および化合物ＸＸＸを出発物質として用いて、調製することができる（N. Miyaura, A. Suzuki, Chem. Rev. 1995, 95, 2457）。

化合物ＸＸＸは、市販されている８−ブロモ−３−メチル−１Ｈ−プリン−２，６（３Ｈ，７Ｈ）−ジオン（Ａ＝Ｈ）または８−ブロモ−１，３−ジメチル−１Ｈ−プリン−２，６（３Ｈ，７Ｈ）−ジオン（Ａ＝Ｍｅ）を、好適な溶媒、例えばＤＭＦ、ＤＭＳＯ、またはＮＭＰ中で、室温〜６０℃の範囲の好適な反応温度にて、好適なアルキル化試薬、例えばハロゲン化アルキル、トリフレート、またはメシル酸塩を用いてアルキル化することにより得ることができる。

スキーム１３：一般構造ＸＸＶＩＩＩの化合物は、Ｙ、Ｒ^１、およびＺ_２が式Ｉと同様に定義され、一般構造ＸＸＸＩＩのアミドから、好適な溶媒、例えばエタノール、イソプロパノール、またはＴＨＦ中で、５０〜１００℃の範囲の温度にて、適切な塩基、例えばナトリウムｔｅｒｔ−ブトキシド、カリウムｔｅｒｔ−ブトキシド、またはナトリウムイソ−プロポキシドを用いた環化により得ることができる。

一般構造ＸＸＩＸの化合物は、Ｙ、Ｒ^１、およびＺ_２が式Ｉと同様に定義され、一般構造ＸＸＸＩのモノまたはジアルキルリン化水素およびリン酸塩から、溶媒、例えばＤＭＦ、ＤＭＳＯ、ＮＭＰ、またはＴＨＦ中で、０℃〜３０℃の範囲の温度にて、好適なルイス酸、例えば臭化トリメチルシリル、三臭化ホウ素、または三塩化アルミニウムを用いた加水分解により得ることができる。

一般構造ＸＸＸＩの化合物は、Ｙ、Ｒ^１、およびＺ_２が実施形態式Ｉと同様に定義され、一般構造ＸＸＸＩＩのアミドから、好適な溶媒、例えばエタノール、イソプロパノール、またはＴＨＦ中で、５０〜１００℃の範囲の温度にて、適切な塩基、例えばナトリウムｔｅｒｔ−ブトキシド、カリウムｔｅｒｔ−ブトキシド、またはナトリウムイソ−プロポキシドを用いた環化により得ることができる。

スキーム１４：一般構造ＸＸＸＩＩの化合物は、Ｙ、Ｒ^１、およびＺ_２が実施形態ＸＸＸと同様に定義され、ＸＸＸＩＩＩを、好適な溶媒、例えばＤＭＦ、ＤＭＳＯ、またはＮＭＰ中で、室温〜５０℃の範囲の温度にて、好適なアクチベータ、例えばＨＡＴＵ、ＨＢＴＵ、Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムテトラフルオロホウ酸塩、または（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート、および好適な塩基、例えばトリエチルアミンまたはヒューニッヒ塩基を用いて、リンカーユニットの適切なカルボン酸でアシル化することにより得ることができる。

一般構造ＸＸＸＩＩＩの化合物は、Ｙ、Ｒ^１が実施形態式Ｉと同様に定義され、ＸＸＸＩＶ（Ｙが置換基Ｒ１の対応するカルボン酸である）を、好適な溶媒、例えばＴＨＦ、ジエチルエーテル、またはジオキサン中で、室温〜１２０℃の範囲の温度にて、還元剤、例えば水素化アルミニウムリチウムまたはＲｅｄ−Ａ１を用いて還元することにより得ることができる。

一般構造ＸＸＸＩＶの化合物は、市販されている５，６−ジアミノピリミジン−４（３Ｈ）−オン（ＸＸＸＶ）を、好適な溶媒、例えばＤＭＦ、ＤＭＳＯ、またはＮＭＰ中で、室温〜５０℃の範囲の温度にて、好適なアクチベータ、例えばＨＡＴＵ、ＨＢＴＵ、Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムテトラフルオロホウ酸塩、または（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート、および好適な塩基、例えばトリエチルアミンまたはヒューニッヒ塩基を用いて、適切なカルボン酸でアシル化して、置換基Ｒ^１を導入することにより得ることができる。

スキーム１５：上記に定義される、一般構造ＸＸＸＶＩおよびＸＸＸＶＩＩの５’３’−ビス改変ＲＮＡは、それぞれ、構造ＸＬおよびＸＬＩの３’改変ＲＮＡから、スキーム１で説明する条件下で、グアノシン誘導体ＸＸＶＩと反応させることにより得ることができる。ＸＸＶＩの合成をスキーム１０で説明する。

定義
「アシル」という用語は、任意選択で置換されたアルキルカルボニル、任意選択で置換されたアリールカルボニルを指す。かかるアシル基の例として、アセチル、ベンゾイルなどが挙げられる。

「親和性部分」という用語は、目的の分子、例えばタンパク質、もしくは核酸、または他の分子に特異的に結合する分子を指す。親和性部分の例として、ビオチンおよびジゴキシゲニンが挙げられるが、これらに限定されない。

「アルカンジイル」という用語は、脂肪族炭化水素に由来する一般式Ｃ_ｎＨ_２ｎの二価ラジカルを指す。別に指定されない限り、かかるアルカンジイルは、置換アルカンジイルを含む。好適な例として、メタンジイル（−ＣＨ_２−）、エタンジイル（−ＣＨ_２−ＣＨ_２−）などが挙げられる。

「アルケニル」および「アルキニル」という用語は、単独または組合せで、本明細書で使用されるとき、１〜２０個の炭素原子を含有し、かつ不飽和の１つまたは複数のユニットを含む、脂肪族直鎖または分岐鎖炭化水素鎖を指す。アルケニルは、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を含有するが、炭素−炭素三重結合は含有しない。アルキニルは、少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を含有する。好ましいアルケニルおよびアルキニル基は、２〜１０個の炭素原子または２〜６個の炭素原子を含むことができる。好適なアルケニル基は、例えばビニル、アリル、１−プロペニル、２−プロペニル、１−ブテニル、２−ブテニル、３−ブテニル、１−ペンテニル、２−ペンテニル、３−ペンテニル、４−ペンテニル、１−ヘキセニル、２−ヘキセニル、３−ヘキセニル、４−ヘキセニル、５−ヘキセニル、１−ヘプテニル、２−ヘプテニル、３−ヘプテニル、４−ヘプテニル、５−ヘプテニル、６−ヘプテニル、１−オクテニル、２−オクテニル、３−オクテニル、４−オクテニル、５−オクテニル、６−オクテニル、７−オクテニル、１−ノネニル、２−ノネニル、３−ノネニル、４−ノネニル、５−ノネニル、６−ノネニル、７−ノネニル、８−ノネニル、１−デセニル、２−デセニル、３−デセニル、４−デセニル、５−デセニル、６−デセニル、７−デセニル、８−デセニル、または９−デセニルを含む。好適なアルキニル基は、例えばエチニル、１−プロピニル、２−プロピニル、１−ブチニル、２−ブチニル、３−ブチニル、１−ペンチニル、２−ペンチニル、３−ペンチニル、４−ペンチニル、１−ヘキシニル、２−ヘキシニル、３−ヘキシニル、４−ヘキシニル、５−ヘキシニル、１−ヘプチニル、２−ヘプチニル、３−ヘプチニル、４−ヘプチニル、５−ヘプチニル、６−ヘプチニル、１−オクチニル、２−オクチニル、３−オクチニル、４−オクチニル、５−オクチニル、６−オクチニル、７−オクチニル、１−ノニニル、２−ノニニル、３−ノニニル、４−ノニニル、５−ノニニル、６−ノニニル、７−ノニニル、８−ノニニル、１−デシニル、２−デシニル、３−デシニル、４−デシニル、５−デシニル、６−デシニル、７−デシニル、８−デシニル、または９−デシニルを含む。アルケニルおよびアルキニル基は任意選択で、本明細書で説明するように置換することができる。

「アルキル」という用語は、単独または組合せで、本明細書で使用されるとき、１〜２０個の炭素原子を含有する、脂肪族直鎖または分岐鎖飽和炭化水素鎖を指す。ある特定の実施形態では、アルキル基は、１〜１０個の炭素原子を含むことができる。さらなる実施形態では、アルキル基は、１〜６個の炭素原子を含むことができる。アルキル基は任意選択で、本明細書で説明するように置換することができる。アルキル基の例として、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソ−アミル、ヘキシル、オクチル、ノイルなどが挙げられる。

「アミノ」という用語は、基−ＮＨ_２を指す。

「アミノアルキル」という用語は、一級、二級、または三級アミノ基で置換されたアルキルを指す。好ましいアミノアルキル基は、１つまたは複数の一級、二級、および／または三級アミン基、ならびに１〜約１２個の炭素原子、より好ましくは１〜約８個の炭素原子、さらにより好ましくは１、２、３、４、５、または６個の炭素原子を有するアミノアルキル基を含む。かかるアミノアルキルの例として、アミノメチル、アミノエチルなどが挙げられる。

「アリール」という用語は、単独または組合せで、本明細書で使用されるとき、少なくとも１つの芳香環を含有する炭素環式芳香族炭化水素環系を意味する。芳香環系は、芳香族もしくは非芳香族炭化水素環を含む縮合環系、または非芳香族炭化水素環を含む芳香環系である場合がある。「アリール」という用語は、芳香族基、例えばフェニル、ナフチル、アントラセニル、およびフェナントリルを包含する。アリールは任意選択で、本明細書で説明するように置換することができる。

「キャップ０」という用語は、唯一のメチル化が^ｍ７Ｇにあるキャップを指す。「キャップ１」という用語は、Ｎ_１に追加のメチル化を有するキャップを指す。一般化したキャップ構造は、^ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎ_１ ^ｍｐＮ_２ ^ｍｐＮ_３ｐ．．．．として表され、Ｎは任意のヌクレオチド、好ましくはプリンまたはピリミジンであり、ｐはリン酸基であり、ｍはメチル基である。グアノシンのＮ^７位置にメチル基を含有する^ｍ７Ｇは、ｍＲＮＡの５’最末端にある。その一方で、Ｎ_１およびＮ_２位置でのメチル化は、リボース部分の２’−ＯＨ基での置換である。様々なキャップ構造は、それらが含有するメチル基の数に基づいて分類される（Banerjee, A. K. Microbiological Rev., 1980, 44, 175）。

「シクロアルケニル」という用語は、単独または他の用語との組合せで、本明細書で使用されるとき、別に示されない限り、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を含有し、好ましくは３〜１０個の炭素原子、すなわち、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の炭素原子、好ましくは３〜６個の炭素原子を有し、環を形成する「アルケニル」の環式変形を表す。また、「シクロアルケニル」という用語は、その二環式変形を含むことが意味される。二環式環が形成される場合、各対応する環は２つの隣接した炭素原子で互いに接続されることが好ましいが、しかしながら、あるいは２つの環は同じ炭素原子を介して接続される、すなわち、それらはスピロ環系を形成するか、またはそれらは架橋環系を形成する。シクロアルケニルの例として、シクロプロペニル、シクロブテニル、シクロペンテニル、シクロペンタジエニル、シクロヘキセニル、１，３−シクロヘキセニル、シクロヘプテニル、シクロヘプタトリエニル、シクロオクテニル、シクロノネイル、シクロデセニル、ビシクロ［２．２．１］−２−ヘプテニル、ビシクロ［２．２．１］−２−オクテニル、またはビシクロ［４．４．０］−２−デセニルが挙げられる。シクロアルケニル基は任意選択で、本明細書で説明するように置換することができる。

「シクロアルキル」という用語は、単独または他の用語との組合せで、本明細書で使用されるとき、別に示されない限り、二環式および多環式アルキル基を含む「アルキル」の環式変形を表す。二環式または多環式環系の環は、縮合されていてもよく、単一の共有原子を介して結合され、すなわちそれらはスピロ環系または架橋環系を形成する。シクロアルキルは好ましくは、３〜１０個の炭素原子、すなわち、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の炭素原子、好ましくは３〜６個の炭素原子を含有して、環を形成することができる。好適なシクロアルキル基の例として、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、シクロノニル、またはシクロデシルが挙げられる。好適なシクロアルキル基の例として、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、スピロ［３，３］ヘプチル、スピロ［３，４］オクチル、スピロ［４，３］オクチル、ビシクロ［４．１．０］ヘプチル、ビシクロ［３．２．０］ヘプチル、ビシクロ［２．２．１］ヘプチル、ビシクロ［２．２．２］オクチル、ビシクロ［５．１．０］オクチル、ビシクロ［４．２．０］オクチルなどが挙げられる。シクロアルキル基は任意選択で、本明細書で説明するように置換することができる。

「検出部分」という用語は、好適な方法を用いて容易に検出され得る化学部分を指す。検出部分の例として、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、および放射性物質が挙げられるが、これらに限定されない。

「半減期」（Ｔ_１／２）という用語は、分子の活性、量、または数の半分を除去するのに必要な期間に関する。本発明の文脈では、ＲＮＡの半減期は、上記ＲＮＡの安定性の表示である。

「ヘテロ原子」という用語は、窒素、酸素、および硫黄を指す。

「ヘテロアリール」という用語は、本明細書で使用されるとき、１つまたは複数の炭素環原子が独立して、Ｏ、Ｓ、およびＮにより置換されたアリールである。ある特定の実施形態では、ヘテロアリールは、５〜７個の炭素原子を含むことができる。また、上記用語は、複素環式環がアリール環と縮合するか、ヘテロアリール環が他のヘテロアリール環と縮合するか、ヘテロアリール環がヘテロシクロアルキル環と縮合するか、またはヘテロアリール環がシクロアルキル環と縮合した、縮合多環式基を包含する。ヘテロアリール基の例として、ピロリル、ピロリニル、イミダゾリル、ピラゾリル、ピリジル、ピリミジニル、ピラジニル、ピリダジニル、トリアゾリル、ピラニル、フリル、チエニル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、オキサジアゾリル、チアゾリル、チアジアゾリル、イソチアゾリル、インドリル、イソインドリル、インドリジニル、ベンゾイミダゾリル、キノリル、イソキノリル、キノキサリニル、キナゾリニル、インダゾリル、ベンゾトリアゾリル、ベンゾジオキソリル、ベンゾピラニル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾオキサジアゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾチアジアゾリル、ベンゾフリル、ベンゾチエニル、クロモニル、クマリニル、ベンゾピラニル、テトラヒドロキノリニル、テトラゾロピリダジニル、テトラヒドロイソキノリニル、チエノピリジニル、フロピリジニル、ピロロピリジニルなどが挙げられる。例示的な三環性複素環式基として、カルバゾリル、ベンジドリル、フェナントロリニル、ジベンゾフラニル、アクリジニル、フェナントリジニル、キサンテニルなどが挙げられる。ヘテロアリールは任意選択で、本明細書で説明するように置換することができる。

「ヘテロシクリル」という用語は、環内の１〜３個の炭素原子が独立して、Ｏ、Ｓ、またはＮにより置換された、上記に定義されるシクロアルキル基を意味する。かかるヘテロシクリル基の例は、ピロリジニル、イミダゾリジニル、オキサゾリジニル、チアゾリジニル、テトラヒドロフラニル、ピペリジニル、ピペラジニル、モルホリニル、チオモルホリニル、テトラヒドロピラニル、ジオキサニル、インドリニル、イソインドリニル、ジヒドロベンゾフラニル、ジヒドロ−イソベンゾフラニル、テトラヒドロキノリニル、テトラヒドロイソキノリニル、テトラヒドロキノキサリニル、クロマニル、イソクロマニル、ジヒドロベンゾオキサジニル、ジヒドロベンゾチアジニル、またはジヒドロベンゾジオキシニルである。ヘテロシクリルは任意選択で、本明細書で説明するように置換することができる。

「免疫原性」という用語は、免疫反応を誘発する能力を指す。

「結合基」という用語は、２つの他の部分を結合する二価ラジカルを指す。結合基は一般的に、１〜４０個の原子を含有し、例えばアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、または複素環結合基である場合があり、そのうちの各々は任意選択で、本明細書で説明するように置換することができる。例えば、好適な結合基として、メタンジイル（−ＣＨ_２−）、エタンジイル（−ＣＨ_２−ＣＨ_２−）、エテンジイル（−ＣＨ＝ＣＨ−）、エチンジイル（−Ｃ≡Ｃ−）、−ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２−、−ＣＨ_２ＣＨ（ＣＨ_３）−、−Ｃ（ＣＨ_３）_２−、−（Ｃ_６Ｈ_４）−、−（Ｃ_６Ｈ_１０）−などが挙げられる。好適な結合基の追加の例として、

が挙げられるが、これらに限定されない。

「低級」という用語は、単独または組合せで、本明細書で使用されるとき、別に特に定義されない場合、１〜６（６を含む）個の炭素原子を含有することを意味する。

「核酸塩基」という用語は、ヌクレオチドの構成成分である窒素含有塩基を指す。核酸塩基として、例えば主要な核酸塩基シトシン、グアニン、アデニン、チミン、ウラシル；シュードウラシル；および改変核酸塩基、例えばｍ５Ｃ（５−メチルシチジン）、ｍ５Ｕ（５−メチルウリジン）、ｍ６Ａ（Ｎ６−メチルアデノシン）、ｓ２Ｕ（２−チオウリジン）、Ｕｍ（２’−０−メチルウリジン）、ｍ１Ａ（１−メチルアデノシン）；ｍ２Ａ（２−メチルアデノシン）；Ａｍ（２−１−Ｏ−メチルアデノシン）；ｍｓ２ｍ６Ａ（２−メチルチオ−Ｎ６−メチルアデノシン）；ｉ６Ａ（Ｎ６−イソペンテニルアデノシン）；ｍｓ２ｉ６Ａ（２−メチルチオ−Ｎ６イソペンテニルアデノシン）；ｉｏ６Ａ（Ｎ６−（シス−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン）；ｍｓ２ｉｏ６Ａ（２−メチルチオ−Ｎ６−（シス−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン）；ｇ６Ａ（Ｎ６−グリシニルカルバモイルアデノシン）；ｔ６Ａ（Ｎ６−トレオニルカルバモイルアデノシン）；ｍｓ２ｔ６Ａ（２−メチルチオ−Ｎ６−トレオニルカルバモイルアデノシン）；ｍ６ｔ６Ａ（Ｎ６−メチル−Ｎ６−トレオニルカルバモイルアデノシン）；ｈｎ６Ａ（Ｎ６−ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン）；ｍｓ２ｈｎ６Ａ（２−メチルチオ−Ｎ６−ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン）；Ａｒ（ｐ）（２’−Ｏ−リボシルアデノシン（リン酸塩））；Ｉ（イノシン）；ｍ１Ｉ（１−メチルイノシン）；ｍ’Ｉｍ（１，２’−Ｏ−ジメチルイノシン）；ｍ３Ｃ（３−メチルシチジン）；Ｃｍ（２Ｔ−Ｏ−メチルシチジン）；ｓ２Ｃ（２−チオシチジン）；ａｃ４Ｃ（Ｎ４−アセチルシチジン）；ｆ５Ｃ（５−フォンニルシチジン（fonnylcytidine））；ｍ５Ｃｍ（５，２−Ｏ−ジメチルシチジン）；ａｃ４Ｃｍ（Ｎ４アセチル２ＴＯメチルシチジン）；ｋ２Ｃ（ライシジン）；ｍ１Ｇ（１−メチルグアノシン）；ｍ２Ｇ（Ｎ２−メチルグアノシン）；ｍ７Ｇ（７−メチルグアノシン）；Ｇｍ（２’−Ｏ−メチルグアノシン）；ｍ２２Ｇ（Ｎ２，Ｎ２−ジメチルグアノシン）；ｍ２Ｇｍ（Ｎ２，２’−Ｏ−ジメチルグアノシン）；ｍ２２Ｇｍ（Ｎ２，Ｎ２，２’−Ｏ−トリメチルグアノシン）；Ｇｒ（ｐ）（２’−Ｏ−リボシルグアノシン（リン酸塩））；ｙＷ（ワイブトシン）；ｏ２ｙＷ（ペルオキシワイブトシン）；ＯＨｙＷ（ヒドロキシワイブトシン）；ＯＨｙＷ^＊（未修飾ヒドロキシワイブトシン）；ｉｍＧ（ワイオシン）；ｍｉｍＧ（メチルグアノシン）；Ｑ（キューオシン）；ｏＱ（エポキシキューオシン）；ｇａｌＱ（ガラクトシル（galtactosyl）−キューオシン）；ｍａｎＱ（マンノシル−キューオシン）；ｐｒｅＱｏ（７−シアノ−７−デアザグアノシン）；ｐｒｅＱｉ（７−アミノメチル−７−デアザグアノシン）；Ｇ（アーケオシン）；Ｄ（ジヒドロウリジン）；ｍ５Ｕｍ（５，２’−Ｏ−ジメチルウリジン）；ｓ４Ｕ（４−チオウリジン）；ｍ５ｓ２Ｕ（５−メチル−２−チオウリジン）；ｓ２Ｕｍ（２−チオ−２’−Ｏ−メチルウリジン）；ａｃｐ３Ｕ（３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウリジン）；ｈｏ５Ｕ（５−ヒドロキシウリジン）；ｍｏ５Ｕ（５−メトキシウリジン）；ｃｍｏ５Ｕ（ウリジン５−オキシ酢酸）；ｍｃｍｏ５Ｕ（ウリジン５−オキシ酢酸メチルエステル）；ｃｈｍ５Ｕ（５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジン）；ｍｃｈｍ５Ｕ（５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジンメチルエステル）；ｍｃｍ５Ｕ（５−メトキシカルボニルメチルウリジン）；ｍｃｍ５Ｕｍ（Ｓ−メトキシカルボニルメチル−２−Ｏ−メチルウリジン）；ｍｃｍ５ｓ２Ｕ（５−メトキシカルボニルメチル−２−チオウリジン）；ｎｍ５ｓ２Ｕ（５−アミノメチル−２−チオウリジン）；ｍｎｍ５Ｕ（５−メチルアミノメチルウリジン）；ｍｎｍ５ｓ２Ｕ（５−メチルアミノメチル−２−チオウリジン）；ｍｎｍ５ｓｅ２Ｕ（５−メチルアミノメチル−２−セレノウリジン）；ｎｃｍ５Ｕ（５−カルバモイルメチルウリジン）；ｎｃｍ５Ｕｍ（５−カルバモイルメチル−２’−Ｏ−メチルウリジン）；ｃｍｎｍ５Ｕ（５−カルボキシメチルアミノメチルウリジン）；ｃｎｍｍ５Ｕｍ（５−カルボキシメチルアミノメチル−２−Ｌ−Ｏメチルウリジン）；ｃｍｎｍ５ｓ２Ｕ（５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン）；ｍ６２Ａ（Ｎ６，Ｎ６−ジメチルアデノシン）；Ｔｍ（２’−Ｏ−メチルイノシン）；ｍ４Ｃ（Ｎ４−メチルシチジン）；ｍ４Ｃｍ（Ｎ４，２−Ｏ−ジメチルシチジン）；ｈｍ５Ｃ（５−ヒドロキシメチルシチジン）；ｍ３Ｕ（３−メチルウリジン）；ｃｍ５Ｕ（５−カルボキシメチルウリジン）；ｍ６Ａｍ（Ｎ６，Ｔ−Ｏ−ジメチルアデノシン）；ｒｎ６２Ａｍ（Ｎ６，Ｎ６，Ｏ−２−トリメチルアデノシン）；ｍ２’７Ｇ（Ｎ２，７−ジメチルグアノシン）；ｍ２’２’７Ｇ（Ｎ２，Ｎ２，７−トリメチルグアノシン）；ｍ３Ｕｍ（３，２Ｔ−Ｏ−ジメチルウリジン）；ｍ５Ｄ（５−メチルジヒドロウリジン）；ｆ５Ｃｍ（５−ホルミル−２’−Ｏ−メチルシチジン）；ｍｌＧｍ（１，２’−Ｏ−ジメチルグアノシン）；ｍ’Ａｍ（１，２−０−ジメチルアデノシン）イリノメチルウリジン（irinomethyluridine））；ｔｍ５ｓ２Ｕ（Ｓ−タウリノメチル−２−チオウリジン））；ｉｍＧ−ｌ４（４−デメチルグアノシン）；ｉｍＧ２（イソグアノシン）；またはａｃ６Ａ（Ｎ６−アセチルアデノシン）、ヒポキサンチン、イノシン、８−オキソ−アデニン、その７−置換誘導体、ジヒドロウラシル、シュードウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−アミノウラシル、５−（Ｃ_１〜Ｃ_６）−アルキルウラシル、５−メチルウラシル、５−（Ｃ_２〜Ｃ_６）−アルケニルウラシル、５−（Ｃ_２〜Ｃ_６）−アルキニルウラシル、５−（ヒドロキシメチル）ウラシル、５−クロロウラシル、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−ヒドロキシシトシン、５−（Ｃ_１〜Ｃ_６）−アルキルシトシン、５−メチルシトシン、５−（Ｃ_２〜Ｃ_６）−アルケニルシトシン、５−（Ｃ_２〜Ｃ_６）−アルキニルシトシン、５−クロロシトシン、５−フルオロシトシン、５−ブロモシトシン、Ｎ^２−ジメチルグアニン、７−デアザグアニン、８−アザグアニン、７−デアザ−７−（Ｃ２〜Ｃ６）アルキニルグアニン、８−ヒドロキシグアニン、６−チオグアニン、８−オキソグアニン、２−アミノプリン、２−アミノ−６−クロロプリン、２，４−ジアミノプリン、２，６−ジアミノプリン、８−アザプリンなどが挙げられる。

基が「無」であると定義される場合、基が不在であることを意味する。

「任意選択で置換された」という用語は、先行する基が置換されていてもよいし、または置換されていなくてもよいことを意味する。置換されている場合、「任意選択で置換された」基の置換基は、単独または組合せの、以下の基または基の特定の指定されるセット：低級アルキル、低級アルケニル、低級アルキニル、低級アルカノイル、低級ヘテロアルキル、低級ヘテロシクロアルキル、低級ハロアルキル、低級ハロアルケニル、低級ハロアルキニル、低級ペルハロアルキル、低級ペルハロアルコキシ、低級シクロアルキル、フェニル、アリール、アリールオキシ、低級アルコキシ、低級ハロアルコキシ、オキソ、低級アシルオキシ、カルボニル、カルボキシル、低級アルキルカルボニル、低級カルボキシエステル、低級カルボキサミド、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシ、アミノ、低級アルキルアミノ、アリールアミノ、アミド、ニトロ、チオール、低級アルキルチオ、低級ハロアルキルチオ、低級ペルハロアルキルチオ、アリールチオ、スルホン酸塩、スルホン酸、三置換シリル、Ｎ_３、ＳＨ、ＳＣＨ_３、Ｃ（Ｏ）ＣＨ_３、ＣＯ_２ＣＨ_３、ＣＯ_２Ｈ、ニトリル、ＣＦ_３、シクロアルキル、ピリジニル、チオフェン、フラニル、低級カルバミン酸塩、ハロフェニル、ヒドロキシフェニル、ハロアルキル、およびヒドロキシアルキルから独立して選択される１つまたは複数の置換基を含んでもよいが、これらに限定されない。２つの置換基は、共に連結されて、５、６、または７員芳香族または非芳香族炭素環式または１〜３個のヘテロ原子を含有する複素環式環を形成してもよく、例えばメチレンジオキシまたはエチレンジオキシを形成する。任意選択で置換された基は、置換されなくても（例えば−ＣＨ_２ＣＨ_３）、完全に置換されても（例えば−ＣＦ_２ＣＦ_３）、一置換されても（例えば−ＣＨ_２ＣＨ_２Ｆ）、または完全置換〜一置換の中間のいずれかのレベルで置換されても（例えば−ＣＦ_２ＣＦ_３）よい。置換基が置換に関して無制限に列挙される場合、置換形態および非置換形態の両方が包含される。置換基が「置換された」と限定される場合、置換形態が特に意図される。加えて、特定の部分について任意選択の置換基の様々なセットは、必要に応じて定義することができ、これらの場合、任意選択の置換は、多くの場合「により任意選択で置換された」という句の直後に続いて、定義されるとおりである。

本発明に従う化合物は、「薬学的に許容される調製物」で提供することができる。かかる組成物は、塩、緩衝液、保存剤、担体、および任意選択で他の療法用剤を含有することができる。「薬学的に許容される塩」は、生理学的に適合性であり、好ましくは非毒性の塩を含む。例えば、酸添加塩は、例えば化合物の溶液を、塩酸、硫酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酢酸、安息香酸、クエン酸、酒石酸、炭酸、またはリン酸などの薬学的に許容される塩の溶液と混合することにより形成することができる。さらに、化合物が酸性部分を有する場合、その好適な薬学的に許容される塩として、アルカリ金属塩（例えばナトリウムまたはカリウム塩）；アルカリ土類金属塩（例えばカルシウムまたはマグネシウム塩）；および好適な有機リガンド（例えばアンモニウム、四級アンモニウム、ならびにハロゲン化物、水酸化物、カルボン酸塩、硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、スルホン酸アルキル、およびアリールスルホン酸エステルなどの対アニオンを用いて形成されるアミンカチオン）で形成される塩を挙げることができる。薬学的に許容される塩の例示的な例として、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重炭酸塩、重硫酸塩、重酒石酸塩、ホウ酸塩、臭化物、酪酸塩、エデト酸カルシウム、樟脳酸塩、樟脳スルホン酸塩、カンシル酸塩、炭酸塩、塩化物、クエン酸塩、クラブラン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、二塩酸塩、ドデシル硫酸塩、エデト酸塩、エジシル酸塩、エストレート、エシル酸塩、エタンスルホン酸塩、蟻酸塩、フマル酸塩、グルセプト酸塩、グルコヘプトン酸塩、グルコン酸塩、グルタミン酸塩、グリセロリン酸塩、グリコリルアルサニル酸塩、半硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、ヘキシルレソルシン酸塩、ヒドラバミン、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシ−エタンスルホン酸塩、ヒドロキシナフトエ酸塩、ヨウ化物、イソチオン酸塩、乳酸塩、ラクトビオン酸塩、ラウリル酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、マンデル酸塩、メシル酸塩、メタンスルホン酸塩、メチル硫酸塩、ムチン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ナプシル酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、Ｎ−メチルグルカミンアンモニウム塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パモ酸塩（エンボン酸塩）、パルミチン酸塩、パントテン酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩／二リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、ポリガラクツロン酸塩、プロピオン酸塩、サリチル酸塩、ステアリン酸塩、硫酸塩、塩基性酢酸塩、コハク酸塩、タンニン酸塩、酒石酸塩、テオクル酸塩、トシル酸塩、トリエチオジド、ウンデカン酸塩、吉草酸塩などが挙げられるが、これらに限定されない（例えばBerge, S. M. et al J. Pharm. Sci. 1977, 66, 1-19を参照のこと）。

「ＰＥＧ」という用語は、繰返し単位

を有するポリマーを指し、式中、ｎ２は２〜１２である。直鎖または分岐鎖ポリエチレングリコールポリマーは、この用語に包含され、ポリエチレングリコールのモノメチルエーテル（ｍＰＥＧ）を含む。また、「ＰＥＧ」という用語は、

などのニューコム型樹状分子、およびまた

を包含する。ＰＥＧはいくつかの処方で市販されている（例えばＣａｒｂｏｗａｘ（商標）（ＤｏｗＣｈｅｍｉｃａｌ、Ｍｉｄｌａｎｄ、ＭＩ）、Ｐｏｌｙ−Ｇ（登録商標）（ＡｒｃｈＣｈｅｍｉｃａｌｓ、ＮｏｒｗａｌｋＣＴ）、およびＳｏｌｂａｓｅ）。

「ポリアミン」という用語は、少なくとも１つのアミノ水素原子を有する少なくとも２つのアミノ基を含有するアミン化合物を指す。ポリアミンの例として、ポリエチレンイミン、ポリプロピレンイミン、ポリビニルアミン、ポリアリルアミン、エチレンジアミン、ヘキサメチレンジアミン、ジエチレントリアミン、トリエチレンテトラミン、テトラエチレンペンタミン、およびビスヘキサメチレントリアミンが挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書で開示される式において、表示

は、５’から３’の向きのＲＮＡを指す。

実施例
材料および方法：全ての試薬は、別に示されない限り、市販の供給源から購入し、処理せずに使用した。ＮＭＲスペクトルは、ＢｒｕｋｅｒＡＶＡＮＣＥ４００ＭＨｚまたは５００ＭＨｚＮＭＲ分析計上でＩＣＯＮ−ＮＭＲを用いて、ＴｏｐＳｐｉｎプラグラム制御下で行った。^１３ＣＮＭＲおよび^３１ＰＮＭＲスペクトルを記録した。別に示されない限り、スペクトルを２９８Ｋで測定し、溶媒共鳴に対して参照した。化学シフト（δ）をｐｐｍで報告し、シグナルをｓ（単重線）、ｄ（二重線）、ｔ（三重線）、ｑ（四重線）、およびｍ（多重線）として記載する。質量スペクトルをＬＣ−ＭＳシステム上でエレクトロスプレイイオン化法を用いて以下に示される構成の器具の連なりから得た。［Ｍ＋Ｈ⁻］^＋は、化学種のプロトン化分子イオンを指す。［Ｍ−Ｈ^＋］⁻は、化学種の脱プロトン化分子イオンを指す。

ＬＣＭＳ法１ＲＸＮＭＯＮ＿ＡＣＩＤＣ
器具Ａｇｉｌｅｎｔ１１００ＨＰＬＣ；ＷａｔｅｒｓＭｉｃｒｏｍａｓｓＺＱ質量分析計
カラムＳｕｎｆｉｒｅＣ１８３．５μｍ３０×３．０ｍｍ、３．５μｍ
カラム温度４０℃
溶離液Ａ：Ｈ_２Ｏ＋０．０５％ＴＦＡ、Ｂ：アセトニトリル
流速２ｍｌ／分
勾配１．７分間で５％〜９５％Ｂ

ＬＣＭＳ法２ＲＸＮＭＯＮＡｃｉｄｉｃ＿Ｐｏｌａｒ＿＝ＲＸＮＭＯＮＡｃｉｄｉｃ＿Ｐｏｌａｒ＿ＰｏｓＮｅｇ
器具Ａｇｉｌｅｎｔ１１００ＨＰＬＣ；ＷａｔｅｒｓＭｉｃｒｏｍａｓｓＺＱ質量分析計
カラムＳｕｎｆｉｒｅＣ１８３．５μｍ３０×３．０ｍｍ、３．５μｍ
カラム温度４０℃
溶離液Ａ：Ｈ_２Ｏ＋０．０５％ＴＦＡ、Ｂ：アセトニトリル
流速２ｍｌ／分
勾配１．２０分間で１％〜３０％Ｂ、０．６５分間で３０％〜９５％Ｂ

ＬＣＭＳ法４ＲＸＮＭＯＮ＿Ｂａｓｉｃ＿Ｐｏｌａｒ
器具Ａｇｉｌｅｎｔ１１００ＨＰＬＣ；ＷａｔｅｒｓＭｉｃｒｏｍａｓｓＺＱ質量分析計
カラムＸｂｒｉｄｇｅＣ１８３．５μｍ３０×３．０ｍｍ、３．５μｍ
カラム温度４０℃
溶離液Ａ：Ｈ_２Ｏ＋５ｍＭ水酸化アンモニウム、Ｂ：アセトニトリル
流速２ｍｌ／分
勾配１．２０分間で１％〜３０％Ｂ、０．６５分間で３０％〜９５％Ｂ

ＬＣＭＳ法５ＳＱ４ｍＲＮＡｃａｐ＿ＦＩＡＡｃｉｄｉｃ
器具ＷａｔｅｒｓＡｃｑｕｉｔｙＵＰＬＣ、ＳＱ検出器を伴う
カラムＡｃｑｕｉｔｙＢＥＨＣ１８１．７μｍ２．１×５０ｍｍ
カラム温度５０℃
溶離液Ａ：Ｈ_２Ｏ＋０．１％蟻酸、Ｂ：アセトニトリル＋０．１％蟻酸
流速１ｍｌ／分
勾配５０％Ｂ均一濃度、２．１６分間

ＬＣＭＳ法６ＡｃｑｕｉｔｙＬＣＴｐ２Ｔｏｆ＿製品分析ａｃｉｄｉｃ
器具ＷａｔｅｒｓＡｃｑｕｉｔｙＵＰＬＣ、ＷａｔｅｒｓＬＣＴＰｒｅｍｉｅｒＸＥ検出器を伴う
カラムＡｃｑｕｉｔｙＢＥＨＣ１８１．７μｍ２．１×５０ｍｍ
カラム温度５０℃
溶離液Ａ：Ｈ_２Ｏ＋０．１％蟻酸、Ｂ：アセトニトリル＋０．１％蟻酸
流速１ｍｌ／分
勾配７．５分間で２％〜９８％Ｂ

ＬＣＭＳ法７ＳＱ４ａｃｉｄｉｃｐｏｌａｒ
器具ＷａｔｅｒｓＡｃｑｕｉｔｙＵＰＬＣ、ＳＱ検出器を伴う
カラムＡｃｑｕｉｔｙＢＥＨＣ１８１．７μｍ２．１×５０ｍｍ
カラム温度５０℃
溶離液Ａ：Ｈ_２Ｏ＋０．１％蟻酸、Ｂ：アセトニトリル＋０．１％蟻酸
流速１ｍｌ／分
勾配１．２０分間で１％〜３０％Ｂ；０．９５分間で３０％〜９８％Ｂ

ＬＣＭＳ法８ＳＱ４ａｃｉｄｉｃ
器具ＷａｔｅｒｓＡｃｑｕｉｔｙＵＰＬＣ、ＳＱ検出器を伴う
カラムＡｃｑｕｉｔｙＢＥＨＣ１８１．７μｍ２．１×５０ｍｍ
カラム温度５０℃
溶離液Ａ：Ｈ_２Ｏ＋０．１％蟻酸、Ｂ：アセトニトリル＋０．１％蟻酸
流速１ｍｌ／分
勾配１．７６分間で２％〜９８％Ｂ

ＬＣＭＳ法９ＩＰＣ
器具ＭｉｃｒｏｍａｓｓＱｕａｔｔｒｏｍｉｃｒｏＡＰＩ、Ａｇｉｌｅｎｔ１１００シリーズポンプ
カラムＸｂｒｉｄｇｅＢＥＨＣ１８２．５μｍ３．０×１００ｍｍ
カラム温度８０℃
溶離液Ａ：Ｈ_２Ｏ＋２００ｍＭＨＦＩＰ＋８ｍＭＴＥＡ、Ｂ：メタノール
流速１ｍｌ／分
勾配３．６５分まで３０％Ｂ；３．７５分で９９％Ｂへ、３．８５分まで９９％Ｂ

ＬＣＭＳ法１０ｓｃｏｕｔｂａｓｉｃｐｅｐｔｉｄｅ
器具Ａｇｉｌｅｎｔ１１００ＨＰＬＣ；ＷａｔｅｒｓＭｉｃｒｏｍａｓｓＺＱ質量分析計
カラムＸｂｒｉｄｇｅＣ１８３．５μｍ、３０×３．０ｍｍ、３．５μｍ
カラム温度４０℃
溶離液Ａ：Ｈ_２Ｏ＋５ｍＭ水酸化アンモニウム、Ｂ：アセトニトリル
流速２ｍｌ／分
勾配４．３０分間で５％〜８０％Ｂ、５．０分で９５％Ｂへ

略語：
ＡＴＰアデノシン５’三リン酸
Ａｔｍ大気
ＡｃＯＨ酢酸
Ａｑ水性
Ａｒアリール
ｂｒブロード
ｂｒ．ｓ．、ｂｓブロード単重線
ＢＳＡウシ血清アルブミン
℃ 摂氏
ＣＤＣｌ_３重水素化クロロホルム
ＣＨ_２Ｃｌ_２、ＤＣＭジクロロメタン
ＣＨ_３ＣＮ、ＭｅＣＮアセトニトリル
ｄ二重線
ｄｄ二重線の二重線
ｄｄｄ二重線の二重線の二重線
ＤＩＰＥＡＮ−エチルジイソプロピルアミン
ＤＭＦＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
ＤＭＡＰジメチルアミノピリジン
ＤＭＳＯジメチルスルホキシド
ｄｔ三重線の二重線
ＥＳＩエレクトロスプレイイオン化
ＥｔＯＡｃ酢酸エチル
ＥｔＯＨエタノール
ＦＣＣフラッシュカラムクロマトグラフィー
Ｇゲージ
ＧＭＰグアノシン５’一リン酸
ＧＤＰグアノシン５’二リン酸
ＧＴＰグアノシン５’三リン酸
ｈ時間
ＨＣｌ塩酸
ＨＡＴＵ１−［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］−１Ｈ−１，２，３−トリアゾロ［４，５−ｂ］ピリジニウム３−オキシドヘキサフルオロホスフェート
ＨＢＴＵＯ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート
ＨＥＰＥＳ２−［４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−イル］エタンスルホン酸
ＨＦＩＰヘキサフルオロイソプロパノール
ＨＯＢｔヒドロキシベンゾトリアゾール（hydoxybenzotriazole）
ＨＰＬＣ高速液体クロマトグラフィー
ｉ−ＰｒＯＨイソプロピルアルコール
Ｈ_２Ｏ水
Ｋケルビン
ＫＯＨ水酸化カリウム
ＬＣ液体クロマトグラフィー
Ｍモル
ｍ多重線、質量
ＭｅＯＨメタノール
ＭＥＳ２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸
ＭｇＳＯ_４硫酸マグネシウム
ＭＨｚメガヘルツ
ｍＬミリリットル
ｍｍミリメートル
ｍｍｏｌミリモル
ｍｉｎ分
ｍＲＮＡメッセンジャーリボ核酸
ＭＳ質量分析法
ｍｗマイクロ波
ｍ／ｚ質量対電荷の比
ＮａＯＨ水酸化ナトリウム
Ｎａ_２ＳＯ_４硫酸ナトリウム
ＮＥｔ_３トリエチルアミン
ＮＨ_３アンモニア
ＮＭＲ核磁気共鳴
ＰＢＳリン酸緩衝食塩水
ｐｐｔ沈殿物
ｐｐｍ百万分率
ｒｂｆ丸底フラスコ
Ｒｆ遅延因子
ＲＰ逆相
ＲＴ、ｒｔ室温
Ｒｔ保持時間
ｓ単重線
ｓａｔ．飽和
ＳＭ出発物質
ｔ三重線
ＴＢＡトリブチルアミン
ＴＥＡトリエチルアミン
ＴＥＡＢトリエチルアンモニウム重炭酸塩
ＴＦＡトリフルオロ酢酸
ＴＨＦテトラヒドロフラン
ＴＬＣ薄層クロマトグラフィー
ＴＲＩＳ２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−プロパン−１，３−ジオール
ＵＰＬＣ高性能液体クロマトグラフィー
Ｔｒｉｓ・ＨＣｌアミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン塩酸塩
ｗｔ重量
ＸｐｈｏｓＰｄＧ２第２世代Ｘｐｈｏｓプレ触媒、クロロ（２−ジシクロヘキシルホスフィノ−２’，４’，６’−トリイソプロピル−１，１’−ビフェニル）［２−（２’−アミノ−１，１’−ビフェニル）］パラジウム（ＩＩ）
μｇマイクログラム
μＬマイクロリットル

ヌクレオチドトリアルキルアンモニウム塩を、対応する市販されているナトリウム塩から文献の手順に従って（Y. Thillier, E. Decroly, F. Morvan, B. Canard, J.-J. Vasseur, F. Debart RNA 2012, 18, 856-868、ＧＭＰナトリウム塩：Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈＧ８３７７番、ＧＤＰナトリウム塩：Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈＧ７１２７番、２’−デオキシＧＭＰナトリウム塩：Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈＤ９５００番、イノシン５’一リン酸ナトリウム塩：Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈＩ４６２５番、イノシン５’二リン酸ナトリウム塩：Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈＩ４３７５番）または以下に説明する条件と同様の条件下で得た。

ＧＭＰトリエチルアンモニウム塩：

ＧＭＰナトリウム塩（２．０ｇ、４．９１ｍｍｏｌ）を、ＲＮアーゼ非含有水（４０ｍＬ）に溶解し、ＤＯＷＥＸ樹脂（５０ＷＸ８、４０ｇ、Ｈ_２Ｏで完全にすすいだ）上を通過させて、ＥｔＯＨ（６０ｍＬ）中のトリエチルアミン（１０ｇ、９８ｍｍｏｌ）の氷冷溶液に入れた。溶離に続いて、溶離液のＵＶ吸収を測定し、さらなるＧＭＰが溶離しなくなるまで樹脂を水ですすいだ。得られた溶液を真空下で約５００ｍＬまで濃縮し、その後凍結乾燥させて、表題の生成物を白色固体として得た（２．２ｇ、^１Ｈ−ＮＭＲにより判定するとＧＭＰ／ＴＥＡ１／２）。

ＧＤＰトリブチルアンモニウム塩：

ＧＤＰ−二ナトリウム塩（１．１７ｇ、２．４０ｍｍｏｌ）を水（１００ｍＬ）に溶解し、ＤＯＷＥＸ樹脂（５０ＷＸ８、１０ｍＬ、＞１．７ミリ当量／ｍＬ、Ｈ_２Ｏで完全にすすいだ）上を通過させて、ＥｔＯＨ（２０ｍＬ）中のトリブチルアミン（１．３４ｇ、７．２０ｍｍｏｌ）の氷冷溶液に入れた。樹脂を水（１０００ｍＬ）ですすぎ、得られた溶液を真空下で約５００ｍＬまで濃縮し、その後凍結乾燥させて、表題の生成物を無色の固体として得た（１．８８ｇ、^１Ｈ−ＮＭＲにより判定するとＧＤＰ／ＴＢＡ１／２．５）。

ＧＭＰのＮ^７アルキル化のための一般手順
方法Ａ：２ドラムバイアル中で、グアノシン一リン酸トリブチルアンモニウム塩（５０ｍｇ、６８μｍｏｌ）をＤＭＳＯ（６８０μＬ）中に溶解し、市販されている臭化アルキルまたは塩化アルキル試薬（４当量）で処理した。塩化物アルキル化試薬を使用した場合、および（２−ブロモエトキシ）−ベンゼン基質の場合、ＮａＩを添加した（５ｍｇ、０．５当量）。得られた溶液を、４０℃で１８時間振盪または撹拌した。得られた溶液を直接、ＨＰＬＣ（逆相、Ｈ_２Ｏ＋０．１％ＴＦＡからＭｅＣＮ＋０．１％ＴＦＡ０〜１００％）による精製に供した。所望の生成物を含有する画分を集め、溶媒を凍結乾燥により除去して、純粋な生成物を無色の固体または泡沫として得た。

方法Ｂ：２ドラムバイアル中で、ＤＭＳＯ中のＧＭＰまたはＧＤＰトリエチルもしくはトリブチルアンモニウム塩の０．１Ｍ溶液を、臭化物アルキル化試薬（４当量）で処理した。上記溶液を室温または５５℃で１８時間撹拌し、その後直接、逆相カラムクロマトグラフィー（ＩＳＣＯＴｅｌｅｄｙｎｅＣ１８ａｑ．溶離液：０．１Ｍトリエチルアンモニウム重炭酸塩（ｐＨ＝８．０）からＭｅＣＮ０〜１００％）による精製に供した。所望の生成物を含有する画分を集め、溶媒を凍結乾燥により除去し、トリブチルアンモニウム塩としての純粋な生成物を無色の固体または泡沫として得た。

Ｎ^７−（［１，１’−ビフェニル］−４−イルメチル）−５’−ＧＭＰＴＥＡ塩

ＤＭＳＯ（１ｍＬ）中のグアノシン一リン酸トリエチルアンモニウム塩（１００ｍｇ、０．１７７ｍｍｏｌ）および４−ビフェニルメチルブロミド（１７５ｍｇ、０．７１０ｍｍｏｌ）の溶液を、５５℃で一晩撹拌した。上記溶液を直接、逆相カラムクロマトグラフィー（ＩＳＣＯＴｅｌｅｄｙｎｅＣ１８３０ｇＧｏｌｄカートリッジ、溶離液Ａ：０．１ＭＴＥＡＢ；Ｂ：０．１ＭＴＥＡＢ中の２０％ＭｅＣＮ；勾配：０〜１００％Ｂ／Ａ）による精製に供した。生成物画分を集め、凍結乾燥させて、表題の化合物を白色粉末として得た（３８ｍｇ、２８％）。¹H NMR (400 MHz, D₂O) δ ppm: 7.58-7.67 (4H, m), 7.46-7.53 (4H, m), 7.38-7.46 (1H, m), 5.97-6.03 (1H, m), 5.63-5.76 (2H, m), 4.62-4.69 (1H,m), 4.46-4.52 (1H, m), 4.32-4.40 (1H, m), 3.97-4.18 (2H, m), 3.11-3.25 (8.6H, q), 1.20-1.34 (13H, t). ³¹P NMR (162 MHz, D₂O): δ ppm: 3.73 (1P).ＬＣＭＳ法２Ｒ_ｔ：１．３９分、ＭＳ［Ｍ＋Ｈ］^＋観察値：５２９．８。計算値：５３０．１。

Ｎ^７−（［１，１’−ビフェニル］−４−イルメチル）−５’−ＧＤＰＴＥＡ塩

ＤＭＳＯ（２ｍＬ）中のグアノシン二リン酸トリエチルアンモニウム塩（４００ｍｇ、０．５３８ｍｍｏｌ）および４−ビフェニルメチルブロミド（４００ｍｇ、１．６１９ｍｍｏｌ）の溶液を、室温で一晩撹拌した。１ＭＮａＣｌＯ_４アセトン溶液（３．２３ｍＬ）を添加し、その後アセトンで希釈した。沈殿物を、遠心分離により分離し、アセトンで洗浄し、真空下で乾燥させた。このようにして得られた固体を、０．１ＭＴＥＡＢ（５ｍＬ）中に溶解した。得られた溶液を、逆相カラムクロマトグラフィー（ＩＳＣＯＴｅｌｅｄｙｎｅＣ１８、３０ｇＧｏｌｄカートリッジ、溶離液Ａ：０．１ＭＴＥＡＢ；Ｂ：０．１ＭＴＥＡＢ中の９０％ＭｅＣＮ；勾配：０〜１００％Ｂ／Ａ）による精製に供した。生成物画分を集め、凍結乾燥させて、表題の化合物を白色粉末として得た（９０ｍｇ、１８％）。¹H NMR (400 MHz, D₂O) δ ppm: 7.57-7.67 (4H, m), 7.39-7.53 (5H, m), 5.92 -6.00 (1H, d), 5.64-5.75 (2H, m), 4.67-4.72 (2H, m), 4.56-4.64 (1H, m), 4.34-4.40 (1 H, m), 4.26-4.34 (2H, m), 3.12-3.24 (12H, q), 1.27 (18H, t). ³¹P NMR (162 MHz, D₂O): δ ppm: 7.16 (1P), 10.93 (1P).ＬＣＭＳ法２Ｒ_ｔ：１．４３分、ＭＳ［Ｍ−Ｈ］^＋観察値：６０８．２、計算値：６０８．１。

Ｎ^７−（４−クロロフェノキシエチル）−５’−ＧＤＰＴＥＡ塩

ＤＭＳＯ（４ｍＬ）中のグアノシン二リン酸トリエチルアンモニウム塩（５００ｍｇ、０．６７２ｍｍｏｌ）および４−クロロフェニル２−ブロモエチルエーテル（６３３ｍｇ、２．６９ｍｍｏｌ）の溶液を、５５℃で一晩撹拌した。１ＭＮａＣｌＯ_４アセトン溶液（４ｍＬ）を添加し、その後アセトンで希釈した。沈殿物を、遠心分離により分離し、アセトンで洗浄し、真空下で乾燥させた。このようにして得られた固体を、０．１ＭＴＥＡＢ（５ｍＬ）中に溶解した。得られた溶液を、イオン交換クロマトグラフィー（ＴＯＳＯＨ、ＴＳＫゲルＤＥＡＥ−５ＰＷ、２１．５ｍｍ×１５ｃｍ、１３μｍ、溶離液Ａ：Ｈ_２Ｏ；Ｂ：水中の１ＭＴＥＡＢ；勾配：０〜１００％Ｂ／Ａ）による精製に供した。生成物画分を集め、凍結乾燥させて、表題の化合物を白色粉末として得た（２５ｍｇ、４％）。¹H NMR (400 MHz, D₂O) δ ppm: 7.22-7.31 (2H, d), 6.86-6.94 (2H, d), 5.96-6.03 (1H, m), 4.46-4.52 (1H, m), 4.37-4.44 (1H, m), 4.29-4.37 (1H, m), 4.19-4.29 (2H, m), 3.12-3.26 (9H, q), 1.20-1.34 (16H, t). ³¹P NMR (162 MHz, D₂O): δ ppm: 9.91 (1P), 11.28 (1P).ＬＣＭＳ法２Ｒ_ｔ：１．２０分、ＭＳ［Ｍ−Ｈ］^＋観察値：５９６．８、計算値：５９６．０。

Ｎ^７−（４−クロロフェノキシエチル）−５’−ＧＭＰＴＥＡ塩

以前に説明されるように調製した（A. R. Kore et al Bioorg. Med. Chem. 2013, 21, 4570、Chen et al J. Med. Chem. 2012, 55, 3837）。生成物は、白色粉末として得られた。（８４ｍｇ、１２％）。¹H NMR (400 MHz, D₂O) δ ppm: 7.18-7.27 (2H, d), 6.83-6.93 (2H, d), 5.92-6.02 (1H, m), 4.41-4.48 (1H, m), 4.33-4.41 (1H, m), 4.11-4.20 (1H, m), 3.97-4.09 (1H, m), 3.13-3.26 (10H, q), 1.20-1.34 (15H, t). ³¹P NMR (162 MHz, D₂O): δ ppm: 3.39 (1P).ＬＣＭＳ法２Ｒ_ｔ：１．２０分、ＭＳ［Ｍ＋Ｈ］^＋観察値：５１７．８、計算値：５１８．１。

Ｎ^７−ベンジル−５’−ＧＭＰＴＥＡ塩

以前に説明されるように調製した（Brown et al J. Mol Biol. 2007, 372, 7-15）。生成物は、白色粉末として得られた（５５ｍｇ、３８％）。¹H NMR (400MHz, D₂O) δ ppm: 7.33-7.45 (5H, m), 6.02-6.11 (1H, m), 5.64-5.73 (2H, m), 4.44-4.53 (1H, m), 4.33-4.42 (1H, m), 3.96-4.17 (2H, m), 3.19 (10H, q), 1.27 (14H, t). ³¹P NMR (162 MHz, D₂O): δ ppm: 3.78 (1P).ＬＣＭＳ法２Ｒ_ｔ：０．８４分、ＭＳ［Ｍ＋Ｈ］^＋観察値：４５４．２、計算値：４５４．１。

Ｎ^７−（６−フェニルピリジン−３−イル）メチル）−５’−ＧＭＰＴＥＡ塩

ステップ１．５−（ブロモメチル）−２−フェニルピリジン

酢酸中の３３％ＨＢｒ（２．９３ｍＬ、１６．２０ｍｍｏｌ）中の（６−フェニルピリジン−３−イル）メタノール（３００ｍｇ、１．６２０ｍｍｏｌ）の溶液を、４０℃で一晩撹拌した。揮発性物質を蒸発させた。残留物をＤＣＭの間で分割し、重炭酸ナトリウム溶液で希釈し、有機層を分離した。有機層を水で洗浄し、乾燥させ、真空下で濃縮して、固体を得た（２７７ｍｇ、６９％）。ＬＣＭＳ法３Ｒ_ｔ：１．３６分、ＭＳ［Ｍ＋Ｈ］^＋観察値：２４９．９、計算値：２５０．０。
ステップ２．Ｎ^７−（６−フェニルピリジン−３−イル）メチル）−５’−ＧＭＰＴＥＡ塩

表題の化合物（４０ｍｇ、２３％）を、１３０ｍｇのＧＭＰＴＥＡ塩から、実施例５で説明する方法により調製した。¹H NMR (400MHz, D₂O) δ ppm: 8.57-8.66 (1H, m), 7.85-7.93 (1H, m), 7.66-7.82 (3H, m), 7.39-7.52 (3H, m), 5.91-6.02 (1H, m), 5.58-5.77 (2H, m), 4.42-4.50 (1H, m), 4.28-4.37 (1H, m), 4.06-4.17 (1H, m), 3.95-4.02 (1H, m), 3.06-3.23 (10H, m), 1.11-1.30 (15H, m). ³¹P NMR (162 MHz, D₂O): δ ppm: 3.54 (1P).ＬＣＭＳ法２Ｒ_ｔ：０．９１分、ＭＳ［Ｍ＋Ｈ］^＋観察値：５３１．０、計算値：５３１．１。

Ｎ^７−（［１，１’−ビフェニル］−４−イルメチル）−２’，３’−イソプロピリデン−５’−ＧＭＰＴＥＡ塩

ステップ１：Ｎ^７−（［１，１’−ビフェニル］−４−イルメチル）−２’，３’−イソプロピリデングアノシン

ＤＭＳＯ（２ｍＬ）中の２’，３’−イソプロピリデングアノシン（５００ｍｇ、１．５４７ｍｍｏｌ）および４−ビフェニルメチルブロミド（１４５ｍｇ、０．８４９ｍｍｏｌ）の溶液を、室温で一晩撹拌した。上記溶液を直接、逆相ＨＰＬＣ（Ｘ−Ｂｒｉｄｇｅ５０×５０ｍｍ、５μｍカラム、溶離液Ａ：５ｍＭＮＨ_４ＯＨを含む水；Ｂ５ｍＭＮＨ_４ＯＨを含むＭｅＣＮ；勾配：１５〜４０％Ｂ／Ａ）による精製に供した。生成物画分を集め、凍結乾燥させて、表題の化合物を白色粉末として得た（２６０ｍｇ、３４％）。ＬＣＭＳ法１Ｒ_ｔ：１．０２分、ＭＳ［Ｍ＋Ｈ］^＋観察値：４９０．１、計算値：４９０．２。
ステップ２：Ｎ^７−（［１，１’−ビフェニル］−４−イルメチル）−２’，３’−イソプロピリデン−５’−ＧＭＰＴＥＡ塩

三塩化ホスホリル（９５μＬ、１．０２１ｍｍｏｌ）を、０℃のリン酸トリメチル（１ｍＬ）中のＮ^７−（［１，１’−ビフェニル］−４−イルメチル）−２’，３’−イソプロピリデングアノシン（１００ｍｇ、０．２０４ｍｍｏｌ）の混合物にゆっくりと添加し、Ｎ_２下で３時間撹拌した。反応混合物を、０℃の１ＭＴＥＡＢ溶液（３ｍＬ）に一滴ずつ添加し、得られた混合物を遠心分離した。このようにして得られた溶液を、逆相カラムクロマトグラフィー（ＩＳＣＯＴｅｌｅｄｙｎｅＣ１８３０ｇＧｏｌｄカートリッジ、溶離液Ａ：０．１ＭＴＥＡＢ；Ｂ：０．１ＭＴＥＡＢ中の３０％ＭｅＣＮ；勾配：０〜１００％Ｂ／Ａ）による精製に供した。生成物画分を集め、凍結乾燥させて、表題の化合物を白色粉末として得た（３８ｍｇ、２４％）。¹H NMR (400MHz, D₂O) δ ppm: 9.70-9.90 (1H, br), 7.57-7.69 (4H, m), 7.29-7.57 (5H, m), 6.01-6.13 (1H, m), 5.61-5.78 (2H, m), 5.34-5.41 (1H, m), 5.09-5.15 (1H, m), 4.52-4.60 (1H, m), 3.98-4.09 (1H, m), 3.80-3.92 (1H, m), 2.60 (8H, q), 1.50 (3H, s), 1.34 (4H, s), 1.00 (14H, t). ³¹C (162 MHz, D₂O): δ ppm: 0.224 (1P).ＬＣＭＳ法４Ｒ_ｔ：０．９４分、ＭＳ［Ｍ＋Ｈ］^＋観察値：５７０．１、計算値：５７０．２。

７−（［１，１’−ビフェニル］−４−イルメチル）−２−アミノ−９−（（２−（ホスホノオキシ）エトキシ）メチル）−９Ｈ−プリン−７−イウム−６−オレートトリエチルアンモニウム塩

ステップ１：７−（［１，１’−ビフェニル］−４−イルメチル）−２−アミノ−９−（（２−ヒドロキシエトキシ）メチル）−９Ｈ−プリン−７−イウム−６−オレート

アシクログアノシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ａ４６６９番）のアルキル化を、以下の一般手順Ｂに従って行った。ＬＣ−ＭＳ法１Ｒ_ｔ＝０．９５分；ＭＳｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］^＋３９２．２。
ステップ２：７−（［１，１’−ビフェニル］−４−イルメチル）−２−アミノ−９−（（２−（ホスホノオキシ）エトキシ）メチル）−９Ｈ−プリン−７−イウム−６−オレートトリエチルアンモニウム塩

ステップ１で得られたアルコール（７３ｍｇ、０．１９ｍｍｏｌ）を、ＰＯ（ＯＭｅ）_３（１．９ｍＬ）中に懸濁し、ＰＯＣｌ_３（８６ｍｇ、０．５６ｍｍｏｌ）を添加した。上記溶液を室温で３時間撹拌し、その後ＴＥＡＢ（０．１Ｍ、１ｍＬ）の添加により抑制した。得られた溶液を直接、カラムクロマトグラフィー（ＩＳＯＣＲＰＣ１８Ａｑ、ＴＥＡＢ０．１ＭおよびＭｅＣＮ；０〜１００％ＭｅＣＮで溶離）による精製に供した。得られた画分の凍結乾燥後、生成物を無色の泡沫として得た（８４ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ、７５％、^１Ｈ−ＮＭＲにより決定するとリン酸塩対ＮＥｔ_３の比１／１．４）。ＬＣ−ＭＳ法６Ｒ_ｔ＝１．７９分；ＭＳｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］^＋４７２．１１６８；計算値：４７２．１１４５、¹H NMR (400 MHz, D₂O) δ 7.45 7.44 (3H, m), 7.54 (2H, d, J = 8.14 Hz), 7.50 (2H, d, J = 7.80 Hz), 5.53 (2H, s), 5.50 (2H, s), 3.78 - 3.74 (2H, m), 3.65 - 3.62 (2H, m), 3.05 (8.4 H, q, J = 7.34 Hz, NEt₃), 1.13 (12.7 H, t, J = 7.56 Hz, NEt₃).

７−（［１，１’−ビフェニル］−４−イルメチル）−２−アミノ−９−（（２−（（ヒドロキシ（ホスホノオキシ）ホスホリル）オキシ）エトキシ）メチル）−９Ｈ−プリン−７−イウム−６−オレートトリエチルアンモニウム塩

ステップ１：アシクログアノシンリン酸トリエチルアンモニウム塩（上記に説明するように得られた、７７ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（無水、６．７ｍＬ）中に懸濁し、イミダゾール（１０１ｍｇ、１．４８ｍｍｏｌ）、２，２’−ジピリジルジスルフィド（１５１ｍｇ、０．６８５ｍｍｏｌ）、およびＮＥｔ_３（３４ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ）を添加した。上記懸濁液を室温で１０分間撹拌し、その後トリフェニルホスフィン（１８３ｍｇ、０．６９８ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物は薄黄色に変わり、室温で５時間撹拌した。アセトン中のＮａＣｌＯ_４溶液（１Ｍ、２．１ｍＬ）およびアセトン（１５ｍＬ）を添加し、懸濁液を氷上で１０分間維持した。得られた溶液を遠心分離し（３分間、２０００×ｇ）、ペレットを１０ｍＬの氷冷アセトンで２回洗浄した。ペレットを真空下で乾燥させ、イミダゾール活性化リン酸塩（５０ｍｇ、０．０９６ｍｍｏｌ、７１％）を得、これをさらに精製することなく、使用した。
ステップ２：ステップ１で得られた活性化リン酸塩を、ＤＭＦ（０．５ｍＬ）中に懸濁し、リン酸トリブチルアンモニウム（ＤＭＦ中の１．０Ｍ、０．５ｍＬ、０．４７９ｍｍｏｌ）およびＺｎＣｌ_２（１３ｍｇ、０．０９６ｍｍｏｌ）を添加した。上記溶液を室温で５時間激しく撹拌し、その後直接、ＩＳＣＯＲＰＡｑ１８上でのカラムクロマトグラフィーによる精製に供し、０．１ＭＴＥＡＢおよびＭｅＣＮ、０〜１００％ＭｅＣＮで溶離した。生成物を含有する画分の凍結乾燥により、表題の生成物を無色の固体として得た（５２ｍｇ、０．０６５ｍｍｏｌ、６８％、^１ＨＮＭＲにより決定するとリン酸塩対ＮＥｔ_３の比１／２．４５）。ＬＣ−ＭＳ：Ｒ_ｔ＝０．９９分；ＭＳｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］^＋５５２．１ＬＣＭＳ法１；¹H NMR (400 MHz, D₂O) δ 7.59 - 7.54 (4 H, m), 7.40 - 7.36 (4H, m), 7.32 - 7.28 (1H, m), 5.58 (2H, s), 5.55 (2H, s), 3.98 - 3.94 (2H, m), 3.73 - 3.71 (2H, m), 3.08 (q, J = 7.22 Hz, NEt₃), 1.13 (12.7 H, t, J = 7.56 Hz, NEt₃).

７−（（２−クロロ−［１，１’−ビフェニル］−４−イル）メチル）−５’−ＧＤＰＴＥＡ塩

ステップ１：２−クロロ−４−メチル−１，１’−ビフェニル

２ドラムバイアル中で、ヨウ化フェニル（２００ｍｇ、０．９８ｍｍｏｌ）および（２−クロロ−４−メチルフェニル）ボロン酸（１６７ｍｇ、０．９８ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（４．９ｍＬ）中に溶解した。Ｋ_２ＣＯ_３（４００μＬのＨ_２Ｏ中の５４２ｍｇ）およびＳｐｈｏｓＰａｌｌａｄａｃｙｃｌｅＧ２（７．１ｍｇ、９．８μｍｏｌ）の水溶液を添加し、得られた懸濁液を８０℃で３時間激しく撹拌した。室温まで冷却後、ＤＣＭ（５ｍＬ）を添加し、有機層を水（１０ｍＬ）、１０％ＬｉＣｌ（水性、３×１０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥させた。真空下での溶媒の除去後に得られた残留物を、フラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ_２、ヘプタンからヘプタン中の２０％ＥｔＯＡｃ）による精製に供した。２−クロロ−４−メチル−１，１’−ビフェニルを、無色の油として得た（１４７ｍｇ、０．７２５ｍｍｏｌ、７４％）。¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 7.45 7.44 (3H, m), 7.41 - 7.36 (1H, m), 7.32 (1H, br s), 7.25 (1H, d, J = 7.58 Hz), 7.14 (1H, d, J = 7.58 Hz), 2.40 (3H, s).
ステップ２：４−（ブロモメチル）−２−クロロ−１，１’−ビフェニル

２−クロロ−４−メチル−１，１’−ビフェニル（１４０ｍｇ、０．６９１ｍｍｏｌ）、Ｎ−ブロモスクシンイミド（１３５ｍｇ、０．７６０ｍｍｏｌ）、およびアゾジイソブチロニトリル（１１ｍｇ、０．０６９ｍｍｏｌ）を、ＣＣｌ_４（６．９ｍＬ）中に溶解し、溶液を８５℃で１時間撹拌した。上記溶媒を真空下で除去し、残留物をフラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ_２、ヘプタンからヘプタン中の２０％ＥｔＯＡｃ）により精製し、表題の化合物を出発物質との混合物中（１ＨＮＭＲにより判定すると３：１）で、無色の固体として得た（１７３ｍｇ、０．４０６ｍｍｏｌ、６６％）。上記混合物を、続くアルキル化反応でそのまま使用した。
ステップ３：７−（（２−クロロ−［１，１’−ビフェニル］−４−イル）メチル）−５’−ＧＤＰＴＥＡ塩

ＧＤＰトリブチルアンモニウム塩（７０ｍｇ、０．０８６ｍｍｏｌ）を、ステップ２の生成物（７３ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）で一般手順Ｂに従ってアルキル化した。表題の生成物を、無色の固体として得た（３０ｍｇ、０．０３６ｍｍｏｌ、４２％）。ＬＣＭＳ法１：Ｒ_ｔ＝１．０１分；ＭＳｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］^＋６４４．０；¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 10.42 (1H, s), 7.93 (1H, s), 7.78 (1H, d, J = 8.12 Hz), 7.72 - 7.63 (1H, m), 7.47 - 7.35 (9 H, m), 5.81 (1H, s), 5.72 (1H, br s), 4.48 (1H, br s), 4.40 (1H, br s), 4.14-4.04 (3H, m), 3.34 (br, NEt₃), 1.03 (12.7 H, t, J = 7.56 Hz, NEt₃).

７−（（３−メトキシ−［１，１’−ビフェニル］−４−イル）メチル）−５’−ＧＤＰＴＥＡ塩

ステップ１：３−メトキシ−４−メチル−１，１’−ビフェニル

２ドラムバイアル中で、ヨウ化フェニル（２００ｍｇ、０．９８ｍｍｏｌ）および（３−メトキシ−４−メチルフェニル）ボロン酸（１６３ｍｇ、０．９８ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（４．９ｍＬ）中に溶解した。Ｋ_２ＣＯ_３（４００μＬのＨ_２Ｏ中の５４２ｍｇ）およびＳｐｈｏｓＰａｌｌａｄａｃｙｃｌｅＧ２（７．１ｍｇ、９．８μｍｏｌ）の水溶液を添加し、得られた懸濁液を８０℃で１２時間激しく撹拌した。室温まで冷却後、ＤＣＭ（５ｍＬ）を添加し、有機層を水（１０ｍＬ）、１０％ＬｉＣｌ（水性、３×１０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥させた。真空下での溶媒の除去後に得られた残留物を、フラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ_２、ヘプタンからヘプタン中の２０％ＥｔＯＡｃ）による精製に供した。３−メトキシ−４−メチル−１，１’−ビフェニルを、無色の油として得た（１４９ｍｇ、０．７５２ｍｍｏｌ、７７％）。¹H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.70 - 7.66 (2H, m), 7.53 - 7.49 (2H, m), 7.44 - 7.39 (1H, m), 7.28 (1H, d, J = 7.04 Hz), 7.19 (1H, dd, J = 7.60, 1.77 Hz), 7.13 (1H, d, J = 1.50 Hz), 3.97 (3H, s), 2.37 (3H, s).
ステップ２：４−（ブロモメチル）−３−メトキシ−１，１’−ビフェニル

３−メトキシ−４−メチル−１，１’−ビフェニル（１４７ｍｇ、０．７４１ｍｍｏｌ）、Ｎ−ブロモスクシンイミド（１４５ｍｇ、０．８１６ｍｍｏｌ）、およびアゾジイソブチロニトリル（１２ｍｇ、０．０７４ｍｍｏｌ）を、ＣＣｌ_４（７．４ｍＬ）中に溶解し、溶液を８５℃で１時間撹拌した。上記溶媒を真空下で除去し、残留物をフラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ_２、ヘプタンからヘプタン中の２０％ＥｔＯＡｃ）により精製し、表題の化合物を無色の固体として得た（１６３ｍｇ、０．５８８ｍｍｏｌ、７９％）。¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 7.62 - 7.59 (2H, m), 7.49 - 7.45 (2H, m), 7.43 - 7.39 (2H, m), 7.18 (1H, dd, J = 7.75, 1.66 Hz), 7.11 (1H, d, J = 1.59 Hz), 4.65 (2H, s), 3.99 (3H, s).
ステップ３：７−（（３−メトキシ−［１，１’−ビフェニル］−４−イル）メチル）−５’−ＧＤＰＴＥＡ塩

ＧＤＰトリブチルアンモニウム塩（１００ｍｇ、０．１２３ｍｍｏｌ）を、ステップ２の生成物（１０２ｍｇ、０．３６９ｍｍｏｌ）で一般手順Ｂに従ってアルキル化した。表題の生成物を無色の固体として得た（４６ｍｇ、０．０５６ｍｍｏｌ、４５％）。ＬＣＭＳ法１Ｒ_ｔ＝０．９９分；ＭＳｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］^＋６４０．０；¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 9.80 (1H, s), 7.66 (2H, d, J = 7.49 Hz), 7.47 - 7.43 (3H, m), 7.38 - 7.34 (1H, m), 7.21 (1H, br s), 7.15 (1H, d, J = 7.59 Hz), 5.83 (1H, s), 5.56 (2H, s), 4.48 (2H, s), 4.14 (1H, br s), 4.06 (1H, br s), 3.95 (3H, s), 2.68 (br, NEt₃), 1.04 (t, J= 6.81 Hz, NEt₃).

７−（６−フェニルピリジン−２（１Ｈ）−オン−３−イル）−５’−ＧＤＰＴＥＡ塩

ステップ１：３−（ヒドロキシメチル）−６−フェニルピリジン−２（１Ｈ）−オン

ＴＨＦ（２４ｍＬ）中の２−オキソ−６−フェニル−１，２−ジヒドロピリジン−３−カルボン酸（５３３ｍｇ、２．４８ｍｍｏｌ）の溶液に、ボランジメチルスルフィド複合体（ＴＨＦ中の１．０Ｍ、９９１μＬ、９．９１ｍｍｏｌ）を添加し、懸濁液を室温で１８時間撹拌した。気体放出が止まるまで、ＭｅＯＨをゆっくりと添加した。得られた溶液をＥｔＯＡｃと塩水との間で分割し、有機層をＮａＳＯ_４上で乾燥させた。真空下での溶媒の除去および残留物のフラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ_２、ＤＣＭからＤＣＭ中の５％ＭｅＯＨ）による精製により、表題の化合物を淡黄色固体として得た（３３１ｍｇ、１．６５ｍｍｏｌ、６６％）。ＬＣＭＳ法１Ｒ_ｔ＝０．８９分；ＭＳｍ／ｚ［Ｍ−ＯＨ⁻］^＋１８３．６。
ステップ２：３−（ブロモメチル）−６−フェニルピリジン−２（１Ｈ）−オン

３−（ヒドロキシメチル）−６−フェニルピリジン−２（１Ｈ）−オン（３３１ｍｇ、１．６５ｍｍｏｌ）をＨＢｒ（水性、４８％、１６．５ｍＬ）で処理し、懸濁液を室温で１時間、その後６０℃で１時間撹拌した。この時間の間、懸濁液は最初に澄み、その後沈殿物が形成される。沈殿物をろ過し、水で完全に洗浄し、真空下で乾燥させて、３−（ブロモメチル）−６−フェニルピリジン−２（１Ｈ）−オンを無色の粉末として得る（３８８ｍｇ、１．４６９ｍｍｏｌ、８９％）。¹H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.08-7.74 (4H, m), 7.55 - 7.51 (3H, m), 7.50 - 7.46 (1H, m), 5.28 (2H, s).
ステップ３：７−（６−フェニルピリジン−２（１Ｈ）−オン−３−イル）−５’−ＧＤＰＴＥＡ塩

ＧＤＰトリブチルアンモニウム塩（１００ｍｇ、０．１２３ｍｍｏｌ）を、ステップ２の生成物（１０２ｍｇ、０．３６９ｍｍｏｌ）で一般手順Ｂに従ってアルキル化した。表題の生成物を、無色の固体として得た（４６ｍｇ、０．０５６ｍｍｏｌ、４５％）。ＬＣＭＳ法１Ｒ_ｔ＝０．７３分；ＭＳｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］^＋６２７．１；¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 9.7 (1H, s), 7.78 - 7.76 (2H, m), 7.63 (1H, d, J = 7.33 Hz), 7.47 - 7.55 (5 H, m), 6.69 (1H, d, J = 7.33 Hz), 5.82 (1H, d, J = 2.04 Hz), 5.45 (2H, s), 4.47 (1H, br), 4.40 (1H, dd, J = 5.48 Hz), 4.13 (1H, br), 4.08 (1H, br), 4.03 (1H, br), 3.35 (br, NEt₃), 1.05 (t, J = 6.49 Hz, NEt₃).

７−（３，５−ジメチルベンジル）−５’−ＧＤＰＴＥＡ塩

ＧＤＰトリブチルアンモニウム塩（１５０ｍｇ、０．１８４ｍｍｏｌ）を、３，５−ジメチルベンジルブロミド（１１０ｍｇ、０．５５３ｍｍｏｌ）で一般手順Ｂに従ってアルキル化した。表題の生成物を、無色の固体として得た（６６ｍｇ、０．０９０ｍｍｏｌ、４９％）。ＬＣＭＳ法１Ｒ_ｔ＝０．８０分；ＭＳｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］^＋５６１．９；¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 10.38 (1H, s), 8.20 (1H, d, J = 7.48 Hz), 7.95 (1H, d, J = 8.73 Hz), 7.65 - 7.58 (1H, m), 5.81 (2H, br s), 4.44 (1H, br s), 4.38 (1H, br s), 4.13 - 4.04 (2H, m), 2.69 (br, NEt₃), 1.05 (t, J = 6.49 Hz, NEt₃).

７−（３−フルオロベンジル）−グアノシン−５’−ＧＤＰＴＥＡ塩

ＧＤＰトリブチルアンモニウム塩（１５０ｍｇ、０．１８４ｍｍｏｌ）を、３−フルオロベンジルブロミド（１０５ｍｇ、０．５５３ｍｍｏｌ）で一般手順Ｂに従ってアルキル化した。表題の生成物を、無色の固体として得た（４０ｍｇ、０．０５５ｍｍｏｌ、３０％）。ＬＣＭＳ法１Ｒ_ｔ＝０．５９分；ＭＳｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］^＋５５１．９；¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 10.38 (1H, s),7.61 (1H, d, J = 9.96 Hz), 7.54 (1H, d, J = 7.87 Hz), 7.38 (1H, dd, J = 14.50, 7.44 Hz), 5.79 (1H, d, J = 1.82 Hz), 5.66 (1H, br s), 4.45 (1H, br s), 4.39 (1H, br s), 4.11 - 4.05 (2H, m), 2.73 (br, NEt₃), 1.05 (t, J = 6.49 Hz, NEt₃).

７−（（３−フルオロ−［１，１’−ビフェニル］−４−イル）メチル）−５’−ＧＤＰＴＥＡ塩

ステップ１：３−フルオロ−４−メチル−１，１’−ビフェニル

２ドラムバイアル中で、ヨウ化フェニル（８００ｍｇ、３．９２ｍｍｏｌ）および（３−フルオロ−４−メチルフェニル）ボロン酸（６０４ｍｇ、３．９２ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（１９．６ｍＬ）中に溶解した。Ｋ_２ＣＯ_３（１．９ｍＬのＨ_２Ｏ中の２．１７ｇ）およびＳｐｈｏｓＰａｌｌａｄａｃｙｃｌｅＧ２（２８．３ｍｇ、３９．０μｍｏｌ）の水溶液を添加し、得られた懸濁液を８０℃で１６時間激しく撹拌した。室温まで冷却後、ＤＣＭ（１５ｍＬ）を添加し、有機層を水（１０ｍＬ）、１０％ＬｉＣｌ（水性、３×１０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥させた。真空下での溶媒の除去後に得られた残留物を、フラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ_２、ヘプタンからヘプタン中の２０％ＥｔＯＡｃ）による精製に供した。３−フルオロ−４−メチル−１，１’−ビフェニルを、無色の油として得た（７４６ｍｇ、３．６１ｍｍｏｌ、９１％、９０％純度）。¹H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.69 - 7.66 (2H, m), 7.48 - 7.36 (6H, m), 2.27 (3H, d, J = 1.68 Hz).
ステップ２：４−（ブロモメチル）−３−フルオロ−１，１’−ビフェニル

３−フルオロ−４−メチル−１，１’−ビフェニル（３００ｍｇ、１．６１１ｍｍｏｌ）、Ｎ−ブロモスクシンイミド（３１５ｍｇ、１．７７ｍｍｏｌ）、およびアゾジイソブチロニトリル（２６．５ｍｇ、０．１６１ｍｍｏｌ）をＣＣｌ_４（１６ｍＬ）中に溶解し、溶液を８５℃で１時間撹拌した。溶媒を真空下で除去し、残留物をフラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ_２、ヘプタンからヘプタン中の２０％ＥｔＯＡｃ）により精製して、表題の化合物を淡黄色固体として得た（３１１ｍｇ、１．１７ｍｍｏｌ、７２％）。¹H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.74 - 7.71 (2H, m), 7.62 (1H, d, J = 7.92 Hz), 7.57 (1H, dd, J = 11.47, 1.70 Hz), 7.53 (1H, dd, J = 7.92, 1.60 Hz), 7.51 - 7.46 (2H, m), 7.43 - 7.38 (1H, m).
ステップ３：７−（（３−フルオロ−［１，１’−ビフェニル］−４−イル）メチル）−５’−ＧＤＰＴＥＡ塩

ＧＤＰトリブチルアンモニウム塩（１５０ｍｇ、０．１８４ｍｍｏｌ）を、ステップ２で得た臭化物（１４７ｍｇ、０．５５３ｍｍｏｌ）で一般手順Ｂに従ってアルキル化した。表題の生成物を、無色の固体として得た（４５ｍｇ、０．０５６ｍｍｏｌ、３０％）。ＬＣＭＳ法１Ｒ_ｔ＝０．９６分；ＭＳｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］^＋６２７．９；¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 10.13 (1H, s), 7.69 - 7.67 (2H, m), 7.55 - 7.50 (2H, m), 7.48 - 7.44 (3H, m), 7.41 - 7.38 (1H, m), 5.84 - 5.78 (2H, m), 4.46 - 4.43 (2H, m), 4.11 - 4.06 (2H, m), 2.75 (br, NEt₃), 1.05 (t, J = 6.49 Hz, NEt₃).

７−（ベンズヒドリル）−グアノシン−５’−ＧＤＰＴＥＡ塩

ＧＤＰトリブチルアンモニウム塩（１５０ｍｇ、０．１８４ｍｍｏｌ）を、ベンズヒドリルブロミド（９１ｍｇ、０．３６９ｍｍｏｌ）で一般手順Ｂに従ってアルキル化した。表題の生成物を、無色の固体として得た（２０ｍｇ、０．０２１ｍｍｏｌ、３０％）。ＬＣＭＳ法１Ｒ_ｔ＝０．９０分；ＭＳｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］^＋６１０．１；¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 7.53 - 7.47 (2H, m), 7.44 - 7.29 (8H, m), 5.86 (1H, d, J = 4.62 Hz), 5.82 (1H, d, J = 4.32), 4.72 (1H, br s), 4.48 - 4.40 (1H, br s), 4.20 - 4.02 (3H, m), 3.98 - 3.92 (2H, m), 2.62 (br, NEt₃), 1.00 (t, J = 6.49 Hz, NEt₃).

７−（（１−（５−メチル−１，２，４−オキサジアゾール−３−イル）フェニル４−イル）メチル）−５’−ＧＤＰＴＥＡ塩

Ｎ^７−アルキル化ＧＭＰ誘導体の分析データを表１に示す。以下のアナログは、一般法ＡもしくはＢによる方法と同様に、または実施例１〜１７で説明する方法と類似する方法で調製した。

Ｎ^７−アルキル化ＧＤＰ誘導体の分析データを表２に示す。以下のアナログは、一般法ＡもしくはＢによる方法と同様に、または実施例１〜１７で説明する方法と類似する方法で調製した。

Ｎ^７−アルキル化イオノシン誘導体の分析データを表３に示す。以下のアナログは、一般法ＡもしくはＢによる方法と同様に、または実施例１〜１７で説明する方法と類似する方法で調製した。

Ｃ８置換キサンチンの合成手順

７−（［１，１’−ビフェニル］−４−イルメチル）−８−ブロモ−３−メチル−１Ｈ−プリン−２，６（３Ｈ，７Ｈ）−ジオン

ＤＭＦ（５ｍＬ）中の８−ブロモ−３−メチル−１Ｈ−プリン−２，６（３Ｈ，７Ｈ）−ジオン（２４５ｍｇ、１．０００ｍｍｏｌ）、４−（ブロモメチル）−１，１’−ビフェニル（２４７ｍｇ、１．０００ｍｍｏｌ）、およびＫ_２ＣＯ_３（３８．５ｍｇ、１．０００ｍｍｏｌ）の混合物を、室温で一晩撹拌した。水を反応混合物に添加した。得られた固体をろ過により回収し、水で洗浄し、乾燥させた。ＩＳＣＯ精製（シリカ８０ｇ、ＤＣＭ中の０〜５％ＭｅＯＨ）により、表題の生成物を得た。

（４−（７−（［１，１’−ビフェニル］−４−イルメチル）−３−メチル−２，６−ジオキソ−２，３，６，７−テトラヒドロ−１Ｈ−プリン−８−イル）フェニル）ホスホン酸

ジオキサン（１ｍＬ）中の実施例１８の反応混合物（６０ｍｇ、０．１４６ｍｍｏｌ）、ジメチル（４−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）フェニル）ホスホン酸塩（４５．５ｍｇ、０．１４６ｍｍｏｌ）、Ｎａ_２ＣＯ_３（３０．９ｍｇ、０．２９２ｍｍｏｌ）、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（１６．９ｍｇ、０．０１５ｍｍｏｌ）、および水（０．２ｍＬ）を、Ｎ_２で２分間パージし、その後密閉バイアル中で１００℃にて一晩撹拌した。Ｐｒｅｐ−ＨＰＬＣ精製（ＷａｔｅｒｓＸ−ＢｒｉｄｇｅＣ１８３０×５０ｍｍ５μｍカラム、ＡＣＮ／Ｈ_２Ｏｗ／５ｍＭＮＨ_４ＯＨ７５ｍｌ／分で、３．５分間にわたる１５〜４０％ＡＣＮ勾配）により、モノメチルエステルおよびジメチルエステルを単離した。これらの２つの生成物を含有する画分を混合し、真空下で濃縮した。残留物をＤＭＦ（１ｍＬ）中に溶解し、ブロモトリメチルシラン（１１２ｍｇ、０．７２９ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で一晩撹拌した。水およびＭｅＯＨを添加して、反応を抑制し、得られた溶液を真空下で濃縮した。Ｐｒｅｐ−ＨＰＬＣ精製（ＷａｔｅｒｓＸ−ＢｒｉｄｇｅＣ１８３０×５０ｍｍ５μｍカラム、ＡＣＮ／Ｈ_２Ｏｗ／５ｍＭＮＨ_４ＯＨ７５ｍｌ／分で、３．２分間にわたる５〜２０％ＡＣＮ勾配）により、所望の生成物を得た。¹H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ ppm 7.64-7.77 (2H, m), 7.54-7.64 (6H, m), 7.27-7.46 (3H, m), 7.03-7.15 (2H, m), 5.56-5.71 (2H, m), 3.42 (3H, s).ＬＣＭＳ（ＸＢｒｉｄｇｅＣ１８３．５μｍ３．０×３０ｍｍＡＣＮ／Ｈ_２Ｏｗ／５ｍＭＮＨ_４ＯＨ７５ｍｌ／分で、２分間にわたる５〜９５勾配）Ｒ_ｔ＝０．５１分、ＭＳ［Ｍ＋Ｈ］^＋観察値：４８９．３、計算値：４８９．４。

７−（［１，１’−ビフェニル］−４−イルメチル）−８−ブロモ−１，３−ジメチル−１Ｈ−プリン−２，６（３Ｈ，７Ｈ）−ジオン

表題の生成物を、上記に説明する方法に従う類似する方法で調製した。¹H NMR (400 MHz, メタノール-d4): δ ppm 7.88-8.00 (2H, m), 7.68-7.78 (2H, m), 7.49-7.59 (4H, m), 7.27-7.44 (3H, m), 7.03-7.15 (2H, m), 5.72-5.81 (2H, m), 3.63 (3H, s), 3.38 (3H, s).ＬＣＭＳ（ＸＢｒｉｄｇｅＣ１８３．５μｍ３．０×３０ｍｍＡＣＮ／Ｈ_２Ｏｗ／５ｍＭＮＨ_４ＯＨ７５ｍｌ／分で、２分間にわたる５〜９５勾配）Ｒ_ｔ：０．６３分、ＭＳ［Ｍ＋Ｈ］^＋観察値：５０３．３、計算値：５０３．４。

Ｃ８置換プリンの一般合成

ステップ１：６−アミノ−５−（（２−（４−クロロフェノキシ）エチル）アミノ）ピリミジン−４（３Ｈ）−オン

２−（４−クロロフェノキシ）酢酸（１３．３ｇ、７１．４ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（９０ｍＬ、０．８Ｍ）中に溶解し、トリエチルアミン（１４．４ｇ、１４３ｍｍｏｌ、２当量）およびＨＡＴＵ（２７．１ｇ、７１．４ｍｍｏｌ）を添加した。反応を室温で３０分間撹拌し、その後ピリドン（９．０ｇ、７１．４ｍｍｏｌ）を添加した。上記混合物を室温で一晩撹拌後、反応を水で抑制し、ｐＨを５ＮＨＣｌの添加により１に調節した。白色沈殿物を回収し、１ＮＨＣｌで洗浄し、真空下で２日間乾燥させた（１２．７ｇ、４３．１ｍｍｏｌ、６０％）。得られたアミドを、次のステップでそのまま使用した。
上記で得たアミド（１０ｇ、３３．９ｍｍｏｌ）を、ＴＨＦ（２５０ｍＬ）中に溶解し、０℃まで冷却した。ＬｉＡｌＨ_４（７．７３ｇ、２０４ｍｍｏｌ）をゆっくりと添加し、混合物を室温で３０分間、５０℃で５時間撹拌した。上記混合物をその後、０℃まで冷却し、１ＮＨＣｌの添加により抑制した。白色沈殿物を回収し、１ＮＨＣｌで洗浄し、真空下で２日間乾燥させた。生成物を白色固体として得、さらに精製することなく使用した（３．０ｇ、１０．７ｍｍｏｌ、３２％）。
ステップ２：アシル化および環閉鎖のための一般手順：

カルボン酸をＤＭＦ（０．１Ｍ）中に取り、ＨＡＴＵ（２当量）およびトリエチルアミン（４．５当量）で処理した。上記溶液を室温で１５分間撹拌し、その後ステップ１で得たピリミジンを添加した。得られた溶液を室温で１６時間撹拌し、その後ＥｔＯＡｃで希釈し、緩衝溶液（ｐＨ＝７．０）で洗浄した。水層をＥｔＯＡｃで２回抽出し、混合した有機層をＮａ_２ＳＯ_４上で乾燥させた。真空下での上記溶液の濃縮により、茶色油を得、これをＲＰ−ＨＰＬＣにより精製した。
Ｒ＝ＯＨについて：上記で得たアミドをイソプロパノール（０．１Ｍ）中に取り、ｔｅｒｔ−ブトキシドナトリウムを添加し（５当量）、混合物を８０℃で４時間撹拌した。上記溶液が酸性になり、沈殿物が形成されるまで、酢酸を添加した。沈殿物をろ過し、水で洗浄し、真空下で乾燥させた。得られたアルコールを、リン酸トリメチル中のＰＯＣｌ_３での０℃で２時間の処理によりリン酸化した。反応をＴＥＡＢ（１Ｍ）で抑制し、直接、ＲＰ−ＨＰＬＣによる精製に供した。
Ｒ＝ＰＯ（ＯＥｔ）_２について：上記で得たリン酸エステルを、ＴＭＳＢｒ（５．５当量）を含むＤＭＦ中の０．７Ｍ溶液の処理により加水分解した。室温で１６時間撹拌後、反応をＭｅＯＨ／Ｈ_２Ｏ１／１および１ＭＴＥＡＢの添加により抑制した。懸濁液をろ過し、直接、ＲＰ−ＨＰＬＣによる精製に供した。

Ｃ８置換プリンの分析データを表４に示す。以下のアナログは、上記に説明する方法により調製した。

イミダゾール活性化ｍＲＮＡキャップの調製
ＧＭＰおよびＧＤＰ誘導体のイミダゾール活性化の一般手順：
ＤＭＦ中のＮ^７−アルキル化−ＧＭＰ／ＧＤＰ誘導体のトリエチルアンモニウム塩の溶液に、イミダゾール（１０当量）、２，２’−ジピリジルジスルフィド（４当量）、およびＴＥＡ（２当量）を添加した。反応を室温で５分間撹拌し、その後トリフェニルホスフィン（４当量）を添加し、反応の色が黄色に変わった。室温で１６〜１８時間撹拌後、アセトン中の１ＭＮａＣｌＯ_４（１０当量）を反応に添加すると、白色沈殿物が生成した。追加のアセトンを反応に添加し、得られた懸濁液を４℃で２０分間冷却し、遠心分離した。上清を注ぎ出し、沈殿物をアセトンで洗浄し、４℃で１０分間冷却し、遠心分離した。この洗浄手順をさらに１回または２回繰り返した。得られた沈殿物を真空下で乾燥させて、イミダゾール活性化Ｎ^７−アルキル化ＧＭＰ／ＧＤＰ誘導体のナトリウム塩を得た。

Ｐ^２−イミダゾリドＮ^７−（［１，１’−ビフェニル］−４−イルメチル）−５’−ＧＤＰナトリウム塩

ジメチルホルムアミド（１．０ｍＬ）中のＮ^７−（［１，１’−ビフェニル］−４−イルメチル）−５’−ＧＤＰのトリエチルアンモニウム塩（４５ｍｇ、０．０４９ｍｍｏｌ）、イミダゾール（５０ｍｇ、０．７４２ｍｍｏｌ）、２，２’−ジチオジピリジン（６５ｍｇ、０．２９７ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（２０７μＬ、１．４８４ｍｍｏｌ）、およびトリフェニルホスフィン（７８ｍｇ、０．２９７ｍｍｏｌ）の混合物を、室温で３時間撹拌した。アセトン中の過塩素酸ナトリウムの溶液（１Ｍ、１ｍＬ）を添加し、その後アセトン（４０ｍＬ）で希釈した。沈殿物を遠心分離により分離し、アセトンで３回洗浄し、真空下で乾燥させて、表題の化合物をナトリウム塩として得た（３４ｍｇ、９３％）。¹H NMR (400MHz, D₂O) δ ppm: 7.80-7.90 (1H, s), 7.63-7.72 (4H, m), 7.38-7.56 (5H, m), 7.18-7.27 (1H, s), 6.86-6.95 (1H, s), 5.97-6.07 (1H, m), 5.59-5.75 (2H, m), 4.58-4.64 (2H, m), 4.33-4.40 (3H, m), 4.16-4.29 (1H, m), 4.06-4.16 (1H, m). ¹³C NMR(162 MHz, D₂O): δ ppm: 11.712 (1P), 19.863 (1P).ＬＣＭＳ法２Ｒ_ｔ：１．３５分、ＭＳ［Ｍ−Ｈ］^＋観察値：６５９．１、計算値：６５９．１。

Ｐ^２−イミダゾリドＮ^７−（［１，１’−ビフェニル］−４−イルメチル）−５’−ＧＭＰナトリウム塩

表題の化合物を、実施例２１で説明する方法と類似する方法で合成した。¹H NMR (400MHz, D₂O) δ ppm: 7.78-7.83 (1H, s), 7.43-7.49 (4H, m), 7.16-7.40 (5H, m), 7.01-7.08 (1H, s), 6.83-6.90 (1H, s), 5.79-5.87 (1H, m), 5.51-5.76 (2H, m), 4.50-4.57 (1H, m), 4.20-4.35 (2H, m), 4.00-4.16 (2H, m). ³¹P NMR (162 MHz, D₂O): δ ppm: 8.134 (1P).ＬＣＭＳ法２Ｒ_ｔ：１．３２分、ＭＳ［Ｍ−Ｈ］^＋観察値：５７７．９、計算値：５７８．２。

７−（［１，１’−ビフェニル］−４−イルメチル）−２−アミノ−９−（（２−（（ヒドロキシ（（ヒドロキシ（１Ｈ−イミダゾール−１−イル）ホスホリル）オキシ）ホスホリル）オキシ）エトキシ）メチル）−９Ｈ−プリン−７−イウム−６−オレート

表題の化合物を、上記に説明する二リン酸エステルのイミダゾール活性化の一般手順に従って合成した。ＬＣＭＳ法５ＭＳ［Ｍ−Ｈ］^＋観察値：６０２．３、計算値：６０２．１。

Ｐ^２−イミダゾリド−Ｎ^７−（２−（４−クロロフェノキシ）エチル）−２’−Ｏ−メチル−５’−ＧＤＰナトリウム塩

ステップ１：Ｎ^７−（２−（４−クロロフェノキシ）エチル）−２’−Ｏ−メチル−グアノシン

２’ＯＭｅ−グアノシン（０．６７３ｍｍｏｌ）および１−（２−ブロモエトキシ）−４−クロロベンゼン（２．７０ｍｍｏｌ）を、４ｍｌの無水ＤＭＳＯ中に取り、５０℃で２０時間撹拌した。反応を室温まで冷却し、ＤＭＳＯで希釈し、分取ＨＰＬＣ［ＳｈｉｍａｄｚｕＰｒｅｐＨＰＬＣ（ＳｕｎｆｉｒｅＰｒｅｐＣ１８５μｍ、１００ｍｍ×３０ｍｍカラム；０〜２０分；５〜３０％ＡＣＮ中の０．１％ＴＦＡ／Ｈ_２Ｏ中の０．１％ＴＦＡ；４２ｍＬ／分）］上で精製した。生成物画分を集め、トルエンと共沸させながら濃縮して、表題の化合物のトリフルオロ酢酸塩を白色固体として得た（９９ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ、２６％）。ＬＣＭＳ法２Ｒ_ｔ＝１．３８分；ＭＳｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］^＋４５２．２。
ステップ２：Ｎ^７−（２−（４−クロロフェノキシ）エチル）−２’−Ｏ−メチル−５’−ＧＭＰＴＥＡ塩

０℃まで冷却した１．０ｍｌのリン酸トリメチル中のＮ^７−（２−（４−クロロフェノキシ）エチル）−２’−Ｏ−メチル−グアノシン（０．０８５ｍｍｏｌ）の溶液に、ＰＯＣｌ_３（０．５３６ｍｍｏｌ）を一滴ずつゆっくりと添加した。反応を０℃で６．５時間撹拌し、その後−２０℃まで１６時間冷却した。反応をその後、０℃まで２時間温めた。追加のＰＯＣｌ_３（０．５３６ｍｍｏｌ）を反応に添加し、反応を０℃で３時間撹拌した。反応を０℃で１ＭＴＥＡＢ（水性）（３．５ｍｌ）によりゆっくりと抑制した。ＴＥＡＢ添加の完了に際して、反応を室温まで温めて、過剰のＰＯＣｌ_３の抑制を確実にした。抑制した反応を直接、分取イオン交換クロマトグラフィー［（ＴｏｓｏｈＴＳＫゲルＤＥＡＥ−５ＰＷ、１３μｍ、２１．５×１５０ｍｍ、０〜３０分：０〜１００％１ＭＴＥＡＢ、５ｍｌ／分）］上で精製した。生成物画分の凍結乾燥により、表題の化合物のトリエチルアンモニウム塩を白色固体として得、これを直接、次のステップで使用した。ＬＣＭＳ法２Ｒ_ｔ＝１．３４分；ＭＳｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］^＋５３２．９；¹H NMR (D₂O) δ: 7.16-7.22 (m, 2H), 6.80-6.86 (m, 2H), 6.03 (d, J=3.4 Hz, 1H), 4.78-4.84 (m, 2H), 4.48-4.54 (m, 2H), 4.46 (t, J=5.3 Hz, 1H), 4.25-4.30 (m, 1H), 4.18-4.22 (m, 1H), 4.09-4.17 (m, 1H), 3.96-4.03 (m, 1H), 3.51 (s, 3H), 3.14 (q, J=7.4 Hz, NEt₃), 1.21 (t, J=7.3 Hz, NEt₃).
ステップ３：Ｐ^１−イミダゾリドＮ^７−（２−（４−クロロフェノキシ）エチル）−２’−Ｏ−メチル−５’−ＧＭＰナトリウム塩

１．０ｍｌの無水ＤＭＦ中のＮ^７−（２−（４−クロロフェノキシ）エチル）−２’−Ｏ−メチル−５’−ＧＭＰ（０．０５ｍｍｏｌ）の懸濁液に、イミダゾール（０．５１４ｍｍｏｌ）、２，２’−ジピリジルジスルフィド（０．２２７ｍｏｌ）、およびＴＥＡ（０．０７２ｍｍｏｌ）を添加した。ＰＰｈ_３（０．２２９ｍｍｏｌ）をその後、反応に添加すると、色が黄色に変わった。室温で１８時間撹拌後、アセトン中の１ＭＮａＣｌＯ_４（０．２５０ｍｍｏｌ）を反応に添加し、続いて４ｍｌのアセトンを添加した。得られた懸濁液を４℃で２０分間冷却し、遠心分離した。上清を注ぎ出し、得られた沈殿物を５ｍｌのアセトンで洗浄し、４℃で２０分間冷却し、再び遠心分離した。この洗浄手順をさらに２回繰り返した。得られたオフホワイトの固体を真空下で乾燥させて、表題の化合物のナトリウム塩（３０ｍｇ）を得た。この化合物を直接、ステップ４で使用した。ＬＣＭＳ法５ＭＳ（ＥＳ⁻）：ｍ／ｚ＝５８０．４（Ｍ−Ｈ^＋）。
ステップ４：Ｎ^７−（２−（４−クロロフェノキシ）エチル）−２’−Ｏ−メチル−５’−ＧＤＰＴＥＡ塩

１ｍｌの無水ＤＭＦ中のＰ^１−イミダゾリドＮ^７−（２−（４−クロロフェノキシ）エチル）−２’−Ｏ−メチル−５’−ＧＭＰナトリウム塩（０．０５ｍｍｏｌ）の溶液に、オルトリン酸トリブチルアンモニウム（A. R. Kore, G. Parmar, Syn. Comm. 2006, 36, 3393-3399中で説明されるように調製した；ＤＭＦ中の１Ｍ、０．２５０ｍｍｏｌ）を一滴ずつ添加し、続いてＺｎＣｌ_２（０．０５１ｍｍｏｌ）を添加した。反応を室温で４．５時間撹拌し、その後水（１ｍｌ）で抑制し、油っぽい固体になるまで濃縮した。この固体をＤＭＦ（１ｍｌ）中に取り、アセトン中の１ＭＮａＣｌＯ_４（０．５００ｍｍｏｌ）を添加し、続いて７ｍｌのアセトンを添加した。得られた懸濁液を０℃まで約１０分間冷却し、遠心分離し、上清を注ぎ出した。固体をアセトンで１回洗浄し、遠心分離し、上清を注ぎ出した。得られた固体をその後、真空下で乾燥させて、任意の残留有機物を除去し、Ｈ_２Ｏ中に取り、分取イオン交換クロマトグラフィー［（ＴｏｓｏｈＴＳＫゲルＤＥＡＤ−５ＰＷ、１３μｍ、２１．５×１５０ｍｍ、０〜１００％１ＭＴＥＡＢ、５ｍｌ／分）］を用いて精製した。生成物画分を集め、濃縮し、エタノールと共沸させて、表題の化合物のトリエチルアンモニウム塩を白色固体として得た（５．７ｍｇ、６．６μｍｏｌ、１３％）。ＬＣＭＳ法５ＭＳ（ＥＳ^＋）：ｍ／ｚ＝６１２．０（Ｍ＋Ｈ^＋）；¹H NMR (D₂O) δ: 9.25 (s, 1H), 7.13 (d, J=8.9 Hz, 2H), 6.79 (d, J=8.9 Hz, 2H), 5.99 (d, J=3.1 Hz, 1H), 4.76-4.87 (m, 2H), 4.40-4.54 (m, 3H), 4.24-4.35 (m, 2H), 4.13-4.23 (m, 2H), 3.50 (s, 3H), 3.13 (q, J=7.3 Hz, NEt₃), 1.17-1.23 (m, J=7.3, 7.3 Hz, NEt₃).
ステップ５：Ｐ^２−イミダゾリド−Ｎ^７−（２−（４−クロロフェノキシ）エチル）−２’−Ｏ−メチル−５’−ＧＤＰナトリウム塩

０．５ｍｌの無水ＤＭＦ中のＮ^７−（２−（４−クロロフェノキシ）エチル）−２’−Ｏ−メチル−５’−ＧＤＰＴＥＡ塩（６．５５μｍｏｌ）の懸濁液に、イミダゾール（８８μｍｏｌ）、２，２’−ジピリジルジスルフィド（２７．２μｍｏｌ）、およびＴＥＡ（１４．３μｍｏｌ）を添加した。ＰＰｈ_３（２６．７μｍｏｌ）をその後、反応に添加すると、色が黄色に変わった。室温で１８時間撹拌後、アセトン中の１ＭＮａＣｌＯ_４（０．１００ｍｍｏｌ）を反応に添加し、続いてアセトン（２ｍｌ）を添加すると、白色沈殿物が生成した。この懸濁液を４℃で２０分間冷却し、遠心分離した。上清を注ぎ出し、得られた沈殿物をアセトン（３ｍｌ）で洗浄し、４℃で１０分間冷却し、遠心分離した。このアセトン洗浄手順をさらに１回繰り返した。得られた白色固体を真空下で乾燥させて、表題の化合物のナトリウム塩（４．６ｍｇ、６．４μｍｏｌ、９７％）を得た。この化合物を直接、ｍＲＮＡキャッピング反応で使用した。ＬＣＭＳ法５ＭＳ（ＥＳ⁻）：ｍ／ｚ＝６６０．２（Ｍ−Ｈ^＋）。

Ｐ^２−イミダゾリド−Ｎ^７−（２−（４−クロロフェノキシ）エチル）−３’−Ｏ−メチル−５’−ＧＤＰナトリウム塩

ステップ１：Ｎ^７−（２−（４−クロロフェノキシ）エチル）−３’−Ｏ−メチル−５’−グアノシン

３’ＯＭｅ−グアノシン（０．６７３ｍｍｏｌ）および１−（２−ブロモエトキシ）−４−クロロベンゼン（２．７０ｍｍｏｌ）を、４ｍｌの無水ＤＭＳＯ中に取り、５０℃で２０時間撹拌した。反応を室温まで冷却し、ＤＭＳＯで希釈し、分取ＨＰＬＣ［ＳｈｉｍａｄｚｕＰｒｅｐＨＰＬＣ（ＳｕｎｆｉｒｅＰｒｅｐＣ１８５μｍ、１００ｍｍ×３０ｍｍカラム；０〜２０分：５〜３０％ＡＣＮ中の０．１％ＴＦＡ／Ｈ_２Ｏ中の０．１％ＴＦＡ；４２ｍＬ／分）］上で精製した。生成物画分を集め、トルエンと共沸させながら濃縮して、表題の化合物のトリフルオロ酢酸塩を白色固体として得た（１２４ｍｇ、０．２２３ｍｍｏｌ、３３％）。ＬＣＭＳ法２Ｒ_ｔ＝１．３９分；ＭＳｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］^＋４５２．９。
ステップ２：Ｎ^７−（２−（４−クロロフェノキシ）エチル）−３’−Ｏ−メチル−５’−ＧＭＰＴＥＡ塩

０℃まで冷却した１．０ｍｌのリン酸トリメチル中のＮ^７−（２−（４−クロロフェノキシ）エチル）−３’−Ｏ−メチル−５’−グアノシン（０．１１５ｍｍｏｌ）の溶液に、ＰＯＣｌ_３（０．５３６ｍｍｏｌ）を一滴ずつゆっくりと添加した。反応を０℃で６．５時間撹拌し、その後−２０℃まで１６時間冷却した（冷凍庫に一晩入れた）。反応をその後、０℃まで２時間温めた。追加のＰＯＣｌ_３（０．５３６ｍｍｏｌ）を反応に添加し、反応を０℃で３時間撹拌した。反応を１ＭＴＥＡＢ（水性）（３．５ｍｌ）で０℃にてゆっくりと抑制した。ＴＥＡＢ添加の完了に際して、反応を室温まで温めて、過剰のＰＯＣｌ_３の抑制を確実にした。抑制した反応を直接、分取イオン交換クロマトグラフィー［（ＴｏｓｏｈＴＳＫゲルＤＥＡＥ−５ＰＷ、１３μｍ、２１．５×１５０ｍｍ、０〜３０分：０〜１００％１ＭＴＥＡＢ、５ｍｌ／分）］上で精製した。生成物画分の凍結乾燥により、表題の化合物のトリエチルアンモニウム塩を白色固体として得、これを得られた状態のままで次のステップにおいて使用した。ＬＣＭＳ法２Ｒ_ｔ＝１．３４分；ＭＳｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］^＋５３２．８；¹H NMR (D₂O) δ: 7.16-7.23 (m, 2H), 6.79-6.87 (m, 2H), 5.94 (d, J=4.0 Hz, 1H), 4.78-4.86 (m, 2H), 4.47-4.52 (m, J=5.0, 5.0 Hz, 2H), 4.36-4.43 (m, 1H), 4.09-4.17 (m, 1H), 4.07 (t, J=5.0 Hz, 1H), 3.93-4.01 (m, 1H), 3.43 (s, 3H), 3.13 (q, J=7.4 Hz, NEt₃), 1.21 (t, J=7.3 Hz, NEt₃).
ステップ３：Ｐ^１−イミダゾリド−Ｎ^７−（２−（４−クロロフェノキシ）エチル）−３’−Ｏ−メチル−５’−ＧＭＰナトリウム塩

１．０ｍｌの無水ＤＭＦ中のＮ^７−（２−（４−クロロフェノキシ）エチル）−３’−Ｏ−メチル−５’−ＧＭＰＴＥＡ塩（０．０７５ｍｍｏｌ）の懸濁液に、イミダゾール（０．７３４ｍｏｌ）、２，２’−ジピリジルジスルフィド（０．３４０ｍｍｏｌ）、およびＴＥＡ（０．１０８ｍｍｏｌ）を添加した。ＰＰｈ_３（０．３４３ｍｍｏｌ）をその後、反応に添加すると、反応の色が黄色に変わった。室温で１８時間撹拌後、アセトン中の１ＭＮａＣｌＯ_４（０．３７５ｍｍｏｌ）を添加し、続いて４ｍｌのアセトンを添加した。得られた懸濁液を４℃で２０分間冷却し、遠心分離した。上清を注ぎ出し、得られた沈殿物をアセトン（５ｍｌ）で洗浄し、４℃で２０分間冷却し、遠心分離した。この洗浄手順をさらに２回繰り返した。得られたオフホワイトの固体を真空下で乾燥させて、表題の化合物のナトリウム塩（４５ｍｇ）を得た。この化合物を直接、ステップ４で使用した。ＬＣＭＳ法５ＭＳ（ＥＳ⁻）：ｍ／ｚ＝５８０．４（Ｍ−Ｈ^＋）。
ステップ４：Ｎ^７−（２−（４−クロロフェノキシ）エチル）−３’−Ｏ−メチル−５’−ＧＤＰＴＥＡ塩

１ｍｌの無水ＤＭＦ中のＰ^１−イミダゾリド−Ｎ^７−（２−（４−クロロフェノキシ）エチル）−３’−Ｏ−メチル−５’−ＧＭＰナトリウム塩（０．０７５ｍｍｏｌ）の溶液に、オルトリン酸トリブチルアンモニウム（A. R. Kore, G. Parmar, Syn. Comm. 2006, 36, 3393-3399中で説明されるように調製した；ＤＭＦ中の１Ｍ、０．３７５ｍｍｏｌ）を一滴ずつ添加し、続いてＺｎＣｌ_２（０．０７６ｍｍｏｌ）を添加した。反応を室温で４．５時間撹拌し、その後水（１ｍｌ）で抑制し、油っぽい固体になるまで濃縮した。この固体をＤＭＦ（１ｍｌ）中に取り、アセトン中の１ＭＮａＣｌＯ_４（１．００ｍｍｏｌ）を添加し、続いてアセトン（７ｍｌ）を添加した。得られた懸濁液を０℃まで１０分間冷却し、遠心分離し、上清を注ぎ出した。固体をアセトンで１回洗浄し、遠心分離し、上清を注ぎ出した。得られた固体をその後、真空下で乾燥させて、任意の残留有機物を除去し、分取イオン交換クロマトグラフィー［（ＴｏｓｏｈＴＳＫゲルＤＥＡＤ−５ＰＷ、１３μｍ、２１．５×１５０ｍｍ、０〜１００％１ＭＴＥＡＢ、５ｍｌ／分）］を用いて精製した。生成物画分を集め、濃縮し、エタノールと共沸させて、表題の化合物のトリエチルアンモニウム塩を白色固体として得た（１４．３ｍｇ、４．２１μｍｏｌ、８％）。ＬＣＭＳ法５ＭＳ（ＥＳ⁻）：ｍ／ｚ＝６１０．２（Ｍ−Ｈ^＋）；¹H NMR (D₂O) δ: 9.30 (s, 1H), 7.15 (d, J=9.0 Hz, 2H), 6.80 (d, J=9.0 Hz, 2H), 5.92 (d, J=4.0 Hz, 1H), 4.77-4.87 (m, 2H), 4.71-4.75 (m, 1H), 4.39-4.49 (m, 3H), 4.23-4.32 (m, 1H), 4.06-4.17 (m, 2H), 3.43 (s, 3H), 3.13 (q, J=7.4 Hz, NEt₃), 1.21 (t, J=7.3 Hz, NEt₃).
ステップ５：Ｐ^２−イミダゾリド−Ｎ^７−（２−（４−クロロフェノキシ）エチル）−３’−Ｏ−メチル−５’−ＧＤＰナトリウム塩

０．５ｍｌの無水ＤＭＦ中の２−アミノ−７−（２−（４−クロロフェノキシ）エチル）−９−（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）−３−ヒドロキシ−５−（（（ヒドロキシ（ホスホノオキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）−４−メトキシテトラヒドロフラン−２−イル）−６−オキソ−６，９−ジヒドロ−１Ｈ−プリン−７−イウム（４．２０μｍｏｌ）の懸濁液に、イミダゾール（８８μｍｏｌ）、２，２’−ジピリジルジスルフィド（２７．２μｍｏｌ）、およびＴＥＡ（１４．３μｍｏｌ）を添加した。ＰＰｈ_３（２６．７μｍｏｌ）をその後、反応に添加すると、反応の色が黄色に変わった。室温で１８時間撹拌後、アセトン中の１ＭＮａＣｌＯ_４（０．１００ｍｍｏｌ）を反応に添加し、続いてアセトン（２ｍｌ）を添加すると、白色沈殿物が生成した。この懸濁液を４℃で２０分間冷却し、遠心分離した。上清を注ぎ出し、得られた沈殿物をアセトン（３ｍｌ）で洗浄し、４℃で１０分間冷却し、遠心分離した。このアセトン洗浄手順をさらに１回繰り返した。得られた白色固体を真空下で乾燥させて、表題の化合物のナトリウム塩（７．２ｍｇ）を得た。この化合物を直接、ｍＲＮＡキャッピング反応で使用した。ＬＣＭＳ法５ＭＳ（ＥＳ⁻）：ｍ／ｚ＝６６０．２（Ｍ−Ｈ^＋）。

７−（［１，１’−ビフェニル］−４−イルメチル）−２−アミノ−９−（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）−３，４−ジヒドロキシ−５−（（（ヒドロキシ（（ヒドロキシ（１Ｈ−イミダゾール−１−イル）ホスホリル）メチル）ホスホリル）オキシ）メチル）テトラヒドロフラン−２−イル）−６−オキソ−６，９−ジヒドロ−１Ｈ−プリン−７−イウム

ステップ１：Ｎ^７−（［１，１’−ビフェニル］−４−イルメチル）−グアノシン

グアノシン（２．６５ｍｍｏｌ）および４−ブロモメチルビフェニル（６．０７ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＳＯ（７．５ｍｌ）中に取り、室温で６０時間撹拌した。反応をＤＭＳＯで希釈し、分取ＲＰ−ＨＰＬＣ上で精製した。集めた生成物画分を、トルエンと共沸させながら濃縮し、１：１Ｈ_２Ｏ／アセトニトリル中に取り、凍結し、凍結乾燥させて、表題の化合物のトリフルオロ酢酸塩を白色固体として得た。ＬＣＭＳ法１Ｒ_ｔ＝０．９４分；ＭＳｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］^＋４５０．０。
ステップ２：７−（［１，１’−ビフェニル］−４−イルメチル）−２−アミノ−９−（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）−３，４−ジヒドロキシ−５−（（（ヒドロキシ（ホスホノメチル）ホスホリル）オキシ）メチル）テトラヒドロフラン−２−イル）−６−オキソ−６，９−ジヒドロ−１Ｈ−プリン−７−イウム

−１０℃の１．０ｍｌのリン酸トリメチル中のＮ^７−（［１，１’−ビフェニル］−４−イルメチル）−グアノシン（０．２６６ｍｍｏｌ）の溶液に、−１０℃まで冷却した１．０ｍｌのリン酸トリメチル中のメチレンジホスホン酸ジクロリド（１．００ｍｍｏｌ）の溶液をゆっくりと添加した。反応を−１０℃〜０℃で６．５時間撹拌し、その後−２０℃で６０時間置いた。反応を、０℃の１ＭＴＥＡＢ（９ｍｌ）に添加することにより、ゆっくりと抑制した。添加の完了に際して、反応を室温まで温めて、過剰のメチレンジホスホン酸ジクロリドの抑制を確実にした。得られた溶液を直接、分取ＨＰＬＣ［（ＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘＧｅｍｉｎｉ−ＮＸ５μｍＣ１８１００ｍｍ×３０ｍｍカラム；０〜１５分：１０〜４０％ＡＣＮ／Ｈ_２Ｏ中の０．１ＭＴＥＡＢ、２５ｍｌ／分）］上で精製した。生成物画分を集め、凍結し、凍結乾燥させて、表題の化合物のトリエチルアンモニウム塩を白色固体として得た（１６ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ、７％）。ＬＣＭＳ法２Ｒ_ｔ＝１．４６分；ＭＳｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］^＋６０８．１；¹H NMR (D₂O) δ: 9.51 (s, 1H), 7.25-7.35 (m, 4H), 7.10-7.25 (m, 5H), 5.70 (d, J=3.4 Hz, 1H), 5.42-5.58 (m, 2H), 4.50 (t, J=3.9 Hz, 1H), 4.40 (t, J=5.1 Hz, 1H), 4.28-4.33 (m, 1H), 4.20-4.28 (m, 1H), 4.06-4.17 (m, 1H), 3.12 (q, J=7.3 Hz, NEt₃), 2.17 (t, J=19.7 Hz, 2H), 1.20 (t, J=7.3 Hz, NEt₃).
ステップ３：７−（［１，１’−ビフェニル］−４−イルメチル）−２−アミノ−９−（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）−３，４−ジヒドロキシ−５−（（（ヒドロキシ（（ヒドロキシ（１Ｈ−イミダゾール−１−イル）ホスホリル）メチル）ホスホリル）オキシ）メチル）テトラヒドロフラン−２−イル）−６−オキソ−６，９−ジヒドロ−１Ｈ−プリン−７−イウム

１．０ｍｌの無水ＤＭＦ中の７−（［１，１’−ビフェニル］−４−イルメチル）−２−アミノ−９−（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）−３，４−ジヒドロキシ−５−（（（ヒドロキシ（ホスホノメチル）ホスホリル）オキシ）メチル）テトラヒドロフラン−２−イル）−６−オキソ−６，９−ジヒドロ−１Ｈ−プリン−７−イウム（０．０１６ｍｍｏｌ）の溶液に、イミダゾール（０．１７６ｍｍｏｌ）、２，２’−ジピリジルジスルフィド（０．０８２ｍｍｏｌ）、およびＴＥＡ（０．０２９ｍｍｏｌ）を添加した。反応を室温で１０分間撹拌し、その後トリフェニルホスフィン（０．０８４ｍｍｏｌ）を添加すると、反応の色が黄色に変わった。室温で１８時間撹拌後、アセトン中の１ＭＮａＣｌＯ_４（０．２５０ｍｍｏｌ）を反応に添加し、続いてアセトン（５ｍｌ）を添加すると、白色沈殿物が生成した。得られた懸濁液を４℃で２０分間冷却し、遠心分離した。上清を注ぎ出し、沈殿物をアセトン（５ｍｌ）で洗浄し、４℃で１０分間冷却し、遠心分離した。この洗浄手順をさらに１回繰り返した。得られた沈殿物を真空下で乾燥させて、表題の化合物のナトリウム塩を白色固体として得た（１０．８ｍｇ、０．０１３ｍｍｏｌ、８１％）。この化合物を直接、ｍＲＮＡキャッピング反応で使用した。ＬＣＭＳ法５ＭＳ（ＥＳ⁻）：ｍ／ｚ＝６５７．５（Ｍ−Ｈ^＋）。

７−（［１，１’−ビフェニル］−４−イルメチル）−２−アミノ−９−（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）−３，４−ジヒドロキシ−５−（（（ヒドロキシ（（ヒドロキシ（１Ｈ−イミダゾール−１−イル）ホスホリル）アミノ）ホスホリル）オキシ）メチル）テトラヒドロフラン−２−イル）−６−オキソ−６，９−ジヒドロ−１Ｈ−プリン−７−イウム

ステップ１：７−（［１，１’−ビフェニル］−４−イルメチル）−２−アミノ−９−（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）−３，４−ジヒドロキシ−５−（（（ヒドロキシ（ホスホノアミノ）ホスホリル）オキシ）メチル）テトラヒドロフラン−２−イル）−６−オキソ−６，９−ジヒドロ−１Ｈ−プリン−７−イウム

Ｎ^７−（［１，１’−ビフェニル］−４−イルメチル）−グアノシン（０．１７７ｍｍｏｌ）を、０℃のリン酸トリメチル（２．０ｍｌ）中のジクロロホスフィニルホスホルイミド酸トリクロリド（J. Emsley, J. Moore, P.B. Udy, J. Chem. Soc. A 1971, 2863-2864、０．８９１ｍｍｏｌ）の溶液に添加した。反応を０℃で１．５時間撹拌し、その後−２０℃まで冷却し、１６時間置いた。反応を０℃まで温め、追加のジクロロホスフィニルホスホルイミド酸トリクロリド（０．８９１ｍｍｏｌ）を反応に添加した。ＬＣＭＳ（方法２ＲＸＮＭＯＮ＿Ａｃｉｄｉｃ＿Ｐｏｌａｒ＿ＰｏｓＮｅｇ．ｏｌｐ−ＺＱ１）によりモニターして少量の出発物質しか残っていないようになるまで、反応を０℃で５時間撹拌した。反応を、０℃の１ＭＴＥＡＢ（１０ｍｌ）にゆっくりと添加することにより抑制した。添加の完了に際して、反応を室温まで温めて、過剰のジクロロホスフィニルホスホルイミド酸トリクロリドの抑制を確実にした。得られた懸濁液をろ過し、ろ過物を分取ＨＰＬＣ［（ＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘＧｅｍｉｎｉ−ＮＸ５μｍＣ１８１００ｍｍ×３０ｍｍカラム；０〜１５分：１０〜５０％ＡＣＮ／Ｈ_２Ｏ中の０．１ＭＴＥＡＢ、２５ｍｌ／分）］に供した。生成物画分を集め、凍結し、凍結乾燥させて、表題の化合物のトリエチルアンモニウム塩を白色固体として得た（１３．５ｍｇ、０．０１８ｍｍｏｌ、１０％）。ＬＣＭＳ法６計算値：６０８．１１８６；発見値：６０９．１２９０［Ｍ＋Ｈ^＋］；¹H NMR (D₂O) δ: 9.51 (s, 1H), 7.49-7.57 (m, 4H), 7.38-7.44 (m, 4H), 7.31-7.38 (m, 1H), 5.90 (d, J=3.6 Hz, 1H), 5.55-5.68 (m, 2H), 4.63 (t, J=4.3 Hz, 1H), 4.48 (t, J=5.1 Hz, 1H), 4.29-4.38 (m, 1H), 4.17-4.26 (m, 1H), 4.04-4.17 (m, 1H), 3.13 (q, J=7.3 Hz, NEt₃), 1.21 (t, J=7.3 Hz, NEt₃).
ステップ２：７−（［１，１’−ビフェニル］−４−イルメチル）−２−アミノ−９−（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）−３，４−ジヒドロキシ−５−（（（ヒドロキシ（（ヒドロキシ（１Ｈ−イミダゾール−１−イル）ホスホリル）アミノ）ホスホリル）オキシ）メチル）テトラヒドロフラン−２−イル）−６−オキソ−６，９−ジヒドロ−１Ｈ−プリン−７−イウム

７−（［１，１’−ビフェニル］−４−イルメチル）−２−アミノ−９−（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）−３，４−ジヒドロキシ−５−（（（ヒドロキシ（ホスホノアミノ）ホスホリル）オキシ）メチル）テトラヒドロフラン−２−イル）−６−オキソ−６，９−ジヒドロ−１Ｈ−プリン−７−イウム（０．００７ｍｍｏｌ）を、１．０ｍｌの無水ＤＭＦ中に取り、イミダゾール（０．０７３ｍｍｏｌ）、２，２’−ジピリジルジスルフィド（０．０３６ｍｍｏｌ）、およびＴＥＡ（０．０１４ｍｍｏｌ）を添加した。反応を室温で５分間撹拌し、その後トリフェニルホスフィン（０．０３８ｍｍｏｌ）を添加すると、反応の色が黄色に変わった。室温で１６時間撹拌後、アセトン中の１ＭＮａＣｌＯ_４（０．１００ｍｍｏｌ）を反応に添加し、続いてアセトン（５ｍｌ）を添加すると、白色沈殿物が生成した。得られた懸濁液を４℃で２０分間冷却し、遠心分離した。上清を注ぎ出し、沈殿物をアセトン（５ｍｌ）で洗浄し、４℃で１０分間冷却し、遠心分離した。この洗浄手順をさらに１回繰り返した。得られた沈殿物を真空下で乾燥させて、表題の化合物のナトリウム塩を白色固体として得た（２．３ｍｇ、３．４μｍｏｌ、３３％）。この化合物を直接、ｍＲＮＡキャッピング反応で使用した。ＬＣＭＳ法５ＭＳ（ＥＳ⁻）：ｍ／ｚ＝６５８．３（Ｍ−Ｈ^＋）。

イミダゾール活性化ＧＤＰ誘導体の分析データを表５に示す。以下の実施例は、上記に説明するイミダゾール活性化の一般手順に従って、または実施例２１〜２７で説明する方法に類似する方法で調製した。

イミダゾール活性化ＧＭＰ誘導体の分析データを表６に示す。以下の実施例は、上記に説明するイミダゾール活性化の一般手順に従って、または実施例２１〜２７で説明する方法に類似する方法で調製した。

オリゴヌクレオチドおよびＲＮＡのキャッピングのために、上記に示す実施例で得られたイミダゾール活性化一および二リン酸塩を、ＲＮＡｓｅ非含有水中に溶解して、Ｈ_２Ｏ中のイミダゾール活性化ＧＭＰ／ＧＤＰ誘導体の２０ｍＭ溶液を得た（^１Ｈ−ＮＭＲにより決定される、試料中に存在する活性化イミダゾールの量に基づいて）。

オリゴヌクレオチドの３’末端改変の一般手順：
オリゴ５−／５Ｐｈｏｓ／ｒＧｒＡｒＡｒＡｒＡｒＡｒＡｒＡｒＡｒＡｒＡ−３（オリゴヌクレオチド１）および５−／５Ｐｈｏｓ／ｒＧｒＵ／ｉＦｌｕｏｒＴ／ｒＵｒＣｒＧｒＣｒＣｒＡｒＵｒＵ／ｉ６−ＴＡＭＮ／ｒＡｒＡｒＡｒＡｒＡｒＡｒＡｒＡｒＡｒＡ−３（オリゴヌクレオチド２）をＩＤＴから購入した。
手順Ａ（濃縮反応）：ＰＢＳ緩衝液中に１０μＭオリゴヌクレオチドを含有する溶液を、５０×ＮａＩＯ_４（５ｍＭストック溶液、５００μＭ最終濃度）で処理し、０℃で１時間維持した。得られた溶液を、１００×Ｎａ_２ＳＯ_３（１０ｍＭストック溶液、１ｍＭ最終濃度）で処理し、室温にした。１０分後、水中の１００×求核試薬を添加し（１０ｍＭストック溶液、１ｍＭ最終濃度）、溶液を室温で一晩維持した。上記溶液をＰｒｉｎｃｅｔｏｎＳｅｐａｒａｔｉｏｎＣＳ１００スピンカラムを用いて脱塩した。
手順Ｂ（還元的アミノ化反応）：ＰＢＳ緩衝液中に１０μＭオリゴヌクレオチドを含有する溶液を、５０×ＮａＩＯ_４（５ｍＭストック溶液、５００μＭ最終濃度）で処理し、０℃で１時間維持した。得られた溶液を、２００×Ｎａ_２ＳＯ_３（１０ｍＭストック溶液、２ｍＭ最終濃度）で処理し、室温にした。１０分後、１００×求核試薬（水中の１０ｍＭストック溶液、１ｍＭ最終濃度）およびＮａＢＨ_３ＣＮ（水中の１００ｍＭストック溶液、１０ｍＭ最終濃度）を添加した。上記溶液を３７℃で一晩振盪し、ＰｒｉｎｃｅｔｏｎＳｅｐａｒａｔｉｏｎＣＳ１００スピンカラムを用いて脱塩した。

３’改変オリゴヌクレオチドの分析データを表７に示す。以下の実施例は、上記に説明する一般手順に従って調製した。

ｍＲＮＡの３’末端改変の一般手順：
水中のｍＲＮＡ（０．５〜１．５ｍｇ／ｍＬ、９０μＬ）を、ＮａＩＩＯ_４（３ＭＮａＯＡｃ緩衝液中の０．１Ｍ、ｐＨ５．２、最終濃度１０ｍＭ）で処理し、溶液を暗条件で氷上にて１時間維持した。試料をＰｒｉｎｃｅｔｏｎＳｅｐａｒａｔｉｏｎｓＣｅｎｔｒｉｓｐｉｎカラムを用いて脱塩し、ＰＢＳ緩衝液で平衡化した。上記溶液を適切な求核試薬（５ｍＭの最終濃度のためにＨ_２ＯまたはＤＭＳＯ中）で処理し、Ｈ_２Ｏで０．７５倍に希釈し、５００ｒｐｍで室温にて２時間振盪した。得られた溶液をＰｒｉｎｃｅｔｏｎＳｅｐａｒａｔｉｏｎｓＣｅｎｔｒｉＳｐｉｎ１０カラム（ＰＢＳで平衡化、その後Ｈ_２Ｏで平衡化）で２回脱塩した。得られたＲＮＡ溶液を、ＬｉＣｌ沈殿によりさらに精製した。

生物学的データ
ビオチン化および表面固定化ｈＥＩＦ４Ｅへのキャップアナログ結合の分析：
二重ヒスチジンおよびアビジンタグ付きヒトＥＩＦ４Ｅ（Ｈｉｓ６−３Ｃ−ａｖｉ−ｅＩＦ４Ｅ）を、８ＬのＴＢ培地中で発現させた。０．４ｍＭＩＰＴＧによる誘発を２．０ＯＤ６００で行い、細胞を１５ＯＤ６００で回収した。２２５グラムのペレットを緩衝液（５０ｍＭＴｒｉｓ、５００ｍＭＮａＣｌ、２ｍＭＭｇＣｌ_２、１ｍＭＴＣＥＰ、ｐＨ７．５；１０％グリセロール、プロテアーゼ阻害剤、およびＤＮａｓｅを含有する）中に６００ｍＬの体積になるように希釈し、マイクロフルイダイザーに１回通す。試料を、５ｍＬＨｉｓＴｒａｐＨＰＩＭＡＣ上に４．０ｍＬ／分ＩＭＡＣにて、１カラム体積の２５ｍＭ〜５００ｍＭイミダゾール勾配により流した。ＧＳＴ−ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼ（２ｍｇ、自家製）を試料に添加し、４℃で一晩反応させた。切断した液溜まりを、重力カラム中の０．５ｍＬＧＳＴおよび０．５ＩＭＡＣ樹脂に通した。試料体積を、５０ｍＭＴｒｉｓｐＨ７．５、１ｍＭＴＣＥＰを用いて８００ｍＬに増大し、５ｍＬのｈｉＴｒａｐＳＰＦＦに４．０ｍＬ／分で０〜１ＭＮａＣｌ勾配により２０カラム体積にわたり通した。試料をその後、１２４ｍＬＳ７５ゲルろ過カラム上に２０ｍｇ／ｍＬで注入した。最終的なＡｖｉ−ｅＩＦ４Ｅ（２６９３１Ｄａ）を、１×ビシン緩衝液中に１ｍｇ／ｍＬになるように希釈し、体積は２．５ｍｇになり、ＡＴＰ／ビオチン混合物と混合した（１０ｍＭＡＴＰ、１０ｍＭＭｇ（ＯＡｃ）_２、５０μＭｄ−ビオチン最終）。ビオチンリガーゼ（自家製の２５μｇＢｉｒＡ）を反応に添加した。反応をＥｐｐｅｎｄｏｒｆＴｈｅｒｍｏＭｉｘｅｒＲ上で３０℃にて６０分間混合しながら（５００ｒｐｍ）行い、ＬＣ−ＭＳを用いて完了をチェックした。試料に、１００μｌの固定化グルタチオン（緩衝液で１：１）を添加し、４℃で１５分間混合して、Ｃ３およびＢｉｒ３を結合させ、遠心分離により除去した。試料を、２０ｍＭＨＥＰＥＳ、１００ｍＭＫＣｌ、１ｍＭＤＴＴ、ｐＨ７．５で平衡化した２つの連続ＰＤ−１０カラムを用いて緩衝液交換した。
ｅＩＦ４Ｅ安定性が低いため、ストレプトアビジンコーティング済みチップを準備し、ＢｉａｃｏｒｅＴ２００上で１０℃にて流した。ｅＩＦ４Ｅ（０．０４ｍｇ／ｍＬ、１５０μｌ）は、ＳｅｒｉｅｓＳＳｅｎｓｏｒＣｈｉｐＳＡ（ＧＥＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ、ＢＲ−１００５−３１）の試料チャネルに、５０００〜７０００ＲＵ（応答単位）の表面密度まで結合した。緩衝液は、１×ＰＢＳ、５０ｍＭＮａＣｌ、０．１％グリセロール、０．１％ＣＨＡＰＳ、および１％ＤＭＳＯを用いて、３０μＬ／分でチップ上を流れた。様々なキャップアナログの試料を、１００μＭ〜１ｎＭ未満の範囲内の様々な濃度に希釈した。試料をＢｉａｃｏｒｅチップに注入し、２分間の会合時間および５分間の解離時間を有した。ブランクを引くために、いくつかの緩衝液注入を各試料について行った。
ＢｉａｃｏｒｅＴ２００評価ソフトウェアを用いて全てのセットについて分析を行った。全ての化合物についての結合分析を、１μＭ化合物での応答単位として報告し、ここで、より高いＲＵ値は、表面固定化ｅＩＦ４Ｅタンパク質へのより大きなリガンド結合として解釈される。１サブセットの化合物を、速度論結合分析および熱力学（定常状態親和性）結合分析のいずれかまたは両方を用いてさらに特徴付けて、解離定数を決定した。定常状態親和性フィットを初期設定で行った（４秒間、その後５秒間ウィンドウでの注入のための停止）。速度論フィットは通常、１：１結合モデルで行い、一定ＲＩ＝０および全ての他の変数は包括的にフィットするように設定した。

上記に説明する方法を用いたキャップアナログのＢｉａｃｏｒｅ結合データを、表８に示す。

ＥＩＦ４Ｅへのキャップアナログの競合結合のＦＲＥＴアッセイ
材料：Ｈｉｓタグ付きｅＩＦ４Ｅタンパク質を、ＦｉｔｚｇｅｒａｌｄＩｎｄｕｓｔｒｉｅｓＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（８０Ｒ−１２５；Ａｃｔｏｎ、ＭＡ）から購入し、ｔＲＮＡを、ＳＩＧＭＡ（Ｒ５６３６；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入した。ビオチン化２０ヌクレオチドＲＮＡオリゴ（５’Ｐｈｏｓ／ｒＧｒＧｒＡｒＣｒＣｒＣｒＣｒＵｒＣｒＵｒＣｒＣｒＣｒＵｒＣｒＣｒＣｒＣｒＣｒＣビオチン−３’）を、ＩｎｔｅｇｒａｔｅｄＤＮＡＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）から購入した。ユーロピウム標識抗ｈｉｓ抗体を、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ（ＡＤ０１１０；Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）から購入し、ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ６４７を接合したストレプトアビジンを、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｓ３２３５７；ＧｒａｎｄＩｓｌａｎｄ、ＮＹ）から購入した。

ｅＩＦ４Ｅ結合のＴＲ−ＦＲＥＴアッセイ：
ＴＲ−ＦＲＥＴアッセイを、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）、０．０２％Ｔｗｅｅｎ、および０．１％ＢＳＡのアッセイ緩衝液中で、４つの別々の追加のステップを用いて行った。最初に、５μｌのＨｉｓ−ｅＩＦ４Ｅ（１０ｎＭ）およびｔＲＮＡ（０．１ｍｇ／ｍｌ）を黒壁３８４ウェル小体積プレートに添加した。次に、１μｌ／ウェルの新たに希釈した化合物を、ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒＢｉｏｍｅｋＦＸ液体ディスペンサーを用いて、１％の最終ＤＭＳＯ濃度で添加した。化合物およびｅＩＦ４Ｅを室温で１５分間結合させた。第３の添加は、全てのウェルへの４μｌの化学キャップされた７ｍＧＤＰイミダゾールｍＲＮＡ−ビオチン（１０ｎＭ）の添加からなるが、ただし、１つのカラムは、バックグラウンド対照として使用するために緩衝液のみを含有した。結合反応を室温で１時間インキュベートした。最後に、５μｌのユーロピウム標識抗Ｈｉｓ抗体（１０ｎＭ）およびａｌｅｘａｆｌｕｏｒ６４７を接合したストレプトアビジン（１０ｎＭ）ＴＲ−ＦＲＥＴ検出試薬を各ウェルに添加し、光から保護して室温で１時間インキュベートした。プレートをＥｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）上で読み取って、Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ（６６５ｎｍ）およびユーロピウム（６１５ｎｍ）の両方からのシグナルを測定した。キャップアナログ濃度の関数としてのａｌｅｘａｆｌｕｏｒとユーロピウム蛍光との比を、データ分析のために計算し、データをＧｒａｐｈＰａｄで標準のＥＣ５０阻害曲線にフィットさせた。

上記に説明する方法を用いたＮ^７−アルキル化ＧＭＰ誘導体のＦＲＥＴアッセイデータを、表９に示す。

５’一リン酸ｍＲＮＡの生成
標準のＴ７転写反応は５’三リン酸ｍＲＮＡをもたらし、これは、三リン酸構造が最終生成物で所望される場合、イミダゾールリン酸活性化キャップアナログと適合性でない。本明細書で説明するイミダゾール活性化キャップアナログを用いて標準の三リン酸キャップ構造を生成するために、ＲＮＡ基質は、化学キャッピングのための５’一リン酸ｍＲＮＡ（イミダゾール−二リン酸キャップアナログを用いる場合）または５’二リン酸ｍＲＮＡ（イミダゾール−一リン酸キャップアナログを用いる場合）のいずれかを有しなければならない。一または二リン酸５’末端ｍＲＮＡを生成する試みで、１０ｍＭＧＭＰまたは１０ｍＭＧＤＰのいずれかの転写反応への添加を試験した。１０ｍＭＧＭＰは９５％を超える５’一リン酸ｍＲＮＡを産生したが、１０ｍＭＧＤＰは完全に転写反応を阻害した。それゆえ、５’三リン酸キャップｍＲＮＡ構造の生成のために、本発明者は、１０ｍＭＧＭＰを含有する転写反応およびイミダゾール−二リン酸活性化キャップアナログの使用に焦点を当てた。

ｍＲＮＡのインビトロ転写（レプチンおよびルシフェラーゼ）：
インビトロ転写のためのＤＮＡ鋳型を生成するために、プラスミドｐＧＥＭ−ｏＴ７−ＴＥＶ−ｏＫ−Ｇｌｕｃ（ＮｃｏＩ）−２ｈＢＧ−（ＮｏｔＩ）−１２０ＡまたはｐＧＥＭ−ｏＴ７−ＴＥＶ−ｈＬｅｐｔｉｎ−ＧＡｏｐｔ−２ｈＢＧ−１２０Ａを、制限酵素ＢｓｐＱ１（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）で製造業者のプロトコルに従って直鎖状にした。直鎖状ＤＮＡベクターを、３倍体積の１００％エタノールおよび１／１０体積の３ＭＮａＯＡｃ、ｐＨ５．１での沈殿により精製した。この次に７０％エタノールで洗浄し、ＤＮＡを水中に再懸濁した。

４０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８、８ｍＭＭｇＣｌ_２、１ｍＭ各ＮＴＰ、１０ｍＭＤＴＴ、２ｍＭスペルミジン、０．００４Ｕ／μＬ無機ピロホスファターゼ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）、１Ｕ／μＬＲＮａｓｅ阻害剤（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）、５Ｕ／μＬＴ７ＲＮＡポリメラーゼ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）、および０．２μｇ／μＬの直鎖状プラスミドＤＮＡ中で、インビトロ転写を行った。

ｍＲＮＡ調製が５’末端化学キャッピングのためである場合、１０ｍＭのＧＭＰ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を転写反応中に添加した。反応を３７℃で１．５時間インキュベートした。ＤＮＡ鋳型を、０．０４Ｕ／μＬのＴＵＲＢＯＤＮａｓｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を添加することにより消化し、３７℃でさらに３０分間インキュベートした。転写産物をＬｉＣｌ（最終濃度２．８１ｍＭ）により沈殿させ、続いて７０％エタノールで洗浄した。ペレットをヌクレアーゼ非含有水中に再懸濁した。

ＲＮＡの化学キャッピング：
使用したＲＮＡは、５’一リン酸塩で合成した２０ヌクレオチド合成ＲＮＡ分子（ＩｎｔｅｇｒａｔｅｄＤＮＡＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ：５’−Ｐ−ｒＧｒＧｒＡｒＣｒＣｒＣｒＣｒＵｒＣｒＵｒＣｒＣｒＣｒＵｒＣｒＣｒＣｒＣｒＣｒＣ−３’）、または上記に説明するようにインビトロ転写した５’一リン酸含有ｍＲＮＡ（ガウシアルシフェラーゼｍＲＮＡまたはヒトレプチンｍＲＮＡ）のいずれかであった。３’改変および非改変ＲＮＡの両方を使用した。

ＲＮＡ溶液を最初に、６５℃で１０分間加熱することにより、水中で変性させた。上記混合物を氷上で５分間冷却し、その後キャッピング緩衝液（１００ｍＭＭＥＳ緩衝液、ｐＨ６．０、１００ｍＭＮａＣｌ、および５ｍＭＭｎＣｌ_２）に添加した。イミダゾール活性化キャップアナログをその後、５ｍＭの最終濃度になるように、反応に添加した。反応をＴｈｅｒｍｏｓｈａｋｅｒ（ＧｒａｎｔＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）中で室温にて一晩行った。ＥＤＴＡを５０ｍＭの最終濃度になるように添加することにより、反応を抑制した。キャップされた生成物を、ＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａＣｅｎｔｒｉｆｕｇａｌＦｉｌｔｅｒＵｎｉｔ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を用いて脱塩した。生成物を、ＬｉＣｌ沈殿（最終２．８１ｍＭＬｉＣｌ）でさらに精製し、７０％エタノールで洗浄した。ペレットを、ヌクレアーゼ非含有水中に再懸濁した。

いくつかの場合、化学キャップされたｍＲＮＡを、ＷａｔｅｒｓＸＢｒｉｄｇｅＳｈｉｅｌｄＲＰ１８３．５μｍ２．１×１００ｍｍカラムを用いる逆相ＨＰＬＣを用いてさらに精製した（表１３）。移動相Ａは水中の０．１Ｍトリエチルアンモニウム酢酸塩（ＴＥＡＡ）であり、移動相Ｂは７５％水／２５％アセトニトリル中の０．１ＭＴＥＡＡであった。カラム流速は０．８ｍｌ／分であり、カラム温度は６５℃であった。画分を手動で回収した。

２０ヌクレオチド合成ＲＮＡオリゴマーのキャッピングのＬＣ／ＭＳ分析：
キャップされたオリゴヌクレオチドおよび非キャップオリゴヌクレオチドを、ＷａｔｅｒｓＡｃｑｕｉｔｙＵＰＬＣＢＥＨＣ１８、１．７μｍ、１００Å、２．１×７５ｍｍカラム上で分解した。水性移動相は、０．８μＭＥＤＴＡ、７．１５ｍＭトリエチルアミン、および１９２．３ｍＭヘキサフルオロイソプロパノールを含有した。有機移動相は、メタノールである。カラムを６５℃で維持し、流速は０．３５ｍＬ／分であった。典型的な勾配は、２分間で５％〜１６％有機物に傾斜し、続いて２０分間で１６％〜２５％傾斜した。オリゴヌクレオチドのＨＰＬＣ後ＭＳ分析を、ＴｈｅｒｍｏＬＴＱ−ＯｒｂｉｔｒａｐＸＬまたはＡＢＳｃｉｅｘ６５００ＱＴｒａｐのいずれかを用いて行った。質量分析計を、ＥＳＩ−ＭＳネガティブモードで作動させ、７３５〜１５５０ｍ／ｚをスキャンした。

ルシフェラーゼｍＲＮＡのトランスフェクション、および発光読み出し
細胞培養：ＨＥＫ２９３を、９６ウェルポリＤリジンコート済みプレート中に３０，０００細胞／ウェルの密度で播種し、３７℃、５％ＣＯ_２のインキュベーターで一晩インキュベートする。培養培地はＥＭＥＭ（ＡＴＣＣ、カタログ番号３０−２００３）、１０％ＦＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）であり、抗生物質は含まない。

ｍＲＮＡトランスフェクション：１００ｎｇ／ウェルのｍＲＮＡを、０．４μｌ／ウェルのＤｈａｒｍａＦＥＣＴｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ２（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＴ−２００２−０１）を用いてトランスフェクトする。これは、１：４の比のｍＲＮＡ対トランスフェクション試薬である。ｍＲＮＡおよびトランスフェクション試薬を、ＯｐｔｉＭＥＭ中で混合して、１０μｌ／ウェルの最終体積を得る。混合物を室温で２０分間インキュベートする。一晩培養した培地を、プレートを反転させることにより細胞から除去する。９０μｌの新しい培養培地を各ウェルに添加する。１０μｌのｍＲＮＡ混合物を各ウェルに添加する。プレートを３７℃、５％ＣＯ_２で２４時間インキュベートする。

培地回収：ガウシアルシフェラーゼタンパク質が培地中に分泌される。培地を回収するために、９０μｌの培地を細胞からｖ底９６ウェルプレートに移す。プレートを１０００ｒｐｍで５分間遠心分離する。８０μｌの上清を新しいｖ底プレートに移し、凍結するか、または直接、ルシフェラーゼ発現アッセイで使用する。

ルシフェラーゼ発現アッセイ：ＢｉｏＬｕｘガウシアルシフェラーゼアッセイキット（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓカタログ番号Ｅ３３００Ｌ）を、ルシフェラーゼアッセイを行うために使用する。ＢｉｏＬｕｘｇＬＵＣ基質の１：１００希釈物をアッセイ緩衝液中に作製する（１０μｌの基質：１０００μｌのアッセイ緩衝液）。２０μｌのトランスフェクション培地を９６ウェル白色透明底プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒｂｉｏ−ｏｎｅ６５５０９５）に添加する。プレートを、ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ３マイクロプレートリーダー（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ）を用いて読み取る。時間０で、５０μＬの基質混合物を培地プレートに添加し、データを６０秒間収集する。相対的発光単位（ＲＬＵ）は３０秒でピークに達し、結果をこの時点を用いて計算する。％ルシフェラーゼ活性を、各改変ｍＲＮＡのＲＬＵを酵素キャップされたＣａｐ−０ｍＲＮＡのＲＬＵについて正規化し、１００倍することにより計算する。

スキーム１６：ＨＰＬＣ精製化学キャップされたｍＲＮＡと比較した、酵素キャップされたＨＰＬＣ精製ｍＲＮＡ（Ｃａｐ−１）のルシフェラーゼ活性。

スキーム１７：化学キャップされたｍＲＮＡと比較した、酵素キャップされたｍＲＮＡ（キャップ−０）のルシフェラーゼ活性。

キャップされたレプチンｍＲＮＡのトランスフェクション、および発光読み出し
細胞培養：ＨＥＫ２９３細胞を、９６ウェルポリＤリジンコートされたプレート中に３０，０００細胞／ウェルの密度で播種し、３７℃、５％ＣＯ_２のインキュベーターで一晩インキュベートする。培養培地はＥＭＥＭ（ＡＴＣＣ、カタログ番号３０−２００３）、１０％ＦＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）であり、抗生物質は含まない。

培地回収：タンパク質が培地中に分泌される。培地を回収するために、９０μｌの培地を細胞からｖ底９６ウェルプレートに移す。プレートを１０００ｒｐｍで５分間遠心分離する。８０μｌの上清を新しいｖ底プレートに移す。

ヒトレプチンタンパク質ＥＬＩＳＡアッセイ：マウス血漿中のヒトレプチンをＥＬＩＳＡにより測定した。Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓｄｕｏｓｅｔから購入した抗体（カタログ番号ＤＹ３９８Ｅ、捕獲抗体についてパート番号８４０２７９および検出抗体についてパート番号８４０２８０）を、ＰＢＳを用いて再構成し、再びＰＢＳを用いて滴定した。捕獲抗体で、白色Ｎｕｎｃ（登録商標）Ｍａｘｉｓｏｒｐ３８４ウェルプレート（カタログ番号４６０３７２）上を、３０μｌ／ウェルで４μｇ／ｍＬにてコーティングした。室温で一晩のインキュベーション後、捕獲抗体を吸引し、プレートを９０μＬ／ウェルのＫＰＬミルクブロッカー（カタログ番号５０−８２−００）により室温で２時間ブロックした。インキュベーションが完了すると、プレートを吸引し、組換え標準および試料を３０μＬ／ウェルでプレートに添加し、３７℃で２時間、６００ｒｐｍにて振盪した。試料／標準希釈物を、カゼイン試料希釈液（０．７％カゼイン、１．７ｍＭ第一リン酸ナトリウム、８．１ｍＭ第二リン酸ナトリウム七水和物、０．１５ＭＮａＣｌ、０．７％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、および０．１％アジ化ナトリウム）を用いて作製した。続いて、Ｔｅｋｎｏｖａプレート洗浄溶液（カタログ番号Ｐ１１９２）を用いて、１００μｌ／ウェルで洗浄／吸引を３回行った。次に、検出抗体を、カゼイン検出抗体希釈液（０．４％カゼイン、１．７ｍＭ第一リン酸ナトリウム、８．１ｍＭ第二リン酸ナトリウム七水和物、０．１５ＭＮａＣｌ、および０．１％アジ化ナトリウム）を用いて１２．５ｎｇ／ｍＬに希釈し、３０μｌ／ウェルで添加し、室温で２時間置いた。このインキュベーション後、プレートを再び洗浄し、ＨＲＰ希釈緩衝液（１．７ｍＭ第一リン酸ナトリウム、８．１ｍＭ第二リン酸ナトリウム七水和物、０．１４５ＭＮａＣｌ、０．１％クロロアセトアミド、１％ＢＳＡプロテアーゼ非含有、および０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）中の１：１２５０希釈のポリ−ストレプトアビジン−ＨＲＰ（カタログ番号２１１４０）の溶液を各ウェルに添加し（３０μｌ／ウェル）、室温で３０分間インキュベートした。最終的な洗浄／吸引により、ＨＲＰ溶液を除去し、化学発光基質を３０μＬ／ウェルで添加した（カタログ番号１８５９６７８および１８５９６７９）。プレートを、ＳｐｅｃｔｒａｍａｘＭ５プレートリーダーを用いて５０ｍｓの積分時間で迅速に読み取った。ＥＬＩＳＡの動的範囲は、５〜１５０ｐＭのヒトレプチンである。

スキーム１８：化学キャップされたＨＰＬＣ精製ｍＲＮＡでのレプチン発現データ。

ＨＥＫ２９３細胞Ｓ１００抽出物：Ｓ１００抽出物を、Ｓ１００調製の標準プロトコルに従って調製した。ＨＥＫ２９３（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＳＨ３０５２１．０２）細胞を、８０％ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ１２３３８）および２０％ＳＦＭ４中で、８％ＣＯ_２にて加湿大気で、１００ｒｐｍで回転する軌道振盪器上にて生育させた。２．５×１０^９細胞を、臨床用遠心機で１，５００ｒｐｍにて５分間ペレット化した。ペレットを１Ｌの氷冷ＤＰＢＳ中で洗浄し、再び臨床用遠心機で４℃にて１，５００ｒｐｍで１０分間回転させた。上清を除去し、細胞ペレットを２５０ｍｌの氷冷ＰＢＳ中に再懸濁し、ピペッティングにより破壊し、臨床用遠心機で４℃にて１，７００ｒｐｍで６分間回転させた。上清を除去し、ペレットを５倍体積の緩衝液Ａ（１０ｍＭＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、ｐＨ７．９、１．５ｍＭＭｇＣｌ_２、１０ｍＭＫＣｌ、新たに添加した０．５ｍＭＤＴＴ）中に再懸濁した。細胞を氷上で１０分間インキュベートし、２，０００ｒｐｍで１０分間回転させ、上清を除去した。追加の体積の緩衝液Ａを添加し、ペレットを、緩いダンス型乳棒ホモジナイザーを５往復することにより破壊した。細胞を、きついダンス型乳棒ホモジナイザーを１５往復することにより溶解し、顕微鏡を用いて溶解を確認した。溶解した材料を、臨床用遠心機で４℃にて４，５００ｒｐｍで１０分間回転させた。上清を除去し、Ｓ１００抽出物を作製するために使用した。０．１１倍体積の緩衝液Ｂ（０．３ＭＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、ｐＨ７．９、１．４ＭＫＣｌ、３０ｍＭＭｇＣｌ_２）をＳ１００に添加し、反転することにより穏やかに混合し、超遠心機で４℃にて１０２，０００ｇで１時間回転させた。上清を除去し、冷却した１５ｍＬ円錐管に入れた。脂質層の下の下層からの透明な上清を除去し、１Ｌの緩衝液Ｄ（２０ｍＭＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、ｐＨ７．９、２０％グリセロール、０．１ＭＫＣｌ、０．２ｍＭＥＤＴＡ、０．５ｍＭＤＴＴ、０．５ｍＭＰＭＳＦ）に対して４℃で５時間を超えて透析した。Ｓ１００抽出物を、すぐに使用できるまで、少ない一定分量で８０℃にて保存した。

ＦＲＥＴＲＮＡ分解アッセイ：ＲＮＡ分解アッセイを、Uhler et al J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 14230-14231のプロトコルに従って、いくらかの改変を伴って行った。オリゴ５−／５Ｐｈｏｓ／ｒＧｒＵ／ｉＦｌｕｏｒＴ／ｒＵｒＣｒＧｒＣｒＣｒＡｒＵｒＵ／ｉ６−ＴＡＭＮ／ｒＡｒＡｒＡｒＡｒＡｒＡｒＡｒＡｒＡｒＡ −３および５−／５Ｐｈｏｓ／ｒＧｒＵ／ｉＦｌｕｏｒＴ／ｒＵｒＣｒＧｒＣｒＣｒＡｒＵｒＵ／ｉ６−ＴＡＭＮ／ｒＡｒＡｒＡｒＡｒＡｒＡｒＡｒＡｒＡｒＡ／３ＢＩＯ−３をＩＤＴから購入し、ＲＮＡ分解アッセイで使用した。アッセイ緩衝液は、１３０ｍＭＫ−グルタミン酸塩ｐＨ７．５、１ｍＭＭｇＣｌ_２からなった。実験の直前にＤＴＴを１０ｍＭの最終濃度になるように添加した。１００μＭまたは２００μＭのオリゴを、それぞれ、反応体積２５μＬおよび５０μＬによって使用した。Ｓ１００抽出物は、０．３％〜２０％ｖ／ｖで変化し、緩衝液Ｄは、全ての試料について全反応体積の２０％であった。全ての反応を、３８４ウェルプレートで３７℃にて行った。１００秒で、Ｓ１００抽出物をオリゴ緩衝液混合物に添加した。フルオレセインを４９０ｎｍで励起し、蛍光放射を５２０ｎｍおよび５８５ｎｍで測定した。データを毎分２時間収集した。ＦＲＥＴ比Ｑ（＝Ｆ_５８５／Ｆ_５２０）を計算し、初期値Ｑ_０について正規化した。データをＰｒｉｓｍ５．０を用いて、単一指数関数減衰関数ｙ＝ｙ_０−Ｐｌａｔｅａｕ^＊ｅｘｐ（−Ｋ^＊Ｘ）＋Ｐｌａｔｅａｕにフィットさせた。ミカエリス−メンテンパラメータを抽出するために、％Ｓ１００［Ｘ］に対する速度定数ｋ_ｄｅｃの依存性を、Ｐｒｉｓｍ５．０を用いて、ミカエリス−メンテン式Ｙ＝Ｖ_ｍａｘ ^＊Ｘ／（Ｋｍ＋Ｘ）にフィットさせた。

ｍＲＮＡの３’末端改変
ルシフェラーゼ３’末端改変ｍＲＮＡのトランスフェクション、および発光読み出し：
細胞培養：ＨＥＫ２９３細胞を、９６ウェルポリＤリジンコート済みプレート中に３０，０００細胞／ウェルの密度で播種し、３７℃、５％ＣＯ_２のインキュベーターで一晩インキュベートする。培養培地はＥＭＥＭ（ＡＴＣＣ、カタログ番号３０−２００３）、１０％ＦＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）であり、抗生物質は含まない。

ｍＲＮＡトランスフェクション：３０ｎｇ／ウェルのｍＲＮＡを、０．４μｌ／ウェルのＤｈａｒｍａＦＥＣＴｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ２（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＴ−２００２−０１）を用いてトランスフェクトする。ｍＲＮＡおよびトランスフェクション試薬を、ＯｐｔｉＭＥＭ中で混合して、１０μｌ／ウェルの最終体積を得る。混合物を室温で２０分間インキュベートした。一晩培養した培地を、プレートを反転させることにより細胞から除去した。９０μｌの新しい培養培地を各ウェルに添加し、１０μｌのｍＲＮＡ混合物を各ウェルに添加した。プレートを３７℃、５％ＣＯ_２で２４時間インキュベートする。

培地回収：ガウシアルシフェラーゼタンパク質が培地中に分泌される。培地を回収するために、トランスフェクション２４時間後、９０μｌの培地を細胞からｖ底９６ウェルプレートに移し、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。８０μｌの上清を新しいｖ底プレートに移し、凍結するか、または直接、ルシフェラーゼ発現アッセイもしくはレプチンＥＬＩＳＡで使用した。

ルシフェラーゼ発現アッセイ：ＢｉｏＬｕｘガウシアルシフェラーゼアッセイキット（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓカタログ番号Ｅ３３００Ｌ）を、ルシフェラーゼアッセイを行うために使用する。ＢｉｏＬｕｘｇＬＵＣ基質の１：１００希釈物をアッセイ緩衝液中に作製する（１０μｌの基質：１０００μｌのアッセイ緩衝液）。２０μｌのトランスフェクション培地を９６ウェル白色透明底プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒｂｉｏ−ｏｎｅ６５５０９５）に添加する。プレートを、ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ３マイクロプレートリーダー（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ）を用いて読み取る。時間０で、５０μＬの基質混合物を培地プレートに添加し、データを６０秒間収集する。相対的発光単位（ＲＬＵ）は３０秒でピークに達し、結果をこの時点を用いて計算する。％ルシフェラーゼ活性を、各改変ｍＲＮＡのＲＬＵを酵素キャップされたＣａｐ１ｍＲＮＡのＲＬＵについて正規化し、１００倍することにより計算する。

本明細書全体を通して、様々な出版物が参照されている。本発明が属する分野の状態をより完全に説明するために、これらの出版物の開示はそれらを全体として、本明細書中で参照により本明細書に組み込まれる。

本発明は、開示される実施形態を参照して説明されているが、当業者は、上記に詳述される特定の実施例および研究は単に本発明の例示であることを容易に理解するであろう。様々な改変が本発明の趣旨から逸脱することなくなされ得ることが理解されるべきである。したがって、本発明は、以下の特許請求の範囲によってのみ限定される。

本発明は以下の態様を含み得る。
［１］
式Ｉの化合物またはその塩

であって、式中、
Ｚ _１が、

、キャップ０、キャップ１、

であり、ただしＺ _１が、

、キャップ０、またはキャップ１である場合、−Ａ _１ −Ｒ ^５および−Ａ _３ −Ｒ ^８の両方と
もが−ＯＨであることはなく、かつＡ _２が無ではなく；
Ｚ _２が、無、または−Ｏ−、−Ｓ−、任意選択で置換された低級アルキル、任意選択で
置換されたアミノアルキル、任意選択で置換されたアリール、任意選択で置換されたヘテ
ロアリール、任意選択で置換されたシクロアルキル、任意選択で置換されたシクロアルケ
ニル、任意選択で置換されたヘテロシクリル、

からなる群から選択される結合部分であり；
Ａ _１およびＡ _３が独立して、無、ＮＨ、Ｓ、およびＯからなる群から選択され；
Ａ _２が、無、または＞ＣＲ ^６Ｒ ^７、＞ＮＲ ^６、＞ＮＮＲ ^６Ｒ ^７、＞ＮＯＲ ^６、＞Ｓ、お
よび＞Ｏからなる群から選択され；
Ｙが、無、または任意選択で置換された低級アルキル、任意選択で置換されたアルケニ
ル、任意選択で置換されたアルキニル、−（ＣＨ _２） _ｎＯＲ ^１５、−（ＣＨ _２） _ｎＣＯＯ
Ｒ ^１５、および−（ＣＨ _２） _ｎＣ（Ｏ）ＮＲ ^１２からなる群から選択される結合部分であ
り；
Ｒ ^１が、Ｈ、任意選択で置換されたシクロアルキル、任意選択で置換されたシクロアル
ケニル、任意選択で置換されたアリール、任意選択で置換されたヘテロアリール、および
任意選択で置換されたヘテロシクリルからなる群から選択され；
Ｒ ^２が、Ｈ、−ＯＨ、任意選択で置換されたアルキル、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ ^１２Ｒ ^１３、お
よび−ＮＲ ^１２Ｒ ^１３からなる群から選択され；
Ｒ ^５、Ｒ ^６、およびＲ ^８が独立して、Ｈ、任意選択で置換されたアルキル、ポリアミン
、ＰＥＧ、−（ＣＨ _２） _ｎ１ＮＲ ^１２Ｒ ^１３、−（ＣＨ _２） _ｎ１ＮＲ ^１４Ｃ（Ｏ）Ｒ ^１５
、−（ＣＨ _２） _ｎ１ＯＲ ^１５、−（ＣＨ _２） _ｎ１Ｃ（Ｏ）ＯＲ ^１５、−（ＣＨ _２） _ｎ１Ｃ
（Ｏ）Ｒ ^１５、−（ＣＨ _２） _ｎ１Ｃ（Ｏ）ＮＲ ^１２Ｒ ^１３、−Ｏ−（ＣＨ _２） _ｎ３ −Ｃ（
Ｏ）−（ＮＲ ^１２） _２ −Ｃ（Ｏ）−Ｘ _２、−Ｏ−（ＣＨ _２） _ｎ３ −Ｃ（Ｏ）−［ＮＲ ^１２
−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ _２） _ｎ３］ _１〜３ −Ｘ _２からなる群から選択されるか、またはＲ ^６お
よびＲ ^８が一緒になって環を形成し、ここで該環が、任意選択で置換され、かつ１０〜８
０個の環原子を含有し、その中の１０〜４０個の環原子がヘテロ原子であってもよく、ま
たはＲ ^６およびＲ ^７が一緒になって３〜８員環を形成し、ここで該環が、任意選択で置換
され、かつその中の１〜６個の環原子がヘテロ原子であってもよく；
Ｒ ^７、Ｒ ^１１、Ｒ ^１２、Ｒ ^１３、Ｒ ^１４、Ｒ ^１５、およびＲ ^１６が独立して、Ｈ、任意
選択で置換された低級アルキル、および任意選択で置換されたアシルからなる群から選択
され；
Ｒ ^９が、Ｈおよび任意選択で置換された低級アルキルからなる群から選択され；
Ｒ ^１０が、Ｈ、−ＮＲ ^１２Ｒ ^１３、および−ＯＲ ^１６からなる群から選択され；
ｎが、１〜４であり；
ｎ１が、０〜１０であり；
ｎ２が、１〜１２であり；
ｎ３が、１〜８であり；
Ｘが、Ｏ、Ｓ、ＮＨ、および任意選択で置換されたアルカンジイルからなる群から選択
され；
Ｘ _１が、

からなる群から選択され；
Ｒ ^３およびＲ ^４が独立して、Ｈおよび−ＯＲ ^１６からなる群から選択されるか、または
Ｒ ^３およびＲ ^４が一緒になってＯ−Ｑ−Ｏを形成し；
Ｑが、−ＣＨ _２ −および−Ｃ（Ｍｅ） _２ −からなる群から選択され；
Ｘ _２が、親和性部分および検出部分からなる群から選択され；並びに
Ｘ _ｎが、核酸塩基である、化合物またはその塩。
［２］
以下の式

を有し、式中、
変数が、式Ｉで定義されるとおりである、請求項１に記載の化合物。
［３］
以下の式

を有し、式中、
変数が、式Ｉで定義されるとおりである、請求項１に記載の化合物。
［４］
以下の式

を有し、式中、
変数が、式Ｉで定義されるとおりである、請求項１に記載の化合物。
［５］
以下の式

を有し、式中、
^＊Ｚ _１が、

、キャップ０、およびキャップ１からなる群から選択され、ただしＡ２が無でないか、ま
たは−Ａ _１ −Ｒ ^５および−Ａ _３ −Ｒ ^８の両方ともが−ＯＨであることはなく、
他の変数が、式Ｉで定義されるとおりである、請求項１に記載の化合物。
［６］

からなる群から選択される構造を含む、請求項５に記載の化合物。
［７］
以下の式

を有し、式中、
−Ａ _１ −Ｒ ^５および−Ａ _３ −Ｒ ^８が、−ＯＨであり、
Ａ _２が、無であり、
Ｘ _ｎが、核酸塩基であり、
他の変数が、式Ｉで定義されるとおりである、請求項１に記載の化合物。
［８］

からなる群から選択される構造を含む、請求項７に記載の化合物。
［９］
以下の式

を有し、式中、
−Ａ _１ −Ｒ ^５および−Ａ _３ −Ｒ ^８が、−ＯＨであり、
Ａ _２が、無であり、
Ｘ _ｎが、核酸塩基であり、
他の変数が、式Ｉで定義されるとおりである、請求項１に記載の化合物。
［１０］
以下の式

を有し、式中、
−Ａ _１ −Ｒ ^５および−Ａ _３ −Ｒ ^８が、−ＯＨであり、
Ａ _２が、無であり、
Ｘ _ｎが、核酸塩基であり、
他の変数が、式Ｉで定義されるとおりである、請求項１に記載の化合物。
［１１］
式ＩＸの化合物またはその塩

であって、式中、
Ｚが、−ＯＨ、

からなる群から選択され、
ｎ４が、０〜２であり、
他の変数が、式１で定義されるとおりである、化合物またはその塩。
［１２］

からなる群から選択される構造を含む、請求項１１に記載の化合物。
［１３］
式Ｘの化合物またはその塩

であって、式中、
Ｚが、−ＯＨ、

からなる群から選択され、
ｎ４が、０〜２であり、
他の変数が、式Ｉで定義されるとおりである、化合物またはその塩。
［１４］

からなる群から選択される構造を含む、請求項１３に記載の化合物。
［１５］
式ＸＩの化合物またはその塩

であって、式中、
Ｚが、−ＯＨ、

からなる群から選択され、
ｎ４が、０〜２であり、
他の変数が、式Ｉで定義されるとおりである、化合物またはその塩。
［１６］

からなる群から選択される構造を含む、請求項１５に記載の化合物。

Claims

式Ｉの化合物またはその薬学的に許容される塩

であって、式中、
Ｚ_１が、

であり；
Ｚ_２が、無、または−Ｏ−、−Ｓ−、任意選択で置換されたＣ_１〜６アルキル、任意選択で置換されたアリール、任意選択で置換されたヘテロアリール、任意選択で置換されたシクロアルキル、

からなる群から選択される結合部分であり；ここで、前記アリールは、フェニルおよびナフチルからなる群から選択され、前記ヘテロアリールは、ピロリル、ピロリニル、イミダゾリル、ピラゾリル、ピリジル、ピリミジニル、ピラジニル、ピリダジニル、トリアゾリル、ピラニル、フリル、チエニル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、オキサジアゾリル、チアゾリル、チアジアゾリル、イソチアゾリル、インドリル、イソインドリル、インドリジニル、ベンゾイミダゾリル、キノリル、イソキノリル、キノキサリニル、キナゾリニル、インダゾリル、ベンゾトリアゾリル、ベンゾジオキソリル、ベンゾピラニル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾオキサジアゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾチアジアゾリル、ベンゾフリル、およびベンゾチエニルからなる群から選択され、および前記シクロアルキルは、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、シクロノニル、およびシクロデシルからなる群から選択され；
Ａ_１およびＡ_３が独立して、無、ＮＨ、Ｓ、およびＯからなる群から選択され；
Ａ_２が、無、または＞ＣＲ^６Ｒ^７、＞ＮＲ^６、＞ＮＮＲ^６Ｒ^７、＞ＮＯＲ^６、＞Ｓ、および＞Ｏからなる群から選択され；
Ｙが、任意選択で置換されたＣ_１〜６アルカンジイル、任意選択で置換されたＣ_２〜６アルケンジイル、−（ＣＨ_２）_ｎ −Ｏ−Ｒ^１５ −、−（ＣＨ_２）_ｎ −Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｒ^１５ −、および−（ＣＨ_２）_ｎ −Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｒ^１２）−からなる群から選択される結合部分であり；
Ｒ^１が、任意選択で置換されたアリール、任意選択で置換されたヘテロアリール、および任意選択で置換されたヘテロシクリルからなる群から選択され；ここで、前記アリールは、フェニルおよびナフチルからなる群から選択され、および前記ヘテロアリールは、ピロリル、ピロリニル、イミダゾリル、ピラゾリル、ピリジル、ピリミジニル、ピラジニル、ピリダジニル、トリアゾリル、ピラニル、フリル、チエニル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、オキサジアゾリル、チアゾリル、チアジアゾリル、イソチアゾリル、インドリル、イソインドリル、インドリジニル、ベンゾイミダゾリル、キノリル、イソキノリル、キノキサリニル、キナゾリニル、インダゾリル、ベンゾトリアゾリル、ベンゾジオキソリル、ベンゾピラニル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾオキサジアゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾチアジアゾリル、ベンゾフリル、およびベンゾチエニルからなる群から選択され；
Ｒ^２が、−ＮＲ^１２Ｒ^１３であり；
Ｒ^５およびＲ^８が、Ｈであり；
Ｒ^６が、Ｈ、Ｃ_１〜６アルキル、ＰＥＧ、−（ＣＨ_２）_ｎ１Ｃ（Ｏ）Ｒ^１５、−Ｏ−（ＣＨ_２）_ｎ３−Ｃ（Ｏ）−（ＮＲ^１２）_２−Ｃ（Ｏ）−Ｘ_２、および−Ｏ−（ＣＨ_２）_ｎ３−Ｃ（Ｏ）−［ＮＲ^１２−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ_２）_ｎ３］_１〜３−Ｘ_２からなる群から選択され；
Ｒ^７、Ｒ^１１、Ｒ^１２、Ｒ^１３、およびＲ^１６が独立して、ＨおよびＣ_１〜６アルキルからなる群から選択され；
Ｒ ^１５が、無およびＣ _１〜６アルカンジイルからなる群から選択され；
Ｒ^９が、ＨおよびＣ_１〜６アルキルからなる群から選択され；
Ｒ^１０が、Ｈ、−ＮＲ^１２Ｒ^１３、および−ＯＲ^１６からなる群から選択され；
ｎが、１〜４であり；
ｎ１が、０〜１０であり；
ｎ２が、１〜１２であり；
ｎ３が、１〜８であり；
Ｘが、Ｏ、Ｓ、およびＮＨからなる群から選択され；
Ｘ_１が、

からなる群から選択され；
Ｒ^３およびＲ^４が独立して、Ｈおよび−ＯＲ^１６からなる群から選択され；
Ｘ_２が、ビオチンおよびジゴキシゲニンからなる群から選択され；並びに
Ｘ_ｎが、核酸塩基である、化合物またはその薬学的に許容される塩。
以下の構造

を有し、式ＩＩ中、
変数が、式Ｉで定義されるとおりである、請求項１に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩。
以下の構造

を有し、式ＩＩＩ中、
変数が、式Ｉで定義されるとおりである、請求項１に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩。
以下の構造

を有し、式ＩＶ中、
変数が、式Ｉで定義されるとおりである、請求項１に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩。
以下の構造

を有し、式ＶＩ中、
−Ａ_１−Ｒ^５および−Ａ_３−Ｒ^８が、−ＯＨであり、
Ａ_２が、無であり、
Ｘ_ｎが、核酸塩基であり、
他の変数が、式Ｉで定義されるとおりである、請求項１に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩。
からなる群から選択される構造を含む、請求項５に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩。
以下の構造

を有し、式ＶＩＩ中、
−Ａ_１−Ｒ^５および−Ａ_３−Ｒ^８が、−ＯＨであり、
Ａ_２が、無であり、
Ｘ_ｎが、核酸塩基であり、
他の変数が、式Ｉで定義されるとおりである、請求項１に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩。
以下の構造

を有し、式ＶＩＩＩ中、
−Ａ_１−Ｒ^５および−Ａ_３−Ｒ^８が、−ＯＨであり、
Ａ_２が、無であり、
Ｘ_ｎが、核酸塩基であり、
他の変数が、式Ｉで定義されるとおりである、請求項１に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩。
−Ｙ−Ｒ^１が、

からなる群から選択され、
他の変数が、式Ｉで定義されるとおりである、請求項１〜５、７および８のいずれかに記載の化合物またはその薬学的に許容される塩。
Ｒ^６が、Ｈ、Ｃ_１〜６アルキル、

および−（ＣＨ_２）_ｎ１Ｃ（Ｏ）Ｒ^１５からなる群から独立して選択され、および
Ｒ^１５がＣ_１〜６アルキルである、請求項１〜９のいずれかに記載の化合物またはその薬学的に許容される塩。
Ｒ ^６が、−Ｏ−（ＣＨ _２） _ｎ３ −Ｃ（Ｏ）−（ＮＲ ^１２） _２ −Ｃ（Ｏ）−Ｘ _２、および−Ｏ−（ＣＨ _２） _ｎ３ −Ｃ（Ｏ）−［ＮＲ ^１２ −Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ _２） _ｎ３］ _１〜３ −Ｘ _２からなる群から選択され；かつ
Ｘ_２が、ビオチンおよびジゴキシゲニンから選択される、請求項１〜４、９および１０のいずれかに記載の化合物またはその薬学的に許容される塩。
Ｘ_ｎが、シトシン、グアニン、アデニン、チミン、およびウラシルから選択される、請求項１〜１１のいずれかに記載の化合物またはその薬学的に許容される塩。