CN112725346A - 一种增加尿酸排泄的修饰mRNA序列及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种增加尿酸排泄的修饰mRNA序列及其应用，涉及生物医学技术领域。该ABCG2mRNA能够降低小鼠肾小管上皮细胞(TCMK1)和小鼠血液中的尿酸，具有潜在的抗痛风作用，具有如SEQIDNO.1和2所示序列，具有免疫原性低、易体外合成与修饰等优点。缓解了现有技术中存在的缺少一种能够靶向降低体内血尿酸的技术问题。

Description

一种增加尿酸排泄的修饰mRNA序列及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物医学技术领域，尤其是涉及一种降低尿酸的修饰mRNA及其应用和应用其的方法。

背景技术

痛风(gout)是成年人中最常见的炎症性关节炎，主要由于嘌呤代谢紊乱尿酸生成过多和尿酸排泄减少导致。高尿酸血症(Hyperuricemia)是痛风的生化前体，其定义为正常摄入嘌呤状态下，不同日的空腹血尿酸检测数值两次皆高于正常值上线(男性>416.4μmol/L，女性>356.9μmol/L)。当尿酸钠(MSU)晶体沉积在关节、肌腱、软骨、滑液囊或软组织，严重时会形成痛风石。持续的血清尿酸增长是高尿酸血症的特点，它不仅是与高血压、糖尿病、肥胖、胰岛素抵抗等疾病密切相关的代谢疾病之一，而且还促进尿酸盐晶体在组织中的沉积，引发急性痛风性关节炎、尿路阻塞和胆石症等多种病理状况。急性发作的痛风特征是关节突然发红、发热、疼痛、肿胀，严重影响患者的日常生活。近年来，人们的生活方式发生改变，肥胖和代谢综合征发病率急剧上升，同时也导致高尿酸血症和痛风的发病率逐年增加且患者年龄逐渐年轻化。

高尿酸血症的形成原因主要是尿酸排泄异常导致的尿酸在体内过度堆积。70％-90％的痛风患者是由于尿酸排泄减少导致，其余则因为体内尿酸合成增加导致，且90％-95％的患者为男性。尿酸在人体中主要以游离的尿酸盐形式存在，主要在肝脏合成。体内约60％-70％的尿酸通过尿酸转运蛋白经肾脏排泄，其余主要从肠道排出体外。尿酸盐经肾小球滤过以后，肾近端小管能重吸收约90％，而后再由肾小管分泌排出。

ABC转运蛋白2(ATP-bindingcassettesuperfamilygmember2，ABCG2)是一种容量较高的尿酸盐转运蛋白，主要在肾脏近曲小管刷状缘膜和肠道中表达，促进尿酸的排泄。目前，临床上常用别嘌呤醇(抑制尿酸生成)，苯溴马隆和丙磺舒(促进尿酸排泄)等药物来降低患者的尿酸水平。例如苯溴马隆可以通过作用于肾脏近曲小管，高效可逆的交换尿酸离子阻碍近曲小管重吸收从而达到促进尿酸排泄的作用来降低尿酸水平，但是这些化学药物会引起肝肾损伤和过敏等严重的不良反应。

近年来，在基因治疗方面，新型稳定的mRNA结构的应用越来越广泛，并且比目前常用的质粒DNA表现出更加优越的表达能力。合成并修饰的mRNA可以替代大多数基于DNA的载体应用，并已成功用于蛋白表达、疫苗、分化调控或细胞重编程。体外转录信使RNA(invitrotranscriptionmessenger RNA，IVT mRNA)可以DNA为模板通过体外转录获得。IVTmRNA具有许多优点，首先，它不能整合到宿主基因组中，因此不存在插入突变的潜在危险，而病毒载体和pDNA有几率整合进宿主基因组中发生插入突变的风险；第二，mRNA只需要进入宿主细胞内的细胞质中就可以立刻被翻译成功能蛋白，不需要穿过核膜进入细胞核；第三，对于药物应用而言，mRNA只在细胞中短暂翻译并在可控的时间内通过生理代谢途径降解。

脂质纳米颗粒(Lipid nanoparticles，LNPs)是有效的mRNA载体并已进入临床实验，它可以对mRNA进行浓缩包裹以防止酶的降解，根据需要通过皮下、静脉、腹腔、气管等各种途径递送到动物体内，带正电荷的LNP有利于mRNA定位在带负电荷的细胞膜上，被细胞膜内吞进入细胞质，帮助mRNA在动物体内的器官组织中表达。纳米颗粒粒径小，不会引起免疫反应，可以对同一动物进行多次注射来保持核酸在体内的长时间表达。

因此，筛选出一种可以靶向尿酸排泄的mRNA并且将其应用在抗痛风药物制备、痛风机理研究等，是急待解决和最佳的策略。

有鉴于此，特提出本发明。

本专利将在体外合成设计修饰过的小鼠ABCG2 mRNA，增加它的稳定性和表达能力，利用脂质纳米颗粒包裹后转染到小鼠体内，增加肾脏中ABCG2尿酸盐转运蛋白的数量从而促进尿酸在肾脏中的排泄。为今后临床应用基因治疗痛风，高尿酸血症提供策略。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种增加血尿酸排泄到尿中的合成mRNA分子，可以用于治疗高尿酸血症或相关代谢性疾病的核酸(药物)，缓解了现有技术中存在的缺少一种能够增加血尿酸排泄、治疗高尿酸血症的核酸(RNA)药物的技术问题。

本发明的第二目的在于提供了一种稳定的能在体内有效翻译蛋白且能抗核酸酶降解的mRNA，以便在痛风病模型或治疗痛风研究中能够有效且稳定地降低血尿酸，缓解了现有技术中存在的缺少一种能够有效且稳定的降低体内血尿酸、又无毒副作用的技术问题。

本发明的第三目的在于提供一种利用脂质纳米载体携带该合成的mRNA分子导入体内细胞的方法，缓解了现有技术中存在的缺少一种可以导入大型mRNA分子进入细胞的技术问题。

一种增加尿酸排泄的修饰mRNA，所述mRNA具有如SEQ ID NO.1所示的序列。

进一步的，所述mRNA的编码基因DNA和cDNA。

进一步的，所述mRNA特异地增加肾小球细胞和体内血尿酸的排泄。

进一步的，所述mRNA为人工合成，或任何其他来源的具有同源序列的mRNA。

进一步的，所述人工合成包括体外RNA直接合成或分子生物学方法合成；

优选地，所述分子生物学方法合成为体外转录合成；

优选地，所述体外合成也包括其编码DNA直接导入靶细胞转录。

一种包含上述mRNA的靶向降血尿酸药物研发。

进一步的，所述药物包括：包含所述mRNA或对应的基因DNA。

利用所述mRNA，作为药物在痛风/高血尿酸研究中的使用。

进一步的，药物包含所述mRNA，将细胞与之孵育或导入动物后检测样品中尿酸的的含量。

本发明提供的增加尿酸排泄的mRNA，具有降低体内血尿酸、无免疫原性、易体外合成与修饰等优点。与传统降尿酸药物相比，该mRNA结构简单，易于制备和纯化，无不良反应。比普通mRNA稳定性高，合成成本也比制备普通药物低，周期短。

本mRNA可直接作为抗痛风/降血尿酸的药物，因为当把其导入细胞后能够翻译出ABCG2蛋白，提高肾细胞将尿酸排出体外(尿中)的能力。

本发明提供的增加尿酸排泄的mRNA，经使用多种方法检测证明，如肾小球细胞高尿酸培养、高血尿酸小鼠模型体内实验等，均能把尿酸排出细胞外/血液外，降低了细胞内/体内的尿酸含量；与血尿酸密切有关的小鼠血尿素氮(BUN)、肌酐(SCr)也都降低了，与合成尿酸代谢有关的肝脏嘌呤氧化酶(XOD)变化很小。这说明该mRNA降尿酸效果良好(应有的功能)，而不产生其他副作用，具有优良的抗痛风药物开发前景。

总之，本发明提供的ABCG2 mRNA可以增加肾细胞的外排尿酸作用，降低血中尿酸，因而可以作为抗痛风/高血尿酸疾病的靶向药物。可以用其蛋白，也可用DNA。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明重组质粒pET-28a(+)-ABCG2的构建示意图。

ABCG2的DNA插入到pET-28a(+)载体的多克隆位点BamHI和

Sal I的酶切点上。

图2为本发明重组质粒pET-28a(+)-ABCG2用BamHI和Sal I双酶切后电泳图。结果表明带有5'UTR和3'UTR的ABCG2序列成功插入到pET-28a(+)质粒中。M：GeneRuler DNALadder Mix；1：pET-28a(+)-ABCG2质粒BamH I/Sal I双酶切的DNA片段。

图3为本发明Western Blot检测ABCG2蛋白在转染细胞系TCMK1中的表达。对照组没有转染mRNA；实验组分别转染了0.5μg,1.5μg,2.5μg mRNA。转染48小时后，实验组的蛋白水平依次增加了，GAPDH作为内参对照。

图4为本发明ABCG2 mRNA对体重的影响结果图。

图5为本发明ABCG2 mRNA对高尿酸血症小鼠的肾组织结构的影响结果图，即小鼠肾脏病理学观察图。

图6为本发明ABCG2mRNA在高尿酸血症小鼠肾脏组织中其蛋白ABCG2的表达结果图。(A-B)小鼠肾脏中ABCG2蛋白的组织化学染色(放大200倍)；(C-D)Western bolt分析各组小鼠肾脏中ABCG2蛋白的水平，GAPDH作为内参对照。

图7为本发明ABCG2 mRNA对高尿酸血症小鼠的尿酸影响。

图8为本发明ABCG2 mRNA对高尿酸血症小鼠的血尿素氮(BUN)、肌酐(SCr)、肝脏嘌呤氧化酶(XOD)的影响。

具体实施方式

下面将结合实施例与附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下即可仿照实施，其所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明提供了一种合成、修饰的ABCG2 mRNA，能增加肾细胞排泄尿酸的能力，可降低血尿酸水平。该ABCG2 mRNA具有如SEQ ID NO.2所示序列。

在针对高尿酸血症引起的疾病治疗过程中，常用的药物如苯溴马隆，别嘌呤醇的疗效受到药物剂量不耐受和毒副作用高的限制，使得降尿酸的治疗变得更加棘手。因此，研发新型高效低毒的降尿酸药物对痛风等高尿酸疾病的治疗非常迫切。

肾脏作为尿酸调节的主要器官，对尿酸的排泄处理起着重要的作用，包括肾小球滤过、肾小管再吸收和分泌。研究发现，约90％高尿酸血症的主要原因是肾脏尿酸排泄不足所致。人类的痛风全基因组关联性分析(GWAS)证明了ABCG2基因与痛风密切相关，为痛风易感基因，并定位于染色体4q22～4q23。Woodward等人进一步证实ABCG2蛋白是尿酸盐外排转运蛋白，当通过定点诱变引入常见的SNP rs2231142编码的突变Q141K时，与野生型ABCG2相比，尿酸盐转运速率降低了53％；当发生基因突变或者其他原因导致分泌蛋白表达减少或者重吸收蛋白表达增强时，都会导致尿酸排泄障碍，增加尿酸在体内的累积。因此，ABCG2可作为一个有潜力的治疗痛风靶点。

mRNA在细胞内可翻译出蛋白质，从而弥补一些突变基因或蛋白的不足，因而可以作为生物药物，这就产生了mRNA疗法。所以近年来，mRNA疗法引起了人们的关注。同时也可表达病毒的蛋白，当做疫苗，如新冠病毒COVID-19的mRNA疫苗。mRNA疗法具有诸多优点，例如与转染DNA相比不会引起基因突变，存在时间短暂，减少发生不利影响的可能性。mRNA可以翻译难以制造的蛋白质，并且在药代动力学方面可以通过修饰设计核酸序列为短寿命的蛋白质延长存在时间。

真核生物成熟mRNA结构主要由5部分组成：5’帽子结构，5’UTR，开放阅读框架(ORF)，3’UTR，3’端多聚腺苷酸尾巴poly(A)。本发明使用了RNA帽结构类似物3′-O-Me-m7G(5′)ppp(5′)G，它具有在真核生物mRNA中发现的7-甲基鸟苷和5’-5’三磷酸键，并且用3′-O-Me封闭m7G的3′-羟基确保转录模板的均一性。将120个碱基的poly(A)连接到mRNA的3’UTR，poly(A)结合到与真核起始因子4G(eIF4G)的N末端区域相互作用的聚腺苷酸结合蛋白(PAPB)上，然后与5’cap和eIF4E相互作用。形成cap-eIF4E-eIF4G-PAPB-poly(A)的闭环mRNA结构，防止核酸酶降解来增加稳定性，通过核糖体的再利用提高翻译效率。UTR序列来源于小鼠肌肉中的α球蛋白基因，该序列已被证实具有较强的稳定性并且可以促进ORF序列表达。其5’UTR中包含IVT-FW、T7启动子、与翻译起始因子结合介导翻译起始的kozak序列。末端ATG，消除了ORF对起始密码子的需求。体外转录合成后mRNA最终被脂质纳米颗粒包裹使其在细胞外也可以保持稳定，防止RNA酶的降解，到达肾脏被细胞内吞后释放出mRNA进一步翻译蛋白。

体外转录(in vitro transcription，IVT)mRNA的递送途径可以分为两种，一种是转染IVT mRNA到离体细胞，再将转染成功的细胞回输至患者体内特定位置；另一种是通过直接递送的方式直接将IVT mRNA注射到患者体内，例如静脉注射、肌肉注射等；用于目标蛋白替补或者以T细胞和DC细胞免疫治疗恶性肿瘤和其它传染性疾病。IVT mRNA在基因表达方面由于其优越的安全性和较高的翻译效率而具有较好的应用前景，但是mRNA的稳定性和免疫原性是广泛使用的最大障碍，利用此方法对其进行修饰可以最大限度地解决这些缺点，使其即便在动物体内也可以稳定存在并起始翻译。

本发明综合利用mRNA治疗技术，体外修饰合成小鼠ABCG2 mRNA，封装到脂质纳米颗粒后转染到高尿酸血症模型小鼠体内，在治疗水平上实现了基因向肾脏细胞的传递，成功地证明了ABCG2蛋白在小鼠肾脏中高水平表达并且促进了小鼠尿酸的排泄，降低了小鼠体内的尿酸及尿素氮、肌酐指标水平，对肝脏中XOD活性没有显著影响。高尿酸小鼠肾脏肾小管细胞水肿、炎细胞浸润等病理损伤得到改善，且未发现mRNA药物的毒副作用。这是首次将基因治疗引入高尿酸血症的治疗，为临床治疗高尿酸相关疾病提供了新的策略。

在一个可选的实施方式中，上述ABCG2 mRNA可以直接用作降尿酸/治疗痛风药物。

由于ABCG2 mRNA可以在肾脏细胞内翻译出ABCG2蛋白，而ABCG2蛋白是尿酸的转运体，可以帮助肾细胞排出尿酸。所以ABCG2蛋白表达后，提高了肾脏细胞对血尿酸的排出、进入尿中能力。所以ABCG2蛋白可开发为靶向抗痛风药物。

在一个可选的实施方式中，ABCG2 mRNA可以体外合成，或任何其他来源的具有同源序列的mRNA。

在一个可选的实施方式中，上述人工合成包括体外化学合成或分子生物学方法合成。

由于ABCG2 mRNA是核酸RNA，在体外合成的过程中可以添加修饰物或标签，然后用做降血尿酸药物。

在一个优选的实施方式中，上述分子生物学方法合成为体外转录合成。体外转录快速、简单，成本较低。

在一个优选的实施方式中，上述分子生物学方法合成为可以利用工程菌进行转录。

利用基因工程技术把编码ABCG2 mRNA的DNA序列导入到载体，建立E.coli、酵母等工程菌进行转录，纯化后作为药物使用。

在一个优选的实施方式中，ABCG2 mRNA也可利用体外翻译系统合成ABCG2蛋白，或者直接合成该蛋白，然后导入到病人体内。

根据ABCG2 mRNA的序列，可以很容易的推导出对应蛋白ABCG2蛋白的序列。利用多肽合成仪，即可以合成ABCG2蛋白，然后导入到病人体内发挥功能。这也是药物治疗的一种方式。

在一个可选的实施方式中，ABCG2 mRNA可以应用于降低血尿酸的其他疾病或动物模型研究中。

诸多研究证明，血尿酸升高除了与痛风性关节炎有关外，还与多种疾病的发生相关，例如与高血压、糖尿病、肥胖、胰岛素抵抗、尿路阻塞和胆石症等疾病密切相关。ABCG2mRNA可以降低血尿酸。因此，ABCG2成为降尿酸的靶向治疗分子靶点，提高ABCG2 mRNA的表达在临床降血尿酸应用中有着广泛的前景。所以，本发明合成并修饰了ABCG2 mRNA，以便开发新的靶向降血尿酸药物。

下面结合优选实施例对本发明做进一步的说明。

实施例1构建携带ABCG2DNA序列的重组质粒pET-28a(+)-ABCG2从NCBI中查得小鼠ABCG2的DNA序列，设计添加5'UTR和3'UTR，其中包含T7启动子、Kozak序列，并分别添加BamHI和Sal I酶切位点。序列由上海生工公司合成。将合成序列和pET-28a(+)质粒同时利用BamH I和Sal I进行双酶切。50μL酶切体系为BamHI 1μL(10U·μL)，SalI 1μL(10U·μL)，10×K Buffer 5μL，DNA20μL，ddH₂O 23μL。恒温水浴37℃，2h。纯化后利用T4 DNA连接酶将酶切后pET-28a(+)质粒与目的基因片段连接，见图1。

实施例2重组质粒pET-28a(+)-ABCG2的酶切鉴定

将重组质粒采用热激法转化到大肠埃希杆菌DH5α中，均匀涂布于含有卡那霉素的LB筛选平板上，37℃培养过夜。单菌落摇菌扩增提取重组质粒进行双酶切电泳鉴定。结果表明带有5'UTR和3'UTR的ABCG2序列成功插入到pET-28a(+)质粒中。见图2。

实施例3 ABCG2 mRNA的体外转录和Western bolt检测mRNA在TCMK-1细胞中的蛋白表达

以重组质粒pET-28a(+)-ABCG2为模板，PCR扩增目的基因序列作为体外转录的模板DNA。下游引物序列末端增添120个T进行加尾。1.2％的琼脂糖凝胶对PCR产物电泳，利用DNA凝胶提取试剂盒提取纯化目的基因。纯化后的DNA样本送至上海生工公司测序鉴定，确保序列一致并且加尾成功后方可进行体外转录。按照MEGAscript T7 kit说明书中的加帽体系操作，以加上poly(T)尾后的DNA产物为模板在T7 RNA聚合酶的作用下体外转录获得ABCG2 mRNA，使mRNA加上3′-O-Me-m7G(5′)ppp(5′)G RNA帽结构类似物和poly(A)尾。DNA酶处理产物15min去除DNA模板，用Monarch RNA Cleanup试剂盒纯化mRNA。

在接种于六孔板上的小鼠肾小管上皮细胞TCMK-1汇合度达到70％-80％时，用TransIT-mRNA转染试剂每孔分别转染0.5μg、1.5μg、2.5μg mRNA。48h后，吸弃培养液，RIPA裂解液和蛋白酶抑制剂提取细胞总蛋白，BCA法测蛋白浓度。SDS-PAGE电泳分离蛋白质，每孔上样20μg。蛋白质转移到PVDF膜上，5％脱脂奶粉封闭，4℃ABCG2一抗(1:2000)孵育过夜。次日加二抗(1:5000)孵育，TBST洗膜3次后化学发光显影。

Western bolt结果显示，48小时后，与正常对照组相比，mRNA转染组ABCG2蛋白表达随着mRNA转染量增多而逐渐增强，说明体外转录合成的修饰后mRNA能够在细胞中成功表达。见图3。

实施例4 ABCG2 mRNA对高尿酸血症小鼠的尿酸影响

昆明小鼠24只，随机分为四组，空白组(Control)，模型组(Model)，苯溴马隆治疗组(BEN)，mRNA治疗组(mRNA)。空白组小鼠进食正常饲料，其它三组进食造模饲料(含10％酵母粉、0.1％腺嘌呤)，并且给予氧嗪酸钾200mg/(kg·d)灌胃处理，使小鼠体内血清尿酸含量升高。苯溴马隆用药剂量为20mg/(kg·d)，以灌胃的形式给药。mRNA脂质体封装为纳米颗粒，尾静脉注射到小鼠体内，72h一次，剂量2mg/kg，持续28d。记录体重并观察小鼠生长状态。最后一次注射后24h禁食，10h后采尿，眼眶取血，室温静置30min，1500×g离心15min分离血清。小鼠杀死后剪取小鼠肾脏，肝脏，置于组织固定液(常温)和-80℃中保存。

根据测试盒说明书，通过酶比色法检测各组小鼠尿尿酸(UUA)、血清中血尿酸(SUA)。

小鼠尿酸水平如图7所示，模型组小鼠的血尿酸水平(SUA)和尿尿酸(UUA)水平明显高于空白组(P<0.01)，说明高尿酸血症小鼠模型成功建立。用药治疗的两组，血尿酸水平与模型组相比，苯溴马隆治疗组(P＜0.01)和mRNA治疗组(P＜0.01)显示出明显的降尿酸效果；从尿尿酸水平上可以看出mRNA能提升小鼠对尿酸的排泄能力。

实施例5 ABCG2 mRNA对高尿酸血症小鼠的血尿素氮(BUN)、肌酐(SCr)、肝脏嘌呤氧化酶(XOD)的影响。

根据测试盒说明书，酶比色法检测各组小鼠血肌酐、血尿素氮的含量。

肝脏组织按照重量(mg)：体积(μL)＝1：9加入0.9％的生理盐水，冰水浴中机械匀浆，制成10％的匀浆液，3000rpm/min离心10min，取上清液按照黄嘌呤氧化酶测试盒说明酶比色法测定黄嘌呤氧化酶含量。

如图8所示，模型组小鼠相较空白组，BUN水平明显升高(P＜0.01)，表明其难以清除尿素且可能伴有肾脏功能障碍。与模型组相比，两治疗组小鼠BUN水平明显降低(p<0.01)，mRNA治疗组的BUN水平甚至低于正常组，说明mRNA对BUN具有较强的清除作用。SCr水平用于评价肾小球滤过率，肾功能受损时SUA、SCr水平会高于正常值。模型组小鼠的SCr水平显著高于空白组(p<0.01)，提示模型组小鼠肾功能受损。与模型组相比，两治疗组都能显著降低SCr水平(p<0.01)，改善小鼠肾损伤。肝脏中的XOD作用于黄嘌呤使其生成尿酸，与空白组相比，模型组小鼠尿酸生成较多，肝脏的XOD活性明显升高(P＜0.01)。与模型组相比，苯溴马隆抑制XOD活性的效果显著(P＜0.01)，mRNA并不能有效抑制XOD的活性(P＞0.05)。

实施例6 ABCG2 mRNA对小鼠体重的影响

在28天的实验期间，空白组小鼠的体重增长速度略高于其它三组小鼠；苯溴马隆治疗组小鼠逐渐出现食欲不振，精神萎靡，反应迟钝，毛发粗糙且缺乏光泽等现象，治疗后期体重呈现明显下降趋势，提示苯溴马隆药物存在肝肾损伤等副作用；模型组小鼠状态略优于苯溴马隆治疗组，体重缓慢增长；mRNA治疗组小鼠并未出现上述副作用，活泼好动，毛发柔顺有光泽，饮食正常，并未发现明显异常生长状态，最近似于空白对照组。这些说明在毒副作用方面mRNA药物的表现要远优于苯溴马隆。见图4。

实施例7 ABCG2 mRNA对高尿酸血症小鼠的肾组织结构的影响

各组小鼠的肾脏组织用多聚甲醛固定，石蜡包埋，切成2μm厚的切片，烘箱烤干后利用二甲苯脱蜡，无水乙醇脱水，苏木素-依红染色(HE染色)，光镜下观察各组小鼠肾脏组织病理变化。结果显示：空白组小鼠肾脏结构正常，肾小管形态结构清晰完整，上皮细胞排列规则整齐分界明显，间质正常。模型组小鼠细胞排列紊乱，核密，炎细胞浸润，边界不清晰，轻度纤维组织增生，肾小囊边界狭窄，肾小管细胞水肿，管腔变小或消失，间质毛细血管扩张，充血。与模型组相比苯溴马隆和mRNA都能够有效改善肾脏的病理损伤。见图5。

实施例8 ABCG2mRNA在小鼠肾脏组织中其蛋白ABCG2的表达。

石蜡包埋的各小鼠组组织样本切片脱蜡水化。用3％H₂O₂的封闭通透液封闭内源性过氧化物酶30min，PBS冲洗三次，微波炉中高温修复抗原决定簇。室温下加入血清封闭非特异性蛋白，然后加ABCG2一抗(1：200)室温孵育1h后4℃过夜，次日恢复到室温加二抗孵育。PBS冲洗5次，快速滴加DAB显色，PBS冲洗后滴加苏木素复染，分步脱水后封片，置于镜下观察。ABCG2蛋白主要表达在肾小管上皮细胞刷状缘膜上。模型组ABCG2蛋白免疫组化阳性表达略低于正常组(P＜0.05)，苯溴马隆治疗组小鼠ABCG2蛋白表达较模型组增强(P＜0.01)，mRNA治疗组小鼠ABCG2蛋白表达水平远高于其它组(P＜0.01)，说明修饰合成的ABCG2 mRNA在小鼠肾脏中成功表达。见图6(A、B)。

不同组的肾脏组织机械匀浆，加含PMSF的裂解液冰上裂解30min，12000rpm离心15min吸取上清液，提取总蛋白。SDS电泳后用Western bolt法分析肾脏中ABCG2蛋白的表达。与空白组相比，模型组小鼠ABCG2蛋白表达降低(P＜0.01)；与模型组相比，苯溴马隆治疗组小鼠ABCG2蛋白表达升高(P＜0.01)；mRNA治疗组ABCG2蛋白表达水平明显高于其它组(P＜0.01)。该结果与免疫组化结果一致。见图6(C、D)。

由图3、图6可以看出，ABCG2mRNA在小鼠肾脏细胞中可高效表达出对应蛋白ABCG2。

由图7、图8可得出结论：ABCG2 mRNA可有效降低小鼠体内血尿酸(SUA)、血尿素氮(BUN)、肌酐(SCr)的水平，升高尿尿酸(UUA)水平，但对肝脏嘌呤氧化酶(XOD)的活性没有影响。这说明ABCG2把血尿酸排出到了尿中。

由图4可知：ABCG2 mRNA对小鼠的生理没有影响，如饮食、活动、体重、毛色等。这说明ABCG2 mRNA在小鼠体内没有毒副作用。

由图5说明：ABCG2 mRNA能够有效改善高血尿酸小鼠的肾脏病理损伤。

综上所述，ABCG2 mRNA可有效降低小鼠体内血尿酸(SUA)的水平，改善高血尿酸小鼠的肾脏病理损伤。具有治疗高血尿酸症的广泛临床应用和基础研究前景。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，只是在本发明的基础上进行的改进，并不能使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

序列表

<110> 青岛大学

<120> 一种增加尿酸排泄的修饰mRNA序列及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2268

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<400> 1

ttggaccctc gtacagaagc taatacgact cactataggg aaataagaga gaaaagaaga 60

gtaagaagaa atataagagc caccatgatg tcttccagta atgtcgaagt ttttatccca 120

gtgtcacaag gaaacaccaa tggcttcccc gcgacagctt ccaatgacct gaaggcattt 180

actgaaggag ctgtgttaag ttttcataac atctgctatc gagtaaaact gaagagtggc 240

tttctacctt gtcgaaaacc agttgagaaa gaaatattat cgaatatcaa tgggatcatg 300

aaacctggtc tcaacgccat cctgggaccc acaggtggag gcaaatcttc gttattagat 360

gtcttagctg caaggaaaga tccaagtgga ttatctggag atgttctgat aaatggagca 420

ccgcgacctg ccaatttcaa atgtaattca ggttacgtgg tacaagatga tgttgtgatg 480

ggcactctga cggtgagaga aaacttacag ttctcagcag ctcttcggct tgcaacaact 540

atgacgaatc atgaaaaaaa cgaacggatt aacagggtca ttcaagagtt aggtctggat 600

aaagtggcag actccaaggt tggaactcag tttatccgtg gtgtgtctgg aggagaaaga 660

aaaaggacta gtataggaat ggagcttatc actgatcctt ccatcttgtt cttggatgag 720

cctacaactg gcttagactc aagcacagca aatgctgtcc ttttgctcct gaaaaggatg 780

tctaagcagg gacgaacaat catcttctcc attcatcagc ctcgatattc catcttcaag 840

ttgtttgata gcctcacctt attggcctca ggaagactta tgttccacgg gcctgctcag 900

gaggccttgg gatactttga atcagctggt tatcactgtg aggcctataa taaccctgca 960

gacttcttct tggacatcat taatggagat tccactgctg tggcattaaa cagagaagaa 1020

gactttaaag ccacagagat catagagcct tccaagcagg ataagccact catagaaaaa 1080

ttagcggaga tttatgtcaa ctcctccttc tacaaagaga caaaagctga attacatcaa 1140

ctttccgggg gtgagaagaa gaagaagatc acagtcttca aggagatcag ctacaccacc 1200

tccttctgtc atcaactcag atgggtttcc aagcgttcat tcaaaaactt gctgggtaat 1260

ccccaggcct ctatagctca gatcattgtc acagtcgtac tgggactggt tataggtgcc 1320

atttactttg ggctaaaaaa tgattctact ggaatccaga acagagctgg ggttctcttc 1380

ttcctgacga ccaaccagtg tttcagcagt gtttcagccg tggaactctt tgtggtagag 1440

aagaagctct tcatacatga atacatcagc ggatactaca gagtgtcatc ttatttcctt 1500

ggaaaactgt tatctgattt attacccatg aggatgttac caagtattat atttacctgt 1560

atagtgtact tcatgttagg attgaagcca aaggcagatg ccttcttcgt tatgatgttt 1620

acccttatga tggtggctta ttcagccagt tccatggcac tggccatagc agcaggtcag 1680

agtgtggttt ctgtagcaac acttctcatg accatctgtt ttgtgtttat gatgattttt 1740

tcaggtctgt tggtcaatct cacaaccatt gcatcttggc tgtcatggct tcagtacttc 1800

agcattccac gatatggatt tacggctttg cagcataatg aatttttggg acaaaacttc 1860

tgcccaggac tcaatgcaac aggaaacaat ccttgtaact atgcaacatg tactggcgaa 1920

gaatatttgg taaagcaggg catcgatctc tcaccctggg gcttgtggaa gaatcacgtg 1980

gccttggctt gtatgattgt tattttcctc acaattgcct acctgaaatt gttatttctt 2040

aaaaaatatt cttaagctgc cttctgcggg gcttgccttc tggccatgcc cttcttctct 2100

cccttgcacc tgtacctctt ggtctttgaa taaagcctga gtaggaagaa aaaaaaaaaa 2160

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2220

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa 2268

<210> 2

<211> 2269

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> n is a, c, g, t or u

<400> 2

nuuggacccu cguacagaag cuaauacgac ucacuauagg gaaauaagag agaaaagaag 60

aguaagaaga aauauaagag ccaccaugau gucuuccagu aaugucgaag uuuuuauccc 120

agugucacaa ggaaacacca auggcuuccc cgcgacagcu uccaaugacc ugaaggcauu 180

uacugaagga gcuguguuaa guuuucauaa caucugcuau cgaguaaaac ugaagagugg 240

cuuucuaccu ugucgaaaac caguugagaa agaaauauua ucgaauauca augggaucau 300

gaaaccuggu cucaacgcca uccugggacc cacaggugga ggcaaaucuu cguuauuaga 360

ugucuuagcu gcaaggaaag auccaagugg auuaucugga gauguucuga uaaauggagc 420

accgcgaccu gccaauuuca aauguaauuc agguuacgug guacaagaug auguugugau 480

gggcacucug acggugagag aaaacuuaca guucucagca gcucuucggc uugcaacaac 540

uaugacgaau caugaaaaaa acgaacggau uaacaggguc auucaagagu uaggucugga 600

uaaaguggca gacuccaagg uuggaacuca guuuauccgu ggugugucug gaggagaaag 660

aaaaaggacu aguauaggaa uggagcuuau cacugauccu uccaucuugu ucuuggauga 720

gccuacaacu ggcuuagacu caagcacagc aaaugcuguc cuuuugcucc ugaaaaggau 780

gucuaagcag ggacgaacaa ucaucuucuc cauucaucag ccucgauauu ccaucuucaa 840

guuguuugau agccucaccu uauuggccuc aggaagacuu auguuccacg ggccugcuca 900

ggaggccuug ggauacuuug aaucagcugg uuaucacugu gaggccuaua auaacccugc 960

agacuucuuc uuggacauca uuaauggaga uuccacugcu guggcauuaa acagagaaga 1020

agacuuuaaa gccacagaga ucauagagcc uuccaagcag gauaagccac ucauagaaaa 1080

auuagcggag auuuauguca acuccuccuu cuacaaagag acaaaagcug aauuacauca 1140

acuuuccggg ggugagaaga agaagaagau cacagucuuc aaggagauca gcuacaccac 1200

cuccuucugu caucaacuca gauggguuuc caagcguuca uucaaaaacu ugcuggguaa 1260

uccccaggcc ucuauagcuc agaucauugu cacagucgua cugggacugg uuauaggugc 1320

cauuuacuuu gggcuaaaaa augauucuac uggaauccag aacagagcug ggguucucuu 1380

cuuccugacg accaaccagu guuucagcag uguuucagcc guggaacucu uugugguaga 1440

gaagaagcuc uucauacaug aauacaucag cggauacuac agagugucau cuuauuuccu 1500

uggaaaacug uuaucugauu uauuacccau gaggauguua ccaaguauua uauuuaccug 1560

uauaguguac uucauguuag gauugaagcc aaaggcagau gccuucuucg uuaugauguu 1620

uacccuuaug augguggcuu auucagccag uuccauggca cuggccauag cagcagguca 1680

gagugugguu ucuguagcaa cacuucucau gaccaucugu uuuguguuua ugaugauuuu 1740

uucaggucug uuggucaauc ucacaaccau ugcaucuugg cugucauggc uucaguacuu 1800

cagcauucca cgauauggau uuacggcuuu gcagcauaau gaauuuuugg gacaaaacuu 1860

cugcccagga cucaaugcaa caggaaacaa uccuuguaac uaugcaacau guacuggcga 1920

agaauauuug guaaagcagg gcaucgaucu cucacccugg ggcuugugga agaaucacgu 1980

ggccuuggcu uguaugauug uuauuuuccu cacaauugcc uaccugaaau uguuauuucu 2040

uaaaaaauau ucuuaagcug ccuucugcgg ggcuugccuu cuggccaugc ccuucuucuc 2100

ucccuugcac cuguaccucu uggucuuuga auaaagccug aguaggaaga aaaaaaaaaa 2160

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2220

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 2269

Claims (7)

1.一种增加尿酸排泄的修饰mRNA序列及其应用，其特征在于，所述ABCG2 mRNA具有如SEQ ID NO.1和2所示序列以及修饰位点。

2.根据权利要求1所述的ABCG2 mRNA，其特征在于，所述RNA能特异降低小鼠肾小管上皮细胞(TCMK1)、高尿酸血症小鼠模型血液的尿酸含量。

3.根据权利要求1-2所述的ABCG2 mRNA，其特征在于，所述ABCG2mRNA为细胞或E.coli表达、人工合成，或任何其他来源的具有同源序列的RNA。

4.根据权利要求3所述的ABCG2 mRNA，其特征在于，所述人工合成包括仪器直接合成和分子生物学方法合成；

优选地，所述分子生物学方法合成为体外转录合成；

优选的，所述体外合成也包括仪器合成和其编码DNA直接导入靶细胞表达。

5.包含权利要求1-4任一项所述的ABCG2 mRNA，作为用于靶向高尿酸细胞和体内高尿酸的药物(DNA或RNA)。

6.包含权利要求1-4任一项所述的ABCG2 mRNA，作为在高尿酸和痛风研究中降低尿酸的试剂盒中的应用。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：合成所述ABCG2mRNA，将所述ABCG2 mRNA转染或导入(注射或透皮吸收)样品体内后检测样品的尿酸浓度；

优选地，所述样品包括细胞或活体内。

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