DE69231828T2 - Für menschlichen tumornekrose-faktor spezifische monoklonale und chimäre antikörper - Google Patents

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Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung aus dem Bereich Immunologie und Medizin betrifft Antikörper, die spezifisch gegen menschlichen Tumornekrosefaktor-alpha (hTNFα) gerichtet sind; Fragmente, Regionen und Derivate davon; und pharmazeutische und diagnostische Zusammensetzungen sowie deren Herstellung und diagnostische und therapeutische Verwendung. Die Erfindung betrifft weiterhin Nukleotidsequenzen, die solche Antikörper kodieren, Fragmente und Regionen, ebenso wie Vektoren und Wirte, die solche Sequenzen enthalten, und Methoden davon.
  • Beschreibung des Stands der Technik
  • Das als Tumornekrosefaktor-α (TNFα; auch als Kachexin bezeichnet) bekannte Zytokin ist ein Protein, das als ein lösliches Homotrimer aus Proteinuntereinheiten von 17 kD hauptsächlich durch Monozyten und Makrophagen als Antwort auf Endotoxin oder andere Stimuli sezerniert wird (Smith, R.A. et al., J. Biol. Chem. 262:6951-6954 (1987)). Eine membrangebundene 26 kD-Vorläuferform von TNF wurde ebenfalls beschrieben (Kriegler, M. et al., Cell 53:45-53 (1988)). Siehe die Übersichtsarbeiten zu TNF von Beutler, B. et al., Nature 320:584 (1986), Old, L.J., Science 230:630 (1986) und Le, J. et al., Lab. Invest. 56:234 (1987). TNF wurde ursprünglich im Serum von Tieren entdeckt, denen in regelmäßiger Folge ein bakterieller Impfstoff (Bacillus Calmette-Guerin, BCG) und Endotoxin injiziert wurde (Carswell, E.A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72:3666 (1975)).
  • Die Expression des TNF-α kodierenden Gens ist nicht auf Zellen der Monozyten/Makrophagen-Familie beschränkt. Für mehrere menschliche, nicht-monozytische Tumorzellinien wurde die Produktion von TNF gezeigt (Rubin, B.Y. et al., J. Exp. Med. 164:1350 (1986); Spriggs, D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:6563 (1987)). TNF wird ebenfalls durch CD4+ und CD8+ periphere Blut-T-Lymphozyten und durch verschiedene, in Kultur gehaltene T- und B-Zellinien produziert (Cuturi, M.C., et al., J. Exp. Med. 165:1581 (1987); Sung, S.-S.J. et al., J. Exp. Med. 168:1539 (1988)).
  • Eine zunehmende Anzahl von Hinweisen deutet darauf hin, daß TNF ein regulatorisches Zytokin mit pleiotropen biologischen Aktivitäten ist. Diese Aktivitäten umfassen: Hemmung der Lipoproteinlipase-Synthese („Kachexin"-Aktivität) (Beutler, B. et al., Nature 316:552 (1985)), Aktivierung polymorphkerniger Leukozyten (Klebanoff, S.J. et al., J. Immunol. 136:4220 (1986); Perussia, B., et al., J. Immunol. 138:765 (1987)), Hemmung des Zellwachstums oder Stimulation des Zellwachstums (Vilcek, J. et al., J. Exp. Med. 163:632 (1986); Sugarman, B.J. et al., Science 230:943 (1985); Lachman, L.B. et al., J. Immunol. 138:2913 (1987)), zytotoxische Wirkung gegenüber bestimmten transformierten Zelltypen (Lachman, L.B. et al., supra; Darzynkiewicz, Z. et al., Canc. Res. 44:83 (1984)), antivirale Aktivität (Kohase, M. et al., Cell 45:659 (1986); Wong, G.H.W. et al., Nature 323:819 (1986)), Stimulation der Knochenresorption (Bertolini, D.R. et al., Nature 319:516 (1986); Saklatvala, J., Nature 322:547 (1986), Stimulation von Kollagenase- und Prostaglandin E2-Produktion (Dayer, J.-M. et al., J. Exp. Med. 162:2163 (1985)); und immunregulatorische Wirkungen, einschließlich Aktivierung von T-Zellen (Yokata, S. et al., J. Immunol 140:531 (1988)), B-Zellen (Kehrl, J.H. et al., J. Exp. Med. 166:786 (1987)), Monozyten (Philip, R. et al., Nature 323:86 (1986)), Thymozyten (Ranges, G.E. et al., J. Exp. Med. 167:1472 (1988)) sowie Stimulation der Zelloberflächenexpression von Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) Klasse I und Klasse II Molekülen (Collins, T. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:446 (1986); Pujol-Borrell, R. et al., Nature 326:304 (1987)).
  • TNF ist bekannt für seine pro-inflammatorischen Wirkungen, die zu einer Zerstörung von Gewebe führen, zu denen etwa die Induktion von prokoagulatorischer Aktivität bei Gefäßendothelzellen (Pober, J.S. et al., J. Immunol. 136:1680 (1986)), vermehrte Adhärenz von Neutrophilen und Lymphozyten (Pober, J.S. et al., J. Immunol. 138:3319 (1987)) sowie Stimulation der Freisetzung von Plättchen-aktivierendem Faktor aus Makrophagen, Neutrophilen und Gefäßendothelzellen (Camussi, G. et al., J. Exp. Med. 166:1390 (1987)) gehören.
  • Jüngsten Hinweisen zufolge ist TNF an der Pathogenese vieler Infektionen (Cerami, A. et al., Immunol. Today 9:28 (1988)), immunologischer Störungen, des neoplastischen Krankheitsbildes, z.B. an Kachexie, die einige maligne Erkrankungen begleitet (Oliff, A. et al., Cell 50:555 (1987)), und an Autoimmunerkrankungen und Graft-Versus-Host-Pathologie (Piguet, P.-F. et al., J. Exp. Med. 166:1280 (1987)) beteiligt. Der Zusammenhang zwischen TNF und Krebs sowie Infektionskrankheiten steht häufig mit dem Stoffwechselzustand des Wirts in Verbindung. Ein Hauptproblem bei Krebspatienten ist der Gewichtsverlust, der gewöhnlich mit Anorexie verbunden ist. Die beträchtliche Auszehrung, die daraus resultiert, ist als „Kachexie" bekannt (Kern, K.A. et al., J. Parent. Enter. Nutr. 12:286-298 (1988)). Kachexie beinhaltet beschleunigten Gewichtsverlust, Anorexie und ständiges Schwinden von Körpermasse als Antwort auf ein malignes Wachstum. Die fundamentale physiologische Entgleisung kann damit zusammenhängen, daß die Nahrungsaufnahme im Verhältnis zum Energieaufwand vermindert ist. Der Zustand der Kachexie ist deshalb mit einer signifikanten Morbidität verbunden und ist für die Mehrzahl der Sterbefälle bei Krebs verantwortlich. Eine Reihe von Studien haben nahegelegt, daß TNF ein wichtiger Mediator der Kachexie bei Krebs, Infektionskrankheiten und anderen katabolen Zuständen ist.
  • Es wird angenommen, daß TNF eine zentrale Rolle bei den pathophysiologischen Folgen von Gram-negativer Sepsis und Endotoxinschock (Michie, H.R. et al., Br. J. Sura. 76:670-671 (1989)); Debets, J.M.H. et al., Second Vienna Shock Forum, S. 463-466 (1989); Simpson, S.Q. et al., Crit. Care Clin. 5:27-47 (1989)), einschließlich Fieber, Unwohlsein, Anorexie und Kachexie spielt. Endotoxin ist ein wirksamer Aktivator von Monozyten/Makrophagen, der die Produktion und Sekretion von TNF (Kornbluth, S.K. et al., J. Immunol. 137:2585-2591 (1986)) und anderen Zytokinen stimuliert. Daraus, daß TNF viele biologische Effekte von Endotoxin nachahmen konnte, wurde gefolgert, daß es sich um einen zentralen Mediator handelt, der für das klinische Bild von Krankheiten, die mit Endotoxin im Zusammenhang stehen, verantwortlich ist. TNF und andere, aus Monozyten stammende Zytokine vermitteln die metabolen und neurohormonalen Antworten auf Endotoxin (Michie, H.R. et al. N. Eng. J. Med. 318:1481-1486 (1988)). Die Verabreichung von Endotoxin an Freiwillige verursacht akute Krankheitserscheinungen mit erkältungsartigen Symptomen einschließlich Fieber, Tachykardie, erhöhter Stoffwechselrate und Streßhormon-Ausschüttung (Revhaug, A. et al., Arch. Surg. 123:162-170 (1988)). Auch bei Patienten, die an Gram-negativer Sepsis leiden, wurden erhöhte Spiegel an zirkulierendem TNF gefunden (Waage, A. et al., Lancet 1:355-357 (1987); Hammerle, A.F. et al., Second Vienna Shock Forum S. 715-718 (1989); Debets, J.M.H. et al., Crit. Care Med. 17:489-497 (1989); Calandra, T. et al., J. Infec. Dis. 161:982-987 (1990)). Die Behandlung von Krebspatienten mit TNF (aufgrund seiner tumoriziden Wirkung) zeigte, daß Dosen über 545 μg/m2/24 h Veränderungen verursachten, die denen ähnlich waren, die durch Injektion von Endotoxin (4 ng/kg) bei gesunden Menschen hervorgerufen wurden (Michie, H.R. et al., Surgery 104:280-286 (1988)), was die Rolle von TNF als dem hauptsächlichen Mediator von septischen und endotoxinämischen Antworten eines Wirts unterstreicht. Chronische intravenöse TNF-Infusion bei Menschen oder Ratten wurde von Anorexie, Flüssigkeitsretention, Akutphaseantworten und negativer Stickstoffbilanz (d.h. klassichen katabolen Effekten) begleitet, was zu der Schlußfolgerung führte, daß TNF für viele der Veränderungen verantwortlich sein könnte, die im Verlauf kritischer Krankheiten bemerkt werden (Michie, H.R. et al., Ann. Surg. 209:19-24 (1989)).
  • Passive Immuntherapie, die auf eine Neutralisierung von TNF abzielt, könnte einen günstigen Effekt bei Gram-negativer Sepsis und Endotoxinämie haben, basierend auf der gesteigerten TNF-Produktion und den erhöhten TNF-Spiegeln bei diesen pathologischen Zuständen, wie oben diskutiert.
  • Antikörper gegen ein „Modulator"-Material, das als Kachexin charakterisiert wurde (und sich später als mit TNF identisch erwies), wurden durch Cerami et al. offenbart (EPO Patentpublikation Nr. 0212489, 4. März 1987). Solche Antikörper wurden als nützlich für diagnostische Immuntests und zur Therapie von Schock bei bakteriellen Infektionen beschrieben. Rubin et al. (EPO Patentpublikation 0218868, 22. April 1987) offenbarte monoklonale Antikörper (mAbs) gegen menschlichen TNF, die Hybridomzellen, die solche Antikörper sezernieren, Methoden zur Herstellung solcher Antikörper und die Anwendung solcher Antikörper im Immuntest auf TNF. Yone et al. (EPO Patentpublikation 0288088, 26. Oktober 1988) offenbarte anti-TNF-Antikörper, einschließlich mAbs, und deren Nutzen bei der Diagnose von Erkrankungen, insbesondere Kawasaki-Syndrom und bakterielle Infektion, mittels Immuntest. Für Körperflüssigkeiten von Patienten mit Kawasaki-Syndrom (infantiles akutes febriles mukokutanes Lymphknotensyndrom; Kawasaki, T., Allergy 16:178 (1967); Kawasaki, T., Shonica (Pediatrics) 26:935 (1985)) wurden erhöhte TNF-Spiegel beschrieben, die mit dem Verlauf der Erkrankung einhergingen (Yone et al., supra).
  • Andere Forscher haben spezifische mAbs gegen rekombinanten menschlichen TNF beschrieben, die in vitro neutralisierende Aktivität aufwiesen (Liang, C-M. et al.. Biochem. Biophys. Res. Comm. 137:847-854 (1986); Meager, A. et al., Hybridoma 6:305-311 (1987); Fendly et al., Hybridoma 6:359-369 (1987); Bringman, T.S. et al., Hybridoma 6:489-507 (1987); Hirai, M. et al., J. Immunol. Meth. 96:57-62 (1987); Moller, A. et al., Cytokine 2:162-169 (1990)). Einige dieser mAbs wurden verwendet, um Epitope des menschlichen TNF zu kartieren und Enzym-Immuntests zu entwickeln (Fendly et al., supra; Hirai et al., supra; Moller et al., supra), und um die Reinigung von rekombinantem TNF zu unterstützen (Bringman et al., supra). Diese Studien stellen jedoch keine Grundlage bereit, um TNF-neutralisierende Antikörper herzustellen, die zur Diagnose in vivo oder zu therapeutischen Zwecken beim Menschen angewendet werden können.
  • Der unmittelbarste Beitrag zur Anwendung einer anti-TNF-Immuntherapie ergibt sich aus in vivo-Protektionsstudien in anderen Tieren als dem Menschen. In anderen Säugetieren als dem Menschen wurde gezeigt, daß neutralisierende Antiseren oder mAbs gegen TNF nachteilige physiologische Veränderungen, die bei experimenteller Endotoxinämie und Bakteriämie auftreten, außer Kraft setzen und den Tod nach Verabreichung einer letaler Dosis verhindern. Dieser Effekt wurde z.B. in Letalitätstests an Nagetieren und in Krankheitsmodellsystemen bei Primaten gezeigt (Mathison, J.C. et al., J. Clin. Invest. 81:1925-1937 (1988); Beutler, B. et al., Science 299:869-871 (1985); Tracey, K.J. et al., Nature 330:662-664 (1987); Shimamoto, Y. et al., Immunol. Lett. 17:311-318 (1988); Silva, A.T. et al., J. Infect. Dis. 162:421-427 (1990); Opal, S.M. et al., J. Infect. Dis. 161:1148-1152 (1990); Hinshaw, L.B. et al., Circ. Shock 30:279-292 (1990)). Beispielsweise waren F(ab')2-Fragmente von neutralisierenden anti-TNF-mAbs in der Lage, bei Pavianen septischen Schock zu verhindern, der durch lebende E. coli hervorgerufen wurde (Tracey, K.J. et al., supra).
  • Putative Rezeptor-Bindungsstellen von hTNF wurden von Eck und Sprang (J. Biol. Chem. 264(29), 17595-17605 (1989) vorgestellt, die nachwiesen, daß der Rezeptor-Bindungslocus von TNF-α aus den Aminosäuren 11-13, 37-42, 49-57 und 155-157 besteht. Die PCT-Anmeldung WO91/02078 (Prioritätsdatum 7. August 1989) offenbart TNF-Liganden, die monoklonale Antikörper binden können, die folgenden Epitope aufweisen: Wenigstens eines aus 1-20, 56-77 und 108-127; wenigstens zwei aus 1-20, 56-77, 108-127 und 138-149; alle aus 1-18, 58-65, 115-125 und 138-149; alle aus 1-18 und 108-128; alle aus 56-79, 110-127 und 135- oder 136-155; alle aus 1-30, 117-128 und 141-153; alle aus 1-26, 117-128 und 141-153; alle aus 22-40, 49-96 oder -97, 110-127 und 136-153; alle aus 12-22, 36-45, 96-105 und 132-157; beide aus 1-20 und 76-90; alle aus 22-40, 69-97, 105-128 und 135-155; alle aus 22-31 und 146-157; alle aus 22-40 und 49-98; wenigstens eines aus 22-40, 49-98 und 69-97, beide aus 22-40 und 70-87.
  • Bis heute ist die Praxis mit anti-TNF-mAbs zur Therapie beim Menschen begrenzt. In einer Klinischen Studie Phase I wurde vierzehn Patienten mit schwerem septischem Schock ein neutralisierender Maus-anti-TNF-mAb in einer Einzeldosis von 0,4-10 mg/kg (Exley, A.R. et al., Lancet 335:1275-1277 (1990)) verabreicht. Sieben der vierzehn Patienten entwickelten allerdings eine Mensch-anti-Maus-Antikörperantwort auf die Behandlung hin, wobei die Behandlung durch die bekannten Probleme beeinträchtigt wurde, die auf der Immunogenität der, aus schwerer und leichter Kette bestehenden Abschnitte des Antikörpers der Maus beruhten. Aufgrund der gesteigerten Immunabwehr-Antwort in Patienten, denen aus diagnostischen oder therapeutischen Gründen Maus-anti-TNF-Antikörper verabreicht werden, vermindert eine derartige Immunogenität die Wirksamkeit bei fortgesetzter Verabreichung und kann die Behandlung ohne Wirkung bleiben lassen.
  • Die Verabreichung von TNF-mAbs der Maus an Patienten, die unter schwerer Graft-versushost-Pathologie leiden, wurde ebenfalls berichtet (Herve, P. et al., Lymphoma Res. 9:591 (1990)).
  • Dementsprechend gibt es einen Bedarf an neuen TNF-Antikörpern, die die Probleme der Immunogenität von Mäuseantikörpern überwinden und die für verminderte Immunogenität und gesteigerte Neutralisierungswirkung sorgen.
  • Gemäß dem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein chimäres Immunglobulinmolekül zur Verfügung gestellt, wobei das Immunglobulinmolekül aus einem chimären Antikörper, einer chimären Immunglobulinkette oder einem Antigen-bindenden Fragment oder einer Region daraus ausgewählt ist, wobei das Immunglobulinmolekül mindestens einen Teil einer konstanten Region eines menschlichen Immunglobulins und mindestens einen Teil einer variablen Region eines nicht-menschlichen Immunglobulins umfaßt, das Immunglobulinmolekül Spezifität für ein neutralisierendes Epitop des menschlichen Tumornekrosefaktors α (TNFα) aufweist und das Immunglobulinmolekül (i) die Zytotoxizität von menschlichem TNFα und Schimpansen-TNFα neutralisiert oder hemmt und (ii) die zytotoxische Aktivität von TNFα, produziert durch Pavian, Cynomolgus- und Rhesusaffe, oder die von menschlichem TNFβ nicht hemmt sowie (iii) folgendes neutralisiert: (a) eine TNF-induzierte IL-6-Sekretion; (b) eine TNF-Aktivierung von Prokoagulations- und Adhäsionsmolekül-Aktivitäten endothelialer Zellen; und (c) eine TNF-induzierte Oberflächenexpression von ELAM-1.
  • Gemäß dem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein chimäres Immunglobulinmolekül zur Verfügung gestellt, wobei das Immunglobulinmolekül aus einem chimären Antikörper, einer chimären Immunglobulinkette oder einem Antigen-bindenden Fragment oder einer Region daraus ausgewählt ist, wobei das Immunglobulinmolekül mindestens einen Teil einer konstanten Region eines menschlichen Immunglobulins und mindestens einem Teil einer variablen Region eines nicht-menschlichen Immunglobulins umfaßt, wobei das Immunglobulinmolekül Spezifität zu einem neutralisierenden Epitop des menschlichen Tumornekrosefaktors α (TNFα) aufweist und eine Antigen-bindende Region, welche an die Reste 87-108 oder sowohl 59-80 als auch 87-108 gemäß der SEQ ID No:1 von menschlichem TNFα bindet, was durch die Peptid-Pin-Synthesemethode nachgewiesen wurde, und welche folgendes neutralisiert: (a) TNF-induzierte IL-6-Sekretion; (b) TNF-Aktivierung von Prokoagulations und Adhäsionsmolekül-Aktivitäten endothelialer Zellen; und (c) TNF-induzierte Oberflächenexpression von ELAM-1.
  • Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung binden chimäre anti-TNF-Antikörper ein Epitop von hTNFα aus mindestens 5 Aminosäuren der Reste 87-108 oder sowohl der Reste 59-80 als auch 87-108 (aus SEQ ID No:1), nicht aber bekannte oder putative rezeptorbindende Bereiche von TNF, wie etwa die Aminosäuresequenzen 1-20, 11-13, 37-42, 49-57 oder 155-157 von TNF (aus SEQ ID No:1).
  • Derartige chimäre anti-TNF-Antikörper, Fragmente und Regionen davon, entsprechend der vorliegenden Erfindung, schließen solche ein, die sowohl durch Hybridomzellen als auch rekombinant durch Zellen produziert werden, die heterologe, mindestens variable Regionen kodierende Nukleinsäuren exprimieren, wie etwa chimere Maus-Mensch-Antikörper derartiger TNF-spezifischer Antikörper, Fragmente oder Regionen wie die der vorliegenden Erfindung.
  • Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin chimäre anti-TNF-Antikörper, Fragmente und Regionen zur Verfügung, wobei Hybridomzellen und Genetic-Engineering-Technologien angewendet werden, um nutzbare Produkte zur an vivo-Behandlung und Diagnose von menschlichen Erkrankungen, die im Zusammenhang mit TNF stehen, herzustellen, wie oben beschrieben.
  • Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin die Anwendung von antigenen Polypeptiden aus hTNFα zur Verfügung, die Abschnitten von TNFα entsprechen; werden Epitope dieser Polypeptide durch chimäre TNF-spezifische Antikörper, Fragmente oder Regionen gebunden, wird die biologische Aktivität von TNFα in vivo neutralisiert oder gehemmt. Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist, chimäre Antikörper, hergestellt von Hybridomzellen oder rekombinanten Wirten, zur Verfügung zu stellen, die Epitope von Polypeptiden spezifisch binden, die mindestens 5 Aminosäuren entsprechen, die aus den Resten 87-108 oder sowohl den Resten 59-80 als auch 87-108 von hTNFα (aus SEQ ID No:1) ausgewählt sind, wie in 15 gezeigt.
  • Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin chimäre anti-TNFα-Antikörper, Fragmente und Regionen zur Verfügung, die in vivo TNFα hemmende und/oder neutralisierende Aktivität aufweisen, und die als pharmazeutische und diagnostische Zusammensetzungen zur Diagnose und Behandlung von Erkrankungen eingesetzt werden können, die im Zusammenhang mit TNFα stehen, einschließlich Kachexie, akute und chronische Infektionen und parasitische Prozesse, wie etwa bakterielle und virale Infektionen und Pilzinfektionen, akute und chronische entzündliche und immunologische Prozesse, einschließlich Autoimmunerkrankungen, alkoholinduzierte Hepatitis, neoplastische Erkrankungen und ähnliches. Zur therapeutischen Anwendung werden hochaffine chimäre anti-TNFα-Antikörper bevorzugt, einschließlich rekombinante und durch Hybridomzellen produzierte monoklonale und chimäre Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung, die menschliches TNFα in vivo mit einer halbmaximalen Dosis (ID50) von mindestens etwa 1 μg/ml, bevorzugter mindestens etwa 100 ng/ml, am bevorzugtesten mindestens etwa 15 ng/ml hemmen oder neutralisieren.
  • Einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung zufolge werden chimäre anti-TNFα-mAbs oder TNF-bindende Fragmente davon, die besonders nützlich sind für diagnostische Methoden zur Detektion von menschlichem TNFα in Patienten, die im Verdacht stehen, an Beschwerden zu leiden, die mit TNFα zusammenhängen, einschließlich Methoden, bei denen hochaffine chimäre anti-TNFα-Antikörper der vorliegenden Erfindung verwendet werden, mit biologischem Material eines Patienten in Kontakt gebracht und eine Antigen-Antikörper-Reaktion nachgewiesen. Die Erfindung kann zur TNFα-Detektion in biologischen Flüssigkeiten in Form von Kits, die hochaffine chimäre anti-TNFα-Antikörper oder Fragmente der vorliegenden Erfindung, bevorzugt in nachweisbar markierter Form, umfassen, verwendet werden.
  • Die chimären Antikörper der vorliegenden Erfindung verkörpern eine Kombination der vorteilhaften Eigenschaften von mAbs. Ebenso wie mAbs der Maus können sie menschliches TNF erkennen und daran binden; anders jedoch als Mäuse-mAbs vermindern die „Mensch-spezifischen" Eigenschaften der chimären Antikörper die Wahrscheinlichkeit einer Immunantwort auf die Antikörper und führen zu verlängerter Überlebenszeit in der Zirkulation infolge verminderter Entfernung. Außerdem können bei Verwendung der in der vorliegenden Erfindung offengelegten Methode, die konstanten Regionen jedes gewünschten menschlichen Immunglobulin-Isotyps mit der gewünschten Antigen-Bindungsstelle kombiniert werden.
  • Die vorliegende Erfindung macht weiterhin chimäre Immunglobulinketten verfügbar, entweder schwer (H) oder leicht (L), die variable oder konstante Regionen mit Spezifität gegenüber einem oder mehreren Epitopen von TNF aufweisen, bevorzugterweise einem Epitop aus mindestens 5 Aminosäuren der Reste 87-107 oder einer Kombination aus sowohl 59-80 als auch 87-108 von hTNFα (aus SEQ ID No:1). In einer bevorzugten Ausführungsform beinhalten die Aminosäuren des Epitops keine Aminosäuren mindestens einer der Reste von 11-13, 37-42, 49-57 oder 155-157 von hTNFα (aus SEQ ID No:1). Eine chimäre Mensch/Maus-Immunglobulinkette enthält eine konstante (C) Region, die im wesentlichen der in natürlichem, menschlichem Immunglobulin vorhandenem ähnlich ist sowie eine variable (V) Region, bevorzugterweise nicht menschlich, die hohe Affinität und die gewünschte Spezifität zu einem TNF-Epitop aufweist. Die Erfindung stellt ebenfalls Antikörper, Fragmente und Regionen mit assoziierten, chimären H- und L-Ketten zur Verfügung, so daß die Gesamtheit des Moleküls die gewünschten Eigenschaften hinsichtlich Antigen-Erkennung und Antigen-Bindung aufweist.
  • Im besonderen zielt die vorliegende Erfindung auch auf einen chimären Antikörper, der zwei leichte Ketten und zwei schwere Ketten umfaßt, wobei jede der Ketten mindestens einen Teil einer menschlichen konstanten Region und mindestens einen Teil einer variablen (V) Region nicht-menschlicher Herkunft mit Spezifität gegenüber menschlichem TNFα umfaßt, wobei der Antikörper mit hoher Affinität an ein hemmendes und/oder neutralisierendes Epitop von menschlichem TNFα bindet. Die Erfindung beinhaltet auch ein Fragment oder ein Derivat eines solchen Antikörpers. Die V-Region ist bevorzugt von nicht-menschlicher Herkunft, bevorzugter stammt sie aus der Maus. In einer bevorzugten Ausführungsform leitet sich die V-Region von dem mAb A2 ab oder bindet dessen Epitope. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird ein chimärer Antikörper zur Verfügung gestellt, der Epitope des als chimärer A2 (cA2) bezeichneten Antikörpers bindet, oder ein chimärer Mensch/Maus-anti-TNF-mAb, der kompetitiv die Bindung von cA2 an TNFα hemmt.
  • Bevorzugterweise hemmt oder neutralisiert der chimäre Antikörper menschlichen TNFα in vivo mit einer ID50 von mindestens ungefähr 1 μg/ml, bevorzugter von mindestens etwa 100 ng/ml, am meisten bevorzugt von mindestens ungefähr 15, 30, 50 oder 80 ng/ml.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1 stellt einen Graphen dar, der die dosisabhängige Bindung von Mäuse-mAb A2 an menschlichen TNFα zeigt.
  • 2 stellt einen Graphen dar, der zeigt, daß Hitze-inaktivierter menschlicher TNFα durch mAb A2 nicht erkannt wird.
  • 3 stellt einen Graphen dar, der die Neutralisierung der TNF-Zytotoxizität in vitro durch Mäuse-A2 zeigt. Kontrolle: Maus-IgG1-anti-LipidA-mAb (8A1) mit natürlichem, menschlichem TNF. Die mittleren Absorptionswerte der Kontrollen waren wie folgt: keine Zugabe von TNF = 1,08; natürlicher TNF, kein Antikörper = 0,290; und rekombinanter TNF, kein Antikörper = 0,500.
  • 4 stellt einen Graphen dar, der zeigt, daß mAb A2 und chimärer A2 menschliches Lymphotoxin (TNFβ) nicht hemmen oder neutralisieren.
  • 5 stellt einen Graphen dar, der zeigt, daß die mAbs Mäuse-A2 und chimärer cA2 TNFα aus der Maus nicht hemmen oder neutralisieren.
  • 6 und 7 stellen Graphen dar, die zeigen, daß mAb A2 durch Schimpansen-Monozyten produzierten TNF und rhTNFα nicht hemmen oder neutralisieren.
  • 8 liefert schematische Diagramme der Plasmide, die zur Expression der chimären H-(pA2HG1apgpt) und L- (pA2HuKapgpt) Ketten des chimären A2-Antikörpers verwendet wurden.
  • 9 stellt einen Graphen dar, der die Ergebnisse eines Cross-blocking-epitope-ELISA mit Kompetitoren des Mäuse-A2 (mA2) und chimären (cA2) Antikörpers zeigt.
  • 10 stellt den Graphen einer Scatchard-Analyse mit 125J-markiertem mAb A2 (mA2) und chimärem A2 (cA2) dar, die an rekombinanten menschlichen TNFα binden, der an einer Mikrotiterplatte immobilisiert ist. Jeder Ka-Wert wurde aus dem Mittelwert zweier unabhängiger Bestimmungen berechnet.
  • 11 stellt einen Graphen dar, der die Neutralisierung der TNF-Zytotoxizität durch chimären A2 zeigt. Die Kontrolle ist ein chimärer Maus/Mensch-IgG1-anti-Thrombozyten-mAb (7E3), der mit natürlichem, menschlichem TNF reagiert. Mittlere Absorptionswerte der Kontrollen waren: keine Zugabe von TNF = 1,08; natürlicher TNF, kein Antikörper = 0,290; und rekombinanter TNF, kein Antikörper = 0,500.
  • 12 stellt einen Graphen dar, der die in vitro-Neutralisierung von TNF-induzierter ELAM-1-Expression durch chimären A2 zeigt. Die Kontrolle ist ein chimärer Maus/Mensch-IgG1-Anti-CD4-Antikörper.
  • 13 stellt eine als SEQ ID No:1 bezeichnete Aminosäuresequenz von humanem TNF dar.
  • 14A ist eine graphische Darstellung einer Epitopkartierung von chimärem mAb cA2, worin die relative Bindung von cA2 an Peptidpins von menschlichem TNF angezeigt ist.
  • 14B ist eine graphische Darstellung einer Epitopkartierung von chimärem mAb cA2, worin die relative Bindung von cA2 an Peptid-Pins, deren die Peptide von menschlichem TNF stammen, in Gegenwart von menschlichem TNF angezeigt ist.
  • 15 stellt eine Aminosäuresequenz von menschlichem TNF dar, die Sequenzen mit Bereiche von Epitopen zeigt, die durch cA2 erkannt werden.
  • 16A ist eine Darstellung eines räumlichen Modells eines menschlichen TNF-Monomers.
  • 16B ist eine Darstellung eines räumlichen Modells zweier nicht aufeinanderfolgender Peptidsequenzen von menschlichem TNF, die durch cA2 erkannt werden.
  • Detaillierte Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
  • Die vorliegende Erfindung stellt anti-Tumor-Nekrose-Faktor (anti-TNF) chimäre Maus/Mensch-Antikörper und Fragmente und Regionen davon zur Verfügung, welche die biologische Aktivität von TNF in vivo hemmen oder neutralisieren und spezifisch gegen menschlichen Tumor-Nekrose-Faktor α (hTNFα) gerichtet sind, welche zu diagnostischen und therapeutischen Zwecken bei Mensch oder Tier verwendet werden können, die Krankheitsbilder oder Beschwerden aufweisen, die mit dem Vorhandensein einer, mit einem anti-TNF-Antikörper reagierenden Substanz, insbesondere hTNFα, verbunden sind, wobei diese Mengen übersteigt, wie sie in einem normalen, gesunden Organismus vorhanden sind. Chimäre Antikörper der vorliegenden Erfindung und Fragmente, Regionen und Derivate davon enthalten bevorzugterweise mindestens eine V-Region, die ein Epitop von TNF erkennt und welche hemmende und/oder neutralisierende biologische Aktivität in vivo aufweist.
  • Unerwarteterweise können monoklonale Antikörper der vorliegenden Erfindung die Wirkung von TNFα blockieren, ohne an die putative Rezeptorbindungsstelle, dargestellt bei Eck und Sprang (J. Biol. Chem. 264 (29), 17595-17605 (1989)), entsprechend der Aminosäuren 11-13, 37-42, 49-57 und 155-157 von hTNFα (aus SEQ ID NO:1), zu binden.
  • Bevorzugte Antikörper der vorliegenden Erfindung sind chimäre Mensch/Maus-anti-TNFα-Antikörper mit hoher Affinität und Fragmente oder Regionen davon, die wirksam hemmende und/oder neutralisierende Aktivität gegenüber menschlichem TNFα in vivo haben. Derartige chimäre Antikörper beinhalten jene, die durch Immunisierung mit gereinigtem rekombinantem hTNFα (SEQ ID NO:1) oder Peptidfragmenten davon, erzeugt wurden. Solche Fragmente enthalten Epitope aus mindestens 5 Aminosäuren der Reste 87-107 oder einer Kombination aus sowohl 59-80 als auch 87-108 von hTNFα (gemäß der entsprechenden Aminosäuren aus SEQ ID NO:1). Zusätzlich erkennen bevorzugte Antikörper, Fragmente und Regionen der chimären anti-TNF-Antikörper der vorliegenden Erfindung keine Aminosäuren aus mindestens einer der Aminosäuren 11-13, 37-42, 49-57 oder 155-157 von hTNFα (aus SEQ ID NO:1).
  • Da TNF-Konzentrationen in der Zirkulation tendenziell extrem niedrig sind, im Bereich von ungefähr 10 pg/ml bei nicht-septischen Individuen, und bis zu ungefähr 50 pg/ml in septischen Patienten und über 100 pg/ml beim septischen Syndrom (Hammerle, A.F. et al., 1989, supra) erreichen oder nur an Stellen TNF-vermittelter Symptomatik nachgewiesen werden können, ist die Verwendung von Antikörpern mit hoher Affinität und/oder Antikörpern, die TNF in vivo wirksam hemmen und/oder neutralisieren, Fragmenten oder Regionen davon, bevorzugt, sowohl für TNF-Immuntests als auch zur Therapie TNF-vermittelter Pathologie. Derartige chimäre Antikörper, Fragmente oder Regionen werden eine Affinität zu hTNFα, ausgedrückt als Ka, von bevorzugt mindestens 108 M–1, bevorzugter von mindestens 109 M–1, wie etwa 5 × 108 M–1, 8 × 108 M–1, 2 × 109 M–1, 4 × 109 M–1, 6 × 109 M–1, 8 × 109 M–1 aufweisen.
  • Zur Therapie am Menschen ist die Verwendung von chimären Hochaffinitäts-Antikörpern und Fragmenten, Regionen und Derivaten mit TNFα in vivo wirksam hemmender und/oder neutralisierender Aktivität, entsprechend der vorliegenden Erfindung, welche die TNF-induzierte IL-6 Sekretion unterbinden, bevorzugt. Ebenfalls zur Therapie am Menschen ist die Verwendung solcher chimärer anti-TNFα-Hochaffinitäts-Antikörper und Fragmente, Regionen und Derivate davon bevorzugt, die die TNF-induzierte Prokoagulations-Aktivität blockieren, einschließlich der Blockierung der TNF-induzierten Expression von Zelladhäsions-Molekülen wie etwa ELAM-1 und ICAM-1, und der Blockierung der mitogenen Aktivität von TNF, in vivo, in situ und in vitro.
  • Bevorzugte chimäre anti-TNF-mAbs sind jene, die in vivo die Bindung von menschlichem TNFα durch anti-TNFα-Mäuse-mAb A2, chimären mAb cA2 oder einen Antikörper mit im wesentlichen denselben spezifischen Bindungseigenschaften, ebenso wie von Fragmenten und Regionen davon, kompetitiv hemmen. Bevorzugte chimäre Antikörper der vorliegenden Erfindung sind jene, die Epitope binden, die durch A2 und cA2 erkannt werden und die in den Aminosäuren 59-80 und/oder 87-108 von hTNFα (gemäß der entsprechenden Aminosäuren aus SEQ ID NO:1) enthaltend sind, derart, daß die Epitope aus mindestens 5 Aminosäuren bestehen, die mindestens eine Aminosäure der oben genannten Abschnitte von menschlichem TNFα umfassen. Bevorzugte Methoden zur Bestimmung von Spezifität und Affinität monoklonaler Antikörper durch kompetitive Inhibition können bei Müller, Meth. Enzymol. 92:589-601 (1983), gefunden werden, was hiermit durch Zitat vollständig aufgenommen ist.
  • Der Mäuse-mAb A2 wird durch eine, als c134A bezeichnete Zellinie produziert. Der chimäre Anitkörper cA2 wird durch eine, als c168A bezeichnete Zellinie produziert. Die Zellinie c134A ist in Gestalt einer Zellbank zu Forschungszwecken im Centocor Cell Biology Services Depository hinterlegt und die Zellinie c1b8A (RCB) ist in Gestalt einer Zellbank zu Forschungszwecken im Centocor Corporate Cell Culture Research and Development Depository hinterlegt, beide bei Centocor, 200 Great Valley Parkway, Malvern, Pennsylvania, 19355. Die Zellinie c168A ist auch bei Centocor BV, Leiden, Niederlande, hinterlegt.
  • Weiterhin wurde c168A mit dem Anmeldedatum der vorliegenden Anmeldung bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, als ein „Culture-Safe-Deposit" hinterlegt.
  • Der Ausdruck „Epitop" soll sich auf denjenigen Abschnitt eines Moleküls beziehen, der die Eigenschaft hat, durch einen Antikörper erkannt und gebunden zu werden. Epitope bestehen gewöhnlich aus chemisch aktiven Oberflächen-Gruppierungen von Molekülen, wie etwa Aminosäuren oder Zuckerseitenketten, und weisen spezifische dreidimensionale Struktureigenschaften ebenso wie spezifische Ladungseigenschaften auf. Mit „hemmendes und/oder neutralisierendes Epitop" ist ein Epitop gemeint, dessen Bindung durch einen Antikörper zum Verlust der biologischen Aktivität des Moleküls oder Organismus', der das Epitop enthält, in vivo, in vitro und in situ, bevorzugter an vivo, führt, einschließlich der Bindung von TNF an einen TNF-Rezeptor. Bevorzugte chimäre Antikörper, Fragmente und Regionen von chimären anti-TNF-Antikörpern der vorliegenden Erfindung erkennen Epitope, die 5 Aminosäuren beinhalten, die mindestens eine Aminosäure der Aminosäurereste 87-108 oder sowohl der Reste 50-80 als auch 87-108 von hTFNα (aus SEQ ID NO:1) umfassen. Bevorzugte chimäre Antikörper, Fragmente und Regionen von chimären anti-TNF-Antikörpern der vorliegenden Erfindung erkennen keine Epitope aus mindestens einer der Aminosäuren 11-13, 37-42, 49-57 oder 155-157 von hTFNα (aus SEQ ID NO:1). In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt das Epitop mindestens 2 Aminosäuren der Reste 87-108 oder sowohl der Reste 50-80 als 87-108 von hTFNα (aus SEQ ID NO:1). In einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfaßt das Epitop mindestens 3 Aminosäuren der Reste 59-80 und 87-108 von hTFNα (aus SEQ ID NO:1). In einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfaßt das Epitop mindestens 4 Aminosäuren der Reste 87-108 oder sowohl der Reste 59-80 als auch 87-108 von hTNFα (aus SEQ ID NO:1). In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfaßt das Epitop mindestens 5 Aminosäuren der Reste 87-108 oder sowohl der Reste 59-80 als auch 87-108 von hTNFα (aus SEQ ID NO:1). In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfaßt das Epitop mindestens 6 Aminosäuren der Reste 87-108 oder sowohl der Reste 59-80 als auch 87-108 von hTNFα (aus SEQ ID NO:1). In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfaßt das Epitop mindestens 7 Aminosäuren der Reste 87-108 oder sowohl der Reste 59-80 und 87-108 von hTNFα (aus SEQ ID NO:1).
  • Ein „Antigen" ist ein Molekül oder ein Teil eines Moleküls, das die Eigenschaft besitzt, durch einen Antikörper gebunden zu werden, das zusätzlich die Fähigkeit besitzt, bei einem Tier die Produktion eines Antikörpers der in der Lage ist, an ein Epitop dieses Antigens zu binden, zu induzieren. Ein Antigen kann ein oder mehrere Epitope aufweisen. Die oben erwähnte spezifische Reaktion soll angeben, daß das Antigen in einer höchst selektiven Weise mit seinem korrespondierenden Antikörper reagieren wird und nicht mit der Vielzahl anderer Antikörper, deren Produktion durch andere Antigene ausgelöst werden kann. Bevorzugte Antigene, die Antikörper, Fragmente und Regionen von anti-TNF-Antikörpern der vorliegenden Erfindung binden, beinhalten mindestens 5 Aminosäuren, die mindestens einen der Aminosäurereste 87-108 oder sowohl der Reste 59-80 als auch 87-108 von hTNFα (aus SEQ ID NO:1) umfassen. Bevorzugte Antigene, die Antikörper, Fragmente und Regionen von anti-TNF-Antikörpern der vorliegenden Erfindung binden, beinhalten keine Aminosäuren der Aminosäuren 11-13, 37-42, 49-57 oder 155-157 von hTNFα (SEQ ID NO:1).
  • Die Bezeichnung „Antikörper" soll einen polyklonalen oder monoklonalen Antikörper sowie Fragmente und Regionen davon, ebenso wie Derivate davon, beinhalten, die in der Lage sind, Bereiche von TNF zu binden und die Bindung von TNF an TNF-Rezeptoren zu verhindern. Fragmente beinhalten z.B. Beispiel Fab, Fab', F(ab')2 und Fv. Diesen Fragmenten fehlt das Fc-Fragment eines intakten Antikörpers, sie werden rascher aus der Zirkulation entfernt und können weniger unspezifische Bindungen im Gewebe ausbilden als ein intakter Antikörper (Wahl et al., J. Nucl. Med. 24:316-325 (1983)). Diese Fragmente werden aus intakten Antikörpern mit Hilfe von Methoden hergestellt, die nach dem Stand der Technik bekannt sind, z.B. durch proteolytische Spaltung mittels Enzymen wie etwa Papain (um Fab-Fragmente zu erzeugen) oder Pepsin (um F(ab')2-Fragmente zu erzeugen). Regionen von anti-TNF-Antikörpern der vorliegenden Erfindung enthalten mindestens eine konstante Region einer schweren Kette (Hc), eine variable Region einer schweren Kette (Hv), eine variable Region einer leichten Kette (Lv) und eine konstante Region einer leichten Kette (Lc), wobei ein polyklonaler oder monoklonaler Antikörper, Fragmente und Regionen davon mindestens eine variable Region einer schweren Kette (Hv) oder eine variable Region einer leichten Kette (Lv) enthält, die einen Teil von TNF bindet und die biologische Aktivität von TNF hemmt.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist der chimäre Antikörper ein monoklonaler Antikörper, der Aminosäuren eines Epitops von TNF bindet, wobei der Antikörper, der mit cA2 bezeichnet wird, durch eine Hybridom-Zellinie oder durch einen rekombinanten Wirt produziert wird. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist der Antikörper ein chimärer Antikörper, der ein Epitop erkennt, das durch A2 erkannt wird. In einer stärker bevorzugten Ausführungsform ist der Antikörper ein chimärer Antikörper, der als chimärer A2 (cA2) bezeichnet wird.
  • Die chimären Antikörper, Fragmente und Regionen der vorliegenden Erfindung umfassen individuelle schwere (H) und leichte (L) Immunglobulin-Ketten. Eine chimäre H-Kette umfaßt eine Antigen-bindende Region, abgeleitet von der H-Kette eines nicht-menschlichen TNF-spezifischen Antikörpers, die mit mindestens einem Teil einer C-Region einer menschlichen H-Kette (CH) verbunden ist.
  • Eine chimäre L-Kette gemäß der vorliegenden Erfindung umfaßt eine Antigen-bindende Region, abgeleitet von der L-Kette eines nicht-menschlichen TNF-spezifischen Antikörpers, die mit mindestens einem Teil einer C-Region einer menschlichen L-Kette (CL) verbunden ist.
  • Gemäß ihrer Verwendung hierin, bezieht sich die Bezeichnung „Antigen-bindende Region" auf denjenigen Bereich eines Antikörper-Moleküls, der die Aminosäurereste enthält, die mit einem Antigen interagieren und dem Antikörper seine Spezifität und Affinität zu dem Antigen verleihen. Die Antikörper-Region beinhaltet das „Grundgerüst" der Aminosäurereste, die notwendig sind, um die ordungsgemäße Konformation der Antigen-bindenden Reste zu erhalten.
  • Gemäß ihrer Verwendung hierin, beinhaltet die Bezeichnung „chimärer Antikörper" monovalente, divalente oder polyvalente Immunglobuline. Ein monovalenter, chimärer Antikörper ist eine Dimer (HL), gebildet aus einer chimären H-Kette, die über Disulfidbrücken mit einer chimären L-Kette assoziiert ist. Ein divalenter, chimärer Antikörper ist tetramer (H2L2), gebildet durch zwei HL-Dimere, die über mindestens eine Disulfidbrücke assoziiert sind. Ein polyvalenter, chimärer Antikörper kann auch hergestellt werden, indem z.B. eine CH-Region eingesetzt wird, die aggregiert (z. B. aus einer IgM-H-Kette oder μ-Kette).
  • Die Erfindung sieht ebenfalls „Derivate" der chimären Antikörper, Fragmente, Regionen oder Derivate davon vor, wobei die Bezeichnung jene Proteine einschließt, die von trunkierten oder modifizierten Genen kodiert werden, um molekulare Spezies hervorzubringen, die funktionell den Immunglobulin-Fragmenten ähneln. Die Modifikationen beinhalten, sind aber nicht darauf beschränkt, zusätzliche genetische Sequenzen, die für zytotoxische Proteine, wie etwa Pflanzentoxine und bakterielle Toxine, kodieren. Die Fragmente und Derivate können von jedem der Wirte dieser Erfindung produziert werden. Alternativ können chimäre anti-TNF-Antikörper, Fragmente und Regionen an zytotoxische Proteine oder Verbindungen in vitro gebunden werden, um zytotoxische anti-TNF-Antikörper verfügbar zu machen, die Zellen mit TNF-Rezeptoren selektiv töten würden.
  • Antikörper, Fragmente oder Derivate mit chimären H-Ketten und L-Ketten der selben oder unterschiedlicher V-Region-Bindungsspezifität, können durch geeignete Assoziation der einzelnen Polypeptidketten präpariert werden, wie z.B. Sears et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72:353-357 (1975) lehrt. Bei diesem Ansatz werden Wirte, die chimäre H-Ketten (oder ihre Derivate) exprimieren, separat von Wirten, die chimäre L-Ketten (oder deren Derivate) exprimieren, kultiviert, und die Immunglobulin-Ketten werden separat gewonnen und dann assoziiert. Alternativ können die Wirte cokultiviert werden und den Ketten kann Gelegenheit gegeben werden, im Kulturmedium spontan zu assoziieren, gefolgt durch Gewinnung des zusammengesetzten Immunglobulins, Fragments oder Derivats.
  • Die Antigen-bindende Region des chimären Anitkörpers der vorliegenden Erfindung leitet sich bevorzugt von einem nicht-menschlichen, spezifisch gegen menschlichen TNF gerichteten Antikörper ab. Bevorzugte DNA-Quellen, die einen solchen nicht-menschlichen Antikörper kodieren, beinhalten Zellinien, die einen Antikörper produzieren, bevorzugterweise hybride Zellinien, die allgemein als Hybridom-Zellinien bekannt sind. Eine bevorzugte Hybridom-Zellinie ist die Hybridom-Zellinie A2.
  • Die hybriden Zellen werden durch die Fusion einer nicht-menschlichen, anti-hTNFα-Antikörper produzierenden Zelle, typischerweise eine Milzzelle eines Tieres, das entweder gegen natürlichen oder rekombinanten menschlichen TNF oder ein Peptid-Fragment der menschlichen TNFα-Proteinsequenz immunisiert wurde, gebildet. Alternativ kann die nicht-menschliche anti-TNFα-Antikörper produzierende Zelle ein B-Lymphozyt sein, der aus dem Blut, der Milz, den Lymphknoten oder anderem Gewebe eines, mit TNF immunisierten Tieres erhalten wurde.
  • Die Antikörper-produzierende Zelle, welche die Nukleotidsequenz beisteuert, die die Antigen-bindende Region des chimären Antikörpers der vorliegenden Erfindung kodiert, kann auch durch Transformation einer nicht-menschlichen, wie etwa einer vom Primaten stammenden, oder einer menschlichen Zelle erzeugt werden. Beispielsweise kann ein B-Lymphozyt, der einen anti-TNF-Antikörper produziert, mit einem Virus, wie etwa dem Epstein-Barr-Virus, infiziert und transformiert werden, um eine immortale, anti-TNF-produzierende Zelle hervorzubringen (Kozbor et al., Immunol. Today 4:72-79 (1983)). Alternativ kann der B-Lymphozyt durch Ausstattung mit einem transformierenden Gen oder transformierenden Genprodukt transformiert werden, was im Stand der Technik bekannt ist.
  • Bevorzugterweise wird die Antigen-bindende Region aus der Maus stammen. In anderen Ausführungsformen kann die Antigen-bindende Region aus anderen Tierspezies, insbesondere Kaninchen oder Nagetieren wie Ratte oder Hamster stammen. Der zweite Fusionspartner, der die immortalisierende Funktion zur Verfügung stellt, kann eine Lymphoblastenzelle oder eine Plasmacytom- oder Myelomzelle sein, die selbst keine Antikörper produzierende Zelle ist, allerdings maligne ist. Bevorzugte Fusionspartner-Zellen beinhalten die Hybridom-Zellinie SP2/0-Ag14, abgekürzt SP2/0 (ATCC CRL1581) und die Myelom-Zellinie P3X63Ag8 (ATCC TIB9), oder ihre Derivate (siehe: Hartlow, E. et al., Antibodies: A Laboratory Manual,. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, (1988)).
  • Mäuse-Hybridomzellen, die einen spezifisch gegen menschlichen TNFα gerichteten mAb produzieren, werden durch die Fusion einer Fusionspartner-Zelle aus der Maus, wie etwa SP2/0, und Milzzellen von Mäusen, die gegen gereinigten hTNFα, rekombinanten hTNFα, natürliche oder synthetische TNF-Peptide, einschließlich Peptiden, die 5 oder mehr Aminosäuren, ausgewählt aus den Resten 59-80 und 87-108 von TNF (aus der SEQ ID NO:1), beinhalten, oder andere biologische, TNF-enthaltende Präparationen immuninisiert sind, erzeugt. Um die Mäuse zu immunisieren, gibt es eine Auswahl verschiedener herkömmlicher Protokolle, die verfolgt werden können. Beispielsweise können Mäuse primäre Immunisierungen und Wiederholungsimpfungen mit TNF erhalten.
  • Die TNF-Reste 87-108 oder sowohl die Reste 59-80 als auch 87-108 von TNF (aus der SEQ ID NO:1), Fragmente oder Kombinationen darin enthaltener Peptide sind als Immunogene nützlich, um die Produktion von Antikörpern auszulösen, die Peptidsequenzen erkennen werden, die im Zusammenhang mit dem nativen TNF-Molekül präsentiert werden.
  • Epitope, die von Antikörpern der vorliegenden Erfindung und Fragmenten und Regionen davon erkannt werden, enthalten 5 oder mehr Aminosäuren, umfassend mindestens eine Aminosäure aus einer oder beiden der folgenden Aminosäuresequenzen von TNF, die ein topographisches Epitop von TNF schaffen, das durch einen Antikörper der vorliegenden Erfindung und Fragmenten und variablen Regionen davon erkannt wird und das mit anti-TNF-Aktivität bindet:
    59-80: Tyr-Ser-Gln-Val-Leu-Phe-Lys-Gly-Gln-Gly-Cys-Pro-Ser-Thr-His-Val-Leu-Leu-Thr-His-Thr-Ile
    (AA 59-80 aus SEQ ID NO:1); und
    87-108: Tyr-Gln-Thr-Lys-Val-Asn-Leu-Leu-Ser-Ala-Ile -Lys-Ser-Pro-Cys-Gln-Arg-Glu-Thr-Pro-Glu-Gly
    (AA 87-108 aus SEQ ID NO:1).
  • Besondere Peptide, die zur Herstellung von Antikörpern der vorliegenden Erfindung benutzt werden können, beinhalten Kombinationen von Aminosäuren, ausgewählt aus mindestens den Resten 87-108 oder sowohl den Resten 59-80 als auch 87-108, die kombiniert werden, um ein Epitop von TNF verfügbar zu machen, das durch chimäre anti-TNF-Antikörper, Fragmente und Regionen davon gebunden wird, und dessen Bindung eine biologische „anti-TNF-Aktivität" verfügbar macht. Derartige Epitope beinhalten mindestens 1-5 Aminosäuren und weniger als 22 Aminosäuren der Reste 87-108 oder jeden der Reste 59-80 und 87-108, die in Verbindung mit anderen TNF-Aminosäuren Epitope verfügbar machen, die mindestens 5 Aminosäuren lang sind.
  • Die Techniken zur Erzeugung von Antikörpern der vorliegenden Erfindung, gerichtet gegen kurze Peptid-Sequenzen, die diese Sequenzen in freier oder konjugierter Form oder präsentiert als eine native Sequenz im Zusammenhang mit einem großen Protein erkennen und daran binden, sind nach dem Stand der Technik bekannt. Solche Antikörper beinhalten Maus/Mensch- und Mensch/Mensch-Antikörper, die durch Hybridomzellen oder im Stand der Technik bekannte, rekombinante Techniken erzeugt werden.
  • Die Identifizierung dieser Peptidsequenzen, die durch mAbs der vorliegenden Erfindung erkannt werden, liefert die nötige Information, um zusätzliche monoklonale Antikörper mit Bindungseigenschaften und therapeutischer Nutzbarkeit herzustellen, die mit den Ausführungsformen dieser Anmeldung vergleichbar sind.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform bestehen die Aminosäuren des Epitops nicht aus mindestens einer der Aminosäuren 11-13, 37-49, 49-57 und 150-157 von hTNFα (aus SEQ ID NO:1).
  • Die Zellfusionen werden durch Standardverfahren erreicht, die einer, auf dem Gebiet der Immunologie sachkundigen Person bekannt sind (Kohler and Milstein, Nature 256:495-497 (1975) und U.S. Patent Nr. 4,376,110; Hartlow, E. et al., supra; Campell, A., „Monoclonal Antibody Technology," In: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Volume 13 (Burdon, R., et al., Hrsg.), Elsevier, Amsterdam (1984); Kennett et al.) Monoclonal Antibodies (Kennett et al., Hrsg. S. 365-367, Plenum Press, NY, 1980); de St. Gorth, S.F., et al., J. Immunol. Meth. 35: 1-21 (1980); Galfre, G. et al., Methods Enzymol. 73:3-46 (1981); Goding, J.W. 1987. Monoclonal Antibodies: Principles and Practise. 2. Auflg., Academic Press, London, 1987);
  • Fusionspartner-Zellinien und Methoden zum Fusionieren und Selektionieren von Hybridomzellen und zum Durchmustern auf mAbs sind nach dem Stand der Technik bekannt (Hartlow, E. et al., supra; Kawamoto, T. et al., Meth. Enzymol 121:266-277 (1986); Kearney, J.F. et al., J. Immunol. 123:1548-1550 (1979); Killmartin, J.V. et al., J. Cell Biol. 93:576-582 (1982); Kohler, G. et al., Eur. J. Immunol. 6:292-295 (1976); Lane, D.P. et al., J. Immunol. Meth. 47:303-307 (1981); Mueller, U.W. et al., J. Immunol. Meth. 87:193-196 (1986); Pontecorvo, G., Somatic Cell Genet. 1:397-400 (1975); Sharo, J., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:1420-1424 (1979); Shulman, M. et al., Nature 276:269-270 (1978); Springer, T.A. (Hrsg.), Hybridoma Technology in the Biosciences and Medicine, Plenum Press, New York, 1985; und Taggart, R.T. et al., Science 219:1228-1230 (1982)).
  • Der hTNFα-spezifische, chimäre mAb der vorliegenden Erfindung kann in großen Mengen produziert werden, indem Hybridom- oder Transfektomzellen, die den Antikörper sezernieren, in die Peritonealhöhle von Mäusen injiziert werden und nach angemessener Zeit die Ascites-Flüssigkeit, die einen hohen mAb-Titer aufweist, geerntet und der mAb daraus isoliert wird. Zu einer solchen in vivo-Produktion des mAb mit Hilfe einer, nicht von der Maus abgeleiteten (z. B. von Ratte oder Mensch) Hybridom-Zellinie, werden Hybridomzellen bevorzugterweise in bestrahlten Mäusen oder athymischen Nackt-Mäusen herangezogen.
  • Alternativ können die Antikörper durch Kultivierung von Hybridom- oder Transfektomzellen in vitro und Isolierung des sezernierten mAb aus dem Zellkulturmedium gewonnen werden.
  • Monoklonale Antikörper der vorliegenden Erfindung erkennen Epitope, einschließend nicht aufeinanderfolgende Reste, die innerhalb der nicht aufeinanderfolgenden Sequenzen der Reste 87-108 oder sowohl der Reste 59-80 als auch 87-108 von TNF (aus SEQ ID NO:1) lokalisiert sind. Bevorzugte chimäre anti-TNF-mAbs sind solche, die diese Bindung von menschlichen TNFα an seine Rezeptoren aufgrund ihrer Fähigkeit, an eine oder mehrere dieser Peptidsequenzen zu binden, hemmen. Diese Antikörper würden die Aktivität von TNF aufgrund der Bindung an das Epitop aus Sequenzen, die 87-108 und/oder 110-128 von TNF (aus SEQ ID NO:1) einschließen, blockieren. Wie hier beschrieben, wurde gezeigt, daß solch eine Bindung die TNF-Aktivität hemmt.
  • Besondere Peptide, die verwendet werden können, um Antikörper der vorliegenden Erfindung auszutesten, beinhalten Kombinationen aus Aminosäuren, ausgewählt aus mindestens den Resten 87-108 oder sowohl den Resten 59-80 als auch 87-108, die kombiniert werden, um ein Epitop von TNF verfügbar zu machen, das durch chimäre TNF-Antikörper der vorliegenden Erfindung, Fragmente und Regionen davon, gebunden wird, und deren Bindung anti-TNF-biologische-Aktivität ausübt. Solche Epitope beinhalten mindestens 1-5 Aminosäuren und weniger als 22 Aminosäuren der Reste 27-108 oder von jedem der Reste 59-80 und 87-108, die in Verbindung mit anderen TNF-Aminosäuren Epitope verfügbar machen, die mindestens 5 Aminosäuren lang sind.
  • Rekombinante Expression chimärer Antikörper mit anti-TNF-Aktivität
  • Rekombinante chimäre Maus/Mensch- oder Mensch/Mensch-Antikörper, die TNF hemmen und an ein Epitop binden, das in den Aminosäuresequenzen der Reste 87-108 oder sowohl der Reste 59-80 als auch 87-108 von hTNFα (aus SEQ ID NO:1) enthalten ist, können gemäß der vorliegenden Erfindung unter Verwendung bekannter Techniken auf der Grundlage der hier dargelegten Anleitung verfügbar gemacht werden.
  • Die DNA, die einen anti-TNF-Antikörper der vorliegenden Erfindung kodiert, kann genomische DNA oder cDNA sein, die mindestens eine der konstanten Regionen schwerer Ketten (Hc), die variable Region einer schweren Kette (Hv), die variable Region einer leichten Kette (Lv) und die konstante Region einer leichten Kette (Lc) kodieren. Eine zweckmäßige Alternative zu der Verwendung chromosomaler Gen-Fragmente als Quelle von DNA, welche das V-Region-Antigen-bindende Segment aus der Maus kodiert, ist die Verwendung von cDNA für die Konstruktion chimärer Immunglobulin-Gene, wie durch Liu et al. (Proc. Natl. Acad. Sci., USA 84:3439 (1987) und J. Immunology 139:3521 (1987)) beschrieben, womit diese Referenzen durch Zitat vollständig aufgenommen sind. Die Verwendung von cDNA erfordert, daß für die Wirtszelle geeignete Gen-Expressionselemente mit dem Gen kombiniert werden, um eine Synthese des gewünschten Proteins zu erreichen. Die Verwendung von cDNA-Sequenzen ist gegenüber genomischen Sequenzen (die Introns erhalten) insofern vorteilhaft, als cDNA-Sequenzen in Bakterien oder anderen Wirten, denen geeignete RNA-Spleiß-Systeme fehlen, exprimiert werden können.
  • Menschliche Gene, welche die konstanten (C) Regionen der chimären Antikörper, Fragmente und Regionen der vorliegenden Erfindung kodieren, können einer menschlichen fötalen Leberbank durch bekannte Methoden entnommen werden. Menschliche Gene für C-Regionen können von jeder menschlichen Zelle, einschließlich solchen, die menschliche Immunglobuline exprimieren und produzieren, stammen. Die menschliche CH-Region kann sich von jeder der bekannten Klassen oder jedem der Isotypen von menschlichen H-Ketten, einschließlich gamma, μ, α, δ oder ε und Subtypen davon, wie etwa G1, G2, G3 und G4, ableiten. Da der H-Kette-Isotyp für die verschiedenen Effektor-Funktionen eines Antikörpers verantwortlich ist, wird die Wahl der CH-Region durch die gewünschten Effektor-Funktionen, wie etwa Komplement-Fixation oder Aktivität bzgl. Antikörper-abhängiger zellulärer Zytotoxizität (ADCC) geleitet sein. Bevorzugterweise leitet sich die CH-Region von gamma 1 (IgG 1), gamma 3 (IgG3), gamma 4 (IgG4) oder μ (IgM) ab.
  • Die menschliche CL-Region kann von jedem der Isotypen menschlicher L-Ketten, kappa oder lambda, abgeleitet sein.
  • Gene, die menschliche Immunglobulin-C-Regionen kodieren, können aus menschlichen Zellen durch Standard-Klonierungstechniken erhalten werden. (Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflg., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1989) und Ausubel et al., Hrsg., Currrent Protocols in Molecular Biology (1987-1991)). Menschliche C-Region-Gene sind leicht aus bekannten Klonen zu gewinnen, die Gene enthalten, welche die zwei Klassen von L-Ketten, die fünf Klassen von H-Ketten und Subklassen davon repräsentieren. Chimäre Antikörper-Fragmente, wie etwa F(ab')2 und Fab, können durch die Konstruktion eines chimären H-Kette-Gens, das in geeigneter Weise trunkiert ist, präpariert werden. Beispielsweise würde ein chimäres Gen, das einen H-Kette-Abschnitt eines F(ab')2-Fragments kodiert, DNA-Sequenzen beinhalten, die die CH1-Domäne und die Angelregion der H-Kette kodieren, gefolgt durch ein translationales Stopcodon, um das trunkierte Molekül hervorzubringen.
  • Im allgemeinen werden die chimären Antikörper, Fragmente und Regionen der vorliegenden Erfindung durch Klonieren von DNA-Segmenten erzeugt, die die H- und L-Kette-Antigen- bindenden Regionen eines TNF-spezifischen Antikörpers kodieren, und durch Verbinden dieser DNA-Segmente mit DNA-Segmenten, die CH- bzw. CL-Regionen kodieren, wodurch Immunglobulin-kodierende Gene der Maus, des Menschen oder chimäre Immunglobulin-kodierende Gene erzeugt werden.
  • Auf diese Weise wird in einer bevorzugten Ausführungsform ein fusioniertes, chimäres Gen geschaffen, das ein erstes DNA-Segment umfaßt, das mindestens die Antigen-bindende Region nicht-menschlichen Ursprungs kodiert, wie etwa eine funktionell neu arrangierte V-Region mit Verbindungs (J)-Segment, gebunden an ein zweites DNA-Segment, das mindestens einen Teil einer menschlichen C-Region kodiert.
  • Deshalb, cDNA, welche die Antikörper-V- und Antikörper-C-Regionen kodiert, die Methode zur Herstellung des chimären Antikörpers gemäß der vorliegenden Erfindung schließt mehrere Schritte ein, wie unten ausgeführt:
    • 1. Isolierung von messenger-RNA (mRNA) aus der Zellinie, die einen anti-TNF-Antikörper produziert, und aus gegebenenfalls zusätzlichen Antikörpern, die schwere und leichte konstanten Regionen beitragen; Klonierung und cDNA-Produktion daraus;
    • 2. Präparation einer vollständigen (full-length) cDNA-Bank aus gereinigter mRNA, wobei die entsprechenden Gen-Segmente der V- und/oder C-Region der L- und H-Kette-Gene sein können: (i) identifiziert durch geeignete Sonden, (ii) sequenziert, und (iii) zu einem C- oder V-Gen-Segment eines anderen Antikörpers für einen chimären Antikörper passend gemacht;
    • 3. Konstruktion von kompletten, die H- oder L-Kette kodierenden Sequenzen durch Verbindung der klonierten spezifischen V-Region-Gen-Segmente mit einem klonierten C-Region-Gen, wie oben beschrieben;
    • 4. Expression und Produktion von L- und H-Ketten in ausgewählten Wirten, einschließlich prokaryontischen und eukaryontische Zellen, um Mensch/Maus- oder Mensch/Mensch-Antikörper zur Verfügung zu stellen.
  • Ein gemeinsames Kennzeichen aller Gene für Immunglobulin-H- und -L-Ketten und ihrer kodierten mRNAs ist die J-Region. J-Regionen von H- und L-Ketten weisen unterschiedliche Sequenzen auf, es besteht jedoch ein hoher Grad an Sequenzhomologie (mehr als 80 %) zwischen den Gruppen, insbesondere in Nähe der C-Region. Diese Homologie wird in dieser Methode ausgenutzt und Konsensus-Sequenzen von J-Regionen der H- und L-Ketten können verwendet werden, um Oligonukleotide zur Verwendung als Startsequenzen (Primer) zu entwerfen, um geeignete Restriktionsstellen in die J-Region zur nachfolgenden Verbindung von V-Region-Segmenten mit menschlichen C-Region-Segmenten einzuführen.
  • Vektoren mit C-Region-cDNA, präpariert aus menschlichen Zellen, können durch Oligonukleotid-gesteuerte Mutagenese (Site-Directed-Mutagenesis) modifiziert werden, um eine Restriktionsstelle an die analoge Position in der menschlichen Sequenz einzufügen. Beispielsweise kann man die komplette C-Region der menschlichen kappa-Kette (Ck) und die komplette menschliche gamma-1-C-Region (Cgamma-1) klonieren. In diesem Fall würde die alternative Methode, die Klone mit genomischer C-Region als Herkunft für C-Region-Vektoren verwendet, die Expression dieser Gene in bakteriellen Systemen, denen Enzyme zur Entfernung intervenierender Sequenzen fehlen, nicht zulassen. Klonierte V-Region-Segmente werden ausgeschnitten und in Vektoren mit C-Regionen einer L- oder H-Kette ligiert. Alternativ kann die menschliche Cgamma-1-Region durch Einführung eines Terminationscodons modifiziert werden, wodurch eine Gensequenz geschaffen wird, die den H-Kette-Abschnitt eines Fab-Moleküls kodiert. Die kodierenden Sequenzen mit verbundenen V- und C-Regionen werden dann in entsprechende Expressionsvehikel transferiert, um in geeigneten Wirten, prokaryontischen oder eukaryontischen, exprimiert zu werden.
  • Zwei kodierende DNA-Sequenzen werden als „operabel verbunden" bezeichnet, wenn ihre Verknüpfung zu einer kontinuierlich translationsfähigen Sequenz ohne Änderung oder Unterbrechung des Triplett-Leserasters führt. Eine kodierende DNA-Sequenz ist mit einem Gen-Expressionselement operabel verbunden, wenn die Verknüpfung zur richtigen Funktion dieses Gen-Expressionselements führt, um zur Expression der kodierenden Sequenz zu führen.
  • Expressionsvehikel beinhalten Plasmide oder andere Vektoren. Unter diesen sind Vehikel bevorzugt, die eine funktionell vollständige Sequenz einer menschlichen CH- oder CL-Kette mit geeigneten Restriktionsstellen tragen, die so konstruiert sind, daß jede Sequenz einer VH- oder VL-Kette mit entsprechenden cohäsiven Enden leicht darin inseriert werden kann. Vehikel, die Sequenzen menschlicher CH- oder CL-Ketten enthalten, dienen deshalb als Intermediate zur Expression jeder gewünschten kompletten H- oder L-Kette in jedem geeigneten Wirt.
  • Ein chimerer Antikörper, wie etwa ein Maus/Mensch- oder Mensch/Mensch-Antikörper, wird typischerweise mit Hilfe von Genen synthetisiert, die durch chromosomale Gen-Promotoren, lokalisiert innerhalb der in den Konstrukten verwendeten V-Regionen der H- und L-Ketten der Maus, angetrieben werden; ein Spleißen erfolgt üblicherweise zwischen der Donor-Spleiß-Stelle in der Maus-J-Region und der Akzeptor-Spleiß-Stelle, die der menschlichen C-Region vorausgeht, und ebenfalls in den Spleiß-Regionen, die innerhalb der menschlichen CH-Region auftreten; Polyadenylierung und Transkriptionstermination treten an nativen chromosomalen Stellen auf, strangabwärts der menschlichen kodierenden Regionen.
  • Gen-Expressionselemente, die zur Expression von cDNA-Genen geeignet sind, beinhalten: (a) virale Transkriptionspromotoren und ihre Enhancer-Elemente, wie etwa der SV40-Early-Promotor (Okayama, H. et al., Mol. Cell. Biol. 3:280 (1983)), der Rous-Sarcoma-Virus-LTR (Gorman, C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:6777 (1982)) und der Moloney-Murine-Leukemia-Virus-LTR (Grosschedl, R. et al., Cell 41:885 (1985)); (b) Spleiß-Regionen und Polyadenylierungsstellen wie die, die sich von der SV40-Late-Region ableiten. (Okayama et al., supra); und (c) Polyadenylierungsstellen wie etwa in SV40 (Okayama et al., supra).
  • Immunglobulin-cDNA-Gene können, wie durch Liu et al., supra, und Weidle et al., Gene 51:21 (1987) beschrieben, exprimiert werden, wobei als Expressionselemente der SV40-Early-Promotor und seine Enhancer, die Enhancer des Maus-Immunglobulin-H-Kette-Promotors, SV40-Late-Region-mRNA-Splicing, die Kaninchen-β-Globulin-intervenierende Sequenz, Immunglobulin- und Kaninchen-β-Globulin-Polyadenylierungsstellen und SV40-Polyadenylierungselemente verwendet werde. Bei Immunglobulin-Genen, die teilweise von cDNA, teilweise von genomischer DNA (Whittle et al., Protein Engineering 1:499 (1987)) umfaßt sind, dient menschliches Zytomegalie-Virus als der transkriptionelle Promotor, die Promotor-Enhancer sind Zytomegalie-Virus und Maus/Mensch-Immunglobulin, und mRNA-Spleiß-Regionen und Polyadenylierungsregionen stammen aus den nativen chromosomalen Immunglobulin-Sequenzen.
  • In einer Ausführungsform ist der transkriptionelle Promotor zur Expression von cDNA-Genen in Nagetierzellen eine virale LTR-Sequenz, die transkriptionellen Promotor-Enhancer sind jeweils einzeln oder beide die Enhancer der Maus-Immunglobulin-Schwerkette und der virale LTR-Enhancer, die Spleiß-Region enthält ein Intron von mehr als 31 bp und die Polyadenylierungs- und Transkriptionsterminations-Regionen stammen von der nativen chromosomalen Sequenz, die der synthetisiert werdenden Immunglobulin-Kette entspricht. In anderen Ausführungsformen werden cDNA Sequenzen, die andere Proteine kodieren, mit den oben aufgezählten Expressionselementen kombiniert, um die Expression der Proteine in Säugerzellen zu erreichen.
  • Jedes fusionierte Gen ist in einem Expressionsvektor zusammengesetzt oder in diesen inseriert worden. Empfängerzellen, fähig zur Expression des Genprodukts der chimeren Immunglobulin-Kette, werden dann einzeln mit einem Gen, das eine chimere H- oder chimere L-Kette kodiert, transfiziert oder mit einem chimeren H- und einem chimeren L-Kette-Gen cotransfiziert. Die transfizierten Empfängerzellen werden unter Bedingungen kultiviert, die die Expression der inkorporierten Gene erlauben und die exprimierten Immunglobulin-Ketten oder intakten Antikörper oder Fragmente werden aus der Kultur gewonnen.
  • In einer Ausführungsform werden die fusionierten Gene, die die chimeren H- und L-Ketten oder Abschnitte davon kodieren, in separaten Expressionsvektoren zusammengesetzt, die dann zur Cotransfektion einer Empfängerzelle verwendet werden.
  • Jeder Vektor kann zwei selektionsfähige Gene enthalten, ein erstes selektionsfähiges Gen, entworfen zur Selektion in einem bakteriellen System, und ein zweites selektionsfähgies Gen, entworfen zur Selektion in einem eukaryontischen System, wobei jeder Vektor ein anderes Gen-Paar aufweist. Diese Strategie führt zu Vektoren, die zunächst die Produktion der fusionierten Gene in einem bakteriellen System steuern und deren Amplifikation erlauben. Die auf diese Weise in einem bakteriellen Wirt produzierten und amplifizierten Gene werden anschließend zur Cotransfektion einer eukaryontischen Zelle verwendet und erlauben die Selektion einer cotransfizierten Zelle, die mit den gewünschten transfizierten Genen ausgestattet ist.
  • Beispiele für selektionsfähige Gene zur Verwendung in einem bakteriellen System sind die Gene, die Resistenz gegenüber Ampicillin verleihen und die Gene, die Resistenz gegenüber Chloramphenicol verleihen. Bevorzugte selektionsfähige Gene zur Verwendung in eukaryontischen Transfektanten beinhalten das Gen für Xanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase (als gpt bezeichnet) und das Phosphotransferase-Gen aus Tn5 (als neo bezeichnet).
  • Die Selektion von gpt-exprimierenden Zellen beruht auf der Tatsache, daß das Enzym, das durch dieses Gen kodiert wird, Xanthin als ein Substrat zur Purinnukleotidsynthese verwendet, wohingegen das analoge endogene Enzym dies nicht kann. In einem Medium, enthaltend (1) Mykophenolsäure, welche die Umsetzung von Inosin-Monophosphat zu Xanthin-Monophosphat blockiert und (2) Xanthin, können nur die Zellen überleben, die das gpt-Gen exprimieren. Das Produkt von neo unterbindet die Hemmung der Proteinsynthese durch das Antibiotikum G418 und andere Antibiotika der Neomycinklasse.
  • Die beiden Selektionsverfahren können gleichzeitig oder nacheinander verwendet werden, um auf die Expression von Immunglobulin-Kette-Genen, die über zwei verschiedene DNA-Vektoren in eine eukaryontische Zelle eingeschleust wurden, zu selektionieren. Bei eukaryontischen Zellen ist es nicht notwendig, verschiedene selektionsfähige Marker einzubeziehen; ein H- und ein L-Kette-Vektor, die jeweils den gleichen selektionsfähigen Marker enthalten, können cotransfiziert werden. Nach Selektion der entsprechend resistenten Zellen wird die Mehrzahl der Klone integrierte Kopien von sowohl H- als auch L-Kette-Vektoren enthalten.
  • Alternativ können die fusionierten Gene, die die chimeren H- und L-Ketten kodieren, in demselben Expressionsvektor neu zusammengesetzt sein.
  • Zur Transfektion der Expressionsvektoren und zur Produktion des chimeren Antikörpers ist die bevorzugte Empfänger-Zellinie eine Myelom-Zellinie. Myelomzellen können Immunglobuline, die von transfizierten Immunglobulin-Genen kodiert werden, synthetisieren, neu zusammensetzen und sezenieren und verfügen über den Mechanismus zur Glykosylierung des Immunglobulins. Eine besonders bevorzugte Empfängerzelle ist die Myelomzelle SP2/0 (ATCC #CRL 8287), die kein Immunglobulin produziert. SP2/0 Zellen produzieren ausschließlich Immunglobulin, das von den transfizierten Genen kodiert wird. Myelomzellen können in Kultur oder in der Peritonealhöhle einer Maus, wobei sezeniertes Immunglobulin aus Ascitesflüssigkeit gewonnen werden kann, herangezogen werden. Andere geeignete Empfängerzellen beinhalten lymphoide Zellen, wie etwa B-Lymphozyten menschlicher oder nicht-menschlicher Herkunft, Hybridomzellen menschlicher oder nicht-menschlicher Herkunft oder zwischenartliche Hetero-Hybridomzellen.
  • Der Expressionsvektor, der ein chimeres Antikörperkonstrukt der vorliegenden Erfindung trägt, kann in eine geeignete Wirtszelle durch jedes einer Vielzahl geeigneter Möglichkeiten eingeführt werden, einschließlich derartiger biochemischer Verfahren wie Transformation, Transfektion, Konjugation, Protoplastenfusion, Kalziumphosphat-Präzipitation und die Verabreichung von Polykationen wie etwa Diethylaminoethyl (DEAE)-Dextran und solchen mechanischen Verfahren wie Elektroporation, direkte Mikroinjektion und Mikroprojektilbeschuß (Johnston et al., Science 240:1538 (1988). Eine bevorzugte Methode, DNA in lymphoide Zellen zu bringen, ist die Elektroporation (Potter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:7161 (1984); Yoshikawa, K. et al., Jpn. J. Cancer Res. 77:1122-1133). Bei diesem Verfahren werden Empfängerzellen in Gegenwart der DNA, die aufgenommen werden soll, einem elektrischen Puls ausgesetzt. Typischerweise dürfen sich die Zellen nach der Transfektion ungefähr 24 Stunden in Vollmedium erholen und werden dann in 96-Well-Kulturplatten in Gegenwart des Selektionsmediums ausgesät. Die G418-Selektion erfolgt mit etwa 0,4 bis 0,8 mg/ml G418. Die Mykophenolsäure-Selektion verwendet ungefähr 6 μg/ml plus ungefähr 0,25 mg/ml Xanthin. Bei der Elektroporationstechnik sind für Sp2/0 Zellen Transfektionsraten von etwa 10–5 bis etwa 10–4 zu erwarten. Bei der Methode der Protoplasten-Fusionsmethode wird Lysozym verwendet, um Zellwände vom Protoplasten, der das rekombinante Plasmid mit dem chimeren Antikörper-Gen beherbergt, zu entfernen. Die resultierenden Sphäroplasten werden mit Hilfe von Polyethylenglykol mit Myelomzellen fusioniert.
  • Die Immunglobulin-Gene der vorliegenden Erfindung können auch in nicht-lymphoiden Säugetierzellen oder in anderen eukaryontischen Zellen, wie etwa Hefe, oder in prokaryontischen Zellen, insbesondere Bakterien, exprimiert werden.
  • Zur Produktion von Immunoglobulin-H- und L-Ketten bietet Hefe erhebliche Vorteile gegenüber Bakterien. Hefen führen post-translationale Modifikationen einschließlich Glykosylierung durch. Gegenwärtig gibt es eine Reihe von Strategien zur Herstellung rekombinanter DNA, bei denen Sequenzen starker Promotoren und Plasmide mit hoher Kopierzahl, die zur Produktion der gewünschten Proteine in Hefe verwendet werden können, benutzt werden. Hefe erkennt Leitsequenzen klonierter Säugetier-Genprodukte und sezeniert Peptide, die Leitsequenzen tragen (d. h. Präpeptide) (Hitzman, et al., 11th International Conference on Yeast, Genetics and Molecular Biology, Monpellier, France, September 13-17, 1982).
  • Gen-Expressionssysteme der Hefe können im Hinblick auf das Ausmaß von Produktion, Sekretion und die Stabilität chimerer H- und L-Kette-Proteine und zusammengesetzter Mäuseantikörper und chimerer Antikörper, Fragmente und Regionen routinemäßig ausgewertet werden. Jedes einer Reihe von Gen-Expressionssystemen der Hefe, die Promotor- und Terminationselemente der aktiv exprimierten Gene beinhalten, welche glykolytische Enzyme kodieren, die in großen Mengen produziert werden, wenn Hefen in glukosereichen Medien gezogen werden, können verwendet werden. Bekannte glykolytische Gene können ebenfalls sehr effiziente Transkriptionskontrollsignale darstellen. Beispielsweise können die Promotor- und Terminatorsignale des Phosphoglyzerinsäurekinase (PGK)-Gens verwendet werden. Eine Reihe von Ansätzen kann zu unternehmen sein, um Expressionsplasmide, die zur Expression klonierter Immunglobulin-cDNA in Hefe optimal sind, auszulesen (siehe Glover, D.M., Hrsg., DNA Cloning Vol. II, S. 45-66, IRL Press, 1985).
  • Bakterienstämme können ebenfalls als Wirte zur Produktion von Antikörpermolekülen oder Antikörperfragmenten, wie durch diese Erfindung beschrieben, verwendet werden. E. coli K12-Stämme wie etwa E. coli W3110 (ATCC 27325) und andere Enterobakteria wie etwa Salmonella typhimurium oder Serratia marcescens und verschiedene Pseudomonas-Spezies können verwendet werden.
  • Plasmidvektoren, die Replikon- und Kontrollsequenzen enthalten, welche sich von Spezies ableiten, die mit einer Wirtszelle kompatiblen sind, werden in Verbindung mit diesen bakteriellen Wirten verwendet. Der Vektor trägt eine Replikationsstelle sowie spezifische Gene, die in der Lage sind, die phenotypische Selektion transformierter Zellen zu ermöglichen. Zur Auslese der Expressionsplasmide für die Produktion von Mäuseantikörpern und chimeren Antikörpern, Fragmenten und Regionen oder Antikörperketten, die durch klonierte Immunglobulin-cDNAs in Bakterien kodiert werden, muß eine Reihe von Ansätzen in Kauf genommen werden (siehe Glover, D.M., Hrsg., DNA Cloning, Vol. I, IRL Press, 1985).
  • Bevorzugte Wirte sind Säugetierzellen, in vitro oder in vivo gewachsen. Säugetierzellen versehen Immunglobulin-Proteinmoleküle mit posttranslationalen Modifikationen, einschließlich Leitpeptid-Entfernung, Faltung und Zusammensetzung von H- und L-Ketten, Glykosylierung der Antikörpermoleküle und Sekretion des funktionellen Antikörperproteins.
  • Säugetierzellen, die als Wirte zur Produktion von Antikörperproteinen geeignet sein können, beinhalten zusätzlich zu den oben beschriebenen Zellen lymphoiden Ursprungs Zellen, die von Fibroblasten abstammen, wie etwa Vero (ATCC CRL 81) oder CHO-K1 (ATCC CRL 61).
  • Zur Expression klonierter H- und L-Kette-Gene in Säugetierzellen stehen viele Vektorsysteme zur Verfügung (siehe Glover, D.M., Hrsg., DNA Cloning, Vol. II, S. 143-238, IRL Press, 1985). Verschiedene Ansätze können verfolgt werden, um vollständige H2L2-Antikörper zu erhalten. Wie oben diskutiert, ist es möglich, H- und L-Ketten in den selben Zellen zu coexprimieren, um intrazelluläre Assoziation und Verknüpfung von H- und L-Ketten zu kompletten tetrameren H2L2-Antikörpern zu erreichen. Die Coexpression kann durch Verwenden entweder der selben oder verschiedener Plasmide im selben Wirt stattfinden. Gene für sowohl H- als auch L-Ketten können in dem selben Plasmid, welches dann in Zellen transfiziert wird, untergebracht werden, wodurch direkt auf Zellen hin selektioniert wird, die beide Ketten exprimieren. Alternativ können Zellen zuerst mit einem Plasmid transfiziert werden, das eine Kette, z. B. die L-Kette kodiert, gefolgt durch Transfektion der resultierenden Zellinie mit einem H-Kette-Plasmid, das einen zweiten selektionsfähigen Marker enthält. Zellinien, die H2L2-Moleküle über beide Wege produzieren, können mit Plasmiden transfiziert werden, die zusätzliche Kopien von H-, L- oder H- plus L-Ketten in Verbindung mit zusätzlichen selektionsfähigen Markern kodieren, um Zellinien mit verbesserten Eigenschaften, wie etwa höhere Produktion zusammengesetzter H2L2-Antikörpermoleküle oder verbesserte Stabilität der transfizierten Zellinien, hervorzubringen.
  • Zusätzlich zu monoklonalen oder chimeren anti-TNF-Antikörpern ist die vorliegende Erfindung auch auf einen anti-idiotypen (Anti-Id) Antikörper gerichtet, der spezifisch gegen den anti-TNF-Antikörper der Erfindung gerichtet ist. Ein anti-Id-Antikörper ist ein Antikörper, der einzigartige Determinanten erkennt, die im allgemeinen mit der Antigen-bindenden Region eines anderen Antikörpers assoziiert sind. Der Antikörper, der für TNF spezifisch ist, wird als der idiotype oder Id-Antikörper bezeichnet. Der anti-Id kann hergestellt werden, indem ein Tier derselben Spezies und desselben genetischen Typs (z.B. Mäusestamms) wie dasjenige, aus dem der Id-Antikörper stammt, mit dem Id-Antikörper oder der Antigen-bindenden Region daraus immunisiert wird. Das immunisierte Tier wird die idiotypen Determinanten des immunisierenden Antikörpers erkennen und darauf antworten und einen Anti-Id-Antikörper-produzieren. Der Anti-Id-Antikörper kann auch als ein „Immunogen" benutzt werden, um eine Immunantwort in noch einem weiteren Tier zu erzeugen, wodurch ein sogenannter anti-anti-Id-Antikörper produziert wird. Der anti-anti-Id kann in seinem Epitop mit dem ursprünglichen Antikörper, der den anti-Id-Antikörper induziert hat, identisch sein. Durch die Verwendung von Antikörpern gegen die idiotypen Determinanten eines mAb ist es deshalb möglich, andere Klone zu identifizieren, die Antiköper von identischer Spezifität exprimieren.
  • Dementsprechend können mAbs, die gemäß der vorliegenden Erfindung gegen TNF erzeugt wurden, verwendet werden, um anti-Id-Antikörper in geeigneten Tieren, wie etwa BALB/c Mäusen, zu induzieren. Milzzellen derartiger immunisierter Mäuse können verwendet werden, um anti-Id-Hybridomzellen zu produzieren, die anti-Id-mAbs sezenieren. Weiterhin können die anti-Id-mAbs an einen Trägerstoff wie etwa „Keyhole-Limpet-Hemocyanin" (KLH) gekoppelt und zur Immunisierung weiterer BALB/c Mäuse verwendet werden. Seren dieser Mäuse werden anti-anti-Id-Antikörper enthalten, welche die Bindungseigenschaften des ursprünglichen mAb aufweisen, der spezifisch gegen ein TNF-Epitop gerichtet ist.
  • Die chimären Antikörper, Fragmente und Derivate der vorliegenden Erfindung sind zur Behandlung eines Organismus nutzbar, der ein Krankheitsbild oder Beschwerden aufweist, die mit Konzentrationen einer, mit einem anti-TNF-Antikörper reagierenden Substanz, insbesondere TNF, verbunden sind, die weit über den Konzentrationen in einem normalen gesunden Organismus liegen. Solche Krankheitsbilder beinhalten, sind aber nicht darauf beschränkt, das septische Syndrom einschließlich Kachexie, Kreislaufkollaps und Schock, resultierend aus akuter oder chronischer bakterieller Infektion, akute und chronische parasitische oder infektiöse Prozesse einschließlich Infektionen durch Bakterien, Viren und Pilze, akute und chronische Immun- und Autoimmunerkrankungen wie etwa systemischer Lupus erythematodes und rheumatoide Arthritis, Alkohol-induzierte Hepatitis, chronisch-entzündliche Erkrankungen wie etwa Sarcoidose und Morbus Crohn, entzündliche Gefäßerkrankungen, wie etwa disseminierte intravasale Gerinnung, Graft-Versus-Host- Reaktion, Kawasaki-Syndrom sowie maligne Erkrankungen, an denen TNF-sezernierende Tumoren beteiligt sind.
  • Eine solche Behandlung umfaßt die parenterale Verabreichung einer Einzeldosis oder mehrfacher Dosen des Antikörpers, Fragments oder Derivats. Zum pharmazeutischen Gebrauch beim Menschen bevorzugt sind hochaffine, wirksame hTNFα-hemmende und/oder neutralisierende Mäuseantikörper und chimäre Antikörper, Fragmente und Regionen dieser Erfindung.
  • Monoklonale Antikörper können durch jedes Mittel verabreicht werden, das es dem aktiven Wirkstoff erlaubt, seinen Wirkort im Körper eines Säugetiers zu erreichen. Im Fall der Antikörper dieser Erfindung ist der wesentliche Gesichtspunkt die Fähigkeit, TNF, das durch Monozyten und Makrophagen freigesetzt wurde, zu erreichen und zu binden. Da Proteine einer Verdauung unterliegen, wenn sie oral verabreicht werden, würde üblicherweise die parenterale Verabreichung, d. h. intravenös, subkutan, intramuskulär, angewendet werden, um die Aufnahme zu optimieren.
  • Monoklonale Antikörper können entweder als individuelle therapeutische Wirkstoffe oder in Kombination mit anderen therapeutischen Wirkstoffen verabreicht werden. Sie können allein verabreicht werden, werden aber gewöhnlich mit einem pharmazeutischen Trägerstoff verabreicht, der auf der Grundlage des gewählten Darreichungswegs und üblicher pharmazeutischer Praxis ausgewählt wird.
  • Die verabreichte Dosis wird selbstverständlich variieren, in Abhängigkeit von bekannten Faktoren, wie etwa den pharmakodynamischen Charakteristika des speziellen Wirkstoffs sowie von Art und Weg seiner Verabreichung; Alter, Gesundheitszustand und Gewicht des Empfängers; Art und Ausmaß von Symptomen, Art einer gleichzeitig erfolgenden Behandlung, Häufigkeit der Behandlung und dem gewünschten Effekt. Gewöhnlich kann eine tägliche Dosierung des aktiven Bestandteils etwa 0,1 bis 100 mg pro Kilogramm Körpergewicht betragen. Üblicherweise sind 0,5 bis 50 und bevorzugterweise 1 bis 10 mg pro Kilogramm pro Tag, in Dosen aufgeteilt 1 bis 6 mal am Tag oder in einer langanhaltenden Freisetzungsform verabreicht, wirksam, um die gewünschten Ergebnisse zu erzielen.
  • Dareichungsformen (Zusammensetzungen), die zur inneren Anwendung geeignet sind, enthalten im allgemeinen ungefähr 1 mg bis ungefähr 500 mg eines aktiven Inhaltsstoffs pro Einheit. In diesen pharmazeutischen Zusammensetzungen wird der aktive Inhaltsstoff normalerweise in einer Menge von ungefähr 0,5 bis 95 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der Zusammensetzung, vorhanden sein.
  • Zur parenteralen Verabreichung kann die Antikörper-Formulierung eine Lösung, Suspension, Emulsion oder ein lyophilisiertes Pulver in Verbindung mit einem pharmazeutisch vertretbaren parenteralen Vehikel sein. Beispiele solcher Vehikel sind Wasser, Kochsalzlösung, Ringer-Lösung, Dextrose-Lösung und 5 %ige Lösung von humanem Serumalbumin. Liposomen und nicht-wässrige Vehikel, wie etwa fixierte Öle, können ebenfalls verwendet werden. Das Vehikel oder lyophilisierte Pulver kann Additive enthalten, die Isotonie (z. B. Natriumchlorid, Mannitol) und chemische Stabilität (z. B. Puffer und Konservierungsstoffe) gewährleisten. Die Formulierung wird durch üblicherweise verwendete Techniken sterilisiert.
  • Geeignete pharmazeutische Trägerstoffe werden in der jüngsten Ausgabe von Remington's Pharmaceutical Sciences, A. Osol, einem Standardreferenztext auf diesem Gebiet, beschrieben.
  • Beispielsweise wird eine parenterale Zusammensetzung, die zur Verabreichung durch Injektion geeignet ist, durch Lösen von 1,5 Gew.-% eines aktiven Inhaltsstoffs in 0,9 %iger Natriumchlorid-Lösung präpariert.
  • Die chimären Antikörper dieser Erfindung können aufgrund ihrer Fähigkeit, Antikörper-abhängige zelluläre Zytotoxizität (ADCC) und/oder Komplement-abhängige Zytotoxizität (CDC) gegenüber Zellen mit oberflächenassoziiertem TNF zu vermitteln, entsprechend angepaßt werden, daß sie therapeutisch wirksam sind. Zu diesem Zweck können Effektorzellen (für ADCC) oder Komplementkomponenten (für CDC) aus entweder endogener Quelle oder exogener Quelle verwendet werden. Die chimären Antikörper, Fragmente und Regionen dieser Erfindung, ihre Fragmente und Derivate können therapeutisch als Immun-Konjugate verwendet werden (zur Übersicht: Dillman, R.O., Ann. Int. Med. 111:592-603 (1989)). Sie können an zytotoxische Proteine, einschließlich, aber nicht darauf beschränkt, Ricin-A, Pseudomonas-Toxin, Diphterietoxin und TNF gekoppelt werden. Toxine, die mit Antikörpern oder anderen Liganden konjugiert sind, entsprechen dem Stand der Techhnik (siehe z. B. Olsnes, S. et al., Immunol. Today 10:291-295 (1989)). Pflanzliche und bakterielle Toxine töten Zellen typischerweise durch Lahmlegen der Proteinsynthese-Maschinerie.
  • Die chimeren Antikörper dieser Erfindung können mit weiteren Arten therapeutischer Einheiten konjungiert werden, einschließlich, aber nicht darauf beschränkt, Radionuklide, zytotoxische Agenzien und Arzneistoffe. Beispiele für Radionuklide, die an Antikörper gekoppelt und in vivo an Stellen mit Antigen befördert werden können, beinhalten 212Bi, 131I, 186Re und 90Y, wobei diese Liste keine Vollständigkeit beabsichtigt. Die Radionuklide üben ihre zytotoxische Wirkung durch lokale Bestrahlung der Zellen aus, was zu verschiedenen intrazellulären Läsionen führt, was auf dem Fachgebiet als Radiotherapie bekannt ist.
  • Zytotoxische Arzneistoffe, die mit Antikörpern konjugiert und anschließend zur in vivo-Therapie benutzt werden können, beinhalten, ohne darauf beschränkt zu sein, Daunorubicin, Doxorubicin, Methotrexat und Mitomycin C. Zytotoxische Arzneistoffe greifen in kritische zelluläre Prozesse, einschließlich DNA-, RNA- und Proteinsynthese ein. Eine ausführlichere Darstellung dieser, nach dem Stand der Technik bekannten Wirkstoffklassen und ihrer Wirkungsmechanismen finden sich bei Goodman, A.G., et al., Goodman and Gilman's THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS, 7. Auflg., Macmillan Publishing Co., 1985.
  • Die chimären Antikörper dieser Erfindung können vorteilhafterweise in Kombination mit anderen monoklonalen oder Mäuseantikörpern und chimären Antikörpern, Fragmenten und Regionen verwendet werden, oder mit Lymphokinen oder hämatopoetischen Wachstumsfaktoren, etc., die dazu dienen, die Anzahl oder Aktivität von Effektorzellen, die mit dem Antikörper interagieren, zu steigern.
  • Die chimären Antikörper, Fragmente oder Derivate dieser Erfindung können ebenfalls in Kombination mit einer TNF-Therapie verwendet werden, um unerwünschte Nebenwirkungen von TNF zu unterbinden. Jüngste Ansätze zur Krebstherapie haben eine direkte Verabreichung von TNF an Krebspatienten oder eine Immuntherapie von Krebspatienten mit Lymphokin-aktivierten Killer (LAK)-Zellen (Rosenberg et al., New Eng. J. Med. 313: 1485-1492 (1985)) oder Tumor-infiltrierenden Lymphozyten (TIL) (Kurnik et al., Clin. Immunol. Immunopath. 38:367-380 (1986); Kradin et al., Cancer Immunol. Immunother. 24:76-85 (1987); Kradin et al., Transplant. Proc. 20:336-338 (1988)) einbezogen. Gegenwärtig werden Versuche mit modifizierten LAK-Zellen oder TIL, die mit dem TNF-Gen transfiziert wurden, um große Mengen an TNF herzustellen, durchgeführt. Solche therapeutischen Ansätze sind wahrscheinlich mit etlichen unerwünschten Nebenwirkungen verbunden, die durch die oben beschriebenen pleiotropen Wirkungen von TNF verursacht werden. Gemäß der vorliegenden Erfindung können diese Nebenwirkungen durch gleichzeitige Behandlung eines Empfängers, der TNF oder Zellen, die große Mengen an TNF produzieren, erhält, mit den Antikörpern, Fragmenten oder Derivaten der vorliegenden Erfindung gemildert werden. Zu diesem Zweck wirksame Dosen entsprechen den oben beschriebenen. Die Höhe der Dosis wird eine Anpassung an die verabreichte Dosis von TNF oder TNF-produzierenden Zellen erfordern, um Nebenwirkungen zu unterbinden, ohne die hauptsächliche anti-Tumorwirkung von TNF zu blockieren. Die durchschnittliche Fachperson wird wissen, wie derartige Dosen ohne übermäßiges Experimentieren zu ermitteln sind.
  • Die chimären Antikörper, Fragmente und Regionen, Fragmente oder Derivate dieser Erfindung können, angehängt an einen festen Träger, verwendet werden, um TNF aus Flüssigkeiten oder Gewebe- oder Zellextrakten zu entfernen. In einer bevorzugten Ausführungsform werden sie verwendet, um TNF aus Blut oder Blutplasmaprodukten zu entfernen. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform werden die chimären Antikörper, Fragmente und Regionen vorteilhafterweise außerhalb des Körpers in Immunadsorbtionseinheiten verwendet, die Stand der Technik sind (siehe z. B. Seminars in Hematology, Vol. 26 (2 Suppl. 1) (1989)). Patientenblut oder andere Körperflüssigkeit wird mit dem immobilisierten Antikörper in Kontakt gebracht, was zu einer teilweisen oder vollständigen Entfernung von zirkulierendem TNF (frei oder in Form von Immunkomplexen) führt, woraufhin die Flüssigkeit dem Körper wieder zugeführt wird. Diese Immunadsorption kann in einer kontinuierlichen Durchflußeinrichtung mit oder ohne Einbeziehung eines Zellzentrifugationsschritts zur Anwendung gebracht werden. Siehe z.B. Terman, D.S. et al., J. Immunol. 117:1971-1975 (1976).
  • Die vorliegende Erfindung stellt die oben beschriebenen chimären Antikörper, Fragmente und Derivate, die wie unten beschrieben detektierbar markiert sind, auch zur Anwendung in diagnostischen Verfahren zur Verfügung, um TNFα in Patienten, von denen bekannt ist oder bei denen der Verdacht besteht, daß ihre Beschwerden durch TNFα vermittelt werden, nachzuweisen.
  • Die chimären Antikörper der vorliegenden Erfindung sind nützlich bei Immuntests, die TNF oder anti-TNF-Antikörper in einer Probe nachweisen oder quantifizieren. Ein Immuntest zum Nachweis von TNF umfaßt typischerweise das Inkubieren einer biologischen Probe in Gegenwart eines detektierbar markierten Hochaffinitäts-Antikörpers der vorliegenden Erfindung, der zur selektiven Bindung an TNF fähig ist, und das Nachweisen des markierten Antikörpers, der in einer Probe gebunden ist. Verschiedene klinische Immuntest-Verfahren werden beschrieben in Immunoassays for the 80's, A. Voller et. al.. Hrsg., University Park, 1981.
  • Bezüglich dieses Aspekts der Erfindung kann der Antikörper oder eine biologische Probe somit auf Nitrozellulose oder einen anderen festen Träger, der in der Lage ist, Zellen, Zellpartikel oder lösliche Proteine zu immobilisieren, gegeben werden. Der Träger kann dann mit geeigneten Puffern gewaschen werden, gefolgt durch Behandlung mit dem detektierbar markierten TNF-spezifischen Antikörper. Der Festphaseträger kann dann mit dem Puffer ein zweites Mal gewaschen werden, um nicht gebundenen Antikörper zu entfernen. Die Menge an gebundener Markierung auf dem festen Träger kann dann durch konventionelle Mittel detektiert werden.
  • Mit „Festphaseträger" oder „Trägerstoff" ist jeder Träger gemeint, der zur Bindung von Antigen oder Antikörpern in der Lage ist. Hinlänglich bekannte Träger oder Trägerstoffe beinhalten Glas, Polystyrol, Polypropylen, Polyethylen, Dextran, Nylon, Amylasen, natürliche und modifizierte Zellulosen, Polyacrylamide, Agarosen und Magnetit. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung kann der Trägerstoff entweder in gewissem Maß löslicher Natur oder unlöslich sein. Das Trägermaterial kann praktisch jeden möglichen strukturellen Aufbau haben, sofern das gekoppelte Molekül in der Lage ist, TNF oder einen anti-TNF-Antikörper zu binden. Dementsprechend kann die Gestalt des Trägers sphärisch sein wie bei einem Korn oder zylindrisich wie bei der inneren Oberfläche eines Reagenzglases oder der äußeren Oberfläche eines Stabs. Alternativ kann die Oberfläche flach sein wie bei einem Blatt, einem Teststreifen, etc. Bevorzugte Träger beinhalten Polystyrolkörner. Der sachkundigen Person werden viele andere geeignete Trägerstoffe zur Bindung von Antikörpern oder Antigenen bekannt sein oder sie wird in der Lage sein, dieselben durch Anwendung von Routineexperimenten herauszufinden.
  • Die Bindungsaktivität einer vorgegebenen Menge an anti-TNF-Antikörpern kann nach gut bekannten Methoden bestimmt werden. Die sachkundige Person wird in der Lage sein, durch Routineexperimente wirksame und optimale Testbedingungen für jede Bestimmung zu ermitteln.
  • Eine der Arten, auf die TNF-spezifische Antikörper detektierbar markiert werden können, ist durch Bindung derselben an ein Enzym und Verwendung in einem Enzym-Immunoassay (EIA) oder Enzyme-Linked-Immunosorbent-Assay (ELISA). Dieses Enzym, wird es anschließend mit seinem Substrat in Kontakt gebracht, wird mit dem Substrat unter Bildung einer chemischen Verbindung reagieren, die z. B. durch spektrophotometrische, fluorometrische oder durch visuelle Mittel nachgewiesen werden kann. Enzyme, die zur detektierbaren Markierung der chimeren TNF-spezifischen Antikörper der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, beinhalten, ohne darauf beschränkt zu sein, Malatdehydrogenase, Staphylococcus-Nuklease, Delta-5-steroid-Isomerase, Alkoholdehydrogenase aus Hefe, alpha-Glycerophosphatdehydrogenase, Triosephosphat-Isomerase, Meerrettichperoxidase, alkalische Phosphatase, Asparaginase, Glukoseoxidase, beta-Galactosidase, Ribonuklease, Urease, Katalase, Glukose-6-phosphat-Dehydrogenase, Glucoamylase und Acetylcholinesterase.
  • Durch radioaktive Markierung der TNF-spezifischen Antikörper ist es möglich, TNF mittels eines Radio-Immunoassay (RIA) (siehe z. B., Work, T.S., et al.. Laboratory Techniques and Biochemistry in Molecular Biology, North Holland Publishing Company, N.Y. (1978) zu detektieren. Das radioaktive Isotop kann durch derartige Mittel wie etwa die Verwendung eines Gammazählers oder eines Szintillationszählers oder durch Autoradiographie nachgewiesen werden. Für den Zweck der vorliegenden Erfindung besonders nützliche Isotope sind: 3H, 125I, 131I, 35S, 14C und bevorzugt 125I.
  • Ebenfalls ist es möglich, die TNF-spezifischen Antikörper mit einer Fluoreszenzverbindung zu markieren. Wird der Fluoreszenz-markierte Antikörper Licht der geeigneten Wellenlänge ausgesetzt, kann sein Vorhandensein aufgrund der Fluoreszenz nachgewiesen werden. Unter den am häufigsten verwendeten Fluoreszenz-markierenden Verbindungen sind Fluoresceinisothiocyanat, Rhodamine, Phycoerythrin, Phycocyanin, Allophycocyanin, o-Phthalaldehyd und Fluorescamine.
  • Die TNF-spezifischen Antikörper können auch durch die Verwendung Fluoreszenz-emittierender Metalle wie etwa 152Eu oder anderer Elemente aus der Gruppe der Lanthanoide detektierbar markiert werden. Diese Metalle können an den TNF-spezifischen Antikörper angehängt werden, indem Gruppen wie Diethylentriaminpentaessigsäure (DTPA) oder Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), die solche Metalle chelatisieren, verwendet werden.
  • Die TNF-spezifischen Antikörper können auch durch Kupplung an eine chemilumineszierende Verbindung detekierbar markiert werden. Die Anwesenheit des Chemilumineszenz-markierten Antikörpers wird dann durch Nachweis des Vorhandenseins von Lumineszenz, die im Verlauf einer chemischen Reaktion auftritt, ermittelt. Beispiele besonders geeigneter Chemiluminszenz-markierender Verbindungen sind Luminol, Isoluminol, aromatische Acridiniumester, Imidazol, Acridiniumsalze und Oxalsäureester.
  • Eine biolumineszierende Verbindung kann ebenfalls verwendet werden, um den TNF-spezifischen Antikörper, ein Fragment oder Derivat der vorliegenden Erfindung zu markieren. Biolumineszenz ist eine Art von Chemilumineszenz, die in biologischen Systemen zu finden ist, in denen ein katalytisches Protein die Effizienz der Chemilumineszenz-Reaktion steigert. Die Anwesenheit eines Biolumineszenz-Proteins wird durch Messung des Vorhandenseins von Lumineszenz nachgewiesen. Wichtige Biolumineszenz-Verbindungen zum Zweck der Markierung sind Luziferin, Luziferase und Aequorin.
  • Eine Detektion des TNF-spezifischen Antikörpers, Fragments oder Derivats kann beispielsweise durch einen Szintillationszähler erfolgen, wenn die detektierbare Markierung radioaktive Gammastrahlen emittiert oder beispielsweise durch ein Fluorometer, wenn die Markierung ein floureszierendes Material ist. Im Fall einer Enzymmarkierung kann der Nachweis durch colorometrische Methoden erfolgen, die ein Substrat des Enzyms nutzen. Die Detektion kann auch durch visuellen Vergleich des Ausmaßes des enzymatischen Umsatzes eines Substrats im Verhältnis zu ähnlich präparierten Standards erfolgen.
  • Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung, nämlich die Verwendung chimärer Antikörper, kann TNF, nachgewiesen durch die oben beschriebenen Tests, in einer biologischen Probe vorhanden sein. Jede Probe, die TNF enthält, kann verwendet werden.
  • Bevorzugterweise ist die Probe eine biologische Flüssigkeit wie etwa beispielsweise Blut, Serum, Lymphe, Urin, entzündliches Exsudat, Cerebrospinalflüssigkeit, Amnionflüssigkeit, ein Gewebeextrakt oder Gewebehomogenat, und ähnliches. Die Erfindung ist jedoch nicht auf Tests, bei denen nur diese Proben eingesetzt werden, beschränkt, es sollte der durchschnittlichen Fachperson möglich sein, geeignete Bedingungen zu bestimmen, welche die Verwendung anderer Proben erlauben.
  • Eine Detektion in situ kann erfolgreich durchgeführt werden, indem einem Patienten eine histologische Probe entnommen und eine solche Probe mit der Kombination aus markierten Antikörpern der vorliegenden Erfindung versetzt wird. Bevorzugterweise wird der Antikörper (oder das Fragment) durch Aufgeben oder durch Überschichten einer biologischen Probe mit dem markierten Antikörper (oder Fragment) bereitgestellt. Durch die Verwendung eines solchen Verfahrens ist es möglich, nicht nur das Vorhandensein von TNF festzustellen, sondern auch die Verteilung von TNF in dem untersuchten Gewebe zu bestimmen. Bei Anwendung der vorliegenden Erfindung ist für die durchschnittliche Fachperson leicht zu erkennen, daß jede einer Vielzahl von histologischen Methoden (wie etwa Färbeverfahren) modifiziert werden kann, um eine derartige in situ-Detektion zu erreichen.
  • Der chimere Antikörper, das Fragment oder Derivat der vorliegenden Erfindung kann an die Verwendung in einem immunometrischen Test, auch bekannt als „zweiseitiger" oder „Sandwich"-Test, angepaßt werden. In einem typischen immunometrischen Test ist eine bestimmte Menge an nicht-markiertem Antikörper (oder Antikörperfragment) an einen festen Träger gebunden, der in der untersuchten Flüssigkeit unlöslich ist, und eine bestimmte Menge an detektierbar markiertem, löslichen Antikörper wird dazugegeben, um die Detektion und/oder Quantifizierung des ternären Komplexes, der sich zwischen Festphase, Antikörper, Antigen und markiertem Antikörper bildet, zu erlauben.
  • Typischerweise und bevorzugterweise beinhalten immunometrische Tests sogenannte „Forward"-Tests, in denen der an die feste Phase gebundene Antikörper zunächst mit der zu untersuchenden Probe in Kontakt gebracht wird, um TNF durch Bildung eines binären Komplexes von TNF mit dem an die Festphase gebundenen Antikörper aus der Probe zu extrahieren. Nach einer angemessenen Inkubationszeit wird der feste Träger gewaschen, um Reste der flüssigen Probe, einschließlich nicht-gebundenem TNF, falls vorhanden, zu entfernen und dann mit der Lösung, die eine bekannte Menge an markiertem Antikörper (der die Funktion eines „Reportermoleküls" erfüllt) in Kontakt gebracht. Nach einer zweiten Inkubationseinheit, die es dem markierten Antikörper erlaubt, mit TNF, der über den unmarkierten Antikörper an den festen Träger gebunden ist, einen Komplex zu bilden, wird der feste Träger ein zweites Mal gewaschen, um den nicht-gebundenen markierten Antikörper zu entfernen. Dieser Typ eines "Forward-Sandwich"-Tests kann ein einfacher „ja/nein"-Test sein, um zu ermitteln, ob TNF vorhanden ist, oder kann als quantitativer Test durchgeführt werden, indem der Meßwert für den markierten Antikörper mit dem, der für eine Standardprobe mit bekannten Mengen an TNF erhalten wurde, verglichen wird. Derartige „zweiseitige" oder „Sandwich"-Tests wurden durch Wide (Radioimmune Assay Method, Kirham, Hrsg. E. & S. Livingstone, Edinburgh, 1970, S. 199-206) beschrieben.
  • Andere Arten von „Sandwich"-Tests, die ebenfalls in Verbindung mit TNF anwendbar sind, sind die sogenannten „simultanen" und „reversen" Tests. Ein simultaner Test umfaßt einen einzigen Inkubationsschritt, bei dem der an die feste Phase gebundene Antikörper und der markierte Antikörper beide zur gleichen Zeit zu der zu untersuchenden Probe gegeben werden. Nachdem die Inkubation abgeschlossen ist, wird der feste Träger gewaschen, um Reste der flüssigen Probe und von nicht-komplexiertem markiertem Antikörper zu entfernen. Das Vorhandensein von markiertem Antikörper, assoziiert mit den festen Träger, wird dann wie bei einem konventionellen „Forward-Sandwich"-Test bestimmt.
  • Bei dem „reversen" Test wird die schrittweise Zugabe von zunächst einer Lösung mit markiertem Antikörper zu der flüssigen Probe, nach angemessener Inkubationszeit gefolgt durch die Zugabe von unmarkiertem Antikörper, der an einem festen Träger gebundenen ist, verwendet. Nach einer zweiten Inkubation wird die feste Phase auf konventionelle Weise gewaschen, um sie von den Resten der zu untersuchenden Probe und der Lösung mit nicht-gebundenem markiertem Antikörper zu befreien. Die Bestimmung von markiertem Antikörper, der mit einem festen Träger assoziiert ist, wird dann wie in den „simultanen" und „Forward"-Tests bestimmt. In einer Ausführungsform kann eine Kombination von Antikörpern der vorliegenden Erfindung, die für einzelne Epitope spezifisch sind, verwendet werden, um einen empfindlichen dreiseitigen immunoradiometrischen Test zu entwickeln.
  • Nachdem die Erfindung bisher in allgemeiner Form beschrieben wurde, wird dieselbe durch Bezugnahme auf bestimmte spezielle Beispiele, die nur zum Zweck der Illustration hierin aufgenommen wurden und, wenn nicht anders angegeben, keine Einschränkung beabsichtigen, umfassender verstanden werden.
  • BEISPIEL I
  • Produktion eines Maus-anti-Mensch-TNF-mAb
  • Um die klinische Untersuchung von TNF-mAb zu ermöglichen, wurde ein hochaffiner, wirksam hemmender und/oder neutralisierender Maus-anti-Mensch-TNF-IgG1-mAb, bezeichnet als A2, hergestellt.
  • BALB/c Mäuseweibchen, 10 Wochen alt, wurden vom Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) bezogen. Vierzig μg gereinigter rekombinanter menschlicher TNF (rhTNF) aus E. coli, emulgiert mit einem gleichen Volumen von komplettem Freund'schem Adjuvans (bezogen von Difco Laboratories) in 0,4 ml, wurden einer Maus subkutan und intraperitoneal (i.p.) injiziert. Eine Woche später wurde eine Injektion von 5 μg rhTNF in inkomplettem Freund'schem Adjuvans i.p. verabreicht, gefolgt von vier aufeinanderfolgenden i.p. Injektionen von 10 μg TNF ohne Adjuvans. Acht Wochen nach der letzten Injektion erhielt die Maus eine Wiederholungsimpfung i.p. mit 10 μg TNF.
  • Vier Tage später wurde die Maus getötet, die Milz wurde entnommen und eine Suspension aus Milzzellen wurde präpariert. Die Milzzellen wurden mit Zellen der nicht-sezernierenden Hybridom-Zellinie Sp2/0 (ATCC CRL1581) in einem Verhältnis von 4:1 Milzzellen zu Sp2/0 Zellen in Gegenwart von 0,3 ml 30 % Polyethylenglycol, PEG 1450, fusioniert. Nach 6-stündiger Inkubation bei 37°C wurden die fusionierten Zellen in Aliquots von 0,2 ml in 96-Well-Platten mit Konzentrationen von 2 × 104 Sp2/0 Zellen pro Napf aufgeteilt. Fütterungszellen in Gestalt von 5 × 104 normalen BALB/c Milzzellen wurden jedem Napf zugegeben.
  • Das verwendete Wachstumsmedium bestand aus RPMI 1640-Medium, 10 % Hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum (FBS) (Hyclone), 0,1 mM MEM nicht-essentielle Aminosäuren, 1 mM Natriumpyruvat, 2 mM L-Glutamin, 100 U/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin (GIBCO Laboratories) und, zur Selektion, Hypoxanthin-Aminopterin-Thymidin (HAT) (Boehringer Mannheim).
  • Ein Festphase-Radioimmuntest (RIA) wurde eingesetzt, um Überstände auf das Vorhandensein von rhTNFα-spezifischen mAbs durchzumustern. Dieser Test wird unten in Beispiel II beschrieben. Die Hintergrundbindung in diesem Test betrug etwa 500 cpm. Ein Überstand wurde als positiv beurteilt, wenn er eine Bindung von 2000 cpm oder mehr aufwies.
  • Von 322 durchgemusterten Überständen waren 25 positiv, nachgewiesen durch RIA. Aus diesen 25 wurde derjenige mit der höchsten Bindung (4800 cpm) als A2 bezeichnet. Näpfe mit einem positiven Ergebnis wurden durch limitierte Verdünnung auf Mäuse-Fütterungszellen subkloniert. Nach weiterer Analyse der Überstände in Neutralisierungstests erwies sich A2 als der einzige positive Klon, der wirksam hemmende und/oder neutralisierender Aktivität zeigte. Folglich wurde die Hybridom-Zellinie A2 ausgewählt. Diese Zellinie wurde in RPMI 1640-Medium mit 10 % FBS (GIBCO), 0,1 mM nicht-essentielle Aminosäuren, 1 mM Natriumpyruvat, 2 mM L-Glutamin, 100 U/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin gehalten.
  • Alternativ können anti-TNF-Antikörper, die die biologische Aktivität von TNF hemmen, durch Bindung an ein Peptid, das mindestens 5 Aminosäuren der Reste 87-108 oder sowohl der Reste 59-80 als auch 87-108 von TNF (aus SEQ ID NO:1) enthält, oder an Kombinationen von Peptiden, die darin enthalten sind, die anstelle des rTNF Proteins, wie oben beschrieben, verwendet wurden, durchgemustert werden.
  • BEISPIEL II
  • Charakterisierung eines anti-TNF-Antikörpers der vorliegenden Erfindung
  • A. Radioimmuntests
  • rhTNF aus E. coli wurde auf 1 μg/ml in BCB-Puffer, pH 9,6, verdünnt und 0,1 ml dieser Lösung wurde zu jedem Test-Napf gegeben. Nach Inkubation über Nacht bei 4°C wurden die Näpfe kurz mit BCB gewaschen, dann mit 1 % Rinderserumalbumin (BSA) in BCB bei 37°C für 1 Stunde bedeckt. Die Näpfe wurden dann 3-mal mit 0,05 % Tween-20 enthaltendem PBS (PBS-Tween) gewaschen und jedem Napf wurden 70 μl verdünnte A2-Ascitesflüssigkeit zugesetzt. Die Näpfe wurden 2 Stunden bei 37°C inkubiert und dreimal mit PBS-Tween gewaschen. Danach wurden ungefähr 50.000 cpm eines 125I-markierten F(ab')2 Fragments von Schaf-anti-Maus-Ig-Antikörpern in 50 μl PBS-Tween mit 1 % BSA zu jedem Napf gegeben und die Näpfe wurden für weitere 2 Stunden bei 37°C inkubiert. Die Näpfe wurden 4-mal mit PBS-Tween gewaschen, ausgeschnitten und für jeden einzelnen wurde die Radioaktivität gemessen. Ergebnisse zweier Bestimmungen werden in 1 gezeigt.
  • rhTNF in einer Konzentration von 5 μg/ml in PBS wurde auf 60°C erhitzt. Zu verschiedenen Zeitpunkten wurden Aliquots der Hitze-behandelten TNF-Präparation rasch auf 4°C abgekühlt, 5-fach in BCB verdünnt und verwendet, um die Näpfe der RIA-Mikrotiterplatten zu beschichten. Der RIA wurde exakt wie oben beschrieben durchgeführt. Ergebnisse zweier Bestimmungen werden in 2 gezeigt. Da die Inkubation bei 60°C die biologische Aktivität von hTNFα wesentlich verminderte, zeigt dieses Experiment, daß mAb A2 Hitze-inaktivierten menschlichen TNFα nicht binden kann.
  • B. Neutralisationstests
  • Proben von A2 und cA2 wurden durch Affinitätschromatographie an Protein A aus Gewebekulturüberständen von Hybridomzellen der als C134A bzw. C168A (oben beschrieben) bezeichneten Zellinien gereinigt und in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS), pH 7,2, diafiltriert.
  • Die toxische Wirkung von TNF auf bestimmte Tumorzellinien wurde auf eine in vitro-Meßmethode zur Bestimmung von TNF-Konzentrationen in Laborproben übertragen. Die Nachweismethode von Feinman et al., J. Immunol. 138:635-640 (1987), modifiziert durch Aderka et al., J. Immunol. 143:3517-3523 (1989) durch den Einsatz der TNF-sensitiven Zielzellinie A673 (eine menschliche Rhabdomyosarcomzellinie), wurde verwendet, um die Fähigkeit von A2, die TNF-Toxizität zu hemmen oder zu neutralisieren, zu untersuchen.
  • Kultivierte menschliche A673/6 Zellen wurden mit 40 pg/ml natürlichem (Genzyme, Boston, MA) oder rekombinantem (Suntory, Osaka, Japan) menschlichem TNFα mit verschiedenen Konzentrationen von mAb A2 in Gegenwart von 20 μg/ml Cycloheximid bei 39°C über Nacht inkubiert. Kontrollen enthielten nur Medium oder Medium + TNF in jedem Napf. Der Zelltod wurde gemessen, indem mit Naphthol Blau-Schwarz gefärbt und die Ergebnisse spektrophotometrisch bei 630 nm gelesen wurden. Die Absorption bei dieser Wellenlänge korreliert mit der Anzahl der vorhandenen lebenden Zellen.
  • Es zeigte sich, daß A2 die zytotoxische Wirkung von sowohl natürlichem als auch rhTNF in einer dosisabhängigen Weise (3) hemmte oder neutralisierte.
  • In einem weiteren Experiment wurde die Spezifität dieser hemmenden und/oder neutralisierenden Aktivität getestet. A673/6 Zellen wurden in einer Dichte von 3 × 104 Zellen/Napf 20 Stunden vor Durchführung des TNF-Biotests ausgesät. Es wurden zweifache, serielle Verdünnungen von rhTNF, rekombinantem menschlichen Lymphotoxin (TNFβ) aus E. coli und rekombinantem Mäuse-TNF aus E. coli präpariert. Der Zellüberstand der A2-Hybridomzellen wurde in einem gleichen Volumen zu den verdünnten TNF-Präpärationen gegeben und die Mischungen wurden bei Raumtemperatur 30 Minuten inkubiert. Aliquots von 0,1 ml wurden in die Näpfe, die A673/6 Zellen enthielten, übertragen, 20 μg/ml Cycloheximid wurden zugesetzt und die Zellen wurden über Nacht bei 39°C inkubiert. Zur Beurteilung der Zytotoxizität wurden die Zellen dann fixiert und gefärbt. Die Ergebnisse zeigen, daß mAb A2 die Zytotoxizität von rhTNFα spezifisch hemmte oder neutralisierte, wogegen er keinen Effekt auf menschliches Lymphotoxin (TNFβ) (4) oder Mäuse-TNF (5) hatte.
  • Im nächsten Schritt wurden Experimente durchgeführt, um die Kreuzreaktivität von mAb A2 mit TNF aus nicht-menschlichen Primaten zu analysieren.
  • Monozyten, die durch Ficoll-Gradientenzentrifugation und Adhärenz aus dem Blut vom Pavian (B514), Cynomolgusaffe (J91) und Rhesusaffe (RH383) isoliert worden waren, wurden in einer Dichte von 1 × 105 Zellen/Napf in RPMI 1640-Medium mit 5 % FBS und 2 μg/ml LPS von E. coli 3 oder 16 Stunden bei 37°C inkubiert, um die TNF Produktion zu induzieren. Überstände von jeweils doppelt angesetzten Proben wurden vereinigt und bis zur Durchführung des TNF-Biotests, durchgeführt wie oben beschrieben unter Verwendung von A673/6 Zellen, bei 4°C weniger als 20 Stunden gelagert. Zweifache Verdünnungen der Kulturüberstände wurden entweder mit Medium oder mit gereinigtem mAb A2 gemischt und auf eine Endkonzentration von 1 μg/ml verdünnt, bei Raumtemperatur 30 Minuten inkubiert und Aliquots wurden auf die Indikatorzellen übertragen. Die Ergebnisse zeigten, daß mAb A2 die zytotoxische Aktivität von TNF, produziert durch Monozyten vom Pavian, Cynomolgusaffe und Rhesusaffe, nicht signifikant hemmte oder neutralisierte.
  • Ein weiteres Experiment wurde mit Schimpansen-TNF durchgeführt. Monozyten, isoliert aus Schimpansenblut (CH563), wurden wie oben beschrieben inkubiert, um TNF-enthaltende Überstände herzustellen. Die Fähigkeit von mAb A2, die Bioaktivität dieser Überstände in einer Konzentration von 10 μg/ml zu hemmen oder zu neutralisieren, wurde wie oben beschrieben getestet. Menschlicher TNF diente als eine positive Kontrolle. Die Ergebnisse, dargestellt in 6, zeigen, daß mAb A2 wirksam hemmende und/oder neutralisierende Aktivität gegenüber Schimpansen-TNF aufweist, ähnlich der Aktivität gegenüber menschlichem TNF (7).
  • Die hemmende und/oder neutralisierende Aktivität von mAb A2 wurde mit drei anderen, für menschlichen TNF spezifischen Mäuse-mAbs, genannt TNF-1, TNF-2 und TNF-3, und einem Kontroll-mAb verglichen. Zweifache, serielle Verdünnungen der gereinigten mAbs wurden mit rhTNF (40 pg/ml) gemischt, bei Raumtemperatur 30 Minuten inkubiert und Aliquots wurden wie oben auf TNF-Bioaktivität getestet. Es zeigte sich, daß die mAbs TNF-1, TNF-2 und TNF-3 hemmende und/oder neutralisierender Aktivität in jeweils ähnlich mäßigem Ausmaß aufwiesen. Im Gegensatz dazu hatte mAb A2 eine deutlich wirksamere hemmende und/oder neutralisierender Aktivität.
  • BEISPIEL III
  • Allgemeine Strategie zur Klonierung von V- und C-Genen eines Antikörpers
  • Die Strategie zur Klonierung der Gene für die V-Regionen der H- und L-Ketten der Hybridom-Zellinie A2, die den oben beschriebenen anti-TNF-Antikörper sezeniert, beruhte auf der Verbindung zwischen der V-Region und der korrespondierenden J (joining) -Region für funktionell neu arrangierte (und exprimierte) Ig-Gene im Genom. DNA-Sonden für J-Regionen können zum Durchmustern genomischer Genbibliotheken verwendet werden, um DNA zu isolieren, die mit den J-Regionen verbunden ist. Obwohl DNA in Keimbahn-Konfiguration (d. h. nicht neu arrangiert) ebenfalls mit J-Sonden hybridisieren würde, wäre diese DNA nicht mit einer Ig-V-Region-Sequenz verbunden und kann durch Restriktionsenzym-Analyse der isolierten Klone identifiziert werden.
  • Die Klonierung, wie sie hier benutzt wurde, hatte den Zweck, V-Regionen aus neu arrangierten H- und L-Kette-Genen unter Verwendung von JH- und Jk-Sonden zu isolieren. Diese Klone wurden durch Northern-Blot-Analyse getestet, um festzustellen, ob ihre Sequenzen in den A2-Hybridomzellen exprimiert werden. Solche Klone, die eine exprimierte Sequenz enthielten, wurden in Expressionsvektoren mit menschlichen C-Regionen umkloniert und in Mäuse-Myelomzellen transfiziert, um nachzuweisen, ob ein Antikörper produziert wurde. Der Antikörper von produzierenden Zellen wurde dann auf seine Bindungsspezifität getestet und funktionell mit dem Mäuse-Antikörper A2 verglichen.
  • BEISPIEL IV
  • Konstruktion einer genomischen Genbibliothek einer L-Kette
  • Um das Gen einer L-Kette-V-Region aus den A2-Hybridomzellen zu isolieren, wurde eine genomische Genbibliothek auf Grundlage einer Größenauswahl konstruiert, wozu der Lambda-Phagenvektor Charon 27 verwendet wurde. Aus A2-Hybridomzellen wurde hochmolekulare DNA isoliert und mit der Restriktionsendonuklease HindIII zur Vollständigkeit verdaut. Die DNA wurde dann auf einem 0,8 %igen Agarosegel fraktioniert und die DNA-Fragmente dreier verschiedener Größenbereiche von ungefähr 3 kb, 4 kb und 6 kb wurden aus dem Gel mittels Elektroelution isoliert. Die Größenbereiche zur Konstruktion der Genbibliothek wurden nach der Größe von HindIII-Fragmenten, die in einem Southern-Blot mit der Jκ-Sonde hybridisierten, ausgewählt. Nach Phenol/Chloroform-Extraktion und Ethanolpräzipitation wurden die DNA Fragmente jeder Größenfraktion mit den offenen Enden von Lambda Charon 27 ligiert und mit Hilfe von Gigapack Gold von Stratagene (LaJolla, CA) in vitro in Phagenpartikel verpackt.
  • Diese Bibliotheken wurden bei einer Dichte von etwa 20.000 Plaques pro 150 mm-Petrischale direkt durchgemustert, wobei eine 32P-markierte Jκ-Sonde verwendet wurde. Die eine L-Kette erkennende Jκ-Sonde aus der Maus war ein 2,7 kb HindIII-Fragment, das alle fünf Jk-Segmente enthielt. Die Sonde wurde durch „Random Priming" mit 32P-markiert, wobei ein von Boehringer Mannheim bezogener Testkit verwendet wurde. Freie Nukleotide wurden durch Zentrifugation über eine Sephadex G-50-Säule entfernt. Die spezifischen Aktivitäten der Sonde waren ungefähr 109 cpm/μg.
  • Plaque-Hybridisierungen wurden in 5 × SSC, 50 % Formamid, 2 × Denhardt's Reagenz und 200 μg/ml denaturierte Lachssperma-DNA 18-20 Stunden bei 42°C durchgeführt. Zuletzt wurde in 0,5 × SSC, 0,1 % SDS bei 65°C gewaschen. Nach Autoradiographie wurden die positiven Klone identifiziert.
  • BEISPIEL V
  • Konstruktion einer genomischen Genbibliothek einer H-Kette
  • Um das V-Region-Gen der A2-H-Kette zu isolieren, wurde eine genomische Genbibliothek im Lambda gt10-Vektorsystem konstruiert. Hochmolekulare DNA wurde mit der Restriktionsendonuklease EcoRI zur Vollständigkeit verdaut und Fragmente von ungefähr 7,5 kb wurden nach Agarose-Gelelektrophorese isoliert. Diese Fragmente wurden mit den offenen Enden von Lambda gt10 ligiert und in vitro mit Hilfe von Gigapack Gold in Phagenpartikel verpackt.
  • Diese Bibliothek wurde bei einer Dichte von 20.000 Plaques pro 150 mm-Platte unter Verwendung einer JH-Sonde durchgemustert. Die JH-Sonde war ein 2 kb BamHUEcoRI-Fragment, das sowohl J3- als auch J4-Segmente enthielt.
  • Die Sonde wurde wie für Beispiel III beschrieben markiert und hatte eine ähnliche spezifische Radioaktivität. Hybridisierungs- und Waschbedingungen waren identisch mit denen, die in Beispiel III verwendet wurden.
  • BEISPIEL VI
  • Klonierung der TNF-spezifischen V-Region-Gene
  • Mehrere positive Klone wurden aus den Genbibliotheken von H- und L-Kette nach dem Durchmustern von ungefähr 106 Plaques mithilfe der JH- bzw. Jκ-Sonden aus jeder Bibliothek isoliert. Nach Reinigung der Plaques wurde die Bakteriophagen-DNA jedes positiven Klons isoliert, entweder mit EcoRI (H-Kette-Klone) oder HindIII (L-Kette-Klone) verdaut und auf 1 %igen Agarosegelen fraktioniert. Die DNA wurde auf Nitrozellulose übertragen und die Blots wurden mit der JH- oder der Jκ-Sonde hybridisiert.
  • Mehrere H-Kette-Klone, die 7,5 kb große EcoRI-DNA-Fragmente enthielten, die mit der JH-Sonde hybridisierten, wurden gewonnen. Aus den Leichtkette-Bibliotheken wurden aus jeder der drei Bibliotheken, die auf einer Größenauswahl beruhten, mehrere Klone, die HindIII-Fragmente enthielten, die mit der Jκ-Sonde hybridisierten, isoliert. Im Fall der L-Kette hybridisierten mehrere HindIII-Fragmente von 2,9 kb, die aus der 2 kb-Bibliothek unabhängig voneinander hervorgegangen waren, mit einer 1250 bp mRNA von A2, nicht jedoch mit SP2/0 mRNA (siehe Beispiel VII). Zusätzlich hybridisierten mehrere HindIII-Fragmente, die aus der 4 kb-Bibliothek stammten, sowohl mit der A2-mRNA als auch mit der Fusionspartner-mRNA. Ein 5,7 kb HindIII-Fragment aus der 6 kb-Bibliothek hybridisierte mit keiner der RNAs.
  • Die beobachteten Größen der hybridisierenden A2-mRNA entsprachen der korrekten Größe der H- bzw. L-Kette-mRNA. Da die RNA-Expression auf die A2-Hybridomzellen beschränkt war, wurde angenommen, daß die 7,5 kb H-Kette-Fragmente und die 2,9 kb L-Kette-Fragmente die korrekten V-Region-Sequenzen von A2 enthielten. Ein Beispiel eines jeden Typs wurde zur weiteren Untersuchung ausgewählt. Der bedeutende funktionelle Test besteht in dem Nachweis, daß diese V-Region-Sequenzen, wenn sie mit entsprechenden C-Region-Sequenzen kombiniert werden, die Synthese eines Antikörpers, dessen Spezifität und Affinität der des Mäuseantikörpers A2 ähnlich sind, steuern können.
  • Das 7,5 kb-Fragment der H-Kette und das 2,9-kb Fragment der L-Kette wurden in Plasmidvektoren subkloniert, die eine Expression der chimären Maus/Mensch-Proteine in Mäuse-Myelomzellen erlauben (siehe Beispiele VIII und IX). Diese Plasmide wurden in SP2/0 Zellen cotransfiziert, um festzustellen, ob intakte Antikörpermoleküle sezeniert wurden und, wenn dies der Fall war, ob sie die korrekte Spezifizität und Affinität aufwiesen. Kontroll-Transfektionen wurden ebenfalls durchgeführt, bei denen die putative anti-TNF-H-Kette mit einer irrelevanten, aber exprimierten L-Kette gepaart wurde; die putative anti-TNF-L-Kette wurde ebenfalls mit einer irrelevanten, aber exprimierten H-Kette gepaart. Die Ergebnisse zeigten, daß das 7,5 kb Fragment der H-Kette exprimiert werden konnte, wogegen das 2,9 kb-L-Kette-Fragment nicht exprimiert werden konnte. Dies wurde durch DNA-Sequenzanalyse bestätigt, wodurch nahelegt wurde, daß Teile der kodierenden Region im Vergleich zu anderen bekannten Aminosäuresequenzen der L-Kette nicht im richtigen Aminosäure-Leserahmen waren.
  • Da das 2,9 kb HindIII-Fragment anscheinend kein funktionelles V-Gen enthielt, wurden die 4,0 kb und 5,7 kb HindIII-Fragmente, die aus L-Kette-Bibliotheken isoliert waren, in Expressionsvektoren kloniert und nach Cotransfektion mit der 7,5 kb H-Kette auf Expression des chimären Antikörpers getestet. Das 5,7 kb HindIII-Fragment war nicht in der Lage, eine Antikörperexpression zu fördern, während das 4,0 kb HindIII-Fragment für eine Antikörperexpression sorgte. Der Antikörper, der aus der Cotransfektion der 7,5 kb großen putativen V-Region der H-Kette und der 4,0 kb großen V-Region der L-Kette hervorging, wurde gereinigt, im TNF-Festphase-Bindungstest getestet und als inaktiv befunden. Die Schlußfolgerung war, daß die sich auf dem 4,0 kb HindIII-Fragment befindende V-Region nicht die korrekte anti-TNF-V-Region war, sondern der Hybridomzelle durch den Fusionspartner beigesteuert wurde. Dies wurde anschließend durch Sequenzanalyse der cDNA, die aus der Hybridomzellinie A2 und aus dem Fusionspartner stammte, bestätigt.
  • Andere, unabhängig gewonnene L-Kette-Klone mit 2,9 kb HindIII-Fragmenten, die mit A2-mRNA hybridisierten, wurden genauer charakterisiert. Obwohl die Restriktionskarten ähnlich waren, konnten die Klone zwei Klassen zugeordnet werden, je nachdem, ob eine Schnittstelle des Restriktionsenzyms AccI vorhanden war oder nicht. Dem ursprünglichen (nicht-funktionellen) 2,9 kb Fragment (bezeichnet als Klon 8,3) fehlte eine AccI-Schnittstelle, die in einigen anderen Klonen (repräsentiert durch Klon 4,3) vorhanden war. Die DNA-Sequenz von Klon 4,3 war der von Klon 8,3 extrem ähnlich, enthielt aber, anders als Klon 8,3, einen einzigen Aminosäure-Leserahmen mit enger Homologie zu bekannten L-Ketten. Das 2,9 kb HindIII-Fragment von Klon 4,3 wurde in den L-Kette-Expressionsvektor subkloniert und mit der putativen anti-TNF-H-Kette in SP2/0 Zellen cotransfiziert. Es wurde ein Antikörper synthetisiert, gereinigt und im TNF-Festphase-Bindungstest getestet. TNF wurde von diesem Antikörper gebunden und deshalb wurde angenommen, daß die L-Kette-V-Region von Klon 4,3 die korrekte ist.
  • Es wurde gezeigt, daß die A2-Mäuse-Hybridomzellen mindestens vier neu zusammengestellte V-Region-Gene einer L-Kette enthielten. Mindestens zwei von diesen werden als Proteine exprimiert: Klon 4,3 (das korrekte anti-TNF-L-Kette-Gen) und das im 4,0 kb HindIII Fragment (beigetragen durch den Fusionspartner) enthaltene Gen. Die Expression zweier L- Ketten legt nahe, daß der resultierende Antikörper, der von den Mäuse-Hybridomzellen sezeniert wird, tatsächlich ein Gemisch von Antikörpern ist, wobei einige die korrekte L-Kette verwenden, einige die inkorrekte L-Kette verwenden und einige jeweils eine Kette von beiden verwenden. Das Vorhandensein zweier unterschiedlicher L-Ketten im Mäuseantikörper A2 wurde durch SDS-Gelanalyse und N-terminale Proteinsequenzanalyse des gereinigten Antikörpers bestätigt. Da die Konstruktion des chimären Antikörpers A2 die Klonierung der individuellen H- und L-Kette-Gene und ihre Expression in einer nicht-produzierenden Zellinie umfaßt, wird der resultierende Antikörper nur die korrekte L-Kette aufweisen und sollte deshalb ein Antikörper mit größerer Wirksamkeit sein (siehe Beispiele X, XI und XII).
  • BEISPIEL VII
  • Northern-Blot-Analyse von klonierter DNA
  • Von klonierter DNA, die den authentischen H- und L-Kette-V-Regionen aus den A2-Hybridomzellen entspricht, wäre zu erwarten, daß sie mit A2-mRNA hybridisiert. Nicht-funktionelle DNA-Neuordnungen der genetischen Loci auf entweder H- oder L-Ketten sollten nicht exprimiert werden.
  • Zehn μg Gesamtzell-RNA wurden der Elektrophorese in 1 %igen Agarose/Formaldehyd-Gelen (Sambrook et al., supra) unterzogen und auf Nitrozellulose transferiert. Die Blots wurden mit, durch „Random Priming" hergestellten DNA-Sonden in 50 % Formamid, 2 × Denhardt's Lösung, 5 × SSC und 200 μg/ml denaturierter Lachssperma-DNA 10 Stunden bei 42°C hybridisiert. Die Waschbedingungen im letzten Schritt waren 0,5 × SSC, 0,1 % SDS bei 65°C.
  • Die subklonierten DNA-Fragmente wurden durch "Random Priming" mit 32P markiert und mit Northern Blots, die Gesamt-RNA aus A2-Zellen oder aus SP2/0 Zellen, den Vorläuferzellen der Fusionspartnerzellen von A2, enthielten, hybridisiert. Das 7,5 kb EcoRI-Fragment der H-Kette hybridisierte mit einer 2 kb großen mRNA von A2, nicht jedoch mit mRNA aus SP2/0. In ähnlicher Weise hybridisierte das 2,9 kb HindIII-Fragment der L-Kette (Klon 4,3) mit einer 1250 bp großen mRNA von A2, nicht jedoch mit mRNA aus SP2/0. Die beobachteten Längen der hybridisierenden A2-mRNA entsprachen den korrekten Größen der H- bzw. L-Kette-mRNA, was bestätigte, daß die Sequenzen der V-Region auf diesen DNA-Fragmenten in A2-Hybridomzellen exprimiert werden.
  • BEISPIEL VIII Konstruktion von Expressionsvektoren
  • Die oben beschriebenen putativen V-Gene der L- (Klon 4,3) und H-Kette wurden mit Genen der menschlichen Kappa- und Gammal-konstante-Region in Expressionsvektoren verbunden. Das 7,5 kb EcoRI-Fragment, das dem putativen VH-Region-Gen von A2 entsprach, wurde in einen Expressionsvektor kloniert, der das menschliche Cgamma1-Gen und das Ecogpt-Gen enthielt, um das als pA2HGlapgpt bezeichnete Plasmid zu liefern (siehe 8).
  • Das 2,9 kb putative VL-Fragment von Klon 4,3 wurde in einen Vektor, der das menschliche Kappa Cκ-Gen und das Ecogpt-Gen enthielt, kloniert, um eine Selektion in Säugetierzellen zu ermöglichen. Das hervorgegangene Plasmid wurde pA2HuKapgpt genannt (siehe 8).
  • BEISPIEL IX
  • Expression von chimären Antikörper-Genen
  • Um die Gene der chimären H- und L-Kette zu exprimieren, wurden die Expressionsplasmide in Zellen der nicht-produzierenden Mäuse-Myelomzellinie SP2/0 transfiziert. Die zur Transfektion vorgesehene Plasmid-DNA wurde durch Gleichgewichtszentrifugation im Ethidiumbromid/Cäsiumchlorid-Gradienten zweimal gereinigt. Plasmid-DNA (10-50 μg) wurde zu 107 SP2/0 Zellen in Medium mit Hank's Salzen gegeben und die Mischung wurde in eine BioRad Elektroporations-Apparatur eingebracht. Nach Elektroporation bei 20 Volt wurden die Zellen in 96-Well-Mikrotiterplatten ausplattiert.
  • Nach 24 Stunden wurde eine Mycophenolsäure-Selektion durchgeführt und nach 1-2 Wochen wurden die wirkstoffresistenten Kolonien identifiziert. Resistente Kolonien wurden zu stabilen Zellinien expandiert und Gewebekulturüberstand dieser Zellinien wurde mit Hilfe eines ELISA-Tests mit Ziege-anti-Mensch-IgG-Fc-Antikörper und Ziege-anti-Mensch-H+L, konjugiert mit alkalischer Phosphatase (bezogen von Jackson Laboratories), auf Antikörper getestet.
  • Der chimäre Antikörper A2 wurde aus dem Gewebekulturüberstand durch Chromatographie an Protein A-Sepharose gereinigt. Der Überstand wurde auf 0,1 M Tris, 0,002 M EDTA, pH 8,0, eingestellt und auf eine, mit dem gleichen Puffer äquilibrierte Protein A-Sepharose-Säule geladen. Das IgG wurde mit 0,1 M Zitratpuffer, pH 3,5, eluiert, mit 1 M Tris gehemmt oder neutralisiert und gegen Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) dialysiert.
  • Der gereinigte chimäre Antikörper wurde auf seine Bindungsaktivität und seine hemmende und/oder neutralisierende Aktivität untersucht.
  • BEISPIEL X
  • Spezifität eines chimären anti-TNF-Antikörpers
  • Da die Antigen-bindende Domäne von cA2 sich von Mäuse-A2 ableitete, wäre von diesen mAbs zu erwarten gewesen, daß sie um dieselbe TNF-Bindungsstelle kompetitieren. Feste Konzentrationen an chimärem A2 und Mäuse-mAb A2 wurden mit steigenden Konzentrationen des entsprechenden Mäuse- bzw. chimären A2-Kompetitors in einer 96-Well-Mikrotiterplatte, beschichtet mit rhTNF (Dainippon, Osaka, Japan), inkubiert. Mit alkalischer Phosphatase konjugiertes anti-Mensch-Immunglobulin und anti-Maus-Immunglobulin wurden als sekundärer Antikörper verwendet, um das Ausmaß der Bindung von chimärem bzw. Maus-A2 nachzuweisen. Es wurde eine Kreuzkompetition um das TNF-Antigen in dieser Ausführung eines Festphase-ELISA beobachtet (9). Dieser Befund stimmt mit der erwarteten identischen Epitopspezifität von cA2 und Maus-A2 überein.
  • Die Affinitätskonstante für die Bindung von Mäuse-mAb A2 und cA2 an rhTNFα wurde durch Scatchard-Analyse (siehe z. B. Scatchard, G., Ann. N.Y. Acad. Sci. 51:660 (1949)) ermittelt. Die Ergebnisse sind in 10 dargestellt. Diese Analyse umfaßte das Messen der direkten Bindung von 125I-markiertem cA2 an immobilisierten rhTNFα in einer 96-Well-Platte. Die Antikörper wurden jeweils mit einer spezifischen Aktivität von etwa 9,7 μCi/μg durch die Iodogen-Methode markiert. Für den Mäuse-mAb A2 wurde eine Affinitätskonstante (Ka) von 0,5 × 109 Liter/Mol berechnet. Unerwarterweise hatte der chimäre Antikörper A2 mit einer Ka von 1,8 × 109 Liter/Mol eine höhere Affinität. Folglich wurde gezeigt, daß der chimäre anti-TNFα-Antikörper der vorliegenden Erfindung eine signifikant höhere Bindungsaffinität zu menschlichem TNFα aufweist, als dies für den Mäuse-mAb A2 als Stammantikörper zutrifft. Dieser Befund war insofern überraschend, als von Mäuseantikörpern und chimären Antikörpern, Fragmenten und Regionen erwartet worden wäre, daß sie Affinitäten zeigen, die gleich oder geringer sind als die des Stamm-mAbs.
  • Solche hochaffinen anti-TNF-Antikörper mit Bindungsaffinitäten zu TNFα von mindestens 1 × 108 M–1, bevorzugter mindestens 1 × 109 M–1 (ausgedrückt als Ka) werden bei Immuntests bevorzugt, die sehr geringe Konzentrationen von TNF in biologischen Flüssigkeiten nachweisen. Zusätzlich werden anti-TNF-Antikörper mit derart hohen Affinitäten zur Therapie TNFα-vermittelter Beschwerden oder Krankheitszustände bevorzugt.
  • Die Spezifität von cA2 gegenüber TNF wurde durch Austesten einer möglichen Kreuz-Neutralisation von menschlichem Lymphotoxin (TNFβ) bestätigt. Lymphotoxin teilt mit TNF eine gewisse Sequenzhomologie und bestimmte biologische Aktivitäten, z. B. Tumorzell-Zytotoxizität (Pennica, D. et al., Nature 312:724-729 (1984)). Kultivierte menschliche A673 Zellen wurden in Gegenwart von 20 μg/ml Cycloheximid mit steigenden Konzentrationen von menschlichem Lymphotoxin (Genentech, San Francisco, CA) mit oder ohne 4 μg/ml chimärem A2 über Nacht bei 39°C inkubiert. Der Zelltod wurde, wie oben beschrieben, durch Vitalfärbung mit Naphthol Blau-Schwarz gemessen. Die Ergebnisse zeigten, daß cA2 hinsichtlich einer Hemmung und/oder Neutralisierung von menschlichem Lymphotoxin unwirksam war, was die TNFα-Spezifität des chimären Antikörpers bekräftigte.
  • Die Fähigkeit von A2 oder cA2 mit TNF aus verschiedenen Tierspezies zu reagieren, wurde ebenfalls untersucht. Wie bereits erwähnt, weist menschliches TNF eine Vielzahl von Epitopen auf, an die hemmende und/oder neutralisierende mAbs binden werden (Moller, A. et al. supra). Menschliches TNF zeigt Bioaktivität in einem großen Bereich verschiedener Spezies von Wirtstieren. Allerdings sind bestimmte hemmend und/oder neutralisierend wirkende Epitope von menschlichem TNF bei verschiedenen Tierspezies untereinander konserviert, während andere auf Menschen und Schimpansen beschränkt zu sein scheinen.
  • In Neutralisierungsexperimenten wurden Zellüberstände von frisch isolierten, Endotoxin-aktiverten Monozyten vom Menschen, Schimpansen, Rhesusaffen, Cynomolgusaffen, Pavian, Schwein, Hund, Kaninchen oder von der Ratte als Quelle für TNF verwendet. Wie oben diskutiert, hemmte oder neutralisierte der Mäuse-mAb A2 nur die Aktivität von menschlichem oder Schimpansen-TNF und zeigte keine Wirkung auf TNF, das von anderen Primaten oder niedereren Tieren stammte. Ebenfalls hemmte oder neutralisierte A2 nicht den zytotoxischen Effekt von rekombinantem Mäuse-TNF.
  • Folglich ist das Epitop, das durch A2 erkannt wird, eines, das von menschlichem und Schimpansen-TNFα geteilt wird. Chimärer A2 wurde ebenfalls auf diese Weise auf Kreuzreaktivität mit TNF, das aus Monozyten der Ratte, vom Kaninchen, Hund und Schwein stammte, ebenso wie mit gereinigtem rekombinantem Mäuse-TNFα und natürlichem und rekombinantem menschlichem TNFα getestet. Chimärer A2 hemmte oder neutralisierte natürlichen und rekombinanten menschlichen TNFα. Deshalb scheint es, daß cA2 seine Spezies-Spezifität mit dem Mäuse-A2 teilt.
  • BEISPIEL XI
  • In vitro-Aktivität und Neutralisierungswirksamkeit eines chimeren anti-TNF-Antikörpers
  • Sowohl für die anti-TNFα-Antikörper aus der Maus als auch für die chimären anti-TNFα Antikörper A2 und cA2 wurde eine wirksame TNF hemmende und/oder neutralisierende Aktivität nachgewiesen. In dem oben beschriebenen TNF-Zytotoxizitätstest hemmte oder neutralisierte der Mäuse-A2 in einer Konzentration von ungefähr 125 ng/ml vollständig die biologische Aktivität von rhTNFα, die durch die Verabreichung von 40 pg/ml ausgelöst wurde. Zwei separate Bestimmungen der hemmenden und/oder neutralisierenden Potenz, ausgedrückt als die um 50 % hemmende Dosis (ID50), ergaben 15,9 ± 1,01 und 17,9 ± 1,6 ng/ml (Mittelwert ± Standardabweichung). Für den mAb A2 bedeutet dies eine ID50 von ungefähr 17 ng/ml.
  • Im selben experimentellen System zeigte sich, daß drei andere Mäuse-anti-TNFα-Antikörper (bezeichnet mit TNF-1, TNF-2 und TNF-3), die vergleichbare Bindungsaffinitäten zu TNF hatten, ID50-Werte aufwiesen, die 1-2 Größenordnungen höher waren, und deshalb hinsichtlich einer Neutralisierung signifikant weniger wirksam waren als A2.
  • Die Fähigkeit von cA2, die Bioaktivität von menschlichem TNFα in vitro zu hemmen oder zu neutralisieren wurde mit Hilfe des oben beschriebenen Biotestsystems getestet. Kultiverte A673 Zellen wurden mit 40 pg/ml natürlichem (Genzyme, Boston, MA) oder rekombinantem (Suntory, Osaka, Japan) menschlichem TNF mit oder ohne Antikörper wie oben beschrieben über Nacht inkubiert und das Ausmaß des Zelltods wurde durch Vitalfärbung bestimmt. Wie auf der Grundlage der oben dargestellten Ergebnisse mit dem Mäuse-mAb A2 zu erwarten, hemmte oder neutralisierte auch cA2 sowohl natürlicher als auch rhTNF im Zytotoxizitätstest in einer dosisabhängiger Weise (11). In dieser Versuchsanordnung hoben derart niedrige cA2-Konzentrationen wie 125 ng/ml die toxische Aktivität von TNF vollständig auf. Wiederholte Analysen zeigten, daß der cA2 größere TNF-hemmende und/oder neutralisierende Aktivität aufwies als dies bei dem Stammantikörper Mäuse-mAb A2 der Fall war. Eine derartige hemmende und/oder neutralisierende Wirksamkeit bei Antikörperkonzentrationen von weniger als 1 μg/ml kann im Blut eines Empfängers, dem der Antikörper verabreicht wird, leicht erzielt werden. Dementsprechend werden derartige hochwirksam hemmende und/oder neutralisierende anti-TNF-Antikörper, insbesondere der chimäre Antikörper, zur therapeutischen Verwendung bei TNFα-vermittelten Krankheitszuständen und Beschwerden bevorzugt.
  • Wie oben erwähnt, induziert TNF die zelluläre Sekretion von IL-6. Weiterhin gibt es Hinweise, daß IL-6 an der Pathophysiologie einer Sepsis beteiligt ist, obwohl die genaue Rolle von IL-6 bei diesem Syndrom unklar ist (Fong, Y. et al.. J Exp Med. 170:1627-1633 (1989); Starnes Jr., H. F. et al., J Immunol. 145:4185-4191 (1990). Die Fähigkeit von cA2 eine TNF-induzierte IL-6-Sekretion zu hemmen oder zu neutralisieren wurde mit Hilfe kultivierter menschlicher diploider FS-4 Fibroblasten untersucht. Die Ergebnisse in Tabelle 1 zeigen, daß cA2 eine IL-6-Sekretion durch Zellen, die über Nacht mit TNF Induziert worden waren, wirksam blockierte. Die TNF-induzierte IL-6-Sekretion wurde in Abwesenheit eines mAb oder in Gegenwart eines Kontroll-mAbs, der für ein irrelevantes Antigen spezifisch war, nicht gehemmt.
  • Figure 00550001
  • Figure 00560001
  • Es wird angenommen, daß die Fähigkeit von TNF, die Aktivitäten von Prokoagulations- und Adhäsionsmolekülen endothelialer Zellen (EC) zu aktivieren, eine wichtige Komponente in der Pathophysiologie von Erkrankungen ist. Dies kann insbesondere mit der Gefäßschädigung, der ausgedehnten intravasalen Koagulation und der schweren Hypotension zusammenhängen, die mit dem septischen Syndrom verbunden sind. Deshalb wurde die Fähigkeit von cA2, die TNF-induzierte Aktivierung von kultivierten menschlichen Nabelschnurgefäßendothelzellen (HUVEC) zu blockieren, untersucht. Eine Stimulation der Prokoagulationsaktivität durch TNF wurde ermittelt, indem intakte kultivierte HUVEC 4 Stunden lang TNF (mit oder ohne Antikörper) ausgesetzt wurden und ein Zell-Lysat in einem Gerinnungstest für menschliches Plasma analysiert wurde. Die Ergebnisse in Tabelle 2 zeigen die erwartete Stimulation der HUVEC-Prokoagulationsaktivität durch TNF (ausgedrückt durch eine verminderte Gerinnungszeit). Der chimäre Antikörper cA2 hemmte oder neutralisierte wirksam diese TNF-Aktivität in einer dosisabhängigen Weise.
  • Figure 00560002
  • Zusätzlich zur Stimulierung der Prokoagulationsaktivität induziert TNF auch die Oberflächenexpression von Endothelzell-Adhäsionsmolekülen wie etwa ELAM-1 und ICAM- 1. Die Fähigkeit von cA2, diese Aktivität von TNF zu hemmen oder zu neutralisieren wurde mit Hilfe eines, zur Detektion von ELAM-1 spezifischen Radioimmuntests gemessen. Kultivierte HUVEC wurden mit 250 ng/ml rhTNF (Dainippon, Osaka, Japan) mit oder ohne Antikörper bei 37°C über Nacht im 96-Well-Platte-Format stimuliert. Die Oberflächenexpression von ELAM-1 wurde durch aufeinanderfolgende Zugabe eines Maus-anti-Mensch-ELAM-1-mAb und eines 125I-markierten Kaninchen-anti-Maus-Immunglobulins als sekundärem Antikörper, die bei 4°C direkt zu den Kulturplatten gegeben wurden, bestimmt.
  • Wie in 12 gezeigt, induzierte TNF die Expression von ELAM-1 auf der Oberfläche von kultivierten HUVEC und diese Aktivität wiederum wurde in einer dosisabhängigen Weise durch cA2 wirksam blockiert.
  • Schließlich ist von TNF bekannt, die mitogene Aktivität in kultivierten Fibroblasten zu stimulieren. Chimärer A2 hemmte oder neutralisierte die TNF-induzierte Mitogenese von menschlichen diploiden FS-4 Fibroblastenkulturen, wodurch das wirksam hemmende und/oder neutralisierende Potential von cA2 gegenüber einem breiten Spektrum der biologischen in vitro-Aktivitäten von TNF bestätigt wurde.
  • BEISPIEL XII
  • In vivo-Aktivität und -Wirksamkeit des cA2 Antikörpers
  • Da die zwischenartliche Kreuzreaktivität von cA2 in hohem Maße beschränkt ist, ist die Möglichkeit, die Wirksamkeit dieses Antikörpers in vivo in Tieren, bei denen es sich nicht um Menschen oder Schimpansen handelt, zu testen, erheblich begrenzt. Dennoch war ein Beweis, daß sich die Fähigkeit von cA2 zu wirksamer Hemmung und/oder Neutralisierung in vitro auch in vivo manifestieren würde, wünschenswert. Frühere Studien an Tieren zeigten, daß durch Verabreichen von TNF an Versuchstiere der Krankheitszustand, der entweder durch Infektion mit Gram-negativen Bakterien oder durch direkte Verabreichung von Endotoxin hervorgerufen wird, nachgeahmt wurde (Tracey, K.J. et al., 1986, supra; Tracey, K.J. et al., 1987, supra; Lehmann, V. et al., supra).
  • Ein in vivo-Modell, bei dem Mäusen, die mit Galaktosamin sensibilisiert waren, letale Dosen von menschlichem TNF verabreicht wurden (Lehmann, V. et al., supra), wurde zur Untersuchung der Fähigkeit von cA2, TNF in vivo zu hemmen oder zu neutralisieren, entsprechend modifiziert. Eine Stimulation mit 5 μg (0,25 mg/kg) rhTNF, i.p. verabreicht, führte zu einer Mortalitätsrate von 80-90 % bei unbehandelten Kontrolltieren und in Tieren, die 15-30 Minuten später entweder mit Kochsalzlösung oder mit 2 mg/kg Kontroll-Antikörper (einem chimären IgG1, abgeleitet von anti-Thrombozyten-mAb 7E3 aus der Maus) i. v. behandelt wurden. Im Gegensatz dazu reduzierte eine Behandlung mit cA2 die Mortalitätsrate auf 0-30 % bei Verabreichung von 0,4 mg/kg Antikörper und auf 0-10 % bei 20 mg/kg. Diese Ergebnisse, zusammengefaßt in Tabelle 3, zeigen, daß cA2 in der Lage war, die biologische Aktivität von TNF in vivo ebenso zu hemmen und/oder zu neutralisieren wie in vitro.
  • Figure 00580001
  • BEISPIEL XII
  • Bestimmung der durch mAb cA2 erkannten Aminosäuresequenzen (Enitop) von menschlichem TNFα
  • Reagenzien
  • Die folgenden Reagenzien können leicht aus kommerziellen Quellen bezogen werden. FMOC-L-Ala-OPfp, FMOC-L-Cys(Trt)-OPfp, FMOC-L-Asp(OtBu)-OPfp, FMOC-L-Glu(OtBu)-OPfp, FMOC-L-Phe-OPfp, FMOC-Gly-OPfp, FMOC-L-His(Boc)-OPfp, FMOC-L-IIe-OPfp, FMOC-L-Lys(Boc)-OPfp, FMOC-L-Leu-OPfp, FMOC-L-Asn-OPfp, FMOC-L-Pro-OPfp, FMOC-L-Gln-OPfp, FMOC-L-Arg(Mtr)-OPfp, FMOC-L-Ser(tBu)-ODhbt, FMOC-L-Thr(tBu)-ODhbt, FMOC-L-Val-OPfp, FMOC-L-Trp-OPfp, FMOC-L-Try(tBu)- OPfp und 1-Hydroxybenzotriazol (HOBT) wurden von Cambridge Research Biochemicals bezogen. Piperidin wurde von Applied Biosystems, Inc., bezogen und 1-Methyl-2-Pyrrolidinon (NMP) wurde von EM Science bezogen; Methanol von JT Baker; Essigsäureanhydrid von Applied Biosystems, Inc.; Trifluoressigsäure (TFA) von Applied Biosystems, Inc.; Diisopropylethylamin (DIEA), Triethylamin, Dithiothreitol (DTT) und Anisol von Aldrich und Hydrochlorsäure (HCl) von JT Baker.
  • Abkürzungen: FMOC, 9-Fluorenylmethoxycarbonyl; tBu, t-Butylether; OtB, t-Butylester; Boc, t-Butyloxycarbonyl; Mtr, 4-Methoxy-2,3,6-trimethylbenzolsulfonyl; Trt, Trityl; OPfp, Pentafluorphenylester; Odhbt, oxo-Benzotriazonester;
  • Ein chimärer Antikörper der vorliegenden Erfindung, bezeichnet als cA2, wurde verwendet, um durch Epitop-Kartierung zu bestimmen, welche Bereiche der TNF-Aminosäuresequenz an der hemmenden Bindung durch den Antikörper beteiligt waren, wodurch die Aminosäuresequenzen von TNFα, die durch cA2 erkannt werden, identifiziert wurden.
  • Die komplette Primärsequenz von menschlichem TNFα, gemäß Pennica et al., Nature 312:724-729 (1984), ist in 13 dargestellt. Überlappende Decapeptide, die mit jeder zweiten Aminosäure begannen und die gesamte Aminosäuresequenz von menschlichem TNFα abdeckten, wurden an Polyethylen-Pins mit Hilfe der Methode von Gysen (Gysen et al., Peptides: Chemistry und Biological, Proceedings of the Twelfth American Peptide Symposium, S. 519-523, Hrsg., G.R. Marshall, Escom, Leiden, 1988) synthetisiert. Sets von Peptid-Pins, die freie N-terminale Aminogruppen und acetylierte N-terminale Aminogruppen trugen, wurden einzeln präpariert. Beide Sets von Peptid-Pins wurden in Lösungen inkubiert, die den anti-TNF-mAb cA2 enthielten, um die Aminosäuresequenzen, die das cA2-Epitop von menschlichem TNFα ausmachen, zu bestimmen, wie unten beschrieben. 14A zeigt die Ergebnisse der Bindung an die überlappenden Decapeptide, die die gesamte Sequenz von menschlichem TNFα umfassen. Die O.D. (optische Dichte) korreliert direkt mit dem zunehmenden Grad der cA2-Bindung. 14B zeigt die Ergebnisse der Bindung von cA2 an das gleiche Set von Peptid-Pins in Gegenwart von menschlichem TNFα. Diese kompetetive Bindungsstudie stellt Peptide heraus, die eine nicht-spezifische Bindung an cA2 zeigen könnten.
  • Es gibt mindestens zwei nicht aufeinanderfolgende Peptidsequenzen von TNFα, die durch cA2 erkannt werden. Bei Verwendung des konventionellen Systems, mit dem Aminosäuren im Protein nummeriert werden und bei dem die N-terminale Aminosäure die Nr. 1 trägt, erkennt der mAb cA2 ein Epitop, das mindestens teilweise aus Aminosäuren zusammengesetzt ist, die im Bereich der Reste 87-108 oder sowohl der Reste 59-80 als auch 97-108 von TNF (aus SEQ ID NO:1) lokalisiert sind. 15 stellt diese nicht aufeinanderfolgenden Sequenzen innerhalb der TNF-Sequenz dar. Diese Sequenzen werden auch in einem räumlichen Modell in 16B gezeigt, zusammen mit einem räumlichen Modell des TNF-Monomers, gezeigt in 16A.
  • Unerwarteterweise blockiert der mAb cA2 die Wirkung von TNFα, ohne an die putative Rezeptorbindungsstelle zu binden, die eine oder mehrere der Aminosäuren z. B. 11-13, 37-42, 49-57 oder 155-157 von hTNFα (aus SEQ ID NO:1) enthalten kann. Bevorzugte anti-TNF-mAbs sind solche, die diese Bindung von menschlichem TNFα an seine Rezeptoren aufgrund ihrer Fähigkeit, an eine oder mehrere dieser Peptidsequenzen zu binden, hemmen. Diese Antikörper können die Aktivität von TNF durch die Bindung an das cA2-Epitop blockieren, wobei gezeigt wurde, daß eine solchen Bindung die TNF-Aktivität hemmt.
  • Die Identifizierung jener Peptidsequenzen, die durch cA2 erkannt werden, stellt die notwendige Information zur Verfügung, um weitere monoklonale Antikörper mit Bindungseigenschaften und therapeutischer Anwendbarkeit zu entwickeln, die den Ausführungsformen dieser Anmeldung entsprechen.
  • Peptid-Pin-Synthese
  • Mit Hilfe eines Kits zur Epitop-Kartierung, bezogen von Cambride Research Biochemicals, Inc. (CRB), wurden Decapeptide, die der gesamten Sequenz von menschlichem TNF-α entsprachen, an Polyethylen-Pins synthetisiert.
  • Unter Verwendung der Software von CRB zur Epitop-Kartierung wurde ein Syntheseprogramm entwickelt. Vor der ersten Aminosäurekopplung wurden die Pins mit einer Lösung von 20 % Piperidin in NMP 30 Minuten bei Raumtemperatur aktiviert. Nach der Aktivierung wurden die Pins 5 Minuten bei Raumtemperatur mit NMP gewaschen, gefolgt von dreimaligem Waschen mit Methanol. Im Anschluß an die Waschschritte wurden die Pins für mindestens 10 Minuten an der Luft trocknen gelassen.
  • Das folgende Verfahren wurde bei jeder Kopplungsrunde durchgeführt:
    • (1) die Aminosäurederivate und das HOBT wurden gemäß der in dem Syntheseprogramm geforderten Gewichtsangaben ausgewogen.
    • (2) Das HOBT wurde gemäß dem Syntheseprogramm in der entsprechenden Menge an NMP gelöst.
    • (3) Die Aminosäurederivate wurden in der empfohlenen Menge an HOBT-Lösung gelöst und 150 μl wurden in die entsprechenden Näpfe pipettiert, wie auf der Seite des Syntheseprogramm, welche die Positionen der Näpfe angibt, geregelt.
    • (4) Die Blöcke, welche die Pins enthielten, wurden in die Näpfe getan und die „Sandwich"-Einheiten wurden in Plastiktüten in einem 30°C warmen Wasserbad 18 Stunden lang gelagert.
    • (5) Die Pins wurden aus den Näpfen entfernt und einmal (5 Minuten) mit NMP gewaschen, dreimal (2 Minuten) mit Methanol gewaschen und 10 Minuten an der Luft getrocknet.
    • (6) Die Pins wurden wie oben beschrieben aktiviert und das Verfahren wurde wiederholt.
  • Um die Peptide an einem Block aus Pins zu acetylieren, wurden die Peptid-Pins gewaschen, aktiviert und mit 150 μl einer Lösung aus NMP: Essigsäureanhydrid: Triethylamin (5:2:1) 90 Minuten bei 30°C behandelt, gefolgt durch das oben beschriebene Waschverfahren. Das zweite Set von Peptid-Pins wurde aktiviert, jedoch nicht acetyliert, um freie N-terminale Aminogruppen zu erhalten.
  • Die letzte Runde der Peptid-Aktivierung mit dem Zweck, die Seitenkette-schützenden Gruppen zu entfernen, wurde mit einer Mischung aus TFA:Anisol:Dithiothreitol, 95:2,5:2,5 (V/V/G) 4 Stunden bei Umgebungstemperatur durchgeführt. Nach der Aktivierung wurden die Pins 10 Minuten luftgetrocknet, gefolgt von einer 15-minütigen Behandlung mit Ultraschall in einer Lösung aus 0,1 % HCl in Methanol/destilliertem Wasser (1:1). Die Pins trockneten über Nacht und waren dann für den Einatz im Test fertig.
  • ELISA-Test auf cA2-Bindung an TNFα-Peptid-Pins
  • Reagenzien: Denaturierungspuffer: Natriumdihydrogenphosphat (31,2 g, Sigma Katalog-Nr. 5-0751 oder vergleichbar) und Natriumdodecylsulfat (20,0 g, Sigma Katalog-Nr. L-3771 oder vergleichbar) wurden in 2,0 1 milliQ-Wasser gelöst. Der pH-Wert wurde mit 50 % G/G Natriumhydroxid (VWR Katalog-Nr. VW6730-3 oder vergleichbar) auf 7,2 ± 0,1 eingestellt.
  • Blockier-Puffer: Natriumdihydrogenphosphat (0,39 g, Sigma Katalog-Nr. 5-0751 oder vergleichbar), Dinatriumhydrogenphosphat (1,07 g, Baker Katalog-Nr. 3828-1 oder vergleichbar) und Natriumchlorid (8,50 g, Baker, Katalognr. 3624-5 oder vergleichbar) wurden in 1,0 1 milliQ-Wasser gelöst. Der pH-Wert wurde mit 50 % G/G Natriumhydroxid (VWR Katalognr. VW6730-3 oder vergleichbar) auf 7,2 ± 0,1 eingestellt. Hühnerei-Albumin (10,0 g, Sigma Katalog-Nr. A-5503 oder vergleichbar) und Rinderserum-Albumin (10,0 g, Sigma Katalog-Nr. A-3294 oder vergleichbar) wurden bei Raumtemperatur unter leichtem Rühren gelöst. Die Lösung wurde filtriert und Tween 20 (2,0 ml, Sigma Katalog-Nr. P-13.79 oder vergleichbar) wurde zu der Lösung gegeben. Die Lösung wurde bei Raumtemperatur 30 Minuten leicht gerührt, filtriert und bei 40°C gelagert.
  • PBS/Tween 20: Ein 10-faches Konzentrat wurde präpariert, indem Natriumdihydrogenphosphat (3,90 g, Sigma Katalog-Nr. S-0751 oder vergleichbar), Dinatriumhydrogenphosphat (10,70 g, Baker Katalog-Nr. 3828-1 oder vergleichbar) und Natriumchlorid (85,0 g, Baker Katalog-Nr. 3624-5 oder vergleichbar) in 1,0 1 milliQ-Wasser gelöst wurden. Der pH-Wert wurde mit 50 % G/G Natriumhydroxid (VWR Katalog-Nr. VW 6730 oder vergleichbar) auf 7,2 ± 0,1 eingestellt. Zu der Lösung wurde Tween 20 (5,0 ml, Sigma Katalog-Nr. P-1379 oder vergleichbar) gegeben und das Gemisch wurde leicht gerührt. Unmittelbar vor der Verwendung wurden 100 ml dieser Lösung mit milliQ-Wasser auf 1,0 1 verdünnt.
  • Substratlösung: Substratpuffer wurde präpariert, indem Zitronensäure (4,20 g, Malinckrodt Katalog-Nr. 0627 oder vergleichbar) und die Dinatriumhydrogenphosphat (7,10 g, Baker Katalog-Nr. 3828-1 oder vergleichbar) in 1,0 1 milliQ-Wasser gelöst wurden. Der pH-Wert wurde mit 50 % G/G Natriumhydroxid (VWR Katalog-Nr. VW 6730-3 oder vergleichbar) auf 5,0 eingestellt. Unmittelbar vor der Verwendung wurde eine Tablette OPD-Substrat (30 mg, Sigma Katalog-Nr. P-8412 oder vergleichbar) und 30 % V/V Wasserstoffperoxid (40 μl, Sigma Katalog-Nr. P-1379 oder vergleichbar) zu den 25,0 ml Substratpuffer gegeben. Das die Lösung enthaltende Gefäß wurde mit Alufolie umwickelt und die Lösung wurde gründlich gemischt.
  • 4 N H2SO4: Schwefelsäure (53 ml, EM Science Katalog-Nr. SX1244-5 oder vergleichbar) wurde langsam zu milliQ-Wasser (447 ml) gegeben und vor der Verwendung auf Raumtemperatur abgekühlt.
  • Ausrüstung: Lesegerät für Mikrotiter-Platten, Molecular Devices, Modell nu-max oder Äquivalent. Oszillierender Tischschüttler, Scientific Products, Modell R4140 oder Äquivalent. Ultraschallbad, Branson, Modell 5200 oder Äquivalent. Multikanalpipette, Finpipette Modell 4172317 oder Äquivalent. Wegwerfare 96-Well-ELISA-Platten aus Polystyrol, Corning, Modell 25801.
  • Vor der Verwendung und nach jeder anschließenden Verwendung wurden die Peptid-Pins durch das folgende Verfahren gereinigt. Denaturierungspuffer (2,0 1) wurde auf 60°C erhitzt und in ein Ultraschallbad unter einem Abzug gegeben. Dem Denaturierungspuffer wurde Dithiothreitol (2,5 g, Sigma Katalog-Nr. D-0632 oder vergleichbar) zugesetzt. Die Peptid-Pins wurden in diesem Medium 30 Minuten mit Ultraschall behandelt, gründlich mit milliQ-Wasser gewaschen, in einem kochenden Ethanolbad 2 Minuten suspendiert und luftgetrocknet.
  • Blockier-Puffer (200 μl) wurde in eine wegwerfare 96-Well-ELISA-Platte aus Polystyrol gegeben und die Peptid-Pins wurden in den Näpfen suspendiert. Die Peptid-Pins und die Platte wurden zwei Stunden bei Raumtemperatur auf einem oszillierenden Tischschüttler inkubiert. Die Platten und Peptid-Pins wurden mit PBS/Tween 20 (viermal) gewaschen. Zu jedem Napf wurde cA2-Antikörper in einer Konzentration von 20 μg/ml (verdünnt mit Blockier-Puffer, 175 μl/Napf) gegeben. Die TNF-Kompetition fand während einer dreistündigen Inkubation von TNFα (40 μg/ml) und cA2 (20 μg/ml) in BSA/Ovalbumin/BBS bei Raumtemperatur statt. Die Peptid-Pins wurden in der Platte suspendiert und bei 4°C über Nacht inkubiert. Die Peptid-Pins und die Platte wurden mit PBS/Tween 20 (viermal) gewaschen. Zu jedem Napf wurde Ziege-anti-Mensch-Antikörper, konjugiert mit Meerrettichperoxidase (verdünnt mit Blockier-Puffer auf 1/2000, 175 μl/Napf, Jackson ImmunoResearch Labs) gegeben. Die Peptid-Pins wurden in der Platte suspendiert und 1 Stunde bei Raumtemperatur auf einem oszillierenden Tischschüttler inkubiert. Die Platten und die Peptid-Pins wurden mit PBS/Tween 20 (viermal) gewaschen. Jedem Napf wurde frisch präparierte Substratlösung (150 μl/Napf) zugesetzt, die Peptid-Pins wurden in der Platte suspendiert und 1 Stunde bei Raumtemperatur auf einem oszillierenden Tischschüttler inkubiert. Die Peptid-Pins wurden entfernt und in jeden Napf wurde 4 N H2SO4 (50 μl) gegeben. Die Platten wurden in einem Molecular Devices Plattenlesegerät gelesen (490 nm, abzüglich einem Leerwert bei 650 nm) und die Ergebnisse sind in den 14A und 14B, dargestellt, wie oben beschrieben.
  • BEISPIEL XIV
  • Produktion von Maus-anti-Mensch TNF-mAb unter Verwendung von TNF-Peptidfragmenten
  • BALB/c Mäuseweibchen, wie in Beispiel I oben, erhalten subkutan und intraperitoneal (i.p.) vierzig μg gereinigte, rekombinante Fragmente von menschlichem TNF (rhTNF), die aus E. coli stammen, injiziert, wobei die Fragmente anti-TNF-Epitope aus mindestens 5 Aminosäuren umfassen, die innerhalb der nicht aufeinanderfolgenden Sequenzen 59-80, 87-108 oder sowohl der Reste 59-80 als auch 87-108 von TNF (aus SEQ ID NO:1), wie oben dargestellt, lokalisiert sind, emulgiert mit einem gleichen Volumen an komplettem Freund'schem Adjuvans (bezogen von Difco Laboratories), wobei jeder Maus 0,4 ml verabreicht werden. Eine Woche später wird eine Wiederholungsinjektion von 5 μg dieser rhTNF-Fragmente in inkomplettem Freund'schem Adjuvans i.p. gegeben, gefolgt von vier aufeinanderfolgenden Injektionen ohne Adjuvans, bei denen 10 μg TNF-Fragmente i.p. verabreicht werden, wobei die TNF-Fragmente anti-TNF-Epitope einschließen, die Aminosäuren der Reste 59-80, 87-108 oder beider Reste 59-80 und 87-108 von hTNFα (aus SEQ ID NO:1) einschließen. Acht Wochen nach der letzten Injektion erhält die Maus eine Wiederholungsimpfung i.p. mit 10 μg TNF.
  • Vier Tage später wird die Maus getötet, die Milz wird entnommen und eine Suspension aus Milzzellen präpariert. Milzzellen werden mit Zellen der nicht-sezenierenden Hybridom-Zellinie Sp2/0 (ATCC CRL1581) in einem Verhältnis 4:1 Milzzellen zu Sp2/0 Zellen in Gegenwart von 0,3 ml 30 % Polyethylenglykol, PEG 1450, fusioniert. Nach 6-stündiger Inkubation bei 37°C werden die fusionierten Zellen in 0,2 ml Aliquots in 96-Well-Platten in Konzentrationen von 2 × 104 Sp2/0 Zellen pro Napf verteilt. Fütterungszellen, in Form von 5 × 104 normalen BALB/c Milzzellen, werden jedem Napf zugesetzt.
  • Das verwendete Wachstumsmedium bestand aus RPMI 1640-Medium, 10 % Hitzeinaktiviertem fötalen Rinderserum (FBS) (Hyclone), 0,1 mM MEM nicht-essentielle Aminosäuren, 1 mM Natriumpyruvat, 2 mM L-Glutamin, 100 U/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin (GIBCO Laboratories) und, zur Selektion, Hypoxanthin-Aminopterin-Thymidin (HAT) (Boehringer Mannheim).
  • Ein Festphase-Radioimmuntest (RIA) wird zum Durchmustern der Überstände auf das Vorhandensein von mAbs verwendet, die spezifisch gegen rhTNFα-Fragmente gerichtet sind, die Teile der Reste 59-80, 87-108 oder sowohl der Reste 59-80 als auch 87-108 von hTNFα (aus SEQ ID NO:1) enthalten. Dieser Test wird oben in Beispiel II beschrieben. Die Hintergrund-Bindung in diesem Test beträgt ungefähr 500 cpm. Ein Überstand ist als positiv zu beurteilen, wenn er eine Bindung von 2000 cpm oder mehr liefert.
  • Von den durchgetesteten Überständen werden routinemäßig ein oder mehrere positive Überstände durch RIA identifiziert. Ausgehend von diesen positiven Überständen wird der Klon, der die höchste Bindungsaktivität produziert (gezeigt durch entsprechend höhere cpm-Werte) durch das Verfahren der limitierten Verdünnung auf Fütterungszellen aus der Maus subkloniert. Nach weiterer Analyse der Überstände in Neutralisierungstests werden routinemäßig ein oder mehrere Antikörper gefunden, die wirksame hemmende und/oder neutralisierende Aktivität aufweisen. Diese positiven und hemmenden und/oder neutralisierenden Hybridomzellinien werden dann selektioniert und in RPMI 1640-Medium mit 10 % FBS (GIBCO), 0,1 mM nicht-essentielle Aminosäuren, 1 mM Natriumpyruvat, 2 mM L-Glutamin, 100 U/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin kultiviert.
  • BEISPIEL XV
  • Produktion von Mäuseantikörpern und chimären Antikörpern, Fragmenten und Regionen aus TNF-Peptiden
  • Mäuseantikörper und chimäre Antikörper, Fragmente und Regionen wurden durch die Konstruktion chimärer Expressionsvektoren erhalten, die die variable Region der in Beispiel XIV gewonnenen Mäuseantikörper und die menschliche konstante Region kodieren, wie oben in den Beispielen IV bis IX dargestellt.
  • Der resultierende chimäre Antikörper A2 wird aus dem Gewebekulturüberstand durch Chromatographie an Protein A-Sepharose gereinigt. Der Überstand wird auf 0,1 M Tris, 0,002 M EDTA, pH 8,0 eingestellt und auf eine Protein A-Sepharose-Säule geladen, die mit dem gleichen Puffer äquilibriert ist. Das IgG wird dann mit 0,1 M Zitrat, pH 3,5 eluiert, mit 1 M Tris neutralisiert und gegen Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) dialysiert.
  • Die gereinigten Mäuseantikörper und chimären Antikörper, Fragmente und Regionen werden auf ihre Bindung und ihre hemmende und/oder neutralisierende Aktivität untersucht.
  • BEISPIEL XVI
  • In vitro-Aktivität und Neutralisierungswirksamkeit eines chimären anti-TNF-Antikörpers
  • Für die anti-TNFα-Antikörper sowohl aus der Maus als auch für die chimären Antikörper, die entsprechend der Beispiele XIV und XV erhalten werden, wird eine wirksame TNF-hemmende und/oder neutralisierende Aktivität ermittelt, beispielsweise gezeigt mit Hilfe des oben beschriebenen TNF-Zytotoxizitätstests, ausgedrückt in der halbmaximal hemmenden Dosis (ID50).
  • In eben diesem experimentellen System wird für drei andere anti-TNFα-Mäuseantikörper (bezeichnet als TNF-1, TNF-2 und TNF-3) mit vergleichbarer Bindungsaffinität zu TNF gefunden, daß sie ID50-Werte aufweisen, die 1-2 Größenordnungen höher und deshalb in Bezug auf eine Neutralisierung signifikant weniger wirksam sind als sowohl die anti-TNFα-Mäuseantikörper als auch die chimären anti-TNFα-Antikörper der vorliegenden Erfindung.
  • Die Fähigkeit sowohl der Mäuseantikörper als auch der chimären anti-TNFα-Antikörper der vorliegenden Erfindung, wie sie nach den Beispielen XIV und XV erhalten werden, die Bioaktivität von menschlichem TNFα in vitro zu hemmen oder zu neutralisieren, wird unter Verwendung des oben beschriebenen Biotest-Systems untersucht. Kultivierte Zellen, die die Mäuseantikörper oder chimären anti-TNFα-Antikörper der vorliegenden Erfindung, wie nach den Beispielen XIV und XV gewonnen, werden mit 40 pg/ml natürlichem (Genzyme, Boston, MA) oder rekombinantem (Suntory, Osaka, Japan) menschlichem TNF mit oder ohne Antikörper wie oben beschrieben über Nacht inkubiert und der Zelltod wird durch Vitalfärbung gemessen. Wie erwartet, hemmten oder neutralisierten sowohl die Mäuseantikörper als auch die chimären anti-TNFα-Antikörper der vorliegenden Erfindung, wie nach den Beispielen XIV und XV gewonnen, sowohl natürliches als auch rhTNF in einer dosisabhängigen Weise im Zytotoxizitätstest. Eine derartige hemmende und/oder neutralisierende Wirksamkeit bei Antikörper-Konzentrationen von weniger als 1 μg/ml kann leicht im Blut eines Empfängers, dem der Antikörper verabreicht wird, erreicht werden. Entsprechend werden solche hochwirksam hemmenden und/oder neutralisierenden anti-TNF-Antikörper, insbesondere der chimäre Antikörper, zur therapeutischen Verwendung bei TNFα-vermittelten Krankheitsbildern oder Beschwerden bevorzugt.
  • Die Fähigkeit von cA2, die TNF-induzierte IL-6-Sekretion zu hemmen oder zu neutralisieren wird mit Hilfe kultivierter menschlicher diploider FS-4 Fibroblasten beurteilt. Von den Ergebnissen ist zu erwarten, daß sie zeigen, daß sowohl die Mäuseantikörper als auch die chimären anti-TNFα-Antikörper der vorliegenden Erfindung, erhalten gemäß der Beispiele XIV und XV, die IL-6-Sekretion in Zellen, die über Nacht mit TNF inkubiert wurden, wirksam blockieren. Die TNF induzierte IL-6-Sekretion wird nicht gehemmt, wenn ein mAb fehlt oder wenn ein Kontroll-mAb vorhanden ist, der für ein irrelevantes Antigen spezifisch ist.
  • Es wird angenommen, daß die Fähigkeit von TNF, die Prokoagulationsaktivität und die Aktivitäten von Adhäsionsmolekülen endothelialer Zellen (EC) zu stimulieren, einen wichtigen Anteil am pathophysiologischen Geschehen hat. Dies kann insbesondere mit der Gefäßschädigung, ausgedehnter intravasaler Koagulation und schwerer Hypotension verbunden sein, die mit dem septischen Syndrom in Zusammenhang stehen. Deshalb wird die Fähigkeit sowohl der Mäuseantikörper als auch der chimären anti-TNFα-Antikörper der vorliegenden Erfindung, wie sie gemäß der Beispiele XIV und XV gewonnen werden, die TNF-induzierte Aktivierung kultivierter menschlicher Endothelzellen aus der Umbilikalvene (HUVEC) zu blockieren, beurteilt. Die stimulierende Wirkung von TNF auf die Prokoagulationsaktivität wird bestimmt, indem intakte kultivierte HUVEC 4 Stunden lang TNF (mit oder ohne Antikörper) ausgesetzt werden und ein Zellysat in einem Gerinnungstest für menschliches Plasma analysiert wird. Die Ergebnisse sollten die erwartete Verstärkung der Prokoagulationsaktivität (ausgedrückt durch eine verminderte Gerinnungszeit) von HUVEC durch TNF zeigen. Es ist zu erwarten, daß sowohl die Mäuseantikörper als auch die chimären anti-TNFα-Antikörper der vorliegenden Erfindung, erhalten gemäß der Beispiele XIV und XV, diese TNF-Aktivität in einer dosisabhängigen Weise wirksam hemmen oder neutralisieren.
  • Zusätzlich zur Stimulation der Prokoagulationsaktivität induziert TNF auch die Oberflächenexpression von Adhäsionsmolekülen endothelialer Zellen wie etwa ELAM-1 und ICAM-1. Die erwartete Fähigkeit sowohl der Mäuseantikörper als auch der chimären anti-TNFα-Antikörper der vorliegenden Erfindung, erhalten gemäß der Beispiele XIV und XV, diese Aktivität von TNF zu hemmen oder zu neutralisieren, wird durch Verwendung eines für die Detektion von ELAM-1 spezifischen Radioimmuntests gemessen. Kultivierte HUVEC werden mit 250 ng/ml rhTNF (Dainippon, Osaka, Japan) mit oder ohne Antikörper bei 37°C über Nacht in einer 96-Well-Platte stimuliert. Die Oberflächenexpression von ELAM-1 wird bestimmt, indem nacheinander ein Maus-anti-Mensch-ELAM-1-mAb und ein 215I-markiertes Kaninchen-anti-Maus-Immunglobulin als sekundärer Antikörper bei 4°C direkt zu den Kulturplatten gegeben werden.
  • Es ist zu erwarten, daß TNF die Expression von ELAM-1 auf der Oberfläche kultivierter HUVEC induziert und diese Aktivität wiederum sollte in einer dosisabhängigen Weise sowohl durch die Mäuseantikörper als auch durch die chimären anti-TNFα-Antikörper der vorliegenden Erfindung, erhalten gemäß der Beispiele XIV und XV, wirksam blockiert werden.
  • Schließlich ist bekannt, daß TNF die mitogene Aktivität kultivierter Fibroblasten stimuliert. Sowohl von den Mäuseantikörpern als auch von den chimären anti-TNFα-Antikörpern der vorliegenden Erfindung, erhalten gemäß der Beispiele XIV und XV, ist zu erwarten, daß sie die TNF-induzierte Mitogenese menschlicher diploider FS-4 Fibroblastenkulturen hemmen oder neutralisieren, wodurch die Fähigkeit sowohl der Mäuseantikörper als auch der chimären anti-TNFα-Antikörper der vorliegenden Erfindung, erhalten gemäß der Beispiele XIV und XV, zur wirksamen Hemmung und/oder Neutralisierung gegenüber einem breiten Spektrum biologischer Aktivitäten von TNF in vitro bestätigt wird.
  • BEISPIEL XVII
  • In vivo-Aktivität und -Wirksamkeit des Antikörpers cA2
  • Ein in vivo-Modell, bei dem Galaktosamin-sensibilisierten Mäusen letale Dosen von menschlichem TNF verabreicht werden (Lehmann, V. et al., supra), wird entsprechend angepaßt, um damit die Fähigkeit sowohl der Mäuseantikörper als auch der chimären anti- TNFα-Antikörper der vorliegenden Erfindung, erhalten gemäß der Beispiele XIV und XV, zur Hemmung oder Neutralisierung von TNF in vivo, zu untersuchen. Eine Stimulation durch 5 μg (0,25 mg/kg) rhTNF, das i.p. verabreicht wurde, führte zu einer Mortalitätsrate von 80-90 % in unbehandelten Kontrolltieren und in Tieren, die 15-30 Minuten später i.v. entweder mit Kochsalzlösung oder mit 2 mg/kg Kontroll-Antikörper (einem chimeren, von Maus-anti-Thrombozyten-mAb 7E3 abgeleiteten IgG1) behandelt wurden. Im Gegensatz dazu ist zu erwarten, daß eine Behandlung sowohl mit den Mäuseantikörpern als auch mit den chimären anti-TNFα-Antikörpern der vorliegenden Erfindung, erhalten gemäß der Beispiele XIV und XV, die Mortalitätsrate auf 0-30 % mit 0,4 mg/kg Antikörper und auf 0-10 % mit 20 mg/kg reduziert. Diese erwarteten Ergebnisse zeigen an, daß sowohl die Mäuseantikörper als auch die chimären anti-TNFα-Antikörper der vorliegenden Erfindung, erhalten gemäß der Beispiele XIV und XV, in der Lage sind, die biologische Aktivität von TNF in vivo ebenso wie in vitro zu hemmen und/oder zu neutralisieren.
  • BEISPIEL XVIII
  • Klinische Aktivität und Wirksamkeit des Antikörpers cA2
  • Chimärer monoklonaler Antikörper cA2, ein gegen menschlichen TNF gerichtetes IgG1, wurde gesunden männlichen Freiwilligen als Patienten verabreicht. Eine Stunde nachdem sie 4 ng/kg eines NIH-Referenz-Endotoxins erhalten hatten, wurde den Freiwilligen entweder Kochsalzlösung als Kontrolle oder 0,01, 0,10 oder 10 mg/kg cA2 in einer pharmazeutisch vertretbaren Form verabreicht. Die TNF-Konzentrationen im Serum wurden über die Zeit gemessen und es wurde festgestellt, daß sie eine dosisabhängige Verminderung der TNF-Spitzenkonzentrationen zeigten, wobei bei Freiwilligen, die cA2 in einer Dosis von 10 mg/kg erhalten hatten, kein TNF nachgewiesen wurde. Dementsprechend ist von einer Therapie mit einem chimären anti-TNF-Antikörper der vorliegenden Erfindung zu erwarten, daß die TNF-vermittelten Wirkungen beim Menschen gehemmt werden.
  • Patienten, die Endotoxin erhalten, entwickeln eine ausgeprägte Leukopenie, die auf eine Verminderung weißer Blutzellen zurückgeführt wird. Werden die weißen Blutzellen aktiviert, können sie sich an endotheliale Rezeptoren heften, was zu Endothelschäden führt. Bei Dosen von 1,0-10,0 mg/kg wird diese Leukopenie verhindert, dagegen wurde bei Dosierungen von 0,01 und 0,1 mg/kg ein Rückgang der Anzahl weißer Blutzellen beobachtet. Der Rückgang war entlang der polymorphkernigen Zellinie am stärksten ausgeprägt. Bei allen Patienten trat nachfolgend eine Leukozytose auf, die durch die Behandlung mit chimärem anti-TNF-Antikörper cA2 unverändert blieb. Die Hemmwirkung auf den Rückgang der weißen Blutzellen könnte einen protektiven Effekt gegenüber der mit TNF zusammenhängenden Endothelschädigung darstellen. Nach dem Stand der Technik wird angenommen, daß diese TNF-abhängige Endothelschädigung eine signifikante Rolle im Hinblick auf Morbidität und Mortalität im Zusammenhang mit einer Sepsis spielt und deshalb ist zu erwarten, daß die anti-TNF-Antikörper der vorliegenden Erfindung einen protektiven Effekt gegenüber diesen schädigenden Wirkungen ausüben, wie hier dargestellt.
  • Die oben zitierten Referenzen sind alle durch Zitat in diese Schrift aufgenommen, unabhängig davon, ob sie ausdrücklich aufgenommen wurden oder nicht.
  • SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 00710001
  • Figure 00720001

Claims (22)

  1. Chimäres Immunglobulinmolekül, wobei das Immunglobulinmolekül aus einem chimären Antikörper, einer chimären Immunglobulinkette oder einem Antigen-bindenden Fragment oder einer Region hiervon ausgewählt ist, wobei das Immunglobulinmolekül mindestens einen Teil einer konstanten menschlichen Immunglobulinregion und mindestens einen Teil einer variablen nicht-menschlichen Immunglobulinregion umfaßt, wobei das Immunglobulinmolekül Spezifität gegenüber einem neutralisierenden Epitop des menschlichen Tumornekrosefaktors-α (TNFα) aufweist und wobei das Immunglobulinmolekül (i) die Cytotoxizität des menschlichen TNFα oder des Schimpansen-TNFα neutralisiert oder hemmt und (ii) die cytotoxische Wirkung des von Pavianen, Cynomolgus- und Rhesusaffen produzierten TNFα oder des menschlichen TNFβ nicht hemmt und (iii) folgendes neutralisiert: (a) die TNF-induzierte IL-6-Sekretion; (b) die TNF-Aktivierung von Prokoagulans und Adhäsionsmolekül-Aktivitäten von Endothelzellen und (c) die TNF-induzierte Oberflächenexpression von ELAM-1.
  2. Ein chimäres Immunglobulinmolekül nach Anspruch 1, umfassend zwei leichte und zwei schwere Ketten, wobei die Ketten jeweils mindestens Teil einer konstanten Region und mindestens Teil einer variablen Region umfassen, wobei die variable Region Spezifität gegenüber dem menschlichen TNFα aufweist und das Immunglobulinmolekül in vivo mit hoher Affinität an ein neutralisierendes Epitop des menschlichen TNFα bindet.
  3. Ein chimäres Immunglobulinmolekül nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei das Immunglobulinmolekül eine Antigen-bindende Region aufweist, die die Reste 87-108 oder sowohl 59-80 als auch 87-108 des hTNFα mit der SEQ ID Nr.: 1 bindet, wie bestimmt durch das Haarnadel-Peptidsyntheseverfahren.
  4. Ein chimäres Immunglobulinmolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Immunglobulinmolekül nicht an eines oder mehrere Epitope bindet, die in den Aminosäuren 11-13, 37-42, 49-57 oder 155-157 des hTNFα mit der SEQ ID Nr.: 1 eingeschlossen sind, wie bestimmt durch das Haarnadel-Peptidsyntheseverfahren.
  5. Ein chimäres Immunglobulinmolekül nach Anspruch 1 oder nach einem der von Anspruch 1 abhängigen Ansprüche, wobei die variable Region von der Maus stammt.
  6. Ein chimäres Immunglobulinmolekül nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die konstante Region als Isoty-pIgG1 gekennzeichnet ist.
  7. Ein chimäres Immunglobulinmolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Affinität, gemessen als Assoziationskonstante (Ka), mindestens 1 × 108 l/mol, beispielsweise mindestens 1 × 109 l/mol beträgt.
  8. Ein chimäres Immunglobulinmolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 7, das menschlichen TNFα mit einer ID50 von mindestens etwa 1 μg/ml neutralisiert.
  9. Ein chimäres Immunglobulinmolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 8, das menschlichen TNFα mit einer ID50 von mindestens etwa 100 ng/ml neutralisiert.
  10. Ein chimäres Immunglobulinmolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 9, das den menschlichen TNFα mit einer ID50 von mindestens etwa 15 ng/ml neutralisiert.
  11. Ein isoliertes Polynucleotid, umfassend eine Nucleotidsequenz, die ein chimäres Immunglobulinmolekül nach einem der vorhergehenden Ansprüche codiert, wobei die Nucleotidsequenz mindestens eine variable Region in zweckorientierter Verknüpfung mit mindestens einer konstanten Region codiert.
  12. Ein Polynucleotid nach Anspruch 11, wobei die Nucleotidsequenz aus einer genomischen DNA-Sequenz oder einer cDNA-Sequenz ausgewählt ist.
  13. Ein Expressionsvehikel, umfassend ein Polynucleotid nach Anspruch 11 oder Anspruch 12.
  14. Ein Wirt, der mit dem Polynucleotid nach Anspruch 11 oder Anspruch 12 transformiert oder transfiziert ist, wobei der Wirt eine eukaryotische Zelle (z.B. eine Säugerzelle) oder eine Bakterienzelle ist.
  15. Ein Verfahren zur Herstellung eines chimären Immunglobulinmoleküls nach einem der Ansprüche 1 bis 10, umfassend die Schritte: (a) Kultivieren eines Wirts nach Anspruch 14 derart, daß das Immunglobulinmolekül in gewinnbaren Mengen exprimiert wird und; (b) Gewinnen des Mengen exprimiert wird und; (b) Gewinnen des Immunglobulinmoleküls aus dem Wirt.
  16. Eine pharmazeutische Zusammensetzung umfassend ein Immunglobulinmolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 10 oder ein pharmazeutisch verträgliches Derivat hiervon, das ein Ester, Ether, Sulfat, Carbonat, Glukuronosid oder ein Salz hiervon ist, und einen pharmazeutisch verträglichen Trägerstoff.
  17. Eine Zusammensetzung zur Verwendung bei der Therapie (z.B. bei der Behandlung eines Subjektes mit einer TNFα-vermittelten Pathologie), umfassend ein Immunglobulinmolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 10 oder ein pharmazeutisch verträgliches Derivat hiervon nach Anspruch 16.
  18. Eine Zusammensetzung nach Anspruch 17, wobei die Pathologie ausgewählt ist aus dem Sepsissyndrom, Kachexie, Kreislaufkollaps und Schock aufgrund von akuter oder chronischer bakterieller Infektion, einer bakteriellen Infektion, einer viralen Infektion, einer Pilzinfektion, eines systemischem Lupus erythematodes, Alkohol-bedingter Hepatitis, einer chronisch-entzündlichen Pathologie, einer entzündlichen Gefäßpathologie, einer Transplantatgegen-Empfänger-Pathologie, Kawasaki-Pathologie und einer malignen Pathologie.
  19. Eine Zusammensetzung nach Anspruch 17, wobei die Pathologie entweder rheumatoide Arthritis oder Crohn Pathologie ist.
  20. Verwendung eines Immunglobulinmoleküls nach einem der Ansprüche 1 bis 10 oder eines pharmazeutisch verträglichen Derivates hiervon, wie in Anspruch 16 definiert, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer TNFα-vermittelten Pathologie.
  21. Verwendung nach Anspruch 20, wobei die Pathologie ausgewählt ist aus dem Sepsissyndrom, Kachexie, Kreislaufkollaps und Schock aufgrund von akuter oder chronischer bakterieller Infektion, einer bakteriellen Infektion, einer viralen Infektion, einer Pilzinfektion, eines systemischem Lupus erythematodes Alkohol-bedingter Hepatitis, einer chronisch-entzündlichen Pathologie, einer entzündlichen Gefäßpathologie, einer Transplantat-gegen-Empfänger-Pathologie, Kawasaki-Pathologie und einer malignen Pathologie.
  22. Verwendung nach Anspruch 20, wobei die Pathologie entweder rheumatoide Arthritis oder Crohn Pathologie ist.
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Families Citing this family (157)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5859205A (en) 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
GB8928874D0 (en) 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
US6750325B1 (en) 1989-12-21 2004-06-15 Celltech R&D Limited CD3 specific recombinant antibody
GB9109645D0 (en) * 1991-05-03 1991-06-26 Celltech Ltd Recombinant antibodies
US5994510A (en) * 1990-12-21 1999-11-30 Celltech Therapeutics Limited Recombinant antibodies specific for TNFα
US6284471B1 (en) 1991-03-18 2001-09-04 New York University Medical Center Anti-TNFa antibodies and assays employing anti-TNFa antibodies
US7192584B2 (en) 1991-03-18 2007-03-20 Centocor, Inc. Methods of treating psoriasis with anti-TNF antibodies
US5919452A (en) * 1991-03-18 1999-07-06 New York University Methods of treating TNFα-mediated disease using chimeric anti-TNF antibodies
US5656272A (en) * 1991-03-18 1997-08-12 New York University Medical Center Methods of treating TNF-α-mediated Crohn's disease using chimeric anti-TNF antibodies
US6277969B1 (en) 1991-03-18 2001-08-21 New York University Anti-TNF antibodies and peptides of human tumor necrosis factor
DE07006112T1 (de) 1991-03-18 2010-01-21 New York University Monoklonale und chimäre Antikörper gegen humanen Tumornekrosefaktor
IT1254315B (it) * 1992-03-27 1995-09-14 Mini Ricerca Scient Tecnolog Anticorpi monoclonali anti-idiotipici diretti contro anticorpi anti-tnf.
ES2121907T3 (es) * 1992-08-28 1998-12-16 Bayer Ag Uso de anticuerpos monoclonales anti-tnf para el tratamiento de meningitis bacterianas.
US6270766B1 (en) 1992-10-08 2001-08-07 The Kennedy Institute Of Rheumatology Anti-TNF antibodies and methotrexate in the treatment of arthritis and crohn's disease
US6863890B1 (en) 1993-02-26 2005-03-08 Advanced Biotherapy, Inc. Treatment of AIDS with antibodies to gamma interferon, alpha interferon and TNF-alpha
US5888511A (en) * 1993-02-26 1999-03-30 Advanced Biotherapy Concepts, Inc. Treatment of autoimmune diseases, including AIDS
ES2138662T3 (es) * 1993-06-03 2000-01-16 Therapeutic Antibodies Inc Produccion de fragmentos de anticuerpos.
CA2097952C (en) * 1993-06-08 2006-03-14 Alex D. Romaschin Early diagnosis of sepsis utilizing antigen-antibody interactions amplified by whole blood chemiluminescence
NZ278607A (en) * 1994-02-07 1999-05-28 Knoll Ag Use of tnf antagonists for treating disorders involving elevated serum levels of il-6 wherein the serum levels are 500pg/ml or above
US6203997B1 (en) 1994-06-08 2001-03-20 Sepsis, Inc. Quantitation of analytes in whole blood
US5804370A (en) * 1994-06-08 1998-09-08 Critichem Medical Products Limited Early diagnosis of sepsis utilizing antigen-antibody interactions amplified by whole blood chemiluminescence
US6090382A (en) 1996-02-09 2000-07-18 Basf Aktiengesellschaft Human antibodies that bind human TNFα
US20140212413A1 (en) * 1995-12-11 2014-07-31 New York University Methods of Treating TNF-alpha-Mediated Diseases Using Chimeric TNF-alpha Antibodies
SI9720020B (en) 1996-02-09 2001-12-31 Basf Ag Human antibodies that bind human TNF alpha
US7608262B2 (en) * 1996-02-16 2009-10-27 The Kennedy Institute Of Rheumatology Methods of preventing or treating thrombosis with tumor necrosis factor antagonists
AU4413097A (en) * 1996-09-19 1998-04-14 Centocor Inc. Hiv-1 therapy with il-2 and anti-tnf antibody
DK0936923T3 (da) * 1996-11-15 2004-04-26 Kennedy Inst Of Rheumatology Undertrykkelse af TNFalpha og IL-12 ved terapi
WO1998036778A1 (en) * 1997-02-19 1998-08-27 Centocor, Inc. Sustained drug delivery and compositions useful therefor
AU7345798A (en) * 1997-05-12 1998-12-08 Kennedy Institute Of Rheumatology, The Suppression of tumor necrosis factor alpha and vascular endothelial growth factor in therapy
US6159683A (en) * 1997-12-16 2000-12-12 Spectral Diagnostics, Inc. Method of determining stage of sepsis
EP1022027A1 (de) * 1999-01-22 2000-07-26 Applied Research Systems ARS Holding N.V. Antagonisten von Tumornecrosefaktor und ihre Verwendungen gegen Endometriose
CA2364026C (en) * 1999-03-02 2012-08-21 Centocor, Inc. Anti-tnf.alpha. antibodies in therapy of asthma
US20040220103A1 (en) 1999-04-19 2004-11-04 Immunex Corporation Soluble tumor necrosis factor receptor treatment of medical disorders
JP4812921B2 (ja) * 2000-04-14 2011-11-09 田辺三菱製薬株式会社 ベーチェット病治療剤
UA81743C2 (uk) 2000-08-07 2008-02-11 Центокор, Инк. МОНОКЛОНАЛЬНЕ АНТИТІЛО ЛЮДИНИ, ЩО СПЕЦИФІЧНО ЗВ'ЯЗУЄТЬСЯ З ФАКТОРОМ НЕКРОЗУ ПУХЛИН АЛЬФА (ФНПα), ФАРМАЦЕВТИЧНА КОМПОЗИЦІЯ, ЩО ЙОГО МІСТИТЬ, ТА СПОСІБ ЛІКУВАННЯ РЕВМАТОЇДНОГО АРТРИТУ
AU2002254234A1 (en) * 2001-03-14 2002-09-24 Centocor, Inc. Chronic obstructive pulmonary disease-related immunglobulin derived proteins, compositions, methods and uses
CA2868614A1 (en) 2001-06-08 2002-12-08 Abbott Laboratories (Bermuda) Ltd. Methods of administering anti-tnf.alpha. antibodies
TWI327597B (en) 2001-08-01 2010-07-21 Centocor Inc Anti-tnf antibodies, compositions, methods and uses
MXPA04004417A (es) * 2001-11-12 2004-08-11 Merck Patent Gmbh Anticuerpo anti-tnf alfa modificado.
US20030206898A1 (en) 2002-04-26 2003-11-06 Steven Fischkoff Use of anti-TNFalpha antibodies and another drug
NZ555692A (en) * 2002-07-19 2009-02-28 Abbott Biotech Ltd Treatment of TNF alpha related disorders
US20040033228A1 (en) 2002-08-16 2004-02-19 Hans-Juergen Krause Formulation of human antibodies for treating TNF-alpha associated disorders
MY150740A (en) * 2002-10-24 2014-02-28 Abbvie Biotechnology Ltd Low dose methods for treating disorders in which tnf? activity is detrimental
ES2347239T3 (es) 2002-12-02 2010-10-27 Amgen Fremont Inc. Anticuerpos dirigidos al factor de necrosis tumoral y usos de los mismos.
US7429378B2 (en) 2003-05-13 2008-09-30 Depuy Spine, Inc. Transdiscal administration of high affinity anti-MMP inhibitors
US7344716B2 (en) 2003-05-13 2008-03-18 Depuy Spine, Inc. Transdiscal administration of specific inhibitors of pro-inflammatory cytokines
US7553827B2 (en) 2003-08-13 2009-06-30 Depuy Spine, Inc. Transdiscal administration of cycline compounds
US8273347B2 (en) 2003-05-13 2012-09-25 Depuy Spine, Inc. Autologous treatment of degenerated disc with cells
US8361467B2 (en) 2003-07-30 2013-01-29 Depuy Spine, Inc. Trans-capsular administration of high specificity cytokine inhibitors into orthopedic joints
US8895540B2 (en) 2003-11-26 2014-11-25 DePuy Synthes Products, LLC Local intraosseous administration of bone forming agents and anti-resorptive agents, and devices therefor
JP5554466B2 (ja) 2004-03-01 2014-07-23 味の素株式会社 抗ヒトＴＮＦ−α抗体活性低下抑制剤
CN104480200B (zh) 2004-03-31 2017-12-29 综合医院公司 测定癌症对表皮生长因子受体靶向性治疗反应性的方法
TW201705980A (zh) 2004-04-09 2017-02-16 艾伯維生物技術有限責任公司 用於治療ＴＮＦα相關失調症之多重可變劑量療法
CN101500607B (zh) 2005-05-16 2013-11-27 阿布维生物技术有限公司 TNFα抑制剂治疗腐蚀性多关节炎的用途
EP1919951B1 (de) * 2005-08-04 2015-01-28 Janssen Biotech, Inc. Anti-tnf-alpha-antikörper und anwendungsverfahren
JP4861019B2 (ja) * 2006-01-31 2012-01-25 独立行政法人科学技術振興機構 ヒトＴＮＦ−αに対する抗体酵素およびその利用
SG170837A1 (en) 2006-04-05 2011-05-30 Abbott Biotech Ltd Antibody purification
US9399061B2 (en) 2006-04-10 2016-07-26 Abbvie Biotechnology Ltd Methods for determining efficacy of TNF-α inhibitors for treatment of rheumatoid arthritis
US9605064B2 (en) 2006-04-10 2017-03-28 Abbvie Biotechnology Ltd Methods and compositions for treatment of skin disorders
US9624295B2 (en) 2006-04-10 2017-04-18 Abbvie Biotechnology Ltd. Uses and compositions for treatment of psoriatic arthritis
AU2007294731B2 (en) 2006-09-13 2014-04-17 Abbvie Inc. Cell culture improvements
WO2008141176A1 (en) 2007-05-11 2008-11-20 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods of treatment of skin ulcers
KR101461659B1 (ko) 2007-05-11 2014-11-17 토마스 제퍼슨 유니버시티 신경변성 질환 및 장애의 치료 및 예방 방법
EP2171451A4 (de) 2007-06-11 2011-12-07 Abbott Biotech Ltd Verfahren zur behandlung juveniler idiopathischer arthritis
WO2009032128A1 (en) 2007-08-28 2009-03-12 Abbott Biotechnology Ltd. Compositions and methods comprising binding proteins for adalimumab
US8986696B2 (en) 2007-12-21 2015-03-24 Depuy Mitek, Inc. Trans-capsular administration of p38 map kinase inhibitors into orthopedic joints
SG2013054218A (en) 2008-01-15 2014-10-30 Abbott Gmbh & Co Kg Powdered protein compositions and methods of making same
CA2722466A1 (en) 2008-04-29 2009-11-05 Tariq Ghayur Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
WO2009142186A1 (ja) * 2008-05-20 2009-11-26 株式会社カネカ 細胞障害性組成物
CA2725666A1 (en) 2008-06-03 2009-12-10 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
AU2009256250B2 (en) 2008-06-03 2013-05-30 Abbvie Inc. Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
WO2009152133A1 (en) 2008-06-10 2009-12-17 Abbott Laboratories Novel tricyclic compounds
NZ590074A (en) 2008-07-08 2012-12-21 Abbott Lab Prostaglandin e2 dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
US8415291B2 (en) 2008-10-31 2013-04-09 Centocor Ortho Biotech Inc. Anti-TNF alpha fibronectin type III domain based scaffold compositions, methods and uses
JP2009102390A (ja) * 2009-01-21 2009-05-14 Mitsubishi Tanabe Pharma Corp ベーチェット病治療剤
EP2228652A1 (de) 2009-03-11 2010-09-15 Medizinische Universität Wien Verbesserung bei der Tumorbehandlung
WO2011015916A2 (en) * 2009-08-03 2011-02-10 Avesthagen Limited Vectors and compounds for expression of recombinant infliximab
TWI465250B (zh) 2009-08-29 2014-12-21 Abbvie Inc 治療用之ｄｌｌ４結合蛋白質
KR20140015139A (ko) 2009-10-15 2014-02-06 애브비 인코포레이티드 이원 가변 도메인 면역글로불린 및 이의 용도
UY32979A (es) 2009-10-28 2011-02-28 Abbott Lab Inmunoglobulinas con dominio variable dual y usos de las mismas
AR079234A1 (es) 2009-12-01 2012-01-04 Abbott Lab Derivados heterociclicos condensados nitrogenados, composiciones farmaceuticas que los contienen y uso de los mismos para tratar afecciones oncologicas, del sistema nervioso y/o del sistema inmune.
NZ599938A (en) 2009-12-01 2014-08-29 Abbvie Inc Novel tricyclic compounds
JO3417B1 (ar) 2010-01-08 2019-10-20 Regeneron Pharma الصيغ المستقرة التي تحتوي على الأجسام المضادة لمضاد مستقبل( interleukin-6 (il-6r
CL2010000019A1 (es) * 2010-01-11 2010-06-11 Univ Chile Anticuerpo monoclonal contra el tnf humano y sus fragmentos, secuencias nucleotidicas que lo codifican, vector de expresion y celulas que las contienen, composiciones y kit que comprenden el anticuerpo, uso de los mismos y metodo para su obtencion.
JP5947727B2 (ja) 2010-01-20 2016-07-06 メルク・シャープ・アンド・ドーム・コーポレーションＭｅｒｃｋ Ｓｈａｒｐ ＆ Ｄｏｈｍｅ Ｃｏｒｐ． 抗ｉｌｔ５抗体およびｉｌｔ５結合抗体断片による免疫調節
EP2525813B1 (de) 2010-01-20 2017-01-04 Merck Sharp & Dohme Corp. Antikörper gegen ilt5 und ilt5-bindende antikörper-fragmente
EP2542582A4 (de) 2010-03-02 2013-12-04 Abbvie Inc Therapeutische dll4-bindende proteine
SI2575884T1 (sl) 2010-06-03 2018-10-30 Abbvie Biotechnology Ltd Uporabe in sestavki za zdravljenje supurativnega hidradenitisa (HS)
CA2807014A1 (en) 2010-08-03 2012-02-09 Abbvie Inc. Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
EP2600901B1 (de) 2010-08-06 2019-03-27 ModernaTX, Inc. Pharmazeutische zusammensetzungen enthaltenbearbeitete nukleinsäuren und ihre medizinische verwendung
TW201211252A (en) 2010-08-26 2012-03-16 Abbott Lab Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
ES2737960T3 (es) 2010-10-01 2020-01-17 Modernatx Inc Nucleósidos, nucleótidos y ácidos nucleicos modificados y sus usos
CN102675460B (zh) 2011-02-28 2015-08-19 珠海市丽珠单抗生物技术有限公司 抗肿瘤坏死因子α的人源化抗体
US8658171B2 (en) 2011-02-28 2014-02-25 Livzon Mabpharm Inc. Humanized anti-TNFα antibodies
AU2012236099A1 (en) 2011-03-31 2013-10-03 Moderna Therapeutics, Inc. Delivery and formulation of engineered nucleic acids
WO2012149197A2 (en) 2011-04-27 2012-11-01 Abbott Laboratories Methods for controlling the galactosylation profile of recombinantly-expressed proteins
AU2012271413B2 (en) 2011-06-17 2017-07-13 President And Fellows Of Harvard College Frizzled 2 as a target for therapeutic antibodies in the treatment of cancer
US20140227293A1 (en) 2011-06-30 2014-08-14 Trustees Of Boston University Method for controlling tumor growth, angiogenesis and metastasis using immunoglobulin containing and proline rich receptor-1 (igpr-1)
JP2014527957A (ja) * 2011-08-01 2014-10-23 アヴァクシア バイオロジクス，インコーポレーテッド ヒトｔｎｆに特異的なウシポリクローナル抗体
US9464124B2 (en) 2011-09-12 2016-10-11 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
EP3682905B1 (de) 2011-10-03 2021-12-01 ModernaTX, Inc. Modifizierte nukleoside, nukleotide und nukleinsäuren und verwendungen davon
US9943594B2 (en) 2011-10-11 2018-04-17 Sanofi Biotechnology Methods for the treatment of rheumatoid arthritis
TWI589299B (zh) 2011-10-11 2017-07-01 再生元醫藥公司 用於治療類風濕性關節炎之組成物及其使用方法
US9580501B2 (en) 2011-12-16 2017-02-28 Synthon Biopharmaceuticals B.V. Anti-TNF alpha monoclonal secretory IgA antibodies and methods for treating inflammatory diseases
EP2791160B1 (de) 2011-12-16 2022-03-02 ModernaTX, Inc. Modifizierte mrna zusammensetzungen
UY34558A (es) 2011-12-30 2013-07-31 Abbvie Inc Proteínas de unión específicas duales dirigidas contra il-13 y/o il-17
JP2012092147A (ja) * 2012-02-07 2012-05-17 Mitsubishi Tanabe Pharma Corp ベーチェット病治療剤
US9283287B2 (en) 2012-04-02 2016-03-15 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of nuclear proteins
US9303079B2 (en) 2012-04-02 2016-04-05 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins
AU2013243948A1 (en) 2012-04-02 2014-10-30 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of proteins associated with human disease
US9572897B2 (en) 2012-04-02 2017-02-21 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins
US9067990B2 (en) 2013-03-14 2015-06-30 Abbvie, Inc. Protein purification using displacement chromatography
US9334319B2 (en) 2012-04-20 2016-05-10 Abbvie Inc. Low acidic species compositions
WO2013158273A1 (en) 2012-04-20 2013-10-24 Abbvie Inc. Methods to modulate c-terminal lysine variant distribution
WO2013176754A1 (en) 2012-05-24 2013-11-28 Abbvie Inc. Novel purification of antibodies using hydrophobic interaction chromatography
KR20150043523A (ko) 2012-09-02 2015-04-22 애브비 인코포레이티드 단백질 불균일성의 제어 방법
US9512214B2 (en) 2012-09-02 2016-12-06 Abbvie, Inc. Methods to control protein heterogeneity
AU2013337775B2 (en) 2012-11-01 2017-03-30 Abbvie Inc. Anti-VEGF/DLL4 dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
EP4074834A1 (de) 2012-11-26 2022-10-19 ModernaTX, Inc. Am kettenende modifizierte rna
SG11201507230PA (en) 2013-03-12 2015-10-29 Abbvie Inc Human antibodies that bind human tnf-alpha and methods of preparing the same
WO2014151878A2 (en) 2013-03-14 2014-09-25 Abbvie Inc. Methods for modulating protein glycosylation profiles of recombinant protein therapeutics using monosaccharides and oligosacharides
US9017687B1 (en) 2013-10-18 2015-04-28 Abbvie, Inc. Low acidic species compositions and methods for producing and using the same using displacement chromatography
WO2014159579A1 (en) 2013-03-14 2014-10-02 Abbvie Inc. MUTATED ANTI-TNFα ANTIBODIES AND METHODS OF THEIR USE
CA2907140A1 (en) * 2013-03-15 2014-09-25 Janssen Biotech, Inc. Manufacturing methods to control c-terminal lysine, galactose and sialic acid content in recombinant proteins
CN105324396A (zh) 2013-03-15 2016-02-10 艾伯维公司 针对IL-1β和/或IL-17的双重特异性结合蛋白
US8980864B2 (en) 2013-03-15 2015-03-17 Moderna Therapeutics, Inc. Compositions and methods of altering cholesterol levels
CA2918194C (en) 2013-03-27 2022-12-06 The General Hospital Corporation Methods and agents for treating alzheimer's disease
WO2015048744A2 (en) 2013-09-30 2015-04-02 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotides encoding immune modulating polypeptides
CA2926218A1 (en) 2013-10-03 2015-04-09 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotides encoding low density lipoprotein receptor
US9598667B2 (en) 2013-10-04 2017-03-21 Abbvie Inc. Use of metal ions for modulation of protein glycosylation profiles of recombinant proteins
US9085618B2 (en) 2013-10-18 2015-07-21 Abbvie, Inc. Low acidic species compositions and methods for producing and using the same
US8946395B1 (en) 2013-10-18 2015-02-03 Abbvie Inc. Purification of proteins using hydrophobic interaction chromatography
US9181337B2 (en) 2013-10-18 2015-11-10 Abbvie, Inc. Modulated lysine variant species compositions and methods for producing and using the same
WO2015073884A2 (en) 2013-11-15 2015-05-21 Abbvie, Inc. Glycoengineered binding protein compositions
JP5797728B2 (ja) * 2013-12-20 2015-10-21 田辺三菱製薬株式会社 ベーチェット病治療剤
WO2015135884A1 (en) 2014-03-10 2015-09-17 Richter Gedeon Nyrt. Immunoglobulin purification using pre-cleaning steps
JP6841753B2 (ja) 2014-09-15 2021-03-10 ザ チルドレンズ メディカル センター コーポレーション ヒストンｈ３−リジントリメチル化を除去することによって体細胞核移入（ｓｃｎｔ）効率を増加させるための方法および組成物
US10093733B2 (en) 2014-12-11 2018-10-09 Abbvie Inc. LRP-8 binding dual variable domain immunoglobulin proteins
EP3078675A1 (de) 2015-04-10 2016-10-12 Ares Trading S.A. Induktionsdosierschema zur behandlung von krankheiten die von tnf alpha verursacht sind
TW201710286A (zh) 2015-06-15 2017-03-16 艾伯維有限公司 抗ｖｅｇｆ、ｐｄｇｆ及／或其受體之結合蛋白
HU231463B1 (hu) 2015-08-04 2024-01-28 Richter Gedeon Nyrt. Módszer rekombináns proteinek galaktóz tartalmának növelésére
US11512092B2 (en) 2015-10-16 2022-11-29 Abbvie Inc. Processes for the preparation of (3S,4R)-3-ethyl-4-(3H-imidazo[1,2-a]pyrrolo[2,3-e]-pyrazin-8-yl)-n-(2,2,2-trifluoroethyl)pyrrolidine-1-carboxamide and solid state forms thereof
US11524964B2 (en) 2015-10-16 2022-12-13 Abbvie Inc. Processes for the preparation of (3S,4R)-3-ethyl-4-(3H-imidazo[1,2-a]pyrrolo[2,3-e]-pyrazin-8-yl)-n-(2,2,2-trifluoroethyl)pyrrolidine-1-carboxamide and solid state forms thereof
US11773106B2 (en) 2015-10-16 2023-10-03 Abbvie Inc. Processes for the preparation of (3S,4R)-3-ethyl-4-(3H-imidazo[1,2-a]pyrrolo[2,3-e]-pyrazin-8-yl)-N-(2,2,2-trifluoroethyl)pyrrolidine-1-carboxamide and solid state forms thereof
US11365198B2 (en) 2015-10-16 2022-06-21 Abbvie Inc. Processes for the preparation of (3S,4R)-3-ethyl-4-(3H-imidazo[1,2-a]pyrrolo[2,3-e]-pyrazin-8-yl)-N-(2,2,2-trifluoroethyl)pyrrolidine-1-carboxamide and solid state forms thereof
US10550126B2 (en) 2015-10-16 2020-02-04 Abbvie Inc. Processes for the preparation of (3S,4R)-3-ethyl-4-(3H-imidazo[1,2-A]pyrrolo[2,3-e]-pyrazin-8-yl)-N-(2,2,2-trifluoroethyl)pyrrolidine-1-carboxamide and solid state forms thereof
CN116270646A (zh) 2015-10-16 2023-06-23 艾伯维公司 制备咪唑并[1,2-a]吡咯并[2,3-e]吡嗪类化合物及其固态形式的方法
US10465003B2 (en) 2016-02-05 2019-11-05 Janssen Biotech, Inc. Anti-TNF antibodies, compositions, methods and use for the treatment or prevention of type 1 diabetes
CN110234351A (zh) 2017-01-30 2019-09-13 詹森生物科技公司 用于治疗活动性银屑病关节炎的抗tnf抗体、组合物和方法
CN110418652A (zh) 2017-02-07 2019-11-05 詹森生物科技公司 用于治疗活动性强直性脊柱炎的抗tnf抗体、组合物和方法
MA53481A (fr) 2018-08-29 2021-07-07 Regeneron Pharma Méthodes et compositions pour le traitement de sujets ayant une polyarthrite rhumatoïde
HUP1800376A2 (hu) 2018-11-07 2020-05-28 Richter Gedeon Nyrt Sejttenyészetben elõállított rekombináns glikoprotein glikozilációs-mintázatának megváltoztatására szolgáló módszer
JP2022519828A (ja) 2019-01-31 2022-03-25 サノフィ・バイオテクノロジー 若年性特発性関節炎を治療するための抗ｉｌ－６受容体抗体
HUP1900112A1 (hu) 2019-04-04 2020-10-28 Richter Gedeon Nyrt Immunglobulinok affinitás kromatográfiájának fejlesztése kötést megelõzõ flokkulálás alkalmazásával
US11780911B2 (en) 2019-05-23 2023-10-10 Janssen Biotech, Inc. Method of treating inflammatory bowel disease with a combination therapy of antibodies to IL-23 and TNF alpha
EP4261222A1 (de) 2020-12-09 2023-10-18 HK inno.N Corporation Anti-ox40l-antikörper, bispezifischer anti-ox40l/anti-tnfalpha-antikörper und verwendungen davon
WO2024054934A1 (en) 2022-09-07 2024-03-14 Mdx Management Llc Shp-1 inhibitors for treating cancer

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3631229A1 (de) * 1986-09-13 1988-03-24 Basf Ag Monoklonale antikoerper gegen humanen tumornekrosefaktor (tnf) und deren verwendung
JP2647427B2 (ja) * 1987-04-24 1997-08-27 帝人株式会社 被検者の病態の判定のための検出方法、モノクロ−ナル抗体および検出キット
DE3823804A1 (de) * 1988-07-14 1990-01-18 Basf Ag Neutralisation der in vitro und in vivo toxischen eigenschaften von tnf-(alpha) durch monoklonale antikoerper und den davon abgeleiteten fragmenten
NZ229922A (en) * 1988-07-18 1992-04-28 Chiron Corp Monoclonal antibodies specifically binding cachectin (tumor necrosis factor) and compositions
PT92900A (pt) * 1989-01-24 1990-07-31 Sistema de vectores de expressao para a producao de anticorpos monoclonais quimericos
DE10399036I1 (de) * 1989-08-07 2004-04-01 Peptide Technology Ltd Bindeligande für Tumornekrosisfaktor.
GB8928874D0 (en) * 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
DE07006112T1 (de) 1991-03-18 2010-01-21 New York University Monoklonale und chimäre Antikörper gegen humanen Tumornekrosefaktor

Also Published As

Publication number Publication date
DE07012626T1 (de) 2010-01-21
ATE201234T1 (de) 2001-06-15
JP2011155992A (ja) 2011-08-18
EP1097945A2 (de) 2001-05-09
NL300069I1 (nl) 2002-02-01
DK1097945T3 (da) 2007-11-05
DE69231828T3 (de) 2008-06-19
CA2106299A1 (en) 1992-09-19
EP1681305A2 (de) 2006-07-19
ES2156859T5 (es) 2008-03-16
AU1764992A (en) 1992-10-21
EP1857554A1 (de) 2007-11-21
HK1037923A1 (en) 2002-02-22
AU668864B2 (en) 1996-05-23
EP1097945A3 (de) 2001-10-10
DE69233701T2 (de) 2008-04-10
WO1992016553A1 (en) 1992-10-01
JP2008156371A (ja) 2008-07-10
DK0610201T3 (da) 2001-06-18
ES2156859T3 (es) 2001-08-01
ATE366316T1 (de) 2007-07-15
DE69233701D1 (de) 2007-08-16
DE07006112T1 (de) 2010-01-21
CA2106299C (en) 2001-02-06
EP1905782A1 (de) 2008-04-02
GR3036375T3 (en) 2001-11-30
EP1857553A1 (de) 2007-11-21
DE06001779T1 (de) 2010-01-14
JP2012087144A (ja) 2012-05-10
DE10199067I2 (de) 2006-03-16
JP2007197457A (ja) 2007-08-09
JP2004180686A (ja) 2004-07-02
DE10199067I1 (de) 2002-02-21
JPH06506120A (ja) 1994-07-14
EP0610201A1 (de) 1994-08-17
NL300069I2 (nl) 2002-10-01
EP0610201B1 (de) 2001-05-16
JP2007254477A (ja) 2007-10-04
DK0610201T4 (da) 2008-02-04
CA2736076A1 (en) 1992-09-19
ES2289997T3 (es) 2008-02-16
DE69231828D1 (de) 2001-06-21
LU90854I2 (fr) 2002-02-04
EP0610201B2 (de) 2007-09-26
EP1097945B1 (de) 2007-07-04
JP2008195724A (ja) 2008-08-28
DE07012625T1 (de) 2010-01-21
EP0610201A4 (de) 1995-05-24
EP1681305A3 (de) 2008-02-27

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