WO2019021945A1 - 可視光域で光架橋可能な光応答性ヌクレオチドアナログ - Google Patents

可視光域で光架橋可能な光応答性ヌクレオチドアナログ Download PDF

Info

Publication number
WO2019021945A1
WO2019021945A1 PCT/JP2018/027169 JP2018027169W WO2019021945A1 WO 2019021945 A1 WO2019021945 A1 WO 2019021945A1 JP 2018027169 W JP2018027169 W JP 2018027169W WO 2019021945 A1 WO2019021945 A1 WO 2019021945A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
group
formula
nucleic acid
hydrogen atom
independently
Prior art date
Application number
PCT/JP2018/027169
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
崇宏 稲継
綾子 向當
勇雄 石丸
雅彦 高村
健造 藤本
Original Assignee
国立大学法人北陸先端科学技術大学院大学
日華化学株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 国立大学法人北陸先端科学技術大学院大学, 日華化学株式会社 filed Critical 国立大学法人北陸先端科学技術大学院大学
Priority to EP18837260.1A priority Critical patent/EP3660021B1/en
Priority to US16/629,148 priority patent/US11078211B2/en
Priority to CN201880035889.3A priority patent/CN110719912B/zh
Publication of WO2019021945A1 publication Critical patent/WO2019021945A1/ja

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D491/00—Heterocyclic compounds containing in the condensed ring system both one or more rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms and one or more rings having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by groups C07D451/00 - C07D459/00, C07D463/00, C07D477/00 or C07D489/00
    • C07D491/02—Heterocyclic compounds containing in the condensed ring system both one or more rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms and one or more rings having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by groups C07D451/00 - C07D459/00, C07D463/00, C07D477/00 or C07D489/00 in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D491/04—Ortho-condensed systems
    • C07D491/044—Ortho-condensed systems with only one oxygen atom as ring hetero atom in the oxygen-containing ring
    • C07D491/052—Ortho-condensed systems with only one oxygen atom as ring hetero atom in the oxygen-containing ring the oxygen-containing ring being six-membered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic System
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/547—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom
    • C07F9/6561—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom containing systems of two or more relevant hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring or ring system, with or without other non-condensed hetero rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H1/00—Processes for the preparation of sugar derivatives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical

Definitions

  • the present invention relates to a photoresponsive nucleotide analogue (photoresponsive nucleotide analog compound) having photocrosslinking (photocrosslinking) ability by light in the visible light range.
  • the basic techniques in the field of molecular biology include nucleic acid ligation and nucleic acid crosslinking.
  • the linking and crosslinking of nucleic acids are used, for example, for introducing a gene, detecting a base sequence in combination with hybridization, or, for example, for inhibiting gene expression. Therefore, techniques for linking and crosslinking nucleic acids are not limited to basic research in molecular biology but, for example, diagnostics and therapeutics in the medical field, or development and manufacture of therapeutic agents and diagnostic agents, enzymes in the industrial and agricultural fields It is an extremely important technology used for the development and production of microorganisms.
  • Patent Document 1 Patent No. 3753938
  • Patent Document 2 Patent No. 3753942
  • Patent Document 3 Patent No. 4814904
  • Patent Document 4 Patent No. 4940311
  • Photocrosslinking technology using a compound in which a chain alkylamide is substituted for the structure of the so-called sugar moiety of a modified nucleoside having a 3-vinylcarbazole structure in its base moiety Patent Document 5: Patent No. 5925383
  • Non-Patent Document 1 discloses a technique for imparting heat resistance to a nanosheet consisting of oligo DNA by photocrosslinking of nucleic acid.
  • An object of the present invention is to provide a new photoreactive compound which can be used for the photoreaction technology of nucleic acid, and a photoreactive crosslinking agent using the photoreactive compound.
  • the inventor of the present invention has been keenly searching for a photoreactive compound that can be used as a photoreactive crosslinking agent for nucleic acid photoreaction technology, and it has a pyranocarbazole skeleton structure in place of the base portion of the nucleic acid base.
  • a compound having a skeleton represented by Formula I described below in place of deoxyribose and deoxyribose is a photoreactive crosslinker that can be used for the photoreaction technology of such nucleic acid. I reached.
  • the photoreactive crosslinking agent according to the present invention is characterized by being capable of causing a photocrosslinking reaction by irradiation with light having a longer wavelength than in the past, for example, irradiation with light in the visible light range, derived from the above-mentioned structure. Therefore, the photoreactive crosslinker according to the present invention is particularly advantageous because it is photocrosslinkable by long wavelength light irradiation when it is desired to avoid damage to DNA and cells as much as possible.
  • the photoreactive compound of the present invention is to initiate a photoreaction upon irradiation with light, but emphasizes the meaning that the compound which has been stabilized up to that point initiates the reaction in response to a signal of the irradiation, Photoreactivity is sometimes referred to as photoresponsiveness.
  • the present invention includes the following (1): (1) The compounds of the following formula I: (I) (However, in Formula I, R1 is a group selected from the group consisting of a hydrogen atom, a halogen atom, a methyl group, a methyl methyl fluoride group, an ethyl group, an ethyl fluoride group, and a C1-C3 alkylsulfanyl group, X is a group represented by the following formula Is or formula IIs: (Is) (However, in the expression Is R11 and R12 are each independently a group selected from the group consisting of a hydrogen atom, a C1-C3 alkyl group, and a C1-C3 alkoxy group, na is 1 or 2; R21 and R22 are each independently a group selected from the group consisting of a hydrogen atom, a C1-C3 alkyl group, and a C1-C3 alkoxy group, nb is 0 or
  • the present invention provides novel compounds that become photoreactive crosslinkers that can be used in the photoreaction technology of nucleic acids. This is due to a novel chemical structure which has neither a natural sugar structure nor a base structure. And, according to the compound of the present invention, since the photocrosslinking can be formed by the irradiation of light having a longer wavelength than the conventional photoreactive crosslinking agent, the adverse effect on the nucleic acid and cells by the irradiation of light can be minimized.
  • FIG. 1 is the UV-vis spectrum of compound 5.
  • FIG. 2 is a UV-vis spectrum of compound 8.
  • FIG. 3a is an explanatory view showing a flow of an operation of photocrosslinking thymine.
  • FIG. 3 b shows the results of HPLC analysis of the product by light irradiation.
  • FIG. 3 c is a graph showing the change in crosslinking rate with light irradiation time.
  • FIG. 3 d is a view showing the results of HPLC analysis of products by light irradiation of each wavelength.
  • FIG. 4a is an explanatory view showing a flow of an operation of photocrosslinking cytosine.
  • FIG. 4 b is a diagram showing the results of HPLC analysis of the product with each light irradiation time.
  • FIG. 4a is an explanatory view showing a flow of an operation of photocrosslinking cytosine.
  • FIG. 4 b is a diagram showing the results of HPLC analysis of the product with each light
  • FIG. 5 a is an explanatory view showing a flow of an operation for cleaving the photocrosslinking.
  • FIG. 5 b shows the results of HPLC analysis of cleavage products with each light irradiation time.
  • FIG. 6a is an explanatory view showing a flow of an operation for forming photocrosslinking by pc-S.
  • FIG. 6 b shows the results of HPLC analysis of the product by light irradiation.
  • FIG. 7 is a graph comparing light irradiation time (seconds) at each wavelength with cell viability (%).
  • R 1 is a group selected from the group consisting of a hydrogen atom, a halogen atom, a methyl group, a methyl fluoride, an ethyl group, an ethyl fluoride, and a C 1 to C 3 alkylsulfanyl group.
  • R 1 is preferably a hydrogen atom, a halogen atom, a methyl group or an ethyl group, and particularly preferably a hydrogen atom.
  • R 1 is substituted and bonded to a hydrogen atom bonded to a carbon at any one of positions 1, 2, 3 and 4 as the carbon position numbered to the carbon atom of the ring to which R 1 is bonded It is shown that it may be done.
  • R1 can be attached to the 3-position carbon atom.
  • X is a group represented by the following formula Is or formula IIs: (Is)
  • R11 and R12 are each independently a group selected from the group consisting of a hydrogen atom, a C1-C3 alkyl group, and a C1-C3 alkoxy group.
  • R11 and R12 are preferably each independently a hydrogen atom or a methyl group, and particularly preferably a hydrogen atom.
  • na is an integer indicating the number of repeating units, and is 1 or 2, preferably 1.
  • R11 and R12 can be independently the above groups in each repeating unit.
  • R21 and R22 are each independently a group selected from the group consisting of a hydrogen atom, a C1-C3 alkyl group, and a C1-C3 alkoxy group.
  • R21 and R22 are preferably each independently a hydrogen atom or a methyl group, and particularly preferably a hydrogen atom.
  • nb is an integer indicating the number of repeating units, and is 0 or 1, preferably 0.
  • R21 and R22 can be independently the above groups in each repeating unit.
  • R31 and R32 are each independently a group selected from the group consisting of a hydrogen atom, a C1-C3 alkyl group, and a C1-C3 alkoxy group.
  • R31 and R32 are preferably each independently a hydrogen atom or a methyl group, and particularly preferably a hydrogen atom.
  • nc is an integer indicating the number of repeating units and is 0, 1, 2 or 3 and preferably 1.
  • R31 and R32 can be independently the above groups in each repeating unit.
  • nc + nd is an integer of 0 to 3, preferably 2.
  • R41 and R42 are each independently a group selected from the group consisting of a hydrogen atom, a C1-C3 alkyl group, and a C1-C3 alkoxy group.
  • R41 and R42 are preferably each independently a hydrogen atom or a methyl group.
  • nd is an integer indicating the number of repeating units, and is 0, 1, 2 or 3, preferably 1.
  • R41 and R42 can be independently the above groups in each repeating unit.
  • Q1 is Hydrogen atom; A phosphate group formed integrally with O bonded to Q1; A nucleotide, nucleic acid or peptide nucleic acid linked via a phosphodiester bond formed by a phosphate group formed together with O linked to Q1; Protecting groups selected from: Trityl group, monomethoxytrityl group, dimethoxytrityl group, trimethoxytrityl group, trimethylsilyl group, triethylsilyl group, t-butyldimethylsilyl group, acetyl group, benzoyl group; And the group selected from the group consisting of
  • the 2-cyanoethyl-N, N-dialkyl (C1-C4) phosphoramidite group has the following structure:
  • the R group and the R ′ group to be the above-mentioned dialkyl groups can be C1 to C4 alkyl groups, respectively.
  • 2-cyanoethyl-N, N-dialkyl (C1-C4) phosphoroamidite group for example, 2-cyanoethyl-N, N-dimethyl phosphoroamidite group, 2-cyanoethyl-N, N-diethyl phosphoro group Mention may be made of an amidite group and 2-cyanoethyl-N, N-diisopropyl phosphoramidite group.
  • the methyl phosphonic amidite group has the following structure:
  • the R group and the R ′ group can each be a hydrogen atom or a C1-C4 alkyl group.
  • the ethyl phosphonamidite group has the following structure:
  • the R group and the R ′ group can each be a hydrogen atom or a C1-C4 alkyl group.
  • the oxazaphosphoridin group has the following structure:
  • the thiophosphite group has the following structure:
  • Q1 can be a hydrogen atom.
  • Q1 can be a nucleotide or nucleic acid linked via a phosphodiester bond formed by a phosphate group formed in conjunction with O attached to Q1.
  • Q1 can be the above-mentioned protecting group, preferably dimethoxytrityl group, trityl group, monomethoxytrityl group, trimethoxytrityl group, particularly preferably dimethoxytrityl group. It can be based.
  • Q2 can be a hydrogen atom.
  • Q2 can be a nucleotide or nucleic acid linked via a phosphodiester bond formed by a phosphate group formed in conjunction with O linked to Q2.
  • Q2 can be a protecting group as described above, preferably 2-cyanoethyl-N, N-dialkyl (C1-C4) phosphoroamidite group, oxazaphosphoridine group, thiophosphatic group It can be a fight group.
  • R51 and R52 are each independently a group selected from the group consisting of a hydrogen atom, a C1-C3 alkyl group, and a C1-C3 alkoxy group.
  • ne is an integer indicating the number of repeating units, and is 1, 2 or 3.
  • R51 and R52 can be independently the above groups in each repeating unit.
  • R 61 and R 62 are each independently a group selected from the group consisting of a hydrogen atom, a C1-C3 alkyl group, and a C1-C3 alkoxy group.
  • n f is an integer indicating the number of repeating units and is 1, 2 or 3.
  • R61 and R62 can be independently the above groups in each repeating unit.
  • Q1 can be Q1 as described in Formula Is above.
  • Q2 can be Q2 as described in Formula Is above.
  • X can be a group represented by the formula It: (It)
  • na can be 1
  • nb can be 0,
  • nc can be 1
  • nd can be 1
  • the structure of the formula It can be obtained.
  • R11, R12, R31, R32, R41, R42, Q1 and Q2 can each be the group described in the above formula Is.
  • X can be a group represented by the following formula Iu: (Iu)
  • na can be 1
  • nb can be 0,
  • nc can be 1
  • nd can be 1
  • R11, R12, R31, R32, R41 can be hydrogen atoms.
  • R11, R12, R31, R32, R41 can be hydrogen atoms.
  • R11, R12, R31, R32, R41 can be hydrogen atoms.
  • R42, Q1 and Q2 can each be the groups described in the above formula Is.
  • Q2 is attached to Q2 as a nucleotide or nucleic acid linked via a phosphodiester bond formed by a phosphate group formed in conjunction with O attached to Q1. It can be a nucleotide or nucleic acid linked via a phosphodiester bond formed by a phosphate group formed together with the O to be linked. That is, the compound represented by the above-mentioned formula I can be a modified nucleic acid or a modified oligonucleotide in which a photoresponsive artificial nucleotide analogue having a characteristic structure is incorporated into the sequence.
  • the photoresponsive modified nucleic acid and the photoresponsive modified oligonucleotide thus prepared may be collectively referred to as a photoresponsive modified nucleic acid.
  • a photoresponsive artificial nucleotide analogue having a characteristic structure may be located at the end of the sequence, in which case only one side of Q1 or Q2 is Q1 or It becomes a modified nucleotide or a modified nucleic acid linked via a phosphodiester bond formed by a phosphate group formed together with O bound to Q2.
  • a peptide nucleic acid may be used in place of the above-described nucleic acid to form a light responsive modified peptide nucleic acid in which a light responsive artificial nucleotide analog having a characteristic structure is incorporated into the sequence.
  • the compound according to the present invention has a backbone structure represented by formula I, and does not have a ribose or deoxyribose sugar structure which should be possessed by the natural nucleosides and nucleotides in formula I. Furthermore, the compounds according to the invention do not have a base structure with purine or pyrimidine bases which should be possessed by the naturally occurring nucleosides and nucleotides in formula I. That is, the compound according to the present invention has a chemical structure that does not seem to be structurally quite similar to natural nucleosides and nucleotides.
  • the compounds according to the invention when formed as single stranded modified nucleic acid, can form a double helix with the complementary single stranded nucleic acid.
  • the pyranocarbazole moiety can form a crosslink by a photoreaction.
  • Q1 and Q2 can be hydrogen atoms. That is, the compound represented by the above-mentioned formula I can be a photoresponsive artificial nucleoside analogue molecule having a characteristic structure.
  • Q1 can be a phosphate group formed integrally with O bound to Q1
  • Q2 can be a hydrogen atom. That is, the compound represented by the above formula I can be a photoresponsive artificial nucleotide analogue molecule having a characteristic structure.
  • Q1 can be a protecting group as described above and Q2 is united with a phosphate group formed integrally with O bound to Q2, O bound to Q2 It may be a nucleotide or nucleic acid linked via a phosphodiester bond formed by the phosphate group formed, or the above-mentioned protecting group. That is, the compound represented by the above-mentioned formula I can be used as a reagent for producing a photoreactive modified nucleic acid (reagent for synthesis).
  • Q1 can be a protecting group as described above
  • Q2 can be a phosphate group formed integrally with O bound to Q2, or a protecting group as described above. it can.
  • compounds having such a structure can be used as monomers for nucleic acid synthesis and can be reagents that can be used by known DNA synthesizers, for example, phosphoramidites
  • the method can be used as a modified nucleic acid synthesis reagent (modified nucleic acid synthesis monomer) that can be used by the method and the H-phosphonate method.
  • a structure in which Q1 is a nucleotide or a nucleic acid which is linked via a phosphodiester bond formed by a phosphate group formed integrally with O bonded to Q2 as the above-mentioned protecting group has a structure that can not be said to be a so-called monomer, and has a structure that can be said to be a modified nucleic acid. In such a case, it can be synthesized therefrom to be used as a manufacturing reagent (reagent for synthesis) for extending the chain length.
  • photoreactive modified nucleic acid-producing reagent photoreactive modified nucleic acid synthesizing reagent
  • monomers can be exemplified.
  • the pyranocarbazole moiety can form a crosslink by photoreaction.
  • the compound according to the present invention can form a double helix with a complementary single-stranded nucleic acid, and the pyranocarbazole moiety forms a crosslink by photoreaction.
  • photocrosslinks photocrosslinks
  • the compound according to the present invention can be used as a photoreactive crosslinking agent.
  • the modified nucleic acid according to the present invention when used as a single stranded nucleic acid, it can be hybridized with a complementary single stranded nucleic acid to form a double helix.
  • nucleobases at positions where base pairing is to be formed in the complementary strand with respect to the pyranocarbazole structural moiety are freely selected without particular limitation.
  • crosslinks can be formed by photoreaction between the nucleic acid strands forming the double helix.
  • This photocrosslinking forms a base pair in a complementary strand to a nucleic acid base located at the 5 'end side by one base in the sequence from the position where the pyranocarbazole structural moiety is located as a nucleic acid base in the sequence It is formed between the nucleobase at the position and the pyranocarbazole structure.
  • this photocrosslink is a nucleic acid base located on the 3 'end side by one base in the sequence from the nucleobase in the position to form a base pair in the complementary strand with respect to the pyranocarbazole structural moiety And the pyranocarbazole structure.
  • the counterpart base whose pyranocarbazole structure can form a photocrosslink is a base having a pyrimidine ring.
  • the pyranocarbazole structure does not form a photocrosslink with a base having a purine ring. That is, the photocrosslinkable compounds according to the present invention form photocrosslinks to cytosine, uracil and thymine as natural nucleic acid bases, while they do not form photocrosslinks to guanine and adenine It has the specificity.
  • the photoreactive modified nucleic acid (photocrosslinkable modified nucleic acid) according to the present invention can be photocrosslinked after being hybridized with a sequence having a base sequence complementary to the modified nucleic acid to form a double helix.
  • the photocrosslinking reaction photocrosslinking reaction
  • the photoreactive crosslinking agent according to the present invention can be provided with very high base sequence selectivity, if desired, by sequence design.
  • the wavelength of light irradiated for photocrosslinking is, for example, in the range of 350 to 600 nm, preferably in the range of 400 to 600 nm, more preferably in the range of 400 to 550 nm, still more preferably in the range of 400 to 500 nm, still more preferably 400. It can be in the range of ⁇ 450 nm. In a preferred embodiment, single wavelength laser light in the wavelength range of these ranges can be used. As described above, in the present invention, photocrosslinking can be formed by light irradiation of a wavelength in the visible light range. Conventional photoreactive crosslinkers have required irradiation with light having a wavelength shorter than these ranges.
  • photocrosslinking can be formed by light irradiation with a longer wavelength than conventional photoreactive crosslinking agents, it is advantageous in that adverse effects on nucleic acid and cells by light irradiation can be minimized. is there.
  • photocleavage of photocrosslinking According to the compound of the present invention, after photocrosslinking is formed, photocleavage can be further performed by light irradiation. That is, the photoreactive compound according to the present invention enables reversible photocrosslinking and can be used as a reversible photoreactive crosslinking agent.
  • the present invention is also a method of separating, recovering or detecting a nucleic acid having a desired base sequence using a reversible photoreactive crosslinking agent.
  • the wavelength of light irradiated for photocleavage can be, for example, in the range of 300 to 350 nm, preferably in the range of 300 to 340 nm. In a preferred embodiment, single wavelength laser light in the wavelength range of these ranges can be used.
  • 0 to 50 ° C. preferably 0 to 40 ° C., more preferably 0 to 30 ° C., more preferably 0 to 20 ° C., more preferably 0 to promote the photocrosslinking reaction.
  • the light irradiation is carried out at a temperature in the range of -10.degree. C., more preferably 0-5.degree.
  • light irradiation is generally performed at a temperature in the range of 55 to 100 ° C., preferably 60 to 90 ° C., more preferably 60 to 80 ° C.
  • the photocrosslinking and photocleaving according to the present invention utilize the photoreaction, so there is no particular limitation in pH, salt concentration, etc., and pH, salt concentration, etc. where biopolymers such as nucleic acids can stably exist. It can be carried out by light irradiation in the solution.
  • Photocrosslinking and photocleavage according to the invention proceed very rapidly. For example, if it is necessary to take several hours (350 nm light irradiation) for a psoralen known as a photoreactive compound, for example, only 10 seconds to 60 seconds (400 nm light) can be emitted by light irradiation with a longer wavelength than that. In the irradiation), the photoreaction proceeds to photocrosslink. That is, when the photocrosslinking agent according to the present invention is used, the photoreaction can be advanced to form photocrosslinking by light irradiation, for example, for 1 to 120 seconds or 1 to 60 seconds.
  • the photocrosslinking according to the present invention can make the photoreaction proceed and cleave photocrosslinking by light irradiation, for example, for 1 to 120 seconds, or 1 to 60 seconds, employing the above-mentioned wavelength and temperature.
  • the photoresponsive artificial nucleoside analog molecule according to the present invention can be synthesized, for example, along the synthetic route shown in Scheme 1 described later.
  • Scheme 1 the synthetic route shown in Scheme 1 described later.
  • compound 1 is obtained, compound 4 is synthesized therefrom, dehydration condensation reaction with an amine is performed to form an amide bond, and compound 5 is obtained.
  • R 1 is a group as described in formula VI, R11 and R12 are the groups described in formula Is, na is 1 or 2;
  • R21, R22, R31, R32, R41 and R42 are the groups described in the formula Is, nb is 0 or 1, nc is 0, 1, 2 or 3, and nc + nd is an integer of 0 to 3, nd is 0, 1, 2 or 3, and nc + nd is an integer of 0 to 3,
  • Q1 is Hydrogen atom;
  • Protecting groups selected from: Trityl group, monomethoxytrityl group, dimethoxytrityl group, trimethoxytrityl group, trimethylsilyl group, triethylsilyl group, t-butyldimethylsilyl group, acetyl group, benzoyl group;
  • R1, R11 and R12 are each independently a group described in the above formula III, na is an integer described in the formula III above; R21, R22, R31, R32, R41, R42, Q1 and Q2 are each independently a group described in the above formula IV, nb, nc and nd are each an integer described in the above formula IV.
  • the compound represented by these can be manufactured.
  • the compound represented by the above formula V can be a compound represented by the following formula VIII :
  • R 1 is a group described in formula III
  • R11 and R12 are the groups described in formula III
  • na is 1 or 2
  • R21, R22, R31, R32, R41 and R42 are the groups described in the formula VII
  • nb is 0 or 1
  • nc is 0, 1, 2 or 3
  • nc + nd is an integer of 0 to 3
  • nd is 0, 1, 2 or 3
  • nc + nd is an integer of 0 to 3.
  • amines of the following formula VIIa can be used as amines of the above formula VII: (VIIa) (However, in Formula VIIa, R42 is a group described in Formula VII, preferably, R42 can be a hydrogen atom or a methyl group.)
  • the compound of formula VIII above is a compound of formula VIIIa: be able to: (VIIIa) (However, in Formula VIIIa, R 1 is a group as described in formula IIIa R42 is a group as described in Formula VIIa, preferably R42 can be a hydrogen atom or a methyl group. )
  • compounds of Formula V, Formula VIII, Formula VIIIa can be synthesized by the formation of an amide by dehydration condensation with an amine.
  • the synthetic route of scheme 1 is described by exemplifying the case where Q1 and Q2 are hydrogen atoms in these formulas, but even if Q1 and Q2 are other than hydrogen atoms, Compounds of formula V can be prepared by the formation of an amide by dehydration condensation with an amine.
  • the synthetic route according to the present invention described above is excellent in that it has few steps, is simple, and can expect a high total yield. Furthermore, in contrast to conventional photocrosslinker synthesis methods, the synthetic route is advantageous in that it does not include steps that require careful operation and skill, such as the step of activation with hydrogen chloride. ing. That is, in the synthesis of a conventional photoreactive modified nucleoside molecule, due to the provision of deoxyribose or ribose in the structure, there are many steps in the synthetic pathway and complexity compared with the above synthetic pathway of the present invention. And the overall yield is low.
  • the step of activation with hydrogen chloride, etc. is performed to protect and activate the hydroxyl group of sugar. It has steps that require attention and skill in operation. Therefore, the compounds according to the present invention are also excellent in terms of the simplicity of the above synthesis and the high overall yield.
  • the present invention is also in the above-mentioned excellent synthesis method (production method).
  • the structure of the monomer for synthesis of the modified nucleic acid according to the present invention is as described above, and when it is used as a nucleic acid synthesis reagent by a known method such as phosphoramidite method and H-phosphonate method, the photoresponsive artificial It is possible to obtain a nucleic acid or oligonucleotide (modified nucleic acid according to the present invention) or a peptide nucleic acid in which a nucleoside analog molecule (formula VIII, a compound of formula VIIIa) is incorporated into the sequence.
  • the modified nucleic acid synthesis monomer according to the present invention is excellent in that it can be used as a nucleic acid synthesis reagent in known methods such as the phosphoroamidite method and the H-phosphonate method.
  • oligo DNA 5′-TGCAXCCGT-3 ′, X is a target containing a nucleic acid photoreactive element
  • a nucleic acid photoreactive element pc-D was obtained.
  • Identification of oligo DNA was performed by MALDI-TOF MS analysis. ([(M + H) +]; Calcd. 2827.80, Found 2828.94)
  • An oligo DNA containing a nucleic acid photoreactive element (5′-TGCGXCCGT-3 ′, X is a nucleic acid photoreactive element (X is a nucleic acid photoreactive element (X)) except that the DNA sequence is partially changed and input to the automatic DNA synthesizer got pc-D)).
  • ODN oligo DNA containing the pc-D
  • Y is A (adenine) or G (guanine)
  • ODN complementary oligo DNA
  • Z is Add deoxyuridine (25 ⁇ M) as an internal standard to an equal mixture of T (thymine) or C (cytosine)] (5 ⁇ M in 50 mM Na-Cacodylate buffer (pH 7.4), 100 mM NaCl) and Irradiation (400 nm, 9500 mW / cm 2 ) was performed.
  • the photoreactivity was evaluated by analyzing this solution by HPLC (eluent: acetonitrile / 50 mM ammonium formate, 1 to 20% acetonitrile / 10 min, flow rate: 0.2 mL / min).
  • FIG. 3 a is an explanatory view showing the flow of this operation.
  • ODN A.pc-D
  • thymine T
  • pc-D nucleoside analog
  • Figure 3b U-VIX UV-LED irradiator (OmniCure (Registration) using ODN (A pc-D) and complementary oligo DNA ODN (T) (5'-ACGGGTGCA-3 ') It is a figure which shows the result analyzed by HPLC, after irradiating 400 nm light using (trademark) LX405S).
  • the chart arranged in the vertical axis direction corresponds to the light irradiation time (0 second, 1 second, 5 seconds, 10 seconds, 30 seconds), and the horizontal axis shows the holding time (minutes).
  • FIG. 3 c is a graph showing the change in crosslinking rate with light irradiation time. The horizontal axis of FIG.
  • 3 c is the light irradiation time (seconds), and the vertical axis is the conversion (%).
  • the conversion rate that is, the rate of conversion from monomer to dimer was 100% conversion when it was completely changed to dimer.
  • the nucleoside analogues according to the invention ie ODN (A. pc-D), show a high conversion of 94% after 10 seconds of irradiation and almost 100% crosslinking after 1 hour.
  • Fig. 3d shows an example of using an ODN (A. pc-D) and an ODN (T) and irradiating light of 450, 500, and 550 nm for 1 hour using a CRM-FD type irradiation spectrometer manufactured by JASCO Corporation.
  • Photodimerized ODN (pc-D / T) solution prepared by light irradiation (400 nm, 60 seconds) of a mixed solution of ODN (A pc-D) and ODN (T) is warmed at 60 ° C, 15 W It was irradiated with light of 312 nm for 0, 5, and 30 minutes using a transilluminator (Fig. 5a). By light irradiation, the peak of ODN (pc-D / T) decreased, and the peaks of original ODN (A. pc-D) and ODN (T) appeared. After 30 minutes of irradiation, the ODN (pc-D / T) peak disappeared and the conversion was 100% (FIG. 5 b).
  • ODN pc-S-containing oligo DNA (5'-TGCGXCCGT-3 ', hereinafter referred to as ODN (A pc-S)) in which T (thymine) is to be photocrosslinked by T (thymine) And a photocrosslinking reaction using complementary oligo DNA ODN (T) (FIG. 6a).
  • FIG. 6 b shows the results of analysis by HPLC after irradiation with 400 nm light for 60 seconds using a UV-LED irradiator (OmniCure® LX 405 S) manufactured by U-VIX.
  • the chart arranged in the vertical axis direction corresponds to the light irradiation time (0 seconds, 60 seconds), and the horizontal axis shows the holding time (minutes).
  • the peaks of ODN (A pc-S) and ODN (T) that existed at the time before light irradiation (0 sec) are reduced by light irradiation, and at the same time, the light dimer (ODN (pc-S / T) The peak of) appeared.
  • FIG. 7 is a graph comparing light irradiation time (seconds) at each wavelength with cell viability (%). From this result, while the cell survival rate greatly decreases even with light irradiation for several seconds with light irradiation at 366 nm, the cell survival rate almost decreases even with light irradiation for several tens of seconds at 400 nm and 450 nm. Absent. That is, this also revealed that pyranocarbazole can be manipulated with long-wavelength light with low cytotoxicity.
  • the present invention provides novel compounds that become photoreactive crosslinkers that can be used in the photoreaction technology of nucleic acids.
  • the present invention is an industrially useful invention.

Abstract

式Ｉ：で表される化合物、及び該化合物からなる光反応性架橋剤によって、核酸の光反応技術に使用可能な新しい光反応性化合物、及び該光反応性化合物を使用した光反応性架橋剤を提供する。

Description

可視光域で光架橋可能な光応答性ヌクレオチドアナログ
　本発明は、可視光域の光による光架橋（光クロスリンク）能を有する光応答性ヌクレオチドアナログ（光応答性ヌクレオチド類似化合物）に関する。
　分子生物学の分野の基本的な技術に、核酸の連結及び核酸の架橋がある。核酸の連結や架橋は、例えば、ハイブリダイゼーションと組みあわせて、遺伝子の導入や、塩基配列の検出のために使用され、あるいは、例えば、遺伝子発現の阻害に使用される。そのために、核酸の連結及び架橋の技術は、分子生物学の基礎研究だけではなく、例えば、医療分野における診断や治療、あるいは治療薬や診断薬等の開発や製造、工業及び農業分野における酵素や微生物等の開発や製造に使用される極めて重要な技術である。
　核酸の光反応技術として、５－シアノビニルデオキシウリジンを使用した光連結技術（特許文献１：特許第３７５３９３８号、特許文献２：特許第３７５３９４２号）、３－ビニルカルバゾール構造を塩基部位に持つ修飾ヌクレオシドを使用した光架橋技術（特許文献３：特許第４８１４９０４号、特許文献４：特許第４９４０３１１号）がある。さらに、３－ビニルカルバゾール構造を塩基部位に持つ修飾ヌクレオシドのいわゆる糖部の構造を、鎖状アルキルアミドに置換した化合物を使用した光架橋技術がある（特許文献５：特許第５９２５３８３号）。
　さらに、最近、核酸の二重鎖形成能を利用した様々なナノ構造体の構築が可能となってきており、ナノテクノロジーの分野においても核酸の連結及び架橋の技術が重要となってきている。例えば、非特許文献１は、核酸の光架橋によってオリゴＤＮＡからなるナノシートに耐熱性を付与する技術を開示している。
特許第３７５３９３８号公報 特許第３７５３９４２号公報 特許第４８１４９０４号公報 特許第４９４０３１１号公報 特許第５９２５３８３号公報
Ｊ．Ｐｈｏｔｏｐｄｙ．Ｓ．Ｔｅｃｈ．，２０１４，２７，４８５
　核酸の光反応技術の重要性から、核酸の光反応技術に使用可能な新しい化合物が、さらに求められている。本発明の目的は、核酸の光反応技術に使用可能な新しい光反応性化合物、及び該光反応性化合物を使用した光反応性架橋剤を提供することにある。
　本発明者は、核酸の光反応技術に使用可能な光反応性架橋剤となる光反応性化合物を鋭意探索してきたところ、核酸塩基の塩基部分に代えてピラノカルバゾール骨格構造を備えて、リボース及びデオキシリボース部分に代えて後述の式Ｉで表される骨格構造を備えた化合物が、このような核酸の光反応技術に使用可能な光反応性架橋剤となることを見いだして、本発明に到達した。
　本発明による光反応性架橋剤は、上記の構造に由来して、従来よりも長波長の光照射によって、例えば可視光域の光照射によって、光架橋反応させることができるという特徴を備える。そのために、ＤＮＡや細胞の損傷をできるだけ回避したいという場合に、本発明による光反応性架橋剤は、長波長の光照射によって光架橋可能であるので、特に有利である。
　本発明の光反応性化合物は、光照射によって光反応を開始するものであるが、それまで安定していた化合物が、光照射というシグナルに応答して反応を開始するという意味を強調して、光反応性を光応答性ということがある。
　したがって、本発明は次の（１）以下を含む。
（１）
　次の式Ｉで表される化合物：
（Ｉ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000009
（ただし、式Ｉにおいて、
　Ｒ１は、水素原子、ハロゲン原子、メチル基、フッ化メチル基、エチル基、フッ化エチル基、及びＣ１～Ｃ３のアルキルスルファニル基からなる群から選択された基であり、
　Ｘは、次の式Ｉｓ又は式ＩＩｓで表される基である：
（Ｉｓ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000010
（ただし、式Ｉｓにおいて、
　Ｒ１１及びＲ１２は、それぞれ独立して、水素原子、Ｃ１～Ｃ３のアルキル基、及びＣ１～Ｃ３のアルコキシ基からなる群から選択された基であり、
　ｎａは、１又は２であり、
　Ｒ２１及びＲ２２は、それぞれ独立して、水素原子、Ｃ１～Ｃ３のアルキル基、及びＣ１～Ｃ３のアルコキシ基からなる群から選択された基であり、
　ｎｂは、０又は１であり、
　Ｒ３１及びＲ３２は、それぞれ独立して、水素原子、Ｃ１～Ｃ３のアルキル基、及びＣ１～Ｃ３のアルコキシ基からなる群から選択された基であり、
　ｎｃは、０、１、２又は３であり、ｎｃ＋ｎｄは０～３の整数であり、
　Ｒ４１及びＲ４２は、それぞれ独立して、水素原子、Ｃ１～Ｃ３のアルキル基、及びＣ１～Ｃ３のアルコキシ基からなる群から選択された基であり、
　ｎｄは、０、１、２又は３であって、ｎｃ＋ｎｄは０～３の整数であり、
　Ｑ１は、
　　水素原子；
　　Ｑ１に結合するＯと一体となって形成されるリン酸基；
　　Ｑ１に結合するＯと一体となって形成されるリン酸基によって形成されるリン酸ジエステル結合を介して連結されるヌクレオチド、核酸又はペプチド核酸；　及び　
　　以下から選択される保護基：
　　トリチル基、モノメトキシトリチル基、ジメトキシトリチル基、トリメトキシトリチル基、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、ｔ－ブチルジメチルシリル基、アセチル基、ベンゾイル基；
　からなる群から選択される基であり、
　Ｑ２は、
　　水素原子；
　　Ｑ２に結合するＯと一体となって形成されるリン酸基；
　　Ｑ２に結合するＯと一体となって形成されるリン酸基によって形成されるリン酸ジエステル結合を介して連結されるヌクレオチド、核酸又はペプチド核酸；　及び　
　　以下から選択される保護基：
　　２－シアノエチル－Ｎ，Ｎ－ジアルキル（Ｃ１～Ｃ４）ホスホロアミダイト基、メチルホスホンアミダイト基、エチルホスホンアミダイト基、オキサザホスホリジン基、チオホスファイト基、－ＰＨ（＝Ｏ）ＯＨのＴＥＡ塩、－ＰＨ（＝Ｏ）ＯＨのＤＢＵ塩、－ＰＨ（＝Ｓ）ＯＨのＴＥＡ塩、－ＰＨ（＝Ｓ）ＯＨのＤＢＵ塩；
　からなる群から選択される基である。）
（ＩＩｓ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000011
（ただし、式ＩＩｓにおいて、
　Ｒ５１及びＲ５２は、それぞれ独立して、水素原子、Ｃ１～Ｃ３のアルキル基、及びＣ１～Ｃ３のアルコキシ基からなる群から選択された基であり、
　ｎｅは、１、２又は３であり、
　Ｒ６１及びＲ６２は、それぞれ独立して、水素原子、Ｃ１～Ｃ３のアルキル基、及びＣ１～Ｃ３のアルコキシ基からなる群から選択された基であり、
　ｎｆは、０、１、２又は３であり、
　Ｑ１は、
　　水素原子；
　　Ｑ１に結合するＯと一体となって形成されるリン酸基；
　　Ｑ１に結合するＯと一体となって形成されるリン酸基によって形成されるリン酸ジエステル結合を介して連結されるヌクレオチド、核酸又はペプチド核酸；　及び　
　　以下から選択される保護基：
　　トリチル基、モノメトキシトリチル基、ジメトキシトリチル基、トリメトキシトリチル基、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、ｔ－ブチルジメチルシリル基、アセチル基、ベンゾイル基；
　からなる群から選択される基であり、
　Ｑ２は、
　　水素原子；
　　Ｑ２に結合するＯと一体となって形成されるリン酸基；
　　Ｑ２に結合するＯと一体となって形成されるリン酸基によって形成されるリン酸ジエステル結合を介して連結されるヌクレオチド、核酸又はペプチド核酸；　及び　
　　以下から選択される保護基：
　　２－シアノエチル－Ｎ，Ｎ－ジアルキル（Ｃ１～Ｃ４）ホスホロアミダイト基、メチルホスホンアミダイト基、エチルホスホンアミダイト基、オキサザホスホリジン基、チオホスファイト基、－ＰＨ（＝Ｏ）ＯＨのＴＥＡ塩、－ＰＨ（＝Ｏ）ＯＨのＤＢＵ塩、－ＰＨ（＝Ｓ）ＯＨのＴＥＡ塩、－ＰＨ（＝Ｓ）ＯＨのＤＢＵ塩；
　からなる群から選択される基である。））。
（２）
　Ｘが、次の式Ｉｔで表される基である、（１）に記載の化合物：
（Ｉｔ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000012
（ただし、式Ｉｔにおいて、
　Ｒ１１及びＲ１２は、それぞれ独立して、式Ｉｓにおいて記載した基であり、
　Ｒ３１及びＲ３２は、それぞれ独立して、式Ｉｓにおいて記載した基であり、
　Ｒ４１及びＲ４２は、それぞれ独立して、式Ｉｓにおいて記載した基であり、
　Ｑ１及びＱ２は、式Ｉｓにおいて記載した基である。）。
（３）
　Ｘが、次の式Ｉｕで表される基である、（１）に記載の化合物：
（Ｉｕ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000013
（ただし、式Ｉｕにおいて、
　Ｒ４２は、式Ｉｓにおいて記載した基であり、
　Ｑ１及びＱ２は、式Ｉｓにおいて記載した基である。）。
（４）
　Ｒ４２が、水素原子又はメチル基である、（３）に記載の化合物。
（５）
　（１）～（４）のいずれかに記載の化合物からなる、光反応性架橋剤。
（６）
　（１）～（４）のいずれかに記載の化合物からなる、光反応性修飾核酸製造用試薬。
（７）
　（１）～（４）のいずれかに記載の化合物からなる光反応性架橋剤を使用して、該光反応性架橋剤と、ピリミジン環を有する核酸塩基との間に、光架橋を形成する方法。
（８）
　次の式ＩＩＩ：
（ＩＩＩ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000014
（ただし、式ＩＩＩにおいて、
　Ｒ１は、水素原子、ハロゲン原子、メチル基、フッ化メチル基、エチル基、フッ化エチル基、及びＣ１～Ｃ３のアルキルスルファニル基からなる群から選択された基であり、
　Ｒ１１及びＲ１２は、それぞれ独立して、水素原子、Ｃ１～Ｃ３のアルキル基、及びＣ１～Ｃ３のアルコキシ基からなる群から選択された基であり、
　ｎａは、１又は２である。）
で表される化合物を、次の式ＩＶ：
（ＩＶ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000015
（ただし、式ＩＶにおいて、
　Ｒ２１及びＲ２２は、それぞれ独立して、水素原子、Ｃ１～Ｃ３のアルキル基、及びＣ１～Ｃ３のアルコキシ基からなる群から選択された基であり、
　ｎｂは、０又は１であり、
　Ｒ３１及びＲ３２は、それぞれ独立して、水素原子、Ｃ１～Ｃ３のアルキル基、及びＣ１～Ｃ３のアルコキシ基からなる群から選択された基であり、
　ｎｃは、０、１、２又は３であり、ｎｃ＋ｎｄは０～３の整数であり、
　Ｒ４１及びＲ４２は、それぞれ独立して、水素原子、Ｃ１～Ｃ３のアルキル基、及びＣ１～Ｃ３のアルコキシ基からなる群から選択された基であり、
　ｎｄは、０、１、２又は３であって、ｎｃ＋ｎｄは０～３の整数であり、
　Ｑ１は、
　　水素原子；
　　Ｑ１に結合するＯと一体となって形成されるリン酸基；
　　Ｑ１に結合するＯと一体となって形成されるリン酸基によって形成されるリン酸ジエステル結合を介して連結されるヌクレオチド、核酸又はペプチド核酸；　及び　
　　以下から選択される保護基：
　　トリチル基、モノメトキシトリチル基、ジメトキシトリチル基、トリメトキシトリチル基、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、ｔ－ブチルジメチルシリル基、アセチル基、ベンゾイル基；
　からなる群から選択される基であり、
　Ｑ２は、
　　水素原子；
　　Ｑ２に結合するＯと一体となって形成されるリン酸基；
　　Ｑ２に結合するＯと一体となって形成されるリン酸基によって形成されるリン酸ジエステル結合を介して連結されるヌクレオチド、核酸又はペプチド核酸；　及び　
　　以下から選択される保護基：
　　２－シアノエチル－Ｎ，Ｎ－ジアルキル（Ｃ１～Ｃ４）ホスホロアミダイト基、メチルホスホンアミダイト基、エチルホスホンアミダイト基、オキサザホスホリジン基、チオホスファイト基、－ＰＨ（＝Ｏ）ＯＨのＴＥＡ塩、－ＰＨ（＝Ｏ）ＯＨのＤＢＵ塩、－ＰＨ（＝Ｓ）ＯＨのＴＥＡ塩、－ＰＨ（＝Ｓ）ＯＨのＤＢＵ塩；
　からなる群から選択される基である。）
で表される化合物と脱水縮合させることによって、次の式Ｖ：
（Ｖ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000016
（ただし、式Ｖにおいて、
　Ｒ１、Ｒ１１及びＲ１２は、それぞれ独立して、上記式ＩＩＩにおいて記載した基であり、
　ｎａは、上記式ＩＩＩにおいて記載した整数であり、
　Ｒ２１、Ｒ２２、Ｒ３１、Ｒ３２、Ｒ４１、Ｒ４２、Ｑ１及びＱ２は、それぞれ独立して、上記式ＩＶにおいて記載した基であり、
　ｎｂ、ｎｃ及びｎｄは、それぞれ上記式ＩＶにおいて記載した整数である。）
で表される化合物を製造する方法。
　本発明は、核酸の光反応技術に使用可能な光反応性架橋剤となる新規な化合物を提供する。これは、天然の糖構造も塩基構造も備えていない、新規な化学構造によるものである。そして、本発明の化合物によれば、従来の光反応性架橋剤よりも長波長の光照射によって光架橋を形成できることから、光照射による核酸や細胞への悪影響を最小限とすることができる。
図１は化合物５のＵＶ－ｖｉｓスペクトルである。 図２は化合物８のＵＶ－ｖｉｓスペクトルである。 図３ａはチミンに対して光架橋させる操作の流れを示す説明図である。 図３ｂは光照射による生成物のＨＰＬＣ分析の結果を示す図である。 図３ｃは光照射時間に伴う架橋率の変化を示すグラフである。 図３ｄは各波長の光照射による生成物のＨＰＬＣ分析の結果を示す図である。 図４ａはシトシンに対して光架橋させる操作の流れを示す説明図である。 図４ｂは各光照射時間による生成物のＨＰＬＣ分析の結果を示す図である。 図５ａは光架橋を開裂させる操作の流れを示す説明図である。 図５ｂは各光照射時間による開裂生成物のＨＰＬＣ分析の結果を示す図である。 図６ａはｐｃ－Ｓによる光架橋を形成させる操作の流れを示す説明図である。 図６ｂは光照射による生成物のＨＰＬＣ分析の結果を示す図である。 図７は各波長での光照射時間（秒）と細胞生存率（％）を対比したグラフである。
　具体的な実施の形態をあげて、以下に本発明を詳細に説明する。本発明は、以下にあげる具体的な実施の形態に限定されるものではない。
［化合物の構造］
　本発明は、次の式Ｉで表される化合物にある：
（Ｉ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000017
　式Ｉにおいて、Ｒ１は、水素原子、ハロゲン原子、メチル基、フッ化メチル基、エチル基、フッ化エチル基、及びＣ１～Ｃ３のアルキルスルファニル基からなる群から選択された基である。Ｒ１は、好ましくは、水素原子、ハロゲン原子、メチル基、又はエチル基であり、特に好ましくは水素原子である。式Ｉにおいて、Ｒ１は、Ｒ１が結合する環の炭素原子に付番された炭素位置として１位、２位、３位、４位のいずれの位置の炭素に結合する水素原子に置換されて結合していてもよいことが示されている。好適な実施の態様において、Ｒ１は３位の炭素原子に結合することができる。
　式Ｉにおいて、Ｘは、以下の式Ｉｓ又は式ＩＩｓで表される基である：
（Ｉｓ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000018
　式Ｉｓにおいて、Ｒ１１及びＲ１２は、それぞれ独立して、水素原子、Ｃ１～Ｃ３のアルキル基、及びＣ１～Ｃ３のアルコキシ基からなる群から選択された基である。Ｒ１１及びＲ１２は、好ましくは、それぞれ独立して、水素原子、メチル基であり、特に好ましくは水素原子である。ｎａは、繰り返し単位の数を示す整数であり、１又は２であり、好ましくは１である。Ｒ１１及びＲ１２は、それぞれの繰り返し単位において独立して、上記の基とすることができる。
　式Ｉｓにおいて、Ｒ２１及びＲ２２は、それぞれ独立して、水素原子、Ｃ１～Ｃ３のアルキル基、及びＣ１～Ｃ３のアルコキシ基からなる群から選択された基である。Ｒ２１及びＲ２２は、好ましくは、それぞれ独立して、水素原子、メチル基であり、特に好ましくは水素原子である。ｎｂは、繰り返し単位の数を示す整数であり、０又は１であり、好ましくは０である。Ｒ２１及びＲ２２は、それぞれの繰り返し単位において独立して、上記の基とすることができる。
　式Ｉｓにおいて、Ｒ３１及びＲ３２は、それぞれ独立して、水素原子、Ｃ１～Ｃ３のアルキル基、及びＣ１～Ｃ３のアルコキシ基からなる群から選択された基である。Ｒ３１及びＲ３２は、好ましくは、それぞれ独立して、水素原子、メチル基であり、特に好ましくは水素原子である。ｎｃは、繰り返し単位の数を示す整数であり、０、１、２又は３であり、好ましくは１である。Ｒ３１及びＲ３２は、それぞれの繰り返し単位において独立して、上記の基とすることができる。ｎｃ＋ｎｄは０～３の整数であり、好ましくは２である。
　式Ｉｓにおいて、Ｒ４１及びＲ４２は、それぞれ独立して、水素原子、Ｃ１～Ｃ３のアルキル基、及びＣ１～Ｃ３のアルコキシ基からなる群から選択された基である。Ｒ４１及びＲ４２は、好ましくは、それぞれ独立して、水素原子又はメチル基である。ｎｄは、繰り返し単位の数を示す整数であり、０、１、２又は３であり、好ましくは１である。Ｒ４１及びＲ４２は、それぞれの繰り返し単位において独立して、上記の基とすることができる。
　式Ｉｓにおいて、Ｑ１は、
　　水素原子；
　　Ｑ１に結合するＯと一体となって形成されるリン酸基；
　　Ｑ１に結合するＯと一体となって形成されるリン酸基によって形成されるリン酸ジエステル結合を介して連結されるヌクレオチド、核酸又はペプチド核酸；　及び　
　　以下から選択される保護基：
　　トリチル基、モノメトキシトリチル基、ジメトキシトリチル基、トリメトキシトリチル基、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、ｔ－ブチルジメチルシリル基、アセチル基、ベンゾイル基；
　からなる群から選択される基とすることができる。
　式Ｉｓにおいて、Ｑ２は、
　　水素原子；
　　Ｑ２に結合するＯと一体となって形成されるリン酸基；
　　Ｑ２に結合するＯと一体となって形成されるリン酸基によって形成されるリン酸ジエステル結合を介して連結されるヌクレオチド、核酸又はペプチド核酸；　及び　
　　以下から選択される保護基：
　　２－シアノエチル－Ｎ，Ｎ－ジアルキル（Ｃ１～Ｃ４）ホスホロアミダイト基、メチルホスホンアミダイト基、エチルホスホンアミダイト基、オキサザホスホリジン基、チオホスファイト基、－ＰＨ（＝Ｏ）ＯＨのトリエチルアミン塩（以下ＴＥＡ塩という）、－ＰＨ（＝Ｏ）ＯＨの１．８－ｄｉａｚａｂｉｃｙｃｌｏ［５．４．０］ｕｎｄｅｃ－７－ｅｙｅ塩（以下ＤＢＵ塩という）、－ＰＨ（＝Ｓ）ＯＨのＴＥＡ塩、－ＰＨ（＝Ｓ）ＯＨのＤＢＵ塩；
　からなる群から選択される基とすることができる。
　２－シアノエチル－Ｎ，Ｎ－ジアルキル（Ｃ１～Ｃ４）ホスホロアミダイト基は、次の構造を有しており、
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000019
上記ジアルキル基となるＲ基とＲ’基は、それぞれＣ１～Ｃ４のアルキル基とすることができる。このような２－シアノエチル－Ｎ，Ｎ－ジアルキル（Ｃ１～Ｃ４）ホスホロアミダイト基として、例えば、２－シアノエチル－Ｎ，Ｎ－ジメチルホスホロアミダイト基、２－シアノエチル－Ｎ，Ｎ－ジエチルホスホロアミダイト基、２－シアノエチル－Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルホスホロアミダイト基をあげることができる。
　メチルホスホンアミダイト基は、次の構造を有しており、
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000020
上記Ｒ基とＲ’基は、それぞれ水素原子又はＣ１～Ｃ４のアルキル基とすることができる。
　エチルホスホンアミダイト基は、次の構造を有しており、
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000021
上記Ｒ基とＲ’基は、それぞれ水素原子又はＣ１～Ｃ４のアルキル基とすることができる。
　オキサザホスホリジン基は、次の構造を有している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000022
　チオホスファイト基は、次の構造を有している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000023
　－ＰＨ（＝Ｏ）ＯＨのＴＥＡ塩、－ＰＨ（＝Ｓ）ＯＨのＴＥＡ塩は、それぞれのトリエチルアミン（ＴＥＡ）の塩である。
　－ＰＨ（＝Ｏ）ＯＨのＤＢＵ塩、－ＰＨ（＝Ｓ）ＯＨのＤＢＵ塩は、それぞれのジアザビシクロウンデセン（ＤＢＵ）の塩である。
　好適な実施の態様において、Ｑ１は、水素原子とすることができる。
　好適な実施の態様において、Ｑ１は、Ｑ１に結合するＯと一体となって形成されるリン酸基によって形成されるリン酸ジエステル結合を介して連結されるヌクレオチド又は核酸とすることができる。
　好適な実施の態様において、Ｑ１は、上述の保護基とすることができ、好ましくは、ジメトキシトリチル基、トリチル基、モノメトキシトリチル基、トリメトキシトリチル基とすることができ、特に好ましくはジメトキシトリチル基とすることができる。
　好適な実施の態様において、Ｑ２は、水素原子とすることができる。
　好適な実施の態様において、Ｑ２は、Ｑ２に結合するＯと一体となって形成されるリン酸基によって形成されるリン酸ジエステル結合を介して連結されるヌクレオチド又は核酸とすることができる。
　好適な実施の態様において、Ｑ２は、上述の保護基とすることができ、好ましくは、２－シアノエチル－Ｎ，Ｎ－ジアルキル（Ｃ１～Ｃ４）ホスホロアミダイト基、オキサザホスホリジン基、チオホスファイト基とすることができる。
（ＩＩｓ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000024
　式ＩＩｓにおいて、Ｒ５１及びＲ５２は、それぞれ独立して、水素原子、Ｃ１～Ｃ３のアルキル基、及びＣ１～Ｃ３のアルコキシ基からなる群から選択された基である。ｎｅは、繰り返し単位の数を示す整数であり、１、２又は３である。Ｒ５１及びＲ５２は、それぞれの繰り返し単位において独立して、上記の基とすることができる。
　式ＩＩｓにおいて、Ｒ６１及びＲ６２は、それぞれ独立して、水素原子、Ｃ１～Ｃ３のアルキル基、及びＣ１～Ｃ３のアルコキシ基からなる群から選択された基である。ｎｆは、繰り返し単位の数を示す整数であり、１、２又は３である。Ｒ６１及びＲ６２は、それぞれの繰り返し単位において独立して、上記の基とすることができる。
　式ＩＩｓにおいて、Ｑ１は、上記式Ｉｓにおいて記載したＱ１とすることができる。
　式ＩＩｓにおいて、Ｑ２は、上記式Ｉｓにおいて記載したＱ２とすることができる。
　好適な実施の態様において、Ｘは、次の式Ｉｔで表される基とすることができる：
（Ｉｔ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000025
　すなわち、好適な実施の態様において、式Ｉｓにおいて、ｎａを１、ｎｂを０、ｎｃを１、ｎｄを１とすることができ、式Ｉｔの構造とすることができる。
　式Ｉｔにおいて、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ３１、Ｒ３２、Ｒ４１、Ｒ４２、Ｑ１、Ｑ２は、それぞれ上記式Ｉｓにおいて記載した基とすることができる。
　好適な実施の態様において、Ｘは、次の式Ｉｕで表される基とすることができる：
（Ｉｕ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000026
　すなわち、好適な実施の態様において、式Ｉｓにおいて、ｎａを１、ｎｂを０、ｎｃを１、ｎｄを１とすることができ、さらに、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ３１、Ｒ３２、Ｒ４１を水素原子とすることができ、式Ｉｕの構造とすることができる。
　式Ｉｕにおいて、Ｒ４２、Ｑ１、Ｑ２は、それぞれ上記式Ｉｓにおいて記載した基とすることができる。
［修飾核酸］
　好適な実施の態様において、Ｑ１を、Ｑ１に結合するＯと一体となって形成されるリン酸基によって形成されるリン酸ジエステル結合を介して連結されるヌクレオチド又は核酸として、Ｑ２を、Ｑ２に結合するＯと一体となって形成されるリン酸基によって形成されるリン酸ジエステル結合を介して連結されるヌクレオチド又は核酸とすることができる。すなわち、上記式Ｉで表される化合物は、特徴的な構造を備えた光応答性人工ヌクレオチドアナログが配列中に取り込まれた修飾核酸又は修飾オリゴヌクレオチドとすることができる。本発明において、このように調整された光応答性修飾核酸と光応答性修飾オリゴヌクレオチドをまとめて光応答性修飾核酸ということがある。本発明に係る修飾核酸において、特徴的な構造を備えた光応答性人工ヌクレオチドアナログが配列中の末端に位置していてもよく、この場合にはＱ１又はＱ２のいずれかの側のみがＱ１又はＱ２に結合するＯと一体となって形成されるリン酸基によって形成されるリン酸ジエステル結合を介して連結される修飾ヌクレオチド又は修飾核酸となる。また、上記の核酸に代えてペプチド核酸を用いて、特徴的な構造を備えた光応答性人工ヌクレオチドアナログが配列中に取り込まれた光応答性修飾ペプチド核酸とすることができる。
［化合物の骨格構造］
　本発明に係る化合物は、式Ｉで表される骨格構造を備えており、式Ｉにおいて天然のヌクレオシド及びヌクレオチドが備えているべきリボースあるいはデオキシリボースによる糖構造を備えていない。さらに、本発明に係る化合物は、式Ｉにおいて天然のヌクレオシド及びヌクレオチドが備えているべきプリン塩基あるいはピリミジン塩基による塩基構造を備えていない。つまり、本発明に係る化合物は、天然のヌクレオシド及びヌクレオチドとは、構造的に全く類似するように思われない化学構造となっている。それにもかかわらず、本発明に係る化合物は、１本鎖の修飾核酸として形成されると、これと相補的な１本鎖の核酸と二重らせんを形成することができる。そして、ピラノカルバゾール部分が光反応によって架橋を形成することができる。
［ヌクレオシドアナログ］
　好適な実施の態様において、Ｑ１及びＱ２を、水素原子とすることができる。すなわち、上記式Ｉで表される化合物は、特徴的な構造を備えた光応答性人工ヌクレオシドアナログ分子とすることができる。
［ヌクレオチドアナログ］
　好適な実施の態様において、Ｑ１を、Ｑ１に結合するＯと一体となって形成されるリン酸基とすることができ、Ｑ２を、水素原子とすることができる。すなわち、上記式Ｉで表される化合物は、特徴的な構造を備えた光応答性人工ヌクレオチドアナログ分子とすることができる。
［修飾核酸製造用試薬］
　好適な実施の態様において、Ｑ１を、上述の保護基とすることができ、Ｑ２を、Ｑ２に結合するＯと一体となって形成されるリン酸基、Ｑ２に結合するＯと一体となって形成されるリン酸基によって形成されるリン酸ジエステル結合を介して連結されるヌクレオチド又は核酸、あるいは上述の保護基、とすることができる。すなわち、上記式Ｉで表される化合物は、光反応性修飾核酸の製造用試薬（合成用試薬）とすることができる。
　好適な実施の態様において、Ｑ１を、上述の保護基とすることができ、Ｑ２を、Ｑ２に結合するＯと一体となって形成されるリン酸基、あるいは上述の保護基、とすることができる。よく知られているように、このような構造を備えた化合物は、核酸合成用のモノマーとして使用することができ、公知のＤＮＡ合成装置によって使用可能な試薬とすることができ、例えばホスホロアミダイト法、及びＨ－ホスホネート法によって使用可能な修飾核酸合成用試薬(修飾核酸合成用モノマー）とすることができる。
　また、Ｑ１を、上述の保護基として、Ｑ２を、Ｑ２に結合するＯと一体となって形成されるリン酸基によって形成されるリン酸ジエステル結合を介して連結されるヌクレオチド又は核酸とした構造はいわゆるモノマーとは言えない構造となっており、修飾核酸と言える構造となっている。このような場合には、そこから合成して鎖長を伸長するための製造用試薬（合成用試薬）として使用することができる。
　このような光反応性修飾核酸製造用試薬（光反応性修飾核酸合成用試薬）として、次のようなモノマーを例示することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000027
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000028
［光反応性架橋剤］
　本発明に係る化合物は、ピラノカルバゾール部分が光反応によって架橋を形成することができる。本発明に係る化合物を、１本鎖の修飾核酸として形成すると、これと相補的な１本鎖の核酸と二重らせんを形成することができ、ピラノカルバゾール部分が光反応によって架橋を形成することができ、結果として、二重らせんの一方の鎖からもう一方の鎖へと形成された鎖間の光架橋（光クロスリンク）を形成することができる。すなわち、本発明に係る化合物は、光反応性架橋剤として使用することができる。
［光架橋の形成］
　本発明に係る修飾核酸は、これを１本鎖核酸として使用すると、これと相補的な１本鎖核酸とハイブリダイズして二重らせんを形成することができる。二重らせんの形成にあたって、ピラノカルバゾール構造部分に対して、相補鎖中において塩基対を形成すべき位置にある核酸塩基については、特段の制約がなく、自由に選択できる。形成された二重らせんに光照射を行うと、二重らせんを形成する核酸鎖の間に、光反応によって架橋を形成することができる。この光架橋は、配列中でピラノカルバゾール構造部分が核酸塩基として位置する位置から配列中で１塩基分だけ５’末端側に位置する核酸塩基に対して、相補鎖中において塩基対を形成する位置にある核酸塩基と、ピラノカルバゾール構造との間に形成される。言い換えれば、この光架橋は、ピラノカルバゾール構造部分に対して、相補鎖中において塩基対を形成すべき位置にある核酸塩基から、配列中で１塩基分だけ３’末端側に位置する核酸塩基と、ピラノカルバゾール構造との間に形成される。
［光架橋の塩基特異性］
　本発明において、ピラノカルバゾール構造が光架橋を形成可能である相手方の塩基は、ピリミジン環を有する塩基である。一方で、ピラノカルバゾール構造は、プリン環を有する塩基とは光架橋を形成しない。すなわち、本発明に係る光架橋性の化合物は、天然の核酸塩基としては、シトシン、ウラシル、及びチミンに対して光架橋を形成し、一方で、グアニン及びアデニンに対しては光架橋を形成しないという、特異性を有している。
［光反応性架橋剤の配列選択性］
　本発明に係る光反応性修飾核酸（光架橋性修飾核酸）は、修飾核酸と相補的な塩基配列を有する配列とハイブリダイズさせて二重らせんを形成させた後に、光架橋させることができる。これによって、目的とする特定の配列に対してのみ光クロスリンク反応（光架橋反応）を行わせることができる。すなわち、本発明に係る光反応性架橋剤は、非常に高い塩基配列選択性を、所望に応じて配列設計して、付与することができる。
［光照射の波長］
　光架橋のために照射される光の波長は、例えば３５０～６００ｎｍの範囲、好ましくは４００～６００ｎｍの範囲、さらに好ましくは４００～５５０ｎｍの範囲、さらに好ましくは４００～５００ｎｍの範囲、さらに好ましくは４００～４５０ｎｍの範囲とすることができる。好適な実施の態様において、これらの範囲の波長にある単波長のレーザー光を使用することができる。このように本発明では、可視光域の波長の光照射によって、光架橋を形成することができる。従来の光反応性架橋剤では、これらの範囲よりも短波長の光照射を必要としていた。本発明によれば、従来の光反応性架橋剤よりも長波長の光照射によって光架橋を形成できることから、光照射による核酸や細胞への悪影響を最小限とすることができる点で、有利である。
［光架橋の開裂］
　本発明の化合物によれば、光架橋を形成した後に、さらに光照射によって光開裂をすることができる。すなわち、本発明に係る光反応性の化合物は、可逆的な光架橋を可能とするものであり、可逆的な光反応性架橋剤として使用することができる。
　この光架橋の可逆性から想起されるように、本発明の化合物による可逆性光反応性架橋剤を使用すれば、特定の塩基配列を有する核酸を、生理的条件下で、分離し、回収し、又は検出することができる。したがって本発明は可逆性光反応性架橋剤を使用して、所望の塩基配列を有する核酸を、分離し、回収し、又は検出する方法にもある。
　光開裂のために照射される光の波長は、例えば３００～３５０ｎｍの範囲、好ましくは３００～３４０ｎｍの範囲とすることができる。好適な実施の態様において、これらの範囲の波長にある単波長のレーザー光を使用することができる。
［光反応の温度］
　好適な実施の態様において、光架橋反応を進行させるためには、一般に０～５０℃、好ましくは０～４０℃、さらに好ましくは０～３０℃、さらに好ましくは０～２０℃、さらに好ましくは０～１０℃、さらに好ましくは０～５℃の範囲の温度で光照射を行う。光開裂反応を進行させるためには、一般に５５～１００℃、好ましくは６０～９０℃、さらに好ましくは６０～８０℃の範囲の温度で光照射を行う。
［光反応の条件］
　本発明による光架橋及び光開裂は、光反応を利用しているために、ｐＨ、塩濃度などに特段の制約がなく、核酸類等の生体高分子が安定に存在可能なｐＨ、塩濃度とした溶液中で、光照射によって行うことができる。
［光反応の時間］
　本発明による光架橋及び光開裂は、極めて迅速に進行する。例えば、光反応性の化合物として知られるソラレンであれば数時間を要する（３５０ｎｍ光照射）ような場合に、それよりもはるかに長波長の光照射によって、例えばわずか１０秒間～６０秒間（４００ｎｍ光照射）で光反応が進行して光架橋する。すなわち、本発明に係る光架橋剤を使用すれば、例えば１～１２０秒間、又は１～６０秒間の光照射によって、光反応を進行させて光架橋を形成させることができる。さらに、本発明による光架橋は、上記の波長及び温度を採用して、例えば１～１２０秒間、又は１～６０秒間の光照射によって、光反応を進行させて光架橋を開裂させることができる。
［光応答性人工ヌクレオシドアナログ分子の合成経路］
　本発明に係る光応答性人工ヌクレオシドアナログ分子は、例えば、後述するスキーム１に示す合成経路に沿って、合成することができる。このスキーム１では、化合物１を得て、そこから化合物４を合成し、アミンと脱水縮合反応させてアミド結合を形成し、化合物５を得るという手順を含むものとなっている。
［アミンとの脱水縮合によるアミドの形成］
　すなわち、スキーム１の合成経路によれば、次の式ＶＩ：
（ＶＩ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000029
（ただし、式ＶＩにおいて、Ｒ１は、式Ｉにおいて記載した基である。）
で表される修飾ピラノカルバゾール分子から、次の式ＩＩＩ：
（ＩＩＩ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000030
（ただし、式ＩＩＩにおいて、
　Ｒ１は、式ＶＩにおいて記載した基であり、
　Ｒ１１及びＲ１２は、式Ｉｓにおいて記載した基であり、
　ｎａは、１又は２である。）
で表されるカルボン酸を合成し、これを次の式ＩＶ：
（ＩＶ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000031
（ただし、式ＩＶにおいて、
　Ｒ２１、Ｒ２２、Ｒ３１、Ｒ３２、Ｒ４１及びＲ４２は、式Ｉｓにおいて記載した基であり、
　ｎｂは、０又は１であり、
　ｎｃは、０、１、２又は３であり、ｎｃ＋ｎｄは０～３の整数であり、
　ｎｄは、０、１、２又は３であって、ｎｃ＋ｎｄは０～３の整数であり、
　Ｑ１は、
　　水素原子；
　　Ｑ１に結合するＯと一体となって形成されるリン酸基；
　　Ｑ１に結合するＯと一体となって形成されるリン酸基によって形成されるリン酸ジエステル結合を介して連結されるヌクレオチド、核酸又はペプチド核酸；　及び　
　　以下から選択される保護基：
　　トリチル基、モノメトキシトリチル基、ジメトキシトリチル基、トリメトキシトリチル基、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、ｔ－ブチルジメチルシリル基、アセチル基、ベンゾイル基；
　からなる群から選択される基であり、
　Ｑ２は、
　　水素原子；
　　Ｑ２に結合するＯと一体となって形成されるリン酸基；
　　Ｑ２に結合するＯと一体となって形成されるリン酸基によって形成されるリン酸ジエステル結合を介して連結されるヌクレオチド、核酸又はペプチド核酸；　及び　
　　以下から選択される保護基：
　　２－シアノエチル－Ｎ，Ｎ－ジアルキル（Ｃ１～Ｃ４）ホスホロアミダイト基、メチルホスホンアミダイト基、エチルホスホンアミダイト基、オキサザホスホリジン基、チオホスファイト基、－ＰＨ（＝Ｏ）ＯＨのＴＥＡ塩、－ＰＨ（＝Ｏ）ＯＨのＤＢＵ塩、－ＰＨ（＝Ｓ）ＯＨのＴＥＡ塩、－ＰＨ（＝Ｓ）ＯＨのＤＢＵ塩；
　からなる群から選択される基である。）
で表されるアミンと脱水縮合反応させることによって、次の式Ｖ：
（Ｖ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000032
（ただし、式Ｖにおいて、
　Ｒ１、Ｒ１１及びＲ１２は、それぞれ独立して、上記式ＩＩＩにおいて記載した基であり、
　ｎａは、上記式ＩＩＩにおいて記載した整数であり、
　Ｒ２１、Ｒ２２、Ｒ３１、Ｒ３２、Ｒ４１、Ｒ４２、Ｑ１及びＱ２は、それぞれ独立して、上記式ＩＶにおいて記載した基であり、
　ｎｂ、ｎｃ及びｎｄは、それぞれ上記式ＩＶにおいて記載した整数である。）
で表される化合物を製造することができる。
　好適な実施の態様において、上記式ＩＶで表される化合物として、次の式ＶＩＩで表される化合物を使用することができる：
（ＶＩＩ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000033
（ただし、式ＶＩＩにおいて、
　Ｒ２１、Ｒ２２、Ｒ３１、Ｒ３２、Ｒ４１及びＲ４２は、式Ｉｓにおいて記載した基であり、
　ｎｂは、０又は１であり、
　ｎｃは、０、１、２又は３であり、ｎｃ＋ｎｄは０～３の整数であり、
　ｎｄは、０、１、２又は３であって、ｎｃ＋ｎｄは０～３の整数である。）
　上記式ＩＶで表される化合物として、次の式ＶＩＩで表される化合物を使用する場合には、上記式Ｖで表される化合物は、次の式ＶＩＩＩで表される化合物とすることができる：
（ＶＩＩＩ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000034
（ただし、式ＶＩＩＩにおいて、
　Ｒ１は、式ＩＩＩにおいて記載した基であり、
　Ｒ１１及びＲ１２は、式ＩＩＩにおいて記載した基であり、
　ｎａは、１又は２であり、
　Ｒ２１、Ｒ２２、Ｒ３１、Ｒ３２、Ｒ４１及びＲ４２は、式ＶＩＩにおいて記載した基であり、
　ｎｂは、０又は１であり、
　ｎｃは、０、１、２又は３であり、ｎｃ＋ｎｄは０～３の整数であり、
　ｎｄは、０、１、２又は３であって、ｎｃ＋ｎｄは０～３の整数である。）
　好適な実施の態様において、上記式ＩＩＩのカルボン酸として、次の式ＩＩＩａ：
（ＩＩＩａ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000035
（ただし、式ＩＩＩａにおいて、Ｒ１は、式ＩＩＩにおいて記載した基である。）
で表されるカルボン酸を使用することができる。
　好適な実施の態様において、上記式ＶＩＩのアミンとして、次の式ＶＩＩａで表されるアミンを使用することができる：
（ＶＩＩａ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000036
（ただし、式ＶＩＩａにおいて、Ｒ４２は式ＶＩＩにおいて記載した基であり、好ましくは、Ｒ４２は水素原子又はメチル基とすることができる。）
　上記式ＩＩＩのカルボン酸として式ＩＩＩａのカルボン酸が使用されて、上記式ＶＩＩのアミンとして式ＶＩＩａのアミンが使用される場合には、上記式ＶＩＩＩの化合物は、次の式ＶＩＩＩａの化合物とすることができる：
（ＶＩＩＩａ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000037
（ただし、式ＶＩＩＩａにおいて、
　Ｒ１は、式ＩＩＩａにおいて記載した基であり、
　Ｒ４２は、式ＶＩＩａにおいて記載した基であり、好ましくは、Ｒ４２は水素原子又はメチル基とすることができる。）
　上述のように、アミンとの脱水縮合によるアミドの形成によって、式Ｖ、式ＶＩＩＩ、式ＶＩＩＩａの化合物を合成することができる。スキーム１の合成経路は、これらの式において、Ｑ１とＱ２が水素原子である場合を例示して、説明したものとなっているが、Ｑ１とＱ２が水素原子以外である場合であっても、アミンとの脱水縮合によるアミドの形成によって式Ｖの化合物を製造することができる。
　上述した本発明に係る合成経路は、ステップが少なく、簡便であり、高い総収率を期待できる点で、優れたものとなっている。さらに、従来の光架橋剤の合成法と対比すると、合成経路中には、塩化水素による活性化のステップなど、操作に注意と熟練を要するステップを含んでいないという点で、有利なものとなっている。すなわち、従来の光反応性の修飾ヌクレオシド分子の合成においては、その構造中にデオキシリボースまたはリボースを備えているために、上記本発明の合成経路と比較すると、合成経路中のステップは多く、複雑であり、総収率は低い。従来型の光反応性の修飾ヌクレオシド分子の合成においては、その構造中にデオキシリボースまたはリボースを備えているために、糖の水酸基の保護と活性化のために、塩化水素による活性化のステップなど、操作に注意と熟練を要するステップを含むものとなっている。したがって、本発明に係る化合物は、上記合成の簡便さと総収率の高さの点でも、優れたものである。また、本発明は、上記の優れた合成方法（製造方法）にもある。
［修飾核酸合成用モノマー及び修飾核酸の合成］
　上記の合成経路によって得られる光応答性人工ヌクレオシドアナログ分子（式ＶＩＩＩ、式ＶＩＩＩａの化合物）を用いて、後述するスキーム１に記載の手法、あるいは当業者に公知の手法を使用して、本発明に係る修飾核酸を得るための合成用モノマー（製造用試薬）を得ることができる。本発明に係る修飾核酸の合成用モノマーの構造は上述した通りであり、これを、ホスホロアミダイト法、及びＨ－ホスホネート法等の公知の手法によって核酸合成試薬として使用すれば、光応答性人工ヌクレオシドアナログ分子（式ＶＩＩＩ、式ＶＩＩＩａの化合物）が配列中に取り込まれた核酸又はオリゴヌクレオチド（本発明に係る修飾核酸）あるいはペプチド核酸を得ることができる。このように、本発明に係る修飾核酸合成モノマーは、ホスホロアミダイト法、及びＨ－ホスホネート法等の公知の手法において核酸合成試薬として使用できる点で、優れたものである。
　以下に実施例をあげて、本発明を詳細に説明する。本発明は、以下に例示する実施例に限定されるものではない。
［ｐｃ－Ｄホスホロアミダイトの合成］
　次のスキーム１に示す６段階の合成経路に沿って、Ｄ－トレオニノール構造を有する光応答性人工ヌクレオシドアナログ分子（化合物５）（ヌクレオシドアナログ、あるいは光反応性素子ということがある）を合成し、さらに修飾核酸合成用モノマー（化合物７）の合成を行った。
　スキーム１：
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000038
（１）化合物２の合成
　非特許文献（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｏｆ　ｆｕｓｅｄ　ｐｙｒａｎｏｃａｒｂａｚｏｌｏｎｅｓ　ｗｉｔｈ　ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｉｎｔｅｒｅｓｔ，　Ａ．Ｖｒｏｎｔｅｌｉ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃｏｍｍｅｍｏｒａｔｉｖｅ　Ｉｓｓｕｅ　ｉｎ　Ｈｏｎｏｒ　ｏｆ　Ｐｒｏｆ．　Ｍｉｃｈａｅｌ　Ｏｒｆａｎｏｐｏｕｌｏｓ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｏｃｃａｓｉｏｎ　ｏｆ　ｈｉｓ　ｏｕｔｓｔａｎｄｉｎｇ　ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ　ｔｏ　ｏｒｇａｎｉｃ　ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ　ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌｕｍｅ２０１５，Ｉｓｓｕｅ３，ｐｐ．１１１－１２３）に従い、２－ヒドロキシカルバゾール（化合物１）からピラノカルバゾール（化合物２）を合成した。
（２）化合物３の合成
　化合物２（４．７ｇ）と水酸化ナトリウム（２．４ｇ）を仕込んだフラスコにアセトニトリル（１０００ｍｌ）を仕込み、室温で１時間撹拌したのち、ブロモ酢酸エチル（６．６７ｇ）を滴下し、さらに室温で１時間撹拌した。残留している水酸化ナトリウムをヌッチェ型ろ過器で吸引ろ過により除去し、ろ液をロータリーエバポレーターで濃縮した。得られた化合物３（固体）を次工程にそのまま用いた。得られた化合物を用いてＮＭＲ測定を実施し、各ピークの帰属を決定し、化合物の構造を確認した。
１Ｈ－ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣＬ3）：８．１４－７．２１（ｍ，６Ｈ，ＡｒＨ）、７．８８（ｄ，１Ｈ，Ｏ＝Ｃ－ＣＨ＝ＣＨ）、６．３４（ｄ，１Ｈ，Ｏ＝Ｃ－ＣＨ＝ＣＨ）、４．９９（ｓ，２Ｈ，ＣＨ2ＣＯ）、４．２４（ｑ，２Ｈ，ＣＨ3ＣＨ2）、１．２７（ｔ，３Ｈ，ＣＨ3）
（３）化合物４の合成
　先の工程で得られた化合物３をＴＨＦ（１０００ｍｌ）に溶解させた。水酸化ナトリウム（０．９ｇ）を水（５０ｍｌ）に溶解した水溶液を、先のＴＨＦ溶液へ滴下し、室温で３時間撹拌した。反応終了後、反応液を希塩酸で中和してｐＨ６～７にした。反応液をロータリーエバポレーターで濃縮し、酢酸エチルを用いた分液操作により有機相へ目的物を抽出した。有機層をロータリーエバポレーターで濃縮し、化合物４（固体）を得た。得られた化合物４をそのまま次工程に用いた。得られた化合物を用いてＮＭＲ測定を実施し、各ピークの帰属を決定し、化合物の構造を確認した。
１Ｈ－ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：８．４８－７．３０（ｍ，６Ｈ，Ａｒ－Ｈ）、８．１８（ｄ，１Ｈ，Ｏ＝Ｃ－ＣＨ＝ＣＨ）、６．３５（ｄ，１Ｈ，Ｏ＝Ｃ－ＣＨ＝ＣＨ）、５．３０（ｓ，２Ｈ，ＣＨ2ＣＯ）
（４）化合物５（トレオニノール骨格型ピラノカルバゾールヌクレオシドアナログ：ｐｃ－Ｄ）の合成
　前工程で得られた化合物４、１－ヒドロキシベンゾトリアゾール（２．７ｇ）、１－（３－ジメチルアミノプロピル）－３－エチルカルボジイミド塩酸塩（３．８ｇ）、Ｄ－トレオニノール（２．１ｇ）をフラスコに仕込み、窒素置換後にＤＭＦ（１００ｍｌ）に溶解させ、室温で２時間撹拌した。反応混合物を撹拌しながら、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を添加した。生成した沈殿物をガラスフィルター付ろ過器で吸引ろ過した。沈殿物を蒸留水およびヘキサンで洗浄後、乾燥させて化合物５（固体）を得た。得られた化合物５のＵＶ－ｖｉｓスペクトルを分光光度計により測定し（図１）、２５０～４００ｎｍに現れた特徴的な吸収ピークから、ピラノカルバゾール構造を有することを確認した。また、得られた化合物を用いてＮＭＲ測定を実施し、各ピークの帰属を決定し、化合物の構造を確認した。
１Ｈ－ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：８．４８－７．２９（ｍ，６Ｈ，Ａｒ－Ｈ）、８．１９（ｄ，１Ｈ，Ｏ＝Ｃ－ＣＨ＝ＣＨ）、８．０３（ｄ，１Ｈ，ＮＨＣＯ）、６．３４（ｄ，１Ｈ，Ｏ＝Ｃ－ＣＨ＝ＣＨ）、５．１７（ｓ，２Ｈ，ＣＨ2ＣＯ）、４．７５（ｂｒ，１Ｈ，ＣＨ2ＯＨ）、４．６８（ｂｒ，１Ｈ，ＣＨＯＨ）、３．９１（ｂｒ，１Ｈ，ＮＨＣＨ）、３．６４（ｍ，１Ｈ，ＣＨ2ＯＨ）、３．５１（ｍ，１Ｈ，ＣＨ2ＯＨ）、１．０３（ｄ，３Ｈ，ＣＨ3）
（５）化合物６の合成
　化合物５（４．６ｇ）、４－ジメチルアミノピリジン（０．３ｇ）をフラスコに仕込み、窒素置換後にピリジン（５５ｍｌ）を加え、氷水浴中で冷却しながら溶解させた。４，４’－ジメトキシトリチルクロリド（８．３ｇ）を添加し、氷水浴中で１時間撹拌し反応させた。反応混合物をロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮物をフラッシュクロマトグラフィーにより精製し化合物６を得た。得られた化合物を用いてＮＭＲ測定を実施し、各ピークの帰属を決定し、化合物の構造を確認した。
１Ｈ－ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣＬ3）：８．１３－７．０３（ｍ，１１Ｈ，Ａｒ－Ｈ）、７．８５（ｄ，１Ｈ，Ｏ＝Ｃ－ＣＨ＝ＣＨ）、６．９５－６．６９（ｍ，８Ｈ，ＭｅＯ－Ａｒ－Ｈ）、６．３３（ｄ，１Ｈ，Ｏ＝Ｃ－ＣＨ＝ＣＨ）、６．２９（ｄ，１Ｈ，ＮＨＣＯ）、４．９６（ｓ，２Ｈ，ＣＨ2ＣＯ）、３．８８（ｍ，１Ｈ，ＮＣＨ）、３．８８（ｍ，１Ｈ，ＣＨＯＨ）、３．７７（ｓ，６Ｈ，ＯＣＨ3）、３．２５－３．１２（ｍ，２Ｈ，ＣＨ2－ＯＤＭＴｒ）、２．５２（ｍ，１Ｈ，ＣＨＯＨ）、０．９３（ｄ，３Ｈ，ＣＨ3）
（６）化合物７（ｐｃ－Ｄホスホロアミダイト）の合成
　化合物６（７．２ｇ）、５－ベンジルチオ－１Ｈ－テトラゾール（０．２ｇ）をフラスコに仕込み、窒素置換後に、アセトニトリル（１６０ｍｌ）を加え、氷水浴中で溶解させた。２－シアノエチルＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトライソプロピルホスホロアミダイト（５．３ｇ）を加え、室温で２時間撹拌した。反応混合物をロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮物をフラッシュクロマトグラフィーにより精製し化合物７を得た。得られた化合物を用いてＮＭＲ測定を実施し、各ピークの帰属を決定し、化合物の構造を確認した。
１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＣＤＣＬ3）：８．１２－７．１８（ｍ，１１Ｈ，Ａｒ－Ｈ）、７．８６（ｄ，１Ｈ，Ｏ＝Ｃ－ＣＨ＝ＣＨ）、７．１２－６．７１（ｍ，８Ｈ，ＭｅＯ－Ａｒ－Ｈ）、６．３４（ｄ，１Ｈ，Ｏ＝Ｃ－ＣＨ＝ＣＨ）、５．８７（ｄ，１Ｈ，ＮＨＣＯ）、４．９３（ｓ，２Ｈ，ＣＨ2ＣＯ）、４．２２（ｍ，１Ｈ，ＣＨＯＰ）、４．１２（ｑ，２Ｈ，ＮＣ－ＣＨ2－ＣＨ2）、４．０７（ｍ，１Ｈ，ＮＨＣＨ）、３．７７（ｓ，６Ｈ，ＯＣＨ3）、３．００（ｍ，２Ｈ，ＣＨ2Ｏ－ＤＭＴｒ）、２．１０－２．００（ｍ，２Ｈ，Ｎ－ＣＨ－（ＣＨ3）2）、１．２６（ｔ，２Ｈ，ＮＣ－ＣＨ２）、１．０６－０．４３（ｍ，１２Ｈ，Ｎ－ＣＨ－（ＣＨ3）2）、０．９３（ｄ，３Ｈ，ＣＨ3）
［光反応性素子（ｐｃ－Ｄ）を含むオリゴＤＮＡの合成］
　一般的なシアノエチルホスホロアミダイト法に従い、ＤＮＡ自動合成機により光反応性素子（核酸光反応性素子ということがある）を含むオリゴＤＮＡを合成した。化合物７の固相縮合反応のみ反応時間を９９９秒に設定した。トリチリルモニターによる化合物７のカップリング収率は９８％以上であった。２８質量％アンモニア水溶液を用いた固相からの切出し・脱保護を行った後、逆相ＨＰＬＣによる精製を行い目的の核酸光反応性素子を含むオリゴＤＮＡ（５’－ＴＧＣＡＸＣＣＧＴ－３’、Ｘは核酸光反応性素子（ｐｃ－Ｄ））を得た。オリゴＤＮＡの同定はＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳ解析により行った。（［（Ｍ＋Ｈ）＋］；Ｃａｌｃｄ．２８２７．８０，Ｆｏｕｎｄ　２８２８．９４）
　ＤＮＡ配列を一部変更してＤＮＡ自動合成機に入力した以外は上記と同様の操作で、核酸光反応性素子を含むオリゴＤＮＡ（５’－ＴＧＣＧＸＣＣＧＴ－３’、Ｘは核酸光反応性素子（ｐｃ－Ｄ））を得た。
［ｐｃ－Ｓホスホロアミダイトおよびｐｃ－Ｓ含有ＤＮＡの合成］
　上記合成したｐｃ－Ｄにおいてトレオニノールをセリノール（２－アミノ－１，３－プロパンジオール）に変えた構造に相当する光応答性人工ヌクレオシドアナログ（化合物８）（ｐｃ－Ｓ）を、次のスキーム２に示す６段階の合成経路（化合物４まではｐｃ－Ｄと同様）に沿って合成した。さらに修飾核酸合成用モノマー（化合物１０）の合成を行った。
スキーム２：
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000039
（１）化合物８（セリノール骨格型ピラノカルバゾールヌクレオシドアナログ：ｐｃ－Ｓ）の合成
　Ｄ－トレオニノールをセリノールへ変更して化合物５を合成する方法と同様の操作を行い、化合物８を合成した。得られた化合物８のＵＶ－ｖｉｓスペクトルを分光光度計により測定し（図２）、２５０～４００ｎｍに現れた特徴的な吸収ピークから、ピラノカルバゾール構造を有することを確認した。また、得られた化合物を用いてＮＭＲ測定を実施し、各ピークの帰属を決定し、化合物の構造を確認した。
１Ｈ－ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：８．５４－７．２６（ｍ，６Ｈ，Ａｒ－Ｈ），８．２１（ｄ，１Ｈ，Ｏ＝Ｃ－ＣＨ＝ＣＨ），８．０３（ｄ，１Ｈ，ＮＨＣＯ），６．３４（ｄ，１Ｈ，Ｏ＝Ｃ－ＣＨ＝ＣＨ），５．１１（ｓ，２Ｈ，ＣＨ2ＣＯ），４．７３（ｂｒ，２Ｈ，ＣＨ2ＯＨ），３．７５（ｂｒ，１Ｈ，ＮＨＣＨ），３．４３（ｍ，４Ｈ，ＣＨ2ＯＨ）
（２）化合物９および化合物１０（ｐｃ－Ｓホスホロアミダイト）の合成
　化合物９および化合物１０（ｐｃ－Ｓホスホロアミダイト）の合成を、スキーム１の化合物６および化合物７を合成する方法と同様の方法で実施した。
［光反応性素子（ｐｃ－Ｓ）を含むオリゴＤＮＡの合成］
　化合物１０を用いて、ｐｃ－Ｄホスホロアミダイトと同様の操作により、核酸光反応性素子を含むオリゴＤＮＡ（５’－ＴＧＣＡＸＣＣＧＴ－３’、Ｘは核酸光反応性素子（ｐｃ－Ｓ））を得た。
［ｐｃ－Ｄの光反応性の評価］
　前記ｐｃ－Ｄを含むオリゴＤＮＡ［以下、ＯＤＮ（Ｙ・ｐｃ－Ｄ）という、ＹはＡ（アデニン）またはＧ（グアニン）］と、相補的オリゴＤＮＡ［以下、ＯＤＮ（Ｚ）という、ＺはＴ（チミン）またはＣ（シトシン）］の等量混合液（５μＭ　ｉｎ　５０ｍＭ　Ｎａ－Ｃａｃｏｄｙｌａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４），１００ｍＭ　ＮａＣｌ）に内部標準としてデオキシウリジン（２５μＭ）を添加し、４℃にて光照射（４００ｎｍ、９５００ｍＷ／ｃｍ2）を行った。この溶液をＨＰＬＣ（溶離液：アセトニトリル／５０ｍＭギ酸アンモニウム、１～２０％アセトニトリル／１０ｍｉｎ、流速：０．２ｍＬ／ｍｉｎ）により分析することで、光反応性を評価した。
（１）チミンを対象とした光架橋反応
　図３ａは、この操作の流れを示す説明図である。光架橋対象がチミン（Ｔ）となるＯＤＮ（Ａ・ｐｃ－Ｄ）（５’－ＴＧＣＡＸＣＣＧＴ－３’）には、配列中のＸの位置に、本発明に係るヌクレオシドアナログ（ｐｃ－Ｄ）が、改良型光反応性素子として導入されている。
　図３ｂはＯＤＮ（Ａ・ｐｃ－Ｄ）と相補的オリゴＤＮＡであるＯＤＮ（Ｔ）（５’－ＡＣＧＧＧＴＧＣＡ－３’）を使用して、Ｕ－ＶＩＸ製のＵＶ－ＬＥＤ照射装置（ＯｍｎｉＣｕｒｅ（登録商標）ＬＸ４０５Ｓ）を用いて４００ｎｍの光を照射した後に、ＨＰＬＣによって分析した結果を示す図である。縦軸方向に並べられたチャートはそれぞれ光照射時間（０秒、１秒、５秒、１０秒、３０秒）に対応しており、横軸は保持時間（分）を示す。光照射前（０秒）の時点で存在していたＯＤＮ（Ａ・ｐｃ－Ｄ）およびＯＤＮ（Ｔ）のピークが光照射によって減少し、同時にＯＤＮ（Ａ・ｐｃ－Ｄ）とＯＤＮ（Ｔ）とが架橋した光２量体（ＯＤＮ（ｐｃ－Ｄ／Ｔ））のピークが出現した。光照射時間の増加に伴い、（ＯＤＮ（ｐｃ－Ｄ／Ｔ））のピーク面積が増大しており、光架橋反応が進行していることを確認した。図３ｃは、光照射時間に伴う架橋率の変化をグラフにしたものである。図３ｃの横軸は光照射時間（秒）、縦軸は転化率（％）である。この転化率、すなわち単量体から二量体へと変化した割合は、完全に二量体と変化した場合を転化率１００％とした。本発明に係るヌクレオシドアナログ、すなわちＯＤＮ（Ａ・ｐｃ－Ｄ）は、照射１０秒後に９４％という高い転化率を示し、１時間後にはほぼ１００％架橋した。
　図３ｄは同じくＯＤＮ（Ａ・ｐｃ－Ｄ）とＯＤＮ（Ｔ）を使用して、日本分光株式会社製のＣＲＭ－ＦＤ型照射分光器を用いて、４５０、５００、５５０ｎｍの光を１時間照射した場合のＨＰＬＣ分析結果である。それぞれの転化率は、４５０ｎｍで８６％、５００ｎｍで７０％、５５０ｎｍで３８％であった。
（２）シトシンを対象とした光架橋反応
　ＯＤＮ（Ａ・ｐｃ－Ｄ）と同様の操作で、Ｃ（シトシン）が光架橋対象となるｐｃ－Ｄ含有オリゴＤＮＡ（５’－ＴＧＣＧＸＣＣＧＴ－３’、以下、ＯＤＮ（Ｇ・ｐｃ－Ｄ）という）と、相補的オリゴＤＮＡ（５’－ＡＣＧＧＧＣＧＣＡ－３’）、以下、ＯＤＮ（Ｃ）という）を用いた光架橋反応を行った（図４ａ）。４００ｎｍの光を３０秒間照射した結果、光架橋による転化率は７１％であった（図４ｂ）。
［ｐｃ－Ｄの光架橋体の光開裂反応］
　ＯＤＮ（Ａ・ｐｃ－Ｄ）およびＯＤＮ（Ｔ）の混合溶液の光照射（４００ｎｍ，６０秒間）によって調製した光２量体ＯＤＮ（ｐｃ－Ｄ／Ｔ）溶液を６０℃で加温し、１５Ｗのトランスイルミネーターを用いて３１２ｎｍ光を、０分、５分、３０分間照射した（図５ａ）。光照射により、ＯＤＮ（ｐｃ－Ｄ／Ｔ）のピークが減少し、もとのＯＤＮ（Ａ・ｐｃ－Ｄ）およびＯＤＮ（Ｔ）のピークが出現した。照射３０分後には、ＯＤＮ（ｐｃ－Ｄ／Ｔ）のピークは消滅し、転化率１００％であった（図５ｂ）。
［ｐｃ－Ｓの光反応性の評価］
　ＯＤＮ（Ａ・ｐｃ－Ｄ）と同様の操作で、Ｔ（チミン）が光架橋対象となるｐｃ－Ｓ含有オリゴＤＮＡ（５’－ＴＧＣＧＸＣＣＧＴ－３’、以下、ＯＤＮ（Ａ・ｐｃ－Ｓ）という）と、相補的オリゴＤＮＡであるＯＤＮ（Ｔ）を用いた光架橋反応を行った（図６ａ）。
　図６ｂは、Ｕ－ＶＩＸ製のＵＶ－ＬＥＤ照射装置（ＯｍｎｉＣｕｒｅ（登録商標）ＬＸ４０５Ｓ）を用いて４００ｎｍの光を照射６０秒間した後に、ＨＰＬＣによって分析した結果である。縦軸方向に並べられたチャートはそれぞれ光照射時間（０秒、６０秒）に対応しており、横軸は保持時間（分）を示す。光照射前（０秒）の時点で存在していたＯＤＮ（Ａ・ｐｃ－Ｓ）とＯＤＮ（Ｔ）のピークが光照射によって減少し、同時に光２量体（ＯＤＮ（ｐｃ－Ｓ／Ｔ））のピークが出現した。
［照射光波長の細胞への影響の検討］
　長波長の光照射が、短波長の光照射と比較して、細胞へのダメージが少ないことを検討するために、以下の実験を行った。
　９６穴プレートに５×１０5ｃｅｌｌ／ｍｌの細胞（ＧＦＰ－ＨｅＬａ細胞、ヒト子宮頸癌由来株）を１００μＬ分注し、ＣＯ2インキュベータで４８時間培養した。その後、３６６ｎｍ、４００ｎｍ、又は４５０ｎｍの波長の光で光照射を行った後、Ｃｅｌｌ　ｃｏｕｎｔｉｎｇ　ｋｉｔを１０μＬずつ入れ、ＣＯ2インキュベータで４時間呈色した後、マイクロプレートリーダを用い、４５０ｎｍの吸光度を測定し、細胞生存率を算出した。この結果を、図７にまとめて示す。
［結果］
　図７は、各波長での光照射時間（秒）と細胞生存率（％）を対比したグラフである。この結果から、３６６ｎｍの光照射では数秒の光照射でも細胞生存率が大きく低下しているのに対して、４００ｎｍ、４５０ｎｍでは、数十秒光照射を行ってもほとんど細胞生存率が低下していない。すなわち、このことからもピラノカルバゾールが細胞毒性の少ない長波長の光で操作可能であることが明らかとなった。
　本発明は、核酸の光反応技術に使用可能な光反応性架橋剤となる新規な化合物を提供する。本発明は産業上有用な発明である。

Claims (8)

  1. 　次の式Ｉで表される化合物：
    （Ｉ）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000001
    （ただし、式Ｉにおいて、
    　Ｒ１は、水素原子、ハロゲン原子、メチル基、フッ化メチル基、エチル基、フッ化エチル基、及びＣ１～Ｃ３のアルキルスルファニル基からなる群から選択された基であり、
    　Ｘは、次の式Ｉｓ又は式ＩＩｓで表される基である：
    （Ｉｓ）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000002
    （ただし、式Ｉｓにおいて、
    　Ｒ１１及びＲ１２は、それぞれ独立して、水素原子、Ｃ１～Ｃ３のアルキル基、及びＣ１～Ｃ３のアルコキシ基からなる群から選択された基であり、
    　ｎａは、１又は２であり、
    　Ｒ２１及びＲ２２は、それぞれ独立して、水素原子、Ｃ１～Ｃ３のアルキル基、及びＣ１～Ｃ３のアルコキシ基からなる群から選択された基であり、
    　ｎｂは、０又は１であり、
    　Ｒ３１及びＲ３２は、それぞれ独立して、水素原子、Ｃ１～Ｃ３のアルキル基、及びＣ１～Ｃ３のアルコキシ基からなる群から選択された基であり、
    　ｎｃは、０、１、２又は３であり、ｎｃ＋ｎｄは０～３の整数であり、
    　Ｒ４１及びＲ４２は、それぞれ独立して、水素原子、Ｃ１～Ｃ３のアルキル基、及びＣ１～Ｃ３のアルコキシ基からなる群から選択された基であり、
    　ｎｄは、０、１、２又は３であって、ｎｃ＋ｎｄは０～３の整数であり、
    　Ｑ１は、
    　　水素原子；
    　　Ｑ１に結合するＯと一体となって形成されるリン酸基；
    　　Ｑ１に結合するＯと一体となって形成されるリン酸基によって形成されるリン酸ジエステル結合を介して連結されるヌクレオチド、核酸又はペプチド核酸；　及び　
    　　以下から選択される保護基：
    　　トリチル基、モノメトキシトリチル基、ジメトキシトリチル基、トリメトキシトリチル基、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、ｔ－ブチルジメチルシリル基、アセチル基、ベンゾイル基；
    　からなる群から選択される基であり、
    　Ｑ２は、
    　　水素原子；
    　　Ｑ２に結合するＯと一体となって形成されるリン酸基；
    　　Ｑ２に結合するＯと一体となって形成されるリン酸基によって形成されるリン酸ジエステル結合を介して連結されるヌクレオチド、核酸又はペプチド核酸；　及び　
    　　以下から選択される保護基：
    　　２－シアノエチル－Ｎ，Ｎ－ジアルキル（Ｃ１～Ｃ４）ホスホロアミダイト基、メチルホスホンアミダイト基、エチルホスホンアミダイト基、オキサザホスホリジン基、チオホスファイト基、－ＰＨ（＝Ｏ）ＯＨのＴＥＡ塩、－ＰＨ（＝Ｏ）ＯＨのＤＢＵ塩、－ＰＨ（＝Ｓ）ＯＨのＴＥＡ塩、－ＰＨ（＝Ｓ）ＯＨのＤＢＵ塩；
    　からなる群から選択される基である。）
    （ＩＩｓ）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000003
    （ただし、式ＩＩｓにおいて、
    　Ｒ５１及びＲ５２は、それぞれ独立して、水素原子、Ｃ１～Ｃ３のアルキル基、及びＣ１～Ｃ３のアルコキシ基からなる群から選択された基であり、
    　ｎｅは、１、２又は３であり、
    　Ｒ６１及びＲ６２は、それぞれ独立して、水素原子、Ｃ１～Ｃ３のアルキル基、及びＣ１～Ｃ３のアルコキシ基からなる群から選択された基であり、
    　ｎｆは、０、１、２又は３であり、
    　Ｑ１は、
    　　水素原子；
    　　Ｑ１に結合するＯと一体となって形成されるリン酸基；
    　　Ｑ１に結合するＯと一体となって形成されるリン酸基によって形成されるリン酸ジエステル結合を介して連結されるヌクレオチド、核酸又はペプチド核酸；　及び　
    　　以下から選択される保護基：
    　　トリチル基、モノメトキシトリチル基、ジメトキシトリチル基、トリメトキシトリチル基、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、ｔ－ブチルジメチルシリル基、アセチル基、ベンゾイル基；
    　からなる群から選択される基であり、
    　Ｑ２は、
    　　水素原子；
    　　Ｑ２に結合するＯと一体となって形成されるリン酸基；
    　　Ｑ２に結合するＯと一体となって形成されるリン酸基によって形成されるリン酸ジエステル結合を介して連結されるヌクレオチド、核酸又はペプチド核酸；　及び　
    　　以下から選択される保護基：
    　　２－シアノエチル－Ｎ，Ｎ－ジアルキル（Ｃ１～Ｃ４）ホスホロアミダイト基、メチルホスホンアミダイト基、エチルホスホンアミダイト基、オキサザホスホリジン基、チオホスファイト基、－ＰＨ（＝Ｏ）ＯＨのＴＥＡ塩、－ＰＨ（＝Ｏ）ＯＨのＤＢＵ塩、－ＰＨ（＝Ｓ）ＯＨのＴＥＡ塩、－ＰＨ（＝Ｓ）ＯＨのＤＢＵ塩；
    　からなる群から選択される基である。））。
  2. 　Ｘが、次の式Ｉｔで表される基である、請求項１に記載の化合物：
    （Ｉｔ）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000004
    （ただし、式Ｉｔにおいて、
    　Ｒ１１及びＲ１２は、それぞれ独立して、式Ｉｓにおいて記載した基であり、
    　Ｒ３１及びＲ３２は、それぞれ独立して、式Ｉｓにおいて記載した基であり、
    　Ｒ４１及びＲ４２は、それぞれ独立して、式Ｉｓにおいて記載した基であり、
    　Ｑ１及びＱ２は、式Ｉｓにおいて記載した基である。）。
  3. 　Ｘが、次の式Ｉｕで表される基である、請求項１に記載の化合物：
    （Ｉｕ）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000005
    （ただし、式Ｉｕにおいて、
    　Ｒ４２は、式Ｉｓにおいて記載した基であり、
    　Ｑ１及びＱ２は、式Ｉｓにおいて記載した基である。）。
  4. 　Ｒ４２が、水素原子又はメチル基である、請求項３に記載の化合物。
  5. 　請求項１～４のいずれかに記載の化合物からなる、光反応性架橋剤。
  6. 　請求項１～４のいずれかに記載の化合物からなる、光反応性修飾核酸製造用試薬。
  7. 　請求項１～４のいずれかに記載の化合物からなる光反応性架橋剤を使用して、該光反応性架橋剤と、ピリミジン環を有する核酸塩基との間に、光架橋を形成する方法。
  8. 　次の式ＩＩＩ：
    （ＩＩＩ）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000006
    （ただし、式ＩＩＩにおいて、
    　Ｒ１は、水素原子、ハロゲン原子、メチル基、フッ化メチル基、エチル基、フッ化エチル基、及びＣ１～Ｃ３のアルキルスルファニル基からなる群から選択された基であり、
    　Ｒ１１及びＲ１２は、それぞれ独立して、水素原子、Ｃ１～Ｃ３のアルキル基、及びＣ１～Ｃ３のアルコキシ基からなる群から選択された基であり、
    　ｎａは、１又は２である。）
    で表される化合物を、次の式ＩＶ：
    （ＩＶ）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000007
    （ただし、式ＩＶにおいて、
    　Ｒ２１及びＲ２２は、それぞれ独立して、水素原子、Ｃ１～Ｃ３のアルキル基、及びＣ１～Ｃ３のアルコキシ基からなる群から選択された基であり、
    　ｎｂは、０又は１であり、
    　Ｒ３１及びＲ３２は、それぞれ独立して、水素原子、Ｃ１～Ｃ３のアルキル基、及びＣ１～Ｃ３のアルコキシ基からなる群から選択された基であり、
    　ｎｃは、０、１、２又は３であり、ｎｃ＋ｎｄは０～３の整数であり、
    　Ｒ４１及びＲ４２は、それぞれ独立して、水素原子、Ｃ１～Ｃ３のアルキル基、及びＣ１～Ｃ３のアルコキシ基からなる群から選択された基であり、
    　ｎｄは、０、１、２又は３であって、ｎｃ＋ｎｄは０～３の整数であり、
    　Ｑ１は、
    　　水素原子；
    　　Ｑ１に結合するＯと一体となって形成されるリン酸基；
    　　Ｑ１に結合するＯと一体となって形成されるリン酸基によって形成されるリン酸ジエステル結合を介して連結されるヌクレオチド、核酸又はペプチド核酸；　及び　
    　　以下から選択される保護基：
    　　トリチル基、モノメトキシトリチル基、ジメトキシトリチル基、トリメトキシトリチル基、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、ｔ－ブチルジメチルシリル基、アセチル基、ベンゾイル基；
    　からなる群から選択される基であり、
    　Ｑ２は、
    　　水素原子；
    　　Ｑ２に結合するＯと一体となって形成されるリン酸基；
    　　Ｑ２に結合するＯと一体となって形成されるリン酸基によって形成されるリン酸ジエステル結合を介して連結されるヌクレオチド、核酸又はペプチド核酸；　及び　
    　　以下から選択される保護基：
    　　２－シアノエチル－Ｎ，Ｎ－ジアルキル（Ｃ１～Ｃ４）ホスホロアミダイト基、メチルホスホンアミダイト基、エチルホスホンアミダイト基、オキサザホスホリジン基、チオホスファイト基、－ＰＨ（＝Ｏ）ＯＨのＴＥＡ塩、－ＰＨ（＝Ｏ）ＯＨのＤＢＵ塩、－ＰＨ（＝Ｓ）ＯＨのＴＥＡ塩、－ＰＨ（＝Ｓ）ＯＨのＤＢＵ塩；
    　からなる群から選択される基である。）
    で表される化合物と脱水縮合させることによって、次の式Ｖ：
    （Ｖ）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000008
    （ただし、式Ｖにおいて、
    　Ｒ１、Ｒ１１及びＲ１２は、それぞれ独立して、上記式ＩＩＩにおいて記載した基であり、
    　ｎａは、上記式ＩＩＩにおいて記載した整数であり、
    　Ｒ２１、Ｒ２２、Ｒ３１、Ｒ３２、Ｒ４１、Ｒ４２、Ｑ１及びＱ２は、それぞれ独立して、上記式ＩＶにおいて記載した基であり、
    　ｎｂ、ｎｃ及びｎｄは、それぞれ上記式ＩＶにおいて記載した整数である。）
    で表される化合物を製造する方法。
PCT/JP2018/027169 2017-07-26 2018-07-19 可視光域で光架橋可能な光応答性ヌクレオチドアナログ WO2019021945A1 (ja)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP18837260.1A EP3660021B1 (en) 2017-07-26 2018-07-19 Photoresponsive nucleotide analog capable of photocrosslinking in visible light region
US16/629,148 US11078211B2 (en) 2017-07-26 2018-07-19 Photoresponsive nucleotide analog capable of photocrosslinking in visible light region
CN201880035889.3A CN110719912B (zh) 2017-07-26 2018-07-19 在可见光区能进行光交联的光响应性核苷酸类似物

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2017144935A JP6920689B2 (ja) 2017-07-26 2017-07-26 可視光域で光架橋可能な光応答性ヌクレオチドアナログ
JP2017-144935 2017-07-26

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2019021945A1 true WO2019021945A1 (ja) 2019-01-31

Family

ID=65040223

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2018/027169 WO2019021945A1 (ja) 2017-07-26 2018-07-19 可視光域で光架橋可能な光応答性ヌクレオチドアナログ

Country Status (5)

Country Link
US (1) US11078211B2 (ja)
EP (1) EP3660021B1 (ja)
JP (1) JP6920689B2 (ja)
CN (1) CN110719912B (ja)
WO (1) WO2019021945A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP7475056B2 (ja) 2019-01-30 2024-04-26 国立大学法人北陸先端科学技術大学院大学 光応答性ヌクレオチドアナログの製造方法

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6920689B2 (ja) 2017-07-26 2021-08-18 日華化学株式会社 可視光域で光架橋可能な光応答性ヌクレオチドアナログ
JP7186165B2 (ja) * 2017-07-26 2022-12-08 国立大学法人北陸先端科学技術大学院大学 可視光域で光架橋可能な光応答性ヌクレオチドアナログ
JPWO2021215428A1 (ja) 2020-04-22 2021-10-28

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS4814904B1 (ja) 1969-03-25 1973-05-10
JPS4940311B1 (ja) 1970-11-14 1974-11-01
JPS5925383B2 (ja) 1979-03-30 1984-06-16 シャープ株式会社 半導体装置
JP3753942B2 (ja) 2000-03-10 2006-03-08 独立行政法人科学技術振興機構 ５−ピリミジン含有核酸、それを用いた可逆的連結方法
JP3753938B2 (ja) 2000-12-15 2006-03-08 独立行政法人科学技術振興機構 光連結性ヌクレオシド含有ｄｎａを用いて塩基を点変異する方法
WO2014157565A1 (ja) * 2013-03-28 2014-10-02 国立大学法人北陸先端科学技術大学院大学 光クロスリンク能を有する光応答性ヌクレオチドアナログ
CN107163169A (zh) * 2017-05-25 2017-09-15 同济大学 一类香豆素并咔唑型肟酯类化合物及其制备方法和应用

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6005094A (en) * 1986-10-28 1999-12-21 Genta Incorporated Oligonucleotide analogues having improved stability at acid pH
US5082934A (en) * 1989-04-05 1992-01-21 Naxcor Coumarin derivatives for use as nucleotide crosslinking reagents
IL99068A (en) 1990-08-09 1998-01-04 Genta Inc Non-nucleotide binding reagents for oligomers
TW200528467A (en) 2004-02-27 2005-09-01 Japan Science & Tech Agency DNA enzyme and method of controlling the activity thereof
EP2216338B1 (en) 2007-11-19 2013-03-20 Japan Advanced Institute of Science and Technology Light-responsive artificial nucleotide having photo-crosslinking ability
JP4814904B2 (ja) 2008-04-16 2011-11-16 国立大学法人北陸先端科学技術大学院大学 核酸類の配列選択的な精製方法
WO2010147673A2 (en) 2009-06-19 2010-12-23 University Of Florida Research Foundation, Inc. Single-dna molecule nanomotor regulated by photons
CN105899525B (zh) 2013-10-30 2021-03-12 国立研究开发法人科学技术振兴机构 光交联的形成抑制方法、及自交联体形成抑制型光响应性核酸
JP6920689B2 (ja) 2017-07-26 2021-08-18 日華化学株式会社 可視光域で光架橋可能な光応答性ヌクレオチドアナログ
JP7186165B2 (ja) * 2017-07-26 2022-12-08 国立大学法人北陸先端科学技術大学院大学 可視光域で光架橋可能な光応答性ヌクレオチドアナログ
JP7475056B2 (ja) * 2019-01-30 2024-04-26 国立大学法人北陸先端科学技術大学院大学 光応答性ヌクレオチドアナログの製造方法

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS4814904B1 (ja) 1969-03-25 1973-05-10
JPS4940311B1 (ja) 1970-11-14 1974-11-01
JPS5925383B2 (ja) 1979-03-30 1984-06-16 シャープ株式会社 半導体装置
JP3753942B2 (ja) 2000-03-10 2006-03-08 独立行政法人科学技術振興機構 ５−ピリミジン含有核酸、それを用いた可逆的連結方法
JP3753938B2 (ja) 2000-12-15 2006-03-08 独立行政法人科学技術振興機構 光連結性ヌクレオシド含有ｄｎａを用いて塩基を点変異する方法
WO2014157565A1 (ja) * 2013-03-28 2014-10-02 国立大学法人北陸先端科学技術大学院大学 光クロスリンク能を有する光応答性ヌクレオチドアナログ
CN107163169A (zh) * 2017-05-25 2017-09-15 同济大学 一类香豆素并咔唑型肟酯类化合物及其制备方法和应用

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A.VRONTELI ET AL., COMMEMORATIVE ISSUE IN HONOR OF PROF. MICHAEL ORFANOPOULOS ON THE OCCASION OF HIS OUTSTANDING CONTRIBUTIONS TO ORGANIC SYNTHETIC CHEMISTRY, vol. 2015, no. 3, pages 111 - 123
FUJIMOTO, KENZO ET AL.: "DNA Photo-cross-linking Using Pyranocarbazole and Visible Light", ORGANIC LETTERS, vol. 20, no. 10, 27 April 2018 (2018-04-27), pages 2802 - 2805, XP055572495 *
GIA, 0. ET AL.: "Pyrrolocoumarin derivatives: DNA-binding properties", JOURNAL OF PHOTOCHEMISTRY AND PHOTOBIOLOGY , B: BIOLOGY, vol. 2, no. 4, 1988, pages 435 - 42, XP026772756, DOI: doi:10.1016/1011-1344(88)85072-3 *
RODIGHIERO, P. ET AL.: "Pyrrolocoumarin derivatives as potential photoreagents toward DNA", JOURNAL OF HETEROCYCLIC CHEMISTRY, vol. 24, no. 4, August 1987 (1987-08-01), pages 1041 - 3, XP055572482 *
See also references of EP3660021A4
VRONTELI, ANASTASIA ET AL.: "Synthesis of fused pyranocarbazolones with biological interest", ARKIVOC, vol. 3, 2015, pages 111 - 123, XP055572471 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP7475056B2 (ja) 2019-01-30 2024-04-26 国立大学法人北陸先端科学技術大学院大学 光応答性ヌクレオチドアナログの製造方法

Also Published As

Publication number Publication date
EP3660021A1 (en) 2020-06-03
US11078211B2 (en) 2021-08-03
EP3660021A4 (en) 2021-03-17
US20200317685A1 (en) 2020-10-08
CN110719912B (zh) 2022-08-09
EP3660021B1 (en) 2022-01-19
JP2019026569A (ja) 2019-02-21
CN110719912A (zh) 2020-01-21
JP6920689B2 (ja) 2021-08-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5427902B2 (ja) 光クロスリンク能を有する光応答性人工ヌクレオチド
WO2019021945A1 (ja) 可視光域で光架橋可能な光応答性ヌクレオチドアナログ
CN112533892B (zh) 烷氧基苯基衍生物、核苷保护体和核苷酸保护体、寡核苷酸制造方法以及取代基除去方法
JP6312729B2 (ja) 光クロスリンク能を有する光応答性ヌクレオチドアナログ
JP2002543214A (ja) Ｌ−リボ−ｌｎａ類縁体
WO2017111137A1 (ja) オリゴヌクレオチドの製造方法
JP7186165B2 (ja) 可視光域で光架橋可能な光応答性ヌクレオチドアナログ
WO2020158687A1 (ja) 光応答性ヌクレオチドアナログの製造方法
JP5975524B2 (ja) 化合物、核酸、核酸の製造方法および核酸を製造するためのキット
JP5076504B2 (ja) 核酸合成用アミダイド及び核酸合成方法
JP2021020883A (ja) 光応答性ヌクレオチドアナログ
JP7484951B2 (ja) オリゴヌクレオチドの製造方法
JP2009256335A (ja) ２’位にアルキル型保護基を有するリボ核酸の製造法
JP6261027B2 (ja) ２’−ｏ−カルバモイル修飾ヌクレオシド三リン酸
JP7296636B2 (ja) アルコキシフェニル誘導体、ヌクレオシド保護体およびヌクレオチド保護体、オリゴヌクレオチド製造方法、ならびに、置換基除去方法
JP7345156B2 (ja) 二本鎖形成によって１９ｆケミカルシフトの変化を生じさせる方法
JP2024510934A (ja) キラルホスホロチオエートの合成のためのキラルシントン
JPH10204097A (ja) Ｈ−ホスホネートオリゴヌクレオチド誘導体、及び該誘導体の製造方法
JP2003088374A (ja) チミジン誘導体およびオリゴヌクレオチド

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 18837260

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2018837260

Country of ref document: EP

Effective date: 20200226