ES2587512T3 - Derivados de 2'-O-aminooximetil nucleósido para su uso en la síntesis y modificación de nucleósidos, nucleótidos y oligonucleótidos - Google Patents

Derivados de 2'-O-aminooximetil nucleósido para su uso en la síntesis y modificación de nucleósidos, nucleótidos y oligonucleótidos Download PDF

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Abstract

Un compuesto de fórmula (I):**Fórmula** en la que B es una nucleobase opcionalmente protegida; R1, R2, y R3 se seleccionan independientemente de entre el grupo que consiste en H, alquilo C1-C6, alquenilo C2- C6, cicloalquilo C3-C8, cicloalquilo C3-C8 alquilo C1-C6, cicloalquenilo C3-C8, dicicloalquilo C3-C8 alquilo C1-C6, bicicloalquilo C7-C12 alquilo C1-C6, tricicloalquilo C7-C14 alquilo C1-C6, arilo C6-C14, arilo C6-C14 alquilo C1-C6, diarilo C6-C14 alquilo C1-C6, arilo C6-C14 alquilo C1-C6, heterociclil alquilo C1-C6, heterociclilo, heteroarilo, un grupo protector de hidroxilo, un resto ácido nucleico, un resto nucleótido, un soporte sólido y un grupo de fórmula:**Fórmula** en la que Ra y Rb se seleccionan independientemente de entre el grupo que consiste en H, alquilo C1-C6, alquenilo C2-C6, cicloalquilo C3-C8, cicloalquilo C3-C8 alquilo C1-C6, cicloalquenilo C3-C8, dicicloalquilo C3-C8 alquilo C1-C6, bicicloalquilo C7-C12 alquilo C1-C6, tricicloalquilo C7-C14 alquilo C1-C6, arilo C6-C14, arilo C6-C14 alquilo C1-C6, diarilo C6-C14 alquilo C1-C6, arilo C6-C14 alquilo C1-C6, heterociclil alquilo C1-C6, heterociclilo, heteroarilo y amido, o Ra y Rb o bien independientemente o bien junto con el N forman un resto imida o un resto imina; o R2 y R3 forman juntos un anillo protector de hidroxilo; en el que al menos uno de R1, R2 y R3 es**Fórmula**

Description

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(iii) convertir el grupo 2’-clorometoxi del compuesto de la fórmula (V) para obtener un compuesto de la fórmula (VI);
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5 en el que R’ es H o un sustituyente seleccionado entre el grupo que consiste en halo, hidroxi, ciano, formilo, acilo, alquil carbonilo, carboxilo, fosforilo, fosfonilo, fosfono alquilo C1-C6, sulfonilo, ciano, nitro, alcoxi, alquiltio, acilo, aciloxi, tioacilo, aciltio, ariloxi, amino, alquilamino, dialquilamino, trialquilamino, guanidina, aldehído, ureido, aminocarbonilo, alquilo C1-C6, halo alquilo C1-C6, hidroxi alquilo C1-C6, alquenilo C2-C6, cicloalquilo C3-C8, cicloalquilo C3-C8 alquilo C1-C6, cicloalquenilo C3-C8, arilo C6-C14 y arilo C6-C14 alquilo C1-C6; y m es 1 a 4;
10 (iv) hacer reaccionar el compuesto de la fórmula (VI) con fluoruro de amonio para obtener un compuesto de la fórmula VII, in situ,
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y
(v) hacer reaccionar el compuesto de la fórmula VII con un compuesto que tiene grupo aldehído o cetona para 15 obtener un compuesto de la fórmula (II).
En una realización, el procedimiento anterior puede incluir adicionalmente proteger el grupo 5’-OH del compuesto de la fórmula II en el que R3 = H, para obtener un compuesto 5’-OH protegido. De acuerdo con una realización, el procedimiento anterior puede incluir adicionalmente el acoplamiento del compuesto 5’-OH protegido a un soporte sólido a través del grupo 3’-OH seguido de la retirada del grupo protector en la posición 5 para obtener un
20 compuesto de la fórmula I que está unido a un soporte sólido. En una realización, el procedimiento anterior incluye adicionalmente la conversión del grupo 3’-OH en un éster de fosforamidita.
La figura 1 ilustra un método para preparar compuestos de realización de la fórmula (I). Por lo tanto, por ejemplo, los compuestos 6a -d se pueden preparar partiendo de los compuestos 1a -d. La reacción de los compuestos 1a -d con DMSO, anhídrido acético y ácido acético durante un periodo de 16 h a ~ 50 ºC dio, después de la purificación 25 por cromatografía sobre gel de sílice, los 2’-tioacetales de ribonucleósido 2a -d en unos rendimientos aislados de un 85 a un 94 %. Los rendimientos de los compuestos 2a -d son en cierta medida dependientes de la relación de los reactivos que se usan en la tioacetalización de los compuestos 1a -d; las relaciones de DMSO, anhídrido acético y ácido acético, tal como es notificado por Semenyuk et al., J. Am. Chem. Soc. 2006, 128, 12356 -12357, se
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implementaron en la preparación de los compuestos 2a -d, que se caracterizaron mediante espectroscopías de RMN de 1H y de 13C y mediante espectrometría de masas de alta resolución (HRMS). La conversión de las funciones metiltiometil éter de los compuestos 2a -d en derivados de clorometil éter (3a -d) se efectuó por tratamiento con cloruro de sulfurilo en CH2Cl2; 3a -d se aislaron como materiales amorfos. La adición de una solución previamente mezclada de N-hidroxiftalimida y una cantidad limitante de DBU (0,9 equiv. molares) en CH2Cl2 a los compuestos 3a -d produjo los 2’-O-ftalimidooximetil ribonucleósidos 4a -d en unos rendimientos de un 66 % a un 94 % en relación con las cantidades molares de los compuestos 2a -d que se usaron como materiales de partida. Los ribonucleósidos purificados con gel de sílice 4a -d se caracterizaron mediante espectroscopías de RMN de 1H y de 13C yHRMS.
La desililación de los compuestos 4a-d se realizó usando una suspensión de NH4F en metanol (Semenyuk et al., mencionado anteriormente) durante un periodo de 16 h a ~ 25 ºC. De forma inesperada, el grupo ftalimido también se escindió en estas condiciones, dando los 2’-O-aminooximetil ribonucleósidos 5a -d después de la N-desacilación de las nucleobases mediante la exposición a NH3 acuoso conc. Después de la retirada del NH3 en exceso, los compuestos 5a -d se hicieron reaccionar con 1-pirenocarboxaldehído a 55ºC en MeOH para dar los conjugados de ribonucleósido pireniladado 6a -d en unos rendimientos de un 69 % a un 82 % en relación con las cantidades molares de los compuestos 4a -d que se usaron como materiales de partida. Las identidades de los compuestos 6a -d se confirmaron mediante HRMS. Como una medida de precaución general, es preferible realizar la Ndesacilación de las nucleobases antes de cualquier reacción de oximación con el fin de evitar la escisión parcial de éteres de oxima, especialmente aquellos con unos protones oxímicos relativamente ácidos, en condiciones básicas.
Merece la pena hacer notar que, cuando la desililación del compuesto 4a se efectuó por tratamiento con TBAF 0,5 M en THF, el único producto nucleosídico que se detectó mediante análisis por cromatografía líquida de alto rendimiento de fase inversa (RP-HPLC) de la reacción de desprotección fue uridina. De forma análoga, cuando el compuesto 4a se trató sucesivamente con hidrazina hidrato, para liberar la función aminooximetilo, y con NH4F en metanol para desililar los grupos 5’-y 3’-hidroxi, el análisis por RP-HPLC de la reacción reveló solo uridina como el producto nucleosídico. Las identidades de los compuestos 5a -d fueron corroboradas por HRMS y mediante análisis de RMN de 1H y de 13C de muestras purificadas con gel de sílice que se aislaron a partir de la desprotección NH4F/MeOH de los compuestos 4a -d.
Con el fin de mostrar adicionalmente la versatilidad de los compuestos 4a -d en la preparación de conjugados de 2’ de ribonucleósido (la figura 2), el ribonucleósido 4a se convirtió en 2’-O-aminooximetil uridina (5a), tal como se ha descrito en lo que antecede, por tratamiento con NH4F/MeOH, y se hizo reaccionar con colesten-3-ona (7) y aldehídos derivados de N-(2,2-dimetoxietil)biotinamida (9), N-(2,2-dimetoxietil)-5-(dimetilamino)naftaleno-1sulfonamida (11) y N-(4,4-dietoxibutil)-5-(dimetilamino) naftaleno-1-sulfonamida (13) para producir los conjugados de 2’ de uridina 8, 10, 12 y 14, respectivamente. La reacción de 2’-O-aminooximetil citidina (5b) con el aldehído derivado de N-(2,2-dimetoxietil)-4-(dimetilamino)azobenceno-4’-sulfonamida (15) dio el conjugado de 2’ de citidina
16. Los acetales 9, 11, 13 y 15 se prepararon de forma conveniente a partir de la reacción de aminoacetaldehído dimetil acetal o 4-aminobutiraldehído dietil acetal con éster D-(+)-biotin 2-nitrofenílico, cloruro de dansilo y cloruro de dabsilo en presencia de trietilamina. Estos acetales se aislaron en unos rendimientos de un 91 -95 % y se caracterizaron mediante espectroscopías de RMN de 1H y de 13C y mediante HRMS. El equilibrio entre los acetales 9, 11, y 13 y sus aldehídos correspondientes con la exposición a HCl concentrado en MeOH condujo, después de la evaporación a presión reducida y preferiblemente después de la neutralización del ácido residual con NaHCO3 ac., a una conjugación eficiente con 2’-O-aminooximetil ribonucleósidos. El acetal 15 no se convirtió de forma significativa en el aldehído cuando se hizo reaccionar con HCl concentrado; la protonación de la función azo puede haber disminuido de forma significativa su solubilidad en MeOH. Esta deficiencia se evitó cuando el acetal 15 se trató con una solución de yodo al 10 % en acetona y se procesó adicionalmente tal como se describe en la bibliografía. Sun, J.; Dong, Y.; Cao, L.; Wang, X.; Wang, S.; Hu, Y. J. Am. Chem. 2004, 69, 8932 -8934. La N-(2-oxoetil)-4(dimetilamino)azobenceno-4’-sulfonamida en bruto se aisló y sin purificación adicional, se hizo reaccionar con el 2’O-aminooximetil ribonucleósido 5b. El conjugado de 2’ de citidina 16 se obtuvo en un rendimiento de un 61 % y se caracterizó mediante HRMS y mediante espectroscopías de RMN de 1H y de 13C.
Los conjugados de 2’ de uridina y de citidina 6a -d, 10, 12, 14 y 16 son conjugados estables, que se pueden convertir de forma conveniente y eficiente en sus ribonucleósidos nativos tras el tratamiento con TBAF 0,5 M en THF. Un mecanismo propuesto para estas transformaciones se muestra en la figura 3 y está soportado por unos perfiles de RP-HPLC representativos que ilustran la conversión de los compuestos 6a, 10 y 14 en uridina. Los cromatogramas de RP-HPLC en la figura 4 muestran la formación de pireno-1-carbonitrilo (17) y N-(4-cianobut-1-il)5-(dimetilamino)naftaleno-1-sulfonamida (18) como productos secundarios a partir de la escisión asistida por fluoruro de la función 2’-iminooximetil éter a partir de los compuestos 6a y 14, respectivamente.
Las identidades de pireno-1-carbonitrilo y N-(4-cianobut-1-il)-5-(dimetilamino)naftaleno-1-sulfonamida se confirmaron mediante análisis de RP-HPLC de muestras auténticas, que revelaron unos tiempos de retención idénticos (tR = 61,5 y 48,2 min, respectivamente, véanse las figuras 4 y 7). Por consiguiente, la presente invención proporciona en una realización un procedimiento para escindir 2’-arilo o -alquiliminooxi éteres de ribonucleósido a través de una reacción mediada por fluoruro.
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En contraste con la oximación de aldehídos con el compuesto5a, su reacción con colesten-3-ona (7) y cloruro de dansilo dio, según lo esperado, los conjugados de 2’ de uridina permanentes 8 y 19, respectivamente. Se halló que ambos de estos conjugados eran estables frente a TBAF/THF en las condiciones que se usan para la conversión de los compuestos 6a -d, 10, 12, 14, y 16 en uridina o citidina. De hecho, el tratamiento del compuesto 19 con TBAF 0,5 M en THF durante 72 h a 55 ºC produjo uridina hasta el grado de menos de un 1 %, tal como se determina mediante el análisis por RP-HPLC de los productos de reacción.
Los conjugados 6a -d, 10, 12, 14 y 16 existen como una mezcla de isómeros geométricos E y Z; parece que uno de estos isómeros experimenta una escisión asistida por fluoruro de la función 2’-iminooximetil éter a una velocidad más rápida que el otro isómero geométrico tal como se evalúa mediante el análisis por RP-HPLC de las reacciones de escisión. La proximidad de una función de donación de electrones a la función 2’-iminooximetil éter afecta claramente a las velocidades de la reacción de escisión asistida por fluoruro. A pesar de que la conversión mediada por fluoruro de los compuestos 6a -d en uridina se completó dentro de un plazo de 4 h a 55 ºC, fueron precisas 6 h para que el compuesto 10 se convirtiera en uridina en unas condiciones idénticas.
Sin desear quedar limitado por teoría o mecanismo alguno, se cree que, en presencia del ión fluoruro, que es una base fuerte en un disolvente aprótico, la función amida del compuesto 10 (pKa ~ 25) se puede ionizar hasta cierto grado y disminuye la acidez del protón oxímico, en relación con la de los compuestos 6a -d, como una consecuencia de las propiedades de donación de electrones de la función amida ionizada; entonces, la acidez reducida del protón oxímico daría como resultado una reacción de eliminación β más lenta. Esta creencia se ve soportada adicionalmente por la conversión asistida por fluoruro, considerablemente más lenta, del compuesto 12 en uridina, que solo estaba completa al 15 % después de 24 h a 55 ºC. Presumiblemente, la función sulfonamida relativamente ácida del compuesto 12 (pKa ~ 10) es ionizada hasta un grado mayor que el de una función amida por el fuertemente básico ión fluoruro y disminuye adicionalmente la acidez del protón oxímico, conduciendo de ese modo a unas velocidades de eliminación β más lentas en relación con las de los compuestos 6a -d y 10 en unas condiciones idénticas. También es consistente con esta creencia que, cuando la función sulfonamida es cada vez más distal con respecto al protón oxímico, las propiedades de donación de electrones de la sulfonamida ionizada tienen un efecto menor sobre la acidez del protón oxímico y dan como resultado unas velocidades de eliminación β relativamente más rápidas. Por lo general, la conversión asistida por fluoruro del compuesto 14 en uridina se completó dentro de un plazo de 48 h a 55 ºC; esta velocidad de eliminación β es más rápida que la del compuesto 12 pero aún significativamente más lenta que las de los compuestos 6a -d y 10. Dada la similitud de los compuestos 16 y 12 en términos de la proximidad de la función sulfonamida al protón oxímico, la conversión del compuesto 16 en citidina por tratamiento con TBAF 0,5 M en THF solo estaba completa al 25 % después de 24 h a 55 ºC.
La presente invención también proporciona un método para preparar un oligorribonucleótido de longitud de cadena n, en el que n es el número de residuos de nucleótido en el oligorribonucleótido, comprendiendo el procedimiento la adición por etapas de residuos de nucleótido al extremo 5’ terminal de una cadena de crecimiento en la que los residuos de nucleótido están protegidos en la posición 2’ con un grupo protector derivado de aminooximetilo.
En una realización más, la invención proporciona un método para preparar un oligorribonucleótido de longitud de cadena n, en el que n es el número de residuos de nucleótido en el oligorribonucleótido, comprendiendo el procedimiento:
(i) proporcionar un sustrato que comprende un nucleósido protegido en una de la función 2’-, 3’-o 5’-hidroxi con un grupo protector derivado de aminooximetilo y un soporte sólido unido de forma covalente a una de las funciones hidroxi restantes, teniendo dicho sustrato la fórmula (XI):
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en el que B es una nucleobase opcionalmente protegida; en el que al menos uno de R10 y R11 es un grupo protector derivado de aminooximetilo y el otro de R10 y R11 es un soporte sólido, opcionalmente unido al átomo de oxígeno a través de un grupo carbonilo (>C=O); y R12 es H;
(ii) proporcionar una fosforamidita de nucleósido 5’-OH-protegido de la fórmula (XII):
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en el que:
R13 es un grupo protector de hidroxilo;
R14
es un grupo protector derivado de aminooximetilo de la fórmula -CH2-O-N=CHR16 y R15 es un grupo fosforamidita, si R10 del sustrato de la fórmula (XI) es un grupo protector derivado de aminooximetilo y R11 es un soporte sólido, opcionalmente unido a través de un grupo carbonilo (>C=O); o
R15
es un grupo protector derivado de aminooximetilo de la fórmula -CH2-O-N=CHR16 y R14 es un grupo fosforamidita, si R11 del sustrato de la fórmula (XI) es un grupo protector derivado de aminooximetilo y R10 es un soporte sólido, opcionalmente unido a través de un grupo carbonilo (>C=O); en el que R16 se selecciona de entre el grupo que consiste en H, alquilo, haloalquilo, cianoalquilo, alcoxialquilo, ariloxialquilo, alquiltioalquilo, ariltioalquilo, alquilsulfinilalquilo, arilsulfinilalquilo, alquilsulfonilalquilo, arilsulfonilalquilo, cianohaloalquilo, alcoxihaloalquilo, ariloxihaloalquilo, alquiltiohaloalquilo, ariltiohaloalquilo, alquilsulfinilhaloalquilo, arilsulfinilhaloalquilo, alquilsulfonilhaloalquilo y arilsulfonilhaloalquilo; en el que el grupo fosforamidita R14 o R15 es de la fórmula: -P(R17)(OR18), en el que R17 es un grupo N,Ndialquilamino o un grupo heterocíclico saturado que tiene al menos un átomo de nitrógeno, opcionalmente con uno o más heteroátomos seleccionados entre el grupo que consiste en O y S; y OR18 es un grupo protector de fósforo;
(iii) acoplar el derivado de la fórmula (XII) con el sustrato de la fórmula (XI) para obtener un producto que comprende el sustrato acoplado al derivado de la fórmula (XII);
(iv)
terminar en 5’ el sustrato sin reaccionar de la fórmula (XI) de la etapa (iii);
(v)
oxidar la función fosfito triéster presente en el producto de la etapa (iii) para obtener un producto que tiene una función fosfato triéster protegida;
(vi)
desproteger el grupo 5’-hidroxi del producto de la etapa (v);
(vii) repetir las etapas (iii) -(vi) n − 1 veces para construir una cadena de oligonucleótido protegida que contiene “n” residuos de nucleótido sobre el soporte sólido;
(viii) retirar la nucleobase y grupos protectores de fosfato y escindir el oligonucleótido del soporte sólido; y
(ix) opcionalmente desproteger el grupo 2’-OH o el grupo 3’-OH.
De acuerdo con una realización particular, la invención proporciona un método para preparar un oligorribonucleótido de longitud de cadena n, en el que n es el número de residuos de nucleótido en el oligorribonucleótido, comprendiendo el procedimiento:
(i) proporcionar un sustrato que comprende un nucleósido, la función 2’-hidroxi o que está protegido con un grupo derivado de aminooximetilo, y un soporte sólido unido de forma covalente a la función 3’-hidroxi del nucleósido, teniendo el sustrato la fórmula (IX):
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de fósforo que tiene una valencia de más de tres, preferiblemente un átomo de fósforo tetracoordinado tal como un fosforoselenoato, o un equivalente del mismo. Los agentes selenizantes adecuados incluyen, por ejemplo, selenocianato de potasio (KSeCN), selenio elemental y similares.
Los grupos R6 y OR7 que se pueden usar de acuerdo con la presente invención pueden ser cualquier grupo adecuado que pueda proteger el fósforo trivalente que está unido a la función o bien 2’-o bien 3’-hidroxi del nucleósido de fosforamidita entrante. Los ejemplos de grupos protectores de fósforo R6 incluyen grupos N,Ndialquilamino, tal como diisopropilamino, o un grupo heterocíclico saturado que tiene al menos un átomo de nitrógeno, opcionalmente con uno o más heteroátomos seleccionados entre el grupo que consiste en O y S, tal como pirrolidino, piperidino, morfolino, y tiomorfolino; y ejemplos de OR7 incluyen grupos alcoxi, tal como grupos metoxi, cianoalcoxi, alqueniloxi, trialquilsililalcoxi, metilsulfonilalcoxi, y arilsulfonilalcoxi, y cualquier combinación de los mismos. Para ejemplos adicionales de grupos protectores, véase, por ejemplo, la Patente de EE. UU. 7.368.550, que divulga grupos protectores de la fórmula:
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en los que Riii es alquilo inferior, alquilo inferior modificado, o alquilo; cada uno de Ri y Rii se selecciona independientemente de entre H, alquilo inferior, alquilo inferior modificado, alquilo, alquilo modificado o arilo.
La figura 10 ilustra algunas de las etapas de reacciones que se pueden emplear en la preparación de oligonucleótidos de acuerdo con una realización de la invención. Los compuestos 2a -d, 3a -d, 4a -d, y 5a -d se pueden preparar tal como se ha descrito en lo que antecede a partir de los compuestos 1a -d disponibles en el mercado. La reacción del compuesto 5a con aldehídos en MeOH dio los derivados de 2’-O-metanimina-N-oximetil ribonucleósido 20a correspondientes (R= H, -CH3, -CH2F, -CH2Cl, -CH2Br, -CH2CN, -CH2OCH3, -CH2SCH3, CH2S(O)CH3, -CH2SO2CH3, -CH(CH3)F, -CH(CH3)CN, -CH(CH3)OCH3, -CH(CH3)SCH3, -CH(CH3)S(O)CH3, -CH(CH3)SO2CH3, -C(CH3)2Cl, -C(CH3)2Br, -CY(Z)F, -CY(Z)CN, -CY(Z)OCH3, -CY(Z)SCH3, -CY(Z)S(O)CH3, o -CY(Z)SO2CH3, en el que Y es F o CH3 y Z es F o CH3, en unos rendimientos de un 69 % a un 82 % en relación con las cantidades molares del compuesto 4a que se usaron como materiales de partida. Las identidades de los ribonucleósidos 20a se confirmaron mediante HRMS. El tratamiento del compuesto 20a (R = H, -CH3, -CH2F, -CH2CN, -CH2OCH3, -CH2SCH3, -CH2S(O)CH3, -CH2SO2CH3, -CH(CH3)F, -CH(CH3)CN, -CH(CH3)OCH3, -CH(CH3)SCH3, -CH(CH3)S(O)CH3, -CH(CH3)SO2CH3, -CY(Z)F, -CY(Z)CN, -CY(Z)OCH3, -CY(Z)SCH3, -CY(Z)S(O)CH3 o -CY(Z)SO2CH3, en el que Y es F o CH3 y Z es F o CH3) con cloruro de 4,4’-dimetoxitritilo en piridina anhidra dio el compuesto 21a (R = H, -CH3, -CH2F, -CH2CN, -CH2OCH3, -CH2SCH3, -CH2S(O)CH3, -CH2SO2CH3, CH(CH3)F, -CH(CH3)CN, -CH(CH3)OCH3, -CH(CH3)SCH3, -CH(CH3)S(O)CH3, -CH(CH3)SO2CH3, -CY(Z)F, -CY(Z)CN, -CY(Z)OCH3, -CY(Z)SCH3, -CY(Z)S(O)CH3 o -CY(Z)SO2CH3, en el que Y es F o CH3 y Z es F o CH3), que se purificaron por cromatografía sobre gel de sílice y se obtuvieron en unos rendimientos de un 85 -95 %. La fosfitilación de los ribonucleósidos 21a se realizó en CH2Cl2 anhidro tras la adición de Et3N y 2-cianoetil N,Ndiisopropilclorofosforamidita dando las fosforamiditas de ribonucleósido 22a (R = H, -CH3, -CH2F, -CH2CN, -CH2OCH3, -CH2SCH3, -CH2S(O)CH3, -CH2SO2CH3, -CH(CH3)F, -CH(CH3)CN, -CH(CH3)OCH3, -CH(CH3)SCH3, -CH(CH3)S(O)CH3, -CH(CH3)SO2CH3, -CY(Z)F, -CY(Z)CN, -CY(Z)OCH3, -CY(Z)SCH3, -CY(Z)S(O)CH3 o -CY(Z)SO2CH3, en el que Y es F o CH3 y Z es F o CH3) en unos rendimientos de un 70 % a un 90 % después de la cromatografía sobre gel de sílice. La figura 11 ilustra unas etapas adicionales que se pueden emplear en la preparación de oligonucleótidos de acuerdo con una realización de la invención.
La figura 12 ilustra un procedimiento de síntesis de fase sólida del fosfodiéster de dinucleósido UpT a partir de la fosforamidita de ribonucleósido 22a (R = H, -CH3, -CH2F, -CH2CN, -CH2OCH3, -CH2SCH3, -CH2S(O)CH3, -CH2SO2CH3, -CH(CH3)F, -CH(CH3)CN, -CH(CH3)OCH3, -CH(CH3)SCH3, -CH(CH3)S(O)CH3, -CH(CH3)SO2CH3, CY(Z)F, -CY(Z)CN, -CY(Z)OCH3, -CY(Z)SCH3, -CY(Z)S(O)CH3 o -CY(Z)SO2CH3 en el que Y es F o CH3 y Z es F o CH3). La reacción de cada una de las fosforamiditas de ribonucleósido 22a con timidina unida de forma covalente a alquilamina de cadena larga -vidrio de poro controlado (LCAA-CPG) a través de un enlazador de 3’-Ohemisuccinato (TsuccCPG) en presencia de 1H-tetrazol en MeCN seco produjo un producto intermedio de fosfito triéster de dinucleósido, que después del tratamiento con una solución disponible en el mercado de yodo acuoso proporcionó el fosfato triéster de dinucleósido 25 (R = H, -CH3, -CH2F, -CH2CN, -CH2OCH3, -CH2SCH3, CH2S(O)CH3, -CH2SO2CH3, -CH(CH3)F, -CH(CH3)CN, -CH(CH3)OCH3, -CH(CH3)SCH3, -CH(CH3)S(O)CH3, -CH(CH3)SO2CH3, -CY(Z)F, -CY(Z)CN, -CY(Z)OCH3, -CY(Z)SCH3, -CY(Z)S(O)CH3 o -CY(Z)SO2CH3, en el que Y es F
o CH3 y Z es F o CH3). Después del desbloqueo completo de los grupos protectores de 5’-hidroxi y de fosfato, el fosfato diéster de dinucleósido 26 se liberó del soporte sólido en unas condiciones amoniolíticas a temperatura ambiente (~ 25 ºC). El tratamiento del compuesto 26 con fluoruro de tetra-n-butilamonio 0,5 M en DMSO seco a 25 ºC dio como resultado la conversión completa del compuesto 26 en UpT. Las fosforamiditas de ribonucleósido 22a (R = CH2S(O)CH3) se seleccionaron para la síntesis de fase sólida de r(Up)20dT como un modelo exploratorio para
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evaluar: (i) cinética de acoplamiento de fosforamidita y eficiencias de acoplamiento y; (ii) la cinética de desbloqueo asistida por fluoruro y la eficiencia de las funciones 2’-hidroxi.
En las realizaciones anteriores, el grupo R puede incluir un grupo aceptor de electrones junto a Z.
La síntesis de fase sólida del r(Up)20dT se llevó a una escala de 0,2 μmoles usando el compuesto 22a como soluciones 0,2 M en MeCN anhidro. Se usó 5-etiltio-1H-tetrazol para la activación del compuesto 22a en la preparación de r(Up)20dT. En estas condiciones, la eficiencia de acoplamiento del compuesto 22a promedió un 99 % a lo largo de un tiempo de acoplamiento de 180 s. Los rendimientos de acoplamiento por etapas se determinaron mediante el ensayo espectrofotométrico de 4,4’-dimetoxitritilo a 498 nm. Después de la compleción de la síntesis, el 20-mero unido a fase sólida se trató con NH3 acuoso conc. durante 30 min a ~ 25 ºC para desbloquear los grupos protectores de fosfato de 2-cianoetilo y liberar el r(Up)20dT 2’-O-protegido del soporte sólido. El oligonucleótido a continuación se disolvió en fluoruro de tetra-n-butilamonio 0,5 M en DMSO; la solución se calentó a 55 ºC durante 48
h. El oligonucleótido r(Up)20dT desalado se analizó por RP-HPLC y se caracterizó mediante espectrometría de masas de MALDI-TOF. El cromatograma de RP-HPLC de r(Up)20dT se muestra en la figura 13 y se compara con un cromatograma de RP-HPLC de r(Up)20dT que se preparó usando fosforamiditas de 2’-O-TBDMS ribonucleósido disponibles en el mercado en unas condiciones que se describen en la bibliografía (Ogilvie, K. K.; Usman, N.; Nicoghosian, K.; Cedergren, R. J. Proc. Natal. Acad. Sci. U. S. A. 1988, 85, 5764 -5768).).
Los siguientes ejemplos ilustran adicionalmente la invención si bien, por supuesto, no se deberían interpretar como limitantes en modo alguno de su alcance.
Ejemplo 1
Este ejemplo ilustra un procedimiento de preparación de determinados productos intermedios o compuestos de acuerdo con una realización de la invención.
Materiales y procedimientos. Los productos químicos y disolventes comunes además de DMSO, ácido acético glacial, anhídrido acético, carbonato de potasio, yodo elemental, bisulfato de sodio, piridina, trietilamina, cloruro de sulfurilo, N-hidroxiftalimida, 1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno (DBU), fluoruro de amonio, 1-pirenocarboxaldehído, pireno-1-carbonitrilo, 5-colesten-3-ona, éster D-(+)-biotin 2-nitrofenílico, cloruro de 5-dimetilamino-1naftalenosulfonilo (cloruro de dansilo), cloruro de 4-(dimetilamino)azobenceno-4’-sulfonilo (cloruro de dabsilo), aminoacetaldehído dimetil acetal, 4-aminobutiraldehído dietil acetal, 4-clorobutironitrilo y ftalimida de potasio se compraron, todos ellos, de fuentes comerciales y se usaron sin purificación adicional.
N4-acetil-5’-O-(1,1,3,3-tetraisopropildisiloxano-1,3-diil)citidina, N6-isobutiril-5’-O-(1,1,3,3-tetraisopropildisiloxano-1,3diil)adenosina, 5’-O-(1,1,3,3-tetraisopropildisiloxano-1,3-diil)uridina, N2-fenoxiacetil-5’-O-(1,1,3,3-tetraisopropil disiloxano-1,3-diil)guanosina, disolventes anhidros (MeCN, CH2Cl2, C6H6, piridina, THF) y disolventes deuterados (C6D6, D2O, DMSO-d6) se obtuvieron de fuentes reputadas y se usaron tal como se recibieron.
Las purificaciones por cromatografía ultrarrápida se realizaron en unas columnas de vidrio (6,0 y 2,5 cm de D. I.) rellenadas con gel de sílice 60 (230 -400 de malla), mientras que los análisis analíticos de cromatografía de capa fina (TLC) se realizaron sobre unas placas de vidrio de 2,5 cm Χ 7,5 cm revestidas una capa de 0,25 mm de espesor de gel de sílice 60 F254.
Los análisis de RP-HPLC analíticos se realizaron usando una columna Supelcosil LC-18S de 5 μm (25 cm Χ 4,6 mm) de acuerdo con las siguientes condiciones: partiendo de trietilacetato de amonio 0,1 M de pH 7,0, un gradiente lineal de un 1 % de MeCN/min se bombea a un caudal de 1 ml/min durante 40 min o, tal como se indicó, partiendo de trietilacetato de amonio 0,1 M de pH 7,0, un gradiente lineal de un 1 % de MeCN/min se bombeó a un caudal de 1 ml/min durante 40 min; el gradiente a continuación se aumentó a un 6 % de MeCN/min durante 10 min al mismo caudal y se mantuvo isocrático durante 15 min más. En todos los cromatogramas de RP-HPLC, las alturas de pico se normalizan con respecto al pico más alto, que se ajusta a 1 unidad arbitraria. Se compró tampón de trietilacetato de amonio 2 M a Applied Biosystem y se diluyó hasta 0,1 M con agua de calidad HPLC antes del uso.
Todos los experimentos de RMN se realizaron usando un espectrómetro en el campo de 300,13, 75,47 y 121,5 MHz para 1H unidimensional, 13C desacoplado de 1H y 31P desacoplado de 1H, respectivamente. Las muestras se mantuvieron a una temperatura de 298 K. Todos los espectros se registraron en disolventes deuterados o tal como se indicó y los desplazamientos químicos δ se notificaron en partes por millón (ppm) en relación con unas referencias internas apropiadas.
Los espectros de masas de alta resolución que se usaron para confirmar la composición elemental de nuevos compuestos se obtuvieron en un espectrómetro de masas Bruker Daltonics ApexQ FT-ICR equipado con un imán de 12 T. Se usó una ionización por electropulverización en modo de iones positivos para generar iones [M + H]+ y [M + Na]+ de entre unas muestras de prueba (0,01 mg disuelto en 1 ml de acetato de amonio 10 mM en MeCN:H2O (1:1 v/v)). Los espectros se calibraron externamente usando una solución de 0,5 mg/ml de CsI en agua, lo que dio una serie de picos en el intervalo de masas que se usó para el análisis (200 -2000 m/z).
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3’,5’-O-(1,1,3,3-Tetraisopropildisiloxano-1,3-diil)-2’-O-(metiltiometil)uridina (2a). La preparación del compuesto 2a se realizó con modificaciones de menor importancia de un procedimiento publicado (Cieslak, J., et al., J. Am. Chem. 2008, 73, 2774 -2783). A una solución de 5’-O-(1,1,3,3-tetraisopropildisiloxano-1,3-diil)uridina disponible en el mercado (compuesto 1a, 7,3 g, 15 mmol) en DMSO (15 ml) se añadió AcOH glacial (23 ml) y Ac2O (15 ml). La solución se agitó a 50 ± 2 ºC hasta la compleción de la reacción (~ 16 h), que se controló por TLC (CHCl3/MeOH
95:5 v/v). La solución se transfirió a un matraz Erlenmeyer de 2 l al que se añadió, con una agitación vigorosa, una solución de K2CO3 (31 g) en agua (200 ml). El material precipitado se aisló o bien por filtración o bien por decantación y se disolvió de nuevo en un volumen mínimo de THF (15 -20 ml). La solución resultante a continuación se vertió en agua (250 ml) para dar el producto en bruto en forma de un material gomoso. La mayor parte del agua se decantó; el producto en bruto se secó cuidadosamente mediante una evaporación conjunta consecutiva con piridina (30 ml), tolueno (3 Χ 30 ml) y diclorometano (30 ml). El ribonucleósido 2a en bruto se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (~ 150 g en una columna de vidrio de 6,5 cm [D. I.]) usando un gradiente de MeOH (0 → 3 %) en CH2CI2 como eluyente. Se recogieron fracciones que contenían el compuesto 2a puro (TLC), se evaporaron para dar una espuma a baja presión, y se disolvieron en C6H6 seco (~ 20 ml); la solución se congeló y, a continuación, se liofilizó a alto vacío dando un polvo de color blanco (7 g, 12,8 mmol, 85 %). Los datos de caracterización que se obtienen a partir del análisis de RMN de 1H y de 13C del compuesto 2a están de acuerdo con los que son notificados por Semenyuk et al., J. Am. Chem. Soc. 2006, 128, 12356 -12357.
3’,5’-O-(1,1,3,3-Tetraisopropildisiloxano-1,3-diil)-2’-O-(ftalimidooximetil)uridina (4a). A una solución del compuesto 2a secado minuciosamente (1,1 g, 2,0 mmol) en diclorometano anhidro (20 ml) se añadió cloruro de sulfurilo puro (2,20 mmol, 176 μl); la solución se agitó a ~ 25 ºC durante 2 h y, a continuación, se concentró a presión reducida para dar el derivado de 2’-O-clorometiluridina 3a en forma de un sólido amorfo. N-Hidroxiftalimida (1,3 g, 8,0 mmol) se puso en un vaso de reacción separado al que se añadió CH2Cl2 anhidro (10 ml) y DBU (1,04 ml, 7,00 mmol). Después de 10 min, la solución de color rojo se añadió al compuesto 3a no purificado; la mezcla de reacción se mantuvo en agitación a ~ 25 ºC durante 24 h a lo que a continuación se añadió CH2CI2 (80 ml). La solución se mezcló de forma vigorosa con ácido acético acuoso 1 M (20 ml); la capa acuosa se descartó y la fase orgánica se lavó dos veces con una solución saturada acuosa de NaHCO3 (20 ml). La capa orgánica se recogió, se secó sobre Na2SO4 anhidro, se filtró y se evaporó para dar un sólido espumoso a presión reducida. El producto en bruto 4a se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (~ 35 g en una columna de vidrio de 2,5 cm [D. I.]) usando un gradiente de MeOH (0 → 3 %) en CH2CI2 como eluyente. Se recogieron fracciones que contenían el compuesto 4a y se evaporaron al vacío para dar un sólido (1,24 mg, 1,88 mmol) en un rendimiento de un 94 % sobre la base de la cantidad molar del material de partida (2a) que se usó. RMN de 1H (300 MHz, DMSO-d6): δ 11,41 (d, J = 2,2 Hz, 1H), 7,88 -7,80 (m, 4H), 7,65 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 5,62 (dd, J = 8,2, 2,2 Hz, 1H), 5,39 (d, J = 7,2 Hz, 1H), 5,34 (d, J = 7,2 Hz, 1H), 4,87 (d, J = 5,2 Hz, 1H), 4,63 (dd, J = 5,2, 5,2 Hz, 1H), 4,03 (dd, J = 13,0, 3,0 Hz, 1H), 3,90 (dd, J = 13,0, 3,0 Hz, 1H), 3,79 (dt, J = 9,0, 3,0 Hz, 1H), 1,07 -0,95 (m, 28H). RMN de 13C (75 MHz, DMSO-d6): δ 163,2, 163,0, 150,0, 142,6, 134,8, 128,4, 123,3, 101,3, 98,0, 90,6, 80,2, 77,9, 69,8, 60,2, 17,2, 17,1, 17,0, 16,81, 16,77, 16,7, 12,5, 12,3, 12,1, 12,0. +ESI-HRMS: Calculado para C30H43N3O10Si2 [M + H]+ 662,2560, encontrado 662,2560.
2’-O-(Aminooximetil)uridina (5a). El compuesto 4a purificado (330 mg, 500 μmol) se disolvió en metanol (3 ml), y se añadió fluoruro de amonio (185 mg, 5,00 mmol). La mezcla de reacción heterogénea se agitó a ~ 25 ºC hasta que se obtuvo la desililación y la retirada completas del grupo ftalimido (~ 16 h) tal como se indicó mediante TLC (CHCl3/MeOH 9:1 v/v). El producto de reacción se purificó por cromatografía sobre gel de sílice usando un gradiente de MeOH (0 → 12 %) en CH2Cl2 como eluyente. Se recogieron fracciones que contenían el producto, se evaporaron a sequedad para proporcionar el compuesto 5a. RMN de 1H (300 MHz, DMSO-d6): δ 11,4 (s a, 1H), 7,93 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 6,21 (s a, 2H), 5,87 (d, J = 4,4 Hz, 1H), 5,64 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 5,17 (t, J = 4,9 Hz, 1H), 4,74 (s, 2H), 4,11 (m, 2H), 3,88 (m, 1H), 3,65 (ddd, J = 12,0, 5,0, 3,1 Hz, 1H), 3,56 (ddd, J = 12,0, 5,0, 3,1 Hz, 1H), 3,16 (d, J = 5,0 Hz). RMN de 13C (75 MHz, DMSO-d6): δ 163,1, 150,7, 140,4, 101,8, 98,0, 86,7, 84,9, 79,1, 69,0, 60,4. +ESI-HRMS: Calculado para C10H15N3O7 [M + H]+ 290,0983, encontrado 290,0986.
2’-O-(Piren-1-ilmetanimina-N-oximetil)uridina (6a). 2’-O-(Aminooximetil)uridina (5a) se preparó a partir del compuesto 4a a la escala y en unas condiciones idénticas a las que se han descrito en lo que antecede. Después de la desililación mediada por NH4F y la retirada completas del grupo ftalimido en MeOH, 1-pirenocarboxaldehído (2,00 mmol, 460 mg) se añadió a la mezcla de reacción, que a continuación se calentó a 55 ± 2 ºC en un frasco dotado de tapa a rosca de 4 ml hasta la compleción de la reacción de oximación (1 h) tal como se indicó mediante TLC (CHCl3/MeOH 9:1 v/v). La mezcla de reacción se transfirió a un frasco de vidrio dotado de tapa a rosca de 20 ml al que se añadió CH2CI2 (7 ml) y una solución saturada acuosa de NaHCO3 (2 ml); después de una agitación vigorosa la fase orgánica se recogió y se evaporó a sequedad al vacío. El ribonucleósido pirenilado 6a se purificó por cromatografía sobre gel de sílice empleando un gradiente de MeOH (0 → 8 %) en CH2CI2 como eluyente. Se recogieron fracciones que contenían el producto puro, se evaporaron a sequedad a presión reducida dando el compuesto 6a como un polvo de color amarillo (206 mg, 410 μmol) en un rendimiento de un 82 % sobre la base de la cantidad molar del material de partida (4a) que se usó. +ESI-HRMS: Calculado para C27H23N3O7 [M + H]+ 502,1609, encontrado 502,1609.
N4-Acetil-3’,5’-O-(1,1,3,3-tetraisopropildisiloxano-1,3-diil)-2’-O-(metiltiometil)citidina (2b). La preparación del compuesto 2b se realizó con modificaciones de menor importancia de un procedimiento publicado. Cieslak, J., et al., mencionado anteriormente. A una solución de N4-acetil-5’-O-(1,1,3,3-tetraisopropildisiloxano-1,3-diil)citidina disponible en el mercado (compuesto 1b, 7,9 g, 15 mmol) en DMSO (15 ml) se añadió AcOH glacial (15 ml) y Ac2O
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Claims (1)

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    imagen6
    un soporte sólido, opcionalmente unido a través de un grupo carbonilo (>C=O); en la que R16 se selecciona de entre el grupo que consiste en H, alquilo, haloalquilo, cianoalquilo, alcoxialquilo, ariloxialquilo, alquiltioalquilo, ariltioalquilo, alquilsulfinilalquilo, arilsulfinilalquilo, alquilsulfonilalquilo, arilsulfonilalquilo, cianohaloalquilo, alcoxihaloalquilo, ariloxihaloalquilo, alquiltiohaloalquilo,
    5 ariltiohaloalquilo, alquilsulfinilhaloalquilo, arilsulfinilhaloalquilo, alquilsulfonilhaloalquilo y arilsulfonilhaloalquilo; en la que el grupo fosforamidita es de fórmula: -P(R17)(OR18), en la que R17 es un grupo N,N-dialquilamino dialquilamino o un grupo heterocíclico saturado que tiene al menos un átomo de nitrógeno, opcionalmente con uno o más heteroátomos seleccionados entre el grupo que consiste en O y S; y OR18 es un grupo protector de fósforo;
    10 (iii) acoplar el derivado de fórmula (XII) con el sustrato de fórmula (XI) para obtener un producto que comprende el sustrato acoplado al derivado de fórmula (XII);
    (iv)
    terminar en 5’ el sustrato sin reaccionar de fórmula (XI) de la etapa (iii);
    (v)
    oxidar la función fosfito triéster presente en el producto de la etapa (iii) para obtener un producto que tiene
    una función fosfato triéster protegida; 15 (vi) desproteger el grupo 5’-hidroxi del producto de la etapa (v);
    (vii) repetir las etapas (iii) -(vi) n − 1 veces para construir una cadena de oligonucleótido protegida que contiene “n” residuos de nucleótido sobre el soporte sólido;
    (viii) retirar la nucleobase y grupos protectores de fosfato y escindir el oligonucleótido del soporte sólido; y
    (ix) opcionalmente desproteger el grupo 2’-OH o el grupo 3’-OH.
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    35
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