JP6574032B2 - 修飾型のヌクレオシド、ヌクレオチドおよび核酸、ならびにそれらの使用方法 - Google Patents

修飾型のヌクレオシド、ヌクレオチドおよび核酸、ならびにそれらの使用方法 Download PDF

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Description

本開示は、細胞機能を変調するための修飾型の核酸を使用する組成物および方法を提供する。本発明の修飾型の核酸は、ペプチド、ポリペプチドまたは複数のタンパク質をコードすることができる。コードされた分子は、治療薬および診断用薬のうち少なくともいずれかとして使用されうる。
天然に存在するＲＮＡは４つの基本的なリボヌクレオチドすなわちＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰおよびＧＴＰから合成されるが、転写後に修飾されたヌクレオチドを含む場合もある。さらに、およそ１００個の異なるヌクレオシド修飾物がＲＮＡにおいて同定されている（非特許文献１）。しかしながら、ＲＮＡの免疫刺激能および翻訳効率に対するヌクレオシド修飾物の役割は明らかではない。
従来のタンパク質発現達成の方法論には数多くの問題がある。例えば、細胞内へ導入された異種ＤＮＡは、娘細胞（該異種ＤＮＡが染色体に組込まれているかどうかに関わらない）または子孫によって受け継がれる可能性がある。導入されたＤＮＡはある頻度で宿主細胞ゲノムＤＮＡに組込まれ、結果として宿主細胞ゲノムＤＮＡへの変質作用および損傷のうち少なくともいずれかをもたらす可能性がある。加えて、タンパク質が作られる前には複数のステップを経なければならない。細胞内部に入ると、ＤＮＡは、ＲＮＡへと転写される場所である核の中へ輸送されなければならない。その後、ＤＮＡから転写されたＲＮＡは、タンパク質へと翻訳される場所である細胞質に入らなければならない。このように複数の処理ステップを必要とすることから、対象とするタンパク質が生成される前に遅延時間が生じる。さらに、細胞内でＤＮＡ発現を達成するのは難しく；多くの場合、ＤＮＡは細胞に入るが発現されないかまたは妥当な速度もしくは濃度では発現されない。これは、ＤＮＡが初代細胞または改変細胞株のような細胞に導入される場合は特に問題となりうる。
ロゼンスキー（Ｒｏｚｅｎｓｋｉ）、Ｊ、クレイン（Ｃｒａｉｎ）、Ｐおよびマックロスキー（ＭｃＣｌｏｓｋｅｙ）、Ｊ．、「ＲＮＡ修飾データベース：１９９９年版（Ｔｈｅ ＲＮＡ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｄａｔａｂａｓｅ： １９９９ ｕｐｄａｔｅ．）」、ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ）、１９９９年、第２７巻、ｐ．１９６−１９７
核酸の細胞内翻訳の変調に取り組むための生物学的手法が当分野において必要とされている。
発明の概要
本開示はとりわけ、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｅｘ ｖｉｖｏのいずれにおいても細胞集団に導入された時に先天性免疫応答の低減を示すことができる、修飾ヌクレオシド、修飾ヌクレオチド、および修飾核酸を提供する。
本発明はポリヌクレオチドを提供し、該ポリヌクレオチドは単離ポリヌクレオチドであってもよいし精製ポリヌクレオチドであってもよい。これらのポリヌクレオチドは、１以上の対象とするポリペプチドをコードし、かつ、Ａ、Ｇ、ＵまたはＣのヌクレオシドまたはヌクレオチドの化学構造と比較して修飾がなされた少なくとも１つのヌクレオシドまたはヌクレオチドを含んでなる、ｎ個の連結したヌクレオシドまたはヌクレオチドの配列を含んでなることができる。該ポリヌクレオチドはさらに、少なくとも１つのコザック配列を含んでなる５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、および少なくとも１つの５’キャップ構造も含みうる。該単離ポリヌクレオチドはポリＡテールをさらに含んでもよく、精製されてもよい。
本発明の単離ポリヌクレオチドはさらに、Ｃａｐ０、Ｃａｐ１、ＡＲＣＡ、イノシン、Ｎ１‐メチル‐グアノシン、２’フルオロ‐グアノシン、７‐デアザ‐グアノシン、８‐オキソ‐グアノシン、２‐アミノ‐グアノシン、ＬＮＡ‐グアノシン、および２‐アジド‐グアノシンで構成されている群から選択された少なくとも１つの５’キャップ構造も含んでなる。
本発明のポリヌクレオチドの修飾は、該ポリヌクレオチドを構成しているヌクレオシドの塩基に対するもの、およびヌクレオシドの糖部分に対するもののうち少なくともいずれかであってよい。
いくつかの実施形態では、修飾は核酸塩基に対するものであり、プソイドウリジンまたはＮ１‐メチルプソイドウリジンで構成されている群から選択される。
いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオシドはプソイドウリジン（Ψ）でも５‐メチル‐シチジン（ｍ５Ｃ）でもない。
いくつかの実施形態では、複数の修飾が、修飾核酸中に、または１つ以上の個々のヌクレオシドもしくはヌクレオチド中に、含まれる。例えば、ヌクレオシドに対する修飾は、核酸塩基および糖に対する１つ以上の修飾を含みうる。
いくつかの実施形態では、修飾ポリヌクレオチドの調製のための新規な構成単位、例えばヌクレオシドおよびヌクレオチド、ならびにそれらの合成および製造の方法が提供される。
本発明はさらに、本明細書中に記載された修飾ポリヌクレオチドを含んでなる医薬組成物も提供する。これらはまた、溶媒、水性溶媒、非水性溶媒、分散媒、希釈剤、分散物、懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘剤または乳化剤、防腐剤、脂質、リピドイド リポソーム、脂質ナノ粒子、コア・シェル型ナノ粒子、ポリマー、リポプレックス（ｌｉｐｏｐｌｅｘｅ） ペプチド、タンパク質、細胞、ヒアルロニダーゼ、およびこれらの混合物から選択された１つ以上の薬学的に許容可能な添加剤を含む。
本発明のポリヌクレオチドおよび修飾核酸を使用する方法も提供される。この事例では、ポリヌクレオチド（ｐｏｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）は、当分野で周知の任意の手段によって調合可能であり、皮内、皮下、または筋肉内の手段による注射を含むいくつかの経路のうち任意の経路を介して投与されうる。
本発明（ｉｎｖｅｎｔｉｎ）の修飾核酸の投与は２以上の均等または不均等な分割用量によってなされることもできる。いくつかの実施形態では、分割用量のポリヌクレオチドの投与によって対象者により産生されるポリペプチドのレベルは、単回投与としての同じ１日総用量のポリヌクレオチドの投与によって産生されるレベルよりも大きい。
修飾核酸またはコードされたポリペプチドの検出は、対象者または患者の体液中で実施されてもよく、体液は、末梢血、血清、血漿、腹水、尿、脳脊髄液（ＣＳＦ）、痰、唾液、骨髄、関節液、眼房水、羊水、耳垢、乳汁、気管支肺胞（ｂｒｏｎｃｈｅｏａｌｖｅｏｌａｒ）洗浄液、精液、前立腺液、カウパー腺液すなわち尿道球腺液、汗、糞便、体毛、涙、嚢胞液、胸膜液および腹膜液、囲心腔液、リンパ液、び汁、乳び、胆汁、間質液、月経分泌物、膿、皮脂、嘔吐物、膣分泌物、粘膜分泌物、水様便（ｓｔｏｏｌ ｗａｔｅｒ）、膵液、副鼻腔由来の洗浄液、気管支肺吸引液、胚盤胞腔（ｂｌａｓｔｏｃｙｌ ｃａｖｉｔｙ）液、ならびに臍帯血から構成されている群から選択される。
いくつかの実施形態では、投与は、数時間、数日間、数週間、数か月間、または数年間にわたって行われる投薬レジメンに従い、マルチニードル式注入システム、カテーテルまたはルーメンシステム、および超音波式、電気式または放射線を用いるシステムから選択された１つ以上のデバイスを使用して行われうる。
別途定義のないかぎり、本明細書において使用される技術用語および科学用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。方法および材料は、本開示内容における使用について本明細書中に記載されているが；当分野において周知の他の適切な方法および材料も使用することができる。材料、方法、および実施例は単なる例証であり、限定を意図するものではない。本明細書において言及された出版刊行物、特許出願、特許、配列、データベースエントリ、およびその他の参照文献は全て、参照によってその全体が本願に組み込まれる。矛盾が生じる場合には、定義を含めて本明細書に従うものとする。
本開示内容のその他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および図面から、また特許請求の範囲から明白となろう。
前記およびその他の目的、特徴および利点は、添付図面に例証されるように、本発明の特定の実施形態についての以降の説明から明白となるが、添付図面においては同様の参照符号は様々な図の全体を通じて同一の部分を指している。図面は必ずしも原寸に比例せず、むしろ本発明の様々な実施形態の原則を例証することに重点が置かれている。
Ｎ４‐Ｍｅ‐ＣＴＰ（化合物１のＮＴＰ）についての解析結果のスペクトルおよびグラフであって、ＤＭＳＯ中における核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルを提示する図。 Ｎ４‐Ｍｅ‐ＣＴＰ（化合物１のＮＴＰ）についての解析結果のスペクトルおよびグラフであって、Ｄ２Ｏ中におけるＮＭＲスペクトルを提示する図。 Ｎ４‐Ｍｅ‐ＣＴＰ（化合物１のＮＴＰ）についての解析結果のスペクトルおよびグラフであって、質量分析（ＭＳ）結果を提示する図。 Ｎ４‐Ｍｅ‐ＣＴＰ（化合物１のＮＴＰ）についての解析結果のスペクトルおよびグラフであって、Ｎ４‐メチルシチジン（Ｎ４‐Ｍｅ‐シチジン、化合物１）についての高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）の結果を示す図。 Ｎ４‐Ｍｅ‐ＣＴＰ（化合物１のＮＴＰ）についてのＨＰＬＣの結果を示す図。 ２’‐ＯＭｅ‐Ｎ，Ｎ‐ジ‐Ｍｅ‐ＣＴＰ（化合物２のＮＴＰ）についての解析結果を示す図であって、ＮＭＲスペクトルを提供する図。 ２’‐ＯＭｅ‐Ｎ，Ｎ‐ジ‐Ｍｅ‐ＣＴＰ（化合物２のＮＴＰ）についての解析結果を示す図であって、ＭＳの結果を提供する図。 ２’‐ＯＭｅ‐Ｎ，Ｎ‐ジ‐Ｍｅ‐ＣＴＰ（化合物２のＮＴＰ）についての解析結果を示す図であって、２’‐Ｏ‐メチル‐Ｎ４，Ｎ４‐ジメチルシチジン（２’‐ＯＭｅＮ，Ｎ‐ジ‐Ｍｅ‐シチジン、化合物２）についてのＨＰＬＣ結果を提供する図。 ２’‐ＯＭｅ‐Ｎ，Ｎ‐ジ‐Ｍｅ‐ＣＴＰ（化合物２のＮＴＰ）についてのＨＰＬＣ結果を示す図。 ５‐メトキシカルボニルメトキシ‐ＵＴＰ（化合物３のＮＴＰ）についてのＨＰＬＣ結果を示す図。 ３‐メチルプソイドウリジン（化合物４）の解析結果を示す図であって、３‐メチルプソイドウリジン（化合物４）のＮＭＲスペクトルを提供する図。 ３‐メチルプソイドウリジン（化合物４）の解析結果を示す図であって、３‐メチルプソイドウリジン（化合物４）についてのＨＰＬＣ結果を提供する図。 ５‐ＴＢＤＭＳ‐ＯＣＨ２‐シチジン（化合物６）の解析結果を示す図であって、ＮＭＲスペクトルを提供する図。 ５‐ＴＢＤＭＳ‐ＯＣＨ２‐シチジン（化合物６）の解析結果を示す図であって、ＭＳの結果を提供する図。 ５‐ＴＢＤＭＳ‐ＯＣＨ２‐シチジン（化合物６）の解析結果を示す図であって、５‐ＴＢＤＭＳ‐ＯＣＨ２‐シチジン（化合物６）についてのＨＰＬＣ結果を提供する図。 ５‐トリフルオロメチルウリジン（化合物８）の解析結果を示す図であって、ＮＭＲスペクトルを提供する図。 ５‐トリフルオロメチルウリジン（化合物８）の解析結果を示す図であって、ＭＳの結果を提供する図。 ５‐トリフルオロメチルウリジン（化合物８）の解析結果を示す図であって、５‐トリフルオロメチルウリジン（化合物８）についてのＨＰＬＣ結果を提供する図。 ５‐（メトキシカルボニル）メチルウリジン（化合物９）のＮＭＲスペクトル結果を示す図。 タンパク質（ＧＣＳＦ；線Ｂ）ならびにサイトカイン（インターフェロン‐α（ＩＦＮａ）；線Ａおよび腫瘍壊死因子‐α（ＴＮＦａ）；線Ｃ）の発現の変動を修飾率（％）の関数として示すグラフ。
詳細な説明
本開示は、とりわけ、治療的特性、例えば、限定されるものではないが細胞集団に導入された時に先天性免疫応答の低減を示す、修飾ヌクレオシド、修飾ヌクレオチド、および修飾核酸を提供する。
当分野では、ポリペプチドまたはそのフラグメントをコードする核酸の細胞内翻訳およびプロセシングの効果的な変調を取り巻く無数の障壁に取り組むための治療的手段が必要とされ続けており、そのため本発明者らは、ある種の修飾ｍＲＮＡ配列が、免疫応答を単に回避し（ｅｖａｄｉｎｇ）、免れ（ａｖｏｉｄｉｎｇ）、または縮小することを超える有益性を備えた治療薬としての潜在性を有することを示した。
本発明は、上記の必要性に対して、核酸ベースの化合物またはポリヌクレオチドであって、対象とするポリペプチドをコードし（例えば、修飾ｍＲＮＡ）、かつ、当分野における問題のうち１つ以上を免れる構造的特徴および化学的特徴のうち少なくともいずれか、例えば、構造的かつ機能的統合性を保持しながら核酸ベースの治療薬を最適化し、発現の閾を乗り越え、発現速度、半減期およびタンパク質濃度のうち少なくともいずれかを改善し、タンパク質局在化を最適化し、免疫応答および分解経路のうち少なくともいずれかのような有害な生体応答を免れるのに有用な特徴を有する、化合物またはポリヌクレオチドを提供することにより、取り組むものである。
本明細書中に提示されるのは、一部には、対象とするポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、組織中における安定性およびクリアランスのうち少なくともいずれか、レセプターの取り込みおよび動態のうち少なくともいずれか、組成物の細胞へのアクセス、翻訳機構とのかみ合い、ｍＲＮＡ半減期、翻訳効率、免疫回避、タンパク質産生能、分泌効率（適用可能な場合）、循環系への入り易さ、タンパク質半減期、ならびに、細胞の状態、機能および活性のうち少なくともいずれかの変調、のうち１つ以上を改善するために化学修飾されている、ポリヌクレオチドである。
本発明の修飾型のヌクレオシド、ヌクレオチドおよび核酸、例えば本明細書中に教示された修飾の組み合わせを含むものは、該ヌクレオシド、ヌクレオチドおよび核酸を治療手段としてより適切なものとする優れた特性を有する。
当分野における「全か無か」のモデルは、修飾ｍＲＮＡの治療的有用性に関連した生物学的現象について説明するには極めて不十分であることが明らかとなっている。本発明者らは、タンパク質産生を改善するために、修飾または修飾の組み合わせの性質、修飾率（％）について検討し、かつ特定の修飾ｍＲＮＡの有効性およびリスクのプロファイルを判定するために２以上のサイトカインまたは測定基準について調査すればよいことを明らかにした。
本発明の１つの態様では、修飾ｍＲＮＡの有効性を非修飾物と比較して判定する方法は、本発明の外来核酸の投与によって発現が誘発される１以上のサイトカインの測定および解析を伴う。これらの値は、非修飾型の核酸の投与との比較、またはサイトカイン反応、ＰｏｌｙＩＣ、Ｒ‐８４８もしくは当分野で既知の他の標準物のような標準的測定基準との比較がなされる。
本明細書中で開発された標準的測定基準の一例は、該修飾核酸の投与または該修飾核酸との接触の結果として細胞、組織または生物内で産生された、コードされたポリペプチド（タンパク質）のレベルまたは量と、細胞、組織または生物内で発現が誘発された１つ以上（または一団）のサイトカインのレベルまたは量との比、という尺度である。そのような比は本明細書中ではタンパク質：サイトカイン比または「ＰＣ」比と呼ばれる。ＰＣ比がより高いほど、該修飾核酸（測定されたタンパク質をコードするポリヌクレオチド）はより有効（ｅｆｆｉｃａｃｉｏｉｕｓ）である。本発明の好ましいＰＣ比（サイトカインによる）は、１より大きい値、１０より大きい値、１００より大きい値、１０００より大きい値、１０，０００より大きい値となりうる。異なる構築物または未修飾構築物の修飾核酸より高いＰＣ比を有する修飾核酸が好ましい。
ＰＣ比は、ポリヌクレオチド中に存在する修飾率（％）によってさらに表現されてもよい。例えば、１００％修飾された核酸に対して標準化されて、サイトカイン（もしくはリスク）またはサイトカインプロファイルの関数としてのタンパク質産生が判定されうる。
１つの実施形態では、本発明は、修飾核酸（ポリヌクレオチド）のＰＣ比を比較することにより、任意の特定の修飾ポリヌクレオチドの相対的効力を、化学構造、サイトカインまたは修飾率（％）すべてにわたって判定する方法を提供する。
別の実施形態では、化学修飾されたｍＲＮＡはほぼ無毒かつ非突然変異誘発性である。
１つの実施形態では、該修飾ヌクレオシド、修飾ヌクレオチドおよび修飾核酸は、主溝面が化学修飾されることにより、先天性免疫応答を引き起こす可能性のある主溝結合パートナーの相互作用を妨害することができる。さらに、これらの修飾ヌクレオシド、修飾ヌクレオチドおよび修飾核酸は、生物学的標的に対してペイロード（例えば検出可能な作用薬または治療薬）を送達するために使用することができる。例えば、核酸は、ペイロード（例えば検出可能な作用薬または治療薬）に、核酸塩基または糖部分に取り付けられたリンカーによって共有結合されうる。本明細書中に記載された組成物および方法は、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、細胞外（ｅｘｔｒａｃｅｌｌａｒｌｙ）または細胞内のいずれにおいても、また無細胞アッセイのようなアッセイにおいても、使用することができる。
いくつかの実施形態では、本開示は、主溝と相互作用（例えば結合）するパートナーが核酸と結合するのを妨害するヌクレオチドであって、主溝と相互作用するパートナーに対して低い結合親和性を有するヌクレオチドを含んでなる化合物を提供する。
別の態様では、本開示は、化学修飾を含むヌクレオチドであって、主溝と相互作用するパートナーへの結合が変化したヌクレオチドを提供する。
いくつかの実施形態では、化学修飾は核酸塩基の主溝面上に位置し、該化学修飾は、ピリミジン核酸塩基の原子を、アミン、ＳＨ、アルキル（例えばメチルまたはエチル）、またはハロ（例えばクロロまたはフルオロ）に置き換えまたは置換をなすことを含みうる。
別の態様では、本開示は、ヌクレオチドの糖部分に位置する化学修飾を提供する。
別の態様では、本開示は、核酸のリン酸バックボーンに位置する化学修飾を提供する。
いくつかの実施形態では、化学修飾は、核酸の主溝面上の電気化学的性質を変化させる。
別の態様では、本開示は、化学修飾を含むヌクレオチドであって、細胞の先天性免疫応答を、対応する非修飾核酸によって誘導される細胞の先天性免疫と比較して低減するヌクレオチドを提供する。
別の態様では、本開示は、少なくとも２つのヌクレオチドを含んでなる核酸配列であって、該核酸配列は主溝と相互作用するパートナーが該核酸配列と結合するのを妨害するヌクレオチドを含んでなり、該ヌクレオチドは主溝結合パートナーへの結合親和性が低下している、核酸配列を提供する。
別の態様では、本開示は、本明細書中に記載されるような化合物を含んでなる組成物を提供する。いくつかの実施形態では、組成物は反応混合物である。いくつかの実施形態では、組成物は医薬組成物である。いくつかの実施形態では、組成物は細胞培養物である。いくつかの実施形態では、組成物はＲＮＡポリメラーゼおよびｃＤＮＡ鋳型をさらに含んでなる。いくつかの実施形態では、組成物は、アデノシン、シトシン、グアノシンおよびウラシルで構成されている群から選択されたヌクレオチドをさらに含んでなる。
さらなる態様では、本開示は、生理活性分泌タンパク質を含んでなる医薬調合物を作製する方法であって、本明細書中に記載された方法によって作製された製薬用核酸を用いて第１集団のヒト細胞をトランスフェクションするステップを含んでなり、該分泌タンパク質は第２集団のヒト細胞に対する活性を有する、方法を提供する。
いくつかの実施形態では、分泌タンパク質は、第２集団に存在する少なくとも１個の細胞の表面上のレセプターと相互作用する能力を有する。
いくつかの実施形態では、分泌タンパク質は顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ‐ＣＳＦ）である。
いくつかの実施形態では、第２集団はＧ‐ＣＳＦレセプターを発現する骨髄芽細胞を含む。
ある種の実施形態では、本明細書中に提供されるのは、哺乳動物の対象者の免疫をブーストする１または複数のタンパク質に加えて抗体依存性の細胞毒性（ｃｅｌｌｕｌａｒ ｔｏｘｉｔｉｔｙ）を誘導するタンパク質をコードする翻訳可能な領域を含んでいる１つ以上の修飾核酸を含有する、組み合わせ治療薬である。例えば、提供されるのは、トラスツズマブおよび顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ‐ＣＳＦ）をコードする１つ以上の核酸を含有する治療薬である。特に、そのような組み合わせ治療薬はトラスツズマブに対する誘導抵抗性を獲得したＨｅｒ２＋乳がん患者において有用である。（例えば、アルブレヒト（Ａｌｂｒｅｃｈｔ）、イムノセラピー（Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ）、２０１０年、第２巻、第６号、ｐ．７９５−８を参照されたい）。
１つの実施形態では、本開示の化合物は安定であることが意図される。さらに当然のことであるが、明確にするために別個の実施形態に関して記載されている、本開示のある種の特徴は、単一の実施形態において組み合わせて提供されることも可能である。反対に、簡潔にするために単一の実施形態に関して記載されている本開示の様々な特徴が、別々に、または任意の適切な部分的組み合わせで提供されることも可能である。
［本発明の修飾型のヌクレオチド、ヌクレオシドおよびポリヌクレオチド］
本明細書中では、ヌクレオチド、ヌクレオシドまたはポリヌクレオチド（本発明の核酸、例えばｍＲＮＡ分子など）において、「修飾」、または必要に応じて「修飾された、修飾型の」という用語は、Ａ、Ｇ、ＵまたはＣリボヌクレオチドに関する修飾を指す。一般に、本明細書中では、これらの用語は、天然に存在する５’末端のｍＲＮＡキャップ部分におけるリボヌクレオチド修飾を指すようには意図されない。ポリペプチドでは、「修飾」という用語は、正統的な２０アミノ酸のセット、構成部分（ｍｏｉｅｔｙ））と比較した場合の修飾を指す。
修飾は様々な別個の修飾であってよい。核酸がｍＲＮＡであるいくつかの実施形態では、コード領域、フランキング領域および末端領域のうち少なくともいずれかが、１個、２個またはそれ以上の（任意選択で異なる）ヌクレオシド修飾またはヌクレオチド修飾を含みうる。いくつかの実施形態では、細胞に導入された修飾ポリヌクレオチドは、未修飾のポリヌクレオチドと比較して、細胞内での分解の低減を示すことができる。
ポリヌクレオチドは、任意の有用な修飾、例えば糖、核酸塩基、またはヌクレオシド間結合に対する修飾（例えば、結合しているリン酸に対するもの／ホスホジエステル結合に対するもの／リン酸ジエステルバックボーンに対するもの）を含むことができる。例えば、ポリヌクレオチドの主溝、または核酸塩基の主溝面は、１つ以上の修飾を含んでなることができる。ピリミジン核酸塩基の（例えば主溝面上の）１つ以上の原子は、任意選択で置換されたアミノ、任意選択で置換されたチオール、任意選択で置換されたアルキル（例えばメチルもしくはエチル）、またはハロ（例えばクロロまたはフルオロ）で置き換えまたは置換されてもよい。ある実施形態では、修飾（例えば１つ以上の修飾）は糖およびヌクレオシド間結合の各々に存在する。本発明による修飾は、リボ核酸（ＲＮＡ）の、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）への修飾、例えばリボフラノシル（ｒｉｂｏｆｕｒａｎｙｓｙｌ）環の２’ＯＨの２’Ｈへの置換）、トレオース核酸（ＴＮＡ）への修飾、グリコール核酸（ＧＮＡ）への修飾、ペプチド核酸（ＰＮＡ）への修飾、ロックド核酸（ＬＮＡ）への修飾またはこれらの混成体への修飾であってよい。さらなる修飾は本明細書中に記載されている。
本明細書中に記載されるように、本発明のポリヌクレオチドは、該ポリヌクレオチド（例えばｍＲＮＡ）が導入される細胞の先天性免疫応答をほとんど誘導しない。誘導される先天性免疫応答の特徴には、１）炎症誘発性サイトカインの発現増大、２）細胞内ＰＲＲ（ＲＩＧ‐Ｉ、ＭＤＡ５など）の活性化、および３）タンパク質翻訳における停止もしくは低減、のうち少なくともいずれかが挙げられる。
ある実施形態では、細胞内に導入された修飾核酸分子は細胞内で（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｙ）分解されることが望ましい。例えば、タンパク質産生の正確な時期選択が望まれる場合には、修飾核酸分子の分解は望ましい場合もある。したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、細胞内で指定の方法で作用せしめることが可能な分解ドメインを含有する修飾核酸分子を提供する。別の態様では、本開示は、主溝と相互作用（例えば結合）するパートナーがポリヌクレオチドと結合するのを妨害することができるヌクレオシドまたはヌクレオチド（例えば、修飾ヌクレオチドが未修飾のヌクレオチドと比較して主溝と相互作用するパートナーに対して低い結合親和性を有する場合）を含んでなるポリヌクレオチドを提供する。
ポリヌクレオチドには、任意選択で、他の作用薬（例えばＲＮＡｉ誘導剤、ＲＮＡｉ剤、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、触媒ＤＮＡ、ｔＲＮＡ、三重らせん形成を誘導するＲＮＡ、アプタマー、ベクターなど）が含まれうる。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、１つ以上の修飾型のヌクレオシドまたはヌクレオチドを有する１つ以上のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）（すなわち修飾ｍＲＮＡ分子）を含みうる。これらのポリヌクレオチドの詳細については後述する。
ポリヌクレオチド
本発明のポリヌクレオチドは、対象とするポリペプチドをコードする連結したヌクレオシドの第１の領域、第１の領域の５’末端に位置する第１のフランキング領域、および第１の領域の３’末端に位置する第２のフランキング領域を含む。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば第１の領域、第１のフランキング領域、または第２のフランキング領域）は、式（Ｉａ）もしくは式（Ｉａ‐１）：

またはこれらの薬学的に許容可能な塩もしくは立体異性体を有するｎ個の連結したヌクレオシドを含み、上記式中、ＵはＯ、Ｓ、Ｎ（ＲＵ）ｎｕ、またはＣ（ＲＵ）ｎｕであって、ｎｕは０〜２の整数であり、ＲＵはそれぞれ独立にＨ、ハロ、または任意選択で置換されたアルキルであり；

は単結合であるかまたは存在せず；
Ｒ１’、Ｒ２’、Ｒ１”、Ｒ２”、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５はそれぞれ、存在する場合、独立に、Ｈ、ハロ、ヒドロキシ、チオール、任意選択で置換されたアルキル、任意選択で置換されたアルコキシ、任意選択で置換されたアルケニルオキシ、任意選択で置換されたアルキニルオキシ、任意選択で置換されたアミノアルコキシ、任意選択で置換されたアルコキシアルコキシ、任意選択で置換されたヒドロキシアルコキシ、任意選択で置換されたアミノ、アジド（ａｚｉｄｏ）、任意選択で置換されたアリール、任意選択で置換されたアミノアルキル、任意選択で置換されたアミノアルケニル、任意選択で置換されたアミノアルキニルであるか、または存在せず；Ｒ３とＲ１’、Ｒ１”、Ｒ２’、Ｒ２”、またはＲ５のうち１つ以上との組み合わせ（例えばＲ１’およびＲ３の組み合わせ、Ｒ１”およびＲ３の組み合わせ、Ｒ２’およびＲ３の組み合わせ、Ｒ２”およびＲ３の組み合わせ、またはＲ５およびＲ３の組み合わせ）は、ともに合わさって、任意選択で置換されたアルキレンまたは任意選択で置換されたヘテロアルキレンを形成することが可能であり、かつ、それらが結合している炭素と一緒になって、任意選択で置換されたヘテロシクリル（例えば二環、三環、もしくは四環のヘテロシクリル）を提供することが可能であり；Ｒ５とＲ１’、Ｒ１”、Ｒ２’、またはＲ２”のうち１つ以上との組み合わせ（例えばＲ１’およびＲ５の組み合わせ、Ｒ１”およびＲ５の組み合わせ、Ｒ２’およびＲ５の組み合わせ、またはＲ２”およびＲ５の組み合わせ）は、ともに合わさって、任意選択で置換されたアルキレンまたは任意選択で置換されたヘテロアルキレンを形成することが可能であり、かつ、それらが結合している炭素と一緒になって、任意選択で置換されたヘテロシクリル（例えば二環、三環、もしくは四環のヘテロシクリル）を提供することが可能であり；Ｒ４とＲ１’、Ｒ１”、Ｒ２’、Ｒ２”、Ｒ３、またはＲ５のうち１つ以上との組み合わせは、ともに合わさって、任意選択で置換されたアルキレンまたは任意選択で置換されたヘテロアルキレンを形成することが可能であり、かつ、それらが結合している炭素と一緒になって、任意選択で置換されたヘテロシクリル（例えば二環、三環、もしくは四環のヘテロシクリル）を提供することが可能であり；
ｍ’およびｍ”はそれぞれ独立に０〜３（例えば０〜２、０〜１、１〜３、または１〜２）の整数であり；
Ｙ１、Ｙ２、およびＹ３はそれぞれ独立に、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、‐ＮＲＮ１‐、任意選択で置換されたアルキレン、または任意選択で置換されたヘテロアルキレンであり、前記式中のＲＮ１は、Ｈ、任意選択で置換されたアルキル、任意選択で置換されたアルケニル、任意選択で置換されたアルキニル、任意選択で置換されたアリールであるか、または存在せず；
Ｙ４はそれぞれ独立に、Ｈ、ヒドロキシ、チオール、ボラニル、任意選択で置換されたアルキル、任意選択で置換されたアルケニル、任意選択で置換されたアルキニル、任意選択で置換されたアルコキシ、任意選択で置換されたアルケニルオキシ、任意選択で置換されたアルキニルオキシ、任意選択で置換されたチオアルコキシ、任意選択で置換されたアルコキシアルコキシ、または任意選択で置換されたアミノであり；
Ｙ５はそれぞれ独立に、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、任意選択で置換されたアルキレン（例えばメチレン）、または任意選択で置換されたヘテロアルキレンであり；
ｎは１〜１００，０００の整数であり；かつ
Ｂは核酸塩基（例えばプリン、ピリミジン、またはこれらの誘導体）であり、ＢおよびＲ１’の組み合わせ、ＢおよびＲ２’の組み合わせ、ＢおよびＲ１”の組み合わせ、もしくはＢおよびＲ２”の組み合わせは、それらが結合している炭素と一緒になって、任意選択で二環基（例えば二環のヘテロシクリル）を形成しうるか、または、Ｂ、Ｒ１”、およびＲ３の組み合わせもしくはＢ、Ｒ２”、およびＲ３の組み合わせは、任意選択で三環基もしくは四環基（例えば、本明細書中の式（ＩＩｏ）‐（ＩＩｐ）のような三環もしくは四環のヘテロシクリル）を形成することができる。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは修飾されたリボースを含んでいる。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば第１の領域、第１のフランキング領域、または第２のフランキング領域）は、ｎ個の連結したヌクレオシドであって式（Ｉａ‐２）〜式（Ｉａ‐５）またはその薬学的に許容可能な塩もしくは立体異性体を有するヌクレオシドを含む。

いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば第１の領域、第１のフランキング領域、または第２のフランキング領域）は、式（Ｉｂ）もしくは式（Ｉｂ‐１）：

またはこれらの薬学的に許容可能な塩もしくは立体異性体を有するｎ個の連結したヌクレオシドを含み、上記式中、
ＵはＯ、Ｓ、Ｎ（ＲＵ）ｎｕ、またはＣ（ＲＵ）ｎｕであって、ｎｕは０〜２の整数であり、ＲＵはそれぞれ独立にＨ、ハロ、または任意選択で置換されたアルキルであり；

は単結合であるかまたは存在せず；
Ｒ１、Ｒ３’、Ｒ３”、およびＲ４はそれぞれ独立に、Ｈ、ハロ、ヒドロキシ、任意選択で置換されたアルキル、任意選択で置換されたアルコキシ、任意選択で置換されたアルケニルオキシ、任意選択で置換されたアルキニルオキシ、任意選択で置換されたアミノアルコキシ、任意選択で置換されたアルコキシアルコキシ、任意選択で置換されたヒドロキシアルコキシ、任意選択で置換されたアミノ、アジド、任意選択で置換されたアリール、任意選択で置換されたアミノアルキル、任意選択で置換されたアミノアルケニル、任意選択で置換されたアミノアルキニルであるか、または存在せず；Ｒ１およびＲ３’の組み合わせまたはＲ１およびＲ３”の組み合わせは、一緒になって、任意選択で置換されたアルキレンまたは任意選択で置換されたヘテロアルキレンを形成する（例えばロックド核酸を生じる）ことが可能であり；
Ｒ５はそれぞれ独立に、Ｈ、ハロ、ヒドロキシ、任意選択で置換されたアルキル、任意選択で置換されたアルコキシ、任意選択で置換されたアルケニルオキシ、任意選択で置換されたアルキニルオキシ、任意選択で置換されたアミノアルコキシ、任意選択で置換されたアルコキシアルコキシであるか、または存在せず；
Ｙ１、Ｙ２、およびＹ３はそれぞれ独立に、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、ＮＲＮ１‐、任意選択で置換されたアルキレン、または任意選択で置換されたヘテロアルキレンであり、ＲＮ１は、Ｈ、任意選択で置換されたアルキル、任意選択で置換されたアルケニル、任意選択で置換されたアルキニル、または任意選択で置換されたアリールであり；
Ｙ４はそれぞれ独立に、Ｈ、ヒドロキシ、チオール、ボラニル、任意選択で置換されたアルキル、任意選択で置換されたアルケニル、任意選択で置換されたアルキニル、任意選択で置換されたアルコキシ、任意選択で置換されたアルケニルオキシ、任意選択で置換されたアルキニルオキシ、任意選択で置換されたアルコキシアルコキシ、または任意選択で置換されたアミノであり；
ｎは１〜１００，０００の整数であり；かつ
Ｂは核酸塩基である。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば第１の領域、第１のフランキング領域、または第２のフランキング領域）は、式（Ｉｃ）：

またはその薬学的に許容可能な塩もしくは立体異性体を有するｎ個の連結したヌクレオシドを含み、上記式中、
ＵはＯ、Ｓ、Ｎ（ＲＵ）ｎｕ、またはＣ（ＲＵ）ｎｕであって、ｎｕは０〜２の整数であり、ＲＵはそれぞれ独立にＨ、ハロ、または任意選択で置換されたアルキルであり；

は単結合であるかまたは存在せず；
Ｂ１、Ｂ２およびＢ３はそれぞれ独立に、核酸塩基（例えば本明細書中に記載されるようなプリン、ピリミジン、またはこれらの誘導体）、Ｈ、ハロ、ヒドロキシ、チオール、任意選択で置換されたアルキル、任意選択で置換されたアルコキシ、任意選択で置換されたアルケニルオキシ、任意選択で置換されたアルキニルオキシ、任意選択で置換されたアミノアルコキシ、任意選択で置換されたアルコキシアルコキシ、任意選択で置換されたヒドロキシアルコキシ、任意選択で置換されたアミノ、アジド、任意選択で置換されたアリール、任意選択で置換されたアミノアルキル、任意選択で置換されたアミノアルケニル、または任意選択で置換されたアミノアルキニルであって、Ｂ１、Ｂ２およびＢ３のうち１つだけが核酸塩基であり；
Ｒｂ１、Ｒｂ２、Ｒｂ３、Ｒ３、およびＲ５はそれぞれ独立に、Ｈ、ハロ、ヒドロキシ、チオール、任意選択で置換されたアルキル、任意選択で置換されたアルコキシ、任意選択で置換されたアルケニルオキシ、任意選択で置換されたアルキニルオキシ、任意選択で置換されたアミノアルコキシ、任意選択で置換されたアルコキシアルコキシ、任意選択で置換されたヒドロキシアルコキシ、任意選択で置換されたアミノ、アジド、任意選択で置換されたアリール、任意選択で置換されたアミノアルキル、任意選択で置換されたアミノアルケニル、または任意選択で置換されたアミノアルキニルであり；
Ｙ１、Ｙ２およびＹ３はそれぞれ独立に、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、‐ＮＲＮ１‐、任意選択で置換されたアルキレン、または任意選択で置換されたヘテロアルキレンであって、ＲＮ１は、Ｈ、任意選択で置換されたアルキル、任意選択で置換されたアルケニル、任意選択で置換されたアルキニル、または任意選択で置換されたアリールであり；
Ｙ４はそれぞれ、独立に、Ｈ、ヒドロキシ、チオール、ボラニル、任意選択で置換されたアルキル、任意選択で置換されたアルケニル、任意選択で置換されたアルキニル、任意選択で置換されたアルコキシ、任意選択で置換されたアルケニルオキシ、任意選択で置換されたアルキニルオキシ、任意選択で置換されたチオアルコキシ、任意選択で置換されたアルコキシアルコキシ、または任意選択で置換されたアミノであり；
Ｙ５はそれぞれ、独立に、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、任意選択で置換されたアルキレン（例えばメチレン）、または任意選択で置換されたヘテロアルキレンであり；
ｎは１〜１００，０００の整数であり；かつ
Ｕを含む環は１つ以上の二重結合を含むことができる。
特定の実施形態では、Ｕを含む環は、Ｕ‐ＣＢ３Ｒｂ３間またはＣＢ３Ｒｂ３−ＣＢ２Ｒｂ２間には二重結合を持たない。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば第１の領域、第１のフランキング領域、または第２のフランキング領域）は、式（Ｉｄ）：

またはその薬学的に許容可能な塩もしくは立体異性体を有するｎ個の連結したヌクレオシドを含み、上記式中、ＵはＯ、Ｓ、Ｎ（ＲＵ）ｎｕ、またはＣ（ＲＵ）ｎｕであり、ｎｕは０〜２の整数であり、ＲＵはそれぞれ独立にＨ、ハロ、または任意選択で置換されたアルキルであり；
Ｒ３はそれぞれ独立に、Ｈ、ハロ、ヒドロキシ、チオール、任意選択で置換されたアルキル、任意選択で置換されたアルコキシ、任意選択で置換されたアルケニルオキシ、任意選択で置換されたアルキニルオキシ、任意選択で置換されたアミノアルコキシ、任意選択で置換されたアルコキシアルコキシ、任意選択で置換されたヒドロキシアルコキシ、任意選択で置換されたアミノ、アジド、任意選択で置換されたアリール、任意選択で置換されたアミノアルキル、任意選択で置換されたアミノアルケニル、または任意選択で置換されたアミノアルキニルであり；
Ｙ１、Ｙ２、およびＹ３はそれぞれ独立に、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、‐ＮＲＮ１‐、任意選択で置換されたアルキレン、または任意選択で置換されたヘテロアルキレンであり、ＲＮ１は、Ｈ、任意選択で置換されたアルキル、任意選択で置換されたアルケニル、任意選択で置換されたアルキニル、または任意選択で置換されたアリールであり；
Ｙ４はそれぞれ独立に、Ｈ、ヒドロキシ、チオール、ボラニル、任意選択で置換されたアルキル、任意選択で置換されたアルケニル、任意選択で置換されたアルキニル、任意選択で置換されたアルコキシ、任意選択で置換されたアルケニルオキシ、任意選択で置換されたアルキニルオキシ、任意選択で置換されたチオアルコキシ、任意選択で置換されたアルコキシアルコキシ、または任意選択で置換されたアミノであり；
Ｙ５はそれぞれ独立に、Ｏ、Ｓ、任意選択で置換されたアルキレン（例えばメチレン）、または任意選択で置換されたヘテロアルキレンであり；
ｎは１〜１００，０００の整数であり；かつ
Ｂは核酸塩基（例えばプリン、ピリミジン、またはこれらの誘導体）である。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば第１の領域、第１のフランキング領域、または第２のフランキング領域）は、式（Ｉｅ）：

またはその薬学的に許容可能な塩もしくは立体異性体を有するｎ個の連結したヌクレオシドを含み、
上記式中、Ｕ’およびＵ”はそれぞれ独立に、Ｏ、Ｓ、Ｎ（ＲＵ）ｎｕ、またはＣ（ＲＵ）ｎｕであって、ｎｕは０〜２の整数であり、ＲＵはそれぞれ独立にＨ、ハロ、または任意選択で置換されたアルキルであり；
Ｒ６はそれぞれ独立に、Ｈ、ハロ、ヒドロキシ、チオール、任意選択で置換されたアルキル、任意選択で置換されたアルコキシ、任意選択で置換されたアルケニルオキシ、任意選択で置換されたアルキニルオキシ、任意選択で置換されたアミノアルコキシ、任意選択で置換されたアルコキシアルコキシ、任意選択で置換されたヒドロキシアルコキシ、任意選択で置換されたアミノ、アジド、任意選択で置換されたアリール、任意選択で置換されたアミノアルキル、任意選択で置換されたアミノアルケニル、または任意選択で置換されたアミノアルキニルであり；
Ｙ５’はそれぞれ独立に、Ｏ、Ｓ、任意選択で置換されたアルキレン（例えば、メチレンもしくはエチレン）、または任意選択で置換されたヘテロアルキレンであり；
ｎは１〜１００，０００の整数であり；かつ
Ｂは核酸塩基（例えばプリン、ピリミジン、またはこれらの誘導体）である。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば第１の領域、第１のフランキング領域、または第２のフランキング領域）は、式（Ｉｆ）もしくは式（Ｉｆ‐１）：

またはこれらの薬学的に許容可能な塩もしくは立体異性体を有するｎ個の連結したヌクレオシドを含み、
上記式中、Ｕ’およびＵ”はそれぞれ独立に、Ｏ、Ｓ、Ｎ、Ｎ（ＲＵ）ｎｕ、またはＣ（ＲＵ）ｎｕであって、ｎｕは０〜２の整数であり、ＲＵはそれぞれ独立に、Ｈ、ハロ、または任意選択で置換されたアルキルであり（例えばＵ’はＯでありかつＵ”はＮであり）；

は単結合であるかまたは存在せず；
Ｒ１’、Ｒ２’、Ｒ１”、Ｒ２”、Ｒ３、およびＲ４はそれぞれ、独立に、Ｈ、ハロ、ヒドロキシ、チオール、任意選択で置換されたアルキル、任意選択で置換されたアルコキシ、任意選択で置換されたアルケニルオキシ、任意選択で置換されたアルキニルオキシ、任意選択で置換されたアミノアルコキシ、任意選択で置換されたアルコキシアルコキシ、任意選択で置換されたヒドロキシアルコキシ、任意選択で置換されたアミノ、アジド、任意選択で置換されたアリール、任意選択で置換されたアミノアルキル、任意選択で置換されたアミノアルケニル、任意選択で置換されたアミノアルキニルであるか、または存在せず；Ｒ１’およびＲ３の組み合わせ、Ｒ１”およびＲ３の組み合わせ、Ｒ２’およびＲ３の組み合わせ、またはＲ２”およびＲ３の組み合わせは、一緒になって、任意選択で置換されたアルキレンまたは任意選択で置換されたヘテロアルキレンを形成する（例えばロックド核酸を生じる）ことが可能であり；ｍ’およびｍ”はそれぞれ独立に０〜３（例えば０〜２、０〜１、１〜３、または１〜２）の整数であり；
Ｙ１、Ｙ２、およびＹ３はそれぞれ独立に、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、‐ＮＲＮ１‐、任意選択で置換されたアルキレン、または任意選択で置換されたヘテロアルキレンであり、ＲＮ１は、Ｈ、任意選択で置換されたアルキル、任意選択で置換されたアルケニル、任意選択で置換されたアルキニル、任意選択で置換されたアリールであるか、または存在せず；
Ｙ４はそれぞれ独立に、Ｈ、ヒドロキシ、チオール、ボラニル、任意選択で置換されたアルキル、任意選択で置換されたアルケニル、任意選択で置換されたアルキニル、任意選択で置換されたアルコキシ、任意選択で置換されたアルケニルオキシ、任意選択で置換されたアルキニルオキシ、任意選択で置換されたチオアルコキシ、任意選択で置換されたアルコキシアルコキシ、または任意選択で置換されたアミノであり；
Ｙ５はそれぞれ独立に、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、任意選択で置換されたアルキレン（例えばメチレン）、または任意選択で置換されたヘテロアルキレンであり；
ｎは１〜１００，０００の整数であり；かつ
Ｂは核酸塩基（例えばプリン、ピリミジン、またはこれらの誘導体）である。
ポリヌクレオチドのいくつかの実施形態（例えば、式（Ｉａ）‐（Ｉａ‐５）、（Ｉｂ）‐（Ｉｆ‐１）、（ＩＩａ）‐（ＩＩｐ）、（ＩＩｂ‐１）、（ＩＩｂ‐２）、（ＩＩｃ‐１）‐（ＩＩｃ‐２）、（ＩＩｎ‐１）、（ＩＩｎ‐２）、（ＩＶａ）‐（ＩＶｌ）、および（ＩＸａ）‐（ＩＸｒ））では、Ｕを含む環は１つまたは２つの二重結合を有する。
ポリヌクレオチドのいくつかの実施形態（例えば式（Ｉａ）‐（Ｉａ‐５）、（Ｉｂ）‐（Ｉｆ‐１）、（ＩＩａ）‐（ＩＩｐ）、（ＩＩｂ‐１）、（ＩＩｂ‐２）、（ＩＩｃ‐１）‐（ＩＩｃ‐２）、（ＩＩｎ‐１）、（ＩＩｎ‐２）、（ＩＶａ）‐（ＩＶｌ）、および（ＩＸａ）‐（ＩＸｒ）では、Ｒ１、Ｒ１’、およびＲ１”はそれぞれ、存在する場合はＨである。さらなる実施形態では、Ｒ２、Ｒ２’、およびＲ２”はそれぞれ、存在する場合、独立にＨ、ハロ（例えばフルオロ）、ヒドロキシ、任意選択で置換されたアルコキシ（例えば、メトキシまたはエトキシ）、または任意選択で置換されたアルコキシアルコキシである。特定の実施形態では、アルコキシアルコキシは‐（ＣＨ２）ｓ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＯＲ’であって、前記式中、ｓ１は１〜１０（例えば１〜６または１〜４）の整数であり、ｓ２およびｓ３はそれぞれ独立に０〜１０（例えば０〜４、０〜６、１〜４、１〜６、または１〜１０）の整数であり、Ｒ’はＨまたはＣ１‐２０アルキルである。いくつかの実施形態では、ｓ２は０であり、ｓ１は１または２であり、ｓ３は０または１であり、Ｒ’はＣ１‐６アルキルである。
ポリヌクレオチドのいくつかの実施形態（例えば、式（Ｉａ）‐（Ｉａ‐５）、（Ｉｂ）‐（Ｉｆ）、（ＩＩａ）‐（ＩＩｐ）、（ＩＩｂ‐１）、（ＩＩｂ‐２）、（ＩＩｃ‐１）‐（ＩＩｃ‐２）、（ＩＩｎ‐１）、（ＩＩｎ‐２）、（ＩＶａ）‐（ＩＶｌ）、および（ＩＸａ）‐（ＩＸｒ））では、Ｒ２、Ｒ２’、およびＲ２”はそれぞれ、存在する場合はＨである。さらなる実施形態では、Ｒ１、Ｒ１’、およびＲ１”はそれぞれ、存在する場合、独立に、Ｈ、ハロ（例えばフルオロ）、ヒドロキシ、任意選択で置換されたアルコキシ（例えば、メトキシまたはエトキシ）、または任意選択で置換されたアルコキシアルコキシである。特定の実施形態では、アルコキシアルコキシは‐（ＣＨ２）ｓ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＯＲ’であって、前記式中、ｓ１は１〜１０（例えば１〜６または１〜４）の整数であり、ｓ２およびｓ３はそれぞれ独立に０〜１０（例えば０〜４、０〜６、１〜４、１〜６、または１〜１０）の整数であり、Ｒ’はＨまたはＣ１‐２０アルキルである。いくつかの実施形態では、ｓ２は０であり、ｓ１は１または２であり、ｓ３は０または１であり、Ｒ’はＣ１‐６アルキルである。
ポリヌクレオチドのいくつかの実施形態（例えば、式（Ｉａ）‐（Ｉａ‐５）、（Ｉｂ）‐（Ｉｆ‐１）、（ＩＩａ）‐（ＩＩｐ）、（ＩＩｂ‐１）、（ＩＩｂ‐２）、（ＩＩｃ‐１）‐（ＩＩｃ‐２）、（ＩＩｎ‐１）、（ＩＩｎ‐２）、（ＩＶａ）‐（ＩＶｌ）、および（ＩＸａ）‐（ＩＸｒ））では、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５はそれぞれ独立に、Ｈ、ハロ（例えばフルオロ）、ヒドロキシ、任意選択で置換されたアルキル、任意選択で置換されたアルコキシ（例えば、メトキシまたはエトキシ）、または任意選択で置換されたアルコキシアルコキシである。特定の実施形態では、Ｒ３はＨであり、Ｒ４はＨであり、Ｒ５はＨである、すなわちＲ３、Ｒ４およびＲ５はすべてＨである。特定の実施形態では、Ｒ３はＣ１‐６アルキルであり、Ｒ４はＣ１‐６アルキルであり、Ｒ５はＣ１‐６アルキルである、すなわちＲ３、Ｒ４、およびＲ５はすべてＣ１‐６アルキルである。特定の実施形態では、Ｒ３およびＲ４はいずれもＨであり、Ｒ５はＣ１‐６アルキルである。
ポリヌクレオチドのいくつかの実施形態（例えば、式（Ｉａ）‐（Ｉａ‐５）、（Ｉｂ）‐（Ｉｆ‐１）、（ＩＩａ）‐（ＩＩｐ）、（ＩＩｂ‐１）、（ＩＩｂ‐２）、（ＩＩｃ‐１）‐（ＩＩｃ‐２）、（ＩＩｎ‐１）、（ＩＩｎ‐２）、（ＩＶａ）‐（ＩＶｌ）、および（ＩＸａ）‐（ＩＸｒ））では、Ｒ３およびＲ５は、ともに合わさって、任意選択で置換されたアルキレンまたは任意選択で置換されたヘテロアルキレンを形成し、かつ、それらが結合している炭素と一緒になって、任意選択で置換されたヘテロシクリル（例えば二環、三環、または四環のヘテロシクリル）、例えばトランス‐３’，４’アナログ体であって、Ｒ３およびＲ５がともに合わさってヘテロアルキレン（例えば‐（ＣＨ２）ｂ１Ｏ（ＣＨ２）ｂ２Ｏ（ＣＨ２）ｂ３‐、式中のｂ１、ｂ２およびｂ３はそれぞれ独立に０〜３の整数）を形成するものを提供する。
ポリヌクレオチドのいくつかの実施形態（例えば、式（Ｉａ）‐（Ｉａ‐５）、（Ｉｂ）‐（Ｉｆ‐１）、（ＩＩａ）‐（ＩＩｐ）、（ＩＩｂ‐１）、（ＩＩｂ‐２）、（ＩＩｃ‐１）‐（ＩＩｃ‐２）、（ＩＩｎ‐１）、（ＩＩｎ‐２）、（ＩＶａ）‐（ＩＶｌ）、および（ＩＸａ）‐（ＩＸｒ））では、Ｒ３と、Ｒ１’、Ｒ１”、Ｒ２’、Ｒ２”、またはＲ５のうち１つ以上とは、ともに合わさって、任意選択で置換されたアルキレンまたは任意選択で置換されたヘテロアルキレンを形成し、かつ、それらが結合している炭素と一緒になって、任意選択で置換されたヘテロシクリル（例えば二環、三環、または四環のヘテロシクリル）を形成し、Ｒ３と、Ｒ１’、Ｒ１”、Ｒ２’、Ｒ２”、またはＲ５のうち１つ以上とは、ともに合わさってヘテロアルキレン（例えば‐（ＣＨ２）ｂ１Ｏ（ＣＨ２）ｂ２Ｏ（ＣＨ２）ｂ３‐、式中のｂ１、ｂ２およびｂ３はそれぞれ独立に０〜３の整数である）を提供する。
ポリヌクレオチドのいくつかの実施形態（例えば、式（Ｉａ）‐（Ｉａ‐５）、（Ｉｂ）‐（Ｉｆ‐１）、（ＩＩａ）‐（ＩＩｐ）、（ＩＩｂ‐１）、（ＩＩｂ‐２）、（ＩＩｃ‐１）‐（ＩＩｃ‐２）、（ＩＩｎ‐１）、（ＩＩｎ‐２）、（ＩＶａ）‐（ＩＶｌ）、および（ＩＸａ）‐（ＩＸｒ））では、Ｒ５と、Ｒ１’、Ｒ１”、Ｒ２’、またはＲ２”のうち１つ以上とは、ともに合わさって、任意選択で置換されたアルキレンまたは任意選択で置換されたヘテロアルキレンを形成し、かつ、それらが結合している炭素と一緒になって、任意選択で置換されたヘテロシクリル（例えば二環、三環、または四環のヘテロシクリル）を形成し、Ｒ５と、Ｒ１’、Ｒ１”、Ｒ２’、またはＲ２”のうち１つ以上とは、ともに合わさってヘテロアルキレン（例えば‐（ＣＨ２）ｂ１Ｏ（ＣＨ２）ｂ２Ｏ（ＣＨ２）ｂ３‐、式中のｂ１、ｂ２およびｂ３はそれぞれ独立に０〜３の整数である）を提供する。
ポリヌクレオチドのいくつかの実施形態（例えば、式（Ｉａ）‐（Ｉａ‐５）、（Ｉｂ）‐（Ｉｆ‐１）、（ＩＩａ）‐（ＩＩｐ）、（ＩＩｂ‐１）、（ＩＩｂ‐２）、（ＩＩｃ‐１）‐（ＩＩｃ‐２）、（ＩＩｎ‐１）、（ＩＩｎ‐２）、（ＩＶａ）‐（ＩＶｌ）、および（ＩＸａ）‐（ＩＸｒ））では、Ｙ２はそれぞれ独立に、Ｏ、Ｓ、または‐ＮＲＮ１‐であって、ＲＮ１は、Ｈ、任意選択で置換されたアルキル、任意選択で置換されたアルケニル、任意選択で置換されたアルキニル、または任意選択で置換されたアリールである。特定の実施形態では、Ｙ２はＮＲＮ１‐であって、ＲＮ１はＨまたは任意選択で置換されたアルキル（例えば、メチル、エチル、イソプロピルまたはｎ‐プロピルのようなＣ１−６アルキル）である。
ポリヌクレオチドのいくつかの実施形態（例えば、式（Ｉａ）‐（Ｉａ‐５）、（Ｉｂ）‐（Ｉｆ‐１）、（ＩＩａ）‐（ＩＩｐ）、（ＩＩｂ‐１）、（ＩＩｂ‐２）、（ＩＩｃ‐１）‐（ＩＩｃ‐２）、（ＩＩｎ‐１）、（ＩＩｎ‐２）、（ＩＶａ）‐（ＩＶｌ）、および（ＩＸａ）‐（ＩＸｒ））では、Ｙ３はそれぞれ独立に、ＯまたはＳである。
ポリヌクレオチドのいくつかの実施形態（例えば、式（Ｉａ）‐（Ｉａ‐５）、（Ｉｂ）‐（Ｉｆ‐１）、（ＩＩａ）‐（ＩＩｐ）、（ＩＩｂ‐１）、（ＩＩｂ‐２）、（ＩＩｃ‐１）‐（ＩＩｃ‐２）、（ＩＩｎ‐１）、（ＩＩｎ‐２）、（ＩＶａ）‐（ＩＶｌ）、および（ＩＸａ）‐（ＩＸｒ））では、Ｒ１はＨであり；Ｒ２はそれぞれ独立に、Ｈ、ハロ（例えばフルオロ）、ヒドロキシ、任意選択で置換されたアルコキシ（例えば、メトキシまたはエトキシ）、または任意選択で置換されたアルコキシアルコキシ（例えば‐（ＣＨ２）ｓ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＯＲ’であって、ｓ１は１〜１０（例えば１〜６または１〜４）の整数であり、ｓ２およびｓ３はそれぞれ独立に、０〜１０（例えば０〜４、０〜６、１〜４、１〜６、または１〜１０）の整数であり、Ｒ’は、ＨまたはＣ１‐２０アルキルであって、例えば、ｓ２は０、ｓ１は１または２、ｓ３は０または１、およびＲ’はＣ１‐６アルキルであり）；Ｙ２はそれぞれ独立に、Ｏまたは‐ＮＲＮ１‐であって、ＲＮ１は、Ｈ、任意選択で置換されたアルキル、任意選択で置換されたアルケニル、任意選択で置換されたアルキニル、または任意選択で置換されたアリールであり（例えば、ＲＮ１はＨまたは任意選択で置換されたアルキル（例えばメチル、エチル、イソプロピル、またはｎ‐プロピルのようなＣ１−６アルキル）であり）；かつ、Ｙ３はそれぞれ独立に、ＯまたはＳ（例えばＳ）である。さらなる実施形態では、Ｒ３は、Ｈ、ハロ（例えばフルオロ）、ヒドロキシ、任意選択で置換されたアルキル、任意選択で置換されたアルコキシ（例えばメトキシまたはエトキシ）、または任意選択で置換されたアルコキシアルコキシである。さらに別の実施形態では、Ｙ１はそれぞれ独立に、Ｏまたは‐ＮＲＮ１‐であって、ＲＮ１は、Ｈ、任意選択で置換されたアルキル、任意選択で置換されたアルケニル、任意選択で置換されたアルキニル、または任意選択で置換されたアリールであり（例えば、ＲＮ１はＨまたは任意選択で置換されたアルキル（例えば、メチル、エチル、イソプロピル、またはｎ‐プロピルのようなＣ１−６アルキル）であり）；かつ、Ｙ４はそれぞれ独立に、Ｈ、ヒドロキシ、チオール、任意選択で置換されたアルキル、任意選択で置換されたアルコキシ、任意選択で置換されたチオアルコキシ、任意選択で置換されたアルコキシアルコキシ、または任意選択で置換されたアミノである。
ポリヌクレオチドのいくつかの実施形態（例えば、式（Ｉａ）‐（Ｉａ‐５）、（Ｉｂ）‐（Ｉｆ‐１）、（ＩＩａ）‐（ＩＩｐ）、（ＩＩｂ‐１）、（ＩＩｂ‐２）、（ＩＩｃ‐１）‐（ＩＩｃ‐２）、（ＩＩｎ‐１）、（ＩＩｎ‐２）、（ＩＶａ）‐（ＩＶｌ）、および（ＩＸａ）‐（ＩＸｒ））では、Ｒ１はそれぞれ独立に、Ｈ、ハロ（例えばフルオロ）、ヒドロキシ、任意選択で置換されたアルコキシ（例えば、メトキシまたはエトキシ）、または任意選択で置換されたアルコキシアルコキシ（例えば‐（ＣＨ２）ｓ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＯＲ’であって、ｓ１は１〜１０（例えば１〜６または１〜４）の整数であり、ｓ２およびｓ３はそれぞれ独立に、０〜１０（例えば０〜４、０〜６、１〜４、１〜６、または１〜１０）の整数であり、Ｒ’は、ＨまたはＣ１‐２０アルキルであって、例えば、ｓ２は０、ｓ１は１または２、ｓ３は０または１、およびＲ’はＣ１‐６アルキルであり）；Ｒ２はＨであり；Ｙ２はそれぞれ独立に、Ｏまたは‐ＮＲＮ１‐であって、ＲＮ１は、Ｈ、任意選択で置換されたアルキル、任意選択で置換されたアルケニル、任意選択で置換されたアルキニル、または任意選択で置換されたアリールであり（例えば、ＲＮ１はＨまたは任意選択で置換されたアルキル（例えば、メチル、エチル、イソプロピル、またはｎ‐プロピルのようなＣ１−６アルキル）であり）；かつ、Ｙ３はそれぞれ独立に、ＯまたはＳ（例えばＳ）である。さらなる実施形態では、Ｒ３は、Ｈ、ハロ（例えばフルオロ）、ヒドロキシ、任意選択で置換されたアルキル、任意選択で置換されたアルコキシ（例えばメトキシまたはエトキシ）、または任意選択で置換されたアルコキシアルコキシである。さらに別の実施形態では、Ｙ１はそれぞれ独立に、Ｏまたは‐ＮＲＮ１‐であって、ＲＮ１は、Ｈ、任意選択で置換されたアルキル、任意選択で置換されたアルケニル、任意選択で置換されたアルキニル、または任意選択で置換されたアリールであり（例えば、ＲＮ１はＨまたは任意選択で置換されたアルキル（例えば、メチル、エチル、イソプロピル、またはｎ‐プロピルのようなＣ１−６アルキル）であり）；かつ、Ｙ４はそれぞれ独立に、Ｈ、ヒドロキシ、チオール、任意選択で置換されたアルキル、任意選択で置換されたアルコキシ、任意選択で置換されたチオアルコキシ、任意選択で置換されたアルコキシアルコキシ、または任意選択で置換されたアミノである。
ポリヌクレオチドのいくつかの実施形態（例えば、式（Ｉａ）‐（Ｉａ‐５）、（Ｉｂ）‐（Ｉｆ‐１）、（ＩＩａ）‐（ＩＩｐ）、（ＩＩｂ‐１）、（ＩＩｂ‐２）、（ＩＩｃ‐１）‐（ＩＩｃ‐２）、（ＩＩｎ‐１）、（ＩＩｎ‐２）、（ＩＶａ）‐（ＩＶｌ）、および（ＩＸａ）‐（ＩＸｒ））では、Ｕを含む環は、β‐Ｄ（例えばβ‐Ｄ‐リボ）構造である。
ポリヌクレオチドのいくつかの実施形態（例えば、式（Ｉａ）‐（Ｉａ‐５）、（Ｉｂ）‐（Ｉｆ‐１）、（ＩＩａ）‐（ＩＩｐ）、（ＩＩｂ‐１）、（ＩＩｂ‐２）、（ＩＩｃ‐１）‐（ＩＩｃ‐２）、（ＩＩｎ‐１）、（ＩＩｎ‐２）、（ＩＶａ）‐（ＩＶｌ）、および（ＩＸａ）‐（ＩＸｒ））では、Ｕを含む環は、α‐Ｌ（例えばα‐Ｌ‐リボ）構造である。
ポリヌクレオチドのいくつかの実施形態（例えば、式（Ｉａ）‐（Ｉａ‐５）、（Ｉｂ）‐（Ｉｆ‐１）、（ＩＩａ）‐（ＩＩｐ）、（ＩＩｂ‐１）、（ＩＩｂ‐２）、（ＩＩｃ‐１）‐（ＩＩｃ‐２）、（ＩＩｎ‐１）、（ＩＩｎ‐２）、（ＩＶａ）‐（ＩＶｌ）、および（ＩＸａ）‐（ＩＸｒ））では、１つ以上のＢはプソイドウリジン（Ψ）または５‐メチル‐シチジン（ｍ５Ｃ）ではない。
いくつかの実施形態では、ｎ個のＢの核酸塩基のうち約１０％〜約１００％はΨまたはｍ５Ｃではない（例えば、ｎ個のＢのうち１０％〜２０％、１０％〜３５％、１０％〜５０％、１０％〜６０％、１０％〜７５％、１０％〜９０％、１０％〜９５％、１０％〜９８％、１０％〜９９％、２０％〜３５％、２０％〜５０％、２０％〜６０％、２０％〜７５％、２０％〜９０％、２０％〜９５％、２０％〜９８％、２０％〜９９％、２０％〜１００％、５０％〜６０％、５０％〜７５％、５０％〜９０％、５０％〜９５％、５０％〜９８％、５０％〜９９％、５０％〜１００％、７５％〜９０％、７５％〜９５％、７５％〜９８％、７５％〜９９％、および７５％〜１００％はΨまたはｍ５Ｃではない）。いくつかの実施形態では、ＢはΨまたはｍ５Ｃではない。
ポリヌクレオチドのいくつかの実施形態（例えば、式（Ｉａ）‐（Ｉａ‐５）、（Ｉｂ）‐（Ｉｆ‐１）、（ＩＩａ）‐（ＩＩｐ）、（ＩＩｂ‐１）、（ＩＩｂ‐２）、（ＩＩｃ‐１）‐（ＩＩｃ‐２）、（ＩＩｎ‐１）、（ＩＩｎ‐２）、（ＩＶａ）‐（ＩＶｌ）、および（ＩＸａ）‐（ＩＸｒ））では、Ｂがシトシン、グアニン、ウラシルおよびアデニンから選択された未修飾の核酸塩基である場合、Ｙ１、Ｙ２、またはＹ３のうち少なくとも１つはＯではない。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは修飾型のリボースを含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば第１の領域、第１のフランキング領域、または第２のフランキング領域）は、式（ＩＩａ）‐（ＩＩｃ）：

またはこれらの薬学的に許容可能な塩もしくは立体異性体を有するｎ個の連結したヌクレオシドを含む。特定の実施形態では、ＵはＯまたはＣ（ＲＵ）ｎｕであって、ｎｕは０〜２の整数であり、かつＲＵはそれぞれ独立に、Ｈ、ハロ、または任意選択で置換されたアルキルである（例えば、Ｕは‐ＣＨ２‐または‐ＣＨ‐である）。他の実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５はそれぞれ独立に、Ｈ、ハロ、ヒドロキシ、チオール、任意選択で置換されたアルキル、任意選択で置換されたアルコキシ、任意選択で置換されたアルケニルオキシ、任意選択で置換されたアルキニルオキシ、任意選択で置換されたアミノアルコキシ、任意選択で置換されたアルコキシアルコキシ、任意選択で置換されたヒドロキシアルコキシ、任意選択で置換されたアミノ、アジド、任意選択で置換されたアリール、任意選択で置換されたアミノアルキル、任意選択で置換されたアミノアルケニル、任意選択で置換されたアミノアルキニルであるか、または存在せず（例えば、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立に、Ｈ、ハロ、ヒドロキシ、任意選択で置換されたアルキル、または任意選択で置換されたアルコキシであり；Ｒ３およびＲ４はそれぞれ独立に、Ｈまたは任意選択で置換されたアルキルであり；Ｒ５はＨまたはヒドロキシであり）、かつ

は単結合または二重結合である。
特定の実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば第１の領域、第１のフランキング領域、または第２のフランキング領域）は、式（ＩＩｂ‐１）‐（ＩＩｂ‐２）：

またはこれらの薬学的に許容可能な塩もしくは立体異性体を有するｎ個の連結したヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、ＵはＯまたはＣ（ＲＵ）ｎｕであって、ｎｕは０〜２の整数であり、かつＲＵはそれぞれ独立に、Ｈ、ハロ、または任意選択で置換されたアルキルである（例えば、Ｕは‐ＣＨ２‐または‐ＣＨ‐である）。他の実施形態では、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立に、Ｈ、ハロ、ヒドロキシ、チオール、任意選択で置換されたアルキル、任意選択で置換されたアルコキシ、任意選択で置換されたアルケニルオキシ、任意選択で置換されたアルキニルオキシ、任意選択で置換されたアミノアルコキシ、任意選択で置換されたアルコキシアルコキシ、任意選択で置換されたヒドロキシアルコキシ、任意選択で置換されたアミノ、アジド、任意選択で置換されたアリール、任意選択で置換されたアミノアルキル、任意選択で置換されたアミノアルケニル、任意選択で置換されたアミノアルキニルであるか、または存在しない（例えば、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立に、Ｈ、ハロ、ヒドロキシ、任意選択で置換されたアルキル、または任意選択で置換されたアルコキシ、例えばＨ、ハロ、ヒドロキシ、アルキル、アルコキシである）。特定の実施形態では、Ｒ２はヒドロキシまたは任意選択で置換されたアルコキシ（例えばメトキシ、エトキシ、または本明細書中に記載された任意のもの）である。
特定の実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば第１の領域、第１のフランキング領域、または第２のフランキング領域）は、式（ＩＩｃ‐１）‐（ＩＩｃ‐４）：

またはこれらの薬学的に許容可能な塩もしくは立体異性体を有するｎ個の連結したヌクレオシドを含む。
いくつかの実施形態では、ＵはＯまたはＣ（ＲＵ）ｎｕであって、ｎｕは０〜２の整数であり、かつＲＵはそれぞれ独立に、Ｈ、ハロ、または任意選択で置換されたアルキルである（例えば、Ｕは‐ＣＨ２‐または‐ＣＨ‐である）。いくつかの実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３はそれぞれ独立に、Ｈ、ハロ、ヒドロキシ、チオール、任意選択で置換されたアルキル、任意選択で置換されたアルコキシ、任意選択で置換されたアルケニルオキシ、任意選択で置換されたアルキニルオキシ、任意選択で置換されたアミノアルコキシ、任意選択で置換されたアルコキシアルコキシ、任意選択で置換されたヒドロキシアルコキシ、任意選択で置換されたアミノ、アジド、任意選択で置換されたアリール、任意選択で置換されたアミノアルキル、任意選択で置換されたアミノアルケニル、任意選択で置換されたアミノアルキニルであるか、または存在しない（例えば、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立に、Ｈ、ハロ、ヒドロキシ、任意選択で置換されたアルキル、任意選択で置換されたアルコキシ、例えばＨ、ハロ、ヒドロキシ、アルキル、またはアルコキシであり；かつＲ３はそれぞれ独立に、Ｈまたは任意選択で置換されたアルキルである）。特定の実施形態では、Ｒ２は任意選択で置換されたアルコキシ（例えばメトキシもしくはエトキシ、または本明細書中に記載された任意のもの）である。特定の実施形態では、Ｒ１は任意選択で置換されたアルキルであり、Ｒ２はヒドロキシである。他の実施形態では、Ｒ１はヒドロキシであり、Ｒ２は任意選択で置換されたアルキルである。さらなる実施形態では、Ｒ３は任意選択で置換されたアルキルである。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは非環式の修飾型リボースを含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば第１の領域、第１のフランキング領域、または第２のフランキング領域）は、式（ＩＩｄ）‐（ＩＩｆ）：

またはこれらの薬学的に許容可能な塩もしくは立体異性体を有するｎ個の連結したヌクレオシドを含む。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは非環式の修飾型ヘキシトールを含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば第１の領域、第１のフランキング領域、または第２のフランキング領域）は、式（ＩＩｇ）‐（ＩＩｊ）：

またはこれらの薬学的に許容可能な塩もしくは立体異性体を有するｎ個の連結したヌクレオシドを含む。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、縮小または拡大されたリボース環を有する糖部分を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば第１の領域、第１のフランキング領域、または第２のフランキング領域）は、式（ＩＩｋ）‐（ＩＩｍ）：

またはこれらの薬学的に許容可能な塩もしくは立体異性体を有するｎ個の連結したヌクレオシドを含み、上記式中、Ｒ１’、Ｒ１”、Ｒ２’、およびＲ２”はそれぞれ独立に、Ｈ、ハロ、ヒドロキシ、任意選択で置換されたアルキル、任意選択で置換されたアルコキシ、任意選択で置換されたアルケニルオキシ、任意選択で置換されたアルキニルオキシ、任意選択で置換されたアミノアルコキシ、任意選択で置換されたアルコキシアルコキシであるか、または存在せず；Ｒ２’およびＲ３の組み合わせまたはＲ２”およびＲ３の組み合わせは、一緒になって、任意選択で置換されたアルキレンまたは任意選択で置換されたヘテロアルキレンを形成することができる。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドはロックされた（ｌｏｃｋｅｄ）修飾型リボースを含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば第１の領域、第１のフランキング領域、または第２のフランキング領域）は、式（ＩＩｎ）：

またはその薬学的に許容可能な塩もしくは立体異性体を有するｎ個の連結したヌクレオシドを含み、上記式中、Ｒ３’はＯ、Ｓ、または‐ＮＲＮ１‐であって、ＲＮ１は、Ｈ、任意選択で置換されたアルキル、任意選択で置換されたアルケニル、任意選択で置換されたアルキニル、または任意選択で置換されたアリールであり、Ｒ３”は、任意選択で置換されたアルキレン（例えば、‐ＣＨ２‐、‐ＣＨ２ＣＨ２‐、もしくは‐ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２‐）または任意選択で置換されたヘテロアルキレン（例えば、‐ＣＨ２ＮＨ‐、‐ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ‐、‐ＣＨ２ＯＣＨ２‐、もしくは‐ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２‐）である（例えば、Ｒ３’はＯであり、Ｒ３”は任意選択で置換されたアルキレン（例えば、‐ＣＨ２‐、‐ＣＨ２ＣＨ２‐、もしくは‐ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２‐）である）。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば第１の領域、第１のフランキング領域、または第２のフランキング領域）は、式（ＩＩｎ‐１）‐（ＩＩｎ‐２）：

またはこれらの薬学的に許容可能な塩もしくは立体異性体を有するｎ個の連結したヌクレオシドを含み、上記式中、Ｒ３’はＯ、Ｓ、または‐ＮＲＮ１‐であって、ＲＮ１は、Ｈ、任意選択で置換されたアルキル、任意選択で置換されたアルケニル、任意選択で置換されたアルキニル、または任意選択で置換されたアリールであり、Ｒ３”は、任意選択で置換されたアルキレン（例えば、‐ＣＨ２‐、‐ＣＨ２ＣＨ２‐、もしくは‐ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２‐）または任意選択で置換されたヘテロアルキレン（例えば、‐ＣＨ２ＮＨ‐、‐ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ‐、‐ＣＨ２ＯＣＨ２‐、もしくは‐ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２‐）である（例えば、Ｒ３’はＯであり、Ｒ３”は任意選択で置換されたアルキレン（例えば、‐ＣＨ２‐、‐ＣＨ２ＣＨ２‐、もしくは‐ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２‐）である）。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、四環式ヘテロシクリルを形成するロックされた修飾型リボースを含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば第１の領域、第１のフランキング領域、または第２のフランキング領域）は、式（ＩＩｏ）：

またはその薬学的に許容可能な塩もしくは立体異性体を有するｎ個の連結したヌクレオシドを含み、上記式中、Ｒ１２ａ、Ｒ１２ｃ、Ｔ１’、Ｔ１”、Ｔ２’、Ｔ２”、Ｖ１およびＶ３は本明細書中に記載されたとおりである。
該ポリヌクレオチドの式はいずれも、本明細書中に記載された１つ以上の核酸塩基（例えば式（ｂ１）‐（ｂ４３））を含むことができる。
１つの実施形態では、本発明は、ポリヌクレオチドであって主溝と相互作用するパートナーが該核酸と結合するのを妨害する少なくとも１つのヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチドを、調製する方法であって、該ポリヌクレオチドは、本明細書中に定義されるような式（Ｉａ）：

を有するｎ個のヌクレオシドを含んでなり、該方法は、本明細書中に定義されるような式（ＩＩＩａ）：

の化合物を、
ＲＮＡポリメラーゼ、およびｃＤＮＡ鋳型と反応させることを含んでなる、方法を提供する。
さらなる実施形態では、本発明は、ポリヌクレオチドであって主溝と結合するパートナーが該ポリヌクレオチド配列と結合するのを妨害する少なくとも１つのヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチドを、増幅する方法であって、本明細書中に定義されるような式（ＩＩＩａ）の化合物を、プライマー、ｃＤＮＡ鋳型、およびＲＮＡポリメラーゼと共に反応させることを含んでなる方法を提供する。
１つの実施形態では、本発明は、ポリヌクレオチドであって主溝と相互作用するパートナーが該核酸と結合するのを妨害する少なくとも１つのヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチドを、調製する方法であって、該ポリヌクレオチドは、本明細書中に定義されるような式（Ｉａ‐１）：

を有するｎ個のヌクレオシドを含んでなり、該方法は、本明細書中に定義されるような式（ＩＩＩａ‐１）：

の化合物を、ＲＮＡポリメラーゼ、およびｃＤＮＡ鋳型と反応させることを含んでなる、方法を提供する。
さらなる実施形態では、本発明は、ポリヌクレオチドであって主溝と結合するパートナーが該ポリヌクレオチド配列と結合するのを妨害する少なくとも１つのヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチド（例えば、修飾ｍＲＮＡ分子）を、増幅する方法であって、本明細書中に定義されるような式（ＩＩＩａ‐１）の化合物を、プライマー、ｃＤＮＡ鋳型、およびＲＮＡポリメラーゼと共に反応させることを含んでなる方法を提供する。
１つの実施形態では、本発明は、ポリヌクレオチドであって主溝と相互作用するパートナーが該核酸配列と結合するのを妨害する少なくとも１つのヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチドを、調製する方法であって、該ポリヌクレオチドは、本明細書中に定義されるような式（Ｉａ‐２）：

を有するｎ個のヌクレオシドを含んでなり、該方法は、本明細書中に定義されるような式（ＩＩＩａ‐２）：

の化合物を、ＲＮＡポリメラーゼ、およびｃＤＮＡ鋳型と反応させることを含んでなる、方法を提供する。
さらなる実施形態では、本発明は、ポリヌクレオチドであって主溝と結合するパートナーが該ポリヌクレオチドと結合するのを妨害する少なくとも１つのヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチド（例えば、修飾ｍＲＮＡ分子）を、増幅する方法であって、本明細書中に定義されるような式（ＩＩＩａ‐２）の化合物を、プライマー、ｃＤＮＡ鋳型、およびＲＮＡポリメラーゼと共に反応させることを含んでなる方法を提供する。
いくつかの実施形態では、反応は１回〜約７，０００回反復されうる。本明細書中の実施形態のいずれにおいても、Ｂは式（ｂ１）‐（ｂ４３）の核酸塩基であってよい。
ポリヌクレオチドは、任意選択で、本明細書中に記載されている、５’フランキング領域および３’フランキング領域のうち少なくともいずれかを含むことができる。
修飾型のヌクレオチドおよびヌクレオシド
本発明はさらに、該ポリヌクレオチド（例えば修飾ＲＮＡ（またはｍＲＮＡ）分子）の構成単位、例えば修飾リボヌクレオシド、修飾リボヌクレオチドも含む。例えば、これらの構成単位は本発明のポリヌクレオチドを調製するために有用となりうる。
いくつかの実施形態では、該構成単位分子は、式（ＩＩＩａ）もしくは（ＩＩＩａ‐１）：

またはこれらの薬学的に許容可能な塩もしくは立体異性体を有し、上記式中、置換基は本明細書中に（例えば、式（Ｉａ）および（Ｉａ‐１について））記載されたとおりであり、Ｂがシトシン、グアニン、ウラシルおよびアデニンから選択された未修飾の核酸塩基である場合、Ｙ１、Ｙ２、またはＹ３のうち少なくとも１つはＯではない。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドに組み入れ可能な構成単位分子は、式（ＩＶａ）‐（ＩＶｂ）：

またはこれらの薬学的に許容可能な塩もしくは立体異性体を有し、上記式中、Ｂは本明細書中に記載されたとおりである（例えば、（ｂ１）‐（ｂ４３）のうちいずれかである）。
特定の実施形態では、式（ＩＶａ）または（ＩＶｂ）は、修飾ウラシル（例えば、式（ｂ１）‐（ｂ９）、（ｂ２１）‐（ｂ２３）、および（ｂ２８）‐（ｂ３１）のうちいずれか１つ、例えば式（ｂ１）、（ｂ８）、（ｂ２８）、（ｂ２９）、または（ｂ３０））と組み合わされる。特定の実施形態では、式（ＩＶａ）または（ＩＶｂ）は、修飾シトシン（例えば、式（ｂ１０）‐（ｂ１４）、（ｂ２４）、（ｂ２５）、および（ｂ３２）‐（ｂ３６）のうちのいずれか１つ、例えば式（ｂ１０）または（ｂ３２））と組み合わされる。特定の実施形態では、式（ＩＶａ）または（ＩＶｂ）は、修飾グアニン（例えば、式（ｂ１５）‐（ｂ１７）および（ｂ３７）‐（ｂ４０）のうちのいずれか１つ）と組み合わされる。特定の実施形態では、式（ＩＶａ）または（ＩＶｂ）は、修飾アデニン（例えば、式（ｂ１８）‐（ｂ２０）および（ｂ４１）‐（ｂ４３）のうちのいずれか１つ）と組み合わされる。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドに組み入れ可能な構成単位分子は、式（ＩＶｃ）‐（ＩＶｋ）：

またはこれらの薬学的に許容可能な塩もしくは立体異性体を有し、上記式中、Ｂは本明細書中に記載されたとおりである（例えば、（ｂ１）‐（ｂ４３）のうちいずれかである）。
特定の実施形態では、式（ＩＶｃ）‐（ＩＶｋ）のうちの１つは、修飾ウラシル（例えば、式（ｂ１）‐（ｂ９）、（ｂ２１）‐（ｂ２３）、および（ｂ２８）‐（ｂ３１）のうちいずれか１つ、例えば式（ｂ１）、（ｂ８）、（ｂ２８）、（ｂ２９）、または（ｂ３０））と組み合わされる。
特定の実施形態では、式（ＩＶｃ）‐（ＩＶｋ）のうちの１つは、修飾シトシン（例えば、式（ｂ１０）‐（ｂ１４）、（ｂ２４）、（ｂ２５）、および（ｂ３２）‐（ｂ３６）のうちのいずれか１つ、例えば式（ｂ１０）または（ｂ３２））と組み合わされる。
特定の実施形態では、式（ＩＶｃ）‐（ＩＶｋ）のうちの１つは、修飾グアニン（例えば、式（ｂ１５）‐（ｂ１７）および（ｂ３７）‐（ｂ４０）のうちのいずれか１つ）と組み合わされる。
特定の実施形態では、式（ＩＶｃ）‐（ＩＶｋ）のうちの１つは、修飾アデニン（例えば、式（ｂ１８）‐（ｂ２０）および（ｂ４１）‐（ｂ４３）のうちのいずれか１つ）と組み合わされる。
他の実施形態では、ポリヌクレオチドに組み入れ可能な構成単位分子は、式（Ｖａ）または（Ｖｂ）：

またはこれらの薬学的に許容可能な塩もしくは立体異性体を有し、上記式中、Ｂは本明細書中に記載されたとおりである（例えば、（ｂ１）‐（ｂ４３）のうちいずれかである）。
他の実施形態では、ポリヌクレオチドに組み入れ可能な構成単位分子は、式（ＩＸａ）‐（ＩＸｄ）：

またはこれらの薬学的に許容可能な塩もしくは立体異性体を有し、上記式中、Ｂは本明細書中に記載されたとおりである（例えば、（ｂ１）‐（ｂ４３）のうちいずれかである）。
特定の実施形態では、式（ＩＸａ）‐（ＩＸｄ）のうちの１つは、修飾ウラシル（例えば、式（ｂ１）‐（ｂ９）、（ｂ２１）‐（ｂ２３）、および（ｂ２８）‐（ｂ３１）のうちいずれか１つ、例えば式（ｂ１）、（ｂ８）、（ｂ２８）、（ｂ２９）、または（ｂ３０））と組み合わされる。特定の実施形態では、式（ＩＸａ）‐（ＩＸｄ）のうちの１つは、修飾シトシン（例えば、式（ｂ１０）‐（ｂ１４）、（ｂ２４）、（ｂ２５）、および（ｂ３２）‐（ｂ３６）のうちのいずれか１つ、例えば式（ｂ１０）または（ｂ３２））と組み合わされる。
特定の実施形態では、式（ＩＸａ）‐（ＩＸｄ）のうちの１つは、修飾グアニン（例えば、式（ｂ１５）‐（ｂ１７）および（ｂ３７）‐（ｂ４０）のうちのいずれか１つ）と組み合わされる。
特定の実施形態では、式（ＩＸａ）‐（ＩＸｄ）のうちの１つは、修飾アデニン（例えば、式（ｂ１８）‐（ｂ２０）および（ｂ４１）‐（ｂ４３）のうちのいずれか１つ）と組み合わされる。
他の実施形態では、ポリヌクレオチドに組み入れ可能な構成単位分子は、式（ＩＸｅ）‐（ＩＸｇ）：

またはこれらの薬学的に許容可能な塩もしくは立体異性体を有し、上記式中、Ｂは本明細書中に記載されたとおりである（例えば、（ｂ１）‐（ｂ４３）のうちいずれかである）。
特定の実施形態では、式（ＩＸｅ）‐（ＩＸｇ）のうちの１つは、修飾ウラシル（例えば、式（ｂ１）‐（ｂ９）、（ｂ２１）‐（ｂ２３）、および（ｂ２８）‐（ｂ３１）のうちいずれか１つ、例えば式（ｂ１）、（ｂ８）、（ｂ２８）、（ｂ２９）、または（ｂ３０））と組み合わされる。
特定の実施形態では、式（ＩＸｅ）‐（ＩＸｇ）のうちの１つは、修飾シトシン（例えば、式（ｂ１０）‐（ｂ１４）、（ｂ２４）、（ｂ２５）、および（ｂ３２）‐（ｂ３６）のうちのいずれか１つ、例えば式（ｂ１０）または（ｂ３２））と組み合わされる。
特定の実施形態では、式（ＩＸｅ）‐（ＩＸｇ）のうちの１つは、修飾グアニン（例えば、式（ｂ１５）‐（ｂ１７）および（ｂ３７）‐（ｂ４０）のうちのいずれか１つ）と組み合わされる。
特定の実施形態では、式（ＩＸｅ）‐（ＩＸｇ）のうちの１つは、修飾アデニン（例えば、式（ｂ１８）‐（ｂ２０）および（ｂ４１）‐（ｂ４３）のうちのいずれか１つ）と組み合わされる。
他の実施形態では、ポリヌクレオチドに組み入れ可能な構成単位分子は、式（ＩＸｈ）‐（ＩＸｋ）：

またはこれらの薬学的に許容可能な塩もしくは立体異性体を有し、上記式中、Ｂは本明細書中に記載されたとおりである（例えば、（ｂ１）‐（ｂ４３）のうちいずれかである）。特定の実施形態では、式（ＩＸｈ）‐（ＩＸｋ）のうちの１つは、修飾ウラシル（例えば、式（ｂ１）‐（ｂ９）、（ｂ２１）‐（ｂ２３）、および（ｂ２８）‐（ｂ３１）のうちいずれか１つ、例えば式（ｂ１）、（ｂ８）、（ｂ２８）、（ｂ２９）、または（ｂ３０））と組み合わされる。特定の実施形態では、式（ＩＸｈ）‐（ＩＸｋ）のうちの１つは、修飾シトシン（例えば、式（ｂ１０）‐（ｂ１４）、（ｂ２４）、（ｂ２５）、および（ｂ３２）‐（ｂ３６）のうちのいずれか１つ、例えば式（ｂ１０）または（ｂ３２））と組み合わされる。
特定の実施形態では、式（ＩＸｈ）‐（ＩＸｋ）のうちの１つは、修飾グアニン（例えば、式（ｂ１５）‐（ｂ１７）および（ｂ３７）‐（ｂ４０）のうちのいずれか１つ）と組み合わされる。特定の実施形態では、式（ＩＸｈ）‐（ＩＸｋ）のうちの１つは、修飾アデニン（例えば、式（ｂ１８）‐（ｂ２０）および（ｂ４１）‐（ｂ４３）のうちのいずれか１つ）と組み合わされる。
他の実施形態では、ポリヌクレオチドに組み入れ可能な構成単位分子は、式（ＩＸｌ）‐（ＩＸｒ）：

またはこれらの薬学的に許容可能な塩もしくは立体異性体を有し、上記式中、ｒ１およびｒ２はそれぞれ独立に、０〜５（例えば０〜３、１〜３、または１〜５）の整数であり、Ｂは本明細書中に記載されたとおりである（例えば、（ｂ１）‐（ｂ４３）のうちいずれかである）。
特定の実施形態では、式（ＩＸｌ）‐（ＩＸｒ）のうちの１つは、修飾ウラシル（例えば、式（ｂ１）‐（ｂ９）、（ｂ２１）‐（ｂ２３）、および（ｂ２８）‐（ｂ３１）のうちいずれか１つ、例えば式（ｂ１）、（ｂ８）、（ｂ２８）、（ｂ２９）、または（ｂ３０））と組み合わされる。
特定の実施形態では、式（ＩＸｌ）‐（ＩＸｒ）のうちの１つは、修飾シトシン（例えば、式（ｂ１０）‐（ｂ１４）、（ｂ２４）、（ｂ２５）、および（ｂ３２）‐（ｂ３６）のうちのいずれか１つ、例えば式（ｂ１０）または（ｂ３２））と組み合わされる。
特定の実施形態では、式（ＩＸｌ）‐（ＩＸｒ）のうちの１つは、修飾グアニン（例えば、式（ｂ１５）‐（ｂ１７）および（ｂ３７）‐（ｂ４０）のうちのいずれか１つ）と組み合わされる。特定の実施形態では、式（ＩＸｌ）‐（ＩＸｒ）のうちの１つは、修飾アデニン（例えば、式（ｂ１８）‐（ｂ２０）および（ｂ４１）‐（ｂ４３）のうちのいずれか１つ）と組み合わされる。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドに組み入れ可能な構成単位分子は、以下すなわち：

またはこれらの薬学的に許容可能な塩もしくは立体異性体で構成されている群から選択可能であり、上記式中、ｒはそれぞれ独立に、０〜５（例えば０〜３、１〜３、または１〜５）の整数である。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドに組み入れ可能な構成単位分子は、

またはこれらの薬学的に許容可能な塩もしくは立体異性体で構成されている群から選択可能であり、上記式中、ｒはそれぞれ独立に、０〜５（例えば０〜３、１〜３、または１〜５）の整数であり、ｓ１は本明細書中に記載されたとおりである。
いくつかの実施形態では、核酸（例えばＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ポリヌクレオチド）に組み入れ可能な構成単位分子は、修飾ウリジンである（例えば、



















またはこれらの薬学的に許容可能な塩もしくは立体異性体で構成されている群から選択され、上記式中、Ｙ１、Ｙ３、Ｙ４、Ｙ６およびｒは本明細書中に記載されたとおりである（例えば、ｒはそれぞれ独立に、０〜５、例えば０〜３、１〜３、または１〜５の整数である））。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドに組み入れ可能な構成単位分子は、修飾シチジンである（例えば、







またはこれらの薬学的に許容可能な塩もしくは立体異性体で構成されている群から選択され、上記式中、Ｙ１、Ｙ３、Ｙ４、Ｙ６およびｒは本明細書中に記載されたとおりである（例えば、ｒはそれぞれ独立に、０〜５、例えば０〜３、１〜３、または１〜５の整数である））。例えば、ポリヌクレオチドに組み入れ可能な構成単位分子は、

またはこれらの薬学的に許容可能な塩もしくは立体異性体であってよく、上記式中、ｒはそれぞれ独立に、０〜５（例えば０〜３、１〜３、または１〜５）の整数である。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドに組み入れ可能な構成単位分子は、修飾アデノシンである（例えば、










またはこれらの薬学的に許容可能な塩もしくは立体異性体で構成されている群から選択され、上記式中、Ｙ１、Ｙ３、Ｙ４、Ｙ６およびｒは本明細書中に記載されたとおりである（例えば、ｒはそれぞれ独立に、０〜５、例えば０〜３、１〜３、または１〜５の整数である））。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドに組み入れ可能な構成単位分子は、修飾グアノシンである（例えば、











またはこれらの薬学的に許容可能な塩もしくは立体異性体で構成されている群から選択され、上記式中、Ｙ１、Ｙ３、Ｙ４、Ｙ６およびｒは本明細書中に記載されたとおりである（例えば、ｒはそれぞれ独立に、０〜５、例えば０〜３、１〜３、または１〜５の整数である））。
いくつかの実施形態では、主溝の化学修飾は、（例えばシトシンまたはウラシルのようなピリミジンヌクレオシドについての）環のＣ‐５におけるＣ基の、Ｎを用いた置換（例えば、Ｃ‐５における＞ＣＨ基の、＞ＮＲＮ１基（ＲＮ１はＨまたは任意選択で置換されたアルキルである）を用いた置換）を含むことができる。例えば、ポリヌクレオチドに組み入れ可能な構成単位分子は、

またはこれらの薬学的に許容可能な塩もしくは立体異性体であってよく、上記式中、ｒはそれぞれ独立に、０〜５（例えば０〜３、１〜３、または１〜５）の整数である。
別の実施形態では、主溝の化学修飾は、シトシンのＣ‐５における水素の、ハロ（例えばＢｒ、Ｃｌ、Ｆ、もしくはＩ）または任意選択で置換されたアルキル（例えば、メチル）を用いた置換を含むことができる。例えば、ポリヌクレオチドに組み入れ可能な構成単位分子は、

またはこれらの薬学的に許容可能な塩もしくは立体異性体であってよく、上記式中、ｒはそれぞれ独立に、０〜５（例えば０〜３、１〜３、または１〜５）の整数である。
さらに別の実施形態では、主溝の化学修飾は、Ｃ‐４位のＮＨ２およびＣ‐５位の炭素原子によって形成される縮合環を含むことができる。例えば、ポリヌクレオチドに組み入れ可能な構成単位分子は、

またはその薬学的に許容可能な塩もしくは立体異性体であってよく、上記式中、ｒはそれぞれ独立に、０〜５（例えば０〜３、１〜３、または１〜５）の整数である。
糖の修飾
ポリヌクレオチド（例えば本明細書中に記載されるようなＲＮＡまたはｍＲＮＡ）に組み入れ可能な修飾型のヌクレオシドおよびヌクレオチド（例えば構成単位分子）は、リボ核酸の糖に対して修飾がなされてもよい。例えば、２’水酸基（ＯＨ）は、いくつかの異なる置換基を用いて修飾または置き換えがなされうる。２’位における典型的な置換には、限定するものではないが、Ｈ、ハロ、任意選択で置換されたＣ１‐６アルキル、任意選択で置換されたＣ１‐６アルコキシ、任意選択で置換されたＣ６‐１０アリールオキシ；任意選択で置換されたＣ３‐８シクロアルキル；任意選択で置換されたＣ３‐８シクロアルコキシ；任意選択で置換されたＣ６‐１０アリールオキシ；任意選択で置換されたＣ６‐１０アリール‐Ｃ１‐６アルコキシ、任意選択で置換されたＣ１‐１２（ヘテロシクリル）オキシ；糖（例えばリボース、ペントース、または本明細書中に記載された任意のもの）；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、−Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２ＯＲであって式中のＲはＨまたは任意選択で置換されたアルキルであり、ｎは０〜２０（例えば０〜４、０〜８、０〜１０、０〜１６、１〜４、１〜８、１〜１０、１〜１６、１〜２０、２〜４、２〜８、２〜１０、２〜１６、２〜２０、４〜８、４〜１０、４〜１６、および４〜２０）の整数であるもの；「施錠型（ロックド：ｌｏｃｋｅｄ）」核酸（ＬＮＡ）であって２’‐水酸基が同じリボース糖の４’‐炭素へのＣ１‐６アルキレンまたはＣ１‐６ヘテロアルキレン架橋によって接続されているもの（例示の架橋にはメチレン架橋、プロピレン架橋、エーテル架橋、またはアミノ架橋が挙げられる）；本明細書中に定義されるようなアミノアルキル；本明細書中に定義されるようなアミノアルコキシ；本明細書中に定義されるようなアミノ；ならびに、本明細書中に定義されるようなアミノ酸、が挙げられる。
一般に、ＲＮＡは酸素を有する５員環である糖基リボースを含んでいる。典型的な非限定的修飾ヌクレオチドは、リボースの酸素の（例えばＳ、Ｓｅ、または、メチレンもしくはエチレンのようなアルキレンを用いた）置き換え；二重結合の付加（例えばシクロペンテニルまたはシクロヘキセニルを用いたリボースの置き換え）；リボースの環縮小（例えばシクロブタンまたはオキセタンの４員環を形成）；リボースの環拡大（例えば追加の炭素またはヘテロ原子を有する６員環または７員環、例えばアンヒドロヘキシトール、アルトリトール、マンニトール、シクロヘキサニル、シクロヘキセニルおよびモルホリノであってホスホロアミダートバックボーンも有するものを形成）；多環式の形態（例えば、三環式の形態；ならびに「解錠型（アンロックド：ｕｎｌｏｃｋｅｄ）」の形態、例えばグリコール核酸（ＧＮＡ）（例えばリボースがホスホジエステル結合に取り付けられたグリコールユニットによって置き換えられているＲ‐ＧＮＡまたはＳ‐ＧＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ、リボースがα‐Ｌ‐トレオフラノシル‐（３’→２’）で置き換えられている）、およびペプチド核酸（ＰＮＡ、２‐アミノ‐エチル‐グリシン結合がリボースおよびホスホジエステルのバックボーンに置き換わっている）、を含む。糖基はさらに、リボース中の対応する炭素とは反対の立体化学配置を有する１つ以上の炭素を含むこともできる。したがって、ポリヌクレオチド分子には、糖として例えばアラビノースを含んでいるヌクレオチドが含まれうる。
核酸塩基の修飾
本開示は修飾型のヌクレオシドおよびヌクレオチドを提供する。本明細書中に記載されるように、「ヌクレオシド」とは、糖分子（例えばペントースもしくはリボース）またはその誘導体を有機塩基（例えばプリンもしくはピリミジン）またはその誘導体（本明細書中では「核酸塩基」とも呼ばれる）とともに組み合わせて含んでいる化合物として定義される。本明細書中に記載されるように、「ヌクレオチド」とは、リン酸基を含んでいるヌクレオシドとして定義される。いくつかの実施形態では、本明細書中に記載されるヌクレオシドおよびヌクレオチドは、一般に主溝面において化学修飾されている。典型的な非限定的修飾には、アミノ基、チオール基、アルキル基、ハロ基、または本明細書中に記載された任意のものが含まれる。修飾ヌクレオチドは、本明細書中に記載されるように、任意の有用な方法によって（例えば、１つ以上の修飾型または非天然型のヌクレオシドを含めるために、化学的に、酵素的に、または組換えにより）合成されうる（ｍａｙ ｂｙ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ）。
修飾ヌクレオチドの塩基対合は、標準的なアデノシン‐チミン、アデノシン‐ウラシル、またはグアノシン‐シトシンの塩基対だけでなく、ヌクレオチドおよび非標準的すなわち修飾型の塩基を含んでなる修飾ヌクレオチドのうち少なくともいずれかの間で形成された塩基対も包含し、該塩基対においては、水素結合供与体および水素結合受容体の配置構成により、非標準的な塩基と標準的な塩基との間、または２つの相補的な非標準的な塩基構造の間の水素結合が可能となる。そのような非標準的な塩基対合の一例は、修飾ヌクレオチドであるイノシンと、アデニン、シトシンまたはウラシルとの間の塩基対合である。
修飾型のヌクレオシドおよびヌクレオチドは修飾型の核酸塩基を含むことができる。ＲＮＡに見出される核酸塩基の例は、限定するものではないがアデニン、グアニン、シトシン、およびウラシルである。ＤＮＡに見出される核酸塩基の例は、限定するものではないがアデニン、グアニン、シトシン、およびチミンである。これらの核酸塩基は、強化された特性、例えばヌクレアーゼに対する抵抗、安定性を有するポリヌクレオチド分子を提供するために、修飾または完全な置き換えがなされてもよく、またこれらの特性は、主溝と結合するパートナーによる結合の妨害を通じて現れてもよい。例えば、記載されたヌクレオシドおよびヌクレオチドは、主溝面において化学的に修飾されうる。いくつかの実施形態では、主溝の化学修飾には、アミノ基、チオール基、アルキル基、またはハロ基が含まれうる。
以下の表１は、個々の正統的なヌクレオチドの化学的側面を同定する。円は、それぞれの化学領域を構成している原子を特定している。

いくつかの実施形態では、Ｂは修飾ウラシルである。典型的な修飾ウラシルには、式（ｂ１）‐（ｂ５）：

またはこれらの薬学的に許容可能な塩もしくは立体異性体を有する修飾ウラシルが含まれ、上記式中、

は単結合または二重結合であり；
Ｔ１’、Ｔ１”、Ｔ２’、およびＴ２”はそれぞれ独立に、Ｈ、任意選択で置換されたアルキル、任意選択で置換されたアルコキシ、もしくは任意選択で置換されたチオアルコキシであるか、またはＴ１’およびＴ１”の組み合わせもしくはＴ２’およびＴ２”の組み合わせがともに合わさって（例えばＴ２となって）、Ｏ（オキソ）、Ｓ（チオ）、またはＳｅ（セレノ）を形成し；
Ｖ１およびＶ２はそれぞれ独立に、Ｏ、Ｓ、Ｎ（ＲＶｂ）ｎｖ、またはＣ（ＲＶｂ）ｎｖであって、ｎｖは０〜２の整数であり、ＲＶｂはそれぞれ独立に、Ｈ、ハロ、任意選択で置換されたアミノ酸、任意選択で置換されたアルキル、任意選択で置換されたハロアルキル、任意選択で置換されたアルケニル、任意選択で置換されたアルキニル、任意選択で置換されたアルコキシ、任意選択で置換されたアルケニルオキシ、任意選択で置換されたアルキニルオキシ、任意選択で置換されたヒドロキシアルキル、任意選択で置換されたヒドロキシアルケニル、任意選択で置換されたヒドロキシアルキニル、任意選択で置換されたアミノアルキル（例えば、本明細書中に記載されたいずれかのようなＮ‐保護基、例えばトリフルオロアセチルで置換されたもの）、任意選択で置換されたアミノアルケニル、任意選択で置換されたアミノアルキニル、任意選択で置換されたアシルアミノアルキル（例えば、本明細書中に記載されたいずれかのようなＮ‐保護基、例えばトリフルオロアセチルで置換されたもの）、任意選択で置換されたアルコキシカルボニルアルキル、任意選択で置換されたアルコキシカルボニルアルケニル、任意選択で置換されたアルコキシカルボニルアルキニル、または任意選択で置換されたアルコキシカルボニルアルコキシ（例えば、本明細書中に記載された任意の置換基、例えばアルキルについて（１）‐（２１）から選択された置換基を用いて任意選択で置換されたもの）であり；
Ｒ１０は、Ｈ、ハロ、任意選択で置換されたアミノ酸、ヒドロキシ、任意選択で置換されたアルキル、任意選択で置換されたアルケニル、任意選択で置換されたアルキニル、任意選択で置換されたアミノアルキル、任意選択で置換されたヒドロキシアルキル、任意選択で置換されたヒドロキシアルケニル、任意選択で置換されたヒドロキシアルキニル、任意選択で置換されたアミノアルケニル、任意選択で置換されたアミノアルキニル、任意選択で置換されたアルコキシ、任意選択で置換されたアルコキシカルボニルアルキル、任意選択で置換されたアルコキシカルボニルアルケニル、任意選択で置換されたアルコキシカルボニルアルキニル、任意選択で置換されたアルコキシカルボニルアルコキシ、任意選択で置換されたカルボキシアルコキシ、任意選択で置換されたカルボキシアルキル、または任意選択で置換されたカルバモイルアルキルであり；
Ｒ１１はＨまたは任意選択で置換されたアルキルであり；
Ｒ１２ａは、Ｈ、任意選択で置換されたアルキル、任意選択で置換されたヒドロキシアルキル、任意選択で置換されたヒドロキシアルケニル、任意選択で置換されたヒドロキシアルキニル、任意選択で置換されたアミノアルキル、任意選択で置換されたアミノアルケニル、任意選択で置換されたアミノアルキニル、任意選択で置換されたカルボキシアルキル（例えば、ヒドロキシを用いて任意選択で置換されたもの）、任意選択で置換されたカルボキシアルコキシ、任意選択で置換されたカルボキシアミノアルキル、または任意選択で置換されたカルバモイルアルキルであり；
かつ
Ｒ１２ｃは、Ｈ、ハロ、任意選択で置換されたアルキル、任意選択で置換されたアルコキシ、任意選択で置換されたチオアルコキシ、任意選択で置換されたアミノ、任意選択で置換されたヒドロキシアルキル、任意選択で置換されたヒドロキシアルケニル、任意選択で置換されたヒドロキシアルキニル、任意選択で置換されたアミノアルキル、任意選択で置換されたアミノアルケニル、または任意選択で置換されたアミノアルキニルである。
他の例示の修飾ウラシルには、式（ｂ６）‐（ｂ９）：

またはこれらの薬学的に許容可能な塩もしくは立体異性体を有する修飾ウラシルが含まれ、上記式中、

は単結合または二重結合であり；
Ｔ１’、Ｔ１”、Ｔ２’、およびＴ２”はそれぞれ独立に、Ｈ、任意選択で置換されたアルキル、任意選択で置換されたアルコキシ、もしくは任意選択で置換されたチオアルコキシであるか、またはＴ１’およびＴ１”の組み合わせがともに合わさって（例えばＴ１となって）、もしくはＴ２’およびＴ２”の組み合わせがともに合わさって（例えばＴ２となって）、Ｏ（オキソ）、Ｓ（チオ）、もしくはＳｅ（セレノ）を形成するか、またはＴ１およびＴ２はそれぞれ独立に、Ｏ（オキソ）、Ｓ（チオ）、またはＳｅ（セレノ）であり；
Ｗ１およびＷ２はそれぞれ独立に、Ｎ（ＲＷａ）ｎｗまたはＣ（ＲＷａ）ｎｗであって、ｎｗは０〜２の整数であり、ＲＷａはそれぞれ独立に、Ｈ、任意選択で置換されたアルキル、または任意選択で置換されたアルコキシであり；
Ｖ３はそれぞれ独立に、Ｏ、Ｓ、Ｎ（ＲＶａ）ｎｖ、またはＣ（ＲＶａ）ｎｖであって、ｎｖは０〜２の整数であり、ＲＶａはそれぞれ独立に、Ｈ、ハロ、任意選択で置換されたアミノ酸、任意選択で置換されたアルキル、任意選択で置換されたヒドロキシアルキル、任意選択で置換されたヒドロキシアルケニル、任意選択で置換されたヒドロキシアルキニル、任意選択で置換されたアルケニル、任意選択で置換されたアルキニル、任意選択で置換されたヘテロシクリル、任意選択で置換されたアルクヘテロシクリル（ａｌｋｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｙｌ）、任意選択で置換されたアルコキシ、任意選択で置換されたアルケニルオキシ、または任意選択で置換されたアルキニルオキシ、任意選択で置換されたアミノアルキル（例えば、本明細書中に記載されたいずれかのようなＮ‐保護基、例えばトリフルオロアセチル、もしくはスルホアルキルで置換されたもの）、任意選択で置換されたアミノアルケニル、任意選択で置換されたアミノアルキニル、任意選択で置換されたアシルアミノアルキル（例えば、本明細書中に記載されたいずれかのようなＮ‐保護基、例えばトリフルオロアセチルで置換されたもの）、任意選択で置換されたアルコキシカルボニルアルキル、任意選択で置換されたアルコキシカルボニルアルケニル、任意選択で置換されたアルコキシカルボニルアルキニル、任意選択で置換されたアルコキシカルボニルアシル、任意選択で置換されたアルコキシカルボニルアルコキシ、任意選択で置換されたカルボキシアルキル（例えば、ヒドロキシおよびＯ‐保護基のうち少なくともいずれかを用いて任意選択で置換されたもの）、任意選択で置換されたカルボキシアルコキシ、任意選択で置換されたカルボキシアミノアルキル、または任意選択で置換されたカルバモイルアルキル（例えば、本明細書中に記載された任意の置換基、例えばアルキルについての（１）‐（２１）から選択された置換基を用いて任意選択で置換されたもの）であり、かつ、ＲＶａおよびＲ１２ｃは、それらが結合している炭素原子と一緒になって、任意選択で置換されたシクロアルキル、任意選択で置換されたアリール、または任意選択で置換されたヘテロシクリル（例えば５員環または６員環）を形成することが可能であり；
Ｒ１２ａは、Ｈ、任意選択で置換されたアルキル、任意選択で置換されたヒドロキシアルキル、任意選択で置換されたヒドロキシアルケニル、任意選択で置換されたヒドロキシアルキニル、任意選択で置換されたアミノアルキル、任意選択で置換されたアミノアルケニル、任意選択で置換されたアミノアルキニル、任意選択で置換されたカルボキシアルキル（例えば、ヒドロキシおよびＯ‐保護基のうち少なくともいずれかを用いて任意選択で置換されたもの）、任意選択で置換されたカルボキシアルコキシ、任意選択で置換されたカルボキシアミノアルキル、任意選択で置換されたカルバモイルアルキルであるか、または存在せず；
Ｒ１２ｂは、Ｈ、任意選択で置換されたアルキル、任意選択で置換されたアルケニル、任意選択で置換されたアルキニル、任意選択で置換されたヒドロキシアルキル、任意選択で置換されたヒドロキシアルケニル、任意選択で置換されたヒドロキシアルキニル、任意選択で置換されたアミノアルキル、任意選択で置換されたアミノアルケニル、任意選択で置換されたアミノアルキニル、任意選択で置換されたアルカリール、任意選択で置換されたヘテロシクリル、任意選択で置換されたアルクヘテロシクリル、任意選択で置換されたアミノ酸、任意選択で置換されたアルコキシカルボニルアシル、任意選択で置換されたアルコキシカルボニルアルコキシ、任意選択で置換されたアルコキシカルボニルアルキル、任意選択で置換されたアルコキシカルボニルアルケニル、任意選択で置換されたアルコキシカルボニルアルキニル、任意選択で置換されたアルコキシカルボニルアルコキシ、
任意選択で置換されたカルボキシアルキル（例えば、ヒドロキシおよびＯ‐保護基のうち少なくともいずれかを用いて任意選択で置換されたもの）、任意選択で置換されたカルボキシアルコキシ、任意選択で置換されたカルボキシアミノアルキル、または任意選択で置換されたカルバモイルアルキルであり、
Ｒ１２ｂおよびＴ１’の組み合わせまたはＲ１２ｂおよびＲ１２ｃの組み合わせはともに合わさって任意選択で置換されたヘテロシクリルを形成することが可能であり；かつ
Ｒ１２ｃは、Ｈ、ハロ、任意選択で置換されたアルキル、任意選択で置換されたアルコキシ、任意選択で置換されたチオアルコキシ、任意選択で置換されたアミノ、任意選択で置換されたアミノアルキル、任意選択で置換されたアミノアルケニル、または任意選択で置換されたアミノアルキニルである。
さらなる例示の修飾ウラシルには、式（ｂ２８）‐（ｂ３１）：

またはこれらの薬学的に許容可能な塩もしくは立体異性体を有する修飾ウラシルが含まれ、上記式中、
Ｔ１およびＴ２はそれぞれ独立に、Ｏ（オキソ）、Ｓ（チオ）、またはＳｅ（セレノ）であり；
ＲＶｂ’およびＲＶｂ”はそれぞれ独立に、Ｈ、ハロ、任意選択で置換されたアミノ酸、任意選択で置換されたアルキル、任意選択で置換されたハロアルキル、任意選択で置換されたヒドロキシアルキル、任意選択で置換されたヒドロキシアルケニル、任意選択で置換されたヒドロキシアルキニル、任意選択で置換されたアルケニル、任意選択で置換されたアルキニル、任意選択で置換されたアルコキシ、任意選択で置換されたアルケニルオキシ、任意選択で置換されたアルキニルオキシ、任意選択で置換されたアミノアルキル（例えば、本明細書中に記載されたいずれかのようなＮ‐保護基、例えばトリフルオロアセチル、もしくはスルホアルキルで置換されたもの）、任意選択で置換されたアミノアルケニル、任意選択で置換されたアミノアルキニル、任意選択で置換されたアシルアミノアルキル（例えば、本明細書中に記載されたいずれかのようなＮ‐保護基、例えばトリフルオロアセチルで置換されたもの）、任意選択で置換されたアルコキシカルボニルアルキル、任意選択で置換されたアルコキシカルボニルアルケニル、任意選択で置換されたアルコキシカルボニルアルキニル、任意選択で置換されたアルコキシカルボニルアシル、任意選択で置換されたアルコキシカルボニルアルコキシ、任意選択で置換されたカルボキシアルキル（例えば、ヒドロキシおよびＯ‐保護基のうち少なくともいずれかを用いて任意選択で置換されたもの）、任意選択で置換されたカルボキシアルコキシ、任意選択で置換されたカルボキシアミノアルキル、または任意選択で置換されたカルバモイルアルキル（例えば、本明細書中に記載された任意の置換基、例えばアルキルについての（１）‐（２１）から選択された置換基を用いて任意選択で置換されたもの）であり（例えば、ＲＶｂ’は、任意選択で置換されたアルキル、任意選択で置換されたアルケニル、または任意選択で置換されたアミノアルキル、例えば、本明細書中に記載されたいずれかのようなＮ‐保護基、例えばトリフルオロアセチル、もしくはスルホアルキルで置換されたものであり）；
Ｒ１２ａは、Ｈ、任意選択で置換されたアルキル、任意選択で置換されたカルボキシアミノアルキル、任意選択で置換されたアミノアルキル（例えば、例えば、本明細書中に記載されたいずれかのようなＮ‐保護基、例えばトリフルオロアセチル、もしくはスルホアルキルで置換されたもの）、任意選択で置換されたアミノアルケニル、または任意選択で置換されたアミノアルキニルであり；かつ、
Ｒ１２ｂは、Ｈ、任意選択で置換されたアルキル、任意選択で置換されたアルケニル、任意選択で置換されたアルキニル、任意選択で置換されたヒドロキシアルキル、任意選択で置換されたヒドロキシアルケニル、任意選択で置換されたヒドロキシアルキニル、任意選択で置換されたアミノアルキル、任意選択で置換されたアミノアルケニル、任意選択で置換されたアミノアルキニル（例えば、例えば、本明細書中に記載されたいずれかのようなＮ‐保護基、例えばトリフルオロアセチル、もしくはスルホアルキルで置換されたもの）、任意選択で置換されたアルコキシカルボニルアシル、任意選択で置換されたアルコキシカルボニルアルコキシ、任意選択で置換されたアルコキシカルボニルアルキル、任意選択で置換されたアルコキシカルボニルアルケニル、任意選択で置換されたアルコキシカルボニルアルキニル、任意選択で置換されたアルコキシカルボニルアルコキシ、任意選択で置換されたカルボキシアルコキシ、任意選択で置換されたカルボキシアルキル、または任意選択で置換されたカルバモイルアルキルである。
特定の実施形態では、Ｔ１はＯ（オキソ）であり、Ｔ２はＳ（チオ）またはＳｅ（セレノ）である。他の実施形態では、Ｔ１はＳ（チオ）であり、Ｔ２はＯ（オキソ）またはＳｅ（セレノ）である。いくつかの実施形態では、ＲＶｂ’は、Ｈ、任意選択で置換されたアルキル、または任意選択で置換されたアルコキシである。
他の実施形態では、Ｒ１２ａおよびＲ１２ｂはそれぞれ独立に、Ｈ、任意選択で置換されたアルキル、任意選択で置換されたアルケニル、任意選択で置換されたアルキニル、または任意選択で置換されたヒドロキシアルキルである。特定の実施形態では、Ｒ１２ａはＨである。他の実施形態では、Ｒ１２ａおよびＲ１２ｂはいずれもＨである。
いくつかの実施形態では、Ｒ１２ｂのＲＶｂ’（ＲＶｂ’ ｏｆ Ｒ１２ｂ）はそれぞれ独立に、任意選択で置換されたアミノアルキル（例えば、本明細書中に記載されたいずれかのようなＮ‐保護基、例えばトリフルオロアセチル、もしくはスルホアルキルで置換されたもの）、任意選択で置換されたアミノアルケニル、任意選択で置換されたアミノアルキニル、または任意選択で置換されたアシルアミノアルキル（例えば、本明細書中に記載されたいずれかのようなＮ‐保護基、例えばトリフルオロアセチルで置換されたもの）である。いくつかの実施形態では、任意選択で置換されたアミノアルキルのアミノおよびアルキルのうち少なくともいずれかは、任意選択で置換されたアルキル、任意選択で置換されたアルケニル、任意選択で置換されたスルホアルキル、任意選択で置換されたカルボキシ（例えば、Ｏ‐保護基で置換されたもの）、任意選択で置換されたヒドロキシ（例えば、Ｏ‐保護基で置換されたもの）、任意選択で置換されたカルボキシアルキル（例えば、Ｏ‐保護基で置換されたもの）、任意選択で置換されたアルコキシカルボニルアルキル（例えば、Ｏ‐保護基で置換されたもの）、またはＮ‐保護基のうち１つ以上で置換されている。いくつかの実施形態では、任意選択で置換されたアミノアルキルは、任意選択で置換されたスルホアルキルまたは任意選択で置換されたアルケニルで置換されている。特定の実施形態では、Ｒ１２ａおよびＲＶｂ”はいずれもＨである。特定の実施形態では、Ｔ１はＯ（オキソ）であり、Ｔ２はＳ（チオ）またはＳｅ（セレノ）である。
いくつかの実施形態では、ＲＶｂ’は任意選択で置換されたアルコキシカルボニルアルキルまたは任意選択で置換されたカルバモイルアルキルである。
特定の実施形態では、Ｒ１２ａ、Ｒ１２ｂ、Ｒ１２ｃ、またはＲＶａのための任意選択の置換基は、ポリエチレングリコール基（例えば、‐（ＣＨ２）ｓ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＯＲ’であって、式中のｓ１は１〜１０（例えば１〜６または１〜４）の整数であり、ｓ２およびｓ３はそれぞれ独立に、０〜１０（例えば、０〜４、０〜６、１〜４、１〜６、または１〜１０）の整数であり、かつＲ’はＨもしくはＣ１‐２０アルキルであるもの）；
または、アミノ‐ポリエチレングリコール基（例えば、‐ＮＲＮ１（ＣＨ２）ｓ２（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＮＲＮ１であって、式中のｓ１は１〜１０（例えば１〜６または１〜４）の整数であり、ｓ２およびｓ３はそれぞれ独立に、０〜１０（例えば、０〜４、０〜６、１〜４、１〜６、または１〜１０）の整数であり、かつＲＮ１はそれぞれ独立に、水素または任意選択で置換されたＣ１‐６アルキルであるもの）である。
いくつかの実施形態では、Ｂは修飾シトシンである。典型的な修飾シトシンは、式（ｂ１０）‐（ｂ１４）：

またはこれらの薬学的に許容可能な塩もしくは立体異性体の化合物を含み、上記式中、
Ｔ３’およびＴ３”はそれぞれ独立に、Ｈ、任意選択で置換されたアルキル、任意選択で置換されたアルコキシ、もしくは任意選択で置換されたチオアルコキシであるか、またはＴ３’およびＴ３”の組み合わせがともに合わさって（例えばＴ３となって）、Ｏ（オキソ）、Ｓ（チオ）、もしくはＳｅ（セレノ）を形成し；
Ｖ４はそれぞれ独立に、Ｏ、Ｓ、Ｎ（ＲＶｃ）ｎｖ、またはＣ（ＲＶｃ）ｎｖであって、ｎｖは０〜２の整数であり、ＲＶｃはそれぞれ独立に、Ｈ、ハロ、任意選択で置換されたアミノ酸、任意選択で置換されたアルキル、任意選択で置換されたアルケニル、任意選択で置換されたアルキニル、任意選択で置換されたアルコキシ、任意選択で置換されたアルケニルオキシ、任意選択で置換されたヘテロシクリル、任意選択で置換されたアルクヘテロシクリル、または任意選択で置換されたアルキニルオキシ（例えば、本明細書中に記載された任意の置換基、例えばアルキルについての（１）‐（２１）から選択された置換基を用いて任意選択で置換されたもの）であって、Ｒ１３ｂおよびＲＶｃの組み合わせは、一緒になって、任意選択で置換されたヘテロシクリルを形成することが可能であり；
Ｖ５はそれぞれ独立に、Ｎ（ＲＶｄ）ｎｖ、またはＣ（ＲＶｄ）ｎｖであって、ｎｖは０〜２の整数であり、ＲＶｄはそれぞれ独立に、Ｈ、ハロ、任意選択で置換されたアミノ酸、任意選択で置換されたアルキル、任意選択で置換されたアルケニル、任意選択で置換されたアルキニル、任意選択で置換されたアルコキシ、任意選択で置換されたアルケニルオキシ、任意選択で置換されたヘテロシクリル、任意選択で置換されたアルクヘテロシクリル、または任意選択で置換されたアルキニルオキシ（例えば、本明細書中に記載された任意の置換基、例えばアルキルについての（１）‐（２１）から選択された置換基を用いて任意選択で置換されたもの）（例えば、Ｖ５は‐ＣＨまたはＮ）であり；
Ｒ１３ａおよびＲ１３ｂはそれぞれ独立に、Ｈ、任意選択で置換されたアシル、任意選択で置換されたアシルオキシアルキル、任意選択で置換されたアルキル、または任意選択で置換されたアルコキシであって、Ｒ１３ｂおよびＲ１４の組み合わせは、一緒になって、任意選択で置換されたヘテロシクリルを形成することが可能であり；
Ｒ１４はそれぞれ独立に、Ｈ、ハロ、ヒドロキシ、チオール、任意選択で置換されたアシル、任意選択で置換されたアミノ酸、任意選択で置換されたアルキル、任意選択で置換されたハロアルキル、任意選択で置換されたアルケニル、任意選択で置換されたアルキニル、任意選択で置換されたヒドロキシアルキル（例えば、Ｏ‐保護基で置換されたもの）、任意選択で置換されたヒドロキシアルケニル、任意選択で置換されたヒドロキシアルキニル、任意選択で置換されたアルコキシ、任意選択で置換されたアルケニルオキシ、任意選択で置換されたアルキニルオキシ、任意選択で置換されたアミノアルコキシ、任意選択で置換されたアルコキシアルコキシ、任意選択で置換されたアシルオキシアルキル、任意選択で置換されたアミノ（例えば、‐ＮＨＲであってＲがＨ、アルキル、アリール、もしくはホスホリルであるもの）、アジド、任意選択で置換されたアリール、任意選択で置換されたヘテロシクリル、任意選択で置換されたアルクヘテロシクリル、任意選択で置換されたアミノアルキル、任意選択で置換されたアミノアルケニル、または任意選択で置換されたアミノアルキニルであり；かつ
Ｒ１５およびＲ１６はそれぞれ独立に、Ｈ、任意選択で置換されたアルキル、任意選択で置換されたアルケニル、または任意選択で置換されたアルキニルである。
さらなる例示の修飾シトシンには、式（ｂ３２）‐（ｂ３５）：

またはこれらの薬学的に許容可能な塩もしくは立体異性体を有する修飾シトシンが含まれ、上記式中、
Ｔ１およびＴ３はそれぞれ独立に、Ｏ（オキソ）、Ｓ（チオ）、またはＳｅ（セレノ）であり；
Ｒ１３ａおよびＲ１３ｂはそれぞれ独立に、Ｈ、任意選択で置換されたアシル、任意選択で置換されたアシルオキシアルキル、任意選択で置換されたアルキル、または任意選択で置換されたアルコキシであり、Ｒ１３ｂおよびＲ１４の組み合わせは、一緒になって、任意選択で置換されたヘテロシクリルを形成することが可能であり；
Ｒ１４はそれぞれ独立に、Ｈ、ハロ、ヒドロキシ、チオール、任意選択で置換されたアシル、任意選択で置換されたアミノ酸、任意選択で置換されたアルキル、任意選択で置換されたハロアルキル、任意選択で置換されたアルケニル、任意選択で置換されたアルキニル、任意選択で置換されたヒドロキシアルキル（例えば、Ｏ‐保護基で置換されたもの）、任意選択で置換されたヒドロキシアルケニル、任意選択で置換されたヒドロキシアルキニル、任意選択で置換されたアルコキシ、任意選択で置換されたアルケニルオキシ、任意選択で置換されたアルキニルオキシ、任意選択で置換されたアミノアルコキシ、任意選択で置換されたアルコキシアルコキシ、任意選択で置換されたアシルオキシアルキル、任意選択で置換されたアミノ（例えば、‐ＮＨＲであってＲがＨ、アルキル、アリール、もしくはホスホリルであるもの）、アジド、任意選択で置換されたアリール、任意選択で置換されたヘテロシクリル、任意選択で置換されたアルクヘテロシクリル、任意選択で置換されたアミノアルキル（例えば、ヒドロキシアルキル、アルキル、アルケニル、またはアルキニル）、任意選択で置換されたアミノアルケニル、または任意選択で置換されたアミノアルキニルであり；かつ
Ｒ１５およびＲ１６はそれぞれ独立に、Ｈ、任意選択で置換されたアルキル、任意選択で置換されたアルケニル、または任意選択で置換されたアルキニルである（例えば、Ｒ１５はＨであり、Ｒ１６はＨまたは任意選択で置換されたアルキルである）。
いくつかの実施形態では、Ｒ１５はＨであり、Ｒ１６はＨまたは任意選択で置換されたアルキルである。特定の実施形態では、Ｒ１４はＨ、アシル、またはヒドロキシアルキルである。いくつかの実施形態では、Ｒ１４はハロである。いくつかの実施形態では、Ｒ１４およびＲ１５はいずれもＨである。いくつかの実施形態では、Ｒ１５およびＲ１６はいずれもＨである。いくつかの実施形態では、Ｒ１４およびＲ１５およびＲ１６はそれぞれＨである。さらなる実施形態では、Ｒ１３ａおよびＲ１３ｂはそれぞれ独立に、Ｈまたは任意選択で置換されたアルキルである。
修飾シトシンのさらなる非限定的な例には、式（ｂ３６）：

の化合物またはその薬学的に許容可能な塩もしくは立体異性体が含まれ、上記式中、
Ｒ１３ｂはそれぞれ独立に、Ｈ、任意選択で置換されたアシル、任意選択で置換されたアシルオキシアルキル、任意選択で置換されたアルキル、または任意選択で置換されたアルコキシであり、Ｒ１３ｂおよびＲ１４ｂの組み合わせは、一緒になって、任意選択で置換されたヘテロシクリルを形成することが可能であり；
Ｒ１４ａおよびＲ１４ｂはそれぞれ独立に、Ｈ、ハロ、ヒドロキシ、チオール、任意選択で置換されたアシル、任意選択で置換されたアミノ酸、任意選択で置換されたアルキル、任意選択で置換されたハロアルキル、任意選択で置換されたアルケニル、任意選択で置換されたアルキニル、任意選択で置換されたヒドロキシアルキル（例えば、Ｏ‐保護基で置換されたもの）、任意選択で置換されたヒドロキシアルケニル、任意選択で置換されたアルコキシ、任意選択で置換されたアルケニルオキシ、任意選択で置換されたアルキニルオキシ、任意選択で置換されたアミノアルコキシ、任意選択で置換されたアルコキシアルコキシ、任意選択で置換されたアシルオキシアルキル、任意選択で置換されたアミノ（例えば、‐ＮＨＲであってＲがＨ、アルキル、アリール、ホスホリル、任意選択で置換されたアミノアルキル、もしくは任意選択で置換されたカルボキシアミノアルキルであるもの）、アジド、任意選択で置換されたアリール、任意選択で置換されたヘテロシクリル、任意選択で置換されたアルクヘテロシクリル、任意選択で置換されたアミノアルキル、任意選択で置換されたアミノアルケニル、または任意選択で置換されたアミノアルキニルであり；かつ
Ｒ１５はそれぞれ独立に、Ｈ、任意選択で置換されたアルキル、任意選択で置換されたアルケニル、または任意選択で置換されたアルキニルである。
特定の実施形態では、Ｒ１４ｂは任意選択で置換されたアミノ酸（例えば任意選択で置換されたリジン）である。いくつかの実施形態では、Ｒ１４ａはＨである。
いくつかの実施形態では、Ｂは修飾グアニンである。典型的な修飾グアニンには、式（ｂ１５）‐（ｂ１７）：

の化合物またはこれらの薬学的に許容可能な塩もしくは立体異性体が含まれ、上記式中、
Ｔ４’、Ｔ４”、Ｔ５’、Ｔ５”、Ｔ６’、およびＴ６”はそれぞれ独立に、Ｈ、任意選択で置換されたアルキル、または任意選択で置換されたアルコキシであり、Ｔ４’およびＴ４”の組み合わせ（例えばＴ４として）またはＴ５’およびＴ５”の組み合わせ（例えばＴ５として）またはＴ６’およびＴ６”の組み合わせ（例えばＴ６として）は、ともに合わさってＯ（オキソ）、Ｓ（チオ）、またはＳｅ（セレノ）を形成し；
Ｖ５およびＶ６はそれぞれ独立に、Ｏ、Ｓ、Ｎ（ＲＶｄ）ｎｖ、またはＣ（ＲＶｄ）ｎｖであって、ｎｖは０〜２の整数であり、ＲＶｄはそれぞれ独立に、Ｈ、ハロ、チオール、任意選択で置換されたアミノ酸、シアノ、アミジン、任意選択で置換されたアミノアルキル、任意選択で置換されたアミノアルケニル、任意選択で置換されたアミノアルキニル、任意選択で置換されたアルキル、任意選択で置換されたアルケニル、任意選択で置換されたアルキニル、任意選択で置換されたアルコキシ、任意選択で置換されたアルケニルオキシ、任意選択で置換されたアルキニルオキシ（例えば、本明細書中に記載された任意の置換基、例えばアルキルについての（１）‐（２１）から選択された置換基を用いて任意選択で置換されたもの）、任意選択で置換されたチオアルコキシ、または任意選択で置換されたアミノであり；かつ
Ｒ１７、Ｒ１８、Ｒ１９ａ、Ｒ１９ｂ、Ｒ２１、Ｒ２２、Ｒ２３、およびＲ２４はそれぞれ独立に、Ｈ、ハロ、チオール、任意選択で置換されたアルキル、任意選択で置換されたアルケニル、任意選択で置換されたアルキニル、任意選択で置換されたチオアルコキシ、任意選択で置換されたアミノ、または任意選択で置換されたアミノ酸である。
典型的な修飾グアノシンには、式（ｂ３７）‐（ｂ４０）：

の化合物またはこれらの薬学的に許容可能な塩もしくは立体異性体が含まれ、上記式中、
Ｔ４’はそれぞれ独立に、Ｈ、任意選択で置換されたアルキル、または任意選択で置換されたアルコキシであり、Ｔ４はそれぞれ独立に、Ｏ（オキソ）、Ｓ（チオ）、またはＳｅ（セレノ）であり；
Ｒ１８、Ｒ１９ａ、Ｒ１９ｂ、およびＲ２１はそれぞれ独立に、Ｈ、ハロ、チオール、任意選択で置換されたアルキル、任意選択で置換されたアルケニル、任意選択で置換されたアルキニル、任意選択で置換されたチオアルコキシ、任意選択で置換されたアミノ、または任意選択で置換されたアミノ酸である。
いくつかの実施形態では、Ｒ１８はＨまたは任意選択で置換されたアルキルである。さらなる実施形態では、Ｔ４はオキソである。いくつかの実施形態では、Ｒ１９ａおよびＲ１９ｂはそれぞれ独立に、Ｈまたは任意選択で置換されたアルキルである。
いくつかの実施形態では、Ｂは修飾アデニンである。典型的な修飾アデニンには、式（ｂ１８）‐（ｂ２０）：

の化合物またはこれらの薬学的に許容可能な塩もしくは立体異性体が含まれ、上記式中、
Ｖ７はそれぞれ独立に、Ｏ、Ｓ、Ｎ（ＲＶｅ）ｎｖ、またはＣ（ＲＶｅ）ｎｖであって、ｎｖは０〜２の整数であり、ＲＶｅはそれぞれ独立に、Ｈ、ハロ、任意選択で置換されたアミノ酸、任意選択で置換されたアルキル、任意選択で置換されたアルケニル、任意選択で置換されたアルキニル、任意選択で置換されたアルコキシ、任意選択で置換されたアルケニルオキシ、または任意選択で置換されたアルキニルオキシ（例えば、本明細書中に記載された任意の置換基、例えばアルキルについての（１）‐（２１）から選択された置換基を用いて任意選択で置換されたもの）であり；
Ｒ２５はそれぞれ独立に、Ｈ、ハロ、チオール、任意選択で置換されたアルキル、任意選択で置換されたアルケニル、任意選択で置換されたアルキニル、任意選択で置換されたチオアルコキシ、または任意選択で置換されたアミノであり；
Ｒ２６ａおよびＲ２６ｂはそれぞれ独立に、Ｈ、任意選択で置換されたアシル、任意選択で置換されたアミノ酸、任意選択で置換されたカルバモイルアルキル、任意選択で置換されたアルキル、任意選択で置換されたアルケニル、任意選択で置換されたアルキニル、任意選択で置換されたヒドロキシアルキル、任意選択で置換されたヒドロキシアルケニル、任意選択で置換されたヒドロキシアルキニル、任意選択で置換されたアルコキシ、またはポリエチレングリコール基（例えば、‐（ＣＨ２）ｓ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＯＲ’であって、ｓ１は１〜１０（例えば１〜６または１〜４）の整数であり、ｓ２およびｓ３はそれぞれ独立に、０〜１０（例えば０〜４、０〜６、１〜４、１〜６、または１〜１０）の整数であり、Ｒ’はＨまたはＣ１‐２０アルキルであるもの）；またはアミノ−ポリエチレングリコール基（例えば、‐ＮＲＮ１（ＣＨ２）ｓ２（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＮＲＮ１であって、ｓ１は１〜１０（例えば１〜６または１〜４）の整数であり、ｓ２およびｓ３はそれぞれ独立に、０〜１０（例えば０〜４、０〜６、１〜４、１〜６、または１〜１０）の整数であり、ＲＮ１はそれぞれ独立に、水素または任意選択で置換されたＣ１‐６アルキルであるもの）であり；
Ｒ２７はそれぞれ独立に、Ｈ、任意選択で置換されたアルキル、任意選択で置換されたアルケニル、任意選択で置換されたアルキニル、任意選択で置換されたアルコキシ、任意選択で置換されたチオアルコキシ、または任意選択で置換されたアミノであり；
Ｒ２８はそれぞれ独立に、Ｈ、任意選択で置換されたアルキル、任意選択で置換されたアルケニル、または任意選択で置換されたアルキニルであり；かつ
Ｒ２９はそれぞれ独立に、Ｈ、任意選択で置換されたアシル、任意選択で置換されたアミノ酸、任意選択で置換されたカルバモイルアルキル、任意選択で置換されたアルキル、任意選択で置換されたアルケニル、任意選択で置換されたアルキニル、任意選択で置換されたヒドロキシアルキル、任意選択で置換されたヒドロキシアルケニル、任意選択で置換されたアルコキシ、または任意選択で置換されたアミノである。
典型的な修飾アデニンには、式（ｂ４１）‐（ｂ４３）：

の化合物またはこれらの薬学的に許容可能な塩もしくは立体異性体が含まれ、上記式中、
Ｒ２５はそれぞれ独立に、Ｈ、ハロ、チオール、任意選択で置換されたアルキル、任意選択で置換されたアルケニル、任意選択で置換されたアルキニル、任意選択で置換されたチオアルコキシ、または任意選択で置換されたアミノであり；
Ｒ２６ａおよびＲ２６ｂはそれぞれ独立に、Ｈ、任意選択で置換されたアシル、任意選択で置換されたアミノ酸、任意選択で置換されたカルバモイルアルキル、任意選択で置換されたアルキル、任意選択で置換されたアルケニル、任意選択で置換されたアルキニル、任意選択で置換されたヒドロキシアルキル、任意選択で置換されたヒドロキシアルケニル、任意選択で置換されたヒドロキシアルキニル、任意選択で置換されたアルコキシ、
またはポリエチレングリコール基（例えば、‐（ＣＨ２）ｓ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＯＲ’であって、ｓ１は１〜１０（例えば１〜６または１〜４）の整数であり、ｓ２およびｓ３はそれぞれ独立に、０〜１０（例えば０〜４、０〜６、１〜４、１〜６、または１〜１０）の整数であり、Ｒ’はＨまたはＣ１‐２０アルキルであるもの）；またはアミノ−ポリエチレングリコール基（例えば、‐ＮＲＮ１（ＣＨ２）ｓ２（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＮＲＮ１であって、ｓ１は１〜１０（例えば１〜６または１〜４）の整数であり、ｓ２およびｓ３はそれぞれ独立に、０〜１０（例えば０〜４、０〜６、１〜４、１〜６、または１〜１０）の整数であり、ＲＮ１はそれぞれ独立に、水素または任意選択で置換されたＣ１‐６アルキルであるもの）であり；かつ
Ｒ２７はそれぞれ独立に、Ｈ、任意選択で置換されたアルキル、任意選択で置換されたアルケニル、任意選択で置換されたアルキニル、任意選択で置換されたアルコキシ、任意選択で置換されたチオアルコキシ、または任意選択で置換されたアミノである。
いくつかの実施形態では、Ｒ２６ａはＨであり、Ｒ２６ｂは任意選択で置換されたアルキルである。いくつかの実施形態では、Ｒ２６ａおよびＲ２６ｂはそれぞれ独立に、任意選択で置換されたアルキルである。特定の実施形態では、Ｒ２７は、任意選択で置換されたアルキル、任意選択で置換されたアルコキシ、または任意選択で置換されたチオアルコキシである。他の実施形態では、Ｒ２５は、任意選択で置換されたアルキル、任意選択で置換されたアルコキシ、または任意選択で置換されたチオアルコキシである。
特定の実施形態では、Ｒ２６ａ、Ｒ２６ｂ、またはＲ２９のための任意選択の置換基は、ポリエチレングリコール基（例えば、‐（ＣＨ２）ｓ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＯＲ’であって、ｓ１は１〜１０（例えば１〜６または１〜４）の整数であり、ｓ２およびｓ３はそれぞれ独立に、０〜１０（例えば０〜４、０〜６、１〜４、１〜６、または１〜１０）の整数であり、Ｒ’はＨまたはＣ１‐２０アルキルであるもの）；またはアミノ‐ポリエチレングリコール基（例えば、‐ＮＲＮ１（ＣＨ２）ｓ２（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＮＲＮ１であって、ｓ１は１〜１０（例えば１〜６または１〜４）の整数であり、ｓ２およびｓ３はそれぞれ独立に、０〜１０（例えば０〜４、０〜６、１〜４、１〜６、または１〜１０）の整数であり、ＲＮ１はそれぞれ独立に、水素または任意選択で置換されたＣ１‐６アルキルであるもの）である。
いくつかの実施形態では、Ｂは式（ｂ２１）：

を有してもよく、上記式中、Ｘ１２は、独立に、Ｏ、Ｓ、任意選択で置換されたアルキレン（例えばメチレン）、または任意選択で置換されたヘテロアルキレンであり、ｘａは０〜３の整数であり、Ｒ１２ａおよびＴ２は本明細書中に記載されたとおりである。
いくつかの実施形態では、Ｂは式（ｂ２２）：

を有してもよく、上記式中、Ｒ１０’は、独立に、任意選択で置換されたアルキル、任意選択で置換されたアルケニル、任意選択で置換されたアルキニル、任意選択で置換されたアリール、任意選択で置換されたヘテロシクリル、任意選択で置換されたアミノアルキル、任意選択で置換されたアミノアルケニル、任意選択で置換されたアミノアルキニル、任意選択で置換されたアルコキシ、任意選択で置換されたアルコキシカルボニルアルキル、任意選択で置換されたアルコキシカルボニルアルケニル、任意選択で置換されたアルコキシカルボニルアルキニル、任意選択で置換されたアルコキシカルボニルアルコキシ、任意選択で置換されたカルボキシアルコキシ、任意選択で置換されたカルボキシアルキル、または任意選択で置換されたカルバモイルアルキルであり、Ｒ１１、Ｒ１２ａ、Ｔ１、およびＴ２は本明細書中に記載されたとおりである。
いくつかの実施形態では、Ｂは式（ｂ２３）：

を有してもよく、上記式中、Ｒ１０は、任意選択で置換されたヘテロシクリル（例えば任意選択で置換されたフリル、任意選択で置換されたチエニル、もしくは任意選択で置換されたピロリル）、任意選択で置換されたアリール（例えば任意選択で置換されたフェニルもしくは任意選択で置換されたナフチル）、または本明細書中に（例えばＲ１０について）記載された任意の置換基であり；Ｒ１１（例えば、Ｈまたは本明細書中に記載された任意の置換基）、Ｒ１２ａ（例えば、Ｈまたは本明細書中に記載された任意の置換基）、Ｔ１（例えば、オキソまたは本明細書中に記載された任意の置換基）、およびＴ２（例えば、オキソまたは本明細書中に記載された任意の置換基）は、本明細書中に記載されたとおりである。
いくつかの実施形態では、Ｂは式（ｂ２４）：

を有してもよく、上記式中、Ｒ１４’は、独立に、任意選択で置換されたアルキル、任意選択で置換されたアルケニル、任意選択で置換されたアルキニル、任意選択で置換されたアリール、任意選択で置換されたヘテロシクリル、任意選択で置換されたアルカリール、任意選択で置換されたアルクヘテロシクリル、任意選択で置換されたアミノアルキル、任意選択で置換されたアミノアルケニル、任意選択で置換されたアミノアルキニル、任意選択で置換されたアルコキシ、任意選択で置換されたアルコキシカルボニルアルキル、任意選択で置換されたアルコキシカルボニルアルケニル、任意選択で置換されたアルコキシカルボニルアルキニル、任意選択で置換されたアルコキシカルボニルアルコキシ、任意選択で置換されたカルボキシアルコキシ、任意選択で置換されたカルボキシアルキル、または任意選択で置換されたカルバモイルアルキルであり、Ｒ１３ａ、Ｒ１３ｂ、Ｒ１５、およびＴ３は本明細書中に記載されたとおりである。
いくつかの実施形態では、Ｂは式（ｂ２５）：

を有してもよく、上記式中、Ｒ１４’は、任意選択で置換されたヘテロシクリル（例えば、任意選択で置換されたフリル、任意選択で置換されたチエニル、または任意選択で置換されたピロリル）、任意選択で置換されたアリール（例えば、任意選択で置換されたフェニルまたは任意選択で置換されたナフチル）、または本明細書中に（例えばＲ１４またはＲ１４’について）記載された任意の置換基であり；Ｒ１３ａ（例えば、Ｈまたは本明細書中に記載された任意の置換基）、Ｒ１３ｂ（例えば、Ｈまたは本明細書中に記載された任意の置換基）、Ｒ１５（例えば、Ｈまたは本明細書中に記載された任意の置換基）、およびＴ３（例えば、オキソまたは本明細書中に記載された任意の置換基）は、本明細書中に記載されたとおりである。
いくつかの実施形態では、Ｂは、シトシン、グアニン、アデニン、およびウラシルで構成されている群から選択された核酸塩基である。いくつかの実施形態では、Ｂは：

であってよい。
いくつかの実施形態では、修飾型の核酸塩基は修飾ウラシルである。修飾ウラシルを有する典型的な核酸塩基およびヌクレオシドには、プソイドウリジン（Ψ）、ピリジン‐４‐オン‐リボヌクレオシド、５‐アザ‐ウリジン、６‐アザ‐ウリジン、２‐チオ‐５‐アザ‐ウリジン、２‐チオ‐ウリジン（ｓ２Ｕ）、４‐チオ‐ウリジン（ｓ４Ｕ）、４‐チオ‐プソイドウリジン、２‐チオ‐プソイドウリジン、５‐ヒドロキシ‐ウリジン（ｈｏ５Ｕ）、５‐アミノアリル‐ウリジン、５‐ハロ‐ウリジン（例えば５‐ヨード‐ウリジンまたは５‐ブロモ‐ウリジン）、３‐メチル‐ウリジン（ｍ３Ｕ）、５‐メトキシ‐ウリジン（ｍｏ５Ｕ）、ウリジン５‐オキシ酢酸（ｃｍｏ５Ｕ）、ウリジン５‐オキシ酢酸メチルエステル（ｍｃｍｏ５Ｕ）、５‐カルボキシメチル‐ウリジン（ｃｍ５Ｕ）、１‐カルボキシメチル‐プソイドウリジン、５‐カルボキシヒドロキシメチル‐ウリジン（ｃｈｍ５Ｕ）、５‐カルボキシヒドロキシメチル‐ウリジンメチルエステル（ｍｃｈｍ５Ｕ）、５‐メトキシカルボニルメチル‐ウリジン（ｍｃｍ５Ｕ）、５‐メトキシカルボニルメチル‐２‐チオ‐ウリジン（ｍｃｍ５ｓ２Ｕ）、５‐アミノメチル‐２‐チオ‐ウリジン（ｎｍ５ｓ２Ｕ）、５‐メチルアミノメチル‐ウリジン（ｍｎｍ５Ｕ）、５‐メチルアミノメチル‐２‐チオ‐ウリジン（ｍｎｍ５ｓ２Ｕ）、５‐メチルアミノメチル‐２‐セレノ‐ウリジン（ｍｎｍ５ｓｅ２Ｕ）、５‐カルバモイルメチル‐ウリジン（ｎｃｍ５Ｕ）、５‐カルボキシメチルアミノメチル‐ウリジン（ｃｍｎｍ５Ｕ）、５‐カルボキシメチルアミノメチル‐２‐チオ−ウリジン（ｃｍｎｍ５ｓ２Ｕ）、５‐プロピニル‐ウリジン、１‐プロピニル‐プソイドウリジン、５‐タウリノメチル‐ウリジン（τｍ５Ｕ）、１‐タウリノメチル‐プソイドウリジン、５‐タウリノメチル‐２‐チオ‐ウリジン（τｍ５ｓ２Ｕ）、１‐タウリノメチル‐４‐チオ‐プソイドウリジン、５‐メチル‐ウリジン（ｍ５Ｕ、すなわち、核酸塩基デオキシチミンを有している）、１‐メチル‐プソイドウリジン（ｍ１Ψ）、５‐メチル‐２‐チオ‐ウリジン（ｍ５ｓ２Ｕ）、１‐メチル‐４‐チオ‐プソイドウリジン（ｍ１ｓ４Ψ）、４‐チオ‐１‐メチル‐プソイドウリジン、３‐メチル‐プソイドウリジン（ｍ３Ψ）、２‐チオ‐１‐メチル‐プソイドウリジン、１‐メチル‐１‐デアザ‐プソイドウリジン、２‐チオ‐１‐メチル‐１‐デアザ‐プソイドウリジン、ジヒドロウリジン（Ｄ）、ジヒドロプソイドウリジン、５，６‐ジヒドロウリジン、５‐メチル‐ジヒドロウリジン（ｍ５Ｄ）、２‐チオ‐ジヒドロウリジン、２‐チオ‐ジヒドロプソイドウリジン、２‐メトキシ‐ウリジン、２‐メトキシ‐４‐チオ‐ウリジン、４‐メトキシ‐プソイドウリジン、４‐メトキシ‐２‐チオ‐プソイドウリジン、Ｎ１‐メチル‐プソイドウリジン、３‐（３‐アミノ‐３‐カルボキシプロピル）ウリジン（ａｃｐ３Ｕ）、１‐メチル‐３‐（３‐アミノ‐３‐カルボキシプロピル）プソイドウリジン（ａｃｐ３Ψ）、５‐（イソペンテニルアミノメチル）ウリジン（ｉｎｍ５Ｕ）、５‐（イソペンテニルアミノメチル）‐２‐チオ‐ウリジン（ｉｎｍ５ｓ２Ｕ）、α‐チオ‐ウリジン、２’‐Ｏ‐メチル‐ウリジン（Ｕｍ）、５，２’‐Ｏ‐ジメチル‐ウリジン（ｍ５Ｕｍ）、２’‐Ｏ‐メチル‐プソイドウリジン（Ψｍ）、２‐チオ‐２’‐Ｏ‐メチル‐ウリジン（ｓ２Ｕｍ）、５‐メトキシカルボニルメチル‐２’‐Ｏ‐メチル‐ウリジン（ｍｃｍ５Ｕｍ）、５‐カルバモイルメチル‐２’‐Ｏ‐メチル‐ウリジン（ｎｃｍ５Ｕｍ）、５‐カルボキシメチルアミノメチル‐２’‐Ｏ‐メチル‐ウリジン（ｃｍｎｍ５Ｕｍ）、３，２’‐Ｏ‐ジメチル‐ウリジン（ｍ３Ｕｍ）、および５‐（イソペンテニルアミノメチル）‐２’‐Ｏ‐メチル‐ウリジン（ｉｎｍ５Ｕｍ）、１‐チオ‐ウリジン、デオキシチミジン、２’‐Ｆ‐アラ‐ウリジン、２’‐Ｆ‐ウリジン、２’‐ＯＨ‐アラ‐ウリジン、５‐（２‐カルボメトキシビニル）ウリジン、および５‐［３‐（１‐Ｅ‐プロペニルアミノ）ウリジンが含まれる。
いくつかの実施形態では、修飾型の核酸塩基は修飾シトシンである。修飾シトシンを有する典型的な核酸塩基およびヌクレオシドには、５‐アザ‐シチジン、６‐アザ‐シチジン、プソイドイソシチジン、３‐メチル‐シチジン（ｍ３Ｃ）、Ｎ４‐アセチル‐シチジン（ａｃ４Ｃ）、５‐ホルミル‐シチジン（ｆ５Ｃ）、Ｎ４‐メチル‐シチジン（ｍ４Ｃ）、５‐メチル‐シチジン（ｍ５Ｃ）、５‐ハロ‐シチジン（例えば５‐ヨード‐シチジン）、５‐ヒドロキシメチル‐シチジン（ｈｍ５Ｃ）、１−メチル−プソイドイソシチジン、ピロロ‐シチジン、ピロロ‐プソイドイソシチジン、２‐チオ‐シチジン（ｓ２Ｃ）、２‐チオ‐５‐メチル‐シチジン、４‐チオ‐プソイドイソシチジン、４‐チオ‐１‐メチル‐プソイドイソシチジン、４‐チオ‐１‐メチル‐１‐デアザ‐プソイドイソシチジン、１‐メチル‐１‐デアザ‐プソイドイソシチジン、ゼブラリン、５‐アザ‐ゼブラリン、５‐メチル‐ゼブラリン、５‐アザ‐２‐チオ‐ゼブラリン、２‐チオ‐ゼブラリン、２‐メトキシ‐シチジン、２‐メトキシ‐５‐メチル‐シチジン、４‐メトキシ‐プソイドイソシチジン、４‐メトキシ‐１‐メチル‐プソイドイソシチジン、リシジン（ｋ２Ｃ）、α‐チオ‐シチジン、２’‐Ｏ‐メチル‐シチジン（Ｃｍ）、５，２’‐Ｏ‐ジメチル‐シチジン（ｍ５Ｃｍ）、Ｎ４‐アセチル‐２’‐Ｏ‐メチル‐シチジン（ａｃ４Ｃｍ）、Ｎ４，２’‐Ｏ‐ジメチル‐シチジン（ｍ４Ｃｍ）、５‐ホルミル‐２’‐Ｏ‐メチル‐シチジン（ｆ５Ｃｍ）、Ｎ４，Ｎ４，２’‐Ｏ‐トリメチル‐シチジン（ｍ４ ２Ｃｍ）、１‐チオ‐シチジン、２’‐Ｆ‐アラ‐シチジン、２’‐Ｆ‐シチジン、および２’‐ＯＨ‐アラ‐シチジンが含まれる。
いくつかの実施形態では、修飾型の核酸塩基は修飾アデニンである。修飾アデニンを有する典型的な核酸塩基およびヌクレオシドには、２‐アミノ‐プリン、２，６‐ジアミノプリン、２‐アミノ‐６‐ハロ‐プリン（例えば２‐アミノ‐６‐クロロ‐プリン）、６‐ハロ‐プリン（例えば６‐クロロ‐プリン）、２‐アミノ‐６‐メチル‐プリン、８‐アジド‐アデノシン、７‐デアザ‐アデニン、７‐デアザ‐８‐アザ‐アデニン、７‐デアザ‐２‐アミノ‐プリン、７‐デアザ‐８‐アザ‐２‐アミノ‐プリン、７‐デアザ‐２，６‐ジアミノプリン、７‐デアザ‐８‐アザ‐２，６‐ジアミノプリン、１‐メチル‐アデノシン（ｍ１Ａ）、２‐メチル‐アデニン（ｍ２Ａ）、Ｎ６‐メチル‐アデノシン（ｍ６Ａ）、２‐メチルチオ‐Ｎ６‐メチル‐アデノシン（ｍｓ２ｍ６Ａ）、Ｎ６‐イソペンテニル‐アデノシン（ｉ６Ａ）、２‐メチルチオ‐Ｎ６‐イソペンテニル‐アデノシン（ｍｓ２ｉ６Ａ）、Ｎ６‐（シス‐ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン（ｉｏ６Ａ）、２‐メチルチオ‐Ｎ６‐（シス−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン（ｍｓ２ｉｏ６Ａ）、Ｎ６‐グリシニルカルバモイル‐アデノシン（ｇ６Ａ）、Ｎ６‐トレオニルカルバモイル‐アデノシン（ｔ６Ａ）、Ｎ６‐メチル‐Ｎ６‐トレオニルカルバモイル‐アデノシン（ｍ６ｔ６Ａ）、２‐メチルチオ‐Ｎ６‐トレオニルカルバモイル‐アデノシン（ｍｓ２ｇ６Ａ）、Ｎ６，Ｎ６‐ジメチル‐アデノシン（ｍ６ ２Ａ）、Ｎ６‐ヒドロキシノルバリルカルバモイル‐アデノシン（ｈｎ６Ａ）、２‐メチルチオ‐Ｎ６‐ヒドロキシノルバリルカルバモイル‐アデノシン（ｍｓ２ｈｎ６Ａ）、Ｎ６‐アセチル‐アデノシン（ａｃ６Ａ）、７‐メチル‐アデニン、２‐メチルチオ‐アデニン、２‐メトキシ‐アデニン、α‐チオ‐アデノシン、２’‐Ｏ‐メチル‐アデノシン（Ａｍ）、Ｎ６，２’‐Ｏ‐ジメチル‐アデノシン（ｍ６Ａｍ）、Ｎ６，Ｎ６，２’‐Ｏ‐トリメチル‐アデノシン（ｍ６ ２Ａｍ）、１，２’‐Ｏ‐ジメチル‐アデノシン（ｍ１Ａｍ）、２’‐Ｏ‐リボシルアデノシン（リン酸塩）（Ａｒ（ｐ））、２‐アミノ‐Ｎ６‐メチル‐プリン、１‐チオ‐アデノシン、８‐アジド‐アデノシン、２’‐Ｆ‐アラ‐アデノシン、２’‐Ｆ‐アデノシン、２’‐ＯＨ‐アラ‐アデノシン、およびＮ６‐（１９‐アミノ‐ペンタオキサノナデシル）‐アデノシンが含まれる。
いくつかの実施形態では、修飾型の核酸塩基は修飾グアニンである。修飾グアニンを有する典型的な核酸塩基およびヌクレオシドには、イノシン（Ｉ）、１‐メチル‐イノシン（ｍ１Ｉ）、ワイオシン（ｉｍＧ）、メチルワイオシン（ｍｉｍＧ）、４‐デメチル‐ワイオシン（ｉｍＧ‐１４）、イソワイオシン（ｉｍＧ２）、ワイブトシン（ｙＷ）、ペルオキシワイブトシン（ｏ２ｙＷ）、ヒドロキシワイブトシン（ＯＨｙＷ）、不完全修飾型（ｕｎｄｅｒｍｏｄｉｆｉｅｄ）ヒドロキシワイブトシン（ＯＨｙＷ＊）、７‐デアザ‐グアノシン、キューオシン（Ｑ）、エポキシキューオシン（ｏＱ）、ガラクトシル‐キューオシン（ｇａｌＱ）、マンノシル‐キューオシン（ｍａｎＱ）、７‐シアノ‐７‐デアザ‐グアノシン（ｐｒｅＱ０）、７‐アミノメチル‐７‐デアザ‐グアノシン（ｐｒｅＱ１）、アルカエオシン（Ｇ＋）、７‐デアザ‐８‐アザ‐グアノシン、６‐チオ‐グアノシン、６‐チオ‐７‐デアザ‐グアノシン、６‐チオ‐７‐デアザ‐８‐アザ‐グアノシン、７‐メチル‐グアノシン（ｍ７Ｇ）、６‐チオ‐７‐メチル‐グアノシン、７‐メチル‐イノシン、６‐メトキシ‐グアノシン、１‐メチル‐グアノシン（ｍ１Ｇ）、Ｎ２‐メチル‐グアノシン（ｍ２Ｇ）、Ｎ２，Ｎ２‐ジメチル‐グアノシン（ｍ２ ２Ｇ）、Ｎ２，７‐ジメチル‐グアノシン（ｍ２，７Ｇ）、Ｎ２，Ｎ２，７‐ジメチル‐グアノシン（ｍ２，２，７Ｇ）、８‐オキソ‐グアノシン、７‐メチル‐８‐オキソ‐グアノシン、１‐メチル‐６‐チオ‐グアノシン、Ｎ２‐メチル‐６‐チオ‐グアノシン、Ｎ２，Ｎ２‐ジメチル‐６‐チオ‐グアノシン、α‐チオ‐グアノシン、２’‐Ｏ‐メチル‐グアノシン（Ｇｍ）、Ｎ２‐メチル‐２’‐Ｏ‐メチル‐グアノシン（ｍ２Ｇｍ）、Ｎ２，Ｎ２‐ジメチル‐２’‐Ｏ‐メチル‐グアノシン（ｍ２ ２Ｇｍ）、１‐メチル‐２’‐Ｏ‐メチル‐グアノシン（ｍ１Ｇｍ）、Ｎ２，７‐ジメチル‐２’‐Ｏ‐メチル‐グアノシン（ｍ２，７Ｇｍ）、２’‐Ｏ‐メチル‐イノシン（Ｉｍ）、１，２’‐Ｏ‐ジメチル‐イノシン（ｍ１Ｉｍ）、２’‐Ｏ‐リボシルグアノシン（リン酸塩）（Ｇｒ（ｐ））、１‐チオ‐グアノシン、Ｏ６‐メチル‐グアノシン、２’‐Ｆ‐アラ‐グアノシン、および２’‐Ｆ‐グアノシンが含まれる。
いくつかの実施形態では、ヌクレオチドは主溝面上において修飾されうる。例えば、そのような修飾には、ウラシルまたはシトシンのＣ‐５上の水素をアルキル（例えばメチル）またはハロに置き換えることが挙げられる。
ヌクレオチドの核酸塩基は、独立に、プリン、ピリミジン、プリンアナログまたはピリミジンアナログから選択されうる。例えば、核酸塩基はそれぞれ独立に、アデニン、シトシン、グアニン、ウラシル、またはヒポキサンチンから選択されうる。別の実施形態では、核酸塩基はさらに、例えば、天然に存在する塩基誘導体および合成の塩基誘導体、例えば
ピラゾロ［３，４‐ｄ］ピリミジン、５‐メチルシトシン（５‐ｍｅ‐Ｃ）、５‐ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２‐アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６‐メチルおよびその他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２‐プロピルおよびその他のアルキル誘導体、２‐チオウラシル、２‐チオチミンおよび２‐チオシトシン、５‐プロピニルウラシルおよび５‐プロピニルシトシン、６‐アゾウラシル、６‐アゾシトシンおよび６‐アゾチミン、５‐ウラシル（プソイドウラシル）、４‐チオウラシル、８‐ハロ（例えば８‐ブロモ）、８‐アミノ、８‐チオール、８‐チオアルキル、８‐ヒドロキシルおよびその他の８‐置換型アデニンおよびグアニン、５‐ハロ、特に５‐ブロモ、５‐トリフルオロメチルおよびその他の５‐置換型ウラシルおよびシトシン、７‐メチルグアニンおよび７‐メチルアデニン、８‐アザグアニンおよび８‐アザアデニン、デアザグアニン、７‐デアザグアニン、３‐デアザグアニン、デアザアデニン、７‐デアザアデニン、３‐デアザアデニン、ピラゾロ［３，４‐ｄ］ピリミジン、イミダゾ［１，５‐ａ］１，３，５トリアジノン、９‐デアザプリン、イミダゾ［４，５‐ｄ］ピラジン、チアゾロ［４，５‐ｄ］ピリミジン、ピラジン‐２‐オン、１，２，４‐トリアジン、ピリダジン、および１，３，５トリアジンが含まれる。ヌクレオチドが簡略表記Ａ、Ｇ、Ｃ、ＴまたはＵを使用して示される場合、各文字は代表的な塩基およびその誘導体のうち少なくともいずれかを指し、例えばＡには、アデニンまたはアデニンアナログ、例えば７‐デアザ‐アデニンが含まれる。
いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは式ＸＩ：

の化合物であって、上記式中、

は単結合または二重結合を表わし；

は任意選択の単結合を表わし；

が単結合であるとき、ＵはＯ、Ｓ、‐ＮＲａ‐、もしくは‐ＣＲａＲｂ‐であるか、または、

が二重結合であるとき、Ｕは‐ＣＲａ‐であり；
Ｚは、Ｈ、Ｃ１−１２アルキル、もしくはＣ６−２０アリールであるか、または

が二重結合であるときＺは存在せず；かつ、
Ｚは‐ＣＲａＲｂ‐であってＡとともに結合を形成してもよく；
Ａは、Ｈ、ＯＨ、ＮＨＲ（Ｒ＝アルキルもしくはアリールもしくはホスホリル）、スルファート、‐ＮＨ２、Ｎ３、アジド、‐ＳＨ、Ｎ アミノ酸、もしくは１〜１２個のアミノ酸を含んでなるペプチドであり；
Ｄは、Ｈ、ＯＨ、ＮＨＲ（Ｒ＝アルキルもしくはアリールもしくはホスホリル）、‐ＮＨ２、‐ＳＨ、アミノ酸、１〜１２個のアミノ酸を含んでなるペプチド、もしくは式ＸＩＩ：

の基であるか、
または、ＡおよびＤはそれらが結合している炭素原子と一緒になって５員環を形成し；
ＸはＯまたはＳであり；
Ｙ１はそれぞれ独立に、‐ＯＲａ１、‐ＮＲａ１Ｒｂ１、および‐ＳＲａ１から選択され；
Ｙ２およびＹ３はそれぞれ独立に、Ｏ、‐ＣＲａＲｂ‐、ＮＲｃ、ＳもしくはリンカーであってＣ、Ｏ、ＮおよびＳで構成されている群から選択された１つ以上の原子を含んでなるリンカーであり；
ｎは０、１、２、もしくは３であり；
ｍは０、１、２、もしくは３であり；
Ｂは核酸塩基であり；
ＲａおよびＲｂはそれぞれ独立に、Ｈ、Ｃ１‐１２アルキル、Ｃ２‐１２アルケニル、Ｃ２‐１２アルキニル、またはＣ６‐２０アリールであり；
Ｒｃは、Ｈ、Ｃ１‐１２アルキル、Ｃ２‐１２アルケニル、フェニル、ベンジル、ポリエチレングリコール基、もしくはアミノ‐ポリエチレングリコール基であり；
Ｒａ１およびＲｂ１はそれぞれ独立に、Ｈもしくはカウンターイオンであり；かつ
‐ＯＲｃ１は約１のｐＨにおいてＯＨであるか、または‐ＯＲｃ１は生理的ｐＨにおいてＯ−であり；
ただし、可変部Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｕ、Ｚ、Ｙ２およびＹ３を包含する環はリボースにはなりえないものとする。
いくつかの実施形態では、Ｂは、シトシン、グアニン、アデニン、およびウラシルで構成されている群から選択された核酸塩基である。
いくつかの実施形態では、核酸塩基はピリミジンまたはその誘導体である。
いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは式ＸＩ‐ａ：

の化合物である。
いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは式ＸＩ‐ｂ：

の化合物である。
いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、式ＸＩ‐ｃ１、ＸＩ‐ｃ２、またはＸＩ‐ｃ３：

の化合物である。
いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは式ＸＩ：

の化合物であって、上記式中、

は単結合または二重結合を表わし；

は任意選択の単結合を表わし；

が単結合を表すとき、ＵはＯ、Ｓ、‐ＮＲａ‐、もしくは‐ＣＲａＲｂ‐であるか、または

が二重結合を表すとき、Ｕは‐ＣＲａ‐であり；
Ｚは、Ｈ、Ｃ１−１２アルキル、もしくはＣ６−２０アリールであるか、または

が二重結合であるとき、Ｚは存在せず；かつ
Ｚは‐ＣＲａＲｂ‐であってＡとともに結合を形成してもよく；
Ａは、Ｈ、ＯＨ、スルファート、‐ＮＨ２、‐ＳＨ、アミノ酸、または１〜１２個のアミノ酸を含んでなるペプチドであり；
Ｄは、Ｈ、ＯＨ、‐ＮＨ２、‐ＳＨ、アミノ酸、１〜１２個のアミノ酸を含んでなるペプチド、もしくは式ＸＩＩ：

の基であるか、
または、ＡおよびＤはそれらが結合している炭素原子と一緒になって５員環を形成し；
ＸはＯまたはＳであり；
Ｙ１はそれぞれ独立に、‐ＯＲａ１、‐ＮＲａ１Ｒｂ１、および‐ＳＲａ１から選択され；
Ｙ２およびＹ３はそれぞれ独立に、Ｏ、‐ＣＲａＲｂ‐、ＮＲｃ、ＳもしくはリンカーであってＣ、Ｏ、ＮおよびＳで構成されている群から選択された１つ以上の原子を含んでなるリンカーであり；
ｎは０、１、２、または３であり；
ｍは０、１、２、または３であり；
Ｂは式ＸＩＩＩ：

の核酸塩基であって、上記式中、
ＶはＮまたは正に荷電したＮＲｃであり；
Ｒ３はＮＲｃＲｄ、‐ＯＲａ、または‐ＳＲａであり；
Ｒ４はＨであるか、または任意選択でＹ３とともに結合を形成してもよく；
Ｒ５はＨ、‐ＮＲｃＲｄ、または‐ＯＲａであり；
ＲａおよびＲｂはそれぞれ独立に、Ｈ、Ｃ１‐１２アルキル、Ｃ２‐１２アルケニル、Ｃ２‐１２アルキニル、またはＣ６‐２０アリールであり；
Ｒｃは、Ｈ、Ｃ１‐１２アルキル、Ｃ２‐１２アルケニル、フェニル、ベンジル、ポリエチレングリコール基、またはアミノ‐ポリエチレングリコール基であり；
Ｒａ１およびＲｂ１はそれぞれ独立に、Ｈまたはカウンターイオンであり；かつ
‐ＯＲｃ１は約１のｐＨにおいてＯＨであるか、または‐ＯＲｃ１は生理的ｐＨにおいてＯ−である。
いくつかの実施形態では、Ｂは：

であって、
上記式中、Ｒ３は‐ＯＨ、‐ＳＨ、または

である。
いくつかの実施形態では、Ｂは：

である。
いくつかの実施形態では、Ｂは：

である。
いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは式Ｉ‐ｄ：

の化合物である。
いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、





またはこれらの薬学的に許容可能な塩で構成されている群から選択された化合物である。
いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、



またはこれらの薬学的に許容可能な塩で構成されている群から選択された化合物である。
ヌクレオシド間結合の修飾
ポリヌクレオチド分子に組み入れ可能な修飾ヌクレオチドは、ヌクレオシド間結合（例えばリン酸バックボーン）について修飾されてもよい。本明細書中、ポリヌクレオチドのバックボーンに関して、「リン酸（ホスファート）」および「ホスホジエステル」という語は互換的に使用される。バックボーンのリン酸基は酸素原子のうち１つ以上を異なる置換基に置き換えることにより修飾されうる。さらに、修飾型のヌクレオシドおよびヌクレオチドは、非修飾型のリン酸部分を本明細書中に記載されるような別のヌクレオシド間結合で大規模に置き換えることを含みうる。修飾リン酸基の例には、限定するものではないが、ホスホロチオエート、ホスホロセレナート、ボラノホスファート、ボラノホスファートエステル、水素ホスホナート、ホスホロアミダート、ホスホロジアミダート、アルキルホスホナートまたはアリールホスホナート、およびホスホトリエステルが挙げられる。ホスホロジチオエートは結合に関与していない酸素がいずれも硫黄によって置き換えられている。リン酸リンカーは、結合に関与している酸素を、窒素（架橋ホスホロアミダート）、硫黄（架橋ホスホロチオエート）、および炭素（架橋メチレン‐ホスホナート）で置き換えることによっても修飾されうる。
α‐チオで置換されたリン酸部分は非天然のホスホロチオエートバックボーン結合によってＲＮＡおよびＤＮＡのポリマーに安定性を付与するために提供される。ホスホロチオエートのＤＮＡおよびＲＮＡは高いヌクレアーゼ抵抗性を有し、ひいては細胞環境においてより長い半減期を有する。理論に束縛されることは望まないが、ホスホロチオエート結合型のポリヌクレオチド分子は、細胞の先天性免疫分子の結合／活性化が弱まることによる先天性免疫応答の低減もなすと予想される。
特定の実施形態では、修飾ヌクレオシドには、α‐チオ‐ヌクレオシド（例えば５’‐Ｏ‐（１‐チオホスファート）‐アデノシン、５’‐Ｏ‐（１‐チオホスファート）‐シチジン（α‐チオ‐シチジン）、５’‐Ｏ‐（１‐チオホスファート）‐グアノシン、５’‐Ｏ‐（１‐チオホスファート）‐ウリジン、または５’‐Ｏ‐（１‐チオホスファート）‐プソイドウリジン）が挙げられる。
本発明によって使用されうるその他のヌクレオシド間結合、例えばリン原子を含まないヌクレオシド間結合は、本明細書中に後述されている。
［修飾型の糖、核酸塩基、およびヌクレオシド間結合の組み合わせ］
本発明のポリヌクレオチドは、糖、核酸塩基、およびヌクレオシド間結合に対する修飾の組み合わせを含むことができる。これらの組み合わせは、本明細書中に記載された任意の１つ以上の修飾を含むことができる。例を挙げると、本明細書中で式（Ｉａ）、（Ｉａ‐１）‐（Ｉａ‐３）、（Ｉｂ）‐（Ｉｆ）、（Ｉｌａ）‐（ＩＩｐ）、（ＩＩｂ‐１）、（ＩＩｂ‐２）、（ＩＩｃ‐１）‐（ＩＩｃ‐２）、（ＩＩｎ‐１）、（ＩＩｎ‐２）、（ＩＶａ）‐（ＩＶｌ）、および（ＩＸａ）‐（ＩＸｒ）に記載されたヌクレオチドのうち任意のものは、本明細書中に記載された核酸塩基（例えば式（ｂ１）‐（ｂ４３）、または本明細書中に記載された任意のその他のもの）のうちいずれとも組み合わせることができる。
［ポリヌクレオチド分子の合成］
本発明に従って使用するためのポリヌクレオチド分子は、本明細書中に記載されるように、任意の有用な技法によって調製されうる。本明細書中に開示されたポリヌクレオチド分子の合成において使用される修飾ヌクレオシドおよびヌクレオチドは、以下の一般的な方法および手順を使用して、容易に入手可能な出発物質から調製可能である。典型的または好ましい工程条件（例えば反応温度、時間、反応物のモル比、溶媒、圧力など）が提供されれば、当業者はさらなる工程条件を最適化かつ開発することができるであろう。最適な反応条件は使用される特定の反応物または溶媒に応じて様々となり得るが、そのような条件は当業者によって日常的な最適化手順により決定可能である。
本明細書中に記載された工程は、当分野で既知の任意の適切な方法によってモニタリング可能である。例えば、生成物の形成は、分光学的手段、例えば核磁気共鳴法（例えば１Ｈもしくは１３Ｃ）赤外分光法、分光測光法（例えば、ＵＶ‐可視）、もしくは質量分析法によって、または高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）もしくは薄層クロマトグラフィのようなクロマトグラフ法によって、モニタリング可能である。
本発明のポリヌクレオチド分子の調製には、様々な化学基の保護および脱保護を伴う可能性がある。保護および脱保護の必要性、ならびに適切な保護基の選択は、当業者には容易に判断可能である。保護基の化学的性質については、例えば、グリーン（Ｇｒｅｅｎｅ）ら、「有機合成における保護基（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」、第２版、ワイリー・アンド・サンズ（Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ）、１９９１年、に見出すことが可能であり、前記文献はその全体が参照により本願に組込まれる。
本明細書中に記載された工程の反応は、適切な溶媒中で実行可能であり、該溶媒は有機合成分野の当業者によって容易に選択可能である。適切な溶媒は、反応が行なわれる温度、すなわち該溶媒の凍結温度から該溶媒の沸騰温度まで及びうる温度において、出発物質（反応物）、中間物、または生成物とほぼ無反応性となりうる。所与の反応は、１つの溶媒中で行われてもよいし、２以上の溶媒の混合物中で行なわれてもよい。特定の反応ステップに応じて、特定の反応ステップに適した溶媒が選択されうる。
修飾型のポリヌクレオチドまたは核酸（例えばポリヌクレオチドまたは修飾ｍＲＮＡ分子）のラセミ混合物の分割は、当分野で既知の多数の方法のうち任意のものによって実行可能である。実例の方法には、光学活性な、塩を形成する有機酸である「キラル分割用の酸（ｃｈｉｒａｌ ｒｅｓｏｌｖｉｎｇ ａｃｉｄ）」を使用する、分別再結晶化が含まれる。分別再結晶化法に適した分割剤は、例えば、光学活性な酸、例えばＤ型およびＬ型の酒石酸、ジアセチル酒石酸、ジベンゾイル酒石酸、マンデル酸、リンゴ酸、乳酸、または様々な光学活性なカンファースルホン酸である。ラセミ混合物の分割は、光学活性な分割剤（例えばジニトロベンゾイルフェニルグリシン）を用いて充填されたカラムでの溶離によっても実行可能である。適切な溶離溶媒の組成は当業者により決定されうる。
修飾型のヌクレオシドおよびヌクレオチド（例えば構成単位分子）は、オガタ（Ｏｇａｔａ）ら、ザ・ジャーナル・オブ・オーガニック・ケミストリー（Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ．）、２００９年、第７４巻、ｐ．２５８５−２５８８；パーマル（Ｐｕｒｍａｌ）ら、ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）、１９９４年、第２２巻、第１号、ｐ．７２−７８；フクハラ（Ｆｕｋｕｈａｒａ）ら、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、１９６２年、第１巻、第４号、ｐ．５６３−５６８；およびシュー（Ｘｕ）ら、テトラヘドロン（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ）、１９９２年、第４８巻、第９号、ｐ．１７２９−１７４０、に記載された合成法によって調製可能であり、前記文献はそれぞれその全体が参照により援用される。
本発明のポリヌクレオチドは、分子の全長に沿って一様に修飾されてもよいし、一様には修飾されなくてもよい。例えば、１つ以上または全種類のヌクレオチド（例えばプリンもしくはピリミジン、またはＡ、Ｇ、Ｕ、Ｃのうち任意の１つ以上もしくはすべて）が、本発明のポリヌクレオチドにおいて、またはその所与の予め決められた配列領域において、一様に修飾されてもよいし、一様には修飾されなくてもよい。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド中の（またはその所与の配列領域中の）全てのヌクレオチドＸが修飾され、ここでＸは、ヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｕ、Ｃのうちいずれか、または組み合わせのＡ＋Ｇ、Ａ＋Ｕ、Ａ＋Ｃ、Ｇ＋Ｕ、Ｇ＋Ｃ、Ｕ＋Ｃ、Ａ＋Ｇ＋Ｕ、Ａ＋Ｇ＋Ｃ、Ｇ＋Ｕ＋ＣもしくはＡ＋Ｇ＋Ｃのうちいずれかであってよい。
様々な糖修飾、ヌクレオチド修飾、およびヌクレオシド間結合（例えばバックボーン構造）のうち少なくともいずれかが、ポリヌクレオチド中の様々な部位に存在することができる。ヌクレオチドのアナログ体またはその他の修飾物は、ポリヌクレオチドの機能がほとんど低下しないように該ポリヌクレオチドの任意の部位に配置されうることが、当業者には理解されるであろう。修飾はさらに、５’末端または３’末端の修飾であってもよい。ポリヌクレオチドは、約１％〜約１００％の修飾ヌクレオチド（全ヌクレオチド含量に関して、または１種類以上のヌクレオチドすなわちＡ、Ｇ、ＵもしくはＣのうちいずれか１つ以上に関して）を、またはその間の割合（％）（例えば、１％〜２０％、１％〜２５％、１％〜５０％、１％〜６０％、１％〜７０％、１％〜８０％、１％〜９０％、１％〜９５％、１０％〜２０％、１０％〜２５％、１０％〜５０％、１０％〜６０％、１０％〜７０％、１０％〜８０％、１０％〜９０％、１０％〜９５％、１０％〜１００％、２０％〜２５％、２０％〜５０％、２０％〜６０％、２０％〜７０％、２０％〜８０％、２０％〜９０％、２０％〜９５％、２０％〜１００％、５０％〜６０％、５０％〜７０％、５０％〜８０％、５０％〜９０％、５０％〜９５％、５０％〜１００％、７０％〜８０％、７０％〜９０％、７０％〜９５％、７０％〜１００％、８０％〜９０％、８０％〜９５％、８０％〜１００％、９０％〜９５％、９０％〜１００％、および９５％〜１００％）を含むことができる。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、修飾ピリミジン（例えば修飾型のウラシル／ウリジン／Ｕまたは修飾型のシトシン／シチジン／Ｃ）を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド分子中のウラシルまたはウリジン（一般に：Ｕ）は、約１％〜約１００％の修飾ウラシルまたは修飾ウリジン（例えば、１％〜２０％、１％〜２５％、１％〜５０％、１％〜６０％、１％〜７０％、１％〜８０％、１％〜９０％、１％〜９５％、１０％〜２０％、１０％〜２５％、１０％〜５０％、１０％〜６０％、１０％〜７０％、１０％〜８０％、１０％〜９０％、１０％〜９５％、１０％〜１００％、２０％〜２５％、２０％〜５０％、２０％〜６０％、２０％〜７０％、２０％〜８０％、２０％〜９０％、２０％〜９５％、２０％〜１００％、５０％〜６０％、５０％〜７０％、５０％〜８０％、５０％〜９０％、５０％〜９５％、５０％〜１００％、７０％〜８０％、７０％〜９０％、７０％〜９５％、７０％〜１００％、８０％〜９０％、８０％〜９５％、８０％〜１００％、９０％〜９５％、９０％〜１００％、および９５％〜１００％の修飾ウラシルまたは修飾ウリジン）で置き換えられてもよい。修飾型のウラシルまたはウリジンは、単一の特異構造を有する化合物によって置き換えられてもよいし、異なる構造（例えば本明細書中に記載されるような、２、３、４種類またはそれ以上の特異構造）を有する複数の化合物によって置き換え可能である。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド分子中のシトシンまたはシチジン（一般に：Ｃ）は、約１％〜約１００％の修飾シトシンまたは修飾シチジン（例えば、１％〜２０％、１％〜２５％、１％〜５０％、１％〜６０％、１％〜７０％、１％〜８０％、１％〜９０％、１％〜９５％、１０％〜２０％、１０％〜２５％、１０％〜５０％、１０％〜６０％、１０％〜７０％、１０％〜８０％、１０％〜９０％、１０％〜９５％、１０％〜１００％、２０％〜２５％、２０％〜５０％、２０％〜６０％、２０％〜７０％、２０％〜８０％、２０％〜９０％、２０％〜９５％、２０％〜１００％、５０％〜６０％、５０％〜７０％、５０％〜８０％、５０％〜９０％、５０％〜９５％、５０％〜１００％、７０％〜８０％、７０％〜９０％、７０％〜９５％、７０％〜１００％、８０％〜９０％、８０％〜９５％、８０％〜１００％、９０％〜９５％、９０％〜１００％、および９５％〜１００％の修飾シトシンまたは修飾シチジン）で置き換え可能である。修飾型のシトシンまたはシチジンは、単一の特異構造を有する化合物によって置き換えられてもよいし、異なる構造（例えば本明細書中に記載されるような、２、３、４種類またはそれ以上の特異構造）を有する複数の化合物によって置き換えられてもよい。
いくつかの実施形態では、本開示は、式（Ｉａ‐１）

を有するｎ個の連結したヌクレオシドを含むポリヌクレオチド（例えば第１の領域、第１のフランキング領域、または第２のフランキング領域）を合成する方法であって、
ａ）式（ＩＶ‐１）

のヌクレオチドを、
式（Ｖ‐１）

のホスホアミダイト化合物と反応させて（上記式中、
Ｙ９は、Ｈ、ヒドロキシ、ホスホリル、ピロホスファート、スルファート、アミノ、チオール、任意選択で置換されたアミノ酸、またはペプチド（例えば、２〜１２個のアミノ酸を含んでいるペプチド）であり；Ｐ１、Ｐ２、およびＰ３はそれぞれ独立に適切な保護基であり；

は固体担体を表す）、
式（ＶＩ‐１）

のポリヌクレオチドを提供するステップと：
ｂ）式（Ｖ）のポリヌクレオチドを酸化または硫化して式（ＶＩＩ‐１）

のポリヌクレオチドを得るステップと：
ｃ）保護基を除去して式（Ｉａ）のポリヌクレオチドを得るステップと、を含んでなる方法を提供する。
いくつかの実施形態では、ステップａ）およびｂ）は１〜約１０，０００回反復される。いくつかの実施形態では、該方法は、Ａ、Ｃ、ＧおよびＵ アデノシン、シトシン、グアノシンおよびウラシルで構成されている群から選択されたヌクレオチドをさらに含んでなる。いくつかの実施形態では、核酸塩基はピリミジンまたはその誘導体であってよい。いくつかの実施形態では、該ポリヌクレオチドは翻訳可能である。
ポリヌクレオチドの他の構成成分は任意選択であり、いくつかの実施形態においては有益である。例えば、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）および３’ＵＴＲのうち少なくともいずれかが提供され、一方または両方が独立に１つ以上の異なるヌクレオチド修飾を含有してもよい。そのような実施形態では、ヌクレオチドの修飾は、翻訳可能な領域中にも存在することができる。さらに、コザック配列を含んでいるポリヌクレオチドも提供される。
［ヌクレオチドの組み合わせ］
修飾ヌクレオチドおよび修飾ヌクレオチドの組み合わせのさらなる実施例は以下の表２に提示されている。これら修飾ヌクレオチドの組み合わせは本発明のポリヌクレオチドを形成するために使用されうる。特に注記のないかぎり、修飾ヌクレオチドは本発明のポリヌクレオチドの天然型ヌクレオチドと完全に置き換わっていてもよい。非限定的な実施例として、天然型ヌクレオチドのウリジンが本明細書中に記載された修飾ヌクレオシドで置換されてもよい。別の非限定的な実施例では、天然型ヌクレオチドのウリジンは、本明細書中に開示された修飾ヌクレオシドのうち少なくとも１つを用いて部分的に（例えば約０．１％、１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９．９％）置換されてもよい。

ある種の修飾型のヌクレオチドおよびヌクレオチドの組み合わせについて、本発明者らによる調査が行われた。これらの知見は、「人為設計された核酸およびその使用方法（Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｕｓｅ Ｔｈｅｒｅｏｆ）」という表題の２０１０年１０月１日に出願された米国仮特許出願第６１／４０４，４１３号明細書、「修飾されたヌクレオチド、および核酸、ならびにこれらの使用（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ， ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ， ａｎｄ Ｕｓｅｓ Ｔｈｅｒｅｏｆ）」という表題の２０１１年１０月３日に出願された米国特許出願第１３／２５１，８４０号明細書（現在は放棄されている）、「修飾されたヌクレオチド、および核酸、ならびにこれらの使用（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ
Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ， ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ， ａｎｄ Ｕｓｅｓ Ｔｈｅｒｅｏｆ）」という表題の２０１２年５月２５日に出願された米国特許出願第１３／４８１，１２７号明細書、「修飾されたヌクレオシド、ヌクレオチド、および核酸、ならびにこれらの使用（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ， Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ， Ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ， ａｎｄ Ｕｓｅｓ Ｔｈｅｒｅｏｆ）」という表題の２０１１年１０月３日に出願された国際公開第２０１２０４５０７５号、「人為設計された核酸およびその使用方法（Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ Ｕｓｅ Ｔｈｅｒｅｏｆ）」という表題の２０１１年１０月３日に出願された米国特許出願公開第２０１２０２３７９７５号明細書、および国際公開第２０１２０４５０８２号（これらは参照により全体が援用される）に記載されている。
修飾ヌクレオチドの組み合わせのさらなる実施例は以下の表３に提示されている。修飾ヌクレオチドのこれらの組み合わせは本発明のポリヌクレオチドを形成するために使用されうる。

いくつかの実施形態では、シトシンのうち少なくとも２５％は式（ｂ１０）‐（ｂ１４）、（ｂ２４）、（ｂ２５）、または（ｂ３２）‐（ｂ３５）の化合物によって置き換えられる（例えば、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％の、例えば式（ｂ１０）または（ｂ３２）の化合物）。
いくつかの実施形態では、ウラシルのうち少なくとも２５％は式（ｂ１）‐（ｂ９）、（ｂ２１）‐（ｂ２３）、または（ｂ２８）‐（ｂ３１）の化合物によって置き換えられる（例えば、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％の、例えば式（ｂ１）、（ｂ８）、（ｂ２８）、（ｂ２９）、または（ｂ３０）の化合物）。
いくつかの実施形態では、シトシンのうち少なくとも２５％は式（ｂ１０）‐（ｂ１４）、（ｂ２４）、（ｂ２５）、または（ｂ３２）‐（ｂ３５）（例えば式（ｂ１０）または（ｂ３２））の化合物によって置き換えられ、かつ、ウラシルのうち少なくとも２５％は式（ｂ１）‐（ｂ９）、（ｂ２１）‐（ｂ２３）、または（ｂ２８）‐（ｂ３１）（例えば式（ｂ１）、（ｂ８）、（ｂ２８）、（ｂ２９）、または（ｂ３０））の化合物によって置き換えられる（例えば少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％）。
［リンカーおよびペイロードを含んでいる修飾物］
ヌクレオチドの核酸塩基は、任意の化学的に適切な部位において、ペイロード、例えば検出可能な作用薬または治療薬に、共有結合により連結されうる。例えば、核酸塩基はデアザ‐アデノシンまたはデアザ‐グアノシンであってよく、リンカーは該デアザ‐アデノシンまたはデアザ‐グアノシンのＣ‐７位またはＣ‐８位に取り付け可能である。他の実施形態では、核酸塩基はシトシンまたはウラシルであってよく、リンカーは該シトシンまたはウラシルのＮ‐３位またはＣ‐５位に取り付け可能である。下記のスキーム１は、核酸塩基（アデニン）が７‐デアザ‐アデニンのＣ‐７の炭素においてリンカーに取り付けられている実例の修飾ヌクレオチドを示している。加えて、スキーム１は、ｍＲＮＡの３’末端に組込まれたリンカーおよびペイロード（例えば検出可能な作用薬）を備えた修飾ヌクレオチドを示している。ジスルフィドの切断およびプロパルギルエステル上へのチオール基の１，２付加により検出可能な作用薬が放出される。残りの構造物（例えばスキーム１ではｐＡｐＣ５Ｐａｒｇとして示されている）は阻害剤である。該修飾ヌクレオチドの構造の原理は、係留された阻害剤により、ポリメラーゼが第２の塩基を組込む能力が立体的に妨害されるということである。したがって、該係留部はこの機能に影響を及ぼす（ａｆｆｅｃｔ）のに十分な長さであること、および、阻害剤は伸長しているポリヌクレオチド鎖の中への第２かつ後続のヌクレオチドを阻害または禁止する立体化学的配向をとっていること、が重要である。

［リンカー］
本明細書中で使用されるような用語「リンカー」は、原子団、例えば原子１０〜１，０００個の原子団を指し、原子または基、例えば、限定するものではないが、炭素、アミノ、アルキルアミノ、酸素、硫黄、スルホキシド、スルホニル、カルボニル、およびイミンなどで構成されうる。リンカーは、第１端において修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドの核酸塩基部分または糖部分に、また第２端においてペイロード、例えば検出可能な作用薬または治療薬に、結合せしめることが可能である。リンカーは、核酸配列中への組み入れを妨げない程度に十分な長さである。
リンカーに組み入れ可能な化学基の例には、限定するものではないが、アルキル基、アルケン基、アルキン基、アミド基、エーテル基、チオエーテル基、またはエステル基が挙げられる。リンカー鎖はさらに、飽和環、不飽和環、または芳香環の部分を含んでなることも可能であり、該部分は例えば多環芳香族複素環であって該芳香族複素環が１〜４個のヘテロ原子Ｎ、ＯまたはＳを含有しているアリール基である多環芳香族複素環である。リンカーの具体例には、限定するものではないが、不飽和アルカン、ポリエチレングリコール、およびデキストランポリマーが挙げられる。
例えば、リンカーは、エチレンまたはプロピレングリコールのモノマー単位、例えばジエチレングリコール、ジプロピレングリコール、トリエチレングリコール、トリプロピレングリコール、テトラエチレングリコール、またはテトラエチレングリコールを含むことができる。いくつかの実施形態では、リンカーは二価のアルキル部分、アルケニル部分、およびアルキニル部分のうち少なくともいずれかを含むことができる。リンカーは、エステル部分、アミド部分、またはエーテル部分を含むことができる。
他の実施例は、リンカー内に、例えばジスルフィド結合（‐Ｓ‐Ｓ‐）またはアゾ結合（‐Ｎ＝Ｎ‐）などのような、還元剤または光分解を使用して開裂されうる開裂可能な部分を含んでいる。リンカーに組みいれられ、かつ修飾ヌクレオチドに結合せしめられた開裂可能な結合は、開裂されると、ヌクレオチド上に例えば短い「傷跡（ｓｃａｒ）」または化学修飾をもたらす。例えば、開裂後には、修飾ヌクレオチドの一部を成し、かつポリヌクレオチド鎖に組み入れられている、ヌクレオチド塩基上に生じた傷跡は、非反応性であり、化学的に中和される必要はない。これは、核酸ポリマーテンプレートの配列決定の際に後続のヌクレオチドの組み入れ易さを増大させる。例えば、条件には、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）およびジスルフィド結合の開裂用の他の還元剤の使用が挙げられる。アミド結合を含んでいる選択的に切断可能な結合は、例えばＴＣＥＰまたはその他の還元剤の使用および光分解のうち少なくともいずれかによって、開裂可能である。エステル結合を含んでいる選択的に切断可能な結合は、例えば酸性または塩基性加水分解によって開裂可能である。
［ペイロード］
本明細書中に記載された方法および組成物は、生物学的標的にペイロードを送達するのに有用である。ペイロードは、例えば、標識を付与するために（例えば発蛍光団のような検出可能な作用薬）、または治療目的で（例えば細胞毒素またはその他の治療薬）、使用されうる。
ペイロード：治療薬
いくつかの実施形態では、ペイロードは、細胞毒素、放射性イオン、化学療法薬、またはその他の治療薬のような治療薬である。細胞毒素すなわち細胞毒性作用薬には、細胞に有害な任意の作用薬が含まれる。例としては、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド（ｔｅｎｏｐｏｓｉｄｅ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン（ｃｏｌｃｈｉｃｉｎ）、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン（ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ ａｎｔｈｒａｃｉｎ ｄｉｏｎｅ）、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１‐デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、ピューロマイシン、メイタンシノイド類、例えばメイタンシノール（米国特許第５，２０８，０２０号明細書を参照）、ＣＣ‐１０６５（米国特許第５，４７５，０９２号、同第５，５８５，４９９号、同第５，８４６，５４５号明細書を参照）、およびこれらのアナログ体またはホモログが挙げられる。放射性イオンには、限定するものではないが、ヨウ素（例えばヨウ素１２５またはヨウ素１３１）、ストロンチウム８９、リン、パラジウム、セシウム、イリジウム、ホスファート、コバルト、イットリウム９０、サマリウム１５３およびプラセオジミウムが挙げられる。その他の治療薬には、限定するものではないが、代謝拮抗物質（例えばメトトレキセート、６‐メルカプトプリン、６‐チオグアニン、シタラビン、５‐フルオロウラシル デカルバジン（ｄｅｃａｒｂａｚｉｎｅ））、アルキル化剤（例えばメクロレタミン、チオエパ（ｔｈｉｏｅｐａ） クロラムブシル、ＣＣ‐１０６５、メルファラン、カルマスティン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロトスファミド（ｃｙｃｌｏｔｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、およびシス‐ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン類（例えばダウノルビシン（以前はダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例えばダクチノマイシン（以前はアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアントラマイシン（ＡＭＣ））、ならびに抗有糸分裂剤（例えばビンクリスチン、ビンブラスチン、タキソールおよびメイタンシノイド類）が挙げられる。
ペイロード：検出可能な作用薬
検出可能な物質の例には、様々な有機小分子、無機化合物、ナノ粒子、酵素または酵素基質、蛍光材料、発光材料、生物発光材料、化学発光材料、放射性物質、および造影剤が挙げられる。そのような光学的に検出可能な標識には、例えば、限定するものではないが、４‐アセトアミド‐４’‐イソチオシアナトスチルベン‐２，２’ジスルホン酸；アクリジンおよび誘導体：アクリジン、アクリジンイソチオシアナート；５‐（２’‐アミノエチル）アミノナフタレン‐１‐スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）；４‐アミノ‐Ｎ‐［３‐ビニルスルホニル）フェニル］ナフタルイミド‐３，５ジスルホナート；Ｎ‐（４‐アニリノ‐１‐ナフチル）マレイミド；アントラニルアミド；ＢＯＤＩＰＹ；ブリリアントイエロー；クマリンおよび誘導体；クマリン、７‐アミノ‐４‐メチルクマリン（ＡＭＣ、クマリン１２０）、７‐アミノ‐４‐トリフルオロメチルクルアリン（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌｃｏｕｌｕａｒｉｎ）（クマラン（Ｃｏｕｍａｒａｎ）１５１）；シアニン色素；シアノシン；４’，６‐ジアミニジノ（ｄｉａｍｉｎｉｄｉｎｏ）‐２‐フェニルインドール（ＤＡＰＩ）；５’５”‐ジブロモピロガロール‐スルホナフタレイン（ｓｕｌｆｏｎａｐｈｔｈａｌｅｉｎ）（ブロモピロガロールレッド）；７‐ジエチルアミノ‐３‐（４’‐イソチオシアナトフェニル）‐４‐メチルクマリン；ジエチレントリアミン五酢酸；４，４’‐ジイソチオシアナトジヒドロ‐スチルベン‐２，２’‐ジスルホン酸；４，４’‐ジイソチオシアナトスチルベン‐２，２’‐ジスルホン酸；５‐［ジメチルアミノ］‐ナフタレン‐１‐スルホニルクロリド（ＤＮＳ、塩化ダンシル）；４‐ジメチルアミノフェニルアゾフェニル‐４’‐イソチオシアナート（ＤＡＢＩＴＣ）；エオシンおよび誘導体；エオシン、エオシンイソチオシアナート、エリトロシンおよび誘導体；エリトロシンＢ、エリトロシン、イソチオシアナート；エチジウム；フルオレセインおよび誘導体；５‐カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、５‐（４，６‐ジクロロトリアジン‐２‐イル）アミノフルオレセイン（ＤＴＡＦ）、２’，７’‐ジメトキシ‐４’５’‐ジクロロ‐６‐カルボキシフルオレセイン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアナート、ＱＦＩＴＣ、（ＸＲＩＴＣ）；フルオレサミン；ＩＲ１４４；ＩＲ１４４６；マラカイトグリーンイソチオシアナート；４‐メチルウンベリフェロンオルトクレゾールフタレイン；ニトロチロシン；パラローズアニリン；フェノールレッド；Ｂ‐フィコエリトリン；ｏ‐フタルジアルデヒド；ピレンおよび誘導体：ピレン、ピレンブチラート、スクシンイミジル１‐ピレン；ブチラート量子ドット；リアクティブレッド４（Ｃｉｂａｃｒｏｎ（商標）ブリリアントレッド３Ｂ‐Ａ）ローダミンおよび誘導体：６‐カルボキシ‐Ｘ‐ローダミン（ＲＯＸ）、６‐カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ）、リサミンローダミンＢスルホニルクロリドローダミン（Ｒｈｏｄ）、ローダミンＢ、ローダミン１２３、ローダミンＸイソチオシアナート、スルホローダミンＢ、スルホローダミン１０１、スルホローダミン１０１のスルホニルクロリド誘導体（テキサスレッド）；Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’テトラメチル‐６‐カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）；テトラメチルローダミン；テトラメチルローダミンイソチオシアナート（ＴＲＩＴＣ）；リボフラビン；ロゾール酸；テルビウムキレート誘導体；シアニン‐３（Ｃｙ３）；シアニン‐５（Ｃｙ５）；シアニン‐５．５（Ｃｙ５．５）、シアニン‐７（Ｃｙ７）；ＩＲＤ７００；ＩＲＤ８００；アレクサ（Ａｌｅｘａ）６４７；ラジョルタブルー（Ｌａ Ｊｏｌｔａ Ｂｌｕｅ）；フタロシアニン；ならびにナフタロシアニン、が挙げられる。いくつかの実施形態では、検出可能な標識はＣｙ５およびＣｙ３のような蛍光色素である。
実施例の発光材料にはルミノールが含まれ；生物発光材料の例には、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンが挙げられる。
適切な放射性物質の例には、１８Ｆ、６７Ｇａ、８１ｍＫｒ、８２Ｒｂ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１３３Ｘｅ、２０１Ｔｌ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、もしくは３Ｈ、直接間接を問わず９９ｍＴｃ（例えば、過テクネチウム酸塩（テクネタート（ＶＩＩ）、ＴｃＯ４ −として）、または、放射線放射（ｒａｄｉｏｅｍｉｓｓｉｏｎ）の直接計数またはシンチレーション計数によって検出可能な他の放射性同位体、が挙げられる。
加えて、造影剤、例えばＭＲＩまたはＮＭＲ用の造影剤、Ｘ線ＣＴ、ラマンイメージング、光コヒーレンストモグラフィ、吸収イメージング、超音波イメージング、または熱感知イメージング用の造影剤が使用されうる。典型的な造影剤には、金（例えば金ナノ粒子）、ガドリニウム（例えばキレート化Ｇｄ）、酸化鉄（例えば超常磁性酸化鉄（ＳＰＩＯ）、単結晶酸化鉄ナノ粒子（ＭＩＯＮ）、および超微小超常磁性酸化鉄（ＵＳＰＩＯ））が含まれ、さらにマンガンキレート化合物（例えばＭｎ‐ＤＰＤＰ）、硫酸バリウム、ヨード造影剤（イオヘキソール）、マイクロバブル、またはペルフルオロカーボンも使用されうる。
いくつかの実施形態では、検出可能な作用薬は、検出不可能な前駆体であって活性化されると検出可能となるものである。例としては、蛍光性のテトラジン‐発蛍光団構築物（例えば、テトラジン‐ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、テトラジン‐オレゴングリーン４８８、もしくはテトラジン‐ＢＯＤＩＰＹ ＴＭＲ‐Ｘ）または酵素活性化型の蛍光性作用薬（例えばＰＲＯＳＥＮＳＥ（ビゼン・メディカル（ＶｉｓＥｎ Ｍｅｄｉｃａｌ）））が挙げられる。
化合物が例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、またはルシフェラーゼを用いて酵素標識される場合、該酵素標識は適切な基質の生成物への変換を測定することにより検出される。
これらの組成物が使用されうるｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイには、酸素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、免疫沈降法、免疫蛍光法、酵素免疫検定法（ＥＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、およびウエスタンブロット解析が挙げられる。
本明細書中に記載されたもの以外の標識、例えば他の光学的に検出可能な標識は、本開示によって検討されている。標識は、開裂可能なリンカーが開裂すると組み入れられた塩基から該標識が取り除かれうるように、標準的な化学構造物を使用して本開示の修飾ヌクレオチドの任意の部位に取り付けることができる。
ペイロード：細胞膜透過性のペイロード
いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドおよび修飾核酸は、組成物の細胞内送達を増強する細胞膜透過性の構成部分（ｍｏｉｅｔｙ）または作用薬となりうるペイロードを備えることもできる。例えば、組成物は、細胞内空間への送達を促進する細胞膜透過性ペプチド配列、例えばＨｌＶ由来ＴＡＴペプチド、ペネトラチン、トランスポータン、またはｈＣＴ由来細胞透過性ペプチドを含むことが可能であり、例えば、キャロン（Ｃａｒｏｎ）ら、モレキュラー・セラピー（Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．）、２００１年、第３巻、第３号、ｐ．３１０−８；
ランゲル（Ｌａｎｇｅｌ）、「細胞膜透過性ペプチド：プロセスと応用（Ｃｅｌｌ−Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ： Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」、米国フロリダ州ボカラトン、ＣＲＣプレス、２００２年；エル‐アンダロッシ（Ｅｌ−Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉ）ら、カレント・ファーマシューティカル・デザイン（Ｃｕｒｒ Ｐｈａｒｍ Ｄｅｓ．）、２００５年、第１１巻、第２８号、ｐ．３５９７−６１１；およびデエー（Ｄｅｓｈａｙｅｓ）ら、セルラー・アンド・モレキュラー・ライフ・サイエンシズ（Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．）、２００５年、第６２巻、第１６号、ｐ．１８３９−４９を参照されたい。組成物は、細胞内空間への組成物の送達を増強する細胞膜透過剤、例えばリポソームを含むように調合されることも可能である。
ペイロード：生物学的標的
本明細書中に記載された修飾ヌクレオチドおよび修飾核酸は、任意の生物学的標的であって該標的に対する特異的リガンドが存在するかまたは特異的リガンドを生成せしめることが可能な生物学的標的に、ペイロードを送達するために使用されうる。該リガンドは該生物学的標的に共有結合または非共有結合のいずれかにより結合することができる。
典型的な生物学的標的には、生体高分子、例えば抗体、ＲＮＡおよびＤＮＡのような核酸、タンパク質、酵素が含まれ；典型的なタンパク質には酵素、レセプター、およびイオンチャネルが含まれる。いくつかの実施形態では、該標的は、組織または細胞の種類に特異的なマーカー、例えば選択された組織または細胞の種類において特異的に発現されるタンパク質である。いくつかの実施形態では、該標的はレセプター、例えば、限定するものではないが、原形質膜レセプターおよび核内受容体；より具体的な例には、Ｇタンパク質共役レセプター、細胞ポアタンパク質、輸送体タンパク質、表面に発現された抗体、ＨＬＡタンパク質、ＭＨＣタンパク質および成長因子レセプターが挙げられる。
［修飾ヌクレオチドの合成］
本明細書中に開示された修飾ヌクレオシドおよびヌクレオチドは、次の一般的な方法および手順を使用して、容易に入手可能な出発物質から調製することができる。当然ながら、典型的または好ましい工程条件（すなわち反応温度、回数、反応物のモル比、溶媒、圧力など）が与えられる場合でも；特に断りのない限りその他の工程条件も使用されうる。最適の反応条件は使用される特定の反応物または溶媒に応じて変化しうるが、そのような条件は、日常作業的な最適化手順により当業者が決定可能である。
本明細書中に記載された工程は、当分野で既知の任意の適切な方法によってモニタリングされうる。例えば、生成物の形成は、分光学的手段、例えば核磁気共鳴法（例えば１Ｈもしくは１３Ｃ）赤外分光法、分光測光法（例えば、ＵＶ‐可視）、もしくは質量分析法によって、または、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）もしくは薄層クロマトグラフィのようなクロマトグラフィ法によって、モニタリングされうる。
修飾型のヌクレオシドおよびヌクレオチドの調製には、様々な化学基の保護および脱保護を伴う可能性がある。保護および脱保護の必要性、ならびに適切な保護基の選択は、当業者によって容易に判断されうる。保護基の化学構造は、例えば、グリーン（Ｇｒｅｅｎｅ）ら、「有機合成における保護基（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」、第２版、ワイリー・アンド・サンズ（Ｗｉｌｅｙ
ａｎｄ Ｓｏｎｓ）、１９９１年に見出すことが可能であり、前記文献は参照により全体が本明細書中に組込まれる。
本明細書中に記載された工程の反応は適切な溶媒中で行なうことが可能であり、該溶媒は有機合成分野の当業者によって容易に選択されうる。適切な溶媒は、反応が行なわれる温度、すなわち該溶媒の凍結温度から該溶媒の沸騰温度まで及びうる温度において、出発物質（反応物）、中間物、または生成物とほぼ無反応性であってよい。所与の反応は、１つの溶媒中で行われてもよいし、２以上の溶媒の混合物中で行なわれてもよい。特定の反応ステップに応じて、特定の反応ステップに適した溶媒が選択されうる。
修飾型のヌクレオシドおよびヌクレオチドのラセミ混合物の分割は、当分野で既知の数多くの方法のうち任意の方法によって実行されうる。実例の方法には、光学活性な、塩を形成する有機酸である「キラル分割用の酸（ｃｈｉｒａｌ ｒｅｓｏｌｖｉｎｇ ａｃｉｄ）」を使用する、分別再結晶化が含まれる。分別再結晶化法に適した分割剤は、例えば、光学活性な酸、例えばＤ型およびＬ型の酒石酸、ジアセチル酒石酸、ジベンゾイル酒石酸、マンデル酸、リンゴ酸、乳酸、または様々な光学活性なカンファースルホン酸である。ラセミ混合物の分割は、光学活性な分割剤（例えばジニトロベンゾイルフェニルグリシン）を用いて充填されたカラムでの溶離によっても実行可能である。適切な溶離溶媒の組成は当業者により決定されうる。
ポリヌクレオチド（例えばＲＮＡ、ｍＲＮＡ）に組込まれる修飾ヌクレオチドの典型的な合成は、スキーム２〜スキーム１２によって以下に提供される。スキーム２は修飾ヌクレオシドを含むヌクレオシドのリン酸化のための一般的な方法を提供する。

反応を制御するために様々な保護基が使用されうる。例えば、スキーム３は、２’および３’ヒドロキシル基ではなく糖の５’位におけるリン酸化を促進するための複数の保護および脱保護ステップの使用を提供する。

修飾ヌクレオチドは任意の有用な方法で合成されうる。スキーム４、５および８は、修飾型のプリン核酸塩基を有する修飾ヌクレオチドを合成するための典型的な方法を提供し；スキーム６および７は、それぞれ修飾型のプソイドウリジンまたはプソイドイソシチジンを有する修飾ヌクレオチドを合成するための典型的な方法を提供している。






スキーム９および１０は修飾ヌクレオチドの典型的な合成を提供する。スキーム１１は、ヌクレオチドを生産するための非限定的な生体触媒による方法を提供する。




スキーム１２は、主溝面上のＮ１位が他所で提示されるようにＲ１２ｂで修飾され、かつリボースの５’位がリン酸化される、修飾ウラシルの典型的な合成を提供している。Ｔ１、Ｔ２、Ｒ１２ａ、Ｒ１２ｂ、およびｒは本明細書中に提供される通りである。この合成、およびこれを最適化したものは、他のピリミジン核酸塩基およびプリン核酸塩基（例えば、式（ｂ１）‐（ｂ４３）を参照）の主溝面の修飾、および１つ以上のリン酸基の（例えば糖の５’位への）取り付け、のうち少なくともいずれかのために使用されうる。このアルキル化反応は、本明細書中に記載された任意の核酸塩基の任意の反応性基（例えばアミノ基）（例えばシトシン、ウラシル、アデニンおよびグアニンのワトソン‐クリック型塩基対の面におけるアミノ基）に１つ以上の任意選択で置換されたアルキル基を含めるためにも使用されうる。

修飾型のヌクレオシドおよびヌクレオチドは、オガタ（Ｏｇａｔａ）ら、ジャーナル・オブ・オーガニック・ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、２００９年、第７４巻、ｐ．２５８５−２５８８；パーマル（Ｐｕｒｍａｌ）ら、ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、１９９４年、第２２巻、第１号、ｐ．７２−７８；フクハラ（Ｆｕｋｕｈａｒａ）ら、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、１９６２年、第１巻、第４号、ｐ．５６３−５６８；およびシュー（Ｘｕ）ら、テトラヘドロン（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ）、１９９２年、第４８巻、第９号、ｐ．１７２９−１７４０、に記載された合成法によって調製可能であり、前記文献はそれぞれその全体が参照により援用される。
［修飾核酸］
本開示は、本明細書中に記載されるような１つ以上の修飾ヌクレオシド（「修飾核酸」と呼ばれる）またはヌクレオチドを含有するｍＲＮＡのようなＲＮＡを含む核酸（またはポリヌクレオチド）であって、該ｍＲＮＡが導入される細胞の先天性免疫応答の実質的な誘導の欠如を含む有用な特性を有する、核酸を提供する。これらの修飾核酸は、タンパク質産生の効率、核酸の細胞内保持、および接触を受けた細胞の生存度を高めるうえに、低い免疫原性を有するので、これらの特性を有する上記核酸は本明細書中では「増強核酸」とも呼ばれる。
加えて、本開示は、主溝と相互作用（例えば結合）するパートナーに対して低い結合親和性を有する核酸を提供する。例えば、該核酸は、本明細書中に記載されるような主溝面上において化学修飾された少なくとも１つのヌクレオチドで構成されている。
用語「核酸」には、その最も広い意味において、オリゴヌクレオチド鎖に組み入れられているかまたは組み入れ可能な任意の化合物および物質のうち少なくともいずれかが含まれる。この意味においては、核酸という用語はポリヌクレオチドと同義的に使用される。本開示に従って使用するための典型的な核酸には、限定するものではないが、１以上のＤＮＡ、メッセンジャーｍＲＮＡ（ｍＲＮＡ）などのＲＮＡ、これらのハイブリッド、ＲＮＡｉ誘発剤、ＲＮＡｉ剤、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、触媒ＤＮＡ、三重らせん形成を誘導するＲＮＡ、アプタマー、ベクターなどが含まれ、本明細書中に詳細に記載される。
提供されるのは、翻訳可能な領域と、１個、２個、または３個以上の異なるヌクレオシド修飾とを含んでいる修飾核酸である。いくつかの実施形態では、修飾核酸は、該核酸が導入されている細胞内において、対応する未修飾の核酸に比べて低減された分解を示す。典型的な核酸には、リボ核酸（ＲＮＡ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、またはこれらのハイブリッドが含まれる。好ましい実施形態では、修飾核酸はメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含む。本明細書中に記載されるように、本開示の核酸は該ｍＲＮＡが導入されている細胞の先天性免疫応答をほとんど誘発しない。
ある実施形態では、例えばタンパク質産生の正確な時期選択が望まれる場合、細胞内に導入された修飾核酸を例えば細胞内で分解することが望ましい。したがって、本開示は、細胞内で指定の方法で作用せしめることが可能な分解ドメインを含有する修飾核酸分子を提供する。
核酸の他の構成成分は任意選択であり、いくつかの実施形態において有益である。例えば、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）および３’ＵＴＲのうち少なくともいずれかであって、一方または両方が独立に１つ以上の異なるヌクレオシド修飾を含みうるＵＴＲが提供される。そのような実施形態では、ヌクレオシドの修飾は翻訳可能な領域中にも存在することができる。さらに、コザック配列を含んでいる核酸も提供される。
さらに提供されるのは、核酸であって該核酸から除去されうる１つ以上のイントロン性ヌクレオチド配列を含んでいる核酸である。
さらに、提供されるのは、内部リボソーム導入部位（ＩＲＥＳ）を含んでいる核酸である。ＩＲＥＳは唯一のリボソーム結合部位として作用してもよいし、ｍＲＮＡの複数のリボソーム結合部位のうちの１つとしての役割を果たしてもよい。２以上の機能的なリボソーム結合部位を含むｍＲＮＡは、リボソームによって独立に翻訳される数個のペプチドまたはポリペプチドをコードすることができる（「マルチシストロン性ｍＲＮＡ」）。核酸がＩＲＥＳとともに提供される場合、さらに任意選択で提供されるのは第２の翻訳可能な領域である。本開示に従って使用されうるＩＲＥＳ配列の例には、限定するものではないが、ピコルナウイルス（例えばＦＭＤＶ）、ペストウイルス（ＣＦＦＶ）、ポリオウイルス（ＰＶ）、脳心筋炎ウイルス（ＥＣＭＶ）、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス、豚コレラウイルス（ＣＳＦＶ）、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）またはコオロギ麻痺ウイルス（ＣｒＰＶ）由来のものが挙げられる。
別の態様では、本開示は、少なくとも２つのヌクレオチドを含んでなる核酸配列であって、該核酸配列は主溝と結合するパートナーが該核酸配列と結合するのを妨害するヌクレオチドを含んでなり、該ヌクレオチドは、主溝と結合するパートナーに対して低い結合親和性を有する、核酸配列を提供する。
いくつかの実施形態では、核酸は式ＸＩ‐ａ：

の化合物であり、上記式中、

は任意選択の二重結合を表し；

は任意選択の単結合を表し；

が単結合を表すとき、ＵはＯ、Ｓ、‐ＮＲａ‐もしくは‐ＣＲａＲｂ‐であるか、または

が二重結合を表すとき、Ｕは‐ＣＲａ‐であり；
ＡはＨ、ＯＨ、ホスホリル、ピロホスファート、スルファート、‐ＮＨ２、‐ＳＨ、アミノ酸、２〜１２個のアミノ酸を含んでなるペプチドであり；
ＸはＯまたはＳであり；
Ｙ１はそれぞれ独立に、‐ＯＲａ１、‐ＮＲａ１Ｒｂ１、および‐ＳＲａ１から選択され；
Ｙ２およびＹ３はそれぞれ独立に、Ｏ、‐ＣＲａＲｂ‐、ＮＲｃ、ＳまたはリンカーであってＣ、Ｏ、ＮおよびＳで構成されている群から選択された１つ以上の原子を含んでなるリンカーであり；
ＲａおよびＲｂはそれぞれ独立に、Ｈ、Ｃ１‐１２アルキル、Ｃ２‐１２アルケニル、Ｃ２‐１２アルキニル、またはＣ６‐２０アリールであり；
Ｒｃは、Ｈ、Ｃ１‐１２アルキル、Ｃ２‐１２アルケニル、フェニル、ベンジル、ポリエチレングリコール基、またはアミノ‐ポリエチレングリコール基であり；
Ｒａ１およびＲｂ１はそれぞれ独立に、Ｈまたはカウンターイオンであり；
‐ＯＲｃ１は約１のｐＨにおいてＯＨであるか、または‐ＯＲｃ１は生理的なｐＨにおいてＯ−であり；かつ
Ｂは核酸塩基であり；
ただし、可変部Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｕ、Ｚ、Ｙ２およびＹ３を包含する環はリボースにはなりえないものとする。
いくつかの実施形態では、Ｂは、式ＸＩＩ‐ａ、ＸＩＩ‐ｂ、またはＸＩＩ‐ｃ：

の核酸塩基であって、上記式中、

は単結合または二重結合を表し；
ＸはＯまたはＳであり；
ＵおよびＷはそれぞれ独立にＣまたはＮであり；
ＶはＯ、Ｓ、ＣまたはＮであり；
ＶがＣである場合、Ｒ１は、Ｈ、Ｃ１‐６アルキル、Ｃ１‐６アルケニル、Ｃ１‐６アルキニル、ハロ、または‐ＯＲｃであって、Ｃ１‐２０アルキル、Ｃ２‐２０アルケニル、Ｃ２‐２０アルキニルはそれぞれ任意選択で‐ＯＨ、‐ＮＲａＲｂ、‐ＳＨ、‐Ｃ（Ｏ）Ｒｃ、‐Ｃ（Ｏ）ＯＲｃ、‐ＮＨＣ（Ｏ）Ｒｃ、または‐ＮＨＣ（Ｏ）ＯＲｃで置換されており；
かつ、ＶがＯ、Ｓ、またはＮである場合、Ｒ１は存在せず；
Ｒ２は、Ｈ、‐ＯＲｃ、‐ＳＲｃ、‐ＮＲａＲｂ、もしくはハロであるか；
または、ＶがＣである場合、Ｒ１およびＲ２は、それらが結合している炭素原子と一緒になって、ハロ、‐ＯＨ、‐ＳＨ、‐ＮＲａＲｂ、Ｃ１‐２０アルキル、Ｃ２‐２０アルケニル、Ｃ２‐２０アルキニル、Ｃ１‐２０アルコキシ、もしくはＣ１‐２０チオアルキルから選択された１〜４個の置換基で任意選択で置換された、５員環または６員環を形成してもよく；
Ｒ３はＨまたはＣ１‐２０アルキルであり；
Ｒ４はＨまたはＣ１‐２０アルキルであって；

が二重結合を表す場合、Ｒ４は存在しないか、またはＮ‐Ｒ４が一緒になって、Ｃ１‐２０アルキルで置換された正電荷のＮを形成し；
ＲａおよびＲｂはそれぞれ独立に、Ｈ、Ｃ１‐２０アルキル、Ｃ２‐２０アルケニル、Ｃ２‐２０アルキニル、またはＣ６‐２０アリールであり；かつ
Ｒｃは、Ｈ、Ｃ１‐２０アルキル、Ｃ２‐２０アルケニル、フェニル、ベンジル、ポリエチレングリコール基、またはアミノ‐ポリエチレングリコール基である。
いくつかの実施形態では、Ｂは、式ＸＩＩ‐ａ１、ＸＩＩ‐ａ２、ＸＩＩ‐ａ３、ＸＩＩ‐ａ４、またはＸＩＩ‐ａ５：

の核酸塩基である。
いくつかの実施形態では、核酸塩基はピリミジンまたはその誘導体である。
いくつかの実施形態では、核酸は、複数の構造的に特有な式ＸＩ‐ａの化合物を含んでいる。
いくつかの実施形態では、シトシンの少なくとも２５％が式ＸＩ‐ａの化合物によって置き換えられる（例えば少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％）。
いくつかの実施形態では、ウラシルの少なくとも２５％が式ＸＩ‐ａの化合物によって置き換えられる（例えば少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％）。
いくつかの実施形態では、少なくともシトシンの２５％およびウラシルの２５％が、式ＸＩ‐ａの化合物によって置き換えられる（例えば少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％）。
いくつかの実施形態では、核酸は翻訳可能である。
いくつかの実施形態では、核酸が、例えば本明細書中に記載されるようにして、リンカーおよびペイロードで修飾されたヌクレオチドを備える場合、リンカーおよびペイロードで修飾されたヌクレオチドは該核酸の３’末端上にある。
［主溝と相互作用するパートナー］
本明細書中に記載されるように、「主溝と相互作用するパートナー」という言葉は、ヌクレオチドまたは核酸の主溝面との相互作用（例えば結合）を通じてＲＮＡリガンドを検出し、かつ該ＲＮＡリガンドに応答するＲＮＡ認識受容体を指す。そのため、本明細書中に記載されるような修飾ヌクレオチドまたは核酸を含んでなるＲＮＡリガンドは、主溝と結合するパートナーとの相互作用を低下せしめ、したがって、先天性免疫応答、もしくは炎症誘発性サイトカインの発現および分泌、または両方を低下せしめる。
主溝と相互作用（例えば結合）するパートナーの例には、限定するものではないが、次のヌクレアーゼおよびヘリカーゼが挙げられる。膜内では、ＴＬＲ（トール様受容体：Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）３、７および８は一本鎖および二本鎖ＲＮＡに応答することができる。細胞質内では、ＤＥＸ（Ｄ／Ｈ）ヘリカーゼのスーパーファミリー２に属するメンバーおよびＡＴＰアーゼは、ＲＮＡを感知して抗ウイルス性の応答を開始することができる。これらのヘリカーゼには、ＲＩＧ‐Ｉ（ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｇｅｎｅ Ｉ）およびＭＤＡ５（ｍｅｌａｎｏｍａ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ５）が含まれる。他の例は、ＬＧＰ２（ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ２）、タンパク質を含んでいるＨＩＮ‐２００ドメインを含有するタンパク質、またはヘリカーゼドメイン含有するタンパク質が挙げられる。
［先天性細胞性免疫応答の予防または低減］
用語「先天性免疫応答」には、一般にはウイルスまたは細菌を起源とする外因性の一本鎖核酸に対する細胞の応答であってサイトカインの発現および放出（特にインターフェロン）ならびに細胞死の誘導を伴う応答が含まれる。タンパク質合成も先天性細胞性免疫応答の間に低減される。外因性の核酸の導入が引き金となって起きる細胞内の先天性免疫応答を排除することは好都合であるが、本開示は、そのような応答を完全に排除することなくインターフェロンシグナル伝達を含む免疫応答を十分に低減する、ｍＲＮＡのような修飾核酸を提供する。いくつかの実施形態では、免疫応答は、対応する未修飾核酸によって誘発される免疫応答と比較して１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、９９．９％、または９９．９％を越えて低減される。そのような低減は、１型インターフェロンの発現もしくは活性のレベル、またはトール様受容体（例えばＴＬＲ７およびＴＬＲ８）のようなインターフェロン調節を受ける遺伝子の発現によって、測定されうる。先天性免疫応答の誘導の低減または欠如は、細胞集団に修飾ＲＮＡを１回以上投与した後の細胞死の減少によっても測定可能であり；例えば、細胞死は、対応する未修飾核酸を用いて観察される細胞死の頻度よりも、１０％、２５％、５０％、７５％、８５％、９０％、９５％、または９５％以上少ない。さらに、細胞死は、修飾核酸と接触せしめられた細胞の５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、１％、０．１％、０．０１％または０．０１％未満に生じうる。
いくつかの実施形態では、修飾核酸、例えばポリヌクレオチドおよびｍＲＮＡ分子のうち少なくともいずれかは、受容側の細胞または生物体による免疫応答を誘発しないか、または最小限にのみ誘発するような方法で、修飾される。免疫応答の誘因または活性化をそのように回避すなわち免れることは、本発明の修飾ポリヌクレオチドの新規な特徴である。
本開示は、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、またはｉｎ ｖｉｖｏにおける、標的細胞集団への修飾核酸の反復的導入（例えばトランスフェクション）を提供する。細胞集団と接触せしめるステップは、１回以上（例えば２、３、４、５回または６回以上）反復されうる。いくつかの実施形態では、細胞集団を修飾核酸と接触せしめるステップは、該細胞集団におけるタンパク質翻訳の所定の効率が達成されるのに十分な回数だけ反復される。核酸の修飾によって提供される標的細胞集団の細胞毒性が低いことを前提とすれば、そのような反復的なトランスフェクションは、多種多様な種類の細胞においてｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏのうち少なくともいずれかにおいて達成可能である。
［ポリペプチドのバリアント］
基準のポリペプチド配列との一定の同一性を有するバリアントのポリペプチドをコードする核酸が提供される。用語「同一性」は、当分野で知られているように、配列の比較により判定されるような２以上のペプチドの配列間の関係を指す。当分野では、「同一性」はさらに、２以上のアミノ酸残基の連なりの間の一致の数によって決定されるような、ペプチド間の配列関連性の程度をも意味する。「同一性」は、特定の数理モデルまたはコンピュータプログラム（すなわち「アルゴリズム」）によってアドレス指定されたギャップアラインメント（もしあれば）を備えた２以上の配列の小さなほうの完全一致の比率（％）を尺度とする。関連するペプチドの同一性は、既知の方法によって容易に計算されうる。そのような方法には、限定するものではないが、レスク（Ｌｅｓｋ）、Ａ．Ｍ．編、「分子計算生物学（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、米国ニューヨーク、オックスフォード大学出版局（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ）、１９８８年；スミス（Ｓｍｉｔｈ）、Ｄ．Ｗ．編、「バイオコンピューティング：インフォマティクスおよびゲノムプロジェクト（Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ： Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ）」、米国ニューヨーク、アカデミックプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、１９９３年；グリフィン（Ｇｒｉｆｆｉｎ）、Ａ．Ｍ．およびグリフィン（Ｇｒｉｆｆｉｎ）、Ｈ．Ｇ．編、「配列データのコンピュータ解析、パート１（Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ， Ｐａｒｔ １）」、米国ニュージャージー州、ヒューマナプレス（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ）、１９９４年；フォン・ハイネ（ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ）、Ｇ．、「分子生物学における配列解析（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、アカデミックプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、１９８７年；グリプスコウ（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ）、Ｍ．およびデヴェルー（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ）、Ｊ．編、「配列解析プライマー（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ
Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ）」、米国ニューヨーク、Ｍ．ストックトンプレス（Ｍ． Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ）、１９９１年；ならびにカリージョ（Ｃａｒｉｌｌｏ）ら、ＳＩＡＭジャーナル・オン・アプライド・マスマティックス（ＳＩＡＭ Ｊ．
Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．）、１９８８年、第４８巻、ｐ．１０７３、に記載されているものが挙げられる。
いくつかの実施形態では、ポリペプチドのバリアントは基準のポリペプチドと同一または同様の活性を有している。別例として、バリアントは基準ポリペプチドと比較して変化した活性（例えば増大または低下した活性）を有する。一般に、本開示の特定のポリヌクレオチドまたはポリペプチドのバリアントは、本明細書中に記載されかつ当業者に既知の配列アラインメントのプログラムおよびパラメータによって決定されるように、特定の基準ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに対して少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有することになろう。
当業者には認識されているように、タンパク質フラグメント、機能タンパク質ドメイン、および相同タンパク質も、本開示の範囲内にあると考えられる。例えば、本明細書中に提供されるのは、長さが１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００アミノ酸または１００個を超えるアミノ酸長の、基準タンパク質の任意のタンパク質フラグメント（基準ポリペプチド配列より少なくとも１アミノ酸残基短いが、それ以外は同一であるポリペプチド配列を意味する）である。別の例において、本明細書中に記載された配列のうち任意の配列と約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、または約１００％同一である、一続きの約２０、約３０、約４０、約５０、または約１００アミノ酸を含む任意のタンパク質が、本開示に従って利用されてもよい。ある実施形態では、本開示に従って利用されるタンパク質配列は、本明細書中において提供または言及された配列のうちいずれかに示されるように、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれ以上の突然変異を備えている。
［ポリペプチドライブラリ］
さらに提供されるのは、ヌクレオシド修飾を含んでいるポリヌクレオチドライブラリであって、該ポリヌクレオチドは、抗体、タンパク質結合パートナー、スカフォールドタンパク質、および当分野で既知の他のポリペプチドのようなポリペプチドをコードする第１の核酸配列を個々に含んでいる。好ましくは、該ポリヌクレオチドは、標的細胞宿主の中に直接導入するのに適した形態のｍＲＮＡであって、該宿主は次にコードされたポリペプチドを合成する。
ある実施形態では、各々が異なるアミノ酸修飾を備えた複数のタンパク質バリアントが産生されて、薬物動態、安定性、生体適合性、および生物学的活性のうち少なくともいずれか、または発現レベルのような生物物理学的特性の点で、最良のバリアントを決定するために試験される。そのようなライブラリは、１０、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９個、または１０９個を上回る可能なバリアント（１以上の残基の置換、欠失、および１以上の残基の挿入を備えたバリアント）を包含している。
［ポリペプチド‐核酸複合体］
適切なタンパク質翻訳には、そのｍＲＮＡに関連したいくつかのポリペプチドおよび核酸の物理的な凝集を伴う。本開示によって提供されるのは、１以上のヌクレオシド修飾（例えば少なくとも２個の異なるヌクレオシド修飾）を有する翻訳可能なｍＲＮＡと、該ｍＲＮＡに結合した１以上のポリペプチドとを包含しているタンパク質‐核酸複合体である。一般に、タンパク質は、該複合体が導入される細胞の先天性免疫応答を予防または低減するのに有効な量で提供される。
［翻訳不可能な修飾核酸］
本明細書中に記載されるように、ほぼ翻訳不可能な配列を有するｍＲＮＡが提供される。そのようなｍＲＮＡは、哺乳動物の対象者に投与された時にワクチンとして効果的である。
さらに、１以上の非コード領域を含んでいる修飾核酸も提供される。そのような修飾核酸は一般に翻訳されないが、リボソームタンパク質または転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）のような１つ以上の翻訳機構構成成分に結合かつ捕捉することが可能であることによって、細胞内におけるタンパク質発現を有効に低減する。該修飾核酸は、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏ‐ＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）またはＰｉｗｉ結合ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）を含みうる。
［修飾核酸の合成］
本開示に従って使用される核酸は、任意の利用可能な技法、例えば、限定するものではないが、化学合成、一般にはｉｎ ｖｉｔｒｏ転写と呼ばれる酵素的合成、より長い先駆物質の酵素的開裂または化学的開裂などによって調製されうる。ＲＮＡを合成する方法は当分野において既知である（例えば、ゲイト（Ｇａｉｔ）、ＭＪ編、「オリゴヌクレオチド合成：実践的アプローチ（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ： ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ）」、オックスフォード［オックスフォードシャー州］、米国ワシントンＤＣ：ＩＲＬプレス（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ）、１９８４年；およびヘルデワイン（Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ）、Ｐ．編、「オリゴヌクレオチド合成：方法および応用（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ： ｍｅｔｈｏｄｓ
ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」、メソッズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、第２８８巻、（米国ニュージャージー州クリフトン）米国ニュージャージー州トトワ、ヒューマナプレス（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ）、２００５年を参照されたい。これらの文献はいずれも参照により本願に組込まれる）。
修飾核酸は、該分子の全長に沿って一様に修飾される必要はない。様々なヌクレオチド修飾およびバックボーン構造のうち少なくともいずれかが該核酸中の様々な部位に存在することができる。当業者には当然のことであろうが、ヌクレオチドのアナログ体またはその他の修飾物は、核酸の機能がほとんど低下しないように該核酸の任意の部位に位置することができる。修飾はさらに、５’末端修飾であっても３’末端修飾であってもよい。核酸は、最小で１個および最大で１００％の修飾ヌクレオチド、または任意のその間の割合（％）、例えば少なくとも５％の修飾ヌクレオチド、少なくとも１０％の修飾ヌクレオチド、少なくとも２５％の修飾ヌクレオチド、少なくとも５０％の修飾ヌクレオチド、少なくとも８０％の修飾ヌクレオチド、もしくは少なくとも９０％の修飾ヌクレオチドを含むことができる。例えば、核酸は、ウラシルまたはシトシンのような修飾ピリミジンを含むことができる。いくつかの実施形態では、核酸中のウラシルの少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または１００％が修飾ウラシルに置き換えられる。修飾ウラシルは、単一の特異構造を有する化合物によって置き換えられてもよいし、異なる構造（例えば２、３、４種類またはそれ以上の特異構造）を有する複数の化合物によって置き換えられてもよい。いくつかの実施形態では、核酸中のシトシンの少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または１００％は修飾シトシンに置き換えられる。修飾シトシンは、単一の特異構造を有する化合物によって置き換えられてもよいし、異なる構造（例えば本明細書中に記載されるような、２、３、４種類またはそれ以上の特異構造）を有する複数の化合物によって置き換えられてもよい。
一般に、最も短い長さの本開示の修飾ｍＲＮＡは、ジペプチドをコードするのに十分な長さのｍＲＮＡ配列となりうる。別の実施形態では、ｍＲＮＡの配列の長さはトリペプチドをコードするのに十分である。別の実施形態では、ｍＲＮＡの配列の長さはテトラペプチドをコードするのに十分である。別の実施形態では、ｍＲＮＡの配列の長さはペンタペプチドをコードするのに十分である。別の実施形態では、ｍＲＮＡの配列の長さはヘキサペプチドをコードするのに十分である。別の実施形態では、ｍＲＮＡの配列の長さはヘプタペプチドをコードするのに十分である。別の実施形態では、ｍＲＮＡの配列の長さはオクタペプチドをコードするのに十分である。別の実施形態では、ｍＲＮＡの配列の長さはノナペプチドをコードするのに十分である。別の実施形態では、ｍＲＮＡの配列の長さはデカペプチドをコードするのに十分である。
修飾核酸配列がコードすることができるジペプチドの例には、限定するものではないが、カルノシンおよびアンセリンが挙げられる。
さらなる実施形態では、ｍＲＮＡは長さが３０ヌクレオチドより長い。別の実施形態では、ＲＮＡ分子は長さが３５ヌクレオチドより長い。別の実施形態では、長さは少なくとも４０ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも４５ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも５５ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも６０ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも６０ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも８０ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも９０ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも１００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも１２０ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも１４０ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも１６０ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも１８０ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも２００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも２５０ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも３００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも３５０ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも４００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも４５０ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも５００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも６００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも７００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも８００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも９００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも１０００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも１１００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも１２００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも１３００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも１４００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも１５００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも１６００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも１８００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも２０００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも２５００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも３０００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも４０００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも５０００ヌクレオチド、または５０００を越えるヌクレオチドである。
例えば、本明細書中に記載された修飾核酸は、核酸合成の当業者に既知の方法を使用して調製されうる。
いくつかの実施形態では、本開示は、核酸配列であって主溝と結合するパートナーが該核酸配列と結合するのを妨害するヌクレオチドを含んでなる核酸配列を調製する方法、例えば酵素的方法を提供し、該核酸配列は、式ＸＩ‐ａ：

の化合物を含んでなり、
上記式中、
該ヌクレオチドは、主溝と結合するパートナーに対して低い結合親和性を有し；

は任意選択の二重結合を表し；

は任意選択の単結合を表し；

が単結合を表すとき、ＵはＯ、Ｓ、‐ＮＲａ‐、もしくは‐ＣＲａＲｂ‐であるか、または、

が二重結合を表すとき、Ｕは‐ＣＲａ‐であり、
ＡはＨ、ＯＨ、ホスホリル、ピロホスファート、スルファート、‐ＮＨ２、‐ＳＨ、アミノ酸、２〜１２個のアミノ酸を含んでなるペプチドであり；
ＸはＯまたはＳであり；
Ｙ１はそれぞれ独立に、‐ＯＲａ１、‐ＮＲａ１Ｒｂ１、および‐ＳＲａ１から選択され；
Ｙ２およびＹ３はそれぞれ独立に、Ｏ、‐ＣＲａＲｂ‐、ＮＲｃ、ＳまたはリンカーであってＣ、Ｏ、ＮおよびＳで構成されている群から選択された１つ以上の原子を含んでなるリンカーであり；
ＲａおよびＲｂはそれぞれ独立に、Ｈ、Ｃ１‐１２アルキル、Ｃ２‐１２アルケニル、Ｃ２‐１２アルキニル、またはＣ６‐２０アリールであり；
Ｒｃは、Ｈ、Ｃ１‐１２アルキル、Ｃ２‐１２アルケニル、フェニル、ベンジル、ポリエチレングリコール基、またはアミノ‐ポリエチレングリコール基であり；
Ｒａ１およびＲｂ１はそれぞれ独立に、Ｈまたはカウンターイオンであり；
‐ＯＲｃ１は約１のｐＨにおいてＯＨであるか、または‐ＯＲｃ１は生理的なｐＨにおいてＯ−であり；かつ
Ｂは核酸塩基であり；
ただし可変部Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｕ、Ｚ、Ｙ２およびＹ３を包含する環はリボースになりえないという条件であって該方法は、式ＸＩＩＩ：

の化合物を、ＲＮＡポリメラーゼ、およびｃＤＮＡ鋳型と、反応させるステップを含んでなる。
いくつかの実施形態では、反応は１回〜約７，０００回反復される。
いくつかの実施形態では、Ｂは、式ＸＩＩ‐ａ、ＸＩＩ‐ｂ、またはＸＩＩ‐ｃ：

の核酸塩基であり、上記式中、

は単結合または二重結合を表し；
ＸはＯまたはＳであり；
ＵおよびＷはそれぞれ独立にＣまたはＮであり；
ＶはＯ、Ｓ、ＣまたはＮであり；
ＶがＣである場合、Ｒ１は、Ｈ、Ｃ１‐６アルキル、Ｃ１‐６アルケニル、Ｃ１‐６アルキニル、ハロ、もしくは‐ＯＲｃであって、Ｃ１‐２０アルキル、Ｃ２‐２０アルケニル、Ｃ２‐２０アルキニルはそれぞれ任意選択で‐ＯＨ、‐ＮＲａＲｂ、‐ＳＨ、‐Ｃ（Ｏ）Ｒｃ、‐Ｃ（Ｏ）ＯＲｃ、‐ＮＨＣ（Ｏ）Ｒｃ、または‐ＮＨＣ（Ｏ）ＯＲｃで置換されており；
ＶがＯ、Ｓ、もしくはＮである場合、Ｒ１は存在せず；
Ｒ２は、Ｈ、‐ＯＲｃ、‐ＳＲｃ、‐ＮＲａＲｂ、もしくはハロであり；
または、ＶがＣである場合、Ｒ１およびＲ２は、それらが結合している炭素原子と一緒になって、ハロ、‐ＯＨ、‐ＳＨ、‐ＮＲａＲｂ、Ｃ１‐２０アルキル、Ｃ２‐２０アルケニル、Ｃ２‐２０アルキニル、Ｃ１‐２０アルコキシ、もしくはＣ１‐２０チオアルキルから選択された１〜４個の置換基で任意選択で置換された、５員環または６員環を形成してもよく；
Ｒ３はＨまたはＣ１‐２０アルキルであり；
Ｒ４はＨまたはＣ１‐２０アルキルであって；

が二重結合を表すとき、Ｒ４は存在しないか、またはＮ‐Ｒ４が一緒になって、Ｃ１‐２０アルキルで置換された正電荷のＮを形成し；
ＲａおよびＲｂはそれぞれ独立に、Ｈ、Ｃ１‐２０アルキル、Ｃ２‐２０アルケニル、Ｃ２‐２０アルキニル、またはＣ６‐２０アリールであり；かつ
Ｒｃは、Ｈ、Ｃ１‐２０アルキル、Ｃ２‐２０アルケニル、フェニル、ベンジル、ポリエチレングリコール基、またはアミノ‐ポリエチレングリコール基である。
いくつかの実施形態では、Ｂは、式ＸＩＩ‐ａ１、ＸＩＩ‐ａ２、ＸＩＩ‐ａ３、ＸＩＩ‐ａ４、またはＸＩＩ‐ａ５：

の核酸塩基である。
いくつかの実施形態では、該方法は、アデノシン、シトシン、グアノシン、およびウラシルから構成されている群から選択されたヌクレオチドをさらに含んでなる。
いくつかの実施形態では、核酸塩基はピリミジンまたはその誘導体である。
別の態様では、本開示は、核酸配列であって主溝と結合するパートナーが該核酸配列と結合するのを妨害するヌクレオチドを含んでなる核酸配列を増幅する方法を提供し、該方法は：
式ＸＩ‐ｄ：

の化合物であって、上記式中、
該ヌクレオチドは、主溝と結合するパートナーに対して低い結合親和性を有し；

は単結合または二重結合を表し；

は任意選択の単結合を表し；

が単結合を表すとき、ＵはＯ、Ｓ、‐ＮＲａ‐、もしくは‐ＣＲａＲｂ‐であるか、または

が二重結合を表すとき、Ｕは‐ＣＲａ‐であり、；
ＺはＨ、Ｃ１‐１２アルキル、もしくはＣ６‐２０アリールであるか、または

が二重結合を表すとき、Ｚは存在せず；かつ
Ｚは‐ＣＲａＲｂ‐であってＡとともに結合を形成してもよく；
Ａは、Ｈ、ＯＨ、ホスホリル、ピロホスファート、スルファート、‐ＮＨ２、‐ＳＨ、アミノ酸、または１〜１２個のアミノ酸を含んでなるペプチドであり；
ＸはＯまたはＳであり；
Ｙ１はそれぞれ独立に、‐ＯＲａ１、‐ＮＲａ１Ｒｂ１、および‐ＳＲａ１から選択され；
Ｙ２およびＹ３はそれぞれ独立に、Ｏ、‐ＣＲａＲｂ‐、ＮＲｃ、ＳまたはリンカーであってＣ、Ｏ、ＮおよびＳで構成されている群から選択された１つ以上の原子を含んでなるリンカーであり；
ｎは０、１、２、または３であり；
ｍは０、１、２、または３であり；
Ｂは核酸塩基であり；
ＲａおよびＲｂはそれぞれ独立に、Ｈ、Ｃ１‐１２アルキル、Ｃ２‐１２アルケニル、Ｃ２‐１２アルキニル、またはＣ６‐２０アリールであり；
Ｒｃは、Ｈ、Ｃ１‐１２アルキル、Ｃ２‐１２アルケニル、フェニル、ベンジル、ポリエチレングリコール基、またはアミノ‐ポリエチレングリコール基であり；
Ｒａ１およびＲｂ１はそれぞれ独立に、Ｈまたはカウンターイオンであり；かつ
‐ＯＲｃ１は約１のｐＨにおいてＯＨであるか、または‐ＯＲｃ１は生理的なｐＨにおいてＯ−であり；
ただし可変部Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｕ、Ｚ、Ｙ２およびＹ３を包含する環はリボースになりえないという条件である、化合物を、プライマー、ｃＤＮＡテンプレート、およびＲＮＡポリメラーゼと反応させるステップを含んでなる。
いくつかの実施形態では、Ｂは、式ＸＩＩ‐ａ、ＸＩＩ‐ｂ、またはＸＩＩ‐ｃ：

の核酸塩基であり、上記式中、

は単結合または二重結合を表し；
ＸはＯまたはＳであり；
ＵおよびＷはそれぞれ独立にＣまたはＮであり；
ＶはＯ、Ｓ、ＣまたはＮであり；
ＶがＣである場合、Ｒ１は、Ｈ、Ｃ１‐６アルキル、Ｃ１‐６アルケニル、Ｃ１‐６アルキニル、ハロ、もしくは‐ＯＲｃであって、Ｃ１‐２０アルキル、Ｃ２‐２０アルケニル、Ｃ２‐２０アルキニルはそれぞれ任意選択で‐ＯＨ、‐ＮＲａＲｂ、‐ＳＨ、‐Ｃ（Ｏ）Ｒｃ、‐Ｃ（Ｏ）ＯＲｃ、‐ＮＨＣ（Ｏ）Ｒｃ、もしくは‐ＮＨＣ（Ｏ）ＯＲｃで置換されており；
ＶがＯ、Ｓ、もしくはＮである場合、Ｒ１は存在せず；
Ｒ２は、Ｈ、‐ＯＲｃ、‐ＳＲｃ、‐ＮＲａＲｂ、またはハロであり；
または、ＶがＣである場合、Ｒ１およびＲ２は、それらが結合している炭素原子と一緒になって、ハロ、‐ＯＨ、‐ＳＨ、‐ＮＲａＲｂ、Ｃ１‐２０アルキル、Ｃ２‐２０アルケニル、Ｃ２‐２０アルキニル、Ｃ１‐２０アルコキシ、もしくはＣ１‐２０チオアルキルから選択された１〜４個の置換基で任意選択で置換された、５員環または６員環を形成してもよく；
Ｒ３はＨまたはＣ１‐２０アルキルであり；
Ｒ４はＨまたはＣ１‐２０アルキルであって；

が二重結合を表すとき、Ｒ４は存在しないか、またはＮ‐Ｒ４が一緒になって、Ｃ１‐２０アルキルで置換された正電荷のＮを形成し；
ＲａおよびＲｂはそれぞれ独立に、Ｈ、Ｃ１‐２０アルキル、Ｃ２‐２０アルケニル、Ｃ２‐２０アルキニル、またはＣ６‐２０アリールであり；
かつ
Ｒｃは、Ｈ、Ｃ１‐２０アルキル、Ｃ２‐２０アルケニル、フェニル、ベンジル、ポリエチレングリコール基、またはアミノ‐ポリエチレングリコール基である。
いくつかの実施形態では、Ｂは、式ＸＩＩ‐ａ１、ＸＩＩ‐ａ２、ＸＩＩ‐ａ３、ＸＩＩ‐ａ４、またはＸＩＩ‐ａ５：

の核酸塩基である。
いくつかの実施形態では、該方法は、アデノシン、シトシン、グアノシン、およびウラシルで構成されている群から選択されたヌクレオチドをさらに含んでなる。
いくつかの実施形態では、核酸塩基はピリミジンまたはその誘導体である。
いくつかの実施形態では、本開示は、医薬用の核酸を合成する方法であって：
ａ）対象とする医薬用タンパク質をコードする相補的デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）を提供するステップと；
ｂ）主溝と結合するパートナーが核酸と結合するのを妨害することが知られているヌクレオチドを選択するステップであって、該ヌクレオチドは、主溝と結合するパートナーに対して低い結合親和性を有する、ステップと；
ｃ）提供されたｃＤＮＡおよび選択されたヌクレオチドを、医薬用の核酸が合成される条件下で、ＲＮＡポリメラーゼと接触させるステップと、を含んでなる方法を提供する。
さらなる実施形態では、医薬用の核酸はリボ核酸（ＲＮＡ）である。
本開示のさらに別の態様では、修飾核酸は固相合成方法を使用して調製されうる。
いくつかの実施形態では、本開示は、式ＸＩ‐ａ：

の化合物であって、上記式中、

は任意選択の二重結合を表し；

は任意選択の単結合を表し；

が単結合を表すとき、ＵはＯ、Ｓ、‐ＮＲａ‐、もしくは‐ＣＲａＲｂ‐であるか、または

が二重結合を表すとき、Ｕは‐ＣＲａ‐であり；
Ａは、Ｈ、ＯＨ、ホスホリル、ピロホスファート、スルファート、‐ＮＨ２、‐ＳＨ、アミノ酸、または１〜１２個のアミノ酸を含んでなるペプチドであり；
ＸはＯまたはＳであり；
Ｙ１はそれぞれ独立に、‐ＯＲａ１、‐ＮＲａ１Ｒｂ１、および‐ＳＲａ１から選択され；
Ｙ２およびＹ３はそれぞれ独立に、Ｏ、‐ＣＲａＲｂ‐、ＮＲｃ、ＳまたはリンカーであってＣ、Ｏ、ＮおよびＳで構成されている群から選択された１つ以上の原子を含んでなるリンカーであり；
ＲａおよびＲｂはそれぞれ独立に、Ｈ、Ｃ１‐１２アルキル、Ｃ２‐１２アルケニル、Ｃ２‐１２アルキニル、またはＣ６‐２０アリールであり；
Ｒｃは、Ｈ、Ｃ１‐１２アルキル、Ｃ２‐１２アルケニル、フェニル、ベンジル、ポリエチレングリコール基、またはアミノ‐ポリエチレングリコール基であり；
Ｒａ１およびＲｂ１はそれぞれ独立に、Ｈまたはカウンターイオンであり；
‐ＯＲｃ１は約１のｐＨにおいてＯＨであるか、または‐ＯＲｃ１は生理的なｐＨにおいてＯ−であり；かつ
Ｂは核酸塩基であり；
ただし、Ａ、Ｂ、Ｕ、Ｚ、Ｙ２およびＹ３を包含する環はリボースにはなりえないことを条件とする化合物、を含んでなる核酸を合成する方法であって、
ａ）式ＸＩＩＩ‐ａ：

のヌクレオチドを、
式ＸＩＩＩ‐ｂ：

のホスホロアミダイト化合物であって、
上記式中、

は固体担体を表し；かつ
Ｐ１、Ｐ２およびＰ３はそれぞれ独立に適切な保護基である、化合物と反応させて、
式ＸＩＶ‐ａ：

の核酸を提供するステップと；
ｂ）式ＸＩＶ‐ａの核酸を酸化または硫化して、式ＸＩＶｂ：

の核酸を生成させるステップと、
ｃ）保護基を除去して式ＸＩ‐ａの核酸を生成させるステップと、を含んでなる方法を提供する。
いくつかの実施形態では、該方法は、アデノシン、シトシン、グアノシン、およびウラシルで構成されている群から選択されたヌクレオチドをさらに含んでなる。
いくつかの実施形態では、Ｂは式ＸＩＩＩ：

の核酸塩基であって、
上記式中、
ＶはＮまたは正電荷のＮＲｃであり；
Ｒ３は、ＮＲｃＲｄ、‐ＯＲａ、または‐ＳＲａであり；
Ｒ４はＨであるか、または任意選択でＹ３とともに結合を形成することが可能であり；
Ｒ５は、Ｈ、‐ＮＲｃＲｄ、または‐ＯＲａであり；
ＲａおよびＲｂはそれぞれ独立に、Ｈ、Ｃ１‐１２アルキル、Ｃ２‐１２アルケニル、Ｃ２‐１２アルキニル、またはＣ６‐２０アリールであり、かつ、
Ｒｃは、Ｈ、Ｃ１‐１２アルキル、Ｃ２‐１２アルケニル、フェニル、ベンジル、ポリエチレングリコール基、またはアミノ‐ポリエチレングリコール基である。
いくつかの実施形態では、ステップａ）およびｂ）は１回〜約１０，０００回反復される。
［修飾核酸の使用］
治療薬
本明細書中に記載された修飾核酸は、治療薬として使用することができる。例えば、本明細書中に記載された修飾核酸は動物または対象者に投与されうるが、その場合該修飾核酸はｉｎ ｖｉｖｏで翻訳されて該動物または対象者において治療用ペプチドが産生される。従って、本明細書において提供されるのは、ヒトおよびその他の哺乳動物における疾患または病的状態の治療または予防のための、組成物、方法、キットおよび試薬である。本開示の活性治療薬には、修飾核酸、修飾核酸または該修飾核酸から翻訳されたポリペプチドを含んでいる細胞、修飾核酸から翻訳されたポリペプチド、修飾核酸または該修飾核酸から翻訳されたポリペプチドを含んでいる細胞と接触せしめられた細胞、修飾核酸を含んでいる細胞を含んでいる組織、および修飾核酸を含んでいる細胞を含んでいる組織を含んでいる臓器が挙げられる。
本明細書中に記載された修飾核酸を使用して細胞集団においてポリペプチドを産生するために合成または組換えポリヌクレオチドの翻訳を誘導する方法が提供される。そのような翻訳は、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、培養物中、またはｉｎ ｖｉｔｒｏの翻訳であってよい。細胞集団は、少なくとも１つのヌクレオシド修飾物と、該ポリペプチドをコードする翻訳可能な領域とを有する核酸を含んでいる有効な量の組成物と接触せしめられる。該集団は、該核酸が細胞集団のうち１個以上の細胞の中に局在化し、かつ該細胞内で組換えポリペプチドが該核酸から翻訳されるような条件の下で、接触せしめられる。
有効な量の組成物は、少なくとも部分的には、標的組織、標的細胞の種類、投与手段、核酸の物理的特性（例えば大きさおよび修飾ヌクレオシドの程度）、およびその他の決定要素に基づいて提供される。一般に、有効な量の組成物は、細胞内における効率的なタンパク質産生、好ましくは対応する未修飾核酸を含んでいる組成物よりも効率的なタンパク質産生を提供する。効率の上昇は、細胞トランスフェクション（すなわち核酸でトランスフェクションされる細胞の割合（％））の増大、核酸からのタンパク質翻訳の増大、核酸分解の減少（例えば修飾核酸からのタンパク質翻訳の持続期間の延長によって実証される）、または宿主細胞の先天性免疫応答の低下もしくは治療的有用性の改善（ｉｍｐｒｏｖｅ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｕｔｉｌｉｔｙ）によって実証されうる。
本開示の態様は、組換えポリペプチドのｉｎ ｖｉｖｏにおける翻訳を必要とする哺乳動物の対象者において、組換えポリペプチドのｉｎ ｖｉｖｏにおける翻訳を誘導する方法に関する。該方法においては、少なくとも１つのヌクレオシド修飾とポリペプチドをコードする翻訳可能な領域とを有する核酸を含んでいる有効な量の組成物が、本明細書中に記載された送達方法を使用して対象者に投与される。該核酸は、該核酸が対象者の１または複数の細胞内に局在化し、かつ組換えポリペプチドが該細胞内で核酸から翻訳されるような、量および条件下で提供される。核酸が局在化する細胞、または該細胞が存在する組織は、１回または２回以上の核酸投与を用いた標的とされうる。
本開示の他の態様は、哺乳動物の対象者への修飾核酸を含んでいる細胞の移植に関する。哺乳動物の対象者への細胞の投与は当業者に周知であり、例えば、薬学的に許容可能な担体中の細胞の調合物と同じように、局所移植（例えば局所投与もしくは皮下投与）、臓器送達または全身注射（例えば静脈内注射もしくは吸入）である。修飾核酸を含んでいる組成物は、筋肉内、経動脈的、腹腔内、静脈内、鼻腔内、皮下、内視鏡的、経皮的、または鞘内の投与のために調合される。いくつかの実施形態では、組成物は持続放出用に調合される。
治療薬が投与される対象者は、疾患、障害、もしくは有害な健康状態に罹患しているか、または該疾患、障害、もしくは有害な健康状態を発症するリスクを有している。これらを基にして対象者を同定、診断、分類する方法が提供され、該方法には臨床診断、バイオマーカーのレベル、ゲノムワイド関連研究（ＧＷＡＳ）、および当分野で既知の他の方法が挙げられる。
ある実施形態では、投与される修飾核酸は、１つ以上の組換えポリペプチドであって、該組換えポリペプチドが翻訳される細胞の中に実質的に存在しない機能的活性を提供する組換えポリペプチドを産生せしめる。例えば、その欠けている機能的活性は、酵素活性であってもよいし、構造的活性であってもよいし、事実上の遺伝子調節活性であってもよい。
他の実施形態では、投与される修飾核酸は、１つ以上の組換えポリペプチドであって、該組換えポリペプチドが翻訳される細胞内に実質的に不在であるポリペプチド（または複数のポリペプチド）を補充する組換えポリペプチドを産生せしめる。そのような不在はコード遺伝子またはその調節経路の遺伝子突然変異に起因するものであってよい。他の実施形態では、投与される修飾核酸は、１つ以上の組換えポリペプチドであって、該組換えポリペプチドが翻訳される細胞の中に存在するポリペプチド（または複数のポリペプチド）の量を補足するために組換えポリペプチドを産生せしめる。別例として、組換えポリペプチドは、細胞内に存在するか、細胞の表面上にあるか、または細胞から分泌される内因性タンパク質の活性に拮抗するように機能する。通常、該内因性タンパク質の活性は、例えば該内因性タンパク質の突然変異であって活性または局在化の変化をもたらす突然変異が原因で、対象者にとって有害である。加えて、組換えポリペプチドは、細胞内に存在するか、細胞の表面上にあるか、または細胞から分泌される生物学的構成部分の活性に、直接または間接的に拮抗する。拮抗せしめられる生物学的構成部分の例には、脂質（例えばコレステロール）、リポタンパク質（例えば低密度リポタンパク質）、核酸、炭水化物、または低分子の毒素が挙げられる。
本明細書中に記載される組換えタンパク質は、細胞内での局在化、可能性としては核のような特定のコンパートメント内での局在化のために人為操作されるか、または細胞からの分泌もしくは細胞の原形質膜への移動のために人為操作される。
本明細書中に記載されるように、本開示の修飾核酸の有用な特徴は、外因性の核酸に対する細胞の先天性免疫応答を低減し、回避し、免れ、または排除する能力である。細胞または細胞集団において免疫応答の量的調整（ｔｉｔｒａｔｉｏｎ）、低減または排除を実施する方法が提供される。いくつかの実施形態では、細胞は、翻訳可能な領域および少なくとも１つのヌクレオシド修飾を備えた第１の用量の第１の外因性核酸を含む、第１の組成物と接触せしめられ、第１の外因性核酸に対する細胞の先天性免疫応答のレベルが決定される。続いて、細胞は、第１の用量と比較して少ない量の第１の外因性核酸を含んでいる、第２の用量の第１の外因性核酸を含む第２の組成物と接触せしめられる。別例として、細胞は第１の用量の第２の外因性核酸と接触せしめられる。第２の外因性核酸は１つ以上の修飾ヌクレオシドを含むことができるが、該修飾ヌクレオシドは第１の外因性核酸と同じであっても異なっていてもよく、または別例として、第２の外因性核酸は修飾ヌクレオシドを含んでいなくてもよい。細胞を第１の組成物および第２の組成物のうち少なくともいずれかと接触させるステップは、１回以上反復されうる。加えて、細胞内におけるタンパク質産生（例えばタンパク質翻訳）の効率が任意選択で決定されて、細胞は、目標とするタンパク質産生効率が達成されるまで第１の組成物および第２の組成物のうち少なくともいずれかを用いて繰り返し再トランスフェクションされてもよい。
疾患および病的状態のための治療薬
タンパク質活性が欠けているかまたは異常であることを特徴とする疾患の症候を、その欠けているタンパク質活性の補充または異常なタンパク質活性の克服によって、治療または予防するための方法が提供される。修飾ｍＲＮＡの導入に続くタンパク質産生の開始がウイルスＤＮＡベクターと比較して迅速であることから、本開示の化合物は、敗血症、卒中、および心筋梗塞のような急性疾患の治療において特に有利である。さらに、本開示の修飾ｍＲＮＡについて転写調節が無いということは、タンパク質産生の正確な量的調整（ｔｉｔｒａｔｉｏｎ）が達成可能であるという点において有利である。多数の疾患は、タンパク質活性の欠落（または適切なタンパク質機能が生じないような実質的減弱）を特徴とする。そのようなタンパク質は、存在しない可能性もあり、非常に低量で存在するか、または根本的に機能しない。本開示は、対象者のそのような病的状態または疾患を、本明細書中に提供された修飾核酸を含んでいる核酸または細胞系治療薬を導入することにより治療する方法であって、該修飾核酸は対象者の標的細胞から失われているタンパク質活性を補充するタンパク質をコードする、方法を提供する。
機能不全または異常なタンパク質活性を特徴とする疾患には、限定するものではないが、がんおよび増殖性疾患、遺伝子疾患（例えば嚢胞性線維症）、自己免疫疾患、糖尿病、神経変性疾患、心血管疾患、ならびに代謝疾患が挙げられる。本開示は、対象者のそのような病的状態または疾患を、本明細書中に提供された修飾核酸を含んでいる核酸または細胞系治療薬を導入することにより治療する方法であって、該修飾核酸は対象者の細胞内に存在する異常なタンパク質活性に拮抗するかまたは他の方法で該活性を克服するタンパク質をコードする、方法を提供する。
機能不全のタンパク質の具体例は、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ｃｙｓｔｉｃ ｆｉｂｒｏｓｉｓ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｃｏｎｄｕｃｔａｎｃｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ：ＣＦＴＲ）遺伝子のミスセンス型またはナンセンス型の突然変異バリアントであり、それぞれ、嚢胞性線維症の原因となるＣＦＴＲタンパク質の機能不全または非機能性のタンパク質バリアントを産生する。
したがって、哺乳動物の対象者の嚢胞性線維症を、有効な量のＣＴＦＲポリペプチドが細胞内に存在するような条件の下で、該対象者の細胞を機能的なＣＦＴＲポリペプチドをコードする翻訳可能領域を有している修飾核酸と接触させることにより、治療する方法が提供される。好ましい標的細胞は肺のような上皮細胞であり、投与の方法は標的組織を考慮して決定される；すなわち、肺への送達用には、ＲＮＡ分子は吸入による投与用に調合される。
別の実施形態では、本開示は、ゲノム研究によって近年特徴解析されたタンパク質であるソルチリン（Ｓｏｒｔｉｌｉｎ）をコードする修飾ｍＲＮＡ分子を対象者の細胞集団へ導入することにより、該対象者の高脂血症を改善して、対象者の高脂血症を治療する方法を提供する。ＳＯＲＴ１遺伝子は、ソルチリンと呼ばれるトランスゴルジ網（ＴＧＮ）膜貫通型タンパク質をコードする。遺伝学的研究から、５人に１人が、ＳＯＲＴ１遺伝子の１ｐ１３座に、低レベルの低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）および超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）を有しやすくなる一塩基変異多型（ｒｓ１２７４０３７４）を有することが示されている。集団の約３０％に存在するこのマイナー対立遺伝子の各コピーは、ＬＤＬコレステロールを８ｍｇ／ｄＬ変化させる一方、集団の約５％に存在する２コピーの該マイナー対立遺伝子は、ＬＤＬコレステロールを１６ｍｇ／ｄＬ低下させる。該マイナー対立遺伝子の保有者は心筋梗塞のリスクが４０％低いことも示された。マウスにおけるｉｎ ｖｉｖｏの機能研究は、マウス肝臓組織におけるＳＯＲＴ１の過剰発現が、顕著に低い（８０％も低い）ＬＤＬコレステロールレベルをもたらすこと、および、ＳＯＲＴ１のサイレンシングはＬＤＬコレステロールをおよそ２００％増加させることを説明している（ムスヌル（Ｍｕｓｕｎｕｒｕ）Ｋら、「１ｐ１３コレステロール遺伝子座のＳＯＲＴ１を介して非コード型バリアントから表現型へ（Ｆｒｏｍ ｎｏｎｃｏｄｉｎｇ ｖａｒｉａｎｔ ｔｏ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ｖｉａ ＳＯＲＴ１ ａｔ ｔｈｅ ｌｐ１３ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ｌｏｃｕｓ．）」、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２０１０年、第４６６巻、ｐ．７１４−７２１）。
細胞内核酸送達の方法
本開示の方法は、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、または培養物中での細胞集団への核酸送達を増強する。例えば、複数の宿主細胞（例えば酵母または哺乳動物細胞のような真核細胞）を含んでいる細胞培養物は、少なくとも１つのヌクレオシド修飾、および任意選択で翻訳可能領域を有している増強核酸を含有する組成物と接触せしめられる。該組成物は一般に、トランスフェクション試薬、または宿主細胞の中への増強核酸の取込み効率を高めるその他の化合物も含んでいる。増強核酸は、対応する未修飾核酸に比べ、細胞集団において増強された保持率を示す。増強核酸の保持率は、未修飾核酸の保持率より大きい。いくつかの実施形態では、該保持率は、未修飾核酸の保持率より少なくとも約５０％、７５％、９０％、９５％、１００％、１５０％、２００％、または２００％を越えて大きい。そのような保持率の利点は、増強核酸を用いた１回のトランスフェクションによって達成される場合もあれば、度重なるトランスフェクションの後に得られる場合もある。
いくつかの実施形態では、増強核酸は、１以上の追加の核酸とともに標的細胞集団に送達される。そのような送達は同時であってもよいし、または増強核酸が１以上の追加の核酸の送達に先立って送達される。追加の１以上の核酸は修飾核酸であっても未修飾核酸であってもよい。当然ながら、増強核酸が最初に存在しても細胞集団の先天性免疫応答を実質的に誘発することはなく、さらに、先天性免疫応答はその後の未修飾核酸の存在によって活性化されることもないであろう。この点では、標的細胞集団に存在することが望まれるタンパク質が未修飾核酸から翻訳される場合、増強核酸はそれ自体が翻訳可能領域を含んでいなくてもよい。
標的化をなす構成部分
本開示の実施形態では、修飾核酸は、タンパク質結合パートナーまたは細胞表面上のレセプターであって、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、該細胞を特定の組織空間に対して標的化するか、または特異的な構成部分と相互作用する機能を果たすものを発現するために提供される。適切なタンパク質結合パートナーには、抗体およびその機能性フラグメント、スカフォールドタンパク質、またはペプチドが含まれる。加えて、修飾核酸は、脂質、炭水化物、またはその他の生物学的構成部分の合成および細胞外局在化を導くためにも使用されうる。
恒久的な遺伝子発現サイレンシング
哺乳動物の対象者において遺伝子発現をエピジェネティックにサイレンシングする方法であって、核酸を含んでなり、該核酸において翻訳可能領域は、配列特異的なヒストンＨ３のメチル化を導いてヘテロクロマチン形成を開始させ、かつ特定の遺伝子のサイレンシングを目的として該遺伝子周辺の遺伝子転写を低減することができる、１または複数のポリペプチドをコードする、方法。例えば、ヤーヌスキナーゼ２遺伝子における機能獲得型突然変異は、骨髄増殖性疾患群の原因である。
生物学的標的への検出可能な作用薬または治療薬の送達
本明細書中に記載された修飾ヌクレオシド、修飾ヌクレオチド、および修飾核酸は、生物学的標的への物質（「ペイロード」）の送達、例えば、該標的の検出用の検出可能な物質の送達、または治療薬の送達が望まれる、いくつかの異なる状況において使用されうる。検出方法には、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの画像化およびｉｎ ｖｉｖｏの画像化法の両方、例えば免疫組織化学法、バイオルミネセンスイメージング（ＢＬＩ）、磁気共鳴撮像法（ＭＲＩ）、陽電子放射形断層撮影法（ＰＥＴ）、電子顕微鏡法、Ｘ線断層撮影法、ラマンイメージング、光干渉断層撮影法、吸収イメージング、熱感知イメージング、蛍光反射率イメージング、蛍光顕微鏡法、蛍光分子断層撮影法、核磁気共鳴撮像法、Ｘ線イメージング、超音波イメージング、光音響イメージング、実験室でのアッセイ、またはタグ付け／染色／画像化が必要な任意の状況におけるものが挙げられる。
例えば、本明細書中に記載された修飾ヌクレオシド、修飾ヌクレオチド、および修飾核酸は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）の再プログラミングに使用可能であり、該ｉＰＳ細胞はその後、トランスフェクションされた細胞を集団内の全細胞と比較して直接追跡するために使用されうる。別の例では、リンカーを介して修飾核酸に取り付けられ、かつ蛍光標識された薬物は、該薬物をｉｎ ｖｉｖｏで、例えば細胞内で追跡するために使用されうる。他の例には、細胞内への可逆的薬物送達における修飾核酸の使用が含まれる。
本明細書中に記載された修飾ヌクレオシド、修飾ヌクレオチド、および修飾核酸は、ペイロード、例えば検出可能な作用薬または治療薬の、特定の細胞小器官へ向けた細胞内標的化において使用されうる。典型的な細胞内標的には、高度ｍＲＮＡプロセシングのための核局在化、または阻害剤を含んでいるｍＲＮＡに連結された核局在配列（ＮＬＳ）が挙げられる。
加えて、本明細書中に記載された修飾ヌクレオシド、修飾ヌクレオチド、および修飾核酸は、細胞または組織に（例えば生きている動物において）治療薬を送達するために使用されうる。例えば、本明細書中に記載された修飾ヌクレオシド、修飾ヌクレオチド、および修飾核酸は、がん細胞を殺すための非常に極性の強い化学療法作用薬を送達するために使用されうる。リンカーによって治療薬に取り付けられた修飾核酸は、該治療薬が細胞内標的に到達するために細胞内に移行することを可能にする部分浸透（ｍｅｍｂｅｒ ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ）を促進することができる。
別の例において、修飾ヌクレオシド、修飾ヌクレオチドおよび修飾核酸は開裂可能なリンカーによってウイルス性阻害ペプチド（ｖｉｒａｌ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｐｅｐｔｉｄｅ：ＶＩＰ）に取り付けられてもよい。該開裂可能なリンカーはＶＩＰおよび色素を細胞内に放出する。別の例において、修飾ヌクレオシド、修飾ヌクレオチドおよび修飾核酸は、リンカーによって、コレラ毒素、ジフテリア毒素および百日咳毒素のようないくつかの細菌毒素の作用に関与しているＡＤＰ‐リボシラートに取り付けられてもよい。これらの毒素タンパク質はヒト細胞の標的タンパク質を修飾するＡＤＰリボース転移酵素である。例えば、コレラ毒素はＧタンパク質をＡＤＰリボシル化して、小腸内膜からの大量の流体分泌を引き起こし、その結果生命に関わる下痢をもたらす。
［医薬組成物］
本開示は、修飾ｍＲＮＡから生成されたタンパク質を提供する。医薬組成物は、任意選択で、１つ以上の追加の治療的活性を有する物質を含んでなることができる。いくつかの実施形態によれば、１以上のタンパク質であって該タンパク質を必要とする対象者に送達されるべきタンパク質をコードする修飾核酸を含んでなる医薬組成物を投与する方法が提供される。いくつかの実施形態では、組成物はヒトに投与される。本開示の目的に関しては、「活性成分」という言葉は一般に、本明細書中に記載されるようなタンパク質、タンパク質をコードするかまたはタンパク質を含んでいる複合体を指す。
本明細書中に提供される医薬組成物の説明は主にヒトへの投与に適した医薬組成物に関しているが、そのような組成物が一般にすべての種類の動物への投与に適していることは当業者には了解されるであろう。ヒトへの投与に適した医薬組成物を様々な動物への投与に適するようにするための該組成物の改良についてはよく理解されており、通常の熟練した獣医学薬理学者は、そのような改良の設計および実施のうち少なくともいずれかを、あるとしても単に通常の実験作業のみで行うことができる。医薬組成物の投与が企図される対象者には、限定するものではないが、ヒトおよび他の霊長類のうち少なくともいずれか；哺乳動物、例えば商業的に重要な哺乳動物であってウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ネコ、イヌ、マウス、およびラットのうち少なくともいずれかなど；ならびに鳥類、例えば商業的に重要な鳥類であってニワトリ、ダック、ガチョウ、および七面鳥のうち少なくともいずれかなどが挙げられる。
本明細書中に記載された医薬組成物の調合物は、薬理学分野において既知または今後開発される任意の方法によって調製されうる。一般に、そのような調製方法は、活性成分を添加剤および１つ以上の他の副成分のうち少なくともいずれかと併せるステップと、その後、必要かつ／または望ましい場合には、該生成物の成形および包装のうち少なくともいずれかを行って所望の単回用量単位または複数回用量単位とするステップと、を含む。
本開示による医薬組成物は、大量に、単一単位用量として、および／または複数の単一単位用量として、調製、包装、および販売のうち少なくともいずれかが行われうる。本明細書中で使用されるように、「単位用量」とは、所定量の活性成分を含んでなる個別の量の医薬組成物である。活性成分の量は、一般に、対象者に投与されることになる活性成分の用量、および／またはそのような用量の適当な分割量、例えばそのような用量の２分の１もしくは３分の１と等しい。
本開示による医薬組成物中の活性成分、薬学的に許容可能な添加剤、および任意の追加成分のうち少なくともいずれかの相対量は、治療を受ける対象者が誰であるか、該対象者の大きさ、および該対象者の病状に応じて、さらには組成物が投与されることになる経路に応じて、変化することになろう。例を挙げると、組成物は、０．１％〜１００％（ｗ／ｗ）の活性成分を含んでなることができる。
医薬調合物はさらに、薬学的に許容可能な添加剤を含んでなることが可能であり、該添加剤には、本明細書中で使用されるように、所望の特定の剤形に適するような、ありとあらゆる溶媒、分散媒、希釈剤、またはその他の液体ビヒクル、分散助剤または懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘剤または乳化剤、保存剤、固体結合剤、滑沢剤などが含まれる。Ａ．Ｒ．ジェンナーロ（Ｇｅｎｎａｒｏ）編、「レミングトンの薬学の科学と実践（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ）」、第２１版（米国メリーランド州ボルティモア、リッピンコット・ウィリアムズ・アンド・ウィルキンズ（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ， Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ）、２００６年；参照により本願に援用）は、医薬組成物の調合に使用される様々な添加剤およびその調製のための既知技法を開示している。任意の従来の添加剤媒体が、何らかの望ましからぬ生物学的作用を生じるかまたは他の点で医薬組成物の他の成分とともに有害なかたちで相互作用することにより、物質またはその誘導体と両立困難である場合を除き、その使用はこの本開示の範囲内にあるものと企図される。
いくつかの実施形態では、薬学的に許容可能な添加剤は、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の純度である。いくつかの実施形態では、添加剤はヒトでの使用および獣医学的使用について承認されている。いくつかの実施形態では、添加剤は米国食品医薬品局によって承認されている。いくつかの実施形態では、添加剤は製薬等級である。いくつかの実施形態では、添加剤は、米国薬局方（ＵＳＰ）、欧州薬局方（ＥＰ）、英国薬局方、および国際薬局方のうち少なくともいずれかの基準を満たしている。
医薬組成物の製造において使用される薬学的に許容可能な添加剤には、限定するものではないが、不活性な希釈剤、分散化剤および造粒剤のうち少なくともいずれか、界面活性剤および乳化剤のうち少なくともいずれか、崩壊剤、結着剤、保存剤、緩衝剤、平滑剤、ならびにオイルのうち少なくともいずれかが挙げられる。そのような添加剤は、任意選択で医薬調合物中に含められうる。ココアバターおよび坐剤ワックス、着色剤、コーティング剤、甘味料、香味料、ならびに着香剤のような添加剤は、調合者の判断に従って、組成物中に存在することができる。
典型的な希釈剤には、限定するものではないが、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、リン酸カルシウム、リン酸二カルシウム、硫酸カルシウム、リン酸水素カルシウム、リン酸ナトリウムラクトース（ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｌａｃｔｏｓｅ）、スクロース、セルロース、結晶セルロース、カオリン、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、塩化ナトリウム、乾燥デンプン、コーンスターチ、粉砂糖など、およびこれらの組み合わせ、のうち少なくともいずれかが挙げられる。
典型的な造粒剤および分散化剤のうち少なくともいずれかとしては、限定するものではないが、ジャガイモデンプン、コーンスターチ、タピオカデンプン、デンプングリコール酸ナトリウム、クレー、アルギン酸、グアーガム、シトラスパルプ、寒天、ベントナイト、セルロースおよび木材生成物、天然スポンジ、カチオン交換樹脂、炭酸カルシウム、シリカート、炭酸ナトリウム、架橋ポリ（ビニルピロリドン（クロスポビドン）、カルボキシメチルスターチナトリウム（デンプングリコール酸ナトリウム）、カルボキシメチルセルロース、架橋カルボキシルメチルセルロースナトリウム（クロスカルメロース）、メチルセルロース、α化デンプン（デンプン１５００）、微晶質デンプン、水不溶性デンプン、カルボキシルメチルセルロースカルシウム、ケイ酸アルミニウムマグネシウム（Ｖｅｅｇｕｍ（登録商標））、ラウリル硫酸ナトリウム、第四アンモニウム化合物など、およびこれらの組み合わせ、のうち少なくともいずれかが挙げられる。
典型的な界面活性剤および乳化剤のうち少なくともいずれかとしては、限定するものではないが、天然の乳化剤（例えばアラビアガム、寒天、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、トラガント、コンドラックス（ｃｈｏｎｄｒｕｘ）、コレステロール、キサンタン、ペクチン、ゼラチン、卵黄、カゼイン、羊毛脂、コレステロール、ワックス、およびレシチン）、コロイドクレー（例えばベントナイト［ケイ酸アルミニウム］およびＶｅｅｇｕｍ（登録商標）［ケイ酸アルミニウムマグネシウム］）、長鎖アミノ酸誘導体、高分子量アルコール（例えばステアリルアルコール、セチルアルコール、オレイルアルコール、トリアセチンモノステアラート、エチレングリコールジステアラート、モノステアリン酸グリセリン、およびプロピレングリコールモノステアラート、ポリビニルアルコール）、カルボマー（例えばカルボキシポリメチレン、ポリアクリル酸、アクリル酸ポリマー、およびカルボキシビニルポリマー）、カラギーナン、セルロース誘導体（例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、粉末セルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース）、ソルビタン脂肪酸エステル（例えばポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート［Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０］、ポリオキシエチレンソルビタン［Ｔｗｅｅｎ（登録商標）６０］、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート［Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０］、ソルビタンモノパルミタート［Ｓｐａｎ（登録商標）４０］、ソルビタンモノステアラート［Ｓｐａｎ（登録商標）６０］、ソルビタントリステアラート［Ｓｐａｎ（登録商標）６５］、グリセリルモノオレアート、ソルビタンモノオレアート［Ｓｐａｎ（登録商標）８０］）、ポリオキシエチレンエステル（例えばポリオキシエチレンモノステアラート［Ｍｙｒｊ（登録商標）４５］、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリエトキシ化ヒマシ油、ポリオキシメチレンステアラート、およびＳｏｌｕｔｏｌ（登録商標））、スクロース脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル（例えばＣｒｅｍｏｐｈｏｒ（登録商標））、ポリオキシエチレンエーテル（例えばポリオキシエチレンラウリルエーテル［Ｂｒｉｊ（登録商標）３０］）、ポリ（ビニルピロリドン）、ジエチレングリコールモノラウレート、トリエタノールアミンオレアート、オレイン酸ナトリウム、オレイン酸カリウム、オレイン酸エチル、オレイン酸、エチルラウレート、ラウリル硫酸ナトリウム、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８、Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ（登録商標）１８８、臭化セトリモニウム、塩化セチルピリジウム、塩化ベンザルコニウム、ドキュセートナトリウムなど、およびこれらの組み合わせ、のうち少なくともいずれかが挙げられる。
典型的な結着剤には、限定するものではないが、デンプン（例えばコーンスターチおよびデンプン糊）；ゼラチン；糖（例えばスクロース、グルコース、デキストロース、デキストリン、糖蜜、ラクトース、ラクチトール、マンニトール）；天然ガムおよび合成ガム（例えばアラビアガム、アルギン酸ナトリウム、アイルランドゴケの抽出物、パンワール（ｐａｎｗａｒ）ガム、ガティガム、イサポール（ｉｓａｐｏｌ）外皮の粘質物、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、微結晶性セルロース、酢酸セルロース、ポリ（ビニルピロリドン）、ケイ酸アルミニウムマグネシウム（Ｖｅｅｇｕｍ（登録商標））、およびカラマツのアラボガラクタン（ａｒａｂｏｇａｌａｃｔａｎ）；アルギナート；ポリエチレンオキシド；ポリエチレングリコール；無機カルシウム塩；ケイ酸；ポリメタクリラート；ワックス；水；アルコールなど、ならびにこれらの組み合わせが挙げられる。
典型的な保存剤には、限定するものではないが、酸化防止剤、キレート剤、抗菌性保存剤、抗真菌性保存剤、アルコール性保存剤、酸性保存剤、およびその他の保存剤のうち少なくともいずれかが挙げられる。典型的な酸化防止剤には、限定するものではないが、αトコフェロール、アスコルビン酸、パルミチン酸アコルビル（ａｃｏｒｂｙｌ ｐａｌｍｉｔａｔｅ）、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、モノチオグリセロール、メタ重亜硫酸カリウム、プロピオン酸、没食子酸プロピル、アスコルビン酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、および亜硫酸ナトリウムのうち少なくともいずれかが挙げられる。典型的なキレート剤には、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、クエン酸一水和物、エデト酸ナトリウム、エデト酸二カリウム、エデト酸、フマル酸、リンゴ酸、リン酸、エデト酸ナトリウム、酒石酸、およびエデト酸三ナトリウムのうち少なくともいずれかが挙げられる。典型的な抗菌性保存剤には、限定するものではないが、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、ベンジルアルコール、ブロノポール、セトリミド、塩化セチルピリジウム、クロルヘキシジン、クロロブタノール、クロロクレゾール、クロロキシレノール、クレゾール、エチルアルコール、グリセリン、ヘキセチジン、イミド尿素、フェノール、フェノキシエタノール、フェニルエチルアルコール、硝酸フェニル水銀、プロピレングリコール、およびチメロサールのうち少なくともいずれかが挙げられる。典型的な抗真菌性保存剤には、限定するものではないが、ブチルパラベン、メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、安息香酸、ヒドロキシ安息香酸、安息香酸カリウム、ソルビン酸カリウム、安息香酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウム、およびソルビン酸のうち少なくともいずれかが挙げられる。典型的なアルコール性保存剤には、限定するものではないが、エタノール、ポリエチレングリコール、フェノール、フェノール化合物、ビスフェノール、クロロブタノール、ヒドロキシベンゾアート、およびフェニルエチルアルコールのうち少なくともいずれかが挙げられる。典型的な酸性保存剤には、限定するものではないが、ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＥ、β‐カロテン、クエン酸、酢酸、デヒドロ酢酸、アスコルビン酸、ソルビン酸、およびフィチン酸のうち少なくともいずれかが挙げられる。他の保存剤には、限定するものではないが、トコフェロール、酢酸トコフェロール、デテロキシムメシラート（ｄｅｔｅｒｏｘｉｍｅ ｍｅｓｙｌａｔｅ）、セトリミド、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ｂｕｔｙｌａｔｅｄ ｈｙｄｒｏｘｙｔｏｌｕｅｎｅｄ：ＢＨＴ）、エチレンジアミン、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＬＳ）、ラウリルエーテル硫酸ナトリウム（ＳＬＥＳ）、亜硫酸水素ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸カリウム、メタ重亜硫酸カリウム、Ｇｌｙｄａｎｔ Ｐｌｕｓ（登録商標）、Ｐｈｅｎｏｎｉｐ（登録商標）、メチルパラベン、Ｇｅｒｍａｌｌ（登録商標）１１５、Ｇｅｒｍａｂｅｎ（登録商標）ＩＩ、Ｎｅｏｌｏｎｅ（商標）、Ｋａｔｈｏｎ（商標）、およびＥｕｘｙｌ（登録商標）のうち少なくともいずれかが挙げられる。
典型的な緩衝剤には、限定するものではないが、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、塩化アンモニウム、炭酸カルシウム、塩化カルシウム、クエン酸カルシウム、グルビオン酸カルシウム、グルセプト酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、ｄ‐グルコン酸、グリセロリン酸カルシウム、乳酸カルシウム、プロパン酸、レブリン酸カルシウム、ペンタン酸、第二リン酸カルシウム、リン酸、第三リン酸カルシウム、カルシウムヒドロキシドホスファート、酢酸カリウム、塩化カリウム、グルコン酸カリウム、カリウム混合物、リン酸一水素カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸カリウム混合物、酢酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、リン酸水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸ナトリウム混合物、トロメタミン、水酸化マグネシウム、水酸化アルミニウム、アルギン酸、発熱性物質除去水、等張生理食塩水、リンゲル液、エチルアルコールなど、およびこれらの組み合わせ、のうち少なくともいずれかが挙げられる。
典型的な平滑剤には、限定するものではないが、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸、シリカ、タルク、麦芽、グリセリルベハナート（ｇｌｙｃｅｒｙｌ ｂｅｈａｎａｔｅ）、硬化植物油、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、ロイシン、ラウリル硫酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウムなど、およびこれらの組み合わせが挙げられる。
典型的なオイルには、限定するものではないが、アーモンド、杏仁、アボカド、ババスーヤシ、ベルガモット、ブラックカレント（ｂｌａｃｋ ｃｕｒｒｅｎｔ）種子、ルリヂサ、ケード、カモミール、キャノーラ、キャラウェー、ブラジルロウヤシ、トウゴマ、シナモン、ココアバター、ココナッツ、たら肝臓、コーヒー、トウモロコシ、綿実、エミュー、ユーカリ、マツヨイグサ、魚、アマニ、ゲラニオール、ヒョウタン、ブドウ種子、ハシバミの実、ヒソップ、ミリスチン酸イソプロピル、ホホバ、クークーエーナッツ、ラバンディン、ラベンダー、レモン、リトシー・キュービバ、マカデミア（ｍａｃａｄｅｍｉａ）ナッツ、ゼニアオイ、マンゴー種子、メドウフォーム種子、ミンク、ニクズク、オリーブ、オレンジ、オレンジラフィー、パーム、パーム核、桃仁、ピーナッツ、ケシの実、パンプキンシード、菜種、米糠、ローズマリー、紅花、ビャクダン、サスカナ（ｓａｓｑｕａｎａ）、サボリー、シーバックソーン、ゴマ、シアバター、シリコーン、ダイズ、ヒマワリ、チャノキ、アザミ、ツバキ、ベチベルソウ、クルミ、および麦芽のオイルが挙げられる。典型的なオイルには、限定するものではないが、ステアリン酸ブチル、カプリル酸トリグリセリド、カプリン酸トリグリセリド、シクロメチコン、セバシン酸ジエチル、ジメチコン３６０、ミリスチン酸イソプロピル、鉱油、オクチルドデカノール、オレイルアルコール、シリコーンオイル、およびこれらの組み合わせ、のうち少なくともいずれかが挙げられる。
経口投与および非経口投与のための液体剤形には、限定するものではないが、薬学的に許容可能な乳剤、マイクロエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップ剤、およびエリキシル剤のうち少なくともいずれかが挙げられる。活性成分に加えて、液体剤形は、当分野で一般に使用される不活性の希釈剤、例えば、水または他の溶媒、可溶化剤および乳化剤、例えばエチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３‐ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、オイル（特に、綿実、落花生類、トウモロコシ、胚芽、オリーブ、トウゴマ、およびゴマのオイル）、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコールおよびソルビタンの脂肪酸エステルならびにこれらの混合物を含んでなることができる。不活性の希釈剤に加えて、経口組成物は、アジュバント、例えば湿潤剤、乳化剤および懸濁化剤、甘味料、香味料、ならびに着香剤のうち少なくともいずれかを含むことができる。非経口投与のためのある実施形態では、組成物は、可溶化剤、例えばＣｒｅｍｏｐｈｏｒ（登録商標）、アルコール、オイル、変性油、グリコール、ポリソルベート、シクロデキストリン、ポリマー、およびこれらの組み合わせのうち少なくともいずれかと混合せしめられる。
注射可能な調製物、例えば、無菌の注射可能な水性または油性の懸濁液は、適切な分散剤、湿潤剤、および懸濁化剤のうち少なくともいずれかを使用して、既知の技術によって調合されうる。無菌の注射可能な調製物は、例えば１，３‐ブタンジオール中の溶液のような、無毒で非経口的に許容可能な希釈剤および溶媒のうち少なくともいずれかを用いた、無菌の注射可能な溶液、懸濁液、および乳剤のうち少なくともいずれかであってよい。使用されうる許容可能なビヒクルおよび溶媒の中には、水、Ｕ．Ｓ．Ｐ．リンゲル液、および等張食塩水がある。無菌の不揮発性油は溶媒または懸濁媒として従来通りに使用される。この目的に関しては、任意の無菌性（ｂｌａｎｄ）の不揮発性油、例えば合成モノグリセリドまたはジグリセリドなども使用されうる。オレイン酸のような脂肪酸は、注射剤の調製に使用可能である。
注射用調合物は、例えば、細菌を保持するフィルタを通す濾過によって、および／または、使用に先立って滅菌水もしくは他の無菌の注射可能な媒体に溶解もしくは分散可能な無菌の固形組成物の形で滅菌剤を組み入れることによって、滅菌されうる。
活性成分の作用を延長するために、皮下または筋肉内注射からの活性成分の吸収を遅延させることが望ましいことが多い。これは、水溶性に乏しい結晶性または無定形の物質の液体懸濁液を使用することによって遂行される場合がある。その場合、薬物の吸収速度は該薬物の溶解速度に依存し、ひいては結晶の大きさおよび結晶形態に依存しうる。別例として、非経口的に投与される薬物形態の遅延吸収は、オイルビヒクル中に薬物を溶解または懸濁することにより遂行される。注射可能なデポー剤形態は、ポリラクチド‐ポリグリコリドのような生分解性ポリマー中で薬物のマイクロカプセル化マトリックスを形成することにより作製される。薬物とポリマーとの比および使用される特定のポリマーの性質によって、薬物放出の速度は制御可能である。他の生分解性ポリマーの例にはポリ（オルトエステル）およびポリ（無水物）が挙げられる。注射可能なデポー剤は、体内組織との適合性を有するリポソームまたはマイクロエマルジョン中に薬物を封入することにより調製される。
直腸投与または膣内投与のための組成物は、典型的には、組成物を、適切な非刺激性の添加剤、例えばココアバター、ポリエチレングリコールまたは坐薬ワックスであって周囲温度では固体だが体温では液体であり、したがって、直腸腔または膣腔の中で融解して活性成分を放出する添加剤と混合することにより調製可能な坐剤である。
経口投与のための固体剤形には、カプセル剤、錠剤、ピル、散剤、および粒剤が挙げられる。そのような固体剤形では、活性成分は、少なくとも１つの不活性な薬学的に許容可能な添加剤、例えばクエン酸ナトリウムまたはリン酸カルシウム、ならびに、充填剤または増量剤（例えばデンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、およびケイ酸）、結合剤（例えばカルボキシメチルセルロース、アルギナート、ゼラチン、ポリビニルピロリジノン、スクロース、およびアラビアガム）、保湿剤（例えばグリセリン）、崩壊剤（例えば寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモデンプンまたはタピオカデンプン、アルギン酸、ある種のケイ酸塩、および炭酸ナトリウム）、溶解遅延剤（例えばパラフィン）、吸収促進剤（例えば第四アンモニウム化合物）、湿潤剤（例えばセチルアルコールおよびモノステアリン酸グリセロール）、吸収剤（例えばカオリンおよびベントナイトクレー）、および滑沢剤（例えばタルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム）、ならびにこれらの混合物、のうち少なくともいずれかとともに混合せしめられる。カプセル剤、錠剤およびピルの場合には、該剤形は緩衝剤を含んでなることもある。
同様の種類の固体組成物は、ラクトースまたは乳糖のような添加剤のほかに高分子量ポリエチレングリコールなどを使用して、軟ゼラチンカプセル剤および硬ゼラチンカプセル剤中の充填剤として使用されうる。錠剤、ドラジェ、カプセル剤、ピル、および粒剤の固体剤形は、医薬調合分野において良く知られた腸溶コーティングおよびその他のコーティングのような、コーティングおよびシェルを備えて調製可能である。該コーティングおよびシェルは任意選択で乳白剤を含んでなることが可能であり、かつ、該コーティングおよびシェルが腸管の一定の部分においてのみ、または該部分において優先的に、任意選択で遅延方式にて、活性成分を放出する組成のものであってよい。使用可能な包埋組成物の例にはポリマー物質およびワックスが挙げられる。同様の種類の固体組成物は、ラクトースまたは乳糖のような添加剤のほかに高分子量ポリエチレングリコールなどを使用して、軟ゼラチンカプセル剤および硬ゼラチンカプセル剤中の充填剤として使用されうる。
組成物の局所投与および経皮投与のうち少なくともいずれかのための剤形には、軟膏剤、パスタ剤、クリーム剤、ローション剤、ゲル剤、散剤、溶液、スプレー、吸入薬および貼付剤のうち少なくともいずれかが挙げられる。一般に、活性成分は、薬学的に許容可能な添加剤、任意の必要とされる保存剤、および必要に応じて緩衝剤、のうち少なくともいずれかと共に無菌条件下で混合される。加えて、本開示は、身体への化合物の制御送達を提供するという追加の長所を有する場合の多い、経皮貼付剤の使用を企図している。そのような剤形は、例えば、適切な媒体中で化合物の溶解および調合のうち少なくともいずれかを行うことにより、調製されうる。別例として、または追加として、速度は、律速メンブレンの提供、ならびに、ポリマーマトリクスおよびゲルのうち少なくともいずれかの中での化合物の分散、のうち少なくともいずれかによって制御されうる。
本明細書中に記載された皮内用医薬組成物の送達に使用される適切なデバイスとしては、短針デバイスであって例えば米国特許第４，８８６，４９９号；同第５，１９０，５２１号；同第５，３２８，４８３号；同第５，５２７，２８８号；同第４，２７０，５３７号；同第５，０１５，２３５号；同第５，１４１，４９６号；および同第５，４１７，６６２号明細書に記載されているものが挙げられる。皮内用組成物は、例えば国際公開第９９／３４８５０号に記載されたもののような皮膚内への針の有効な貫入長さを制限するデバイス、およびその機能的等価物によって投与されうる。液体ジェット式注射器、および、角質層を貫通し、かつ真皮に達する噴流を生じる針、のうち少なくともいずれかを介して真皮に液体組成物を送達するジェット式注射デバイスは適切である。ジェット式注射デバイスは、例えば、米国特許第５，４８０，３８１号；同第５，５９９，３０２号；同第５，３３４，１４４号；同第５，９９３，４１２号；同第５，６４９，９１２号；同第５，５６９，１８９号；同第５，７０４，９１１号；同第５，３８３，８５１号；同第５，８９３，３９７号；同第５，４６６，２２０号；同第５，３３９，１６３号；同第５，３１２，３３５号；同第５，５０３，６２７号；同第５，０６４，４１３号；同第５，５２０，６３９号；同第４，５９６，５５６号；同第４，７９０，８２４号；同第４，９４１，８８０号；同第４，９４０，４６０号明細書；ならびに国際公開第９７／３７７０５号および同第９７／１３５３７号に記載されている。皮膚の外側層を通して真皮へと粉末形態のワクチンを加速させるために圧縮ガスを使用する衝撃式（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ）粉末／粒子送達デバイスが適切である。別例として、または追加として、従来のシリンジが皮内投与の古典的なマントー法において使用されてもよい。
局所投与に適した製剤には、限定するものではないが、液体および／または半液体の調製物であって例えばリニメント剤、ローション剤、水中油型および／または油中水型の乳剤であって例えばクリーム剤、軟膏剤および／またはパスタ剤、ならびに溶液および／または懸濁液、のうち少なくともいずれかが挙げられる。局所投与可能な調合物は、例えば、約１％〜約１０％（ｗ／ｗ）の活性成分を含んでなることができるが、活性成分の濃度は溶媒中の活性成分の溶解限度と同じくらい高くてもよい。局所投与のための製剤は、本明細書中に記載された追加の成分のうち１つ以上をさらに含んでなることもできる。
医薬組成物は、頬腔を介した肺内投与に適した調合物として調製、包装、かつ／または販売されうる。そのような調合物は、活性成分を含んでなり、かつ約０．５ｎｍ〜約７ｎｍまたは約１ｎｍ〜約６ｎｍの範囲の直径を有する、乾燥粒子を含んでなることができる。そのような組成物は、好都合には、乾燥粉末リザーバであって推進剤の流れが粉末を分散させるべく該リザーバへ向かって方向付けられうるリザーバを含んでなるデバイスを使用して、かつ／または、自己推進式の溶媒／粉末分配容器であって例えば密封容器内で低沸点推進剤に溶解および／もしくは懸濁された活性成分を含んでなるデバイスなどを使用して、投与するための乾燥粉末の形態である。そのような粉末は、粒子であって重量比で該粒子の少なくとも９８％が０．５ｎｍを超える直径を有し、かつ数量比で該粒子の少なくとも９５％が７ｎｍ未満の直径を有する、粒子を含んでなる。別例として、重量比で該粒子の少なくとも９５％が１ｎｍを超える直径を有し、かつ数量比で該粒子の少なくとも９０％が６ｎｍ未満の直径を有する。乾燥粉末組成物は、糖のような固形微細粉末の希釈剤を含んでもよいし、好都合には単位用量形態で提供される。
低沸点推進剤には一般に、大気圧において１８．３℃（華氏６５度）未満の沸点を有する液体推進剤が挙げられる。一般に、推進剤は組成物の５０％〜９９．９％（ｗ／ｗ）を構成してもよく、活性成分は組成物の０．１％〜２０％（ｗ／ｗ）を構成してもよい。推進剤は、液体の非イオン性および固体の陰イオン性のうち少なくともいずれかの界面活性剤、ならびに固体の希釈剤（活性成分を含んでなる粒子と同程度の粒径を有しうるもの）のうち少なくともいずれかのような、追加の成分をさらに含んでなることができる。
肺送達のために調合された医薬組成物は、溶液および懸濁液のうち少なくともいずれかの小滴の形をした活性成分を提供することができる。そのような調合物は、活性成分を含んでなる、任意選択で無菌の、水性および／または薄いアルコールの溶液および／または懸濁液として、調製、包装、および／または販売されることが可能であり、かつ好都合には任意の噴霧化および／または微粒化デバイスを使用して投与されうる。そのような調合物は、１つ以上の追加の成分であって例えば、限定されるものではないが、サッカリンナトリウムのような着香剤、揮発性油、緩衝剤、界面活性剤、およびオキシ安息香酸メチルのような保存剤、のうち少なくともいずれかをさらに含んでなることができる。この投与経路によって提供される小滴は、約０．１ｎｍ〜約２００ｎｍの範囲の平均直径を有しうる。
肺送達に有用であるとして本明細書中に記載された調合物は、医薬組成物の鼻腔内送達に有用である。鼻腔内投与に適した別の調合物は、活性成分を含んでなりかつ約０．２μｍ〜５００μｍの平均粒子を有する粗粉末である。そのような調合物は、鼻から吸い込む方式で、すなわち、鼻の近くに保持された粉末のコンテナから鼻通路を通して急速に吸入することによって、投与される。
経鼻投与に適した製剤は、例えば、わずか約０．１％（ｗ／ｗ）から１００％（ｗ／ｗ）もの活性成分を含んでなることが可能であり、本明細書中に記載された追加の成分のうち１つ以上を含んでなることもできる。医薬組成物は、口腔投与に適した調合物として調製、包装、および／または販売されてもよい。そのような調合物は、例えば、従来の方法を使用して作製された錠剤および／またはロゼンジの形態であってよく、かつ例えば、活性成分が０．１％〜２０％（ｗ／ｗ）であって、これは経口的に溶解可能および／または分解可能な組成物と、任意選択で、本明細書中に記載された追加の成分のうち１つ以上とを含んでなるバランスである。別例として、口腔投与に適した調合物は、活性成分を含んでなる、粉末、ならびにエアロゾル化および／または霧化された溶液および／または懸濁液、のうち少なくともいずれかを含んでなることができる。そのような、粉末状、エアロゾル状、および／またはエアロゾル状の調合物は、分散せしめられると、大きさが平均約０．１ｎｍ〜約２００ｎｍの範囲の粒子および／または液滴を有することが可能であり、かつ、本明細書中に記載された任意の追加の成分のうち１つ以上をさらに含んでなることができる。
医薬組成物は、眼部投与に適した調合物として調製、包装、および／または販売されてもよい。そのような調合物は、例えば、水性または油性の液体添加剤中に、例えば活性成分の０．１／１．０％（ｗ／ｗ）溶液および／または懸濁液を含む、点眼剤の形態であってよい。そのような点眼剤は、緩衝剤、塩、および本明細書中に記載された１つ以上の他の任意の追加の成分をさらに含んでなることができる。有用なその他の眼部投与可能な調合物には、微晶質形態およびリポソーム調製物のうち少なくともいずれかである活性成分を含んでなるものが含まれる。点耳剤および点眼剤のうち少なくともいずれかは本開示の範囲内にあるものとして意図されている。
医薬品の調合および製造のうち少なくともいずれかにおける全般的な考察は、例えば、「レミングトン：薬学の科学と実践（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ）」、第２１版、リッピンコット・ウィリアムズ・アンド・ウィルキンズ（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ， Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ）、２００５年（参照により本願に援用される）に見出すことができる。
投与
本開示は、本開示によるタンパク質または複合体を、該タンパク質または複合体を必要とする対象者に投与することを含んでなる方法を提供する。タンパク質もしくは複合体、またはその医薬組成物、造影用組成物、診断用組成物、もしくは予防用組成物は、疾患、障害、および病的状態のうち少なくともいずれか（例えば作業記憶障害に関する疾患、障害、および病的状態のうち少なくともいずれか）の予防、治療、診断、画像化に有効な任意の量および任意の投与経路を使用して対象者に投与されうる。正確な必要量は、対象者の生物種、年齢、および全体的な病状、その疾患の重症度、特定の組成物、該組成物の投与様式、該組成物の活性様式などに応じて、対象者ごとに変わることになろう。本開示による組成物は、投与が容易でありかつ用量を均一とするために、典型的には投薬単位形態に調合される。しかしながら、当然であるが、本開示の組成物の１日あたりの総使用量は、主治医によって正しい医学的判断の範囲内において決定されることになる。任意の特定の患者のための、治療的に有効、予防的に有効、または適切な画像化用の、具体的な用量レベルは、様々な要因、例えば治療される障害および該障害の重症度；使用される具体的な化合物の活性；使用される具体的な組成物；患者の年齢、体重、全体的な健康状態、性別および食事；使用される具体的な化合物の投与時間、投与経路、および排出速度；治療の期間；使用される具体的な化合物とともに併用または同時使用される薬物；ならびに、医学分野において良く知られた同様の要因に応じて変化することになろう
送達されるタンパク質、および該タンパク質の医薬組成物、予防用組成物、診断用組成物、もしくは造影用組成物、のうち少なくともいずれかは、動物、例えば哺乳動物（例えばヒト、家畜、ネコ、イヌ、マウス、ラットなど）に投与されうる。いくつかの実施形態では、その医薬組成物、予防用組成物、診断用組成物、または造影用組成物は、ヒトに投与される。
送達されるタンパク質、および本開示による該タンパク質の医薬組成物、予防用組成物、診断用組成物、もしくは造影用組成物、のうち少なくともいずれかは、任意の経路によって投与可能である。いくつかの実施形態では、タンパク質、および該タンパク質の医薬組成物、予防用組成物、診断用組成物、または造影用組成物、のうち少なくともいずれかは、様々な経路のうち１つ以上、例えば、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、鞘内、皮下、脳室内、経皮、皮膚間（ｉｎｔｅｒｄｅｒｍａｌ）、直腸、膣内、腹腔内、局所（例えば、散剤、軟膏剤、クリーム剤、ゲル剤、ローション剤、および滴剤のうち少なくともいずれかによる）、経粘膜、経鼻、口腔、経腸、硝子体、腫瘍内、舌下によって；気管内点滴注入、気管支点滴注入、および吸入のうち少なくともいずれかによって；経口スプレー、鼻内スプレー、およびエアロゾルのうち少なくともいずれかとして、ならびに／または門脈カテーテルを通じて、投与される。いくつかの実施形態では、タンパク質または複合体、および該タンパク質または複合体の医薬組成物、予防用組成物、診断用組成物、または造影用組成物、のうち少なくともいずれかは、全身性の静脈内注射によって投与される。特定の実施形態では、タンパク質または複合体、および該タンパク質または複合体の医薬組成物、予防用組成物、診断用組成物、または造影用組成物、のうち少なくともいずれかは、静脈内投与および経口投与のうち少なくともいずれかが可能であってよい。特定の実施形態では、タンパク質または複合体、および該タンパク質または複合体の医薬組成物、予防用組成物、診断用組成物、または造影用組成物、のうち少なくともいずれかは、該タンパク質または複合体が血液脳関門、血管障壁、またはその他の上皮性関門を横断することを可能にする方法で投与されうる。
しかしながら、本開示は、薬物送達の科学において見込まれる進歩を考慮に入れた任意の適切な経路による、タンパク質または複合体、および該タンパク質または複合体の医薬組成物、予防用組成物、診断用組成物、または造影用組成物、のうち少なくともいずれかの送達を包含する。
一般に、最適な投与経路は、様々な要因、例えばタンパク質または送達されるべき少なくとも１つの作用薬に関連付けられたタンパク質を含んでなる複合体の性質（例えば、胃腸管、血流などの環境におけるその安定性）、患者の病状（例えば、患者が特定の投与経路に耐えられるかどうか）、などに応じて変化することになろう。本開示は、薬物送達の科学において見込まれる進歩を考慮に入れた任意の適切な経路による医薬組成物、予防用組成物、診断用組成物、または造影用組成物の送達を包含する。
ある実施形態では、本開示による組成物は、所望の治療効果、診断的効果、予防的効果、または造影効果を得るために、１日につき１回以上、１日当たり対象者の体重に対して約０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、または約１ｍｇ／ｋｇ〜約２５ｍｇ／ｋｇを送達するのに十分な投与量レベルで投与されうる。所望の投与量は、１日に３回、１日に２回、１日に１回、１日おき、３日に１回、毎週、２週ごと、３週ごと、または４週ごとに送達されうる。ある実施形態では、所望の投与量は、複数回投与（例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４回またはより多数回の投与）を使用して送達されてもよい。
タンパク質または複合体は、１つ以上の他の治療剤、予防剤、診断剤、または造影剤と組み合わせて使用されうる。「組み合わせて」という語によって、該作用薬が同時に投与されなければならないこと、および／または、一緒に送達するために調合されなければならないことを示唆するようには意図されていないが、これらの送達方法は本開示の範囲内にある。組成物は、１つ以上の他の所望の治療薬または医学的処置に対して、同時に、先行して、または後続して、投与されうる。一般に、作用薬はそれぞれ、その作用薬について決定された用量および日程で投与されることになろう。いくつかの実施形態では、本開示は、医薬組成物、予防用組成物、診断用組成物、または造影用組成物についての、該組成物の生物学的利用能を改善し、該組成物の代謝を低減および／もしくは改変し、該組成物の排出を抑制し、ならびに／または該組成物の身体内における分布を改変する作用薬と組み合わせた送達を包含する。
さらに当然のことであるが、組み合わせて利用される治療的に、予防的に、診断上、または造影上活性な作用薬は、単一の組成物中で一緒に投与されてもよいし、異なる組成物中で別々に投与されてもよい。一般に、組み合わせて利用される作用薬は、該作用薬が個別に利用される際のレベルを超過しないレベルで利用されることになる（ｗｉｔｈ ｂｅ
ｕｔｉｌｉｚｅｄ）と予想される。いくつかの実施形態では、組み合わせて利用されるレベルは個別に利用されるレベルより低くなる。
組み合わせレジメンにおいて利用すべき特定の組み合わせの治療（治療薬または治療処置）は、所望の治療薬および治療処置のうち少なくともいずれか一方の併用可能性、ならびに達成されるべき所望の治療効果を考慮に入れることになる。さらに当然のことであるが、使用されるこれらの治療は同じ障害について所望の効果を達成してもよいし（例えば、本開示によるがん治療に有用な組成物は化学療法剤と同時に投与されてもよい）、異なる効果（例えば何らかの副作用の制御）を達成してもよい。
［キット］
本開示は、本開示の方法を好都合かつ／または有効に実行するための様々なキットを提供する。典型的には、キットは、ユーザが対象者の複数回の治療を実施すること、および複数回の実験を実施することのうち少なくともいずれかを可能にするために十分な量および／または数の構成要素を含んでなることになる。
１つの態様では、本開示は、翻訳可能な領域および核酸修飾を含んでなる第１の単離核酸であって、第１の単離核酸が導入される細胞の先天性免疫応答の誘導を回避すなわち免れることが可能である、単離核酸と、包装および説明書と、を含んでなるタンパク質産生のためのキットを提供する。
１つの態様では、本開示は、タンパク質産生のためのキットであって：翻訳可能な領域を含んでなる第１の単離された修飾核酸であって、標的細胞に導入された時に該翻訳可能な領域によってコードされたタンパク質を所望の量だけ産生するのに有効な量で提供された、第１の単離修飾核酸と、抑制性の核酸を含んでなる第２の核酸であって、細胞の先天性免疫応答をほぼ抑制するのに有効な量で提供された、第２の核酸と、包装および説明書と、を含んでなるキットを提供する
１つの態様では、本開示は、翻訳可能な領域およびヌクレオシド修飾を含んでなる第１の単離核酸であって、細胞内ヌクレアーゼによる分解の低下を示す、単離核酸と、包装および説明書と、を含んでなるタンパク質産生のためのキットを提供する。
１つの態様では、本開示は、翻訳可能な領域および少なくとも２つの異なるヌクレオシド修飾を含んでなる第１の単離核酸であって、細胞内ヌクレアーゼによる分解の低下を示す、単離核酸と、包装および説明書と、を含んでなるタンパク質産生のためのキットを提供する。
１つの態様では、本開示は、翻訳可能な領域および少なくとも１つのヌクレオシド修飾を含んでなる第１の単離核酸であって、細胞内ヌクレアーゼによる分解の低下を示す、第１の単離核酸と、抑制性の核酸を含んでなる第２の核酸と、包装および説明書と、を含んでなるタンパク質産生のためのキットを提供する。
いくつかの実施形態では、第１の単離核酸はメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含んでなる。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、ピリジン‐４‐オンリボヌクレオシド、５‐アザ‐ウリジン、２‐チオ‐５‐アザ‐ウリジン、２‐チオウリジン、４‐チオ‐プソイドウリジン、２‐チオ‐プソイドウリジン、５‐ヒドロキシウリジン、３‐メチルウリジン、５‐カルボキシメチル‐ウリジン、１‐カルボキシメチル‐プソイドウリジン、５‐プロピニル‐ウリジン、１‐プロピニル‐プソイドウリジン、５‐タウリノメチルウリジン、１‐タウリノメチル‐プソイドウリジン、５‐タウリノメチル‐２‐チオ‐ウリジン、１‐タウリノメチル‐４‐チオ‐ウリジン、５‐メチル‐ウリジン、１‐メチル‐プソイドウリジン、４‐チオ‐１‐メチル‐プソイドウリジン、２‐チオ‐１‐メチル‐プソイドウリジン、１‐メチル‐１‐デアザ‐プソイドウリジン、２‐チオ‐１‐メチル‐１‐デアザ‐プソイドウリジン、ジヒドロウリジン、ジヒドロプソイドウリジン、２‐チオ‐ジヒドロウリジン、２‐チオ‐ジヒドロプソイドウリジン、２‐メトキシウリジン、２‐メトキシ‐４‐チオ‐ウリジン、４‐メトキシ‐プソイドウリジン、４‐メトキシ‐２‐チオ−プソイドウリジンまたは本明細書中に開示された任意のもので構成されている群から選択された、少なくとも１つのヌクレオシドを含んでなる。
いくつかの実施形態では、該ｍＲＮＡは、５‐アザ‐シチジン、プソイドイソシチジン、３‐メチル‐シチジン、Ｎ４‐アセチルシチジン、５‐ホルミルシチジン、Ｎ４‐メチルシチジン、５‐ヒドロキシメチルシチジン、１‐メチル‐プソイドイソシチジン、ピロロ‐シチジン、ピロロ‐プソイドイソシチジン、２‐チオ‐シチジン、２‐チオ‐５‐メチル‐シチジン、４‐チオ‐プソイドイソシチジン、４‐チオ‐１‐メチル‐プソイドイソシチジン、４‐チオ‐１‐メチル‐１‐デアザ‐プソイドイソシチジン、１‐メチル‐１‐デアザ‐プソイドイソシチジン、ゼブラリン、５‐アザ‐ゼブラリン、５‐メチル‐ゼブラリン、５‐アザ‐２‐チオ‐ゼブラリン、２‐チオ‐ゼブラリン、２‐メトキシ‐シチジン、２‐メトキシ‐５‐メチル‐シチジン、４‐メトキシ‐プソイドイソシチジン、４‐メトキシ‐１‐メチル‐プソイドイソシチジンまたは本明細書中に開示された任意のもので構成されている群から選択された、少なくとも１つのヌクレオシドを含んでなる。
いくつかの実施形態では、該ｍＲＮＡは、２‐アミノプリン、２，６‐ジアミノプリン、７‐デアザ‐アデニン、７‐デアザ‐８‐アザ‐アデニン、７‐デアザ‐２‐アミノプリン、７‐デアザ‐８‐アザ‐２‐アミノプリン、７‐デアザ‐２，６‐ジアミノプリン、７‐デアザ‐８‐アザ‐２，６‐ジアミノプリン、１‐メチルアデノシン、Ｎ６‐メチルアデノシン、Ｎ６‐イソペンテニルアデノシン、Ｎ６‐（シス‐ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、２‐メチルチオ‐Ｎ６‐（シス‐ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、Ｎ６‐グリシニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６‐トレオニルカルバモイルアデノシン、２‐メチルチオ‐Ｎ６‐トレオニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６，Ｎ６‐ジメチルアデノシン、７‐メチルアデニン、２‐メチルチオ‐アデニン、２‐メトキシ‐アデニンまたは本明細書中に開示された任意のもので構成されている群から選択された、少なくとも１つのヌクレオシドを含んでなる。
いくつかの実施形態では、該ｍＲＮＡは、イノシン、１‐メチル‐イノシン、ワイオシン、ワイブトシン、７‐デアザ‐グアノシン、７‐デアザ‐８‐アザ‐グアノシン、６‐チオ‐グアノシン、６‐チオ‐７‐デアザ‐グアノシン、６‐チオ‐７‐デアザ‐８‐アザ‐グアノシン、７‐メチル‐グアノシン、６‐チオ‐７‐メチル‐グアノシン、７‐メチルイノシン、６‐メトキシ‐グアノシン、１‐メチルグアノシン、Ｎ２‐メチルグアノシン、Ｎ２，Ｎ２−ジメチルグアノシン、８‐オキソ‐グアノシン、７‐メチル‐８‐オキソ‐グアノシン、１‐メチル‐６‐チオ‐グアノシン、Ｎ２‐メチル‐６‐チオ‐グアノシン、Ｎ２，Ｎ２‐ジメチル‐６‐チオ‐グアノシンまたは本明細書中に開示された任意のもので構成されている群から選択された、少なくとも１つのヌクレオシドを含んでなる。
別の態様では、本開示は、翻訳可能な領域およびヌクレオシド修飾を含んでなる第１の単離核酸であって、細胞内ヌクレアーゼによる分解の低下を示す、単離核酸と、第１の核酸の翻訳可能な領域の翻訳に適した哺乳動物細胞と、を含んでなるタンパク質産生のための組成物を提供する。
［定義］
本明細書中の随所に、本開示の化合物の置換基が、群として、または範囲として開示されている。明確に意図されるのは、本開示がそのような群および範囲に属する構成要因のありとあらゆる個々の部分的組み合わせを含むことである。例えば、「Ｃ１‐６アルキル」という用語は、メチル、エチル、Ｃ３アルキル、Ｃ４アルキル、Ｃ５アルキルおよびＣ６アルキルを個々に開示するように明確に意図されている。
「約」：本明細書中で使用されるように、「約」という用語は列挙された値の±１０％を意味する。
「組み合わせて投与された（ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ ｉｎ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）」：本明細書中で使用されるように、「組み合わせて投与された」または「併用投与」という用語は、２つ以上の作用薬が、同時に、または患者に対して各作用薬の効果の重なり合いがありうるような間隔以内で、対象者に投与されることを意味する。いくつかの実施形態では、該作用薬は互いに約６０、３０、１５、１０、５、または１分以内に投与される。いくつかの実施形態では、作用薬の投与は、組み合わせの（例えば、相乗的な）効果が達成されるように、互いに十分に接近した間隔でなされる。
「動物」：本明細書中で使用されるように、「動物」という用語は動物界に属する任意の構成要員を指す。いくつかの実施形態では、「動物」は任意の発達段階のヒトを指す。いくつかの実施形態では、「動物」は任意の発達段階のヒト以外の動物を指す。ある実施形態では、ヒト以外の動物は、哺乳動物（例えばげっ歯動物、マウス、ラット、ウサギ、サル、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、霊長類、またはブタ）である。いくつかの実施形態では、動物には、限定するものではないが、哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、および蠕虫（ｗｏｒｍ）が挙げられる。いくつかの実施形態では、動物はトランスジェニック動物、遺伝子操作された動物、またはクローンである。
「対象とする抗原または所望の抗原」：本明細書中で使用されるように、「対象とする抗原」または「所望の抗原」という用語は、本明細書中に記載された抗体および該抗体のフラグメント、突然変異体、バリアント、および変形物によって免疫特異的に結合される、本明細書中に提供されるタンパク質および他の生体分子を含む。対象とする抗原の例には、限定するものではないが、インスリン、インスリン様成長因子、ｈＧＨ、ｔＰＡ、サイトカイン、例えばインターロイキン類（ＩＬ）、例えばＩＬ‐１、ＩＬ‐２、ＩＬ‐３、ＩＬ‐４、ＩＬ‐５、ＩＬ‐６、ＩＬ‐７、ＩＬ‐８、ＩＬ‐９、ＩＬ‐１０、ＩＬ‐１１、ＩＬ‐１２、ＩＬ‐１３、ＩＬ‐１４、ＩＬ‐１５、ＩＬ‐１６、ＩＬ‐１７、ＩＬ‐１８、インターフェロン（ＩＦＮ）α、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＩＦＮωもしくはＩＦＮτ、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、例えばＴＮＦαおよびＴＮＦβ、ＴＮＦγ、ＴＲＡＩＬ；Ｇ‐ＣＳＦ、ＧＭ‐ＣＳＦ、Ｍ‐ＣＳＦ、ＭＣＰ‐１およびＶＥＧＦが挙げられる。
「およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」：本明細書中で使用されるように、「およそ」または「約」という用語は、１つ以上の対象とする値に適用されるように、明示された基準値に類似の値を指す。ある実施形態では、「およそ」または「約」という用語は、特に断りのない限り、または文脈から明白でない限り、明示された基準値の両方向に（基準値より大きく、または基準値より小さく）、２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、または１％未満の範囲内にある値域を指す（そのような数値が可能な値の１００％を超過する場合を除く）。
「〜と関連付けられた（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ）」：本明細書中で使用されるように、「〜と関連付けられた」、「コンジュゲートされた」、「連結された」、「取り付けられた」、および「係留された」という用語は、２以上の構成部分に関して使用される場合、該構成部分が直接、または連結剤としての役割を果たす１つ以上の追加の構成部分を介して、互いに物理的に関連付けられるかまたは接続されて構造物を形成し、該構造物は、該構造物が使用される条件（例えば生理学的条件）の下で構成部分が物理的に関連付けられ続けるのに十分に安定であることを意味する。「関連、会合（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）」は、厳密に直接の共有結合による化学結合によるものである必要はない。該用語はさらに、「関連付けられた」物が物理的に関連付けられ続けるのに十分に安定した、イオン結合もしくは水素結合またはハイブリダイゼーションに基づいた接続性をも示唆しうる。
「生体適合性（の）（ｂｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ）」：本明細書中で使用されるように、「生体適合性（の）」という用語は、生きている細胞、組織、臓器または器官系と適合性であって、損傷、毒性または免疫系による拒絶のリスクをほとんど〜全く引き起こさないことを意味する。
「生物分解性（の）（ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ）」：本明細書中で使用されるように、「生物分解性（の）」という用語は、生物の活動によって無害の生成物に分解されることが可能であることを意味する。
「生物学的に活性である（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ）」：本明細書中で使用されるように、「生物学的に活性である」という言葉は、生物系および生物体のうち少なくともいずれかにおいて活性を有する任意の物質の特徴を指す。例えば、生物体に投与された時にその生物体に生物学的作用を有する物質は、生物学的に活性であると考えられる。特定の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、該ポリヌクレオチドの一部分でも生物学的に活性であるかまたは生物学的に関連性があると考えられる活性を模倣する場合、生物学的に活性であると考えることができる。
「化学用語」：下記は「アシル」から「チオール」まで様々な化学用語の定義を提供する。
「アシル」という用語は、本明細書中で使用されるように、本明細書中に定義されるようなカルボニル基によって親分子群に取り付けられた、本明細書中に定義されるような水素またはアルキル基（例えばハロアルキル基）を表わし、ホルミル（すなわちカルボキシアルデヒド基）、アセチル、トリフルオロアセチル、プロピオニル、ブタノイルなどにより例証される。典型的な非置換のアシル基は、１〜７個、１〜１１個、または１〜２１個の炭素を含んでいる。いくつかの実施形態では、該アルキル基は、本明細書中に記載されるような１、２、３、または４個の置換基でさらに置換される。
「アシルアミノ」という用語は、本明細書中で使用されるように、本明細書中で定義されるようなアミノ基によって親分子群に取り付けられた、本明細書中に定義されるようなアシル基を表わす（すなわち、‐Ｎ（ＲＮ１）‐Ｃ（Ｏ）‐Ｒであって、式中のＲはＨまたは任意選択で置換されたＣ１‐６、Ｃ１‐１０、もしくはＣ１‐２０アルキル基（例えばハロアルキル）であり、ＲＮ１は本明細書中に定義された通りである）。典型的な非置換のアシルアミノ基は、１〜４１個の炭素（例えば、１〜７、１〜１３、１〜２１、２〜７、２〜１３、２〜２１、または２〜４１個の炭素）を含んでいる。いくつかの実施形態では、該アルキル基は、本明細書中に記載されるような１、２、３、もしくは４個の置換基でさらに置換され、および／または、該アミノ基は‐ＮＨ２もしくは‐ＮＨＲＮ１であり、式中のＲＮ１は独立に、ＯＨ、ＮＯ２、ＮＨ２、ＮＲＮ２ ２、ＳＯ２ＯＲＮ２、ＳＯ２ＲＮ２、ＳＯＲＮ２、アルキル、アリール、アシル（例えば、アセチル、トリフルオロアセチル、もしくは本明細書中に記載された他のもの）、もしくはアルコキシカルボニルアルキルであり、ＲＮ２はそれぞれＨ、アルキル、もしくはアリールであってよい。
「アシルアミノアルキル」という用語は、本明細書中で使用されるように、本明細書中で定義されるようなアルキル基によって親分子群に取り付けられたアミノ基に取り付けられた、本明細書中に定義されるようなアシル基を表わす（すなわち、‐アルキル‐Ｎ（ＲＮ１）‐Ｃ（Ｏ）‐Ｒであって、式中のＲはＨまたは任意選択で置換されたＣ１‐６、Ｃ１‐１０、もしくはＣ１‐２０アルキル基（例えばハロアルキル）であり、ＲＮ１は本明細書中に定義された通りである）。典型的な非置換のアシルアミノ基は、１〜４１個の炭素（例えば、１〜７、１〜１３、１〜２１、２〜７、２〜１３、２〜２１、または２〜４１個の炭素）を含んでいる。いくつかの実施形態では、該アルキル基は、本明細書中に記載されるような１、２、３、もしくは４個の置換基でさらに置換され、および／または、該アミノ基は‐ＮＨ２もしくは‐ＮＨＲＮ１であり、式中のＲＮ１は独立に、ＯＨ、ＮＯ２、ＮＨ２、ＮＲＮ２ ２、ＳＯ２ＯＲＮ２、ＳＯ２ＲＮ２、ＳＯＲＮ２、アルキル、アリール、アシル（例えば、アセチル、トリフルオロアセチル、もしくは本明細書中に記載された他のもの）、もしくはアルコキシカルボニルアルキルであり、ＲＮ２はそれぞれＨ、アルキル、もしくはアリールであってよい。
「アシルオキシ」という用語は、本明細書中で使用されるように、酸素原子によって親分子群に取り付けられた、本明細書中で定義されるようなアシル基を表わす（すなわち‐Ｏ‐Ｃ（Ｏ）‐Ｒであって、式中のＲはＨまたは任意選択で置換されたＣ１‐６、Ｃ１‐１０、もしくはＣ１‐２０アルキル基である）。典型的な非置換のアシルオキシ基は、１〜２１個の炭素（例えば１〜７個または１〜１１個の炭素）を含んでいる。いくつかの実施形態では、該アルキル基は、本明細書中に記載されるような１、２、３、または４個の置換基でさらに置換される。
「アシルオキシアルキル」という用語は、本明細書中で使用されるように、アルキル基によって親分子群に取り付けられた酸素原子に取り付けられた、本明細書中で定義されるようなアシル基を表わす（すなわち、‐アルキル‐Ｏ‐Ｃ（Ｏ）‐Ｒであって、式中のＲはＨまたは任意選択で置換されたＣ１‐６、Ｃ１‐１０、もしくはＣ１‐２０アルキル基である）。典型的な非置換のアシルオキシアルキル基は、１〜２１個の炭素（例えば１〜７個または１〜１１個の炭素）を含んでいる。いくつかの実施形態では、該アルキル基は、独立に、本明細書中に記載されるような１、２、３、または４個の置換基でさらに置換される。
「アルカリール（アルクアリール）」という用語は、本明細書中で使用されるように、本明細書中に定義されるようなアルキレン基によって親分子群に取り付けられた、本明細書中に定義されるようなアリール基を表わす。典型的な非置換のアルカリール基は、７〜３０個の炭素（例えば、７〜１６または７〜２０個の炭素、例えばＣ１‐６アルク‐Ｃ６‐１０アリール、Ｃ１‐１０アルク‐Ｃ６‐１０アリール、またはＣ１‐２０アルク‐Ｃ６‐１０アリール）である。いくつかの実施形態では、アルキレンおよびアリールは各々、それぞれの基について１、２、３、または４個の本明細書中に定義されるような置換基でさらに置換されうる。接頭辞「アルク（ａｌｋ−）」が前に付されるその他の基も同じ方式で定義され、その場合「アルク」は、特に記載のないかぎりＣ１‐６アルキレンを指し、かつ、付される化学構造は本明細書中に定義された通りである。
「アルクシクロアルキル」という用語は、本明細書中に定義されるようなアルキレン基（例えば、炭素数１〜４、１〜６、１〜１０、または１〜２０（ｆｏｒｍ １ ｔｏ ２０）のアルキレン基）によって親分子群に取り付けられた、本明細書中に定義されるようなシクロアルキル基を表わす。いくつかの実施形態では、アルキレンおよびシクロアルキルは各々、それぞれの基について１、２、３、または４個の本明細書中に定義されるような置換基でさらに置換されうる。
「アルケニル」という用語は、本明細書中で使用されるように、１つ以上の炭素‐炭素二重結合を含んでいる、別段の定めがない限り炭素数２〜２０の（例えば炭素数２〜６または２〜１０の）一価の直鎖または分岐鎖の基を表し、エテニル、１‐プロペニル、２‐プロペニル、２‐メチル‐１‐プロペニル、１‐ブテニル、２‐ブテニルなどにより例証される。アルケニルにはシス異性体およびトランス異性体の両方が含まれる。アルケニル基は、任意選択で、本明細書中に定義されるようなアミノ、アリール、シクロアルキル、もしくはヘテロシクリル（例えばヘテロアリール）から独立に選択される１、２、３、もしくは４個の置換基、または本明細書中に記載された典型的なアルキル置換基のうち任意のものを用いて置換されうる。
「アルケニルオキシ」という用語は、式‐ＯＲの化学置換基であって、式中のＲは別段の定めがない限りＣ２‐２０アルケニル基（例えばＣ２‐６またはＣ２‐１０アルケニル）である、置換基を表わす。典型的なアルケニルオキシ基には、エテニルオキシ、プロペニルオキシなどが挙げられる。いくつかの実施形態では、アルケニル基は、本明細書中に定義されるような１、２、３、または４個の置換基（例えば水酸基）でさらに置換されうる。
「アルクヘテロアリール」という用語は、本明細書中に定義されるようなアルキレン基によって親分子群に取り付けられた、本明細書中に定義されるようなヘテロアリール基を指す。典型的な非置換のアルクヘテロアリール基は、２〜３２個の炭素（例えば、２〜２２、２〜１８、２〜１７、２〜１６、３〜１５、２〜１４、２〜１３、または２〜１２個の炭素、例えばＣ１‐６アルク‐Ｃ１‐１２ヘテロアリール、Ｃ１‐１０アルク‐Ｃ１‐１２ヘテロアリール、またはＣ１‐２０アルク‐Ｃ１‐１２ヘテロアリール）である。いくつかの実施形態では、アルキレンおよびヘテロアリールは各々、それぞれの基について１、２、３、または４個の本明細書中に定義されるような置換基でさらに置換されうる。アルクヘテロアリール基はアルクヘテロシクリル基のサブセットである。
「アルクヘテロシクリル」という用語は、本明細書中に定義されるようなアルキレン基によって親分子群に取り付けられた、本明細書中に定義されるようなヘテロシクリル基を表わす。典型的な非置換のアルクヘテロシクリル基は、２〜３２個の炭素（例えば、２〜２２、２〜１８、２〜１７、２〜１６、３〜１５、２〜１４、２〜１３、または２〜１２個の炭素、例えばＣ１‐６アルク‐Ｃ１‐１２ヘテロシクリル、Ｃ１‐１０アルク‐Ｃ１‐１２ヘテロシクリル、またはＣ１‐２０アルク‐Ｃ１‐１２ヘテロシクリル）である。いくつかの実施形態では、アルキレンおよびヘテロシクリルは各々、それぞれの基について１、２、３、または４個の本明細書中に定義されるような置換基でさらに置換されうる。
「アルコキシ」という用語は、式‐ＯＲの化学置換基であって、式中のＲは別段の定めがない限りＣ１−２０アルキル基（例えばＣ１‐６またはＣ１‐１０アルキル）である、置換基を表わす。典型的なアルコキシ基には、メトキシ、エトキシ、プロポキシ（例えばｎ‐プロポキシおよびイソプロポキシ）、ｔ‐ブトキシなどが挙げられる。いくつかの実施形態では、該アルキル基は、１、２、３、または４個の本明細書中に定義されるような置換基（例えばヒドロキシまたはアルコキシ）でさらに置換されうる。
「アルコキシアルコキシ」という用語は、アルコキシ基で置換されたアルコキシ基を表わす。典型的な非置換のアルコキシアルコキシ基は、２〜４０個の炭素（例えば、２〜１２または２〜２０個の炭素、例えばＣ１‐６アルコキシ‐Ｃ１‐６アルコキシ、Ｃ１‐１０アルコキシ‐Ｃ１‐１０アルコキシ、またはＣ１‐２０アルコキシ‐Ｃ１‐２０アルコキシ）を含んでいる。いくつかの実施形態では、各アルコキシ基は、本明細書中に定期されるような１、２、３、または４個の置換基でさらに置換されうる。
「アルコキシアルキル」という用語は、アルコキシ基で置換されたアルキル基を表わす。典型的な非置換のアルコキシアルキル基は、２〜４０個の炭素（例えば、２〜１２または２〜２０個の炭素、例えばＣ１‐６アルコキシ‐Ｃ１‐６アルキル、Ｃ１‐１０アルコキシ‐Ｃ１‐１０アルキル、またはＣ１‐２０アルコキシ‐Ｃ１‐２０アルキル）を含んでいる。いくつかの実施形態では、該アルキルおよびアルコキシは各々、それぞれの基について１、２、３、または４個の本明細書中に定義されるような置換基でさらに置換されうる。
「アルコキシカルボニル」という用語は、本明細書中で使用されるように、カルボニル原子によって親分子群に取り付けられた、本明細書中に定義されるようなアルコキシを表す（例えば、‐Ｃ（Ｏ）‐ＯＲであって、式中のＲはＨまたは任意選択で置換されたＣ１‐６、Ｃ１‐１０、またはＣ１‐２０アルキル基である）。典型的な非置換のアルコキシカルボニルは、１〜２１個の炭素（例えば１〜１１個または１〜７個の炭素）を含んでいる。いくつかの実施形態では、該アルコキシ基は、本明細書中に記載されるような１、２、３、または４個の置換基でさらに置換される。
「アルコキシカルボニルアシル」という用語は、本明細書中で使用されるように、本明細書中に定義されるようなアルコキシカルボニル基で置換された、本明細書中に定義されるようなアシル基を表わす（例えば‐Ｃ（Ｏ）‐アルキル‐Ｃ（Ｏ）‐ＯＲであって、式中のＲは任意選択で置換されたＣ１‐６、Ｃ１‐１０、またはＣ１‐２０アルキル基である）。典型的な非置換のアルコキシカルボニルアシルは、３〜４１個の炭素（例えば３〜１０、３〜１３、３〜１７、３〜２１、または３〜３１個の炭素、例えばＣ１‐６アルコキシカルボニル‐Ｃ１‐６アシル、Ｃ１‐１０アルコキシカルボニル‐Ｃ１‐１０アシル、またはＣ１‐２０アルコキシカルボニル‐Ｃ１‐２０アシル）を含んでいる。いくつかの実施形態では、アルコキシおよびアルキル基はそれぞれ、１、２、３、または４個の、各基について本明細書中に記載されるような置換基（例えば水酸基）でさらに独立に置換される。
「アルコキシカルボニルアルコキシ」という用語は、本明細書中で使用されるように、本明細書中に定義されるようなアルコキシカルボニル基で置換された、本明細書中に定義されるようなアルコキシ基を表わす（例えば‐Ｏ‐アルキル‐Ｃ（Ｏ）‐ＯＲであって、式中のＲは任意選択で置換されたＣ１‐６、Ｃ１‐１０、またはＣ１‐２０アルキル基である）。典型的な非置換のアルコキシカルボニルアルコキシは、３〜４１個の炭素（例えば３〜１０、３〜１３、３〜１７、３〜２１、または３〜３１個の炭素、例えばＣ１‐６アルコキシカルボニル‐Ｃ１‐６アルコキシ、Ｃ１‐１０アルコキシカルボニル‐Ｃ１‐１０アルコキシ、またはＣ１‐２０アルコキシカルボニル‐Ｃ１‐２０アルコキシ）を含んでいる。いくつかの実施形態では、各アルコキシ基は、１、２、３、または４個の本明細書中に記載されるような置換基（例えば水酸基）でさらに独立に置換される。
「アルコキシカルボニルアルキル」という用語は、本明細書中で使用されるように、本明細書中に定義されるようなアルコキシカルボニル基で置換された、本明細書中に定義されるようなアルキル基を表わす（例えば‐アルキル‐Ｃ（Ｏ）‐ＯＲであって、式中のＲは任意選択で置換されたＣ１‐２０、Ｃ１‐１０、またはＣ１‐６アルキル基である）。典型的な非置換のアルコキシカルボニルアルキルは、３〜４１個の炭素（例えば３〜１０、３〜１３、３〜１７、３〜２１、または３〜３１個の炭素、例えばＣ１‐６アルコキシカルボニル‐Ｃ１‐６アルキル、Ｃ１‐１０アルコキシカルボニル‐Ｃ１‐１０アルキル、またはＣ１‐２０アルコキシカルボニル‐Ｃ１‐２０アルキル）を含んでいる。いくつかの実施形態では、アルキルおよびアルコキシ基はそれぞれ、１、２、３、または４個の本明細書中に記載されるような置換基（例えば水酸基）でさらに独立に置換される。
「アルコキシカルボニルアルケニル」という用語は、本明細書中で使用されるように、本明細書中に定義されるようなアルコキシカルボニル基で置換された、本明細書中に定義されるようなアルケニル基を表わす（例えば‐アルケニル‐Ｃ（Ｏ）‐ＯＲであって、式中のＲは任意選択で置換されたＣ１‐２０、Ｃ１‐１０、またはＣ１‐６アルキル基である）。典型的な非置換のアルコキシカルボニルアルケニルは、４〜４１個の炭素（例えば４〜１０、４〜１３、４〜１７、４〜２１、または４〜３１個の炭素、例えばＣ１‐６アルコキシカルボニル‐Ｃ２‐６アルケニル、Ｃ１‐１０アルコキシカルボニル‐Ｃ２‐１０アルケニル、またはＣ１‐２０アルコキシカルボニル‐Ｃ２‐２０アルケニル）を含んでいる。いくつかの実施形態では、アルキル、アルケニル、およびアルコキシ基はそれぞれ、１、２、３、または４個の本明細書中に記載されるような置換基（例えば水酸基）でさらに独立に置換される。
「アルコキシカルボニルアルキニル」という用語は、本明細書中で使用されるように、本明細書中に定義されるようなアルコキシカルボニル基で置換された、本明細書中に定義されるようなアルキニル基を表わす（例えば、‐アルキニル‐Ｃ（Ｏ）‐ＯＲであって、式中のＲは任意選択で置換されたＣ１‐２０、Ｃ１‐１０、またはＣ１‐６アルキル基である）。典型的な非置換のアルコキシカルボニルアルキニルは、４〜４１個の炭素（例えば４〜１０、４〜１３、４〜１７、４〜２１、または４〜３１個の炭素、例えばＣ１‐６アルコキシカルボニル‐Ｃ２‐６アルキニル、Ｃ１‐１０アルコキシカルボニル‐Ｃ２‐１０アルキニル、またはＣ１‐２０アルコキシカルボニル‐Ｃ２‐２０アルキニル）を含んでいる。いくつかの実施形態では、アルキル、アルキニル、およびアルコキシ基はそれぞれ、１、２、３、または４個の本明細書中に記載されるような置換基（例えば水酸基）でさらに独立に置換される。
「アルキル」という用語は、本明細書中で使用されるように、別段の定めがない限り炭素数１〜２０の（例えば１〜１０または１〜６の）直鎖および分岐鎖の両方の飽和基を含んでいる。アルキル基は、メチル、エチル、ｎ‐プロピルおよびイソプロピル、ｎ‐、ｓｅｃ‐、イソ‐およびｔｅｒｔ‐ブチル、ネオペンチルなどにより例証され、かつ任意選択で、１、２、３個、または炭素が２個以上のアルキル基の場合には４個の、下記すなわち：（１）Ｃ１‐６アルコキシ；（２）Ｃ１‐６アルキルスルフィニル；（３）本明細書中に定義されるようなアミノ（例えば、非置換のアミノ（すなわち‐ＮＨ２）または置換されたアミノ（すなわち、−Ｎ（ＲＮ１）２であって式中のＲＮ１はアミノについて定義された通りである）；（４）Ｃ６‐１０アリール‐Ｃ１‐６アルコキシ；（５）アジド；（６）ハロ；（７）（Ｃ２‐９ヘテロシクリル）オキシ；（８）任意選択でＯ‐保護基で置換されたヒドロキシ；（９）ニトロ；（１０）オキソ（例えばカルボキシアルデヒドまたはアシル）；（１１）Ｃ１‐７スピロシクリル；（１２）チオアルコキシ；（１３）チオール；（１４）任意選択でＯ‐保護基で置換された‐ＣＯ２ＲＡ’であって、式中のＲＡ’は以下すなわち（ａ）Ｃ１‐２０アルキル（例えばＣ１‐６アルキル）、（ｂ）Ｃ２‐２０アルケニル（例えばＣ２‐６アルケニル）、（ｃ）Ｃ６‐１０アリール、（ｄ）水素、（ｅ）Ｃ１‐６アルク‐Ｃ６‐１０アリール、（ｆ）アミノ‐Ｃ１‐２０アルキル、（ｇ）‐（ＣＨ２）ｓ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＯＲ’のポリエチレングリコールであって、式中のｓ１は１〜１０（例えば１〜６または１〜４）の整数であり、ｓ２およびｓ３はそれぞれ独立に、０〜１０（例えば０〜４、０〜６、１〜４、１〜６、または１〜１０）の整数であり、Ｒ’はＨまたはＣ１‐２０アルキルであるもの、ならびに、（ｈ）‐ＮＲＮ１（ＣＨ２）ｓ２（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＮＲＮ１のアミノポリエチレングリコールであって、式中のｓ１は１〜１０（例えば１〜６または１〜４）の整数であり、ｓ２およびｓ３はそれぞれ独立に、０〜１０（例えば０〜４、０〜６、１〜４、１〜６、または１〜１０）の整数であり、かつＲＮ１はそれぞれ独立に水素または任意選択で置換されたＣ１‐６アルキルであるもの；で構成されている群から選択されるもの；（１５）‐Ｃ（Ｏ）ＮＲＢ’ＲＣ’であって、式中のＲＢ’およびＲＣ’はそれぞれ独立に、（ａ）水素、（ｂ）Ｃ１‐６アルキル、（ｃ）Ｃ６‐１０アリール、および（ｄ）Ｃ１‐６アルク‐Ｃ６‐１０アリール、で構成されている群から選択されるもの；（１６）‐ＳＯ２ＲＤ’であって、式中のＲＤ’は、（ａ）Ｃ１‐６アルキル、（ｂ）Ｃ６‐１０アリール、（ｃ）Ｃ１‐６アルク‐Ｃ６‐１０アリール、および（ｄ）ヒドロキシ、で構成されている群から選択されるもの；（１７）‐ＳＯ２ＮＲＥ’ＲＦ’であって、式中のＲＥ’およびＲＦ’はそれぞれ独立に、（ａ）水素、（ｂ）Ｃ１‐６アルキル、（ｃ）Ｃ６‐１０アリール、および（ｄ）Ｃ１‐６アルク‐Ｃ６‐１０アリール、で構成されている群から選択されるもの；（１８）‐Ｃ（Ｏ）ＲＧ’であって、式中のＲＧ’は、（ａ）Ｃ１‐２０アルキル（例えばＣ１‐６アルキル）、（ｂ）Ｃ２‐２０アルケニル（例えばＣ２‐６アルケニル）、（ｃ）Ｃ６‐１０アリール、（ｄ）水素、（ｅ）Ｃ１‐６アルク‐Ｃ６‐１０アリール、（ｆ）アミノ‐Ｃ１‐２０アルキル、（ｇ）‐（ＣＨ２）ｓ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＯＲ’のポリエチレングリコールであって、式中のｓ１は１〜１０（例えば１〜６または１〜４）の整数であり、ｓ２およびｓ３はそれぞれ独立に、０〜１０（例えば０〜４、０〜６、１〜４、１〜６、または１〜１０）の整数であり、Ｒ’はＨまたはＣ１‐２０アルキルであるもの、ならびに、（ｈ）‐ＮＲＮ１（ＣＨ２）ｓ２（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＮＲＮ１のアミノポリエチレングリコールであって、式中のｓ１は１〜１０（例えば１〜６または１〜４）の整数であり、ｓ２およびｓ３はそれぞれ独立に、０〜１０（例えば０〜４、０〜６、１〜４、１〜６、または１〜１０）の整数であり、かつＲＮ１はそれぞれ独立に水素または任意選択で置換されたＣ１‐６アルキルであるもの；で構成されている群から選択されるもの；（１９）‐ＮＲＨ’Ｃ（Ｏ）ＲＩ’であって、式中のＲＨ’は、（ａ１）水素および（ｂ１）Ｃ１‐６アルキルで構成されている群から選択され、ＲＩ’は、（ａ２）Ｃ１‐２０アルキル（例えばＣ１‐６アルキル）、（ｂ２）Ｃ２‐２０アルケニル（例えばＣ２‐６アルケニル）、（ｃ２）Ｃ６‐１０アリール、（ｄ２）水素、（ｅ２）Ｃ１‐６アルク‐Ｃ６‐１０アリール、（ｆ２）アミノ‐Ｃ１‐２０アルキル、（ｇ２）‐（ＣＨ２）ｓ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＯＲ’のポリエチレングリコールであって、式中のｓ１は１〜１０（例えば１〜６または１〜４）の整数であり、ｓ２およびｓ３はそれぞれ独立に、０〜１０（例えば０〜４、０〜６、１〜４、１〜６、または１〜１０）の整数であり、Ｒ’はＨまたはＣ１‐２０アルキルであるもの、ならびに、（ｈ２）‐ＮＲＮ１（ＣＨ２）ｓ２（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＮＲＮ１のアミノポリエチレングリコールであって、式中のｓ１は１〜１０（例えば１〜６または１〜４）の整数であり、ｓ２およびｓ３はそれぞれ独立に、０〜１０（例えば０〜４、０〜６、１〜４、１〜６、または１〜１０）の整数であり、かつＲＮ１はそれぞれ独立に水素または任意選択で置換されたＣ１‐６アルキルであるもの；で構成されている群から選択されるもの；（２０）‐ＮＲＪ’Ｃ（Ｏ）ＯＲＫ’であって、式中のＲＪ’は、（ａ１）水素および（ｂ１）Ｃ１‐６アルキルで構成されている群から選択され、ＲＫ’は、（ａ２）Ｃ１‐２０アルキル（例えばＣ１‐６アルキル）、（ｂ２）Ｃ２‐２０アルケニル（例えばＣ２‐６アルケニル）、（ｃ２）Ｃ６‐１０アリール、（ｄ２）水素、（ｅ２）Ｃ１‐６アルク‐Ｃ６‐１０アリール、（ｆ２）アミノ‐Ｃ１‐２０アルキル、（ｇ２）‐（ＣＨ２）ｓ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＯＲ’のポリエチレングリコールであって、式中のｓ１は１〜１０（例えば１〜６または１〜４）の整数であり、ｓ２およびｓ３はそれぞれ独立に、０〜１０（例えば０〜４、０〜６、１〜４、１〜６、または１〜１０）の整数であり、Ｒ’はＨまたはＣ１‐２０アルキルであるもの、ならびに、（ｈ２）‐ＮＲＮ１（ＣＨ２）ｓ２（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＮＲＮ１のアミノポリエチレングリコールであって、式中のｓ１は１〜１０（例えば１〜６または１〜４）の整数であり、ｓ２およびｓ３はそれぞれ独立に、０〜１０（例えば０〜４、０〜６、１〜４、１〜６、または１〜１０）の整数であり、かつＲＮ１はそれぞれ独立に水素または任意選択で置換されたＣ１‐６アルキルであるもの；で構成されている群から選択されるもの；ならびに、（２１）アミジン；で構成されている群から独立に選択された置換基で置換されてもよい。いくつかの実施形態では、これらの基はそれぞれ、本明細書中に記載されるようにさらに置換されてもよい。例えば、Ｃ１‐アルカリールのアルキレン基は、オキソ基でさらに置換されてそれぞれのアリーロイル（ａｒｙｌｏｙｌ）置換基を提供することができる。
用語「アルキレン」および接頭辞「アルク」は、本明細書中で使用されるように、直鎖または分岐鎖の飽和炭化水素から２個の水素原子の除去により生じた２価の飽和炭化水素基を表わし、メチレン、エチレン、イソプロピレンなどにより例証される。用語「Ｃｘ‐ｙアルキレン」および接頭辞「Ｃｘ‐ｙアルク」は、ｘ〜ｙ個の炭素を有するアルキレン基を表す。ｘの典型的な値は１、２、３、４、５および６であり、ｙの典型的な値は２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、または２０である（例えば、Ｃ１‐６、Ｃ１‐１０、Ｃ２‐２０、Ｃ２‐６、Ｃ２‐１０、またはＣ２‐２０アルキレン）。いくつかの実施形態では、アルキレンは、１、２、３、または４個の、アルキル基について本明細書中に定義されるような置換基でさらに置換されうる。
「アルキルスルフィニル」という用語は、本明細書中で使用されるように、‐Ｓ（Ｏ）‐基によって親分子群に取り付けられたアルキル基を表わす。典型的な非置換のアルキルスルフィニル基は、炭素数が１〜６、１〜１０、または１〜２０個である。いくつかの実施形態では、該アルキル基は、１、２、３、または４個の本明細書中に定義されるような置換基でさらに置換されうる。
「アルキルスルフィニルアルキル」という用語は、本明細書中で使用されるように、アルキルスルフィニル基によって置換された、本明細書中に定義されるようなアルキル基を表わす。典型的な非置換のアルキルスルフィニルアルキル基は、炭素数が２〜１２、２〜２０、または２〜４０個である。いくつかの実施形態では、アルキル基はそれぞれ、１、２、３、または４個の本明細書中に定義されるような置換基でさらに置換されうる。
「アルキニル」という用語は、本明細書中で使用されるように、炭素‐炭素間三重結合を含んでいる炭素原子２〜２０個の（例えば炭素数２〜４、２〜６、または２〜１０の）一価の直鎖または分岐鎖の基を表わし、エチニル、１‐プロピニルなどにより例証される。アルキニル基は、１、２、３、または４個の、本明細書中に定義されるような、アリール、シクロアルキル、もしくはヘテロシクリル（例えばヘテロアリール）、または本明細書中に記載された典型的なアルキル置換基のうちいずれかから独立に選択された置換基で、任意選択で置換されてもよい。
「アルキニルオキシ」という用語は、式‐ＯＲの化学置換基であって、式中のＲは別段の定めがない限りＣ２‐２０アルキニル基（例えばＣ２‐６またはＣ２‐１０アルキニル）である、置換基を表わす。典型的なアルキニルオキシ基には、エチニルオキシ、プロピニルオキシなどが含まれる。いくつかの実施形態では、該アルキニル基は、１、２、３、または４個の本明細書中に定義されるような置換基（例えば水酸基）でさらに置換されうる。
「アミジン」という用語は、本明細書中で使用されるように、‐Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２基を表わす。
「アミノ」という用語は、本明細書中で使用されるように、−Ｎ（ＲＮ１）２を表し、式中のＲＮ１はそれぞれ独立に、Ｈ、ＯＨ、ＮＯ２、Ｎ（ＲＮ２）２、ＳＯ２ＯＲＮ２、ＳＯ２ＲＮ２、ＳＯＲＮ２、Ｎ‐保護基、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アリール、アルカリール、シクロアルキル、アルクシクロアルキル、カルボキシアルキル（例えば、任意選択で、Ｏ‐保護基、例えば任意選択で置換されたアリールアルコキシカルボニル基または本明細書中に記載された任意のもの、で置換されたもの）、スルホアルキル、アシル（例えば、アセチル、トリフルオロアセチル、または本明細書中に記載されたその他のもの）、アルコキシカルボニルアルキル（例えば、任意選択で、Ｏ‐保護基、例えば任意選択で置換されたアリールアルコキシカルボニル基または本明細書中に記載された任意のもの、で置換されたもの）、ヘテロシクリル（例えばヘテロアリール）、またはアルクヘテロシクリル（例えばアルクヘテロアリール）であり、上記の列挙されたＲＮ１基はそれぞれ、各基について本明細書中に定義されるように、任意選択で置換されうるか；または２つのＲＮ１が組み合わさってヘテロシクリルもしくはＮ‐保護基を形成し、かつＲＮ２はそれぞれ独立に、Ｈ、アルキル、またはアリールである。本発明のアミノ基は、非置換のアミノ（すなわち‐ＮＨ２）であってもよいし、置換されたアミノ（すなわち‐Ｎ（ＲＮ１）２）であってもよい。好ましい実施形態では、アミノは‐ＮＨ２または‐ＮＨＲＮ１であって、式中のＲＮ１は、独立に、ＯＨ、ＮＯ２、ＮＨ２、ＮＲＮ２ ２、ＳＯ２ＯＲＮ２、ＳＯ２ＲＮ２、ＳＯＲＮ２、アルキル、カルボキシアルキル、スルホアルキル、アシル（例えば、アセチル、トリフルオロアセチル、もしくは本明細書中に記載されたその他のもの）、アルコキシカルボニルアルキル（例えば、ｔ‐ブトキシカルボニルアルキル）もしくはアリールであり、ＲＮ２はそれぞれ、Ｈ、Ｃ１‐２０アルキル（例えばＣ１‐６アルキル）、またはＣ６‐１０アリールであってよい。
「アミノ酸」という用語は、本明細書中に記載されるように、側鎖、アミノ基、および酸性基（例えば‐ＣＯ２Ｈのカルボキシ基または‐ＳＯ３Ｈのスルホ基）を有する分子を指し、該アミノ酸は、側鎖、アミノ基、または酸性基（例えば側鎖）によって親分子群に取り付けられる。いくつかの実施形態では、アミノ酸はカルボニル基によって親分子群に取り付けられ、側鎖またはアミノ基は該カルボニル基に取り付けられる。典型的な側鎖には、任意選択で置換されたアルキル、アリール、ヘテロシクリル、アルカリール、アルクヘテロシクリル、アミノアルキル、カルバモイルアルキル、およびカルボキシアルキルが挙げられる。典型的なアミノ酸には、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、ヒドロキシノルバリン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、ノルバリン、オルニチン、フェニルアラニン、プロリン、ピロリジン、セレノシステイン、セリン、タウリン、トレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリンが挙げられる。アミノ酸基は、任意選択で、１、２、３個、または炭素が２個以上のアミノ酸基の場合には４個の、下記すなわち：（１）Ｃ１‐６アルコキシ；（２）Ｃ１‐６アルキルスルフィニル；（３）本明細書中に定義されるようなアミノ（例えば、非置換のアミノ（すなわち‐ＮＨ２）または置換されたアミノ（すなわち、−Ｎ（ＲＮ１）２であって式中のＲＮ１はアミノについて定義された通りである）；（４）Ｃ６‐１０アリール‐Ｃ１‐６アルコキシ；（５）アジド；（６）ハロ；（７）（Ｃ２‐９ヘテロシクリル）オキシ；（８）ヒドロキシ；（９）ニトロ；（１０）オキソ（例えばカルボキシアルデヒドまたはアシル）；（１１）Ｃ１‐７スピロシクリル；（１２）チオアルコキシ；（１３）チオール；（１４）‐ＣＯ２ＲＡ’であって、式中のＲＡ’は以下すなわち（ａ）Ｃ１‐２０アルキル（例えばＣ１‐６アルキル）、（ｂ）Ｃ２‐２０アルケニル（例えばＣ２‐６アルケニル）、（ｃ）Ｃ６‐１０アリール、（ｄ）水素、（ｅ）Ｃ１‐６アルク‐Ｃ６‐１０アリール、（ｆ）アミノ‐Ｃ１‐２０アルキル、（ｇ）‐（ＣＨ２）ｓ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＯＲ’のポリエチレングリコールであって、式中のｓ１は１〜１０（例えば１〜６または１〜４）の整数であり、ｓ２およびｓ３はそれぞれ独立に、０〜１０（例えば０〜４、０〜６、１〜４、１〜６、または１〜１０）の整数であり、Ｒ’はＨまたはＣ１‐２０アルキルであるもの、ならびに、（ｈ）‐ＮＲＮ１（ＣＨ２）ｓ２（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＮＲＮ１のアミノポリエチレングリコールであって、式中のｓ１は１〜１０（例えば１〜６または１〜４）の整数であり、ｓ２およびｓ３はそれぞれ独立に、０〜１０（例えば０〜４、０〜６、１〜４、１〜６、または１〜１０）の整数であり、かつＲＮ１はそれぞれ独立に水素または任意選択で置換されたＣ１‐６アルキルであるもの；（１５）‐Ｃ（Ｏ）ＮＲＢ’ＲＣ’であって、式中のＲＢ’およびＲＣ’はそれぞれ独立に、（ａ）水素、（ｂ）Ｃ１‐６アルキル、（ｃ）Ｃ６‐１０アリール、および（ｄ）Ｃ１‐６アルク‐Ｃ６‐１０アリール、で構成されている群から選択されるもの；（１６）‐ＳＯ２ＲＤ’であって、式中のＲＤ’は、（ａ）Ｃ１‐６アルキル、（ｂ）Ｃ６‐１０アリール、（ｃ）Ｃ１‐６アルク‐Ｃ６‐１０アリール、および（ｄ）ヒドロキシ、で構成されている群から選択されるもの；（１７）‐ＳＯ２ＮＲＥ’ＲＦ’であって、式中のＲＥ’およびＲＦ’はそれぞれ独立に、（ａ）水素、（ｂ）Ｃ１‐６アルキル、（ｃ）Ｃ６‐１０アリール、および（ｄ）Ｃ１‐６アルク‐Ｃ６‐１０アリール、で構成されている群から選択されるもの；（１８）‐Ｃ（Ｏ）ＲＧ’であって、式中のＲＧ’は、（ａ）Ｃ１‐２０アルキル（例えばＣ１‐６アルキル）、（ｂ）Ｃ２‐２０アルケニル（例えばＣ２‐６アルケニル）、（ｃ）Ｃ６‐１０アリール、（ｄ）水素、（ｅ）Ｃ１‐６アルク‐Ｃ６‐１０アリール、（ｆ）アミノ‐Ｃ１‐２０アルキル、（ｇ）‐（ＣＨ２）ｓ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＯＲ’のポリエチレングリコールであって、式中のｓ１は１〜１０（例えば１〜６または１〜４）の整数であり、ｓ２およびｓ３はそれぞれ独立に、０〜１０（例えば０〜４、０〜６、１〜４、１〜６、または１〜１０）の整数であり、Ｒ’はＨまたはＣ１‐２０アルキルであるもの、ならびに、（ｈ）‐ＮＲＮ１（ＣＨ２）ｓ２（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＮＲＮ１のアミノポリエチレングリコールであって、式中のｓ１は１〜１０（例えば１〜６または１〜４）の整数であり、ｓ２およびｓ３はそれぞれ独立に、０〜１０（例えば０〜４、０〜６、１〜４、１〜６、または１〜１０）の整数であり、かつＲＮ１はそれぞれ独立に水素または任意選択で置換されたＣ１‐６アルキルであるもの；（１９）‐ＮＲＨ’Ｃ（Ｏ）ＲＩ’であって、式中のＲＨ’は、（ａ１）水素および（ｂ１）Ｃ１‐６アルキルで構成されている群から選択され、ＲＩ’は、（ａ２）Ｃ１‐２０アルキル（例えばＣ１‐６アルキル）、（ｂ２）Ｃ２‐２０アルケニル（例えばＣ２‐６アルケニル）、（ｃ２）Ｃ６‐１０アリール、（ｄ２）水素、（ｅ２）Ｃ１‐６アルク‐Ｃ６‐１０アリール、（ｆ２）アミノ‐Ｃ１‐２０アルキル、（ｇ２）‐（ＣＨ２）ｓ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＯＲ’のポリエチレングリコールであって、式中のｓ１は１〜１０（例えば１〜６または１〜４）の整数であり、ｓ２およびｓ３はそれぞれ独立に、０〜１０（例えば０〜４、０〜６、１〜４、１〜６、または１〜１０）の整数であり、Ｒ’はＨまたはＣ１‐２０アルキルであるもの、ならびに、（ｈ２）‐ＮＲＮ１（ＣＨ２）ｓ２（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＮＲＮ１のアミノポリエチレングリコールであって、式中のｓ１は１〜１０（例えば１〜６または１〜４）の整数であり、ｓ２およびｓ３はそれぞれ独立に、０〜１０（例えば０〜４、０〜６、１〜４、１〜６、または１〜１０）の整数であり、かつＲＮ１はそれぞれ独立に水素または任意選択で置換されたＣ１‐６アルキルであるもの；（２０）‐ＮＲＪ’Ｃ（Ｏ）ＯＲＫ’であって、式中のＲＪ’は、（ａ１）水素および（ｂ１）Ｃ１‐６アルキルで構成されている群から選択され、ＲＫ’は、（ａ２）Ｃ１‐２０アルキル（例えばＣ１‐６アルキル）、（ｂ２）Ｃ２‐２０アルケニル（例えばＣ２‐６アルケニル）、（ｃ２）Ｃ６‐１０アリール、（ｄ２）水素、（ｅ２）Ｃ１‐６アルク‐Ｃ６‐１０アリール、（ｆ２）アミノ‐Ｃ１‐２０アルキル、
（ｇ２）‐（ＣＨ２）ｓ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＯＲ’のポリエチレングリコールであって、式中のｓ１は１〜１０（例えば１〜６または１〜４）の整数であり、ｓ２およびｓ３はそれぞれ独立に、０〜１０（例えば０〜４、０〜６、１〜４、１〜６、または１〜１０）の整数であり、Ｒ’はＨまたはＣ１‐２０アルキルであるもの、ならびに、（ｈ２）‐ＮＲＮ１（ＣＨ２）ｓ２（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＮＲＮ１のアミノポリエチレングリコールであって、式中のｓ１は１〜１０（例えば１〜６または１〜４）の整数であり、ｓ２およびｓ３はそれぞれ独立に、０〜１０（例えば０〜４、０〜６、１〜４、１〜６、または１〜１０）の整数であり、かつＲＮ１はそれぞれ独立に水素または任意選択で置換されたＣ１‐６アルキルであるもの；ならびに、（２１）アミジン；で構成されている群から独立に選択された置換基で置換されてもよい。いくつかの実施形態では、これらの基はそれぞれ、本明細書中に記載されるようにさらに置換されてもよい。
「アミノアルコキシ」という用語は、本明細書中で使用されるように、本明細書中に定義されるようなアミノ基によって置換された、本明細書中に定義されるようなアルコキシ基を表わす。該アルキルおよびアミノは各々、それぞれの基について本明細書中に記載されるような１、２、３、または４個の置換基（例えばＣＯ２ＲＡ’であって式中のＲＡ’は（ａ）Ｃ１‐６アルキル、（ｂ）Ｃ６‐１０アリール、（ｃ）水素、および（ｄ）Ｃ１‐６アルク‐Ｃ６‐１０アリール、例えばカルボキシ、で構成されている群から選択されるもの）でさらに置換されうる。
「アミノアルキル」という用語は、本明細書中で使用されるように、本明細書中に定義されるようなアミノ基によって置換された、本明細書中に定義されるようなアルキル基を表わす。該アルキルおよびアミノは各々、それぞれの基について本明細書中に記載されるような１、２、３、または４個の置換基（例えばＣＯ２ＲＡ’であって式中のＲＡ’は（ａ）Ｃ１‐６アルキル、（ｂ）Ｃ６‐１０アリール、（ｃ）水素、ならびに（ｄ）Ｃ１‐６アルク‐Ｃ６‐１０アリール、例えばカルボキシおよびＮ‐保護基のうち少なくともいずれか、で構成されている群から選択されるもの）でさらに置換されうる。
「アミノアルケニル」という用語は、本明細書中で使用されるように、本明細書中に定義されるようなアミノ基によって置換された、本明細書中に定義されるようなアルケニル基を表わす。該アルケニルおよびアミノは各々、それぞれの基について本明細書中に記載されるような１、２、３、または４個の置換基（例えばＣＯ２ＲＡ’であって式中のＲＡ’は（ａ）Ｃ１‐６アルキル、（ｂ）Ｃ６‐１０アリール、（ｃ）水素、ならびに（ｄ）Ｃ１‐６アルク‐Ｃ６‐１０アリール、例えばカルボキシおよびＮ‐保護基のうち少なくともいずれか、で構成されている群から選択されるもの）でさらに置換されうる。
「アミノアルキニル」という用語は、本明細書中で使用されるように、本明細書中に定義されるようなアミノ基によって置換された、本明細書中に定義されるようなアルキニル基を表わす。該アルキニルおよびアミノは各々、それぞれの基について本明細書中に記載されるような１、２、３、または４個の置換基（例えばＣＯ２ＲＡ’であって式中のＲＡ’は（ａ）Ｃ１‐６アルキル、（ｂ）Ｃ６‐１０アリール、（ｃ）水素、ならびに（ｄ）Ｃ１‐６アルク‐Ｃ６‐１０アリール、例えばカルボキシおよびＮ‐保護基のうち少なくともいずれか、で構成されている群から選択されるもの）でさらに置換されうる。
「アリール」という用語は、本明細書中で使用されるように、１個または２個の芳香環を有する単環式、二環式、または多環式の炭素環構造を表し、フェニル、ナフチル、１，２‐ジヒドロナフチル、１，２，３，４‐テトラヒドロナフチル、アントラセニル、フェナントレニル、フルオレニル、インダニル、インデニルなどにより例証され、かつ、任意選択で、１、２、３、４、または５個の置換基であって以下すなわち：（１）Ｃ１‐７アシル（例えばカルボキシアルデヒド）；（２）Ｃ１‐２０アルキル（例えば、Ｃ１‐６アルキル、Ｃ１‐６アルコキシ‐Ｃ１‐６アルキル、Ｃ１‐６アルキルスルフィニル‐Ｃ１‐６アルキル、アミノ‐Ｃ１‐６アルキル、アジド‐Ｃ１‐６アルキル、（カルボキシアルデヒド）‐Ｃ１‐６アルキル、ハロ‐Ｃ１‐６アルキル（例えばペルフルオロアルキル）、ヒドロキシ‐Ｃ１‐６アルキル、ニトロ‐Ｃ１‐６アルキル、またはＣ１‐６チオアルコキシ‐Ｃ１‐６アルキル）；（３）Ｃ１‐２０アルコキシ（例えば、ペルフルオロアルコキシのようなＣ１‐６アルコキシ）；（４）Ｃ１‐６アルキルスルフィニル；（５）Ｃ６‐１０アリール；（６）アミノ；（７）Ｃ１‐６アルク‐Ｃ６‐１０アリール；（８）アジド；（９）Ｃ３‐８シクロアルキル；（１０）Ｃ１‐６アルク‐Ｃ３‐８シクロアルキル；（１１）ハロ；（１２）Ｃ１‐１２ヘテロシクリル（例えばＣ１‐１２ヘテロアリール）；（１３）（Ｃ１‐１２ヘテロシクリル）オキシ；（１４）ヒドロキシ；（１５）ニトロ；（１６）Ｃ１‐２０チオアルコキシ（例えばＣ１‐６チオアルコキシ）；（１７）‐（ＣＨ２）ｑＣＯ２ＲＡ’であって、式中のｑはゼロ〜４の整数であり、ＲＡ’は、（ａ）Ｃ１‐６アルキル、（ｂ）Ｃ６‐１０アリール、（ｃ）水素、および（ｄ）Ｃ１‐６アルク‐Ｃ６‐１０アリール、で構成されている群から選択されるもの；（１８）‐（ＣＨ２）ｑＣＯＮＲＢ’ＲＣ’であって、式中のｑはゼロ〜４の整数であり、ＲＢ’およびＲＣ’は独立に、（ａ）水素、（ｂ）Ｃ１‐６アルキル、（ｃ）Ｃ６‐１０アリール、および（ｄ）Ｃ１‐６アルク‐Ｃ６‐１０アリール、で構成されている群から選択されるもの；（１９）‐（ＣＨ２）ｑＳＯ２ＲＤ’であって、式中のｑはゼロ〜４の整数であり、ＲＤ’は、（ａ）アルキル、（ｂ）Ｃ６‐１０アリール、および（ｃ）アルク‐Ｃ６‐１０アリール、で構成されている群から選択されるもの；（２０）‐（ＣＨ２）ｑＳＯ２ＮＲＥ’ＲＦ’であって、式中のｑはゼロ〜４の整数であり、ＲＥ’およびＲＦ’はそれぞれ独立に、（ａ）水素、（ｂ）Ｃ１‐６アルキル、（ｃ）Ｃ６‐１０アリール、および（ｄ）Ｃ１‐６アルク‐Ｃ６‐１０アリール、で構成されている群から選択されるもの；（２１）チオール；（２２）Ｃ６‐１０アリールオキシ；（２３）Ｃ３‐８シクロアルコキシ；（２４）Ｃ６‐１０アリール‐Ｃ１‐６アルコキシ；（２５）Ｃ１‐６アルク‐Ｃ１‐１２ヘテロシクリル（例えばＣ１‐６アルク‐Ｃ１‐１２ヘテロアリール）；（２６）Ｃ２‐２０アルケニル；ならびに（２７）Ｃ２‐２０アルキニル、で構成されている群から独立に選択された置換基で置換されてもよい。いくつかの実施形態では、これらの基はそれぞれ、本明細書中に記載されるようにさらに置換されてもよい。例えば、Ｃ１‐アルカリールまたはＣ１‐アルクヘテロシクリルのアルキレン基は、オキソ基でさらに置換されてそれぞれのアリーロイルおよび（ヘテロシクリル）オイル置換基を生じることができる。
「アリールアルコキシ」という用語は、本明細書中で使用されるように、酸素原子によって親分子群に取り付けられた、本明細書中に定義されるようなアルカリール基を表わす。典型的な非置換のアリールアルコキシ基は、７〜３０個の炭素（例えば、７〜１６または７〜２０個の炭素、例えばＣ６‐１０アリール‐Ｃ１‐６アルコキシ、Ｃ６‐１０アリール‐Ｃ１‐１０アルコキシ、またはＣ６‐１０アリール‐Ｃ１‐２０アルコキシ）を含んでいる。いくつかの実施形態では、該アリールアルコキシ基は、１、２、３、または４個の本明細書中に定義されるような置換基で置換されうる。
「アリールアルコキシカルボニル」という用語は、本明細書中で使用されるように、カルボニルによって親分子群に取り付けられた、本明細書中に定義されるようなアリールアルコキシ基を表わす（例えば‐Ｃ（Ｏ）‐Ｏ‐アルキル‐アリール）。典型的な非置換のアリールアルコキシ基は、８〜３１個の炭素（例えば、８〜１７または８〜２１個の炭素、例えばＣ６‐１０アリール‐Ｃ１‐６アルコキシ‐カルボニル、Ｃ６‐１０アリール‐Ｃ１‐１０アルコキシ‐カルボニル、またはＣ６‐１０アリール‐Ｃ１‐２０アルコキシ‐カルボニル）を含んでいる。いくつかの実施形態では、アリールアルコキシカルボニル基は、１、２、３、または４個の本明細書中に定義されるような置換基で置換されうる。
「アリールオキシ」という用語は、式‐ＯＲ’の化学置換基であって、式中のＲ’は別段の定めがない限り炭素数６〜１８個のアリール基である、置換基を表わす。いくつかの実施形態では、該アリール基は１、２、３、または４個の本明細書中に定義されるような置換基で置換されうる。
「アリーロイル（ａｒｙｌｏｙｌ）」という用語は、本明細書中で使用されるように、カルボニル基によって親分子群に取り付けられた、本明細書中に定義されるようなアリール基を表わす。典型的な非置換のアリーロイル基は炭素７〜１１個のものである。いくつかの実施形態では、該アリール基は１、２、３、または４個の本明細書中に定義されるような置換基で置換されうる。
「アジド」という用語は、‐Ｎ＝Ｎ＝Ｎとして表わすこともできる‐Ｎ３基を表わす。
「二環式」という用語は、本明細書中で使用されるように、２つの環を有する構造を指し、該環は芳香族であっても芳香族でなくてもよい。二環式構造は、本明細書中に定義されるようなスピロシクリル基と、１つ以上の架橋部を共有する２つの環とを備え、そのような架橋部は、１個の原子、または２、３個もしくはそれ以上の原子を含む鎖を含みうる。典型的な二環式基には、本明細書中に定義されるような、第１および第２の環がカルボシクリル基である二環式カルボシクリル基；本明細書中に定義されるような、第１および第２の環がアリール基である二環式アリール基；第１の環はヘテロシクリル基であり、第２の環はカルボシクリル（例えばアリール）またはヘテロシクリル（例えばヘテロアリール）基である二環式ヘテロシクリル基；ならびに、第１の環はヘテロアリール基であり、第２の環はカルボシクリル（例えばアリール）またはヘテロシクリル（例えばヘテロアリール）基である二環式ヘテロアリール基、が挙げられる。いくつかの実施形態では、二環式基は、シクロアルキル、ヘテロシクリル、およびアリール基について本明細書中に定義されるような１、２、３、または４個の置換基で置換されうる。
「ボラニル」という用語は、本明細書中で使用されるように、‐Ｂ（ＲＢ１）３であって、ＲＢ１はそれぞれ独立に、Ｈおよび任意選択で置換されたアルキルで構成されている群から選択されるもの、を表わす。いくつかの実施形態では、該ボラニル基は、１、２、３、または４個の、アルキル基について本明細書中に定義されるような置換基で置換されうる。
「炭素環式（の）」および「カルボシクリル」という用語は、本明細書中で使用されるように、任意選択で置換されたＣ３‐１２の単環式、二環式、または三環式の構造物であって、環は芳香族であっても芳香族でなくてもよいが炭素原子によって形成されるものを指す。炭素環式の構造物には、シクロアルキル基、シクロアルケニル基、およびアリール基が含まれる。
「カルバモイル」という用語は、本明細書中で使用されるように、‐Ｃ（Ｏ）‐Ｎ（ＲＮ１）２であって、各ＲＮ１の意味は本明細書中に提供される「アミノ」の定義において見られる。
「カルバモイルアルキル」という用語は、本明細書中で使用されるように、本明細書中に定義されるようなカルバモイル基によって置換された、本明細書中に定義されるようなアルキル基を表わす。該アルキル基は、１、２、３、または４個の本明細書中に記載されるような置換基でさらに置換されうる。
「カルバミル」という用語は、本明細書中で使用されるように、構造‐ＮＲＮ１Ｃ（＝Ｏ）ＯＲまたは‐ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（ＲＮ１）２を有するカルバメート基を指し、各ＲＮ１の意味は、本明細書中に提供された「アミノ」の定義において見られ、かつＲは、本明細書中に定義されるようなアルキル、シクロアルキル、アルクシクロアルキル、アリール、アルカリール、ヘテロシクリル（例えばヘテロアリール）、またはアルクヘテロシクリル（例えばアルクヘテロアリール）である。
「カルボニル」という用語は、本明細書中で使用されるように、Ｃ＝Ｏとして表わすこともできるＣ（Ｏ）基を表わす。
「カルボキシアルデヒド」という用語は、構造‐ＣＨＯを有するアシル基を表わす。
「カルボキシ」という用語は、本明細書中で使用されるように、‐ＣＯ２Ｈを意味する。
「カルボキシアルコキシ」という用語は、本明細書中で使用されるように、本明細書中に定義されるようなカルボキシ基によって置換された、本明細書中に定義されるようなアルコキシ基を表わす。該アルコキシ基は、１、２、３、または４個の、アルキル基について本明細書中に記載されるような置換基でさらに置換可能であり、かつカルボキシ基は、任意選択で、１つ以上のＯ‐保護基で置換されうる。
「カルボキシアルキル」という用語は、本明細書中で使用されるように、本明細書中に定義されるようなカルボキシ基によって置換された、本明細書中に定義されるようなアルキル基を表わす。該アルキル基は、１、２、３、または４個の本明細書中に記載されるような置換基でさらに置換可能であり、かつカルボキシ基は、任意選択で、１つ以上のＯ‐保護基で置換されうる。
「カルボキシアミノアルキル」という用語は、本明細書中で使用されるように、本明細書中に定義されるようなカルボキシによって置換された、本明細書中に定義されるようなアミノアルキル基を表わす。該カルボキシ、アルキル、およびアミノは各々、それぞれの基について本明細書中に記載されるような１、２、３、または４個の置換基（例えばＣＯ２ＲＡ’であって式中のＲＡ’は（ａ）Ｃ１‐６アルキル、（ｂ）Ｃ６‐１０アリール、（ｃ）水素、ならびに（ｄ）Ｃ１‐６アルク‐Ｃ６‐１０アリール、例えばカルボキシ、Ｎ‐保護基、およびＯ‐保護基のうち少なくともいずれか、で構成されている群から選択されるもの）でさらに置換されうる。
「シアノ」という用語は、本明細書中で使用されるように、‐ＣＮ基を表わす。
「シクロアルコキシ」という用語は、式‐ＯＲの化学置換基であって、式中のＲは、別段の定めがない限り本明細書中に定義されるようなＣ３‐８シクロアルキル基である、置換基を表わす。該シクロアルキル基は、１、２、３、または４個の本明細書中に記載されるような置換基でさらに置換されうる。典型的な非置換のシクロアルコキシ基は炭素数３〜８個である。いくつかの実施形態では、該シクロアルキル基は、１、２、３、または４個の本明細書中に記載されるような置換基でさらに置換されうる。
「シクロアルキル」という用語は、本明細書中で使用されるように、別段の定めがない限り炭素数３〜８個の一価の飽和または不飽和の非芳香族環式炭化水素基を表わし、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、ビシクルヘプチル（ｂｉｃｙｃｌｅ ｈｅｐｔｙｌ）などにより例証される。シクロアルキル基が１つの炭素‐炭素二重結合を含んでいる場合、該シクロアルキル基は「シクロアルケニル」基と呼ぶことができる。典型的なシクロアルケニル基には、シクロペンテニル、シクロヘキセニルなどが含まれる。本発明のシクロアルキル基は、任意選択で、（１）Ｃ１‐７アシル（例えばカルボキシアルデヒド）；（２）Ｃ１‐２０アルキル（例えば、Ｃ１‐６アルキル、Ｃ１‐６アルコキシ‐Ｃ１‐６アルキル、Ｃ１‐６アルキルスルフィニル‐Ｃ１‐６アルキル、アミノ‐Ｃ１‐６アルキル、アジド‐Ｃ１‐６アルキル、（カルボキシアルデヒド）‐Ｃ１‐６アルキル、ハロ‐Ｃ１‐６アルキル（例えばペルフルオロアルキル）、ヒドロキシ‐Ｃ１‐６アルキル、ニトロ‐Ｃ１‐６アルキル、またはＣ１‐６チオアルコキシ‐Ｃ１‐６アルキル）；（３）Ｃ１‐２０アルコキシ（例えば、ペルフルオロアルコキシのようなＣ１‐６アルコキシ）；（４）Ｃ１‐６アルキルスルフィニル；（５）Ｃ６‐１０アリール；（６）アミノ；（７）Ｃ１‐６アルク‐Ｃ６‐１０アリール；（８）アジド；（９）Ｃ３‐８シクロアルキル；（１０）Ｃ１‐６アルク‐Ｃ３‐８シクロアルキル；（１１）ハロ；（１２）Ｃ１‐１２ヘテロシクリル（例えばＣ１‐１２ヘテロアリール）；（１３）（Ｃ１‐１２ヘテロシクリル）オキシ；（１４）ヒドロキシ；（１５）ニトロ；（１６）Ｃ１‐２０チオアルコキシ（例えばＣ１‐６チオアルコキシ）；（１７）‐（ＣＨ２）ｑＣＯ２ＲＡ’であって、式中のｑはゼロ〜４の整数であり、ＲＡ’は、（ａ）Ｃ１‐６アルキル、（ｂ）Ｃ６‐１０アリール、（ｃ）水素、および（ｄ）Ｃ１‐６アルク‐Ｃ６‐１０アリール、で構成されている群から選択されるもの；（１８）‐（ＣＨ２）ｑＣＯＮＲＢ’ＲＣ’であって、式中のｑはゼロ〜４の整数であり、ＲＢ’およびＲＣ’は独立に、（ａ）水素、（ｂ）Ｃ６‐１０アルキル、（ｃ）Ｃ６‐１０アリール、および（ｄ）Ｃ１‐６アルク‐Ｃ６‐１０アリール、で構成されている群から選択されるもの；（１９）‐（ＣＨ２）ｑＳＯ２ＲＤ’であって、式中のｑはゼロ〜４の整数であり、ＲＤ’は、（ａ）Ｃ６‐１０アルキル、（ｂ）Ｃ６‐１０アリール、および（ｃ）Ｃ１‐６アルク‐Ｃ６‐１０アリール、で構成されている群から選択されるもの；（２０）‐（ＣＨ２）ｑＳＯ２ＮＲＥ’ＲＦ’であって、式中のｑはゼロ〜４の整数であり、ＲＥ’およびＲＦ’はそれぞれ独立に、（ａ）水素、（ｂ）Ｃ６‐１０アルキル、（ｃ）Ｃ６‐１０アリール、および（ｄ）Ｃ１‐６アルク‐Ｃ６‐１０アリール、で構成されている群から選択されるもの；（２１）チオール；（２２）Ｃ６‐１０アリールオキシ；（２３）Ｃ３‐８シクロアルコキシ；（２４）Ｃ６‐１０アリール‐Ｃ１‐６アルコキシ；（２５）Ｃ１‐６アルク‐Ｃ１‐１２ヘテロシクリル（例えばＣ１‐６アルク‐Ｃ１‐１２ヘテロアリール）；（２６）オキソ；（２７）Ｃ２‐２０アルケニル；ならびに（２８）Ｃ２‐２０アルキニル、を用いて置換されうる。いくつかの実施形態では、これらの基はそれぞれ、本明細書中に記載されるようにさらに置換されてもよい。例えば、Ｃ１‐アルカリールまたはＣ１‐アルクヘテロシクリルのアルキレン基は、オキソ基でさらに置換されてそれぞれのアリーロイルおよび（ヘテロシクリル）オイル置換基を生じることができる。
「ジアステレオマー」という用語は、本明細書中で使用されるように、互いの鏡像ではなく、かつ互いに重ね合わせることのできない立体異性体を意味する。
作用薬の「有効な量」という用語は、本明細書中で使用されるように、有益な結果または所望の結果、例えば臨床結果を達成するのに十分な量であり、それゆえ「有効な量」とは、該用語が適用されている状況に応じて変化する。例えば、がんを治療する作用薬を投与する状況においては、有効な量の作用薬は、例えば、該作用薬の投与を伴わずに得られた応答と比較して、がんの、本明細書中に定義されるような治療を達成するのに十分な量である。
「エナンチオマー」という用語は、本明細書中で使用されるように、光学純度すなわちエナンチオマー過剰率（当分野において標準的な方法によって決定されたもの）が少なくとも８０％（すなわち、あるエナンチオマーが少なくとも９０％であり別のエナンチオマーが多くとも１０％）、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９８％である、本発明の化合物の個々の光学活性形態それぞれを意味する。
「ハロ」という用語は、本明細書中で使用されるように、臭素、塩素、ヨウ素、またはフッ素から選択されたハロゲンを表わす。
「ハロアルコキシ」という用語は、本明細書中で使用されるように、ハロゲン基（すなわちＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、またはＩ）によって置換された、本明細書中に定義されるようなアルコキシ基を表わす。ハロアルコキシは、１、２、３個、または炭素数２以上のアルキル基の場合には４個のハロゲンで、置換されうる。ハロアルコキシ基には、ペルフルオロアルコキシ（例えば‐ＯＣＦ３）、‐ＯＣＨＦ２、‐ＯＣＨ２Ｆ、‐ＯＣＣｌ３、‐ＯＣＨ２ＣＨ２Ｂｒ、‐ＯＣＨ２ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ２Ｂｒ）ＣＨ３、および‐ＯＣＨＩＣＨ３が含まれる。いくつかの実施形態では、該ハロアルコキシ基は、１、２、３、または４個の、アルキル基について本明細書中に記載されるような置換基でさらに置換されうる。
「ハロアルキル」という用語は、本明細書中で使用されるように、ハロゲン基（すなわちＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、またはＩ）によって置換された、本明細書中に定義されるようなアルキル基を表わす。ハロアルキルは、１、２、３個、または炭素数２以上のアルキル基の場合には４個のハロゲンで、置換されうる。ハロアルキル基には、ペルフルオロアルキル（例えば‐ＣＦ３）、‐ＣＨＦ２、‐ＣＨ２Ｆ、‐ＣＣｌ３、‐ＣＨ２ＣＨ２Ｂｒ、‐ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ２Ｂｒ）ＣＨ３、および‐ＣＨＩＣＨ３が含まれる。いくつかの実施形態では、該ハロアルキル基は、１、２、３、または４個の、アルキル基について本明細書中に記載されるような置換基でさらに置換されうる。
「ヘテロアルキレン」という用語は、本明細書中で使用されるように、構成要素である炭素原子のうち１つまたは２つがそれぞれ窒素、酸素、または硫黄に置き換えられている、本明細書中に定義されるようなアルキレン基を指す。いくつかの実施形態では、該ヘテロアルキレン基は、１、２、３、または４個の、アルキレン基について本明細書中に記載されるような置換基でさらに置換されうる。
「ヘテロアリール」という用語は、本明細書中で使用されるように、本明細書中に定義されるようなヘテロシクリルの部分集合であって、芳香族である、すなわち単環式または多環式の環構造内に４ｎ＋２π電子を含んでいるものを表わす。典型的な非置換のヘテロアリール基は、炭素数１〜１２（例えば１〜１１、１〜１０、１〜９、２〜１２、２〜１１、２〜１０、または２〜９）である。いくつかの実施形態では、ヘテロアリールは、１、２、３、または４個の、ヘテロシクリル基について定義されるような置換基で置換される。
「ヘテロシクリル」という用語は、本明細書中で使用されるように、別段の定めがない限り、窒素、酸素、および硫黄で構成されている群から独立に選択された１、２、３、または４個のヘテロ原子を含んでいる、５員環、６員環または７員環を表わす。５員環はゼロ〜２個の二重結合を有し、６員環および７員環はゼロ〜３個の二重結合を有している。典型的な非置換のヘテロシクリル基は、炭素数１〜１２（例えば１〜１１、１〜１０、１〜９、２〜１２、２〜１１、２〜１０、または２〜９）である。「ヘテロシクリル」という用語はさらに、架橋型の多環式構造であって、１つ以上の炭素およびヘテロ原子のうち少なくともいずれかが、１つの環の２つの隣接していない構成要員を架橋している構造（例えばキヌクリジニル基）を有する複素環式化合物も表わす。「ヘテロシクリル」という用語は、二環式、三環式および四環式の基であって、上記の複素環のうち任意のものが、１、２、または３個の炭素環、例えば、アリール環、シクロヘキサン環、シクロヘキセン環、シクロペンタン環、シクロペンテン環、または別の単環式複素環であって例えばインドリル、キノリル、イソキノリル、テトラヒドロキノリル、ベンゾフリル、ベンゾチエニルなどに縮合せしめられているもの、を含んでいる。縮合ヘテロシクリルの例には、トロパン類および１，２，３，５，８，８ａ‐ヘキサヒドロインドリジンが挙げられる。複素環には、ピロリル、ピロリニル、ピロリジニル、ピラゾリル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、イミダゾリル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、ピリジル、ピペリジニル、ホモピペリジニル、ピラジニル、ピペラジニル、ピリミジニル、ピリダジニル、オキサゾリル、オキサゾリジニル、イソオキサゾリル、イソオキサゾリジニル、モルホリニル、チオモルホリニル、チアゾリル、チアゾリジニル、イソチアゾリル、イソチアゾリジニル、インドリル、インダゾリル、キノリル、イソキノリル、キノキサリニル、ジヒドロキノキサリニル、キナゾリニル、シンノリニル、フタラジニル、ベンズイミダゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾチアジアゾリル、フリル、チエニル、チアゾリジニル、イソチアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、オキサジアゾリル（例えば１，２，３‐オキサジアゾリル）、プリニル、チアジアゾリル（例えば１，２，３‐チアジアゾリル）、テトラヒドロフラニル、ジヒドロフラニル、テトラヒドロチエニル、ジヒドロチエニル、ジヒドロインドリル、ジヒドロキノリル、テトラヒドロキノリル、テトラヒドロイソキノリル、ジヒドロイソキノリル、ピラニル、ジヒドロピラニル、ジチアゾリル、ベンゾフラニル、イソベンゾフラニル、ベンゾチエニルなどが含まれ、これらのジヒドロ形態およびテトラヒドロ形態であって１つ以上の二重結合が低減されて水素に置き換えられているものを含んでいる。さらに別の典型的なヘテロシクリルには：２，３，４，５‐テトラヒドロ‐２‐オキソ‐オキサゾリル；２，３‐ジヒドロ‐２‐オキソ‐１Ｈ‐イミダゾリル；２，３，４，５‐テトラヒドロ‐５‐オキソ‐１Ｈ‐ピラゾリル（例えば２，３，４，５‐テトラヒドロ‐２‐フェニル‐５‐オキソ‐１Ｈ‐ピラゾリル）；２，３，４，５‐テトラヒドロ‐２，４‐ジオキソ‐１Ｈ‐イミダゾリル（例えば２，３，４，５‐テトラヒドロ‐２，４‐ジオキソ‐５‐メチル‐５‐フェニル‐１Ｈ‐イミダゾリル）；２，３‐ジヒドロ‐２‐チオキソ‐１，３，４‐オキサジアゾリル（例えば２，３‐ジヒドロ‐２‐チオキソ‐５‐フェニル‐１，３，４‐オキサジアゾリル）；４，５‐ジヒドロ‐５‐オキソ‐１Ｈ‐トリアゾリル（例えば４，５‐ジヒドロ‐３‐メチル‐４‐アミノ５‐オキソ‐１Ｈ‐トリアゾリル）；１，２，３，４‐テトラヒドロ‐２，４‐ジオキソピリジニル（例えば１，２，３，４‐テトラヒドロ‐２，４‐ジオキソ‐３，３‐ジエチルピリジニル）；２，６‐ジオキソ‐ピペリジニル（例えば２，６‐ジオキソ‐３‐エチル‐３‐フェニルピペリジニル）；１，６‐ジヒドロ‐６‐オキソピリジミニル（ｏｘｏｐｙｒｉｄｉｍｉｎｙｌ）；１，６‐ジヒドロ‐４‐オキソピリミジニル（例えば２‐（メチルチオ）‐１，６‐ジヒドロ‐４‐オキソ‐５‐メチルピリミジン‐１‐イル）；１，２，３，４‐テトラヒドロ‐２，４‐ジオキソピリミジニル（例えば１，２，３，４‐テトラヒドロ‐２，４‐ジオキソ‐３‐エチルピリミジニル）；１，６‐ジヒドロ‐６‐オキソ‐ピリダジニル（例えば１，６‐ジヒドロ‐６‐オキソ‐３‐エチルピリダジニル）；１，６‐ジヒドロ‐６‐オキソ‐１，２，４‐トリアジニル（例えば１，６‐ジヒドロ‐５‐イソプロピル‐６‐オキソ‐１，２，４‐トリアジニル；２，３‐ジヒドロ‐２‐オキソ‐１Ｈ‐インドリル（例えば３，３‐ジメチル‐２，３‐ジヒドロ‐２‐オキソ‐１Ｈ‐インドリルおよび２，３‐ジヒドロ‐２‐オキソ‐３，３’‐スピロプロパン‐１Ｈ‐インドール‐１‐イル）；１，３‐ジヒドロ‐１‐オキソ‐２Ｈ‐イソ‐インドリル；１，３‐ジヒドロ‐１，３‐ジオキソ‐２Ｈ‐イソ‐インドリル；１Ｈ‐ベンゾピラゾリル（例えば１‐（エトキシカルボニル）‐１Ｈ‐ベンゾピラゾリル）；２，３‐ジヒドロ‐２‐オキソ‐１Ｈ‐ベンズイミダゾリル（例えば３‐エチル‐２，３‐ジヒドロ‐２‐オキソ‐１Ｈ‐ベンズイミダゾリル）；２，３‐ジヒドロ‐２‐オキソ‐ベンゾオキサゾリル（例えば５‐クロロ‐２，３‐ジヒドロ‐２‐オキソ‐ベンゾオキサゾリル）；２，３‐ジヒドロ‐２‐オキソ‐ベンゾオキサゾリル；２‐オキソ‐２Ｈ‐ベンゾピラニル；１，４‐ベンゾジオキサニル；１，３‐ベンゾジオキサニル；２，３‐ジヒドロ‐３‐オキソ，４Ｈ‐１，３‐ベンゾチアジニル；３，４‐ジヒドロ‐４‐オキソ‐３Ｈ‐キナゾリニル（例えば２‐メチル‐３，４‐ジヒドロ‐４‐オキソ‐３Ｈ‐キナゾリニル）；１，２，３，４‐テトラヒドロ‐２，４‐ジオキソ‐３Ｈ‐キナゾリル（例えば１‐エチル‐１，２，３，４‐テトラヒドロ‐２，４‐ジオキソ‐３Ｈ‐キナゾリル）；１，２，３，６‐テトラヒドロ‐２，６‐ジオキソ‐７Ｈ‐プリニル（例えば１，２，３，６‐テトラヒドロ‐１，３‐ジメチル‐２，６‐ジオキソ‐７Ｈ‐プリニル）；１，２，３，６‐テトラヒドロ‐２，６‐ジオキソ‐１Ｈ‐プリニル（例えば１，２，３，６‐テトラヒドロ‐３，７‐ジメチル‐２，６‐ジオキソ‐１Ｈ‐プリニル）；２‐オキソベンズ［ｃ，ｄ］インドリル；１，１‐ジオキソ‐２Ｈ‐ナフト［１，８‐ｃ，ｄ］イソチアゾリル；ならびに１，８‐ナフチレンジカルボキサミド、が挙げられる。さらなる複素環には、３，３ａ，４，５，６，６ａ‐ヘキサヒドロ‐ピロロ［３，４‐ｂ］ピロール‐（２Ｈ）‐イル、および２，５‐ジアザビシクロ［２．２．１］ヘプタノ‐２‐イル、ホモピペラジニル（またはジアゼパニル）、テトラヒドロピラニル、ジチアゾリル、ベンゾフラニル、ベンゾチエニル、オキセパニル、チエパニル、アゾカニル、オキセカニル、およびチオカニルが含まれる。複素環基にはさらに、式

の基であって、上記式中、
Ｅ’は‐Ｎ‐および‐ＣＨ‐で構成されている群から選択され；Ｆ’は、‐Ｎ＝ＣＨ‐、‐ＮＨ‐ＣＨ２‐、‐ＮＨ‐Ｃ（Ｏ）‐、‐ＮＨ‐、‐ＣＨ＝Ｎ‐、‐ＣＨ２‐ＮＨ‐、‐Ｃ（Ｏ）‐ＮＨ‐、‐ＣＨ＝ＣＨ‐、‐ＣＨ２‐、‐ＣＨ２ＣＨ２‐、‐ＣＨ２Ｏ‐、‐ＯＣＨ２‐、‐Ｏ‐、および‐Ｓ‐で構成されている群から選択され；Ｇ’は‐ＣＨ‐および‐Ｎ‐で構成されている群から選択される基も含まれる。本明細書中で言及されるヘテロシクリル基はいずれも、任意選択で、１、２、３、４個または５個の、以下すなわち：（１）Ｃ１‐７アシル（例えばカルボキシアルデヒド）；（２）Ｃ１‐２０アルキル（例えば、Ｃ１‐６アルキル、Ｃ１‐６アルコキシ‐Ｃ１‐６アルキル、Ｃ１‐６アルキルスルフィニル‐Ｃ１‐６アルキル、アミノ‐Ｃ１‐６アルキル、アジド‐Ｃ１‐６アルキル、（カルボキシアルデヒド）‐Ｃ１‐６アルキル、ハロ‐Ｃ１‐６アルキル（例えばペルフルオロアルキル）、ヒドロキシ‐Ｃ１‐６アルキル、ニトロ‐Ｃ１‐６アルキル、またはＣ１‐６チオアルコキシ‐Ｃ１‐６アルキル）；（３）Ｃ１‐２０アルコキシ（例えば、ペルフルオロアルコキシのようなＣ１‐６アルコキシ）；（４）Ｃ１‐６アルキルスルフィニル；（５）Ｃ６‐１０アリール；（６）アミノ；（７）Ｃ１‐６アルク‐Ｃ６‐１０アリール；（８）アジド；（９）Ｃ３‐８シクロアルキル；（１０）Ｃ１‐６アルク‐Ｃ３‐８シクロアルキル；（１１）ハロ；（１２）Ｃ１‐１２ヘテロシクリル（例えばＣ２‐１２ヘテロアリール）；（１３）（Ｃ１‐１２ヘテロシクリル）オキシ；（１４）ヒドロキシ；（１５）ニトロ；（１６）Ｃ１‐２０チオアルコキシ（例えばＣ１‐６チオアルコキシ）；（１７）‐（ＣＨ２）ｑＣＯ２ＲＡ’であって、式中のｑはゼロ〜４の整数であり、ＲＡ’は、（ａ）Ｃ１‐６アルキル、（ｂ）Ｃ６‐１０アリール、（ｃ）水素、および（ｄ）Ｃ１‐６アルク‐Ｃ６‐１０アリール、で構成されている群から選択されるもの；（１８）‐（ＣＨ２）ｑＣＯＮＲＢ’ＲＣ’であって、式中のｑはゼロ〜４の整数であり、ＲＢ’およびＲＣ’は独立に、（ａ）水素、（ｂ）Ｃ１‐６アルキル、（ｃ）Ｃ６‐１０アリール、および（ｄ）Ｃ１‐６アルク‐Ｃ６‐１０アリール、で構成されている群から選択されるもの；（１９）‐（ＣＨ２）ｑＳＯ２ＲＤ’であって、式中のｑはゼロ〜４の整数であり、ＲＤ’は、（ａ）Ｃ１‐６アルキル、（ｂ）Ｃ６‐１０アリール、および（ｃ）Ｃ１‐６アルク‐Ｃ６‐１０アリール、で構成されている群から選択されるもの；（２０）‐（ＣＨ２）ｑＳＯ２ＮＲＥ’ＲＦ’であって、式中のｑはゼロ〜４の整数であり、ＲＥ’およびＲＦ’はそれぞれ独立に、（ａ）水素、（ｂ）Ｃ１‐６アルキル、（ｃ）Ｃ６‐１０アリール、および（ｄ）Ｃ１‐６アルク‐Ｃ６‐１０アリール、で構成されている群から選択されるもの；（２１）チオール；（２２）Ｃ６‐１０アリールオキシ；（２３）Ｃ３‐８シクロアルコキシ；（２４）アリールアルコキシ；（２５）Ｃ１‐６アルク‐Ｃ１‐１２ヘテロシクリル（例えばＣ１‐６アルク‐Ｃ１‐１２ヘテロアリール）；（２６）オキソ；（２７）（Ｃ１‐１２ヘテロシクリル）イミノ；（２８）Ｃ２‐２０アルケニル；ならびに（２９）Ｃ２‐２０アルキニル、で構成されている群から独立に選択された置換基で置換されうる。いくつかの実施形態では、これらの基はそれぞれ、本明細書中に記載されるようにさらに置換されてもよい。例えば、Ｃ１‐アルカリールまたはＣ１‐アルクヘテロシクリルのアルキレン基は、オキソ基でさらに置換されてそれぞれのアリーロイルおよび（ヘテロシクリル）オイル置換基を生じることができる。
「（ヘテロシクリル）イミノ」という用語は、本明細書中で使用されるように、イミノ基によって親分子群に取り付けられた、本明細書中に定義されるようなヘテロシクリル基を表わす。いくつかの実施形態では、該ヘテロシクリル基は、１、２、３、または４個の本明細書中に定義されるような置換基でさらに置換されうる。
「（ヘテロシクリル）オキシ」という用語は、本明細書中で使用されるように、酸素原子によって親分子群に取り付けられた、本明細書中に定義されるようなヘテロシクリル基を表わす。いくつかの実施形態では、該ヘテロシクリル基は、１、２、３、または４個の本明細書中に定義されるような置換基でさらに置換されうる。
「（ヘテロシクリル）オイル」という用語は、本明細書中で使用されるように、カルボニル基によって親分子群に取り付けられた、本明細書中に定義されるようなヘテロシクリル基を表わす。いくつかの実施形態では、該ヘテロシクリル基は、１、２、３、または４個の本明細書中に定義されるような置換基でさらに置換されうる。
「炭化水素」という用語は、本明細書中で使用されるように、炭素および水素原子のみで構成されている基を表わす。
「ヒドロキシ」という用語は、本明細書中で使用されるように、‐ＯＨ基を表わす。いくつかの実施形態では、ヒドロキシ基（水酸基）は、１、２、３、または４個の、アルキルについて本明細書中に定義されるような置換基（例えばＯ‐保護基）で置換されうる。
「ヒドロキシアルケニル」という用語は、本明細書中で使用されるように、１〜３個の水酸基によって置換された、本明細書中に定義されるようなアルケニル基であって、アルキル基の１個の炭素原子に水酸基は１個しか取り付けられないことを条件とするものを表わし、ジヒドロキシプロペニル、ヒドロキシイソペンテニルなどにより例証される。いくつかの実施形態では、該ヒドロキシアルケニル基は、１、２、３、または４個の、アルキルについて本明細書中に定義されるような置換基（例えばＯ‐保護基）で置換されうる。
「ヒドロキシアルキル」という用語は、本明細書中で使用されるように、１〜３個の水酸基によって置換された、本明細書中に定義されるようなアルキル基であって、アルキル基の１個の炭素原子に水酸基は１個しか取り付けられないことを条件とするものを表わし、ヒドロキシメチル、ジヒドロキシプロピルなどにより例証される。いくつかの実施形態では、該ヒドロキシアルキル基は、１、２、３、または４個の、アルキルについて本明細書中に定義されるような置換基（例えばＯ‐保護基）で置換されうる。
「ヒドロキシアルキニル」という用語は、本明細書中で使用されるように、１〜３個の水酸基によって置換された、本明細書中に定義されるようなアルキニル基であって、アルキル基の１個の炭素原子に水酸基は１個しか取り付けられないことを条件とするものを表わす。いくつかの実施形態では、該ヒドロキシアルキニル基は、１、２、３、または４個の、アルキルについて本明細書中に定義されるような置換基（例えばＯ‐保護基）で置換されうる。
「異性体」という用語は、本明細書中で使用されるように、本発明の任意の化合物の任意の互変異性体、立体異性体、エナンチオマー、またはジアステレオマーを意味する。本発明の化合物は、１つ以上のキラル中心および二重結合のうち少なくともいずれかを有することが可能であり、したがって、立体異性体、例えば二重結合異性体（すなわち幾何学的なＥ／Ｚ異性体）またはジアステレオマー（例えばエナンチオマー（すなわち（＋）もしくは（−））またはシス／トランス異性体）として存在しうることが認識されている。本発明によれば、本明細書中に示された化学構造およびしたがって本発明の化合物は、対応する立体異性体の全て、すなわち立体異性体に関して（ｓｔｅｒｅｏｍｅｒｉｃａｌｌｙ）純粋な形態（例えば、幾何学的に純粋、エナンチオマーに関して（ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｉｃａｌｌｙ）純粋、またはジアステレオマーに関して（ｄｉａｓｔｅｒｅｏｍｅｒｉｃａｌｌｙ）純粋）ならびにエナンチオマーおよび立体異性体の混合物（例えばラセミ化合物）をいずれも包含する。本発明の化合物のエナンチオマーおよび立体異性体の混合物は、典型的には、良く知られた方法、例えばキラルガスクロマトグラフィ、キラル高速液体クロマトグラフィ、キラル塩錯体としての化合物の結晶化、またはキラル溶媒中における化合物の結晶化によって、該混合物の構成要素のエナンチオマーまたは立体異性体へと分割されうる。エナンチオマーおよび立体異性体は、良く知られた不斉合成法によって、立体異性体に関して純粋またはエナンチオマーに関してに純粋な中間体、試薬、および触媒から得ることもできる。
「Ｎ‐保護アミノ」という用語は、本明細書中で使用されるように、本明細書中に定義されるような１個または２個のＮ‐保護基が取り付けられた、本明細書中に定義されるようなアミノ基を指す。
「Ｎ‐保護基」という用語は、本明細書中で使用されるように、合成手順の際に望ましからぬ反応からアミノ基を保護するように意図された基を表わす。一般に用いられるＮ‐保護基は、グリーン（Ｇｒｅｅｎｅ）、「有機合成における保護基（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」、第３版、米国ニューヨーク、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ）、１９９９年に開示されており、前記文献は参照により本願に組込まれる。Ｎ‐保護基には、アシル、アリールオイル、またはカルバミル基であって例えばホルミル、アセチル、プロピオニル、ピバロイル、ｔ‐ブチルアセチル、２‐クロロアセチル、２‐ブロモアセチル、トリフルオロアセチル、トリクロロアセチル、フタリル、ｏ‐ニトロフェノキシアセチル、α‐クロロブチリル、ベンゾイル、４‐クロロベンゾイル、４‐ブロモベンゾイル、４‐ニトロベンゾイル、およびキラル補助基、例えば保護または非保護のＤ、ＬまたはＤ，Ｌアミノ酸であって例えばアラニン、ロイシン、フェニルアラニンなど；スルホニル含有基、例えばベンゼンスルホニル、ｐ‐トルエンスルホニルなど；カルバマートを形成する基、例えばベンジルオキシカルボニル、ｐ‐クロロベンジルオキシカルボニル、ｐ‐メトキシベンジルオキシカルボニル、ｐ‐ニトロベンジルオキシカルボニル、２‐ニトロベンジルオキシカルボニル、ｐ‐ブロモベンジルオキシカルボニル、３，４‐ジメトキシベンジルオキシカルボニル、３，５‐ジメトキシベンジルオキシカルボニル、２，４‐ジメトキシベンジルオキシカルボニル、４‐メトキシベンジルオキシカルボニル、２‐ニトロ‐４，５‐ジメトキシベンジルオキシカルボニル、３，４，５‐トリメトキシベンジルオキシカルボニル、１‐（ｐ‐ビフェニリル）‐１‐メチルエトキシカルボニル、α，α‐ジメチル‐３，５‐ジメトキシベンジルオキシカルボニル、ベンズヒドリルオキシカルボニル、ｔ‐ブチルオキシカルボニル、ジイソプロピルメトキシカルボニル、イソプロピルオキシカルボニル、エトキシカルボニル、メトキシカルボニル、アリルオキシカルボニル、２，２，２，‐トリクロロエトキシカルボニル、フェノキシカルボニル、４‐ニトロフェノキシカルボニル、フルオレニル‐９‐メトキシカルボニル、シクロペンチルオキシカルボニル、アダマンチルオキシカルボニル、シクロヘキシルオキシカルボニル、フェニルチオカルボニルなど、アルカリール基、例えばベンジル、トリフェニルメチル、ベンジルオキシメチルなど、ならびにシリル基、例えばトリメチルシリルなど、が挙げられる。好ましいＮ‐保護基は、ホルミル、アセチル、ベンゾイル、ピバロイル、ｔ‐ブチルアセチル、アラニル、フェニルスルホニル、ベンジル、ｔ‐ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、およびベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）である。
「ニトロ」という用語は、本明細書中で使用されるように、‐ＮＯ２基を表わす。
「Ｏ‐保護基」という用語は、本明細書中で使用されるように、酸素を含有する（例えばフェノール、ヒドロキシル、またはカルボニル）基を合成手順の際に望ましからぬ反応から保護するように意図された基を表わす。一般に用いられるＯ‐保護基は、グリーン（Ｇｒｅｅｎｅ）、「有機合成における保護基（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」、第３版、米国ニューヨーク、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ）、１９９９年に開示されており、前記文献は参照により本願に組込まれる。典型的なＯ‐保護基には、アシル、アリールオイル、またはカルバミル基であって例えばホルミル、アセチル、プロピオニル、ピバロイル、ｔ‐ブチルアセチル、２‐クロロアセチル、２‐ブロモアセチル、トリフルオロアセチル、トリクロロアセチル、フタリル、ｏ‐ニトロフェノキシアセチル、α‐クロロブチリル、ベンゾイル、４‐クロロベンゾイル、４‐ブロモベンゾイル、ｔ‐ブチルジメチルシリル、トリ‐イソ‐プロピルシリルオキシメチル、４，４’‐ジメトキシトリチル、イソブチリル、フェノキシアセチル、４‐イソプロピルペヘノキシアセチル（４−ｉｓｏｐｒｏｐｙｌｐｅｈｅｎｏｘｙａｃｅｔｙｌ）、ジメチルホルムアミジノ、および４‐ニトロベンゾイル；アルキルカルボニル基、例えばアシル、アセチル、プロピオニル、ピバロイルなど；任意選択で置換されたアリールカルボニル基、例えばベンゾイル；シリル基、例えばトリメチルシリル（ＴＭＳ）、ｔｅｒｔ‐ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）、トリ‐イソ‐プロピルシリルオキシメチル（ＴＯＭ）、トリイソプロピルシリル（ＴＩＰＳ）など；ヒドロキシルとともにエーテルを形成する基、そのような（ｓｕｃｈ）メチル、メトキシメチル、テトラヒドロピラニル、ベンジル、ｐ‐メトキシベンジル、トリチルなど；アルコキシカルボニル、例えばメトキシカルボニル、エトキシカルボニル、イソプロポキシカルボニル、ｎ‐イソプロポキシカルボニル、ｎ‐ブチルオキシカルボニル、イソブチルオキシカルボニル、ｓｅｃ‐ブチルオキシカルボニル、ｔ‐ブチルオキシカルボニル、２‐エチルヘキシルオキシカルボニル、シクロヘキシルオキシカルボニル、メチルオキシカルボニルなど；アルコキシアルコキシカルボニル基、例えばメトキシメトキシカルボニル、エトキシメトキシカルボニル、２‐メトキシエトキシカルボニル、２‐エトキシエトキシカルボニル、２‐ブトキシエトキシカルボニル、２‐メトキシエトキシメトキシカルボニル、アリルオキシカルボニル、プロパルギルオキシカルボニル、２‐ブテンオキシカルボニル、３‐メチル‐２‐ブテンオキシカルボニルなど；ハロアルコキシカルボニル、例えば２‐クロロエトキシカルボニル、２‐クロロエトキシカルボニル、２，２，２‐トリクロロエトキシカルボニルなど；任意選択で置換されたアリールアルコキシカルボニル基、例えばベンジルオキシカルボニル、ｐ‐メチルベンジルオキシカルボニル、ｐ‐メトキシベンジルオキシカルボニル、ｐ‐ニトロベンジルオキシカルボニル、２，４‐ジニトロベンジルオキシカルボニル、３，５‐ジメチルベンジルオキシカルボニル、ｐ‐クロロベンジルオキシカルボニル、ｐ‐ブロモベンジルオキシ‐カルボニル、フルオレニルメチルオキシカルボニルなど；ならびに任意選択で置換されたアリールオキシカルボニル基、例えばフェノキシカルボニル、ｐ‐ニトロフェノキシカルボニル、ｏ‐ニトロフェノキシカルボニル、２，４‐ジニトロフェノキシカルボニル、ｐ‐メチル‐フェノキシカルボニル、ｍ‐メチルフェノキシカルボニル、ｏ‐ブロモフェノキシカルボニル、３，５‐ジメチルフェノキシカルボニル、ｐ‐クロロフェノキシカルボニル、２‐クロロ‐４‐ニトロフェノキシ‐カルボニルなど；置換されたアルキル、アリール、およびアルカリールのエーテル（例えばトリチル；メチルチオメチル；メトキシメチル；ベンジルオキシメチル；シロキシメチル；２，２，２，‐トリクロロエトキシメチル；テトラヒドロピラニル；テトラヒドロフラニル；エトキシエチル；１‐［２‐（トリメチルシリル）エトキシ］エチル；２‐トリメチルシリルエチル；ｔ‐ブチルエーテル；ｐ‐クロロフェニル、ｐ‐メトキシフェニル、ｐ‐ニトロフェニル、ベンジル、ｐ‐メトキシベンジル、およびニトロベンジル）；シリルエーテル（例えば、トリメチルシリル；トリエチルシリル；トリイソプロピルシリル；ジメチルイソプロピルシリル；ｔ‐ブチルジメチルシリル；ｔ‐ブチルジフェニルシリル；トリベンジルシリル；トリフェニルシリル；およびジフェニメチルシリル（ｄｉｐｈｅｎｙｍｅｔｈｙｌｓｉｌｙｌ））；カルボナート（例えば、メチル、メトキシメチル、９‐フルオレニルメチル；エチル；２，２，２‐トリクロロエチル；２‐（トリメチルシリル）エチル；ビニル、アリル、ニトロフェニル；ベンジル；メトキシベンジル；３，４‐ジメトキシベンジル；およびニトロベンジル）；カルボニル保護基（例えば、アセタール基およびケタール基であって例えばジメチルアセタール、１，３‐ジオキソランなど；アシラール基；およびジチアン基、例えば１，３‐ジチアン、１，３‐ジチオランなど）；カルボン酸保護基（例えばエステル基、例えばメチルエステル、ベンジルエステル、ｔ‐ブチルエステル、オルトエステルなど；ならびにオキサゾリン基、が挙げられる。
「オキソ」という用語は、本明細書中で使用されるように、＝Ｏを表わす。
「ペルフルオロアルキル」という用語は、本明細書中で使用されるように、本明細書中に定義されるようなアルキル基であって該アルキル基に結合した各水素ラジカルがフルオリドラジカルによって置き換えられているものを表わす。ペルフルオロアルキル基は、トリフルオロメチル、ペンタフルオロエチルなどにより例証される。
「ペルフルオロアルコキシ」という用語は、本明細書中で使用されるように、本明細書中に定義されるようなアルコキシ基であって該アルコキシ基に結合した各水素ラジカルがフルオリドラジカルによって置き換えられているものを表わす。ペルフルオロアルコキシ基は、トリフルオロメトキシ、ペンタフルオロエトキシなどにより例証される。
「スピロシクリル」という用語は、本明細書中で使用されるように、Ｃ２‐７アルキレンジラジカルであってその両端が親基の同じ炭素原子に結合されてスピロシクリル基を形成するもの、および同様にＣ１‐６ヘテロアルキレンジラジカルであってその両端が同じ原子に結合されるものを表わす。スピロシクリル基を形成しているヘテロアルキレンラジカルは、窒素、酸素、および硫黄で構成されている群から独立に選択された１、２、３、または４個のヘテロ原子を包含することができる。いくつかの実施形態では、スピロシクリル基は、ジラジカルが取り付けられている炭素原子以外に、１〜７個の炭素を含む。本発明のスピロシクリル基は、任意選択で、シクロアルキル基およびヘテロシクリル基のうち少なくともいずれかについての任意選択の置換基として本明細書中に提供される１、２、３、または４個の置換基で置換されうる。
「立体異性体」という用語は、本明細書中で使用されるように、化合物（例えば本明細書中に記載された任意の式の化合物）が有することができるあらゆる可能な異なる異性体および立体配座の形態、特に、基本の分子構造の、全ての可能な立体化学的かつ立体配座的な異性体、全てのジアステレオマー、エナンチオマーおよび配座異性体のうち少なくともいずれかを指す。本発明のいくつかの化合物は種々の互変異性体として存在することが可能であり、該異性体は全て本発明の範囲内に含まれている。
「スルホアルキル」という用語は、本明細書中で使用されるように、‐ＳＯ３Ｈのスルホ基によって置換された、本明細書中に定義されるようなアルキル基を表わす。いくつかの実施形態では、該アルキル基は、本明細書中に記載されるような１、２、３、または４個の置換基でさらに置換可能であり、スルホ基は１つ以上のＯ‐保護基（例えば本明細書中に記載されるようなもの）でさらに置換されうる。
「スルホニル」という用語は、本明細書中で使用されるように、‐Ｓ（Ｏ）２‐基を表わす。
「チオアルカリール」という用語は、本明細書中で使用されるように、式‐ＳＲの化学置換基であって式中のＲはアルカリール基であるものを表わす。いくつかの実施形態では、該アルカリール基は、１、２、３、または４個の本明細書中に記載されるような置換基でさらに置換されうる。
「チオアルクヘテロシクリル」という用語は、本明細書中で使用されるように、式‐ＳＲの化学置換基であって式中のＲはアルクヘテロシクリル基であるものを表わす。いくつかの実施形態では、該アルクヘテロシクリル基は、１、２、３、または４個の本明細書中に記載されるような置換基でさらに置換されうる。
「チオアルコキシ」という用語は、本明細書中で使用されるように、式‐ＳＲの化学置換基であって式中のＲは本明細書中に定義されるようなアルキル基であるものを表わす。いくつかの実施形態では、該アルキル基は、１、２、３、または４個の本明細書中に記載されるような置換基でさらに置換されうる。
「化合物」：本明細書中で使用されるように、「化合物」という用語は、示された構造の全ての立体異性体、幾何異性体、互変異性体、および同位体を含むことを意味する。
本明細書中に記載された化合物は（例えば、１つ以上の立体中心を有して）非対称となりうる。別段の指定のない限り、エナンチオマーおよびジアステレオマーのような全ての立体異性体が意図される。非対称的に置換された炭素原子を含有する本開示の化合物は、光学活性体またはラセミ体の形で単離されうる。光学活性な出発物質からいかにして光学活性体を調製するかについての方法は、ラセミ混合物の分割によるか、または立体選択的合成によるなど、当分野で周知である。オレフィン、Ｃ＝Ｎ二重結合など数多くの幾何異性体も本明細書中に記載された化合物中に存在しうるが、そのような安定な異性体はすべて本開示において企図されている。本開示の化合物のシスおよびトランス幾何異性体について説明されており、かつ該異性体は、異性体の混合物として単離されてもよいし、分離された異性体として単離されてもよい。
本開示の化合物には互変異性体も含まれる。互変異性体は、単結合が隣接する二重結合と相互交換すると同時にプロトンが移動することから生じる。互変異性体には、同じ実験式および総電荷を有するプロトン化異性状態であるプロトトロピック互変異性体が挙げられる。例示のプロトトロピック互変異性体には、ケトン‐エノール対、アミド‐イミド酸対、ラクタム‐ラクチム対、アミド‐イミド酸対、エナミン‐イミン対、およびプロトンが複素環構造の２以上の部位を占めることができる環状の形態、例えば１Ｈ‐および３Ｈ‐イミダゾール、１Ｈ‐、２Ｈ‐および４Ｈ‐１，２，４‐トリアゾール、１Ｈ‐および２Ｈ‐イソインドール、ならびに１Ｈ‐および２Ｈ‐ピラゾールなどが挙げられる。互変異性体は平衡状態にあってもよいし、適切な置換により１つの形態に立体的に固定されてもよい。
本開示の化合物はさらに、中間体または最終化合物中に生じる原子の全ての同位体をも含む。「同位体」とは、同じ原子番号を有するが核内の中性子の数が異なることから異なる質量数を有する原子を指す。例えば、水素の同位体にはトリチウムおよび重水素が含まれる。
本開示の化合物および塩は、日常作業的な方法により、溶媒和物および水和物を形成するために溶媒または水の分子と組み合わせて調製されうる。
「保存された」：本明細書中で使用されるように、「保存された」という用語は、ポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の、それぞれヌクレオチドまたはアミノ酸残基であって、比較されている２以上の配列の同じ部位において変更なく存在するヌクレオチドまたはアミノ酸残基であるものを指す。相対的に保存されたヌクレオチドまたはアミノ酸とは、配列中の他所に出現するヌクレオチドまたはアミノ酸よりも、より多くの関連配列において保存されているものである。
いくつかの実施形態では、２以上の配列は、該配列が互いに１００％同一である場合に「完全に保存された」と言われる。いくつかの実施形態では、２以上の配列は、該配列が互いに少なくとも７０％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも９０％同一、または少なくとも９５％同一である場合に「高度に保存された」と言われる。いくつかの実施形態では、２以上の配列は、該配列が互いに約７０％同一、約８０％同一、約９０％同一、約９５％、約９８％、または約９９％同一である場合に「高度に保存された」と言われる。いくつかの実施形態では、２以上の配列は、該配列が互いに少なくとも３０％同一、少なくとも４０％同一、少なくとも５０％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも９０％同一、または少なくとも９５％同一である場合に「保存された」と言われる。いくつかの実施形態では、２以上の配列は、該配列が互いに約３０％同一、約４０％同一、約５０％同一、約６０％同一、約７０％同一、約８０％同一、約９０％同一、約９５％同一、約９８％同一、または約９９％同一である場合に「保存された」と言われる。配列の保存は、オリゴヌクレオチドまたはポリペプチドの全長に適用される場合もあれば、それらの一部、領域または主要部に適用される場合もある。
「環式または環化された」：本明細書中で使用されるように、「環式」という用語は一続きの輪状構造の存在を指す。環式分子は円形である必要はないが、ただし結合して切れ目のないサブユニットの鎖を形成する。本発明のｍＲＮＡのような環式分子は、単一構成単位でも多量体であってもよく、複雑な構造または高次構造の構成要素を１つ以上含んでなることができる。
「細胞増殖抑制性」：本明細書中で使用されるように、「細胞増殖抑制性（の）」とは、細胞（例えば哺乳動物細胞（例えばヒト細胞））、細菌、ウイルス、真菌、原生動物、寄生生物、プリオン、またはこれらの組み合わせの成長、分裂、または増殖を、阻害、低減、抑制することを指す。
「細胞毒性」：本明細書中で使用されるように、「細胞毒性（の）」とは、細胞（例えば哺乳動物細胞（例えばヒト細胞））、細菌、ウイルス、真菌、原生動物、寄生生物、プリオン、またはこれらの組み合わせを死滅させるか、または前記の細胞その他に対して有害、有毒、もしくは致命的な影響を引き起こすことを指す。
「送達」：本明細書中で使用されるように、「送達」とは、化合物、物質、実体（もの）、構成部分、積荷またはペイロードを送達する行為または方法を指す。
「送達作用薬」：本明細書中で使用されるように、「送達作用薬」とは、標的細胞へのポリヌクレオチドのｉｎ ｖｉｖｏにおける送達を少なくとも部分的に促進する任意の物質を指す。
「不安定化」：本明細書中で使用されるように、「不安定な（ｄｅｓｔａｂｌｅ）」、「不安定化する」、または「不安定化領域」という用語は、その同じ領域または分子の当初の野生型すなわち天然の形態よりも、安定性の低い領域または分子を意味する。
「検出可能な標識」：本明細書中で使用されるように、「検出可能な標識」とは、別の実体に取り付け、組み入れ、または関連付けがなされる１つ以上のマーカー、シグナル、または構成部分であって、Ｘ線検査、蛍光発光、化学発光、酵素活性、吸光度などを含む当分野で既知の方法によって容易に検出されるものを指す。検出可能な標識には、放射性同位体、発蛍光団、発色団、酵素、色素、金属イオン、リガンド、例えばビオチン、アビジン、ストレプトアビジンおよびハプテン、量子ドットなどが挙げられる。検出可能な標識は本明細書中に開示されたペプチドまたはタンパク質中の任意の部位に位置することができる。該標識は、アミノ酸、ペプチド、またはタンパク質の内部にあってもよいし、Ｎ末端またはＣ末端に位置してもよい。
「消化（する）」：本明細書中で使用されるように、「消化（する）」という用語は、より小さな断片または構成成分へと分解することを意味する。ポリペプチドまたはタンパク質に関する場合、消化はペプチドの産生をもたらす。
「遠位（側）」：本明細書中で使用されるように、「遠位（側）」という用語は、中心から離れて位置するかまたは対象とする地点もしくは領域から離れて位置することを意味する。
「コードされたタンパク質開裂シグナル」：本明細書中で使用されるように、「コードされたタンパク質開裂シグナル」とはタンパク質開裂シグナルをコードするヌクレオチド配列を指す。
「人為操作された（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）」：本明細書中で使用されるように、本発明の実施形態は、該実施形態が構造的であれ化学的であれ出発点の野生型または天然の分子とは異なる特徴または特性を有するように設計される場合、「人為操作され」ている。
「発現」：本明細書中で使用されるように、核酸配列の「発現」とは、以下の事象すなわち：（１）ＤＮＡ配列からのＲＮＡ鋳型の産生（例えば転写による）；（２）ＲＮＡ転写物のプロセシング（例えば、スプライシング、エディティング、５’キャップ形成、または３’末端プロセシングのうち少なくともいずれかによる）；（３）ポリペプチドまたはタンパク質へのＲＮＡの翻訳；ならびに、（４）ポリペプチドまたはタンパク質の翻訳後修飾、のうち１つ以上を指す。
「特徴」：本明細書中で使用されるように、「特徴」とは特質（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ）、特性（ｐｒｏｐｅｒｔｙ）、または特有な要素を指す。
「調合物」：本明細書中で使用されるように、「調合物」は、少なくともポリヌクレオチドおよび送達作用薬を含む。
「フラグメント」：「フラグメント」とは、本明細書中で使用されるように、一部分を指す。例えば、タンパク質のフラグメントは、培養細胞から単離された完全長タンパク質の消化により得られたポリペプチドを含んでなることができる。
「機能的（機能性）」：本明細書中で使用されるように、「機能的」生体分子とは、該分子が、該分子を特徴付ける特性および活性のうち少なくともいずれかを示す形態である、生体分子である。
「相同性（ホモロジー）」：本明細書中で使用されるように、「相同性」という用語は、ポリマー状分子の間、例えば、核酸分子（例えばＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子のうち少なくともいずれか）間、およびポリペプチド分子間のうち少なくともいずれかにおける、全体的な関連性を指す。いくつかの実施形態では、ポリマー状分子は、それらの配列が少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％同一であるかまたは類似している場合、互いに「相同」であるとみなされる。「相同である」という用語は、必然的に少なくとも２つの配列（ポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列）の間の比較を指す。本発明によれば、２つのポリヌクレオチド配列は、該ポリヌクレオチド配列がコードするポリペプチドが、少なくとも約２０アミノ酸の少なくとも１つの区間について少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または実に９９％である場合、相同であるとみなされる。いくつかの実施形態では、相同なポリヌクレオチド配列は、少なくとも４〜５個の独自に指定されたアミノ酸の区間をコードする能力によって特徴付けられる。長さ６０ヌクレオチド未満のポリヌクレオチド配列については、相同性は、少なくとも４〜５個の独自に指定されたアミノ酸の区間をコードする能力によって判定される。本発明によれば、２つのタンパク質配列は、該タンパク質が、少なくとも約２０アミノ酸の少なくとも１つの区間について少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％同一である場合、相同であるとみなされる。
「同一性」：本明細書中で使用されるように、「同一性」という用語は、ポリマー状分子の間、例えばオリゴヌクレオチド分子間（例えばＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子のうち少なくともいずれか）、およびポリペプチド分子間のうち少なくともいずれかにおける、全体的な関連性を指す。２つのポリヌクレオチド配列の同一性（％）の計算は、例えば、最適な比較のためにその２つの配列をアラインメントすることにより実施されうる（例えば、最適なアラインメントのために第１および第２の核酸配列のうち一方または両方にギャップが導入されてもよく、また、比較の目的のために同一でない配列は無視されてもよい）。ある実施形態では、比較を目的としてアラインメントされる配列の長さは、基準配列の長さの少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％である。その後、対応するヌクレオチド部位のヌクレオチドが比較される。第１の配列のある部位に第２の配列の対応する部位と同じヌクレオチドがある場合、これらの分子はその部位について同一である。２つの配列の間の同一性（％）は、その２つの配列の最適なアラインメントのために導入される必要のあるギャップの数および各ギャップの長さを考慮に入れた、該配列によって共有される同一な部位の数の関数である。配列の比較、および２つの配列間の同一性（％）の決定は、数学アルゴリズムを使用して遂行することができる。例えば、２つのヌクレオチド配列間の同一性（％）は、レスク（Ｌｅｓｋ）、Ａ．Ｍ．編、「計算分子生物学（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、米国ニューヨーク、オックスフォード大学出版局（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ）、１９８８年；スミス（Ｓｍｉｔｈ）、Ｄ．Ｗ．編、「バイオコンピューティング：インフォマティクスおよびゲノムプロジェクト（Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ： Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ）」、米国ニューヨーク、アカデミックプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、１９９３年；フォン・ハインイェ（ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ）、Ｇ．、「分子生物学における配列分析（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、アカデミックプレス、１９８７年；グリフィン（Ｇｒｉｆｆｉｎ）、Ａ．Ｍ．およびグリフィン（Ｇｒｉｆｆｉｎ）、Ｈ．Ｇ．編、「配列データのコンピュータ分析（Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ）」、第Ｉ部、米国ニュージャージー、ヒューマナプレス（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ）、１９９４年；ならびに、グリブスコフ（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ）、Ｍ．およびデヴェルー（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ）、Ｊ．編、「配列分析プライマー（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ）、米国ニューヨーク、Ｍストックトンプレス（Ｍ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ）、１９９１年；に記載されているもののような方法を使用して決定可能であり、前記文献はそれぞれ参照により本願に組み込まれる。例えば、２つのヌクレオチド配列間の同一性（％）は、マイヤーズ（Ｍｅｙｅｒｓ）およびミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）のアルゴリズム（コンピュータ・アプリケーション・イン・バイオサイエンス（ＣＡＢＩＯＳ）、１９８９年、第４巻、ｐ．１１−１７）を使用して決定することができるが、該アルゴリズムは、ＰＡＭ１２０の重み付け残基表（ｗｅｉｇｈｔ ｒｅｓｉｄｕｅ ｔａｂｌｅ）、ギャップ長ペナルティ１２およびギャップペナルティ４を使用するＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。２つのヌクレオチド配列間の同一性（％）は、別例として、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックスを使用するＧＣＧソフトウェアパッケージにおいてＧＡＰプログラムを使用して決定することもできる。配列間の同一性（％）を決定するために一般に使用される方法には、限定するものではないが、カリロ（Ｃａｒｉｌｌｏ）、Ｈ．およびリプマン（Ｌｉｐｍａｎ）、Ｄ．、ＳＩＡＭジャーナル・オン・アプライド・マスマティックス（ＳＩＡＭ Ｊ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．）、１９８８年、第４８巻、ｐ．１０７３に開示されたもの（参照により本願に組み込まれる）が挙げられる。同一性を決定するための技法は公的に利用可能なコンピュータプログラムに成文化されている。２つの配列間の相同性を決定するための典型的なコンピュータソフトウェアには、限定するものではないが、ＧＣＧプログラムパッケージ、デヴェルー（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ）、Ｊ．ら、ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、１９８４年、第１２巻、第１号、ｐ．３８７）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、およびＦＡＳＴＡ アルトシュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）、Ｓ．Ｆ．ら、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ． Ｍｏｌｅｃ． Ｂｉｏｌ．）、１９９０年、第２１５巻、ｐ．４０３）が挙げられる。
「遺伝子の発現を阻害する」：本明細書中で使用されるように、「遺伝子の発現を阻害する」という言葉は、遺伝子の発現産物の量の低減を引き起こすことを意味する。該発現産物は、遺伝子から転写されたＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）であってもよいし、遺伝子から転写されたｍＲＮＡから翻訳されたポリペプチドであってもよい。典型的には、ｍＲＮＡのレベルの低減は、該ｍＲＮＡから翻訳されるポリペプチドのレベルの低減をもたらす。発現のレベルは、ｍＲＮＡまたはタンパク質を測定するための標準的な技法を使用して決定されうる。
「ｉｎ ｖｉｔｒｏ」：本明細書中で使用されるように、「ｉｎ ｖｉｔｒｏ」という用語は、生物体（例えば動物、植物、または微生物）の中ではなく、人工的環境、例えば試験管内または反応槽内、細胞培養物中、ペトリ皿内などにおいて生じる事象を指す。
「ｉｎ ｖｉｖｏ」：本明細書中で使用されるように、「ｉｎ ｖｉｖｏ」という用語は、生物体（例えば動物、植物、もしくは微生物、またはこれらの細胞もしくは組織）の中で生じる事象を指す。
「単離（された）」：本明細書中で使用されるように、「単離（された）」という用語は、物質または実体であって該物質または実体が（自然界であるか実験的設定であるかに関わらず）関連付けられていた構成要素のうち少なくとも一部から分離されているものを指す。単離された物質は、該物質が関連付けられていた物質に関して様々なレベルの純度を有しうる。単離された物質および／または実体は、これらが当初関連付けられていた他の構成要素のうち少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、またはそれ以上から分離されうる。いくつかの実施形態では、単離された作用薬は、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約９９％を越えて純粋である。本明細書中で使用されるように、物質は、該物質が他の構成要素をほとんど含まない場合に「純粋」である。「ほぼ単離された」：「ほぼ単離された」とは、化合物が、該化合物が形成または検出された環境からほぼ（実質的に）分離されていることを意味する。部分的な分離には、例えば、本開示の化合物が強化された組成物が挙げられる。実質的な分離には、本開示の化合物またはその塩を重量比で少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、または少なくとも約９９％含んでいる組成物が挙げられる。化合物およびその塩を単離する方法は当分野では日常的な作業である。
「リンカー」：本明細書中で使用されるように、リンカーとは、原子団（例えば１０〜１，０００個の原子）を指し、例えば、限定するものではないが、炭素、アミノ、アルキルアミノ、酸素、硫黄、スルホキシド、スルホニル、カルボニル、およびイミンなどの原子または基で構成されうる。リンカーは、第一端において核酸塩基または糖部分の修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドに、かつ第二端においてペイロード（例えば検出可能な作用薬または治療薬）に、取り付けることができる。リンカーは、核酸配列中への組み入れを妨害しないために十分な長さのものであるとよい。リンカーは、任意の有用な目的に、例えば多量体を（例えば２つ以上のポリヌクレオチドの連結により）形成するかまたはコンジュゲートを形成するため、および本明細書中に記載されるようなペイロードを投与するために、使用されうる。リンカーに組み入れることができる化学基の例には、限定するものではないが、アルキル、アルケニル、アルキニル、アミド、アミノ、エーテル、チオエーテル、エステル、アルキレン、ヘテロアルキレン、アリール、またはヘテロシクリルであり、これらはそれぞれ本明細書中に記載されるようにして任意選択で置換されうる。リンカーの例には、限定するものではないが、不飽和のアルカン、ポリエチレングリコール（例えばエチレングリコールまたはプロピレングリコールのモノマー単位、例えばジエチレングリコール、ジプロピレングリコール、トリエチレングリコール、トリプロピレングリコール、テトラエチレングリコール、またはテトラエチレングリコール）、およびデキストランポリマーが挙げられる。他の例には、限定するものではないが、還元剤または光分解を使用して開裂されうるリンカー内の開裂部分、例えばジスルフィド結合（‐Ｓ‐Ｓ‐）またはアゾ結合（‐Ｎ＝Ｎ‐）などが挙げられる。選択的に開裂可能な結合の非限定的な例には、例えばトリス（２‐カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、または他の還元剤の使用、および光分解のうち少なくともいずれかによって開裂可能なアミド結合、ならびに、例えば酸性加水分解または塩基性加水分解によって開裂可能なエステル結合が挙げられる。
「修飾（された）」：本明細書中で使用されるように、「修飾（された）」とは、本発明の分子の変化した状態または構造を指す。分子は、化学的、構造的、かつ機能的など数多くの方法で修飾されうる。１つの実施形態では、本発明のｍＲＮＡ分子は、非天然のヌクレオシドおよびヌクレオチドのうち少なくともいずれかを、例えば、天然型のリボヌクレオチドであるＡ、Ｕ、Ｇ、およびＣに関するようにして導入することにより、修飾される。キャップ構造のような正統的でないヌクレオチドは、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕリボヌクレオチドの化学構造とは異なるが「修飾された」とはみなされない。
「天然に存在する」：本明細書中で使用されるように、「天然に存在する」とは人為的な助力を伴わずに自然界に存在することを意味する。
「ヒト以外の脊椎動物」：本明細書中で使用されるように、「ヒト以外の脊椎動物」には、野生生物種および家畜生物種など、ホモ・サピエンスを除く全ての脊椎動物が含まれる。ヒト以外の脊椎動物の例には、限定するものではないが、哺乳動物、例えばアルパカ、バンテン、バイソン、ラクダ、ネコ、ウシ、シカ、イヌ、ロバ、ガヤール、ヤギ、モルモット、ウマ、ラマ、ミュール、ブタ、ウサギ、トナカイ、ヒツジ 水牛、およびヤクなどが挙げられる。
「オフターゲット」：本明細書中で使用されるように、「オフターゲット」とは、任意の１つ以上の標的（ターゲット）、遺伝子、または細胞内転写物に対する任意の意図せぬ作用を指す。
「オープンリーディングフレーム」：本明細書中で使用されるように、「オープンリーディングフレーム」または「ＯＲＦ」とは、所与のリーディングフレームにおいて終止コドンを含んでいない配列を指す。
「作動可能なように連結された」：本明細書中で使用されるように、「作動可能なように連結された」という言葉は、２つ以上の分子、構築物、転写物、実体、構成部分などの間の機能的接続を指す。
「パラトープ」：本明細書中で使用されるように、「パラトープ」とは抗体の抗原結合部位を指す。
「患者」：本明細書中で使用されるように、「患者」とは、治療を求めているかもしくは治療の必要がある可能性があるか、治療を必要としているか、治療を受けているか、治療を受ける予定である対象者、または、特定の疾患もしくは病状について熟練した専門家によるケアを受けている対象者を指す。
「任意選択で置換（された）」：本明細書中、「任意選択で置換されたＸ」（例えば任意選択で置換されたアルキル）という形の表現は、「Ｘであって、Ｘは任意選択で置換されている」（例えば「アルキルであって、前記アルキルは任意選択で置換されている」）と等しいことが意図される。主体である「Ｘ」（例えばアルキル）それ自身が任意選択であることを意味するようには意図されていない。
「ペプチド」：本明細書中で使用されるように、「ペプチド」は、５０アミノ酸以下の長さ、例えば約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０アミノ酸の長さである。
「薬学的に許容可能な」：「薬学的に許容可能な」という言葉は、本明細書中では、正しい医学的判断の範囲内において、過度の毒性、刺激、アレルギー応答、または他の問題もしくは合併症を伴うことなく人間および動物の組織と接触して使用するのに適しており、合理的なベネフィット・リスク比に見合っている、化合物、材料、組成物、および剤形のうち少なくともいずれかを指すために使用される。
「薬学的に許容可能な添加剤」：「薬学的に許容可能な添加剤」という言葉は、本明細書中で使用されるように、本明細書中に記載された化合物以外の任意の成分（例えば、活性化合物を懸濁または溶解することができるビヒクル）であって患者にほとんど無毒かつ非炎症性である特性を有する成分を指す。添加剤としては、例えば：接着防止剤、酸化防止剤、結合剤、コーティング、圧縮助剤、崩壊剤、色素（着色料）、皮膚軟化薬、乳化剤、充填剤（希釈剤）、塗膜形成物またはコーティング剤、香味料、芳香剤、流動促進剤（流動増強剤）、滑沢剤、保存剤、印刷インキ、吸着剤、懸濁化剤または分散剤、甘味料、および水和水が挙げられる。典型的な添加剤には、限定するものではないが、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム（二塩基性）、ステアリン酸カルシウム、クロスカルメロース、架橋ポリビニルピロリドン、クエン酸、クロスポビドン、システイン、エチルセルロース、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ラクトース、ステアリン酸マグネシウム、マルチトール、マンニトール、メチオニン、メチルセルロース、メチルパラベン、微結晶性セルロース、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポビドン、α化デンプン、プロピルパラベン、レチニルパルミテート、セラック、二酸化ケイ素、カルボキシメチルセルロースナトリウム、クエン酸ナトリウム、デンプングリコール酸ナトリウム、ソルビトール、デンプン（トウモロコシ）、ステアリン酸、スクロース、タルク、二酸化チタン、ビタミンＡ、ビタミンＥ、ビタミンＣ、およびキシリトールが挙げられる。
「薬学的に許容可能な塩」：本開示はさらに、本明細書中に記載された化合物の薬学的に許容可能な塩も含む。本明細書中に使用されるように、「薬学的に許容可能な塩」とは、開示された化合物の誘導体であって、親化合物が、既存の酸または塩基部分をその塩の形態に変換することにより（例えば遊離塩基の基を適切な有機酸と反応させることにより）修飾されているものを指す。薬学的に許容可能な塩の例には、限定するものではないが、塩基性残基の無機塩または有機酸塩、例えばアミン；酸性残基のアルカリ塩または有機塩、例えばカルボン酸；などが挙げられる。代表的な酸付加塩には、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、樟脳酸塩、カンファースルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、硫酸ドデシル、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプトン酸塩、ヘキサン酸塩、臭素酸塩、塩酸塩、ヒドロヨージド、２‐ヒドロキシ‐エタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２‐ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３‐フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、吉草酸塩塩などが挙げられる。代表的なアルカリまたはアルカリ土類金属塩には、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなどに加えて、無毒なアンモニウム、第四アンモニウム、およびアミンのカチオン類、例えば、限定するものではないが、アンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、エチルアミン、などが挙げられる。本開示の薬学的に許容可能な塩には、例えば無毒の無機酸または有機酸から形成された、親化合物の通常の無毒な塩が挙げられる。本開示の薬学的に許容可能な塩は、従来の化学的手法によって塩基性部分または酸性部分を含んでいる親化合物から合成されうる。一般に、そのような塩は、これらの化合物の遊離の酸または塩基の形態を、化学量論量の適切な塩基または酸と、水中もしくは有機溶媒中、またはこれら２つの混合物中で、反応させることにより調製可能であり；一般に、エーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノール、またはアセトニトリルのような非水性の媒体が好ましい。適切な塩のリストは、「レミングトンの薬剤学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」、第１７版、米国ペンシルバニア州イーストン、マック・パブリシング・カンパニー（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ）、１９８５年、ｐ．１４１８、Ｐ．Ｈ．シュタール（Ｓｔａｈｌ）およびＣ．Ｇ．ワームース（Ｗｅｒｍｕｔｈ）編、「薬剤の塩：特性、選択、および使用（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ： Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ， Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，
ａｎｄ Ｕｓｅ）」、ワイリー‐ＶＣＨ（Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ）、２００８年、ならびにベルゲ（Ｂｅｒｇｅ）ら、ジャーナル・オブ・ファーマシューティカル・サイエンス（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ）、１９７７年、第６６巻、ｐ．１−１９に見られ、前記文献はそれぞれ全体が参照により本願に組込まれる。
「薬物動態」：本明細書中で使用されるように、「薬物動態（の）」とは、生体に投与された物質の運命の決定に関係するような、分子または化合物の任意の１つ以上の特性を指す。薬物動態は、吸収、分布、代謝および排泄の程度および速度を含むいくつかの分野に分割される。これは一般にＡＤＭＥと呼ばれ：（Ａ）吸収（Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ）は、物質が血液循環系に入るプロセスであり；（Ｄ）分布（Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）は、身体の体液および組織の全体にわたる物質の分散または散在であり；（Ｍ）代謝（Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ）（または生体内変化）は、親化合物の娘代謝産物への不可逆的変換であり；（Ｅ）排泄（Ｅｘｃｒｅｔｉｏｎ）（または排除）は、身体からの物質の排除を指す。まれな事例では、いくつかの医薬品は身体組織内に不可逆的に蓄積する。
「薬学的に許容可能な溶媒和物」：「薬学的に許容可能な溶媒和物」という用語は、本明細書中で使用されるように、適切な溶媒の分子が結晶格子に組み込まれている本発明の化合物を意味する。適切な溶媒は、投与用量で生理学的に忍容性である。例えば、溶媒和物は、有機溶媒、水、またはこれらの混合物を含んでいる溶液からの結晶化、再結晶化、または沈降反応によって調製されうる。適切な溶媒の例は、エタノール、水（例えば一水和物、二水和物、および三水和物）、Ｎ‐メチルピロリジノン（ＮＭＰ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ，Ｎ’‐ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ，Ｎ’‐ジメチルアセトアミド（ＤＭＡＣ）、１，３‐ジメチル‐２‐イミダゾリジノン（ＤＭＥＵ）、１，３‐ジメチル‐３，４，５，６‐テトラヒドロ‐２‐（１Ｈ）‐ピリミジノン（ＤＭＰＵ）、アセトニトリル（ＡＣＮ）、プロピレングリコール、酢酸エチル、ベンジルアルコール、２‐ピロリドン、安息香酸ベンジルなどである。水が溶媒である場合、溶媒和物は「水和物」と呼ばれる。
「物理化学的」：本明細書中で使用されるように、「物理化学的」とは、物理的特性および化学的特性のうち少なくともいずれかを意味するか、または該特性に関係することを意味する。
「防止する（こと）」：本明細書中で使用されるように、「防止する（こと）」という用語は、感染、疾患、障害および病状のうち少なくともいずれかの開始を部分的または完全に遅延させること；特定の感染、疾患、障害および病状のうち少なくともいずれかの１つ以上の症状、特徴、または臨床徴候の開始を部分的または完全に遅延させること；特定の感染、疾患、障害および病状のうち少なくともいずれかの１つ以上の症状、特徴、または徴候の開始を部分的または完全に遅延させること；感染、特定の疾患、障害および病状のうち少なくともいずれかの進行を部分的または完全に遅延させること；ならびに、該感染、疾患、障害および病状のうち少なくともいずれかに関連した病理を発症するリスクを減少させること、のうち少なくともいずれかを指す。
「プロドラッグ」：本開示はさらに、本明細書中に記載された化合物のプロドラッグも含む。本明細書中で使用されるように、「プロドラッグ」とは、任意の物質、分子または実体であって、化学的または物理的に変化すると、その物質、分子または実体が治療薬として作用するための合法的に市販されている（ｐｒｅｄｉｃａｔｅ）形態になるものを指す。プロドラッグは共有結合によって結合されてもよいし何らかの方法で抑制されてもよく、哺乳動物の対象者に投与される前、投与され次第、または投与後に、活性薬物部分を放出するかまたは活性薬物部分へと変換される。プロドラッグは、化合物中に存在する官能基の修飾であって、該修飾が日常作業的操作またはｉｎ ｖｉｖｏのいずれかにおいて開裂されて親化合物となるような方法での修飾を行うことにより、調製されうる。プロドラッグには、任意の基にヒドロキシル、アミノ、スルフヒドリル、またはカルボキシル基が結合されている化合物であって、哺乳動物の対象者に投与された時に該任意の基が開裂して遊離のヒドロキシル、アミノ、スルフヒドリル、またはカルボキシル基をそれぞれ形成するものが挙げられる。プロドラッグの調製および使用については、Ｔ．ヒグチ（Ｈｉｇｕｃｈｉ）およびＶ．ステラ（Ｓｔｅｌｌａ）、「新規な送達システムとしてのプロドラッグ（Ｐｒｏ−ｄｒｕｇｓ ａｓ Ｎｏｖｅｌ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ）」、Ａ．Ｃ．Ｓ．シンポジウムシリーズ（Ａ．Ｃ．Ｓ． Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ）、第１４巻、ならびにエドワードＢ．ロッシュ（Ｅｄｗａｒｄ Ｂ． Ｒｏｃｈｅ）編、「医薬分子設計における生体可逆的担体（Ｂｉｏｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ Ｃａｒｒｉｅｒｓ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ）」、米薬学会（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）およびペルガモンプレス（Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ）、１９８７年、において議論されており、前記文献はいずれも参照により全体が本願に組み込まれる）。
「増殖する」：本明細書中で使用されるように、「増殖する」という用語は、成長、拡大もしくは増大すること、または急速な成長、拡大もしくは増大を引き起こすことを意味する。「増殖性」とは増殖する能力を有していることを意味する。「抗増殖性」とは、増殖特性に反するかまたは不適当である特性を有していることを意味する。
「タンパク質開裂部位」：本明細書中で使用されるように、「タンパク質開裂部位」とはアミノ酸鎖の制御された開裂が化学的、酵素的または光化学的手段によって遂行することができる部位を指す。
「タンパク質開裂シグナル」：本明細書中で使用されるように、「タンパク質開裂シグナル」とは、開裂のためにポリペプチドに目印またはマークを付与する少なくとも１つのアミノ酸を指す。
「対象とするタンパク質」：本明細書中で使用されるように、「対象とするタンパク質」または「所望のタンパク質」という用語には、本明細書中に提供されるものならびにそのフラグメント、突然変異体、バリアントおよび改変物が含まれる。
「近位（側）」：本明細書中で使用されるように、「近位（側）」という用語は、中心部または対象とする地点もしくは領域により近い位置にあることを意味する。
「精製された」：本明細書中で使用されるように、「精製する」、「精製された」、「精製」とは、不要成分、材料汚染、混成物または不完全体から、ほぼ純粋または清澄にすることを意味する。
「試料」：本明細書中で使用されるように、「試料」または「生物学的試料」という用語は、その組織、細胞または構成要素部分のサブセット（例えば体液、例えば限定するものではないが血液、粘液、リンパ液、関節液、脳脊髄液、唾液、羊水、羊膜帯血（ａｍｎｉｏｔｉｃ ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ）、尿、膣液および精液）を指す。試料にはさらに、生物全体またはその組織、細胞、もしくは構成要素部分のサブセットから調製されたホモジネート、溶解産物もしくは抽出物、またはこれらの画分もしくは一部分、例えば、限定するものではないが、例を挙げると血漿、血清、髄液、リンパ液、皮膚の外側部分、気道、腸管、および尿生殖器管、涙液、唾液、乳汁、血球、腫瘍、臓器が含まれうる。試料はさらに、タンパク質または核酸分子のような細胞成分を含んでいる可能性のある培地、例えば栄養ブイヨンまたはゲルを指す。
「シグナル配列」：本明細書中で使用されるように、「シグナル配列」という言葉は、タンパク質の輸送または局在化を導くことができる配列を指す。
「顕著な、顕著に」：本明細書中で使用されるように、「顕著な」または「顕著に」という用語は、「ほぼ、ほとんど」という用語と同義的に使用される。
「単一単位用量（ｓｉｎｇｌｅ ｕｎｉｔ ｄｏｓｅ）」：本明細書中で使用されるように、「単一単位用量」とは、１回用量で／一度に／単一経路で／単一接点で（すなわち単回の投与事象で）投与される任意の治療薬の用量である。
「類似性」：本明細書中で使用されるように、用語「類似性」とは、ポリマー状分子の間、例えば、ポリヌクレオチド分子（例えばＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子のうち少なくともいずれか）間、およびポリペプチド分子間のうち少なくともいずれかにおける、全体的な関連性を指す。ポリマー状分子相互の類似性（％）の計算は、類似性（％）の計算については当分野で理解されるような保存的置換を考慮に入れることを除いて、同一性（％）の計算と同じ方法で実施されうる。
「分割用量」：本明細書中で使用されるように、「分割用量」とは、単一単位用量または一日合計用量を２回以上の用量に配分することである。
「安定な」：本明細書中で使用されるように、「安定な」とは、反応混合物から有用な程度の純度とする単離に耐えるのに十分に強健であり、かつ好ましくは効果的な治療薬への調合が可能な化合物を指す。
「安定化された」：本明細書中で使用されるように、「安定化する」、「安定化された」、「安定化領域」という用語は、安定にすることまたは安定になることを意味する。
「対象者」：本明細書中で使用されるように、「対象者」または「患者」という用語は、本発明による組成物が、例えば、実験、診断、予防、および治療のうち少なくともいずれかの目的で投与される可能性のある任意の生物体を指す。典型的な対象者には、動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒト以外の霊長類およびヒトのような哺乳動物）および植物のうち少なくともいずれかが挙げられる。
「ほぼ（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ）」：本明細書中で使用されるように、「ほぼ」という用語は、対象とする特質または特性の、全体またはほとんど全体の範囲または程度を示す質的状態を指す。生物学分野における当業者には理解されるであろうが、生物学的および化学的現象は、あるとしても、完了に至り、かつ／または、完全状態まで進むかもしくは絶対的な結果を達成する、もしくは免れる、ということはない場合が多い。したがって、「ほぼ」という用語は、多くの生物学的および化学的現象において本来的な完全状態の潜在的欠如を捕らえるために、本明細書中において使用される。
「ほぼ等しい」：本明細書中で使用されるように、投薬間の時間差に関するとき、該用語はプラス／マイナス２％を意味する。
「ほぼ同時に」：本明細書中で使用されるように、かつ複数回の投薬に関するとき、該用語は２秒以内を意味する。
「〜に罹患している」：疾患、障害、および病状のうち少なくともいずれかに「罹患している」個体は、疾患、障害、および病状のうち少なくともいずれかの１つ以上の症状を有すると診断されているか、または該症状を示す。
「〜を被りやすい（〜に罹患しやすい）」：疾患、障害、および病状のうち少なくともいずれかを「被りやすい（罹患しやすい）」個体は、疾患、障害、および病状のうち少なくともいずれかの症状を有するとは診断されていないか、かつ／または、該症状を示していないかもしれないが、疾患もしくはその症状を発症する傾向を有している。いくつかの実施形態では、疾患、障害、および病状のうち少なくともいずれか（例えば、がん）に罹患しやすい個体は、下記すなわち：（１）疾患、障害および病状のうち少なくともいずれかの発症に関連する遺伝子突然変異；（２）疾患、障害および病状のうち少なくともいずれかの発症に関連する遺伝的多型；（３）疾患、障害および病状のうち少なくともいずれかに関連するタンパク質および核酸のうち少なくともいずれかの、発現および活性のうち少なくともいずれかの増大および減少のうち少なくともいずれか；（４）疾患、障害および病状のうち少なくともいずれかの発症に関連する、習慣およびライフスタイルのうち少なくともいずれか；（５）疾患、障害および病状のうち少なくともいずれかの家族歴；ならびに（６）疾患、障害および病状のうち少なくともいずれかの発症に関連する微生物への曝露および該微生物による感染のうち少なくともいずれか、のうち１つ以上により特徴付けられうる。いくつかの実施形態では、疾患、障害および病状のうち少なくともいずれかを被りやすい個体は、おそらく該疾患、障害および病状のうち少なくともいずれかを発症することになろう。いくつかの実施形態では、疾患、障害および病状のうち少なくともいずれかを被りやすい個体は、該疾患、障害および病状のうち少なくともいずれかを発症しないであろう。
「合成（の）」：「合成（の）」という用語は、人の手によって生産、調製、および製造のうち少なくともいずれかがなされることを意味する。ポリヌクレオチドもしくはポリペプチドまたは本発明の他の分子の合成は、化学合成であってもよいし、酵素合成であってもよい。
「標的細胞」：本明細書中で使用されるように、「標的細胞」とは、対象とする任意の１以上の細胞を指す。該細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｓｉｔｕまたは生物体の組織内もしくは臓器内において見出されうる。該生物体は、動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒト、最も好ましくは患者であってよい。
「治療薬」：「治療薬」という用語は、対象者に投与された時に、治療的効果、診断的効果、および予防的効果のうち少なくともいずれかを有し、かつ／または、所望の生物学的効果および薬理効果のうち少なくともいずれかを誘発する、任意の作用薬を指す。
「治療上有効な量」：本明細書中で使用されるように、「治療上有効な量」という用語は、感染、疾患、障害および病状のうち少なくともいずれかに罹患しているかまたは被りやすい対象者に投与された時に、該感染、疾病、疾患、障害および病状のうち少なくともいずれかについて治療、症状の改善、診断、予防、および開始の遅延のうち少なくともいずれかをなすのに十分な、送達されるべき作用薬（例えば核酸、薬物、治療薬、診断用薬、予防薬など）の量を意味する。
「治療上有効な成果」：本明細書中で使用されるように、「治療上有効な成果」という用語は、感染、疾患、障害および病状のうち少なくともいずれかに罹患しているかまたは被りやすい対象者において、該感染、疾患、障害および病状のうち少なくともいずれかについて治療、症状の改善、診断、予防、および開始の遅延のうち少なくともいずれかをなすのに十分な成果を意味する。
「一日合計用量」：本明細書中で使用されるように、「一日合計用量」とは２４時間の間に与えられるかまたは処方される量である。それは単一単位用量として投与されてもよい。
「転写因子」：本明細書中で使用されるように、「転写因子」という用語は、例えば転写の活性化または抑制によって、ＤＮＡのＲＮＡへの転写を調節するＤＮＡ結合タンパク質を指す。いくつかの転写因子は単独で転写の調節を行う一方、他の転写因子は他のタンパク質と協力して作用する。転写因子のなかには、ある一定の条件下で転写の活性化および抑制の両方を行うことができるものもある。一般に、転写因子は標的遺伝子の調節領域内の特異的な共通配列に極めて類似している特異的な１または複数の標的配列に結合する。転写因子は、標的遺伝子の転写を単独で調節してもよいし、他の分子との複合体の状態で調節してもよい。
「治療（すること）」：本明細書中で使用されるように、「治療（すること）」という用語は、特定の感染、疾患、障害および病状のうち少なくともいずれかの１つ以上の症状または特徴の、部分的または完全な緩和、好転、改善、軽減、開始の遅延、進行の阻害、重症度の低減、および発生率の低減のうち少なくともいずれかを指す。例えば、がんを「治療すること」は、腫瘍の生存、成長、および転移のうち少なくともいずれかを阻害することを指すことができる。治療は、疾患、障害および病状のうち少なくともいずれかの徴候を示さない対象者、ならびに疾患、障害および病状のうち少なくともいずれかの初期徴候のみを示す対象者のうち少なくともいずれかに、該疾患、障害および病状のうち少なくともいずれかに関連する病理を発症するリスクを減少させる目的で、投与されてもよい。
「未修飾（の）」：本明細書中で使用されるように、「未修飾（の）」とは、何らかの形で変化せしめられる前の、任意の物質、化合物または分子を指す。未修飾とは、常にではないが、生体分子の野生型または天然型を指す場合もある。分子は一連の修飾を受けることが可能であり、これによりそれぞれの修飾分子は、その後の修飾のための「未修飾の」出発分子としての役割を果たすことができる。
［等価物および範囲］
当業者は、型通りの実験作業しか使用せずとも、本明細書中に記載された本発明による特定の実施形態の数多くの等価物を認識するであろうし、または確認することができるであろう。本発明の範囲は、上記の説明に限定されるようには意図されておらず、添付の特許請求の範囲に述べられた通りである。
特許請求の範囲において、冠詞、例えば「１つの（ａ， ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、反することが示されるかまたは文脈からそうでないことが明白でない限りは、１または２以上を意味することができる。群の１つ以上の構成要員の間に「または、もしくは（ｏｒ）」を含む請求項または記載は、反することが示されるかまたは文脈からそうでないことが明白でない限り、その群の構成要員のうち１つ、２以上、または全部が、所与の生成物もしくはプロセスの中に存在するか、該生成物もしくはプロセスにおいて使用されるか、またはその他の方法で該生成物もしくはプロセスに関係していれば条件が満たされるとみなされる。本発明は、その群のまさに１つの構成要因が、所与の生成物もしくはプロセスの中に存在するか、該生成物もしくはプロセスにおいて使用されるか、またはその他の方法で該生成物もしくはプロセスに関係している、実施形態を含んでいる。本発明は、その群の構成要員のうち２以上、または全部が、所与の生成物もしくはプロセスの中に存在するか、該生成物もしくはプロセスにおいて使用されるか、またはその他の方法で該生成物もしくはプロセスに関係している、実施形態を含んでいる。
さらに、「〜を含んでなる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、オープンであることが意図され、かつ追加の要素またはステップを含めることを許容するが必須ではない、ということも留意される。「〜を含んでなる」という用語が本明細書中で使用される場合、「〜で構成される（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」という用語も包含かつ開示される。
範囲が与えられる場合は、端点が含まれる。更に、当然のことであるが、別段の記載がないかまたは文脈および当業者の理解からそうでないことが明白でないかぎり、範囲として表現される値は、本発明の様々な実施形態において指定された範囲内のあらゆる具体値または部分範囲を、文脈がそうでないことを明白に記していないかぎり該範囲の下限値の単位の１０分の１までとることが可能である。
加えて、当然のことながら、先行技術の範囲内にある本発明の任意の特定の実施形態は、特許請求の範囲の任意の１つ以上の請求項から明確に除外されうる。そのような実施形態は当業者に周知であると考えられるので、該実施形態は、本明細書中で除外について明確に述べられなくとも除外されうる。本発明の組成物のいかなる特定の実施形態（例えば任意の核酸または該核酸によりコードされるタンパク質；任意の生産方法；任意の使用方法など）も、先行技術の存在に関連づけられるか否かにかかわらず、任意の理由で、特許請求の範囲の任意の１つ以上の請求項から除外されうる。
全ての引用された出典、例えば本明細書中で引用された参照文献、出版物、データベース、データベースエントリ、および技術は、その引用において明らかに記されなくとも参照により本願に組み込まれる。引用された出典および本願が矛盾する状況においては、本願における記述が優先されるものとする。
［実施例］
本開示は以降の実施例においてさらに説明されるが、該実施例は特許請求の範囲に記載された開示内容の範囲を限定するものではない。
実施例１． 修飾ｍＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写
Ａ． 材料および方法
本発明の修飾ｍＲＮＡは、ヌクレオチド混合物が修飾ヌクレオチドを含んでいるということを除いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写のための標準的な実験室的方法および材料を使用して作製される。対象とする遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、強力なコザック翻訳開始シグナルを含んでいる５’非翻訳領域（ＵＴＲ）と、アデノシンアナログ体を組み入れていないｍＲＮＡのための鋳型に基づいた（ｔｅｍｐｌａｔｅｄ）ｐｏｌｙＡテールの付加を行うためのオリゴ（ｄＴ）配列を終端とするα‐グロビンの３’ＵＴＲとによって、両端が隣接せしめられる。アデノシンを含んでいるｍＲＮＡは、転写後のポリ（Ａ）ポリメラーゼによるポリ（Ａ）テーリングを可能にするためにオリゴ（ｄＴ）配列なしで合成される。
修飾ｍＲＮＡは細胞の先天性免疫応答を低減するために修飾されうる。該細胞応答を低減する修飾物には、プソイドウリジン（Ψ）および５‐メチル‐シチジン（５ｍｅＣ、５ｍｃまたはｍ５Ｃ）が挙げられる。（カリコ（Ｋａｒｉｋｏ） Ｋら、イミュニティ（Ｉｍｍｕｎｉｔｙ）、２００５年、第２３巻、ｐ．１６５−７５、（Ｋａｒｉｋｏ） Ｋら、モレキュラー・セラピー（Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ）、２００８年、第１６巻、ｐ．１８３３−４０、アンダーソン（Ａｎｄｅｒｓｏｎ） ＢＲら、ヌクレイック・アシッド・リサーチ（ＮＡＲ）、２０１０年（参照により本願に組込まれる）を参照のこと）。
該ＯＲＦはさらに、様々な上流または下流の付加物（例えば、限定するものではないが、β‐グロビン、タグなど）を含んでもよく、例えば、限定するものではないがＤＮＡ２．０社（米国カリフォルニア州メンローパーク）のような最適化サービスに注文可能であり、かつＸｂａＩ認識を有しうる多重クローニング部位を包含してもよい。該構築物は受領後すぐに再構成され、化学的にコンピテントな大腸菌に形質転換されうる。
本発明については、ＮＥＢのＤＨ５αコンピテント大腸菌が使用される。形質転換は、１００ｎｇのプラスミドを使用してＮＥＢの指示書に従って実施される。プロトコールは以下のとおりである：
ＮＥＢの５αコンピテント大腸菌細胞のチューブを氷中で１０分間融解させる。
該細胞混合物に、１ｐｇ〜１００ｎｇのプラスミドＤＮＡを含有している１〜５μｌを加える。該チューブを４〜５回注意深くはじいて細胞とＤＮＡとを混合する。渦流混合は行わないこと。
該混合物を氷中に３０分間置く。混合しないこと。
４２℃で正確に３０秒間の熱ショックを加える。混合しないこと。
氷中に５分間置く。混合しないこと。
該混合物中に室温のＳＯＣを９５０μｌ、ピペット操作で加える。
３７℃に６０分間置く。激しく（２５０ｒｐｍ）震とうまたは回転させる。
選択用プレートを３７℃に温める。
チューブをはじき、かつ反転させることにより細胞を徹底的に混合する。
選択用プレート上に各希釈物５０〜１００μｌを広げ、３７℃で一晩インキュベートする。別例として、３０℃で２４〜３６時間または２５℃で４８時間インキュベートする。
その後、適切な抗生物質を使用して単一コロニーが５ｍｌのＬＢ増殖用培地に接種され、次いで５時間成長せしめられる（２５０ＲＰＭ、３７℃）。次いでこれは２００ｍｌの培地に接種するために使用され、同じ条件下で一晩成長せしめられる。
プラスミド（最大８５０μｇ）を単離するために、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＰＵＲＥＬＩＮＫ（商標）ＨｉＰｕｒｅ Ｍａｘｉｐｒｅｐキット（米国カリフォルニア州カールスバード）を使用し、製造業者の指示書に従ってマキシプレップ（大量調製）が実施される。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）用のｃＤＮＡを生成するために、プラスミド（その一例は図３に示されている）は最初にＸｂａＩのような制限酵素を使用して線状化される。ＸｂａＩを用いた典型的な制限酵素消化は下記を含んでなることになる：プラスミドを１．０μｇ；１０×バッファーを１．０μｌ；ＸｂａＩを１．５μｌ；ｄＨ２Ｏで１０μｌとし；３７℃で１時間インキュベートする。実験室規模（＜５μｇ）で実施する場合、反応物は、インビトロジェンのＰＵＲＥＬＩＮＫ（商標）ＰＣＲ Ｍｉｃｒｏキット（米国カリフォルニア州カールスバード）を使用して製造業者の指示書により精製される。より大規模な精製には、インビトロジェンの標準的なＰＵＲＥＬＩＮＫ（商標）ＰＣＲキット（米国カリフォルニア州カールスバード）のような、より大きな装荷能力を有する製品を用いて行われる必要があるかもしれない。精製に続いて、線状化されたベクターの量はＮａｎｏＤｒｏｐ（商標）を使用して定量され、線状化を確認するためにアガロースゲル電気泳動法を使用して解析される。
Ｂ． 修飾ｍＲＮＡのアガロースゲル電気泳動
個々の修飾ｍＲＮＡ（２０μｌ体積中に２００〜４００ｎｇ）は、１．２％の非変性アガロースＥ‐Ｇｅｌ（登録商標）（インビトロジェン、米国カリフォルニア州カールスバード）のウェルに装荷され、製造業者のプロトコールに従って１２〜１５分間泳動せしめられる。
Ｃ． ＲＴ‐ＰＣＲ生成物のアガロースゲル電気泳動
個々の逆転写ＰＣＲ生成物（２００〜４００ｎｇ）は１．２％の非変性アガロースＥ‐Ｇｅｌ（インビトロジェン、米国カリフォルニア州カールスバード）のウェルに装荷され、製造業者のプロトコールに従って１２〜１５分間泳動せしめられる。
Ｄ． Ｎａｎｏｄｒｏｐによる修飾ｍＲＮＡの定量およびＵＶスペクトルデータ
ＴＥバッファー（１μｌ）中の修飾ｍＲＮＡが、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応からの各修飾ｍＲＮＡの収量を定量するためにＮａｎｏｄｒｏｐのＵＶ吸光度の読み取りに使用される（ＵＶ吸光度のトレースは示されない）。
実施例２． 修飾ｍＲＮＡのトランスフェクション
Ａ． リバーストランスフェクション
２４ウェルのコラーゲンコーティングされた組織培養プレートで行なわれる実験については、ケラチノサイトは１×１０５の細胞密度で播種される。９６ウェルのコラーゲンコーティングされた組織培養プレートで行なわれる実験については、ケラチノサイトは０．５×１０５の細胞密度で播種される。トランスフェクションされるべき各修飾ｍＲＮＡについて、修飾ｍＲＮＡ：ＲＮＡＩＭＡＸ（商標）は記載のように調製され、細胞が組織培養プレートに付着してしまう前の細胞の播種から６時間以内にマルチウェルプレート中の細胞と混合せしめられる。
Ｂ． フォワードトランスフェクション
２４ウェルのコラーゲンコーティングされた組織培養プレートでは、ケラチノサイトは０．７×１０５の細胞密度で播種される。９６ウェルのコラーゲンコーティングされた組織培養プレートで行なわれる実験については、ケラチノサイトは０．３×１０５の細胞密度で播種される。その後、ケラチノサイトは＞７０％コンフルエントになるまで２４時間以上成長せしめられる。トランスフェクションされるべき各修飾ｍＲＮＡについて、修飾ｍＲＮＡ：ＲＮＡＩＭＡＸ（商標）は記載のように調製され、細胞の播種および組織培養プレートへの付着から２４時間以上経た後のマルチウェルプレート中の細胞についてトランスフェクションされる。
Ｃ． 修飾ｍＲＮＡの翻訳スクリーニング：Ｇ‐ＣＳＦ ＥＬＩＳＡ
ケラチノサイトは、インビトロジェン製のサプリメントＳ７（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ Ｓ７）を含んだＥｐｉＬｉｆｅ培地で＞７０％コンフルエントに成長せしめられる。ケラチノサイトは、インビトロジェンのＲＮＡＩＭＡＸ（商標）と複合体化された表示の化学修飾ｍＲＮＡを３００ｎｇ用いてリバーストランスフェクションされる。別例として、ケラチノサイトは、インビトロジェンのＲＮＡＩＭＡＸ（商標）と複合体化された修飾ｍＲＮＡを３００ｎｇ用いてフォワードトランスフェクションされる。ＲＮＡ：ＲＮＡＩＭＡＸ（商標）複合体は、最初に、サプリメントを含まないＥＰＩＬＩＦＥ（登録商標）培地とともにＲＮＡを容積で５×希釈として室温で１０分間インキュベートすることにより、形成される。
別のバイアルにおいて、ＲＮＡＩＭＡＸ（商標）試薬は、サプリメントを含まないＥＰＩＬＩＦＥ（登録商標）培地とともに容積で１０×希釈として室温で１０分間インキュベートされる。その後、ＲＮＡのバイアルはＲＮＡＩＭＡＸ（商標）のバイアルと混合せしめられ、室温で２０〜３０インキュベートされてから細胞に一滴ずつ添加される。培地中の分泌ｈｕＧ‐ＣＳＦ濃度は、トランスフェクション後１８時間においてそれぞれの化学修飾ｍＲＮＡについて３連として測定される。トランスフェクションされたヒトのケラチノサイトからのヒト顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ‐ＣＳＦ）の分泌は、インビトロジェンまたはアール・アンド・ディー・システムズ（Ｒ ａｎｄ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、米国ミネソタ州ミネアポリス）のＥＬＩＳＡキットを使用して、製造業者の推奨する指示書に従って定量される。
Ｄ． 修飾ｍＲＮＡの用量および持続期間：Ｇ‐ＣＳＦ ＥＬＩＳＡ
ケラチノサイトは、インビトロジェン製のサプリメントＳ７を含んだＥＰＩＬＩＦＥ（登録商標）培地で＞７０％コンフルエントに成長せしめられる。ケラチノサイトは、０ｎｇ、４６．８７５ｎｇ、９３．７５ｎｇ、１８７．５ｎｇ、３７５ｎｇ、７５０ｎｇ、または１５００ｎｇの、インビトロジェンのＲＮＡＩＭＡＸ（商標）と複合体化された修飾ｍＲＮＡを用いて、リバーストランスフェクションされる。修飾ｍＲＮＡ：ＲＮＡＩＭＡＸ（商標）複合体は記載されたようにして形成される。培地中の分泌ｈｕＧ‐ＣＳＦ濃度は、トランスフェクション後０、６、１２、２４および４８時間においてそれぞれの修飾ｍＲＮＡの各濃度について３連として測定される。トランスフェクションされたヒトのケラチノサイトからのヒト顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ‐ＣＳＦ）の分泌は、インビトロジェンまたはアール・アンド・ディー・システムズのＥＬＩＳＡキットを使用して、製造業者の推奨する指示書に従って定量される。
実施例３． 修飾核酸に対する細胞の先天性免疫応答：ＩＦＮ‐β ＥＬＩＳＡおよびＴＮＦ‐α ＥＬＩＳＡ
ｉｎ ｖｉｔｒｏでトランスフェクションされたヒトケラチノサイト細胞から分泌されるヒト腫瘍壊死因子‐α（ＴＮＦ‐α）、ヒトインターフェロン‐β（ＩＦＮ‐β）およびヒト顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ‐ＣＳＦ）についての酸素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ）は、細胞の先天性免疫応答の検出に関して試験される。
ケラチノサイトは、ヒトケラチノサイト成長サプリメントを含んだＥＰＩＬＩＦＥ（登録商標）培地において、インビトロジェンのヒドロコルチゾンが存在しない状態で＞７０％コンフルエントに成長せしめられる。ケラチノサイトは、０ｎｇ、９３．７５ｎｇ、１８７．５ｎｇ、３７５ｎｇ、７５０ｎｇ、１５００ｎｇまたは３０００ｎｇの、記載されるようにしてインビトロジェンのＲＮＡＥＩＭＡＸ（商標）と複合体化された表示の化学修飾ｍＲＮＡを用いて、３連でリバーストランスフェクションされる。培地中の分泌されたＴＮＦ‐αは、トランスフェクション後２４時間において、インビトロジェンのＥＬＩＳＡキットを使用して製造業者のプロトコールに従って、それぞれの化学修飾ｍＲＮＡについて測定される。
分泌されたＩＦＮ‐βは、トランスフェクション後２４時間において、インビトロジェンのＥＬＩＳＡキットを使用して製造業者のプロトコールに従って、それぞれの化学修飾ｍＲＮＡについて測定される。分泌されたｈｕ‐Ｇ‐ＣＳＦ濃度は、トランスフェクション後２４時間において、それぞれの化学修飾ｍＲＮＡについて測定される。トランスフェクションされたヒトのケラチノサイトからのヒト顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ‐ＣＳＦ）の分泌は、インビトロジェンまたはアール・アンド・ディー・システムズ（米国ミネソタ州ミネアポリス）のＥＬＩＳＡキットを使用して、製造業者の推奨する指示書に従って定量される。これらのデータは、典型的な１型サイトカインであるＴＮＦ‐αおよびＩＦＮ‐βの測定により、どの修飾ｍＲＮＡが、天然ポリヌクレオチドおよび他の化学修飾ポリヌクレオチドまたは標準化合物と比較して細胞の先天性免疫応答の低減を導き出すことができるかを示す。
実施例４． ヒト顆粒球コロニー刺激因子の修飾ｍＲＮＡで誘導された細胞増殖反応の測定
ヒトケラチノサイトは、２４ウェルのコラーゲンコーティングされたＴＲＡＮＳＷＥＬＬ（登録商標）（コーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ）、米国マサチューセッツ州ローウェル）共培養組織培養プレートで、インビトロジェンのサプリメントＳ７を備えたＥＰＩＬＩＦＥ（登録商標）培地において、＞７０％コンフルエントに成長せしめられる。ケラチノサイトは、７５０ｎｇの、記載されるようにしてインビトロジェンのＲＮＡＩＭＡＸ（商標）と複合体化された表示の化学修飾ｍＲＮＡを用いて、３連でリバーストランスフェクションされる。修飾ｍＲＮＡ：ＲＮＡＩＭＡＸ（商標）の複合体は記載されたようにして形成される。ケラチノサイト培地はトランスフェクション後６〜８時間で交換される。トランスフェクション後４２時間に、孔径０．４μｍの半浸透性ポリエステルメンブレンを備えた２４ウェルＴＲＡＮＳＷＥＬＬ（Ｒ）プレートインサートが、ｈｕ‐Ｇ‐ＣＳＦの修飾ｍＲＮＡでトランスフェクションされたケラチノサイトを含んでいる培養プレート内に設置された。
ヒト骨髄芽球細胞であるＫａｓｕｍｉ‐１細胞またはＫＧ‐１（細胞数０．２×１０５個）が該インサートウェル内に播種され、細胞増殖は、共培養開始後４２時間で、９６ウェルプレートにおいて体積１００〜１２０μｌで、ＣｙＱｕａｎｔ（登録商標）直接細胞増殖アッセイ（Ｄｉｒｅｃｔ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ）（インビトロジェン）を使用して定量化された。ｈｕ‐Ｇ‐ＣＳＦをコードする修飾ｍＲＮＡで誘導された骨髄芽球細胞の増殖は、トランスフェクションされていないケラチノサイト／骨髄芽球の共培養対照ウェルに対して標準化された細胞増殖率（％）として表される。ケラチノサイトおよび骨髄芽球両方のインサート共培養ウェルにおける分泌ｈｕ‐Ｇ‐ＣＳＦ濃度は、共培養開始後４２時間で、２連で各修飾ｍＲＮＡについて測定される。ヒト顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ‐ＣＳＦ）の分泌は、インビトロジェンのＥＬＩＳＡキットを使用して、製造業者の推奨する指示書に従って定量される。
ヒトのケラチノサイトのフィーダー細胞およびトランスフェクションされていないヒト骨髄芽球細胞における、トランスフェクションされたｈｕ‐Ｇ‐ＣＳＦ修飾ｍＲＮＡがＲＴ‐ＰＣＲによって検出される。試料細胞からの全ＲＮＡは、ＲＮＡＥＡＳＹ（登録商標）キット（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）、米国カリフォルニア州バレンシア）を使用して製造業者の指示書に従って抽出および溶解される。抽出された全ＲＮＡは、ＰＲＯＴＯＳＣＲＩＰＴ（登録商標）Ｍ‐ＭｕＬＶ Ｔａｑ ＲＴ‐ＰＣＲキット（ニュー・イングランド・バイオラボ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）米国マサチューセッツ州イプスウィッチ）を使用して、製造業者の指示書に従い、ｈｕ‐Ｇ‐ＣＳＦ特異的プライマーを用いて、修飾ｍＲＮＡ‐Ｇ‐ＣＳＦの特異的増幅についてのＲＴ‐ＰＣＲに供される。ＲＴ‐ＰＣＲ生成物は１．２％アガロースゲル電気泳動によって視覚化される。
実施例５． 細胞毒性およびアポトーシス
この実験は、異なる修飾ｍＲＮＡでｉｎ ｖｉｔｒｏトランスフェクションされたヒトケラチノサイト細胞についての、細胞生存率、細胞毒性（ｃｙｔｏｔｏｘｉｔｙ）およびアポトーシスを実証する。ケラチノサイトは、ヒトケラチノサイト増殖サプリメントを含んだＥＰＩＬＩＦＥ（登録商標）培地において、インビトロジェンのヒドロコルチゾンの非存在下で＞７０％コンフルエントに成長せしめられる。ケラチノサイトは、０ｎｇ、４６．８７５ｎｇ、９３．７５ｎｇ、１８７．５ｎｇ、３７５ｎｇ、７５０ｎｇ、１５００ｎｇ、３０００ｎｇ、または６０００ｎｇの、インビトロジェンのＲＮＡＩＭＡＸ（商標）と複合体化された修飾ｍＲＮＡを用いてリバーストランスフェクションされる。修飾ｍＲＮＡ：ＲＮＡＩＭＡＸ（商標）の複合体が形成される。培地中の分泌ｈｕＧ‐ＣＳＦ濃度は、トランスフェクション後０、６、１２、２４および４８時間においてそれぞれの修飾ｍＲＮＡの各濃度について３連として測定される。トランスフェクションされたヒトのケラチノサイトからのヒト顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ‐ＣＳＦ）の分泌は、インビトロジェンまたはアール・アンド・ディー・システムズのＥＬＩＳＡキットを使用して、製造業者の推奨する指示書に従って定量される。細胞生存率、細胞毒性およびアポトーシスは、トランスフェクション後０、１２、４８、９６、および１９２時間において、プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ、米国ウィスコンシン州マディソン）のＡＰＯＴＯＸ‐ＧＬＯ（商標）キットを使用して製造業者の指示書に従って測定される。
実施例６． 共培養環境
ヒト顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ‐ＣＳＦ）をコードする化学的に異なる修飾ヌクレオチドで構成された修飾ｍＲＮＡは、共培養環境においてトランスフェクション能力のない細胞の細胞増殖を刺激する可能性がある。該共培養物は、ヒトケラチノサイトのようなトランスフェクション能力の高い種類の細胞と、白血球（ＷＢＣ）のようなトランスフェクション能力のない種類の細胞とを含む。Ｇ‐ＣＳＦをコードする修飾ｍＲＮＡは、トランスフェクション能力の高い細胞にトランスフェクションされて細胞外環境へのＧ‐ＣＳＦタンパク質の産生および分泌を可能とし、該細胞外環境においてＧ‐ＣＳＦはパラクリン様の方式で作用してＧ‐ＣＳＦレセプターを発現する白血球が増殖するように刺激する。増殖したＷＢＣ集団は、免疫力が低下した患者を治療するために、または、免疫抑制患者のＷＢＣ集団を部分的に再構成し、その結果日和見感染のリスクを低減するために、使用されうる。
別の例では、繊維芽細胞のようなトランスフェクション能力の高い細胞が、トランスフェクション能力に乏しい胚性幹細胞または人工多能性幹細胞の成長、維持、または分化を支援かつシミュレート（ｓｉｍｕｌａｔｅ）するある種の成長因子でトランスフェクションされる。
実施例７． 修飾核酸（修飾ｍＲＮＡ）への５’‐グアノシンキャッピング
Ａ． 材料および方法
クローニング、遺伝子合成およびベクターの塩基配列決定は、ＤＮＡ２．０社（ＤＮＡ２．０ Ｉｎｃ．、米国カリフォルニア州メンローパーク）によって実施された。ＯＲＦは、ＸｂａＩを使用して制限酵素消化され、テール付き（ｔａｉｌｅｄ）またはテール無し（ｔａｉｌ−ｌｅｓｓ）ＰＣＲを用いるｃＤＮＡ合成に使用された。テール付きＰＣＲのｃＤＮＡ生成物は、それぞれ２５ｍＭの修飾ヌクレオチド混合物（修飾ヌクレオチドはすべて米国カリフォルニア州サンディエゴのトリリンク・バイオテク（ＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈ）からカスタム合成または購入され、ただし例外としてピロロ‐Ｃ三リン酸は米国バージニア州スターリングのグレン・リサーチ（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）から購入され；非修飾ヌクレオチドは米国ウィスコンシン州マディソンのエピセンター・バイオテクノロジー（Ｅｐｉｃｅｎｔｅｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）から購入された）およびＣｅｌｌＳｃｒｉｐｔ（商標）ＭＥＧＡＳＣＲＩＰＴ（商標）（エピセンター・バイオテクノロジー、米国ウィスコンシン州マディソン）完全ｍＲＮＡ合成キットを使用する修飾ｍＲＮＡの合成反応のための、テンプレートとして使用された。ｉｎ ｖｉｔｒｏの転写反応は３７℃で４時間実行された。アデノシンアナログ体を組み入れている修飾ｍＲＮＡは、酵母ポリ（Ａ）ポリメラーゼ（アフィメトリックス（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）、米国カリフォルニア州サンタクララ）を使用してポリ（Ａ）テールが付された。ＰＣＲ反応には、ＨｉＦｉ ＰＣＲ ２×ＭＡＳＴＥＲ ＭＩＸ（商標）（カパ・バイオシステムズ（Ｋａｐａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、米国マサチューセッツ州ウォーバーン）が使用された。修飾ｍＲＮＡは、組換えワクシニアウイルスキャッピング酵素（ニュー・イングランド・バイオラボ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）、米国マサチューセッツ州イプスウィッチ）および組換え２’‐ｏ‐メチルトランスフェラーゼ（エピセンター・バイオテクノロジー、米国ウィスコンシン州マディソン）を使用して転写後にキャッピングされ、５’‐グアノシンＣａｐ１構造が生成された。１または複数のキャップ２構造が、さらなる２’‐ｏ‐メチルトランスフェラーゼを使用して生成されてもよい。ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写された該ｍＲＮＡ生成物は、アガロースゲルで泳動かつ視覚化された。修飾ｍＲＮＡは、アンビオン／アプライド・バイオシステムズ（Ａｍｂｉｏｎ／Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、米国テキサス州オースティン）のＭＥＧＡＣｌｅａｒ ＲＮＡ（商標）精製キットで精製された。ＰＣＲにはＰＵＲＥＬＩＮＫ（商標）ＰＣＲ精製キット（インビトロジェン、米国カリフォルニア州カールスバード）が使用された。生成物はＮＡＮＯＤＲＯＰ（商標）ＵＶ吸光度計（ＵＶ Ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ）（サーモフィッシャー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、米国マサチューセッツ州ウォルサム）で定量された。生成物の品質、ＵＶ吸光度品質（ＵＶ ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ ｑｕａｌｉｔｙ）および視覚化は１．２％アガロースゲル上で実施された。生成物はＴＥバッファー中に再懸濁された。
Ｂ． ５’キャッピング修飾核酸（ｍＲＮＡ）の構造
修飾ｍＲＮＡの５’キャッピングは、５’‐グアノシンキャップ構造を生成するための以下の化学的ＲＮＡキャップアナログ：３’‐Ｏ‐Ｍｅ‐ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ（ＡＲＣＡキャップ）；Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａ；Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ；ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａ；ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ（ニュー・イングランド・バイオラボ、米国マサチューセッツ州イプスウィッチ）を使用して、製造業者のプロトコールに従ってｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応の際に付随的に完成されてもよい。修飾ｍＲＮＡの５’キャッピングは、「キャップ０」構造すなわち：ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ（ニュー・イングランド・バイオラボ、米国マサチューセッツ州イプスウィッチ）を生成するためのワクシニアウイルスキャッピング酵素を使用して転写後に完成されてもよい。キャップ１構造は、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ‐２’‐Ｏ‐メチルを生成するためにワクシニアウイルスキャッピング酵素および２’‐Ｏメチルトランスフェラーゼの両方を使用して生成されうる。キャップ２構造は、キャップ１構造から、その後の２’‐Ｏメチルトランスフェラーゼを使用した５’‐末端から３番目のヌクレオチドの２’‐ｏ‐メチル化により生成されうる。キャップ３構造は、キャップ２構造から、その後の２’−Ｏメチルトランスフェラーゼを使用した５’‐末端から４番目のヌクレオチドの２’‐ｏ‐メチル化により生成されうる。酵素は、組換え体供給源に由来することが好ましい。
哺乳動物細胞にトランスフェクションされた時、該修飾ｍＲＮＡは、１２〜１８時間または１８時間を超える、例えば２４、３６、４８、６０、７２、もしくは７２時間を超える、安定性を有する。
実施例８． Ｎ４‐メチルシチジン（化合物１）およびＮ４‐メチルＣＴＰ（前記化合物のＮＴＰ）の合成

ウリジンはシリル化されてトリシリル化化合物が提供され、該化合物はカラムにより精製され、無水条件下にて再蒸留ＰＯＣｌ３／トリアゾールで活性化され、次いで４０％メチルアミン水溶液を用いた求核置換が行われた。このようにＮ４‐メチル‐２’，３’，５’‐トリ‐Ｏ‐ＴＢＤＭＳ‐シチジンがクロマトグラフィ精製の後に得られた。該生成物はＴＢＡＦで脱保護され、次いでエタノール‐酢酸エチル（３：１）溶剤系で精製されて化合物１が得られた。最終生産物の特徴解析が行われ、ＮＭＲ（ＤＭＳＯ中）；ＭＳ：２５８（Ｍ＋Ｈ）＋、２８０（Ｍ＋Ｎａ）＋、および２９６（Ｍ＋Ｋ）＋；ならびにＨＰＬＣ：純度、９９．３５％であった（図１Ａ〜１Ｄ）。ＨＰＬＣ、純度９８％（図２）。
実施例９． ２’‐ＯＭｅ‐Ｎ，Ｎ‐ジ‐Ｍｅ‐シチジン（化合物２）および２’‐ＯＭｅ‐Ｎ，Ｎ‐ジ‐Ｍｅ‐ＣＴＰ（前記化合物のＮＴＰ）の合成

２’‐Ｏ‐メチルウリジンはシリル化されてジシリル化化合物が得られた。精製された２’‐Ｏ‐メチル‐３’，５’‐ジ‐Ｏ‐ＴＢＤＭＳウリジンは無水条件下にて再蒸留ＰＯＣｌ３およびイミダゾールを用いて活性化され、その後、ＨＣｌを捕捉するためのトリエチルアミン環境下にてジメチルアミン塩酸塩を用いた求核置換が行われた。中間化合物Ｎ４，Ｎ４，２’‐トリ‐Ｏ‐メチル‐３’，５’‐ビス‐Ｏ‐ＴＢＤＭＳウリジンはフラッシュクロマトグラフィによって精製され、白色の泡状物として得られた。得られた化合物はＴＢＡＦで脱保護され、次いで精製されて、〜４００ｍｇの最終生成物である化合物２が白色の泡状物として提供された。ＥＳ ＭＳ：ｍ／ｚ ３０８（Ｍ＋Ｎａ）＋、３８６（Ｍ＋Ｈ）＋；ＨＰＬＣ：純度、９９．４９％（図３Ａ〜３Ｃ）。
対応するＮＴＰを合成するために、７０ｍｇのヌクレオシド化合物２から、イオン交換カラムおよび逆相カラムによる精製の後に２３ｍｇの２’‐ＯＭｅ‐Ｎ，Ｎ‐ジ‐Ｍｅ‐ＣＴＰが提供された。ＨＰＬＣ：純度、９５％（図４）。
実施例１０． ５‐メトキシカルボニルメトキシウリジン（化合物３）および５‐メトキシカルボニルメトキシ‐ＵＴＰ（前記化合物のＮＴＰ）の合成

ウリジン３‐ａの水溶液は過剰量の臭素で処理され、次いで臭素を除去するために空気で洗い流された。該反応混合物は制御された速度および温度にてピリジンで処理された。該反応中、不安定な臭素中間物３‐ｂは徐々にジヒドロキシル中間物３‐ｃへと変換し、３‐ｃは恐らく脱水されて安定な５‐ヒドロキシウリジン３‐ｄとなった。その後、その５‐ヒドロキシウリジンは２’，３’‐イソプロピリデン基で保護されて化合物３ｇが提供された。化合物３‐ｆとの反応により化合物３が提供された。
６０〜７０ｍｇの該ヌクレオシドから、２回のＨＰＬＣカラム精製および２回の凍結乾燥ステップを経て、＞２１ｍｇの所望の三リン酸塩が得られた。ＨＰＬＣ：純度、９８％（図５）。
実施例１１． ３‐メチルプソイドウリジン（化合物４）および３‐メチルプソイド‐ＵＴＰ（前記化合物のＮＴＰ）の合成

プソイドウリジン４‐ａはＡｃ２Ｏと反応せしめられ、アセチルで保護されたプソイドウリジン４‐ｂが得られた。次いで、Ｎ１がＰＯＭで選択的に防護されて化合物４‐ｃが得られた。Ｎ３のメチル化、その後の脱保護から、化合物４（〜４００ｍｇ）が得られた。分子式：Ｃ１０Ｈ１４Ｎ２Ｏ６、分子量：２５８．２３ｇ／ｍｏｌ；外観：白色固形物；保存条件：２５℃で保存；ＨＰＬＣ：純度、９８．５１％；１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ‐ｄ６）：δ１１．１７（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝３．０Ｈｚ）、７．５６（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝３．６Ｈｚ）、４．９１（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝３．６Ｈｚ）、４．７９（ｔ、１Ｈ、Ｊ＝４．２Ｈｚ）、４．７０（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝４．２Ｈｚ）、４．４９（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝３．０Ｈｚ）、３．８２‐３．８８（ｍ、２Ｈ）、３．６６‐３．６７（ｍ、１Ｈ）、３．５７‐３．６１（ｍ、１Ｈ）、３．４０‐３．４７（ｍ、１Ｈ）、３．０９（ｓ、３Ｈ）；ＭＳ：２８１（Ｍ＋Ｎａ）＋）（図６Ａおよび６Ｂ）。
化合物４を得るために代替経路を適用することも考えられる。例えば、プソイドウリジンはＯ‐保護基（例えば、ＴＭＳのような本明細書中に記載されたもの）と反応せしめられ、かつＮ‐保護基（例えば、Ｎ１のアセチルのような本明細書中に記載されたもの）と反応せしめられることも考えられる。その後、核酸塩基のＮ３がアルキル化剤（例えば、ジメチルアミン／ジメトキシメチル）と反応せしめられて、Ｎ‐保護基およびＯ‐保護基を有する化合物４が提供されてもよい。最後に、得られた化合物は脱保護されて（例えば、ＮＨ３／ＭｅＯＨのような塩基性条件下）、化合物４が得られることになろう。
実施例１２． Ｎ‐Ａｃ，５‐Ａｃ‐ＯＣＨ２シチジン（化合物５）の合成

ウリジン５‐ａは保護されてイソプロピリデン化合物５‐ｂが得られ、化合物５‐ｂは（ＣＨＣＯ）ｎと反応せしめられた。酢酸が触媒量のＴＦＡとともに使用されて、所望の選択的にアシル化された化合物５‐ｆが得られた（収率３０％）。５’‐ＯＨ基のさらなるトリチル化により、所望の直交保護された化合物５‐ｇが得られた。
化合物５‐ｇはＰＯＣｌ３およびトリアゾールで処理されて、脱アシル化化合物５‐ｉとともに化合物５‐ｈが得られた。これらの２つの化合物のアセチル化により、完全に保護されたジアシル化化合物５‐ｊが得られた。加熱条件下での酢酸を用いた化合物５‐ｊの脱保護から３つの生成物が得られ、そのうちの１つは化合物５であった。
対応するＮＴＰを得るために、三リン酸反応（ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ）を行なうことができる（例えば本明細書中に記載される任意のもの）。任意選択で、該ＮＴＰは精製され（例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）ＤＥＡＥ‐Ａ２５カラムを使用）、凍結乾燥され、または蒸発乾固（例えばＥｔＯＨから）されてもよい。
出発物質としてシチジンから始めるなど、化合物５を得るために代替経路を適用することも考えられる。そのような方法では、５位は、ハロゲンまたはハロゲン化剤（例えば、Ｉ２／メタクロロペルオキシ安息香酸などの本明細書中に記載された任意のもの）と反応せしめられることも考えられ、該ハロゲンまたはハロゲン化剤はアルキル化剤に置き換えることも可能である。さらに、そのような方法は、シチジンのアミノ基および糖部分のヒドロキシル基のうち少なくともいずれかを保護するために、１つ以上のＮ‐保護基またはＯ‐保護基（例えば、シリル化またはアセチル化のような、本明細書中に記載された任意のもの）を使用することを含むことも考えられる。
実施例１３． ５‐ＴＢＤＭＳ‐ＯＣＨ２‐シチジン（化合物６）の合成

５‐ヒドロキシウラシル化合物’‐ｂはグリコシル化されて化合物６’‐ｄが得られ（収率２８％）、化合物６’‐ｄはシリル化されて化合物６’‐ｅが得られた。保護されたウリジンの活性化により、さらなるアミノ化および脱保護の後に所望の化合物６が得られた（８００ｍｇの最終化合物）。分子式：Ｃ１６Ｈ２９Ｎ３Ｏ６Ｓｉ；分子量：３８７．５０ｇ／ｍｏｌ；外観：白色固形物；保存条件：２５℃で保存；ＨＰＬＣ：純度、９７．５７％；１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：ｄ ７．８１（ｓ、１Ｈ）、７．４０（ｂｓ、１Ｈ）、６．４９（ｂｓ、１Ｈ）、５．７９（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝２．４Ｈｚ）、５．３−５．３２（ｍ、１Ｈ）、５．００−５．０７（ｍ、２Ｈ）、４．３０−４．４５（ｍ、２Ｈ）、３．９０−３．９４（ｍ、２Ｈ）、３．８０−３．８３（ｍ、１Ｈ）、３．５０−３．７０（ｍ、２Ｈ）、０．８７（ｓ、９Ｈ）、０．０５（Ｓ、６Ｈ）；ＭＳ：３８８（Ｍ＋Ｈ）＋、４１０（Ｍ＋Ｎａ）＋）（図７Ａ〜７Ｃ）。
対応するＮＴＰを得るために、三リン酸反応を行なうことができる（例えば本明細書中に記載される任意のもの）。任意選択で、該ＮＴＰは精製され（例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＤＥＡＥ‐Ａ２５カラムを使用）、凍結乾燥され、または蒸発乾固（例えばＥｔＯＨから）されてもよい。
実施例１４． ５‐トリフルオロメチルシチジン（化合物７）の合成

化合物７‐Ａはグリコシル化されて化合物７‐Ｂが得られ、化合物７‐Ｂは２，４，６‐トリイソプロピルベンゼンスルホニルクロリド（ＴＰＳＣｌ）で処理されて、カルボニル基が活性化され、かつ還元的アミノ化が促進された。脱保護により化合物７が得られた。ＴＰＳＣｌの代わりに、２，４，６‐トリメチルベンゼンスルホニルクロリドのような代替活性化剤を使用することも考えられる。
対応するＮＴＰを得るために、三リン酸反応を行なうことができる（例えば本明細書中に記載される任意のもの）。任意選択で、該ＮＴＰは精製され（例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＤＥＡＥ‐Ａ２５カラムを使用）、凍結乾燥され、または蒸発乾固（例えばＥｔＯＨから）されてもよい。
実施例１５． ５‐トリフルオロメチルウリジン（化合物８）の合成

５‐トリフルオロメチルウラシル８‐Ａはテトラ‐Ｏ‐アセチルリボースを用いてグリコシル化され、所望の三官能基保護型の５‐トリフルオロメチルウリジン８‐Ｂが好収率で得られた。さらなる脱保護により所望の化合物８が得られ、ＮＭＲ、ＭＳおよびＨＰＬＣの結果で特徴解析がなされた。ＭＳ：３１３（Ｍ＋Ｈ）＋、３３５（Ｍ＋Ｎａ）＋；
ＨＰＬＣ：純度、９８．８７％、（図８Ａ〜８Ｃ）。
対応するＮＴＰを得るために、三リン酸反応を行なうことができる（例えば本明細書中に記載される任意のもの）。任意選択で、該ＮＴＰは精製され（例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＤＥＡＥ‐Ａ２５カラムを使用）、凍結乾燥され、または蒸発乾固（例えばＥｔＯＨから）されてもよい。
実施例１６． ５‐（メトキシカルボニル）メチルウリジン（化合物９）の合成

ウリジン９‐ａは保護されて化合物９‐ｂが得られた（収率９８％）。この化合物は、無水酢酸および酢酸の存在下で過剰量の臭素を用いて臭素化された。５‐ブロモアナログ体９‐ｃが得られ（収率６０％）、さらにベンゾイル化されて所望の化合物９‐ｄが得られた（収率６４％）。５‐ブロモ化合物９‐ｄは塩基性条件下でマロン酸ジメチルとともに縮合され、アリール化されたマロナートおよび完全に保護されたジエステル９‐ｅが得られた（収率５０％）。脱カルボキシル化および脱保護の後、化合物９が得られてＮＭＲにより確認された（図９）。
対応するＮＴＰを得るために、三リン酸反応を行なうことができる（例えば本明細書中に記載される任意のもの）。任意選択で、該ＮＴＰは精製され（例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＤＥＡＥ‐Ａ２５カラムを使用）、凍結乾燥され、または蒸発乾固（例えばＥｔＯＨから）されてもよい。
実施例１７． ５‐（メトキシカルボニル）メチル‐２’‐Ｏ‐メチルウリジン（２‐ＯＭｅ‐ＭＣＭ５Ｕ）（化合物１０）の合成

上記の化合物９の合成と同様の方策で、２’‐Ｏ‐メチルウリジン１０‐ａはアシル化および臭素化されて化合物１０‐ｃが得られた。さらなるベンゾイル化により５‐ブロモアナログ体１０‐ｄが得られ、これはマロン酸ジメチルとともに縮合されて所望の生成物１０‐ｅが得られた（収率４５％）。脱カルボキシル化および脱保護により化合物１０が得られた。
対応するＮＴＰを得るために、三リン酸反応を行なうことができる（例えば本明細書中に記載される任意のもの）。任意選択で、該ＮＴＰは精製され（例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＤＥＡＥ‐Ａ２５カラムを使用）、凍結乾燥され、または蒸発乾固（例えばＥｔＯＨから）されてもよい。
実施例１８． ５‐トリフルオロアセチル‐アミノメチル‐２‐チオウリジン（化合物１１）の合成

２‐チオウラシル１１‐ａのグリコシル化によって化合物１１‐ｃが得られ、化合物１１‐ｃは任意の有用な脱保護試薬で脱保護されうる。具体的には、ＬｉＯＨによって所望の生成物１１‐ｄが得られた（収率８０〜９０％）。イソプロピリデン保護により化合物１１‐ｅが得られた（収率９０％）。さらなる５‐ヒドロキシメチル化により化合物１１‐ｆが得られた。塩素化、アジ化、およびさらなる還元によってメチルアミン化合物１１‐ｉが得られ、該化合物はアセチル化されて提示の化合物１１となされた。
対応するＮＴＰを得るために、三リン酸反応を行なうことができる（例えば本明細書中に記載される任意のもの）。任意選択で、該ＮＴＰは精製され（例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＤＥＡＥ‐Ａ２５カラムを使用）、凍結乾燥され、または蒸発乾固（例えばＥｔＯＨから）されてもよい。
実施例１９． ５‐メチルアミノメチル‐２‐ウリジン（化合物１２）の合成

化合物１２は任意の有用な方法によって得ることができる（例えば、上記スキーム（ｉ）および（ｉｉ）を参照）。例えば、化合物１２を提供するために、保護されたウラシルがグリコシル化され、続いてアミノ化されてもよい。追加の保護、脱保護、および活性化ステップが必要に応じて行われてもよい。対応するＮＴＰを得るために、三リン酸反応を行なうことができる（例えば本明細書中に記載される任意のもの）。任意選択で、該ＮＴＰは精製され（例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＤＥＡＥ‐Ａ２５カラムを使用）、凍結乾燥され、または蒸発乾固（例えばＥｔＯＨから）されてもよい。
実施例２０． ５‐ＴＦＡ‐メチルアミノメチル‐２‐ウリジン（化合物１３）の合成

ウリジン１３‐ａはイソプロピリデンで保護されて化合物１３‐ｂが得られ、次いで５‐ヒドロキシメチル化されて化合物１３‐ｃが得られた。塩素化およびその後のアミノ化により化合物１３‐ｅが得られ、化合物１３‐ｅの保護により１３‐ｆを得ることができる。その後の脱保護により化合物１３が得られた。
対応するＮＴＰを得るために、三リン酸反応を行なうことができる（例えば本明細書中に記載される任意のもの）。任意選択で、該ＮＴＰは精製され（例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＤＥＡＥ‐Ａ２５カラムを使用）、凍結乾燥され、または蒸発乾固（例えばＥｔＯＨから）されてもよい。
実施例２１． ５‐カルボキシメチルアミノメチルウリジン（化合物１４）の合成

ウリジン１４‐ａはイソプロピリデンで保護されて化合物１４‐ｂが得られ、次いでマンニッヒ反応を用いた５‐アミノアルキル化により化合物１４‐ｃが得られた。メチル化により第四級アミン１４‐ｄが得られた。その後のアミノ化および脱保護のステップは化合物１４を提供するために使用することができる。対応するＮＴＰを得るために、三リン酸反応を行なうことができる（例えば本明細書中に記載される任意のもの）。任意選択で、該ＮＴＰは精製され（例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＤＥＡＥ‐Ａ２５カラムを使用）、凍結乾燥され、または蒸発乾固（例えばＥｔＯＨから）されてもよい。
実施例２２． ５‐メチルアミノメチル‐２‐ウリジン（化合物１２）および５‐カルボキシメチルアミノメチル‐２‐ウリジン（化合物１４）の代替例による合成

化合物１２および１４について上記に提供された方策に加えて、次の方策も実践されうる。５‐メチルウリジンＡはシリル化されて化合物Ｂが提供されうる。ラジカルモノ臭素化の後、得られた中間臭化物Ｃは、化合物１２および化合物１４のアナログ体の調製に使用されうる。臭化化合物Ｃを続いてアルキルアミノ化して、脱保護によりそれぞれ化合物１４および１２を提供しうる化合物ＤおよびＥを得ることも考えられる。対応するＮＴＰを得るために、三リン酸反応を行なうことができる（例えば本明細書中に記載される任意のもの）。任意選択で、該ＮＴＰは精製され（例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＤＥＡＥ‐Ａ２５カラムを使用）、凍結乾燥され、または蒸発乾固（例えばＥｔＯＨから）されてもよい。
実施例２３． ジメチル‐プソイドウリジン（化合物１５）およびジメチル‐プソイド‐ＵＴＰ（前記化合物のＮＴＰ）の合成

ヌクレオシドは任意の有用な方法によってリン酸化されうる。例えば、上記に示されるように、ヌクレオシドをオキシ塩化リンと反応させ、続いてモノリン酸中間物を用いてビス（トリブチルアンモニウム）ピロリン酸（ＴＢＡＰＰ）で処理することにより三リン酸塩が得られる。
実施例２４． ２’‐Ｃ‐メチルアデノシン（化合物１６）および２’‐Ｃ‐メチルＡＴＰ（前記化合物のＮＴＰ）の合成

約５ｇの化合物１６‐２は、５ｇの化合物１６‐１からデス・マーチン・ペルヨーダン（Ｄｅｓｓ−Ｍａｒｔｉｎ ｐｅｒｉｏｄａｎｅ）反応によって調製された。化合物１６‐２はＭｅＭｇＩ／ＴｉＣｌ４／−７８℃と反応せしめられて化合物１６‐３が得られ、粗製化合物１６‐３（６ｇ）は塩化ベンジルと直接反応せしめられて化合物１６‐４が調製された。核酸塩基との反応および脱保護により化合物１６（０．５６ｇ）が得られた。
実施例２５． ２’‐Ｃ‐メチル‐シチジン異性体（化合物１７および化合物１８）ならびに２’‐Ｃ‐メチルＵＴＰ（前記化合物のＮＴＰ）の合成

約１７．４ｇの化合物１７‐３は２０ｇの化合物１７‐１から調製された。次いで、２’‐酸化およびＭｅＭｇＩを用いたアルキル化により３００ｍｇの化合物１７‐５ａおよび８０ｍｇの化合物１７‐５ｂが得られた。約９ｇの化合物１７‐５ａ（純度約９０％）および２．１ｇの化合物１７‐５ｂ（純粋）が、１７．４ｇの化合物１７‐３から２バッチで調製された。Ｎ‐脱保護およびＯ‐脱保護により化合物１７および１８が得られた。
実施例２６． ２’‐Ｃ‐メチルグアノシン（化合物１９）および２’‐Ｃ‐メチルＧＴＰ（前記化合物のＮＴＰ）の合成

保護されたリボース１９‐１の２’‐酸化およびその後のＭｅＭｇＣｌを用いたアルキル化により、化合物１９‐３が得られた。得られた化合物はさらに保護されて化合物１９‐４が得られ、３．１ｇの化合物１９‐４から１．５６ｇの化合物１９‐５ａが調製された。その後のオイデーション（ｏｉｄａｔｉｏｎ）および脱保護から化合物１９（純度約９０％、５０ｍｇ）が得られた。
対応するＮＴＰを得るために、三リン酸反応を行なうことができる（例えば本明細書中に記載される任意のもの）。任意選択で、該ＮＴＰは精製され（例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＤＥＡＥ‐Ａ２５カラムを使用）、凍結乾燥され、または蒸発乾固（例えばＥｔＯＨから）されてもよい。
実施例２７． ２’‐Ｃ‐メチルウリジン（化合物２０）および２’‐Ｃ‐メチルＵＴＰ（前記化合物のＮＴＰ）の合成

保護されたリボース２０‐１の２’‐酸化およびその後のＭｅＭｇＣｌを用いたアルキル化により、化合物２０‐３が得られた。生じた化合物はさらに保護されて化合物２０‐４が得られた。ウラシルとの反応および脱保護から純粋な化合物２０（５０ｍｇ）が得られた。
対応するＮＴＰを得るために、三リン酸反応を行なうことができる（例えば本明細書中に記載される任意のもの）。任意選択で、該ＮＴＰは精製され（例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＤＥＡＥ‐Ａ２５カラムを使用）、凍結乾燥され、または蒸発乾固（例えばＥｔＯＨから）されてもよい。
実施例２８． （Ｓ）‐２’‐Ｃ‐メチルアデノシン（化合物２１）および（Ｓ）‐２’‐Ｃ‐メチルＡＴＰ（前記化合物のＮＴＰ）の合成

化合物２１‐１（５ｇ）は保護されて化合物２１‐２ａが形成され、クロム酸化により化合物２１‐３ａが得られた。経路［ｉ］を介したアルキル化（エーテル中の５等量（ｅｑ．）のＭｅＭｇＩ、−５０℃）により化合物２１‐４が得られた。任意選択で、アミノ基を保護して化合物２１‐３ｂを得て、次いで２’‐Ｃ位のアルキル化により化合物２１‐４ａを得ることにより、経路［ｉｉ］を介して収率を改善することも考えられる。化合物２１‐３ａはアルキル化されて粗製化合物２１‐４（３ｇ、この粗製生成物中で化合物３ａの２０％）が得られ、該生成物は任意選択で精製されてもよい。化合物２１‐４の脱保護から化合物２１が得られた（収率５０％）。
対応するＮＴＰを得るために、三リン酸反応を行なうことができる（例えば本明細書中に記載される任意のもの）。任意選択で、該ＮＴＰは精製され（例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＤＥＡＥ‐Ａ２５カラムを使用）、凍結乾燥され、または蒸発乾固（例えばＥｔＯＨから）されてもよい。
実施例２９． （Ｓ）‐２’‐Ｃ‐メチルグアノシン（化合物２２）および（Ｓ）‐２’‐メチルＧＴＰ（前記化合物のＮＴＰ）の合成

約３０ｇの化合物２２‐１はシリル化されて３ステップで化合物２２‐２が得られた。さらなる保護により化合物２２‐３が得られ、デス・マーチン・ペルヨーダン（Ｄｅｓｓ−Ｍａｒｔｉｎ ｐｅｒｉｏｄａｎｅ）酸化により２バッチの化合物２２‐４（１．６ｇ）が得られた。２’‐Ｃアルキル化（エーテル中の５等量のＭｅＭｇＩ、−５０℃〜ＲＴ）により化合物２２‐５が得られ、さらなる脱保護ステップにより化合物２２が得られた。
対応するＮＴＰを得るために、三リン酸反応を行なうことができる（例えば本明細書中に記載される任意のもの）。任意選択で、該ＮＴＰは精製され（例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＤＥＡＥ‐Ａ２５カラムを使用）、凍結乾燥され、または蒸発乾固（例えばＥｔＯＨから）されてもよい。
実施例３０． （Ｓ）‐２’‐Ｃ‐メチルウリジン（化合物２３）および（Ｓ）‐２’‐Ｃ‐メチルＵＴＰ（前記化合物のＮＴＰ）の合成

ウリジン２３‐１（２．０ｇ）はＴＩＰＤＳＣｌ２（１，３‐ジクロロ‐１，１，３，３‐テトライソプロピルジシロキサン）を用いて保護され、化合物２３‐２が得られた。酸化により化合物２３‐３が得られ、２’‐Ｃアルキル化により化合物２３‐４が得られたが、該化合物は、任意選択で次のステップに先立って分取ＨＰＬＣで精製されてもよい。その後、脱保護により所望の化合物２３が得られた。
対応するＮＴＰを得るために、三リン酸反応を行なうことができる（例えば本明細書中に記載される任意のもの）。任意選択で、該ＮＴＰは精製され（例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＤＥＡＥ‐Ａ２５カラムを使用）、凍結乾燥され、または蒸発乾固（例えばＥｔＯＨから）されてもよい。
実施例３１． ４’‐Ｃ‐メチルアデノシン（化合物２４）および４’‐Ｃ‐メチルＡＴＰ（前記化合物のＮＴＰ）の合成

１，２：５，６‐ジ‐Ｏ‐イソプロピリデン‐α‐Ｄ‐グルコフラノース２４‐１は、連続的な酸化、還元および保護のステップを介して変換され、化合物２４‐４が得られた。化合物２４‐２を提供する第１の酸化ステップは、任意の有用な試薬、例えば０．７５等量の二クロム酸ピリジニウム（ＰＤＣ）を１等量のＡｃ２Ｏまたは１．２等量のデス・マーチン・ペルヨーダン（Ｄｅｓｓ−Ｍａｒｔｉｎ ｐｅｒｉｏｄａｎｅ）とともに用いて実践されうる。その後の脱保護、ホルミル化、および還元により化合物２４‐７が得られ、該化合物は続いて保護および脱酸素のステップが行われて化合物２４‐１０が得られた。約０．４ｇの化合物２４‐１４が、１ｇの化合物２４‐１０から連続する保護および脱保護のステップによって調製された。Ｎ６‐ベンゾイルアデニンの付加およびその後の脱保護により化合物２４が得られた。
対応するＮＴＰを得るために、三リン酸反応を行なうことができる（例えば本明細書中に記載される任意のもの）。任意選択で、該ＮＴＰは精製され（例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＤＥＡＥ‐Ａ２５カラムを使用）、凍結乾燥され、または蒸発乾固（例えばＥｔＯＨから）されてもよい。
実施例３２． ４’‐Ｃ‐メチルシチジン（化合物２５）および４’‐Ｃ‐メチルＣＴＰ（前記化合物のＮＴＰ）の合成

化合物２４について上記に提示された方策と同様に、化合物２５‐１４が化合物２５‐１を用いて生成された。シチジンの付加およびその後の脱保護により化合物２５が得られた。
対応するＮＴＰを得るために、三リン酸反応を行なうことができる（例えば本明細書中に記載される任意のもの）。任意選択で、該ＮＴＰは精製され（例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＤＥＡＥ‐Ａ２５カラムを使用）、凍結乾燥され、または蒸発乾固（例えばＥｔＯＨから）されてもよい。
実施例３３． ４’‐Ｃ‐メチルグアノシン（化合物２６）および４’‐Ｃ‐メチルＧＴＰ（前記化合物のＮＴＰ）の合成

化合物２４について上記に提示された方策と同様に、化合物２６‐１４が化合物２６‐１を用いて生成された。２‐アミノ‐６‐クロロプリンの付加、続いて酸化、およびその後の脱保護により化合物２６が得られた。
対応するＮＴＰを得るために、三リン酸反応を行なうことができる（例えば本明細書中に記載される任意のもの）。任意選択で、該ＮＴＰは精製され（例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＤＥＡＥ‐Ａ２５カラムを使用）、凍結乾燥され、または蒸発乾固（例えばＥｔＯＨから）されてもよい。
実施例３４． ４’‐Ｃ‐メチルウリジン（化合物２７）および４’‐Ｃ‐メチルＵＴＰ（前記化合物のＮＴＰ）の合成

化合物２４について上記に提示された方策と同様に、化合物２７‐１４が化合物２７‐１を用いて生成された。ウラシルの付加およびその後の脱保護により化合物２７が得られた。
対応するＮＴＰを得るために、三リン酸反応を行なうことができる（例えば本明細書中に記載される任意のもの）。任意選択で、該ＮＴＰは精製され（例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＤＥＡＥ‐Ａ２５カラムを使用）、凍結乾燥され、または蒸発乾固（例えばＥｔＯＨから）されてもよい。
実施例３５． ２’‐Ｏ，４’‐Ｃ‐メチレンアデノシン（化合物２８）および２’‐Ｏ，４’‐Ｃ‐メチレンＡＴＰ（前記化合物のＮＴＰ）の合成

化合物２４について上記に提示された方策と同様に、化合物２８‐７が化合物２８‐１を用いて生成された。続くメシル化、脱保護、およびアセチル化により化合物２８‐１０が得られ、該化合物は続いてＮ６‐ベンゾイルアデニンの付加およびその後に分子内環化が行われた。様々な保護および脱保護のステップにより化合物２８が得られた。
実施例３６． ５‐メチル‐２’‐Ｏ，４’‐Ｃ‐メチレンシチジン（化合物２９）および５‐メチル‐２’‐Ｏ，４’‐Ｃ‐メチレンＣＴＰ（前記化合物のＮＴＰ）の合成

アルドフラノース化合物２９‐１は様々な保護ステップを介して反応せしめられ、次いで５‐メチルウラシルが付加されて化合物２９‐５が得られた。続く分子内環化、脱保護、保護、およびアミノ化のステップにより化合物２９が得られた。
実施例３７． ２’‐Ｏ，４’‐Ｃ‐メチレングアノシン（化合物３０）および２’‐Ｏ，４’‐Ｃ‐メチレンＧＴＰ（前記化合物のＮＴＰ）の合成

化合物２９について上記に提示された方策と同様に、アルドフラノース化合物３０‐１は様々な保護ステップを介して反応せしめられ、次いで２‐アミノ‐６‐クロロプリンが付加されて化合物３０‐５が得られた。続く分子内環化、アミノ化、および脱保護のステップにより化合物３０が得られた。
対応するＮＴＰを得るために、三リン酸反応を行なうことができる（例えば本明細書中に記載される任意のもの）。任意選択で、該ＮＴＰは精製され（例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＤＥＡＥ‐Ａ２５カラムを使用）、凍結乾燥され、または蒸発乾固（例えばＥｔＯＨから）されてもよい。
実施例３８． ２’‐Ｏ，４’‐Ｃ‐メチレンウリジン（化合物３１）および２’‐Ｏ，４’‐Ｃ‐メチレンＵＴＰ（前記化合物のＮＴＰ）の合成

化合物２４について上記に提示された方策と同様に、化合物３１‐７が化合物３１‐１を用いて生成された。続くメシル化、脱保護、およびアセチル化により化合物３０‐１０が得られた。ウラシルの付加およびその後の分子内環化により化合物３１‐１２が得られ、様々な保護および脱保護のステップにより化合物３１が得られた。その後の三リン酸反応（例えば本明細書中に記載されたようなもの）により、化合物３１のＮＴＰが得られ、これは任意選択で精製されてもよい（例えばＨＰＬＣを用いる）。
実施例３９． ２’‐クロロアデノシン（化合物３２）および２’‐クロロＡＴＰ（前記化合物のＮＴＰ）の合成

アラビノアデノシン３２‐１はステップ１および２によって保護され、次いで塩素化されて化合物３２‐４が得られた。続く脱保護により化合物３２が得られ、三リン酸反応により化合物３２のＮＴＰが得られた。
実施例４０． ２’‐ヨードアデノシン（化合物３３）および２’‐ヨードＡＴＰ（前記化合物のＮＴＰ）の合成

アラビノアデノシン３３‐１はステップ１および２によって保護され、次いでヨウ素化されて化合物３３‐４が得られた。続く脱保護により化合物３３が得られ、ＤＭＦ中の三リン酸反応により化合物３３のＮＴＰが得られた。
実施例４１． ２’‐ブロモシチジン（化合物３４）および２’‐ブロモＣＴＰ（前記化合物のＮＴＰ）の合成

アラビノシチジン３４‐１は様々な条件下で保護され、次いで臭素化されて化合物３４‐４が得られた。任意選択で、該反応は、化合物３４‐３ａを介して任意の有用な保護反応の下、例えば（ｉ）１．５等量のＥｔ３Ｎ、１等量のＤＭＡＰ、１．２等量のＴｆＣｌ、ＤＣＭ中（１０ｍＬ）；（ｉｉ）３等量のＤＭＡＰ、１．２等量のＴｆＣｌ、ＤＣＭ中（１５ｍＬ）；または（ｉｉｉ）１５等量のＤＭＡＰ、１．５等量のＴｆ２Ｏ、ＤＣＭ中（１５ｍＬ）、−１０℃〜０℃で２時間の反応で化合物３４‐４を提供することもできる。具体的には、５５ｍｇの化合物３４‐３ａが反応条件（ｉｉｉ）から得られた。続く脱保護により化合物３４が得られ、ＤＭＦ中の三リン酸反応により化合物３４のＮＴＰが得られた。粗製生成物３４が任意選択でリン酸化の前に精製されることも考えられる。
実施例４２． ２’‐クロログアノシン（化合物３５）および２’‐クロロＧＴＰ（前記化合物のＮＴＰ）の合成

グアノシン３５‐１は様々な条件下で保護され、次いでアセチル化されて化合物３５‐４が得られた。化合物３５‐２から化合物３５‐３への反応は、２等量のＤＭＡＰ、２等量のＥｔ３Ｎ、３等量のＴｆ２Ｏを用いて１，２‐ジクロロエタン（１０ｍＬ）中にて４０℃で４時間行われた。約５５ｍｇの化合物３５‐３が精製後に得られた。
所望の化合物３５は任意の有用な方法によって得ることができる。例えば、上記に示されるように、化合物３５‐４が連続した保護、塩素化、および脱保護のステップで処理されて化合物３５が得られてもよい。対応するＮＴＰを得るために、三リン酸反応を行なうことができる（例えば本明細書中に記載される任意のもの）。任意選択で、該ＮＴＰは精製され（例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＤＥＡＥ‐Ａ２５カラムを使用）、凍結乾燥され、または蒸発乾固（例えばＥｔＯＨから）されてもよい。
実施例４３． ２’‐ヨードウリジン（化合物３６）および２’‐ヨードＵＴＰ（前記化合物のＮＴＰ）の合成

Ｏ２，２’‐シクロウリジン３６‐１は保護されて化合物３６‐２が得られた。続くヨウ素化（任意選択で、セレンで仲介される）により、化合物３６が得られた。三リン酸反応が行われて化合物３６のＮＴＰが得られた。任意選択で、該ＮＴＰは精製され（例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＤＥＡＥ‐Ａ２５カラムを使用）、凍結乾燥され、または蒸発乾固（例えばＥｔＯＨから）されてもよい。
実施例４４． ２’‐Ｏ，４’‐Ｃ‐メチレンアデノシン（化合物３７）および２’‐Ｏ，４’‐Ｃ‐メチレンＡＴＰ（前記化合物のＮＴＰ）の合成

化合物２４について上記に提示された方策と同様に、化合物３７‐７が化合物３７‐１を用いて生成された。続くメシル化、脱保護、およびアセチル化により化合物３７‐１０が得られた。ウラシルの付加および続く分子内環化により化合物３７‐１２が得られた。様々な保護および脱保護のステップにより化合物３７が得られた。
対応するＮＴＰを得るために、三リン酸反応を行なうことができる（例えば本明細書中に記載される任意のもの）。任意選択で、該ＮＴＰは精製され（例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＤＥＡＥ‐Ａ２５カラムを使用）、凍結乾燥され、または蒸発乾固（例えばＥｔＯＨから）されてもよい。
実施例４５． シクロペンテンジオールシチジン（化合物３８）およびシクロペンテンジオールＣＴＰ（前記化合物のＮＴＰ）の合成

Ｄ‐リボースは保護された後にアリル化されて化合物３８‐４が得られ、該化合物は次に環化および還元されて化合物３８‐７が得られた。オレフィンメタセシスおよびその後の酸化により化合物３８‐９が得られ、さらなる還元反応およびＮ‐ベンゾイルウラシルの付加により化合物３８‐１４が得られた。さらなる脱保護反応および保護反応により化合物３８が得られ、三リン酸反応（例えば、本明細書中、または参照により本願に組込まれる米国特許第７，８９３，２２７号明細書中に記載されたもののような、任意の有用な反応条件を用いる）により、化合物３８のＮＴＰが得られた。
実施例４６． ２’‐メチルウリジン（化合物３９）および２’‐メチルＵＴＰ（前記化合物のＮＴＰ）の合成

ウリジン３９‐１は保護され、次いで２等量のデス・マーチン・ペルヨーダン（Ｄｅｓｓ−Ｍａｒｔｉｎ ｐｅｒｉｏｄａｎｅ）を用いて酸化されて化合物３９‐３が得られた。続くウィッティヒ反応、水素化、および脱保護のステップにより化合物３９が得られた。
実施例４７． ２’‐メチルシチジン（化合物４０）および２’‐メチルＣＴＰ（前記化合物のＮＴＰ）の合成

シチジン４０‐１は保護され、次いで酸化されて化合物４０‐３が得られた。続くウィッティヒ反応、水素化、および脱保護のステップにより化合物４０が得られた。
実施例４８． Ｎ‐アセチルシチジン（化合物４１）およびＮ‐アセチルＣＴＰ（前記化合物のＮＴＰ）の合成

Ｎ‐アセチル‐シチジン（化合物４１）（１０３．０ｍｇ、０．３６ｍｍｏｌ）の溶液は、１．０ｍＬのリン酸トリメチル（ＴＭＰ）および１．０ｍＬの無水テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）に含めたプロトンスポンジ（１１５．７２ｍｇ、０．５４ｍｍｏｌ、１．５０等量）に添加された。該溶液は０℃で１０分間撹拌された。オキシ塩化リン（ＰＯＣｌ３）（６７．２ｕｌ、０．７２ｍｍｏｌ、２．０等量）が該溶液に滴下された後、Ｎ２雰囲気下で２時間撹拌され続けた。２時間後、該溶液は、２．５ｍｌのジメチルホルムアミド中のビストリブチルアンモニウムピロリン酸（ＴＢＡＰＰまたは（ｎ‐Ｂｕ３ＮＨ）２Ｈ２Ｐ２Ｏ７）（１．２８ｇ、２．３４ｍｍｏｌ、６．５等量）およびトリブチルアミン（３５０．０ｕｌ、１．４５ｍｍｏｌ、４．０等量）の混合物と反応せしめられた。およそ１５分後、反応は２４．０ｍｌの０．２Ｍ重炭酸トリエチルアンモニウム（ＴＥＡＢ）で停止され、透明な該溶液は室温で１時間撹拌された。反応混合物は一晩凍結乾燥され、該粗製反応混合物はＨＰＬＣ（日本国京都の島津製作所、フェノメネクス（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）Ｃ１８分取用カラム、２５０×２１．２０ｍｍ、１０．０μｍ（ミクロン）；グラジエント：１００％のＡで３．０分、その後１％Ｂ／分、Ａ＝１００ｍＭ ＴＥＡＢバッファー、Ｂ＝ＡＣＮ；流量：１０．０ｍＬ／分；保持時間：１６．８１〜１７．８０分）によって精製された。所望の化合物を含んでいる画分が集め合わされ、凍結乾燥されて化合物４１のＮＴＰが得られた。三リン酸化反応は、フレームドライ処理された二つ口フラスコ中でＮ２雰囲気下にて行なわれた。ヌクレオシドおよびプロテインスポンジ（ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｐｏｎｇｅ）は、使用前に真空下にて一晩、Ｐ２Ｏ５で脱水された。一リン酸塩の形成はＬＣＭＳによってモニタリングされた。
実施例４９． ５‐メトキシウリジン（化合物４２）および５‐メトキシＵＴＰ（前記化合物のＮＴＰ）の合成

５‐メトキシウリジン（化合物４２）（６９．０ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ、＋可溶化するための熱）の溶液は、０．７ｍＬのリン酸トリメチル（ＴＭＰ）に含めたプロトンスポンジ（８０．３６ｍｇ、０．３７５ｍｍｏｌ、１．５０等量）に添加され、０℃で１０分間撹拌された。オキシ塩化リン（ＰＯＣｌ３）（４６．７ｕｌ、０．５０ｍｍｏｌ、２．０等量）が該溶液に滴下された後、Ｎ２雰囲気下で２時間撹拌され続けた。２時間後、該溶液は、２．０ｍｌのジメチルホルムアミド中のビストリブチルアンモニウムピロリン酸（ＴＢＡＰＰまたは（ｎ‐Ｂｕ３ＮＨ）２Ｈ２Ｐ２Ｏ７）（８９４．６０ｍｇ、１．６３ｍｍｏｌ、６．５０等量）およびトリブチルアミン（２４３．０ｕｌ、１．００ｍｍｏｌ、４．０等量）の混合物と反応せしめられた。およそ１５分後、反応は１７．０ｍｌの０．２Ｍ重炭酸トリエチルアンモニウム（ＴＥＡＢ）で停止され、透明な該溶液は室温で１時間撹拌された。反応混合物は一晩凍結乾燥され、該粗製反応混合物はＨＰＬＣ（日本国京都の島津製作所、フェノメネクスＣ１８分取用カラム、２５０×２１．２０ｍｍ、１０．０μｍ（ミクロン）；グラジエント：１００％のＡで３．０分、その後１％Ｂ／分、Ａ＝１００ｍＭ ＴＥＡＢバッファー、Ｂ＝ＡＣＮ；流量：１０．０ｍＬ／分；保持時間：１６．５７〜１７．５１分）によって精製された。所望の化合物を含んでいる画分が集め合わされ、凍結乾燥されて化合物４２のＮＴＰが得られた。三リン酸化反応は、フレームドライ処理された二つ口フラスコ中でＮ２雰囲気下にて行なわれた。ヌクレオシドおよびプロテインスポンジ（ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｐｏｎｇｅ）は、使用前に真空下にて一晩、Ｐ２Ｏ５で脱水された。一リン酸塩の形成はＬＣＭＳによってモニタリングされた。
実施例５０． ５‐ホルミルシチジン（化合物４３）および５‐ホルミルＣＴＰ（前記化合物のＮＴＰ）の合成

５‐ホルミルシチジン（化合物４３）（４８．４ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ、＋可溶化するための熱）の溶液は、０．７ｍＬのリン酸トリメチル（ＴＭＰ）に含めたプロトンスポンジ（５７．８６ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ、１．５０等量）に添加され、０℃で１０分間撹拌された。オキシ塩化リン（ＰＯＣｌ３）（３３．６ｕｌ、０．３６ｍｍｏｌ、２．０等量）が該溶液に滴下された後、Ｎ２雰囲気下で２時間撹拌され続けた。２時間後、該溶液は、１．７ｍｌのジメチルホルムアミド中のビストリブチルアンモニウムピロリン酸（ＴＢＡＰＰまたは（ｎ‐Ｂｕ３ＮＨ）２Ｈ２Ｐ２Ｏ７）（６４２．０ｍｇ、１．１７ｍｍｏｌ、６．５０等量）およびトリブチルアミン（１７５．０ｕｌ、０．７２ｍｍｏｌ、４．０等量）の混合物と反応せしめられた。およそ１５分後、反応は１２．０ｍｌの０．２Ｍ重炭酸トリエチルアンモニウム（ＴＥＡＢ）で停止され、透明な該溶液は室温で１時間撹拌された。反応混合物は一晩凍結乾燥され、該粗製反応混合物はＨＰＬＣ（日本国京都の島津製作所、フェノメネクスＣ１８分取用カラム、２５０×２１．２０ｍｍ、１０．０μｍ（ミクロン）；グラジエント：１００％のＡで３．０分、その後１％Ｂ／分、Ａ＝１００ｍＭ ＴＥＡＢバッファー、Ｂ＝ＡＣＮ；流量：１０．０ｍＬ／分；保持時間：１７．０４〜１７．８７分）によって精製された。所望の化合物を含んでいる画分が集め合わされ、凍結乾燥されて化合物４３のＮＴＰが得られた。三リン酸化反応は、フレームドライ処理された二つ口フラスコ中でＮ２雰囲気下にて行なわれた。ヌクレオシドおよびプロテインスポンジ（ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｐｏｎｇｅ）は、使用前に真空下にて一晩、Ｐ２Ｏ５で脱水された。一リン酸塩の形成はＬＣＭＳによってモニタリングされた。
実施例５１． ３‐メチルウリジン（化合物４４）および３‐メチルＵＴＰ（前記化合物のＮＴＰ）の合成

３‐メチルウリジン（化合物４４）（４５．８０ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ）の溶液は、０．５ｍＬのリン酸トリメチル（ＴＭＰ）に含めたプロトンスポンジ（５７．８６ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ、１．５０等量）に添加され、０℃で１０分間撹拌された。オキシ塩化リン（ＰＯＣｌ３）（３３．６ｕｌ、０．３６ｍｍｏｌ、２．０等量）が該溶液に滴下された後、Ｎ２雰囲気下で２時間撹拌され続けた。２時間後、該溶液は、１．３ｍｌのジメチルホルムアミド中のビストリブチルアンモニウムピロリン酸（ＴＢＡＰＰまたは（ｎ‐Ｂｕ３ＮＨ）２Ｈ２Ｐ２Ｏ７）（６５２．０ｍｇ、１．１９ｍｍｏｌ、６．６０等量）およびトリブチルアミン（１７５．０ｕｌ、０．７２ｍｍｏｌ、４．０等量）の混合物と反応せしめられた。およそ１５分後、反応は１２．０ｍｌの０．２Ｍ重炭酸トリエチルアンモニウム（ＴＥＡＢ）で停止され、透明な該溶液は室温で１時間撹拌された。反応混合物は一晩凍結乾燥され、該粗製反応混合物はＨＰＬＣ（日本国京都の島津製作所、フェノメネクスＣ１８分取用カラム、２５０×２１．２０ｍｍ、１０．０μｍ（ミクロン）；グラジエント：１００％のＡで３．０分、その後１％Ｂ／分、Ａ＝１００ｍＭ ＴＥＡＢバッファー、Ｂ＝ＡＣＮ；流量：１０．０ｍＬ／分；保持時間：１８．５２〜１９．５７分）によって精製された。所望の化合物を含んでいる画分が集め合わされ、凍結乾燥されて化合物４４のＮＴＰが得られた。三リン酸化反応は、フレームドライ処理された二つ口フラスコ中でＮ２雰囲気下にて行なわれた。ヌクレオシドおよびプロテインスポンジ（ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｐｏｎｇｅ）は、使用前に真空下にて一晩、Ｐ２Ｏ５で脱水された。一リン酸塩の形成はＬＣＭＳによってモニタリングされた。
実施例５２． Ｎ１‐メチルプソイドウリジン（化合物４５）およびＮ１‐メチルプソイドＵＴＰ（前記化合物のＮＴＰ）の合成

Ｎ１‐メチルプソイドウリジン（化合物４５）（９６．６ｍｇ、０．３７４ｍｍｏｌ、＋可溶化するための熱）の溶液は、０．８ｍＬのリン酸トリメチル（ＴＭＰ）に含めたプロトンスポンジ（１２０．０ｍｇ、０．５６ｍｍｏｌ、１．５０等量）に添加され、０℃で１０分間撹拌された。オキシ塩化リン（ＰＯＣｌ３）（７０．０ｕｌ、０．７５ｍｍｏｌ、２．０等量）が該溶液に滴下された後、Ｎ２雰囲気下で２時間撹拌され続けた。２時間後、該溶液は、２．５ｍｌのジメチルホルムアミド中のビストリブチルアンモニウムピロリン酸（ＴＢＡＰＰまたは（ｎ‐Ｂｕ３ＮＨ）２Ｈ２Ｐ２Ｏ７）（１．３６ｇ、２．４７ｍｍｏｌ、６．６０等量）およびトリブチルアミン（３６２．０ｕｌ、１．５ｍｍｏｌ、４．０等量）の混合物と反応せしめられた。およそ１５分後、反応は１７．０ｍｌの０．２Ｍ重炭酸トリエチルアンモニウム（ＴＥＡＢ）で停止され、透明な該溶液は室温で１時間撹拌された。反応混合物は一晩凍結乾燥され、該粗製反応混合物はＨＰＬＣ（日本国京都の島津製作所、フェノメネクスＣ１８分取用カラム、２５０×２１．２０ｍｍ、１０．０μｍ（ミクロン）；グラジエント：１００％のＡで３．０分、その後１％Ｂ／分、Ａ＝１００ｍＭ ＴＥＡＢバッファー、Ｂ＝ＡＣＮ；流量：１０．０ｍＬ／分；保持時間：１５．９１〜１７．０１分）によって精製された。所望の化合物を含んでいる画分が集め合わされて凍結乾燥され、三リン酸化反応に供されて化合物４５のＮＴＰが得られた。三リン酸化反応は、フレームドライ処理された二つ口フラスコ中でＮ２雰囲気下にて行なわれた。ヌクレオシドおよびプロテインスポンジ（ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｐｏｎｇｅ）は、使用前に真空下にて一晩、Ｐ２Ｏ５で脱水された。一リン酸塩の形成はＬＣＭＳによってモニタリングされた。
実施例５３． ５‐メトキシカルボニルエテニルウリジン（化合物４６）および５‐メトキシカルボニルエテニルＵＴＰ（前記化合物のＮＴＰ）の合成

５‐メトキシカルボニルエテニルウリジン（化合物４６）（１０２．０ｍｇ、０．３１ｍｍｏｌ）の溶液は、０．８ｍＬのリン酸トリメチル（ＴＭＰ）に含めたプロトンスポンジ（９９．６５ｍｇ、０．４６ｍｍｏｌ、１．５０等量）に添加され、０℃で１０分間撹拌された。オキシ塩化リン（ＰＯＣｌ３）（５７．８ｕｌ、０．６２ｍｍｏｌ、２．０等量）が該溶液に滴下された後、Ｎ２雰囲気下で２時間撹拌され続けた。２時間後、該溶液は、２．５ｍｌのジメチルホルムアミド中のビストリブチルアンモニウムピロリン酸（ＴＢＡＰＰまたは（ｎ‐Ｂｕ３ＮＨ）２Ｈ２Ｐ２Ｏ７）（１．１２ｇ、２．０５ｍｍｏｌ、６．６０等量）およびトリブチルアミン（３００．０ｕｌ、１．２４ｍｍｏｌ、４．０等量）の混合物と反応せしめられた。およそ１５分後、反応は２０．０ｍｌの０．２Ｍ重炭酸トリエチルアンモニウム（ＴＥＡＢ）で停止され、透明な該溶液は室温で１時間撹拌された。反応混合物は一晩凍結乾燥され、該粗製反応混合物はＨＰＬＣ（日本国京都の島津製作所、フェノメネクスＣ１８分取用カラム、２５０×２１．２０ｍｍ、１０．０μｍ（ミクロン）；グラジエント：１００％のＡで３．０分、その後１％Ｂ／分、Ａ＝１００ｍＭ ＴＥＡＢバッファー、Ｂ＝ＡＣＮ；流量：１０．０ｍＬ／分；保持時間：２１．５６〜２３．２１分）によって精製された。所望の化合物を含んでいる画分が集め合わされ、凍結乾燥されて化合物４６のＮＴＰが得られた。三リン酸化反応は、フレームドライ処理された二つ口フラスコ中でＮ２雰囲気下にて行なわれた。ヌクレオシドおよびプロテインスポンジ（ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｐｏｎｇｅ）は、使用前に真空下にて一晩、Ｐ２Ｏ５で脱水された。一リン酸塩の形成はＬＣＭＳによってモニタリングされた。
実施例５４． ５‐アミノプロペニルウリジン（化合物４７）および５‐アミノプロペニルＵＴＰ（前記化合物のＮＴＰ）の合成

５‐アミノプロペニルウリジン４７は保護され、保護された化合物４７（８６．０ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）の溶液は、０．７ｍＬのリン酸トリメチル（ＴＭＰ）に含めたプロトンスポンジ（７０．７ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ、１．５０等量）に添加されて０℃で１０分間撹拌された。オキシ塩化リン（ＰＯＣｌ３）（４１．４ｕｌ、０．４４ｍｍｏｌ、２．０等量）が該溶液に滴下された後、Ｎ２雰囲気下で２時間撹拌され続けた。２時間後、該溶液は、１．６ｍｌのジメチルホルムアミド中のビストリブチルアンモニウムピロリン酸（ＴＢＡＰＰまたは（ｎ‐Ｂｕ３ＮＨ）２Ｈ２Ｐ２Ｏ７）（７８４．６ｍｇ、１．４３ｍｍｏｌ、６．５０等量）およびトリブチルアミン（２１３．０ｕｌ、０．８８ｍｍｏｌ、４．０等量）の混合物と反応せしめられた。およそ１５分後、反応は１５．０ｍｌの０．２Ｍ重炭酸トリエチルアンモニウム（ＴＥＡＢ）で停止され、透明な該溶液は室温で１時間撹拌された。１８．０ｍｌの濃縮水酸化アンモニウムが反応混合物に添加されてトリフルオロアセチル基が除去された。次いで撹拌しながら終夜保存された。反応混合物は一晩凍結乾燥され、該粗製反応混合物はＨＰＬＣ（日本国京都の島津製作所、フェノメネクスＣ１８分取用カラム、２５０×２１．２０ｍｍ、１０．０μｍ（ミクロン）；グラジエント：１００％のＡで３．０分、その後１％Ｂ／分、Ａ＝１００ｍＭ ＴＥＡＢバッファー、Ｂ＝ＡＣＮ；流量：１０．０ｍＬ／分；保持時間：１６．１４〜１７．０２分）によって精製された。所望の化合物を含んでいる画分が集め合わされ、凍結乾燥されて化合物４７のＮＴＰが得られた。三リン酸化反応は、フレームドライ処理された二つ口フラスコ中でＮ２雰囲気下にて行なわれた。ヌクレオシドおよびプロテインスポンジ（ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｐｏｎｇｅ）は、使用前に真空下にて一晩、Ｐ２Ｏ５で脱水された。一リン酸塩の形成はＬＣＭＳによってモニタリングされた。
実施例５５． Ｎ‐ＰＥＧアデノシン（化合物４８）およびＮ‐ＰＥＧ ＡＴＰ（前記化合物のＮＴＰ）の合成

Ｎ‐ＰＥＧアデノシン４８は保護され、保護された化合物４８（１００．０ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）の溶液は、０．６５ｍＬのリン酸トリメチル（ＴＭＰ）に含めたプロトンスポンジ（４９．３ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ、１．５０等量）に添加されて０℃で１０分間撹拌された。オキシ塩化リン（ＰＯＣｌ３）（２８．０ｕｌ、０．３ｍｍｏｌ、２．０等量）が該溶液に滴下された後、Ｎ２雰囲気下で２時間撹拌され続けた。２時間後、該溶液は、１．２ｍｌのジメチルホルムアミド中のビストリブチルアンモニウムピロリン酸（ＴＢＡＰＰまたは（ｎ‐Ｂｕ３ＮＨ）２Ｈ２Ｐ２Ｏ７）（５３７．７ｍｇ、０．９８ｍｍｏｌ、６．５０等量）およびトリブチルアミン（１４６．０ｕｌ、０．６ｍｍｏｌ、４．０等量）の混合物と反応せしめられた。およそ１５分後、反応は１０．０ｍｌの０．２Ｍ重炭酸トリエチルアンモニウム（ＴＥＡＢ）で停止され、透明な該溶液は室温で１時間撹拌された。１８．０ｍｌの濃縮水酸化アンモニウムが反応混合物に添加されてトリフルオロアセチル基が除去された。次いで撹拌しながら終夜保存された。反応混合物は一晩凍結乾燥され、該粗製反応混合物はＨＰＬＣ（日本国京都の島津製作所、フェノメネクスＣ１８分取用カラム、２５０×２１．２０ｍｍ、１０．０μｍ（ミクロン）；グラジエント：１００％のＡで３．０分、その後１％Ｂ／分、Ａ＝１００ｍＭ ＴＥＡＢバッファー、Ｂ＝ＡＣＮ；流量：１０．０ｍＬ／分；保持時間：２４．５〜２５．５分）によって精製された。所望の化合物を含んでいる画分が集め合わされ、凍結乾燥されて化合物４８のＮＴＰが得られた。三リン酸化反応は、フレームドライ処理された二つ口フラスコ中でＮ２雰囲気下にて行なわれた。ヌクレオシドおよびプロテインスポンジ（ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｐｏｎｇｅ）は、使用前に真空下にて一晩、Ｐ２Ｏ５で脱水された。一リン酸塩の形成はＬＣＭＳによってモニタリングされた。
実施例５６． Ｎ‐メチルアデノシン（化合物４９）およびＮ‐メチルＡＴＰ（前記化合物のＮＴＰ）の合成

Ｎ‐メチルアデノシン（化合物４９）（７０．０ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）の溶液は、０．７ｍＬのリン酸トリメチル（ＴＭＰ）に含めたプロトンスポンジ（７９．２９ｍｇ、０．３７ｍｍｏｌ、１．５０等量）に添加され、０℃で１０分間撹拌された。オキシ塩化リン（ＰＯＣｌ３）（４６．６６ｕｌ、０．５０ｍｍｏｌ、２．０等量）が該溶液に滴下された後、Ｎ２雰囲気下で２時間撹拌され続けた。２時間後、該溶液は、１．３ｍｌのジメチルホルムアミド中のビストリブチルアンモニウムピロリン酸（ＴＢＡＰＰまたは（ｎ‐Ｂｕ３ＮＨ）２Ｈ２Ｐ２Ｏ７）（８８８．８５ｍｇ、１．６２ｍｍｏｌ、６．５０等量）およびトリブチルアミン（２４１．０ｕｌ、１．０ｍｍｏｌ、４．０等量）の混合物と反応せしめられた。およそ１５分後、反応は１６．０ｍｌの０．２Ｍ重炭酸トリエチルアンモニウム（ＴＥＡＢ）で停止され、透明な該溶液は室温で１時間撹拌された。反応混合物は一晩凍結乾燥され、該粗製反応混合物はＨＰＬＣ（日本国京都の島津製作所、フェノメネクスＣ１８分取用カラム、２５０×２１．２０ｍｍ、１０．０μｍ（ミクロン）；グラジエント：１００％のＡで３．０分、その後１％Ｂ／分、Ａ＝１００ｍＭ ＴＥＡＢバッファー、Ｂ＝ＡＣＮ；流量：１０．０ｍＬ／分；保持時間：１９．６２〜２０．１４分）によって精製された。所望の化合物を含んでいる画分が集め合わされ、凍結乾燥されて化合物４９のＮＴＰが得られた。三リン酸化反応は、フレームドライ処理された二つ口フラスコ中でＮ２雰囲気下にて行なわれた。ヌクレオシドおよびプロテインスポンジ（ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｐｏｎｇｅ）は、使用前に真空下にて一晩、Ｐ２Ｏ５で脱水された。一リン酸塩の形成はＬＣＭＳによってモニタリングされた。
実施例５７． Ｎ，Ｎ‐ジメチルグアノシン（化合物５０）およびＮ，Ｎ‐ジメチルＧＴＰ（前記化合物のＮＴＰ）の合成

Ｎ，Ｎ‐ジメチルグアノシン（化合物５０）（６５．８ｍｇ、０．２１ｍｍｏｌ）の溶液は、０．７ｍＬのリン酸トリメチル（ＴＭＰ）に含めたプロトンスポンジ（６８．５８ｍｇ、０．３２ｍｍｏｌ、１．５０等量）に添加され、０℃で１０分間撹拌された。オキシ塩化リン（ＰＯＣｌ３）（３９．２０ｕｌ、０．４２ｍｍｏｌ、２．０等量）が該溶液に滴下された後、Ｎ２雰囲気下で２時間撹拌され続けた。２時間後、該溶液は、１．５ｍｌのジメチルホルムアミド中のビストリブチルアンモニウムピロリン酸（ＴＢＡＰＰまたは（ｎ−Ｂｕ３ＮＨ）２Ｈ２Ｐ２Ｏ７）（７５１．６７ｍｇ、１．３７ｍｍｏｌ、６．５０等量）およびトリブチルアミン（２０４．０ｕｌ、０．８４ｍｍｏｌ、４．０等量）の混合物と反応せしめられた。およそ１５分後、反応は１４．０ｍｌの０．２Ｍ重炭酸トリエチルアンモニウム（ＴＥＡＢ）で停止され、透明な該溶液は室温で１時間撹拌された。反応混合物は一晩凍結乾燥され、該粗製反応混合物はＨＰＬＣ（日本国京都の島津製作所、フェノメネクスＣ１８分取用カラム、２５０×２１．２０ｍｍ、１０．０μｍ（ミクロン）；グラジエント：１００％のＡで３．０分、その後１％Ｂ／分、Ａ＝１００ｍＭ ＴＥＡＢバッファー、Ｂ＝ＡＣＮ；流量：１０．０ｍＬ／分；保持時間：１９．２７〜１９．９５分）によって精製された。所望の化合物を含んでいる画分が集め合わされ、凍結乾燥されて化合物５０のＮＴＰが得られた。三リン酸化反応は、フレームドライ処理された二つ口フラスコ中でＮ２雰囲気下にて行なわれた。ヌクレオシドおよびプロテインスポンジ（ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｐｏｎｇｅ）は、使用前に真空下にて一晩、Ｐ２Ｏ５で脱水された。一リン酸塩の形成はＬＣＭＳによってモニタリングされた。
実施例５８． ＮＴＰＳの三リン酸塩合成のための一般法

ヌクレオシドｉは、三リン酸塩である化合物ｉｉを提供するために任意の有用な方法でリン酸化されうる。例えば、ヌクレオシドはプロトンスポンジおよびリン酸トリメチル（ＴＭＰ）に添加されて冷却されうる（例えば−４０℃に）。オキシ塩化リン（ＰＯＣｌ３）が滴下された後、ビストリブチルアンモニウムピロリン酸（ＴＢＡＰＰまたは（ｎ‐Ｂｕ３ＮＨ）２Ｈ２Ｐ２Ｏ７）およびトリブチルアミンと反応させることができる。該反応はその後、重炭酸トリエチルアンモニウム（ＴＥＡＢ）で急速に停止させることができる。典型的な条件は、米国特許第７，８９３，２２７号明細書に提示されており、前記文献は参照により本願に組込まれる。
リン酸化反応の後、反応混合物は、任意選択で、凍結乾燥、精製（例えばイオン交換クロマトグラフィおよびＨＰＬＣのうち少なくともいずれかによる）、またはナトリウム塩への変換（例えばＭｅＯＨに溶解してアセトン中の過塩素酸ナトリウムを加えることによる）が行われてもよい。
実施例５９：ｃＤＮＡ生産のためのＰＣＲ
ｃＤＮＡの調製のためのＰＣＲ手法は、カパ・バイオシステムズ（Ｋａｐａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、米国マサチューセッツ州ウォーバーン）の２×ＫＡＰＡ ＨＩＦＩ（商標）ＨｏｔＳｔａｒｔ ＲｅａｄｙＭｉｘを使用して行なわれる。このシステムは、２×ＫＡＰＡ ＲｅａｄｙＭｉｘ１２．５μｌ；順方向プライマー（１０ｕＭ）０．７５μｌ；逆方向プライマー（１０ｕＭ）０．７５μｌ；テンプレートｃＤＮＡ １００ｎｇ；およびｄＨ２Ｏを含んで２５．０μｌとなっている。反応条件は、９５℃で５分、および２５サイクルの、９８℃で２０秒、次に５８℃で１５秒、次に７２℃で４５秒、次に７２℃で５分、その後４℃で停止、である。
本発明の逆方向プライマーは、ｍＲＮＡ中のポリ‐Ａ１２０のためのポリ‐Ｔ１２０を組み入れている。より長いかまたはより短いポリ‐Ｔ区間を備えた他の逆方向プライマーが、ｍＲＮＡ中のポリＡテールの長さを調節するために使用されうる。
該反応物は、インビトロジェンのＰＵＲＥＬＩＮＫ（商標）ＰＣＲ Ｍｉｃｒｏキット（米国カリフォルニア州カールスバード）を使用して製造業者の指示書に従って精製される（最大５μｇ）。より大規模な反応にはより大きな処理能力を備えた製品を使用する精製が必要となろう。精製に続いて、ｃＤＮＡはＮａｎｏＤｒｏｐを使用して定量され、かつアガロースゲル電気泳動法により解析されて該ｃＤＮＡが予定通りの大きさであることが確認される。その後、ｃＤＮＡは配列分析に供された後にｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応へと進められる。
実施例６０． ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）
ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応により、修飾ヌクレオチドを含んでいるｍＲＮＡすなわち修飾ＲＮＡが生成される。投入されるヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）混合物は、天然および非天然のＮＴＰを使用して自家作製される。
典型的なｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応には下記が含まれる：

３７℃で３時間〜５時間インキュベーション。
粗製ＩＶＴ混合物は、翌日の精製のために４℃で一晩保存されうる。その後、ＲＮアーゼを含まないＤＮアーゼ１Ｕを使用して元のテンプレートが消化される。３７℃で１５分間のインキュベーションの後、ｍＲＮＡは、アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）のＭＥＧＡＣＬＥＡＲ（商標）キット（米国テキサス州オースティン）を使用して製造業者の指示書に従って精製される。このキットは５００μｇのＲＮＡを精製することができる。精製に続いて、ＲＮＡはＮａｎｏＤｒｏｐを使用して定量され、かつアガロースゲル電気泳動法によって解析されて、該ＲＮＡが適正な大きさであること、および該ＲＮＡの分解が生じていないことが確認される。
Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼおよび突然変異体ポリメラーゼから選択可能であり、突然変異体ポリメラーゼは例えば、限定されるものではないが、修飾ＮＴＰを組み入れることができる新規なポリメラーゼ、ならびにリウ（Ｌｉｕ）（エスヴェルト（Ｅｓｖｅｌｔ）ら（ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２０１１年、第４７２巻、第７３４４号、ｐ．４９９−５０３および米国特許出願公開第２０１１０１７７４９５号明細書）により報告されたポリメラーゼであって、代替プロモータを認識するもの、エリントン（Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ）（シェリセリカッティル（Ｃｈｅｌｌｉｓｅｒｒｙｋａｔｔｉｌ）およびエリントン（Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ）、ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、２００４年、第２２巻、第９号、ｐ．１１５５−１１６０）が述べている２’‐Ｏ‐メチルＲＮＡを転写するＴ７ ＲＮＡポリメラーゼバリアント、ならびにスーザ（Ｓｏｕｓａ）（パディリャ（Ｐａｄｉｌｌａ）およびスーザ（Ｓｏｕｓａ）、ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、２００２年、第３０巻、第２４号、ｅ１２８）が述べているＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ二重突然変異体であり；前記文献は参照により全体が本願に組み込まれる。
実施例６１． ｍＲＮＡの酵素的キャッピング
ｍＲＮＡのキャッピングは以下のようにして実施されるが、該キャッピングにおいて混合物は：ＩＶＴ ＲＮＡ ６０μｇ〜１８０μｇを含み、ｄＨ２Ｏで７２μｌとされている。該混合物は、ＲＮＡを変性されるために６５℃で５分間インキュベーションされ、次いで直ちに氷中に移される。
その後該プロトコールは、１０×キャッピングバッファー（０．５Ｍトリス‐ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、６０ｍＭ ＫＣｌ、１２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２）（１０．０μｌ）；２０ｍＭ ＧＴＰ（５．０μｌ）；２０ｍＭ Ｓ‐アデノシルメチオニン（２．５μｌ）；ＲＮアーゼ阻害剤（１００Ｕ）；２’‐Ｏ‐メチルトランスフェラーゼ（４００Ｕ）；ワクシニアのキャッピング酵素（グアニリルトランスフェラーゼ）（４０Ｕ）；ｄＨ２Ｏ（２８μｌとなるまで）；を混合すること、および、６０μｇのＲＮＡについては３０分間、１８０μｇのＲＮＡについては最大で２時間の、３７℃でのインキュベーションを伴う。
次いでｍＲＮＡは、アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）のＭＥＧＡＣＬＥＡＲ（商標）キット（米国テキサス州オースティン）を使用して製造業者の指示書に従って精製される。精製に続いて、ＲＮＡはＮＡＮＯＤＲＯＰ（商標）（サーモフィッシャー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、米国マサチューセッツ州ウォルサム）を使用して定量され、かつアガロースゲル電気泳動法によって解析されて、該ＲＮＡが適正な大きさであること、および該ＲＮＡの分解が生じていないことが確認される。ＲＮＡ生成物は、配列決定用のｃＤＮＡを生成するための逆転写ＰＣＲを実行することにより配列決定されることも可能である。
実施例６２． ポリＡテーリング反応
ｃＤＮＡ中にポリＴがなければ、最終生産物の精製前にポリＡテーリング反応が実施されなければならない。これは、キャップ付きＩＶＴ ＲＮＡ（１００μｌ）；ＲＮアーゼ阻害剤（２０Ｕ）；１０×テーリングバッファー（０．５Ｍトリス‐ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２．５Ｍ ＮａＣｌ、１００ｍＭ ＭｇＣｌ２）（１２．０μｌ）；２０ｍＭ ＡＴＰ（６．０μｌ）；ポリＡポリメラーゼ（２０Ｕ）；ｄＨ２Ｏ（１２３．５μｌとなるまで）；を混合することと、３７℃で３０分間のインキュベーションとにより行われる。ポリＡテールが既に転写物中にある場合、テーリング反応はスキップされ、アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）のＭＥＧＡＣＬＥＡＲ（商標）キット（米国テキサス州オースティン）（最大５００μｇまで）を使用した精製へと直接進めることができる。ポリＡポリメラーゼは好ましくは酵母で発現された組換え酵素である。
本明細書中で実施および説明される研究については、ポリＡテールは長さ１６０ヌクレオチドを含んでなるようにＩＶＴテンプレート中にコードされる。しかしながら、当然のことであるがポリＡテーリング反応の処理能力または完全性が必ずしも正確に１６０ヌクレオチドを生じるとは限らない場合がある。従って、およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテール、例えば、約１５０〜１６５、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４または１６５ヌクレオチドが本発明の範囲内にある。
実施例６３． タンパク質発現に関するスクリーニング方法
Ａ． エレクトロスプレーイオン化
対象者に投与された修飾ＲＮＡによってコードされたタンパク質を含有する可能性のある生物学的試料が調製されて、１、２、３または４台の質量分析装置を使用したエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）のための製造業者のプロトコールに従って解析される。生物学的試料はタンデム型ＥＳＩ質量分析システムを使用して解析されてもよい。
タンパク質フラグメントのパターン、またはタンパク質全体が、所与のタンパク質に関する既知対照と比較され、同一性は比較によって判定される。
Ｂ． マトリックス支援レーザー脱離イオン化法
対象者に投与された修飾ＲＮＡによってコードされたタンパク質を含有する可能性のある生物学的試料が調製されて、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化法（ＭＡＬＤＩ）のための製造業者のプロトコールに従って解析される。
タンパク質フラグメントのパターン、またはタンパク質全体が、所与のタンパク質に関する既知対照と比較され、同一性は比較によって判定される。
Ｃ． 液体クロマトグラフィ‐タンデム型質量分析法
修飾ＲＮＡによってコードされたタンパク質を含んでいる可能性のある生物学的試料は、その中に含まれたタンパク質を消化するためにトリプシン酵素で処理されうる。得られたペプチドは、液体クロマトグラフィ‐タンデム型質量分析法（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）によって解析される。該ペプチドは質量分析計においてフラグメント化されて診断用パターンを生じ、該パターンはコンピュータアルゴリズムによってタンパク質配列データベースにマッチングさせることが可能である。消化された試料は、所与のタンパク質について１ｎｇ以下の出発物質とするために希釈されうる。単純なバッファーのバックグラウンド（例えば水または揮発性の塩）を含有している生物学的試料は、直接的な溶液中での消化に適しており；より複雑なバックグラウンド（例えば洗浄剤、不揮発性の塩、グリセリン）は、試料の解析を促進するための付加的な精製ステップを必要とする。
タンパク質フラグメントのパターン、またはタンパク質全体が、所与のタンパク質に関する既知対照と比較され、同一性は比較によって判定される。
実施例６４． サイトカイン研究：ＰＢＭＣ
Ａ． ＰＢＭＣの単離および培養
２名のドナー由来のヒト血液５０ｍＬは、ヘパリンナトリウム・チューブに入ってリサーチ・ブラッド・コンポーネンツ（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂｌｏｏｄ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ）から受け取られた（ロットＫＰ３０９２８およびＫＰ３０９３１）。各ドナーについて、血液が集め合わされてＤＰＢＳ（ＳＡＦＣバイオサイエンシズ（ＳＡＦＣ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）の５９３３１Ｃ、ロット番号０７１Ｍ８４０８）で７０ｍＬに希釈され、２本の５０ｍＬコニカルチューブに均等に分けられた。１０ｍＬのＦｉｃｏｌｌ‐Ｐａｑｕｅ（登録商標）（ＧＥヘルスケア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の１７‐５４４２‐０３、ロット番号１００７４４００）が血液層の下に穏やかに入れられた。該チューブは、加速および制動を低くして２０００ｒｐｍで３０分間遠心分離処理された。チューブが取り出され、軟膜状のＰＢＭＣ層が新しい５０ｍＬ容コニカルチューブに穏やかに移されてＤＰＢＳで洗浄された。該チューブは１４５０ｒｐｍで１０分間遠心分離処理された。
上清が吸引除去され、ＰＢＭＣペレットは再懸濁されて５０ｍＬのＤＰＢＳ中で洗浄された。該チューブは１２５０ｒｐｍで１０分間遠心分離処理された。この洗浄ステップが繰り返され、ＰＢＭＣペレットは１９ｍＬのＯｐｔｉｍｅｍ（登録商標）Ｉ（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）の１１０５８、ロット番号１０７２０８８）に再懸濁されて計数された。この細胞懸濁液は、生細胞数３．０×１０６個／ｍＬの濃度に調整された。
次いでこれらの細胞は、ドナーごとに５枚の９６ウェル組織培養用表面処理済丸底プレート（Ｃｏｓｔａｒ（登録商標）３７９９）に、１ウェルあたり５０ｕＬずつ播種された。３０分以内に、トランスフェクション混合物が１ウェルあたり体積５０ｕＬとして各ウェルに添加された。トランスフェクションの４時間後、培地に１０ｕＬのウシ胎児血清（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）の１００８２、ロット番号１０１２３６８）が補足された。
Ｂ． トランスフェクション調製物
ヒトのＧ‐ＣＳＦをコードしている修飾ｍＲＮＡ（配列番号１に示されるｍＲＮＡ配列；
配列中に示されていないおよそ１６０ヌクレオチドのｐｏｌｙＡテール；５’キャップ、キャップ１）（（１）天然のＮＴＰ、（２）５‐メチルシチジンおよびプソイドウリジンでの１００％置換、または（３）５‐メチルシチジンおよびＮ１‐メチルプソイドウリジンでの１００％置換、のうちいずれかを含有している）；ルシフェラーゼをコードしているｍＲＮＡ（配列番号２に示されるＩＶＴのｃＤＮＡ配列；配列番号３に示されるｍＲＮＡ配列、配列中に示されていないおよそ１６０ヌクレオチドのｐｏｌｙＡテール、５’キャップ、キャップ１であって、各シトシンにおいて５‐メチルシトシンで、かつ各ウリジン部位においてプソイドウリジン置換で完全に修飾されているもの）（（１）天然のＮＴＰ、または（２）５‐メチルシチジンおよびプソイドウリジンでの１００％置換のうちいずれかを含有している）、ならびにＴＬＲアゴニストＲ８４８（インビトロジェン ｔｌｒｌ‐ｒ８４８）は、最終体積２５００ｕＬのＯｐｔｉｍｅｍ Ｉの中に３８．４ｎｇ／ｕＬとなるように希釈された。
別途、１１０ｕＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）２０００（インビトロジェン １１６６８‐０２７、ロット番号１０７０９６２））が６．７６ｍＬのＯｐｔｉｍｅｍ Ｉで希釈された。９６ウェルプレート内で、１３５ｕＬの各ｍＲＮＡ、陽性対照（Ｒ‐８４８）または陰性対照（Ｏｐｔｉｍｅｍ Ｉ）の９アリコートが、１３５ｕＬの希釈済みＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００に加えられた。トランスフェクションされるべき材料が入っている該プレートは２０分間インキュベーションされた。その後、トランスフェクション混合物は１ウェル当たり５０ｕＬとして各々のヒトＰＢＭＣプレートに移された。その後、プレートは３７℃でインキュベーションされた。２、４、８、２０および４４時間において、各プレートがインキュベータから取り出されて上清が冷凍された。
最後のプレートが取り出された後、上清はヒトＧ‐ＣＳＦ ＥＬＩＳＡキット（インビトロジェンのＫＨＣ２０３２）およびヒトＩＦＮ‐α ＥＬＩＳＡキット（サーモ・サイエンティフィック（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の４１１０５‐２）を使用してアッセイされた。各条件は２連で行われた。
Ｃ． タンパク質および先天性免疫応答の解析
未修飾ｍＲＮＡおよび修飾ｍＲＮＡがコードされたタンパク質を産生する能力（Ｇ‐ＣＳＦ産生）は、該ｍＲＮＡの先天性免疫認識を誘発する能力をインターフェロンα産生によって測定しながら、経時的に評価された。ｉｎ ｖｉｔｒｏのＰＢＭＣ培養物の使用は、オリゴヌクレオチドの免疫刺激能を測定するために容認された方法である（ロビンズ（Ｒｏｂｂｉｎｓ）ら、オリゴヌクレオチド（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）、２００９年、第１９巻、ｐ．８９−１０２）。
結果は、４パラメータロジスティック曲線へのあてはめを使用して各ＥＬＩＳＡプレートの標準曲線に対して内挿された。表４および５に示されているのは、特異的ＥＬＩＳＡによって測定された経時的なＧ‐ＣＳＦ、インターフェロンα（ＩＦＮ‐α）および腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ‐α）産生についての、３名の別個のＰＢＭＣドナーの平均である。
Ｇ‐ＣＳＦのＥＬＩＳＡでは、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（ＬＦ２０００）未処理の条件のバックグラウンドシグナルが各時点において差し引かれた。該データは、天然のＮＴＰ、５‐メチルシチジンおよびプソイドウリジンによる１００％置換、または５‐メチルシチジンおよびＮ１‐メチルプソイドウリジンによる１００％置換、を含有しているＧ‐ＣＳＦ ｍＲＮＡを用いて、ヒト末梢血単核によるヒトＧ‐ＣＳＦタンパク質の特異的産生が見られることを実証した。Ｇ‐ＣＳＦの産生は、５‐メチルシチジンおよびＮ１‐メチルプソイドウリジンで修飾されたｍＲＮＡの使用により、５‐メチルシチジンおよびプソイドウリジンで修飾されたｍＲＮＡと比較して顕著に増大された。
先天性免疫認識に関しては、いずれの修飾ｍＲＮＡの化学構造物もＩＦＮ‐αおよびＴＮＦ‐αの産生を陽性対照（Ｒ８４８、ｐ（Ｉ）ｐ（Ｃ））と比較して大きく防止したが、該化学構造物間において有意差が存在した。５‐メチルシチジンおよびプソイドウリジンで修飾されたｍＲＮＡは低いが検出可能なレベルのＩＦＮ‐αおよびＴＮＦ‐α産生をもたらした一方、５‐メチルシチジンおよびＮ１‐メチルプソイドウリジンで修飾されたｍＲＮＡは検出可能なＩＦＮ‐αおよびＴＮＦ‐α産生をもたらさなかった。
従って、先天性免疫応答の活性化の２以上のサイトカインマーカーを調査する必要に加えて、意外にも修飾の組み合わせにより様々なレベルの細胞応答（タンパク質産生および免疫活性化）が得られることが見出されることが分かった。本研究における該修飾、Ｎ１‐メチルプソイドウリジンは、他者の調査による５‐メチルシチジン／プソイドウリジンという標準的組み合わせを上回る付加的保護をもたらして、２倍分のタンパク質と、免疫活性化（ＴＮＦ‐α）のほぼ１５０倍の低減とをもたらすことが示された。
ＰＢＭＣが、極めて多様な先天性免疫のＲＮＡ認識センサを包含しており、かつタンパク質翻訳も可能であるとすれば、これら２つの経路の相互依存性を試験する有用な系を提供している。ｍＲＮＡの翻訳はそのような先天性免疫経路の活性化によって負の影響を受ける可能性があることが知られている（カリコ（Ｋａｒｉｋｏ）ら、イミュニティ（Ｉｍｍｕｎｉｔｙ）、２００５年、第２３巻、ｐ．１６５−１７５；ウォレン（Ｗａｒｒｅｎ）ら、セル・ステム・セル（Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ）、２０１０年、第７巻、ｐ．６１８−６３０）。ｉｎ ｖｉｔｒｏのアッセイ系としてＰＢＭＣを使用して、翻訳（この場合はＧ‐ＣＳＦタンパク質産生）とサイトカイン産生（この場合はＩＦＮ‐αおよびＴＮＦ‐αタンパク質産生によって例証される）との間の相関を確立することが可能である。より高いタンパク質産生は、先天性の免疫活性化経路のより低い誘導と相関しており、新しい化学構造物はこの比に基づいて良好に判断されうる（表６）。
本研究では、２つの化学修飾すなわちプソイドウリジンおよびＮ１‐メチルプソイドウリジンについてのＰＣ比は、いずれも５‐メチル（５−ｍｅｔｈｙ）シトシンを伴って、サイトカインＩＦＮ‐αについて、４７４２／１４１＝３４と、対して９９４４／１＝９９４４であった。サイトカインＴＮＦ‐αについては、この２つの化学構造物はそれぞれ１５３および１２４３というＰＣ比を有し、いずれのサイトカインについてもＮ１‐メチルプソイドウリジンが優れた修飾であることが示唆された。表４および５において、「ＮＴ」は、試験が行われていないことを意味する。

実施例６５． 修飾ｍＲＮＡの化学修飾範囲
修飾ヌクレオシド、例えば、限定するものではないが、化学修飾物５‐メチルシトシンおよびプソイドウリジンは、哺乳動物細胞において先天性免疫応答を低下させ、かつＲＮＡの発現を増大させることが示された。驚くべきことに、かつこれまで知られていなかったが、これらの化学修飾によって明らかとなった影響は、特定のヌクレオチドの化学修飾の量が１００％未満であるときに量的調整がなされうる。かつて、化学修飾の有益性は、完全には置き換えることなく修飾ヌクレオシドを使用して引き出されうるものと考えられており、かつ、公開された報告は、修飾ヌクレオシドによる置換のレベルが５０％未満までは有益性の損失がないことを示唆している（カリコ（Ｋａｒｉｋｏ）ら、イミュニティ（Ｉｍｍｕｎｉｔｙ）、２００５年、第２３巻、ｐ．１６５−１７５）。
しかしながら、化学修飾の有益性は、化学修飾の程度と直接的に相関しており、かつ免疫応答について単一の尺度にとどまらずに考慮に入れて検討されなければならないことが、ここで示された。そのような有益性には、タンパク質産生またはｍＲＮＡ翻訳の増強、ならびに、サイトカインプロファイルおよび免疫応答トリガーの計量によって測定されるような先天性免疫応答の刺激を低減するかまたは免れることが含まれる。
ｍＲＮＡ翻訳の増強および先天性免疫刺激の低減または欠如は、修飾ヌクレオシドを用いた１００％置換で見られる。置換の比率（％）がより少ないほどｍＲＮＡ翻訳の低減および先天性免疫刺激の増大がもたらされ、未修飾ｍＲＮＡは最も低い翻訳および最も高い先天性免疫刺激を示す。
ｉｎ ｖｉｔｒｏのＰＢＭＣ研究：修飾率（％）
４８０ｎｇの、５‐メチルシトシン（５ｍＣ）およびプソイドウリジン（プソイドＵ）で修飾されたＧ‐ＣＳＦ ｍＲＮＡまたは未修飾のＧ‐ＣＳＦ ｍＲＮＡは、０．４ｕＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を用いて、３名の健康な血液ドナー（Ｄ１、Ｄ２およびＤ３）からの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）にトランスフェクションされた。Ｇ‐ＣＳＦ ｍＲＮＡ（配列番号１；配列中に示されていないおよそ１６０ヌクレオチドのｐｏｌｙＡテール；５’キャップ、キャップ１）は、５ｍＣおよびプソイドで完全に修飾されるか（１００％修飾）、５ｍＣおよびプソイドで修飾されていないか（０％修飾）、または５ｍＣおよびプソイドＵで部分的に修飾されて該ｍＲＮＡが７５％修飾、５０％修飾もしくは２５％修飾を含有するようになされた。対照試料のルシフェラーゼ（配列番号３に示されるｍＲＮＡ配列；配列中に示されていないおよそ１６０ヌクレオチドのｐｏｌｙＡテール；５’キャップ、キャップ１；完全に修飾された５ｍｅＣおよびプソイドＵ）も、Ｇ‐ＣＳＦ発現について解析された。ＴＮＦ‐αおよびＩＦＮ‐αについて、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００、ＬＰＳ、Ｒ‐８４８、ルシフェラーゼ（配列番号３に示されるｍＲＮＡ配列；配列中に示されていないおよそ１６０ヌクレオチドのｐｏｌｙＡテール；５’キャップ、キャップ１；完全に修飾された５ｍＣおよびプソイド）、ならびにＰ（Ｉ）Ｐ（Ｃ）の対照試料も解析された。上清が採取され、タンパク質発現を判定するためにトランスフェクションの２２時間後にＥＬＩＳＡが実行された。Ｇ‐ＣＳＦの発現は表７に示され、ＩＦＮ‐αおよびＴＮＦ‐αの発現は表８に示されている。ＩＦＮ‐αおよびＴＮＦ‐αの発現は、Ｇ‐ＣＳＦ ｍＲＮＡのトランスフェクションからの二次的影響である可能性がある。表７、８および図１０は、Ｇ‐ＣＳＦ、インターフェロンα（ＩＦＮ‐α）および腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ‐α）の化学修飾の量はｍＲＮＡが完全には修飾されていない場合は量的調整が可能であることを示し、その量的調整が可能な傾向は各標的について同じであることを示している。
上記に言及されたように、ｉｎ ｖｉｔｒｏのアッセイ系としてＰＢＭＣを使用して、翻訳（この場合はＧ‐ＣＳＦタンパク質の産生）とサイトカイン産生（この場合はＩＦＮ‐αタンパク質の産生によって例証される）との間の相関を確立することが可能である。より良好なタンパク質産生は先天性免疫活性化経路のより低い誘導と相関し、化学構造の修飾率（％）はこの比に基づいて良好に判断されうる（表９）。表７および８から計算され、かつ表９に示されるように、５‐メチルシチジンおよびプソイドウリジンを用いた完全な修飾は、修飾を伴わないもの（天然のＧ‐ＣＳＦ ｍＲＮＡ）よりもはるかに良好なタンパク質／サイトカイン産生の比を示している（ＩＦＮ‐αについては１００倍、およびＴＮＦ‐αについては２７倍）。部分的修飾は、修飾が次第に減少するにつれてより低いタンパク質／サイトカイン比をもたらすという直線的関係を示す。

実施例６６． ＰＢＭＣにトランスフェクションされた修飾ＲＮＡ
５‐メチルシトシン（５ｍＣ）およびプソイドウリジン（プソイドＵ）で修飾された５００ｎｇのＧ‐ＣＳＦ ｍＲＮＡまたは未修飾のＧ‐ＣＳＦ ｍＲＮＡは、０．４ｕＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を用いて、３名の健康な血液ドナー（Ｄ１、Ｄ２およびＤ３）由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）にトランスフェクションされた。Ｇ‐ＣＳＦ ｍＲＮＡ（配列番号１；配列中に示されていないおよそ１６０ヌクレオチドのｐｏｌｙＡテール；５’キャップ、キャップ１）は、５ｍＣおよびプソイドで完全に修飾されるか（１００％修飾）、５ｍＣおよびプソイドで修飾されていないか（０％修飾）、または５ｍＣおよびプソイドＵで部分的に修飾されて該ｍＲＮＡが５０％修飾、２５％修飾、１０％修飾、５％修飾、１％修飾もしくは０．１％修飾を含有するようになされた。対照試料のｍＣｈｅｒｒｙ（配列番号６に示されるｍＲＮＡ配列；配列中に示されていないおよそ１６０ヌクレオチドのｐｏｌｙＡテール；５’キャップ、キャップ１；完全に修飾された５ｍｅＣおよびプソイドウリジン）、ならびに５‐メチルシトシンおよびプソイドウリジンで完全に修飾されたＧ‐ＣＳＦ（対照Ｇ‐ＣＳＦ）も、Ｇ‐ＣＳＦ発現について解析された。腫瘍壊死因子‐α（ＴＮＦ‐α）およびインターフェロン‐α（ＩＦＮ‐α）について、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００、ＬＰＳ、Ｒ‐８４８、ルシフェラーゼ（配列番号３に示されるｍＲＮＡ配列；配列中に示されていないおよそ１６０ヌクレオチドのｐｏｌｙＡテール；５’キャップ、キャップ１；完全に修飾された５ｍＣおよびプソイド）、ならびにＰ（Ｉ）Ｐ（Ｃ）の対照試料も解析された。上清はトランスフェクション後６時間および１８時間に採取され、タンパク質発現を決定するためにＥＬＩＳＡが実行された。ドナー１についてのＧ‐ＣＳＦ、ＩＦＮ‐αおよびＴＮＦ‐αの発現は表１０に示され、ドナー２については表１１に示され、ドナー３については表１２に示されている。
５‐メチルシチジンおよびプソイドウリジンを用いた完全な１００％修飾は、３名のヒトＰＢＭＣドナー全員にわたって最も高いタンパク質翻訳（Ｇ‐ＣＳＦ）および最も少ない産生サイトカイン量をもたらした。修飾の量を減少させると、より多くのサイトカイン産生（ＩＦＮ‐αおよびＴＮＦ‐α）がもたらされ、よってサイトカインを低減しかつタンパク質翻訳を改善する（ここではＧ‐ＣＳＦ産生によって証明される）ための完全な修飾の重要性が一層明らかとなっている。

実施例６７． 修飾物のマイクロエイムス復帰突然変異スクリーニング
背景および方法
マイクロエイムススクリーニングは正式なエイムス・プレインキュベーション・アッセイの変法である。該方法は、４つのサルモネラ試験株（ＴＡ９７ａ、ＴＡ９８、ＴＡ１００およびＴＡ１５３５）および１つの大腸菌株（ＷＰ２ ｕｖｒＡ ｐＫＭ１０１）を使用して、フレームシフト変異および塩基対置換変異の両方を検出する。菌株ＴＡ９７ａおよびＴＡ９８はフレームシフト突然変異を検出し、ＴＡ１００、ＴＡ１５３５およびＷＰ２ ｕｖｒＡ ｐＫＭ１０１は塩基対置換変異を検出する。このスケールダウンされたエイムス試験法は、最小限の化合物を使用し、代謝活性化（Ｓ９分画）の有り無し両方で行なわれ、マルチウェルプレートを使用する。この試験（ｔｅｓｔｅ）は、試験化合物の変異原性潜在力を検出する微生物学的アッセイである。
５‐メチルシチジン、プソイドウリジンまたはＮ’‐メチルプソイドウリジン被験物質についてのマイクロエイムススクリーニングは、０．２５、２．５、１２．５、２５、７５および２５０ｕｇ／ウェルで、代謝活性化システム（ＡＲＯＣＬＯＲ（商標）１２５４誘導ラット肝Ｓ９ミクロソーム分画）の存在下および非存在下で菌株ＴＡ９７ａ、ＴＡ９８、ＴＡ１００、ＴＡ１５３５およびＷＰ２ ｕｖｒＡ ｐＫＭ１０１を用いて２連で試験された。陽性対照化合物は、該アッセイ系が既知の変異原性化合物に対して感受性であることを保証するために、４つの異なる濃度で使用された。ＤＭＳＯはビヒクル対照として使用された。陽性対照およびビヒクル対照は予想どおりの結果を生じ、このマイクロエイムススクリーニングが突然変異原を検出するのに十分な感度を有することを実証した。
結果
５‐メチルシトシンについては、沈殿は、代謝活性化の有無にかかわらずいずれの試験株でも観察されなかった。細胞毒性（バックグラウンドローンおよび復帰突然変異体の数のうち少なくともいずれかの低減）は、代謝活性化の有無にかかわらずいずれの菌株でも観察されなかった。復帰突然変異体のコロニーの数は、代謝活性化の有無にかかわらずいずれの菌株においてもビヒクル対照と比較して増加はなかった。したがって、５‐メチルシチジンは、マイクロエイムススクリーニングの条件下において、代謝活性化の有無にかかわらず、菌株ＴＡ９７ａ、ＴＡ９８、ＴＡ１００、ＴＡ１５３５およびＷＰ２ ｕｖｒＡ ｐＫＭ１０１において最大２５０ｕｇ／ウェルまで変異原性ではなかった。
沈殿は、プソイドウリジンについて、代謝活性化の有無にかかわらずいずれの試験株でも観察されなかった。細胞毒性（復帰突然変異体の数の低減）は、代謝活性化を伴わない菌株ＴＡ１００において観察された。細胞毒性（バックグラウンドローンおよび復帰突然変異体の数のうち少なくともいずれかの低減）は、代謝活性化の有無にかかわらず他のいずれの菌株でも観察されなかった。復帰突然変異体のコロニーの数は、代謝活性化の有無にかかわらずいずれの菌株においてもビヒクル対照と比較して増加はなかった。したがって、プソイドウリジンは、このマイクロエイムススクリーニングの条件下において、代謝活性化を伴わない菌株ＴＡ１００において最大７５ｕｇ／ウェルまで、ならびに、代謝活性化の有無にかかわらず菌株ＴＡ９７ａ、ＴＡ９８、ＴＡ１５３５およびＷＰ２ ｕｖｒＡ ｐＫＭ１０１と、代謝活性化を伴う菌株ＴＡ１００とでは最大２５０μｇ／ウェルまで、変異原性ではなかった。
修飾物については、Ｎ１‐メチルプソイドウリジンの沈殿は、代謝活性化の有無にかかわらずいずれの試験株でも観察されなかった。細胞毒性（バックグラウンドローンおよび復帰突然変異体の数のうち少なくともいずれかの低減）は、代謝活性化の有無にかかわらずいずれの菌株でも観察されなかった。復帰突然変異体のコロニーの数は、代謝活性化の有無にかかわらずいずれの菌株においてもビヒクル対照と比較して増加はなかった。Ｎ１‐メチルプソイドウリジンは、このマイクロエイムススクリーニングの条件下において、代謝活性化の有無にかかわらず、菌株ＴＡ９７ａ、ＴＡ９８、ＴＡ１００、ＴＡ１５３５およびＷＰ２ ｕｖｒＡ ｐＫＭ１０１において最大２５０μｇ／ウェルまで変異原性ではなかった。Ｎ１‐メチルプソイドウリジンはプソイドウリジンよりも変異原性が低いことが見出された。
このマイクロエイムス試験における５メチルシチジン、プソイドウリジン、およびＮ１‐メチルプソイドウリジンの比較は、これらが概ね変異原性ではないことを明らかにしている。しかしながら特に注目すべきなのは、Ｎ１‐メチルプソイドウリジンが細胞傷害反応を示さなかった１菌株においてプソイドウリジンが細胞傷害反応を示したという、プソイドウリジンとＮ１‐メチルプソイドウリジンの間の差であった。これらのマイクロエイムス試験は、化合物の安全性についての前臨床評価の一部として定常的に使用されており、Ｎ１‐メチルプソイドウリジンとプソイドウリジンとの間の重要な差異を明らかにしている。
実施例６８． ヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）の毒性
天然型および修飾型のヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）単独の、または他の塩基と組み合わせての細胞毒性は、ヒト胎児腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）細胞においてトランスフェクション試薬の非存在下で解析された。ＨＥＫ２９３細胞は、１ウェルあたり０．７５ｕｌのＲＮＡｉＭＡＸ（商標）（インビトロジェン、米国カリフォルニア州カールスバード）が入っている９６ウェルプレートに、細胞密度を１ウェルあたり３０，０００個として、ウェル内の合計体積が１００ｕｌとなるように播種された。１０ｕｌの、表１２に略記されたＮＴＰは、１０ｕｌの脂質希釈物と組み合わされて３０分間インキュベーションされて複合体を形成し、その後８０ｕｌのＨＥＫ２９３細胞懸濁液が該ＮＴＰ複合体に添加された。
天然型および修飾型のＮＴＰは、２．１ｎＭ、２１ｎＭ、２１０ｎＭ、２．１ｕｍ、２１ｕＭ、２１０ｕｍまたは２．１ｍＭの濃度でトランスフェクションされた。組み合わせのＮＴＰは、８．４ｎＭ、８４ｎＭ、８４０ｎＭ、８．４ｕＭ、８４ｕＭ、８４０ｕＭおよび８．４ｍＭのＮＴＰ合計濃度でトランスフェクションされた。対照の修飾Ｇ‐ＣＳＦ
ｍＲＮＡ（配列番号１；配列中に示されていないおよそ１６０ヌクレオチドのｐｏｌｙＡテール；５’キャップ、キャップ１；完全に修飾された５‐メチルシトシンおよびプソイドウリジン）は、８．４ｎＭの濃度でＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクションされた。ＮＴＰおよび修飾Ｇ‐ＣＳＦ ｍＲＮＡの細胞毒性は、プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ、米国ウィスコンシン州マディソン）のＣＹＴＯ ＴＯＸ−ＧＬＯ（商標）アッセイを使用して、細胞の溶解のためにプレートを振とうする代わりにピペッティングが使用された以外は製造業者のプロトコールに従って、ＨＥＫ２９３細胞への添加後４、２４、４８および７２時間においてアッセイされた。
表１３および１４は、試験されたＮＴＰ、ＮＴＰの組み合わせおよび対照それぞれについての生細胞の比率（％）を示している。未処理の細胞と比較して、個々のＮＴＰでは毒性は見られなかった。これらのデータは、５‐メチルシチジン、プソイドウリジン、およびＮ１‐メチルプソイドウリジンを含む個々のＮＴＰの哺乳動物細胞への導入が、修飾ｍＲＮＡとして導入される場合の有効量の１，０００，０００倍の用量において有毒ではないことを実証している。




実施例６９． ＢＪ繊維芽細胞における先天性免疫応答の研究
ヒトの初代包皮線維芽細胞（ＢＪ繊維芽細胞）はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）から入手され（カタログ番号ＣＲＬ‐２５２２）、１０％ウシ胎児血清が補足されたイーグルの最少必須培地（ＡＴＣＣ、カタログ番号３０‐２００３）にて３７℃、５％ＣＯ２で成長せしめられた。ＢＪ繊維芽細胞は、２４ウェルプレートに細胞密度を０．５ｍｌの培地中で１ウェルあたり３００，０００個として播種された。２５０ｎｇの修飾Ｇ‐ＣＳＦ ｍＲＮＡ（配列番号１に示されるｍＲＮＡ配列；配列中に示されていないおよそ１６０ヌクレオチドのｐｏｌｙＡテール；５’キャップ、キャップ１）であって、５‐メチルシトシンおよびプソイドウリジンで完全に修飾されたもの（Ｇｅｎ１）または５‐メチルシトシンおよびＮ１‐メチルプソイドウリジンで完全に修飾されたもの（Ｇｅｎ２）であり、Ｃａｐ０もしくはＣａｐ１を有するかまたはキャップを持たないものが、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（インビトロジェン、カタログ番号１１６６８‐０１９）を使用して製造業者のプロトコールに従ってトランスフェクションされた。対照試料の、ポリＩ：Ｃ（ＰＩＣ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｌｉｐｏ）、天然のルシフェラーゼｍＲＮＡ（配列番号３に示されるｍＲＮＡ配列；配列中に示されていないおよそ１６０ヌクレオチドのｐｏｌｙＡテール；５’キャップ、キャップ１）および天然のＧ‐ＣＳＦ ｍＲＮＡも、トランスフェクションされた。細胞は１８時間後に採取され、全ＲＮＡが単離されて、ＲＮｅａｓｙ（登録商標）マイクロキット（カタログ番号７４００４）を使用して製造業者のプロトコールに従ってＤＮＡＳＥ（登録商標）による処理が行われた。１００ｎｇの全ＲＮＡは、高容量ｃＤＮＡ逆転写キット（カタログ番号４３６８８１４）を使用して製造業者のプロトコールに従うｃＤＮＡ合成に使用された。次いで該ｃＤＮＡは、バイオラッド（Ｂｉｏｒａｄ）のＣＦＸ３８４（商標）機器で製造業者のプロトコールに従ってサイバーグリーンを使用する定量的リアルタイムＰＣＲによって、先天性免疫応答遺伝子の発現について解析された。表１５は、先天性免疫応答転写物の発現レベルをハウスキーピング遺伝子ＨＰＲＴ（ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ））と比較して示しており、ＨＰＲＴに対しての誘導倍率として表現されている。同表では、一連の標準的な指標物には以下が含まれる、すなわち：ＲＩＧ‐Ｉはレチノイン酸誘導性遺伝子１であり、ＩＬ６はインターロイキン６であり、ＯＡＳ‐１はオリゴアデニル酸シンセターゼ１であり、ＩＦＮｂはインターフェロンβであり、ＡＩＭ２はアブセント・イン・メラノーマ‐２（ａｂｓｅｎｔ ｉｎ ｍｅｌａｎｏｍａ−２）であり、ＩＦＩＴ‐１はインターフェロン‐インデュースト・プロテイン・ウィズ・テトラトリコペプチドリピーツ１（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｉｔｈ ｔｅｔｒａｔｒｉｃｏｐｅｐｔｉｄｅ ｒｅｐｅａｔｓ １）であり、ＰＫＲはプロテインキナーゼＲであり、ＴＮＦａは腫瘍壊死因子αであり、ＩＦＮａはインターフェロンαである。

実施例７０． 先天性免疫応答のｉｎ ｖｉｖｏにおける検出
ｉｎ ｖｉｖｏでのタンパク質産生およびｉｎ ｖｉｖｏでのサイトカイン応答に対するｍＲＮＡの様々な化学修飾の重要性を識別するための取り組みにおいて、メスのＢＡＬＢ／Ｃマウス（ｎ＝５）に、表１６に記載されているような、Ｇ‐ＣＳＦ ｍＲＮＡ（ＧＣＳＦ ｍＲＮＡ ｕｎｍｏｄ）（配列番号１に示されるｍＲＮＡ配列；配列中に示されていないおよそ１６０ヌクレオチドのｐｏｌｙＡテール；）キャップ１の５’キャップを備えたもの、５‐メチルシトシンおよびプソイドウリジンで完全に修飾されたＧ‐ＣＳＦ
ｍＲＮＡ（ＧＣＳＦ ｍＲＮＡ ５ｍｃ／ｐＵ）、５‐メチルシトシンおよびＮ１‐メチルプソイドウリジンで完全に修飾されたＧ‐ＣＳＦ ｍＲＮＡであって５’キャップを備えたもの（ＧＣＳＦ ｍＲＮＡ ５ｍｃ／Ｎ１ｐＵ）もしくは５’キャップを備えていないもの（ＧＣＳＦ ｍＲＮＡ ５ｍｃ／Ｎ１ｐＵ キャップなし）、またはＲ８４８もしくは５％スクロースのいずれかの対照が、筋肉内注射される。

血液は投薬後８時間に収集される。ＥＬＩＳＡを使用して、Ｇ‐ＣＳＦ、ＴＮＦ‐αおよびＩＦＮ‐αのタンパク質レベルがＥＬＩＳＡによって決定される。投薬の８時間後、注射部位から筋肉が収集されて、定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＱＰＣＲ）を使用して該筋肉中のＲＩＧ‐Ｉ、ＰＫＲ、ＡＩＭ‐２、ＩＦＩＴ‐１、ＯＡＳ‐２、ＭＤＡ‐５、ＩＦＮ‐β、ＴＮＦ‐α、ＩＬ‐６、Ｇ‐ＣＳＦ、ＣＤ４５のｍＲＮＡレベルが決定される。
実施例７１． 先天性免疫応答研究のｉｎ ｖｉｖｏにおける検出
メスのＢＡＬＢ／Ｃマウス（ｎ＝５）に、表１７に記載されているような、Ｇ‐ＣＳＦ
ｍＲＮＡ（ＧＣＳＦ ｍＲＮＡ ｕｎｍｏｄ）（配列番号１に示されるｍＲＮＡ配列；配列中に示されていないおよそ１６０ヌクレオチドのｐｏｌｙＡテール；）キャップ１の５’キャップを備えたもの、５‐メチルシトシンおよびプソイドウリジンで完全に修飾されたＧ‐ＣＳＦ ｍＲＮＡ（ＧＣＳＦ ｍＲＮＡ ５ｍｃ／ｐＵ）、５‐メチルシトシンおよびＮ１‐メチルプソイドウリジンで完全に修飾されたＧ‐ＣＳＦ ｍＲＮＡであって５’キャップを備えたもの（ＧＣＳＦ ｍＲＮＡ ５ｍｃ／Ｎ１ｐＵ）もしくは５’キャップを備えていないもの（ＧＣＳＦ ｍＲＮＡ ５ｍｃ／Ｎ１ｐＵ キャップなし）、またはＲ８４８もしくは５％スクロースのいずれかの対照が、筋肉内注射された。血液は投薬の８時間後に収集され、ＥＬＩＳＡを使用してＧ‐ＣＳＦおよびインターフェロン‐α（ＩＦＮ‐α）のタンパク質レベルがＥＬＩＳＡによって決定されて表１７に示されている
表１７に示されるように、未修飾、５ｍｃ／ｐＵ修飾型、および５ｍｃ／Ｎ１ｐＵ修飾型のＧ‐ＣＳＦ ｍＲＮＡは、マウス血清中においてヒトＧ‐ＣＳＦの発現をもたらした。キャップを備えていない５ｍＣ／Ｎ１ｐＵ修飾型Ｇ‐ＣＳＦ ｍＲＮＡは血清中でヒトＧ‐ＣＳＦの発現を示さず、タンパク質翻訳のために５’キャップ構造を有することの重要性が明らかとなった。
予想される通り、ヒトＧ‐ＣＳＦタンパク質は、Ｒ８４８、５％スクロースのみ、および未処理の群では発現されなかった。重要なのは、血清中のマウスＩＦＮ‐αによって測定されたようにサイトカイン産生に有意差が見られたことである。予想通り、未修飾のＧ‐ＣＳＦ ｍＲＮＡはｉｎ ｖｉｖｏにおいて強いサイトカイン応答を実証した（Ｒ８４８の陽性対照より大きい）。５ｍｃ／ｐＵ修飾型のＧ‐ＣＳＦ ｍＲＮＡはｉｎ ｖｉｖｏにおいて低いが検出可能なサイトカイン応答を示したが、５ｍｃ／Ｎ１ｐＵ修飾型のｍＲＮＡは、血清中に検出可能なＩＦＮ‐αを示さなかった（そしてビヒクルまたは未処理の動物と同じであった）。
さらに、５ｍｃ／Ｎ１ｐＵ修飾型ｍＲＮＡの応答は、キャップの有無にかかわらず同じであった。これらのｉｎ ｖｉｖｏにおける結果は、１）未修飾ｍＲＮＡは強い先天性免疫応答を生じる、２）これは５ｍｃ／ｐＵ修飾を１００％組み入れることにより低減されるが排除はされない、３）５ｍｃ／Ｎ１ｐＵ修飾を組み入れると検出可能なサイトカイン応答は生じない、という結論を補強するものである。
最後に、これらの注射剤が５％スクロース（それ単独では影響はない）に含められていることを考えれば、これらの結果は、上記修飾の免疫刺激能を正確に反映しているはずである。
データから、Ｎ１ｐＵ修飾型の分子はより多くのタンパク質を産生する一方でＩＦＮ‐αの発現にはほとんどまたは全く影響を伴わないことが明らかである。さらに、この化学修飾についてはタンパク質産生にキャッピングが必要であることも明らかである。７４８というタンパク質：サイトカイン比は、未修飾ｍＲＮＡの該ＰＣ比（ＰＣ＝９）と比較すると、この化学修飾が、ＩＦＮ‐αに関連した影響または生物学的意義に関係づけられるとおり、はるかに優れていることを意味している。

実施例７２：リポプレックスを使用するｉｎ ｖｉｖｏ送達
Ａ． ヒトＧ‐ＣＳＦの修飾ＲＮＡ
２種類の修飾型ヒトＧ‐ＣＳＦ ｍＲＮＡ（配列番号１に示されるｍＲＮＡ配列；配列中に示されていないおよそ１６０ヌクレオチドのｐｏｌｙＡテール；５’キャップ、キャップ１）（５‐メチルシトシンおよびプソイドウリジンで完全に修飾されたＧ‐ＣＳＦ（Ｇ‐ＣＳＦ）または５‐メチルシトシンおよびＮ１‐メチル‐プソイドウリジンで完全に修飾されたＧ‐ＣＳＦ（Ｇ‐ＣＳＦ‐Ｎ１））のうちの１つを１００μｇ含有している調合物は、体積比３０％のＲＮＡＩＭＡＸ（商標）を用いてリポプレックス化され、Ｃ５７／ＢＬ６マウスに１５０ｕＬとして筋肉内（Ｉ．Ｍ．）送達および２２５ｕＬとして静脈内（Ｉ．Ｖ．）送達された。
３つの対照群が投与を受け、該対照群は、１００μｇの修飾ルシフェラーゼｍＲＮＡ（配列番号２に示されるＩＶＴ ｃＤＮＡ配列；配列番号３に示されるｍＲＮＡ配列、配列中に示されていないおよそ１６０ヌクレオチドのｐｏｌｙＡテール、５’キャップ、キャップ１、各シトシン部位は５‐メチルシトシンで、各ウリジン部位はプソイドウリジンでの置き換えで完全に修飾されている）の筋肉内投与（Ｌｕｃ‐ｕｎｓｐ Ｉ．Ｍ．）もしくは１５０μｇの修飾ルシフェラーゼｍＲＮＡの静脈内投与（Ｌｕｃ‐ｕｎｓｐ Ｉ．Ｖ．）、または１５０ｕＬの調合用バッファーの筋肉内投与（バッファー Ｉ．Ｍ．）であった。調合物の投与の６時間後、血清が収集されてヒトＧ‐ＣＳＦ ＥＬＩＳＡによって該マウス血清中のヒトＧ‐ＣＳＦタンパク質の量が測定された。結果は表１８に示されている。
これらの結果は、５‐メチルシトシン／プソイドウリジン修飾型および５‐メチルシトシン／Ｎ１‐メチルプソイドウリジン修飾型のいずれのヒトＧ‐ＣＳＦ ｍＲＮＡも、リポプレックス調合物としてＩ．Ｖ．またはＩ．Ｍ．投与経路で送達された場合に血清中に特異的なヒトＧ‐ＣＳＦタンパク質の発現をもたらすことができることを実証している。

Ｂ． ヒトＧ‐ＣＳＦ修飾ＲＮＡの比較
１００μｇの修飾ＲＮＡを含有している調合物であって、修飾ＲＮＡは、５‐メチルシトシン（５ｍｃ）およびプソイドウリジン（Ψ）修飾を有する体積比３０％のＲＮＡＩＭＡＸ（商標）を用いてリポプレックス化された修飾ヒトＧ‐ＣＳＦ ｍＲＮＡ（Ｇ‐ＣＳＦ‐Ｇｅｎ１‐リポプレックス）、５ｍｃおよびΨ修飾を有する生理食塩水中の修飾ヒトＧ‐ＣＳＦ ｍＲＮＡ（Ｇ‐ＣＳＦ‐Ｇｅｎ１‐生理食塩水）、Ｎ１‐５‐メチルシトシン（Ｎ１‐５ｍｃ）およびΨ修飾を有する体積比３０％のＲＮＡＩＭＡＸ（商標）を用いてリポプレックス化された修飾ヒトＧ‐ＣＳＦ ｍＲＮＡ（Ｇ‐ＣＳＦ‐Ｇｅｎ２‐リポプレックス）、Ｎ１‐５ｍｃおよびΨ修飾を有する生理食塩水中の修飾ヒトＧ‐ＣＳＦ ｍＲＮＡ（Ｇ‐ＣＳＦ‐Ｇｅｎ２‐生理食塩水）、５ｍｃおよびΨ修飾を有する体積比３０％のＲＮＡＩＭＡＸ（商標）を用いてリポプレックス化された修飾ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ‐リポプレックス）、または５ｍｃおよびΨ修飾で完全に修飾された生理食塩水中のルシフェラーゼｍＲＮＡ（Ｌｕｃ‐生理食塩水）、のいずれかである調合物が、筋肉内（Ｉ．Ｍ．）送達または皮下（Ｓ．Ｃ．）送達され、また各投与方法の対照群には、Ｃ５７／ＢＬ６マウスに調合用バッファー（Ｆ．バッファー）８０ｕＬの用量が与えられた。
注射後１３時間において血清および注射部位からの組織が各マウスから収集され、ヒトＧ‐ＣＳＦタンパク質のレベルを比較するためにＧ‐ＣＳＦ ＥＬＩＳＡによって解析された。筋肉内投与および皮下投与の結果からのマウス血清中のヒトＧ‐ＣＳＦタンパク質の結果は、表１９に示されている。
これらの結果は、５‐メチルシトシン／プソイドウリジンおよび５‐メチルシトシン／Ｎ１‐メチルプソイドウリジンで修飾されたヒトＧ‐ＣＳＦ ｍＲＮＡが、生理食塩水調合物でもリポプレックス調合物でも、Ｉ．Ｍ．またはＳ．Ｃ．投与経路で送達された時に血清中に特異的なヒトＧ‐ＣＳＦタンパク質の発現を生じうることを実証している。表１９に示されるように、５‐メチルシトシン／Ｎ１‐メチルプソイドウリジンで修飾されたヒトＧ‐ＣＳＦ ｍＲＮＡは、一般に、５‐メチルシトシン／プソイドウリジンで修飾されたヒトＧ‐ＣＳＦ ｍＲＮＡと比較して高いＧ‐ＣＳＦタンパク質産生を示している。

実施例７３． 複数部位投与：筋肉内および皮下
Ｇｅｎ１またはＧｅｎ２（５‐メチルシトシン（５ｍｃ）およびプソイドウリジン（Ψ）修飾、Ｇ‐ＣＳＦ‐Ｇｅｎ１；またはＮ１‐５‐メチルシトシン（Ｎ１‐５ｍｃ）およびΨ修飾、Ｇ‐ＣＳＦ‐Ｇｅｎ２）のいずれかとして修飾されて生理食塩水中に調合されたヒトＧ‐ＣＳＦの修飾ｍＲＮＡ（配列番号１に示されるｍＲＮＡ配列；配列中に示されていないおよそ１６０ヌクレオチドのｐｏｌｙＡテール；５’キャップ、キャップ１）は、筋肉内（ＩＭ）注射または皮下（ＳＣ）注射によってマウスに送達された。４回分用量または１日あたり２×５０ｕｇ（２部位）で３日間（２４時間間隔）の注射が実施された。４回目の用量は血液採取およびＣＢＣ解析の６時間前に投与された。対照には、ルシフェラーゼ（配列番号２に示されるＩＶＴ用のｃＤＮＡ配列；配列番号３に示されるｍＲＮＡ配列、配列中に示されていないおよそ１６０ヌクレオチドのｐｏｌｙＡテール、５’キャップ、キャップ１、各シトシン部位について５‐メチルシトシンおよび各ウリジン部位についてプソイドウリジンの置き換えで完全に修飾されたもの）または調合用バッファー（Ｆ．バッファー）が含められた。マウスは、ｍＲＮＡにコードされたヒトＧ‐ＣＳＦの好中球数に対する作用を判定するため、最初のｍＲＮＡ注射の７２時間後（最後のｍＲＮＡ投薬の６時間後）に採血された。投薬レジメンは、結果の好中球数（千個／ｕＬ）とともに表２０に示されている。表２０では、アステリスク（＊）は、ｐ＜０．０５における統計的有意差を示している。
筋肉内投与については、該データから、Ｇｅｎ１ Ｇ‐ＣＳＦ ｍＲＮＡでは第３日において対照に対して好中球数の４倍の増大が、またＧｅｎ２ Ｇ‐ＣＳＦ ｍＲＮＡでは２倍の増大が、明らかとなっている。皮下投与については、該データから、Ｇｅｎ２ Ｇ‐ＣＳＦ ｍＲＮＡでは第３日において対照に対して好中球数の２倍の増大が明らかとなっている。
これらのデータは、５‐メチルシチジン／プソイドウリジン修飾型および５‐メチルシチジン／Ｎ１‐メチルプソイドウリジン修飾型のいずれのｍＲＮＡも、血中好中球数の特異的増大によって証拠づけられるように、生物学的に活性となりうることを実証している。

実施例７４． 静脈内投与
５‐メチルシトシン（５ｍｃ）およびプソイドウリジン（Ψ）修飾で修飾されている（Ｇｅｎ１）か；または修飾されていない、１０％リポプレックス（ＲＮＡＩＭＡＸ（商標））中で調合されたヒトＧ‐ＣＳＦの修飾ｍＲＮＡ（配列番号１に示されるｍＲＮＡ配列；配列中に示されていないおよそ１６０ヌクレオチドのｐｏｌｙＡテール；５’キャップ、キャップ１）は、５０ｕｇのＲＮＡおよび体積１００ｕｌの用量として第０日、第２日および第４日に静脈内（ＩＶ）注射によりマウスに送達された。好中球は第１日、第５日および第８日に測定された。対照には、非特異的な哺乳類ＲＮＡまたは調合用バッファーのみ（Ｆ．バッファー）を含めた。マウスは、ｍＲＮＡにコードされたヒトＧ‐ＣＳＦが好中球数を増大させる作用を判定するために、第１、５および８日に採血された。投薬レジメンは、結果の好中球数（千個／ｕＬ；Ｋ／ｕＬ）とともに表２１に示されている。
静脈内投与について、該データから、Ｇ‐ＣＳＦ修飾ｍＲＮＡでは第５日において対照に対して好中球数が４〜５倍増大したが、未修飾のＧ‐ＣＳＦ ｍＲＮＡまたは非特異的な対照物では増大しなかったことが明らかとなっている。血球数は最後の注射の４日後にベースラインに戻った。白血球集団におけるその他の変化は観察されなかった。
表２１では、アステリスク（＊）はバッファーとの比較でｐ＜０．００１における統計的有意差を示している。
これらのデータは、リポプレックスで調合された５‐メチルシチジン／プソイドウリジン修飾型ｍＲＮＡが、Ｉ．Ｖ．投与経路で送達された時、血中好中球数の特異的増大によって証拠づけられるように、生物学的に活性となりうることを実証している。他の細胞サブセットに有意な変化はなかった。同様に投与された未修飾のＧ‐ＣＳＦ ｍＲＮＡは、好中球数に対する薬理作用を示さなかった。

実施例７５：投与経路
様々な投与経路を使用する分割投薬（ｓｐｌｉｔ ｄｏｓｉｎｇ）について調査するための研究が実施された。修飾ｍＲＮＡ薬物の曝露を増大させ、かつタンパク質産生を改善する方法を調べるために、複数の皮下または筋肉内注射部位を一度に利用する研究が設計かつ実施された。発現されるタンパク質生成物の検出に加えて、タンパク質の生理機能の評価も、被験動物由来の試料を解析することによって判定された。
意外にも、修飾ｍＲＮＡの分割投薬は、単回の単位用量投薬または複数回投薬により生じるよりも大きなタンパク質産生および表現型応答を生じることが分かった。
分割投薬実験の設計には、ヒトエリスロポエチン（ＥＰＯ）の修飾ｍＲＮＡ（配列番号５に示されるｍＲＮＡ配列；配列中に示されていないおよそ１６０ヌクレオチドのｐｏｌｙＡテール；５’キャップ、キャップ１）またはルシフェラーゼ修飾ｍＲＮＡ（配列番号３に示されるｍＲＮＡ配列；配列中に示されていないおよそ１６０ヌクレオチドのｐｏｌｙＡテール；５’キャップ、キャップ１）が、単独でバッファーに含めて投与されるかまたは３０％リポプレックス（ＲＮＡＩＭＡＸ（商標））を用いて調合されて使用することを伴った。投薬ビヒクル（バッファー）は、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ２、２ｍＭ Ｎａ＋‐リン酸塩（１．４ｍＭリン酸一ナトリウム；０．６ｍＭ第二リン酸ナトリウム）、および０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ６．５、で構成された。ｐＨは水酸化ナトリウムを使用して調整され、最終溶液はフィルタ濾過滅菌された。ｍＲＮＡは、各シトシンを５メチルＣ（５ｍｅＣ）で、また各ウリジン部位をプソイドウリジンで置き換えることにより修飾された。
１群当たり４匹のマウスに、表２２に略述された投薬チャートにより筋肉内（Ｉ．Ｍ．）、静脈内（Ｉ．Ｖ．）、または皮下（Ｓ．Ｃ．）投与が行われた。血清は注射の１３時間後にすべてのマウスから収集され、組織は、筋肉内および皮下の群について注射部位から収集され、またひ臓、肝臓および腎臓は静脈内の群から収集された。筋肉内の群からの結果および皮下の群の結果は表２３に示されている。

実施例７６：様々な脂質比率を使用するｉｎ ｖｉｖｏ送達
修飾ｍＲＮＡは、様々な脂質比率およびその結果生じるタンパク質発現を評価するために、Ｃ５７／ＢＬ６マウスに送達された。１００μｇの修飾ヒトＥＰＯ ｍＲＮＡ（配列番号５に示されるｍＲＮＡ配列；配列中に示されていないおよそ１６０ヌクレオチドのｐｏｌｙＡテール；５’キャップ、キャップ１；５‐メチルシトシンおよびプソイドウリジンで完全に修飾されている）が１０％、３０％もしくは５０％のＲＮＡＩＭＡＸ（商標）を用いてリポプレックス化された調合物、１００μｇの修飾ルシフェラーゼｍＲＮＡ（配列番号２に示されるＩＶＴ ｃＤＮＡ配列；配列番号３に示されるｍＲＮＡ配列、配列中に示されていないおよそ１６０ヌクレオチドのｐｏｌｙＡテール、５’キャップ、キャップ１、各シトシンについて５‐メチルシトシンおよび各ウリジン部位についてプソイドウリジンへの置き換えで完全に修飾されている）が１０％、３０％もしくは５０％のＲＮＡＩＭＡＸ（商標）を用いてリポプレックス化された調合物、または調合用バッファーは、単回の７０μｌ用量としてマウスに筋肉内投与された。注射の１３時間後に血清が収集され、各マウスにおけるヒトＥＰＯタンパク質レベルを決定するためにヒトＥＰＯ ＥＬＩＳＡが行われた。ヒトＥＰＯ ＥＬＩＳＡの結果は、表２４に示されるように、筋肉で発現された修飾ヒトＥＰＯが、様々な比率（％）のＲＮＡＩＭＡＸ（商標）それぞれについて血清中へ分泌されることを示している。

実施例７７：ラットにおける修飾ＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏ送達
修飾ｍＲＮＡのタンパク質産生は、メスのスプラーグ・ドーリー（Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ）ラット（ｎ＝６）に修飾Ｇ‐ＣＳＦ ｍＲＮＡまたは修飾第ＩＸ因子ｍＲＮＡを送達することにより評価された。ラットは、１００ｕｌ中に４００ｕｇの、５‐メチルシトシンおよびプソイドウリジンで完全に修飾されたＧ‐ＣＳＦ ｍＲＮＡ（配列番号１に示されるｍＲＮＡ配列；配列中に示されていないおよそ１６０ヌクレオチドのｐｏｌｙＡテール；５’キャップ、キャップ１）（Ｇ‐ＣＳＦ Ｇｅｎ１）、５‐メチルシトシンおよびＮ１‐メチルプソイドウリジンで完全に修飾されたＧ‐ＣＳＦ ｍＲＮＡ（Ｇ‐ＣＳＦ Ｇｅｎ２）、または５‐メチルシトシンおよびプソイドウリジンで完全に修飾された第ＩＸ因子ｍＲＮＡ（配列番号６に示されるｍＲＮＡ配列；配列中に示されていないおよそ１６０ヌクレオチドのｐｏｌｙＡテール；５’キャップ、キャップ１）（第ＩＸ因子 Ｇｅｎ１）であって、凍結乾燥形態から５％スクロース中に再構成されたものを注射された。血液は注射の８時間後に収集されて、血清中のＧ‐ＣＳＦタンパク質レベルはＥＬＩＳＡによって測定された。表２５は８時間後の血清中のＧ‐ＣＳＦタンパク質レベルを示している。
これらの結果は、Ｇ‐ＣＳＦ Ｇｅｎ１およびＧ‐ＣＳＦ Ｇｅｎ２の修飾ｍＲＮＡがいずれも単回の筋肉内注射後にラットにおいてヒトＧ‐ＣＳＦタンパク質を産生することができること、ならびにヒトＧ‐ＣＳＦタンパク質の産生はＧｅｎ２の化学構造を使用するとＧｅｎ１の化学構造よりも向上することを実証している。

実施例７８． 化学修飾：ｉｎ ｖｉｔｒｏでの研究
Ａ． ＰＢＭＣにおけるｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニング
表２６および２７に略述された化学修飾で完全に修飾された５００ｎｇのＧ‐ＣＳＦ（配列番号１に示されるｍＲＮＡ配列；配列中に示されていないおよそ１６０ヌクレオチドのｐｏｌｙＡテール；５’キャップ、キャップ１）ｍＲＮＡは、０．４ｕＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を用いて３名の健康な血液ドナー由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）にトランスフェクションされた。ＬＰＳ、Ｒ８４８、Ｐ（Ｉ）Ｐ（Ｃ）、およびｍＣｈｅｒｒｙ（配列番号４に示されるｍＲＮＡ配列；配列中に示されていないおよそ１６０ヌクレオチドのｐｏｌｙＡテール；５’キャップ、キャップ１；５‐メチルシトシンおよびプソイドウリジンで完全に修飾されている）の対照試料も解析された。上清が採取され、Ｇ‐ＣＳＦタンパク質の発現、ならびにサイトカインのインターフェロン‐α（ＩＦＮ‐α）および腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ‐α）の誘導を判定するためにＥＬＩＳＡによって解析されるまで、凍結保存された。Ｇ‐ＣＳＦのタンパク質発現は表２６に示され、ＩＦＮ‐αおよびＴＮＦ‐αの発現は表２７に示されている。
表２６のデータは、全てではないが多数の化学修飾が、ＰＢＭＣにおいてヒトＧ‐ＣＳＦを生産的に産生させるために使用されうることを実証している。注目すべきは、１００％のＮ１‐メチルプソイドウリジン置換は最高レベルのヒトＧ‐ＣＳＦ産生を示すことである（プソイドウリジン自体よりほぼ１０倍高い）。Ｎ１‐メチルプソイドウリジンが５‐メチルシチジンと組み合わせて使用される場合も、高レベルのヒトＧ‐ＣＳＦタンパク質が産生される（これもプソイドウリジンが５‐メチルシチジンと組み合わせて使用される場合よりも高い）。
ＰＢＭＣ中におけるタンパク質産生とサイトカイン産生との間の逆相関を考えると、表２７においても同様の傾向が見られ、同表ではＮ１‐メチルプソイドウリジンを用いた１００％置換によりサイトカイン誘導がもたらされず（トランスフェクションのみの対照と同様である）かつプソイドウリジンはバックグラウンドより高い検出可能なサイトカイン誘導を示している。
Ｎ６‐メチルアデノシンおよびα‐チオシチジンのような他の修飾はサイトカイン刺激を増大させるようである。




Ｂ． ＨｅＬａ細胞におけるｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニング
トランスフェクションの前日、２０，０００個のＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ‐２；米国バージニア州マナッサス）がトリプシン‐ＥＤＴＡ溶液（ライフテクノロジーズ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、米国ニューヨーク州グランドアイランド）を用いた処理によって採取され、９６ウェル細胞培養プレート（コーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ）、米国バージニア州マナッサス）に１ウェルあたりの総体積１００ｕｌのＥＭＥＭ培地（１０％ＦＣＳおよび１×Ｇｌｕｔａｍａｘ（商標）を補足）に含めて播種された。該細胞は、５％ＣＯ２雰囲気中３７ｏＧで一晩成長せしめられた。翌日、表２８に記載された化学修飾を備えた８３ｎｇのルシフェラーゼ修飾ＲＮＡ（配列番号３に示されるｍＲＮＡ配列；配列中に示されていないおよそ１６０ヌクレオチドのｐｏｌｙＡテール；５’キャップ、キャップ１）は、最終体積１０ｕｌのＯＰＴＩ‐ＭＥＭ（ライフテクノロジーズ、米国ニューヨーク州グランドアイランド）中で希釈された。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（ライフテクノロジーズ、米国ニューヨーク州グランドアイランド）がトランスフェクション試薬として使用されて、０．２ｕｌが最終体積１０ｕｌのＯＰＴＩ‐ＭＥＭに希釈された。室温で５分間のインキュベーションの後、両溶液は組み合わされて室温でさらに１５分インキュベーションされた。その後、組み合わされた２０ｕｌの該溶液は、ＨｅＬａ細胞を含有する１００ｕｌの細胞培養培地に添加されて室温でインキュベーションされた。
１８〜２２時間のインキュベーション後、ルシフェラーゼを発現している細胞は１００ｕｌのパッシブライシスバッファー（Ｐａｓｓｉｖｅ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ）（プロメガ、米国ウィスコンシン州マディソン）を用いて製造業者の指示書に従って溶解された。溶解産物のアリコートは白色の不透明なポリスチレン製９６ウェルプレート（コーニング、米国バージニア州マナッサス）に移され、１００ｕｌの完全ルシフェラーゼアッセイ溶液（プロメガ、米国ウィスコンシン州マディソン）と組み合わされた。溶解産物の体積は、最も強いシグナルを生じる試料について１ウェルあたり２００万（２ ｍｉｏ）以下の相対発光量（ＲＬＵ）が検出されるまで調整または希釈され、試験された各化学構造物のＲＬＵは表２８に示されている。プレートリーダはバイオテク（ＢｉｏＴｅｋ）のＳｙｎｅｒｇｙ（商標）Ｈ１（バイオテク（ＢｉｏＴｅｋ）、米国バーモント州ウィヌースキー）であった。試薬の入っていないプレートのバックグラウンドシグナルは１ウェル当たり約２００相対発光量であった。
これらの結果は、全てではないが多数の化学修飾が、ＨｅＬａ細胞においてヒトＧ‐ＣＳＦを生産的に産生させるために使用されうることを実証している。注目すべきは、１００％のＮ１‐メチルプソイドウリジン置換は最高レベルのヒトＧ‐ＣＳＦ産生を示すことである。

Ｃ． ウサギ網状赤血球抽出液におけるｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニング
ルシフェラーゼｍＲＮＡ（配列番号３に示されるｍＲＮＡ配列；配列中に示されていないおよそ１６０ヌクレオチドのｐｏｌｙＡテール；５’キャップ、キャップ１）は、表２９に列挙された化学修飾で修飾され、ヌクレアーゼを含まない滅菌水中で１０ｕｌ中に最終量２５０ｎｇまで希釈された。該希釈ルシフェラーゼは新たに調製されたばかりのウサギ網状赤血球抽出液４０ｕｌに添加され、ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳反応は、標準的な１．５ｍＬポリプロピレン製反応チューブ（サーモフィッシャー、米国マサチューセッツ州ウォルサム）の中で、ドライヒートブロックにて３０℃で行われた。該翻訳アッセイは、ウサギ網状赤血球抽出液（ヌクレアーゼ処理済）キット（プロメガ、米国ウィスコンシン州マディソン）を用いて製造業者の指示書に従って行われた。反応バッファーに、ロイシンまたはメチオニンのいずれかを欠く添付のアミノ酸ストック溶液の１対１混成物が加えられて、有効なｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳を可能にするのに十分な量の両アミノ酸を含有する反応混合物が得られた。
６０分間のインキュベーションの後、該反応は反応チューブを氷上に置くことにより停止された。ルシフェラーゼの修飾ＲＮＡを含有するｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳反応物のアリコートは白色の不透明なポリスチレン製９６ウェルプレート（コーニング、米国バージニア州マナッサス）に移され、１００ｕｌの完全ルシフェラーゼアッセイ溶液（プロメガ、米国ウィスコンシン州マディソンと組み合わされた。ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳反応物の体積は、最も強いシグナルを生じる試料について１ウェルあたり２００万（２ ｍｉｏ）以下の相対発光量（ＲＬＵ）が検出されるまで調整または希釈され、試験された各化学構造物のＲＬＵは表２９に示されている。プレートリーダはバイオテクのＳｙｎｅｒｇｙ（商標）Ｈ１（バイオテク、米国バーモント州ウィヌースキー）であった。試薬の入っていないプレートのバックグラウンドシグナルは１ウェル当たり約２００相対発光量であった。
これらの無細胞での翻訳の結果はＨｅＬａにおけるタンパク質産生の結果と非常によく相関し、同じ修飾は概して、両方の系においてうまく機能するかまたはうまく機能しない。注目すべき１つの例外は、無細胞翻訳系でうまく機能したがＨｅＬａ細胞のトランスフェクション系では機能しなかった、５‐ホルミルシチジンで修飾されたルシフェラーゼｍＲＮＡである。２つのアッセイ間における同様の差異は５‐ホルミルシチジンで修飾されたＧ‐ＣＳＦ ｍＲＮＡでも見出された。

実施例７９． 化学修飾：ｉｎ ｖｉｖｏでの研究
Ａ． Ｇ‐ＣＳＦ修飾ｍＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏスクリーニング
Ｂａｌｂ‐Ｃマウス（ｎ＝４）は、表３０に略述された化学修飾で完全に修飾され、１×ＰＢＳ中で調合された修飾Ｇ‐ＣＳＦ ｍＲＮＡ（配列番号１に示されるｍＲＮＡ配列；配列中に示されていないおよそ１６０ヌクレオチドのｐｏｌｙＡテール；５’キャップ、キャップ１）を、それぞれの脚に筋肉内注射される。対照のルシフェラーゼ修飾ｍＲＮＡ（配列番号３に示されるｍＲＮＡ配列；配列中に示されていないおよそ１６０ヌクレオチドのｐｏｌｙＡテール；５’キャップ、キャップ１；プソイドウリジンおよび５‐メチルシトシンで完全に修飾されている）ならびに対照のＰＢＳについても試験が行われる。８時間後、ＥＬＩＳＡによってＧ‐ＣＳＦタンパク質レベル サイトカインレベルを判定するために血清が収集される。

Ｂ． ルシフェラーゼ修飾ｍＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏスクリーニング
Ｂａｌｂ‐Ｃマウス（ｎ＝４）は、表３１に略述された化学修飾で完全に修飾され、１×ＰＢＳ中で調合された修飾ルシフェラーゼｍＲＮＡ（配列番号３に示されるｍＲＮＡ配列；配列中に示されていないおよそ１６０ヌクレオチドのｐｏｌｙＡテール；５’キャップ、キャップ１）を４２〜１０３ｕｇ含んでいる２００ｕｌを、皮下注射された。対照のＰＢＳについても試験が行われた。修飾ルシフェラーゼｍＲＮＡの用量は表３１にも略述されている。投薬の８時間後、マウスはルシフェラーゼ発現を判定するために撮像された。撮像の２０分前に、マウスはＤ‐ルシフェリン溶液を１５０ｍｇ／ｋｇとして腹腔内注射された。その後、動物は麻酔され、画像はＩＶＩＳ（登録商標）Ｌｕｍｉｎａ ＩＩ画像化システム（パーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ））を用いて得られた。生物発光はマウス全体の全光束（光子／秒）として測定された。
表３１に実証されるように、２’‐フルオロウリジンを例外として、全てのルシフェラーゼｍＲＮＡ修飾化学構造物がｉｎ ｖｉｖｏでの活性を示した。さらに、１‐メチルプソイドウリジンで修飾されたｍＲＮＡはルシフェラーゼの極めて高い発現（プソイドウリジンを含有するｍＲＮＡより５倍高い発現）を示した。

実施例８０． 組み合わせルシフェラーゼ修飾ｍＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏスクリーニング
Ｂａｌｂ‐Ｃマウス（ｎ＝４）は、表３２に略述された化学修飾で完全に修飾され、１×ＰＢＳ中で調合された修飾ルシフェラーゼｍＲＮＡ（配列番号３に示されるｍＲＮＡ配列；配列中に示されていないおよそ１６０ヌクレオチドのｐｏｌｙＡテール；５’キャップ、キャップ１）を１００ｕｇ含んでいる２００ｕｌを、皮下注射された。対照のＰＢＳについても試験が行われた。修飾ルシフェラーゼｍＲＮＡの用量は表２９にも略述されている。投薬の８時間後、マウスはルシフェラーゼ発現を判定するために撮像された。撮像の２０分前に、マウスはＤ‐ルシフェリン溶液を１５０ｍｇ／ｋｇとして腹腔内注射された。その後、動物は麻酔され、画像はＩＶＩＳ Ｌｕｍｉｎａ ＩＩ画像化システム（パーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ））を用いて得られた。生物発光はマウス全体の全光束（光子／秒）として測定された。
表３２に実証されるように、全てのルシフェラーゼｍＲＮＡ修飾化学構造物（組み合わせとして）がｉｎ ｖｉｖｏでの活性を示した。さらに、修飾ｍＲＮＡの中にＮ１‐メチルプソイドウリジンが（Ｎ４‐アセチルシチジンまたは５ メチルシチジンとともに）存在すると、プソイドウリジンを使用して同じ組み合わせが試験される場合よりも高い発現を示した。総合すると、これらのデータは、Ｎ１‐メチルプソイドウリジンを含んでいるルシフェラーゼｍＲＮＡが、単独で使用された場合（表３１）であろうと他の修飾ヌクレオチドと組み合わせて使用された場合（表３２）であろうとｉｎ ｖｉｖｏにおいて高いタンパク質発現をもたらすことを示している。

実施例８１． 修飾ＲＮＡの安定性
Ａ． 修飾ＲＮＡの保存
修飾ＲＮＡの完全性を保持する保存条件についてのよりよい理解を得るために、安定性実験が行なわれた。未修飾のＧ‐ＣＳＦ ｍＲＮＡ（配列番号１に示されるｍＲＮＡ配列；配列中に示されていないおよそ１６０ヌクレオチドのｐｏｌｙＡテール；５’キャップ、キャップ１）、５‐メチルシトシンおよびプソイドウリジンで完全に修飾されたＧ‐ＣＳＦ ｍＲＮＡ、ならびに５‐メチルシトシンおよびプソイドウリジンで完全に修飾されたＧ‐ＣＳＦ ｍＲＮＡであって体積比０．７５％のＲＮＡＩＭＡＸ（商標）を用いてリポプレックス化されたものが、５０℃、４０℃、３７℃、２５℃、４℃または−２０℃で保存された。該ｍＲＮＡが０時間、２時間、６時間、２４時間、４８時間、５日間および１４日間保存された後、該ｍＲＮＡはバイオ‐ラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）のＥＸＰＥＲＩＯＮ（商標）システムを使用してゲル電気泳動により解析された。上記の修飾、未修飾およびリポプレックス化されたＧ‐ＣＳＦ ｍＲＮＡはさらに、４０℃のＲＮＡＳＴＡＢＬＥ（登録商標）（バイオマトリカ社（Ｂｉｏｍａｔｒｉｃａ， Ｉｎｃ．）、米国カリフォルニア州サンディエゴ）の中または水中で−８０℃もしくは４０℃にて３５日間保存されてからゲル電気泳動によって解析された。
安定化剤を伴わない全てのｍＲＮＡ試料が４℃または−２０℃での保存後の２週間後に安定であった。修飾されたＧ‐ＣＳＦ ｍＲＮＡは、リポプレックスの有無にかかわらず、未修飾のＧ‐ＣＳＦよりも、２５℃（完全に安定なのが５日までに対して４８時間）、３７℃（完全に安定なのが２４時間に対して６時間）および５０℃（完全に安定なのが６時間に対して２時間）で保存された時に安定していた。未修飾のＧ‐ＣＳＦ ｍＲＮＡ、修飾されたＧ‐ＣＳＦ ｍＲＮＡであってリポプレックス伴うもの、または伴わないものは、１２回の凍結／融解サイクルに耐えた。
４０℃の安定化剤の中で保存されたｍＲＮＡ試料は３５日後に−８０℃の水中で保存されたｍＲＮＡ試料と同様の安定性を示したが、４０℃の水中で保存されたｍＲＮＡは１８日後に激しい分解を示した。
実施例８２． ＢＪ繊維芽細胞における細胞生存率
ヒトの初代包皮線維芽細胞（ＢＪ繊維芽細胞）はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）から入手され（カタログ番号ＣＲＬ‐２５２２）、１０％ウシ胎児血清が補足されたイーグルの最少必須培地（ＡＴＣＣ、カタログ番号３０‐２００３）にて３７℃、５％ＣＯ２で成長せしめられた。ＢＪ繊維芽細胞は、２４ウェルプレートに細胞密度を０．５ｍｌの培地中で１ウェルあたり１３０，０００個として播種された。２５０ｎｇの修飾Ｇ‐ＣＳＦ ｍＲＮＡ（配列番号１に示されるｍＲＮＡ配列；配列中に示されていないおよそ１６０ヌクレオチドのｐｏｌｙＡテール；５’キャップ、キャップ１）であって、５‐メチルシトシンおよびプソイドウリジンで完全に修飾されたもの（Ｇｅｎ１）、または５‐メチルシトシンおよびＮ１‐メチルプソイドウリジンで完全に修飾されたもの（Ｇｅｎ２）が、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（インビトロジェン、カタログ番号１１６６８‐０１９）を使用して製造業者のプロトコールに従ってトランスフェクションされた。対照試料のＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（ＬＦ２０００）および未修飾Ｇ‐ＣＳＦ ｍＲＮＡもトランスフェクションされた。修飾ｍＲＮＡまたは対照試料は４日間毎日トランスフェクションされた。トランスフェクション後の細胞の生存率は、最初のトランスフェクションの６時間後および２４時間後（Ｔ１、６時間またはＴ１、２４時間）、ならびに２回目のトランスフェクションの２４時間後（Ｔ２、２４時間）および４回目のトランスフェクションの２４時間後（Ｔ４、２４時間）に評価された。
細胞生存率を決定するために、培地は完全に削除され、細胞は、緩く付着している細胞を洗い流すために６００ｕｌのＣａ２＋／Ｍｇ２＋を含まない滅菌ＰＢＳ（ギブコ／ライフテクノロジーズ（Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、米国バージニア州マナッサス）で１回洗浄された。ＰＢＳは除去および廃棄された。各ウェル中の清浄化された繊維芽細胞は、２２０ｕｌの希釈されたＣＥＬＬ ＴＩＴＥＲ ＧＬＯ（登録商標）（プロメガ、カタログ番号Ｇ７５７０）ストック溶液で処理された（ＣＥＬＬ ＴＩＴＥＲ ＧＬＯ（登録商標）ストック溶液は等量の滅菌ＰＢＳで１：１にさらに希釈された）。プレートから細胞を剥がして溶解過程を速めるために滅菌ピペットチップが使用された。
２つの時間間隔すなわちＴ１、２４時間およびＴ２、２４時間については、代替プロトコールが適用された。細胞は上述のようにしてＰＢＳで洗浄され、続いて、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液（ギブコ／ライフテクノロジーズ、米国バージニア州マナッサス）でトリプシン処理された。細胞は、トリプシンインヒビターを含有する培地５００ｕｌの中で分離および収集された。細胞は１２００ｒｃｆで５分間の遠心分離処理により採取された。細胞ペレットは５００ｕｌのＰＢＳに再懸濁された。この細胞懸濁液は氷中に保たれ、そのうち１００ｕｌが希釈されていないＣｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏ溶液１００ｕｌと合わされた。
その後、ＣＥＬＬ ＴＩＴＥＲ ＧＬＯ（登録商標）溶解産物はすべて室温で２０分間インキュベーションされた。２０ｕｌの溶解産物は、白色の不透明なポリスチレン製９６ウェルプレート（コーニング、米国バージニア州マナッサス）に移され、１００ｕｌの希釈されたＣＥＬＬ ＴＩＴＥＲ ＧＬＯ（登録商標）溶液と合わされた。使用されたプレートリーダはバイオテクのＳｙｎｅｒｇｙ（商標）Ｈ１（バイオテク、米国バーモント州ウィヌースキー）であり、絶対値は、１００％細胞生存率としての未処理のＢＪ繊維芽細胞のシグナルに対して標準化された。ＢＪ繊維芽細胞についての生存率（％）は表３３に示されている。
重要なのは、これらの実験はすべて、インターフェロンまたはその他のサイトカインの阻害剤が存在しない状態で行なわれ、よって様々なｍＲＮＡの細胞毒性の正確な尺度を表わしているということである。
これらの結果は、未修飾ｍＲＮＡを用いたＢＪ繊維芽細胞の反復トランスフェクションが細胞生存率の低下をもたらすことを実証しており、これは早くも最初のトランスフェクションの２４時間後（Ｔ１、２４時間）に明らかであり、その後の時点でも継続して明らかかつ一層顕著である。
５メチルシチジンおよびプソイドウリジンで修飾されたｍＲＮＡの反復トランスフェクションに伴う生存率の低下もあり、これは、毎日のトランスフェクションの４回目の２４時間後（Ｔ４、２４時間）において明らかである。この実験全体を通じて、５メチルシチジンおよびＮ１‐メチルプソイドウリジンで修飾されたｍＲＮＡを使用すると細胞の生存率の低下は見られない。これらの結果は、反復トランスフェクションの下で解析された場合、５メチルシチジンおよびＮ１‐メチルプソイドウリジンを含有しているｍＲＮＡは細胞の生存率を改善したことを実証している。修飾ｍＲＮＡを反復して投与することができるということはほとんどの治療的適用において重要であり、また細胞毒性を伴わずにそうすることができること自体も重要である。理論に束縛されるものではないが、１回のトランスフェクションに伴う応答遺伝子が、タンパク質産生の減少、サイトカイン誘導、および最終的には細胞生存率の低下をもたらしている可能性があると考えられる。これらの結果は、Ｎ１‐メチルプソイドウリジンを含有するｍＲＮＡがこの点に関して未修飾ｍＲＮＡおよびプソイドウリジンで修飾されたｍＲＮＡのいずれと比べても改善されたプロファイルを示していることと一致する。

実施例８３． ＢＪ繊維芽細胞における先天性免疫応答
ヒトの初代包皮線維芽細胞（ＢＪ繊維芽細胞）はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）から入手され（カタログ番号ＣＲＬ‐２５２２）、１０％ウシ胎児血清が補足されたイーグルの最少必須培地（ＡＴＣＣ、カタログ番号３０‐２００３）にて３７℃、５％ＣＯ２で成長せしめられる。ＢＪ繊維芽細胞は、２４ウェルプレートに細胞密度を０．５ｍｌの培地中で１ウェルあたり１３０，０００個として播種された。２５０ｎｇの修飾Ｇ‐ＣＳＦ ｍＲＮＡ（配列番号１に示されるｍＲＮＡ配列；配列中に示されていないおよそ１６０ヌクレオチドのｐｏｌｙＡテール；５’キャップ、キャップ１）であって、５‐メチルシトシンおよびプソイドウリジンで完全に修飾されたもの（Ｇｅｎ１）、または５‐メチルシトシンおよびＮ１‐メチルプソイドウリジンで完全に修飾されたもの（Ｇｅｎ２）は、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（インビトロジェン、カタログ番号１１６６８‐０１９）を使用して製造業者のプロトコールに従ってトランスフェクションされる。対照試料のＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００および未修飾Ｇ‐ＣＳＦ ｍＲＮＡ（天然のＧ‐ＣＳＦ）もトランスフェクションされる。細胞は５日間連続してトランスフェクションされる。トランスフェクション複合体は各回のトランスフェクションの４時間後に除去される。
培養上清は、毎日トランスフェクション後に、分泌されたＧＣＳＦ（アール・アンド・ディー・システムズ（Ｒ ａｎｄ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、カタログ番号ＤＣＳ５０）、腫瘍壊死因子‐α（ＴＮＦ‐α）およびインターフェロンα（ＩＦＮ‐α）について、ＥＬＩＳＡにより製造業者のプロトコールに従ってアッセイされる。細胞は、ＣＥＬＬ ＴＩＴＥＲ ＧＬＯ（登録商標）（プロメガ、カタログ番号Ｇ７５７０）を使用して、初回のトランスフェクションの６時間後および１８時間後ならびにその後１日おきに生存率について解析される。同時に、採取された細胞から、ＲＮＡＥＡＳＹマイクロキット（カタログ番号７４００４）を使用して製造業者のプロトコールに従って全ＲＮＡが単離されかつＤＮＡＳＥ（登録商標）で処理される。１００ｎｇの全ＲＮＡは、高容量ｃＤＮＡ逆転写キット（アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、カタログ番号４３６８８１４）を使用して製造業者のプロトコールに従ってｃＤＮＡ合成に使用される。次いで該ｃＤＮＡは、バイオラッドのＣＦＸ３８４機器で製造業者のプロトコールに従ってサイバーグリーンを使用する定量的リアルタイムＰＣＲによって、先天性免疫応答遺伝子の発現について解析される。
実施例８４． 野生型Ｔ７ポリメラーゼを用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ転写
ルシフェラーゼｍＲＮＡ（配列番号３に示されるｍＲＮＡ配列；配列中に示されていないおよそ１６０ヌクレオチドのｐｏｌｙＡテール；５’キャップ、キャップ１）、およびＧ‐ＣＳＦ ｍＲＮＡ（配列番号１に示されるｍＲＮＡ配列；配列中に示されていないおよそ１６０ヌクレオチドのｐｏｌｙＡテール；５’キャップ、キャップ１）は、これまでに記載されたような野生型Ｔ７ポリメラーゼを使用して、表３４〜３７に列挙された様々な化学構造物および化学構造物の組み合わせを用いて完全に修飾された。
該翻訳反応の収量は分光光度測定（ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｍｅｔｒｉｃ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ）（ＯＤ２６０）によって決定され、ルシフェラーゼについての収量は表３４に、Ｇ‐ＣＳＦについては表３６に示されている。
ルシフェラーゼおよびＧ‐ＣＳＦの修飾ｍＲＮＡはさらに酵素的キャッピング反応に供され、各修飾ｍＲＮＡキャッピング反応は分光光度測定（ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｍｅｔｉｃ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ）（ＯＤ２６０）によって収量について、またバイオアナライザを使用して正確な大きさについて、評価された。キャッピング反応からの収量はルシフェラーゼについては表３５に示されており、Ｇ‐ＣＳＦについては表３７に示されている。




実施例８５． 突然変異体Ｔ７ポリメラーゼを用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ転写
ルシフェラーゼｍＲＮＡ（配列番号３に示されるｍＲＮＡ配列；配列中に示されていないおよそ１６０ヌクレオチドのｐｏｌｙＡテール；５’キャップ、キャップ１）およびＧ‐ＣＳＦ ｍＲＮＡ（配列番号１に示されるｍＲＮＡ配列；配列中に示されていないおよそ１６０ヌクレオチドのｐｏｌｙＡテール；５’キャップ、キャップ１）は、突然変異体Ｔ７ポリメラーゼ（Ｄｕｒａｓｃｒｉｂｅ（登録商標）Ｔ７転写キット（カタログ番号ＤＳ０１０９２５）（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ（登録商標）、米国ウィスコンシン州マディソン）を使用して表３８〜４１に列挙された様々な化学構造物および化学構造物の組み合わせを用いて完全に修飾された。
該翻訳反応の収量は分光光度測定（ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｍｅｔｒｉｃ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ）（ＯＤ２６０）によって決定され、ルシフェラーゼについての収量は表３８に、Ｇ‐ＣＳＦについては表４０に示されている。
ルシフェラーゼおよびＧ‐ＣＳＦの修飾ｍＲＮＡはさらに酵素的キャッピング反応に供され、各修飾ｍＲＮＡキャッピング反応は分光光度測定（ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｍｅｔｉｃ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ）（ＯＤ２６０）によって収量について、またバイオアナライザを使用して正確な大きさについて、評価された。キャッピング反応からの収量はルシフェラーゼについては表３９に示されており、Ｇ‐ＣＳＦについては表４１に示されている。




実施例８６． ２’Ｏ‐メチルおよび２’フルオロ化合物
ルシフェラーゼｍＲＮＡ（配列番号３に示されるｍＲＮＡ配列；配列中に示されていないおよそ１６０ヌクレオチドのｐｏｌｙＡテール；５’キャップ、キャップ１）は、表４２の化学構造物を用いて完全に修飾されたものとして生産され、かつ突然変異体Ｔ７ポリメラーゼ（Ｄｕｒａｓｃｒｉｂｅ（登録商標）Ｔ７転写キット（カタログ番号ＤＳ０１０９２５）（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ（登録商標）、米国ウィスコンシン州マディソン）を使用して転写された。２’フルオロを含有するｍＲＮＡはＤｕｒａｓｃｒｉｂｅ Ｔ７を使用して作製されたが、２’Ｏメチルを含有するｍＲＮＡはＤｕｒａｓｃｒｉｂｅ Ｔ７を使用して転写することができなかった。
２’Ｏメチル修飾ｍＲＮＡの組み入れは、恐らくは他の突然変異体Ｔ７ポリメラーゼを使用すれば遂行される可能性もありうる（ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）、２００４年、第２２巻、ｐ．１１５５−１１６０；ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）、２００２年、第３０巻、ｅ１３８）。別例として、２’ＯＭｅ修飾は、酵素的手段を使用して転写後に導入されることも考えられる。
糖の２’基への修飾の導入には数多くの潜在的長所がある。２’ＯＭｅ置換は、２’フルオロ置換のように、ヌクレアーゼに対する保護となることが知られており、かつさらにｓｉＲＮＡおよびアンチセンスのような他の核酸に組み入れられた時に先天性免疫認識を防止することも示されている（全体が組み入れられる、クルック（Ｃｒｏｏｋｅ）編、「アンチセンス医薬のテクノロジー（Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｄｒｕｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、第２版、ボカラトン、ＣＲＣプレス（ＣＲＣ ｐｒｅｓｓ））。
２’フルオロ修飾ｍＲＮＡはその後、細胞内という状況におけるタンパク質産生を評価するためにＨｅＬａ細胞にトランスフェクションされ、その同じｍＲＮＡは無細胞のウサギ網状赤血球の系においても評価された。対照の未修飾ルシフェラーゼ（天然のルシフェラーゼ）がいずれの転写実験にも使用され、未処理およびモックトランスフェクション（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００のみ）が行われた対照もＨｅＬａのトランスフェクションについて解析され、また、ＲＮＡを用いない対照がウサギ網状赤血球抽出液（ｒａｂｂｉｔ ｒｅｔｉｃｕｌｙｓａｔｅ）について解析された。
ＨｅＬａのトランスフェクション実験については、トランスフェクションの前日に、２０，０００個のＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ‐２；米国バージニア州マナッサス）が、トリプシン‐ＥＤＴＡ溶液（ライフテクノロジーズ、米国ニューヨーク州グランドアイランド）を用いた処理によって採取され、９６ウェル細胞培養プレート（コーニング、米国バージニア州マナッサス）に１ウェルあたりの総体積１００ｕｌのＥＭＥＭ培地（１０％ＦＣＳおよび１×Ｇｌｕｔａｍａｘを補足）に含めて播種された。細胞は、５％ＣＯ２雰囲気中３７ｏＧで一晩成長せしめられた。翌日、表４２に記載された化学修飾を備えた８３ｎｇの２’フルオロを含有するルシフェラーゼ修飾ＲＮＡ（配列番号３に示されるｍＲＮＡ配列；配列中に示されていないおよそ１６０ヌクレオチドのｐｏｌｙＡテール；５’キャップ、キャップ１）は、最終体積１０ｕｌのＯＰＴＩ‐ＭＥＭ（ライフテクノロジーズ、米国ニューヨーク州グランドアイランド）中に希釈された。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（ライフテクノロジーズ、米国ニューヨーク州グランドアイランド）がトランスフェクション試薬として使用されて、０．２ｕｌが最終体積１０ｕｌのＯＰＴＩ‐ＭＥＭに希釈された。室温で５分間のインキュベーションの後、両溶液は組み合わされて室温でさらに１５分インキュベーションされた。その後、組み合わされた２０ｕｌの該溶液は、ＨｅＬａ細胞を含有する１００ｕｌの細胞培養培地に添加されて室温でインキュベーションされた。１８〜２２時間のインキュベーション後、ルシフェラーゼを発現している細胞は１００ｕｌのパッシブライシスバッファー（Ｐａｓｓｉｖｅ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ）（プロメガ、米国ウィスコンシン州マディソン）を用いて製造業者の指示書に従って溶解された。溶解産物のアリコートは白色の不透明なポリスチレン製９６ウェルプレート（コーニング、米国バージニア州マナッサス）に移され、１００ｕｌの完全ルシフェラーゼアッセイ溶液（プロメガ、米国ウィスコンシン州マディソン）と組み合わされた。溶解産物の体積は、最も強いシグナルを生じる試料について１ウェルあたり２００万（２ ｍｉｏ）以下の相対発光量（ＲＬＵ）が検出されるまで調整または希釈され、試験された各化学構造物のＲＬＵは表４２に示されている。プレートリーダはバイオテク（ＢｉｏＴｅｋ）のＳｙｎｅｒｇｙ（商標）Ｈ１（バイオテク（ＢｉｏＴｅｋ）、米国バーモント州ウィヌースキー）であった。試薬の入っていないプレートのバックグラウンドシグナルは１ウェル当たり約２００相対発光量であった。
ウサギ網状赤血球抽出液アッセイについては、２’‐フルオロを含有するルシフェラーゼｍＲＮＡはヌクレアーゼを含まない滅菌水中で最終量が１０ｕｌ中に２５０ｎｇとなるように希釈され、新たに調製されたばかりのウサギ網状赤血球抽出液４０ｕｌに添加され、ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳反応は、標準的な１．５ｍＬ容ポリプロピレン製反応チューブ（サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、米国マサチューセッツ州ウォルサム）の中で、ドライヒートブロックにて３０℃で行われた。該翻訳アッセイは、ウサギ網状赤血球抽出液（ヌクレアーゼ処理済）キット（プロメガ、米国ウィスコンシン州マディソン）を用いて製造業者の指示書に従って行われた。反応バッファーは、ロイシンまたはメチオニンのいずれかを欠く添付のアミノ酸ストック溶液の１対１混成物が加えられて、有効なｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳を可能にするのに十分な量の両アミノ酸を含有する反応混合物を生じた。６０分間のインキュベーションの後、反応は反応チューブを氷上に置くことにより停止せしめられた。
ルシフェラーゼ修飾ｍＲＮＡを含有しているｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳反応物のアリコートは白色の不透明なポリスチレン製９６ウェルプレート（コーニング、米国バージニア州マナッサス）に移され、１００ｕｌの完全ルシフェラーゼアッセイ溶液（プロメガ、米国ウィスコンシン州マディソン）と組み合わされた。ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳反応物の体積は、最も強いシグナルを生じる試料について１ウェルあたり２００万（２ ｍｉｏ）以下の相対発光量（ＲＬＵ）が検出されるまで調整または希釈され、試験された各化学構造物のＲＬＵは表４３に示されている。プレートリーダはバイオテクのＳｙｎｅｒｇｙ（商標）Ｈ１（バイオテク、米国バーモント州ウィヌースキー）であった。試薬の入っていないプレートのバックグラウンドシグナルは１ウェル当たり約１６０相対発光量であった。
表４２および４３に見られるように、多数の２’フルオロ含有化合物がｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて活性を有し、ルシフェラーゼタンパク質を産生する。

実施例８７． 修飾の組み合わせを使用したＨｅＬａ細胞におけるルシフェラーゼ
２’フルオロで修飾されたｍＲＮＡを他の修飾と組み合わせて使用することについて評価するために、一連のｍＲＮＡが、野生型Ｔ７ポリメラーゼ（フルオロを含有しない化合物）または実施例８６に記載されたような突然変異体Ｔ７ポリメラーゼ（フルヨロ（ｆｌｕｙｏｒｏ）を含有する化合物）のいずれかを使用して転写された。すべての修飾ｍＲＮＡはＨｅＬａ細胞におけるｉｎ ｖｉｔｒｏトランスフェクションによって試験された。
トランスフェクションの前日、２０，０００個のＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ‐２；米国バージニア州マナッサス）が、トリプシン‐ＥＤＴＡ溶液（ライフテクノロジーズ、米国ニューヨーク州グランドアイランド）を用いた処理によって採取され、９６ウェル細胞培養プレート（コーニング、米国バージニア州マナッサス）に１ウェルあたりの総体積１００ｕｌのＥＭＥＭ培地（１０％ＦＣＳおよび１×Ｇｌｕｔａｍａｘを補足）に含めて播種された。細胞は、５％ＣＯ２雰囲気中３７ｏＧで一晩成長せしめられた。翌日、表４４に記載された化学修飾を備えた８３ｎｇのルシフェラーゼ修飾ＲＮＡ（配列番号３に示されるｍＲＮＡ配列；配列中に示されていないおよそ１６０ヌクレオチドのｐｏｌｙＡテール；５’キャップ、キャップ１）は、最終体積１０ｕｌのＯＰＴＩ‐ＭＥＭ（ライフテクノロジーズ、米国ニューヨーク州グランドアイランド）中に希釈された。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（ライフテクノロジーズ、米国ニューヨーク州グランドアイランド）がトランスフェクション試薬として使用されて、０．２ｕｌが最終体積１０ｕｌのＯＰＴＩ‐ＭＥＭ中に希釈された。室温で５分間のインキュベーションの後、両溶液は組み合わされて室温でさらに１５分インキュベーションされた。その後、組み合わされた２０ｕｌの該溶液は、ＨｅＬａ細胞を含有する１００ｕｌの細胞培養培地に添加されて室温でインキュベーションされた。
１８〜２２時間のインキュベーション後、ルシフェラーゼを発現している細胞は１００ｕｌのパッシブライシスバッファー（プロメガ、米国ウィスコンシン州マディソン）を用いて製造業者の指示書に従って溶解された。溶解産物のアリコートは白色の不透明なポリスチレン製９６ウェルプレート（コーニング、米国バージニア州マナッサス）に移され、１００ｕｌの完全ルシフェラーゼアッセイ溶液（プロメガ、米国ウィスコンシン州マディソン）と組み合わされた。溶解産物の体積は、最も強いシグナルを生じる試料について１ウェルあたり２００万（２ ｍｉｏ）以下の相対発光量（ＲＬＵ）が検出されるまで調整または希釈され、試験された各化学構造物についてのＲＬＵは表４４に示されている。プレートリーダはバイオテクのＳｙｎｅｒｇｙ（商標）Ｈ１（バイオテク、米国バーモント州ウィヌースキー）であった。試薬の入っていないプレートのバックグラウンド信号は１ウェル当たり約２００相対発光量であった。
表４４に明示されるように、すべてのフルオロを含有しない化合物、および２’フルオロ修飾を含有する組み合わせの多くを含む、ほとんどの組み合わせの修飾は、機能的なルシフェラーゼタンパク質を産生するｍＲＮＡを生じた。

実施例８８． Ｇ‐ＣＳＦのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写
別のオープンリーディングフレームに関して本発明者らのすべての様々な化学修飾の活性を評価するために、本発明者らは、ルシフェラーゼｍＲＮＡをヒトＧ‐ＣＳＦ ｍＲＮＡとともに使用して、先に行なわれた実験を繰り返した。Ｇ‐ＣＳＦ ｍＲＮＡ（配列番号１に示されるｍＲＮＡ配列；配列中に示されていないおよそ１６０ヌクレオチドのｐｏｌｙＡテール；５’キャップ、キャップ１）は、野生型Ｔ７ポリメラーゼ（フルオロを含有しないすべての化合物用）または突然変異体Ｔ７ポリメラーゼ（フルオロを含有するすべての化合物用）を使用して表４５および４６の化学構造物で完全に修飾された。突然変異体Ｔ７ポリメラーゼは市販のものを入手した（Ｄｕｒａｓｃｒｉｂｅ（登録商標）Ｔ７転写キット（カタログ番号ＤＳ０１０９２５）（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ（登録商標）、米国ウィスコンシン州マディソン）。
表４５および４６の修飾ＲＮＡは、表示のように、ＨｅＬａ細胞にｉｎ ｖｉｔｒｏでトランスフェクションされるか、またはウサギ網状赤血球抽出液（ｒａｂｂｉｔ ｒｅｔｉｃｕｌｙｓａｔｅ）に添加（２５０ｎｇの修飾ｍＲＮＡ）された。対照の未処理群、モックトランスフェクション（トランスフェクション試薬のみ）群、５‐メチルシトシンおよびＮ１‐メチルプソイドウリジンで完全に修飾されたＧ‐ＣＳＦ、または、５‐メチルシトシンおよびＮ１‐メチルプソイドウリジンで完全に修飾されたルシフェラーゼ対照（配列番号３に示されるｍＲＮＡ配列；配列中に示されていないおよそ１６０ヌクレオチドのｐｏｌｙＡテール；５’キャップ、キャップ１）も解析された。Ｇ‐ＣＳＦタンパク質の発現はＥＬＩＳＡによって決定され、その値は表４５および４６に示されている。表４５において、「ＮＴ」は試験されていないことを意味する。
表４５に示されるように、すべてではないが多数の化学修飾がヒトＧ‐ＣＳＦタンパク質の産生をもたらした。細胞翻訳系および無細胞翻訳系からのこれらの結果は非常によく相関しており、同じ修飾はいずれの系においても概ね機能しているかまたは機能していない。１つの顕著な例外は、無細胞翻訳系では機能したがＨｅＬａ細胞を用いるトランスフェクション系では機能しなかった５‐ホルミルシチジン修飾Ｇ‐ＣＳＦ ｍＲＮＡである。２つのアッセイ間の同様の差異は、５‐ホルミルシチジン修飾ルシフェラーゼｍＲＮＡを用いたときにも見られた。
表４６に示されるように、全てではないが多数の、（組み合わせて使用された場合の）化学構造物で修飾されたＧ‐ＣＳＦ ｍＲＮＡは、ｉｎ ｖｉｖｏでの活性を実証した。さらに、（Ｎ４‐アセチルシチジンまたは５メチルシチジンを用いた）修飾ｍＲＮＡにＮ１‐メチルプソイドウリジンが存在すると、同じ組み合わせがプソイドウリジンと共に用いて試験された場合よりも高い発現を示した。まとめると、これらのデータは、Ｎ１‐メチルプソイドウリジンを含有するＧ‐ＣＳＦ ｍＲＮＡがｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて改善されたタンパク質発現をもたらすことを実証している。


実施例８９． 化学構造物のスクリーニング
以下に挙げた表（表４７〜４９）は、先の実施例において示された様々な化合物を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニングデータの大半を概括している。細胞を用いる翻訳アッセイと無細胞翻訳アッセイとの間には良好な相関が存在する。同じ化学構造物の置換は一般にルシフェラーゼまたはＧ‐ＣＳＦのｍＲＮＡのいずれに関して試験されても良好な一致を示す。最後に、Ｎ１‐メチルプソイドウリジンを含有するｍＲＮＡは、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏにおいて検出可能なサイトカイン刺激をほとんどまたは全く伴わずに極めて高レベルのタンパク質発現を示し、かつｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏのいずれにおいてもプソイドウリジンを含有するｍＲＮＡより優れている。
ルシフェラーゼｍＲＮＡ（配列番号３に示されるｍＲＮＡ配列；配列中に示されていないおよそ１６０ヌクレオチドのｐｏｌｙＡテール；５’キャップ、キャップ１）、およびＧ‐ＣＳＦ ｍＲＮＡ（配列番号１に示されるｍＲＮＡ配列；配列中に示されていないおよそ１６０ヌクレオチドのｐｏｌｙＡテール；５’キャップ、キャップ１）は、表４７および４８に記載された天然に存在する化学構造物および天然に存在しない化学構造物、ならびに表４８に記載された化学構造物の組み合わせを用いて修飾され、かつ本明細書中に記載された方法を用いて試験された。
表４７および４８では、「＊」は、突然変異体Ｔ７ポリメラーゼ（Ｄｕｒａｓｃｒｉｂｅ（登録商標）Ｔ７転写キット（カタログ番号ＤＳ０１０９２５）（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ（登録商標）、米国ウィスコンシン州マディソン）を使用したｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応を指し；「＊＊」は、突然変異体Ｔ７ポリメラーゼ（Ｄｕｒａｓｃｒｉｂｅ（登録商標）Ｔ７転写キット（カタログ番号ＤＳ０１０９２５）（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ（登録商標）、米国ウィスコンシン州マディソン）を使用したｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応の２回目の結果を指し；「＊＊＊」は、無細胞翻訳（ウサギ網状赤血球抽出液）における産生を指し；ＨｅＬａのタンパク質産生は「＋」、「＋／−」および「−」で判断され；Ｇ‐ＣＳＦ ＰＢＭＣを参照すると、「＋＋＋＋」は６，０００ｐｇ／ｍｌを超えるＧ‐ＣＳＦを意味し、「＋＋＋」は３，０００ｐｇ／ｍｌを超えるＧ‐ＣＳＦを意味し、「＋＋」は１，５００ｐｇ／ｍｌを超えるＧ‐ＣＳＦを意味し、「＋」は３００ｐｇ／ｍｌを超えるＧ‐ＣＳＦを意味し、「＋／−」は１５０〜３００ｐｇ／ｍｌのＧ‐ＣＳＦを意味し、バックグラウンドは約１１０ｐｇ／ｍｌであり；サイトカイン ＰＢＭＣを参照すると、「＋＋＋＋」は１，０００ｐｇ／ｍｌを超えるインターフェロン‐α（ＩＦＮ‐α）を意味し、「＋＋＋」は６００ｐｇ／ｍｌを超えるＩＦＮ‐αを意味し、「＋＋」は３００ｐｇ／ｍｌを超えるＩＦＮ‐αを意味し、「＋」は１００ｐｇ／ｍｌを超えるＩＦＮ‐αを意味し、「−」は１００ｐｇ／ｍｌ未満を意味し、バックグラウンドは約７０ｐｇ／ｍｌであり；また、「ＮＴ」は試験されていないことを意味する。表４８では、タンパク質産生は、突然変異体Ｔ７ポリメラーゼ（Ｄｕｒａｓｃｒｉｂｅ（登録商標）Ｔ７転写キット（カタログ番号ＤＳ０１０９２５）（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ（登録商標）、米国ウィスコンシン州マディソン）を使用して評価された。




表４９では、ＨｅＬａのタンパク質産生は「＋」、「＋／−」および「−」で判断され；Ｇ‐ＣＳＦ ＰＢＭＣを参照すると、「＋＋＋＋」は６，０００ｐｇ／ｍｌを超えるＧ‐ＣＳＦを意味し、「＋＋＋」は３，０００ｐｇ／ｍｌを超えるＧ‐ＣＳＦを意味し、「＋＋」は１，５００ｐｇ／ｍｌを超えるＧ‐ＣＳＦを意味し、「＋」は３００ｐｇ／ｍｌを超えるＧ‐ＣＳＦを意味し、「＋／−」は１５０〜３００ｐｇ／ｍｌのＧ‐ＣＳＦを意味し、バックグラウンドは約１１０ｐｇ／ｍｌであり；サイトカイン ＰＢＭＣを参照すると、「＋＋＋＋」は１，０００ｐｇ／ｍｌを超えるインターフェロン‐α（ＩＦＮ‐α）を意味し、「＋＋＋」は６００ｐｇ／ｍｌを超えるＩＦＮ‐αを意味し、「＋＋」は３００ｐｇ／ｍｌを超えるＩＦＮ‐αを意味し、「＋」は１００ｐｇ／ｍｌを超えるＩＦＮ‐αを意味し、「−」は１００ｐｇ／ｍｌ未満を意味し、バックグラウンドは約７０ｐｇ／ｍｌであり；「ＷＴ」は野生型Ｔ７ポリメラーゼを指し、「ＭＴ」は突然変異体Ｔ７ポリメラーゼ（Ｄｕｒａｓｃｒｉｂｅ（登録商標）Ｔ７転写キット（カタログ番号ＤＳ０１０９２５）（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ（登録商標）、米国ウィスコンシン州マディソン）を指し、「ＮＴ」は試験されていないことを意味する。

実施例９０． ＰＢＭＣにおける２’フルオロ化学構造物
Ｇ‐ＣＳＦ修飾ｍＲＮＡ（配列番号１に示されるｍＲＮＡ配列；配列中に示されていないおよそ１６０ヌクレオチドのｐｏｌｙＡテール；５’キャップ、キャップ１）が先天性免疫応答を誘発する能力は、インターフェロン‐α（ＩＦＮ‐α）および腫瘍壊死因子‐α（ＴＮＦ‐α）産生を測定することにより判定された。ｉｎ ｖｉｔｒｏのＰＢＭＣ培養物の使用は、オリゴヌクレオチドの免疫刺激能を測定するための一般的な方法であり（ロビンズ（Ｒｏｂｂｉｎｓ）ら、オリゴヌクレオチド（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）、２００９年、第１９巻、ｐ．８９−１０２）、トランスフェクションの方法は本明細書中に記載されている。表５０に示すのは、特異的ＥＬＩＳＡによって測定された経時的なインターフェロン‐α（ＩＦＮ‐α）および腫瘍壊死因子‐α（ＴＮＦ‐α）産生についての２名または３名の別個のＰＢＭＣドナーの平均である。対照のＲ８４８、Ｐ（Ｉ）Ｐ（Ｃ）、ＬＰＳおよびＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｌ２０００）についても解析された。
先天性の免疫認識に関し、いずれの（ｂｏｔｈ）修飾型ｍＲＮＡ化学構造物も主として、陽性対照（Ｒ８４８、Ｐ（Ｉ）Ｐ（Ｃ））と比較してＩＦＮ‐αおよびＴＮＦ‐αの産生を防いだが、２’フルオロ化合物は他の組み合わせよりさらに低くＩＦＮ‐αおよびＴＮＦ‐α産生を低減し、Ｎ４‐アセチルシチジンの組み合わせはサイトカインプロファイルを上昇させた。

その他の実施形態
当然のことであるが、本開示はその詳細な説明と共に記載されてきたが前述の説明は本開示を例証することを意図したものであって本開示の範囲を限定するようには意図されておらず、本開示は添付の特許請求の範囲に述べた範囲によって定義される。その他の態様、利点および改変形態は添付の特許請求の範囲の範囲内にある。

Claims (1)

  1. 対象とするポリペプチドをコードしている単離ポリヌクレオチドであって、
    （ａ）前記ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームであって、１−メチルプソイドウリジン、シチジン、アデノシン、およびグアノシンを含むヌクレオチドからなるオープンリーディングフレームと、
    （ｂ）５’ＵＴＲと、
    （ｃ）３’ＵＴＲと、
    （ｄ）少なくとも１つの５’キャップ構造と
    を含み、
    哺乳動物細胞に投与されると、該ポリヌクレオチドは、プソイドウリジン、シチジン、アデノシン、およびグアノシンを含むヌクレオチドからなるオープンリーディングフレームを含む対応するポリヌクレオチドと比較して、コードする前記ポリヌクレオチドの増加した発現量を有する、単離ポリヌクレオチド。
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