JP2007254477A - ヒト腫瘍壊死因子に特異的なモノクローナルなキメラ抗体 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】ヒト腫瘍壊死因子−α(TNFα)に特異的であり、かつTNFに仲介される種々の疾患や症状のin vivoでの診断および治療に有用な抗TNF抗体、そのフラグメントおよび領域部分、並びに、マウスとのキメラ抗体をコードするポリヌクレオチド、前記抗体の製造方法、並びに前記抗TNF抗体、そのフラグメント、領域およびそれらの誘導体の免疫学的分析や免疫学的治療への応用に関する種々のアプローチ。
【選択図】なし
Description
免疫学と医学の分野に属する本発明はヒトの腫瘍壊死因子−アルファ(hTNFα);そのフラグメント、領域部分(原文:regions)および誘導体;その薬用組成物および診断用組成物、ならびにその産生、それによる診断および治療法に関する。本発明は、またそのような抗体、フラグメント、領域部分をコードするヌクレオチド配列、ならびにそのような配列を含むベクターおよび宿主と、さらにその製法とに関する。
その殺腫瘍活性の故になされるTNFによる癌患者の治療は、545μg/m2/24hrより多い投与で、健康人に対する内毒素4ng/kgの注射によって惹起されるのに似た変化を惹き起こすことがわかり(Michie,H.R.et al.,Surgery 104:280−286(1988))、敗血症と内毒素に対する反応の主たる宿主の仲介者としてのTNFの役割を支持している。ヒトまたはラットへの長期間にわたる静脈内注入は食欲不振、体液うっ滞、急性反応、負の窒素バランス(すなわち、古典的異化効果)に関係し、重篤な疾患において見られる多くの変化に対する原因であるという結論に導かれる((Michie,H.R.et al.,Ann.Surg.209:19−24(1989))。
本発明のさらに他の目的は、生体内において、TNFα阻害ないし中和作用を有し、悪液質を含むTNFαに関連する疾患、細菌性疾患、ウィルス性疾患、および真菌性疾患のような急性および慢性の感染性および寄生虫性疾患、自己免疫疾患、アルコール誘発性肝炎、悪性形質転換疾患等を含む急性および慢性の炎症性および免疫性疾患の診断および治療のための、薬用および診断用の組成物として提供することのできる抗TNFαおよび/またはそのフラグメント、領域部分を提供することである。治療用に好適なのは、高親和性抗TNFα抗体で、モノクローナルキメラ抗体であって、組換えによりまたはハイブリドーマによって産生されるものを含み、それは少なくとも約1μg/ml、より好ましくは、少なくとも約100ng/ml、もっとも好ましくは約15ng/mlの阻害投与量50(ID50)で生体内でヒトのTNFαを阻害ないし中和する。
本発明におけるマウスとのキメラ抗体、フラグメントおよび領域部分は、個々の重(H)鎖免疫グロブリン鎖および軽(L)鎖免疫グロブリン鎖からなる。キメラH鎖は、ヒトH鎖C領域の少なくとも一部に結合された、TNFに対して特異的な非ヒト抗体のH鎖から誘導された抗原結合領域を有する。
雑種細胞は、非ヒト抗hTNFα抗体産生細胞、典型的には天然のもしくは組み換えヒトTNFまたはヒトTNFαタンパク配列のペプチドフラグメントに対して免疫された動物の脾臓細胞の融合によって形成される。また、非ヒト抗TNF抗体産生細胞は、血液、脾臓、リンパ節またはTNFで免疫された動物の他の組織から得られたBリンパ球であっても良い。
87−108:Tyr−Gly−Thr−Lys−Val−Asn−Leu−Leu−Ser−Ala−Ile−Lys−Ser−Pro−Cys−Gln−Arg−Glu−Thr−Pro−Glu−Gly(SEQ ID NO:1のAA 87−108)
アミノ酸配列中に(SEQ ID NO:1における)hTNFαの残基87−108または残基59−80と87−108との両方のいずれかが含まれたエピトープを結合しかつTNFを阻害するところの、組み換え体であるネズミ抗体、またはネズミ/ヒトキメラ抗体もしくはヒト/ヒトキメラ抗体は、ここに提供された教示に基づく既知の手法を使用する本発明に従って提供される。
1. 抗TNF抗体を産生する細胞系から、および重鎖定常領域と軽鎖定常領域とを与える任意選択の付加的な抗体から、メッセンジャーRNA(mRNA)を単離し、クローニングし、cDNAを産生すること。
2. L鎖遺伝子およびH鎖遺伝子における適当なV領域遺伝子および/またはC領域遺伝子が、(i)適当なプローブで同定され、(ii)順序良く配列され(原文:sequenced)、および(iii)キメラ抗体のためにその他の抗体からC遺伝子セグメントまたはV遺伝子セグメントと一致させられる、そのような精製したmRNAから全長のcDNAライブラリーを合成すること。
3. 上述されたように、クローニングされた特定のV領域遺伝子セグメントを、クローニングされたC領域遺伝子を結合することによって、完全なH鎖またはC鎖をコードする遺伝子が形成されること。
4. ネズミ/ネズミ、ヒト/ネズミ、ヒト/ヒトまたはヒト/ネズミ抗体を産生するための原核細胞および真核細胞を含む、選択された宿主中でL鎖およびH鎖の発現と産生とが行われること。
マウス抗ヒトTNFモノクローナル抗体の生産
TNFモノクローナル抗体の臨床研究を容易にするために、A2と呼ばれる、阻害および/または中和能のある高親和性のマウス抗ヒトTNF免疫グロブリンG1モノクローナル抗体が生産された。10週齢のBALB/c雌マウスは、ジャクソン・ラボラトリー社(バー・ハーバー)から得られた。0.4ml中に完全フロイント・アジュバント(ディフコ・ラボラトリーズ社から得られた)の40μgと共に乳剤化される、精製されたE.Coli由来組換えヒトTNFの40μgが、マウスの皮下および腹腔(以下、i.p.と称することがある。)に注射された。一週間後、アジュバントを含まないTNFの10μgが連続4回腹腔に注射された後、不完全フロイント・アジュバント中に含まれるrhTNFの5μgが腹腔に注射された。最後の注射から8週間後、マウスは、TNFの10μgで腹腔に追加免疫された。
この発明における抗TNF抗体の特長
A.ラジオイムノアッセイ
E.coli由来のrhTNFは、pH9.6のBCB緩衝液中に1μg/mlの濃度に希釈され、この溶液の0.1mlが各アッセイウエルに添加された。4℃で一昼夜培養した後、各ウエルは、BCBで簡単に洗浄され、それから37℃で1時間、BCB中の1%ウシ血清アルブミン(以下、BSAと称することがある。)でシールされた。各ウエルは、それから0.05%ツイーン−20を含有するPBS(以下、PBS−Tweenと称することがある。)で3回洗浄され、希釈されたA2腹水の70μlが、各ウエルに添加された。各ウエルは、37℃で2時間培養され、PBS−Tweenで3回洗浄された。その後、1%BSAを含有するPBS−Tweenの50μl中に含まれる、125Iで標識された、ヒツジ抗マウスIg抗体のF(ab')2フラグメントのおよそ50,000cpmが、各ウエルに添加され、各ウエルは、更に37℃で2時間培養された。各ウエルは、各々PBS−Tweenで4回洗浄され、切り離され、計数された。2つの測定の結果が図1に示されている。
A2およびcA2の試料は、プロテインA・アフィニティー・クロマトグラフィーにより、C134A、C168A(上述)とそれぞれ呼ばれる細胞系のハイブリドーマ組織培養上清から精製され、pH7.2のリン酸緩衝生理食塩水(以下、PBSと称することがある。)でダイアフィルトレーションされた。
B514(ヒヒ)、J91(カニクイザル)、およびRH383(アカゲザル)の血液からフィコール比重差遠心により分離された単球は、TNF生産を誘導するため、37℃で3時間あるいは16時間、5%FBSおよび2μg/mlのE.coliLPSを含むRPMl 1640培地中で、1×105細胞/ウエルの割合で培養された。同じウエルからの各上清は、上述のA673/6細胞を用いるTNFのバイオアッセイが行われるまで、4℃で20時間未満、貯蔵された。培養上清の2倍希釈液は、1μg/mlの最終濃度で、培地あるいは精製されたA2モノクローナル抗体のいずれかと共に混合され、室温で30分間インキュベートされ、そして、アリクオットは、指示細胞に移された。結果としては、A2モノクローナル抗体は、ヒヒ、カニクイザルおよびアカゲザルの単球により生産されるTNFの細胞障害作用を阻害あるいは中和していなかった。
抗体のVおよびC遺伝子をクローニングするための一般的な方法
上述の抗TNF抗体を分泌するA2ハイブリドーマからのH鎖およびL鎖遺伝子についてのV領域をクローニングするための方法は、機能的に再編成される(および発現される)Ig遺伝子についての、V領域および対応するJ領域間のゲノムにおける連結に基づいて行われた。J(結合)領域のDNAブローブは、J領域にリンクされるDNAを分離するため、ゲノム・ライブラリーをスクリーンするのに用いられた。生殖細胞系の配列における(すなわち、未再編成された)DNAは、Jプローブにハイブリッド化するにもかかわらず、このDNAは、IgのV領域のシークエンスにリンクせず、分離されたクローンの制限酵素分析により同定され得る。
L鎖ゲノム・ライブラリーの構築
A2ハイブリドーマからのL鎖のV領域遺伝子を分離するため、大きさの選択されたゲノム・ライブラリーは、λファージベクターシャロン(原文;Charon)27を用いて構築された。高分子量DNAが、A2ハイブリドーマ細胞から分離され、制限エンドヌクレアーゼHindIIIで完全に切断された。DNAは、それから0.8%アガロースゲル上で分画され、およそ3kb、4kbおよび6kbという3つの異なる大きさのDNAフラグメントが、電気溶出によりゲルから分離された。ライブラリー構築についての大きさの範囲は、サザーンブロッティングにおいてJκプローブとハイブリッド化したHindIIIフラグメントの大きさに基づいて選択された。フェノール/クロロホルム溶出およびエタノール沈澱の後、同じ大きさのクラスからのDNAフラグメントは、λシャロン(原文;Charon)27のアームと結合され、ストラタジーン社からの得たギガパック・ゴールドを用いてinvitroでファージ粒子中にパッケージされた。
H鎖ゲノム・ライブラリーの構築
A2のH鎖についてのV領域遺伝子を分離するため、ゲノム・ライブラリーが、λgt10ベクター系において構築された。高分子量のDNAは、制限エンドヌクレアーゼEcoRIで完全に切断され、およそ7.5kbのフラグメントが、アガロースゲル電気泳動後に分離された。これらのフラグメントは、λgt10アームと共に結合され、ギガパック・ゴールドを用いてinvitroでファージ粒子中にパッケージされた。
そのプローブは、実験3のように標識され、同様の比放射活性を有していた。ハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件は、実験3において用いた条件と同様とした。
TNFに特異的なV遺伝子領域のクローニング
幾つかのポジティブ・クローンが、JHおよびJκプローブをそれぞれ用いて、各ライブラリーからおよそ106個のプラークをスクリーニングした後に、HおよびL鎖ライブラリーから分離された。プラーク精製に続いて、バクテリオファージDNAが、各ポジティブ・クローンのために分離され、EcoRI(H鎖クローン)あるいはHindIII(L鎖クローン)で切断され、1%アガロースゲルにおいて分画された。DNAは、ニトロセルロースに移され、ブロットはJHあるいはJκプローブでハイブリッド化された。
クローンされたDNAのノーザン分析
A2ハイブリドーマからの標準のH鎖およびL鎖V領域に相当する、クローンされたDNAは、A2mRNAにハイブリッド化することが予想される。H鎖あるいはL鎖の遺伝的な位置での機能をもたないDNAの再編成は、当然発現されない。
発現ベクターの構築
上述の推測上のL鎖(クローン4.3)およびH鎖V遺伝子は、発現ベクター中においてヒトκ(原文;human kappa)およびγ1定常領域遺伝子(原文;gammal constant region)に連結された。A2からの推測上のVH領域遺伝子に相当する7.5kbのEcoRIフラグメントは、pA2HGlapgptと呼ばれるプラスミドを生ずる、ヒトCγ1遺伝子(原文;human Cgammal gene)およびEcogpt遺伝子を含む発現ベクター中にクローンされた(図8参照)。
キメラ抗体遺伝子の発現
キメラH鎖およびL鎖遺伝子を発現させるため、発現プラスミドは、非生産性マウスミエローマ(骨髄腫)細胞系であるSP2/0中にトランスフェクトされた。トランスフェクトされるプラスミドDNAは、エチジウムブロマイド/セシウムクロライド・グラジュエント中での2回の平衡遠心によって精製された。プラスミドDNA(10〜50μg)が、ハンク塩(原文;Hank's salts)を含有する培地中の107個のSP2/0細胞に添加され、この混合物は、バイオラッド社製のエレクトロポレーション装置中に配置された。96穴マイクロプレート中に細胞がプレートされた後、エレクトロポレーションが20Vで行われた。
抗TNFキメラ抗体の特異性
cA2のドメインと結合する抗体はネズミA2に由来するので、これらのモノクローナル抗体は、TNFにおける同じ結合部位に拮抗(競合)することが予想される。rhTNF(大日本、大阪、日本)で被覆された96穴マイクロプレート中で、固定された濃度のキメラA2およびネズミmAb A2が、増加する濃度のネズミキメラA2の拮抗(競合)体で、それぞれインキュベートされた。抗ヒト免疫グロブリンと結合したアルカリ・ホスホターゼおよび抗マウス免疫グロブリン第ニ抗体が、それぞれ、ネズミキメラA2の結合のレベルを検出するのに用いられた。TNF抗原に対する交叉競合が、この固層ELISAフォーマットにおいて観察された(図9)。この発見は、cA2およびネズミA2の予想される同一のエピトープ特異性と矛盾していない。
キメラ抗TNF抗体の生体外(原文;in vitro)活性と中和能力
ネズミキメラ抗TNF−α抗体すなわちA2およびcA2の両抗体が、有効なTNF阻害および/または中和活性を有することが示された。前述の細胞障害性分析において、ネズミ A2は、約125ng/mlの濃度で、40pg/ml濃度のrhTNFαの生物学的活性を完全に阻害または中和した。二つの独立した系で阻害および/または中和能を調べた結果、50%阻害投与量(ID50)は、15.9±1.01および17.9±1.6ng/ml(平均値±標準誤差)と測定された。よって、mAb A2は約17ng/mlのID50値を有する。
表1に示す結果は、cA2がTNF添加で一晩培養された細胞のIL−6の分泌を阻害するのに有効であることを示している。TNFに誘導されるIL−6の分泌は、mabの非存在下または他の抗原に特異的なコントロールmAbの存在下においては、阻害を受けなかった。
cA2抗体の生体内(原文;in vivo)活性と機能
cA2の種交叉反応性が高度に制限的であるので、人間やチンパンジー以外の動物の生体内での(原文;in vivo)この抗体の機能を調べるための試験は厳しい制約を受ける。それでもなお、cA2の生体外での(原文;in vitro)強い阻害および/または中和作用が生体内(原文;in vivo)においても発現されるという証明が望まれていた。過去の動物実験は、実験動物へのTNFの投与は、グラム陰性細菌の感染またはエンドトキシンの直接的投与により呈される病理学的状態に類似することを示した(Tracey,K.J.et al.,1986.前出;Tracey,K.J.et al.,1987,前出;Lehmann,V.et al.,前出)。
これに対し、cA2による処理は、致死率を0.4mg/kgの抗体を投与した場合には0〜30%に、20mg/kgsの場合に0〜10%に低下させた。これらの結果を表3にまとめて記載したが、この結果は、in vitroと同様に生体内での(原文;in vivo)においても、cA2がTNFの生物学的活性を阻害および/または中和する作用を有することが示された。
cA2により認識されるヒトTNF−αのアミノ酸配列(抗原決定基)の決定
試 薬 下記の市販の試薬は容易に入手可能である。FMOC−L−Ala−OPfp、FMOC−L−Cys(Trt)−OPfp、FMOC−L−Asp(OtBu)−OPfp、FMOC−L−Glu(OtBu)−OPfp、FMOC−L−Phe−OPfp、FMOC−Gly−OPfp、FMOC−L−His(Boc)−OPfp、FMOC−L−Ile−OPfp、FMOC−L−Lys(Boc)−OPfp、FMOC−L−Leu−OPfp、FMOC−L−Asn−OPfp、FMOC−L−Pro−OPfp、FMOC−L−Gln−OPfp、FMOC−L−Arg(Mtr)−OPfp、FMOC−L−Ser(tBu)−ODhbt、FMOC−L−Thr(tBu)−ODhbt、FMOC−L−Val−OPfp、FMOC−L−Trp−OPfp、FMOC−L−Try(tBu)−OPfp、および1−ヒドロキシベノトリアゾール(HOBT)をケンブリッジ リサーチ バイオケミカルズより入手した。ビペリジン(原文;piperidine)はアプライド バイオシステム社より入手した。1−メチル−2−ピロリジノン(NMP)をEM サイエンスより入手した。以下、メタノールをJT ベーカーより、無水酢酸をアプライド バイオシステムズ社より、トリフルオロ酢酸(TFA)をアプライド バイオシステムズ社より、ジイソプロピルアミン(DIEA)、トリエチルアミン、ジチオスレイトール(DTT)およびアニソールをアルドリッチ社より、塩酸(HCl)をJT ベーカー社よりそれぞれ入手した。
ヒトTNFαの全アミノ酸配列に渡る、二つ毎のアミノ酸より開始し、オーバーラップする、デカペプチドがポリエチレン ピン上にGysenの方法を用いて合成された(Gysen et al.,Peptides:Chemistry and biological, アメリカン ペプチド シンポジウム文書,p.519〜523,Ed、G.R.Marshall,Escom,Leidn,1988)。アセチル化N−末端を有するペプチドのピン群と、遊離のN−末端を有するペプチドのピン群がそれぞれ調製された。以下に示すように、ヒトTNF−αのエピトープを構成するアミノ酸配列を決定するため、これらペプチドピンの両群が、抗TNF mAB cA2含有溶液中にインキュベートされた。
図14Aに、それら全部でヒトTNF−αの全配列を網羅する、オーバーラップしているデカペプチドのそれぞれについて、結合試験の結果を示した。O.D.は直接cA2の結合の増加と相関する。図14Bは、TNF−αの存在下における同一のペプチドピン群に対するcA2の結合を調べた結果である。この競合的結合試験により、cA2に対し非特異的に結合するペプチドが示された。
図15は、TNF中に存在するこれらの非隣接の配列を示したものである。これらの配列の空間配置図を図16Bに示し、同時にTNF単量体の空間配置図を16Aに示した。
cA2によって認識されるこれらのペプチド配列を同定によって、本発明の態様に類似する結合特性および治療上の利用性を有する他のモノクローナル抗体の調製に必要な情報が得られた。
1)前記アミノ酸誘導体および前記HOBTの前記合成スケジュールにおける必要量が秤量された。
2)前記HOBTの前記合成スケジュールによる適当量がNMPに溶解された。
3)前記アミノ酸誘導体が適量のHOBT溶液に溶解され、次いでピペットによりその150μlが合成スケジュールのウェル位置表(原文;Sheet)の示す適切なウェルに注入された。
4)ピンを有するブロックが前記ウェル中に入れられ、この「サンドイッチ」ユニットはプラスチック製容器中で、18時間30℃の湯浴中に保持された。
5)ピンがウェルより取り出され、NMPにより1回(5分間)、メタノールにより3回(2分間)洗浄された後、10分間空気中で乾燥された。
6)ピンが前記と同様に脱保護され、さらに、この操作が繰り返された。
試 薬:ディスラプション バッファー:リン酸二水素ナトリウム(31.2g,シグマ社(原文;Sigma)cat#S−0751または同等物)およびドデシル硫酸ナトリウム(20.0g,シグマ社 cat#L−3771または同等物)を2.0LのミリQ(原文;milliQ)水に溶解した。次いで、50% w/w 水酸化ナトリウム(VWR社 cat # VW6730−3または同等物)によりpHを7.2±0.1に調整した。
鶏卵アルブミン(10.0g,シグマ社 cat#A−5503または同等物)および牛血清アルブミン(10.0g,シグマ社 cat#L−3294または同等物)を室温下で緩やかに撹拌しながら溶解した。この溶液を濾過し、濾過液に、ツウィーン(原文;Tween)20(2.0ml シグマ社 cat#13.79または同等物)を添加した。さらに40分間室温にて緩やかに撹拌し、濾過した後、40℃に保存した。
TNFペプチドフラグメントを使用したネズミの抗ヒトTNFモノクローナル抗体の作製
TNF(SEQ ID NO:1により示される)における上述の非隣接の配列59−80、87−108中、または両配列59−80、87−108中に存在する少なくとも5アミノ酸残基である抗TNFエピトープを含有するE.coli由来組換えヒトTNF(rhTNF)フラグメントの精製品40μgを、等量の完全フロイント・アジュバンド(ディフコ・ラボラトリーズ社から入手)により乳化し、0.4mlとしたものが、実施例Iにおけるのと同様に、BALB/c雌ネズミの皮下および腹腔に注射された。一週間後、不完全フロイント・アジュバンド中の前記rhTNFフラグメント5μgが腹腔に追加免疫として注射され、次いで、TNF(SEQ ID NO:1により示される)における配列59−80、87−108中、または両配列59−80、87−108中にのアミノ酸残基を有する抗TNFエピトープを含有するTNFフラグメントが、アジュバントなしで、4回連続して腹腔注射された。最後の注射から8週間後に、ネズミはTNF10μgにより追加免疫された。
TNFペプチドを用いたネズミとのキメラ抗体、そのフラグメントおよび領域の作製
ネズミとのキメラ抗体、そのフラグメントおよび領域が、実施例XIVで得られたネズミ抗体の可変領域とヒト定常領域とのキメラ発現媒体を構築することによって、前記実施例4〜9に示した方法によって作製された。
キメラ抗TNF抗体のin vitroの活性と中和活性
例えば、阻害作用が50%阻害投与量として表わされるTNF細胞障害作用のアッセイにおいて、実施例XIVと実施例XVにおいて得られたネズミ抗体およびキメラ抗TNF抗体のいづれも、阻害および/または中和活性を有することが確認された。
TNFの細胞障害アッセイにおいて、予想通り、実施例XIVと実施例XVにおいて得られた本発明のネズミ抗体およびキメラ抗TNF抗体は、共に投与量に応じた、ノーマルおよびrhTNFの活性の阻害または中和活性を示した。このような、抗体濃度1μg/ml以下での阻害および/または中和能は抗体を投与された患者の血液中でも容易に達成することができる。従って、このような抗TNF抗体、特にキメラ抗体は、その高い阻害および/または中和能によって、TNFによってもたらされる病気や病理学的状態の治療に好適である。
培養ヒト二倍体FS−4繊維牙細胞を用いて、cA2のTNFによるIL−6の分泌の阻害または中和能を評価した。望ましい結果は、実施例XIVと実施例XVにおいて得られたネズミ抗体およびキメラ抗TNF抗体が共に、TNFの存在下に一晩培養した細胞においてIL−6の産生の阻害活性を示すという結果である。TNFによって誘導されるIL−6の産生は、mABの非存在下または他の抗原に対するコントロールmABの存在下においては阻害されなかった。
そのため、実施例XIVと実施例XVにおいて得られたネズミ抗体およびキメラ抗TNF抗体について、TNFに誘導される、培養ヒトさい帯の、動脈内皮細胞(HUVEC)の活性を阻害するか否かが評価された。未処理のHUVEC細胞を、抗体の存在下および非存在下においてTNFに4時間接触させた後、細胞溶解産物(原文;lysate)をヒト結漿(原文;plasma)凝固分析(原文;clotting assey)することにより、TNFのプロ凝固活性への刺激性が調べられた。予想される結果は、TNFがHUVECのプロ凝固活性に対しの正の制御を示すことである。本発明の実施例XIVと実施例XVにおいて得られたネズミ抗体およびキメラ抗TNF抗体は、TNFの活性を投与量に応じて阻害または中和することが予想される。
生体内での(原文;in vivo)におけるcA2抗体の活性および効力
実施例XIVと実施例XVにおいて得た本発明のネズミ抗体またはキメラ抗TNF抗体が生体内での(原文;in vivo)においてTNFの阻害または中和作用を有するか否かを調べるために、ガラクトサミンで感作したネズミに致死量のヒトTNFを投与する生体内での(原文;in vivo)実験系が採用された。
5μg(0.25mg/kg)のrhTNFを腹腔投与された結果、未処理のコントロール用動物および投与後15〜30分後に生理食塩水または2mg/kgのコントロール用抗体(キメラIgG1;ネズミ7E3抗血小板(原文;p1atelet)mAB由来)が静脈注射(i.v.)により投与された場合には80〜90%の致死率であった。
これに対し、実施例XIVと実施例XVにおいて得た本発明のネズミ抗体およびキメラ抗TNF抗体で処理されたものは、致死率が、0.4mg/kgの抗体を投与した群は0〜30%に、20mg/kgsの群は0〜10%に低下することが予想される。この予想の結果によって、実施例XIVと実施例XVにおいて得られた本発明のネズミ抗体およびキメラ抗TNFα抗体が生体外(原文;in vitro)のみならず生体内(原文;in vivo)においてもTNFの生物学的活性を阻害および/または中和する効力を有することを示されることになる。
cA2抗体の臨床的活性および効力
抗ヒトTNFのキメラIgG1モノクローナル抗体cA2が健康な男性ボランティアに投与された。NIH標準エンドトキシン4ng/kgの投与の一時間後に、ボランティアに、コントロールとしての生理食塩水または0.01,0.10または10mg/kgのcA2が製剤の形態で投与された。血清中のTNF値が経時的に追跡された結果、TNF値の最高値はcA2の投与に応じた減少することが示され、cA2を10mg/kg投与したボランティアについてはTNFは検出されなかった。したがって、本発明の抗TNF抗体による処置は、人体中のTNFによってもたらされる作用を阻害することが予想される。
本願における用語の選択および用語の定義は記述上の便宜のためのものでありこれらに制限されるものではない。
1. ヒトの腫瘍壊死因子α(TNFα)に対する高親和性マウスモノクローナル抗体であって、(a)抗体A2のTNFとの結合を競合的に阻害し、(b)ヒトTNFαの中和性エピトープに結合する抗体。
2. 請求項1に記載のマウスモノクローナル抗体であって、検出可能にラベルされているもの。
3. ヒトの免疫グロブリンの不変領域の少なくとも一部と、ヒトのTNFαに特異性を有するヒト以外の免疫グロブリンの可変部分の少なくとも一部を含むキメラ免疫グロブリン鎖。
4. 請求項3に記載のキメラ免疫グロブリン鎖であって、H鎖とL鎖を有するもの。
5. 請求項3に記載のキメラ免疫グロブリン鎖であって、不変領域がヒト起源のものであるもの。
6. 2個のL鎖と2個のH鎖を有し、そのおのおのが不変領域の少なくとも一部と可変領域の少なくとも一部からなり、可変領域がヒトTNFαに対して特異性を有し、生体内で、ヒトTNFαの中和作用を有するエピトームに高い親和性をもって結合するキメラ抗体分子。
7. 請求項6に記載のキメラ抗体であって、TNFβに結合しないもの。
8. 請求項6に記載のキメラ抗体であって、可変領域および不変領域がマウス起源であるもの。
9. 請求項6に記載のキメラ抗体であって、その可変領域がヒトTNFαの中和作用を有するエピトープに結合する高親和性マウスモノクローナル抗体から誘導されるもの。
10. 請求項9に記載のキメラ抗体であって、該マウスモノクローナル抗体がA2またはcA2のTNFαに対する結合を競合的に阻害するするもの。
11. 請求項9に記載のキメラ抗体であって、該マウスモノクローナル抗体がA2であるもの。
12. 請求項6に記載のキメラ抗体であって、会合定数(Ka)で示される親和性が少なくとも1x108l/molであるもの。
13. 請求項6に記載のキメラ抗体であって、会合定数(Ka)で示される親和性が少なくとも1x109l/molであるもの。
14. 請求項6に記載のキメラ抗体であって、少なくとも1μg/mlで、ID50でヒトTNFαを中和するもの。
15. 請求項6に記載のキメラ抗体であって、少なくとも100ng/mlで、ID50でヒトTNFαを中和するもの。
16. 請求項6に記載のキメラ抗体であって、少なくとも15ng/mlで、ID50でヒトTNFαを中和するもの。
17. 請求項6に記載のキメラ抗体であって、検出可能にラベルされているもの。
18. 請求項1に記載のモノクローナル抗体であって、ハイブリドーマにより、または組換えにより産生される検出可能にラベルされたもの。
19. 請求項1に記載のモノクローナル抗体であって、hTNFαの残基87−108、または59−80および87−108の両者と結合する抗原結合領域を有するもの。
20. 請求項1に記載のモノクローナル抗体であって、それ自身、そのフラグメント、または領域がSEQ ID NO:1のhTNFαのアミノ酸11−13、37−42、49−57または155−157に含まれる1個以上のエピトープに結合しないもの。
21. (a)モノクローナル抗体A2のマウスモノクローナル抗体、または
(b)モノクローナル抗体cA2のマウス/ヒトーキメラモノクローナル抗体に相当する抗TNF結合領域またはそのフラグメントを有する抗TNF抗体。
22. SEQ ID NO:1のアミノ酸残基87−108または59−80および87−108の両者からなる群から選ばれる少なくとも5個のアミノ酸からなるTNFペプチドであって、TNFのTNFレセプターへの結合を実質的に阻害するように、レセプター結合配列と結合することによる抗TNF生物学的活性を有する抗TNF抗体のエピトープを有するTNFポリペプチド。
23. 請求項22に記載のTNFポリペプチドであって、実質的に、
SED ID NO:1のアミノ酸59−80 としてのTyr−Ser−Gln−Val−Leu−Phe−Lys−Gly−Gln−Gly−Cys−Pro−Ser−Thr−His−Val−Leu−Leu−Thr−His−Thr−Ire; および
SED ID NO:1のアミノ酸87−108としてTyr−Gln−Thr−Lys−Val−Asn−Leu−Leu−Ser−Ala−Ile−Lys−Ser−Pro−Cys−Gln−Arg−Glu−Thr−Pro−Glu−Glyの少なくとも一つの配列の3ないし22個のアミノ酸からなるTNFポリペプチド。
24. 請求項1に記載の抗体もしくはそのフラグメント、領域部分、またはその薬学的に許容されエステル、エーテル、硫酸塩、炭酸塩、グルクロン化物もしくはその塩、および薬学的に許容される担体からなる薬学的組成物。
25. 単離TNFポリヌクレオチドであって、請求項6に記載の抗体をコードするヌクレオチド配列からなり、該ヌクレオチド配列が、少なくとも一つの不変領域との作動連関(連鎖)において少なくとも一つの不変領域をコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド。
26. 請求項25に記載のポリヌクレオチドであって、ゲノムDNA配列またはcDNA配列から選ばれるヌクレオチド配列を有するもの。
27. 請求項25に記載のポリヌクレオチドであって、それ自身が発現担体であるもの。
28. 請求項25に記載のポリヌクレオチドで転換され、またはトランスフェクトされた宿主。
29. 請求項28に記載の宿主であって、真核細胞または細菌細胞であるもの。
30. 請求項29に記載の宿主であって、哺乳類の細胞であるもの。
31. 請求項6に記載の抗体またはそのフラグメント、領域部分の製法であって、
(a)請求項28に記載の宿主を抗体が回収可能の量で発現するように培養し、
(b)該抗体、またはそのフラグメント、領域部分を宿主または培養物から回収することからなる製法。
32. TNFαによって仲介される疾患を有する患者の治療法であって、患者に請求項24に記載の薬学的組成物の治療量を投与することからなる治療法。
33. TNFαによって仲介される疾患を有する患者の治療法であって、患者に請求項42に記載の薬学的組成物の治療量を投与することからなる治療法。
34. 試料からTNFαもしくはそのフラグメントまたは該TNFαを含む免疫複合体から該TNFαを除去するための、
(a)該試料を、請求項1に記載の抗体またはそのフラグメント、領域部分であって、該TNFα、その部分または免疫複合体が固定された抗体、フラグメント、または領域部分が可逆的に結合して、結合したTNFα、その部分または免疫複合体を生成するように支持体に結合されたもの、を含む手段と接触させ、
(b)該結合抗体、フラグメント、または領域部分から、結合したTNFα、その部分、または免疫複合体を回収することからなる方法。
35. 試料からTNFαもしくはそのフラグメントまたは該TNFαを含む免疫複合体から該TNFαを除去するための、
(a)該試料を、請求項6に記載の抗体またはそのフラグメント、領域部分であって、該TNFα、その部分または免疫複合体が固定された抗体、フラグメント、または領域部分に可逆的に結合して、結合したTNFα、その部分または免疫複合体を生成するように支持体に結合されたもの、を含む装置と接触させ、
(b)該結合抗体、フラグメント、または領域部分から、結合したTNFα、その部分、または免疫複合体を回収することからなる方法。
36. 体液中の高レベルのTNFαに関係する疾患または症状を有することを疑われている患者を治療するための、
(a)請求項34に記載の方法によって、該体液から該TNFαを除去し、
(b)該体液を患者に戻すことからなる方法。
37. 体液中の高レベルのTNFαに関係する疾患または症状を有することを疑われている患者を治療するための、
(a)請求項35に記載の方法によって、該体液から該TNFαを除去し、
(b)該体液を患者に戻すことからなる方法。
38. 試料中のヒトのTNFα検出する免疫検定方法であって、
(a)該試料を請求項1に記載の抗体、またはそのフラグメント、領域部分と接触させ、
(b)抗体と該TNFαの結合を検出することからなる方法。
39. 試料中のヒトのTNFα検出する免疫検定方法であって、
(a)該試料を請求項6に記載の抗体、またはそのフラグメント、領域部分と接触させ、
(b)抗体と該TNFαの結合を検出することからなる方法。
40. 請求項32に記載の患者の治療方法であって、該疾患が敗血症症侯群、悪液質、循環虚脱、急性および慢性の細菌感染、ウィルス感染、真菌感染によるショック、紅斑性狼蒼、リウマチ性関節炎、アルコール誘発性肝炎、慢性炎症性疾患、脈管炎症性疾患、GVH疾患、カイサキ病、および悪性疾患の一つである方法。
41. 請求項33に記載の患者の治療方法であって、該疾患が敗血症症侯群、悪液質、循環虚脱、急性および慢性の細菌感染、ウィルス感染、真菌感染によるショック、紅斑性狼蒼、リウマチ性関節炎、アルコール誘発性肝炎、慢性炎症性疾患、脈管炎症性疾患、GVH疾患、カイサキ病、および悪性疾患の一つである方法。
42. 請求項6に記載の抗体、もしくはそのフラグメント、領域部分、またはその薬学的に許容されるエステル、エーテル、硫酸塩、炭酸塩、グルコン化物もしくはその塩と、薬学的に許容できる担体からなる薬学的組成物。
Claims (7)
- マウス抗腫瘍壊死因子α(TNFα)モノクローナル抗体A2の非ヒト免疫グロブリンの可変領域およびヒト免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含むキメラ抗TNFαモノクローナル抗体であって、
親和定数(Ka)として測定される少なくとも1×108 L/molの親和性でTNFαに結合し;かつ、オーバーラップする複数のTNFフラグメントのペプチドピンを合成することを含むエピトープマッピング法により決定されるSEQ ID NO: 1の59−80位および87−108位のアミノ酸残基内のヒトTNFαのエピトープでTNFαに結合する、前記キメラ抗TNFαモノクローナル抗体。 - 以下のステップ(a)および(b)を含む、キメラ抗腫瘍壊死因子α(TNFα)モノクローナル抗体cA2の製造方法:
(a) (i) 親和定数(Ka)として測定される少なくとも1×108 L/molの親和性でTNFαに結合し、かつ (ii) オーバーラップする複数のTNFフラグメントのペプチドピンを合成することを含むエピトープマッピング法により決定されるSEQ ID NO: 1の59−80位および87−108位のアミノ酸残基内のヒトTNFαのエピトープでTNFαに結合する、マウス抗TNFαモノクローナル抗体A2を調製するステップ、および
(b) ステップ(a)で調製される前記マウス抗TNFαモノクローナル抗体A2をキメラ化して、ヒト免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部およびA2の非ヒト免疫グロブリンの可変領域を含む、キメラ抗TNFαモノクローナル抗体cA2を製造するステップ。 - 請求項2記載の方法により製造されるキメラ抗TNFαモノクローナル抗体cA2。
- 請求項2記載の方法により製造されるキメラ抗TNFαモノクローナル抗体cA2であって、エピトープマッピング法が二アミノ酸毎にオーバーラップする複数のヒトTNFαデカペプチドポリエチレンピンの合成を含むものである、前記抗体。
- 請求項2記載の方法により製造されるキメラ抗TNFαモノクローナル抗体cA2であって、エピトープマッピング法が二アミノ酸毎にオーバーラップする複数のヒトTNFαドデカペプチドポリエチレンピンの合成を含むものである、前記抗体。
- 請求項2記載の方法により製造されるキメラ抗TNFαモノクローナル抗体cA2であって、前記ヒト免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部がヒトIgG1の定常領域の少なくとも一部である、前記抗体。
- 請求項2記載の方法により製造されるキメラ抗TNFαモノクローナル抗体cA2であって、(i) ヒトTNFαおよびチンパンジーTNFαの細胞障害作用を中和または阻害し;(ii) ヒヒ、カニクイザルおよびアカゲザルにより産生されるTNFαまたはヒトTNFβの細胞障害作用を阻害せず;かつ(iii) (a) TNFα誘導IL-6分泌;(b) TNFにより誘導される内皮細胞のプロ凝固活性の活性化および内皮細胞における接着分子の発現;および(c) TNFにより誘導されるELAM-1の表面発現、を中和する、前記抗体。
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