JPH11503752A

JPH11503752A - 抗ｔｎｆ抗体の複数回投与

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Publication number: JPH11503752A
Application number: JP8531685A
Authority: JP
Inventors: フェルドマン，マーク; ナスメイニ，ラビンダー; エヌ．ウッディー，ジェイムス
Original assignee: ザケネディーインスティチュートオブリューマトロジー; セントコー，インコーポレーテッド
Priority date: 1995-04-20
Filing date: 1995-04-20
Publication date: 1999-03-30

Abstract

(57)【要約】本発明は、個体に複数回の用量の抗ＴＮＦ抗体を投与することを含む、ＴＮＦ介在性疾患を有する個体の治療方法であって、第２回目のまたはその後の投与が、該疾患の再発期または再発前に投与される方法に関する。該疾患は、関節リウマチ等のＴＮＦα介在性疾患であることが好ましい。抗ＴＮＦ抗体は、ネズミ抗体、キメラ抗体もしくはヒト抗体またはその断片等のモノクローナル抗体またはその断片であってもよい。該抗体は、８７〜１０８および５９〜８０からなる群より選ばれたヒトＴＮＦα（ｈＴＮＦα）の１以上のアミノ酸と結合することが好ましい。該抗体は、Ａ２またはｃＡ２のエピトープと結合できる。好ましい態様において、該抗体は、Ａ２またはｃＡ２である。

Description

【発明の詳細な説明】抗ＴＮＦ抗体の複数回投与発明の背景単球とマクロファージは、エンドトキシンその他の刺激に応答して、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦαまたはＴＮＦ）として知られるサイトカインを分泌する。ＴＮＦαは17kDタンパク質サブユニットの可溶性ホモ三量体である(Smith ら，J．Bi ol．Chem．262 :6951〜6954(1987))。ＴＮＦの膜結合型26Kd前駆体も存在する(K rieglerら，Cell 53 :45〜53(1988))。ＴＮＦの総説については、Beutlerら，Na ture 320 :584(1986)、Old，Science 230 :630(1986)及びLeら，Lab．Invest．5 6 :234を参照のこと。単球やマクロファージ以外の細胞もＴＮＦαを産生する。例えば、ヒト非単球腫瘍細胞株はＴＮＦを産生する（Rubin ら，J．Exp．Med．164 :1350（1986）； Spriggs ら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 84 :6563(1987)）。CD4＋及びCD8+末梢血T リンパ球といくつかの培養T 及びB 細胞株（Cuturiら，J．Exp．Med．165 : 1581（1987）；Sungら，J．Exp．Med．165 :1539（1987））もＴＮＦαを産生する。ＴＮＦは、血管内皮細胞に対する凝血促進活性を誘導したり（Pober ら，J．I mmunol．136 :1680(1986)）、好中球とリンパ球の付着性を増大させたり（Pober ら，J．Immunol．138 :3319(1987)）、マクロファージ、好中球及び血管内皮細胞からの血小板活性化因子の放出を刺激する（Camussi ら，J．Exp．Med．166： 1390（1987））など、組識損傷をもたらす起炎症作用を引き起こす。したがって、ＴＮＦαは、炎症性疾患、自己免疫疾患、ウイルス感染症、細菌感染症、寄生虫感染症、悪性腫瘍および/ または神経変性疾患に関連づけられており、関節リウマチやクローン病などといった疾患の特異的生物療法にとって有用な標的である。ＴＮＦαに対するキメラ抗体（cA2）によるオープンラベル（ open-label）試験では、炎症の抑制を伴う有益な作用が報告されている。Elliot t ら，Arthritis Rheum 36 :1681〜1690（1993）。しかし、この抗ＴＮＦα抗体で治療した患者はしばしば再発した。現在までのところ、抗体の複数回投与は、ヒト抗マウス抗体応答（HAMA応答）ゆえに、問題が多かった。Exley ら，Lancet 335 :1275〜1277（1990）。さらに、キメラ抗体を続けて投与すると、患者における治療効果が減少した。例えば、重篤な敗血症性ショックを伴う14人の患者の抗ＴＮＦネズミmAb 治療では、0.4 〜10mg/kg の単一用量で、ネズミ抗ＴＮＦ mAbが投与された（Exley，A.R．ら， Lancet 335 :1275〜1277（1990））。しかし、14人の患者のうち7 人は、この治療に対してヒト抗ネズミ抗体応答を示し、この治療はその抗体のネズミ重鎖及び軽鎖部分の免疫原性による問題を含んでいる。免疫原性は、継続投与の有効性を減じ、ネズミ抗ＴＮＦ抗体の診断的または治療的投与を受ける患者において、治療を無効にしうる。かかる抗体のキメラ化はこの負の反応を緩和すると期待されたが（Morrison，Science，229 :1202〜1207（1985））、いくつかのキメラ抗体はHACA（ヒト抗キメラ抗体）応答をもたらし、それが時には対応するネズミ抗体と同じ程度にまでなることがわかった。（例えば、Khazaeliら，Cancer Res.，5 1 :5461〜5466（1991））。ネズミ抗体のキメラ化において免疫原性の減少が認められた場合でさえ、増大したHACA反応のために、反復療法としてのそれらの使用は避けられることが多い。したがって、ＴＮＦ介在性疾患において、抗体を投与することによってその疾患状態の再発を治療することができれば、極めて有益であろう。発明の要約本発明は、一定の抗ＴＮＦ抗体をＴＮＦ介在性疾患が再発した患者に投与することにより、その抗体の最初の治療で達成される応答強度と同じか、それに類似する応答強度を得ることができるという予想外の驚くべき発見に基づいている。したがって、本発明は、ＴＮＦ介在性疾患を有する個体を治療する方法であって、その個体に複数回の用量の抗ＴＮＦ抗体を投与することからなり、その第２回またはそれ以降の投与量を、その疾患の再発期、または再発直前に与えるという方法に関する。また本発明は、過去に抗ＴＮＦ抗体で治療されたＴＮＦ介在性疾患の再発の治療に、抗ＴＮＦ抗体を使用することに関する。ＴＮＦ介在性疾患には、関節リウマチやクローン病などの慢性衰弱性疾患状態が含まれる。本発明は、これらの慢性疾患状態を病む患者の有益で長期にわたる治療を可能にする。図面の簡単な説明図1 は、第1 サイクルに20mg/kg の抗ＴＮＦα抗体（cA2）を投与し、3 サイクルにわたって10mg/kg の抗ＴＮＦα抗体（cA2）を投与した患者の応答強度を表す線グラフである。この図は、2 回目の投与とそれ以降の投与が、第1 治療サイクルと同じか、それ以上の応答をもたらしたことを示している。実線は、腫脹した関節数を表し、破線は血清C-反応性タンパク質（CRP）応答を表す。図2 は、少なくとも2 完全サイクルの抗ＴＮＦα抗体（cA2）を投与した7 人の患者の応答の持続時間を表す棒グラフである。発明の詳細な説明本発明は、抗ＴＮＦ抗体をＴＮＦ介在性疾患を病む患者に複数回投与することにより、再発期であっても、第2 回またはそれ以降の投与において、その疾患の症状を極めて有効に緩和できるという発見に関係する。本発明は、ＴＮＦ関連病を治療するための本発明の治療法に有用な医薬組成物の形態にある抗ＴＮＦ抗体をも提供する。高親和性および/ または強力な生体内ＴＮＦ阻止および/ または中和抗体、その断片または領域を使用することが好ましい。かかる抗体、断片または領域は、 h ＴＮＦαに対して、Kaにして少なくとも10⁸M^-1、より好ましくは少なくとも10⁹ M^-1の親和性を持つことが好ましい。ヒト治療用には、ＴＮＦ誘導性IL-6分泌を遮断する本発明の強力な生体内ＴＮＦα阻止および／または中和活性を持つ高親和性抗体および断片、領域並びに誘導体が好ましい。ヒト治療用には、生体内および試験管内でＴＮＦ誘導性凝血促進活性を遮断する（ELAM-IやICAM-Iのような細胞接着分子のＴＮＦ誘導性発現の遮断およびＴＮＦ有糸分裂活性遮断を含む）ような高親和性抗ＴＮＦα抗体およびその断片、領域並びに誘導体も好ましい。本発明で使用できる抗ＴＮＦ抗体には、ＴＮＦに対する高い親和性と低毒性（ HAMAおよび/ またはHACA応答を含む）を特徴とするモノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、表面再処理（resurfaced）抗体もしくは組換え抗体またはそれらの断片が含まれる。具体的には、可変領域、定常領域および枠組みなどといった個々の成分が個別におよび/ または集合的に低い免疫原性を持つ抗体を使用することが好ましい。本発明の抗体は、症状を著しく緩和する効力と低毒性を保ちつつ、患者を長期間治療できることを特徴とする。低免疫原性および/ または高親和性は、その他の不確定の特徴と共に、達成される治療結果に寄与するだろう。好ましい抗体はキメラ抗体である。キメラ抗体は、異なる動物種に由来する2 以上の区分または部分によって特徴づけられる免疫グロブリン分子である。一般に、キメラ抗体の可変領域はヒト以外の哺乳類抗体（例えばネズミmAb）に由来し、その免疫グロブリン定常領域は、ヒト免疫グロブリン分子に由来する。好ましくは、低免疫原性を持つ可変領域を選択し、それを、やはり低免疫原性を持つヒト定常領域と組み合わせる。そして、その組み合わせもまた、低い免疫原性を持つことが好ましい。本明細書において「低」免疫原性とは、有意なHACAまたはHAMA応答を起す患者が、治療される患者の約75% 未満、好ましくは約50% 未満であること、および/ または、治療される患者で低い力価（二重抗原酵素免疫検定法で測定した場合に約300 未満、好ましくは約100 未満）を生じることと定義される。Elliott ら，Lancet 344 :11 25〜1127（1994）（参考文献として本明細書に合体させる）。本明細書で使用する「キメラ抗体」という用語には、一価、二価または多価免疫グロブリンが含まれる。一価キメラ抗体は、ジスルフィド橋を介してキメラL 鎖と結合したキメラH 鎖によって形成される二量体（HL）である。二価キメラ抗体は、少なくとも1 つのジスルフィド橋を介して結合した2 つのHL二量体によって形成される四量体（H2L2）である。例えば会合するCH領域（例えばIgM H 鎖またはμ鎖由来のもの）を使用することによって、多価キメラ抗体も製造できる。抗体は、個々の重鎖（H）免疫グロブリンおよび/ または軽鎖（L）免疫グロブリンからなる。キメラH 鎖は、ヒトH 鎖C 領域（CH）（CH1 またはCH2 など）の少なくとも一部に結合した、ＴＮＦ特異的非ヒト抗体のH 鎖に由来する抗原結合領域からなる。本発明のキメラL 鎖は、ヒトL 鎖C 領域（CL）の少なくとも一部に結合した、ＴＮＦ特異的非ヒト抗体のL 鎖に由来する抗原結合領域からなる。キメラ抗体およびそれらの製造方法は、当該技術分野で既に記述されている（ Morrisonら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 81 :6851〜6855（1984）；Boulianne ら，Nature 312 :643〜646（1984）；Neuberger ら，Nature 314 :268〜270(19 85)；Taniguchi ら，欧州特許出願第171496号明細書（1985年2 月19日公開）；M orrisonら，欧州特許出願第173494号明細書（1986年3 月5 日公開）；Neuberger ら，PCT 出願国際公開第 86/01533 号パンフレット（1986年3 月13日公開）；K udoら，欧州特許出願第184187号明細書（1986年6 月11日公開）；Morrisonら，欧州特許出願第173494号明細書（1986年3 月5 日公開）；Sahagan ら，J．Immun ol．137 :1066〜1074（1986）；Robinsonら，国際特許公開PCT/US86/02269（198 7年5 月7 日公開）；Liuら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 84 :3439〜3443 （1987）；Sun ら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，84 :214〜218(1987)；Better ら，Science 240 :1041〜1043（1988）；およびHarlowとLane ANTIBODIES: A LA BORATORY MANUAL Cold Spring Harbor Laboratory（1988））。これらの引用文献の全内容を、参考文献として本明細書と合体させる。抗ＴＮＦキメラ抗体は、例えば、それぞれがヒト定常領域の少なくとも一部とヒト以外の起源を持つ可変（V）領域の少なくとも一部とからなる、２本の軽鎖と2 本の重鎖を含み、該抗体は、抗体cA2 のように、ヒトＴＮＦの阻止および/ または中和エピトープに対して高い親和性で結合することができる。本抗体には、かかる抗体の断片または誘導体、例えばその抗体鎖の1 以上の部分（例えば重鎖定常領域もしくは可変領域、または軽鎖定常領域もしくは可変領域）も含まれる。抗体のヒト化および表面再処理によって、抗体の免疫原性をさらに減少させることができる。例えば、Winter（米国特許第5,225,539 号およびEP 239,400 B1 ）、Padlanら（EP 519,596 A1）およびPedersenら（EP 592,106 A1）（これらは参考文献として本明細書に合体される）を参照のこと。本発明の好ましい抗体は、ヒトＴＮＦαに対して生体内で強力な阻止および/ または中和活性を持つ高親和性ヒト- ネズミキメラ抗ＴＮＦ抗体およびそれらの断片または領域である。かかる抗体およびキメラ抗体には、精製組換えＴＮＦα または1 以上のエピトープを含むそのペプチド断片を用いる免疫化によって生成するものが含まれうる。かかるキメラ抗体の例としてはcA2 と、抗ＴＮＦαネズミmAb A2、キメラmAb cA2、または実質上同じ特異的結合特性を持つ抗体ならびにそれらの断片およびそれらの領域のヒトＴＮＦαに対する結合を生体内で競合的に阻止する抗体が挙げられる。mAb の特異性と親和性を競合阻止によって決定するための好ましい方法は、Harlowら，Antibodies: A Laboratory Manual，Col d Spring Harbor Laboratory Press，ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（1988）、Colliganら編，Current Protocols in Immunology,Greene Publish ing Assoc．and Wiley Interscience,ニューヨーク（1992，1993）、Kozborら， Immunol．Today 4 :72〜79（1983）、Ausubel ら編，Current Protocols in Mol ecular Biology，Wiley Interscience，ニューヨーク（1987，1992，1993）；およびMuller，Meth．Enzymol．92 :589〜601(1983)（これらは全て参考文献として本明細書に合体される）に認めることができる。本明細書で使用する「抗原結合領域」という用語は、抗原と相互作用するアミノ酸残基を含有し、その抗原に対する特異性と親和性をその抗体に付与する、抗体分子の一部分をいう。該抗体領域には、その抗原結合残基の適正な立体配置を維持するのに必要な「枠組み」アミノ酸残基が含まれる。抗原結合領域は、一般的には、ネズミ由来のものだろう。別の態様として、抗原結合領域を他の動物種、例えばヒツジ、ウサギ、ラットまたはハムスターに由来してもよい。かかる非ヒト抗体をコードするDNA の好ましい供給源としては、抗体を産生する細胞株、好ましくは通常ハイブリドーマとして知られるハイブリッド細胞株が挙げられる。好ましいハイブリドーマは、A2ハイブリドーマ細胞株である。「抗原」とは、抗体によって結合される能力を持ち、かつ、動物にその抗原のエピトープに選択的に結合することのできる抗体を産生させることができる分子または分子の一部をいう。抗原は1 以上のエピトープを持つことができる。「エピトープ」という用語は、抗体によって認識され、かつ、その抗体の1 以上の抗原結合領域で結合可能な抗原の一部分を意味する。エピトープは通常、特定の三次元構造特徴と特定の荷電特徴を持つ、アミノ酸や糖側鎖などの、化学的に活性な分子の表面基を有する。「阻止および/ または中和エピトープ」とは、抗体と結合すると、そのエピトープを含有する分子の生物活性（ＴＮＦ受容体に対するＴＮＦの結合を含む）が生体内または試験管内（より好ましくは生体内）で失われるエピトープを意味する。ＴＮＦのエピトープは、アミノ酸1〜約20、約56〜約77、約108〜約127、および約138〜約149 に同定されている。抗体は、ＴＮＦ残基約87〜約107、約59〜約80またはそれらの組み合わせのうち、少なくとも約5 アミノ酸のＴＮＦを有するエピトープに結合することが好ましい。一般的には、エピトープは、これらの領域の1 以上を包含するまたはそれらと部分的に重なる少なくとも約5 個、および約22個未満のアミノ酸を含む。例えば、抗ＴＮＦ活性、抗体およびその断片並びにその可変領域が認識し、および/ または結合するＴＮＦのエピトープは、次の残基を含む：５９−８０：８７−１０８：これらの好ましい抗ＴＮＦ抗体またはペプチドは、Eck とSprang（J．Biol．C hem．264（29）:17595〜17605(1989)）が示した推定受容体結合中心（h ＴＮＦ αのアミノ酸11〜13、37〜42、49〜57および155〜157）に結合することなく、ＴＮＦαの作用を遮断する。ハイブリドーマを用いる抗体産生小さいペプチド配列に対して、それらの配列が遊離型もしくは複合型でまたは大きなタンパク質との関連で天然配列として提示される場合、それらの配列を認識しそれらの配列に結合する抗体を惹起させる技術は、当該技術分野で良く知られている。かかる抗体は、当該技術分野で公知のハイブリドーマまたは組換え技術によって産生可能である。本発明の抗体の製造に使用できるネズミ抗体は、Rubin ら，EP 0218868，1987 年4 月22日；Yoneら，EP 0288088，1988年10月26日；Liang ら，Biochem．Bioph ys．Res．Comm．137 :847〜854(1986)；Meagerら，Hybridoma 6 :305〜311(1987 )；Fendlyら，Hybridoma 6 :359〜369(1987); Bringmanら，Hybridoma 6 :4 89〜507(1987)；Hirai ら，J.Immunol．Meth．96 :57〜62（1987）；Mollerら， Cytokine 2 :162〜169（1990）にも記述されている。細胞融合は、免疫学分野の技術者に良く知られている標準的方法で達成される。融合パートナー細胞株ならびにハイブリドーマを融合し選択する方法およびmA b をスクリーニングする方法は、当該技術分野で良く知られている。例えば、Au subel（下記）、Harlow（下記）およびColligan（下記）（これら引用文献の内容は、全て参考文献として本明細書に合体される）を参照のこと。本発明のＴＮＦα特異的ネズミmAb は、その抗体を分泌するハイブリドーマまたはトランスフェクトーマ細胞をマウスの腹腔内に注射し、適当な期間後に、高力価の該mAb を含有する腹水を回収し、そこからmAb を単離することによって、大量に産生され得る。ハイブリドーマ（例えばラットまたはヒト）によるかかる mAb の生体内産生には、ハイブリドーマ細胞を照射または無胸腺ヌードマウス中で生育することが好ましい。別法として、ハイブリドーマまたはトランスフェクトーマ細胞を試験管内で培養し、分泌されたmAb をその細胞培養培地から単離することにより、または真核もしくは原核細胞内で組換え的に産生することもできる。好ましい態様において、本抗体は、A2、rA2 またはcA2 によって認識されるＴＮＦエピトープのアミノ酸を結合し、ハイブリドーマまたは組換え宿主によって産生されるmAb である。もう1 つの好ましい態様では、本抗体は、A2によって認識されるエピトープを認識するキメラ抗体である。さらに好ましい態様では、本抗体は、キメラA2（cA2）と称するキメラ抗体である。本発明の抗体の例として、本発明のネズミmAb A2は、c134A と命名された細胞株によって産生される。キメラ抗体cA2 は、c168A と命名された細胞株によって産生される。c168A は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（American T ype Culture Collection）（メリーランド州ロックビル）に「培養確定寄託」として寄託された。本発明は、断片、領域、またはその免疫グロブリン断片と機能的に類似する分子種を得るために先端削除もしくは修飾した遺伝子によってコードされるタンパク質を含む、抗体の「誘導体」をも規定する。修飾には、植物および細菌毒素などの細胞傷害性タンパク質をコードする遺伝子配列の付加が含まれるが、これに限定されない。断片および誘導体は、当該技術分野で知られているように、適当な細胞から産生することができる。別法として、抗ＴＮＦ抗体、断片および領域を、細胞傷害性タンパク質または細胞傷害性化合物に試験管内で結合することにより、表面にＴＮＦを持つ細胞を選択的に殺す細胞傷害性抗ＴＮＦ抗体を得ることもできる。断片には、例えばFab、Fab'、F（ab'）２およびFvが含まれる。これらの断片は完全な抗体のFc断片を欠き、循環系からより迅速に消失し、完全な抗体よりも低い非特異的組識結合性を持ちうる（Wahlら，J．Nucl．Med．24 :316〜325(198 3)）。これらの断片は、当該技術分野で良く知られる方法を用いて、例えばパパイン（Fab 断片の製造）やペプシン（F(ab')2断片の製造）などの酵素によるタンパク質分解的切断によって、完全な抗体から産生される。抗ＴＮＦ抗体の組換え発現ＴＮＦを阻止する組換えおよび/ またはキメラ化ネズミ- ヒトまたはヒト- ヒト抗体は、本明細書に記載する教示に基づき、既知の技術を用いて、本発明に従って得ることができる。例えば、Ausubel ら編，Current Protocols in Moleula r Biology，Wiley Interscience，ニューヨーク（1987，1992，1993）；Sambroo kら，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laborato ry Press（1989）（これら文献の内容は、参考文献として本明細書に合体される）を参照のこと。本発明の抗ＴＮＦ抗体をコードするDNA は、重鎖定常領域（Hc）、重鎖可変領域（Hc）、軽鎖可変領域（Lv）および軽鎖定常領域（Lc）のうち少なくとも1 つをコードするゲノムDNA またはcDNAでありうる。ネズミV 領域抗原結合区分をコードするDNA の供給源として染色体遺伝子断片を使用する方法に代わる便利な方法は、例えばLiu ら（Proc．Natl．Acad．Sci.，USA 84 :3439（1987）およびJ. Immunology 139 :3521(1987)；これらは参考文献として全て本明細書に合体される）が報告しているように、cDNAを使用してキメラ免疫グロブリン遺伝子を構築することである。cDNAの使用して所望のタンパク質の合成を達成するには、その宿主細胞に適した遺伝子発現要素を、その遺伝子と組み合わせる必要がある。 cDNA配列の使用は、細菌その他の適当なRNA スプライシング系を欠く宿主でcDNA 配列を発現させることができるという点で、（イントロンを含有する）ゲノム配列より有利である。かかる製造の例を以下に説明する。遺伝コードは縮重しているので、ある特定のアミノ酸をコードするのに2 以上のコドンを使用することができる。遺伝コードを使用することにより、それぞれがそのアミノ酸をコードする能力を持つ1 以上の異なるオリゴヌクレオチドを同定することができる。特定のオリゴヌクレオチドが現実のXXX コード配列を実際に構成する可能性は、異常塩基対関係ならびに特定のコドンが抗ＴＮＦ抗体または断片を発現させる真核または原核細胞内で（特定のアミノ酸をコードするのに）実際に使用される頻度を考慮することによって見積もることができる。かかる「コドン使用則」は、Lathe ら，J．Molec．Biol．183 :1〜12（1985）に開示されている。Lathe の「コドン使用則」を利用することにより、抗ＴＮＦ可変または定常領域配列をコードすることができる理論的に「最も有望な」ヌクレオチド配列を含有する単一のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドセットが同定される。アミノ酸配列は単一のオリゴヌクレオチドのみによってコードされる場合もあるが、アミノ酸配列は類似するオリゴヌクレオチドセットのいずれによってもコードされうる場合が多い。重要なことは、このセットの要素は全て、そのペプチド断片をコードすることができるオリゴヌクレオチドを含有し、それゆえにいずれも、そのペプチド断片をコードする遺伝子と同じオリゴヌクレオチド配列を含有する可能性を持つが、その遺伝子のヌクレオチド配列と同一のヌクレオチド配列を含有するのは、そのセットの1 要素のみであるということである。この要素はそのセット内に存在し、そのセットの他の要素が存在していてもDNA にハイブリダイズすることができるので、そのタンパク質をコードする遺伝子をクローニングするには、単一のオリゴヌクレオチドを使用するのと同じ方法で、未分画のオリゴヌクレオチドセットを使用することもできる。抗ＴＮＦ抗体または可変もしくは定常領域を含むその断片をコードすることができる理論的に「最も有望な」配列を含有するオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドセットを用いて、その「最も有望な」配列または配列セットにハイブリダイズすることができる相補的なオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドセットの配列を同定する。かかる相補配列を含有するオリゴヌクレオチドは、可変または定常領域抗ＴＮＦ遺伝子を同定および単離するためのプローブとして使用できる（Sambrookら，下記）。可変もしくは定常抗ＴＮＦ領域断片をコードすることができる好適なオリゴヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチドセット（またはかかるオリゴヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチドセットに相補的なオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドセット）を、（前述の手法を用いて）同定し、合成し、当該技術分野で良く知られた手段で、抗ＴＮＦ抗体またはその可変もしくは定常領域を発現させることができる細胞から得られるDNA またはより好ましくはcDNA調製物に対してハイブリダイズさせる。「最も有望な」可変または定常抗ＴＮＦ領域ペプチドをコードする配列に対して相補的な一本鎖オリゴヌクレオチド分子は、通常の当業者に良く知られている方法で合成することができる（Belagajeら，J．Bio l．Chem．254 :5765〜5780（1979）；Maniatisら，Molecular Mechanisms in th e Control of Gene Expression，Nierlichら編，Acad．Press,ニューヨーク（19 76）；Wuら，Prog．Nucl．Acid Res．Molec．Biol．21 :101〜141(1978)；Khor ana，Science 203 :614〜625(1979)）。さらに、DNA 合成は、自動合成装置を使用して達成することもできる。核酸ハイブリダイゼーションの技術は、Sambrook ら（下記）およびHaynesら（Nucleic Acid Hybridization，A Practical Approa ch，IRL Press,ワシントンDC（1985））によって開示されている（これらの文献は、参考文献として本明細書に合体される）。前述のような技術およびそれらに類似の技術によって、ヒトアルデヒド脱水素酵素の遺伝子（Hsu ら，Proc．Natl ．Acad．Sci．USA 82 :3771〜3775（1985））、フィブロネクチンの遺伝子（Suz ukiら，Bur．Mol．Biol．Organ．J．4 :2519〜2524（1985））、ヒトエストロゲン受容体遺伝子（Walterら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 82 :7889〜7893（198 5））、組識型プラスミノーゲン活性化因子の遺伝子（Pennica ら，Nature 301 :214〜221（1983））およびヒト胎盤アルカリ性ホスファターゼcDNA（Keunら，P roc．Natl．Acad．Sci．USA 82 :8715〜8719（1985））のクローニングが成功している。抗ＴＮＦ可変または定常領域をコードするポリヌクレオチドをクローニングするもう1 つの方法として、DNA、より好ましくはcDNA（抗ＴＮＦ抗体またはその可変もしくは定常領域を発現させることができる細胞由来）を発現ベクターにクローニングすることにより、発現ベクターのライブラリーを調製する。次に、そのライブラリーを、A2およびcA2 などの抗ＴＮＦ抗体の結合を競合的に阻止するタンパク質を発現させることができ、かつ、抗ＴＮＦ抗体またはその断片と同じアミノ酸配列を持つポリペプチドをコードすることができるヌクレオチド配列を持つ構成要素についてスクリーニングする。この態様では、DNA、より好ましくはcDNAを、抗ＴＮＦ抗体またはその断片を発現させることのできる細胞から抽出し、精製する。精製したcDNAを（せん断、エンドヌクレアーゼ消化などによって）断片化することにより、DNA またはcDNA断片のプールを作製する。次に、各要素が原核細胞（例えば細菌）または真核細胞（例えば哺乳類、酵母、昆虫またはカビ）で発現する独自のクローン化DNA またはcDNA断片を含有する発現ベクターのゲノムライブラリー（例えばλファージライブラリー）を作製するために、このプールから得られるDNA またはcDNA断片を発現ベクター中にクローニングする。例えば、Ausubel（下記）、Harlow（下記）、Colligan（下記）、Nyyssonen ら，Bio/Technology 11 :591〜595（1993）；Marks ら，Bio/Technology 11 :11 45〜1149（1993年10月）を参照のこと。かかる可変または定常抗ＴＮＦ領域をコードする核酸を単離したら、ＴＮＦに結合して阻止活性を発揮する組換えmab を提供するために、その核酸を宿主細胞内で、他の定常または可変重鎖または軽鎖をコードする核酸と共に、適当に発現させることができる。かかる抗体は、抗原結合の原因となる相補性決定残基を持つ枠組み残基を含有するネズミまたはヒト抗ＴＮＦ可変領域を含むことが好ましい。本発明のキメラ抗体、断片および領域の定常（C）領域をコードするヒト遺伝子は、ヒト胎児肝臓ライブラリーから既知の方法で得ることができる。ヒトC 領域遺伝子は、ヒト免疫グロブリンを発現、産生するものを含めて、いずれのヒト細胞に由来するものであってもよい。ヒトCH領域は、ヒトH 鎖の既知のクラスまたはイソタイプ（ガンマ、μ、α、δまたはε、およびそれらのサブタイプ、例えばG1、G2、G3およびG4を含む）のいずれに由来するものであってもよい。H 鎖イソタイプは抗体の様々なエフェクター機能の原因となるので、CH領域の選択は、例えば、補体固定や抗体依存的細胞性細胞傷害性（ADCC）における活性などの所望のエフェクター機能によって左右されるだろう。CH領域は、ガンマ1（IgG1 ）、ガンマ3（IgG3）、ガンマ4（IgG4）またはμ（IgM）に由来することが好ましい。ヒトCL領域は、ヒトL 鎖イソタイプ、カッパまたはラムダのいずれかに由来することができる。ヒト免疫グロブリンC 領域をコードする遺伝子は、標準的なクローニング技術（Sambrookら，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，第2 版，Cold Sprin g Harbor Press，ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（1989）およびAu subel ら編，Current Protocols in Molecular Biology（1987〜1993））によって、ヒト細胞から得られる。ヒトC 領域遺伝子は、２つのクラスのL 鎖、５つのクラスのH 鎖およびそれらのサブクラスを代表する遺伝子を含有する既知のクローンから容易に入手できる。F(ab')2やFab などのキメラ抗体断片は、適当に先端削除されたキメラH 鎖遺伝子を設計することによって製造できる。例えば、F( ab')2断片のH 鎖部分をコードするキメラ遺伝子には、CH1 ドメインおよびH 鎖のヒンジ領域をコードするDNA 配列と、それに続く、先端欠失分子を得るための翻訳停止コドンとが含まれるだろう。一般に、ネズミ抗体、ヒト抗体およびキメラ抗体、その断片および領域は、ＴＮＦ特異的抗体のH 鎖およびL 鎖抗原結合領域をコードするDNA 部分をクローニングし、それらDNA 部分をそれぞれCHおよびCL領域をコードするDNA 部分に連結して、ネズミ、ヒトまたはキメラ免疫グロブリンコーディング遺伝子を作製することによって産生される。したがって、好ましい態様として、ヒトC 領域の少なくとも一部をコードする第2DNA部分に連結した、少なくとも非ヒト起源の抗原結合領域をコードする第1DNA部分（例えば連関（J）部分を伴う機能的に再編成したV 領域など）からなる融合キメラ遺伝子を作製する。したがって、抗体V およびC 領域をコードするcDNAおよびキメラ抗体の製造方法は、以下に概説する数工程を伴いうる：１．抗ＴＮＦ抗体を産生する細胞株由来ならびに重鎖および軽鎖定常領域を供給する任意の追加抗体由来のメッセンジャーRNA（mRNA）の単離工程；クローニングとそこからのcDNAの製造工程；２．精製したmRNAからの完全長cDNAライブラリーの調製工程、L およびH 鎖遺伝子の適当なV および/ またはC 領域遺伝子部分は、ここから、（ｉ）適当なプローブで同定し、（ii）配列決定し、さらに（iii）キメラ抗体用のもう1 つの抗体から得られるC またはV 遺伝子部分に適合させることができる；３．クローニングしたC 領域遺伝子に対するクローン化した特異的V 領域遺伝子部分の前述のような連結による、完全なH またはL 鎖コーディング配列の構築工程；４．ネズミ- ネズミ、ヒト- ネズミ、ヒト- ヒトまたはヒト- ネズミ抗体の獲得のための原核細胞および真核細胞を含む選択した宿主におけるL およびH 鎖の発現および製造工程。すべての免疫グロブリンH 鎖およびL 鎖遺伝子およびそれらがコードするmRNA に共通する特徴の一つはJ 領域である。H およびL 鎖J 領域は異なる配列を持つが、各群間には80% を超える高度な配列相同性が存在し、特にC 領域付近ではそれが著しい。本発明の方法では、この相同性を活用する。H およびL 鎖J 領域の共通配列を利用してプライマーとして使用するためのオリゴヌクレオチドを設計することにより、その後にV 領域部分をヒトC 領域部分に連結するのに役立つ制限部位を、J 領域に導入することができる。ヒト細胞から調製されるC 領域cDNAベクターを部位特異的突然変異誘発法で修飾することにより、ヒト配列中の類似の位置に制限部位を置くことができる。例えば、完全なヒトカッパ鎖C（Ck）領域および完全なヒトガンマ-1C 領域（C ガンマ-1）をクローニングすることができる。この場合、C 領域ベクターの供給源としてゲノムC 領域クローンに基づく代替法では、介在配列を除去するのに必要な酵素を欠く細菌系でこれらの遺伝子を発現させることはできないだろう。クローニングしたV 領域部分を切り出し、L またはH 鎖C 領域ベクターに連結する。別法として、停止コドンの導入によってヒトC ガンマ-1領域を修飾し、それによってFab 分子のH 鎖部分をコードする遺伝子配列を作製することもできる。次に、連結したV およびC 領域を持つコーディング配列を、適当な原核宿主または真核宿主での発現に適した発現伝達体に移す。 2 つのコーディングDNA 配列は、その結合がトリプレット読み枠の変更または中断を伴わずに連続的に翻訳可能な配列をもたらすならば、「有効に連結」しているという。あるDNA コーディング配列とある遺伝子発現要素の結合が、その遺伝子発現要素の適正な機能をもたらし、そのコーディング配列の発現をもたらすならば、両者は有効に連結している。発現伝達体には、プラスミドその他のベクターが含まれる。これらのうち、適当な付着末端を持つあらゆるVHまたはVL鎖配列を容易に挿入できるように操作された適当な制限部位を持つ機能的に完全なヒトCHまたはCL鎖配列を保持する伝達体が好ましい。したがって、ヒトCHまたはCL鎖配列含有伝達体は、適当な宿主で所望の完全H またはL 鎖を発現させるための中間体として機能する。マウス- ヒトまたはヒト- ヒトなどのキメラ抗体は、典型的には、その構築物に使用するマウスH およびL 鎖V 領域本来の染色体遺伝子プロモーターによって駆動される遺伝子から合成されるだろう。通常、スプライシングはマウスJ 領域にあるスプライス供与部位とヒトC 領域の前にあるスプライス受容部位の間で起こり、ヒトC 領域内にあるスプライス領域でも起こる。ポリアデニル化と転写終結は、ヒトコーディング領域の下流にある天然の染色体部位で起こる。抗ＴＮＦ抗体断片の少なくとも1 つをコードする核酸配列は、連結用の平滑末端または付着末端、適当な末端を得るための制限酵素消化、付着末端の充填（適当な場合）、望ましくない結合を避けるためのアルカリ性ホスファターゼ処理および適当なリガーゼによる連結を含む従来の技術に従って、ベクターDNA に組換えることができる。かかる操作の技術は、例えばAusubel（下記）、Sambrook（下記）（これらはすべて参考文献として本明細書に合体される）などに開示されており、当該技術分野では良く知られている。 DNA などの核酸分子は、それが転写および翻訳調節情報を含有するヌクレオチド配列を含み、かかる配列があるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に「有効に連結」しているならば、そのポリペプチドを「発現させることができる」。有効な連結とは、調節DNA 配列と発現させようとするDNA 配列とが、回収できる量の抗ＴＮＦペプチドまたはAb断片としての遺伝子発現が可能なようにつながっている連結をいう。遺伝子発現に必要な調節領域の正確な性質は、類似の分野で良く知られているように、生物ごとに異なるだろう。例えばSambrook（上記）およびAusubel（上記）を参照のこと。好ましい宿主は、細菌、酵母、昆虫、カビ、鳥類および哺乳類細胞を含む生体内もしくは正常位置（in situ）いずれかの細菌もしくは真核宿主、または哺乳類、昆虫、鳥類または酵母由来の宿主細胞である。ヒト、霊長類、ハムスター、ウサギ、ネズミ、ラットその他の齧歯動物、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、ヤギ、イヌまたはネコ由来の哺乳類細胞または組識が好ましい。さらに、例えば酵母ユビキチン加水分解酵素系を使用することによって、ユビキチン膜貫通ポリペプチド融合タンパク質の生体内合成を達成することもできる。そのように産生された融合タンパク質を生体内でプロセシングしたり、試験管内で精製およびプロセシングすることによって、指定のアミノ末端配列を持つ本発明の抗ＴＮＦ抗体または断片を合成することができる。さらに、直接酵母（または細菌）発現において開始コドン由来のメチオニン残基が保持されることに伴う問題も回避できる。Sabin ら，Bio/Technol．7(7):705〜709（1989）；Miller ら，Bio/Technol．7(7):698〜704（1989）。酵母をグルコースに富む培地で生育したときに大量に産生される解糖系酵素をコードし活発に発現する遺伝子由来のプロモーターと終結要素とを組込んだ一連の酵母遺伝子発現系はいずれも、本発明の抗ＴＮＦ抗体断片を得るために利用することができる。既知の解糖系遺伝子から、極めて効率のよい転写制御シグナルを得ることもできる。例えば、ホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝子のプロモーターと終結シグナルを使用することができる。抗ＴＮＦ抗体断片とその機能的誘導体の昆虫における産生は、例えば、当業者に公知の方法で膜貫通ポリペプチドを発現させるように操作されたバキュロウイルスで昆虫宿主を感染させることによって達成できる。例えばAusubel ら編，Cu rrent Protocols in Molecular Biology，Wiley Interscience，§§16.8〜16.1 1（1987，1993）を参照のこと。好ましい態様として、導入される核酸配列を、受容宿主内で自律的に複製できるプラスミドまたはウイルスベクターに組込む。この目的には種々のベクターのいずれを使用してもよい。例えばAusubel ら（下記）§§1.5、1.10、7.1、7.3 、8.1、9.6、9.7、13.4、16.2、16.6および16.8〜16.11 を参照のこと。特定のプラスミドまたはウイルスベクターを選択する際に重要な因子には、そのベクターを含有する受容細胞を認識し、そのベクターを含有しない受容細胞から選択することの容易さ；特定の宿主で望まれるそのベクターのコピー数；およびそのベクターを種の異なる宿主細胞間で「シャトル」できることが望ましいかどうかが含まれる。当該技術分野で知られる好ましい原核ベクターには、大腸菌内で複製できるプラスミド（例えばpBR322、ColE1、pSC101、pACYC184、πVXなど）が含まれる。かかるプラスミドは、例えばManiatis，T.ら（Molecular Cloning，A Laborator y Manual，第2 版，Cold Spring Harbor Press，ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（1989））；Ausubel（下記）によって開示されている。バチルスプラスミドには、pC194、pC221、pT127 などが含まれる。かかるプラスミドは、 Gryczan，T．がThe Molecular Biology of the Bacilli（Academic Press，ニューヨーク（1982），307〜329 頁）に開示している。好適なストレプトミセスプラスミドには、pIJ101（Kendall，K.J．ら，J．Bacteriol．169:4177〜4183（19 87））ならびにφC31（Chater，K.F.ら，Sixth International Symposium on Ac tinomycetales Biology，Akademiai Kaido,ハンガリー，ブダペスト（1986），4 5〜54頁）などのストレプトミセスバクテリオファージが含まれる。シュードモナスプラスミドについては、John，J.F.ら（Rev．Infect．Dis．8 :693〜704(19 86)）、Izaki，K.（Jpn．J．Bacteriol．33 :729〜742(1978)）およびAusubel ら（上記）による総説がある。他にも、抗ＴＮＦ抗体またはペプチドをコードするcDNAの発現に有用な遺伝子発現要素として、（a）ウイルス転写プロモーターとそれらのエンハンサー要素、例えばSV40初期プロモーター（Okayama ら，Mol．Cell．Blol．3 :280(1983) ）、ラウス肉腫ウイルスLTR（Gormanら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 79 :6777 (1982)）およびモロニーネズミ白血病ウイルスLTR（Grosschedl ら，Cell 41 :8 85（1985））など；（b）スプライス領域とポリアデニル化部位、例えばSV40後期領域から得られるもの（Okayareaら，下記）など；ならびに（c）SV40中にあるようなポリアデニル化部位（Okayama ら，下記）が挙げられるが、これらに限定されない。免疫グロブリンcDNA遺伝子は、Liu ら（下記）およびWeidleら，Gene 51 :21( 1987)に記述されているように、SV40初期プロモーターとそのエンハンサー、マウス免疫グロブリンH 鎖プロモーターエンハンサー、SV40後期領域mRNAスプライシング、ウサギS-グロビン介在配列、免疫グロブリンおよびウサギS-グロビンポリアデニル化部位、ならびにSV40ポリアデニル化要素を発現要素として使用することによって発現させることができる。部分cDNA、部分ゲノムDNA からなる免疫グロブリン遺伝子（Whittle ら，Prot ein Engineering 1 :499（1987））については、転写プロモーターをヒトサイトメガロウイルスとし、プロモーターエンハンサーをサイトメガロウイルスおよびマウス/ ヒト免疫グロブリンとし、mRNAスプライシングおよびポリアデニル化領域を天然の染色体免疫グロブリン配列とすることができる。一態様として、齧歯動物細胞でcDNA遺伝子を発現させるために、転写プロモーターをウイルスLTR 配列とし、転写プロモーターエンハンサーをマウス免疫グロブリン重鎖エンハンサーおよびウイルスLTR エンハンサーのいずれかまたは両方とし、スプライス領域に31bpより大きいイントロンを含み、ポリアデニル化および転写終結領域を、合成される免疫グロブリン鎖に対応する本来の染色体配列から得る。もう1 つの態様として、他のタンパク質をコードするcDNA配列を前記発現要素と組み合わせて、哺乳類細胞におけるそのタンパク質の発現を達成する。各融合遺伝子を、発現ベクター中で組立てるかまたは発現ベクターに挿入する。次に、そのキメラ免疫グロブリン鎖遺伝子産物を発現させることのできる受容細胞を、抗ＴＮＦ抗体もしくはキメラH 鎖またはキメラL 鎖コーディング遺伝子単独でトランスフェクトするか、またはキメラH 鎖遺伝子とキメラL 鎖遺伝子で同時にトランスフェクトする。トランスフェクトした受容細胞を、組込まれた遺伝子の発現が可能な条件下に培養し、発現した免疫グロブリン鎖または完全抗体または断片をその培養物から回収する。一態様として、抗ＴＮＦ抗体もしくはキメラH およびL 鎖またはその一部をコードする融合遺伝子を別個の発現ベクター内で組立て、次いで、それを受容細胞の同時トランスフェクションに使用する。各ベクターは2 つの選択可能遺伝子、すなわち細菌系での選択用に設計された第1 選択可能遺伝子と真核系での選択用に設計された第2 選択可能遺伝子とを含有することができ、各ベクターは異なる一対の遺伝子を持つ。この方法では、まず、細菌系における融合遺伝子の産生を指令し、その増幅が可能なベクターを得る。次に、そのようにして細菌宿主内で産生され増幅された遺伝子は真核細胞の同時トランスフェクションに使用され、所望のトランスフェクト遺伝子を保持する同時トランスフェクト細胞の選択を可能にする。細菌系で使用するための選択可能遺伝子の例としては、アンピシリンに対する耐性を付与する遺伝子とクロラムフェニコールに対する耐性を付与する遺伝子が挙げられる。真核トランスフェクタント用の好ましい選択可能遺伝子には、キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（gpt）とTn5 由来のホスホトランスフェラーゼ（neo）がある。 gpt を発現する細胞の選択は、この遺伝子によってコードされる酵素がキサンチンをプリンヌクレオチド合成の基質として利用し、一方、類似の内因性酵素はキサンチンをプリンヌクレオチド合成の基質として利用することができないという事実に基づく。（1）イノシン一リン酸のキサンチン一リン酸への変換を遮断するミコフェノール酸と（2）キサンチンとを含有する培地では、gpt 遺伝子を発現する細胞のみが生き残れる。neo の産物は、抗生物質G418その他のネオマイシンクラスの抗生物質によるタンパク質合成阻害を遮断する。これら2 つの選択法を同時にまたは逐次使用することにより、2 つの異なるDN A ベクターにのせて真核細胞に導入した免疫グロブリン鎖遺伝子の発現を選択することができる。真核細胞用の異なる選択可能マーカーを含む必要はない。それぞれが同じ選択可能マーカーを含有するH 鎖およびL 鎖ベクターを同時トランスフェクトすることができる。適当な耐性細胞を選択した後、それらクローンの大半は、H 鎖およびL 鎖ベクター両方の組込まれたコピーおよび/ または抗ＴＮＦ抗体を含有するだろう。別法として、キメラH 鎖およびL 鎖をコードする融合遺伝子を同じ発現ベクター上で組み立てることもできる。発現ベクターのトランスフェクションとキメラ抗体の産生については、骨髄腫細胞が好ましい受容細胞株である。骨髄腫細胞は、トランスフェクトした免疫グロブリン遺伝子によってコードされる免疫グロブリンを合成し、組立て、分泌することができ、その免疫グロブリンをグリコシル化する機構を持つ。特に好ましい受容細胞は、骨髄腫細胞SP2/0（ATCC#CRL 8287）である。SP2/0細胞は、トランスフェクトした遺伝子によってコードされる免疫グロブリンのみを産生する。骨髄腫細胞は培養液中で生育することもできるし、マウスの腹腔内で生育することもできる。後者の場合、分泌された免疫グロブリンを腹水から得ることができる。その他の好適な受容細胞としては、リンパ細胞、例えばヒトまたは非ヒト起源のB 細胞、ヒトまたは非ヒト起源のハイブリドーマ細胞または異種間ヘテロハイブリドーマ細胞が挙げられる。本発明のキメラ抗体構築物を保持する発現ベクターは、形質転換、トランスフェクション、接合、プロトプラスト融合、リン酸カルシウム沈降法、ジエチルアミノエチル（DEAE）デキストランなどのポリカチオンの適用などといった生化学的手段、ならびにエレクトロポレーション、直接微量注射法および微量投射物衝撃法（microprojectile bombardment；Johnstonら，Science 240 :1538（1988））などの機械的手段を含む種々の好適な手段のいずれによっても、適当な宿主に導入することができる。リンパ細胞にDNA を導入する好ましい方法はエレクトロポレーション（Potterら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 81 :7161(1984)；Yoshi kawa ら，Jpn．J．Cancer Res．77 :1122〜1133）である。この方法では、取り込ませようとするDNA の存在下に、受容細胞に電気パルスをかける。具体的には、トランスフェクション後、細胞を完全培地で約24時間回復させた後で、選択培地と共に96ウェル培養プレートに播種する。約0.4〜0.8mg/ml G418 を用いて、G 418選択を行なう。ミコフェノール酸選択には、約6 μg/ml＋約0.25mg/ml キサンチンを使用する。このエレクトロポレーション法では、Sp2/0 細胞について、約10^-5ないし約10^-4のトランスフェクション頻度が得られると予想される。プロトプラスト融合法では、リゾチームを用いて、キメラ抗体遺伝子を含有する組換えプラスミドを保持するカタル（catarrhal）から細胞壁を除去する。得られたスフェロプラストをポリエチレングリコールを用いて骨髄腫細胞と融合する。免疫グロブリン遺伝子は、非リンパ性哺乳類細胞その他の真核細胞（例えば酵母）または原核細胞（具体的には細菌）でも発現させることができる。酵母は、実質的に、免疫グロブリンH 鎖およびL 鎖の産生に関して細菌よりかなりの利点を持つ。酵母はグリコシル化を含む翻訳後ペプチド修飾を行なう。現在、酵母における所望のタンパク質の産生に使用できる強力なプロモーター配列と高コピー数プラスミドを使用する組換えDNA 法がいくつか存在する。酵母は、クローン化された哺乳類遺伝子産物のリーダー配列を認識し、リーダー配列を持つペプチド（すなわちプレペプチド）を分泌する（Hitzman ら，11th Internati onal Conference on Yeast，Genetics and Molecular Biology，フランス，モンペリエ，1982年9 月13〜17日）。酵母遺伝子発現系では、抗ＴＮＦペプチド、抗体および集合したネズミおよびキメラ抗体、それらの断片および領域の産生、分泌ならびに安定性のレベルを定型的に評価することができる。例えば、酵母をグルコースに富む培地で生育したときに大量に産生される解糖系酵素をコードする活発に発現する遺伝子由来のプロモーターおよび終結要素を組込んだ酵母遺伝子発現系を使用することができる。既知の解糖系酵素は、極めて効率のよい転写制御シグナルをも提供できる。例えば、ホスホグリセリン酸キナーゼ（PGK）遺伝子のプロモーターと終結シグナルを利用することができる。クローン化した免疫グロブリンcDNAの酵母における発現に最適な発現プラスミドを評価するには、いくつかの方法を採用することができる（Glover編，DNA Cloning，Vol．II，45〜66頁，IRL Press，1985 を参照のこと）。大腸菌W3110（ATCC 27325）などの大腸菌K12 株やネズミチフス菌、Serratia marcescens などのその他の腸内細菌および種々のシュードモナス種などといった細菌株も、本発明に記載される抗体分子またはペプチドを産生するための宿主として使用できる。これらの細菌宿主には、宿主細胞に適合する種に由来するレプリコンと制御配列を含有するプラスミドベクターが用いられる。該ベクターは、複製部位と、形質転換細胞での表現型選択を与えうる特定の遺伝子とを保持する。ネズミ抗体およびキメラ抗体、その断片および領域またはクローン化免疫グロブリンcDNAによってコードされる抗体鎖の細菌における産生に関して発現プラスミドを評価するには、いくつかの方法を採用することができる（Glover編，DNA Cloning，Vol． I.，IRL Press，1985，Ausubel，下記，Sambrook，下記Colligan，下記を参照のこと）。好ましい宿主は、試験管内または生体内で生育する哺乳類細胞である。哺乳類細胞は、免疫グロブリンタンパク質分子に、リーダーペプチドの除去、H 鎖およびL 鎖の折り畳みと集合、抗体分子のグリコシル化および機能的抗体タンパク質の分泌を含む翻訳後修飾を提供する。抗体タンパク質産生用の宿主として有用でありうる哺乳類細胞には、前述のリンパ由来の細胞に加えて、繊維芽細胞起源の細胞、例えばVero（ATCC CRL 81）やCHO-K1（ATCC CRL 61）がある。哺乳類細胞におけるクローン化抗ＴＮＦペプチドH 鎖およびL 鎖遺伝子の発現には、数多くのベクター系を利用できる（Glover編，DNA Cloning，Vol．II，14 3〜238 頁，IRL Press，1985 を参照のこと）。完全なH2L2抗体は、異なる方法で得ることができる。前述のように、同じ細胞内でH 鎖とL 鎖を同時に発現させて、H 鎖とL 鎖の完全な四量体H2L2抗体への細胞内での会合と結合を達成することができる。この同時発現は、同じ宿主内で同じプラスミドまたは異なるプラスミドいずれかを用いることによって起こりうる。H 鎖とL 鎖の両方の遺伝子を同じプラスミドに入れて、次いで、それを細胞にトランスフェクトすることによって、両鎖を発現させる細胞を直接選択することができる。別法として、まず1 つの鎖（例えばL 鎖）をコードするプラスミドで細胞をトランスフェクトした後、得られた細胞株を第2 の選択可能マーカーを含有するH 鎖プラスミドでトランスフェクトしてもよい。どちらかの経路でH2L2分子を産生する細胞株を、追加の選択可能マーカーと共にペプチド、H、L またはH＋L 鎖の追加コピーをコードするプラスミドでトランスフェクトすることにより、集合したH2L2抗体分子の産生量の増大や、トランスフェクトした細胞株の安定性の増大など、強化された特性を持つ細胞株を作成することもできるだろう。キメラA2（cA2）抗ＴＮＦ抗体高親和性、エピトープ特異性およびヒトＴＮＦの細胞傷害作用を中和する能力を持つネズミ- ヒトキメラ抗ヒトＴＮＦαMAb が開発された。キメラA2抗ＴＮＦは、A2と命名された高親和性中和ネズミ抗ヒトＴＮＦ IgG1 抗体の抗原結合性可変領域と、ヒトIgG1カッパ免疫グロブリンの定常領域とからなる。ヒトIgG1 Fc 領域は、同種抗体エフェクター機能を改善し、循環血清半減期を増大させ、抗体の免疫原性を減少させる。キメラA2の親和力とエピトープ特異性は、ネズミA2の可変領域に由来する。固相ELISA では、キメラA2とネズミA2の間にＴＮＦに関する交差競合が観測され、 cA2 とネズミA2のエピトープ特異性が同一であることが示された。ＴＮＦ- αに対するcA2 の特異性は、それがリンホトキシン（ＴＮＦ- β）の細胞傷害作用を中和する能力がないということによって確認された。キメラA2は天然ヒトＴＮＦと組換えヒトＴＮＦの細胞傷害作用を用量依存的に中和する。cA2 と組換えヒトＴＮＦの結合検定から、cA2 の親和定数は1.8×10⁹M1 と計算された。ＴＮＦ関連病変を治療するための治療法抗ＴＮＦ抗体、その断片および/ または誘導体は、抗ＴＮＦ抗体と反応する物質の異常レベルに関係する（具体的には健康な正常被験者に存在するレベルよりＴＮＦが過剰かまたは少なく、かかる過剰レベルまたは減少したレベルが、全身的、局所的、特定の組識タイプまたは身体の特定の位置で存在する）病変または状態を持つ被験者を治療するのに有用である。かかる組識タイプとしては、血液、リンパ液、CNS、肝臓、腎臓、脾臓、心筋または血管、脳または脊髄の白質または灰白質、軟骨、勒帯、腱、肺、膵臓、卵巣、精巣、前立腺が挙げられるが、これらに限定されない。正常レベルより増大または減少したＴＮＦ濃度は、関節、神経血管接合部、骨、特定の腱もしくは勒帯、または細菌もしくはウイルス感染などの感染部位などといった身体の特定の領域または細胞に局在化することもある。ＴＮＦ関連病変または疾患には次に挙げるものが含まれるが、これらに限定されるわけではない：（A）急性および慢性の免疫および自己免疫病、例えば全身性紅斑性狼瘡（SLE ）、関節リウマチ、甲状腺炎、対宿主移植片病、硬皮症、真性糖尿病、グレーヴズ病など；（B）感染症、例えば敗血症症候群、悪液質、急性または慢性細菌感染症がもたらすショックおよび循環虚脱、HIV やAIDS（悪液質、自己免疫障害、AIDS痴呆症候群および感染症を含む）などの急性および慢性の寄生虫および/ または細菌、ウイルスまたはカビ感染性疾患を含むが、これらに限るわけではない；（C）慢性炎症性病変および血管炎症性病変などの炎症性疾患、例えば、類肉腫症、慢性炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎およびクローン病などの慢性炎症性病変ならびに散在性血管内凝固、アテローム性動脈硬化および川崎病などの血管炎症性病変を含むが、これらに限られるわけではない；（D）神経変性疾患、多発性硬化症や急性横断脊髄炎などの脱髄性疾患；皮質脊髄系の病巣などといった錐体外路障害および小脳障害；脳幹神経節の障害または小脳障害；ハンチントン舞踏病や老人性舞踏病などといった多動性運動障害； CNS ドーパミン受容体を遮断する薬物によって誘発されるような薬物誘発性運動障害；パーキンソン病のような減動性運動障害；進行性核上麻痺；小脳の非構造的（astructural）病巣などの小脳および脊髄小脳障害；脊髄小脳変性（脊髄失調症；フリートライヒ運動失調、小脳皮質変性；多重組識変性（multiple syste ms degeneration）（メンセル（Mencel）、デジェリーヌ- トーマス、シー- ドレーガー（Shi-Drager）およびマチャドジョセフ(MachadoJoseph)）；全身性障害（レフスム病、無β- リポタンパク血症、運動失調症、毛細管拡張症およびミトコンドリア性多重組識障害）；多発性硬化症、急性横断脊髄炎などの脱髄性核障害；神経性筋萎縮症（筋萎縮性側索硬化症、小児脊髄筋萎縮症および若年性脊髄筋萎縮症などの前方角細胞変性）などの運動単位の障害；アルツハイマー病；中年のダウン症候群；広汎性レーヴィ小体病；レーヴィ小体型の老人性痴呆；ヴェルニッケ- コルサコフ症候群；慢性アルコール中毒；クロイツフェルト- ヤコブ病；亜急性硬化性汎脳炎、ハレルフォルデン- シュパッツ病（Hallerrorden-S patz disease）；拳闘家痴呆またはそれらのサブセットを含む；（E）ＴＮＦ分泌性腫瘍を伴う悪性病変またはその他のＴＮＦ関連悪性腫瘍、例えば白血病（急性、慢性骨髄性、慢性リンパ球性および/ または脊髄障害（my elodyspastic）症候群）；リンパ種（ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫、例えば悪性リンパ腫（バーキットリンパ腫や菌状息肉腫）など；（F）アルコール誘発性肝炎。例えばBerkowら編，The Merck Manual，第16版，11章，1380〜529頁，Merck a nd Co.,ニュージャージー州ローウェイ，1992（参考文献として本明細書に合体される）を参考のこと。「再発（reoccurrenceまたはflare-up）」または「患者の再発（relapse of t he patient）」という用語は、疾患状態の1 以上の症状の再発を包含するものとする。例えば関節リウマチの場合であれば、膨張した関節、早朝硬直または関節圧痛の1 以上の経験が再発に含まれうる。抗ＴＮＦ抗体は、作用剤を哺乳類体内のその作用剤の作用部位に到達させうる手段のいずれによっても投与できる。第1 の焦点は、単球およびマクロファージまたはその他のＴＮＦ産生細胞によって放出されたＴＮＦに到達し、それと結合できるということである。タンパク質は経口投与されると消化される対象となるので、吸収を最適化するために、通常は、非経口投与、すなわち静脈内、皮下、筋肉内投与が使用されるだろう。抗ＴＮＦ抗体は、個々の治療剤として投与してもよいし、他の治療剤と併用してもよい。これらは単独でも投与できるが、一般的には、選択した投与経路と標準的な製薬上の慣例に基づいて選択される医薬担体と共に投与される。投与量は、当然、その薬剤の薬力学的特徴、投与形式と投与経路、受容者の年齢、健康状態および体重、症状の性質と程度、併用する治療の種類、治療の頻度および所望する効果などといった既知の因子に依存して変化するだろう。通例、作用成分の日用量を、約0.01〜100m/kg 体重とすることができる。通常は、1〜4 0mg/kg/日を一日1〜6 回の分割投与または徐放性製剤として与えると、所望の結果を得るのに有効である。２回目以降の投与は、その患者に対する最初のまたは以前の投与量と同じ用量か、それより少ないか多い用量で投与することができる。２回目以降の投与は、疾患または疾患の症状の再発期またはその直前に行なうことが好ましい。例えば、２回目以降の投与は、先に行なった投与から約5〜30 週間または約10〜25週間後に行なうことができる。必要に応じて合計2、3、4 回またはそれ以上の投与を患者に行なうことができる。内用に適した投与剤形（組成物）は、一般的には、1 単位あたり約0.1mg〜約5 00mg の作用成分を含有する。これらの医薬組成物には、通常、組成物の全重量に基づいて約0.5〜95重量% の作用成分が含まれるだろう。非経口投与については、抗ＴＮＦ抗体またはその断片を医薬的に許容できる非経口賦形剤と共に溶液、懸濁液、乳剤または凍結乾燥粉末として製剤化することができる。かかる賦形剤の例は、水、生理食塩水、リンゲル溶液、デキストロース溶液および5%ヒト血清アルブミンである。リポソームおよび不揮発性油などの非水性賦形剤も使用できる。賦形剤または凍結乾燥粉末は、等張性を維持する添加物（例えば塩化ナトリウム、マンニトール）および化学的安定性を維持する添加物（例えば緩衝剤や保存剤）を含有してもよい。製剤は一般的に使用される技術で滅菌される。好適な医薬担体は、この技術分野における標準的な教科書であるRemington's Pharmaceutical Sciences,（A．Osol）に記述されている。例えば、注射による投与に適した非経口組成物は、1.5 重量% の作用成分を0. 9%塩化ナトリウム溶液に溶解することによって調製される。本発明の抗ＴＮＦ抗体は、ＴＮＦをその表面に持つ細胞に対する抗体依存的細胞性細胞傷害性（ADCC）および/ または補体依存的細胞傷害性（CDC）を仲介するというそれらの能力ゆえに、治療効力を持つようにすることができる。これらの作用に対して、内因性または外因性のエフェクター細胞（ADCCの場合）または補体成分（CDC の場合）のいずれかの供給源を利用することができる。本発明のネズミおよびキメラ抗体、断片および領域、それらの断片および誘導体は、免疫複合体として治療的に使用することができる（総説についてはDillman，R.O.,An n．Int．Med．111 :592〜603 を参照のこと）。かかるペプチドまたは抗体は、リシン-A、シュードモナス毒素およびジフテリア毒素を含むが、これらに限定されない細胞傷害性タンパク質に結合することができる。抗体、その他のリガンドまたはペプチドに結合した毒素は、当該分野で良く知られている（例えばOlsnes ，S.ら，Immunol．Today 10 :291〜295（1989）を参照のこと）。植物および細菌毒素は、具体的にはタンパク質合成機構を破壊することによって細胞を殺す。放射性核種、治療剤、細胞傷害性剤および薬物を含むがこれらに限定されない別のタイプの治療部分に、抗ＴＮＦ抗体を結合してもよい。抗体に結合して、生体内で抗原部位に送達することができる放射性核種の例としては、212Bi、131I 、186Re および90Y が挙げられるが、このリストは、完全であることを意図するものではない。放射性核種は、放射線療法の分野で知られているように、細胞を局所的に照射して、種々の細胞内損傷を誘発することによって、それらの細胞傷害性作用を発揮する。抗ＴＮＦ抗体に結合した後、生体内治療に使用できる細胞傷害性剤には、ダウノルビシン、ドキソルビシン、メトトレキセートおよびマイトマイシンC が挙げられるが、これらに限定されない。細胞傷害性剤は、DNA、RNA およびタンパク質合成を含む重要な細胞過程を妨害する。当該分野で良く知られているこれらの種類の薬物とその作用機構に関する記述については、Goodman ら，Goodman and Gilman's THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS，第8 版，Macmillan Pu blishing Co.，1990を参照のこと。抗ＴＮＦ抗体は、その抗体と相互作用するエフェクター細胞の数または活性を増大させる機能を果たす他のモノクローナルもしくはネズミおよびキメラ抗体、断片もしくは領域、またはリンホカインもしくは造血性増殖因子などと併用すると有利である。抗ＴＮＦ抗体、断片または誘導体を、ＴＮＦ療法と併用することにより、ＴＮＦの望ましくない副作用を遮断することもできる。ガン療法に対する最近のアプローチには、ガン患者に対するＴＮＦの直接投与や、リンホカイン活性化キラー（LAK）細胞（Rosenberg ら，New Eng．J．Med．313 :1485〜1492（1985））または腫瘍浸潤性リンパ球(TIL)（Kurnick ら，Clin．Immunol．Immunopath．38 : 367〜380(1986)；Kradinら，Cancer Inmunol．Immunother．24 :76〜85（1987）；Kradinら，Transplant．Proc．20 :336〜338（1988））によるガン患者の免疫療法が含まれている。ＴＮＦ遺伝子を用いるトランスフェクションによって大量のＴＮＦを産生するようになった改良LAK 細胞またはTIL を用いる試験が現在進行中である。かかる治療法は、本明細書に記載し、関連分野で知られているように、ＴＮＦの多面発現性作用が引き起こすいくつかの望ましくない副作用を伴う可能性がある。本発明によれば、ＴＮＦまたは大量のTIL を産生する細胞を受けている被験者を本発明の抗体、断片または誘導体で同時に治療することによって、これらの副作用を軽減することができる。有効投与量は前述の通りである。その投与量レベルは、ＴＮＦの主たる抗腫瘍効果を遮断することなく副作用を遮断するように、投与されるＴＮＦまたはＴＮＦ産生細胞の用量に従って調節する必要があるだろう。通常の当業者には、過度の実験を行なわずにかかる投与量を決定する方法がわかるだろう。関節炎の治療関節リウマチの場合、主に現れる症状は痛み、硬直、腫脹および機能の喪失である（「Textbook of Rheumatology」（Kelley WN，Harris ED，Ruddy S，Sledg e CB編；WB Saunders,フィラデルフィア，1985）の 879〜886 頁，Bennett JC． The etiology of rheumatoid arthritis）。ＴＮＦαは関節リウマチの病因において主たる重要性を持つ。関節リウマチ関節組識と滑液には、タンパク質レベルとmRNAレベルで、ＴＮＦαの産生に関する証拠があり(Buchan G．ら，Clin．Exp．Immunol．73 :449〜455，1988)、このことは局所的合成を示している。しかし、関節リウマチ関節においてＴＮＦαが生物活性化に足る量で検出されるということは、必ずしも、関節リウマチの病因においてそれが重要であるということを示すわけでないし、また、それが良好な治療標的候補であることを示すわけでもない。これらの問題と取り組むために、リウマチ関節細胞培養と比較用の骨関節炎細胞培養に対する抗ＴＮＦ抗体およびペプチド（ウサギまたはモノクローナル）の効果を研究した。IL-1産生が破壊され、ＴＮＦαが関節リウマチの治療に関する好適な治療標的であることが示された。なぜなら、抗ＴＮＦαは、軟骨と骨の破壊に関与することが知られている2 つのサイトカイン(Brennan ら，Lancet 11 :244〜247，1989)ＴＮＦとIL-1の両方を遮断するからである。この仮説は、続いて行なった関節リウマチ組識での研究によって裏付けられた。抗ＴＮＦ Ab はもう1 つの起炎症性サイトカインGM-CSF（Haworth ら，Bur．J ．Immunol．21 :2575〜2579，1991）の産生を排除した。この観察結果は、独立して確認されている（Alvaro-Gracia ら，1991）。また、抗ＴＮＦが関節リウマチ関節細胞培養における細胞接着とHLA クラスII発現を減少させることも示されている。ここに本発明を一般的に説明し終えたが、いくつかの特定の実施例を参照することによって、本発明がよりよく理解されるだろう。これらの実施例は単なる例示であって、特に明言しない限り、限定を意図するものではない。ｃＡ2 の調製実施例Ｉ：マウス抗ヒトＴＮＦｍＡｂの製造ＴＮＦｍＡｂの臨床研究を容易にするために、Ａ２と命名した高親和性能阻止および／または中和マウス抗ヒトＴＮＦＩｇＧ１ｍＡｂを製造した。１０週齢の、雌ＢＡＬＢ／ｃマウス、をジャクソンラボラトリー（ＪａｃｋｓｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｙ）（メーン州、バーハーバー）から入手した。０．４ｍｌの、等量のＦｒｅｕｎｄ完全アジュバント（ディフコラボラトリーズ（ＤｉｆｃｏＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）より入手）で乳化された４０μｇの精製大腸菌由来組み換えヒトＴＮＦ（ｒｈＴＮＦ）を、マウスに皮下および腹膜内（ｉ．ｐ．）注射した。１週間後、Ｆｒｅｕｎｄ不完全アジュバント中の５μｇのｒｈＴＮＦの注射をｉ．ｐ．にし、つぎに、４回の連続的なアジュバント無しの１０μｇのＴＮＦのｉ．ｐ．注射を行なった。最終注射の８週間後、マウスを１０μｇのＴＮＦでｉ．ｐ．ブーストした。４日後、マウスを殺し、脾臓を得て、脾臓細胞懸濁物を調製した。脾臓細胞を非分泌ハイブリドーマ、Ｓｐ２／０（ＡＴＣＣＣＲＬ１５８１）細胞と、脾臓細胞対ＳＰ２／０細胞が４：１の比で、０．３ｍｌの３０％ポリエチレングリコール、ＰＥＧ１４５０の存在下で、融合させた。３７℃で６時間のインキュベーション後、融合細胞を、ウェルあたり２×１０⁴個のＳｐ２／０細胞の濃度で９６ウェルプレート中に、０．２ｍｌのアリコートに分配した。支持細胞を、５ ×１０⁴正常ＢＡＬＢ／ｃ脾臓細胞の状態で、各ウェルに添加した。用いた生育培地は、ＲＰＭ１−１６４０培地、１０％熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（ハイクローン（ＨＹＣＬＯＮＥ）製）、０．１ｍＭ最小必須培地（ＭＥＭ）非必須アミノ酸、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、２ｍＭＬ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（ギブコラボラトリーズ（ＧＩＢＣＯＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）製）、および、選択のためのヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン（ＨＡＴ）（ベーリンガーマンハイム（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）製）からなっていた。ｒｈＴＮＦαに対して特異的なｍＡｂの存在について上清をスクリーニングするために、固相ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）を行なった。このアッセイは、後記の実施例IIに記載されている。このアッセイにおけるバックグランド結合は、約５００ｃｐｍであった。上清は、２０００ｃｐｍ以上の結合が得られた場合、陽性であると見なした。スクリーニグした３２２個の上清のうち、２５個はＲＩＡにより陽性であった。これら２５個のうち、最大の結合を有するもの（４８００ｃｐｍ）をＡ２と命名した。陽性ウェルを、マウス支持細胞に、限界希釈しサブクローニングした。さらなる中和アッセイにおける上清の分析で、Ａ２が、強い阻止および／または中和活性を示す唯一の陽性クローンであることが分かった。このように、ハイブリドーマ株Ａ２を選択した。この株を、１０％ＦＢＳ（ギブコ製）、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、２ｍＭＬ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むＲＰＭ１−１６４０培地中で維持した。二者択一的に、前記のように、ｒＴＮＦ蛋白質の代わりに用いられる、ＴＮＦの８７〜１０８番目の残基もしくは５９〜８０番目および８７〜１０８番目の両残基の少なくとも５アミノ酸を含むペプチドまたはそれらに含まれるペプチドの組み合わせに結合させることにより、ＴＮＦの生物学的活性を阻止する抗ＴＮＦ抗体をスクリーニングすることができる。実施例II：抗ＴＮＦ抗体ラジオイムノアッセイの特徴付け大腸菌由来ｒｈＴＮＦをＢＣＢ緩衝液、ｐＨ９．６中で１μｇ／ｍｌに希釈し、０．１ｍｌの溶液を各アッセイウェルに添加した。４℃で一晩のインキュベーション後、ウェルをＢＣＢで短時間洗浄し、つぎに、１％ウシでシールし、４０ｐｇ／ｍｌの天然（マサチューセッツ州、ボストン、ジェンザイム（ＧＥＮＺＹＭＥ）製）または組み換え（日本、大阪、サントリー製）ヒトＴＮＦαと、様々な濃度のｍＡｂＡ２と共に、２０μｇ／ｍｌシクロヘキシミドの存在下で３９ ℃で一晩インキュベートした。対照は、各ウェル中に培地単独または培地＋ＴＮＦを含んでいた。細胞死を、ナフトールブルーブラックで染色することにより測定し、結果を分光学的に６３０ｎｍで読み取った。この波長での吸光度は、存在する生存細胞の数と相関している。Ａ２が、用量依存様式で、天然およびｒｈＴＮＦの両方の細胞傷害性効果を阻止または中和したことがわかった。他の実験において、この阻止および／または中和活性の特異性を試験した。ＴＮＦバイオアッセイの２０時間前に、Ａ６７３／６細胞を３×１０⁴細胞／ウェルで播種した。連続２倍希釈したｒｈＴＮＦ、大腸菌由来組み換えヒトリンホトキシン（ＴＮＦβ）および大腸菌由来組み換えネズミＴＮＦを調製した。Ａ２ハイブリドーマ上清を、等量の希釈ＴＮＦ調製物に添加し、混合物を室温で３０分間インキュベートした。０．１ｍｌのアリコートをＡ６７３／６細胞を含むウェルに移し、２０μｇ／ｍｌのシクロヘキシミドを添加し、細胞を３９℃で一晩インキュベートした。つぎに、細胞傷害性の評価のために、細胞を固定し、染色した。結果は、ｍＡｂＡ２が特異的にｒｈＴＮＦαの細胞傷害性を阻止または中和するが、ヒトリンホトキシン（ＴＮＦβ）またはネズミＴＮＦに対する効果を有していなかったことを示している。つぎに、実験を行なって、ｍＡｂＡ２の非ヒト霊長類由来のＴＮＦとの交差反応性を分析した。Ｂ５１４（ヒヒ）、Ｊ９１（カニクイザル）およびＲＨ３８３（アカゲザル）血液から、フィコール勾配遠心分離および吸着により単離された単球を、１×１０⁵細胞／ウェルで、５％ＦＢＳおよび２μｇ／ｍｌ大腸菌ＬＰＳを含むＲＰＭｉ１６４０培地中で３時間または１６時間３７℃でインキュベートし、ＴＮＦ産生を誘導した。前記のように、Ａ６７３／６細胞を用いて、ＴＮＦバイオアッセイを行なうまで、二連のウェル由来の上清をプールし、４℃で２０時間未満保存した。培養上清の２倍希釈物を、培地または最終濃度１ μｇ／ｍｌの精製ｍＡｂＡ２のいずれかと混合し、室温で３０レイン（ｒａｉｎ）間インキュベートし、アリコートを指示細胞に移した。結果は、ｍＡｂＡ２がヒヒ、カニクイザルおよびアカゲザル単球により生産されるＴＮＦの細胞傷害性活性を有意には阻止または中和できないことを示した。さらなる実験をチンパンジーＴＮＦで行なった。ＣＨ５６３（チンパンジー）血液から単離された単球を前記のようにインキュベートして、ＴＮＦ含有上清を作製した。１０μｇ／ｍｌのｍＡｂＡ２がこれらの上清の生物活性を阻止または中和する能力を、前記のようにアッセイした。ヒトＴＮＦを陽性対照として用いた。結果は、ｍＡｂＡ２がチンパンジーＴＮＦに対する強い阻止および／または中和活性を有していたことを示す。ｍＡｂＡ２の阻止および／または中和活性を、ヒトＴＮＦ、すなわちＴＮＦ −１、ＴＮＦ−２およびＴＮＦ−３に特異的な３つの他のネズミｍＡｂ、ならびに対照ｍＡｂと比較した。連続２倍希釈した精製ｍＡｂをｒｈＴＮＦ（４０ｐｇ／ｍｌ）と混合し、室温で３０分間インキュベートし、アリコートを前記のようにＴＮＦ生物活性について試験した。ｍＡｂＴＮＦ−１、ＴＮＦ−２およびＴＮＦ−３は、それぞれ同様の中程度の阻止および／または中和活性を有することがわかった。対照的に、ｍＡｂＡ２は、はるかに強い阻止および／または中和活性を有していた。実施例III：抗体ＶおよびＣ遺伝子をクローニングするための一般的方法前記抗ＴＮＦ抗体を分泌するハイブリドーマＡ２から、ＨおよびＬ鎖遺伝子に対するＶ領域をクローニングする方法は、機能的に再編成された（および発現された）Ｉｇ遺伝子に対する、Ｖ領域および対応するＪ（連関）領域間のゲノムにおける連結に基づいていた。Ｊ領域ＤＮＡプローブをゲノムライブラリーをスクリーニングするために用いて、Ｊ領域に連結したＤＮＡを単離することができる。生殖系列配置（すなわち、未再編成）におけるＤＮＡもＪプローブにハイブリダイズすると思われるにもかかわらず、このＤＮＡは、ＩｇＶ領域配列に結合しないと思われ、単離されたクローンの制限酵素分析により同定することができる。本明細書に用いられたクローニングは、Ｊ_HおよびＪ_Kプローブを用いて再編成されたＨおよびＬ鎖遺伝子からＶ領域を単離することであった。これらのクローンを、それらの配列がＡ２ハイブリドーマにおいて発現しているかどうかを見るために、ノーザン分析により試験した。発現された配列を含むこれらのクローンを、抗体が産生されているかどうかを決定するために、ヒトＣ領域を含む発現ベクターにクローニングし、マウス骨髄腫細胞にトランスフェクトした。つぎに、産生細胞由来の抗体を、結合特異性について試験し、機能的にＡ２ネズミ抗体と比較した。実施例IV−Ｌ鎖ゲノムライブラリーの構築Ａ２ハイブリドーマからＬ鎖Ｖ領域遺伝子を単離するために、サイズ選択ゲノムライブラリーを、ファージラムダベクターシャロン２７を用いて構築した。高分子量ＤＮＡをＡ２ハイブリドーマ細胞から単離し、制限酵素ＨｉｎｄIIIで完全に消化した。つぎに、ＤＮＡを０．８％アガロースゲルで分画し、約３ｋｂ、４ｋｂおよび６ｋｂの３つの異なるサイズ範囲のＤＮＡ断片をゲルから電気溶出により単離した。ライブラリー構築のためのサイズ範囲は、サザンブロットでＪ_K プローブとハイブリダイズするＨｉｎｄIII断片のサイズに基づいて選択した。フェノール／クロロホルム抽出およびエタノール沈殿の後、各サイズクラスからのＤＮＡ断片をラムダシャロン２７アームとライゲーションし、ストラタジェン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）（カリフォルニア州、ラホーラ）製のＧｉｇａｐａｃｋＧｏｌｄを用いて、ファージ粒子にｉｎｖｉｔｒｏでパッケージングした。これらのライブラリーを、³²Ｐ標識Ｊ_kプローブを用いて、１５０ｍｍペトリ皿あたり約２０，０００プラークの密度で、直接スクリーニングした。マウスＬ鎖Ｊ_Kプローブは、５つのＪ_kセグメント全てを含む２．７ｋｂＨｉｎｄIII断片である。ベーリンガーマンハイムから得たキットを用いたランダムプライミングにより、プローブを³²Ｐで標識した。遊離ヌクレオチドを、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−ＳＯカラムを通した遠心分離により除いた。プローブの比活性は約１０⁹ ｃｐｍ／μｇであった。プラークハイブリダイゼーションを、５×ＳＳＣ、５０％ホルムアミド、２× Ｄｅｎｈａｒｔ’ｓ試薬、および２００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ中で、４２℃で１８〜２０時間行なった。最終洗浄は、０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で６５℃であった。オートラジオグラフィーの後、陽性クローンを同定した。実施例Ｖ−Ｈ鎖ゲノムライブラリーの構築Ａ２Ｈ鎖に対するＶ領域遺伝子を単離するために、ゲノムライブラリーを、ラムダｇｔ１０ベクターシステム中に構築した。高分子量ＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩで完全に消化し、約７．５ｋｂの断片をアガロースゲル電気泳動後に単離した。これらの断片をラムダｇｔ１０アームとライゲーションし、ＧｉｇａｐａｃｋＧｏｌｄを用いて、ファージ粒子にｉｎｖｉｔｒｏでパッケージングした。このライブラリーを、Ｊ_Hプローブを用いて、１５０ｍｍプレートあたり２０，０００プラークの密度で、スクリーニングした。Ｊ_Hプローブは、Ｊ３およびＪ４セグメントの両方を含む２ｋｂＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ断片であった。プローブを、実施例IIIと同様に標識し、同様の比放射活性を有していた。ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は、実施例IIIにおいて用いられたものと同一であった。実施例VI−ＴＮＦ特異的Ｖ遺伝子領域のクローニングＪ_HおよびＪ_Kプローブをそれぞれ用いて各ライブラリー由来の約１０⁶個のプラークをスクリーニングした後、数個の陽性クローンをＨおよびＬ鎖ライブラリーから単離した。プラーク精製後、バクテリオファージＤＮＡを、各陽性クローンについて単離し、ＥｃｏＲＩ（Ｈ鎖クローン）またはＨｉｎｄIII（Ｌ鎖クローン）のいずれかで消化し、１％アガロースゲルで分画した。ＤＮＡをニトロセルロースに移し、ブロットをＪ_HまたはＪ_kプローブでハイブリダイズした。Ｊ_Hプローブに対するＭＡｂの断片をコードする７．５ｋ／ＤＥｃｏＲＩＤＮＡを含む数個のＨ鎖クローンを得た。軽鎖ライブラリーについて、３つのサイズ選択ライブラリーのそれぞれからの、Ｊ_kプローブにハイブリダイズするＨｉｎｄIII断片を含む数個のクローンを単離した。Ｌ鎖について、数個の独立に得られた、２ｋｂライブラリー由来の２．９ｋｂのＨｉｎｄIII断片は、Ａ２由来の１２５０ｂｐｍＲＮＡとハイブリダイズしたが、ＳＰ２／０ｍＲＮＡとはしなかった（実施例VII参照）。さらに、４ｋｂライブラリー由来の数個のＨｉｎｄIII断片は、Ａ２ｍＲＮＡおよび融合パートナーｍＲＮＡの両方にハイブリダイズした。６ｋｂライブラリー由来の５．７ｋｂのＨｉｎｄIII断片は、いずれのＲＮＡにもハイブリダイズしなかった。観察されたハイブリダイズするＡ２ｍＲＮＡの長さは、ＨおよびＬ鎖ｍＲＮＡそれぞれに対して正確な長さであった。ＲＮＡ発現はＡ２ハイブリドーマに制限されたので、７．５ｋｂＨ鎖断片および２．９ｋｂＬ鎖断片は、Ａ２由来の正しいＶ領域配列を含むと想定された。各タイプの１つの例を、さらなる研究のために選択した。重要な機能試験は、これらのＶ領域配列が、適したＣ領域配列と結合したときに、ネズミＡ２抗体と同様な特異性および親和性を有する抗体の合成を導くことができることの証明である。７．５ｋｂＨ鎖断片および２．９ｋｂＬ鎖断片を、ネズミ骨髄腫細胞においてキメラマウス／ヒト蛋白質の発現を許容するプラスミドベクターにサブクローニングした（実施例VIIIおよIX参照）。これらのプラスミドを、ＳＰ２／０細胞に同時にトランスフェクトし、インタクト抗体分子が分泌されるかどうか、もしそうなら、それらは正確な特異性および親和性であるかを確かめた。推定抗ＴＮＦＨ鎖と不適当だが発現されるＬ鎖とを対にして、対照トランスフェクションも行なった；推定抗ＴＮＦＬ鎖も、不適当だが発現されるＨ鎖と対にした。結果は、７．５ｋｂＨ鎖断片は発現されるが、２．９ｋｂＬ鎖断片は発現されないことを示した。これは、ＤＮＡ配列分析により確認され、他の公知のＬ鎖アミノ酸配列と比較して、コード領域の一部が正確でないアミノ酸リーディングフレームであったことを示していた。２．９ｋｂのＨｉｎｄIII断片は、機能的Ｖ遺伝子を含んでいないようにみえたので、Ｌ鎖ライブラリーから単離された４．０ｋｂおよび５．７ｋｂのＨｉｎｄIII断片を、発現ベクターにクローニングし、７．５ｋｂのＨ鎖との同時トランスフェクション後のキメラ抗体の発現を試験した。５．７ｋｂのＨｉｎｄIII 断片は抗体発現を補助することができず、４．０ｋｂのＨｉｎｄIII断片は抗体発現を補助しなかった。７．５ｋｂの推定Ｈ鎖Ｖ領域および４．０ｋｂのＬ鎖Ｖ領域の同時トランスフェクションにより得られた抗体を精製し、固相ＴＮＦ結合アッセイで試験し、不活性であることがわかった。４．０ｋｂのＨｉｎｄIII断片上に含まれるＶ領域は、正確な抗ＴＮＦＶ領域ではなく、融合パートナーによりハイブリドーマに寄与していたと結論された。これは、その後、Ａ２ハイブリドーマ由来および融合パートナー由来のｃＤＮＡの配列分析により確認された。Ａ２ｍＲＮＡとハイブリダイズする２．９ｋｂＨｉｎｄIII断片を含む他の独立に得られたＬ鎖クローンを、さらに詳細に特徴付けした。制限地図が類似していたにもかかわらず、クローンはＡｃｃＩ酵素部位の存在または不存在の点で２つのクラスに分けられた。最初の（非機能的）２．９ｋｂ断片（クローン８．３と命名）は、いくつかの他のクローン（クローン４．３で表わされる）には存在するＡｃｃＩ部位を失っていた。クローン４．３のＤＮＡ配列は、クローン８．３に極端に類似していたが、クローン８．３とは異なり、公知のＬ鎖に近い相同性を有する単一のアミノ酸リーディングフレームを含んでいた。クローン４．３由来の２．９ｋｂＨｉｎｄIII断片を、Ｌ鎖発現ベクターにサブクローニングし、推定抗ＴＮＦＨ鎖でＳＰ２／０細胞に同時トランスフェクトした。抗体を合成し、精製し、固相ＴＮＦ結合アッセイにおいて試験した。この抗体はＴＮＦに結合し、それゆえ、クローン４．３Ｌ鎖Ｖ領域は正確なものであると想定された。Ａ２ネズミハイブリドーマは、少なくとも４つの再編成Ｌ鎖Ｖ領域遺伝子を含むことが示されている。これらのうちの少なくとも２つは、蛋白質として発現される：クローン４．３（正しい抗ＴＮＦＬ鎖遺伝子）および４．０ｋｂＨｉｎｄIII断片に含まれる遺伝子（融合パートナーにより寄与される）。いくつかは正しいＬ鎖を用い、いくつかは間違ったＬ鎖を用い、いくつかはそれぞれの１つを用いて、２つのＬ鎖の発現は、ネズミハイブリドーマから分泌された得られた抗体が実際に抗体の混合物であることを示している。ネズミＡ２抗体における２つの異なるＬ鎖の存在は、精製抗体のＳＤＳゲルおよびＮ末端蛋白質配列分析により確認されている。キメラＡ２抗体の構築は、個々のＨおよびＬ鎖遺伝子をクローニングし、それらを非産生細胞株で発現させることを伴うので、得られた抗体は、正しいＬ鎖しか有せず、したがって、より強い抗体であるだろう（実施例Ｘ、ＸＩ、ＸII参照）。実施例VII−クローニングしたＤＮＡのノーザン分析真正のＡ２ハイブリドーマ由来のＨおよびＬ鎖Ｖ領域に対応するクローニングしたＤＮＡは、Ａ２ｍＲＮＡにハイブリダイズすると期待される。ＨまたはＬ鎖遺伝子座での非機能的ＤＮＡ再編成は発現されるべきでない。１０μｇの全細胞ＲＮＡを１％アガロース／ホルムアルデヒドゲルでの電気泳動（サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、下記）に付し、ニトロセルロースに移した。ブロットを、ランダムプライムドＤＮＡプローブと、５０％ホルムアミド、２× Ｄｅｎｈａｒｔ’ｓ溶液、５× ＳＳＣおよび２００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ中で、４２℃で１０時間ハイブリダイズした。最終洗浄条件は、６５℃で０．５× ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳであった。サブクローニングされたＤＮＡ断片を、ランダムプライミングにより³²Ｐで標識し、Ａ２細胞またはＡ２の融合パートナーの親であるＳＰ２／０細胞由来の全ＲＮＡを含んでいるノーザンブロットにハイブリダイズさせた。７．５ｋｂＥｃｏＲＩＨ鎖断片は、Ａ２由来の２ｋｂｍＲＮＡとハイブリダイズしたが、ＳＰ２／０ｍＲＮＡとはしなかった。同様に、２．９ｋｂＬ鎖ＨｉｎｄIII 断片（クローン４．３）は、Ａ２由来の１２５０ｂｐｍＲＮＡとハイブリダイズしたが、ＳＰ２／０ｍＲＮＡとはしなかった。ハイブリダイズしているＡ２ｍＲＮＡの観察された長さは、ＨおよびＬ鎖ｍＲＮＡそれぞれに対して正確な大きさであり、これらのＤＮＡ断片上のＶ領域配列がＡ２ハイブリドーマ細胞中で発現されていることが確認された。実施例VIII−発現ベクターの構築前記推定Ｌ（クローン４．３）およびＨ鎖Ｖ遺伝子を、発現ベクターのヒトカッパおよびガンマ１定常領域遺伝子に結合させた。Ａ２由来の推定Ｖ_H領域遺伝子に対応する７．５ｋｂＥｃｏＲＩ断片を、ヒトＣ_gammal遺伝子およびＥｃｏｇｐｔ遺伝子を含んでいる発現ベクターにクローニングし、ｐＡ２ＨＧｌａｐｇｐｔと命名されたプラスミドを得た。クローン４．３由来の２．９ｋｂ推定ＶＬ断片を、ヒトカッパＣ_K遺伝子およびＥｃｏｇｐｔ遺伝子を含んでいるベクターにクローニングし、哺乳類細胞中で選択させた。得られたプラスミドを、ｐＡ２ＨｕＫａｐｇｐｔと命名した。実施例IX−キメラ抗体遺伝子の発現キメラＨおよびＬ鎖遺伝子を発現させるために、発現プラスミドを非産生マウス骨髄腫細胞株、ＳＰ２／０の細胞にトランスフェクトした。トランスフェクト対象のプラスミドＤＮＡを、２度臭化エチジウム／塩化セシウム勾配中で平衡になるまで遠心分離することによって精製した。プラスミドＤＮＡ（１０〜５０ｎｇ）を、Ｈａｎｋ’ｓ塩を含んでいる培地中の１０⁷個のＳＰ２／０細胞に添加し、混合物をＢＩＯＲＡＤエレクトロポレーション装置に静置した。エレクトロポレーションを２０Ｖで行ない、つぎに、細胞を９６ウェルマイクロタイタープレートにプレーティングした。ミコフェノール酸選択を２４時間後に適用し、薬剤耐性コロニーを１〜２週間後に同定した。耐性コロニーを安定細胞株に拡張し、これらの細胞株由来の組織培養上清を、アルカリフォスファターゼを結合させたヤギ抗ヒトＩｇＧＦｃ抗体およびヤギ抗ヒトＨ＋Ｌ（ジャクソンラボラトリーより入手）でのＥＬＩＳＡアッセイを用いて、抗体に対して試験した。キメラＡ２抗体を、プロテインＡセファロースクロマトグラフィーにより、組織培養上清から精製した。上清を、０．１ＭＴｒｉｓ、０．００２ＭＥＤＴＡ、ｐＨ８．０に調整し、同じ緩衝液で平衡化させたプロテインＡセファロースカラムに負荷した。ＩｇＧを、０．１Ｍクエン酸塩、ｐＨ３．５で溶出し、１ＭＴｒｉｓで阻止または中和し、リン酸緩衝液生理食塩水（ＰＢＳ）中で透析した。精製キメラ抗体を、結合活性ならびに阻止活性および／または中和活性について評価した。実施例Ｘ−抗ＴＮＦキメラ抗体の特異性ｃＡ２の抗原結合ドメインはネズミＡ２由来なので、これらのｍＡｂは、ＴＮＦの同じ結合部位に競合すると期待される。固定された濃度のキメラＡ２およびネズミｍＡｂＡ２を、ｒｈＴＮＦ（日本、大阪、大日本製）で被覆した９６ウェルマイクロタイタープレート中で、ネズミおよびキメラＡ２競合剤それぞれの濃度を増加させてインキュベートした。アルカリフォスファターゼ結合抗ヒト免疫グロブリンおよび抗マウス免疫グロブリン２次抗体を用いて、キメラおよびネズミＡ２それぞれの結合のレベルを検出した。ＴＮＦ抗原に対する交差競合は、この固相ＥＬＩＳＡ形式で観察された。この発見は、ｃＡ２およびネズミＡ２の期待された同一のエピトープ特異性と一致している。ｒｈＴＮＦαに対するマウスｍＡｂＡ２およびｃＡ２の結合親和性定数を、スキャチャード分析により決定した（例えば、スキャチャード（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ），Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５１：６６０（１９４９））。この分析は、９６ウェルプレートにイモビライズされた（ｉｒａｍｏｂｉｌｉｚｅｄ）ｒｈＴＮＦαに対する¹²⁵Ｉ標識ｃＡ２の直接結合を測定することを伴っていた。抗体を、イオドゲン法によりそれぞれ約９．７μＣｉ／μｇの比活性に標識した。０．５×１０⁹リットル／モルの親和性定数（Ｋａ）がマウスｍＡｂＡ２について計算された。期待とは違い、キメラＡ２抗体は、１．８×１０⁹リットル／モルのＫａの、より高い親和性を有していた。このように、本発明のキメラ抗ＴＮＦα抗体は、親のネズミＡ２ｍＡｂよりもヒトＴＮＦαに対して有意により高い結合親和性を現すことが示された。ネズミおよびキメラの抗体、断片および領域は、親のｍＡｂと同じかそれより低い親和性を有することが期待されるので、この発見は驚くべきことであった。かかる高親和性抗ＴＮＦ抗体は、少なくとも１×１０⁸Ｍ^-1、より好ましくは少なくとも１×１０⁹Ｍ^-1のＴＮＦαへの結合親和性（Ｋａで表される）を有しており、生物学的液体における非常に低いレベルのＴＮＦを検出するイムノアッセイに好適である。さらに、かかる高い親和性を有する抗ＴＮＦ抗体は、ＴＮＦ −α介在状態または病変状態の治療に好適である。ｃＡ２のＴＮＦに対する特異性は、ヒトリンホトキシン（ＴＮＦ−β）の交差中和性を試験することにより確認された。リンホトキシンは、数個の配列相同性および特定の生物学的活性、例えば、腫瘍細胞細胞傷害性を、ＴＮＦと共有する（ペンニカ（Ｐｅｎｎｉｃａ）ら、Ｎａｔｕｒｅ３１２：７２４−７２９（１９８４））。培養ヒトＡ６７３細胞を、３９℃で一晩２０μｇ／ｍｌシクロヘキシミドの存在下で、４μｇ／ｍｌキメラＡ２共存または無しで、ヒトリンホトキシン（カリフォルニア州、サンフランシスコ、ジェネンテック（ＧＥＮＥＮＴＥＣＨ）製）の濃度を増加させてインキュベートした。細胞死を、前記のように、ナフトールブルーブラックでの生細胞染色により測定した。結果は、ｃＡ２がヒトリンホトキシンを阻止および／または中和するのに効果的ではなかったことを示し、キメラ抗体のＴＮＦα特異性を確認した。Ａ２またはｃＡ２の異なる動物種由来のＴＮＦと反応する能力も評価した。以前に述べられているように、阻止および／または中和ｍＡｂが結合するだろうヒトＴＮＦ上の複数のエピトープが存在する（モラー（Ｍｏｌｌｅｒ）ら、以下）。ヒトＴＮＦは、広い範囲の宿主動物種において生物活性を有する。しかしながら、ある種のヒトＴＮＦ上の阻止および／または中和エピトープは、異なる動物種間で保存されており、その他の物はヒトおよびチンパンジーに限定されているようにみえる。中和実験は、ＴＮＦ源として、新鮮に単離されたヒト、チンパンジー、アカゲザルおよびカニクイザル、ヒヒ、ブタ、イヌ、ウサギ、またはラット単球由来のエンドトキシン活性化細胞上清を利用した。前記議論したように、ネズミｍＡｂＡ２は、ヒトおよびチンパンジーＴＮＦのみの活性を阻止または中和し、他の霊長類および下等動物由来のＴＮＦには効果を有していなかった。Ａ２も、組み換えマウスＴＮＦの細胞傷害性効果を阻止または中和しなかった。このように、Ａ２により認識されるエピトープは、ヒトおよびチンパンジーＴＮＦαにより共有されるものである。キメラＡ２も、ラット、ウサギ、イヌおよびブタの単球由来のＴＮＦならびに精製組み換えマウスＴＮＦα、および天然および組み換えヒトＴＮＦαとの交差活性について、この方法で試験した。キメラＡ２は、天然および組み換えヒトＴＮＦαのみを阻止または中和した。それゆえ、ｃＡ２は、ネズミＡ２と種特異性を共有しているようにみえる。実施例ＸＩ−キメラ抗ＴＮＦ抗体のｉｎｖｉｔｒｏ活性および中和効力ネズミおよびキメラ抗ＴＮＦα抗体、Ａ２およびｃＡ２の両方が、強いＴＮＦ阻止および／または中和活性を有するかどうか決定した。前記ＴＮＦ細胞傷害性アッセイにおいて、ネズミＡ２は、約１２５ｎｇ／ｍｌの濃度で、４０ｐｇ／ｍｌのｒｈＴＮＦαの攻撃の生物学的活性を、完全に阻止または中和した。５０％阻止投与（ＩＤ５０）として表現された、阻止および／または中和能力の２つの別々の決定は、１５．９±１．０１および１７．９±１．６ｎｇ／ｍｌ（平均＋標準誤差）であると決定された。このように、ｍＡｂＡ２は、約１７ｎｇ／ｍｌのＩＤ５０を有している。この同じ実験システムにおいて、３つの他のネズミ抗ＴＮＦα抗体（すなわち、ＴＮＦ−１、ＴＮＦ−２およびＴＮＦ−３）のＴＮＦへの比較結合親和性が、１〜２桁大きいＩＤ５０値を有していることが分かり、したがって、Ａ２より中和において有意に低かった。ｃＡ２のｉｎｖｉｔｒｏでのヒトＴＮＦα生物活性を阻止または中和する能力を、前記バイオアッセイシステムを用いて試験した。培養Ａ６７３細胞を、前記のように、４０ｐｇ／ｍｌ天然（マサチューセッツ州、ボストン、ジェンザイム製）または組み換え（日本、大阪、サントリー製）ヒトＴＮＦと、抗体共存または無しで、一晩インキュベートし、細胞死を生細胞染色により測定した。Ａ２マウスｍＡｂでの前記結果に基づいて期待されたように、ｃＡ２も、細胞傷害性アッセイにおいて、用量依存様式で天然およびｒｈＴＮＦ両方を阻止または中和した。このアッセイ形式において、１２５ｎｇ／ｍｌの低いｃＡ２レベルで、ＴＮＦの毒性活性を完全に回避した。繰り返された分析に基づくと、ｃＡ２は、親のネズミＡ２ｍＡｂよりも優れたＴＮＦ阻止および／または中和活性を示した。かかる阻止および／または中和能力は、１μｇ／ｍｌ以下の抗体レベルで、抗体が投与された被験者の血液中で容易に達成される。したがって、かかる高度に強い阻止および／または中和抗ＴＮＦ抗体、特にキメラ抗体は、ＴＮＦα介在病変または状態における治療用に好適である。前記したように、ＴＮＦは、ＩＬ−６の細胞性分泌を誘導する。さらに、症候群におけるＩＬ−６の正確な役割は不明であるにもかかわらず、ＩＬ−６が敗血症の異状病態に伴っている証拠がある（フォング（Ｆｏｎｇ）ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７０：１６２７−１６３３（１９８９）；スターネスジュニア（ＳｔａｒｎｅｓＪｒ．）ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４５：４１８５−４１９１（１９９０））。ｃＡ２のＴＮＦ誘導ＩＬ−６分泌を阻止または中和する能力を、培養ヒト二倍体ＦＳ−４繊維芽細胞を用いて評価した。表１の結果は、ｃＡ２がＴＮＦと一晩インキュベートされた細胞におけるＩＬ−６分泌を遮断する時に効果的であったことを示す。ＴＮＦ誘導ＩＬ−６分泌は、ｍＡｂの非存在下または不適当な抗原に特異的な対照ｍＡｂの存在下で阻止された。値は、二連のウェルのＩＬ−６の平均濃度を、ｎｇ／ｍｌで表している。ＲｈＴＮＦ（日本、大阪、サントリー製）を、４μｇ／ｍｌ抗体共存または無しで、ＦＳ−４繊維芽細胞の培養物に添加し、１８時間後、ＱＵＡＮＴＩＫＩＮＥＨｕｍａｎＩＬ−６イムノアッセイ（ミネソタ州、ミネアポリス、アールアンドディーシステム（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ）製）を用いて、上清をＩＬ−６についてアッセイした。対照ｍＡｂ＝キメラネズミ／ヒトＩｇＧ１抗血小板ｍＡｂ（７Ｅ３）。ＴＮＦの、内皮細胞（ＥＣ）の凝血促進性および接着分子活性を活性化する能力は、病理学病態生理学の重要な構成要素である。特に、これは血管障害と関連し、散在性血管内凝固、敗血症症候群と関連する重症の低血圧と関連する。したがって、ｃＡ２の、培養ヒト請帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）のＴＮＦ誘導活性化を遮断する能力を評価した。凝血促進活性のＴＮＦ刺激は、インタクト培養ＨＵＶＥＣ細胞をＴＮＦ（抗体ありまたは無し）に４時間さらし、ヒト血漿凝固アッセイで細胞溶解物を分析することにより決定した。表２中の結果は、期待されたＴＮＦによるＨＵＶＥＣ凝血促進活性の上昇制御を示す（減少した凝固時間により反映）。キメラ抗体ｃＡ２は、用量依存様式においてこのＴＮＦ活性を効果的に阻止または中和した。凝血促進活性を刺激するのに加え、ＴＮＦも、ＥＬＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１などの内皮細胞接着分子の表面発現を誘導する。ｃＡ２の、ＴＮＦのこの活性を阻止または中和する能力を、ＥＬＡＭ−１特異的検出ラジオイムノアッセイを用いて測定した。培養ＨＵＶＥＣを、抗体ありまたは無しで、２５０μｇ／ｍｌのｒｈＴＮＦ（日本、大阪、大日本製）で、９６ウェルプレート形式で３７℃で一晩刺激した。ＥＬＡＭ−１の表面発現を、続くマウス抗ヒトＥＬＡＭ−１ｍＡｂおよび¹²⁵Ｉ標識ウサギ抗マウス免疫グロブリン２次抗体の培養プレートへの４ ℃での添加により決定した。ＴＮＦは、培養ＨＵＶＥＣ細胞の表面でのＥＬＡＭ−１の発現を誘導し、この活性はｃＡ２による用量関連様式で再び効果的に遮断された。結局、ＴＮＦが培養繊維芽細胞において、細胞分裂促進活性を刺激することは公知である。キメラＡ２は、ヒト二倍体ＦＳ−４繊維芽細胞培養物のＴＮＦ誘導細胞分裂促進を阻止または中和し、広範囲のｉｎｖｉｔｒｏＴＮＦ生物学的活性に対するｃＡ２の強い阻止および／または中和能力を確認した。実施例ＸII−ｃＡ２ｍＡｂ試薬により認識されるヒトＴＮＦα上のアミノ酸配列（エピトープ）の決定以下の試薬は、市販源から難なく入手できる。ＦＭＯＣ−Ｌ−Ａｌａ−ＯＰｆｐ、ＦＭＯＣ−Ｌ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＰｆｐ、ＦＭＯＣ−Ｌ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＰｆｐ、ＦＭＯＣ−Ｌ−Ｇｉｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＰｆｐ、ＦＭＯＣ− Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＰｆｐ、ＦＭＯＣ−Ｇｌｙ−ＯＰｆｐ、ＦＭＯＣ−Ｌ−Ｈｉｓ（Ｂｏｃ）−ＯＰｆｐ、ＦＭＯＣ−Ｉｌｅ−ＯＰｆｐ、ＦＭＯＣ−Ｌ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＰｆｐ、ＦＭＯＣ−Ｌ−Ｌｅｕ−ＯＰｆｐ、ＦＭＯＣ−Ｌ−Ａｓｎ− ＯＰｆｐ、ＦＭＯＣ−Ｌ−Ｐｒｏ−ＯＰｆｐ、ＦＭＯＣ−Ｌ−Ｇｉｎ−ＯＰｆｐ、ＦＭＯＣ−Ｌ−Ａｒｇ（Ｍｔｒ）−ＯＰｆｐ、ＦＭＯＣ−Ｌ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＤｈｂｔ、ＦＭＯＣ−Ｌ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＤｈｂｔ、ＦＭＯＣ−Ｌ −Ｖａｌ−ＯＰｆｐ、ＦＭＯＣ−Ｌ−Ｔｒｐ−ＯＰｆｐ、ＦＭＯＣ−Ｌ−Ｔｒｙ（ｔＢｕ）−ＯＰｆｐ、および１−ヒドロキサ−フベノトリアゾール（ｆｂｅｎｏｔｒｉａｚｏｌ）（ＨＯＢＴ）は、ケンブリッジリサーチバイオケミカルズ（ＣａｍｂｒｉｄｇｅＲｅｓｅａｒｃｈＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）から得た。ピペリジンは、アプライドバイオシステムズ社（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＩｎｃ．）から得た。１−メチル−２−ピロリジノン（ＮＭＰ）は、イーエムサイエンス（ＥＭＳｃｉｅｎｃｅ）から得た；メタノールはジェイティーベーカー（ＪＴＢａｋｅｒ）から；無水酢酸はアプライドバイオシステムズ社から；トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）はアプライドバイオシステムズ社から；ジイソプロピルアムン（ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌａｍｎｅ）（ＤＩＥＡ）、トリエチルアミン、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）およびアニソールはアルドリッチ（Ａｌｄｒｉｃｈ）から、塩酸（ＨＣｌ）はジェイティーベーカーから得た。略語：ＦＭＯＣ、９−フルオレニルメトキシカルボニル；ｔＢｕ、ｔ−ブチルエーテル；ＯｒＢ、ｔ−ブチルエステル；Ｂｏｃ、ｔ−ブチルオキシカルボニル；Ｍｔｒ、４−メトキシ−２，３，６−トリメチル−ベンゼンスルホニル；Ｔｒｔ、トリチル；ＯＰｆｐ、ペンタフルオロフェニルエステル；ＯＤｈｂｔ、オキソ−ベンゾトリアゾンステル（ｓｔｅｒ）。ｃＡ２と命名された、本発明のキメラ抗体を用いて、エピトープマッピングにより、ＴＮＦアミノ酸配列のどの部分が抗体による阻止結合に伴われているかを決定し、それにより、ｃＡ２により認識されるＴＮＦ−αのアミノ酸配列を同定した。ヒトＴＮＦαの完全な一次配列は、Ｎａｔｕｒｅ３１２：７２４−７２９（１９８４）に開示されている。２番目のアミノ酸毎に始まり、ヒトＴＮＦ−αの全アミノ酸配列をカバーする重複するデカペプチドを、ジセン（Ｇｙｓｅｎ）の方法（ジセンら，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：ＣｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ，ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆｔｈｅＴｗｅｌｆｔｈＡｍｅｒｉｃａｎＰｅｐｔｉｄｅＳｙｍｐｏｓｉｕｍ，５１９−５２３頁，マーシャル（Ｇ．Ｒ．Ｍａｒｓｈａｌｌ）、エスコム（Ｅｓｃｏｍ）、レイデン（Ｌｅｉｄｅｎ）版）を用いて、ポリエチレンピン上に合成した。遊離Ｎ末端アミノ基およびアセチル化Ｎ末端アミノ基を有するペプチドピンのセットを、個々に調製した。後記のように、ペプチドピンの両セットを、抗ＴＮＦｍＡｂｃＡ２を含んでいる溶液中でインキュベートし、ヒトＴＮＦ−α上のｃＡ２エピトープを構成するアミノ酸配列を決定した。Ｏ．Ｄ．（光学密度（ｏｐｔｉｏｎａｌｄｅｎｓｉｔｙ））は、ｃＡ２結合の増加の程度と直接関連する。この競合結合実験は、ｃＡ２への非特異的結合を示すことができるペプチドを線引きする。ｃＡ２により認識される少なくとも２つのＴＮＦ−αの非隣接ペプチド配列がある。Ｎ末端アミノ酸が１番である通常の蛋白質番号付けシステムを用いて、ｃＡ２ｍＡｂは、少なくともＴＮＦの８７〜１０８番目の残基または５９〜８０番目および８７〜１０８番目の残基の両方に位置するアミノ酸の一部に構成されるエピトープを認識する。期待とは違い、例えば、ｈＴＮＦαの１１〜１３、３７〜４２、４９〜５７または１５５〜１５７の１以上を含んでいてもよい、推定受容体結合部位に結合することなく、ｍＡｂｃＡ２は、ＴＮＦ−αの作用を遮断した。好ましい抗ＴＮＦｍＡｂは、これらのペプチド配列の１以上に結合する能力の利点により、ヒトＴＮＦ−αの受容体へのこの結合を阻止するものである。これらの抗体は、ＣＡ２エピトープへの結合の利点により、ＴＮＦの活性を遮断でき、かかる結合はＴＮＦ活性を阻止することを立証する。ｃＡ２により認識されるこれらのペプチド配列の同定は、この適用の態様と並行する結合特性および治療上の利用性を有する追加のｍＡｂを作製するのに必要な情報を提供する。ペプチドピン合成ケンブリッジリサーチバイオケミカルズ社（ＣＲＢ）から購入したエピトープマッピングキットを用いて、ヒトＴＮＦ−αの全配列に対応するドデカペプチドをポリエチレンピン上に合成した。合成スケジュールは、ＣＲＢエピトープマッピングソフトウェアーを用いて行なった。最初のアミノ酸カップリングの前に、ピンをＮＭＰ溶液中２０％ピペリジンで３０分間室温で脱保護した。脱保護した後、ピンをＮＭＰで室温で５分間洗浄し、つぎにメタノールで３回洗浄した。洗浄工程の後、ピンを少なくとも１０分間風乾させた。以下の方法を、各カップリングサイクルについて行なった。１）合成スケジュールに必要とされる重量にしたがって、アミノ酸誘導体およびＨＯＢＴを計量した。２）合成スケジュールにしたがって、ＨＯＢＴを適当な量のＮＭＰに溶解させた。３）アミノ酸誘導体を推奨される量のＨＯＢＴ溶液に溶解させ、１５０マイクロリットルを、合成スケジュールのウェルポジションシートにより指示された適当なウェルにピペッティングした。４）ピンを含むブロックをウェル中に置き、「サンドイッチ」ユニットを３０ ℃のウォーターバス中のプラスチックバッグに１８時間保存した。５）ピンをウェルから除き、ＮＭＰで１回（５分間）、メタノールで３回（２分間）洗浄し、１０分間風乾させた。６）ピンを前記したように脱保護し、方法を繰り返した。ピンの１つのブロック上のペプチドをアセチル化するために、ペブチドピンを洗浄し、脱保護し、ＮＭＰ；無水酢酸：トリエチルアミン（５：２：１）を含む１５０マイクロリットルの溶液で３０℃で９０分間処理し、つぎに前記概説した洗浄方法を行なった。ペプチドピンの２番目の組を、アセチル化しないことにより脱保護し、遊離のＮ末端アミノ基を得た。側鎖保護基を除去するペプチドの最終脱保護を、ＴＦＡ：アニソール：ジチオスレイトール、９５：２．５：２．５（ｖ／ｖ／ｗ）の混合物を用いて、４時間室温で行なった。脱保護後、ピンを１０分間風乾させ、つぎに、メタノール／蒸留水（１：１）中０．１％ＨＣｌ溶液中で１５分間超音波処理を行なった。ピンを一晩乾燥させ、つぎに試験のために準備した。ＴＮＦ−αペプチドピンへのｃＡ２結合についてのＥＬＩＳＡアッセイ試薬：ディスラプション緩衝液リン酸二水素ナトリウム（３１．２ｇ、シグマ（Ｓｉｇｍａ）製カタログ番号Ｓ−０７５１または同等物）およびドデシル硫酸ナトリウム（２０．０ｇ、シグマ製カタログ番号Ｌ−３７７１または同等物）を、２．０ＬのミリＱ水に溶解させた。ｐＨを５０％ｗ／ｗ水酸化ナトリウム（ＶＷＲ製カタログ番号ＶＷ６７３０−３または同等物）で７．２±０．１に調整した。ブロッキング緩衝液リン酸二水素ナトリウム（０．３９ｇ、シグマ製カタログ番号Ｓ−０７５１または同等物）、リン酸水素二ナトリウム（１．０７ｇ、ベーカー製カタログ番号３８２８−１または同等物）および塩化ナトリウム（８．５０ｇ、ベーカー製カタログ番号３６２４−５または同等物）を、１．０ＬのミリＱ水に溶解させた。ｐＨを５０％ｗ／ｗ水酸化ナトリウム（ＶＷＲ製カタログ番号ＶＷ６７３０−３または同等物）で７．２±０．１に調整した。ニワトリタマゴアルブミン（１０．０ｇ、シグマ製カタログ番号Ａ−５５０３または同等物）およびウシ血清アルブミン（１０．０ｇ、シグマ製カタログ番号Ａ−３２９４または同等物）を、穏やかに攪拌しながら室温で溶解させた。溶液をろ過し、溶液にＴｗｅｅｎ２０（２．０ｍｌ、シグマ製カタログ番号Ｐ−１３．７９または同等物）を添加した。溶液を室温で３０分間穏やかに攪拌し、ろ過し、４０℃で保存した。ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０１０×濃縮物は、リン酸二水素ナトリウム（３．９０ｇ、シグマ製カタログ番号Ｓ−０７５１または同等物）、リン酸水素二ナトリウム（１０．７０ｇ、ベーカー製カタログ番号３８２８−１または同等物）および塩化ナトリウム（８５．０ｇ、ベーカー製カタログ番号３６２４−５または同等物）を、１．０ＬのミリＱ水に溶解させることにより調製した。ｐＨを５０％ｗ／ｗ水酸化ナトリウム（ＶＷＲ製カタログ番号ＶＷ６７３０または同等物）で７．２±０．１に調整した。溶液にＴｗｅｅｎ２０（５．０ｍｌ、シグマ製カタログ番号Ｐ−１３７９または同等物）を添加し、混合物を穏やかに攪拌した。使う直前に、１００ｍＬのこの溶液をミリＱ水で１．０Ｌに希釈した。基質溶液クエン酸（４．２０g、マリンクロット（Ｍａｌｉｎｃｋｒｏｄｔ）製カタログ番号０６２７または同等物）およびリン酸水素二ナトリウム（７．１０ｇ、ベーカー製カタログ番号３８２８−１または同等物）を１．０ＬのミリＱ水に溶解させることにより、基質緩衝液を調製した。ｐＨを５０％ｗ／ｗ水酸化ナトリウム（ＶＷＲ製カタログ番号ＶＷ６７３０−３または同等物）で５．００に調整した。使用直前に、ＯＰＤ基質タブレット（３０ｍｇ、シグマ製カタログ番号Ｐ− ８４１２または同等物）、および３０％（ｖ／ｖ）過酸化水素（４０μＬ、シグマ製カタログ番号Ｐ−１３７９または同等物）を基質緩衝液２５．０ｍＬに添加した。溶液をホイルでラップし、徹底的に混合した。４ＮＨ₂ＳＯ₄ 硫酸（５３ｍＬ、イーエムサイエンス（ＥＭＳｃｉｅｎｃｅ）製カタログ番号ＳＸ１２４４−５または同等物）を、ゆっくりとミリＱ水（４４７ｍＬ）に添加し、使用前に室温まで冷やした。装置ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓＭｏｄｅｌｎｕ−ｍａｘプレートリーダーまたは同等物。ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＰｒｏｄｕｃｔｓＭｏｄｅｌＲ４１４０Ｏｓｃｉｌｌａｔｉｎｇ卓上シェーカーおよび同等物。ＢＲＡＮＳＯＮＭｏｄｅｌ５２００超音波バスまたは同等物。ＦＩＮＮＰＩＰＥＴＴＥＭｏｄｅｌ４１７２３１７マルチチャンネルピペッターまたは同等物。ＣＯＲＮＩＮＧＭｏｄｅｌ２５８０１９６ウェル使い捨てポリスチレンＥｌｉｓａプレート。使用前および各その後の使用後、ペプチドピンを以下の方法を用いて清掃した。ディスラプション緩衝液（２．０Ｌ）を６０℃に加熱し、防煙フード中の超音波バス中に置いた。ディスラプション緩衝液に、ジチオールスレイトール（２．５ｇ、シグマ製カタログ番号Ｄ−０６３２または同等物）を添加した。ペプチドピンをこの媒体中で３０分間音波処理し、ミリＱ水（ｗａｓｔｅｒ）で徹底的に洗浄し、沸騰エタノールバス中で２分間懸濁し、風乾した。ブロッキング緩衝液（２００μＬ）を、９６ウェル使い捨てポリスチレンＥｌｉｓａプレートに添加し、ペプチドピンをウェル中で懸濁した。ペプチドピンおよびプレートを振動卓上シェーカーで室温で２時間インキュベートした。プレートおよびペプチドピンをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄した（４回）。各ウェルに、２０μｇ／ｍｌの濃度のｃＡ２抗体（ブロッキング緩衝液で希釈、１７５μ Ｌ／ウェル）を添加した。ＴＮＦ競合は、ＢＳＡ／卵白アルブミン／ＢＢＳ中で室温で３時間、ＴＮＦα（４０μｇ／ｍｌ）およびｃＡ２（２０μｇ／ｍｌ）のインキュベーションにより行なった。ペプチドピンをプレートに懸濁し、４℃で一晩インキュベートした。ペプチドピンおよびプレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄した（４回）。各ウェルに、セイヨウワサビペルオキシダーゼに結合させた抗ヒトヤギ抗体（ブロッキング緩衝液で１／２０００に希釈、１７５μＬ／ウェル、ジャクソンイムノリサーチラブス（ＪａｃｋｓｏｎＩＭＭＵＮＯＲＥＳＥＡＲＣＨＬａｂｓ）製）を添加した。ペプチドピンを、プレート中で懸濁し、振動卓上シェーカーで室温で１時間インキュベートした。プレートおよびペプチドピンをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄した（４回）。各ウェルに、新鮮に調製された基質溶液（１５０μＬ／ウェル）を添加し、ペプチドピンをプレート中に懸濁し、振動卓上シェーカーで室温で１時間インキュベートした。ペプチドピンを除き、各ウェルに４ＮＨ₂ＳＯ₄（５０μＬ）を添加した。プレートをＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓプレートリーダーで読んだ（４９０ｎｍ、６５０ｎｍをブランクとして引く）。実施例ＸIII−ＴＮＦペプチド断片を用いたマウス抗ヒトＴＮＦｍＡｂの生産メスＢＡＬＢ／ｃマウスを、前記で示したように、等量のＦｒｅｕｎｄ完全アジュバント（ディフコラボラトリーズから得た）で乳化されて０．４ｍｌにした、（配列番号：１の）ＴＮＦの非隣接配列５９〜８０番目、８７〜１０８番目の残基または５９〜８０番目および８７〜１０８番目の両方の残基内に位置する少なくとも５アミノ酸の抗ＴＮＦエピトープを含む４０μｇの精製大腸菌由来組み換えヒトＴＮＦ（ｒｈＴＮＦ）断片を、前記実施例１のように、皮下および腹膜内（ｉ．ｐ．）注射し、マウスに入る。１週間後、５μｇのＦｒｅｕｎｄ不完全アジュバント中のこれらのｒｈＴＮＦ断片のブースター注射をｉ．ｐ．にし、つぎに、４回の連続的なアジュバント無しの（配列番号：１の）ｈＴＮＦαの５９〜８０番目の残基、８７〜１０８番目の残基または５９〜８０番目および８７〜１０８番目の両方の残基由来のアミノ酸を含有する抗ＴＮＦエピトープを含む１０μｇのＴＮＦ断片のｉ．ｐ．注射を行なう。最終注射の８週間後、マウスを１０μｇのＴＮＦでｉ．ｐ．ブーストする。４日後、マウスを殺し、脾臓を得て、脾臓細胞懸濁物を調製する。脾臓細胞を非分泌ハイブリドーマ、Ｓｐ２／０（ＡＴＣＣＣＲＬ１５８１）と、脾臓細胞対ＳＰ２／０細胞が４：１の比で、０．３ｍｌの３０％ポリエチレングリコール、ＰＥＧ１４５０の存在下で、融合させる。３７℃で６時間のインキュベーション後、融合細胞を、ウェルあたり２×１０⁴個のＳｐ２／０細胞の濃度で９６ウェルプレート中に、０．２ｍｌのアリコートに分配する。支持細胞を、５×１０⁴個の正常ＢＡＬＢ／ｃ脾臓細胞の状態で、各ウェルに添加する。用いた生育培地は、ＲＰＭ１−１６４０培地、１０％熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（ハイクローン製）、０．１ｍＭＭＥＭ非必須アミノ酸、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、２ｍＭＬ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（ギブコラボラトリーズ製）、および、選択のため、ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン（ＨＡＴ）（ベーリンガーマンハイム製）からなっていた。固相ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）を、（配列番号：１の）ｈＴＮＦαの５９〜８０番目の残基、８７〜１０８番目の残基または５９〜８０番目および８７〜１０８番目の両方の残基の部分を含むｒｈＴＮＦα断片に対して特異的なｍＡｂの存在について上清をスクリーニングするために行なう。このアッセイは、前記、実施例IIに記載されている。このアッセイのバックグランド結合は約５００ｃｐｍである。上清は、２０００ｃｐｍ以上の結合が得られた場合、陽性であると見なす。スクリーニグした上清のうち、１以上の陽性上清が、ＲＩＡにより慣例的に同定される。これらの陽性上清のうち、最大の結合を有するもの（より高いｃｐｍ値により示される）を、マウス支持細胞に限界希釈でサブクローニングする。さらなる中和アッセイにおける上清の分析で、慣例的に１以上の抗体が、強い阻止および／または中和活性を有することがわかる。つぎに、これらの陽性ならびに阻止および／または中和ハイブリドーマ株を選択し、１０％ＦＢＳ（ギブコ製）、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、２ｍＭＬ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマシンを含むＲＰＭ１−１６４０培地中で維持する。実施例ＸIV−ＴＮＦペプチド由来ネズミおよびキメラ抗体、断片および領域の産生前記実施例IV〜IXで示されたように、ネズミおよびキメラ抗体、断片および領域を、実施例ＸIVで得た抗体のマウス可変領域およびヒト定常領域をコードするキメラ発現ベクターの構築により得る。得られたキメラＡ２抗体は、プロテインＡセファロースクロマトグラフィーにより、組織培養上清から精製する。上清を、０．１ＭＴｒｉｓ、０．００２ＭＥＤＴＡ、ｐＨ８．０に調整し、同緩衝液で平衡化させたプロテインＡセファロースカラムに負荷する。つぎに、ＩｇＧを、０．１Ｍクエン酸塩、ｐＨ３．５で溶出し、１ＭＴｒｉｓで中和し、リン酸緩衝液生理食塩水（ＰＢＳ）中で透析する。精製ネズミおよびキメラ抗体、断片および領域を、結合ならびに阻止および／または中和活性について評価する。関節リウマチ患者へのｃＡ２の複数回投与再治療プログラムは、ｃＡ２での開放性標識試行からの関節リウマチ患者１、２、３、５、７、８、９および１０を含んでいた。患者は、開放性試行における完全注入プロトコールがサイクル１である、４サイクルまでの治療を受けた。サイクル２〜４の時期は、前サイクルへの応答の喪失で定義される、症状の再発により指示された。ほとんどのサイクルは、再発の５週間以内に投与されたが、サイクル２は４人の患者で投与理由に対して遅らせた。８人の患者は再治療プログラムに参加したが、患者５は、サイクル２中の有害な結果のための離脱のため応答の分析から除外した（後記参照）。３人の患者は、サイクル２後離脱した。それゆえ、応答データは、サイクル１および２については７人の患者から、サイクル３については５人、サイクル４については４人からである。症状再発期間を含む、観察の全期間は、１７〜１０８週間まで多様であった。ｃＡ２を、２〜３時間かけて静脈内注入により投与した。投与は、サイクル１で３０ｍｇ／ｋｇ（２回または４回の投与）およびサイクル２〜４について単回注入での１０ｍｇ／ｋｇであった。患者は、サイクル１について一晩許可されたが、その後、昼間の場合として治療された。サイクル１および２の間の症状再発後のいくつかの変更：患者３は、１週間増加したペドニソロンの投与を受けた；患者５は、メチルプレドニソロンの単回関節内注射を受けた；患者８および１０は、非ステロイド系抗炎症剤を止めた、を除いては、他の薬剤を、サイクル１の開始から安定投与で維持した。開放性試行におけるように、いかなる経路による追加のステロイドも、研究の間禁止したが、ありふれた鎮痛剤は自由に許容した。応答の第一段階の測定は、多可変ポーラス指数であって、２つのレベル（ポーラス２０％および５０％）で計算し、変更して集められたデータの形式に適応させた。実験室測定は、赤血球沈降速度（ＥＳＲ、Ｗｅｓｔｅｒｇｒｅｎ）、Ｃ反応性蛋白質（ＣＲＰ、比濁速度）および前記のように測定された自己抗体を含んでいた。ヒト抗キメラＡ２抗体応答（ＨＡＣＡｓ）を、２重抗原酵素イムノアッセイを用いて測定した。リウマチ因子抗Ｆｃ抗体による誤差のあるシグナルを、共有重合ヒトＦｃのＨＡＣＡ試料希釈物への添加により除いた。２００ｎｇ／ｍＬ以上のｃＡ２を含んでいる試料（遊離ｃＡ２に対する個別アッセイ）を、ＨＡＣＡに対して誤差のない結果を与えそうだと考え、分析から不適とした。応答の程度を維持しながら、各患者は、サイクル１処置への応答を達成し、サイクル２〜４後の反復応答を示した。例えば、膨張関節数およびＣＲＰ等の、個々の症状活性の評価における最大改善の中央値は、各サイクル後８０％を超えた（データは示されていない）。各サイクル前の膨張関節数および各サイクル後の最高の評価の中央値（四分位数間領域）は：（前、後）サイクル１、２１（１６〜２５）、３（０〜３）（Ｗｉｌｃｏｘｏｎの徴候評価試験によりｐ＝０．０１１）；サイクル２、１６（８〜２１）、２（０〜４）（ｐ＝０．０１１）；サイクル３、８（６．５〜１８．５）、１（１〜３）（ｐ＝０．０３）；およびサイクル４、１１（１０．３〜１４．８）、２（２〜６．５）（ｐ＞０．０５）であった。ＣＲＰに対する同等のデータは：サイクル１、３１ｍｇ／Ｌ１０〜４４、正常＜１０ｍｇ／Ｌ）、０（０〜５）（ｐ＝０．０１１）；サイクル２、４９（２４〜６２）、３（２〜７）（ｐ＝０．０１１）；サイクル３、３９（２４〜６９．５）、０（０〜１７．．５）（ｐ＝０．０３）：およびサイクル４、４０．５（１１．５〜１２５）、５（０〜６５．５）（ｐ＞０．０５）であった。４つのサイクル全部を完成した患者における応答の全体のパターンは、図１に示されている。示すように、膨張関節数およびＣＲＰにおいて同等の変化があった。応答期間中の可能な変化の分析を、サイクル３〜４における投与の減少およびサイクル１における複数分割投与注入からその後の単回注入への変化により複雑にした。個々の患者は、様々な応答パターンを示したが（図２）、全体として、期間は、成功したサイクルで短くなる傾向があった。サイクル１における２０ｍｇ／ｋｇのｃＡ２での処置後の中央値ポーラス２０％応答期間は１２週間であった（四分位数間領域８〜１７．４）。サイクル２〜４についての同等の値（患者がこの投与の半分を受けたとき）は、９．１週間（１〜１９．１）、８．３週間（３．２〜１２．５）、および７．７週間（１．６〜１５．２）（Ｆｒｉｅｄｍａｎ試験、反復したＷｉｌｃｏｘｏｎの徴候評価試験および直線回帰によりサイクル１と比較してｐ＞０．０５）であった。２つの例外があるが、４１回の注入を本研究において投与し、よく耐えさせた。患者５は、サイクル２における予定のｃＡ２投与の１％のみの投与後に離脱させた。これは、血管迷走神経性失神の発現、続いて、外傷性静脈穿刺にしたっがていた。患者９は、サイクル４の間に、熱、頭痛、一過性顔面紅潮を起こしたが、症状に関して治療し、離脱しなかった。合理的にｃＡ２と関連があると考えられる他の有害な事象は、表に概略されている。３つの事象は、早期離脱の警告を与えた（患者１、７および１０）。４人の患者は、最終注入後少なくとも６週間試験したとき、ＨＡＣＡ応答を有していなかった。残りの４人の患者は、再治療後様々なときにＨＡＣＡを発生し（患者３、１、５および９それぞれにおいて、力価１０、２０、８０および６４０）、全てｃＡ２のネズミ可変領域に特異的であった。これらのうち、２人の患者は全４サイクルを完了し、１人は２サイクルを完了し、１人はサイクル２中に離脱した。ＨＡＣＡを有する幾人かの患者は、サイクル２〜４における応答期間の減少を示した。他の患者においては、しかしながら、明白な関係は確実ではなかった。患者９は、サイクル２後、高い力価のＨＡＣＡ（６４０）を発生したが、８．７週間のサイクル３の応答期間は、サイクル１の期間（８週間）と相違がなかった。逆に、患者８ではＨＡＣＡは検出されなかったが、応答期間はサイクル１における１７．４週間からサイクル３における８．３週間に減少した。データは、関節リウマチの拡大を有する患者をｃＡ２で好結果に制御できることを示し、病院への入院、コルチコステロイドの高投与または細胞傷害性治療などの典型的な処置に選択肢を提供する。再治療前の症状の再発に対する要求は、困難な治療上の挑戦を提供する。このことにも関わらず、応答は、炎症の臨床上および実験室的測定における印象的な改良で、各患者／サイクル後達成された。同じ個体における反復応答を行なうときの成功は、ｃＡ２での標準的な治療が長期の症状抑制を達成することができることを示した。有害な結果は、７人の患者中３人における抗核抗体の発生を含んでいた。これらの発見の２つは特異的自己抗体と関連がないにも関わらず、患者１０はサイクル１後有意な力価のｄｓＤＮＡおよびカルジオリピン抗体を発生し、サイクル２後さらなる力価の上昇を示した。全身性の紅斑性狼瘡の臨床上の特徴は発生しなかったにもかかわらず、研究から離脱した。慎重なアプローチが、軽症の感染事象に対して採用され、静脈洞炎の発生後患者７を離脱させた。ｃＡ２の反復使用におけるさらなる実験で、より低い脱落率が達成された。最初の開放性標識試行において２０人の患者の内１人のみが抗グロブリン応答を発生し、ｃＡ２が本質的に免疫原性でないことが示された。ｃＡ２のネズミ部分に特異的なＨＡＣＡは、結局再治療プログラムにおいて半分の患者で検出された。これらは最も低い力価で、２人の患者はそれらの存在にもかかわらず好結果で再治療された。同様の抗グロブリン応答は、ＣＤ２５２に対するヒト化モノクローナル抗体の反復注入で治療された４人の関節リウマチ患者の３人において見られ、抗体再形成は全く免疫原性を排除しないことが示された。均等物当業者であれば、単なる日常的実験手法により、本明細書に記載された発明の具体的態様に対する多くの均等物を認識し、あるいは確認することができるであろう。そのような均等物は下記クレームに記載されるような本発明の範疇に含まれるものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＡ６１Ｋ 39/395 ＡＥＡＡ６１Ｋ 39/395 ＡＥＡＮＣ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/08 15/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ 15/09 15/00 ＣＣ１２Ｐ 21/08 Ａ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者メイニ，ラビンダーナス英国ロンドンエスダブリュー13 ９イーダブリュー，バーネス，キャッスルノー 151 (72)発明者ウッディー，ジェイムスエヌ. アメリカ合衆国ペンシルバニア 19382 ウェストチェスター，ナンバー331 ウェストチェスターパイク 1512

Claims

【特許請求の範囲】１．複数回の用量の抗ＴＮＦ抗体を投与することを含む、ＴＮＦ介在性疾患を有する個体におけるＴＮＦ介在性疾患の再発の治療または予防方法であって、第２回目のまたはその後の投与が、該疾患の再発期または再発前に行なわれる、治療または予防方法。２．ＴＮＦ介在性疾患が、自己免疫疾患、急性または慢性免疫疾患、細菌感染症、ウイルス感染症、寄生虫感染症、炎症性疾患、神経変性疾患、悪性疾患およびアルコール誘発性肝炎からなる群より選ばれる請求項１記載の方法。３．抗ＴＮＦ抗体が、低免疫原性を有するモノクローナル抗体またはその断片である請求項２記載の方法。４．抗ＴＮＦ抗体が、ＴＮＦαに対する高親和性を有する請求項３記載の方法。５．抗体が、キメラ抗体、ヒト化抗体もしくは表面再処理（ｒｅｓｕｒｆａｃｅｄ）抗体またはその断片からなる群より選ばれる請求項４記載の方法。６．抗体が、約８７〜１０８および約５９〜８０からなる群より選ばれるｈＴＮＦαの１以上のアミノ酸と結合する請求項５記載の方法。７．抗体が、Ａ２のエピトープと結合する請求項５記載の方法。８．抗体が、キメラ抗体である請求項５記載の方法。９．抗体が、約８７〜１０８および約５９〜８０からなる群より選ばれるｈＴＮＦαの１以上のアミノ酸と結合する請求項８記載の方法。１０．抗体が、ｃＡ２のエピトープと結合する請求項８記載の方法。１１．抗体が、ｃＡ２である請求項１０記載の方法。１２．個体に複数回の用量の抗ＴＮＦα抗体を投与することを含む、該投与が必要な個体における関節リウマチの再発の治療または予防方法であって、第２回目のまたはその後の投与が、該疾患の再発期または再発前に行なわれる、治療または予防方法。１３．抗ＴＮＦ抗体が、低免疫原性を有するモノクローナル抗体またはその断片である請求項１２記載の方法。１４．抗体が、キメラ抗体、ヒト化抗体もしくは表面再処理抗体またはその断片からなる群より選ばれる請求項１３記載の方法。１５．抗体が、約８７〜１０８および約５９〜８０からなる群より選はれるｈＴＮＦαの１以上のアミノ酸と結合する請求項１４記載の方法。１６．抗体が、Ａ２のエピトープと結合する請求項１４記載の方法。１７．抗体が、キメラ抗体である請求項１４記載の方法。１８．抗体が、約８７〜１０８および約５９〜８０からなる群より選ばれるｈＴＮＦαの１以上のアミノ酸と結合する請求項１７記載の方法。１９．抗体が、ｃＡ２のエピトープと結合する請求項１７記載の方法。２０．抗体が、ｃＡ２である請求項１９記載の方法。２１．複数回の用量の抗ＴＮＦ抗体を投与することを含む、ＴＮＦ介在性疾患を有する個体におけるＴＮＦ介在性疾患の治療方法およびＴＮＦ介在性疾患の再発の治療または再発の予防方法。２２．ＴＮＦ介在性疾患の再発の治療または予防における複数回投与用の医薬の製造に使用する抗ＴＮＦ抗体。２３．抗体が、低免疫原性および高ＴＮＦα親和性を有するモノクローナル抗体またはその断片である請求項２２記載の抗ＴＮＦ抗体。２４．抗体が、キメラ抗体である請求項２３記載の抗ＴＮＦ抗体。２５．キメラ抗体が、ｃＡ２のエピトープと結合する請求項２４記載の抗ＴＮＦ抗体。２６．キメラ抗体が、ｃＡ２である請求項２５記載の抗ＴＮＦ抗体。