ES2289997T3 - Anticuerpos monoclonales y quimericos especificos para el factor de necrosis tumoral humano. - Google Patents

Abstract

Una molécula de inmunoglobulina quimérica, siendo dicha molécula de inmunoglobulina un anticuerpo quimérico que comprende una región constante de la inmunoglobulina humana y una región variable de inmunoglobulina no humana, teniendo dicha molécula de inmunoglobulina especificidad hacia un epítopo neutralizante del factor de necrosis tumoral humano alfa (TNFalfa) como el anticuerpo monoclonal murino A2, molécula de inmunoglobulina que: (i) neutraliza o inhibe la citotoxicidad del TNFalfa humano y del TNFalfa de chimpancé y (ii) no inhibe la actividad citotóxica del TNFalfa producido por mandriles, macacos de Java y macacos de la India o del TNFbeta humano y (iii) neutraliza: (a) la secreción de la IL-6 inducida por el TNF; b) la activación por el TNF de las actividades moleculares de adhesión y de procoagulación de las células endoteliales, y c) la expresión en la superficie de la ELAM-1 inducida por el TNF e (iv) inhibiendo competitivamente dicha molécula de inmunoglobulina la unión de A2 aTNFalfa humano, y (v) une un epitopo neutralizante de TNFalfa humano con una afinidad de al menos 1 x 108 litros/mol, medida como una constante de asociación (Ka), como se determina mediante análisis de Scatchard.

Description

Anticuerpos monoclonales y quiméricos específicos para el factor de necrosis tumoral humano.

Campo de la invención

La presente invención en el campo de la inmunología y la medicina se refiere a anticuerpos que son específicos para el factor de necrosis tumoral alfa humano (hTNF\alpha); a fragmentos, regiones y derivados de los mismos; y a composiciones de diagnóstico y farmacéuticas y procedimientos terapéuticos, de diagnóstico y de producción de los mismos. La invención se refiere además a secuencias de nucleótidos que codifican dichos anticuerpos, fragmentos y regiones, así como a vectores y hospedadores que contienen dichas secuencias, y procedimientos para los mismos.

Descripción de los antecedentes de la técnica

La citocina conocida como factor de necrosis tumoral \alpha (TNF\alpha; también denominada caquectina) es una proteína segregada principalmente por monocitos y macrófagos en respuesta a una endotoxina o a otros estímulos como un homotrímero soluble de subunidades de proteína de 17 kD (Smith, R.A. et al., J. Biol. Chem. 262: 6951-6954 (1987)). También se ha descrito una forma precursora de TNF de 26 kD unida a la membrana (Kriegler, M. et al., Cell 53: 45-53 (1988)). Para efectuar una revisión sobre el TNF, véanse Beutler, B. et al., Nature 320: 584 (1986), Old, L.J., Science 230: 630 (1986), y Le, J. et al., Lab. Invest. 56: 234 (1987). El TNF se descubrió inicialmente en el suero de animales a los que se inyectó secuencialmente una vacuna bacteriana (bacilo Calmette-Guerin, BCG) y una endotoxina (Carswell, E.A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72: 3666 (1975)).

La expresión del gen que codifica al TNF\alpha no se limita a las células de la familia de los monocitos y los macrófagos. Se halló que diversas estirpes celulares tumorales no monocíticas humanas producían el TNF (Rubin, B.Y. et al., J. Exp. Med. 164: 1350 (1986); Spriggs, D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 6563 (1987)). El TNF también es producido por los linfocitos T de la sangre periférica CD4^{+} y CD8^{+}, y por diversas estirpes celulares T y B cultivadas (Cuturi, M.C., et al., J. Exp. Med. 165: 1581 (1987); Sung, S.-S.J. et al., J. Exp. Med. 168: 1539 (1988)).

Diversas evidencias reunidas indican que el TNF es una citocina reguladora con actividades biológicas pleótropas. Estas actividades incluyen: la inhibición de la síntesis de la lipoproteína lipasa (actividad "caquectina") (Beutler, B. et al., Nature 316: 552 (1985)), la activación de leucocitos polimorfonucleares (Klebanoff, S.J. et al., J. Immunol. 136: 4220 (1986); Perussia, B., et al., J. Immunol. 138: 765 (1987)), la inhibición de la proliferación celular o la estimulación de la proliferación celular (Vilcek, J. et al., J. Exp. Med. 163: 632 (1986); Sugarman, B.J. et al., Science 230: 943 (1985); Lachman, L.B. et al., J. Immunol. 138: 2913 (1987)), la acción citotóxica sobre determinados tipos de células transformadas (Lachman, L.B. et al., supra; Darzynkiewicz, Z. et al., Canc. Res. 44: 83 (1984)), la actividad antivírica (Kohase, M. et al., Cell 45:659 (1986); Wong, G.H.W. et al., Nature 323: 819 (1986)), la estimulación de la resorción ósea (Bertolini, D.R. et al., Nature 319: 516 (1986); Saklatvala, J., Nature 322: 547 (1986)), la estimulación de la producción de colagenasa y de prostaglandina E2 (Dayer, J.-M. et al., J. Exp. Med. 162: 2163 (1985)); y acciones inmunorreguladoras, que incluyen la activación de las células T (Yokota, S. et al., J. Immunol. 140: 531 (1988)), las células B (Kehrl, J.H. et al., J. Exp. Med. 166: 786 (1987)), los monocitos (Philip, R. et al., Nature 323: 86 (1986)), los timocitos (Ranges, G.E. et al., J. Exp. Med. 167: 1472 (1988)), y la estimulación de la expresión en la superficie de la célula de las moléculas del complejo principal de histocompatibilidad (MHC) de clase I y clase II (Collins, T. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 446 (1986); Pujol-Borrell, R. et al., Nature 326: 304 (1987)).

El TNF es conocido por sus acciones pro-inflamatorias que dan como resultado una lesión de los tejidos, tal como la inducción de la actividad procoagulante sobre las células del endotelio vascular (Pober, J.S. et al., J. Immunol. 136: 1680 (1986)), un aumento de la adherencia de los neutrófilos y los linfocitos (Pober, J.S. et al., J. Immunol. 138: 3319 (1987)), y la estimulación de la liberación del factor de activación de plaquetas de macrófagos, neutrófilos y células del endotelio vascular (Camussi, G. et al., J. Exp. Med. 166: 1390 (1987)).

Indicios recientes implican al TNF en la patogenia de muchas infecciones (Cerami, A. et al., Immunol. Today 9: 28 (1988)), trastornos inmunológicos, patologías neoplásicas, por ejemplo, en la caquexia que acompaña a determinadas neoplasias malignas (Oliff, A. et al., Cell 50: 555 (1987)), y en patologías autoinmuntarias y la patología del injerto contra el hospedador (Piguet, P.-F. et al., J. Exp. Med. 166: 1280 (1987)). La asociación del TNF con el cáncer y las patologías infecciosas se relaciona frecuentemente con el estado catabólico del hospedador. Uno de los problemas principales en los pacientes oncológicos es el adelgazamiento, normalmente asociado a la anorexia. El debilitamiento general que resulta es conocido como "caquexia" (Kern, K.A. et al. (J. Parent. Enter. Nutr. 12: 286-298 (1988)). La caquexia incluye adelgazamiento progresivo, anorexia, y desgaste continuo de la masa corporal en respuesta al crecimiento de un tumor maligno. El trastorno fisiológico fundamental puede estar relacionado con una disminución de la ingestión de alimento con respecto al gasto energético. El estado caquéctico se asocia, por tanto, a una morbilidad importante y es el responsable de la mayor parte de los casos de mortalidad por cáncer. Una serie de estudios han sugerido que el TNF es un importante mediador de la caquexia en el cáncer, en patologías infecciosas, y en otros estados catabólicos.

Se cree que el TNF desempeña una importante función en las consecuencias patofisiológicas de la septicemia por gramnegativos y del choque endotóxico (Michie, H.R. et al., Br. J. Surg. 76: 670-671 (1989); Debets, J.M.H. et al., Second Vienna Shock Forum, págs. 463-466 (1989); Simpson, S.Q. et al., Crit. Care Clin. 5: 27-47 (1989)), que incluyen fiebre, malestar, anorexia, y caquexia. Una endotoxina es un potente activador de monocitos y macrófagos que estimula la producción y la secreción del TNF (Kornbluth, S.K. et al., J. Immunol. 137: 2585-2591 (1986)) y otras citocinas. Ya que el TNF podría imitar muchos de los efectos biológicos de una endotoxina, se llegó a la conclusión de que era un importante mediador responsable de las manifestaciones clínicas de enfermedades relacionadas con las endotoxinas. El TNF y otras citocinas derivadas de monocitos intervienen en las respuestas metabólicas y neurohormonales a una endotoxina (Michie, H.R. et al., N. Eng. J. Med. 318: 1481-1486 (1988). La administración de endotoxinas a voluntarios humanos produce una enfermedad aguda con síntomas similares a los de la gripe que incluyen fiebre, taquicardia, aumento del índice metabólico y liberación de hormonas por estrés (Revhaug, A. et al., Arch. Surg. 123: 162-170 (1988). También se han encontrado elevados niveles de TNF en la circulación en pacientes que padecen septicemia por gramnegativos (Waage, A. et al., Lancet 1: 355-357 (1987); Hammerle, A.F. et al., Second Vienna Shock Forum págs. 715-718 (1989); Debets, J.M.H. et al., Crit. Care Med. 17: 489-497 (1989); Calandra, T. et al., J. Infec. Dis. 161: 982-987 (1990). El tratamiento de pacientes oncológicos con TNF (debido a su acción tumoricida) reveló que dosis superiores a 545 \mug/m^{2}/24 h causaban alteraciones similares a las inducidas por la inyección de una endotoxina (4 ng/kg) en personas sanas (Michie, H.R. et al., Surgery 140: 280-286 (1988), confirmando la función del TNF como principal mediador en el hospedador de las respuestas séptica y endotoxinémica. La infusión crónica intravenosa de TNF en personas o ratas se asoció a la anorexia, la retención hídrica, las respuestas de fase aguda, y el balance negativo del nitrógeno (es decir, a efectos catabólicos típicos), llevando a la conclusión de que el TNF puede ser responsable de muchos de los cambios advertidos durante enfermedades críticas (Michie, H.R. et al., Ann. Surg. 209: 19-24(1989).

La inmunoterapia pasiva dirigida a neutralizar el TNF puede producir un efecto beneficioso en la septicemia por gramnegativos y en la endotoxinemia, basada en el aumento de la producción de TNF y los elevados niveles de TNF en estos estados patológicos, tal como se ha discutido anteriormente.

Se describieron anticuerpos para un material "modulador" que se caracterizó como una caquectina (descubriéndose más tarde que era idéntico al TNF) en Cerami et al. (publicación de patente EPO 0212489, 4 de marzo de 1987). Se apuntó que dichos anticuerpos eran útiles en inmunoensayos de diagnóstico y en la terapia de choque en infecciones bacterianas. Rubin et al. (publicación de patente EPO 0218868, 22 de abril de 1987) describieron anticuerpos monoclonales para el TNF humano, hibridomas que segregaban dichos anticuerpos, procedimientos de producción de dichos anticuerpos, y el uso de dichos anticuerpos en el inmunoensayo del TNF. Yone et al. (publicación de patente EPO 0288088, 26 de octubre de 1988) describieron anticuerpos anti-TNF, que incluían los mAb (anticuerpos monoclonales), y su utilidad en el inmunodiagnóstico de patologías, en particular la patología de Kawasaki e infecciones bacterianas. Se expuso que los líquidos corporales de pacientes con la patología de Kawasaki (síndrome febril ganglionar mucocutáneo infantil agudo; Kawasaki, T., Allergy 16: 178 (1967); Kawasaki, T., Shonica (Pediatrics) 26: 935 (1985)) contenían elevados niveles de TNF que estaban relacionados con el progreso de la patología (Yone et al., supra).

Otros investigadores han descrito mAb específicos para el TNF humano recombinante que habían neutralizado su actividad in vitro (Liang, C-M. et al. (Biochem. Bioghys. Res. Comm. 137: 847-854 (1986); Meager, A. et al., Hybridoma 6: 305-311 (1987); Fendly et al., Hybridoma 6: 359-369 (1987); Bringman, T.S. et al., Hybridoma 6: 489-507 (1987); Hirai, M. et al., J. Immunol. Meth. 96: 57-62 (1987); Moller, A. et al. (Cytokine 2: 162-169 (1990)). Algunos de estos mAb se usaron para cartografiar epítopos de TNF humano y para desarrollar inmunoensayos de enzimas (Fendly et al., supra; Hirai et al., supra; Moller et al., supra) así como para favorecer la purificación de TNF recombinante (Bringman et al., supra). Sin embargo, estos estudios no proporcionan una base para producir anticuerpos que neutralizan el TNF que puede usarse para usos terapéuticos o de diagnóstico in vivo en personas.

La confirmación más directa para el uso de inmunoterapia anti-TNF procede de estudios de protección in vivo en otros animales distintos del hombre. Los mAb o los antisueros neutralizantes para el TNF han mostrado en otros mamíferos distintos del hombre que suprimen cambios fisiológicos adversos y evitan la muerte tras una exposición letal en endotoxinemias y bacteriemias experimentales. Este efecto se ha demostrado, por ejemplo, en ensayos de letalidad en roedores y en sistemas modelo de patologías en primates (Mathison, J.C. et al., J. Clin. Invest. 81: 1925-1937 (1988); Beutler, B. et al., Science 222: 869-871 (1985); Tracey, K.J. et al., Nature 330: 662-664 (1987); Shimamoto, Y. et al., Immunol. Lett. 17: 311-318 (1988); Silva, A.T. et al., J. Infect. Dis. 162: 421-427 (1990); Opal, S.M. et al., J. Infect. Dis. 161: 1148-1152 (1990); Hinshaw, L.B. et al., Circ. Shock 30: 279-292 (1990)). Por ejemplo, los fragmentos F(ab')_{2} de la neutralización por los mAb anti-TNF fueron capaces de evitar el choque séptico producido por bacterias E. coli vivas en mandriles (Tracey, K.J. et al., supra).

El supuesto receptor que se une a los locus del hTNF ha sido presentado por Eck y Sprang (J. Biol. Chem. 264 (29), 17595-17605 (1989), quienes identificaron dicho receptor que se une a los locus del TNF-\alpha como el compuesto por los aminoácidos 11-13, 37-42, 49-57 y 155-157. La solicitud PCT WO91/02078 (con fecha de prioridad del 7 de agosto de 1989) describe ligandos TNF que pueden unirse a anticuerpos monoclonales con los siguientes epítopos: al menos uno de 1-20, 56-77, y 108-127; al menos dos de 1-20, 56-77, 108-127 y 138-149; todos los de 1-18, 58-65, 115-125 y 138-149; todos los de 1-18, y 108-128; todos los de 56-79, 110-127 y 135- o 136-155; todos los de 1-30, 117-128 y 141-153; todos los de 1-26, 117-128 y 141-153; todos los de 22-40, 49-96 o -97, 110-127 y 136-153; todos los de 12-22, 36-45, 96-105 y 132-157; todos los de los dos intervalos 1-20 y 76-90; todos los de 22-40, 69-97, 105-128 y 135-155; todos los de 22-31 y 146-157; todos los de 22-40 y 49-98; al menos uno de 22-40, 49-98 y 69-97, los dos intervalos 22-40 y 70-87.

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Hasta la fecha, la experiencia con terapias de mAb anti-TNF en personas ha sido limitada. En un estudio de fase I, a catorce pacientes con choque séptico grave se les administró un mAb neutralizante anti-TNF de ratón en una única dosis de 0,4-1,0 mg/kg (Exley, A.R. et al., Lancet 335: 1275-1277 (1990)). Sin embargo, siete de los catorce pacientes desarrollaron una respuesta de anticuerpos humanos antimurinos al tratamiento, experimentando dicho tratamiento los problemas conocidos debidos a la inmunogenia de las porciones de cadena ligera y pesada murinas del anticuerpo. Dicha inmunogenia provoca una disminución de la eficacia de la administración continua y puede hacer ineficaz el tratamiento debido al aumento del rechazo inmunitario en pacientes que se someten a la administración terapéutica o de diagnóstico de anticuerpos anti-TNF de ratón.

También se ha comunicado la administración de mAb anti-TNF murinos a pacientes que padecen una grave patología del injerto contra el hospedador (Herve, P. et al., Lymphoma Res. 9: 591 (1990)).

De acuerdo con esto, existe la necesidad de proporcionar nuevos anticuerpos anti-TNF que superen los problemas de la inmunogenia de los anticuerpos murinos y que proporcionen una reducción de la inmunogenia y un aumento de la actividad neutralizante.

De acuerdo con un primer aspecto de la presente invención, se proporciona una molécula de inmunoglobulina quimérica, siendo dicha molécula de inmunoglobulina un anticuerpo quimérico que comprende una región constante de la inmunoglobulina humana y una región variable de inmunoglobulina no humana, teniendo dicha molécula de inmunoglobulina la misma especificidad hacia un epítopo neutralizante del factor de necrosis tumoral \alpha (TNF\alpha) humano como el anticuerpo monoclonal murino A2; molécula de inmunoglobulina quimérica que: (i) neutraliza o inhibe la citotoxicidad del TNF\alpha humano y del TNF\alpha de chimpancé y (ii) no inhibe la actividad citotóxica del TNF\alpha producido por mandriles, macacos de Java y macacos de la India o del TNF\beta humano y (iii) neutraliza: (a) la secreción de la IL-6 inducida por el TNF; b) la activación por el TNF de las actividades moleculares de adhesión y de coagulación de las células endoteliales; y c) la expresión de la ELAM-1 inducida por el TNF.

De acuerdo con un segundo aspecto de la presente invención, se proporciona una molécula de inmunoglobulina quimérica, siendo dicha molécula de inmunoglobulina un anticuerpo quimérico que comprende una región constante de la inmunoglobulina humana y una región variable de inmunoglobulina no humana, teniendo dicha molécula de inmunoglobulina la misma especificidad hacia un epítopo neutralizante del factor de necrosis tumoral \alpha (TNF\alpha) humano como el anticuerpo monoclonal murino A2, que tiene una región de unión al antígeno que se une a los residuos 87-108 o a ambos de 59-80 y 87-108 del TNF\alpha humano de la SEC ID NO:1 tal como se ha determinado mediante el procedimiento de síntesis de péptidos en varillas y que neutraliza: (a) la secreción de la IL-6 inducida por el TNF; b) la activación por el TNF de las actividades moleculares de adhesión y de coagulación de las células endoteliales; y c) la expresión en la superficie de la ELAM-1 inducida por el TNF.

En otro aspecto de la presente invención, los anticuerpos anti-TNF quiméricos se unen a un epítopo de, al menos, 5 aminoácidos de los residuos 87-108 o de los dos intervalos de residuos 59-80 y 87-108 del hTNF\alpha (de la SEC ID NO:1), pero que no se unen a un receptor conocido o supuesto que se une a porciones del TNF tales como las secuencias de aminoácidos 1-20, 11-13, 37-42, 49-57 o 155-157 del TNF (de la SEC ID NO:1).

Dichos anticuerpos anti-TNF quiméricos de la presente invención incluyen los producidos a partir tanto de hibridomas como de células recombinantes que expresan ácidos nucleicos heterólogos que codifican al menos regiones variables, tales como los anticuerpos quiméricos murino-humanos, de dichos anticuerpos específicos para el TNF, fragmentos o regiones de la presente invención.

La presente invención proporciona además anticuerpos anti-TNF quiméricos, que usan tecnologías de ingeniería genética e hibridomas para proporcionar productos útiles para el tratamiento y el diagnóstico in vivo de patologías humanas asociadas al TNF, tal como se ha descrito anteriormente.

Por otro lado, la presente memoria descriptiva describe además el uso de polipéptidos antigénicos del hTNF\alpha que corresponden a porciones del TNF-\alpha que, cuando los epítopos de estos polipéptidos están unidos por anticuerpos quiméricos específicos para el TNF, los cuales neutralizan o inhiben la actividad biológica del TNF-\alpha in vivo. Otro objetivo de la presente invención es proporcionar anticuerpos quiméricos generados a partir de hibridomas u hospedadores recombinantes que se unen a epítopos específicos de polipéptidos que corresponden a, al menos, 5 aminoácidos seleccionados de entre los residuos 87-108 o de ambos intervalos de residuos 59-80 y 87-108 del hTNF\alpha (de la SEC ID NO:1), tal como se muestra en la Figura 15.

La presente invención proporciona además anticuerpos anti-TNF quiméricos que tienen actividad inhibidora o neutralizante del TNF\alpha in vivo, y que se pueden proporcionar como composiciones de diagnóstico y farmacéuticas para el diagnóstico y el tratamiento de patologías relacionadas con el TNF\alpha, que incluyen caquexia, infecciones y procesos parasitarios agudos y crónicos tales como infecciones bacterianas, víricas y fúngicas, procesos inflamatorios e inmunitarios agudos y crónicos, que incluyen patologías autoinmunitarias, la hepatitis inducida por el alcohol, patologías neoplásicas y similares. Para uso terapéutico, se prefieren anticuerpos anti-TNF quiméricos de elevada afinidad, que incluyen anticuerpos monoclonales e quiméricos producidos por hibridomas o mediante recombinación, de acuerdo con la presente invención, que inhiben o neutralizan el TNF\alpha humano con una dosis inhibidora en un 50% (DI50) in vivo de, al menos, aproximadamente 1 \mug/ml, más preferiblemente de, al menos, aproximadamente 100 ng/ml, y lo más preferible es que sea de, al menos, aproximadamente 15 ng/ml.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, los anticuerpos anti-TNF\alpha quiméricos, que son particularmente útiles en procedimientos de diagnóstico para detectar el TNF\alpha humano en pacientes de los que se sospecha que padecen trastornos asociados a la producción de TNF\alpha, que incluyen procedimientos en los que los anticuerpos anti-TNF\alpha quiméricos de elevada afinidad de la presente invención se ponen en contacto con materiales biológicos procedentes de un paciente y se detecta una reacción antígeno-anticuerpo. La invención se puede usar en forma de estuches para detectar el TNF\alpha en líquidos biológicos que comprenden anticuerpos quiméricos anti-TNF\alpha de elevada afinidad de la presente invención, preferiblemente en una forma marcada con radiosótopos para su detección.

Los anticuerpos quiméricos de la presente invención incorporan una combinación delas características ventajosas de los mAb. Al igual que los mAb de ratón, pueden reconocer y unirse al TNF humano; sin embargo, a diferencia de los mAb de ratón, las propiedades "humanas específicas" delos anticuerpos quiméricos reducen la probabilidad de una respuesta inmunitaria a los anticuerpos, dando como resultado una supervivencia prolongada en la circulación mediante una reducción de su eliminación. Además, usando los procedimientos descritos en la presente invención, se puede combinar la región constante de cualquier isotipo deseado de la inmunoglobulina humana con el sitio de combinación del antígeno deseado.

La presente invención proporciona además cadenas de inmunoglobulina quiméricas, ya sean pesadas (H) o ligeras (L), con regiones variables o constantes, con especificidad hacia uno o más epítopos del TNF, preferiblemente un epítopo de, al menos, 5 aminoácidos de los residuos 87-107, o una combinación de los dos intervalos de residuos 59-80 y 87-108, del hTNF\alpha (de la SEC ID NO:1). En una realización preferida, los aminoácidos del epítopo no incluyen los aminoácidos de los residuos de, al menos, uno de 11-13, 37-42, 49-57 o 155-157 del hTNF\alpha (de la SEC ID NO:1). Una cadena de inmunoglobulina quimérica humano-murina contiene una región constante (C) sustancialmente similar a la presente en una inmunoglobulina humana natural, y una región variable (V), no humana, con la elevada afinidad y la especificidad deseadas hacia un epítopo del TNF. La invención proporciona asimismo anticuerpos que tienen cadenas H y L quiméricas asociadas de modo que la molécula total exhiba las propiedades de reconocimiento y de unión al antígeno deseadas.

Específicamente, la presente invención se refiere también a un anticuerpo quimérico que comprende dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas, comprendiendo cada una de las cadenas una región constante humana y una región variable (V) de procedencia no humana teniendo la misma especificidad hacia el TNF\alpha humano que el anticuerpo monoclonal murino A_{2}, uniéndose dicho anticuerpo con elevada afinidad a un epítopo del TNF\alpha humano inhibidor o neutralizante. La invención incluye también un fragmento o un derivado de dicho anticuerpo. La región V es de procedencia no humana, más preferiblemente de procedencia murina. En una realización preferida, la región V procede de epítopos del mAb A2, o se une a ellos. En otra realización preferida, se proporciona un anticuerpo quimérico que se une a epítopos del anticuerpo denominado quimérico A2 (cA2), o un mAb anti-TNF quimérico humano-murino que inhibe competitivamente la unión del cA2 al TNF\alpha.

Preferiblemente, el anticuerpo quimérico inhibe o neutraliza el TNF\alpha humano in vivo con una DI50 de, al menos, aproximadamente 1 \mug/ml, más preferiblemente de, al menos, aproximadamente 100 ng/ml, más preferiblemente de, al menos, aproximadamente 15, 30, 50, ó 80 ng/ml.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 es un gráfico que muestra la unión dependiente de la dosis del mAb A2 murino al TNF\alpha humano.

La Figura 2 es un gráfico que muestra el no reconocimiento del TNF\alpha humano inactivado por el calor por parte del mAb A2.

La Figura 3 es un gráfico que muestra la neutralización de la citotoxicidad del TNF in vitro por el A2 murino. Control: mAb de IgG1 murina anti-lípido A (8A1) con TNF humano natural. Los valores medios de la absorbancia para los controles fueron los siguientes: sin TNF = 1,08; con TNF natural, sin anticuerpo = 0,290; y con TNF recombinante, sin anticuerpo = 0,500.

La Figura 4 es un gráfico que muestra cómo el mAb A2 y el A2 quimérico no inhiben o neutralizan la linfotoxina humana (TNF\beta).

La Figura 5 es un gráfico que muestra cómo los mAb A2 murino y CA2 quimérico no inhiben o neutralizan el TNF\alpha murino.

Las Figuras 6 y 7 son gráficos que muestran cómo el mAb A2 inhibe o neutraliza el TNF producido por monocitos de chimpancé y el rhTNF\alpha.

La Figura 8 proporciona los diagramas esquemáticos de los plásmidos usados para la expresión de las cadenas quiméricas H (pA2HGlapgpt) y L (pA2HuKapgpt) del anticuerpo A2 quimérico.

La Figura 9 es un gráfico que muestra los resultados de un ensayo ELISA de bloqueo cruzado del epítopo con competidores del anticuerpo A2 murino (mA2) y del A2 quimérico (cA2).

La Figura 10 es un gráfico de un análisis de Scatchard del mAb A2 (mA2) y del A2 quimérico (cA2) marcados con ^{125}I que se unen al TNF\alpha humano recombinante inmovilizado sobre una placa de microensayo. Se calculó cada valor de Ka a partir de la media de las dos determinaciones

La Figura 11 es un gráfico que muestra la neutralización de la citotoxicidad del TNF por el A2 quimérico. El control es un mAb de IgG1 quimérica humano-murina anti-plaquetas (7E3) que reacciona con TNF humano natural. Los valores medios de la absorbancia para los controles fueron los siguientes: sin TNF = 1,08; con TNF natural, sin anticuerpo = 0,290; y con TNF recombinante, sin anticuerpo = 0,500.

La Figura 12 es un gráfico que muestra la neutralización in vitro de la expresión de la ELAM-1 inducida por el TNF por parte del A2 quimérico. El control es un anticuerpo de IgG1 quimérica humano-murina anti-CD4.

La Figura 13 es una secuencia de aminoácidos del TNF humano como la SEC ID NO:1.

La Figura 14A es una representación gráfica de la cartografía de un epítopo del mAb quimérico cA2 que indica la unión relativa del cA2 a las varillas de péptidos de TNF humano.

La Figura 14B es una representación gráfica de la cartografía de un epítopo del mAb quimérico cA2 que indica la unión relativa del cA2 a las varillas de péptidos de TNF humano en presencia de TNF humano.

La Figura 15 es una secuencia de aminoácidos del TNF humano que muestra secuencias con porciones de epítopos reconocidos por el cA2.

La Figura 16A es una representación de un modelo de llenado del espacio de un monómero de TNF humano.

La Figura 16B es una representación de un modelo de llenado del espacio de dos secuencias no contiguas de péptidos del TNF humano reconocidas por el cA2.

Descripción detallada de las realizaciones preferidas

La presente invención proporciona anticuerpos quiméricos anti-factor de necrosis tumoral (TNF) murino-humanos, que inhiben o neutralizan la actividad biológica del TNF in vivo y que son específicos para el factor de necrosis tumoral alfa humano (hTNF\alpha), que se pueden usar para fines terapéuticos y de diagnóstico en sujetos con patologías o trastornos asociados a la presencia de una sustancia reactiva con anticuerpos anti-TNF, en particular hTNF\alpha, en cantidades superiores a las presentes en un sujeto sano normal. Los anticuerpos quiméricos, y derivados de los mismos, de la presente invención contienen preferiblemente al menos una región V que reconoce un epítopo del TNF que tienen una actividad biológica inhibidora o neutralizante in vivo.

De forma inesperada, los mAb de la presente invención pueden bloquear la acción del TNF\alpha sin unirse al sitio de unión del supuesto receptor, tal como fue presentado por Eck y Sprang (J. Biol. Chem. 264(29), 17595-17605 (1989) como los aminoácidos 11-13, 37-42, 49-57 y 155-157 del hTNF\alpha (de la SEC ID NO:1).

Los anticuerpos preferidos de la presente invención son anticuerpos quiméricos humano-murinos anti-TNF\alpha de elevada afinidad y presentan una potente actividad inhibidora o neutralizante in vivo frente al TNF\alpha humano. Dichos anticuerpos y anticuerpos quiméricos incluyen los generados mediante inmunización usando hTNF\alpha recombinante purificado (SEC ID NO:1) o fragmentos peptídicos del mismo. Dichos fragmentos incluyen epítopos de,al menos, 5 aminoácidos de los residuos 87-107, o una combinación delos dos intervalos de residuos 59-80 y 87-108 del hTNF\alpha (como los correspondientes a los aminoácidos de la SEC ID NO:1). Asimismo, los anticuerpos anti-TNF quiméricos, anticuerpos anti-TNF quiméricos preferidos de la presente invención no reconocen los aminoácidos de, al menos, uno de los aminoácidos 11-13, 37-42, 49-57 o 155-157 del hTNF\alpha (de la SEC ID NO:1).

Debido a que las concentraciones en la circulación del TNF o bien tienden a ser extremadamente bajas, del orden de aproximadamente 10 pg/ml en individuos sin septicemia, que llegan a aproximadamente 50 pg/ml en pacientes con septicemia y que superan los 100 pg/ml en el síndrome septicémico (Hammerle, A.F. et al., 1989, supra) o bien sólo pueden detectarse en zonas de patologías mediadas por el TNF, se prefiere usar anticuerpos, fragmentos o regiones de los mismos de elevada afinidad o que son potentes neutralizadores o inhibidores del TNF in vivo; tanto para inmunoensayos del TNF como para la terapia de patologías mediadas por el TNF. Dichos anticuerpos quiméricos tendrán preferiblemente una afinidad por el hTNF\alpha, expresada como Ka, de, al menos, 10^{8} M^{-1}, más preferiblemente, de, al menos, 10^{9} M^{-1}, tal como de 5 X 10^{8} M^{-1}, 8 x 10^{8} M^{-1}, 2 x 10^{9} M^{-1}, 4 x 10^{9} M^{-1}, 6 x 10^{9} M^{-1} ó 8 x 10^{9} M^{-1}.

Para uso terapéutico humano se prefieren los anticuerpos quiméricos de elevada afinidad, y derivados con una potente actividad inhibidora o neutralizante in vivo delTNF\alpha, de acuerdo con la presente invención, que bloqueen la secreción de la IL-6 inducida por el TNF. Asimismo, también se prefieren para usos terapéuticos humanos dichos anticuerpos quiméricos anti-TNF\alpha de elevada afinidad, y fragmentos, que bloqueen la actividad procoagulante inducida por el TNF, que comprende bloquear la expresión de las moléculas de adhesión celular, tales como la ELAM-1 y la ICAM-1, inducida por el TNF, y bloquear la actividad mitógena del TNF in situ, in vivo e in vitro.

\newpage

Los mAb anti-TNF quiméricos preferidos son los que inhiben competitivamente in vivo la unión al TNF\alpha humano del mAb anti-TNF\alpha A2 murino, del mAb anti-TNF\alpha quimérico cA2, o de un anticuerpo que tenga sustancialmente las mismas características específicas de unión. Los anticuerpos quiméricos preferidos de la presente invención son los que se unen a epítopos reconocidos por el A2 y el cA2, que están incluidos en los aminoácidos 59-80 y/o 87-108 del hTNF\alpha (como los correspondientes a los aminoácidos de la SEC ID NO:1), como los epítopos compuestos por al menos 5 aminoácidos que comprenden, al menos, un aminoácido de las anteriores porciones del TNF\alpha humano. Los procedimientos preferidos para determinar la especificidad y la afinidad de los mAb mediante inhibición competitiva se pueden encontrar en Muller, Meth. Enzymol. 92: 589-601 (1983), que se incorpora en su totalidad como referencia.

El mAb A2 murino es producido por una estirpe celular denominada c134A. El anticuerpo quimérico cA2 es producido por una estirpe celular denominada c168A. La estirpe celular c134A está depositada como banco celular en el Centocor Cell Biology Services Depository, y la estirpe celular c168A (RCB) está depositada como banco celular en el Centocor Corporate Cell Culture Research y Development Depository, ambos en Centocor, 200 Great Valley Parkway, Malvern, Pennsylvania, 19355. La estirpe celular c168A también está depositada en Centocor BV, Leiden, Holanda.

Por otro lado, la c168A se depositó con la fecha de presentación de la presente solicitud en la American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, como un "depósito de cultivo seguro".

El término "epítopo" se refiere a la porción de una molécula cualquiera capaz de ser reconocida por un anticuerpo y de unirse a él. Los epítopos están compuestos normalmente por grupos de moléculas de la superficie químicamente activas, tales como cadenas laterales de aminoácidos o de sacáridos, y tienen características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas. El término "epítopo inhibidor o neutralizante" se refiere a un epítopo, que, cuando se une a él un anticuerpo, disminuye la actividad biológica de la molécula o del organismo que contiene al epítopo, in vivo, in vitro e in situ, más preferiblemente in vivo, incluyendo la unión del TNF a un receptor del TNF. Los anticuerpos anti-TNF quiméricos de la presente invención reconocen epítopos que incluyen 5 aminoácidos que comprenden, al menos, un aminoácido de entre los residuos de aminoácidos 87-108 o de ambos intervalos de residuos 59-80 y 87-108 del hTNF\alpha (de la SEC ID NO:1). Los anticuerpos anti-TNF quiméricos anti-TNF quiméricos preferidos de la presente invención no reconocen epítopos de entre, al menos, uno de los aminoácidos 11-13, 37-42, 49-57 o 155-157 del hTNF\alpha (de la SEC ID NO:1). En una realización preferida, el epítopo comprende, al menos, 2 aminoácidos de los residuos 87-108 o de ambos intervalos de residuos 59-80 y 87-108 del hTNF\alpha (de la SEC ID NO:1). En otra realización preferida, el epítopo comprende, al menos, 3 aminoácidos de los residuos 59-80 y 87-108 del hTNF\alpha (de la SEC ID NO:1). En otra realización preferida, el epítopo comprende, al menos, 4 aminoácidos de los residuos 87-108 o ambos residuos 59-80 y 87-108 del hTNF\alpha (de la SEC ID NO:1). En otra realización preferida, el epítopo comprende, al menos, 5 aminoácidos de los residuos 87-108 o de ambos intervalos de residuos 59-80 y 87-108 del hTNF\alpha (de la SEC ID NO:1). En otra realización preferida, el epítopo comprende, al menos, 6 aminoácidos de los residuos 87-108 o de ambos intervalos de residuos 59-80 y 87-108 del hTNF\alpha (de la SEC ID NO:1). En otra realización preferida, el epítopo comprende, al menos, 7 aminoácidos de los residuos 87-108 o de ambos intervalos de residuos 59-80 y 87-108 del hTNF\alpha (de la SEC ID NO:1).

Un término "antígeno" es una molécula o una porción de una molécula que es capaz de unirse a un anticuerpo y que es capaz también de inducir a un animal a producir anticuerpos capaces de unirse a un epítopo de dicho antígeno. Un antígeno puede tener uno o más epítopos. La reacción específica mencionada anteriormente se refiere a que el antígeno reaccionará, de un modo altamente selectivo, con su correspondiente anticuerpo y no con los muchos otros anticuerpos que pueden ser inducidos por otros antígenos. Los antígenos preferidos que se unen a los anticuerpos anti-TNF, de la presente invención incluyen, al menos, 5 aminoácidos que comprenden, al menos, uno delos residuos de aminoácidos 87-108 o de ambos intervalos de residuos 59-80 y 87-108 del hTNF\alpha (de la SEC ID NO:1). Los antígenos preferidos que se unen a los anticuerpos anti-TNF, de la presente invención no incluyen los aminoácidos de las secuencias de aminoácidos 11-13, 37-42, 49-57 o 155-157 de hTNP\alpha (SEC ID NO:1).

El término "anticuerpo" se pretende que incluya un anticuerpo monoclonal o policlonal, así como derivados de los mismos, que son capaces de unirse a porciones del TNF que inhiben la unión del TNF a receptores del TNF. La memoria descriptiva también incluye fragmentos los cuales incluyen, por ejemplo, Fab, Fab', F(ab')_{2} y F_{v}. Estos fragmentos carecen del fragmento Fc del anticuerpo íntegro, se eliminan más rápidamente de la circulación, y pueden tener menos uniones a tejidos no específicos que el anticuerpo íntegro (Wahl et al., J. Nucl. Med. 24: 316-325 (1983). Los fragmentos se producen a partir de anticuerpos íntegros usando procedimientos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante escisión proteolítica con enzimas tales como la papaína (para producir fragmentos Fab) o la pepsina (para producir fragmentos F(ab')_{2}). Las regiones de los anticuerpos anti-TNF de la presente invención incluyen, al menos, una de las siguientes: una región constante de cadena pesada (H_{c}), una región variable de cadena pesada (H_{v}), una región variable de cadena ligera (L_{v}) y una región constante de cadena ligera (L_{c}), incluyendo el anticuerpo monoclonal o policlonal al menos una región variable de cadena pesada (H_{v}) o una región variable de cadena ligera (L_{v}) que se une a una porción de un TNF e inhibe la actividad biológica del TNF.

El anticuerpo quimérico se une a los aminoácidos de un epítopo del TNF, anticuerpo denominado cA2, que es producido por un hibridoma o por un hospedador recombinante. El anticuerpo es un anticuerpo quimérico que reconoce un epítopo reconocido por el A2.En una realización aún más preferida, el anticuerpo es un anticuerpo quimérico denominado A2 quimérico (cA2).

Los anticuerpos quiméricos de la presente invención comprenden cadenas de inmunoglobulina pesadas (H) y ligeras (L) individuales. Una cadena H quimérica comprende una región de unión al antígeno derivada de una cadena H de un anticuerpo no humano específico para el TNF que se une a, al menos, una porción de una región C de cadena H (C_{H}) humana.

Una cadena L quimérica de acuerdo con la presente invención comprende una región de unión al antígeno derivada de una cadena L de un anticuerpo no humano específico para el TNF, unida a, al menos, una porción de una región C de cadena L (C_{L}).

Tal como se usa en el presente documento, el término "región de unión al antígeno" se refiere a la porción de una molécula de anticuerpo que contiene los residuos de aminoácidos que interactúan con un antígeno y que confieren al anticuerpo su especificidad y afinidad hacia el antígeno. La región del anticuerpo incluye los residuos de aminoácidos del "marco conservado" necesarios para conservar la conformación adecuada de los residuos que se unen al
antígeno.

Tal como se usa en el presente documento, el término "anticuerpo quimérico" incluye inmunoglobulinas monovalentes, divalentes o polivalentes. Un anticuerpo quimérico monovalente es un dímero (HL) formado por una cadena H quimérica asociada mediante enlaces disulfuro a una cadena L quimérica. Un anticuerpo quimérico divalente es un tetrámero (H_{2}L_{2}) formado por dos dímeros HL asociados mediante, al menos, un enlace disulfuro. Un anticuerpo quimérico polivalente también puede obtenerse, por ejemplo, empleando una región C_{H} que se une (por ejemplo, de una cadena H de IgM, o de una cadena \mu).

La invención proporciona asimismo "derivados" de los anticuerpos quiméricos, o derivados, incluyendo dicho término las proteínas codificadas por genes truncados o modificados para proporcionar especies moleculares funcionalmente similares a los fragmentos de inmunoglobulina. Las modificaciones incluyen, aunque no se limitan a ellas, la adición de secuencias génicas que codifican proteínas citotóxicas tales como toxinas vegetales y bacterianas. Los derivados se pueden obtener a partir de cualquiera de los hospedadores de esta invención. Como alternativa, los anticuerpos, anti-TNF quiméricos se pueden unir a proteínas citotóxicas o a compuestos in vitro, para proporcionar anticuerpos anti-TNF citotóxicos que podrían destruir selectivamente células que tienen receptores del TNF.

Los anticuerpos con cadenas H y cadenas L quiméricas con la misma o con diferente especificidad de unión a la región V, se pueden preparar mediante la asociación adecuada de las cadenas polipeptídicas individuales, tal como se describe, por ejemplo, en Sears et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72: 353-357 (1975). Según este enfoque, los hospedadores que expresan cadenas H quiméricas (o sus derivados) se cultivan por separado en hospedadores que expresan cadenas L quiméricas (o sus derivados), y las cadenas de inmunoglobulina se recuperan por separado y después se asocian. Como alternativa, los hospedadores se pueden cultivar conjuntamente y dejar que las cadenas se asocien espontáneamente en el medio de cultivo, recuperando a continuación la inmunoglobulina, o el fragmento o el derivado, ensamblada.

La región de unión al antígeno del anticuerpo quimérico de la presente invención procede preferiblemente de un anticuerpo no humano específico para el TNF humano. Las fuentes preferidas del ADN que codifica dicho anticuerpo no humano incluyen las estirpes celulares que producen anticuerpos, preferiblemente estirpes celulares quiméricas conocidas comúnmente como hibridomas. Un hibridoma preferido es la estirpe celular del hibridoma A2.

Las células hídridas se forman por la fusión de una célula productora de un anticuerpo anti-hTNF\alpha no humano, típicamente una célula de bazo de un animal inmunizado contra el TNF humano recombinante o natural, o un fragmento peptídico de la secuencia proteínica del TNF\alpha humano. Como alternativa, la célula productora de un anticuerpo anti-TNF\alpha no humano puede ser un linfocito B obtenido de la sangre, el bazo, los ganglios linfáticos u otro tejido de un animal inmunizado con el TNF.

La célula productora del anticuerpo que aporta las secuencias de nucleótidos que codifican la región de unión al antígeno del anticuerpo quimérico de la presente invención se puede obtener también mediante transformación de una célula no humana, como la de un primate, o de una célula humana. Por ejemplo, un linfocito B que produce anticuerpos anti-TNF puede ser infectado y transformado con un virus tal como el virus Epstein-Barr para proporcionar una célula productora de anti-TNF inmortal (Kozbor et al., Immunol. Today 4: 72-79 (1983)). Como alternativa, el linfocito B puede ser transformado para proporcionar un gen transformante o un producto de un gen transformante, tal como es bien conocido en la técnica.

Preferiblemente, la región de unión al antígeno será de procedencia murina. En otras realizaciones, la región de unión al antígeno puede proceder de otras especies animales, en particular de roedores tales como conejos, ratas o hámsters.

El segundo copartícipe de la fusión, que proporciona la función inmortalizadora, puede ser una célula linfoblastoide o una célula de mieloma o plasmocitoma, que no es en sí misma una célula productora de anticuerpos, aunque sí es maligna. Las células copartícipes de la fusión preferidas incluyen el hibridoma SP2/0-Ag14, abreviado como SP2/0 (ATCC CRL1581) y el mieloma P3X63Ag8 (ATCC TIB9), o sus derivados (véanse: Hartlow, E. et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1988).

Los hibridomas murinos que producen mAb específicos para el TNF\alpha humano se forman por la fusión de una célula copartícipe de la fusión de ratón, tal como SP2/0, y células de bazo de ratón inmunizado contra hTNF\alpha purificado, hTNF\alpha recombinante, péptidos del TNF naturales o sintéticos, que engloban péptidos que incluyen 5 o más aminoácidos seleccionados de entre los residuos 59-80, y 87-108 del TNF (de la SEC ID NO:1), u otras preparaciones biológicas que contienen TNF. Para inmunizar a los ratones, se puede seguir una serie de protocolos convencionales diferentes. Por ejemplo, los ratones pueden recibir inmunizaciones primarias y de refuerzo del TNF.

Los residuos del TNF 87-108 o ambos intervalos de residuos 59-80 y 87-108 del TNF (de la SEC ID NO:1), fragmentos o combinaciones de péptidos que los contienen son útiles como inmunógenos para inducir anticuerpos que reconocerán secuencias peptídicas presentes en el contexto de la molécula del TNF original.

Los epítopos reconocidos por los anticuerpos, de la presente invención incluyen 5 o más aminoácidos que comprenden, al menos, un aminoácido de cada una o de ambas de las siguientes secuencias de aminoácidos del TNF, que proporcionan un epítopo topográfico del TNF que es reconocido por un anticuerpo, y por regiones variables del mismo, de la presente invención, y se une a él con actividad anti-TNF:

59-80:

Tyr-Ser-Gln-Val-Leu-Phe-Lys-Gly-Gln-Gly-Cys-Pro-Ser-Thr-His-Val-Leu-Leu-Thr-His-Thr-Ile

\quad

(aminoácidos 59-80 de la SEC ID NO:1);

y

87-108:

Tyr-Gln-Thr-Lys-Val-Asn-Leu-Leu-Ser-Ala-Ile Lys-Ser-Pro-Cys-Gln-Arg-Glu-Thr-Pro-Glu-Gly

\quad

(aminoácidos 87-108 de la SEC ID NO:1).

Los péptidos particulares que se pueden usar para generar anticuerpos de la presente invención incluyen combinaciones de aminoácidos seleccionados de entre, al menos, los residuos 87-108 o de ambos intervalos de residuos 59-80 y 87-108, que se combinan para proporcionar un epítopo del TNF al que se unen los anticuerpos anti-TNF quiméricos, y cuya unión proporciona la actividad biológica anti-TNF. Dichos epítopos incluyen, al menos, de 1 a 5 aminoácidos y menos de 22 aminoácidos de los residuos 87-108 o de cada intervalo de residuos 59-80 y 87-108, que en combinación con otros aminoácidos del TNF proporcionan un epítopo de, al menos, 5 aminoácidos de longitud.

Las técnicas para inducir los anticuerpos de la presente invención por parte de secuencias pequeñas peptídicas que reconocen y se unen a esas secuencias en forma libre o conjugada, o que se presentan como una secuencia original en el contexto de una proteína grande son bien conocidas en la técnica. Dichos anticuerpos incluyen anticuerpos humanos y murino-humanos producidos por hibridomas o técnicas recombinantes conocidas en la técnica.

La identificación de estas secuencias peptídicas reconocidas por los mAb de la presente invención proporciona la información necesaria para generar anticuerpos monoclonales adicionales con características de unión y utilidad terapéutica que son análogas a las de las realizaciones de esta solicitud.

En una realización preferida, los aminoácidos del epítopo no son, al menos, uno de los aminoácidos 11-13, 37-42, 49-57 y 155-157 del hTNF\alpha (de la SEC ID NO:1).

Las fusiones celulares se efectúan mediante procedimientos convencionales bien conocidos por los especialistas del campo de la inmunología (Kohler y Milstein, Nature 256: 495-497 (1975) y patente de Estados Unidos con número 4.376.110; Hartlow, E. et al., supra; Campbell, A., "Monoclonal Antibody Technology" In: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Volume 13 (Burdon, R., et al., eds.), Elsevier, Amsterdam (1984); Kennett et al., Monoclonal Antibodies (Kennett et al., eds. págs. 365-367, Plenum Press, NY, 1980); de St. Groth, S.F., et al., J. Immunol. Meth. 35: 1-21 (1980); Galfre, G. et al., Methods Enzymol. 73: 3-46 (1981); Goding, J.W. 1987. Monoclonal Antibodies: Principles and Practice. 2nd ed. Academic Press, London, 1987).

Las estirpes celulares copartícipes de la fusión y los procedimientos para fusionar y seleccionar hibridomas y para rastrear los mAb son bien conocidas en la técnica (Hartlow, E. et al., supra; Kawamoto, T. et al., Meth. Enzymol. 121: 266-277 (1986); Kearney, J.F. et al., J. Immunol. 123: 1548-1550 (1979); Kilmartin, J.V. et al., J. Cell Biol. 93: 576-582 (1982); Kohler, G. et al., Eur. J. Immunol. 6: 292-295 (1976); Lane, D.P. et al., J. Immunol. Meth. 47: 303-307 (1981); Mueller, U.W. et al., J. Immunol. Meth. 87: 193-196 (1986); Pontecorvo, G., Somatic Cell Genet. 1: 397-400 (1975); Sharo, J., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 1420-1424 (1979); Shulman, M. et al., Nature 276: 269-270 (1978); Springer, T.A. (ed), Hibridoma Technology in the Biosciences and Medicine, Plenum Press, New York, 1985; y Taggart, R.T. et al., Science 219: 1228-1230 (1982)).

El mAb quimérico específico para el hTNF\alpha de la presente invención se puede producir en grandes cantidades inyectando células de hibridomas o transfectomas que segregaban el anticuerpo en la cavidad peritoneal de los ratones y, después del periodo de tiempo adecuado, recogiendo el líquido ascítico que contiene un título elevado de mAb, y aislando los mAb del mismo. Para dicha producción in vivo de mAb con un hibridoma no murino (por ejemplo, de ratas o humano), las células de hibridoma se desarrollan preferiblemente en ratones irradiados o atímicos desnudos.

Como alternativa, los anticuerpos se pueden producir cultivando células de hibridomas o transfectomas in vitro y aislando el mAb segregado en el medio de cultivo celular.

Los anticuerpos monoclonales de la presente invención reconocen epítopos que incluyen residuos no contiguos localizados en los residuos no contiguos de las secuencias 87-108 o en ambos intervalos de residuos 59-80 y 87-108 del TNF (de la SEC ID NO:1). Los mAb anti-TNF quiméricos preferidos son los que inhiben esta unión del TNF\alpha humano a sus receptores gracias a su capacidad para unirse a una o más de estas secuencias peptídicas. Estos anticuerpos podrían bloquear la actividad del TNF ya que se unen al epítopo de secuencias que incluyen 87-108 y/o 110-128 del TNF (de la SEC ID NO:1). Dicha unión se ha demostrado que inhibe la actividad anti-TNF, tal como se describe en el presente documento.

Los péptidos particulares que se pueden usar para rastrear los anticuerpos de la presente invención incluyen combinaciones de aminoácidos seleccionados de entre, al menos, los residuos 87-108 o ambos intervalos de residuos 59-80 y 87-108, que se combinan para proporcionar un epítopo del TNF al que se unen los anticuerpos anti-TNF quiméricos, fragmentos y regiones de los mismos, de la presente invención, y cuya unión proporciona la actividad biológica anti-TNF. Dichos epítopos incluyen, al menos, de 1 a 5 aminoácidos y menos de 22 aminoácidos de los residuos 87-108 o de cada uno de los residuos 59-80 y 87-108, que en combinación con otros aminoácidos del TNF proporciona un epítopo de, al menos, 5 aminoácidos de longitud.

Expresión recombinante de anticuerpos quiméricos con actividad anti-TNF

Se pueden proporcionar anticuerpos quiméricos humanos o murino-humanos recombinantes que inhiben el TNF y se unen a un epítopo incluido en las secuencias de los residuos de aminoácidos 87-108 o de ambos intervalos de residuos 59-80 y 87-108 del hTNF\alpha (de la SEC ID NO:1), de acuerdo con la presente invención usando técnicas conocidas basadas en lo expuesto en el presente documento.

El ADN que codifica un anticuerpo anti-TNF de la presente invención puede ser ADN genómico o ADNc que codifica, al menos, una de las siguientes regiones: la región constante de cadena pesada (H_{c}), la región variable de cadena pesada (H_{V}), la región variable de cadena ligera (L_{V}) y la región constante de cadena ligera (L_{c}). Una alternativa conveniente para el uso de fragmentos génicos cromosómicos como fuente del ADN que codifica el segmento de unión al antígeno con región V murina es el uso de ADNc para la construcción de genes de inmunoglobulina quiméricos, tal como se describe en Liu et al. (Proc. Natl. Acad. Sci., USA 84: 3439 (1987) y J. Immunology 139: 3521 (1987), cuyas informaciones se incorporan en su totalidad al presente documento como referencia. El uso del ADNc requiere elementos de expresión génica adecuados para que la célula hospedadora se combine con el gen a fin de conseguir la síntesis de la proteína deseada. El uso de secuencias de ADNc es ventajoso respecto al uso de secuencias genómicas (que contienen intrones), ya que las secuencias de ADNc se pueden expresar en bacterias u otros hospedadores que carecen de sistemas adecuados de corte y empalme del ARN.

Los genes humanos que codifican las regiones constantes (C) de los anticuerpos quiméricos de la presente invención pueden proceder de una genoteca hepática fetal humana, mediante procedimientos conocidos. Los genes humanos de las regiones C pueden proceder de cualquier célula humana que incluye las que expresan y producen inmunoglobulinas humanas. La región humana C_{H} puede proceder de cualquiera de las clases o isotipos conocidos de cadenas H humanas, que incluyen: gamma, \mu, \alpha, \delta o \varepsilon, y subtipos de los mismos, tales como G1, G2, G3 y G4. Debido a que el isotipo de la cadena H es el responsable de las diversas funciones efectoras de un anticuerpo, la elección de la región C_{H} vendrá determinada por las funciones efectoras deseadas, tales como la fijación del complemento, o la citotoxicidad celular dependiente de la actividad del anticuerpo (ADCC). Preferiblemente, la región C_{H} procede de los isotipos gamma 1 (IgG1), gamma 3 (IgG3), gamma 4 (IgG4), o \mu (IgM).

La región C_{L} humana pueden proceder de un isotipo de cadena L humana kappa o lambda.

Los genes que codifican las regiones C de la inmunoglobulina humana se obtienen a partir de células humanas mediante técnicas de clonación convencionales (Sambrook, J. et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1989) y Ausubel et al, eds. Current Protocols in Molecular Biology (1987-1991). Los genes humanos de la región C se encuentran fácilmente disponibles a partir de clones conocidos que contienen genes que representan las dos clases de cadenas L, las cinco clases de cadenas H y subclases de las mismas. Se pueden preparar fragmentos de un anticuerpo quimérico, tales como F(ab')_{2} y Fab, mediante diseño de un gen de la cadena H quimérico que se trunca adecuadamente. Por ejemplo, un gen quimérico que codifica una porción de cadena H de un fragmento F(ab')_{2} podría incluir secuencias de ADN que codifican el dominio CH_{1} y la región bisagra de la cadena H, seguidas de un codón de terminación de la traducción para proporcionar la molécula truncada.

Por lo general, los anticuerpos quiméricos de la presente invención se producen mediante clonación de segmentos de ADN que codifican las regiones de unión al antígeno de cadena L y H de un anticuerpo específico para el TNF, y unión de estos segmentos de ADN a segmentos de ADN que codifican regiones C_{H} y C_{L}, respectivamente, para producir genes que codifican la inmunoglobulina murina, humana o quimérica.

Así pues, en una realización preferida, se crea un gen quimérico fusionado que comprende un primer segmento de ADN que codifica, al menos, la región de unión al antígeno de origen no humano, tal como una región V funcionalmente reordenada con un segmento de unión (J), unido a un segundo segmento de ADN que codifica, al menos, una parte de una región C humana.

Por tanto, al codificar el ADNc las regiones C y V del anticuerpo, el procedimiento de producción del anticuerpo quimérico de acuerdo con la presente invención implica diversas etapas, que se reseñan a continuación:

1.

Aislamiento del ARN mensajero (ARNm) a partir de la estirpe celular que produce un anticuerpo anti-TNF y de anticuerpos adicionales opcionales que proporcionen las regiones constantes de cadena pesada y ligera; clonación y producción del ADNc a partir de las mismas;

2.

Preparación de una genoteca de ADNc que contiene todo el gen del ARNm purificado, a partir de la cual los segmentos génicos de la región C o V adecuados de los genes de cadena L y H se pueden: (i) identificar con las sondas adecuadas, (ii) secuenciar, y (iii) hacerlos compatibles con un segmento génico C o V de otro anticuerpo para un anticuerpo quimérico;

3.

Construcción de secuencias completas que codifican la cadena H o L mediante unión de los segmentos génicos específicos de la región V clonados al gen de la región C clonado, tal como se ha descrito anteriormente;

4.

Expresión y producción de cadenas L y H en hospedadores seleccionados, que incluyen células procariotas y eucariotas para proporcionar anticuerpos murino-humanos o humanos.

Una característica común de todos los genes de las cadenas H y L de la inmunoglobulina y de sus ARNm codificados es la región J. Las regiones J de las cadenas H y L tienen secuencias diferentes, pero existe un alto grado de homología entre dichas secuencias (superior al 80%) entre cada grupo, especialmente cerca de la región C. Esta homología se utiliza en este procedimiento y se pueden usar secuencias consenso de las regiones J de las cadenas H y L para diseñar oligonucleótidos que se usarán como cebadores en la introducción de sitios de restricción útiles en la región J para una unión posterior de los segmentos de la región V a segmentos de la región C humanos.

Los vectores ADNc de la región C preparados a partir de células humanas se pueden modificar mediante mutagénesis dirigida específica de sitio para situar un sitio de restricción en una posición análoga en la secuencia humana. Por ejemplo, se puede clonar la región C de la cadena completa humana kappa (C_{k}) y la región C completa humana gamma-1 (C_{gamma-1}). En este caso, el procedimiento alternativo basado en los clones genómicos de la región C como fuente de vectores de la región C podría no permitir que se expresaran estos genes en sistemas bacterianos en los que no existen las enzimas necesarias para eliminar las secuencias interpuestas. Los segmentos clonados de la región V se extraen y se ligan a vectores de la región C de cadena L o H. Como alternativa, la región humana C_{gamma-1} se pueden modificar mediante la introducción de un codón de terminación, generando de ese modo una secuencia génica que codifica la porción de cadena H de una molécula Fab. Las secuencias de codificación con regiones V y C unidas se transfieren después a vehículos de expresión adecuados para la expresión en hospedadores adecuados, eucariotas o procariotas.

Dos secuencias de codificación del ADN se dice que están "unidas operativamente" si la unión da como resultado una secuencia continuamente traducible sin alteración o interrupción del marco de lectura triplete. Una secuencia de ADN de codificación está unida operativamente a un elemento de expresión génica si la unión da como resultado la función adecuada de ese elemento de expresión génica que da como resultado la expresión de la secuencia de codificación.

Los vehículos de expresión incluyen plásmidos u otros vectores. Entre estos se prefieren los vehículos que llevan una secuencia de cadena C_{H} o C_{L} funcionalmente completa humana con sitios de restricción adecuados modificados de modo que cualquier secuencia de cadena V_{H} o V_{L} con extremos cohesivos adecuados se puede insertar en ella fácilmente. Los vehículos que contienen secuencias de cadenas C_{H} o C_{L} humanas sirven, por tanto, como intermedios para la expresión cualquier cadena H o L completa deseada en cualquier hospedador adecuado.

Un anticuerpo quimérico, tal como murino-humano o humano, se sintetizará típicamente a partir de genes controlados por los promotores génicos cromosómicos naturales para las regiones V de cadenas H y L de ratón usadas en las construcciones; el proceso de corte y empalme se produce normalmente entre el sitio donante del corte y empalme en la región J de ratón y el sitio aceptor del corte y empalme que precede a la región C humana y también en las regiones de corte y empalme que aparecen en la región humana C_{H}; la poliadenilación y la terminación de la transcripción se producen en los sitios cromosómicos naturales cadena abajo de las regiones de codificación humanas.

Los elementos de expresión génica útiles para la expresión de los genes de ADNc incluyen: (a) promotores de la transcripción vírica y los elementos intensificadores de los mismos, tal como el promotor temprano SV40 (Okayama, H. et al., Mol. Cell. Biol. 3: 280 (1983)), la secuencia LTR del virus del sarcoma de Rous (Gorman, C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 79: 6777 (1982)), y la secuencia LTR del virus de la leucemia murina de Moloney (Grosschedl, R. et al., Cell 41: 885 (1985)); (b) regiones de corte y empalme y sitios de poliadenilación tales como los procedentes de la región tardía del SV40 (Okayama et al., supra); y (c) sitios de poliadenilación tales como en el SV40 (Okayama et al., supra).

Los genes de ADNc de la inmunoglobulina se pueden expresar tal como se describe en Liu et al., supra, y Weidle et al., Gene 51: 21 (1987), usando como elementos de expresión el promotor temprano SV40 y su intensificador, los intensificadores del promotor de la cadena H de la inmunoglobulina de ratón, las regiones de corte y empalme del ARNm en la región tardía del SV40, la secuencia interpuesta de la \beta-globina de conejo, los sitios de poliadenilación de la \beta-globina de conejo y de la inmunoglobulina, y los elementos de poliadenilación del SV40. Para genes de inmunoglobulina que están compuestos en parte de ADNc y en parte de ADN genómico (Whittle et al., Protein Engineering 1: 499 (1987), el promotor de la transcripción es un citomegalovirus humano, los intensificadores del promotor son citomegalovirus e inmunoglobulina humana y de ratón, y las regiones de corte y empalme del ARNm y de poliadenilación proceden de secuencias cromosómicas naturales de inmunoglobulina.

En una realización, para la expresión de los genes de ADNc en células de roedor, el promotor de la transcripción es una secuencia LTR vírica, los intensificadores del promotor de la transcripción son un potenciador de la cadena pesada de la inmunoglobulina de ratón o el potenciador LTR vírico, o ambos, la región de corte y empalme contiene un intrón de más de 31 pb, y las regiones de poliadenilación y de terminación de la transcripción proceden de la secuencia cromosómica natural correspondiente a la cadena de inmunoglobulina que se está sintetizando. En otras realizaciones, las secuencias de ADNc que codifican otras proteínas se combinan con los elementos de expresión anteriormente citados para conseguir la expresión de las proteínas en células de mamíferos.

Cada gen fusionado se ensambla en un vector de expresión, o bien se inserta en él. Las células recipientes capaces de expresar el producto génico de la cadena de inmunoglobulina quimérica se transfectan entonces por separado con un gen que codifica una cadena L quimérica o una cadena H quimérica, o se transfectan conjuntamente con un gen de una cadena L quimérica y una cadena H quimérica. Las células recipientes transfectadas se cultivan en condiciones que permiten la expresión de los genes incorporados, y las cadenas de inmunoglobulina o los anticuerpos íntegros o los fragmentos expresados se recuperan del cultivo.

En una realización, los genes fusionados que codifican las cadenas H y L quiméricas, o porciones de las mismas, se ensamblan en vectores de expresión por separado que se usan después para transfectar conjuntamente una célula recipiente.

Cada vector puede contener dos genes seleccionables, un primer gen seleccionable diseñado para la selección en un sistema bacteriano y un segundo gen seleccionable diseñado para la selección en un sistema eucariota, teniendo cada vector un par de genes diferente. Esta estrategia da como resultado vectores que dirigen en primer lugar la producción de los genes fusionados en un sistema bacteriano, permitiendo su amplificación. Los genes producidos y amplificados de este modo en un hospedador bacteriano se usan posteriormente para transfectar conjuntamente una célula eucariota, permitiendo la selección de una célula transfectada conjuntamente que lleva los genes transfectados deseados.

Ejemplos de genes seleccionables para usar en un sistema bacteriano son el gen que confiere resistencia a la ampicilina y el gen que confiere resistencia al cloranfenicol. Los genes seleccionables preferidos para usar transfectantes eucariotas incluyen el gen xantina guanina fosforibosiltransferasa (denominado gpt) y el gen fosfotransferasa de Tn5 (denominado neo). La selección de células que expresan el gpt se basa en el hecho de que la enzima codificada por este gen utiliza xantina como sustrato para la síntesis de nucleótidos de purina, mientras que la enzima endógena análoga no. En un medio que contiene: (1) ácido micofenólico, que bloquea la conversión del monofosfato de inosina en monofosfato de xantina, y (2) xantina, sólo pueden sobrevivir las células que expresan el gen gpt. El producto del neo bloquea la inhibición de la síntesis de proteínas por el antibiótico G418 y otros antibióticos de la clase neomicina.

Los dos procedimientos de selección se pueden usar simultánea o secuencialmente para seleccionar los genes para la expresión de la cadena de inmunoglobulina introducidos en dos vectores diferentes de ADN en una célula eucariota. No es necesario incluir diferentes marcadores seleccionables para células eucariotas; un vector de cadena L y uno de cadena H, que contienen cada uno el mismo marcador seleccionable se pueden transfectar conjuntamente. Tras la selección de las células resistentes adecuadas, la mayoría de los clones contendrá copias integradas de ambos vectores de cadena L y H.

Como alternativa, los genes fusionados que codifican las cadenas H y L quiméricas se pueden ensamblar en el mismo vector de expresión.

Para la transfección de vectores de expresión y la producción del anticuerpo quimérico, la estirpe de células recipientes preferida es una célula de mieloma. Las células de mieloma pueden sintetizar, ensamblar y segregar inmunoglobulinas codificadas por genes de inmunoglobulina transfectados y poseen el mecanismo de glucosilación de la inmunoglobulina. Una célula recipiente particularmente preferida es la célula de mieloma que no produce Ig SP2/0 (ATCC #CRL 8287). Las células SP2/0 producen sólo inmunoglobulina codificada por los genes transfectados. Las células de mieloma se pueden desarrollar en un cultivo o en la cavidad peritoneal de un ratón, en la que se puede obtener la inmunoglobulina segregada en el líquido ascítico. Otras células recipientes adecuadas incluyen células linfoides tales como los linfocitos B de origen humano o no humano, las células de hibridoma de origen humano o no humano, o células de heterohibridoma de especies distintas.

El vector de expresión que lleva una construcción de un anticuerpo quimérico de la presente invención se puede introducir en una célula hospedadora adecuada mediante cualquiera de una serie de medios adecuados, que incluyen medios bioquímicos tales como la transformación, la transfección, la conjugación, la fusión protoplasmática, la precipitación con fosfato cálcico, y la aplicación con policationes tales como el dietilaminoetildextrano (DEAE), y medios mecánicos tales como la electroformación de poros, la microinyección directa, y el bombardeo de microproyectiles (Johnston et al., Science 240: 1538 (1988). Un modo preferido para introducir el ADN en células linfoides es mediante electroformación de poros (Potter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 7161 (1984); Yoshikawa, K. et al., Jpn. J. Cancer Res. 77: 1122-1133). En este procedimiento, las células recipientes se someten a un pulso eléctrico en presencia del ADN que se va a incorporar. Típicamente, después de la transfección, se dejan recuperar las células en el medio completo durante aproximadamente 24 horas, y se siembran después en placas de cultivo de 96 pocillos en presencia del medio selectivo. La selección con G418 se lleva a cabo usando aproximadamente de 0,4 a 0,8 mg/ml de G418. La selección con ácido micofenólico utiliza aproximadamente 6 \mug/ml más aproximadamente 0,25 mg/ml de xantina. La técnica de electroformación de poros se espera que proporcione unas frecuencias de transfección de aproximadamente 10^{-5} a aproximadamente 10^{-4} para las células SP2/0. En el procedimiento de fusión protoplasmática, se usa lisozima para separar las paredes celulares del virus del catarro que hospeda el plásmido recombinante que contiene el gen quimérico del anticuerpo. Los esferoplastos resultantes se fusionan con las células de mieloma con
polietilenglicol.

Los genes de inmunoglobulina de la presente invención se pueden expresar también en células de mamíferos no linfoides o en otras células eucariotas, tales como levaduras, o en células procariotas, en particular bacterias.

Las levaduras proporcionan ventajas sustanciales respecto a las bacterias para la producción de cadenas L y H de inmunoglobulina. Las levaduras llevan a cabo modificaciones post-traduccionales de los péptidos que incluyen la glucosilación. Actualmente, existe una serie de estrategias con ADN recombinante que utilizan potentes secuencias promotoras y un elevado número de plásmidos copia que se pueden usar para la producción de la proteína deseada en levaduras. Las levaduras reconocen las secuencias guía de productos génicos de mamíferos clonados y segregan péptidos que llevan las secuencias guía (es decir, pre-péptidos) (Hitzman, et al., 11th International Conference on Yeats, Genetics and Molecular Biology, Montpellier, Francia, 13-17 de septiembre de 1982).

Los sistemas de expresión de genes en levaduras se pueden evaluar de modo rutinario para determinar los niveles de producción, secreción y estabilidad de proteínas de cadenas L y H quiméricas y de anticuerpos, fragmentos y regiones ensamblados quiméricos y murinos. Se pueden utilizar cualquiera de una serie de sistemas de expresión de genes en levaduras que incorporan elementos promotores y de terminación de genes activamente expresados que codifican enzimas glucolíticas producidas en grandes cantidades cuando las levaduras se desarrollan en medios ricos en glucosa. Los genes glucolíticos conocidos pueden proporcionar, asimismo, señales de control de la transcripción muy eficaces. Se pueden utilizar, por ejemplo, las señales de terminación y promotoras del gen de la fosfoglicerato quinasa (PGK). Se pueden considerar también una serie de criterios para evaluar plásmidos de expresión óptimos para la expresión de ADNc de inmunoglobulina clonados en levaduras (véase Glover, D.M., ed., ADN Cloning. Vol. II, págs. 45-66, IRL Press, 1985).

Se pueden utilizar también cepas bacterianas como hospedadores para la producción de moléculas de anticuerpos o fragmentos de anticuerpos descritos por esta invención; se puede usar las cepas de E. coli K12 tal como la E. coli W3110 (ATCC 27325), y otras enterobacterias tales como la Salmonella typhimurium o la Serratia marcescens, y diversas especies de Pseudomonas.

Junto con estos hospedadores bacterianos se usan vectores plásmido que contienen secuencias de control y replicones que proceden de especies compatibles con la célula hospedadora. El vector lleva un sitio de replicación, así como genes específicos que son capaces de proporcionar una selección fenotípica de las células transformadas. Se pueden considerar también una serie de criterios para evaluar plásmidos de expresión para la producción de anticuerpos, fragmentos y regiones quiméricos y murinos o cadenas de anticuerpo codificados por los ADNc de inmunoglobulina clonados en bacterias (véase Glover, D.M., ed., ADN Cloning. Vol. I, IRL Press, 1985).

Los hospedadores preferidos son células de mamífero, desarrolladas in vitro o in vivo. Las células de mamífero proporcionan modificaciones post-traduccionales a las moléculas proteínicas de inmunoglobulina que incluyen la eliminación del péptido guía, el plegamiento y ensamblaje de las cadenas L y H, la glucosilación de las moléculas de anticuerpo, y la secreción de proteínas anticuerpo funcionales.

Las células de mamífero que pueden ser útiles como hospedadores para la producción de proteínas anticuerpo, además de las células de origen linfoide que se han descrito anteriormente, incluyen células de origen fibroblástico, tales como las células Vero (ATCC CRL 81) o CHO-K1 (ATCC CRL 61).

Se encuentran disponibles muchos sistemas de vectores para la expresión de genes de las cadenas H y L clonados en células de mamíferos (véase Glover, D.M., ed., ADN Cloning. Vol. II, págs. 143-238, IRL Press, 1985). Se pueden adoptar diversos enfoques para obtener los anticuerpos H_{2}L_{2} completos. Tal como se ha discutido anteriormente, es posible expresar conjuntamente cadenas H y L en las mismas células para conseguir la asociación y la unión intracelulares de las cadenas L y H en anticuerpos tetrámericos H_{2}L_{2} completos. La expresión conjunta se puede producir usando el mismo o diferentes plásmidos en el mismo hospedador. Los genes para ambas cadenas H y L se pueden situar en el mismo plásmido, que se transfecta entonces en las células, seleccionando directamente de este modo las células que expresan ambas cadenas. Como alternativa, se pueden transfectar primero las células con un plásmido que codifica una cadena, por ejemplo la cadena L, seguida de la transfección de la estirpe celular resultante con un plásmido de cadena H que contiene un segundo marcador seleccionable. Las estirpes celulares que producen moléculas H_{2}L_{2} mediante una u otra vía podrían transfectarse con plásmidos que codifican copias adicionales de cadenas H, L o H y L junto con marcadores seleccionables adicionales para generar las estirpes celulares con propiedades mejoradas, tal como una mayor producción de moléculas de anticuerpo H_{2}L_{2} ensambladas o un aumento de la estabilidad de las estirpes celulares transfectadas.

Además de anticuerpos anti-TNF quiméricos o monoclonales, la presente invención se refiere también a un anticuerpo antidiotípico (anti-Id) específico para el anticuerpo anti-TNF de la invención. Un anticuerpo anti-Id es un anticuerpo que reconoce determinantes únicos asociados, por lo general, a la región de unión al antígeno de otro anticuerpo. El anticuerpo específico para el TNF se denomina anticuerpo idiotípico o Id. El anti-Id se pueden preparar mediante inmunización de un animal de la misma especie y tipo génico (por ejemplo una cepa de ratón) como fuente del anticuerpo Id con el anticuerpo Id o la región de unión al antígeno del mismo. El animal inmunizado reconocerá y responderá a los determinantes idiotípicos del anticuerpo de inmunización y producirá un anticuerpo anti-Id. El anticuerpo anti-Id se puede usar también como "inmunógeno" para inducir una respuesta inmunitaria en otro animal, que produce un anticuerpo denominado anti-anti-Id. El anti-anti-Id puede ser epitópicamente idéntico al anticuerpo original que indujo el anti-Id. Así pues, usando anticuerpos para los determinantes idiotípicos de un mAb, es posible identificar otros clones que expresan anticuerpos de idéntica especificidad.

De acuerdo con esto, los mAb generados contra el TNF de acuerdo con la presente invención se puede usar para inducir anticuerpos anti-Id en animales adecuados, tal como ratones BALB/c. Se pueden usar células de bazo de dichos ratones inmunizados para producir hibridomas anti-Id que segreguen mAb anti-Id. Asimismo, los mAb anti-Id se pueden acoplar a un portador tal como la hemocianina de lapa de bocallave (KLH) y se pueden usar para inmunizar ratones BALB/c adicionales. Los sueros de estos ratones contendrán anti-anticuerpos anti-Id tienen las propiedades de unión de los mAb originales específicos para un epítopo del TNF.

Los anticuerpos y derivados quiméricos de la presente invención son útiles para tratar un sujeto con una patología o un trastorno asociado a niveles de una sustancia reactiva con un anticuerpo anti-TNF, en particular TNF, en exceso respecto a los niveles presentes en un sujeto sano normal. Dichas patologías incluyen, aunque no se limitan a ellas, el síndrome septicémico, que incluyen la caquexia, la insuficiencia y el choque circulatorios como resultado de infecciones bacterianas agudas o crónicas, procesos infecciosos o parasitarios agudos o crónicos, que incluyen infecciones bacterianas, víricas y fúngicas, patologías inmuntarias y autoinmuntarias agudas o crónicas, tales como el lupus eritomatoso diseminado y la artritis reumatoide, la hepatitis inducida por el alcohol, patologías inflamatorias crónicas tales como la sarcoidosis y La patología de Crohn, patologías inflamatorias vasculares tales como la coagulación intravascular diseminada, la patología del injerto contra el hospedador, la patología de Kawasaki y patologías malignas que implican tumores que segregan TNF.

Dicho tratamiento comprende la administración parenteral de una dosis sencilla o múltiple del anticuerpo, fragmento o derivado. Para uso farmacéutico humano, se prefieren los potentes anticuerpos, fragmentos y regiones quiméricos y murinos de elevada afinidad y que inhiben o neutralizan el hTNF\alpha de esta invención.

Los anticuerpos monoclonales se pueden administrar a través de cualquier medio que permita al agente activo alcanzar el sitio de acción del agente en el organismo de un mamífero. En el caso de los anticuerpos de esta invención, el principal elemento es la capacidad para alcanzar y unirse al TNF liberado por los monocitos y los macrófagos. Ya que las proteínas son sometidas a digestión cuando se administran oralmente, o mediante administración parenteral, es decir, intravenosa, subcutánea o intramuscular, podrían usarse normalmente para optimizar la absorción.

Los anticuerpos monoclonales se pueden administrar bien como agentes terapéuticos individuales o bien en combinación con otros agentes terapéuticos. Se pueden administrar por separado, aunque, por lo general, se administran con un vehículo farmacéutico seleccionado en función de la vía de administración elegida y de la práctica farmacéutica convencional.

La dosis administrada variará, naturalmente, según una serie de factores conocidos tales como las características farmacodinámicas del agente particular, y el modo y la vía de administración del mismo; la edad, el estado de salud, y el peso del receptor; la naturaleza y la importancia de los síntomas, el tipo de tratamiento concurrente, la frecuencia del tratamiento, y el efecto deseado. Normalmente, una dosificación diaria de ingrediente activo puede ser de aproximadamente 0,1 a 100 miligramos por kilogramo de peso corporal. Normalmente, la administración de 0,5 a 50 miligramos por kilogramo y por día y, preferiblemente, de 1 a 10, administrados en dosis divididas de 1 a 6 veces al día o en una forma de liberación prolongada es eficaz para obtener los resultados deseados.

Las formas de dosificación (composiciones) adecuadas para administración interna contienen, por lo general, de aproximadamente 1 miligramo a aproximadamente 500 miligramos de ingrediente activo por unidad. En estas composiciones farmacéuticas el ingrediente activo estará presente habitualmente en una cantidad de aproximadamente 0,5-95% en peso basado en el peso total de la composición.

Para administración parenteral, el anticuerpo se puede formular como una disolución, una suspensión, una emulsión o un polvo liofilizado junto con un vehículo parenteral farmacéuticamente aceptable. Ejemplos de dichos vehículos son el agua, la disolución salina, la disolución de Ringer, la disolución de dextrosa, y la seroalbúmina humana al 5%. También se pueden usar liposomas y vehículos no acuosos tales como aceites no volátiles. El vehículo o el polvo liofilizado puede contener aditivos que conserven el carácter isotónico (por ejemplo, el cloruro sódico o el manitol) y la estabilidad química (por ejemplo, los tampones y los conservantes). La formulación se esteriliza mediante técnicas usadas comúnmente.

Se describen vehículos farmacéuticos adecuados en la edición más reciente de Remington's Pharmaceutical Sciences, A. Osol, un texto de referencia convencional en este campo.

Por ejemplo, se prepara una composición parenteral adecuada para administración mediante inyección disolviendo un 1,5% en peso del ingrediente activo en una disolución de cloruro sódico al 9%.

Los anticuerpos quiméricos de esta invención se pueden adaptar para tener eficacia terapéutica gracias a su capacidad para mediar en la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) o la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) contra células que tienen TNF asociado a su superficie. Para estas actividades, se puede utilizar una fuente endógena o una fuente exógena de las células efectoras (para la ADCC) o de los componentes del complemento (para la CDC). Los anticuerpos quiméricos, de esta invención, y sus derivados se pueden usar terapéuticamente como inmunoconjugados (véase para una revisión: Dillman, R.O., Ann. Int. Med. 111: 592-603 (1989)). Se pueden acoplar a proteínas citotóxicas, que incluyen, aunque no se limitan a ellas, la ricina, la toxina de Pseudomonas, la toxina diftérica, y el TNF. Las toxinas conjugadas a anticuerpos u otros ligandos, son conocidas en la técnica (véase, por ejemplo, Olsnes, S. et al., Immunol. Today 10: 291-295 (1989)). Las toxinas vegetales y bacterianas típicamente destruirán las células mediante el deterioro del mecanismo de síntesis de las proteínas.

Los anticuerpos quiméricos de esta invención se pueden conjugar con tipos adicionales de restos terapéuticos que incluyen, aunque no se limitan a ellos, radionúclidos, agentes citotóxicos y fármacos. Ejemplos de radionúclidos que se pueden acoplar a anticuerpos y liberar in vivo en sitios del antígeno incluyen ^{212}Bi, ^{131}I, ^{186}Re, y ^{90}Y, lista que no pretende ser exhaustiva. Los radionúclidos ejercen su efecto citotóxico mediante irradiación local de las células, lo que provoca diversas lesiones intracelulares, tal como se conoce en la técnica de la radioterapia.

Los fármacos citotóxicos que se pueden conjugar con anticuerpos y que se pueden usar posteriormente para terapias in vivo incluyen, aunque no se limitan a ellos, daunorubicina, doxorubicina, metotrexato, y Mitomicina C. Los fármacos citotóxicos interfieren con procesos celulares críticos que incluyen la síntesis de ADN, ARN y proteínas. Para una exposición más completa de estas clases de fármacos que son conocidos en la técnica, y los mecanismos de acción de los mismos, véase Goodman, A.G., et al., Goodman y Gilman's THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS, 7th Ed., Macmillan Publishing Co., 1985.

Los anticuerpos quiméricos de esta invención se pueden utilizar ventajosamente en combinación con otros anticuerpos, fragmentos y regiones quiméricos o monoclonales y murinos o con linfocinas o factores del crecimiento hemopoyético, etc., que sirven para aumentar el número o la actividad de las células efectoras que interactúan con los anticuerpos.

Los anticuerpos quiméricos, o derivados de esta invención también se pueden usar en combinación con la terapia TNF para bloquear los efectos secundarios indeseados del TNF. Enfoques recientes de la terapia oncológica han incluido la administración directa del TNF a pacientes oncológicos o la inmunoterapia de pacientes oncológicos con células destructoras activadas con linfocina (LAK) (Rosenberg et al., Rew Eng. J. Med. 313: 1485-1492 (1985)) o linfocitos de infiltración tumoral (TIL) (Kurnick et al. (Clin. Immunol.Immunopath. 38: 367-380 (1986); Kradin et al. , Cancer Immunol. Immunother. 24: 76-85 (1987); Kradin et al., Transplant. Proc. 20: 336-338 (1988)). Los ensayos se realizan normalmente usando células LAK o TIL modificadas que se han transfectado con el gen del TNF para producir grandes cantidades de TNF. Dichos enfoques terapéuticos probablemente están asociados a una serie de efectos secundarios indeseados debidos a las acciones pleótropas del TNF que se han descrito anteriormente. De acuerdo con la presente invención, estos efectos secundarios se pueden reducir mediante tratamiento concurrente de un sujeto que recibe TNF o células que producen grandes cantidades de TIL, con los anticuerpos de la presente invención. Las dosis eficaces son las descritas anteriormente. El nivel de la dosis requerirá un ajuste de acuerdo con la dosis de TNF o de las células que producen TNF, administrada, a fin de bloquear los efectos secundarios sin bloquear el efecto antitumoral principal del TNF. Un especialista habitual de la técnica sabrá cómo determinar dichas dosis sin experimentaciones innecesarias.

Los anticuerpos quiméricos, de esta invención, unidos a un soporte sólido, se pueden usar para eliminar el TNF de extractos de líquidos, tejidos o células. En una realización preferida, se usan para eliminar el TNF de productos de la sangre o del plasma sanguíneo. En otra realización preferida, los anticuerpos quiméricos, se usan ventajosamente en dispositivos inmunoadsorbentes extracorpóreos, que son conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Seminars in Hematology, Vol. 26 (2 Suppl. 1) (1989)). La sangre de un paciente u otro líquido corporal se expone al anticuerpo unido, dando como resultado una retirada parcial o total del TNF de la circulación (libre o en inmunocomplejos), y después se devuelve el líquido al cuerpo. Esta inmunoadsorción se pueden implementar en una disposición de flujo continuo, con o sin intercalamiento de una etapa de centrifugación de las células. Véase, por ejemplo, Terman, D.S. et al., J. Immunol. 117: 1971-1975 (1976).

La presente invención proporciona asimismo los anteriores anticuerpos quiméricos marcados con radioisótopos para su detección, tal como se describe más adelante, para usar en procedimientos de diagnóstico destinados a detectar el TNF\alpha en pacientes de los que se sabe o se sospecha que tienen un trastorno mediado por el TNF\alpha.

Los anticuerpos quiméricos de la presente invención son útiles en inmunoensayos que detectan o cuantifican el TNF, o los anticuerpos anti-TNF, en una muestra. Un inmunoensayo para el TNF comprende típicamente incubar una muestra biológica en presencia de un anticuerpo de elevada afinidad radiomarcado para su detección de la presente invención capaz de unirse selectivamente al TNF, y detectar el anticuerpo radiomarcado que se une en una muestra. Se describen diversos procedimientos de inmunoensayo clínicos en Immunoassays for the 80's, A. Voller et al., eds., University Park, 1981.

Así pues, en este aspecto de la invención, se puede añadir el anticuerpo o una muestra biológica a nitrocelulosa, u otro soporte sólido que es capaz de inmovilizar células, partículas celulares o proteínas solubles. El soporte se puede lavar después con tampones adecuados seguido del tratamiento con el anticuerpo específico anti-TNF radiomarcado para su detección. El soporte de fase sólida se puede lavar después con el tampón por segunda vez a fin de eliminar el anticuerpo no unido. La cantidad de marcador unido sobre dicho soporte sólido se puede detectar entonces por medios convencionales.

El término "soporte de fase sólida" o "portador" se refiere a cualquier soporte capaz de unirse al antígeno o a anticuerpos. Soportes o portadores bien conocidos incluyen vidrio, poliestireno, polipropileno, polietileno, dextrano, nailon, amilasas, celulosas naturales y modificadas, poliacrilamidas, agarosas, y magnetita. La naturaleza del portador puede ser soluble en cierto grado o insoluble para los fines de la presente invención. El soporte material puede tener prácticamente cualquier configuración estructural posible siempre que la molécula acoplada sea capaz de unirse al TNF o a un anticuerpo anti-TNF. Así pues, la configuración del soporte puede ser esférica, como la de una perla, o cilíndrica, como la de la superficie interior de un tubo de ensayo, o la superficie exterior de una varilla. Como alternativa, la superficie puede ser plana tal como una lámina, una tira de ensayo, etc. Los soportes preferidos incluyen perlas de poliestireno. Los especialistas en la técnica conocerán muchos otros portadores adecuados para fijar el anticuerpo o el antígeno, o bien serán capaces de determinar los mismos mediante la experimentación convencional.

La actividad de unión de un lote dado de anticuerpos anti-TNF se puede determinar de acuerdo con procedimientos bien conocidos. Los especialistas en la técnica serán capaces de determinar las condiciones de ensayo óptimas y operativas para cada determinación mediante la experimentación convencional.

Uno de los modos en que se puede marcar con radioisótopos el anticuerpo anti-TNF específico para su detección es uniendo el mismo a una enzima y usándolo en un enzimoinmunoensayo (EIA) o en un enzimoensayo inmunosorbente (ELISA). Esta enzima, cuando se expone posteriormente a su sustrato, reaccionará con el sustrato generando un resto químico que se puede detectar, por ejemplo, mediante espectrofotometría, fluorometría o por medios visuales. Las enzimas que se pueden usar para marcar de forma detectable los anticuerpos quiméricos anti-TNF específicos de la presente invención incluyen, aunque no se limitan a ellas, la malato deshidrogenasa, la estafilococo nucleasa, la delta-5-esteroide isomerasa, la alcohol deshidrogenasa de levaduras, la alfa-glicerofosfato deshidrogenasa, la triosa fosfato isomerasa, la peroxidasa de rábano silvestre, la alcalino fosfatasa, la asparaginasa, la glucosa oxidasa, la beta-galactosidasa, la ribonucleasa, la ureasa, la catalasa, la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, la glucoamilasa y la acetilcolinesterasa.

Mediante marcado radiactivo de los anticuerpos anti-TNF específicos es posible detectar el TNF con un radioinmunoensayo (RIA) (véase, por ejemplo, Work, T.S., et al., Laboratory Techniques and Biochemistry in Molecular Biology, North Holland Publishing Company, N.Y. (1978). El isótopo radiactivo se puede detectar mediante medios tales como el uso de un contador gamma o un contador de centelleo o mediante autorradiografía. Isótopos que son particularmente útiles para los fines de la presente invención son: ^{3}H, ^{125}I, ^{131}I, ^{35}S, ^{14}C, y, preferiblemente, ^{125}I.

También es posible marcar los anticuerpos anti-TNF específicos con un compuesto fluorescente. Cuando el anticuerpo marcado con un compuesto fluorescente se expone a una luz con la longitud de onda adecuada, se puede detectar su presencia por la fluorescencia. Entre los compuestos fluorescentes de marcado más comúnmente usados están el isotiocinato de fluoresceína, la rodamina, la ficoeritrina, la ficocianina, la aloficocianina, el Q-ftaldehído y la fluorescamina.

Los anticuerpos anti-TNF específicos se pueden marcar también con radioisótopos para su detección usando metales que producen fluorescencia tal como el ^{152}Eu, u otros de la serie de los lantánidos. Estos metales se pueden unir al anticuerpo anti-TNF específico usando grupos quelantes de dicho metal tales como el ácido dietilentriaminopentacético (DTPA) o el ácido etilendiaminotetracético (EDTA).

Asimismo, los anticuerpos anti-TNF específicos se pueden marcar con radioisótopos para su detección mediante acoplamiento a un compuesto quimioluminiscente. La presencia del anticuerpo marcado con un compuesto quimioluminiscente con el radioisótopo se determina entonces detectando la presencia de luminiscencia que aumenta a lo largo de una reacción química. Ejemplos de compuestos de marcado quimioluminiscente particularmente útiles son el luminol, el isoluminol, los ésteres de acridinio terómico, el imidazol, las sales de acridinio y los ésteres oxalato.

Análogamente, se puede usar un compuesto bioluminiscente para marcar el anticuerpo, o derivado anti-TNF específico de la presente invención. La bioluminiscencia es un tipo de quimioluminiscencia encontrado en sistemas biológicos en los que una proteína catalítica aumenta la eficacia de la reacción quimioluminiscente. La presencia de una proteína bioluminiscente se determina detectando la presencia de luminiscencia. Compuestos bioluminiscentes importantes con fines de marcado son la luciferina, la luciferasa y la ecuorina.

La detección del anticuerpo anti-TNF específico se puede llevar a cabo mediante un contador de centelleo, por ejemplo, si el marcador detectable es un emisor de rayos gamma, o mediante un fluorímetro, por ejemplo, si el marcador es un material fluorescente. En el caso de un marcador enzimático, la detección se puede efectuar mediante procedimientos colorimétricos que emplean un sustrato para la enzima. La detección también se puede llevar a cabo mediante comparación visual del grado de reacción enzimática de un sustrato en comparación con estándares preparados de modo similar.

Para los fines de la presente invención usando anticuerpos quiméricos, el TNF que se detecta mediante los anteriores ensayos puede estar presente en una muestra biológica. Se puede usar cualquier muestra que contenga TNF. Preferiblemente, la muestra es un líquido biológico tal como, por ejemplo, sangre, suero, linfa, orina, exudado inflamatorio, líquido cefalorraquídeo, líquido amniótico, un extracto de tejido o un homogenato, y similares. Sin embargo, la invención no se limita a ensayos que usan sólo estas muestras, siendo posible para un especialista habitual de la técnica determinar las condiciones adecuadas que permiten el uso de otras muestras.

La detección in situ se puede llevar a cabo extrayendo una muestra histológica de un paciente, y proporcionando la combinación de anticuerpos marcados con radioisótopos de la presente invención a dicha muestra. El anticuerpo se proporciona preferiblemente aplicando, o cubriendo con él, el anticuerpo radiomarcado a una muestra biológica. Mediante el uso de dicho procedimiento, es posible determinar no sólo la presencia del TNF sino también la distribución del TNF en el tejido examinado. Usando la presente invención, los especialistas habituales comprenderán que se puede modificar cualquiera de la amplia variedad de procedimientos histológicos (tales como los procedimientos de tinción) a fin de conseguir dicha detección in situ.

El anticuerpo quimérico o derivado de la presente invención se puede adaptar para su utilización en un ensayo inmunométrico, también conocido como ensayo de "dos sitios" o "sandwich". En un ensayo inmunométrico típico, una cantidad de un anticuerpo radiomarcado, se une a un soporte sólido que es insoluble en el líquido que se está ensayando y se añade una cantidad de anticuerpo soluble radiomarcado para su detección para permitir la detección o la cuantificación del complejo ternario formado entre el anticuerpo en fase sólida, el antígeno, y un anticuerpo radiomarcado.

Típica y preferentemente, los ensayos inmunométricos incluyen ensayos "hacia adelante" en los que el anticuerpo unido a la fase sólida en primer lugar se pone en contacto con la muestra que se está ensayando para extraer el TNF de la muestra mediante la formación de un complejo binario fase sólida/anticuerpo-TNF. Después de un periodo de incubación adecuado, se lava el soporte sólido para eliminar el residuo de la muestra líquida, que incluye el TNF que no ha reaccionado, si queda, y después se pone en contacto con la disolución que contiene una cantidad conocida de un anticuerpo radiomarcado (con funciones como "molécula informadora"). Después de un segundo periodo de incubación para permitir que el anticuerpo radiomarcado forme un complejo con el TNF unido al soporte sólido mediante el anticuerpo no radiomarcado, se lava el soporte sólido por segunda vez para eliminar el anticuerpo radiomarcado que no ha reaccionado. Este tipo de ensayo "sandwich" hacia adelante puede ser un simple ensayo de "sí o no" para determinar si el TNF está presente, o puede ser cuantitativo si se compara la medición de un anticuerpo radiomarcado con la obtenida para una muestra estándar que contienen una cantidad conocida de TNF. Dichos ensayos de "dos sitios" o "sandwich" se describen en Wide (Radioimmune Assay Method, Kirkham, ed., E. & S. Livingstone, Edinburgh, 1970, págs. 199-206).

Otro tipo de ensayos "sandwich", que también pueden ser útiles con el TNF, son los denominados ensayos "simultáneos" y ensayos "inversos". Un ensayo simultáneo implica una sola etapa de incubación en la que el anticuerpo unido al soporte sólido y el anticuerpo radiomarcado se añaden ambos a la muestra que se está ensayando al mismo tiempo. Una vez que se ha completado la incubación, se lava el soporte sólido para eliminar el residuo de la muestra líquida y el anticuerpo radiomarcado sin complejar. La presencia de un anticuerpo radiomarcado asociado al soporte sólido se determina entonces como si fuera un ensayo "sandwich" hacia adelante convencional.

En el ensayo "inverso", se utiliza en primer lugar la adición en etapas de una disolución de un anticuerpo radiomarcado a la muestra líquida seguido de la adición de un anticuerpo no radiomarcado unido a un soporte sólido después de un periodo de incubación adecuado. Después de una segunda incubación, la fase sólida se lava de modo convencional para liberarlo del residuo de la muestra que se está ensayando y la disolución del anticuerpo radiomarcado que no ha reaccionado. La determinación de un anticuerpo radiomarcado asociado a un soporte sólido se realiza entonces como en los ensayos "simultáneos" y "hacia adelante". En una realización, se puede usar una combinación de anticuerpos de la presente invención específicos para epítopos separados a fin de construir un ensayo inmunorradiométrico sensible a tres sitios.

Habiendo descrito ahora de modo general la invención, la misma se comprenderá mejor haciendo referencia a determinados ejemplos específicos que se incluyen en el presente documento tan sólo con fines ilustrativos y no se pretende que sean limitantes, a menos que se especifique otra cosa.

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Ejemplo I

(Referencial)

Producción de un mAb de ratón anti-TNF humano

Para facilitar el estudio clínico del mAb anti-TNF se preparó un potente mAb de IgG1 de ratón de elevada afinidad que inhibía o neutralizaba el TNF humano, denominado A2. Se obtuvieron ratones BALB/c hembra, de 10 semanas de edad, de Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Se inyectaron subcutánea e intraperitonealmente (i.p.) a un ratón 40 \mug de TNF humano recombinante purificado derivado de E. coli (rhTNF) emulsionado con un volumen igual de adyuvante de Freund completo (obtenido en Difco Laboratories) en 0,4 ml. Una semana más tarde, se administró i.p. una inyección de 5 \mug de rhTNF en adyuvante de Freund incompleto seguida de cuatro inyecciones i.p. consecutivas de 10 \mug de TNF sin adyuvante. Ocho semanas después de la última inyección, al ratón se le administró i.p. una dosis de refuerzo de 10 \mug de TNF.

Cuatro días más tarde, se sacrificó el ratón, se extrajo el bazo y se preparó una suspensión de células de bazo. Las células de bazo se fusionaron con células de hibridoma no segregante, Sp2/0 (ATCC CRL1581), en una relación 4:1 entre las células de bazo y las células SP2/0, en presencia de 0,3 ml de polietilenglicol al 30%, PEG 1450. Después de la incubación a 37ºC durante 6 horas, las células fusionadas se distribuyeron en partes alícuotas de 0,2 ml en placas de 96 pocillos con concentraciones de 2 x 10^{4} células SP2/0 por pocillo. Se añadieron a cada pocillo células condicionadoras, en forma de 5 x 10^{4} células de bazo normales BALB/c.

El medio de crecimiento usado consistía en medio RPMI-1640, suero fetal bovino (FBS) al 10% inactivado por el calor (Hyclone), aminoácidos no esenciales MEM 0,1 mM, piruvato sódico 1 mM, L-glutamina 2 mM, penicilina 100 U/ml, estreptomicina 100 \mug/ml (GIBCO Laboratories) y, para la selección, hipoxantina-aminopterina-timidina (HAT) (Boehringer Mannheim).

Se empleó un radioinmunoensayo (RIA) en fase sólida para rastrear los sobrenadantes a fin de determinar la presencia de los mAb específicos para el rhTNF\alpha. Este ensayo se describe en el Ejemplo II, a continuación. La unión de fondo en este ensayo fue de aproximadamente 500 cpm. Se consideró positivo un sobrenadante si proporcionaba una unión de 2000 cpm o más; de 322 sobrenadantes rastreados, 25 fueron positivos mediante RIA. De estos 25, el de la unión mayor (4800 cpm) se denominó A2. Los pocillos positivos se subclonaron a dilución limitante en células condicionadoras de ratón, según un análisis posterior de los sobrenadantes en ensayos de neutralización, se encontró que el A2 era el único clon positivo que mostraba una potente actividad inhibidora o neutralizante. Así pues, se seleccionó la línea de hibridoma A2. Esta línea se conservó en medio RPMI-1640 con FBS al 10% (GIBCO), aminoácidos no esenciales 0,1 mM, piruvato sódico 1 mM, L-glutamina 2 mM, penicilina 100 U/ml y estreptomicina 100 \mug/ml.

Como alternativa, se pueden rastrear anticuerpos anti-TNF que inhiben la actividad biológica del TNF mediante unión a un péptido que incluye, al menos, 5 aminoácidos de los residuos 87-108 o de ambos intervalos de residuos 59-80 y 87-108 del TNF (de la SEC ID NO:1) o combinaciones de péptidos contenidos en ellos, que se usan en lugar de la proteína rTNF, tal como se ha descrito anteriormente.

Ejemplo II

(Referencial)

Caracterización de un anticuerpo anti-TNF de la presente invención A. Radioimmunoensayos

Se diluyó rhTNF derivado de E. coli se diluyó a 1 \mug/ml en tampón BCB, pH 9,6, y se añadieron 0,1 ml de la disolución a cada pocillo de ensayo. Después de la incubación a 4ºC durante una noche, los pocillos se lavaron brevemente con BCB, y después se sellaron con seroalbúmina bovina al 1% (BSA) en BCB a 37ºC durante 1 h. A continuación, los pocillos se lavaron 3 veces con PBS que contenía Tween-20 al 0,05% (PBS-Tween), y se añadieron 70 \mul del líquido ascítico A2 diluido a cada pocillo. Los pocillos se incubaron durante 2 h a 37ºC, y se lavaron 3 veces con PBS-Tween. Después, se añadió a cada pocillo aproximadamente 50.000 cpm de un fragmento F(ab')_{2} marcado con ^{125}I de anticuerpos de Ig de oveja anti-ratón en 50 \mul de PBS-Tween que contenían BSA al 1%, y los pocillos se incubaron durante 2 h más a 37ºC. Los pocillos se lavaron 4 veces con PBS-Tween, se retiraron y se contaron individualmente. Los resultados de las dos determinaciones se muestran en la Figura 1.

Se calentó mTNF a 5 \mug/ml en PBS a 60ºC. En distintos momentos a lo largo del ensayo, se enfriaron rápidamente a 4ºC partes alícuotas de la preparación de TNH tratada térmicamente, se diluyeron 5 veces en BCB, y se usaron para recubrir los pocillos de las microplacas RIA. El RIA se realizó exactamente tal como se ha descrito anteriormente. Los resultados de las dos determinaciones se muestran en la Figura 2. Ya que la incubación a 60ºC reducía notablemente la actividad biológica del hTNF\alpha, este experimento muestra cómo el mAb A2 no lograba unirse al TNF\alpha humano inactivado por el calor.

B. Ensayos de Neutralización

Se purificaron muestras de A2 y cA2 mediante cromatografía de afinidad por la proteína A a partir de los sobrenadantes del cultivo de tejidos de hibridoma de las estirpes celulares denominadas C134A y C168A (descritas anteriormente), respectivamente, y se dializaron en disolución salina tamponada con fosfato de pH 7,2 (PBS).

El efecto tóxico del TNF sobre determinadas estirpes celulares tumorales se ha adaptado como una medida in vitro de los niveles de TNF en muestras de laboratorio y líquidos biológicos. Se usó el procedimiento de ensayo de Feinman et al., J Immunol 138: 635-640 (1987), tal como lo modificaron Aderka et al., J. Immunol. 143: 3517-3523 (1989), empleando la célula diana sensible al TNF A673 (una estirpe celular del rabdomiosarcoma humano), para investigar la capacidad del A2 para inhibir o neutralizar la toxicidad del TNF.

Se incubaron células A673/6 humanas cultivadas con 40 pg/ml de TNF\alpha humano natural (Genzima, Boston, MA) o recombinante (Suntory, Osaka, Japón) variando las concentraciones del mAb A2 en presencia de 20 \mug/ml de cicloheximida a 39ºC durante una noche. Los controles incluían en cada pocillo sólo medio o medio + TNF. La muerte celular se midió mediante tinción con negro azulado de naftol, y los resultados se leyeron espectrofotométricamente a 630 nm.

La absorbancia a esta longitud de onda estaba relacionada con el número de células vivas presentes.

Se encontró que el A2 inhibía o neutralizaba el efecto citotóxico del hTNF natural y del rhTNF de un modo que dependía de la dosis (Figura 3).

En otros experimentos, se ensayó la especificidad de esta potente actividad inhibidora o neutralizante. Se sembraron células A673/6 a 3 x 10^{4} células/pocillo 20 h antes del bioensayo del TNF. Se prepararon diluciones en serie a la mitad de rhTNF, linfotoxina humana recombinante derivada de E. coli (TNF\beta), y TNF murino recombinante derivado de E. coli. El sobrenadante de hibridomas A2 se añadió a un volumen igual de las preparaciones de TNF diluidas, y las mezclas se incubaron a temperatura ambiente durante 30 min. Se transfirieron partes alícuotas de 0,1 ml a los pocillos que contenían células A673/6, se añadieron 20 \mug/ml de cicloheximida, y las células se incubaron a 39ºC durante una noche. Después, las células se fijaron y se tiñeron para evaluar la citotoxicidad. Los resultados indican que el mAb A2 inhibía o neutralizaba específicamente la citotoxicidad del rhTNF\alpha, mientras que no producía ningún efecto sobre la linfotoxina humana (TNF\beta) (Figura 4) o el TNF murino (Figura 5).

A continuación, se realizaron experimentos para analizar la reactividad cruzada del mAb A2 con el TNF procedente de primates no humanos.

Se aislaron monocitos de la sangre de B514 (mandriles), J91 (macacos de Java) y RH383 (macacos de la India) mediante centrifugación en gradiente Ficoll y adherencia, se incubaron a 1 x 10^{5} células/pocillo en medio RPMI-1640 con FBS al 5% y 2 \mug/ml de LPS de E. coli durante 3 ó 16 h a 37ºC para inducir la producción de TNF. Se reunieron los sobrenadantes de los pocillos duplicados y se almacenaron a 4ºC durante menos de 20 h hasta que se llevó a cabo el bioensayo del TNF, tal como se ha descrito anteriormente, usando células A673/6. Se mezclaron diluciones a la mitad de los sobrenadantes del cultivo con medio o con mAb A2 purificado a una concentración final de 1 \mug/ml, se incubaron a temperatura ambiente durante 30 min y se transfirieron partes alícuotas a las células indicadoras. Los resultados mostraron que el mAb A2 no lograba inhibir o neutralizar significativamente la actividad citotóxica del TNF producido por los monocitos de mandriles, macacos de Java y macacos de la India.

Se realizó un experimento adicional con TNF de chimpancé. Se aislaron monocitos de sangre de CH563 (chimpancé) y se incubaron tal como se ha descrito anteriormente para generar sobrenadantes que contuvieran TNF. La capacidad de 10 \mug/ml de mAb A2 para inhibir o neutralizar la bioactividad de estos sobrenadantes se ensayó como antes. El TNF humano se usó como control positivo. Los resultados, mostrados en la Figura 6, indican que el mAb A2 tenía una potente actividad inhibidora o neutralizante del TNF de chimpancé, similar a la ejercida sobre el TNF humano (Figura 7).

Se comparó la actividad inhibidora y/o neutralizante del mAb A2 con otros tres mAb murinos específicos para el TNF humano, designados como TNF-1, TNF-2 y TNF-3, y un control mAb. Se mezclaron diluciones en serie a la mitad de mAb purificados con rhTNF (40 pg/ml), se incubaron a temperatura ambiente durante 30 min, y se ensayaron partes alícuotas como antes para determinar la bioactividad del TNF. Se encontró que los mAb TNF-1, TNF-2 y TNF-3 tenían cada uno un similar grado moderado de la potente actividad inhibidora o neutralizante. Por el contrario, el mAb A2 tenía una actividad inhibidora o neutralizante mucho más potente.

Ejemplo III Estrategia general para la clonación de genes de anticuerpos V y H

La estrategia para la clonación de los genes de las regiones V de cadenas L y H del hibridoma A2, que segrega el anticuerpo anti-TNF descrito anteriormente, se basaba en la unión en el genoma entre la región V y la correspondiente región de unión (J) para genes de Ig funcionalmente reordenados (y expresados). Se pueden usar sondas de ADN de la región J para rastrear las genotecas a fin de aislar el ADN unido a las regiones J. Si bien el ADN en la configuración de la estirpe germinal (es decir, no reordenada) podría hibridarse también con sondas J, este ADN no podría unirse a una secuencia de la región V de la Ig y se podría identificar mediante análisis con enzimas de restricción de los clones aislados.

La clonación utilizada en el presente documento fue para aislar regiones V de los genes de cadenas L y H reordenadas usando sondas J_{H} y J_{K}. Estos clones se ensayaron para determinar si sus secuencias se expresaban en el hibridoma A2 mediante análisis Northern. Los clones que contenían la secuencia expresada se clonaron en vectores de expresión que contenían regiones C humanas y se transfectaron en células de mieloma de ratón para determinar si se producía el anticuerpo. El anticuerpo procedente de las células productoras se ensayó después para determinar la especificidad de la unión y la funcionalidad comparadas con las del anticuerpo A2 murino.

Ejemplo IV Construcción de una genoteca de la cadena L

A fin de aislar el gen de la región V de cadena L del hibridoma A2, se construyó una genoteca de selección por el tamaño usando el vector fago lambda Charon 27. el ADN de elevado peso molecular se aisló a partir de las células de hibridoma A2 y se digirió por completo con la endonucleasa de restricción HindIII. El ADN se fraccionó después sobre un gel de agarosa al 0,8% y se aislaron fragmentos de ADN con tamaños en tres intervalos diferentes de aproximadamente 3 kb, 4 kb y 6 kb del gel mediante electroelución. El intervalo de tamaños para la construcción de la genoteca se seleccionó en función del tamaño de los fragmentos HindIII que se hibridaban sobre una banda de Southern con la sonda J_{K}. Después de la extracción con una mezcla de fenol y cloroformo y la precipitación con etanol, los fragmentos de ADN de cada clase de tamaño se ligaron a brazos del lambda Charon 27 y se compactaron en partículas fago in vitro usando un dispositivo Gigapack Gold de Stratagene (LaJolla, CA).

Estas genotecas se rastrearon directamente a una densidad de aproximadamente 20.000 placas por placa de Petri de 150 mm usando una sonda J_{K} marcada con ^{32}P. La sonda J_{K} de la cadena L de ratón era un fragmento HindIII de 2,7 kb que contenía los cinco segmentos J_{K}. La sonda se marcó con ^{32}P mediante cebado aleatorio usando un equipo obtenido en Boehringer Mannheim. Los nucleótidos libres se retiraron mediante centrifugación a través de una columna Sephadex G-50. La actividad específica de la sonda fue de aproximadamente 109 cpm/\mug.

Las hibridaciones en placa se llevaron a cabo en 5 x SSC, formamida al 50%, 2 x reactivo de Denhardt, y 200 \mug/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado a 42ºC durante 18-20 horas. Los lavados finales se realizaron en 0,5 x SSC, SDS al 0,1% a 65ºC. Los clones positivos se identificaron después de una autorradiografía.

Ejemplo V Construcción de una genoteca de la cadena H

A fin de aislar el gen de la región V para la cadena H del A2, se construyó una genoteca en el sistema vector lambda gt10. El ADN de elevado peso molecular se digirió por completo con la endonucleasa de restricción EcoRI y se aislaron fragmentos de aproximadamente 7,5 kb después de una electroforésis sobre gel de agarosa. Estos fragmentos se ligaron a brazos del lambda gt10 y se compactaron en partículas fago in vitro usando el dispositivo Gigapack Gold.

Esta genoteca se rastreó a una densidad de 20.000 placas por placa de 150 mm usando una sonda J_{H}. La sonda J_{H} era un fragmento BamHI/EcoRI de 2 kb que contenía segmentos J3 y segmentos J4.

La sonda se marcó como en el Ejemplo III y tenía una radiactividad específica similar. Las condiciones de hibridación y de lavado eran idénticas a las usadas en el Ejemplo III.

Ejemplo VI Clonación de regiones del gen V específico para el TNF

Se aislaron diversos clones positivos de las genotecas de las cadenas H y L después de rastrear aproximadamente 106 placas de cada genoteca usando las sondas J_{H} y J_{K}, respectivamente. Después de la purificación de la placa, se aisló el ADN de bacteriófagos para cada clon positivo, se digirió con EcoRI (clones de la cadena H) o con HindIII (clones de la cadena L) y se fraccionó sobre gel de agarosa al 1%. El ADN se transfirió a nitrocelulosa y las bandas se hibridaron con la sonda J_{H} o la sonda J_{K}.

Se obtuvieron diversos clones de la cadena H que contenían fragmentos de ADN EcoRI de 7,5 kb que se hibridaban a la sonda J_{H}. Para las genotecas de la cadena ligera, se aislaron diversos clones de cada una de las tres genotecas de selección por el tamaño que contenían fragmentos HindIII que se hibridaban a la sonda J_{K}. Para la cadena L, diversos fragmentos HindIII de 2,9 kb obtenidos de modo independiente de la genoteca de 2 kb se hibridaban con un ARNm de 1250 pb del A2, pero no con el ARNm de SP2/0 (véase el Ejemplo VII). Por otro lado, diversos fragmentos HindIII procedentes de la genoteca de 4 kb se hibridaban tanto con el ARNm del A2 como con el ARNm copartícipe de la fusión. Un fragmento de 5,7 kb HindIII de la genoteca de 6 kb no se hibridó a ninguno de los ARN.

Las longitudes observadas del ARNm de A2 hibridado eran los tamaños correctos para el ARNm de la cadena H y de la cadena L, respectivamente. Ya que la expresión del ARN era restringida para el hibridoma A2, se supuso que los fragmentos de cadena H de 7,5 kb y los fragmentos de cadena L de 2,9 kb contenían las secuencias de la región V correctas del A2. Se seleccionó un ejemplo de cada tipo para un estudio posterior. El ensayo de la funcionalidad principal es la demostración de que estas secuencias de las regiones V, cuando se combinan con las secuencias de la región C adecuadas, son capaces de dirigir la síntesis de un anticuerpo con una especificidad y una afinidad similar a la del anticuerpo A2 murino.

El fragmento de cadena H de 7,5 kb y el fragmento de cadena L de 2,9 kb se subclonaron en los vectores plásmido que permitían la expresión de las proteínas quiméricas humano-murinas en células de mieloma murinas (véanse los Ejemplos VIII y IX). Estos plásmidos se transfectaron conjuntamente en las células SP2/0 para determinar si se segregaban las moléculas del anticuerpo íntegro, y si era así, si tenían la especificidad y la afinidad correctas. Se realizaron también transfecciones de control emparejando la supuesta cadena H anti-TNF con una cadena L irrevelante pero expresada; la supuesta cadena L anti-TNF también se emparejó con una cadena H irrevelante pero expresada. Los resultados indicaron que el fragmento de cadena H de 7,5 kb se podría expresar, mientras que el fragmento de cadena L de 2,9 kb no. Esto se confirmó mediante un análisis de la secuencia del ADN, que sugería que porciones de la región de codificación no se encontraban en el adecuado marco de lectura de aminoácidos cuando se comparaban con otras secuencias de aminoácidos conocidas de la cadena L.

Ya que el fragmento HindIII de 2,9 kb parecía no contener un gen V funcional, los fragmentos de 4,0 kb y 5,7 kb HindIII, aislados a partir de genotecas de cadenas L, se clonaron en los vectores de expresión y se ensayaron para la expresión del anticuerpo quimérico después de la transfección conjunta con la cadena H de 7,5 kb. El fragmento HindIII de 5,7 kb fue incapaz de confirmar la expresión del anticuerpo, mientras que el fragmento HindIII de 4,0 kb sí confirmó la expresión del anticuerpo. El anticuerpo como resultado de la transfección conjunta de la supuesta región V de cadena H de 7,5 kb y la región V de cadena L de 4,0 kb se purificó, se ensayó en un ensayo de unión al TNF en fase sólida, y se encontró que era inactivo. Se llegó a la conclusión de que la región V contenida en el fragmento HindIII de 4,0 kb no era la región V anti-TNF correcta, aunque sí era aportado al hibridoma por parte del copartícipe de la fusión. Esto se confirmó posteriormente mediante un análisis de la secuencia del ADNc procedente del hibridoma A2 y procedente del copartícipe de la fusión.

Se caracterizaron con más detalle otros clones obtenidos de modo independiente de la cadena L que contenían fragmentos HindIII de 2,9 kb que se hibridaban con ARNm de A2. Si bien los mapas de restricción eran similares, los clones se dividieron en dos clases con respecto a la presencia o ausencia del sitio de la enzima AccI. El fragmento de 2,9 kb original (no funcional) (denominado clon 8.3) era un sitio AccI perdido presente en algunos otros clones (representados por el clon 4.3). La secuencia de ADN del clon 4.3 fue muy similar a la del clon 8.3, pero contenía un marco de lectura de aminoácidos sencillo con una gran homología respecto a cadenas L conocidas, a diferencia del clon 8.3. El fragmento HindIII de 2,9 kb del clon 4.3 se subclonó en el vector de expresión de la cadena L y se transfectó conjuntamente con la supuesta cadena H anti-TNF en células SP2/0. Se sintetizó un anticuerpo que se purificó y se ensayó mediante un ensayo de unión al TNF en fase sólida. Este anticuerpo se unió al TNF, y por tanto, se supuso que la región V de cadena L del clon 4.3 sería la correcta.

Se demostró que el hibridoma murino A2 contenía, al menos, cuatro genes de la región de cadena L reordenada. Al menos dos de estos se expresan como las proteínas: clon 4.3 (el gen de la cadena L anti-TNF correcto) y el gen contenido en el fragmento HindIII de 4,0 kb (aportado por el copartícipe de la fusión). La expresión de dos cadenas L implica que el anticuerpo segregado resultante del hibridoma murino es en realidad una mezcla de anticuerpos, unos que usan la cadena L correcta, unos que usan la cadena L incorrecta, y unos que usan una de cada. Se ha confirmado la presencia de dos cadenas L diferentes en el anticuerpo A2 murino mediante análisis sobre gel de SDS y de la secuencia proteínica N-terminal del anticuerpo purificado. Ya que la construcción de los anticuerpos A2 quiméricos implica la clonación de los genes individuales de las cadenas L y H y la expresión de los mismos en una estirpe celular no productora, el anticuerpo resultante sólo tendrá la cadena L correcta y por tanto debería ser un anticuerpo más potente (véanse los Ejemplos X, XI y XII).

Ejemplo VII Análisis Northern del ADN clonado

Cabría esperar que el ADN clonado correspondiente a las regiones V de cadenas L y H auténticas del hibridoma A2 se hibridara con el ARNm del A2. Los reordenamientos del ADN no funcional en los sitios génicos de la cadena H o la cadena L no se deberían expresar.

Se sometieron a electroforésis 10 \mug del ARN celular total sobre geles de formaldehído/agarosa al 1% (Sambrook et al., supra) y se transfirieron a nitrocelulosa. Las bandas se hibridaron con sondas de ADN cebadas aleatoriamente en formamida al 50%, 2 x disolución de Denhardt, 5 x SSC, y 200 \mug/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado a 42ºC durante 10 horas. Las condiciones del lavado final fueron 0,5 x SSC, SDS al 0,1% a 65ºC.

Los fragmentos de ADN subclonados se marcaron con ^{32}P mediante cebado aleatorio y se hibridaron con bandas Northern que contenían el ARN total procedente de células A2 o de células de SP2/0, el progenitor del copartícipe de la fusión de A2. El fragmento de cadena H EcoRI de 7,5 kb se hibridó con un ARNm de 2 kb de A2, pero no con el ARNm de SP2/0. Análogamente, el fragmento de cadena L HindIII de 2,9 kb (clon 4.3) se hibridó con un ARNm de 1250 pb de A2, pero no con el ARNm de SP2/0. Las longitudes observadas del ARNm de A2 hibridado eran los tamaños correctos para el ARNm de la cadena H y de la cadena L, respectivamente, confirmando así que las secuencias de la región V sobre estos fragmentos de ADN se expresaban en células del hibridoma A2.

Ejemplo VIII Construcción de vectores de expresión

Los supuestos genes V de cadenas L (clon 4.3) y H que se han descrito anteriormente se ligaron a genes de la región constante kappa y gamma1 humana en vectores de expresión. El fragmento EcoRI de 7,5 kb correspondiente al supuesto gen la región V_{H} de A2 se clonó en un vector de expresión que contenía el gen C_{gamma-1} humano y el gen Ecogpt para proporcionar el plásmido denominado pA2HG1apgpt (véase la Figura 8).

El supuesto fragmento V_{L} de 2,9 kb del clon 4.3 se clonó en un vector que contenía el gen kappa C_{k} humano y el gen Ecogpt para permitir la selección en células de mamíferos. El plásmido resultante se denominó pA2HuKapgpt (véase la Figura 8).

Ejemplo IX Expresión de genes de anticuerpos quiméricos

Para expresar los genes de las cadenas H y L quiméricas, se transfectaron plásmidos de expresión en células de la estirpe celular de mieloma de ratón no productora, SP2/0. El ADN del plásmido que se iba a transfectar se purificó mediante centrifugación hasta el equilibrio en gradientes de bromuro de etidio/cloruro de cesio dos veces. El ADN del plásmido (10-50 \mug) se añadió a 10^{7} células SP2/0 en un medio que contenía sales de Hank, y la mezcla se dispuso en un aparato de electroformación de poros BioRad. La electroformación de poros se produjo a 20 voltios, y después las células se sembraron en placas de microtitulación de 96 pocillos.

Después de 24 horas, se aplicó la selección con ácido micofenólico y se identificaron las colonias resistentes al fármaco después de 1-2 semanas. Las colonias resistentes se expandieron a estirpes celulares estables, y se ensayó el sobrenadante del cultivo de tejido de estas estirpes celulares para determinar los anticuerpos usando un ensayo ELISA de anticuerpos Fc de IgG de cabra antihumana y H+L de cabra antihumana conjugados con alcalino fosfatasa (obtenida en Jackson Laboratories).

El anticuerpo A2 quimérico se purificó del sobrenadante del cultivo de tejido mediante cromatografía Sepharose-Proteína A. El sobrenadante se ajustó con Tris 0,1 M y EDTA 0,002 M a pH 8,0, y se cargó en una columna Sepharose-Proteína A equilibrada con el mismo tampón. La IgG se eluyó con citrato 0,1 M, pH 3,5, se inhibió o neutralizó con Tris 1 M, y se dializó en disolución salina tamponada con fosfato (PBS).

El anticuerpo quimérico purificado se evaluó para determinar su unión y su potente actividad inhibidora o neutralizante.

Ejemplo X Especificidad de un anticuerpo quimérico anti-TNF

Debido a que el dominio de unión al antígeno de cA2 procedía de A2 murino, se esperaba que estos mAb compitieran por el mismo sitio de unión en el TNF. Se incubaron concentraciones determinadas del A2 quimérico y del mAb A2 murino aumentando las concentraciones de A2 quimérico y murino competidor, respectivamente, en una placa de microtitulación de 96 pocillos recubierta con rhTNF (Dainippon, Osaka, Japón). Se usaron anticuerpos de inmunoglobulina antihumana conjugada con alcalino fosfatasa y de inmunoglobulina antimurina para detectar el nivel de unión del A2 quimérico y murino, respectivamente. Se observó una competición cruzada por el antígeno TNF en este formato del ensayo ELISA en fase sólida (Figura 9). Este descubrimiento es consistente con la idéntica especificidad del epítopo esperada del cA2 y del A2 murino.

Se determinó la constante de afinidad para la unión del mAb A2 murino y del cA2 al rhTNF\alpha mediante análisis de Scatchard (véase, por ejemplo, Scatchard, G., Ann. N.Y. Acad. Sci. 51:660 (1949)). Los resultados se muestran en la Figura 10. Este análisis suponía medir la unión directa de cA2 marcado con ^{125}I a rhTNF\alpha inmovilizado en una placa de 96 pocillos. Los anticuerpos se marcaron para una actividad específica de aproximadamente 9,7 \muCi/\mug mediante el procedimiento del yodógeno. Se calculó una constante de afinidad (Ka) de 0,5 x 10^{9} litros/mol para el mAb A2 murino. De forma inesperada, el anticuerpo A2 quimérico tenía una elevada afinidad, con una Ka de 1,8 x 10^{9} litros/mol. Así pues, se demostró que el anticuerpo anti-TNF\alpha quimérico de la presente invención exhibía una afinidad de unión al TNF\alpha humano significativamente mayor que el mAb A2 murino progenitor. Este descubrimiento fue sorprendente, debido a que se esperaba que los anticuerpos, fragmentos y regiones quiméricos y murinos tuvieran afinidades iguales o menores a las del mAb progenitor.

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Se prefieren dichos anticuerpos de elevada afinidad anti-TNF, con afinidades de unión al TNF\alpha de, al menos, 1 x 10^{8} M^{-1}, más preferiblemente de, al menos, 1 x 10^{9} M^{-1} (expresada como Ka) para inmunoensayos que detectan niveles muy bajos del TNF en líquidos biológicos. Por otro lado, se prefieren los anticuerpos anti-TNF con dichas afinidades tan elevadas para la terapia de trastornos o de estados patológicos mediados por el TNF-\alpha.

La especificidad del cA2 por el TNF se confirmó mediante un ensayo de neutralización cruzada de la linfotoxina humana (TNF-\beta). La linfotoxina comparte con el TNF cierta homología entre las secuencias y determinadas actividades biológicas, por ejemplo, la citotoxicidad celular tumoral (Pennica, D., et al., Nature 312: 724-729 (1984)). Se incubaron células A673 humanas cultivadas aumentando las concentraciones de linfotoxina humana (Genentech, San Francisco, CA) con o sin 4 \mug/ml de A2 quimérico en presencia de 20 \mug/ml de cicloheximida a 39ºC durante una noche. La muerte celular se midió mediante tinción vital con negro azulado de naftol, como se indicó anteriormente. Los resultados indicaron que el cA2 era ineficaz para inhibir o neutralizar la linfotoxina humana, confirmando la especificidad del anticuerpo quimérico por el TNF\alpha.

Asimismo, se evaluó también la capacidad del A2 o del cA2 para reaccionar con el TNF de diferentes especies animales. Como ya se ha mencionado, existen múltiples epítopos en el TNF humano al que se unirán mAb neutralizantes o inhibidores (Moller, A. et al., supra). El TNF humano presenta bioactividad en una amplia serie de especies animales hospedadoras. Sin embargo, determinados epítopos inhibidores o neutralizantes del TNF humano se conservan entre diferentes especies animales, y otros parecen estar restringidos a personas y chimpancés.

Los experimentos de neutralización utilizaron sobrenadantes celulares activados con una endotoxina procedentes de monocitos recién aislados humanos, de chimpancé, macaco de la India y macaco de Java, mandril, cerdo, perro, conejo o rata como fuentes del TNF. Tal como se ha discutido anteriormente, el mAb A2 murino inhibía o neutralizaba la actividad sólo del TNF humano y de chimpancé, y no producía ningún efecto sobre el TNF procedente de otros primates y animales inferiores. El A2 tampoco inhibía o neutralizaba el efecto citotóxico del TNF recombinante de ratón.

Así pues, el epítopo reconocido por el A2 es uno de los compartidos por el TNF\alpha humano y de chimpancé. El A2 quimérico se ensayó también de este modo para determinar la reactividad cruzada con TNF derivado de monocitos de rata, conejo, perro y cerdo, así como con TNF\alpha purificado recombinante de ratón, y TNF\alpha humano natural y recombinante. El A2 quimérico inhibía o neutralizaba el TNF\alpha humano natural y recombinante. Por tanto, el cA2 parecía compartir con el A2 murino la especificidad según las especies.

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Ejemplo XI Eficacia de la actividad y neutralización in vitro de un anticuerpo anti-TNF quimérico

Se determinó que los anticuerpos anti-TNF\alpha murinos y quiméricos, A2 y cA2, tenían una potente actividad inhibidora o neutralizante del TNF. En el ensayo de citotoxicidad del TNF que se ha descrito anteriormente, el A2 murino, a una concentración de aproximadamente 125 ng/ml inhibía o neutralizaba totalmente la actividad biológica de una exposición a 40 pg/ml de rhTNF\alpha. Se efectuaron dos determinaciones por separado de la potencia de inhibición o neutralización, expresada como la dosis inhibidora en un 50% (DI50) que era de 15,9 \pm 1,01 y de 17,9 \pm 1,6 ng/ml (media \pm error estándar). Por tanto, el mAb A2 tenía una DI50 de aproximadamente 17 ng/ml.

En el mismo sistema experimental, se encontró que otros tres anticuerpos anti-TNF\alpha murinos (designados como TNF-1, TNF-2 y TNF-3), con una afinidad de unión al TNF comparable, tenían valores de la DI50 1 ó 2 veces mayores, y eran, por tanto, significativamente menos potentes en cuanto a la neutralización que el A2.

Se ensayó la capacidad del cA2 para inhibir o neutralizar la bioactividad del TNF\alpha humano in vitro usando el sistema de bioensayo que se ha descrito anteriormente. Se incubaron células A673 cultivadas con 40 pg/ml de TNF humano natural (Genzima, Boston, MA) o recombinante (Suntory, Osaka, Japón), con o sin anticuerpo, durante una noche como se ha indicado anteriormente, y la muerte celular se midió mediante tinción vital. Tal como se esperaba a partir de los anteriores resultados con el mAb A2 murino, el cA2 también inhibía o neutralizaba el hTNF natural y el rhTNF de un modo que dependía de la dosis en el ensayo de citotoxicidad (Figura 11). En este formato de ensayo, unos niveles de cA2 bajos del orden de 125 ng/ml suprimían por completo la actividad tóxica del TNF. Tras repetidos análisis, el cA2 mostraba una actividad inhibidora o neutralizante del TNF mayor que la del mAb A2 murino progenitor. Dicha potencia de inhibición o neutralización, a niveles del anticuerpo por debajo de 1 \mug/ml, se podían alcanzar fácilmente en la sangre de un sujeto al que se le administró el anticuerpo. De acuerdo con esto, se prefieren dichos anticuerpos anti-TNF inhibidores y neutralizantes altamente potentes, en particular se prefiere el anticuerpo quimérico, para uso terapéutico en patologías o trastornos mediados por el
TNF\alpha.

Tal como se ha mencionado anteriormente, el TNF induce la secreción celular de la IL-6. Por otro lado, existen evidencias de que la IL-6 está implicada en la patofisiología de la septicemia, si bien no está muy clara la función precisa de la IL-6 en ese síndrome (Fong, Y. et al., J Exp Med 170: 1627-1633 (1989); Starnes Jr., H.F. et al., J Immunol 145: 4185-4191 (1990)). Se evaluó la capacidad del cA2 para inhibir o neutralizar la secreción de la IL-6 inducida por el TNF usando fibroblastos FS-4 diploides humanos cultivados. Los resultados de la Tabla 1 muestran cómo el cA2 era eficaz para bloquear la secreción de la IL-6 en células que se habían incubado durante una noche con el TNF. La secreción de la IL-6 inducida por el TNF no era inhibida en ausencia de un mAb o en presencia de un mAb de control específico para un antígeno irrelevante.

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La capacidad del TNF para promover las actividades moleculares de adhesión y de coagulación de las células endoteliales (EC) se cree que es un importante componente de la patología patofisiología. En particular, se puede asociar este a lesiones vasculares, a la coagulación intravascular diseminada, y a la hipotensión grave que se asocia al síndrome septicémico. Por tanto, se evaluó la capacidad del cA2 para bloquear la activación de células endoteliales de vena umbilical humanas (HUVEC) inducida por el TNF. La estimulación por el TNF de la actividad procoagulante se determinó mediante exposición de células HUVEC cultivadas íntegras al TNF (con o sin anticuerpo) durante 4 horas y análisis de un lisado celular en un ensayo de coagulación en el plasma humano. Los resultados de la Tabla 2 muestran la esperada regulación por parte del TNF de la actividad procoagulante de las HUVEC (reflejado en una disminución del tiempo de coagulación). El anticuerpo quimérico cA2 inhibía o neutralizaba eficazmente esta actividad anti-TNF de un modo que dependía de la dosis.

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(Tabla pasa a página siguiente)

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Además de estimular la actividad procoagulante, el TNF también induce la expresión en la superficie de las moléculas endoteliales de adhesión celular tales como la ELAM-1 y la ICAM-1. La capacidad del cA2 para inhibir o neutralizar esta actividad del TNF se midió usando un radioinmunoensayo de detección específico para la ELAM-1. Se estimularon células HUVEC cultivadas con 250 ng/ml de rhTNF (Dainippon, Osaka, Japón), con o sin anticuerpo, a 37ºC durante una noche en un formato de placa de 96 pocillos. La expresión en la superficie de ELAM-1 se determinó mediante la adición secuencial de un mAb de ELAM-1 murino antihumano y un segundo anticuerpo antimurino de inmunoglobulina de conejo marcado con ^{125}I directamente a placas de cultivo a 4ºC.

Tal como se muestra en la Figura 12, el TNF inducía la expresión de la ELAM-1 sobre la superficie de células HUVEC cultivadas, y esta actividad era bloqueada nuevamente de manera eficaz de un modo que dependía de la dosis por el cA2.

Por último, se sabe que el TNF estimula la actividad mitógena en fibroblastos cultivados. El A2 quimérico inhibía o neutralizaba la mitogenia inducida por el TNF de cultivos de fibroblastos FS-4 diploides humanos, confirmando la potente capacidad inhibidora o neutralizante del cA2 frente a un amplio espectro de actividades biológicas del TNF in vitro.

Ejemplo XII Actividad y eficacia in vivo del anticuerpo cA2

La reactividad cruzada altamente restrictiva según la especie del cA2 limita severamente la capacidad para ensayar la eficacia in vivo de este anticuerpo en otros animales que no sean el ser humano o el chimpancé. No obstante, era deseable que se manifestara in vivo la evidencia de la potente capacidad inhibidora o de neutralización in vitro del cA2. Los primeros estudios en animales mostraron que la administración del TNF a animales experimentales imitaba el estado patológico obtenido bien por infecciones de bacterias gramnegativas o bien por la administración directa de endotoxinas (Tracey, K.J. et al., 1986. supra; Tracey, K.J. et al., 1987, supra; Lehmann, V. et al., supra).

Se adaptó un modelo in vivo en el que se administraron dosis letales de TNF humano a ratones sensibilizados con galactosamina (Lehmann, V. et al., supra) para ensayar la capacidad del cA2 para inhibir o neutralizar el TNF in vivo. Una exposición i.p. con 5 \mug (0,25 mg/kg) de rhTNF dio como resultado un 80-90% de mortalidad en animales de control sin tratar y en animales tratados i.v. 15-30 minutos después con disolución salina o con 2 mg/kg de anticuerpo de control (un mAb de IgG1 quimérica de procedencia murina anti-plaquetas 7E3). Por el contrario, el tratamiento con cA2 redujo la mortalidad a un 0-30% con 0,4 mg/kg de anticuerpo, y a un 0-10% con 20 mg/kg. Estos resultados, resumidos en la Tabla 3, indicaban que el cA2 era capaz de inhibir o neutralizar la actividad biológica del TNF tanto in vivo como in vitro.

104

Ejemplo XIII Determinación de las secuencias de aminoácidos (epítopo) en el TNF-\alpha humano reconocidas por el mAb cA2

Reactivos: Los reactivos siguientes se encuentran fácilmente disponibles en el mercado. En Cambridge Research Biochemicals se obtuvieron: FMOC-L-Ala-OPfp, FMOC-L-Cys(Trt)-OPfp, FMOC-L-Asp(OtBu)-OPfp, FMOC-L-Glu(OtBu)-OPfp, FMOC-L-Phe-OPfp, FMOC-Gly-OPfp, FMOC-L-His(Boc)-OPfp, FMOC-L-Ile-OPfp, FMOC-L-Lys(Boc)-OPfp, FMOC-L-Leu-OPfp, FMOC-L-Asn-OPfp, FMOC-L-Pro-OPfp, FMOC-L-Gln-OPfp, FMOC-L-Arg(Mtr)-OPfp, FMOC-L-Ser(tBu)-ODhbt, FMOC-L-Thr(tBu)-ODhbt, FMOC-L-Val-OPfp, FMOC-L-Trp-OPfp, FMOC-L-Try(tBu)-OPfp, y 1-hidroxibenotriazol (HOBT). La piperidina se obtuvo en Applied Biosystems, Inc. La 1-metil-2-pirrolidinona (NMP) se obtuvo en EM Science. El metanol en JT Baker. El anhídrido acético en Applied Biosystems, Inc. El ácido trifluoroacético (TFA) en Applied Biosystems, Inc. La diisopropilamina (DIEA), la trietilamina, el ditiotreitol (DTT) y el anisol en Aldrich, y el ácido clorhídrico (HCl) en JT Baker.

Abreviaturas: FMOC, 9-fluorenilmetoxicarbonilo; tBu, t-butil éter; OtB, éster t-butílico; Boc, t-butiloxicarbonilo; Mtr, 4-metoxi-2,3,6-trimetil-benzenosulfonilo; Trt, tritilo; OPfp, éster pentafluorofenílico; Odhbt, éster oxo-benzotriazona;

Se usó un anticuerpo quimérico de la presente invención, denominado cA2, para determinar qué porciones de la secuencia de aminoácidos del TNF estaban implicadas en la unión inhibidora por parte del anticuerpo mediante la cartografía del epítopo, por lo cual se han identificado las secuencias de aminoácidos del TNF-\alpha reconocidas por el cA2. La secuencia primaria completa del TNF\alpha humano, de acuerdo con Pennica et al, Nature 312: 724-729 (1984) se muestra en la Figura 13. Se sintetizaron decapéptidos superpuestos que comenzaban con cada segundo aminoácido y que cubrían toda la secuencia de aminoácidos del TNF-\alpha humano sobre varillas de polietileno usando el procedimiento de Gysen (Gysen et al., Peptids: Chemistry and Biological, Proceedings of the Twelfth American Peptid Symposium, págs. 519-523, Ed, G.R. Marshall, Escom, Leiden, 1988). Se prepararon individualmente grupos de varillas de péptidos que llevaban grupos amino N-terminal libres y grupos amino N-terminal acetilados. Ambos grupos de varillas de péptidos se incubaron en disoluciones que contenían el mAb anti-TNF cA2 para determinar las secuencias de aminoácidos que constituían el epítopo del cA2 en el TNF-\alpha humano, tal como se describe más adelante. La Figura 14A muestra los resultados de la unión a los decapéptidos superpuestos que comprenden la secuencia completa del TNF\alpha humano. La O.D. (densidad óptica) se relaciona directamente con el aumento del grado de unión del cA2. La Figura 14B muestra los resultados de la unión del cA2 al mismo grupo de varillas de péptidos en presencia del TNF\alpha humano. Este estudio de unión competitiva indica péptidos que pueden mostrar una unión no específica a cA2.

Existen al menos dos secuencias de péptidos no contiguas del TNF-\alpha reconocidas por el cA2. Usando el sistema de numeración de proteínas convencional en el que el aminoácido N-terminal es el número 1, el mAb cA2 reconoce un epítopo compuesto, al menos en parte, por los aminoácidos localizados en los residuos 87-108 o en ambos intervalos de residuos 59-80 y 87-108 del TNF (de la SEC ID NO:1). La Figura 15 presenta estas secuencias no contiguas dentro de la secuencia del TNF. Estas secuencias se muestran también en un modelo de llenado del espacio en la Figura 16B, junto con un modelo de llenado del espacio del monómero de TNF mostrado en la Figura 16A.

De forma inesperada, el mAb cA2 bloquea la acción del TNF-\alpha sin unirse al sitio de unión del supuesto receptor, que puede incluir uno o más de, por ejemplo, 11-13, 37-42, 49-57 o 155-157 del hTNF\alpha (de la SEC ID NO:1). Los mAb anti-TNF preferidos son los que inhiben esta unión del TNF-\alpha humano a sus receptores gracias a su capacidad para unirse a una o más de estas secuencias peptídicas. Estos anticuerpos pueden bloquear la actividad del TNF gracias a que se unen al epítopo del cA2, demostrando que dicha unión inhibe la actividad anti-TNF. La identificación de estas secuencias peptídicas reconocidos por el cA2 proporciona la información necesaria para generar anticuerpos monoclonales adicionales con características de unión y de utilidad terapéutica que son análogas a las de las realizaciones de esta solicitud.

Síntesis de péptidos en varillas: Usando un equipo de cartografía de epítopos adquirido en Cambridge Research Biochemicals, Inc. (CRB), se sintetizaron sobre varillas de polietileno dodecapéptidos correspondientes a la secuencia completa del TNF-\alpha humano.

Se creó un protocolo de síntesis usando el programa informático de cartografía de epítopos CRB. Antes de acoplar el primer aminoácido, las varillas se desprotegieron con una disolución de piperidina al 20% en NMP durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de desprotegerlas, las varillas se lavaron con NMP durante 5 minutos a temperatura ambiente, seguido de tres lavados con metanol. Después de las etapas de lavado, las varillas se dejaron secar al aire durante, al menos, 10 minutos.

Se llevó a cabo el siguiente procedimiento para cada ciclo de acoplamiento:

1) Los derivados de aminoácidos y el HOBT se pesaron de acuerdo con los pesos requeridos en el protocolo de síntesis.

2) El HOBT se disolvió en la cantidad adecuada de NMP de acuerdo con el protocolo de síntesis.

3) Los derivados de aminoácidos se disolvieron en la cantidad recomendada de disolución de HOBT y se pipetearon 150 microlitros en los pocillos adecuados según la dirección de la lámina de posición de los pocillos del protocolo de síntesis.

4) Los bloques que contenían las varillas se situaron en los pocillos, y las unidades "sandwich" se conservaron en bolsas de plástico en un baño de agua a 30ºC durante 18 horas.

5) Las varillas se retiraron de los pocillos y se lavaron una vez (durante 5 minutos) con NMP, tres veces (durante dos minutos) con metanol y se secaron al aire durante 10 minutos.

6) Las varillas se desprotegieron tal como se ha descrito anteriormente y se repitió el procedimiento.

Para acetilar los péptidos sobre un bloque de varillas, se lavaron las varillas de péptidos, se desprotegieron y se trataron con 150 microlitros de una disolución que contenía NMP, anhídrido acético y trietilamina (5:2:1) durante 90 minutos a 30ºC, seguido del procedimiento de lavado detallado anteriormente. Se desprotegió el segundo grupo de varillas de péptidos pero no se acetiló para proporcionar grupos amino N-terminal libres.

La desprotección final de los péptidos para eliminar los grupos protectores de las cadenas laterales se efectuó usando una mezcla 95:2,5:2,5 (v/v/p) de TFA, anisol y ditiotreitol, durante cuatro horas a temperatura ambiente. Después de la desprotección, las varillas se secaron al aire durante 10 minutos, seguido de una sonicación de 15 minutos en una disolución de HCl al 0,1% en metanol y agua destilada (1:1). Las varillas se secaron durante una noche y se dejaron preparadas para el ensayo.

Ensayo ELISA para la unión del cA2 a varillas de péptidos con TNF-\alpha Reactivos

Tampón de disgregación: Se disolvieron fosfato diácido de sodio (31,2 g, Sigma cat # S-0751 o equivalente) y dodecilsulfato sódico (20,0 g, Sigma cat # L-3771 o equivalente) en 2,0 l de agua milliQ. El pH se ajustó a 7,2 \pm 0,1 con hidróxido sódico al 50% p/p (VWR cat # VW6730-3 o equivalente).

Tampón de bloqueo: Se disolvieron fosfato diácido de sodio (0,39 g, Sigma cat #S-0751 o equivalente), fosfato ácido de sodio (1,07 g, Baker cat # 3828-1 o equivalente) y cloruro sódico (8,50 g, Baker cat # 3624-5 o equivalente en 1,0 l de agua milliQ. El pH se ajustó a 7,2 \pm 0,1 con hidróxido sódico al 50% p/p (VWR cat VW6730-3 o equivalente). Se disolvieron ovoalbúmina de pollo (10,0 g, Sigma cat #A-5503 o equivalente) y seroalbúmina bovina (10,0 g, Sigma, cat #A-3294 o equivalente) a temperatura ambiente con agitación suave. La disolución se filtró, y a la disolución se añadió Tween 20 (2,0 ml, Sigma cat #P-13.79 o equivalente). La disolución se agitó suavemente a temperatura ambiente durante 30 min, se filtró y se conservó a 40ºC.

PBS/Tween 20: Se preparó un concentrado (x 10) disolviendo fosfato diácido de sodio (3,90 g, Sigma cat # S-0751 o equivalente), fosfato ácido de sodio (10,70 g, Baker cat #3828-1 o equivalente) y cloruro sódico (85,0 g, Baker cat #3624-5 o equivalente) en 1,0 l de agua milliQ. El pH se ajustó a 7,2 \pm 0,1 con hidróxido sódico al 50% p/p (VWR cat #VW 6730 o equivalente). A la disolución se añadió Tween 20 (5,0 ml, Sigma cat #P.-1379 o equivalente), y la mezcla se agitó suavemente. Inmediatamente antes de su uso, se diluyeron 100 ml de esta disolución a 1,0 l con agua milliQ.

Disolución de sustrato: El tampón de sustrato se preparó disolviendo ácido cítrico (4,20 g, Malinckrodt cat #0627 o equivalente) y fosfato ácido de sodio (7,10 g, Baker cat #3828-1 o equivalente) en 1,0 l de agua milliQ. El pH se ajustó a 5,00 con hidróxido sódico al 50% p/p (VWR cat #VW6730-3 o equivalente). Inmediatamente antes de su uso, se añadieron un comprimido de sustrato OPD (30 mg, Sigma cat #P-8412 o equivalente y peróxido de hidrógeno al 30% v/v (40 \mul, Sigma cat #P-1379 o equivalente) al tampón de sustrato (25,0 ml). La disolución se envolvió en papel metalizado y se mezcló bien.

H_{2}SO_{4} 4N: Se añadió lentamente ácido sulfúrico (53 ml, EM Science cat #SX1244-5 o equivalente) a agua milliQ (447 ml) y se enfrió hasta temperatura ambiente antes de usarlo.

Equipo: Lector de placas Molecular Devices modelo Nu-max o equivalente. Mesa vibratoria Scientific Products modelo R4140 o equivalente. Baño de ultrasonidos Branson modelo 5200 o equivalente. Pipeta multicanal Finnpipette modelo 4172317 o equivalente. Placas desechables de poliestireno de 96 pocillos para ensayos ELISA Corning modelo 25801.

Antes de su uso y después de cada uso posterior, se limpiaron las varillas de péptidos usando el siguiente procedimiento. Se calentó tampón de disgregación (2,0 l) a 60ºC y se colocó en un baño de ultrasonidos bajo una vitrina de gases. Al tampón de disgregación se añadió ditiotreitol (2,5 g, Sigma cat #D-0632 o equivalente). Se sonicaron las varillas de péptidos en este medio durante 30 min, se lavaron bien con agua milliQ, se suspendieron en un baño de etanol hirviendo durante 2 min, y se secaron al aire.

Se añadió tampón de bloqueo (200 \mul) a una placa desechable de poliestireno de 96 pocillos para ensayos ELISA y se suspendieron las varillas de péptidos en los pocillos. Las varillas de péptidos y la placa se incubaron durante 2 h a temperatura ambiente sobre un agitador de mesa oscilante. Las placas y las varillas de péptidos se lavaron con PBS/Tween 20 (cuatro veces). A cada pocillo se añadió una concentración de 20 \mug/ml de anticuerpo cA2 (diluido con tampón de bloqueo, 175 \mul/pocillo). La competición por el TNF se efectuó mediante incubación del TNF\alpha (40 \mug/ml) y del cA2 (20 \mug/ml) en BSA/ovoalbúmina/BBS durante 3 horas a temperatura ambiente. Las varillas de péptidos se suspendieron en la placa y se incubaron a 4ºC durante una noche. Las varillas de péptidos y la placa se lavaron con PBS/Tween 20 (cuatro veces). A cada pocillo se añadió anticuerpo de cabra antihumano conjugado con peroxidasa de rábano silvestre (diluida con tampón de bloqueo a 1/2000, 175 \mul/pocillo, Jackson ImmunoResearch Labs). Las varillas de péptidos se suspendieron en la placa, y se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente sobre un agitador de mesa oscilante. Las placas y las varillas de péptidos se lavaron con PBS/Tween 20 (cuatro veces). A cada pocillo se añadió disolución de sustrato recién preparada (150 \mul/pocillo), las varillas de péptidos se suspendieron en la placa y se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente sobre un agitador de mesa oscilante. Las varillas de péptidos se retiraron y a cada pocillo se añadió H_{2}SO_{4} 4N (50 \mul). Las placas se leyeron en un lector de placas Molecular Devices (490 nm, restando la absorbancia a 650 nm como blanco), y los resultados se muestran en las Figuras 14A y 14E, tal como se ha descrito anteriormente.

Ejemplo XIV

(Referencial)

Producción de MAb murino anti-TNF humano usando fragmentos peptídicos del TNF

A ratones BALB/c hembra, como en el Ejemplo I anterior, se les inyectó subcutánea e intraperitonealmente (i.p.) 40 \mug de fragmentos de TNF humano recombinante derivado de E. coli (rhTNF) purificado que comprendía epítopos anti-TNF de, al menos, 5 aminoácidos localizados en la secuencia no contigua 59-80, 87-108 o en ambos intervalos de residuos 59-80 y 87-108 del TNF (de la SEC ID NO:1), tal como se indicó anteriormente, emulsionados con un volumen igual de adyuvante de Freund completo (obtenido en Difco Laboratories) en 0,4 ml. Una semana más tarde, se administró i.p. una inyección de refuerzo de 5 \mug de estos fragmentos de rhTNF en adyuvante de Freund incompleto, seguido de cuatro inyecciones consecutivas de 10 \mug de fragmentos del TNF que incluyen los epítopos anti-TNF que comprenden los aminoácidos de los residuos 59-80, 87-108 o de ambos intervalos de residuos 59-80 y 87-108 del hTNF\alpha (de la SEC ID NO:1) sin adyuvante. Ocho semanas después de la última inyección, se administró i.p. al ratón una inyección de refuerzo con 10 \mug del TNF.

Cuatro días más tarde, se sacrificó el ratón, se extrajo el bazo y se preparó una suspensión de células de bazo. Se fusionaron células de bazo con células del hibridoma no segregante, Sp2/0 (ATCC CRL1581), en una relación 4:1 entre las células de bazo y las células SP2/0, en presencia de 0,3 ml de polietilenglicol al 30%, PEG 1450. Después de la incubación a 37ºC durante 6 horas, las células fusionadas se distribuyeron en partes alícuotas de 0,2 ml en placas de 96 pocillos con concentraciones de 2 x 10^{4} células SP2/0 por pocillo. Se añadieron a cada pocillo células condicionadoras, en forma de 5 x 10^{4} células de bazo normales BALB/c.

El medio de crecimiento usado consistía en medio RPMI-1640, suero fetal bovino al 10% inactivado por el calor (FBS) (Hyclone), aminoácidos no esenciales MEM 0,1 mM, piruvato sódico 1 mM, L-glutamina 2 mM, penicilina 100 U/ml, estreptomicina 100 \mug/ml (GIBCO Laboratories) y, para la selección, hipoxantina-aminopterina-timidina (HAT) (Boehringer Mannheim).

Se empleó un radioinmunoensayo (RIA) en fase sólida para rastrear los sobrenadantes a fin de determinar la presencia de los mAb específicos para los fragmentos de rhTNF\alpha que incluyen porciones de los residuos 59-80, 87-108 o de ambos intervalos de residuos 59-80 y 87-108 del hTNF\alpha (de la SEC ID NO:1). Este ensayo se describe en el anterior Ejemplo II. La unión de fondo en este ensayo era de aproximadamente 500 cpm. Un sobrenadante se consideraba positivo si proporcionaba una unión de 2000 cpm o más.

De los sobrenadantes rastreados, se identificaron de modo rutinario uno o más sobrenadantes positivos mediante un ensayo RIA. De estos sobrenadantes positivos, el de la unión mayor (indicada por los valores de cpm mayores) se subclonaron a dilución limitante en células condicionadoras de ratón. Según un análisis posterior de los sobrenadantes en ensayos de neutralización, se encontró de modo rutinario que uno o más anticuerpos tenían una potente actividad inhibidora o neutralizante. Estas estirpes de hibridomas positivas e inhibidoras o neutralizantes se seleccionaron entonces y se conservaron en medio RPMI-1640 con FBS al 10% (GIBCO), aminoácidos no esenciales 0,1 mM, piruvato sódico 1 mM, 2 mM L-glutamina, penicilina 100 U/ml y estreptomicina 100 \mug/ml.

Ejemplo XV Producción de anticuerpos, fragmentos y regiones quiméricos y murinos procedentes de péptidos del TNF

Se obtienen anticuerpos, fragmentos y regiones quiméricos y murinos mediante la construcción de vectores de expresión quiméricos que codifican la región variable murina de anticuerpos obtenidos en el Ejemplo XIV y las regiones constantes humanas, tal como se ha presentado en los Ejemplos IV-IX anteriores.

El anticuerpo A2 quimérico resultante se purifica del sobrenadante del cultivo de tejido mediante cromatografía Sepharose-Proteína A. El sobrenadante se ajusta con Tris 0,1 M y EDTA 0,002 M a pH 8,0, y se carga en una columna Sepharose-Proteína A equilibrada con el mismo tampón. La IgG se eluye entonces con citrato 0,1 M, pH 3,5, se neutraliza con 1M Tris, y se dializa en disolución salina tamponada con fosfato (PBS).

Los anticuerpos, fragmentos y regiones quiméricos y murinos purificados se evaluaron para determinar su unión y su potente actividad inhibidora o neutralizante.

Ejemplo XVI Eficacia de la actividad y la neutralización in vitro de un anticuerpo anti-TNF quimérico

Los anticuerpos murinos y anti-TNF\alpha quiméricos obtenidos de acuerdo con los Ejemplos XIV y XV, se determinó que tenían una potente actividad inhibidora o neutralizante del TNF, cono se demostró por ejemplo, en el ensayo de citotoxicidad del TNF que se ha descrito anteriormente, expresada como la dosis inhibidora en un 50% (DI50).

En el mismo sistema experimental, se encontró que otros tres anticuerpos murinos anti-TNF\alpha (designados como TNF-1, TNF-2 y TNF-3), con una afinidad de unión al TNF comparable, tenían valores de la DI50 1 ó 2 veces mayores, y eran, por tanto, significativamente menos potentes en cuanto a la neutralización que los anticuerpos anti-TNF\alpha murinos y que los anticuerpos anti-TNF\alpha quiméricos de la presente invención.

Se ensaya la capacidad de los anticuerpos murinos y de los anticuerpos anti-TNF\alpha quiméricos de la presente invención, obtenidos de acuerdo con los Ejemplos XIV y XV, para inhibir o neutralizar la bioactividad in vitro del TNF\alpha humano usando el sistema de bioensayo que se ha descrito anteriormente. Se incuban células cultivadas que producían los anticuerpos murinos o los anticuerpos anti-TNF\alpha quiméricos de la presente invención, obtenidos de acuerdo con los Ejemplos XIV y XV, con 40 pg/ml de TNF humano natural (Genzima, Boston, MA) o recombinante (Suntory, Osaka, Japón), con o sin anticuerpo, durante una noche como anteriormente se indicó, y se mide la muerte celular mediante tinción vital. Tal y como se esperaba, los anticuerpos murinos y los anticuerpos anti-TNF\alpha quiméricos de la presente invención, obtenidos de acuerdo con los Ejemplos XIV y XV, inhiben o neutralizan el hTNF natural y el rhTNF de un modo que depende de la dosis en el ensayo de citotoxicidad. Dicha potencia de inhibición o neutralización, a niveles del anticuerpo por debajo de 1 \mug/ml, se puede alcanzar fácilmente en la sangre de un sujeto al que se le administra el anticuerpo. De acuerdo con esto, se prefieren dichos anticuerpos anti-TNF inhibidores y neutralizantes altamente potentes, en particular el anticuerpo quimérico, para uso terapéutico en patologías o trastornos mediados por el TNF\alpha.

La capacidad del cA2 para inhibir o neutralizar la secreción de la IL-6 inducida por el TNF se evalúa usando fibroblastos FS-4 diploides humanos cultivados. Los resultados se espera que muestren cómo los anticuerpos murinos y los anticuerpos anti-TNF\alpha quiméricos de la presente invención, obtenidos de acuerdo con los Ejemplos XIV y XV, son eficaces para bloquear la secreción de la IL-6 en células que se han incubado durante una noche con el TNF. La secreción de la IL-6 inducida por el TNF no es inhibida en ausencia de un mAb o en presencia de un mAb de control específico para un antígeno irrelevante.

La capacidad del TNF para promover las actividades moleculares de adhesión y de coagulación de las células endoteliales (EC) se cree que es un importante componente de la patología patofisiología. En particular, se puede asociar este a lesiones vasculares, a la coagulación intravascular diseminada, y a la hipotensión grave que se asocia al síndrome septicémico. Por tanto, se evalúa la capacidad de los anticuerpos murinos y los anticuerpos anti-TNF\alpha quiméricos de la presente invención, obtenidos de acuerdo con los Ejemplos XIV y XV, para bloquear la activación de células endoteliales de vena umbilical humanas (HUVEC) inducida por el TNF. Se determina la estimulación por el TNF de la actividad procoagulante mediante exposición de células HUVEC cultivadas íntegras al TNF (con o sin anticuerpo) durante 4 horas y análisis de un lisado celular en un ensayo de coagulación en el plasma humano. Los resultados se espera que muestren la esperada regulación por parte del TNF de la actividad procoagulante de las HUVEC (reflejado en una disminución del tiempo de coagulación). Los anticuerpos murinos y los anticuerpos anti-TNF\alpha quiméricos de la presente invención, obtenidos de acuerdo con los Ejemplos XIV y XV, se espera que inhiban o neutralicen eficazmente esta actividad anti-TNF de un modo que dependa de la dosis.

Además de estimular la actividad procoagulante, el TNF induce también la expresión en la superficie de las moléculas endoteliales de adhesión celular tales como la ELAM-1 y la ICAM-1. La capacidad de los anticuerpos murinos y los anticuerpos anti-TNF\alpha quiméricos de la presente invención, obtenidos de acuerdo con los Ejemplos XIV y XV, se espera que inhiba o neutralice esta actividad del TNF que se mide usando un radioinmunoensayo de detección específico para la ELAM-1. Las células HUVE cultivadas se estimulan con 250 ng/ml de rhTNF (Dainippon, Osaka, Japón), con o sin anticuerpo, a 37ºC durante una noche en un formato de placa de 96 pocillos. La expresión en la superficie de la ELAM-1 se determina mediante la adición secuencial de un mAb de ELAM-1 murino antihumano y de un segundo anticuerpo antimurino de inmunoglobulina de conejo marcado con ^{125}I, directamente a las placas de cultivo a 4ºC.

Se espera que el TNF induzca la expresión de la ELAM-1 sobre la superficie de células HUVEC cultivadas, y esta actividad se espera también que sea bloqueada eficazmente de un modo que dependa de la dosis por los anticuerpos murinos y por los anticuerpos anti-TNF\alpha quiméricos de la presente invención, obtenidos de acuerdo con los Ejemplos XIV y XV.

Por último, se sabe que el TNF estimula la actividad mitógena en fibroblastos cultivados. Los anticuerpos murinos y los anticuerpos anti-TNF\alpha quiméricos de la presente invención, obtenidos de acuerdo con los Ejemplos XIV y XV, se espera que inhiban o neutralicen la mitogenia inducida por el TNF de cultivos de fibroblastos FS-4 diploides humanos, confirmando la potente capacidad inhibidora o neutralizante de los anticuerpos murinos y de los anticuerpos anti-TNF\alpha quiméricos de la presente invención, obtenidos de acuerdo con los Ejemplos XIV y XV frente a un amplio espectro de actividades biológicas in vitro del TNF.

Ejemplo XVII Actividad y eficacia in vivo del anticuerpo cA2

Se adapta un modelo in vivo en el que se administran dosis letales de TNF humano a ratones sensibilizados con galactosamina (Lehmann, V. et al., supra) para ensayar la capacidad de los anticuerpos murinos y los anticuerpos anti-TNF\alpha quiméricos de la presente invención, obtenidos de acuerdo con los Ejemplos XIV y XV, para inhibir o neutralizar el TNF in vivo. Una exposición i.p. con 5 \mug (0,25 mg/kg) de rhTNF dio como resultado un 80-90% de mortalidad en animales de control sin tratar y en animales tratados i.v. 15-30 minutos después con disolución salina o con 2 mg/kg de anticuerpo de control (un mAb de IgG1 quimérica de procedencia murina anti-plaquetas 7E3). Por el contrario, el tratamiento con los anticuerpos murinos y los anticuerpos anti-TNF\alpha quiméricos de la presente invención, obtenidos de acuerdo con los Ejemplos XIV y XV, se espera que reduzca la mortalidad a un 0-30% con 0,4 mg/kg de anticuerpo, y a un 0-10% con 20 mg/kg. Estos resultados esperados indican que los anticuerpos murinos y los anticuerpos anti-TNF\alpha quiméricos de la presente invención, obtenidos de acuerdo con los Ejemplos XIV y XV, son capaces de inhibir o neutralizar la actividad biológica del TNF tanto in vivo como in vitro.

Ejemplo XVIII Actividad y eficacia clínica del anticuerpo cA2

Se administró el anticuerpo monoclonal quimérico de IgG1 anti-TNF humano cA2 voluntarios humanos varones sanos como pacientes. Una hora después de recibir 4 ng/kg de una endotoxina de referencia NIH, a los voluntarios se les administró bien disolución salina, como control, o bien 0,01, 0,10 ó 10 mg/kg de cA2 en una forma farmacéuticamente aceptable. Se midieron los niveles de TNF en suero a lo largo del tiempo y se encontró que mostraban una disminución de los niveles máximos de TNF dependientes de la dosis, no habiéndose detectado TNF en los voluntarios que recibieron una dosis de 10 mg/kg de cA2. De acuerdo con esto, la terapia con un anticuerpo anti-TNF quimérico de la presente invención se espera que inhiba los efectos mediados por el TNF en personas.

Los pacientes que recibieron una endotoxina desarrollaron una fuerte leucopenia que se pensó era debida a la marginación de los leucocitos. A medida que se activaban los leucocitos, estos atacaban a los receptores endoteliales dando como resultado un daño endotelial. Con dosis de 1,0 a 10,0 mg/kg, se evitaba esta leucopenia, mientras que, con dosis de 0,01 y 0,1 mg/kg, se observó una disminución del recuento de linfocitos. La disminución fue mayor en la estirpe celular polimorfa. En todos los pacientes se dio una leucocitosis posterior, que no varió con el tratamiento con el anticuerpo quimérico anti-TNF cA2. Este efecto de bloqueo sobre la marginación de los leucocitos se espera que represente un efecto protector contra el daño endotelial asociado al TNF. En la técnica, se espera que este daño endotelial relacionado con el TNF desempeñe una importante función en la morbilidad y la mortalidad asociadas a la septicemia, y se espera, por tanto, que el anticuerpo anti-TNF de la presente invención proporcione un efecto protector contra estos efectos lesivos, tal y como se indica en el presente documento.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i)

SOLICITANTE: Le, Junming

\hskip3.88cm

Vilcek, Jan

\hskip3.88cm

Daddona, Peter E.

\hskip3.88cm

Ghrayeb, John

\hskip3.88cm

Knight, David M.

\hskip3.88cm

Siegel, Scott A.

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(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: ANTICUERPOS MONOCLONALES Y QUIMÉRICOS ESPECÍFICOS PARA EL FACTOR DE NECROSIS TUMORAL HUMANO

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(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 1

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(iv)

DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:

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(A)

DESTINATARIO: Browdy y Neimark

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(B)

CALLE: 419 Seventh Street, N.W.

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(C)

CIUDAD: Washington

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(D)

ESTADO: D.C.

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(E)

PAÍS: EE.UU.

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(F)

ZIP: 20004

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(v)

FORMA LEGIBLE DEL ORDENADOR:

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(A)

TIPO MEDIO: Disco flexible

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(B)

ORDENADOR: IBM PC compatible

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(C)

SISTEMA OPERATIVO:PC-DOS/MS-DOS

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(D)

SOFTWARE: PatentIn Release #1,0,

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Versión #1,25

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(vi)

DATOS ACTUALES DE LA SOLICITUD:

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(A)

NÚMERO DE SOLICITUD:

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(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN:

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(C)

CLASIFICACIÓN:

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(vii)

DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

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(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: US 07/670827

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(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 18-MAR-1991

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(ix)

INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES:

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(A)

TELÉFONO: 202-628-5197

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(B)

FAX: 202-737-3528

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:1:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 157 aminoácidos

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(B)

TIPO: aminoácida

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:1:

1

Claims (22)

1. Una molécula de inmunoglobulina quimérica, siendo dicha molécula de inmunoglobulina un anticuerpo quimérico que comprende una región constante de la inmunoglobulina humana y una región variable de inmunoglobulina no humana, teniendo dicha molécula de inmunoglobulina especificidad hacia un epítopo neutralizante del factor de necrosis tumoral humano alfa (TNFalfa) como el anticuerpo monoclonal murino A2, molécula de inmunoglobulina que: (i) neutraliza o inhibe la citotoxicidad del TNFalfa humano y del TNFalfa de chimpancé y (ii) no inhibe la actividad citotóxica del TNFalfa producido por mandriles, macacos de Java y macacos de la India o del TNFbeta humano y (iii) neutraliza: (a) la secreción de la IL-6 inducida por el TNF; b) la activación por el TNF de las actividades moleculares de adhesión y de procoagulación de las células endoteliales, y c) la expresión en la superficie de la ELAM-1 inducida por el TNF e (iv) inhibiendo competitivamente dicha molécula de inmunoglobulina la unión de A2 a TNFalfa humano, y (v) une un epitopo neutralizante de TNFalfa humano con una afinidad de al menos 1 x 108 litros/mol, medida como una constante de asociación (Ka), como se determina mediante análisis de Scatchard.

2. Una molécula de inmunoglobulina quimérica de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas, comprendiendo cada una de dichas cadenas una región constante y una región variable, teniendo dicha región variable especificidad hacia el TNFalfa humano y uniéndose dicha molécula de inmunoglobulina con elevada afinidad a un epítopo neutralizante del TNFalfa humano in vivo.

3. Una molécula de inmunoglobulina quimérica de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, teniendo dicha molécula de inmunoglobulina una región de unión al antígeno que se une a los residuos 87-108, o a ambos intervalos de residuos 59-80 y 87-108, del hTNFalfa de la SEC ID NO:1, tal como se ha determinado mediante el procedimiento de síntesis de péptidos en varillas.

4. Una molécula de inmunoglobulina quimérica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, no uniéndose dicha molécula de inmunoglobulina a uno o más epítopos incluidos en los aminoácidos 11-13, 37-42, 49-57 o 155-157 del hTNFalfa de la SEC ID NO:1, tal como se ha determinado mediante el procedimiento de síntesis de péptidos en varillas.

5. Una molécula de inmunoglobulina quimérica de acuerdo con la reivindicación 1 o cualquier reivindicación dependiente de la misma, en la que dicha región variable es de procedencia murina.

6. Una molécula de inmunoglobulina quimérica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicha región constante se caracteriza como el isotipo IgG1.

7. Una molécula de inmunoglobulina quimérica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que dicha afinidad, medida como una constante de asociación (Ka), es de, al menos, 1 x 10^{8} litros/mol, por ejemplo de, al menos, 1 x 10^{9} litros/mol.

8. Una molécula de inmunoglobulina quimérica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que neutraliza el TNFalfa humano con una DI50 de, al menos, aproximadamente 1 \mug/ml.

9. Una molécula de inmunoglobulina quimérica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que neutraliza el TNFalfa humano con una DI50 de, al menos, aproximadamente 100 ng/ml.

10. Una molécula de inmunoglobulina quimérica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, que neutraliza el TNFalfa humano con una DI50 de, al menos, aproximadamente 15 ng/ml.

11. Un polinucleótido aislado, que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una molécula de inmunoglobulina quimérica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, codificando dicha secuencia de nucleótidos al menos una región variable unida operativamente a, al menos, una región constante.

12. Un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 11, seleccionándose dicha secuencia de nucleótidos de entre una secuencia de ADN genómico o una secuencia de ADNc.

13. Un vehículo de expresión que comprende un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 11 o la reivindicación 12.

14. Un hospedador transformado o transfectado con el polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 11 o la reivindicación 12, siendo el hospedador una célula eucariota (por ejemplo una célula de mamífero) o una célula bacteriana.

15. Un procedimiento para preparar una molécula de inmunoglobulina quimérica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que comprende las etapas de: (a) cultivar un hospedador de acuerdo con la reivindicación 14 de modo que dicha molécula de inmunoglobulina se exprese en cantidades recuperables; y (b) recuperar dicha molécula de inmunoglobulina de dicho hospedador.

16. Una composición farmacéutica que comprende una molécula de inmunoglobulina de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, o un derivado farmacéuticamente aceptable de la misma que sea un éster, un éter, un sulfato, un carbonato, un glucurónido o una sal de la misma, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

17. Una composición para usar en terapia que comprende una molécula de inmunoglobulina de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, o un derivado farmacéuticamente aceptable de la misma tal como se ha definido en la reivindicación 16.

18. Una composición de acuerdo con la reivindicación 17, seleccionándose la patología de entre el síndrome septicémico, la caquexia, la insuficiencia y el choque circulatorios como resultado de infecciones bacterianas agudas o crónicas, una infección bacteriana, una infección vírica, una infección fúngica, el lupus eritomatoso diseminado, la hepatitis inducida por el alcohol, una patología inflamatoria crónica, una patología inflamatoria vascular, una patología del injerto contra el hospedador, la patología de Kawasaki y una patología maligna.

19. Una composición de acuerdo con la reivindicación 17, en la que la patología es la artritis reumatoide o la patología de Crohn.

20. El uso de una molécula de inmunoglobulina de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 o un derivado farmacéuticamente aceptable de la misma tal como se ha definido en la reivindicación 16, para la fabricación de un medicamento destinado al tratamiento de una patología mediada por el TNFalfa.

21. El uso de la reivindicación 20, en la que dicha patología se selecciona de entre el síndrome septicémico, la caquexia, la insuficiencia y el choque circulatorios como resultado de infecciones bacterianas agudas o crónicas, una infección bacteriana, una infección vírica, una infección fúngica, el lupus eritomatoso diseminado, la hepatitis inducida por el alcohol, una patología inflamatoria crónica, una patología inflamatoria vascular, una patología del injerto contra el hospedador, la patología de Kawasaki y una patología maligna.

22. El uso de la reivindicación 20, en el que dicha patología es la artritis reumatoide o la patología de Crohn.