ES2339433T3 - Aumento de la expresion de retrovirus endogeno en cancer de prostata. - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento para diagnosticar el cáncer de próstata, comprendiendo el procedimiento la etapa de detectar en una muestra del paciente el nivel de un producto de expresión de un retrovirus endógeno humano (PCAV) localizado en la megabase 20,428 del cromosoma 22 en el que el producto de expresión es un transcrito de ARNm o un polipéptido y en el que el nivel del producto de expresión en la muestra del paciente se compara con una muestra control.
Description
Aumento en la expresión de retrovirus endógeno
en cáncer de próstata.
La presente solicitud reivindica el beneficio
de: la solicitud de patente internacional PCT/US01/47824 (publicada
en inglés el 13 de junio de 2002, como WO02/46477), presentada el 7
de diciembre de 2001; la solicitud de patente de los Estados Unidos
10/016.604; presentada el 7 de diciembre de 2001; la solicitud de
patente provisional de los Estados Unidos 60/340.064, presentada el
7 de diciembre de 2001; y la solicitud de patente provisional de los
Estados Unidos 60/388.046, presentada el 12 de junio de 2002.
La presente invención se refiere al diagnóstico
de cáncer, particularmente cáncer de próstata. En concreto se
refiere a un retrovirus endógeno humano (RVEH) localizado en el
cromosoma 22, que muestra aumento de expresión en tumores,
particularmente en tumores de próstata.
El cáncer de próstata es el tipo más común de
cáncer en varones en los EE.UU. La hiperpiasia prostética benigna
es el crecimiento anormal de células prostéticas benignas en el que
la próstata crece y presiona contra la uretra y la vejiga,
bloqueando el flujo normal de orina. Más de la mitad de los varones
en los EE.UU. con edades comprendidas entre 60-70 y
hasta el 90% con edades comprendidas entre 70-90
tienen síntomas de BPH. Aunque la BPH es rara vez un riesgo para la
vida, puede requerir tratamiento para aliviar los síntomas.
El cáncer que comienza en la próstata se
denomina cáncer prostético primario (o cáncer prostético). El cáncer
de próstata puede permanecer en la glándula prostética o se puede
diseminar hasta los nódulos linfáticos cercanos y puede también
diseminarse a los huesos, vejiga, recto, y otros órganos. El cáncer
de próstata se diagnostica actualmente midiendo los niveles de
antígeno prostético específico (AEP) y la fosfatasa ácida prostética
(FAP) en la sangre. El nivel de FAP aumenta por encima de lo normal
en muchos pacientes con cáncer de próstata, especialmente, si el
cáncer se ha diseminado más allá de la próstata. Sin embargo, no se
puede diagnosticar el cáncer de próstata usando únicamente estos
ensayos debido a que los niveles elevados de AEP o FAP pueden
indicar también otros problemas no
cancerosos.
cancerosos.
Con el fin de ayudar a determinar si las
dolencias de la próstata son benignas o malignas, se llevan
normalmente a cabo ensayos adicionales tales como ultrasonografía
transrectal, pielograma intravenoso, y citoscopia. Si los
resultados de estos ensayos sugieren que puede estar presente el
cáncer, el paciente debe someterse a una biopsia como único medio
seguro de diagnóstico. En consecuencia, es deseable proporcionar un
ensayo sencillo y directo para la detección y el diagnóstico
temprano del cáncer de próstata sin tener que experimentar múltiples
sesiones de incómodos procedimientos de ensayo. Es deseable y
necesario también proporcionar composiciones y procedimientos para
la prevención y/o el tratamiento del cáncer de próstata.
Las referencias 1 y 2 dan a conocer que los
retrovirus endógenos humanos (RVEH) del subgrupo
HML-2 de la familia RVEH-K muestran
aumento de expresión en tumores de próstata. Se da a conocer este
hallazgo como algo útil en el cribado, diagnóstico y terapia de
cánceres de próstata. En particular, se considera que niveles más
elevados de un producto de expresión de HML-2 en
relación con el tejido normal indican que el paciente del cual se
tomó la muestra tiene cáncer.
El documento WO00/73801 describe ácidos
nucleicos y polipéptidos codificados que son antígenos asociados a
cáncer expresados en pacientes que padecen cáncer de mama, gástrico
o de próstata.
El documento WO01/60860 se refiere a genes
novedosos asociados con cáncer de próstata así como a los
procedimientos para evaluar si un paciente padece de o tiene un
riesgo mayor del normal de desarrollar cáncer de próstata.
Smith y col., (American Journal of Human
Genetics, vol. 69, nº. 4, supl., 2001) describen una investigación
en la expresión de RVEH-K y la posible
retrotransposición en el cáncer de próstata.
Es un objeto de la invención proporcionar
materiales y procedimientos mejorados que se puedan usar en el
diagnóstico, prevención y tratamiento del cáncer de próstata.
Se ha encontrado un miembro específico de la
familia RVEH-K localizado en el cromosoma 22 en la
megabase 20.428 (22q11.2) que tiene un aumento de expresión
preferente y significativamente en los tumores de próstata. Este
retrovirus endógeno (denominado "PCAV" en el presente
documento) tiene diversas características que no se encuentran el
resto de los miembros de la familia RVEH-K y estas
características se pueden utilizar en el cribado, diagnóstico y
terapia del cáncer (por ejemplo, terapia adyuvante).
\newpage
La invención proporciona un procedimiento para
el diagnóstico del cáncer de próstata, comprendiendo el
procedimiento la etapa de detectar en una muestra del paciente el
nivel de un producto de expresión de un retrovirus endógeno humano
localizado en la megabase 20.428 en el cromosoma 22, en el que el
nivel del producto de expresión en la muestra del paciente se
compara con una muestra control. Mayores niveles del producto de
expresión en relación con el tejido normal indican que el paciente
del cual se tomó la muestra tiene cáncer.
El producto de expresión que se detecta es
preferiblemente un transcrito de ARNm, pero puede ser
alternativamente un polipéptido traducido a partir de dicho
transcrito. Se pueden detectar estos productos de expresión directa
o indirectamente. Un ensayo directo usa un ensayo que detecta el ARN
o el polipéptido de PCAV en una muestra del paciente. Un ensayo
indirecto usa un ensayo que detecta biomoléculas que no se expresan
directamente in vivo a partir del PCAV, por ejemplo, un
ensayo para detectar ADNc que se ha transcrito de manera inversa a
partir de ARNm de PCAV, o un ensayo para detectar un anticuerpo que
se ha aumentado en respuesta a un polipéptido de PCAV.
\vskip1.000000\baselineskip
Muchas regiones comprendidas en la secuencia
publicada del genoma humano se apuntan como retrovirus endógenos e,
incluso, antes de que se determinara su secuencia, se sabía que el
genoma humano contenía múltiples RVEH. Uno de los muchos RVEH es un
RVEH-K localizado en la megabase 20.428 del
cromosoma 22, denominado en el presente documento como "PCAV".
Se ha encontrado que la expresión de este RVEH aumenta en el tejido
canceroso. Además, PCAC tiene cinco características específicas que
no se encuentran en otros RVEH. Estas cinco características se
manifiestan en los transcritos de ARNm de PCAV y se pueden utilizar
en el cribado y diagnóstico: (1) tiene una secuencia de nucleótidos
específica que lo distingue de otros RVEH en el interior del genoma,
aunque la secuencia comparte una identidad significativa con el
resto de RVEH; (2) tiene LTR 5' en tándem; (3) tiene un LTR 3'
fragmentado; su gen env está interrumpido por una inserción
alu; y (5) su gag contiene una única inserción.
\vskip1.000000\baselineskip
PCAV es un miembro de la subfamilia HML2.0. de
RVEH. En líneas generales, existen de 30 a 50 copias de virus
HML2.0 por genoma humano haploide. Los virus HML2 parecen haberse
insertado al menos dos veces en los antecesores humanos: hace 30
millones de años, antes de que el linaje antropoide (que incluye los
seres humanos) se separara del de los monos; y hace 20 millones,
después de la separación. Los virus procedentes de la inserción de
hace 30 millones de años se denominan algunas veces como de "tipo
antiguo" y los virus procedentes de la inserción de hace 20
millones de año como de "tipo nuevo" {3}. Las proteínas de los
virus antiguos y nuevos están muy relacionadas en lo que se refiere
a la secuencia de aminoácidos, pero existen algunos epitopos que los
distinguen. La identidad de la secuencia de ADN es alta en algunas
regiones del genoma, pero en otras, particularmente en los LTR, la
conservación es únicamente de aproximadamente el 70%. La mayor parte
de las diferencias entre los LTR antiguos y nuevos son están
agrupadas cerca del inicio de la transcripción, mientras que los
virus antiguos tienen una o dos inserciones en relación con los
virus nuevos. Los LTR antiguos y nuevos se agrupan como dos grupos
separados en el análisis filogenético (figura 1). Estando de acuerdo
con sus edades genéticas relativas, los virus antiguos contienen
también más interrupciones y delecciones que los virus nuevos.
PCAV parece haber surgido de una reordenación
entre un virus nuevo y un virus antiguo. La región 5' del virus
(figura 2) se inicia con un LTR nuevo seguido por 162 pb de un virus
nuevo. El resto del virus nuevo parece haber desaparecido, ya que
los 162 pb se continúan por una secuencia no vírica de 552 pb y a
continuación un virus antiguo casi completo. El LTR 3' del virus
antiguo (figura 3) está fragmentado e incluye una inserción
MER11.
La SEC ID 1 es la secuencia de 12366 pb de PCAV,
basada en la secuencia disponible del cromosoma 22 humano {4},
desde el comienzo de su primer LTR 5' hasta el final de su LTR 3'
fragmentado. Es la cadena de sentido directo del ADN genómico de
doble cadena. La SEC ID 10 es la secuencia de 11101 pb de PCAV
procedente del nucleótido 559 en la SEC ID 1 (un posible
emplazamiento de inicio de la transcripción) en su emplazamiento de
poliadenilación (hasta el nucleótido 11735 en la SEC ID 1), aunque
es más probable un emplazamiento de inicio de la transcripción más
en la dirección 3' (por ejemplo, nucleótido 635 \pm 5).
La secuencia específica de PCAV se manifiesta
tanto en el ARNm y como en los aminoácidos, y se puede usar para
distinguirla de otros RVEH en el genoma.
\vskip1.000000\baselineskip
En la dirección 3' del LTR 5^{r} de un
RVEH-K, antes del inicio del marco de lectura
abierto gag, se encuentra un emplazamiento donante de corte y
empalme conservado (5'SS). Este donante de corte y empalme puede
unirse a los emplazamientos aceptores de corte y empalme (3'SS) al
inicio del marco de lectura abierto env (Figura 4).
Los genomas de RVEH-K incluyen
también dos secuencias aceptaras de corte y empalme próximas al
extremo 3' del LTR, pero éstas no se usan ordinariamente debido a
que no tienen compañero donante de corte y empalme vírico en la
dirección 3'. Sin embargo, PCAV tiene dos LTR en su extremo 5': el
primero procede de un RVEH-K nuevo y el segundo
procede de un RVEH-K viejo. Los aceptores de corte y
empalme normalmente no usados en el LTR viejo pueden de esta manera
cooperar con el donante de corte y empalme del LTR nuevo (Figura 2),
y los transcritos resultantes de estos emparejamientos
donante/aceptor son específicos del PCAV.
Los transcritos formados usando un emplazamiento
aceptor de corte y empalme próximo al extremo 3' del segundo LTR 5'
comprenden (i) una secuencia transcrita procedente del emplazamiento
de inicio de la transcripción en el primer LTR 5', continuando con
un emplazamiento donante de corte y empalme muy cercano en la
dirección 3' del primer LTR 5', unido a (ii) una secuencia
transcrita procedente de uno de los emplazamientos aceptores de
corte y empalme próximo al extremo 3' del segundo LTR 5'. La
detección de dichos transcritos indica que se está transcribiendo el
PCAV.
En la SEC ID 1 el emplazamiento de inicio de la
transcripción en el primer LTR 5' estaría en el nucleótido 559 por
homología con otros virus, pero empíricamente parece estar además en
la dirección 3' (por ejemplo, en alrededor de 635 \pm 2);
el emplazamiento donante de corte y empalme conservado en la
dirección 3' del primer LTR 5' está en los nucleótidos
1076-1081; los dos emplazamientos aceptores de corte
y empalme próximos al extremo 3' del segundo LTR 5' están en los
nucleótidos 2593-2611 y 2680-2699.
La SEC ID 2 es la secuencia entre el emplazamiento de inicio de la
transcripción predicho y el emplazamiento de corte y empalme. La
SEC ID 3 son los primeros 10 nucleótidos que siguen al primer
emplazamiento aceptor de corte y empalme. La SEC ID 4 son los
primeros 10 nucleótidos que siguen a segundo emplazamiento aceptor
de corte y empalme. La SEC ID 5 es la SEC ID 2 fusionada con la SEC
ID 3. La SEC ID 6 es la SEC ID 2 fusionada con la SEC ID 4.
\vskip1.000000\baselineskip
El LTR 3' de PCAV está fragmentado, incluyendo
la inserción de un elemento repetitivo MER11a (figura 3). Los ARNm
de PCAV terminan usando una señal de poliadenilación en el interior
de la inserción MER11a, más que usando la señal del LTR vírico. Los
transcritos que terminan con una copia parcial del LTR 3' de
RVEH-K seguido por una secuencia MER 11 son
específicos de PCAV.
Los extremos 3' de los transcritos procedentes
de PCAV incluyen copias de un LTR parcial y un MER11a parcial
(figura 3). La detección de dichos transcritos indica que se está
transcribiendo este PCAV.
En la SEC ID 1: el LTR 3' comienza en el
nucleótido 10520 y continúa hasta el nucleótido 10838, en el que
este queda interrumpido por una inserción MER11a; la inserción
MER11a se inicia en el nucleótido 10839 y continúa hasta el
nucleótido 11834; después de los nucleótidos
11835-11928, el LTR 3' continúa desde el nucleótido
11929 hasta el 12366. Dentro de la inserción de MER11a está su señal
de poliadenilación (localizada entre los nucleótidos 11654 y
11659). La SEC ID 7 es la secuencia del primer fragmento del nt 319
del LTR 3'. La SEC ID 8 es la secuencia de la inserción MER11a
hasta su emplazamiento poliA. La SEC ID 9 es la SEC ID 7 fusionada a
la SEC ID 8.
\vskip1.000000\baselineskip
En tanto en cuanto está perturbado por
mutaciones debidas a la edad genética, el gen env de PCAV
está interrumpido por una secuencia alu. La detección de los
transcritos que contienen la secuencia env y la alu indica que se
está transcribiendo el PCAV.
En la SEC ID 1, alu se encuentra en los
nucleótidos 9938 a 10244 (SEC ID 32). Los 10 nucleótidos
inmediatamente anteriores a la secuencia alu
(9838-9937) son la SEC ID 37, los últimos 10mer de
la cual (9928-9937) forman la SEC ID 33. Los 100
nucleótidos inmediatamente siguientes a la secuencia alu forman la
SEC ID 40, los primeros 10mer de la cual
(10244-10253) forman la SEC ID 34. Los primeros 10
nucleótidos de la secuencia alu forman la SEC ID 35 y los últimos
10 forman la SEC ID 41. La SEC ID 36 es el puente de 20mer del
límite alu/env y la SEC ID 45 es el puente de 20mer del extremo de
la secuencia alu. La SEC ID 39 es el puente de 8mer del límite
alu/env, y la SEC ID 44 es el puente de 8mer del extremo de la
secuencia alu. La SEC ID 38 es la SEC ID 37 + la SEC ID 32, la SEC
ID 42 es la SEC ID 41 + la SEC ID 40, y la SEC ID 43 es la SEC ID 32
+ la SEC ID 40.
\vskip1.000000\baselineskip
El gen gag de PCAV contiene una secuencia de 48
nucleótidos (SEC ID 53) que no se encuentra en otros
RVEH-K. Los 48mer codifican la SEC ID 10 de 16mer,
que no se encuentra en las proteínas gag procedentes de los otros
RVEH-K nuevos o antiguos. La detección de los
transcritos que contienen la SEC ID 53, o de los polipéptidos que
contienen la SEC ID 110, o de los anticuerpos que reconocen los
epitopos en el interior o que incluyen la SEC ID 110 indica por
tanto que se está transcribiendo el PCAV.
El gen gag de PCAV contiene también una
secuencia de 69 nucleótidos (SEC ID 111) que no se encuentra en los
RVEH-K nuevos. Los 69mr codifican la SEC ID 55 de
23mer. La detección de los transcritos que contienen la SEC ID 11,
o de los polipéptidos que contienen la SEC ID 55, o de los
anticuerpos que reconocen loe epitopos en el interior o que
incluyen la SEC ID 55 indica por tanto que se está transcribiendo un
RVEH-K, normalmente PCAV.
\vskip1.000000\baselineskip
\global\parskip0.900000\baselineskip
El procedimiento diagnóstico de la invención
puede basarse en la detección del ARNm. Se puede detectar el ARNm
de PCAV directa o indirectamente. Se prefiere detectar un ARNm
directamente, evitando por tanto la necesidad de preparación por
separado del material derivado de ARNm (por ejemplo,
ADNc).
\vskip1.000000\baselineskip
Los transcritos de ARNm para uso de acuerdo con
la presente invención se transcriben de PCAV. Tres tipos preferidos
de transcrito son: (1) transcritos de corte y empalme que usan un
emplazamiento aceptor de corte y empalme próximo al extremo 3' del
segundo LTR 5', (2) transcritos que comprenden ambas secuencias de
LTR 3' y MER11a; (3) transcritos que comprenden un gen env
interrumpido en alu, y (4) transcritos que comprenden una secuencia
gag específica de PCAV.
La invención proporciona un transcrito de ARNm
procedente de un retrovirus endógeno humano localizado en la
megabase 20.428 del cromosoma 22.
La invención proporciona también un transcrito
de ARNm que comprende una secuencia de nucleótidos con n % o más
identidad de la secuencia con la SEC ID 23, o con una secuencia de
nucleótidos que carece de hasta 100 nucleótidos (por
ejemplo, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77,
78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90 ó 100)
procedentes del extremo 5' de la SEC ID 23, por ejemplo, n %
o más identidad de la secuencia con la SEC ID 1197 o 1198. La
secuencia de nucleótidos está preferiblemente en el extremo 5' del
ARN, aunque pueden estar presentes secuencias en la dirección 5'. La
secuencia de nucleótidos puede estar en el extremo 3' del ARN, pero
existirán normalmente además elementos en la dirección 3' tales
como la cola poli-A. Estos transcritos de ARNm
incluyen variantes alélicas, variantes SNP, homólogos, ortólogos,
parálogos, mutantes, etc, de la SEC ID 23, la SEC ID 1197 y la SEC
ID 1198.
La invención proporciona un transcrito de ARNm
formado mediante corte y empalme que implica un emplazamiento
aceptor de corte y empalme próximo al extremo 3' del segundo LTR 5'.
De esta manera, la invención proporciona un transcrito de ARNm que
comprende la secuencia -N_{1}-N_{2}- (por
ejemplo, SEC ID 24, SEC ID 25, SEC ID 1199 o SEC ID 1200), en
el que: N_{1} es una secuencia de nucleótidos (por ejemplo,
SEC ID 26, SEC ID 1201) que procede (i) del extremo 5' de un
transcrito de ARNm procedente del primer LTR 5' de un retrovirus
endógeno humano localizado en la megabase 20.428 en el cromosoma 22,
y (ii) un primer emplazamiento donante de corte y empalme de la
región U5 de dicho ARNm transcrito procedente del primer LTR 5'; y
N_{2} es una secuencia de nucleótidos (por ejemplo, SEC ID 27 o
SEC ID 28) inmediatamente en la dirección 3' de un emplazamiento
aceptor de corte y empalme localizado (i) en la dirección 3' de
dicho primer emplazamiento donante de corte y empalme y (ii) en la
dirección 5' de un segundo emplazamiento donante de corte y empalme,
estando el segundo emplazamiento donante de corte y empalme en la
dirección 3' del segundo LTR 5' de dicho retrovirus endógeno. El
primer emplazamiento donante de corte y empalme es preferiblemente
el emplazamiento conservado en la subfamilia HML2, localizado
aproximadamente 100 nucleótidos en la dirección 3' del primer LTR 5'
(tras el nucleótido 1075 en la SEC ID 1). El segundo emplazamiento
donante de corte y empalme es preferiblemente el emplazamiento
conservado en la subfamilia HML2, localizado aproximadamente 100
nucleótidos en la dirección 3' del segundo LTR 5' (tras la SEC ID 1
nucleótido 2778). El aceptor de corte y empalme está preferiblemente
en la dirección 3' del segundo LTR 5'.
La invención proporciona también un transcrito
de ARNm que comprende la secuencia -N_{1}-N_{2},
en la que: N-, es una secuencia de nucleótidos con a % o más
de identidad de la secuencia con la SEC ID 26 y/o la SEC ID 1201, y
N_{2} es una secuencia de nucleótidos con b % o más de
identidad de la secuencia con la SEC ID 27 o la SEC ID 28. En la
figura 5, se ilustran estos transcritos de ARNm de la invención. Se
prefieren los transcritos que usan el segundo emplazamiento de corte
y empalme (es decir, N_{2} es la SEC ID 28).
En ambos casos, está preferiblemente en el
extremo 5' del ARN, aunque pueden estar presentes secuencias en la
dirección 5'. N_{2} puede estar en el extremo 3' del ARN, pero
normalmente, estarán presentes secuencias en la dirección 3'.
La invención proporciona también un transcrito
de ARNm que comprende una secuencia de nucleótidos con c % o
más identidad de la secuencia con la SEC ID 24, la SEC ID 25, la SEC
ID 1199 o la SEC ID 1200.
La invención proporciona un transcrito de ARNm
que comprende la secuencia -N_{3}-N_{4}-, en la
que: N_{3} es una secuencia de nucleótidos (por ejemplo,
la SEC ID 30) procedente del extremo 3' del fragmento 5' del LTR 3'
de un retrovirus endógeno humano localizado en la megabase 20.428 en
el cromosoma 22, y N_{4} es una secuencia de nucleótidos (por
ejemplo, la SEC ID 31) procedente del extremo 5' de la inserción
MER11a en un retrovirus endógeno humano localizado en la megabase
20.428 en el cromosoma 22.
La invención proporciona también un transcrito
de ARNm que comprende la secuencia
-N_{3}-N_{4}-, en la que: N_{3} es una
secuencia de nucleótidos con d % o más identidad de la
secuencia con la SEC ID 30 y N_{4} es una secuencia de
nucleótidos con e % o más identidad de la secuencia con la
SEC ID 31. El ARN puede comprender la secuencia
-N_{3}-N_{4}-N_{5}-N_{6}-,
en la que: N_{5} es una secuencia de nucleótidos entre la señal
poliA y el emplazamiento poliA de una secuencia MER11a; y N_{6} es
una cola poliA.
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En ambos casos, el transcrito incluirá
generalmente la secuencia en la dirección 5' de N_{3}. El
transcrito incluirá generalmente la secuencia en la dirección 3' de
N_{4}, tal como una cola poliA.
La invención proporciona también un transcrito
de ARNm que comprende una secuencia de nucleótidos con f % o
más de identidad de la secuencia con la SEC ID 29.
La invención proporciona un transcrito de ARNm
que comprende la secuencia -N_{7}-N_{8}- (por
ejemplo, la SEC ID 38), en la que: N_{7} es una secuencia de
nucleótidos (por ejemplo, la SEC ID 37) que precede a la
inserción alu en el interior del gen env de un retrovirus
endógeno humano localizado en la megabase 20.428 en el cromosoma
22, y N_{8} es una secuencia de nucleótidos (por ejemplo,
la SEC ID 32) que comienza en el extremo 5' de dicha
inserción
alu.
alu.
La invención proporciona también un transcrito
de ARNm que comprende la secuencia
-N_{7}-N_{8}-, en la que: N_{7} es una
secuencia de nucleótidos con mm % o más identidad de la
secuencia con la SEC ID 37 y N_{8} es una secuencia de
nucleótidos con nn % o más de identidad de la secuencia con
la SEC ID 32.
El transcrito incluirá generalmente la secuencia
en la dirección 5' de N_{7} y en la dirección 3' de N_{8}.
La invención proporciona también un transcrito
de ARNm que comprende una secuencia de nucleótidos con pp % o
más de identidad de la secuencia con la SEC ID 38.
La invención proporciona un transcrito de ARNm
que comprende la secuencia -N_{9}-N_{10}-
(por ejemplo, la SEC ID 43), en la que: N_{9} es una
secuencia de nucleótidos (por ejemplo, la SEC ID 32) al final
de la inserción alu en el interior del gen env de un retrovirus
endógeno humano localizado en la megabase 20.428 en el cromosoma
22, y N_{10} es una secuencia de nucleótidos (por ejemplo,
la SEC ID 40) inmediatamente en la dirección 3' de dicha inserción
alu.
La invención proporciona también un transcrito
de ARNm que comprende la secuencia
-N_{9}-N_{10}-, en la que N_{9} es una
secuencia de nucleótidos con uu % o más de identidad de la
secuencia con la SEC ID 41 y N_{10} es una secuencia de
nucleótidos con vv % o más de identidad de la secuencia con
la SEC ID 40.
El transcripto incluirá generalmente la
secuencia en la dirección 5' de N_{9} y en la dirección 3' de
N_{10}.
La invención proporciona también un transcrito
de ARNm que comprende una secuencia de nucleótidos con
ww % o más identidad de la secuencia con la SEC ID 42.
ww % o más identidad de la secuencia con la SEC ID 42.
La invención proporciona un transcrito de ARNm
que comprende una secuencia de nucleótidos con uu % o más
identidad de la secuencia con la SEC ID 41.
El transcrito incluirá generalmente la secuencia
en la dirección 5' de N_{9} y en la dirección 3' de N_{10}-.
La invención proporciona también un transcrito
de ARNm que comprende una secuencia de nucleótidos con ii % o
más de identidad de la secuencia con la SEC ID 53.
La invención proporciona también un transcrito
de ARNm que comprende una secuencia de nucleótidos con ii % o
más de identidad de la secuencia con la SEC ID 111.
La invención proporciona también un transcrito
de ARNm que comprende una secuencia de nucleótidos con ii % o
más de identidad de la secuencia con la SEC DE 1191. La invención
proporciona también un transcrito de ARNm que codifica un
polipéptido que tiene al menos ii % identidad de la secuencia con la
SEC ID 98.
\vskip1.000000\baselineskip
Se pueden detectar directamente los transcritos
de ARNm de PCAV de la invención, por ejemplo, mediante secuenciación
del ARNm o mediante hibridación de los transcritos de ARNm (por
ejemplo, mediante transferencia Northern). Están disponibles
diversas técnicas para detectar la presencia o ausencia de una
secuencia de ARN concreta en una muestra {por ejemplo, refs.
20 y 21}.
Es también posible la detección indirecta de los
transcritos de ARNm y se lleva a cabo sobre ácido nucleico derivado
de un transcrito de ARNm de PCAV, por ejemplo, la detección
de una copia de ADNc de un ARNm de PCAV, la detección de ácidos
nucleicos amplificados a partir de una plantilla de ARNm de PCAV,
etc.
Un procedimiento preferido para detectar ARN es
la RT-PCR (reacción en cadena de la polimerasa
mediante transcriptasa inversa) {por ejemplo, refs. 5 a 13}. Se
informa de la RT-PCR de ARNm procedente de células
de próstata en, por ejemplo, las referencias 14 a 19. Se prefiere
usar sondas específicas de PCAV en la RT-PCR.
Tanto si se usa la detección directa como la
indirecta, el procedimiento de la invención implica la detección de
una diana de ácido nucleico de PCAV de cadena única o de doble
cadena, tanto (a) en forma de ARNm de PCAV como (b) en forma de
ácido nucleico que comprende una copia de al menos una porción de
ARNm de PCAV y/o una secuencia complementaria de al menos una
porción de un ARNm de PCAV.
El procedimiento de la invención no implica la
detección del ADN genómico de PCAV, ya que éste está presente en
todas las células humanas y su presencia no es, por tanto,
característica de los tumores. Si una muestra contiene ADN de PCAV,
se prefiere usar una técnica de detección específica de ARN o
centrarse en las secuencias presentes en los transcritos de ARNm de
PCAV, pero no en el ADN genómico de PCAV (por ejemplo,
uniones de corte y empalme, cola poliA, etc). El
procedimiento de la invención puede por tanto comprender una etapa
inicial de: (a) extraer el ARNm de una muestra del paciente; (b)
eliminar el ADN de una muestra del paciente sin eliminar el ARNm;
y/o (c) eliminar o perturbar el ADN de PCAV, pero no el ARNm de
PCAV, en una muestra del paciente. Como alternativa, se puede usar
un ensayo específico de ARN que no se vea afectado por la presencia
de ADN homólogo. Para la RT-PCR, se debe eliminar el
ADN genómico.
Se conocen bien los procedimientos para extraer
ARN selectivamente procedente de muestras biológicas {por
ejemplo, refs. 20 y 21} e incluyen procedimientos basados en
tampones de guanidinio, cloruro de litio, extracción con fenol
ácido cloroformo, SDS/acetato de potasio, etc. Una vez que se ha
extraído el ARN celular total, se puede enriquecer el ARNm, por
ejemplo, usando técnicas de oligo-dT.
Se conocen bien los procedimientos para eliminar
el ADN de las muestras biológicas sin eliminar el ARNm {por
ejemplo, apéndice C de la ref. 20} e incluyen la digestión con
DNasa. Si se usa DNasa, a continuación, debe ésta eliminarse o
inactivarse (por ejemplo, mediante quelación con EDTA,
mediante calentamiento, o mediante tratamiento con proteinasa K
seguido por extracción con fenol/cloroformo y precipitación con
NH_{4}OAc/EtOH) antes de la posterior síntesis o amplificación
del ADN, con el fin de evitar la digestión del ADN recientemente
sintetizado.
Los procedimientos para eliminar el ADN de PCAV,
pero no el ARN de PCAV, usarán un reactivo que sea específico de
una secuencia de un ADN de PCAV, por ejemplo, una enzima de
restricción que reconoce una secuencia de ADN en el el genoma de
PCAV, pero que no rompe la secuencia de ARN correspondiente.
Se pueden usar también procedimientos para
purificar específicamente los ARNm de PCAV procedentes de una
muestra. Uno de dichos procedimientos usa un soporte de afinidad que
se une a los ARNm de PCAV. El soporte de afinidad puede incluir una
secuencia de polipéptido que se une al ARNm de PCAV, por ejemplo,
el polipéptido cORF, que se une al LTR de los ARNm de
RVEH-K de una manera específica de la secuencia, o
la proteína Rev de VIH, que ha mostrado reconocer el LTR de
RVEH-K en los transcritos de ARN {22}.
El ARNm de PCAV necesita mantenerse en una forma
natural para la detección. Puede, por ejemplo, fragmentarse, con la
condición de que la fragmentación mantenga las secuencias
específicas de PCAV en el interior del ARNm.
\vskip1.000000\baselineskip
Se describe un ácido nucleico que comprende (a)
la secuencia de nucleótido de un transcrito de ARNm transcrito a
partir de un retrovirus endógeno humano localizado en la megabase
20.428 del cromosoma 22, y/o (b) el complemento de (a). Se describe
también un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos
con qq % o más de identidad de la secuencia con la SEC ID
10, SEC ID 1197 y/o la SEC ID 1198. PCAV es aproximadamente un 87,5%
idéntico al RVEH-K que se encuentra en la megabase
47.1 del cromosoma 6 y aproximadamente un 86% idéntico al
RVEH-K que se encuentra en la megabase 103.75 del
cromosoma 3.
Se describe un ácido nucleico que comprende (a)
una secuencia de nucleótidos -N_{1}-N_{2}- tal
como se ha definido anteriormente, y/o (b) el complemento de (a).
Se describe un ácido nucleico que comprende (a) una secuencia de
nucleótidos con c % o más de identidad de la secuencia con la
SEC ID 5, SEC ID 6, SEC ID 1199 o la SEC ID 1200 y/o (b) el
complemento de (a).
Se describe un de ácido nucleico que comprende
(a) la secuencia de nucleótidos -N_{3}-N_{4}-
tal como se ha definido anteriormente, y/o (b) el complemento de
(a). Se describe un de ácido nucleico que comprende (a) una
secuencia de nucleótidos con f % o más de identidad de la
secuencia con la SEC ID 9, y/o (b) el complemento de (a).
Se describe un ácido nucleico que comprende (a)
la secuencia de nucleótidos
-N_{3}-N_{4}-N_{5}-N_{6}-,
y/o (b) el complemento de (a).
Se describe un ácido nucleico que comprende (a)
la secuencia e nucleótidos -N_{7}-N_{8}- tal
como se ha definido anteriormente, y/o (b) el complemento de (a).
Se describe una secuencia de ácido nucleico que comprende (a) una
secuencia de nucleótidos con aa % o más de identidad de la
secuencia con la SEC ID 38, y/o (b) el complemento de (a).
Se describe un ácido nucleico que comprende (a)
la secuencia de nucleótidos -N_{9}-N_{10}- tal
como se ha definido anteriormente, y/o (b) el complemento de (a).
Se describe un ácido nucleico que comprende (a) una secuencia de
nucleótidos con hh % o más de identidad de la secuencia con
la SEC ID 42, y/o (b) el complemento de (a).
Se describe un ácido nucleico que comprende una
secuencia de nucleótidos con bbb % o más de identidad de la
secuencia con la SEC ID 53, y/o (b) el complemento de (a).
Se describe un ácido nucleico que comprende una
secuencia de nucleótidos con fff % o más de identidad de la
secuencia con la SEC ID 111, y/o el complemento de (a).
Las dianas específicas de ácido nucleico
incluyen las SEC ID 99 a 109, que son secuencias variantes de ADNc
de corte y empalme que suponen un emplazamiento de inicio de la
transcripción en la SEC ID 1 a la 559 y que incluyen cuatro restos
A en el extremo 3'. Suponiendo un emplazamiento de inicio de la
transcripción más en la dirección 3' (por ejemplo, el
nucleótido 635 de la SEC ID 1), estas dianas nucleicas no incluirían
un tramo de nucleótidos en el extremo 5' de las SEC ID 99 a 109,
por ejemplo, no incluirían 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 71,
72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88,
89, 90, 100 o más de los nucleótidos 5', Se proporcionan las
secuencias 25mer basadas en las secuencias de ADNc como las SEC ID
337 a 599.
\vskip1.000000\baselineskip
Se describe un ácido nucleico que se puede
hibridar con un ácido nucleico diana de PCAV.
Se pueden llevar a cabo las reacciones de
hibridación en diferentes condiciones de "restricción". Se
conocen ampliamente las condiciones que aumentan la restricción de
una reacción de hibridación y están publicadas en la técnica
{por ejemplo, página 7.52 de la referencia 21}. Los ejemplos
de condiciones relevantes incluyen (a objeto de aumentar la
restricción): temperatura de incubación de 25ºC, 37ºC, 50ºC, 55ºC y
68ºC; concentraciones de tampón de 10 x SSC, 6 x SSC, 1 x SSC, 0,1
x SSC (en la que SSC es tampón de NaCl 0,15 M y de citrato 15 mM) y
sus equivalentes usando otros sistemas tampón; concentraciones de
formamida de 0%, 25%, 50%, y 75%; tiempos de incubación entre 5
minutos y 24 horas; 1, 2, o más etapas de lavado; tiempos de
incubación con lavado de 1, 2, o 15 minutos; y soluciones de lavado
de 6 x SSC, 1 x SSC, 0,1 x SSC, o de agua desionizada. Se conocen
bien en la técnica las técnicas de hibridación y su optimización
{por ejemplo, véanse las referencias 20, 21, 23, 24, 28,
etc.}.
En algunas formas de realización, el ácido
nucleico se híbrida con una diana en condiciones de restricción
baja; en otras formas de realización, éste se híbrida en condiciones
de restricción intermedia; en las formas de realización preferidas,
éste se híbrida en condiciones de restricción elevada. Un conjunto
de condiciones de hibridación con restricción baja a modo de
ejemplo es 50ºC y 1 x SSC. Un conjunto de condiciones de hibridación
con restricción intermedia a modo de ejemplo es 55ºC y 1 x SSC. Un
conjunto de condiciones de hibridación con restricción elevada a
modo de ejemplo es 68ºC y 0,1 x SSC.
Los ácidos nucleicos preferidos se hibridan con
los ácidos nucleicos diana de PCAV pero no con los ácidos nucleicos
diana de otros RVEH-K. La hibridación específica de
PCAV está favorecida por la utilización de las características que
se encuentran en los transcritos de PCAV pero no en otros
transcritos de RVEH-K, por ejemplo,
secuencias de nucleótidos específicas, características que surgen de
los LTR 5' en tándem, características que surgen de la inserción
MER11a en el interior del LTR 3', o características que surgen de la
interrupción alu de env. Se pueden usar las alineaciones de las
secuencias para localizar regiones de PCAV que son más divergentes
de otros genomas de RVEH-K y en las que se puede
producir la hibridación específica de PCAV. Es deseable la
especificidad para PCAV con el fin de detectar su aumento sobre el
bajo nivel de expresión de fondo natural de otros
RVEH-K que se observa en la mayor parte de las
células.
Un grupo de ácidos nucleicos preferido puede
detectar específicamente los productos de PCAV en los que se ha
usado un emplazamiento aceptor de corte y empalme próximo al extremo
3' del segundo LTR 5'. Tal como se ha descrito anteriormente,
dichos cortes y empalmes llevan juntas las secuencias N_{1}, y
N_{2}, que no están yuxtapuestas en el ADN genómico de PCAV. Se
describe un ácido nucleico que se híbrida con una secuencia
-N_{1}-N_{2}- (o su complemento) en el interior
de un ácido nucleico diana de PCAV, pero que no se híbrida con las
secuencia N_{1} o N_{2} solas (o con sus complemento solos). El
ácido nucleico comprende una primera secuencia que se puede
hibridar con N_{1} (o con su complemento) y una segunda secuencia
que se puede hibridar con N_{2} (o con su complemento), de tal
manera que se hibridará con una diana en la que N_{1} y N_{2}
están adyacentes, pero no se hibridará con las dianas en las que el
corte y empalme no ha llevado juntas a N_{1} y N_{2}.
Otro grupo de ácidos nucleicos preferidos puede
detectar específicamente los ARNm que contienen las secuencias LTR
3' y MER11a. De esta manera, se describe un ácido nucleico que se
hibrida con la secuencia -N_{3}-N_{4}- (o su
complemento) en el interior de un ácido nucleico diana de PCAV, pero
que no se hibrida con las secuencias N_{3} o N_{4} solas (o con
sus complementos solos). El ácido nucleico comprende una primera
secuencia que se puede hibridar con N_{3} (o con su complemento)
y una segunda secuencia que se puede hibridar con N_{4} (o con su
complemento), de tal manera que se hibridará con las dianas que
incluyen ambos (i) una secuencia LTR 3' y (ii) una secuencia
MER11a, pero no con las dianas que incluyen únicamente una de (i) e
(ii). El ácido nucleico puede ser capaz inherentemente de
hibridarse con el ADN genómico, aunque esta propiedad no es útil
para detectar los transcritos.
Otro grupo de ácidos nucleicos preferidos puede
detectar específicamente los ARNm que contienen el gen env
interrumpido por alu. De esta manera, se describe un ácido nucleico
que se hibrida con la secuencia -N_{7}-N_{8}. (o
su complemento) en el interior de un ácido nucleico diana de PCAV,
pero que no se híbrida con las secuencias N_{7} o N_{s} solas (o
con sus complementos solos). El ácido nucleico comprende una
primera secuencia que se puede hibridar con N_{7} (o con su
complemento) y una segunda secuencia que se puede hibridar con
N_{8} (o con su complemento), de tal manera que se hibridará con
las dianas que incluyen ambos (i) la secuencia de env que precede
inmediatamente la interrupción alu e (ii) una interrupción alu,
pero no las dianas que incluyen únicamente una de (i) e (ii). El
ácido nucleico puede ser capaz inherentemente de hibridarse con el
ADN genómico, aunque esta propiedad no es útil para detectar los
transcritos.
Se describe un ácido nucleico que se híbrida con
la secuencia -N_{9}-N_{10}- (o su complemento)
en el interior de un ácido nucleico diana de PCAV, pero no se
híbrida con las secuencias N_{9} o N_{10} solas (o con sus
complementos solos). El ácido nucleico comprende una primera
secuencia que se puede hibridar con N_{9} (o con su complemento)
y una segunda secuencia que se puede hibridar con N_{10} (o con su
complemento), de tal manera que se hibridará con las dianas que
incluyen ambos (i) la región 3' de la interrupción alu en el
interior de env y (ii) la secuencia inmediatamente en la dirección
3' de la interrupción alu, pero no las dianas que incluye
únicamente una de (i) e (ii). El ácido nucleico puede ser
ca-
paz inherentemente de hibridarse con el ADN genómico, aunque esta propiedad no es útil para detectar transcritos.
paz inherentemente de hibridarse con el ADN genómico, aunque esta propiedad no es útil para detectar transcritos.
La capacidad de un ácido nucleico de hibridarse
con un ácido nucleico de PCAV está relacionada con sus
características intrínsecas (por ejemplo, el grado de
identidad de la secuencia con la diana) así como las características
extrínsecas (por ejemplo, temperatura, concentración de sal, etc.).
Un grupo de ácidos nucleicos preferidos de la invención tiene una
buena capacidad intrínseca para hibridarse con ácidos nucleicos
diana de PCAV.
De esta manera, se describe un ácido nucleico
que comprende una secuencia de nucleótidos con s % o más de
identidad de la secuencia con un fragmento de ácido nucleico diana
de PCAV o con el complemento de un fragmento de un ácido nucleico
diana de PCAV. Se describe un ácido nucleico que comprende una
secuencia de nucleótidos con g % o más de identidad de la
secuencia con un fragmento de la SEC ID 10 o con el complemento de
un fragmento de la SEC ID 10. Se describe un ácido nucleico que
comprende una secuencia de nucleótidos con h % o más
identidad de la secuencia con un fragmento de la SEC ID 5 o con el
complemento de un fragmento de la SEC ID 5. Se describe un ácido
nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos con i % o
más identidad de la secuencia con un fragmento de la SEC ID 6 o con
el complemento de un fragmento de la SEC ID 6. Se describe un ácido
nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos con j %
o más de identidad de la secuencia con un fragmento de la SEC ID 9
o con el complemento de un fragmento de la SEC ID 9. Se describe un
ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos con
ccc % o más identidad de la secuencia con un fragmento de la
SEC ID 53 o con el complemento de un fragmento de la SEC ID 53. Se
describe un ácido nucleico que comprende una secuencia de
nucleótidos con
kkk % o más de identidad de la secuencia con la SEC ID 1191. Se proporciona también un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con al menos mmm % de identidad de la secuencia con la SEC ID 98. Se describe un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos con nnn % o más de identidad de la secuencia con la SEC ID 1198. Se proporciona también un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene al menos qqq % de identidad de la secuencia con la SEC ID 1199. Se proporciona también un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene al menos rrr % de identidad de la secuencia con la SEC ID 1200.
kkk % o más de identidad de la secuencia con la SEC ID 1191. Se proporciona también un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con al menos mmm % de identidad de la secuencia con la SEC ID 98. Se describe un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos con nnn % o más de identidad de la secuencia con la SEC ID 1198. Se proporciona también un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene al menos qqq % de identidad de la secuencia con la SEC ID 1199. Se proporciona también un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene al menos rrr % de identidad de la secuencia con la SEC ID 1200.
Se describe un ácido nucleico que comprende un
fragmento de al menos k nucleótidos contiguos de la SEC ID 10 o del
complemento de la SEC ID 10. El fragmento está localizado
preferiblemente en el interior de la SEC ID 1197 y/o la 1198.
Se describe un ácido nucleico que comprende un
fragmento de al menos l nucleótidos contiguos de la SEC ID
47 o del complemento de la SEC ID 47. El fragmento comprende
preferiblemente la secuencia de nucleótidos
B_{1a}-B_{2a} (o su complemento), en la que
B_{1a} comprende m o más nucleótidos procedentes del
extremo 3' de la SEC ID 2 y B_{2a} comprende p o más
nucleótidos procedentes del extremo 5' de la SEC ID 46. Estos ácidos
nucleicos expanden de esta manera una unión de corte y empalme que
lleva las secuencias N_{1} y N_{2} juntas y son capaces de
identificar de esta manera los transcritos de PCAV en presencia de
ADN genómico de PCAV debido a la diferencia en las localizaciones
relativas de B_{1a} y B_{2a}, B_{1a}-B_{2a}
comprende preferiblemente la SEC ID 11 (o su complemento), en la
que M = p = 4, y más preferiblemente, comprende la SEC ID 50 (o su
complemento), en la que m = p = 10.
Se describe un ácido nucleico que comprende un
fragmento de al menos q nucleótidos contiguos de la SEC ID
49 o del complemento de la SEC ID 49. El fragmento comprende
preferiblemente la secuencia de nucleótidos
B_{1b}-B_{2b} (o su complemento), en la que
B_{1b} comprende r o más nucleótidos procedentes del
extremo 3' de la SEC ID 2 y B_{2b} comprende t o más
nucleótidos procedentes del extremo 5' de la SEC ID 48. Estos ácidos
nucleicos expanden de esta manera la unión de corte y empalme que
lleva las secuencias N_{1} y N_{2} juntas y de esta manera son
capaces de identificar los transcritos de PCAV en presencia de ADN
genómico de PCAV debido a la diferencia en las localizaciones
relativas de B_{1b} y B_{2b}, B_{1b}-B_{2b}
comprende preferiblemente la SEC ID 12 (o su complemento), en la
que r = t = 4, y más preferiblemente, comprende la SEC ID 51 (o su
complemento), en la que r = t = 10.
Se describe un ácido nucleico que comprende un
fragmento de al menos u nucleótidos contiguos de la SEC ID 9
o del complemento de la SEC ID 9. El fragmento comprende
preferiblemente la secuencia B_{3}-B_{4} (o su
complemento), en la que B_{3} comprende v o más nucleótidos
procedentes del extremo 3' de la SEC ID 7 y B_{4} comprende
w o más nucleótidos procedentes del extremo 5' de la SEC ID
8. Estos ácidos nucleicos incluyen de esta manera parte de ambos de
N_{3} y N_{4}. B_{3}-B_{4} comprende
preferiblemente la SEC ID 13 (o su complemento), en la que v = w =
4, y más preferiblemente, compréndela SEC ID 52 (o su complemento),
en la que v = w= 10.
Se describe un ácido nucleico que comprende un
fragmento de al menos rr nucleótidos contiguos de la SEC ID
38 o el complemento de la SEC ID 38. El fragmento comprende
preferiblemente la secuencia de nucleótidos
B_{7}-B_{8} (o su complemento), en la que
B_{7} comprende ss o más nucleótidos procedentes del
extremo 3' de la SEC ID 37 y B_{4} comprende tt o más
nucleótidos procedentes del extremo 5' de la SEC ID 32. Estos ácidos
nucleicos incluyen de esta manera parte de N_{7} y N_{8}.
B_{7}-B_{8} comprende preferiblemente la SEC ID
39 (o su complemento), en la que ss = tt = 4, y comprende más
preferiblemente la SEC ID 36 (o su complemento), en la que ss = tt =
10.
Se describe un ácido nucleico que comprende un
fragmento de al menos jj nucleótidos contiguos de la SEC ID
43 o del complemento de la SEC ID 43. El fragmento comprende
preferiblemente la secuencia de nucleótidos
B_{9}-B_{10}, o su complemento, y en la que
B_{9} comprende kk o más nucleótidos procedentes del
extremo 3' de la SEC DE ID 32 y B_{10} comprende ll o más
nucleótidos procedentes del extremo 5' de la SEC ID 40. Estos ácidos
nucleicos incluyen de esta manera parte de N_{9} y N_{10}.
B_{9}-B_{10} comprende preferiblemente la SEC
ID 44 (o su complemento), en la que kk = 11 = 4, y comprende más
preferiblemente la SEC DE ID 45 (o su complemento), en la que kk= 11
=10.
Se describe un ácido nucleico que comprende un
fragmento de al menos ddd nucleótidos contiguos de la SEC ID
53 o del complemento de la SEC ID 53. La invención proporciona
también un ácido nucleico que comprende un fragmento de al menos
ggg nucleótidos contiguos de la SEC ID 11 o del complemento
de la SEC ID 111. La invención proporciona también un ácido
nucleico que comprende un fragmento de al menos hhh
nucleótidos contiguos de la SEC ID 112 o del complemento de la SEC
ID 112. Se describe un ácido nucleico que comprende un fragmento de
al menos jjj nucleótidos contiguos de la SEC ID 1191 o del
complemento de la SEC ID 1191.
Se describe un ácido nucleico de fórmula
5'-X-Y-Z-3',
en el que: -X- es una secuencia de nucleótidos constituida por x
nucleótidos; -Z es una secuencia de nucleótidos constituida por z
nucleótidos; -Y- es una secuencia de nucleótidos constituida tanto
por (a) un fragmento de y nucleótidos de cualquiera de las SEC ID
1-13, 20-53, 57, 58, 63, 81, 86,
88-91, 99-109, 111,112, 1191, 1197 ó
1198, o (b) el complemento de (a); y dicho ácido nucleico
5'-X-Y-Z-3'
nunca es (i) un fragmento de las SEC ID 1-13,
20-53, 57, 58, 63, 81, 86, 88-91,
99-109, 111, 112, 1191, 1197 ó 1198 o (ii) el
complemento de (i).
En el que -Y- es (a), la secuencia de
nucleótidos de -X- comparte preferiblemente menos de bb % de
identidad de la secuencia con los nucleótidos x que son 5'
de la secuencia -Y- en las SEC ID 1-13,
20-53, 57, 58, 63, 81, 86, 88-91,
99-109, 111, 112, 1191, 1197 ó 1198 y/o la secuencia
de nucleótidos de -Z- comparte preferiblemente menos de cc %
de identidad de la secuencia con los nucleótidos z que son 3' de la
secuencia -Z- en las SEC ID 1-13,
20-53, 57, 58, 63, 81, 86,
88-91,99-109,111, 112, 1191, 1197 ó
1198.
En el que -Y- es (b), la secuencia de
nucleótidos de -X- comparte preferiblemente menos de bb % de
identidad de la secuencia con el complemento de los nucleótidos x
que son 5' del complemento de la secuencia -Y- en las SEC ID
1-13, 20-53, 57, 58, 63, 81, 86,
88-91, 99-109, 111, 112, 1191, 1197
ó 1198 y/o la secuencia de nucleótidos de -Z- comparte
preferiblemente menos de cc % de identidad de la secuencia
con el complemento de los nucleótidos z, que son 3' del complemento
de la secuencia -Y- en las SEC ID 1-13,
20-53, 57, 58, 63, 81, 86, 88-91,
99- 109, 111, 112, 1191, 1197 ó 1198.
Los restos -X- y/o -Z- pueden comprender una
secuencia de promotor (o su complemento).
Se describe un ácido nucleico que comprende la
SEC ID 53. Esta secuencia es específica en el interior del genoma
humano con PCAV. La invención proporciona también un ácido nucleico
que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEC ID 111.
Se describe un ácido nucleico que comprende la
secuencia de nucleótidos de la SEC ID 1191. La invención proporciona
diversos ácidos nucleicos de PCAV. Se proporcionan fragmentos de
25mer de las secuencias de PCAV como las SEC ID 120 a 1184. Se
describen estas secuencias como de 25mer, así como sus fragmentos
(por ejemplo, los 2 x 24mer, los 3 x 24mer, los 4 x 22mer
... los 19 x 7mer en cada) y como fragmentos de PCAV más largos que
comprenden estos 25mer.
Los ácidos nucleicos preferidos de la invención
comprenden una o más de las SEC ID 53 y
842-1184.
Los ácidos nucleicos son particularmente útiles
como sondas y/o como cebadores para uso en la hibridación y/o las
reacciones de amplificación.
Se puede hibridar más de un ácido nucleico con
la misma diana (por ejemplo, se puede hibridar más de uno con un
ARNm o ADNc único).
\vskip1.000000\baselineskip
Se puede detectar conveniente y sensiblemente el
ácido nucleico en la muestra mediante técnicas de amplificación de
ácidos nucleicos tales como amplificación mediante PCR, SDA, SSSR,
LCR, TMA, NASBA, T7, etc. Una técnica preferida para uso con ARN es
la RT-PCR (por ejemplo, véase el capítulo 15
de la ref. 20). La técnica puede ser cuantitativa y/o en tiempo
real.
Las técnicas de amplificación implican
generalmente el uso de dos cebadores. Cuando la secuencia diana es
una cadena única, las técnicas implican generalmente una etapa
preliminar en la que se prepara una cadena complementaria con el
fin de proporcionar una doble cadena diana. Los dos cebadores se
hibridan con diferentes cadenas de la doble cadena diana y a
continuación se extienden. Los productos extendidos pueden servir
como dianas para rondas adicionales de hibridación/extensión. El
efecto neto es amplificar una secuencia plantilla con la diana,
definiéndose los términos 5' y 3' mediante las localizaciones de los
dos cebadores en la diana.
Los cebadores y las sondas son preferiblemente
ácidos nucleicos, tal como se describe en la sección B.4 anterior.
Los cebadores particularmente preferidos son los basados en las SEC
ID 600-1184 (o sus complementos), por ejemplo, que
comprendiendo los cebadores que comprenden las SEC ID
600-1184, o los cebadores que comprenden fragmentos
de ppp o más nucleótidos procedentes de una de las SEC ID
600-1184.
En la sección B.6, dada a continuación, se
describen las características adicionales de cebadores y sondas.
\vskip1.000000\baselineskip
Se proporcionan preferiblemente ácidos nucleicos
y transcritos en forma aislada o sustancialmente aislada, es decir,
sustancialmente libre de otros ácidos nucleicos (por ejemplo,
libre de los ácidos nucleicos que se producen naturalmente), siendo
generalmente al menos un 50% pura (en peso), y usualmente, al menos
un 90% pura.
Los ácidos nucleicos pueden tener diversas
formas.
Los ácidos nucleicos pueden ser de cadena única
o de doble cadena. A no ser que se especifique o requiera otra
cosa, cualquier forma de realización de la invención que utiliza un
ácido nucleico puede utilizar la doble cadena y cada una de dos
formas complementarias de cadena única que completan la forma de
doble cadena. Los cebadores y las sondas son generalmente de cadena
única, ya que son ácidos nucleicos de sentido contrario.
Los ácidos nucleicos pueden ser circulares o
ramificados, pero generalmente serán lineales.
El ácido nucleico se puede unir a un soporte
sólido (por ejemplo, una perla, placa, filtro, película,
soporte de micromatriz, resina, etc.).
Para algunas formas de realización, los ácidos
nucleicos tienen al menos preferiblemente 7 nucleótidos de longitud
(por ejemplo, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19,
20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36,
37, 38, 39, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 90, 100, 110, 120,
130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 225, 250, 275, 300
nucleótidos o más largos).
Para algunas formas de realización, los ácidos
nucleicos tienen preferiblemente como máximo 500 nucleótidos de
longitud (por ejemplo, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150,
140, 130, 120, 110, 100, 90, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40,
39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23,
22, 21, 20, 19, 18, 17,16, 15 nucleótidos o más cortos).
Los cebadores y las sondas, y otros ácido
nucleicos usados para la hibridación, tienen preferiblemente entre
10 y 30 nucleótidos de longitud (por ejemplo, 10, 11, 12, 13,
14, 15, 16,17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, ó 30
nucleótidos).
Los ácidos nucleicos pueden transportar una
marca detectable, por ejemplo, una marca radioactiva o
fluorescente, o una marca de biotina. Estos es particularmente útil
cuando el ácido nucleico se va a usar en técnicas de detección de
ácidos nucleicos, por ejemplo, cuando el ácido nucleico es
una sonda o un cebador.
Los ácidos nucleicos comprenden secuencias de
PVAC, pero pueden comprender también secuencias no de PCAV (por
ejemplo, en ácidos nucleicos de fórmula
5'-X-Y-Z-3'),
tal como se ha definido anteriormente. Esto es particularmente útil
para los cebadores, que pueden comprender de esta manera una primera
secuencia complementaria con un ácido nucleico diana de PCAV y una
segunda secuencia que no es complementaria con el ácido nucleico
diana. Las secuencias típicas no complementarias comprenden los
emplazamientos de restricción {26} o las secuencias del promotor
{27}.
Se pueden preparar los ácidos nucleicos de
muchas maneras, por ejemplo, mediante síntesis química (al
menos en parte), digiriendo ácidos nucleicos más largos usando
nucleasas (por ejemplo, enzimas de restricción), uniendo
ácidos nucleicos más cortos (usando, por ejemplo, ligasas o
polimerasas), procedentes de bibliotecas genómicas o de ADNc,
etc.
Los ácidos nucleicos pueden ser parte de un
vector, es decir, parte de una construcción de ácido nucleico
diseñada para la transducción/transfección de uno o más tipos de
células. Los vectores pueden ser, por ejemplo, "vectores de
clonación" que se diseñan para el aislamiento, la propagación y
replicación de los nucleótidos insertados, "vectores de
expresión", que se diseñan para la expresión de una secuencia de
nucleótidos en una célula huésped, "vectores víricos", que se
diseñan para dar como resultado la producción de un virus
recombinante o de una partícula de tipo virus, o "vectores
lanzadera", que comprenden los atributos de más de un tipo de
vector. Una "célula huésped" incluye una célula individual o
cultivo celular que puede ser o ha sido un receptor de ácido
nucleico exógeno. Las células huéspedes incluyen la progenie de una
célula huésped única, y la progenie puede no ser completamente
idéntica (en morfología o en el complemento del ADN total) con la
célula parental original debido a mutación y/o cambio natural,
accidental, o deliberado. Las células huéspedes incluyen células
transfectadas o infectadas in vivo o in vitro con el
ácido nucleico.
El término "ácido nucleico" incluye en
términos generales una forma polimérica de nucleótidos de cualquier
longitud, que contiene desoxiribonucleótidos, ribonucleótidos, y/o
sus análogos. Esto incluye el ADN, ARN, los híbridos de ADN/ARN.
Incluye también los análogos de ADN o ARN, tales como los que
contienen los esqueletos modificados (por ejemplo, ácidos
nucleicos de péptidos (ANP) o fosforotioatos) o las bases
modificadas. No se pretende que el término "ácido nucleico"
esté limitado a la longitud o a la estructura de un ácido nucleico
a no ser que se indique específicamente, y los siguientes son
ejemplos no limitantes de ácidos nucleicos; un gen o fragmento de
gen, ARNm, ARNt, ARNr, ribozimas, ADNc, ácidos nucleicos
recombinantes, ácidos nucleicos ramificados, plásmidos, vectores,
ADN de cualquier fuente, ARN de cualquier fuente, sondas y
cebadores. Cuando el ácido nucleico de la invención toma la forma
de ARN, puede tener un casquete 5'.
Cuando un ácido nucleico es ADN, se apreciará
que "U" es una secuencia de ARN estará sustituido por "T"
en el ADN. De manera similar, cuando un ácido nucleico es ARN, se
apreciará que "T" en una secuencia de ADN estará sustituido por
"U" en el ARN.
El término "complemento" o
"complementario" cuando se usa en relación con ácidos
nucleicos, se refiere al emparejamiento de bases de
Watson-Crick. De esta manera, el complemento de C es
G, el complemento de G es C, el complemento de A es T (o U), y el
complemento de T (o U) es A. Es también posible usar bases tales
como 1 (la purina inosina), por ejemplo para complementar
pirimidinas (C o T). Los términos implican también una dirección-
el complemento de 5'-ACAGT-3' es
5'-ACTGT-3' más bien que
5'-TGTCA-3'.
Se pueden usar los ácidos nucleicos, por
ejemplo: para producir polipéptidos; como sondas de hibridación para
la detección de ácidos nucleicos en muestras biológicas; para
generar copias adicionales de los ácidos nucleicos, para generar
ribozimas u oligonucleótidos de sentido contrario, como cebadores o
ondas de ADN de cadena única; o como oligonucleótidos formadores de
triples cadenas. Se usan preferiblemente los ácidos nucleicos para
detectar ácido nucleicos diana tales como ARNm de PCAV.
Las referencias a un porcentaje de identidad de
la secuencia entre dos secuencias de ácidos nucleicos significan
que, cuando se alinean, estos porcentajes de bases son los mismos
comparando las dos secuencias. Se puede determinar esta alineación
y el porcentaje de homología o identidad de la secuencia usando
programas de software conocidos en la técnica, p_{0r} ejemplo,
los descritos en la sección 7.7.18 de la referencia 28. Un programa
de alineación preferido es GCG Gap (Genetics Computer Group,
Wisconsin, Suite Versión 10.1), que usa preferiblemente parámetros
por defecto, que son como sigue: hueco abierto = 3; hueco extendido
= 1.
El porcentaje de valores de a, aa, b, bbb, c,
ccc, d, e, eee, f, fff, g, h, hh, i, ii, j, kkk, mm, mmm; n, nn,
nnn, pp, qq, qqq, rrr, s, uu, vv y ww tal como se usaron
anteriormente puede ser independientemente cada uno 50, 55, 60, 65,
70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99.5, 99.9 ó
100. Los valores de cada uno de a, aa, b, bbb, c, ccc, d, e,
eee, f, fff, g, h, hh, i, ii, j, mm, n, nn, pp, qq, s, uu, vv y
ww pueden ser iguales o diferentes entre sí. Las secuencias
de ácidos nucleicos que incluyen cambios "silenciosos" (es
decir, que no afectan el aminoácido codificado por un codón) son
ejemplos de estos ácidos nucleicos.
Los valores de ddd, ggg, hhh, jj, jjj, k, kk,
l, ll, m, p, ppp, q, r, rr, ss, t, tt, u, v, w e y tal
como se usaron anteriormente pueden ser cada uno independientemente
6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23,
24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 40, 45, 50, 60, 70,
80, 90, 100 o más. Los valores de cada uno de ddd, ggg, jj, k,
kk, l, ll, m, p, q, r, rr, ss, t, tt, u, v, w e y pueden
ser iguales o diferentes entre sí.
El valor de x+z es al menos 1 (por
ejemplo, al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14,
15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35,
40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100 etc.). se prefiere que el valor de
x+y+z sea al menos 8 (por ejemplo, al menos 9, 10, 11, 12,
13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45,
50, 60, 70, 80, 90, 100 etc.). Se prefiere que el valor de x+y+z sea
como máximo 500 (por ejemplo, como máximo 450, 400, 350,
300, 250, 200, 190, 180, 170, 160, 150, 140, 130, 120, 110, 100,
90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12,
11, 10, 9, 8).
El porcentaje de valores de bb y
cc que se usó anteriormente es preferiblemente,
independientemente de cada uno menor de 60 (por ejemplo, 50,
40, 30, 20, 10), o puede ser incluso 0. Los valores de bb y
cc pueden ser iguales o diferentes entre sí.
Los ácidos nucleicos preferidos comprenden
secuencias de nucleótidos que permaneces sin enmascarar tras la
aplicación de un programa de enmascaramiento para enmascarar la baja
complejidad (por ejemplo, XBLAST).
Cuando se dice que un ácido nucleico
"codifica" un polipéptido, no se implica necesariamente que el
polinucleótido esté traducido, pero incluirá una serie de codones
que codifiquen los aminoácidos del polipéptido.
\vskip1.000000\baselineskip
Cuando el procedimiento se basa en la detección
de polipéptidos, implicará detectar la expresión de un polipéptido
codificado por un transcrito de ARNm de PCAV. Esto implicará
normalmente detectar uno o más de los siguientes polipéptidos; gag
(por ejemplo, SEC ID 57) o PCAP3/mORF (por ejemplo, SEC ID 87).
Aunque algún ARNm de PCAV codifica todos estos polipéptidos (por
ejemplo, ERVK6 {44}, PCAV es un virus antiguo y sus genes prt, pol y
env están muy fragmentados.
Los transcritos que codifican los polipéptidos
HML-2 están generados mediante corte y empalme
alternativo de la copia de ARNm de longitud completa del genoma
endógeno {por ejemplo, la Figura 4 de la ref. 45, la Figura
1 de la ref. 54}. El polipéptido gag de PCAV está codificado
por el primer ORF largo en el genoma (nucleótidos
2813-4683 de la SEC ID 1; SEC ID 54). El polipéptido
gag de longitud completa se rompe proteolíticamente. El
polipéptido prt de PCAV está codificado por el segundo ORF largo
en el genoma y se traduce como el polipéptido de fusión
gag-prt que se rompe proteolíticamente para dar la
proteasa. El polipéptido pol de PCAV está codificado por el
tercer ORF largo en el genoma y se traduce como el polipéptido de
fusión gag-prt-pol que se rompe
proteolíticamente para dar tres productos pol - transcriptasa
inversa, endonucleasa e integrasa {46}. El polipéptido env de
PCAV está codificado por el cuarto ORF largo en el genoma. El
polipéptido traducido se rompe proteolíticamente. El polipéptido
cORF de PCAV está codificado por un ORF que comparte la misma
región 5' y el codón de inicio que env, pero en el que un episodio
de corte y empalme elimina las secuencias que codifican env y los
cambios en un marco de lectura +1 en relación con el de env {47,
48}. El polipéptido PCAP3 está codificado por un ORF que
comparte la misma región 5' y el codón de inicio que env, pero en el
que un episodio de corte y empalme elimina las secuencias que
codifican env y los cambios en un marco de lectura +2 en relación
con el de env (el tercer marco de lectura).
\vskip1.000000\baselineskip
Están disponibles diversas técnicas para
detectar la presencia o ausencia de polipéptidos concretos en una
muestra. Se trata por lo general de técnicas de inmunoensayo que
están basadas en la interacción específica entre un anticuerpo y
una secuencia de aminoácidos antigénicos en el polipéptido: las
técnicas adecuadas incluyen procedimientos inmunohistológicos
normalizados, ELISA, RIA, FIA, inmunoprecipitación,
inmunofluorescencia, etc.
Se pueden detectar también los polipéptidos de
la invención mediante ensayos funcionales, por ejemplo, ensayos
para detectar la actividad de unión o la actividad enzimática. Por
ejemplo, se dan a conocer ensayos funcionales para cORF en las
referencias 48 a 50, y se da a conocer un ensayo funcional para la
proteasa en la referencia 51. Se ha encontrado que PCAP3 produce la
apoptosis en células primarias epiteliales de próstata y, cuando se
suprime la apoptosis, permite a las células expandirse más allá de
su punto normal de senescencia.
Otro medio de detectar los polipéptidos de la
invención es usar técnicas proteómicas normalizadas, por ejemplo,
purificar o separar polipéptidos y usar a continuación la
secuenciación de péptidos. Por ejemplo, se pueden separar
polipéptidos usando 2D-PAGE, y se pueden secuenciar
manchas de polipéptidos (por ejemplo, mediante
espectrometría de masas) con el fin de identificar si está presente
una secuencia en un polipéptido diana.
Las técnicas pueden requerir el enriquecimiento
de los polipéptidos diana antes de la detección. Sin embargo, se
pueden llevar a cabo fácilmente ensayos de inmunofluorescencia en
células sin necesidad de dicho enriquecimiento. Se pueden fijar, en
primer lugar, las células, sobre un soporte sólido, tal como un
porta de microscopio o pocillo de microvaloración. A continuación
las membranas de las células se pueden permeabilizar con el fin de
permitir la entrada del anticuerpo (NB: se pueden conseguir
conjuntamente la fijación y permeabilización). A continuación, las
células fijadas se pueden exponer a un anticuerpo marcado con
fluorescencia que sea específico del polipéptido. La presencia de
esta marca identifica las células que expresan el polipéptido diana
de PCAV. Para aumentar la sensibilidad del ensayo, es posible usar
un segundo anticuerpo para que se una con el anticuerpo dirigido
contra PCAV, transportándose la marca por el segundo anticuerpo.
{52}
\vskip1.000000\baselineskip
En lugar de detectar los polipéptidos
directamente, puede preferirse detectar las moléculas producidas por
el cuerpo en respuesta a un polipéptido (es decir, detección
indirecta de un polipéptido). Esto implicará normalmente la
detección de los anticuerpos, de tal manera que la muestra del
paciente será generalmente una muestra de sangre. Se pueden
detectar los anticuerpos mediante técnicas de inmunoensayo
convencionales, usando, por ejemplo, los polipéptidos de
PCAV de la invención, que normalmente estarán inmovilizados.
Se han detectado anticuerpos contra
RVEH-K en seres humanos {por ejemplo, 45, 53,
54} por ejemplo en tejido de seminoma o teratocarcinoma.
\newpage
Los polipéptidos que se pueden usar en los
procedimientos de detección de la invención, están codificados por
un retrovirus endógeno humano localizado en la megabase 20.428 en el
cromosoma 22.
Los polipéptidos que comprenden una secuencia de
aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido por las SEC ID
54, 55, 56, 59, 60, 61, 62, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73,
74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 82, 83, 84, 85, 87, 92, 93, 94, 95, 96,
97, 98, 110, 1186 y 1188. Las SEC ID 54, 55, 56, 87, 98 y 110 son
miembros preferidos de este grupo.
Se describe también (a) un polipéptido que
comprende un fragmento de al menos dd aminoácidos de una o más de
las SEC 54, 55, 56, 59, 60, 61, 62, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71,
72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 82, 83, 84, 85, 87, 92, 93, 94,
95, 96, 97, 98, 110, 1186 y 1188, y (b) un polipéptido que comprende
una secuencia de aminoácidos que tiene al menos ee % ee % de
identidad con una o más de las SEC 54, 55, 56, 59, 60, 61, 62, 64,
65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 82,
83, 84, 85, 87, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 110, 1186 y 1188. Estos
polipéptidos incluyen las variantes (por ejemplo, variantes
alélicas, homólogos, ortólogos, mutantes, etc.).
El fragmento de (a) puede comprender una célula
T o, preferiblemente, un epitopo de célula B de las SEC 54, 55, 56,
59, 60, 61, 62, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76,
77, 78, 79, 80, 82, 83, 84, 85, 87, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98,
110, 1186 y 1188. Se pueden identificar los epitopos de células T y
B empíricamente (usando, por ejemplo, PEPSCAN {55, 56} o
procedimientos similares), o se pueden predecir (usando, por
ejemplo, el índice antigénico de Jameson-Wolf
{57}, soluciones basadas en la matriz {58}, TEPITOPE {59}, redes
neurales {60}, OptSMer y EpiMer {61, 62}, ADEPT {63},
emplazamientos T {64}, hidrofilia {65}, índice antigénico {66} o los
procedimientos que se dan a conocer en la referencia 67
etc.
Los fragmentos preferidos de (a) son las SEC ID
55, 56 y 110, o son los fragmentos de las SEC ID 55, 56 o 110. Las
SEC ID 55, 56 y 110 se encuentran en el interior de la proteína gag
de PCAV y son particularmente útiles para detectar la expresión de
PCAV por encima de la expresión de fondo de otros
RVEH-K.
En el interior de (b), el epitopo puede, en
comparación con las SEC ID 54, 55, 56, 59, 60, 61, 62, 64, 65, 66,
67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 82, 83, 84,
85, 87, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 110, 1186 y 1188, comprender
una o más sustituciones de aminoácidos conservativos, es decir,
sustituciones de un aminoácido con otro que tiene una cadena
secundaria relacionada. Los aminoácidos genéticamente codificados
se dividen generalmente en cuatro familias: (1) ácidos, es decir,
aspartato, glutamato; (2) básicos, es decir, lisina, arginina,
histidina; (3) no polares, es decir, alanina, valina, ieucina,
isoleucina, prolina, fenilalanina, metíonina, triptófano; y (4)
polares no cargados, es decir, glicina, asparagina, glutamina,
cistina, serina, treonina, tirosina. Fenilalanina, triptófano, y
tirosina se clasifican algunas veces conjuntamente como aminoácidos
aromáticos. En general, la sustitución de los aminoácidos únicos
dentro de estas familias no tiene un mayor efecto sobre la actividad
biológica.
Se describe también un polipéptido que tiene la
fórmula
NH_{2}-XX-YY-ZZ-COOH,
en el que: XX es una secuencia de polipéptido constituida por los
aminoácidos xx; ZZ es una secuencia de polipéptido
constituida por los aminoácidos zz; YY es una secuencia de
polipéptido constituida por un fragmento de los aminoácidos
yy de una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el
grupo constituido por las SEC ID 54, 55, 56, 59, 60, 61, 62, 64,
65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 82,
83, 84, 85, 87, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 110, 1186 y 1188; y
dicho polipéptido
NH_{2}-YX-YY-ZZ-COOH
no es un fragmento de una secuencia de polipéptidos seleccionada
entre las SEC ID 54, 55, 56, 59, 60, 61, 62, 64, 65, 66, 67, 69, 69,
70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 82, 83, 84, 85, 87, 92,
93, 94, 95, 96, 97, 98, 110, 1186 y 1188.
La secuencia de -XX- comparte preferiblemente
menos de ff % de identidad de la secuencia con los
aminoácidos xx que son el término N de la secuencia -YY- en
las SEC ID 54, 55, 56, 59, 60, 61, 62, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,
71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 82, 83, 84, 85, 87, 92, 93,
94, 95, 96, 97, 98, 110, 1186 y 1188. La secuencia de -ZZ- comparte
preferiblemente menos de gg % de identidad con los
aminoácidos zz que son el término C de la secuencia -YY- en las SEC
ID 54, 55, 56, 59, 60, 61, 62, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72,
73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 82, 83, 84, 85, 87, 92, 93, 94, 95,
96, 97, 98, 110, 1186 y 1188.
El término "polipéptido" se refiere a
polímeros de aminoácidos de cualquier longitud. El polímero puede
ser lineal o ramificado, puede comprender aminoácidos modificados,
puede estar interrumpido por no aminoácidos. Los términos abarcan
también un polímero de aminoácidos que se ha modificado naturalmente
o mediante intervención; por ejemplo, formación de enlace
disulfuro, glicosilación, lipidación, acetilación, fosforilación, o
cualquier otra manipulación o modificación, tal como conjugación
con un componente marcado. Incluidos también dentro de la
definición están, por ejemplo, los polipéptidos que contienen uno o
más análogos de un aminoácido (incluyendo, por ejemplo, aminoácidos
no naturales, etc), así como otras modificaciones conocidas
en la técnica. Se pueden producir los polipéptidos como cadenas
únicas o cadenas asociadas. Los polipéptidos de la invención se
pueden glicosilar o no glicosilar naturalmente (es decir, el
polipéptido tiene un modelo de glicosilación que difiere del modelo
de glicosilación que se encuentra en el polipéptido correspondiente
que se produce naturalmente.).
Los mutantes pueden incluir sustituciones,
adiciones o delecciones de aminoácidos. Las sustituciones de
aminoácidos pueden ser sustituciones de aminoácidos conservativas o
sustituciones para eliminar aminoácidos no esenciales, tales como
para alterar un emplazamiento de glicosilación, un emplazamiento de
fosforilación o un emplazamiento de acetilación, o para minimizar
el plegado incorrecto mediante sustitución o delección de uno o más
restos de cisteína que no son necesarios para la función. Las
sustituciones de aminoácidos conservativas son aquellas que
preservan la carga general, la hidrofobia/hidrofilia, y/o el volumen
estérico del aminoácido sustituido. Se pueden diseñar variantes con
el fin de que retengan o tengan actividad biológica potenciada de
Una región concreta del polipéptido (por ejemplo, una región
funcional y/o, cuando el polipéptido es un miembro de una familia
de polipéptidos, una región asociada con una secuencia consenso). La
selección de alteraciones de aminoácidos para la producción de
variantes puede estar basada en la accesibilidad (interior frente a
exterior) del aminoácido (por ejemplo, ref. 68), la
termoestabilidad del polipéptido variante (por ejemplo, ref.
69), los emplazamiento de glicosilación deseados (por
ejemplo, ref. 70), los puentes de disulfuro deseados (por
ejemplo refs. 71 y 72), los emplazamientos deseados de unión con
metales (por ejemplo, refs. 73 y 74) y las sustituciones
deseadas en bucles de prolina (por ejemplo, ref. 75). Se
pueden producir muteínas sin cisteína tal como se da a conocer en la
referencia 76.
El valor del porcentaje de ee tal como se usó
anteriormente puede ser 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93,
94, 95, 96, 97, 98, 99, 99.5, 99.9 ó 100.
Los valores de los porcentajes de ff y
gg tal como se usaron anteriormente son independientemente
cada uno preferiblemente menores de 60 (por ejemplo, 50, 40, 30,
20,10), o pueden ser incluso 0. Los valores de ff y gg
pueden ser iguales o diferentes entre sí.
Los valores de dd, xx, yy, y zz
tal como se usaron anteriormente pueden ser cada uno
independientemente 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16,17,
18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34,
35, 40, 45, 50, 60, 70, 75, 80, 90, 100 o más. Los valores de cada
uno de dd, xx, yy y zz pueden ser iguales o
diferentes entre sí. El valor de dd puede ser menor de 2000 (por
ejemplo, menor de 1000, 500, 100, ó 50).
El valor de xx+zz es al menos 1 (por
ejemplo, al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14,
15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35,
40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100 etc.). se prefiere que el valor de
xx+yy+zz sea al menos 8 (por ejemplo, al menos 9, 10,
11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35,
40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100 etc.). Se prefiere que el valor de
xx+yy+zz sea como máximo 500 (por ejemplo, como
máximo 450, 400, 350, 300, 250, 200, 190, 180, 170, 160, 150, 140,
130, 120, 110, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 25, 20, 19, 18, 17,
16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8).
Los polipéptidos tienen generalmente al menos 7
aminoácidos de longitud (por ejemplo, 8, 9, 10, 11, 12, 13,
14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 2S, 26, 27, 28, 29, 30,
31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75,
80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 225,
250, 275, 300 aminoácidos o más largos).
Para algunas formas de realización los
polipéptidos tienen preferiblemente como máximo 500 aminoácidos de
longitud (por ejemplo, 450, 400, 350, 300, 250, 200,150, 140,
130, 120, 110, 100, 90, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 39, 38,
37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21,
20, 19, 18,17, 16,15 aminoácidos o más cortos).
Las referencias a un porcentaje de identidad de
la secuencia entre dos secuencias de aminoácidos significan que,
cuando se alinean, este porcentaje de aminoácidos es el mismo en
comparación con las dos secuencias. Se pueden determinar esta
alineación y el porcentaje de homología o la identidad de la
secuencia usando programas de software conocidos en la técnica, por
ejemplo, los descritos en la sección 7.7.18 de la referencia 28. Se
determinó una alineación preferida mediante el algoritmo de búsqueda
de la homología de Smith-Waterman usando una
búsqueda refinada de huecos con una penalización por apertura de
hueco de 12 y una penalización por extensión de hueco de 2, matriz
BLOSUM de 62. Se enseña el algoritmo de búsqueda de la homología de
Smith-Waterman en la referencia 77.
Los polipéptidos preferidos comprenden las
secuencias de aminoácidos que permanecen sin enmascarar tras la
aplicación de un programa de enmascaramiento de baja complejidad
(por ejemplo, XBLAST).
\vskip1.000000\baselineskip
Se describe un anticuerpo que se une a un
polipéptido descrito en el presente documento. Se describe un
anticuerpo que se une a un polipéptido codificado por un ácido
nucleico descrito en el presente documento.
Los anticuerpos preferidos reconocen epitopos en
las SEC ID 54, 55, 56, 59, 60, 61, 62, 64, 65, 66, 67, 68_{r} 69,
70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 82, 83, 84, 85, 87, 92,
93, 94, 95, 96, 97, 98, 110, 1186 y 1188. Los anticuerpos más
preferidos reconocen epitopos en las SEC ID 54, 55, 56 o 110.
Otros anticuerpos preferidos reconocen una
proteína gag de RVEH-K. El anticuerpo puede (a)
reconocer gag procedente de PCAV y también de uno o más
RVEH-K adicionales, (b) reconocer gag procedente de
PCAV pero no procedente de cualquier otros RVEH-K,
(c) reconocer gag procedente de PCAV y también procedente de uno o
más RVEH-K antiguos, pero no procedente de
RVEH-K nuevos, o (d) reconocer gag procedente de uno
o más RVEH-K pero no procedente de PCAV. Un
anticuerpo preferido en el grupo (a) es 5G2; un anticuerpo preferido
en el grupo (c) es 5A5.
Los anticuerpos pueden ser policlonales o
monoclonales.
Los anticuerpos se pueden producir mediante
cualquier medio adecuado, por ejemplo, mediante expresión
recombinante, o administrando (por ejemplo, mediante
inyección) un polipéptido de la invención en un animal apropiado
(por ejemplo, un conejo, hámster, ratón u otro roedor).
Los anticuerpos pueden incluir una marca. La
marca puede ser detectable directamente, tal como una marca
radioactiva o fluorescente. Alternativamente, la marca puede ser
detectable indirectamente, tal como una enzima cuyos productos son
detectables (por ejemplo, luciferasa,
\beta-galactosidasa, peroxidasa, etc.).
Los anticuerpos se pueden unir a un soporte
sólido.
En general, se proporcionan anticuerpos en un
entorno que se produce de manera no natural, por ejemplo, se
separan del entorno en el que se producen naturalmente. En algunas
formas de realización, los anticuerpos están presentes en una
composición que está enriquecida para ellos en comparación con un
control. Los anticuerpos se proporcionan preferiblemente de esta
manera en forma aislada o sustancialmente aislada, es decir,
es anticuerpo está presente en una composición que está
sustancialmente libre de otros anticuerpos, en el que por
sustancialmente libre se entiende que menos del 75% (en peso),
preferiblemente menos del 50%, y más preferiblemente menos del 10%
(por ejemplo, 5%) de la composición está preparada con otros
anticuerpos.
El término "anticuerpo" incluye cualquier
inmunoglobulina natural o artificial o su derivado. En general, el
anticuerpo comprenderá una región Fv que posee actividad específica
de unión a antígeno. Esto incluye, pero no se limita a:
inmunoglobulinas completas, fragmentos de inmunoglobulina de unión a
antígeno (por ejemplo, Fv, Fab, F(ab')_{2} etc.),
anticuerpos de cadena única (por ejemplo, ScFv),
oligocuerpos, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados,
anticuerpos camuflados, etc.
Para aumentar la compatibilidad con el sistema
inmune humano, los anticuerpos pueden ser quiméricos o humanizados
{por ejemplo, refs. 78 y 79}, o se pueden usar anticuerpos
completamente humanos. Debido a que los anticuerpos humanizados son
mucho menos inmunogénicos en los seres humanos que en los
anticuerpos monoclonales no humanos originales, se pueden usar para
el tratamiento de seres humanos con mucho menos riesgo de
anafilaxis. De esta manera, se pueden preferir estos anticuerpos en
aplicaciones terapéuticas que implican la administración in
vivo a un ser humano tal como, el uso como sensibilizadores de
la radiación para el tratamiento de una enfermedad neoplasica o el
uso en procedimientos para reducir los efectos secundarios de la
terapia contra el cáncer.
Se pueden conseguir anticuerpos humanizados
mediante una variedad de procedimientos entre los que se incluyen,
por ejemplo. (1) injertar regiones determinantes de la
complementariedad no humanas (CDR) sobre una región FW y una región
constante humana ("humanización"), con la transferencia
opcional de uno o más restos de la región FW procedentes del
anticuerpo no humano; (2) trasplantar regiones completas variables
no humanas, pero "cubriéndolas" con una superficie de tipo
humano mediante la sustitución de restos superficiales
("camuflado"). En la presente invención, los anticuerpos
humanizados incluirán anticuerpos "humanizados" y anticuerpos
"camuflados", {refs. 80 a 86}. Las CDR son secuencias de
aminoácidos que definen conjuntamente la afinidad y la especificidad
de unión de una región Fv de un emplazamiento de unión a la
inmunoglobulina nativa. {Por ejemplo, 87 y 88}.
La frase "región constante" se refiere a
una porción de la molécula de anticuerpo que confiere funciones
efectoras. En los anticuerpos quiméricos, las regiones constantes
de ratón están sustituidas por regiones constantes humanas. Las
regiones constantes de los anticuerpos humanizados se derivan de las
inmunoglobulinas humanas. Se puede seleccionar la región constante
de la cadena pesada a partir de cualquiera de los 5 isotipos: alfa,
delta, épsilon, gamma o mu, y de esta manera, el anticuerpo puede
ser de cualquier isotipo (por ejemplo, IgG, IgA, IgM, IgD,
IgE). Se prefiere IgG, que puede ser de cualquier subtipo (por
ejemplo, IgGt, IgG_{2}).
Se pueden producir también anticuerpos
humanizados o completamente humanos usando animales transgénicos que
tienen un locus Ig humano en el que los animales no producen
inmunoglobulinas endógenas funcionales debido a la inactivación de
los loci endógenos de la cadena pesada y la ligera. La ref. 90
también da a conocer huéspedes mamíferos no primates endógenos
capaces de estimular una respuesta inmune a un inmunógeno, en la que
los anticuerpos tienen regiones constantes y/o variables de
primate, y en la que los loci que codifican la inmunoglobulina
endógena están sustituidos o inactivados. La ref. 91 da a conocer el
uso del sistema Cre/Lox para modificar el locus de la
inmunoglobulina en un mamífero, tal como sustituir toda o una
porción de la región constante o variable para formar una molécula
de anticuerpo modificado. La ref. 92 da a conocer huéspedes
mamíferos no humanos que tienen los loci Ig endógenos inactivados y
los loci Ig humanos funcionales. La ref. 93 da a conocer
procedimientos para preparar ratones transgénicos en los que el
ratón carece de las cadenas pesadas endógenas, y expresa un locus de
inmunoglobulina exógena que comprende una o más regiones constantes
xenogénicas.
Usando un animal transgénico descrito
anteriormente, se puede producir una respuesta inmune en un
polipéptido de PCAV, y se pueden eliminar las células que producen
el anticuerpo del animal y usarse para producir hibridomas que
segregan anticuerpos monoclonales. Se conocen en la técnica
protocolos de inmunización, adyuvantes, y similares, y se usan en
la inmunización de, por ejemplo, un ratón transgénico tal como se
describe en la ref. 94. Se pueden ensayar anticuerpos monoclonales
para determinar la capacidad de inhibir o neutralizar la actividad
biológica o el efecto fisiológico del polipéptido
correspondiente.
\vskip1.000000\baselineskip
Cuando el procedimiento de diagnóstico de la
invención esté basado en la detección de la expresión del ARNm, la
muestra del paciente comprenderá generalmente células (por ejemplo,
células de próstata, particularmente las procedentes del epitelio
luminal). Estas pueden estar presentes en una muestra de tejido (por
ejemplo, tejido de la próstata), o pueden ser células que han
escapado en la circulación (por ejemplo, durante la metástasis). En
vez de, o así como comprende células de próstata, la muestra puede
comprender viriones que contienen el ARNm de PCAV.
Cuando el procedimiento diagnóstico de la
invención está basado en la detección de la expresión del
polipéptido, la muestra del paciente puede comprender células,
preferiblemente células de próstata y/o viriones (tal como se
describe anteriormente para el ARNm), o puede comprender anticuerpos
que reconocen los polipéptidos de PCAV. Dichos anticuerpos estarán
presentes normalmente en la circulación.
En general, por tanto, la muestra del paciente
es muestra de tejido, preferiblemente una muestra de próstata
(por ejemplo, una biopsia) o una muestra de sangre. Otras
fuentes posibles de muestras del paciente incluyen células
aisladas, tejidos completos, o fluidos corporales (por
ejemplo, plasma, suero, orina, derrames pleurales, fluido
cerebroespinal, etc). Otra muestra preferida del paciente es una
muestra de semen.
El paciente será, generalmente, un ser humano,
preferiblemente un varón humano, y más preferiblemente un varón
humano adulto.
Se pueden detectar productos de expresión en la
propia muestra del paciente, o se pueden detectar en material
derivado de la muestra (por ejemplo, el sobrenadante de un
lisado celular, un extracto de ARN, ADN generado a partir de un
extracto de ARN, polipéptidos traducidos a partir de un extracto de
ARN, células derivadas de células en cultivo extraídas de un
paciente, etc). Se consideran estas todavía por ser
"muestras del paciente" comprendidas en el significado de la
invención.
Los procedimientos de detección de la invención
se pueden llevar a cabo in vitro o in vivo.
\vskip1.000000\baselineskip
Los transcritos de PCAV tienen un aumento de la
expresión en tumores de próstata. Para detectar dicho aumento, se
necesita normalmente un punto de referencia, es decir; un
control. El análisis de la muestra control proporciona un nivel
estándar de expresión de ARNm y/o de la proteína frente a la cual se
puede comparar una muestra del paciente. Ya que la transcripción de
PCAV es despreciable en células normales y tiene un aumento muy
regulado en células tumorales, sin embargo, puede no ser ya
necesario un punto de referencia - una expresión significativa
indica enfermedad. Incluso de esta manera, es preferible el uso de
controles, particularmente para la normalización o para ensayos
cuantitativos.
Un control negativo proporciona un nivel de
fondo o basal de expresión frente al cual se puede comparar la
muestra del paciente. Niveles mayores del producto de expresión en
relación con un control negativo indican que el paciente a partir
del cual se tomó la muestra tiene un tumor de próstata.
Inversamente, niveles equivalentes de producto de expresión indican
que el paciente no tiene un cáncer relacionado con PCAV.
Un control negativo comprenderá generalmente
material procedente de células que no son células tumorales. El
control negativo podría ser una muestra procedente del mismo
paciente que la muestra del paciente, pero procedente de un tejido
en el que la expresión de PCAV no tiene aumento, por ejemplo,
una célula no de próstata no tumoral. El control negativo podría
ser una célula de próstata procedente del mismo paciente que la
muestra del paciente, pero tomada en una etapa más temprana de la
vida del paciente (por ejemplo, antes del desarrollo del
cáncer, o procedente de un paciente BPH). El control negativo podría
ser una célula procedente de un paciente sin un tumor de próstata,
y esta célula puede ser o no un tipo de célula en el que se ensaye
la muestra del paciente (por ejemplo, una célula de próstata
o una muestra de sangre).
Un control positivo proporciona un nivel de
expresión frente al cual se puede comparar una muestra del paciente.
Niveles equivalentes o mayores del producto de expresión en
relación con un control positivo indican que el paciente del cual
se tomó la muestra tiene un tumor de próstata. Inversamente, niveles
más bajos de producto de expresión indican que el paciente no tiene
un tumor relacionado con PCAV.
Un control positivo comprenderá generalmente
material procedente de células tumorales o procedente de una
muestra de sangre tomada de un paciente conocido por tener un tumor.
El control positivo podría ser una célula de tumor de próstata
procedente del mismo paciente como muestra del paciente, pero tomada
en una etapa más temprana en la vida del paciente (por
ejemplo, para vigilar la remisión). El control positivo podría
ser una célula procedente de otro paciente con un tumor de
próstata. El control positivo podría ser una línea celular
prostética.
Otros controles positivos y negativos adecuados
serán evidentes para una persona experta.
Se puede evaluar la expresión de PCAV en el
control al mismo tiempo que la expresión en la muestra del paciente.
Alternativamente, se puede evaluar la expresión de PCAV en el
control separadamente (más temprano o más tarde). En vez de
comparar realmente dos muestras, sin embargo, el control puede ser
un valor absoluto, es decir, un nivel de expresión que se ha
determinado empíricamente a partir de muestras tomadas de pacientes
con tumor de próstata (por ejemplo, en condiciones
normalizadas). Los ejemplos de dichos controles negativos para
tumores de próstata incluyen los niveles de valores iniciales
vitales de expresión o el nivel de expresión, por ejemplo, tal como
se observó en muestras normales combinadas.
\vskip1.000000\baselineskip
El aumento de la expresión en relación con el
control (100%) será normalmente al menos del 150%) por ejemplo,
200%, 250%, 300%, 400%, 500%, 600% o más. No es común un aumento de
20 a cuarenta veces.
\vskip1.000000\baselineskip
La invención proporciona un procedimiento para
diagnosticar el cáncer de próstata, que comprende la etapa de
detectar en una muestra del paciente el nivel de un producto de
expresión de un retrovirus endógeno humano localizado en la megabase
20.482 del cromosoma 22.
\vskip1.000000\baselineskip
Se describen en las secciones B.1, B.3 y C.3
anteriores los productos de expresión preferidos para la detección
en los procedimientos diagnósticos de la invención.
Se describen en las secciones B.4, C.3 y C.4
anteriores los reactivos preferidos para uso en los procedimientos
diagnósticos de la invención.
\vskip1.000000\baselineskip
La invención proporciona un procedimiento para
analizar una muestra del paciente, que comprende las etapas de:
poner en contacto la muestra del paciente con el ácido nucleico
descrito en el presente documento en condiciones de hibridación, y
(b) detectar la presencia o ausencia de hibridación del ácido
nucleico descrito en el presente documento con el ácido nucleico
presente en la muestra del paciente. La presencia de hibridación en
la etapa (b) indica que el paciente del cual se tomó la muestra
tiene un cáncer de próstata.
La invención proporciona también un
procedimiento para analizar una muestra del paciente, que comprende
las etapas de: (a) enriquecer el ARNm en la muestra con respecto al
ADN para dar una muestra enriquecida en ARNm, (b) poner en contacto
la muestra enriquecida con ARNm con el ácido nucleico descrito en el
presente documento en condiciones de hibridación, y (c) detectar la
presencia o ausencia de hibridación del ADN descrito en el presente
documento con el ARNm presente en la muestra enriquecida con ARNm.
La presencia de hibridación en la etapa (c) indica que el paciente
a partir del cual se tomó la muestra tiene un cáncer de próstata. El
enriquecimiento en la etapa (a) puede tomar la forma de extraer el
ARNm sin extraer el ADN, eliminar el ADN sin eliminar el ARNm, o
perturbar el ADN de PCAV perturbando el ARNm de PCAV, etc
(véase la sección B.2 anterior).
La invención proporciona también un
procedimiento para analizar una muestra del paciente que comprende
las etapas de: (a) preparar copias de ADN del ARNm en una muestra;
(b) poner en contacto las copias de ADN con el ácido nucleico
descrito en el presente documento en condiciones de hibridación; y
(c) detectar la presencia o ausencia de hibridación del ácido
nucleico descrito en el presente documento con dichas copias de ADN.
La presencia de hibridación en la etapa (c) indica que el paciente
a partir del cual se tomó la muestra tiene un tumor de próstata. La
preparación del ADN en la etapa (a) puede ser específica de PCAV
(usando, por ejemplo, la RT-PCR con cebadores
apropiados) o puede ser no específica (por ejemplo,
preparación de ADNc celular).
En los anteriores procedimientos para analizar
una muestra del paciente, el ácido nucleico descrito en el presente
documento puesto en contacto con la muestra puede ser una sonda
descrita en el presente documento. Como alternativa, puede
comprender los cebadores descritos en el presente documento, en cuyo
caso, la etapa relevante del procedimiento implicará generalmente
dos o más (por ejemplo 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más) ciclos de
amplificación. Cuando se usan cebadores, el procedimiento puede
implicar el uso de una sonda para detectar la hibridación del ADN
amplificado.
La invención proporciona también un
procedimiento para analizar una muestra del paciente, comprendiendo
las etapas de: (a) amplificar cualquier ácido nucleico diana de
PCAV en la muestra; y (b) detectar la presencia o ausencia de las
dianas amplificadas. La presencia de las dianas amplificadas en la
etapa (b) indica que el paciente a partir del cual se tomó la
muestra tiene un tumor de próstata.
Estos procedimientos de la invención pueden ser
cualitativos, cuantitativos, o semicuantitativos.
\vskip1.000000\baselineskip
La invención proporciona un procedimiento de
inmunoensayo para diagnosticar el cáncer de próstata, que comprende
la etapa de poner en contacto una muestra del paciente con un
polipéptido o anticuerpo de la invención.
La invención proporciona también un
procedimiento para analizar una muestra de sangre del paciente, que
comprende las etapas de: (a) poner en contacto la muestra de sangre
con un polipéptido de la invención; y (b) detectar la presencia o
ausencia de interacción entre dicho polipéptido y los anticuerpos en
dicha muestra. La presencia de una interacción en la etapa (b)
indica que el paciente a partir del cual se tomó la muestra tiene
aumentados los anticuerpos dirigidos contra PCAV, y de esta manera,
tiene un tumor de próstata. La etapa (a) puede estar precedida por
una etapa en la que los anticuerpos en la muestra de sangre están
enriquecidos.
La invención proporciona también un
procedimiento para analizar una muestra del paciente, que comprende
las etapas de: (a) poner en contacto la muestra con un anticuerpo
de la invención; y (b) detectar la presencia o ausencia de
interacción entre dicho anticuerpo y dicha muestra. La presencia de
una interacción en la etapa (b) indica que el paciente a partir del
cual se tomó la muestra está expresando los polipéptidos de PCAV, y
de esta manera, tiene un tumor de próstata. La etapa (a) puede estar
precedida por una etapa en la que se lisan o permeabilizan las
células en la muestra y/o en la que se enriquecen los polipéptidos
en la muestra.
Estos procedimientos de la invención pueden ser
cualitativos, cuantitativos, o semicuantitativos.
Se pueden adaptar los anteriores procedimientos
para el uso in vivo (por ejemplo, para localizar o
identificar los emplazamientos en los que las células tumorales
están presentes). En estas formas de realización, se administra un
anticuerpo específico de un polipéptido diana de PCAV a un individuo
(por ejemplo, mediante inyección) y el anticuerpo se
localiza usando técnicas de formación de imagen normalizadas (por
ejemplo, formación de imagen mediante resonancia magnética,
escaneo mediante tomografía computerizada, etc). Se usarán marcas
apropiadas (por ejemplo, marcas de spin, etc). Usando estas
técnicas, se marcan diferencialmente las células cancerosas.
Otros procedimientos in vivo pueden
detectar polipéptidos de PCAV funcionalmente. Por ejemplo, una
construcción que comprende un LTR de PCAV operativamente unido a un
gen indicador (por ejemplo, una proteína fluorescente tal
como GFP) se expresará en paralelo con los polipéptidos naturales de
PCAV.
Para aumentar la sensibilidad de los
inmunoensayos, es posible usar un segundo anticuerpo para unirse con
el anticuerpo dirigido contra PCAV, transportando el segundo
anticuerpo una marca.
\vskip1.000000\baselineskip
La invención proporciona un procedimiento para
diagnosticar el cáncer de próstata. Se apreciará que
"diagnosis" de acuerdo con la invención, puede variar desde
una diagnosis clínica definitiva de la enfermedad hasta una
indicación de que el paciente debe experimentar un ensayo adicional
que puede conducir a una diagnosis definitiva. Por ejemplo, se
puede usar el procedimiento de la invención como parte de un proceso
de cribado, sometiendo a las muestras positivas a un análisis
adicional.
Además, la diagnosis incluye la vigilancia del
progreso del cáncer en un paciente ya conocido que tiene el cáncer.
También se puede tipificar el cáncer mediante los procedimientos de
la invención. Preferiblemente, el cáncer es cáncer de próstata.
Se puede vigilar también la eficacia de un
régimen de tratamiento (teramétrica) de un cáncer asociado mediante
el procedimiento de la invención, por ejemplo, para
determinar su eficacia.
Se puede detectar también la susceptibilidad a
un cáncer, por ejemplo, cuando se ha producido el aumento de
la expresión, pero antes de que se haya desarrollado el cáncer.
Están abarcados también los procedimientos de pronóstico.
Todas estas técnicas quedan comprendidas dentro
del significado general de "diagnosis" en la presente
invención.
\vskip1.000000\baselineskip
El término "que comprende" significa "que
incluye" así como "que está constituido", por
ejemplo, una composición "que comprende" X puede estar
constituida exclusivamente por X o puede incluir algo adicional,
por ejemplo, X + Y.
El término "aproximadamente" en relación
con un valor numérico x significa, x \pm 10%.
Los términos "células neoplásicas",
"neoplasia", "tumor", "células tumorales",
"cáncer" y células cancerosas (usados de manera
intercambiable) se refieren a las células que presentan crecimiento
relativamente autónomo, de tal manera que presentan un fenotipo con
crecimiento aberrante caracterizado por una pérdida significativa
de control de la proliferación celular (es decir, división
celular desregulada). Las células neoplásicas pueden ser malignas o
benignas e incluyen el tejido derivado de cáncer de próstata.
La palabra "sustancialmente" no excluye
"completamente", por ejemplo, una composición que está
"sustancialmente libre" de Y puede estar completamente libre
de Y. cuando sea necesario, la palabra "sustancialmente" puede
omitirse de la definición de la invención.
\vskip1.000000\baselineskip
La Figura 1 es un árbol filogenético que muestra
la relación entre diversos LTR retrovíricos endógenos. Los LTR de
RVEH-K "antiguos" y "nuevos" están
resaltados.
La Figura 2 ilustra la disposición del genoma de
PCAV en su extremo 5'.
La Figura 3 ilustra la disposición del genoma de
PCAV en su extremo 3'.
La Figura 4 muestra los episodios de corte y
empalme que tienen lugar en un RVEH-K de la técnica
anterior ("HTDV" {45}) para producir las proteínas env y
cORF.
La Figura 5 ilustra los episodios de corte y
empalme en los LTR 5' de PCAV.
La Figura 6 ilustra cómo los episodios de corte
y empalme en los LTR 5' en tándem de PCAV (Figura 6B) se puede
distinguir de aquellos en otros RVEH-K (Figura
6A).
La Figura 7 ilustra cómo se pueden usar los
cebadores para detectar específicamente el ARNm de PCAV.
La Figura 8 ilustra como se pueden utilizar las
inserciones en el extremo 3' de PCAV para distinguir éste de otros
RVEH-K.
La Figura 9 mapea la localización de las
características positivas de la matriz en el genoma de PCAV.
La Figura 10 muestra los resultados del análisis
de la RT-PCR del episodio de corte y empalme del
exón 1-2 en diversos tejidos. Las bandas son: (1)
marcadores; (2) placenta; (3) y (4) cerebro; (5) testículo, (6)
próstata, (7) mama; (8) útero; (9) tiroides; (10) cérvix; y (11)
pulmón.
La Figura 11 muestra los resultados del análisis
de la RT-PCR del episodio de corte y empalme del
exón en las líneas celulares. Las bandas son: (1) y (12) marcadores;
(2) Teral, (3) colo360; (4) PC3; (5) DU145; (6) 22RV1; (7) PCA 2B;
(8) LNCaP; (9) RWPE1; (10) RWPE2; y (11) PrEC.
La Figura 12 muestra los resultados de
fluorescencia obtenido usando un anticuerpo monoclonal 5G2 contra:
(12B) células MDA PCA 2b; (12C) células PC3; y (12D) células NIH3T3.
La Figura 12A muestra células MDA PCA 2b sin el anticuerpo 5G2.
Las Figuras 13 y 14 muestran la tinción de
muestras de tumor de próstata con (A) tinción de hematoxilina y
eosina, (B) anti-IgG de ratón fluoresceína más 5G2
de mAb, o (C) anti IgG de ratón fluoresceína únicamente.
La Figura 15 muestra la expresión de las
proteínas gag de RVEH-K en levaduras, siendo 15A un
gel de proteína teñida y siendo 15B una transferencia western.
La Figura 16 muestra las transferencias western
de las proteínas gag usando ocho anticuerpos monoclonales.
La Figura 17 es un diagrama esquemático no a
escala de algunas SEC ID mapeadas contra el genoma.
La Figura 18 muestra el análisis de micromatriz
de la expresión de PCAV en las muestras del paciente. En la porción
expandida en la derecha, los encabezamientos indican los grados de
Gleason de las muestras. El rojo identifica las secuencias
aumentadas en el cáncer, el verde identifica aquellas deprimidas en
el cáncer, y el negro denota los lugares no cambiados. Las
secuencias individuales se disponen verticalmente y los pacientes se
presentan horizontalmente. El panel en la izquierda muestra todas
las 6000 secuencias ensayadas con el ARN procedente de 103
pacientes, y la región que muestra un aumento casi uniforme está
expandida en la derecha.
La Figura 19 muestra la localización subcelular
de PCAP3 usando la inmunotinción.
\newpage
La Figura 20 muestra la tinción PIN usando la
inmunofluorescencia contra gag. Se usó una sección congelada
recientemente de tejido PIN, y un patólogo certificado llevó a cabo
la evaluación de PIN en una sección en serie teñida con hematoxilina
y eosina.
La Figura 21 muestra TUNEL para las células
transfectadas con adenovirus que codifica PCAP3 a moi 100 (parte
superior de la izquierda), 50 (parte superior de la derecha), 25
(parte inferior de la izquierda), o un control no transfectado
(parte inferior de la derecha).
La Figura 22 muestra el resultado de un ensayo
de división celular usando un marcado de
bromo-desoxiuridina.
La Figura 23 muestra el corte y empalme en el
interior del genoma de PCAV, particularmente para env, cORF y
PCAP3.
La Figura 24 muestra el vector de adenovirus
usado en un ensayo de expresión para ensayar la actividad de LTR, y
la Figura 25 muestra los resultados de la expresión de GFP impulsada
desde este vector.
La Figura 26 muestra el vector usado para
ensayar la capacidad de PCAP3 para activar el LTCR de PCAV.
La Figura 27 muestra los experimentos de
inmunofluorescencia usando un anticuerpo monoclonal 5G2 dirigido
contra gag para teñir las secciones de tejido tomadas de un paciente
con cáncer de próstata. La Figura 27A muestra una glándula
prostética normal, 27B muestra tejido atrofiado, 27C muestra un
cáncer de grado 3 de Gleason, y 27D muestra un cáncer de grado 4 de
Gleason.
La Figura 28 muestra la posición de los
cebadores específicos de PCAV (cf. Región 5' de la Figura 2), y la
Figura 29 muestra los resultados de la PCR usando estos cebadores.
"R" es tejido de próstata y "B" es tejido de mama. La
Figura 30 muestra los resultados de la RT-PCR usando
los cebadores. Se usó tejido de próstata normal ("N") o
canceroso ("C") emparejados, y se proporciona la relación de la
señal por encima de cada pareja.
La Figura 31 muestra los resultados de la PCR
cuantitativa de diversos tejidos. El eje y muestra los niveles de
PCAV normalizados respecto HPRT. Los tejidos son, de izquierda a
derecha: placenta, cerebro fetal, corazón fetal, cerebro, corazón,
hígado, páncreas, estómago, intestino delgado, colon, recto,
testículo, próstata (de un hombre de 47 años), ovario, adrenal,
tiroides, riñón, vejiga, mama, útero, cérvix, músculo esquelético,
pulmón, bazo, timo, piel.
La Figura 32 muestra el aumento relacionado con
la edad en la expresión del ARNm de PCAV en tejido de próstata.
La Figura 33 muestra los resultados de un ensayo
de escaneo de la RT-PCR usado para mapear el extremo
5' de los ARNm de PCAV.
La Figura 34 proporciona detalles de un ensayo
de protección de la RNasa. Se usaron dos sondas de sentido contrario
- una sonda larga (24B) y una sonda corta (24C). Ambas sondas
protegieron la región que se muestra en 24A. En 24B, se muestra la
posición esperada de la banda esperada basada en el extremo 5'
"usual" basado en la posición de la señal TATA, más la banda
real conseguida. Las tres bandas en 24B son: (1) Teral; (2) sin ARN;
(3) sonda, sin RNasa. Las dos bandas en 24C son: (1) Tera 1; (2)
sonda, sin RNasa.
\vskip1.000000\baselineskip
Se describen con mayor detalle algunos aspectos
de la presente invención en los ejemplos no limitantes que siguen.
Se presentan los ejemplos de tal manera que proporcionen a las
personas normalmente expertas en la técnica una memoria descriptiva
y descripción de cómo preparar y usar la presente invención, y no se
pretende que limiten el alcance de lo que los inventores consideran
como su invención, ni estos pretenden representar que los
experimentos siguientes son todos y únicamente los experimentos
llevados a cabo. Se han hecho esfuerzos para asegurar la precisión
con respecto a los números usados (por ejemplo, cantidades,
temperatura, etc.), pero deben tenerse en cuenta algunos errores y
desviaciones experimentales. A no ser que se indique otra cosa, las
partes son partes en peso, peso molecular es peso molecular promedio
en peso, la temperatura está en grados Celsius, y la presión está a
o próxima a la
atmosférica.
atmosférica.
\vskip1.000000\baselineskip
Se obtuvieron ácidos nucleicos candidatos que
pueden representar genes expresados diferencialmente en el cáncer a
partir de fuentes públicamente disponibles y de bibliotecas de ADNc
generadas a partir de líneas celulares seleccionadas y tejidos de
pacientes. Se preparó una biblioteca normalizada de ADNc a partir de
un tejido tumoral del paciente y se aislaron los ácidos nucleicos
clonados para imprimir en micromatrices a partir de una biblioteca.
Se procesaron tejidos normales y tumorales de 100 pacientes para
generar ácidos nucleicos transcritos con ARN polimerasa T7, que a su
vez, se evaluaron para la expresión en las micromatrices.
\newpage
Normalización: El objetivo de la
normalización es generar una biblioteca de ADN en la que todos los
transcritos expresados en un tipo de célula o tejido concreto están
igualmente representados {refs. 160 y 161}, y por tanto, el
aislamiento de tan poco como 30.000 clones recombinantes en una
biblioteca óptimamente normalizada puede representar el repertorio
completo de expresión génica de una célula, estimado en un número de
10.000 por célula. Los materiales de la fuente para generar las
bibliotecas normalizadas de próstata se crioconservaron a partir de
tejido de tumor de próstata procedente de un paciente con
adenocarcinoma de grado 3+3 de Gleason y biopsias normales de
próstata a partir de una mezcla de sujetos en riesgo bajo vigilancia
médica. Se cosecharon los epitelios de próstata directamente de las
secciones congeladas de tejido por microdisección mediante captura
por láser (LCM, Arcturus Engineering Inc., Mountain View, CA), se
llevaron a cabo de acuerdo con los procedimientos bien conocidos en
la técnica (por ejemplo, ref. 162), para proporcionar muestras de
células sustancialmente homogéneas.
Se extrajo el ARN total procedente de las
células cosechadas con LCM usando el Kit Rneasy^{TM} Protect
(Qiagen, Valencia, CA), siguiendo los procedimientos recomendados
por el fabricante. Se cuantificó el ARN usando el kit de
cuantificación del ARN RiboGreen^{TM} (Molecular Probes, Inc.
Eugene, OR). Se transcribió de manera inversa un \mug de ARN
total y se amplificó la PCR usando el kit de síntesis de ADNc de la
PCR SMART^{TM} (ClonTech, Palo Alto, CA). Los productos del ADNc
se seleccionaron por tamaño mediante electroforesis en gel de
agarosa usando procedimientos normalizados (ref. 21). Se extrajo el
ADNc usando el kit Bio 101 Geneclean® (Qbiogene, Carlsbad, CA). Se
llevó a cabo la normalización del ADNc usando los principios de la
cinética de hibridación: se desnaturalizaron 1,0 \mug de ADNc
mediante calentamiento a 100ºC durante 10 minutos, a continuación
se incubaron a 42ºC durante 42 horas en presencia de NaCl 120 mM,
Tris.HCl 10 mM (pH = 8,0), EDTA.Na^{+} 5 mM y formamida al 50%.
Se purificó el ADNc de cadena única (ADNc "normalizado")
mediante cromatografía con hidroxiapatita (nº
130-0520, Biorad, Hércules, CA) siguiendo los
procedimientos recomendados por el fabricante, se amplificó y se
convirtió a ADNc de doble cadena mediante tres ciclos de
amplificación de la PCR, y se clonó en vectores plásmidos usando
procedimientos normalizados (ref. 21). El fabricante proporcionó
todos los cebadores/adaptadores usados en la normalización y el
procedimiento de clonación en el kit de síntesis del ADNc de la PCR
SMART^{TM} (Clon Tech, Palo Alto, CA). Se transfectaron células
supercompetentes (XL-2 Blue Ultracompetent Cells,
Stratagene, California) con las bibliotecas normalizadas de ADNc, se
plaquearon en placas sobre medio sólido y se hicieron crecer durante
la noche a 36ºC.
Caracterización de bibliotecas
normalizadas: se analizaron las secuencias de 10.000
recombinantes por biblioteca mediante secuenciación capilar usando
el Analizador de ADN ABI PRISM 3700 (Applied Biosystems,
California). Para determinar la representación de los transcritos
en una biblioteca, se llevó a cabo el análisis BLAST sobre las
secuencias de los clones para asignar la identidad del transcrito a
cada clon aislado, es decir, las secuencias de ácidos nucleicos
aislados se enmascararon en primer lugar para eliminar las
secuencias de complejidad baja usando el programa de
enmascaramiento XBLAST (refs. 163, 164 y 165). Generalmente, el
enmascaramiento no influencia los resultados finales de la búsqueda,
excepto para eliminar las secuencias de interés relativamente
pequeño debido a su baja complejidad y para eliminar múltiples
"éxitos" basados en la similaridad con las regiones
repetitivas comunes a las múltiples secuencias, por ejemplo, los
duplicados de Alu. A continuación se usaron las secuencias restantes
en un BLASTN frente a la búsqueda en el GenBank. Se usaron también
las secuencias como secuencia pregunta en una búsqueda en la base de
datos mediante BLASTX frente a NRP (proteínas no redundantes).
Se llevaron a cabo las reacciones automatizadas
de secuenciación usando un PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing
Ready Reaction Kit de Perkin-Elmer que contenía la
AmpliTaq ADN Polimerasa, FS, de acuerdo con las direcciones del
fabricante. Se ciclaron las reacciones en un GeneAmp PCR System 9600
conforme a las instrucciones del fabricante, excepto en que se
hibridaron a 20ºC, o 30ºC, durante un minuto. Las reacciones de
secuenciación se precipitaron con etanol, se volvieron a suspender
los residuos en 8 microlitros de tampón de carga, se introdujeron
1,5 microlitros en un gel de secuenciación, y se recogieron los
datos en un Secuenciador de ADN ABI PRISM 3700. (Applied Biosystems,
Foster city, CA).
Se determinó el número de veces que estaba
representada una secuencia en una biblioteca llevando a cabo el
análisis de identidad de la secuencia sobre secuencias de ADNc
clonado y asignando la identidad del transcrito a cada clon
aislado. En primer lugar, se comprobó cada secuencia para observar
si ésta tenía un contaminante mitocondrial, bacteriano o
ribosómico. Se excluyeron dichas secuencias del análisis posterior.
En segundo lugar, se enmascararon y/o se eliminaron de cada
secuencia los artefactos de la secuencia (por ejemplo,
vectores y elementos repetitivos).
Se compararon las secuencias restantes mediante
BLAST {166} con las bases de datos del GenBank y EST para la
identificación del gen y se compararon entre sí mediante FastA {167}
para calcular la frecuencia de aparición del ADNc en la biblioteca
normalizada de ADNc. A continuación se buscaron también las
secuencias frente a las bases de datos de nucleótidos del GenBank y
GeneSeq usando el programa BLASTN (BLASTN 1.3MP {166}). Esta base
de datos de proteínas es una combinación de las bases de datos de
proteínas Swiss-Prot, PIR y NCBI GenPept. Se hizo
avanzar el programa BLASTX usando la matriz de sustitución
BLOSUM-62 por defecto con el parámetro de filtro:
"xnu+seg". El corte de puntuación utilizado fue 75.
Se llevó a cabo el ensamblaje de los clones
solapantes en cóntigos usando el programa Sequencher (Gene Codes
Corp.; Ann Arbor, Mich.). Se analizaron los cóntigos ensamblados
usando los programas en el paquete GCG (Genetic Computer Group,
University Research Park, 575 Science Drive, Madison, Wis, 53711)
Suite Versión 10.1.
\vskip1.000000\baselineskip
Se ensayaron secuencias de ADNc que
representaban una variedad de genes candidatos para cribarse para la
expresión diferencial en cáncer de próstata mediante la hibridación
en matrices de ácido nucleico. Las secuencias de ADNc analizadas
incluyeron clones de ADNc procedentes de líneas celulares o tejidos
tal como se describe anteriormente. Las secuencias de ADNc
analizadas incluyeron también también ácidos nucleicos que
comprendían secuencias solapadas con secuencias en la base de datos
Unigene, y que codificaban una variedad de productos génicos de
diversos orígenes, funcionalidad, y niveles de caracterización. Se
imprimieron los ADNc sobre portas reflectores (Amersham) de acuerdo
con los procedimientos bien conocidos en la técnica a una densidad
de 9.216 manchas por porta que representaban 4608 secuencia
(incluyendo los controles) impresas por duplicado, con
aproximadamente 0,8 \mul de una disolución de 200 ng/\mul de
ADNc.
Se prepararon los productos de la PCR de los
clones de ADNc seleccionados que correspondían a los productos
génicos de interés en una disolución de DMSO al 50%. Estos productos
de la PCR se imprimieron sobre portas con micromatriz de aluminio
de Amersham a una densidad de 9216 clones por matriz usando u robot
de impresión Generation III de Molecular Dynamics. Se imprimieron
los clones por duplicado, dando 4608 secuencias diferentes por
matriz.
Se prepararon sondas de ADNc procedentes del ARN
total obtenido por microdisección mediante captura por láser (LCM,
Arcturus Enginering Inc., Mountain View, CA) de muestras de tejidos
tumorales y muestras de tejido normales aisladas a partir de los
pacientes descritos anteriormente.
En primer lugar, se transcribió de manera
inversa el ARN total en el ADNc usando un cebador que contenía un
promotor de la ARN polimerasa T7, seguido por la síntesis de la
segunda cadena de ADN. A continuación se transcribió el ADNc in
vitro para producir ARN de sentido contrario usando la expresión
mediada por el promotor de T7 (por ejemplo, ref. 68), y a
continuación se convirtió el ARN de sentido contrario en ADNc, Se
transcribió de nuevo in vitro el segundo conjunto de ADNc,
usando el promotor de T7, para proporcionar el ARN de sentido
contrarío. A continuación se marcó fluorescentemente este ARN de
sentido contrario, o se convirtió de nuevo el ARN en ADNc,
permitiendo una tercera ronda de amplificación mediada por T7 para
producir más ARN de sentido contrario. De esta manera, el
procedimiento proporcionó dos o tres rondas de transcripción in
vitro para producir el ARN final usado para el marcado
fluorescente. Se marcaron las sondas tomando el ADNc marcado
fluorescentemente procedente del material de partida del ARN. Los
ADNc marcados fluorescentemente preparados a partir de la muestra
de ARN tumoral se compararon con los ADNc marcados fluorescentemente
preparados a partir de la muestra de ARN de células normales. Por
ejemplo, las sondas de ADNc procedentes de células normales se
marcaron con colorante fluorescente Cy3 (verde) y las sondas de
ADNc preparadas a partir de células tumorales se marcaron con
colorante fluorescente Cy5 (rojo).
Se llevó a cabo el ensayo de expresión
diferencial mezclando cantidades iguales de sondas procedentes de
células tumorales y células normales del mismo paciente. Se
hibridaron las matrices mediante incubación durante aproximadamente
2 h a 60ºC en 5X SSC/SDS al 0,2%/EDTA 1 mM, y a continuación se
lavaron tres veces en agua y dos veces en isopropanol. Tras la
prehibridación de la matriz, a continuación se hibridó la mezcla de
la sonda en condiciones de restricción elevada (durante la noche a
42ºC en formamida al 50%, 5X SSC, y SDS al 0,2%. Tras la
hibridación, se lavó la matriz a 55ºC tres veces como sigue: 1)
primer lavado en 1X SSC/SDS al 0,2%; 2) segundo lavados en 0,1 X
SSC/SDS al 0,2% y 3) tercer lavado en 0,1 X SSC.
A continuación se escanearon las matrices para
la fluorescencia verde y roja usando un escáner/detector con láser
de doble color Generation III de Molecular Dynamics. Se procesaron
las imágenes usando el software Autogene de BioDiscovery, y se
normalizaron los datos de cada conjunto de escaneo. Se repitió el
experimento, marcando esta vez las dos sondas con el color opuesto
con e fin de llevar a cabo el ensayo en ambas "direcciones de
color". Se repitió varias veces cada experimento con dos o más
portas (uno en cada dirección de color). Se normalizaron los datos
de cada escaneo, y el nivel de fluorescencia de cada secuencia en la
matriz se expresó como la relación de la media geométrica de 8
réplicas de manchas/genes procedentes de 4 matrices o de 4 réplicas
de manchas/genes procedentes de 2 matrices o alguna otra
permutación.
Se secuenciaron las características de la matriz
que se encontró que daban señales elevadas usando tejido de tumor de
próstata y se mapearon para la secuencia del genoma humano. En la
figura 9 se muestran las características consideradas de manchas de
la matriz expanden aproximadamente el 90% del PCAV en las
localizaciones de 11 de dichas secuencias en el genoma del PCAV,
siendo los códigos números de cinco dígitos para las características
individuales de la matriz.
Aunque algunas de las 11 secuencias consideradas
proceden de regiones en el genoma que están muy conservadas entre la
familia HML2.0 de RVEH-K, y aunque de esta manera no
serán específicas del virus en la megabase 20.428 del cromosoma 22,
otras manchas no lo son.
\newpage
27378 (SEC ID 14) está presente con elevados
niveles en tumores de próstata. Se alinea en dos regiones separadas
de la secuencia del ADN genómico en el cromosoma 22 (nucleótidos
977-1075 y 2700-2777 de la SEC ID
1):
\vskip1.000000\baselineskip
Dentro de la SEC ID 1, los nucleótidos
1076-1077 son GT y los nucleótidos
2698-2699 son AG, siendo éstas las secuencias
donante y aceptora de corte y empalme consenso, respectivamente. La
hibridación con 27378 verifica de esta manera el corte y empalme en
el que el primer LTR 5' se une al emplazamiento aceptor de corte y
empalme próximo al segundo LTR 5' (uniones del nucleótido 1075 de la
SEC ID 1 con el nucleótido 2700). Puesto que las secuencias de los
dos exones proceden de dos virus diferentes (antiguo y nuevo), y
estos son significativamente diferentes del resto de miembros de la
familia nueva y de la familia antigua, es improbable que el producto
de 27378 se transcribiera a partir de otro RVEH-K
que no fuera PCAV.
\newpage
El lugar 34058 (SEC ID 15) está muy elevado en
el tejido del tumor de próstata. Su secuencia abarca un
emplazamiento de corte y empalme alternativo que se produce en
algunos genomas ``antiguos y que conecta la envoltura ATG de un
emplazamiento aceptor de corte y empalme próximo al LTR 3'. La
secuencia se corresponde con PCAV más estrechamente (emparejamiento
incorrecto único en 2443) que la relacionada con los
RVEH-K que se encuentra en los cromosomas 3 y 6:
\vskip1.000000\baselineskip
La señal de la secuencia 26254 en la matriz en
el tejido del tumor de próstata está elevada en comparación con el
tejido normal. La secuencia 26254 (SEC ID 16) se alinea casi
perfectamente con los cóntigos AP000345 (SEC ID 17 = nucleótidos
63683-64332 de AP000345) y AP000346 (SEC ID 18 =
nucleótidos 26271-26920 de AP000346) (nucleótidos
7065-7701 de la SEC ID 1) del cromosoma 22:
\vskip1.000000\baselineskip
Las cuatro mutaciones puntuales en relación con
la secuencia del cromosoma 22 podrían representar errores de
secuenciación (tanto para el cromosoma como para 26254) o podrían,
alternativamente, ser SNP en el interior del genoma humano.
PCAV está más estrechamente relacionado con los
RVEH-K de los cromosomas 3 y 6. La alineación de los
virus de los cromosomas 3, 6 y 22 en la región de 26254 muestra que
es improbable que 26254 se derive de los cromosomas 3 ó 6 y que se
derive más probablemente de un transcrito del PCAV del cromosoma
22:
Aunque los RVEH de los cromosomas 3, 6 y 22
están estrechamente relacionados, se pueden distinguir, por tanto,
por hibridación.
\vskip1.000000\baselineskip
La señal procedente de la secuencia 30453 en la
matriz en el tejido del tumor de próstata está elevada en
comparación con el tejido normal. La secuencia 30453 (SEC ID 113) se
alinea con el cromosoma 22:
\newpage
Se elevó la señal procedente de la secuencia
26503 en el tejido del tumor de próstata en comparación con el
tejido normal. La secuencia 26503 (SEC ID 116) se alinea con el
cromosoma 22:
\vskip1.000000\baselineskip
Los ADNc de HML2.0 de RVEH-K
clonados de bibliotecas de pacientes se alinean con el PCAV. Los
clones procedentes de las bibliotecas derivados de cuatro pacientes
se alinean con > 95% de identidad con el PCAV.
\newpage
La SEC ID 19 procede de un ADNc que está
presente con elevados niveles en los tumores de próstata. Los
primeros 463 de sus 470 nucleótidos se alinean con cuatro regiones
separadas de la secuencia del ADN genómico en el cromosoma 22
(nucleótidos 956-1075, 2700- 2777,
8166-8244 y 10424-10609 de la SEC ID
1):
\vskip1.000000\baselineskip
Las secuencias de dinucleótidos antes y después
de los "huecos" en la SEC ID 1 son como sigue:
Los "huecos" en la SEC ID 1 comienzan y
finalizan de esta manera con las secuencia donante y aceptora de
corte y empalme consenso. La presencia de la SEC ID 19 en un ADNc
verifica de esta manera el corte y empalme en el que el primer LTR
5' se une al emplazamiento aceptor de corte y empalme próximo al
extremo 3' del segundo LTR 5' (nucleótido 1075 de la SEC ID 1 unido
al nucleótido 2700), así como otros episodios de corte y empalme.
Debido a que las secuencias en los exones 1 y 2 están entre dos
virus diferentes (antiguo y nuevo) y estos son significativamente
diferentes de las familias antigua y nueva, es improbable que el
producto de la SEC ID 19 se transcribiera a partir de
RVEH-K diferente de PCAV.
La SEC ID 114 (035JN013.F03-FIS)
se alinea con la secuencia disponible del cromosoma 22:
\newpage
La SEC ID 115 (035JN0.H02-FIS)
se alinea con la secuencia disponible del cromosoma 22:
\newpage
La SEC ID 117 (035JN003.E06-FIS)
se alinea con la secuencia disponible del cromosoma 22:
\newpage
La SEC ID 118 (035JN013.C11) se alinea con la
secuencia disponible del cromosoma 22:
\newpage
La SEC ID 119 (035JN001.F06) se alinea con la
secuencia disponible del cromosoma 22:
\vskip1.000000\baselineskip
Se cortó tejido de cáncer de próstata congelado
reciente procedente de dos pacientes en secciones de 10 micrómetros,
se montó en portas de vidrio, y se tiñó con anticuerpo monoclonal
de murino 5G2. Se visualizó la tinción con un segundo anticuerpo
(anticuerpo caprino dirigido contra inmunoglobulinas de ratón). Se
encontró que la segunda tinción era específica del tejido
canceroso. Se analizaron también las muestras mediante hibridación
con 26254 y la señal fue 35-40 veces más fuerte que
en las muestras control procedentes del mismo paciente.
\vskip1.000000\baselineskip
Se analizaron los extractos de ARN procedentes
de diversos tejidos mediante la RT-PCR. En
particular, se investigó el episodio de corte y empalme entre los
exones 1 y 2 usando cebadores tal como se muestra en la figura 6.
En la figura 10, se muestran los resultados. Todas las bandas
muestran niveles de fondo de la expresión de HML2.0 de
RVEH-K (es decir, virus nuevos (líneas finas) pero
el tejido de próstata (banda 6), muestra un producto más largo
(línea gruesa), que indica la expresión de un RVEH-K
con una secuencia más larga entre el LTR 5' y el inicio de ENV. La
diferencia de longitud entre el producto largo de la banda 6 y el
producto de fondo observado en otros tejidos (-80pb) corresponde en
longitud a la longitud del exón 2 ilustrado en la figura 6B.
Se ensayaron también los extractos procedentes
de las líneas celulares (figura 11). De nuevo, fueron evidentes
niveles de fondo, de la expresión "ubicua" de
RVEH-K en la mayor parte de las líneas celulares.
Las líneas celulares de próstata MDA PCA 2b (banda 7) y, en una
menor extensión, 22RV1 (banda 6), mostraron claramente productos de
la RT-PCR más largos.
\vskip1.000000\baselineskip
Se extrajo el ARN de las líneas celulares MDA
PCA 2b. Los ARNm cortados y empalmados se clonaron y se
secuenciaron, lo que confirma que se usaron los emplazamientos
aceptores de corte y empalme próximos al extremo 3' del segundo LTR
5', Estos ARNm tienen cuatro exones con secuencias que corresponden
exactamente a PCAV. Tienen exones adyacentes a los LTR 1 y 2
seguidos por un exón que contiene la envoltura ATG y un marco de
lectura abierto muy corto y que termina finalmente en el LTR 3'
final fragmentario.
Se observó también el uso de un emplazamiento
aceptor de corte y empalme próximo al extremo 3' del segundo LTR 5'
en un ADNc presente en una biblioteca privada de cáncer de próstata
(ID del clon de Chiron 035JN024.B09).
Se mapeo el extremo 3' del ARN de MDA PCA 2b
mediante RACE. El cebador directo de la PCR era la SEC ID 21, que
corresponde a PCAV y a los RVEH-K nuevos. El cebador
inverso de la PCR era la SEC ID 22. El cebador de la transcripción
inversa era la SEC ID 20. Usar las dianas de ARNm procedentes de MDA
PCA 2b proporciona una banda mayor en 1,3 kb. Se clonaron y
secuenciaron las bandas (usando cualquiera de los cebadores de
secuenciación T7 o SP6) y se muestra a continuación una
alineación:
\vskip1.000000\baselineskip
La secuenciación de estos productos de la
amplificación, muestra que los transcritos terminan usando una señal
poliA en el interior de una inserción MER11a = (véase la hilera que
comienza con el nucleótido 961). De nuevo, este es un emparejamiento
perfecto para PCAV.
\vskip1.000000\baselineskip
PCAV es un RVEH-K
"antiguo". Se puede detectar también la expresión de nivel bajo
de los RVEH-K "nuevos". Los marcos de lectura
abiertos de PCAV y los nuevos RVEH-K son homólogos a
nivel de la secuencia primaria, pero con divergencia significativa.
Se expresó la proteína gag en levadura y se purificó para PCAV y el
RVEH-K "nuevo", y se aumentaron los anticuerpos
monoclonales de ratón.
Se construyeron estas secuencias mediante
ingeniería genética para la expresión en la cepa AD3 de
Saccharomyces cerevisiae, usando el vector de expresión de
levadura pBS24.1. Este vector contiene la secuencia 2 \mu para la
replicación autónoma en levadura y los genes de levadura Ieu2d y
URA3 como marcadores seleccionabas. Están también presentes en este
vector de expresión el gen de la \beta-lactamasa y
el origen de replicación ColE1, requeridos para la replicación
plásmida en bacterias, así como el terminador del
factor-a. La expresión de las proteínas
recombinantes está bajo el control del promotor híbrido
ADH2/GAPDH.
Se clonaron las secuencias de codificación del
RVEH-K "nuevo" y la de gag de PCAV como
fragmentos HindIII-SalI de 2012pb y 2168 pb,
respectivamente. Cada gag se subclonó en dos partes:
- 1.
- Se subclonó la gag del RVEH-K nuevo en pSP72. Un oligonucleótido sintético de 143 pb procedente del emplazamiento HindIII adjunto al promotor ADH/GAPDH en un emplazamiento NcoI en el interior de la secuencia de codificación de gag. Los 1868 pb restantes de la secuencia de gag del RVEH-K "nuevo", procedentes de NcoI y SalI, se derivaron mediante la PCR usando un clon de ADNc obtenido de células LnCaP denominadas orf-99 como plantilla.
- 2.
- Se usó la PCR para crear un fragmento HindIII-Ava3 de gag de PCAV de 1715 pb, usando un clon de ADNc obtenido de células MDA PCa 2b denominadas 2B11.12-4 como plantilla. Se subclonó el producto de la PCR resultante en pGEM7-Z. Se aisló el fragmento Ava3-SalI que codifica el extremo 3' de esta construcción a partir del clon de gag del RVEH-K "nuevo" anterior, debido a que el extremo 3' de la proteína gag desapareció en el clon 2B 11.12-44.
\vskip1.000000\baselineskip
Tras la confirmación de (a secuencia se ligaron
los respectivos fragmentos con el promotor ADH2/GAPDH en el vector
de expresión de levadura para crear los plásmidos de expresión de
levadura pd.LnCap.gag (que codifican gag del RVEH-K
"nuevo") y pd.MDA.gag (que codifica el híbrido PCAV/gag del
RVEH-K "nuevo").
La construcción de expresión "nueva" es la
SEC ID 1185 y codifica la SEC ID 1186:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
La construcción híbrida es la SEC ID 1187 y
codifica la SEC ID 1188:
\vskip1.000000\baselineskip
A continuación se muestra una alineación de las
proteínas codificadas:
Se transformó la cepa AD3 de S.
cerevisiae (mata, leu2, trp1, ura3-52,
prb-1122, pep4-3,
prcl-407, cirº, trp+: DM15[GAP/ADR]) y se
comprobaron los transformantes únicos para la expresión tras el
agotamiento de la glucosa en el medio. Se expresaron las proteínas
recombinantes a nivel elevado en levadura, tal como se detectó en
los extractos totales de levadura mediante la tinción de azul de
Coomasie (Figura 15A). Se observaron fácilmente las proteínas
expresadas en un extracto total de levadura (flechas), con la gag
"nueva" en las bandas 5 y 6 y la gag híbrida en las bandas 3 y
4. En la banda 2 se muestran las células control no
transformadas.
Tras una fermentación a gran escala, se
purificaron las proteínas y se usaron para la producción de
anticuerpos monoclonales. Se obtuvieron 8 mAb en grandes cantidades
y se ensayaron para su capacidad para reconocer ambas proteínas gag
en transferencias Western (Figura 16). De los 8 mAb, 7 reconocen
ambas proteínas recombinantes y uno (5A5/D4) reconoce sólo la
proteína gag híbrida de PCAV/RVEH-K. el anticuerpo
5G2 reacciona en cruzado con ambos antígenos de gag, antiguo y
nuevo.
Se usó el mAb 6F8/F1 en una transferencia
Western (Figura 15B) de un gen que contenía los extractos de
levadura en el mismo orden y en la Figura 15A. para reducir la
intensidad de la señal, las muestras que contenían las proteínas
recombinantes gag se diluyeron 50 veces en relación con las muestras
que se muestran en la Figura 15A usando el extracto de levadura que
no contenía la proteína recombinante.
El anticuerpo 5G2 se une a las células MDA PCA
2b (figura 12B). Las células no fluorescente en ausencia del
anticuerpo (figura 12A). La línea celular de próstata PC3 fue
también reactiva (figura 12C), pero menos que MDA PCA 2b. Una línea
celular de fibroblastos transformados (NIH3T3) no fue reactiva con
el anticuerpo de gag dirigido contra RVEH-K (figura
12D).
La estructura del ARNm de gag que se encuentra
en las células MDA PCA 2b comienza en el primer LTR 5' y corta y
empalma el segundo LTR 5'. Dicha disposición es necesaria con el fin
de que el ARN sea traduccionalmente competente debido a que el
segundo LTR 5' contiene muchos codones de detención que, en el ARNm
sin cortar y empalmar, evitaría la traducción de gag.
\vskip1.000000\baselineskip
Se proporciona la secuencia de PCAV procedente
del cromosoma 22 como SEC ID 1. Esta secuencia se extiende desde el
inicio del primer LTR 5' en el genoma del extremo del fragmento
final del LTR 3'. Tiene en total 12366 pb.
En el interior de la SEC ID 1, el primer LTR 5'
(nuevo) está formado por los nucleótidos 1-968. Se
continúa éste por la secuencia de RVEH-K hasta el
nucleótido 1126. Los nucleótidos 1127-1678 son no
víricos, incluyendo los duplicados TG en 1464-1487.
El segundo LTR 5' \deltaantiguo) está entre los nucleótidos
1679-2688. El LTR 3' está fragmentado como los
nucleótidos 10520-10838 y
11929-12366. La inserción MER11a es en los
nucleótidos 10839-11834, que es una señal poliA
localizada entre 11654-11659. El emplazamiento de
adición de poliA está localizado entre 11736 y 11739, pero no es
posible decir precisamente cuando, debido a que estos cuatro
nucleótidos son ya As.
Las regiones básicas de codificación en el
interior de la SEC ID 1 son:
Los emplazamientos donantes de corte y empalme
(5'SS) está localizados en los nucleótidos 999-1004,
1076-1081, 2778-2783,
8243-8249, 8372-8378,
8429-8436, 8634-8641,
8701-8708 y 8753-8760. Los
emplazamientos aceptores de corte y empalme (3'SS) están
localizados en los nucleótido 2593-2611,
2680-2699, 8112-8131,
8143-8165 y 10408-10423.
Tras la primera región transcrita, existen tres
exones principales en la dirección 3' localizados en los nucleótidos
2700-2777, 8166-8244 y
10424-11739.
El gen gag (nucleótidos
2813-4960 de la SEC ID 1; SEC ID 57) codifica un
polipéptido de 715 aa (SEC ID 54).
El gen de la proteasa (nucleótidos
4762-5688 de la SEC ID 1; SEC ID 58) está
interrumpido por tres codones de detención:
Las cuatro secuencias ele aminoácidos entre los
codones de detención son las SEC ID 59 a 62.
El gen pol (SEC ID 86) está también
interrumpido. La alineación con las secuencias pol conocidas desvela
diversos fragmentos de las secuencias de aminoácidos (SEC ID 92 a
97):
El gen env (nucleótidos
9165-9816 de la SEC ID 1; SEC ID 63) está
interrumpido por los codones de detención. La secuencia
ininterrumpida más larga codifica la secuencia de aminoácidos de la
SEC ID 64. El marco de lectura +1 de Ja SEC ID 63 contiene diversas
secuencias cortas de aminoácido (SEC ID 65 a 80) entre los codones
de detención:
Los nucleótidos 8916-9155 de la
SEC ID 1 (SEC ID 81) están también interrumpidos para dar diversas
secuencias cortas de aminoácidos (SEC ID 82 a 85):
\vskip1.000000\baselineskip
Un producto de polipéptido denominado
"morf" o "PCAP3" (SEC ID 87). La secuencia gag
"novedosa" HERV-K usada para la expresión fue
aislada de la linea celular de cáncer de próstata LnCap y la
secuencia PCAV fue aislada de la linea celular de cáncer de próstata
MAD PCA 2b.
Es aproximadamente equivalente al producto
"cORF" anteriormente observado para los
RVEH-K.
\vskip1.000000\baselineskip
Se proporcionan a continuación detalles
adicionales acerca de PCAP3.
\vskip1.000000\baselineskip
Gag de PCAV contiene una secuencia de 48
nucleótidos (SEC ID 53) que no se encuentra en los
RVEH-K estrechamente relacionados en los cromosomas
3, 6 y 16. Los 48mer codifican la SEC ID 110 de 16 mer, que no se
encuentra en los RVEH-K nuevos o en otros antiguos.
Los 5 de arriba en el análisis BLAST de un 99mer (3614 a 3712 de la
SEC ID 1) comprenden la SEC ID 53 que se muestra:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Secuencia pasa a página
siguiente)
A continuación se muestra una alineación de los
términos N de diversos RVEH-K:
\vskip1.000000\baselineskip
Dos regiones son particularmente útiles para
generar reactivos de detección específicos de PCAV. La primera está
entre los aminoácidos 203 a 225 en la alineación (SEC ID 55,
codificada por la SEC ID 111). Aunque esta región está presente en
otros dos RVEH-K en el cromosoma 6, aquellos dos
virus están en el grupo de RVEH-K antiguo. Se
observa la expresión de fondo ("ubicua") de los
RVEH-K nuevos en muchos tejidos (por ejemplo,
Figura 10), pero no de los RVEH-K antiguos. La
detección de la SEC ID 55 distingue por tanto sobre la expresión de
fondo de los RVEH-K antiguos y se puede usar para
detectar la expresión de PCAV.
La segunda región se encuentra entre los
aminoácidos 284-300 (SEC ID 56, codificada por la
SEC ID 112), ya que esta secuencia es única para PCAV. La SEC ID 110
(SEC ID 53) es un fragmento de truncamiento del aminoácido único de
la SEC ID 56.
El análisis TBLASTN de la SEC ID 110 frente a la
secuencia del genoma humano desvela un 100% de emparejamiento en los
clones KB208E9 y KB1572G7 en el cromosoma 22q11.2 pero en ningún
otro sitio. El análisis BLASTP fracasa en identificar cualquier
emparejamiento.
El análisis BLASTN de la SEC ID 53 frente a la
secuencia del genoma humano desvela un 100% de emparejamiento en los
nucleótidos 3180761 a 3180808 de la secuencia borrador de trabajo
del cromosoma 22 de Homo sapiens, y no hay hallazgos
adicionales.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se construyeron las SEC ID 99 a 109 sobre la
base de los emplazamientos donantes y aceptores de corte y empalme.
La SEC ID 109 comienza en el segundo LTR 5'.
Las SEC ID 99 a 108 se alinean con la SEC ID 10
como sigue:
\vskip1.000000\baselineskip
Por homología con otros retrovirus, el extremo
5' del ARNm de PCAV (es decir, el emplazamiento de inicio de
la transcripción en el interior del genoma de PCAV) debería perder
30 bases en la dirección 3' de la secuencia TATA regular, en el
nucleótido 559 en la SEC ID 1.
Sin embargo, el trabajo empírico sugiere que el
extremo 5' del ARNm de PCAV está adicionalmente en la dirección
3'.
La Figura 33 muestra los resultados de un ensayo
de escaneo de la RT-PCR usado para mapear el extremo
5'. Se preparó el LTR 5' del ADNc cebando el ARN total de Teral con
un oligonucleótido de sentido contrario que se extiende desde 997 a
972 en el genoma provírico (SEC ID 1202). A continuación se dividió
este ADNc y se hizo avanzar en el análisis de la PCR con un cebador
de sentido contrario desde 968 a 950 (SEC ID 1203) combinado con un
cebador de sentido directo procedente de un conjunto de cebadores
diseñado para cubrir los probables extremos 5'. 1) 571 < SEC ID
1204>, 2) 600 < SEC ID 1205>, 3) 626 < SEC ID 1206>,
4) 660 < SEC ID 1207>, 5) 712 < SEC ID 1208>. Se usaron
reacciones de la PCR por duplicado en 1 \mug de ADN de HeLa
genómico como control positivo, y estas reacciones mostraron que
eran efectivas todas las parejas de cebadores. Las reacciones
cebadas con ADNc mostraron una marcada diferencia entre los
cebadores 600 y 626 sugiriendo que el extremo 5' está próximo a la
posición 626 en el genoma provírico.
Se confirmó este resultado usando ensayos de
protección de la RNasa (Figura 34). Las sondas de ARN antisentido
marcadas que cubrían las bases (34B) 509-735 y (34C)
600-735 en el genoma provírico se hibridaron con el
ARN total procedente de las células Teral y se digirieron con RNasa
en condiciones estándar. Tras el procesamiento y la detección
mediante PAGE conteniendo urea, ambas sondas dieron 100 productos de
base. Estos dos resultados están de acuerdo y muestran que el
extremo 5' del ARN de RVEH-K está alrededor de la
base 635 en el genoma provírico, es decir, alrededor de 100 pb en
la dirección 3' de la señal TATA, más bien que los 30 pb que son
usuales para los genes dependientes de TATA.
\vskip1.000000\baselineskip
En el interior del exón final en la región env
de PCAV, los marcos de lectura 1 y 2 codifican env y cORF,
respectivamente (figura 23). La SEC ID 87 es PCAP3, que comparte la
misma región 5' y el codón de inicio como env, pero en el
que un episodio de corte y empalme elimina las secuencias que
codifican env y los cambios en un marco de lectura +2 en relación
con el de env (SEC ID 88 y 1191):
La mayoría de la secuencia de codificación se
localiza de esta manera después del corte y empalme, en el interior
del exón que contiene el LTR 3'. Aunque el marco de lectura +2 no
tiene función conocida en el RVEH-K, el ADNc
preparado a partir de la línea celular MDA Pca-2b de
cáncer de próstata incluyó estos transcritos, como lo hace el ARNm
de cáncer de próstata. Por ejemplo, el lugar 34058 (véase
anteriormente) codifica PCAP3 y estaba regulado con aumento más de
2 veces en el 79% de las muestras de pacientes y más de 5 veces en
el 53%. Estas figuras apoyan la vista de que PCAP3 está implicado
en muchos cánceres de próstata. Además, las figuras no reflejan la
relación completa entre la expresión del cáncer y la de PCAP3 - si
los pacientes se agrupan de acuerdo con los grados de Gleason,
tumores de grado 3 muestran una elevada regulación con aumento de
PCAP3 mientras que tumores más desarrollados de grado 4 parecen
mostrar supresión de PCAP3. La Figura 18 muestra el análisis de
micromatriz del cáncer de próstata que emplea 6000 EST aleatorios
procedentes de una biblioteca de próstata normalizada. Se
compararon los niveles de ARN preparado a partir de un tumor
microdiseccionado capturado con láser con el ARN de tejido normal
de un peritumor. Las secuencias etiquetadas con asteriscos en la
Figura 18 están reguladas con aumento y son todas de un
emplazamiento único de 12 kb en el cromosoma 22. Estas secuencias
expanden todas las porciones de PCAV. La expresión relativa de PCAV
es muy alta en tumores de grado 3, teniendo muchos de los pacientes
relaciones tumor/normal en el intervalo de 10 a 50 veces. En el
Grado 4 de Gleason y por encima, sin embargo, las relaciones vuelven
a 1 y en algunos casos, la expresión del virus está suprimida. Se
observa un modelo similar con la expresión de gag (Figura
27), sugiriendo que la expresión de PCAV está implicada en las
etapas tempranas del cáncer de próstata.
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Introducen un cambio de marco y un "virus
antiguo" en el emplazamiento de corte y empalme 5' (aceptor de
corte y empalme), permitiendo por tanto el episodio de corte y
empalme específico de PCAP3. La inspección de diversos genomas de
RVEH-K alineados proporciona evidencia adicional de
que PCAP3 es una forma mutada de una proteína original. Es de esta
manera improbable que la proteína funcione con su capacidad
original, y la actividad oncogénica podría surgir a través de la
retención de una región funcional. El exón de codificación común
para env, cORF y PCAP3 contiene una región de unión a ARN que
funciona también como una señal de localización nuclear (SLN).
Para estudiar la localización subcelular de
PCAP3, con el fin de comprender mejor su papel, se usó un adenovirus
que expresaba PCAP3 con una etiqueta V5 C terminal (SEC ID 1189)
para infectar células primarias epiteliales de próstata. La
proteína era relativamente estable y se marcó en el nucleoptasma
mediante anti-V5 (Figura 19). La concentración de
esta pequeña proteína en esta localización celular muestra que ésta
interactúa específicamente con algo en el interior del núcleo.
Se diseñó también un ensayo de expresión
funcional. El primer componente del ensayo es un vector de
adenovirus con un LTR de PCAV (SEC ID 1190) que impulsa la
expresión de GFP (Figura 24). Se infectaron una variedad de líneas
celulares humanas con este virus y se midió la fluorescencia tanto
mediante microscopio fluorescente como mediante FACS. Como control
positivo, se usó un vector en el que se impulsó la expresión de GFP
mediante un promotor EF-a, que debería ser activo en
todas las células eucariotas.
La expresión de GFP fue mínima en células
cancerosas de ovario, colon e hígado. Fue también mínima en células
293, una línea celular de riñón inmortalizada, y en células
primarias de epitelio de próstata. Se detectó fácilmente GFP en
diversas líneas celulares de cáncer de próstata (PC3, LNCaP, MDA2B
PCA, DU145). En la figura 25 se muestran los datos representativos.
El modelo de expresión corresponde exactamente a los resultados
genómicos de las muestras del paciente. Estos datos indican que la
expresión impulsada desde un LTR del ARNm de PCAV es un marcador del
cáncer de próstata.
Ya que la expresión de GFP procedente del LTR
pareció ser silenciosa en células primarias de próstata, pero
activa en tejido de cáncer de próstata, se ensayó PCAP3 para su
capacidad para activar la expresión en células primarias de
próstata. Se insertó la secuencia de codificación en un casete de
expresión y se incorporó en un vector de adenovirus (Figura 26). Se
infectó simultáneamente el vector con el vector de GFP en células
primarias epiteliales de próstata, y PCAP3 activó débilmente la
expresión de GFP.
En un experimento separado, PrEC de paso elevado
(acercándose a la senescencia) se infectaron simultáneamente con un
vector de adenovirus que expresaba GFP procedente de un LTR de
RVEH-K de tipo antiguo ('MDALTR': SEC ID 1196, y un
segundo vector que expresaba PCPA3 en moi de aproximadamente 20.
Tras 3 días, se midió la intensidad fluorescente mediante FAC y se
observó la activación por PCAP3. En un experimento similar con
LTR60, sin embargo, no hubo activación.
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Se cree que el cáncer de próstata surge en la
capa epitelial luminal, pero las células epiteliales luminales
normales son capaces de muy pocas divisiones celulares. En
contraste, las células NIH3T3 y RWPE1 (véase las Figuras 11 y 12)
son inmortales. Debido a que PCAV parece estar implicado en las
etapas tempranas del cáncer, se ensayaron los efectos de PCAP3 en
las células primarias epiteliales de próstata (PrEC), que
normalmente senescen rápidamente.
Las células primarias epiteliales humanas tienen
un potencial de división muy limitado. Tras un cierto número de
divisiones, las células entrarán en la senescencia. La senescencia
es distinta de la quiescencia (las células inmortales o
presenescentes entran en quiescencia cuando se retira una señal
positiva de crecimiento, o cuando se recibe una señal inhibidora
tal como un contacto célula-célula, pero se puede
inducir a que se dividan de nuevo añadiendo factores de crecimiento
o volviendo a plaquear las células a inferior densidad) y es un
obstáculo permanente en la división, aunque las células senescentes
pueden vivir muchos meses sin dividirse si se renueva regularmente
el medio de crecimiento
Algunos genes, particularmente los oncogenes
víricos (por ejemplo, antígeno T de SV40) fuerzan a las células a
ignorar las señales de senescencia. El antígeno T estimula a las
células a continuar la división hasta una barrera de expansión
adicional denominada "crisis replicativa". Se producen dos
procesos en la crisis, las células continúan dividiéndose, pero, en
paralelo, las células mueren a una velocidad muy alta procedente
del daño genético acumulado. Cuando la muerte celular excede a la
división, entonces, virtualmente, todas las células mueren en un
corto periodo. Las raras células que crecen después de la crisis
llegan a ser inmortales y dan como resultado líneas celulares. Las
líneas celulares normalmente tienen redisposiciones genéticas
obvias: son frecuentemente casi iguales a tetraploides, existen
frecuentes translocaciones cromosómicas no recíprocas, y muchos
cromosomas tienen delecciones y amplificaciones de múltiples loci
{169, 170, 171}.
Los productos génicos que conducen a la crisis
son particularmente interesantes debido a que los cánceres de
próstata presentan elevada inestabilidad genómica, lo que podría ser
producido por la replicación después de la senescencia. La teoría
actual mantiene que el cáncer de próstata surge de lesiones
denominadas neoplasias intraepiteliales prostáticas (NIP) {172}.
Los análisis genéticos de NIP muestran que muchas de la
redisposiciones genéticas características del cáncer de próstata
han ocurrido ya en esta etapa {173}. Se ensayaron de esta manera
células de NIP para la expresión de PCAV para determinar si el virus
podría jugar un papel en las etapas más tempranas del cáncer de
próstata. Se encontró que gag de PCAV se expresaba abundantemente
(Figura 20), indicando que la expresión de PCAV es elevada en el
momento en que se producen los cambios genéticos asociados con el
cáncer de próstata. Como se observó que PCAP3 se expresaba en el
cáncer de próstata, se investigó su papel observando si éste es
capaz de inducir la división celular en PrEC tras la
senescencia.
Los intentos iniciales para seleccionar PrEC
resistentes a fármacos tras la transfección los plásmidos de
expresión de PCAP fracasaron. El análisis de PrEC después de la
infección con vectores de adenovirus que expresaban tanto GFP como
PCAP3 desveló abundante muerte celular en el día 4 después de la
infección en las células PCAP3. Un aumento dependiente de la dosis
en la marcación del extremo de la desoxitransferasa terminal
(TUNEL), para marcar los núcleos con ADN romo, confirmó que las
células experimentaron la apoptosis (Figura 21). Esta apoptosis
puede explicar el fracaso en aislar PrEC resistentes a fármacos, y
es consistente con la implicación de la maquinaria de la división
celular por PCAP3, ya que una señal dé crecimiento desequilibrado es
un inductor de la apoptosis. Estos resultados sugirieron que la
apoptosis podría haberse bloqueado antes de que se pudiera evaluar
el efecto de la expresión de PCAP3 en las PrEC. De esta manera, se
cotransfectaron los plásmidos que codificaban PCAP3 más un marcador
de la neomicina con un plásmido de expresión que codificaba
bcl-2 (anti-apoptosis) y lacZ
(marcador). Como controles, se transfectaron las células con
plásmidos que expresaban la neomicina y cualquiera de lacZ,
ncl-2, bcl-X_{L}, o PCAP3. Tras
dos semanas de selección, todas las placas con lacZ,
bcl-2 y bcl-XL tuvieron numerosas
células resistentes que crecían hasta rellenar una fracción de la
placa. Cuando se dividieron estas células, fracasaron en dividirse
adicionalmente, pero fueron viables y semejaron células parentales
senescentes. En contraste, las células que expresaron PCAP3 y
bcl-2 dieron como resultado algunas colonias
compuestas por pequeñas células que se dividieron para rellenar la
placa inicial y continuaron hasta dividirse en el momento de la
división.
En paralelo a las anteriores selecciones de
fármacos, se evaluó el crecimiento potencial de las células. Las
PrEC parentales registraron siete multiplicaciones de población
antes de alcanzar la senescencia. En contraste, las células
resistentes a fármacos cotransfectadas con un gen antiapoptótico más
PCAP3 se expandieron bien más allá del punto de la senescencia
antes de cesar el crecimiento, registrando dieciséis
multiplicaciones. Tras crecimiento rápido durante aproximadamente
dos semanas, se retardó la expansión de las células y finalmente
cesó. Concomitantemente, aumentó el número de células fluctuantes o
muertas y cambió la apariencia de las células - no eran más largas
que la apariencia regular de "adoquín" de las células
epiteliales, pero, en vez de esto, tenían diversas morfologías, y
había muchas células multinucleadas. Las células murieron dos
semanas después, mientras que las células transfectadas con lacZ o
lazcZ+bcl-2 se mantuvieron todavía vivas un mes
más.
Ni las células senescentes ni las células que se
aproximan a la crisis se expanden en número. Una diferencia entre
ellas, sin embargo, es que las células que se aproximan a la crisis
se dividen y mueren a una velocidad apreciable, y de esta manera,
la división celular puede distinguir entre los dos estados. Tras
marcado con bromo-desoxiuridina, se marcó un 30% de
PrEC presenescentes, así como, se transfectó un 10% de PrEC con
PCAP3 + bcl2, pero no se marcaron ninguno de los controles de lacZ o
cORF + bcl-2 senescentes (Fig. 22).
Estos resultados muestran que PCAP3 es capaz de
inducir el crecimiento en células epiteliales de próstata, y que
este crecimiento podría ser una causa subyacente del cáncer de
próstata.
\vskip1.000000\baselineskip
Se ensayaron parejas de cebadores para
determinar aquellos que producían el producto de PCAV esperado en
las muestras de próstata (P) y poco o ningún producto en la muestra
de pecho (B). En la Figura 28 se muestran los cebadores en el mapa
de los LTR 5' de PCAV. Los cebadores directos fueron "914" (SEC
ID 1192) o "949" (SEC ID 1193); los cebadores inversos fueron
"2736" (SEC ID 1194) o "ADNc" (SEC ID 1195). El cebador de
ADNc expande la unión de corte y empalme. Se hizo avanzar cada
reacción durante 30 ciclos en el ADNc cebado con dT preparado a
partir del ARN total extraído tanto de células MCF7 (B) como de MDA
PCA 2b (P).
En la Figura 29 se muestran los resultados. Los
cebadores muestran claramente amplificación preferente en las
células de próstata, y el cebador que realiza un puente con la unión
de corte y empalme ("ADNc" es muy específico.
Se llevaron a cabo también experimentos de la
RT-PCR semicuantitativos. El ARN amplificado
procedente del tejido de próstata derivado de LCM de 10 pacientes
se transcribió de manera inversa usando el cebador 2736, seguido
por la amplificación de la PCR tanto con las parejas de cebadores
"914" y "ADNc" (28 ciclos), o con cebadores estándares
para la \beta-actina humana (25 ciclos). En la
Figura 30 se muestran los resultados. Se amplificaron las muestras
emparejadas de normal (N) o cáncer (C). Se muestra anteriormente la
relación de la señal en el tejido canceroso en comparación con el
tejido normal para cada pareja de productos de la PCR de PCAV.
Se ensayaron también los cebadores "914" y
"ADNc" en la PCR cuantitativa frente al ADNc cebado con dT
procedente de una variedad de tejidos. Tal como se muestra en la
Figura 31, únicamente el tejido de próstata de un paciente de 47
años de edad proporcionó una señal significativa.
Se llevó a cabo también la
RT-PCR en tejido de próstata procedente de pacientes
de diversas edades. Se compararon los niveles de expresión para gusB
(\beta-glucuronidasa). Los resultados son como
sigue:
Se ha presentado la anterior descripción de las
formas de realización preferidas de la invención por medio de
ilustración y ejemplo con objetivos de claridad y comprensión. No se
pretende que sea exhaustiva o que limite la invención a las formas
precisas que se dan a conocer. Será fácilmente aparente para las
personas normalmente expertas en la técnica a la luz de las
enseñanzas de esta invención que se pueden hacer muchos cambios y
modificaciones en la anterior sin apartarse del espíritu de la
invención quede definido por las reivindicaciones adjuntas y sus
equivalentes.
Todas las patentes, solicitudes y referencias
citadas en el presente documento se incorporan por referencia en su
totalidad.
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\newpage
(Continuación)
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(Continuación)
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(Continuación)
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{1} Solicitud de patente internacional
WO02/46477 (PCT/US01/47824. Presentada el 7 de Diciembre de
2001).
{2} Solicitud de patente de los Estados Unidos
10/016,604 (presentada el 7 de Diciembre de 2001).
{3} Reus y col. (2001) J.
Virol. 75: 8917-8926.
{4} Dunham y col. (1999)
Nature 402: 489-495.
{5} Prediger (2001) Methods Mol
Biol 160: 49-63.
{6} Bustin (2000) J. Mol.
Endocrinol. 25: 169-193.
{7} Gene Cloning and Analysis by
RT-PCR (eds. Siebert y col.) ISBN: 1881299147.
{8} RT-PCR Protocols (ed.
O'Connell) ISBN: 0896038750.
{9} The PCR Technique: RT-PCR
(ed. Siebert) ISBN: 1881299139.
{10} Thaker (1999) Methods Mol
Biol 115:379-402.
{11} Seiden y Sklar (1996)
Important Adv Oncol 191-204.
{12} Hagen-Mann y
Mann (1995) Exp Clin Endocrinol Diabetes
103:150-155.
{13} Clementi y col. (1993) PCR
Methods Appl 2:191-196.
{14} Robbins y col. (1997) Clin
Lab Sci. 10(5): 265-71.
{15} De la Taille (1999) Prog
Urol 9: 1084-1089.
{16} Ylikoski y col. (1999)
Clin Chem 45 (9): 1397-1407.
{17} Yao y col. (1996) Cáncer
Treat Res 88: 77-91.
{18} Ylikoski y col. (2001)
Biotechniques 30: 832-840.
{19} Shirahata y Pegg
(1986) J. Biol. Chem. 261(29):
13833-7.
{20} RNA Methodologies (Farrell,
1998) (Academic Press; ISBN
0-12-249695-7).
{21} Sambrook y col. (1989)
Molecular Cloning: A Laboratory Manual. NY, Cold Spring Harbor
Laboratory.
{22} Yang y col. (1999) Proc
Natl Acad Sci U S A 96(23): 13404-8.
{23} Short protocols in molecular biology (4ª
edición, 1999) Ausubel y col. eds. ISBN
0-471-32938-X.
{24} Patente de los Estados Unidos
5.707.829.
{25} Filie y col. (1997)
Biotechniques 23: 34-36.
{26} Documento
EP-B-0509612
{27} Documento
EP-B-0505012.
{28} Current Protocols in Molecular
Biology (F.M. Ausubel y col. eds., 1987) Suplemento
30.
{29} Solicitud de patente internacional
WO00/73801.
{30} Solicitud de patente internacional
WO01/51633.
{31} Solicitud de patente internacional
WO01/73032.
{32} Solicitud de patente de los Estados Unidos
20020022248.
{33} Solicitud de patente internacional
WO01/57270.
{34} Solicitud de patente internacional
WO01/75067.
{35} Solicitud de patente internacional
WO01/57182.
{36} Solicitud de patente internacional
WO01/57277.
{37} Solicitud de patente internacional
WO01/57274.
{38} Solicitud de patente internacional
WO01/57275.
{39} Solicitud de patente internacional
WO01/57276.
{40} Solicitud de patente internacional
WO01/57278.
{41} Solicitud de patente internacional
WO01/57272.
{42} Solicitud de patente internacional
WO01/42467.
{43} Solicitud de patente europea
EP-A-1074617.
{44} Mayer y col. (1999) Nat.
Genet. 21 (3), 257-258.
{45} Löwer y col. (1996) Proc.
Natl. Acad. Sci USA 93: 5177
{46} Berkhout y col. (1999) J.
Virol. 73: 2365-2375.
{47} Löwer y col. (1995) J.
Virol. 69: 141-149.
{48} Magin y col. (1999) J.
Virol. 73: 9496-9507.
{49} Magin y col..(2000)
Virology 274:11-16.
{50} Boese y col. (2001) FEBS
Lett 493 (2-3): 117-21.
{51} Mueller-Lantzsch y
col. AIDS Research and Human Retroviruses 9:
343-350 (1993).
{52} Hashidoy col. (1992)
Biochem. Biophys. Res. Comm. 187:
1241-1248.
{53} Vogetseder y col. (1995)
Exp Clin Immunogenet. 12: 96-102.
{54} Sauter y col. (1995) J.
Virol. 69: 414-421.
{55} Geysen y col. (1984) PNAS
USA 81: 3998-4002.
{56} Carter (1994) Methods Mol
Biol 36: 207-23.
{57} Jameson, BA y col. 1988,
CABIOS 4 (1): 181-186.
{58} Raddrizzani y Hammer
(2000) Brief Bioinform 1(2):
179-89.
{59} De Lalla y col. (1999) J.
Immunol. 163:1725-29.
{60} Brusic y col. (1998)
Bioinformatics 14(2): 121-30.
{61} Meister y col. (1995)
Vaccine 13(6): 581-91.
{62} Roberts y col. (1996) AIDS
Res Hum Retroviruses 12(7): 593-610.
{63} Maksyutov y Zagrebelnaya
(1993) Comput Appl Biosci 9(3):
291-7.
{64} Feller y de la Cruz
(1991) Nature 349(6311):
720-1.
{65} Hopp (1993) Peptide
Research 6:183-190.
{66} Welling y col. (1985) FEBS
Lett. 188: 215-218.
{67} Daveriport y col. (1995)
Immunogenetics 42: 392-297.
{68} Go y col. (1980) Int. J.
Peptide Protein Res. 15: 211.
{69} Querol y col. (1996) Prot.
Eng. 9: 265.
{70} Olsen y Thomsen (1991)
J. Gen. Microbiol. 137: 579.
{71} Clarke y col. (1993)
Biochemistry 32: 4322.
{72} Wakarchuk y col. (1994)
Protein Eng. 7: 1379.
{73} Toma y col. (1991)
Biochemistry 30: 97.
{74} Haezerbrouck y col. (1993)
Protein Eng. 6: 643.
{75} Masul y col. (1994) Appl.
Env. Microbiol. (1994) 60: 3579.
{76} Patente de los Estados Unidos 4.959.314
{77} Smith y Waterman
(1981) Adv. Appl. Math. 2:
482-489.
{78} Breedveld (2000)
Lancet 355(9205): 735-740.
{79} Gorman y Clark (1990)
Semin. Immunol. 2: 457-466
{80} Jones y col. (1986)
Nature 321: 522-525.
{81} Morrison y col. (1984)
Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 81:
6851-6855.
{82} Morrison y col (1988) Adv.
Immunol., 44: 65-92.
{83} Verhoeyer y col. (1988)
Science 239:1534-1536.
{84} Padlan (1991) Molec.
Immun. 28: 489-498.
{85} Padlan (1994) Molec,
Immunol. 31(3): 169-217.
{86} Kettleborough y col. (1991)
Protein Eng. 4(7): 773-83
{87} Chothia y col. (1987) J.
Mol. Biol. 196: 901-917.
{88} Kabat y col. U.S. Dept. of Health
and Human Services NIH Publication No. 91-3242
(1991).
{89} 98/24893.
{90} Documento WO 91/10741.
{91} Documento WO 96/30498.
{92} Documento WO 94/02602.
{93} Patente de los Estados Unidos
5.939.598.
{94} Documento WO 96/33735.
{95} Gennaro (2000) Remington: The
Science and Practice of Pharmacy. 20^{a} edición, ISBN:
0683306472.
{96} Documento WO 93/14778.
{97} Findeis y col. (1993)
Trends Biotechnol. 11: 202.
{98} Chiou y col. (1994) Gene
Therapeutics: Methods And Applications Of Direct Gene Transfer. ed.
Wolff.
{99} Wu y col. (1988), J. Biol.
Chem. 263: 621.
{100} Wu y col. (1994) J. Biol.
Chem. 269: 542.
{101} Zenke y col. (1998) Proc.
Natl. Acad. Sci. (USA) 87: 3655.
{102} Wu y col. (1991) J. Biol.
Chem. 266: 338.
{103} Jolly (1994) Cancer Gene
Therapy 1: 51.
{104} Kimura (1994) Human Gene
Therapy 5: 845.
{105} Connelly (1995) Human
Gene Therapy 1: 185.
{106} Kapiitt (1994) Hature
Genetics 6: 148.
{107} Documento WO 90/07936.
{108} Documento WO 94/03622.
{109} Documento WO 93/25698.
{110} Documento WO 93/25234.
{111} Patente de los Estados Unidos
5.219.740.
{112} Documento WO 93/11230.
{113} Documento WO 93/10218.
{114} Patente de los Estados Unidos
4.777.127.
{115} Patente de Gran Bretaña Nº 2.200.651.
{116} Documento EP-A- 0 345
242.
{117} Documento WO 91/02805.
{118} Documento WO 94/12649.
{119} Documento WO 93/03769.
{120} Documento WO 93/19191.
{121} Documento WO 94/28938.
{122} Documento WO 95/11984.
{123} Documento WO 95/00655.
{124} Curie (1992) Hum. Gene
Ther. 3: 147.
{125} Wu, (1989) J. Biol.
Chem. 264: 16985.
{126} Patente de los Estados Unidos
5.814.482.
{127} Documento WO 95/07994.
{128} Documento WO 96/17072.
{129} Documento WO 95/30763.
{130} Documento WO 97/42338.
{131} Documento WO 90/11092.
{132} Patente de los Estados Unidos
5.580.859.
{133} Patente de los Estados Unidos
5.422.120.
{134} Documento WO 95/13796.
{135} Documento WO 94/23697.
{136} Documento WO 91/14445.
{137} Documento EP 0524968.
{138} Philip (1994) Mol. Cell
Biol. 14:2411.
{139} Woffendin (1994) Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 91: 11581.
{140} Patente de los Estados Unidos
5.206.152.
{141} Documento WO 92/11033.
{142} Patente de los Estados Unidos
5.149.655.
{143} Documento WO90/14837.
{144} Vaccine Design - the subunit and adjuvant
approach (1995) eds. Powell y Newman. ASIN: 030644867X.
{145} Documento WO00/07621.
{146} Documento GB-2220221.
{147} Documento
EP-A-0689454.
{148} Documento
EP-A-0835318.
{149} Documento
EP-A-0735898.
{150} Documento
EP-A-0761231.
{151} Documento WO99/52549.
{152} Documento WO01/21207.
{153} Documento WO01/21152.
{154} Documento WO00/62800.
{155} Documento WOOO/23105.
{156} Documento WO99/11241.
{157} Documento WO98/57659.
{158} Documento WO93/13202.
{159} McSharry (1999) Antiviral
Res 43(1): 1-21.
{160} Weissman (1987) Mol Biol.
Med. 4(3): 133-143.
{161} Patanjali y col. (1991)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 1943-1947.
{162} Simone y col. (2000) Am J
Pathol. 156(2): 445-52.
{163} Claverie (1996) Meth.
Enzymol. 266: 212-227.
{164} Capítulo 36 (página 267ff) of Automated
DNA Sequencing and Analysis Techniques (eds. Adams y col.) ISBN:
0127170103.
{165} Claverie y col. (1993)
Comput. Chem. 17: 191.
{166} Aitschul y col. (1990),
J. Mol. Biol. 215: 403-410.
{167} Pearson y Lipman
(1988) PNAS USA, 85: 2444.
{168} Luo y col. (1999) Nature
Med 5: 117-122.
{169} Sedivy (1998) Proc Natl
Acad Sci USA 95: 9078-9081.
{170} Hahn y col. (2002) Mol
Cell Biol. 22(7): 2111-2123.
{171} Hahn y col. (1999)
Nature 400(6743): 464-468.
{172} De Marzo y col. (1998) J
Urol. 160: 2381-2392.
{173} Sakr y Partin (2001)
Uroiogy 57 (4 Suppl 1): 115-120.
Claims (10)
1. Un procedimiento para diagnosticar el cáncer
de próstata, comprendiendo el procedimiento la etapa de detectar en
una muestra del paciente el nivel de un producto de expresión de un
retrovirus endógeno humano (PCAV) localizado en la megabase 20,428
del cromosoma 22 en el que el producto de expresión es un transcrito
de ARNm o un polipéptido y en el que el nivel del producto de
expresión en la muestra del paciente se compara con una muestra
control.
2. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que se detecta un transcrito de ARNm mediante hibridación,
mediante secuenciación, o mediante una reacción en cadena de la
polimerasa mediante transcriptasa inversa.
3. El procedimiento de cualquier reivindicación
anterior, en el que el procedimiento comprende una etapa inicial de:
(a) extraer el ARNm procedente de la muestra del paciente; (b)
eliminar el ADN procedente de la muestra del paciente sin eliminar
el ARNm; y/o (c) eliminar o perturbar el ADN de PCAV, pero no el
ARNm de PCAV, en la muestra del paciente.
4. El procedimiento de cualquier reivindicación
anterior, en el que el transcrito de ARNm comprende una o más de las
SEC ID 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 37, 38, 40, 41, 42, 43
y/o 1191.
5. El procedimiento de cualquier reivindicación
anterior, que comprende las etapas de: (a) poner en contacto la
muestra del paciente con cebadores de ácido nucleico y/o
una(s) sonda(s) en condiciones de hibridación; y (b)
detectar la presencia o ausencia de hibridación en la muestra del
paciente.
6. El procedimiento de cualquier reivindicación
anterior, que comprende las etapas de: (a) enriquecer el ARNm de la
muestra respecto del ADN para dar una muestra enriquecida en ARNm;
(b) poner en contacto la muestra enriquecida en ARNm con cebadores
de ácido nucleico y/o una(s) sonda(s) en condiciones
de hibridación; y (c) detectar la presencia o ausencia de
hibridación en el ARNm presente en la muestra enriquecida con
ARNm.
7. El procedimiento de cualquier reivindicación
anterior, que comprende las etapas de: (a) preparar copias de ADN
del ARNm de la muestra; (b) poner en contacto las copias de ADN con
cebadores de ácido nucleico y/o sonda(s) en condiciones de
hibridación; y (c) detectar la presencia o ausencia de hibridación
en dichas copias de ADN.
8. El procedimiento de cualquier reivindicación
anterior que comprende la etapa de poner en contacto la muestra del
paciente con un anticuerpo que reconoce un polipéptido expresado
procedente del retrovirus.
9. El procedimiento de cualquier reivindicación
anterior, en el que la muestra del paciente comprende células de
próstata.
10. El procedimiento de cualquier reivindicación
anterior, en el que el paciente es un varón humano adulto.
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| WO2018165600A1 (en) | 2017-03-09 | 2018-09-13 | Genomedx Biosciences, Inc. | Subtyping prostate cancer to predict response to hormone therapy |
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|---|---|---|---|---|
| US5858723A (en) * | 1995-12-05 | 1999-01-12 | Behringwerke Aktiengesellschaft | Polypeptides and antibodies for diagnosing and treating seminoma |
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