CZ9903550A3

CZ9903550A3 - Prostředky a způsob léčení a diagnostiky rakoviny prsu

Info

Publication number: CZ9903550A3
Application number: CZ19993550A
Authority: CZ
Inventors: Tony N Frudakis; John M Smith; Steven G Reed
Original assignee: Corixa Corp
Priority date: 1998-04-09
Filing date: 1998-04-09
Publication date: 2001-06-13

Abstract

Izolovaná molekula DNA obsahující sekvence nukleotidů, které jsou přednostně expresovány v nádorové tkáni prsu, a polypeptidy zakódované takovými sekvencemi nukleotidů. Vakciny a farmaceutické prostředky obsahující takové sloučeniny použitelné například k prevenci a léčení rakoviny prsu a k výrobě protilátek, které se hodí k diagnostice a sledování rozvoje rakoviny prsu

Description

Oblast techniky

Vynález se týká obecně detekce a léčení rakoviny prsu. Zvláště se vynález týká sekvencí nukleotidů, které jsou přednost ně expresovány v rakovi nové tkáni prsu a polypeptidů kódovaných takovými sekvencemi nukleotidů. Sekvencí nukleotidů a polypeptidů může být použito ve vakcinách a ve farmaceutických prostředcích k prevenci a léčení rakoviny prsu. Polypeptidů může být také použito k produkci sloučenin, jako jsou protilátky užitečné k diagnóze a sledování šíření rakoviny prsu u pacientů.

Dosavadní stav techniky

Rakovina prsu je významným zdravotnickým problémem u žen ve Spojených Státech a jinde ve světě. Ačkoli v detekci a léčení této nemoci došlo k určitému pokroku, zůstává rakovina prsu druhou vedoucí příčinou úmrtí žen způsobených rakovinou, což postihuje ve Spojených Státech každoročně 180 000 žen. U žen v Severní Americe šance, že dostanou rakovinu prsu předst avuj e dnes 1:8.

Běžně není k disposici žádná vakcina nebo univerzálně použitelný způsob prevence nebo léčení rakoviny prsu. Léčení je běžně založeno na včasné diagnose (rutinními způsoby vyšetřování prsu) a na agresivní léčbě, která může zahrnovat jednu nebo několik variant ošetření, jako je chirurgie, rádiot erapi e, chemoterapie a hormonální terapie. Průběh léčby příslušné rakoviny prsu se často volí v závislosti na četných prognostických parametrech, včetně analysy specifických markérů nádoru (například Porter-Jordán a Lippman, Breast Cancer 8, str. 73 až 100, 1994). Avšak použití zavedených markérů často vede k výsledkům, které se dají obtížně interpretovat a vysoká úmrtnost, pozorovaná u pacientek s rakovinou prsu, naznačuje, že jsou nutná zlepšení v ošetřování, diagnostice a prevenci tohoto onemocnění.

Je tedy zapotřebí vyvinout zlepšený způsob pro terapii a dignózu rakoviny prsu. Vynález splňuje tento úkol a je spojen s dále uvedenými přednostmi.

Podstata vynálezu

Podstatou vynálezu je izolovaná molekula DNA, sestávající (a) ze sekvence nukleotidů volených ze souboru zahrnujícího SEQ ID N0:1, 3-26, 28-77, 142, 143, 146-152, 154-166, 168-176, 178-192, 194-198, 200-204, 206, 207, 209-214, 216, 218, 219, 221-240, 243-245, 247, 250, 251, 253, 255, 257-266, 268, 269, 271-273, 275, 276, 278, 280, 281, 284, 288 a 291-297;

(b) z varianty této sekvence nukleotidů, která obsahuje jednu nebo několik substitucí, vypuštění, začlenění a/nebo modififikací nukleotidů a méně než 20 % nukleotidových pozic, takže antigenové nebo imunogenní vlastnosti polypeptidu, zakódovaného sekvencí nukleotidů jsou zachovány, nebo (c) ze sekvence nukleotidů kódující epitop polypeptidu kódovaného alespoňjednou sekvencí volenou ze souboru zahrnujícího SEQ ID N0:1, 3-26, 28-77, 142, 143, 146-152, 154-166, 168-176, 178-192, 194-198, 200-204, 206, 207, 209-214, 216, 218, 219, 221-240, 243-245, 247, 250, 251, 253, 255, 257-266, 268, 269, 271-273, 275, 276, 278, 280, 281, 284, 288 a 291-297.

Podstatou vynálezu je tedy týká prostředek a způsob k diagnose a k léčení rakoviny prsu. Jednak jde o izolované molekuly DNA, sestávající ze (a) sekvence nukleotidů přednostně extresovaných v prsní rakovinové tkáni ve srovnání s normální prsní tkáni, (b) z varianty této sekvence nukleotidů, která obsahuje jednu nebo několik substitucí, vypuštění, začlenění a/nebo módififikácí nukleotidů na méně než 20 % nukleotidových pozicíc (s výhodou nejvýše na 5 % pozic), takže an• · · · tigenové nebo imunogenní vlastnosti polypeptidu, zakódovaného sekvencí nukleotidů jsou zachovány, nebo (c) ze sekvence nukleotidů kódující epitop polypeptidu kódovaného alespoň jednou ze shora uvedených sekvecí.

Podle některých provedení kóduje izolovaná DNA molekula epitop polypeptidu, přičemž je polypeptid kódován nukleotidovou sekvencí, které hybridizuje kterékoliv na sekvenci ze souboru zahrnujícího SEQ ID N0:1, 3-26, 28-77, 142, 143, 146-152, 154-166, 168-176, 178-192, 194-198, 200-204, 206, 207, 209214, 216, 218, 219, 221-240, 243-245, 247, 250, 251, 253, 255, 257-266, 268, 269, 271-273, 275, 276, 278, 280, 281, 284, 288 a 291-297 za přísných podmínek a (b) alespoň z 80 % jsou sekvence identické se sekvencemi SEQ ID N0:1, 3-26, 28-77, 142, 143, 146-152, 154-166, 168-176, 178-192, 194-198, 200204, 206, 207, 209-214, 216, 218, 219, 221-240, 243-245, 247, 250, 251, 253, 255, 257-266, 268, 269, 271-273, 275, 276, 278, 280, 281, 284, 288 a 291-297; přičemž RNA odpovídající uvedené nukleotidové sekvenci je expresována ve větším množství ve tkáni lidského prsního nádoru než v normální prsní tkáni.

V jiném provedení se vynález týká izolované molekuly DNA kódující epitop polypeptidu, přičemž je polypeptid kódován (a) sekvencí nukleotidů transkribovanou ze sekvence SEQ ID NO: 141; nebo (b) je zachována varianta uvedené sekvence nukleotidů, která obsahuje jednu nebo několik substitucí nukleotidů, vypuštění, začlenění a/nebo modifikací v méně než 20 % pozic nukleotidů, jako jsou antigenní nebo imunogenní vlastnosti polypeptidu zakódovaného sekvencí nukleotidů. Jsou také zajištěny izolované molekuly DNA a RNA zahrnující sekvence nukleotidů komplementární k molekule DNA, jak shora popsáno.

Vynález se také týká rekombinantních expresních vektorů zahrnujících shora popsanou molekulu DNA a hostitelské buňky případně transformované takovými expresními vektory.

• ·

Vynález se také týká polypeptidů zahrnujících sekvenci aminokyseliny, kódovanou shora popsanou molekulou DNA, a monoklonálních protilátek, ktré se vážou na takové polypeptidy.

• · · · · • · · · · · ·

Vynález se týká také způsobu st anoven í rakovi ny prsu u pacientky. Podle jednoho provedení spočívá způsob v detekci shora popsaného polypeptidů v biologickém vzorku. Podle jiného provedení spočívá způsob v detekci shora popsaného polypeptidů v biologickém vzorku molekuly RNA kódující shora popsaný polypeptid. Podle ještě jiného provedení spočívá způsob z (a) intradermální ho injektování pacientce shora popsaného polypeptidu a (b) z detekce imunitní odezvy na pacientčině pokožce, přičemž se podle toho usuzuje na onemocnění pacientky rakovinou. Podle ještě dalšího provedení se vynálezu využívá ke st anovení onemocnění pacientky rakovinou prsu, jak shora popsáno, přičemž polypeptid je zakódován nuok1eotidovou sekvencí vole-

nou ze souboru	zahrnujícího SEQ	ID NO	: 78	-86,	144,	1 45 ,	1 53,
167, 177, 193,	199, 205,	208,	215, 217,	220,	241 ,	242,	246,
248, 249, 252,	256, 267,	270,	274,	277,	279,	282,	283,	285-

287, 289,

290 a sekvencemi, které je hybridizují za přísných podmí nek.

Vynález se týká také diagnostického kitu užitečného k detekci rakoviny prsu. Diagnostický kit sestává obecně z jedné nebo z několika shora popsaných monok1onálních protilátek nebo jedné nebo několika monoklonálnich protilátek, které se vážou na polypeptid kódovaný sekvencí nukleotidů volenou ze souboru zahrnujícího SEQ ID NO: 78-86, 144, 145, 153, 167, 177, 193, 199, 205, 208, 215, 217, 220, 241, 242, 246, 248, 249, 252, 256, 267, 270, 274, 277, 279, 282, 283, 285-287, 289, 290 a z detekčního reakčního činidla.

Diagnostický kit obsahuje první reakční primer polymerázového řetězce a druhý reakční primer polymerázového řetězce, přičemž alespoň jeden z primerů je specifický pro shora popsanou molekulu RNA. Podle jednoho provedení tvoří alespoň jeden • · primer nejméně 10 sousedících nukleotidů shora popsané molekuly RNA nebo molekulu RNA kódující polypeptid zakódovaný sekvencí nukleotidů volenou ze souboru zahrnujícího SEQ ID NO: 78-86, 144, 145, 153, 167, 177, 193, 199, 205, 208, 215, 217, 220, 241, 242, 246, 248, 249, 252, 256, 267, 270, 274, 277, 279, 282, 283, 285-287, 289 a 290.

Podle jiného provedení diagnostický kit sestává z alespoň jedné ol igonuk1eotidové sondy, přičemž sonda je specifická pro shora popsanou molekulu DNA. Podle jednoho provedení sestává sonda z alespoň přibližně 15 sousedících sekvencí nukleotidů shora popsané molekuly DNA, nebo molekuly DNA volené ze souboru zahrnujícího SEQ ID NO: 78-86, 144, 145, 153, 167, 177, 193, 199, 205, 208, 215, 217, 220, 241, 242, 246, 248, 249,

252, 256, 290.

267, 270, 274, 277, 279, 282, 283, 285-287, 289 a

Vynález se týká také způsobu sledování postupu rakoviny prsu. Podle jednoho provedení způsob zahrnuje (a) napřed detekci množství shora popsaného polypeptidu v biologickém vzorku, (b) pak opakování kroku (a) a nato (c) porovnání množství zjištěných polypeptidů v kroku (a) a (b) a tím sledovat postup rakoviny prsu. Podle jiného provedení způsob spočívá (a) napřed v detekci molekuly RNA kódující shora popsaný polypeptid, (b) pak opakování kroku (a) a nato (c) porovnání množství zjištěných RNA molekul ve kroku (a) a (b) a tím monitorovat postup rakoviny prsu. Podle ještě dalšího provedení se vynález týká způsobu monitorování postupu rakoviny prsu, jak shora popsáno, přičemž jsou polypeptidy kódovány nukleoditovou sekvencí volenou ze souboru zahrnujícího SEQ ID NO: 78-86, 144, 145, 153, 167, 177, 193, 199, 205, 208, 215, 217, 220, 241, 242, 246, 248, 249, 252, 256, 267, 270, 274, 277, 279, 282, 283, 285-287, 289 a 290 a sekvencemi, které tam hybridizují za přísných podmínek.

Vynález se dále týká farmaceutických prostředků, které zahrnují shora popsaný polypeptid v kombinaci s fyziologicky přijatelným nosičem a vakciny, které obsahují shora popsaný polypeptid v kombinaci s činitelem zvyšujícím imunitní odezvu nebo adjuvant. Dále se vynález týká farmaceutických prostředků a vakcin, které obsahují polypeptid zakódovaný sekvencí nukleotidů volenou ze souboru zahrnujícího SEQ ID NO: 78-86, 144, 145, 153, 167, 177, 193, 193, 205, 208, 215, 217, 220, 241, 242, 246, 248, 249, 252, 256, 267, 270, 274, 277, 279, 282, 283, 285-287, 289 a 290 a sekvencemi, které hybridizují kromě toho za přísných podmínek..

Odvozeně se vynález týká způsobů inhibice šíření rakoviny prsu, spočívajících v podávání pacientkám shora popsaných farmaceutických prostředků nebo vakciny.

Vynález blíže objasňuje následující podrobný popis pomocí připojených obrázků.

Seznam výkresů na obrázcích

Na obr. 1 je diferenční displej produktů PCR, separovaných gelovou e1ektroforézou z cDNA připravené z normální tkáně prsu (pásma 1a 2) a z cDNA připravené z nádorové tkáně prsu téže pacientky (pásma 3 a 4). šipka vyznačuje pás odpovídající B18Ag1.

Na obr. 2 je northern blot porovnávající hladinu B18Ag1 mRNA v nádorové tkáni prsu (pásmo 1) s hladinou v normální tkáni prsu.

Na obr. 3 je hladina B18Ag1 mRNA v nádorové tkáni prsu v porovnání s normálními a nádorovými tkáněmi nepocházejícími z prsu zjištěné protekční zkouškou RNázy, přičemž představují pásma 1 až 12 vzorky normální tkáně prsu, pásma 13 až 25 různé vzorky nádorových tkání prsu, pásma 26 až 27 normální vzorky prostaty, pásma 28-29 nádorové vzorky prostaty, pásma 30 až 32 nádorové vzorky tlustého střeva, pásmo 33 normální aortu, pásmo 34 normální tenké střevo, pásmo 35 normální pokožku, pásmo • · · · · · · ·· · · · · ··· ·· · · « ··· ··· · · · ··· ··· ·· ·· · · · ·· normální lymfatickou uzlinu, pásmo 37 normální vaječník, pásmo 38 normální játra, pásmo 39 normální kosterní svalstvo, pásmo 40 první normální vzorek žaludku, pásmo 41 druhý normální vzorek žaludku, pásmo 42 normální plíce, pásmo 43 normální ledviny a pásmo 44 představuje normální slinivku.

Obr. 4 je mapa genomického klonu ukazující umístění přídavných retrovirových sekvencí získaných z konců Xbal restrikčních digestů (zajištěných v SEQ ID N0:3 -SEQ ID NO: 10) vůči B18Ag1. Na obr. 5A a 5B je znázorněna genomická strategie, genomická organizace a předvídaný otevřený čtecí rámec pro retrovirový element obsahující B18Ag1.

Na obr. 6 je znázorněna sekvence nukleot idů reprezentativní cDNA B18Ag1 specifické pro nádor prsu.

Na obr. 7 je znázorněna sekvence nukleotidů reprezentativní cDNA B17Ag1 specifické pro nádor prsu.

Na obr. 8 je znázorněna sekvence nukleotidů reprezentativní cDNA B17Ag2 specifické pro nádor prsu.

Na obr. 9 je znázorněna sekvence nukleotidů reprezentativní cDNA B13Ag2a specifické pro nádor prsu.

Na obr. 10 je znázorněna sekvence nukleotidů reprezentativní cDNA B13Ag2b specifické pro nádor prsu.

Na obr. 11 je znázorněna sekvence nukleotidů reprezentativní cDNA B13Ag1a specifické pro nádor prsu.

Na obr. 12 je znázorněna sekvence nukleotidů reprezentativní cDNA B11Ag1 specifické pro nádor prsu.

Na obr. 13 je znázorněna sekvence nukleotidů reprezentativní cDNA B3CA3c specifické pro nádor prsu.

Na obr. 14 je znázorněna sekvence nukleotidů reprezentativní cDNA B9CG1 specifické pro nádor prsu.

Na obr. 15 je znázorněna sekvence nukleotidů reprezentativní cDNA B9CG3 specifické pro nádor prsu.

Na obr. 16 je znázorněna sekvence nukleotidů reprezentativní cDNA B2CA2 specifické pro nádor prsu.

Na obr. 17 je znázorněna sekvence nukleotidů reprezentativní cDNA B3CA1 specifické pro nádor prsu.

··· · · · · · · * » • ·· · · · ···

Na obr. 18 je znázorněna sekvence nukleotidů reprezentativní cDNA B3CA2 specifické pro nádor prsu.

Na obr. 19 je znázorněna sekvence nuk i eoti dů reprezent at i vn í cDNA B3CA3 specifické pro nádor prsu.

Na obr. 20 je znázorněna sekvence nukleotidů reprezentativní cDNA B4CA1 specifické pro nádor prsu.

Obr. 21A znázorňuje analysu RT-PCR genů nádoru prsu v prsních tkáních (pásmo 1-8) a v normálních tkáních (pásmo 9-13) a H2O (pásmo 14).

Obr. 21B znázorňuje analysu RT-PCR genů v nádoru prostaty (pásmo 1,2), v nádorech tlustého střeva (pásmo 3), v plicním nádoru (pásmo 4), v normální prostatě (pásmo 5), v normálním tlustém střevu (pásmo 6), v normálních ledvinách (pásmo 8), v normálních játrech (pásno 8) v normálních plicích (pásmo 9), v normálním vaječníků (pásma 10, 18), v normální slinivce (pásma 11, 12), v normálním kosterním svalu (pásmo 13), v normální pokožce (pásmo 14), v normálním žaludku (pásmo 15), v normálních varlatech (pásmo 16), v normálním tenkém střevě (pásmo 17), v HLB-100 (pásmo 19), v MCF-12A (pásmo 20), v plicním nádoru (pásma 21-23), v H2O (pásmo 4) a v nádoru tlusého střeva (pásmo 25).

Jak bylo shora uvedeno, týká se vynález obecně prostředků a způsobů pro dignosu, sledování a léčení rakoviny prsu. Mezi zde popsané prostředky patří poíypeptidy, sekvence nukleových kyselin a protilátky. Poíypeptidy podle vynálezu zahrnují alespoň část proteinu, který je expresován ve větší míře v nádorové tkáni lidského prsu než v tkáni normálního prsu (například hladina RNA kódující polypeptid je nejméně 2 x vyšší v nádorové tkáni). Takové poíypeptidy jsou zde označovány jako specifické pro nádor prsu a molekuly cDNA, kódující takové polypeptidy, se zde označují jako cDNA specifické pro nádor pi— su. Sekvence nukleových kyselin podle vynálezu zahrnují obecně sekvenci DNA nebo RNA, která kóduje všechny nebo část shora popsaných polypeptidů, nebo je s takovou sekvencí komplemen·· ·· • · · · ·· · · tární. Protilátky jsou obecně proteiny imunitního systému, nebo jejich fragmenty, které jsou schopny vázat část shora popsaného polypeptidu. Protilátky lze produkovat technikou kultivace buněk, včetně generace zde popsaných monoklonálních protilátek, nebo cestou transfekce proti 1átkových genů do vhodné bakteriální buňky nebo do buňky savčího hostitele, k umožnění produkce rekombinantních protilátek.

Mezi polypeptidy v rámci vynálezu se počítají příkladně, tedy bez záměru na jakémkoliv omezení, polypeptidy (a jejich epitopy) zakódované lidskou endogenní retrovirovou sekvencí, jako je sekvence B18Ag1 (obr. 5 a SEQ ID N0:1). Do rozsahu vynálezu také patří polypeptidy zakódované jinými sekvencemi uvnitř retrovirového genomu obsahující B1SAg1 (obr. 5 a SEQ ID N0:141). Takové sekvence zahrnují příkladně, tedy bez záměru na jakémkoliv omezení, sekvence citované v SEQ ID N0:3 až SEQ ID NQ-.10. B18Ag1 má homologii vůči gagu p30 genu endogenního lidského retrovirového elementu S71 (Werner a kol., Virology 174, str. 225 až 238 (1990) a vykazuje také homologii vůči přibližně třiceti jiným retrovirovým gag genům. Jak je dále blíže uvedeno, zahrnuje vynález také řadu dalších polypeptidů specifických pro prsní nádor, jako jsou polypeptidy zakódované sekvencemi nukleotidů citovanými v SEQ ID NO: 11-26, 28-77, 142, 143, 146-152, 154-166, 168-176, 178-192, 194-198, 200-204 206, 207, 209-214, 216, 218, 219, 221-240, 243-245, 247, 250, 251, 253, 255, 257-266, 268, 269, 271-273, 275, 276, 278, 280, 281, 284, 288 a 291-297. Zde používaný termín polypeptid zahrnuje řetězce aminokyselin jakékoli délky, včetně proteinů v plné délce obsahujících citované sekvence. Polypeptid zahi— nující epitop proteinu, obsahující zde popsané sekvence, může sestávat plně z epitopu, nebo může obsahovat přídavné sekvence. Přídavné sekvence mohou být odvozeny z nativního proteinu nebo mohou být heterologové a takové sekvence mohou (avšak nemusejí) mít imunogenní nebo antigenní vlastnosti.

Zde používaný termín epitop znamená část polypeptidu, která je rozeznána (například specificky vázána) povrchovým antigenovým receptorem B-buněk a/nebo T-buněk. Epitopy lze obecně identifikovat dobře známými způsoby, jak jsou popsány v literatuře (Paul, Fundamental Immunology 3. vydání, str. 243 až 247, Raven Press 1993). Mezi tyto způsoby patří skríning polypeptidů odvozených od nativního polypeptidu na schopnost reagovat s antigen-specifickými antiséry a/nebo s liniemi T-buněk nebo klonů. Epitop polypeptidu je část, která reaguje s takovými antiséry a/nebo s T-buňkami v míře, která je podobná reaktivitě polypeptidu v plné délce (například v testu ELISA a/nebo reaktivity T-buněk). Takové skríny mohou být obvykle prováděny způsoby známými pracovníkům v oboru, jak jsou popsány v literatuře (Harlow a Lané: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). Epitopy B-buněk a T-buněk mohou být také předpověděny počítačovou analysou. Do rámce vynálezu spadají polypeptidy zahrnující epitop polypeptidu, který je přednostně expresován v nádorové tkáni (případně s přídavnou sekvencí aminokyselin).

Prostředky a způsoby podle vynálezu dále zahrnují varianty shora uvedených polypeptidů a sekvencí nukleových kyselin kódujících takové polypeptidy. Zde používaný termín varianta polypeptidu znamená polypeptid, který se od nativního polypeptidu liší v substitucích a/nebo modifikacích takových, že antigenní a/nebo imunogenní vlastnosti jsou v polypeptidu uchovány. Takové varianty mohou být obecně identifikovány modifikováním sekvencí shora uvedených polypeptidů a vyhodnocováním reaktivity modifikovaného polypeptidu s antiséry a/nebo s Tbuňkami jak shora popsáno. Varianty nukleových kyselin mohou obsahovat jednu nebo několik substitucí, vypuštění, začlenění a/nebo modifikací takových, že antigenní a/nebo imunogenní vlastnosti jsou v zakódovaném polypeptidu uchovány. Jednou výhodnou variantou zde popsaných polypeptidů je varianta, která obsahuje substituce, vypuštění, začlenění a/nebo modifikace • 4 • · 4 4 «4 · · 4

4 4 4 v méně než 20 % nuk 1eotidových pozic.

S výhodou obsahuje var i ant a konzervat i vní substituce. Konzervativní substituce je substitucí, kde je aminokyselina substituována za jinou aminokyselinu, která má podobné vlastnosti, u které by pracovníci v oboru očekávali že sekundární struktura a hydropatická povaha polypeptidu zůstane v podstatě nezměněna. Obecně představují konzervativní změny následující skupiny aminokyselin: (1) ala, pro, gly, glu, asp, gin, asn, ser, thn; (2) cys, ser, tyr, thr; (3) val, ile, leu, met, ala, phe; (4) lys, arg, his a (5) phe, tyr, trp, his.

Varianty mohou být také (nebo alternativně) modifikovány, například vypuštěním nebo přidáním aminokyselin, které mají minimální vliv na imunogenní nebo antigenní vlastnosti, na sekundární strukturu a na hydropatickou povahu polypeptidu. Může být například polypeptid konjugován na signální (nebo vůdčí) sekvenci u N-terminálového konce proteinu, který ko-translačně nebo post-translačně usměrňuje transfer proteinu. Polypeptid může být také konjugován na spojovník nebo na jinou sekvenci k usnadnění syntesy, čistění nebo identifikace polypeptidu (například poly-His) nebo k usnadnění vazby polypeptidu na pevný nosič. Například může být polypeptid konjugován do oblasti imunoglobuli nu Fc.

Obecně se mohou připravovat sekvence nukleotidů kódující všechny nebo část zde popisovaných polypeptidů různými způsoby. Například mohou být molekuly cDNA kódovány na bázi exprese specifické pro nádory prsu odpovídajících mRNA pomocí diferenčního displeje PCR. Tímto způsobem se porovnávají a zesilují produkty ze šablony RNA připravené z normální a z nádorové tkáně prsu. cDNA se může připravit reversní transkripcí RNA za použití primeru (dT)i2AG. Po zesílení cDNA pomocí náhodného primeru se může vyříznout ze stříbrně zabarveného gelu pás odpovídající zesílenému produktu specifickému pro nádorovou RNA • S » 9 9 * · a subklonuje se do vhodného vektoru (například T-vektoru, Novagen, Madison, WI). Sekvence nukleotidů, kódující všechny zde vynalezené polypeptidy specifické pro nádor nebo jejich část, se mohou zesílit z cDNA, připravené jak shora popsáno, pomocí náhodných primerů uvedených v SEQ ID NO:S7-125.

Alternativně může být gen, kódující zde popsaný polypeptid (nebo jeho část), zesílen z lidské genomické DNA, nebo z cDNA prsního nádoru cestou polymerázového řetězce. K tomu mohou být určeny primery specifické pro B16Ag1 založené na sekvenci poskytované v SEQ ID NO:1, přičemž jde o obchodní produkt nebo se může syntetizovat. Jedním vhodným párem primerů pro zesílení cDNA je (5'ATG GCT ATT TTC GGG GGC TGA CA) (SEQ ID NO:126) a (5'CCG GTA TCT CCT CGT GGG TAT T) (SEQ ID NO:127). Zesílené části B18Ag1 může pak být použito k izolování plné délky genu z knihovny lidských genomických DNA nebo z knihovny prsních nádorových cDNA, pomocí známých způsobů, jako jsou popsány v literatuře (Sambrook a kol., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Ostatní sekvence v retrovirovém genomu, jehož je B18Ag1 součástí, se mohou připravit podobně skrínováním lidských genomických knihoven za použití sekvencí specifických pro B18Ag1 jako sond. Nukleotidy, translatované do proteinu z retrovirového genomu, uvedeného v SEQ ID NO:141, mohou pak být určeny klonováním odpovídajících cDNA, předvídajících otevřené čtecí rámce a klonováním příslušných cDNA do vektoru obsahujícího virový promotor, jako je T7. Výsledných konstruktů pak může být použito v translačních reakcích pomocí způsobů známých pracovníkům v oboru, k identifikování sekvencí nukleotidů, jejichž výsledkem je expresovaný protein. Podobně mohou být konstruovány primery specifické pro zbývající, zde popsané polypeptidy, specifické pro nádory prsu na základě sekvencí nukleotidů poskytovaných v SEQ ID NO:11-SEQ ID NO:86 a SEQ ID NO: 142 - SEQ ID NO:297.

• · « «Φ *»· * • φ φ · » φ φ φ • · φ · · ·

- · · · φ φ · φ φ · ·· * * »* • · » φ « · · · φ· ΦΦ

Rekombinantní polypeptidy, kódované shora popsanými sekvencemi DNA, lze snadno připravit ze sekvencí DNA. Například supernatanty ze vhodných systémů host/vektor, které vylučují rekombinantní protein nebo polypeptid do kultivačního prostředí, se mohou napřed zkoncentrovat pomocí obchodně dostupného filtru. Po zkoncentrování může být koncentrát aplikován na vhodnou čisticí matrici, jako je afinitní matrice nebo iontoměničová pryskyřice. Nakonec lze provést jeden nebo několik kroků reverzní fázovou chromatografi i HPLC k dalšímu vyčištění rekombinantního polypeptidu.

Obecně je možno k expresi rekombinantního polypeptidu podle vynálezu použít různých expresních vektorů, známých pracovníkům v oboru. Exprese lze dosáhnout ve vhodné hostitelské buňce, která byla transformována nebo transfektována expresním vektorem, obsahujícím molekulu DNA, která kóduje rekombinantní polypeptid. Mezi vhodné hostitelské buňky patří prokaryoty, kvasnice a vyšší eukaryotické buňky. S výhodou jsou hostitelskými buňkami E coli, kvasnice nebo linie savčích buněk jako je COS nebo CHO.

Takových způsobů je možno použít k přípravě polypeptidů obsahujících epitopy nebo varianty nativních polypeptidů. Například mohou být varianty nativního polypeptidu obecně připraveny pomocí standardní techniky mutagenese, jako je na oligonukleotid zaměřená místně specifická mutagenese a sekce sekvence DNA mohou být odstraněny k umožnění přípravy zkomolených polypeptidů. Syntetickými prostředky mohou být také generovány části a další varianty mající méně než přibližně 100 aminokyselin a obecně méně než přibližně 50 aminokyselin způsoby, známými pracovníkům v oboru. Například mohou být takové polypeptidy syntetizovány obchodně dostupnými technikami v pevné fázi, jako je Merrifieldův způsob synthesy v pevné fázi, kde se aminokyseliny sekvenčně přidávají do rostoucího řetězce aminokyselin (Merrifield, J. Am. Chem.Soc. 85, str. 2146 až • · • ·· ·· · · · • · · · · · · · · · · · • · · ·· · · · · ♦ ··· ·· ·· ··· ·· ··

2149, 1963). Zařízení k automatizované synthese polypeptidů je obchodně dostupné od různých dodavatelů jako je Perkin Elmer/ Applied BioSystems Division, Foster City,CA a obsluhují se podle návodu výrobce.

Podle specifických provedení zahrnují polypeptidy podle vynálezu sekvence aminokyselin kódovaných molekulou DNA mající sekvenci citovanou v kterékoli z variant SEQ ID N0:1. 3-26, 2S-77, 142, 143, 146-152, 154-166, 168-176, 178-192, 194-198, 200-204, 206, 207, 209-214, 216, 218, 219, 221-240, 243-245, 247, 250, 251, 253, 255, 257-266, 268, 269, 271-273, 275, 276, 278, 280, 281, 284, 288 a 291-297 takových polypeptidů, které jsou kódovány molekulami DNA obsahujícími jednu nebo několik nukleotidových substitucí, vypuštění, začlenění a/nebo modifikací na méně než 20 % nukleotidových pozic a epitopy shora uvedených polypeptidů. Polypeptidy podle vynálezu zahrnují také polypeptidy (a jejich epitopy) kódované sekvencemi DNA, které hybridizují na molekule DNA mající sekvence citované ve kterékoliv SEQ ID N0:1, 3-26, 28-77, 142, 143, 146-152, 154-166, 168-176, 178-192, 194-198, 200-204, 206, 207, 209214, 216, 218, 219, 221-240, 243-245, 247, 250, 251, 253, 255, 257-266, 268, 269, 271-273, 275, 276, 278, 280, 281, 284, 288 a 291-297 za přísných podmínek, kde sekvence DNA jsou alespoň z 80 % identické s celkovou sekvencí s citovanou sekvencí a kde RNA, odpovídající sekvenci nukleotidů, je expresována ve větší míře v lidské tkáni prsního nádoru než v normální prsní tkáni. Pojem za přísných podmínek se týká prmývání v roztoku 6X SSC, 0,2 % SDS; hybridizace při teplotě 65 °C, 6X SSC 0,2 % SDS přes noc; s následným dvojím promytim po 30 minutách vždy v 1X SSC, 0,1 % SDS při teplotě 65 °C a dvojím promytim po dobu 30 minut vždy 0,2 X SSC, 0,1 % SDS při 65 °C. Molekuly DNA podle vynálezu zahrnují molekuly, které kódují kterýkoli ze shora uvedených polypeptidů.

Vynález se také týká protilátek. Takové protilátky je • ·· ·· · ·· ··· · · ··· · ·· · • *

možno připravovat kterýmkoli ze způsobů známým pracovníkům v oboru (například Harlow a Lané: Antibodies: A Laboratory Manuál, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). Při jednom způsobu se napřed injektuje imunogen obsahující polypeptid rozmanitým savcům (například myši, krysy, králíci, ovce nebo kozy). Při tomto kroku mohou polypeptidy podle vynálezu sloužit jako imunogen bez modifikace. Alternativně, zejména u poměrně krátkých polypeptidů, se může dostavit silná imunitní odezva, je-li polypeptid napojen na nosičový protein, jako je albumin hovězího séra nebo klíčový klíštatový hemocyanin (keyhole limpet hemocyanin). Imunogen se injektuje do zvířecího hostitele, s výhodou podle předem stanoveného plánu zahrnujícího jednu nebo několik stupňovaných imunizací a zvířatům se pravidelně odebírá krev. Polyklonální prot ilátky, specifické pro polypeptidy, se pak mohou vyizolovat z takových antisér, například afinitní chromatografií za použití polypeptidů spojeného se vhodným pevným nosičem.

Monoklonální protilátky, specifické pro příslušný antigenový polypeptid, se mohou připravit například použitím způsobu, který popsali Kohler a Milstein (Eur. J. Immunol. 6, str. 511 až 519 (1976) a jeho vylepšením. Tyto způsoby zahrnují přípravu nesmrtelných buněčných linií schopných produkovat protilátky mající žádanou specifičnost (například reaktivitu s příslušným polypeptidem). Takové buněčné linie se mohou produkovat například ze slezinových buněk, získaných z imunizovaných zvířat, jak shora popsáno. Slezinové buňky se pak imortalizují například fúzí s fúzním partnerem buňky kostní dřeně, s výhodou takové, která je syngenová s imunizovaným zvířetem. Použít se dá rozmanitých způsobů fúze. Mohou se například kombinovat slezinové buňky a buňky kostní dřeně s neiontovým detergentem po několik minut a pak se v nízké hustotě nanesou na selektivní medium, které podporuje růst hybridních buněk, nikoli však buněk kostní dřeně. Výhodný způsob používá HAT (hypoxanthinovou, aminopteri novou,thymidinovou) selekci. Po urči• · té době, přibližně 1 až 2 týdnů lze pozorovat kolonie hybridů. Jednotlivé kolonie se oddělí a jejich kulturní supernatanty se testují na vazební aktivitu vůči polypeptidů. Přednost se dává hybridomům s vysokou reaktivitou a specifičností.

Monoklonální protilátky mohou být izolovány ze supernatantů rostoucích kolonií hybridomů. Kromě toho může být různých způsobů použito ke zlepšení výtěžku, jako je injekce buněčné linie hybridomů do peritoneální dutiny vhodného obratlovce, jako je myš. Monoklonální protilátky lze pak těžit z ascites tekutin nebo z krve. Nečistoty se z protilátek odstraňují běžnými způsoby, jako je chromatografie, filtrace, gelová filtrace, precipitace a extrakce. Polypeptidů podle vynálezu se může použ í vat v čisticích procesech, například v af i nitní chromatografií.

Protilátek se může používat například ve způsobech detekce rakoviny prsu. Tyto způsoby používají protilátku k detekci případné přítomnosti zde popsaného polypeptidů specifického pro rakovinu prsu ve vhodném biologickém vzorku. Zde používanými vhodnými biologickými vzorky jsou normální a nádorové tkáně vyšetřované drobnohledně, tkáně chirurgicky odňatých prsů, krev, mízní uzliny, vzorky séra a moče nebo jiné tkáně, homogenizáty nebo jejich extrakty získané od pacientů.

Pracovníkům v oboru je známa řada testovacích postupů s použitím protilátek k detekci polypeptidových markérů ve vzorku. Například Harlow a Lanc (Antibodies: A Laboratory Manuál, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). Test se může provádět například ve Westernovém přenosu, kde proteinový preparát z biologického vzorku je podroben gelové elektroforéze, přenese se na vhodnou membránu a nechá se reagovat s protilátkou. Přítomnost protilátky na membráně může pak být zjištěna vhodným detekčním reakčním činidlem, jak dále popsáno.

Podle jiného provedení zkouška používá protilátky imobilizované na pevném nosiči k vázání polypeptidu a k jeho vyjmutí ze zbytku vzorku. Vázaný polypeptid může pak být odstraněn pomocí druhé protilátky nebo reakčního činidla, které obsahuje hlásiči (reportér) skupinu. Alternativně ie možno použít souběžnou zkoušku, při které je polypeptid označen hlásící skupinou a nechá se vázat na imobi1 izovanou protilátku po inkubaci protilátky se vzorkem. Míra, jakou složky vzorku inhibují vazbu značeného polypeptidu na protilátku, je indikativní pro reaktivitu vzorku s i mobilizovanou protilátkou a jako výsledek je indikativní pro koncentraci polypeptidu ve vzorku.

Pevným nosičem může být jakýkoli materiál známý pracovníkům v oboru, na který může být protilátka vázána. Například může být pevným nosičem zkušební důlek v mikrotitrační destičce nebo nitroce!ulózový filtr nebo jiná vhodná membrána. Alternativně může být nosičem kulička nebo kotouček ze skla, z vláknitého skla, z latexu nebo z plastu, jako je polystyren nebo polyviny1ch1orid. Nosičem může být také magnetická částice nebo vláknité optické čidlo, jako například podle amerického patentového spisu číslo 5 359 681.

Protilátka může být imobi1 izována na pevném nosiči různými, v oboru známými způsoby, které jsou bohatě popsány v patentové a vědecké literatuře. V kontextu vynálezu znamená pojem znehybnění jak nekovalentní spojení, jako je adsorpce, tak kovalentní spojení (kterým může být přímá vazba mezi protilátkou a funkčními skupinami na nosiči nebo může být vazbou prostřednictvím zesilovacího činidla). Výhodné je znehybnění adsorpcí na zkušební důlek v mikrotitrační destičce nebo na membránu. V takových případech může být adsorpce dosaženo uvedením do styku protilátky ve vhodném pufru s pevným nosičem po vhodnou dobu. Dodá styku se mění s teplotou, avšak obykle bývá přibližně jena hodina až jeden den. Obecně kontaktování důlku v plastové mikrotitrační destičce (jako je polystyren nebo po1yviny1ch1orjd) s množstvím protilátky přibližně 10 ng až při• · · · · ·

8 • · bližně 1 pg, s výhodou přibližně 100 až 200 ng, postačí ke znehybnění přiměřeného množství polypeptidů.

Kovalentní vazby protilátky na pevný nosič lze obecně dosáhnout také napřed reakcí nosiče s bifunkčním činidlem, které reaguje jak s nosičem, tak s funkční skupinou, jako je hydroxylová skupina nebo aminoskupina, protilátky. Například může být protilátka kovalentně vázána na nosiče s vhodným polymerovým povlakem za použití benzochinonu nebo nakondenzování aldehydové skupiny na nosič aminem a aktivním vodíkem na vazebním partnerovi (například Pierce, Immunotechnology Catalog and Handbook, A12 až A13, 1991).

Podle některých provedení je test detekce polypeptidů ve vzorku sendvičovým testem dvou protilátek. Tento test se provádí napřed uvedením do styku protilátky, která byla imobilizována na pevném nosiči, zpravidla v důlku v mikrotitrační destičce, s biologickým vzorkem tak, že polypeptid ve vzorku se nechá vázat na znehybněnou protilátku. Nespojený vzorek se pak odstraní z komplexů znehybněný polypeptid-proti 1átka a přidá se druhá protilátka (obsahující hlásiči skupinu), schopná vazby na odlišné místo na polypeptidů. Množství druhé protilátky, která zůstane vázána na pevný nosič, se pak zjistí způsobem příslušným pro specifickou hlásiči skupinu.

Jakmile je jednou protilátka imobi1 izována na nosiči, jak shora popsáno, jsou zbývající proteinová vazební místa na nosiči obvykle blokována jakýmkoli vhodným blokovacím činidlem známým pracovníkům v oboru, jako je například albumin hovězího séra nebo Tween 20™ (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Znehybněná protilátka se pak inkubuje spolu se vzorkem a polypeptid se nechá vázat na protilátku. Vzorek se může před inkubací zředit vhodným ředidlem, jako je fosfátem pufrovaná solanka (PBS). Zpravidla je vhodnou dobou styku (tedy inkubační dobou) časový úsek postačující k detekci přítomnosti polypeptidů

9 • · ve vzorku získaného od ženy s rakovinou prsu. S výhodou je doba styku postačující k dosažení úrovně vazby, která je alespoň 95 % doby k dosažení rovnováhy mezi vázaným a nevázaným polypeptidem. Pracovníkům v oboru je zřejmé, že doba potřebná k dosažení rovnováhy může být snadno zjištěna zkouškou úrovně vazby, ke které dojde v časovém úseku. Při teplotě místnosti postačí obvykle inkubační doba přibližně 30 minut.

Nevázaný vzorek se může pak odstranit oplachem pevného nosiče vhodným pufrem, jako je PBS obsahující 0,1 % Tween 20™. Druhá protilátka, která obsahuje hlásiči skupinu, může být pak přidána k pevnému nosiči. Mezi výhodné hlásící skupiny patří enzymy (jako je peroxidáza křenu), substráty, kofaktory, inhibitory, barviva, radionukleotidy, lumiscenční skupiny a biotin. Spojení protilátky s hlásící skupinou může být dosaženo použitím standardních způsobů známých pracovníkům v oboru.

Druhá protilátka se pak inkubuje se znehybněným komplexem proti 1átka-polypeptid po dobu postačující k detekci vázaného polypeptidu. Vhodný časový úsek se obvykle určí zkoumáním míry vazby, ke které během časové lhůty dochází. Nevázaná druhá protilátka se pak odstraní a vázaná druhá protilátka se zjistí pomocí hlásící skupiny. Použitý způsob k detekci hlásící skupiny závisí na povaze hlásící skupiny. U reaktivních skupin jsou obvykle vhodnými způsoby scintilační čítání nebo autoradiografie. K detekci barev, luminiscenčních a fluorescenčních skupin může být použito spektroskopie. Biotin je možno zjistit pomocí avidinu vázaného na různou hlásiči skupinu (obvykle radioaktivní nebo f1uorescenční skupinu nebo enzym). Enzymové hlásiči skupiny mohou být obecně zjištovány přísadou substrátu (obecně po určitou dobu), po níž následuje spektroskopická nebo jiná analysa produktů reakce.

Ke zjištění přítomnosti nebo nepřítomnosti rakoviny prsu se obecně porovnává signál detekovaný z hlásící skupiny, která • · zůstává vázána na pevný nosič, se signálem, který odpovídá předem stanovené mezní hodnotě prokázané z nenádorové tkáně. V jednom vhodném provedení je mezní hodnotou průměrný střední signál, získaný inkubací imobi1 izovanbé protilátky se vzorky od pacientů bez rakoviny prsu. Obecně je možno považovat vzorky generující signál, který je o tři směrodatné odchylky nad předem stanovenou mezní hodnotou za pozitivní pro rakovinu prsu. Podle jiného výhodného provedení se mezní hodnota určuje pomocí křivky Receiver Operátor Curve způsobem, který popsali Sackett a kol. (Clinical Epidemiology: A Basic Science for Clinical Medicine, str. 106 až 107 [Littel Brown and Co.], 1935). Při tomoto provedení se může mezní hodnota stanovit z vynesené křivky párů tří pozitivních měr (například citlivosti) a falešných pozitivních měr (100% specifičnost), které odpovídají každé pozitivní mezní hodnotě pro výsledek diagnostického testu. Mezní hodnota křivky, která je nejblíže k hoi— nímu levému okraji (tedy hodnota, která zahrnuje největší plochu) je nejpřesnější mezní hodnotou a vzorek generující signál, který je vyšší než mezní hodnota stanovená tímto způsobem, může být považována za pozitivní. Alternativně může být mezní hodnota posunuta doleva podél vynesené křivky k minimalizaci falešné pozitivní míry, nebo doprava k mimalizaci falešnou negativní míru. Obecně se považuj e vzorek generující signál, který je vyšší než mezní hodnota, stanovená tímto způsobem, za pozitivní pro rakovinu prsu.

V podobném provedení se zkouška provádí formou průtočného nebo proužkového testu, přičemž je prot i 1át ka i mobi1 i zována na membráně, jako je nitrocelulóza. Při průtočném testu prochází polypeptid uvnitř vzorku vázaný ke imobi1 izované protilátce membránou jako vzorek. Druhá, značená protilátka se pak váže na komplex proti 1átka-polypeptid a jako roztok obsahující druhou protilátku protéká membránou. Detekce vázané druhé protilátky se pak může provést jak shora popsáno. Při formě proužkového testu, se ponoří jeden konec membrány, na kterou je • · protilátka vázána, do roztoku obsahujícího vzorek.. Vzorek proniká membránou oblastí obsahující druhou protilátku a oblastí imobi1 izované protilátky. Koncentrace druhé protilátky v oblasti imobi1 izované protilátky indikuje přítomnost rakoviny prsu. Koncentrace druhé protilátky na této straně vytváří obvykle obrazec, jako je linie, kterou lze pozorovat vizuálně. Nepřítomnost takového obrazce indikuje negativní výsledek. 0becně se množství protilátky, imobi1 izované na membráně, volí k vytváření vizuálně rozeznatelného obrazce, když biologický vzorek obsahuje množství polypeptidu, které by bylo postačující k vytvoření pozitivního signálu v sendvičovém testu dvou protilátek ve shora uvedené formě. Množství imobi1 izované protilátky na membráně se s výhodou volí přibližně 25 ng až 1 pg, výhodněji přibližně 50 ng až 1 pg. Takové testy se dají provádět s velmi malým množstvím biologického vzorku.

Přítomnost nebo nepřítomnost rakoviny prsu se může stanovit vyhodnoceném hladiny mRNA kódující zde popsaný polypeptid specifický pro rakovinu prsu v biologickém vzorku (například biopsie, mastektomie a/nebo vorek krve pacientky) vůči předem stanovené mezní hodnotě. Takového vyhodnocení lze dosáhnout pomocí řady způsobů známých pracovníkům v oboru, jako je například hybridizace in sítu a zesílení reakce polymerázového řetězce.

Reakce polymerázového řetězce může být použito k zesílení sekvencí z cDNA připravené z RNA, která je izolovaná z uvedených biologických vzorků. Primery specifické pro sekvence pro použití v takovém zesilování mohou být konstruovány na základě sekvencí poskytovaných v kterékoli SEQ ID NO: 1, 11-86 a 142297 a jsou obchodním produktem nebo se mohou syntetizovat. V případě B18Ag1, jak zde uvedeno, je vhodným párem primerů B18Ag1-2(5'ATG GCT ATT TTC GGG GGC TGA CA) (SEQ ID NO:126) a B18Ag1-3(5' CCG GTA TCT CCT CGT GGG TAT T (SEQ ID NO: 127). Produkty reakce PCR se pak mohou separovat gelovou elektro9 · • · ···· · · · ·

- 22 forézou a zviditelnit způsoby známými pracovníkům v oboru. Zesílení se obvykle provádí na vzorcích získaných ze k sobě patřících párů tkáně (nádorové nebo nenádorové tkáně od stejného jedince) nebo získaných ze k sobě nepatřících párů tkáně (nádorové nebo nenádorové tkáně od různých jedinců). Zesilovací reakce se provádí s výhodou na několika zředěních cDNA zahrnujících dva řády velikosti. Dvojnásobný nebo větší nárůst exprese v několika zředěních nádorového vzorku v porovnání se stejným zředěním nenádorového vzorku je považováno za pozitivní .

Zde použitý výraz primer/sonda specifické pro molekulu DNA/RNA (primer/probe specific for DNA/RNA molecule) znamená sekvenci oligonukleotidů, která je nejméně přibližně z 80 % identická, s výhodou alespoň přibližně z 90 % a nejvýhodněji alespoň přibližně z 95 % identická s příslušnou molekulou DNA/ RNA. Primery a/nebo sondy, kterých může být s užitkem použito v diagnostických způsobech podle vynálezu, mají s výhodou nejméně přibližně 10 až 40 nukleotidů. Ve výhodném provedení mají polymerázové řetězcové reakční primery alespoň 10 sdružených nukleotidů molekuly DNA/RNA kódující jeden z polypeptidů podle vynálezu. S výhodou obsahují oligonukleidové sondy k použití v diagnostických způsobech podle vynálezu nejméně přibližně 15 sdružených oligonuk1eotidů molekuly DNA/RNA, kódující jeden z polypeptidů podle vynálezu. Způsoby testů jak založených na PCR tak založených na hybridizaci in sítu, jsou v oboru dobře známy.

Konvenční protokoly RT-PCR používající agarového a ethidiumbromidového vybarvování ve snaze definovat genovou specifičnost se nehodí k vývoji diagnostického kitu vzhledem k času a úsilí učinit je kvantitativními (například konstrukcí křivek sycení nebo titrace) a jejich prosazení vzorku. Tomuto problému se čelí vývojem postupů, jako je průběžná (reál time) RT PCR, která umožňuje provádění v jednotlivých zkumavkách a může • A být okamžitě převedena k použití ve formě 96-důlkových destiček. Přístrojové vybavení k provádění těchto způsobů je obchodním produktem společnosti Perkin Elmer/Applied Biosystems Division. Alternativně může být použito jiných výkonných testů používajících značené vzorky (například digoxygeninem) v kombinaci se značenými protilátkami (například fluorescencí, radioaktivitou) takových vzorků při vývoji testů s 96-důlkovými destičkami.

Ještě pro jiné způsoby zjištování přítomnosti nebo nepřítomnosti rakoviny prsu, může být použito jednoho nebo několika popsaných polypeptidů v kožních testech. Zde použitý termín kožní test je jakákoli zkouška provedená přímo na pacientce, při které se měří reakce hypersensitivity zpožděného typu (delayed-type hypersensitivity DTH) (jako je opuchnutí, zrudnutí nebo dermatitida) po intradermální injekci jednoho nebo několika shora popsaných polypeptidů. Takové injekce lze dosáhnout použitím jakéhokoli vhodného zařízení postačujícího k uvedení do styku polypeptidů nebo polypeptidů s kožními buňkami pacientky, jako je tuberkuli nová injekční stříkačka nebo 1 ml injekční stříkačka. Reakce se s výhodou měří alespoň 45 hodin po injektáži, výhodněji po 48 až 72 hodinách.

Reakce DRH je buňkami zprostředkovaná imunitní odezva, která je větší u pacientek, které byly předem vystaveny protilátkovému testu (tedy imunogenní části použitého polypeptidů nebo jeho varianty). Odezva se může měřit vizuálně za použití měřítka. Má-li odezva průměr větší než přibližně 0,5 cm, s výhodou větší než 5,0 cm, jde o pozitivní odezvu, indikativní pro rakovinu prsu.

Zde popsané specificky nádorové polypeptidy jsou s výhodou formulovány pro použití ke kožnímu testu jako farmaceutické prostředky obsahující alespoň jeden polypeptid a fyziologicky přijatelný nosič, jako je voda, solanka, alkohol nebo pufr. Takové prostředky obsahují obvykle jeden nebo několik shora popsaných polypeptidů v množství 1 pg až 100 pg, s výhodou přibližně 10 pg až 50 pg v objemu 0,1 ml. S výhodou je nosičem, použitým v takových farmaceutických prostředcích, solný roztok s vhodnými konzervačními prostředky, jako je fenol nebo Tween 80 ™.

Podle dalších hledisek vynálezu mohou být postup rakoviny a/nebo odezva na léčení rakoviny prsu sledovány prováděním shora uvedených testů během určité doby a vyhodnocováním změny úrovně odezvy (například množstvím zjištěného polypeptidů nebo mRNA, nebo v případě kožních testů rozsahem zjištěné imunitní odezvy). Testy se mohou provádět například každý měsíc po dobu jednoho až dvou roků. Obecně jde o postup rakoviny u pacientek, u kterých odezva s časem vzrůstá. Naproti tomu rakovina nepostupuje, jestliže detekovaný signál zůstává konstantní nebo s časem klesá.

Podle dalšího hlediska vynálezu může být zde popsaných sloučenin použito k imunoterapii rakoviny prsu. Při tom se do farmaceutických prostředků nebo vakcin s výhodou začleňují sloučeniny (kterými jsou polypeptidy, protilátky nebo molekuly nukleových kyselin). Farmaceutické prostředky obsahují jednu nebo několik takových sloučenin a fyziologicky vhodný nosič. Vakciny mohou obsahovat jeden nebo několik polypeptidů a zesilovač imunitní odezvy, jako je adjuvant nebo liposom (do kterých je sloučenina začleněna). Farmaceutické prostředky a vakciny mohou přídavně obsahovat uvolňovací systém, jako jsou biologicky odbouratelné mi kroku!ičky, popsané například v amerických patentových spisech číslo 4 897 268 a 5 075 109. Farmaceutické prostředky a vakciny podle vynálezu mohou obsahovat další sloučeniny, včetně jednoho nebo několika oddělených po1ypept i dů.

Alternativně může vakcina obsahovat DNA kódující jeden • «· * · · · · ·· nebo několik shora popsaných polypeptidů tak, že polypeptid je generován in šitu. V takových vakcinách může být DNA obsažena v řadě uvolňovacích systémů známých pracovníkům v oboru, včetně expresních systémů nukleové kyseliny, bakteriálních a virových expresních systémů. Vhodné expresní systémy nukleových kyselin obsahují potřebné sekvence DNA k expresi v pacientce (jako je vhodný promotorovy a teminální signál). Bakteriální uvolňovací systémy zahrnují podávání bakterií (jako je Bacil1us-Calmette-Guerrin), který expresuje imugenní část polypeptidu na povrchu buňky. Podle výhodného provedení může být DNA zavedena pomocí virového expresního systému (například vakcinia nebo jiný virus neštovic, retrovirus nebo adenovirus), což může zahrnovat použití nepatogenního (defekt ivního) replikačně kompetentního viru. Techniky vnášení odpovídájících DNA do takových expresních systémů jsou pracovníkům v oboru známé. DNA může být také obnažena, jak popsáno například v literatuře (Ulmer a kol. Science 259, str. 1745 až 1749, 1993) a oživena (Cohen, Science 259, str. 1691 až 1692, 1993). Uvolňování obnažené DNA může být zvýšeno povlečením DNA do biologicky odbouratelných kuliček, které se účinně dopravují do buněk.

Zatímco ve farmaceutických prostředcích může být použito jakéhokoli, pracovníkům v oboru známého nosiče, mění se typ nosiče podle způsobu podání. Pro parenterální podání stejně jako pro subkutánní injekce, je nosičem s výhodou voda, solanka, alkohol, tuk, vosk nebo pufr. K orálnímu podání může být použito kteréhokoli ze shora uvedených nosičů, jako je manitol, laktóza, škrob, stearát hořečnatý, sacharin sodný, mastek, celulóza, glukóza, sacharóza a uhličitan hořečnatý. Jako nosičů pro farmaceutické prostředky podle vynálezu lze použít také biologicky odbouratelných mikrokuliček (například polylaktát, pol ygl ykol át).

Ve vakcinách podle vynáležu lze použít řady adjuvantů nespecificky zlepšujících imunitní odezvu. Většina adjuvantů

• 4 • · · obsahuje látku určenou ke chránění antigenu proti rychlému katabolismu, jako je hydroxid hlinitý nebo minerální olej a stímulátor imunitní odezvy, jako jsou proteiny odvozené od lipidu A3 Bortadella pertussís nebo Mycobacteri um tuberculosis. Vhodné adjuvanty jsou obchodně dostupné, jako například Freunďs Incomplete Adjuvant a Complete Adjuvant (Difco Laboratories, Detroid, MI), Merck Adjuvant 65 (Merck and Company, lne. Rahway, NJ), alum. biologicky odbouratelné mi kroku!ičky, monofosforyl lipid A a quil A. Jako adjuvantů může být použito také cytokinů, jako je GM-CSF nebo inter1eukin-2, -7, nebo -12.

Uvedených farmaceutických prostředků se může používat například k terapii rakoviny prsu pacientů. Pojmem pacient se zde míní teplokrevný živočich, s výhodou člověk. Pacient může a nemusí být napaden rakovinou prsu. Uvedených farmaceutických prostředků může být tudíž použito k prevenci rozvoje rakovi ny prsu nebo k ošet řování pacientů napadených rakovinou prsu. K prevenci rozvoje rakoviny prsu se může pacientovi podávat farmaceutický prostředek nebo vakcina obsahující jeden nebo několik polypeptidů podle vynálezu. Alternativně je možno podávat obnaženou DNA nebo plasmid nebo virový vektor kódující polypeptid. K léčení pacienta s rakovinou prsu může farmaceutický prostředek nebo vakcina obsahovat jeden nebo několik polypeptidů, protilátek nebo nukleotidových sekvencí komplementárních s DNA kódující polypeptid, jak zde popsáno (například antimediátorová RNA nebo antimediátorové deoxyribonukleotidové ol i gonukleot i dy).

Cesty podání a dávkování se budou lišit od jedince k jedinci. Obvykle mohou být farmaceutické prostředky podávány injekčně (například intrakutánně, intramuskulárně, intravenosně nebo subkutánně), intranasálně (například vdechováním) nebo orálně. Podávat lze 1 až 10 dávek v 52-týdenní lhůtě. S výhodou se podává 6 dávek v 1 měsíčních intervalech a posléze se může podávat posilovači vakcinace. Pro jednotlivé pacienty mo• ·· ·· · ·· · · • · · · · · · · · · · · • ·· ·· · · - · * hou být vhodné alternativní postupy.

Vhodnou dávkou je nožství sloučeniny, které, je-li podáno jak shora popsáno, je schopné vyvolat proti nádorovou imunitní odezvu. Takovou odezvu lze sledovat měřením proti nádorových protilátek pacienta nebo na vakcině závislým generováním cytolytických efektorových buněk schopných zničit pacientovy nádorové buňky in vitro. Takové vakciny by měly být také schopny způsobit imunitní odezvu, která vede ke zlepšenému klinickému výsledku (například k četnějším remisím, k úpné nebo částečnému nebo delšímu přežití bez onemocnění) u vakciovaných pacientů ve srovnání s pacienty nevakciovánými. Ve farmaceutických prostředcích a vakcinách obsahujících jeden nebo několik polypeptidů, je obsah každého obsaženého polypeptidu přiblžně 100 pg až 5 mg. Vhodné velikosti dávek se mění podle hmotnosti pacienta, typicky však jsou přibližně 0,1 ml až přibližně 5 ml.

Vynález objasňují, nijak však neomezují následující příklady praktického provedení pomocí přiložených obrázků.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Příprava cDNA specifických pro nádor prsu, pomocí Diferenciál Display RT-PCR

Tento příklad objasňuje způsob přípravy cDNA molekul kódujících pro nádor prsu specifické polypeptidy za použití diferenciálního displejového snínítka

A. Příprava cDNA R18Ag1 a charakterizace exprese mRNA

Připraví se vzorky tkání z nádorové a nenádorové tkáně pacienta s rakovinou prsu, která byla potvrzena pathologií po odebrání pacientovi. Ze vzorků se extrahují normální RNA a ná- 28 • ·

dorové RNA a rnRNA se izoluje a převede se na cDNA pomocí zakotveného primeru 3'(dT)i2AG (SEQ ID N0:130). Pak se provede diferenciální displej PCR za použití náhodně voleného primeru (CTTCAACCTCf SEQ ID N0;103). Podmínky zesílení jsou standardní pufr obsahující 1,5 mM MgClž, 20 pmol primeru, 500 pmol dNTP a 1 jednotku Taq DNA polymerázy (Perkin-Elmer, Branchburg, NJ). Provede se 40 zesilovacích cyklů za použití denaturace při teplotě 94 °C po dobu 30 sekund, 1-minutové prodlevy při teplotě 42 °C a prodloužení 30 sekund při teplotě 72 ⁰C. Získá se peptidová mapa RNA obsahující 76 zesílených produktů. Ačkoli peptidová mapa RNA nádorové tkáně prsu je více než z 98% identická s peptidovou mapou normální tkáně prsu, opakovaně se pozoruje pásmo specifické pro peptidovou mapu RNA obrazce nádoru. Toto pásmo se vyřízne stříbrem zbarveným gelem, subklonuje se do T-vektoru (Novagen, Madison, WI) a sekvencuje se.

Sekvence cDNA, označovaná jako B18Ag1, je v SEQ ID NO:1). Průzkumem databáze GENBANK a EMBL se zjišfuje, že fragment B18Ag1 na počátku klónovaný, je ze 77 % identický s endogenním lidským retrovirovým elementem S71, kterým je zkomolený retrovirový element homologický se Simian Sarcoma Virus (SSV). S71 obsahuje neúplný gag gen, část pol genu a LTR-podobnou strukturu 3'terminálu (Werner a kol. Virology 174, str. 225 až 238, 1990). B18Ag1 je také z 64 % identický se SSV v oblasti odpovídající místu P30 (gag). B18Ag1 obsahuje tři oddělené a neúplné čtecí rámce zahrnující oblast, která vykazuje značnou homologii s řadou gag proteinů retrovirů, které infikují savce. Kromě toho není S71 právě uvnitř gag genu, avšak zabírá několik kilobází sekvence zahrnující LTR.

Primery PCR specifické pro B18Ag1 se syntetizují pomocí směrnic pro počítačovou analysu. Zesílení RT PCR (30 sekund při teplotě 94 °C, 30 sekund při 60 °C —>42 °C, 30 sekund při teplotě 73 °C ve 40 cyklech) potvrzuje, že B18Ag1 představuje aktuální sekvenci rnRNA přítomnou ve vysoké míře v pacientově «Μ · · • · · · nádorové tkání prsu. Použitými primery v zesílení jsou B18Ag11(CTG CCT GAG CCA CAA ATG)(SEQ ID N0:128) a B18Ag1-4(CCG GAG GAG GAA GCT AGA GGA ATA)(SEQ ID NO: 129) a koncentrace 3,5 mM hořčíku a hodnota pH 8,5 a B18Ag1-2 (ATG GCT ATT TTC GGG GCC TGA CA) (SEQ ID NO:126) a B18Ag1-3 (CCG GTA TCT CCT CGT GGG TAT T) (SEQ ID NO:127) a 2 mM hořčíku při hodnotě pH 9,5. Tytéž pokusy ukázaly krajně nízké až neexistující hladiny exprese v nenádorové tkáni prsu tohoto pacienta (obr. 1). RT-PCR zkoušek se pak použije k důkazu, že B18Ag1 mRNA jsou obsaženy v devvíti jiných vzorcích nádoru prsu (od brazilských a amerických pacientů) chybí však nebo jsou obsaženy v krajně snížené míře, v normální tkáni prsu odpovídající každé pacientky s rakovinou. Analysa RT-PCR také ukázala, že transkript B18Ag1 není přítomen v různých normálních tkáních (včetně lymfatických uzlin, myokardu a jater) a je přítomen v poměrně nízké míře v PBMC a plicní tkáni. Přítomnost B18Ag1 MRNA ve vzorcích nádoru prsu a její nepřítomnost ve vzorcích z normální tkáně prsu byla potvrzena Nortehrn blot analysou (obr. 2).

Diferenciální exprese B18Ag1 v nádorové tkáni prsu byla také potvrzena testy RNázové ochrany. Obr. 3 ukazuje hladinu mediátorové RNA B18Ag1 v různých typech tkání zjištěnou různý1 až 12 představují vzorky 25 představují různé vzorky až 27 představují normální mi testy RNázové ochrany. Pásma normální tkáně prsu, pásma 13 až nádorových tkání prsu, pásma 26 vzorky prostaty, pásma 28-29 představují nádorové vzorky prostaty, pásma 30 až 32 představují nádorové vzorky tlustého střeva, pásmo 33 představuje normální aortu, pásmo 34 představuje normální tenké střevo, pásmo 35 představuje normální pokožku, pásmo 36 představuje normální lymfatickou uzlinu, pásmo 37 představuje normální vaječník, pásmo 38 představuje normální játra, pásmo 39 představuje normální kosterní svalstvo, pásmo 40 představuje první normální vzorek žaludku, pásmo 41 představuje druhý normální vzorek žaludku, pásmo 42 představuje normální plíce, pásmo 43 představuje normální ledviny, pás30 mo 44 představuje normální slinivku. Porovnání mezi experimenty je usnadněno zařazením pozitivní kontroly RNA nadbytku známého β-laktinu v každém testu a normalizováním výsledků různých testů, s respektováním této pozitivní kontroly.

RT-PCR a analysa Southern Blot prokázaly přítomnost loku B1SAg1 v lidské genomické DNA jako jediného endogenního retrového elementu. Genomický klon o přibližně 12 až 18 kilobázích byl izolován pomocí počáteční sekvence B18Ag1 jako sondy. Izolovány byly také 4 subklony Xbal digescí. Přídavné retrovirové sekvence získané z konců Xbal digescí těchto klonů (lokalizovaných jak patrno z obr. 4), jsou SEQ ID N0:3 až SEQ ID N0:10, kde SEQ ID N0:3 ukazuje umístění sekvence označené 10 na obr. 4, SEQ ID N0:4 ukazuje umístění sekvence označené 11 až 29, SEQ ID N0:5 ukazuje umístění sekvence označené 3, SEQ ID N0:6 ukazuje umístění sekvence označené 6, SEQ ID N0:7 ukazuje umístění sekvence označené 12, SEQ ID N0:8 ukazuje umístění sekvence označené 13, SEQ ID N0:9 ukazuje umístění sekvence označené 14 a SEQ ID N0:10 ukazuje umístění sekvence označené 11 až 22.

Následné studie prokázaly, že 12 až 18 kilobází genomického klonu obsahuje ret rovi rový element o přibližně 7,75 kilobázích, jak patrno z obr. 5A a 5B. Sekvence tohoto retrovirového elementu je patrná v SEQ ID N0:141. Kótovaná čára v horní části obr. 5A představuje sekvenci negativního řetězce DNA retrovirového genomového klonu. Box pod touto čarou vykazuje polohu vybraných restričních míst. šipkami jsou vyznačeny různé překrývající se klony použité k sekvencování retrovirového elementu. Směr šipek vyznačuje, zda jednořetězcová subklonová sekvence odpovídá negativnímu nebo pozitivnímu řetězci DNA. Obr. 5B je schéma retrovirového elementu obsahujícího B18Ag1, vyznačující organizaci virových genů uvnitř elementu. Otevřené boxy odpovídají předvídaným čtecím rámcům začínajícím methioninem, jež se nacházejí v elementu. Je znázorněn každý ze šes31

•« · ·« • · · · · · · ti pravděpodobných čtecích rámců, což je patrno vlevo od boxů, s rámci 1-3 odpovídajícími rámcům nacházejícím se ve stejném řet ězc i.

Při použití cDNA SEQ ID N0:1 jako sondy, se získá delší cDNA (SEQ ID N0:227), která obsahuje nepatrné nukleotidové rozdíly (menší než 1 %) ve srovnání s genomickou sekvencí patrnou v SEQ ID NO:141,

B. Příprava molekul cDNA kódujících jiné polypeptidy specifické pro rakovinu prsu

Připraví se normální RNA a nádorová RNA a mRNA se izoluje a převede se na cDNA pomocí zakotveného 3' primeru (dT)i2AG, jak shora popsáno. Pak se provede diferenční displej PCR pomocí náhodně volených primerů SEQ ID NO:87 až 125. Podmínky zesilování jsou stejné jak shora uvedeno a pásma, jež jsou specifická pro nádorovou mapu RNA, se vyříznou stříbrem zbarveným gelem, subk1onovaným bud do T-vektoru (Novagen, Michigan, WI) nebo do vektoru pCRII (Invitrogen, San Diego, CA) a sekvencují se. Sekvence j sou zajištěny v SEQ ID N0:11-SEQ ID NO:86. Ze 79 izolovaných sekvencí je 67 nových (SEQ ID N0:11 až 26 a 29 až 77) (též obr. 6 až 20).

V dalších studiích se získají rozšířené sekvence DNA (SEQ ID NO: 290) pro antigen B15Ag1 (původně identifi kované parciální sekvence SEQ ID NO:27). Výsledkem porovnání sekvence SEQ ID NO: 290 se sekvencemi v genové bance je homologie se známým lidským aktivinovým genem β-Α.

Následné studie identifikovaly dalších 146 sekvencí (SEQ ID NO:142 až 289), z nichž 115 se jevilo jako nové (SEQ ID NO: 142,143,146-152, 154-166, 168-176, 178-192, 194-198, 200-204, 206, 207, 209-214, 216, 218, 219, 221-240, 243-245, 247, 250, 251, 253, 255, 257-266, 268, 269, 271-273, 275, 276, 278

280, 281, 284, 288 a 291). Podle nejlepších příhlašovatelných vědomostí nebylo dosud o žádné z identifikovaných sekvencí známo, že je ve větší míře expresována v lidské nádorové tkáni prsu než v normální tkáni prsu.

V dalších studiích bylo izolováno šest různých sestřihových forem antigenu B11Ag1, přičemž každá z různých sestřihových forem obsahovala mírně se lišící verse kódující rámec B11Ag1. Sestřihové spojovací sekvence definují individuální exony, které v různých obrazcích a uspořádáních vytvářejí různé sestřihové formy. Ke zkoumání expresního obrazce každého exonu byly zkonstruovány primery pomocí RT-PCR jak dále popsáno. Zjistilo se, že každý exon vykazuje stejný expresní obrazec jako původní klon B11Ag1, přičemž exprese byla specifická pro nádor prsu, prostaty nebo varlat pro izolovaný protein kódující exony N0:292 až 297.

Zjištěné sekvence cDNA jsou zajištěny v SEQ ID

Příklad 2

Příprava DNA B18Ag1 z lidské genomické DNA

Tento příklad ilustruje přípravu DNA B18Ag1 z lidské genomické DNA.

DNA B18Ag1 je možno připravit z 250 ng lidské genomické DNA, za použití 20 pmol primerů specifických pro B18Ag1, 500 pmol dNTPS a jedné jednotky polymerázy Taq DNA (Perkin Elmer, Branchburg, NJ), za použití následujících zesilovacích parametrů: denaturace 30 sekund při teplotě 94 °C, zchlazení ponořováním při teplotách 60 až 42 ^eC po 2 °C stupních v každých dvou cyklech a s prodlevou 30 sekund při teplotě 72 °C. Poslední přírůstek (chlazení při teplotě 42 °C) se cykluje 25 krát. Selekce primerů se provádí počítačovou analysou. Syntetizovanými primery jsou B18Ag1-1, B18Ag1-2, B18Ag1-3, B18Ag1-4 « ·9 99 · 9· 9· • · * < · 9 9 9 9 « «. ·

9 9 · * 9 9 · · > É ·

999 99 9 · · <t <

• 99 «9 99 ·9Φ 99 99

Páry primerů, kterých lze použít jsou 1+3, 1+4, 2+3 a 2+4.

Po elektroforéze může být vystřiženo pásmo odpovídající DNA B18Ag1 a klonováno do vhodného vektoru.

Příklad 3

Příprava DNA B18Ag1 z nádorové cDNA prsu

Tento přiklad ilustruje přípravu DNA B18Ag1 zesílením z lidské nádorové cDNA prsu.

První řetězec cDNA se syntetizuje z RNA připravené z lidské nárové tkáně prsu v reakční směsi obsahující 500 ng póly A+RNA, 200 pmol primeru (T)i₂AG (tedy TTT TTT TTT TTT AG) (SEQ ID N0:130), reversního transkriptázového pufru IX prvního řetězce, 6,7 mM DTT, 500 mmol dNTP a 1 jednotky AMV nebo reversní transkriptázy MMLV (od jakéhokoli dodavatele jako je GibcoBRL [Grand Island NY]) v konečném objemu 30 μΐ. Po syntese prvního řetězce se cDNA zředí přibližně 25-krát a 1 pl se použije k zesílení popsanému v příkladu 2. Ačkoli některé páry primerů mohou vést k heterogenní populaci transkriptů, primery B18Ag1-2 (ATG GCT ATT TTC GGG GGC TGA CA) (SEQ ID NO:126) a B18Ag1-3 (5’CCG GTA TCT CCT CGT GGG TAT T) (SEQ ID NO:127) poskytují jediný zesilovací produkt 151 bp.

Příklad 4

Identifikace epitopů B-buněk a T-buněk B18Ag1

Tento příklad ilustruje identifikaci epitopů B18Ag1. Sekvence B18Ag1 se může skrínovat pomocí různých počítačových algoritmů. Ke zjištění epitopů B-buněk se může sekvence skrínovat na hodnoty hydrofobicity a hydrofi 1 icity způsobem, který popsal Hopp (Prog. Clin. Biol. Res 172B, str. 367 až 377, • ·· * · · · · *· ··· · · ··· · · · · • ·· · · · ····

1985) nebo alternativně Cease a kol. (J. Exp. Med. 164, str. 1779 až 1784, 1986) nebo Spouge a kol. (J. Journal 138, str. 204 až 212, 1987). Další epitopy třídy II MHC (prot i 1át ky nebo B-buňky) lze předpovědět pomocí programů jako je AMPHI (Margalit a kol. (J. Immunol. 138, str. 2213, 1987) nebo způsoby Rothbard a Taylor (například EMBO J.7, str. 93, 1988).

Jakmile jsou peptidy (15-20 délka aminokyselin) těmito způsoby identifikovány, je možno jednotlivé peptidy syntetizovat pomocí automatizovaného zařízení pro syntesu peptidů (obchodně dostupného od výrobců jako je Perkin Elmer/Applied Biosystems Division, Foster City,CA) a způsoby jako je Merrifieldova syntesa. Po syntese je možno peptidů použít ke skrínování sér pocházejících bud od normálních nebo nádorovým onemocněním prsů postižených pacientů ke zjištění, zda pacienti, postižení rakovinou prsu, mají protilátky reaktivní s peptidy. Přítomnost takových protilátek u pacienta s rakovinou prsu by potvrzovala imunogenecitu příslušného epitopu specifické B-buňky. Peptidy je možno také testovat na schopnost vytvářet geny nebo sérologii nebo humorální imunitu u zvířat (myší, krys, králíků, šimpansů) po imunizaci in vivo. Vytváření pro peptid specifického antiséra po takové imunizaci potvrzuje dále imunogenicitu příslušného epitopu specifické B-buňky.

k identifikování B18Ag1, j ež j sou příklad Rammence

K identifikaci epitopů T-buněk, se může sekvence B18Ag1 skrínovat pomocí různých počítačových algoritmů, které se hodí aminokyselinových motivů 8-10 v sekvenci schopny vázat H1A molekuly MHC třídy I (naa kol., Immunogenetics 41, str. 178 až 228,

1995). Po syntese je možno takové peptidy testovat na jejich schopnost vázat se na třídu I MHC pomocí normálních vazebních zkoušek (Sette a kol., J. Immunol. 153, str. 5586 až 5592, 1994) a významněji se mohou testovat na jejich schopnost generovat cytotoxické T-buňky reaktivní na antigen po stimulaci in vitro pacientových nebo normálních periferálnich mononukleo• · ··· · · · ·· · · · · • ·· ·· · · · · · • · · ·· ·· · · · · · ·· vých buněk pomocí například způsobů, které popsal Bakker a kol. (Cancer Res. 55, str.533O až 5334, 1995; Visseren a kol. (J. Immunol. 154, str. 3991 až 3998 1995; Kawakami a kol. (J. Immunol. 154, str. 3961 až 1968, 1995; a Kast a kol. (J.Immunol. 152, str. 3904 až 3912,1994). Úspěšné vytvářeni in vitro T-buněk schopných zabíjet autologové nádorové buňky (obsahující stejné molekuly MHC třídy I) po stimulaci peptidů in vitro dále potvrzuje imunogenicitu protilátky B18Ag1. Kromě toho se může takových peptidů použit k vytvářeni myšího peptidu a B18AG1 reaktivních cytotoxických T-buněk po imunizaci in vitro transgenů od myší pro expresi příslušného lidského haplotypu MHC třídy I (Vitiello a kol., I. Exp. Med. 173, str. 1007 až 1015).

Následně je uveden seznam předpověděných epitopů B-buněk a T-buněk B18Ag1 stržených podle předpověděné protilátky vázající HLA MHC třídy I:

Výhodné motivy Th (epitopů B-buněk) (SEQ ID N0:131 až 133)

SSGGRTFDDFHRYLLVGI

QGAAQKPINLSKXIEVVQGHDE

SPGVFLEHLQEAYRIYTPFDLSA

Přdepověděné motivy HLA A2.1 (epitopy T-buněk) (SEQ ID N0:134 až 140)

YLLVGIQGA

GAAQKPINL

NLSKXIEVV

EVVQGHDES

HLQEAYRIY

NLAFVAQAA

FVAQAAPDS

Příklad 5

Charakterizace nádorových genů prsu zjištěná diferenciálním displejem PCR

Specifičnost a citlivost nádorových genů prsu objevená diferenciálním displejem PCR se zjištuje pomocí RT-PCR. Tento způsob umožnil rychlé semikvant itativní vyhodnocování exprese mRNA nádorových genů prsu bez použití velkých množství RNA. Pomocí primerů, specifických pro geny, byly zkoumány expresní úrovně mRNA v řadě tkání, včetně S nádorů prsu, 5 normálních prsů, 2 nádorů prostaty, 2 nádorů tlustého střeva, 1 plicního nádoru a 14 jiných normálních lidských tkání od dospělých jedinců, včetně normální prostaty, tlustého střeva, ledvin, jater, plic, vaječníků, slinivky, kosterních svalů, pokožky, žaludku a varlat.

K zajištění semikvant itativni povahy RT-PCR, bylo použito β-aktinu jako vnitřní kontroly pro takové zkoumané tkáně. Serie zředění prvního řetězce cDNA se připraví analysou RT-PCR provedenou pomocí primerů specifických pro β-aktin. Pak byla vybrána zředění, která umožňovala zesílení v lineárním pořadí β-aktinové šablony, a která byla dostatečně citlivá reflektovat rozdíl v počátečním počtu kopií. Za těchto podmínek byly stanoveny hladiny β-aktinu pro každou reversní transkripční reakci z každé tkáně. Kontaminace DNA byla minimalizována zpracováním DNásou a zaručením negativního výsledku, bylo-li použito cDNA, která byla připravena bez přísady reversní transkri pt ázy.

V každé variantě tkání byly stanoveny expresní hladiny mRNA pomocí primerů specifických pro geny. Dosud bylo úspěšně vyzkoušeno pomocí RT-PCR 38 genů, z nichž 5 vykazuje dobrou specifičnost a citlivost pro nádory prsu (B15AG-1, B31GA1b, B38GA2a, B11A1a a B18AG1a). Obr. 21A a 21B obsahují výsledky ··· · · · ·· · · · * • ·· ·· · ···· tří z těchto genů: B15AG-1, (SEQ ID NO:27), B31GA1b (SEQ ID N0:148) a B38GA2a (SEQ ID NO:157). V tabulce I jsou shrnuty expresní hladiny všech těchto testovaných genů v normál ní prsní tkáni a v prsních nádorech a také v jiných tkáních.

Tabu1ka I

Procento protilátek rakoviny prsu, jež jsou expresovány v různých tkáních

Přeexpresováno v tkáních prsu 84%

Prsní tkáně

Stejně expresováno v normálecha nádoru 16%

Přeexpresováno v tkáních prsu,avšak nikoli v žádné normální tkáni 9%

Ostatní tkáně

Přeexpresováno v tkáních prsu,avšak expresováno v několika normálních tkáních 30%

Přeexpresováno v tkáních prsu,avšak stejně expresováno ve všech normálních tkáních 61%

Z uvedeného vyplývá, že ačkoli zde byla popsána specifická provedení pro ilustraci, může být provedena řada různých modifikací v rozsahu vynálezu.

Průmyslová využitelnost

Sekvence nukleotidů a polypeptidů pro výrobu vakcin a farmaceutických prostředcích k prevenci a léčení rakoviny prsu. Polypeptidů může být také použito k výrobě sloučenin, jako jsou protilátky užitečné k diagnóze a sledování šíření rakoviny prsu u pacientů. _e--~,

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1, Izolovaná molekula DNA, sestávající (a) ze sekvence nukleotidů volených ze souboru zahrnujícího SEQ ID N0:1, 3-26, 28-77, 142, 143, 146-152, 154-166, 168-176, 178-192, 194-198, 200-204, 206, 207, 209-214, 216, 218, 219, 221-240, 243-245, 247, 250, 251, 253, 255, 257-266, 268, 269, 271-273, 275, 276, 278, 280, 281, 284, 288 a 291-297;

(b) z varianty této sekvence nukleot idů, která obsahuje jednu nebo několik substitucí, vypuštění, začlenění a/nebo modififikací nukleotidů a méně než 20 % nukleotidových pozic, takže antigenové nebo imunogenní vlastnosti polypeptidů, zakódovaného sekvencí nukleotidů jsou zachovány, nebo (c) ze sekvence nukleotidů kódující epitop polypeptidů kódovaného alespoňjednou sekvencí volenou ze souboru zahrnujícího SEQ ID N0:1, 3-26, 28-77, 142, 143, 146-152, 154-166, 168-176, 178-192, 194-198, 200-204, 206, 207, 209-214, 216, 218, 219, 221-240, 243-245, 247, 250, 251, 253, 255, 257-266, 268, 269, 271-273, 275, 276, 278, 280, 281, 284, 288 a 291-297.
2. Izolovaná molekula DNA kódující epitop polypeptidů, přičemž polypeptid je zakódován nukleotidovou sekvencí, která (a) hybridizuje na sekvenci, volené ze souboru zahrnujícího SEQ ID N0:1, 3-26, 28-77, 142, 143, 146-152, 154-166, 168-176,

178-192, 194-198, 200-204, 206, 207 , 209-214, 216, 218, 219, 221-240, 243-245, 247, 250, 251 , 253, 255, 257-266, 268, 269, 271-273, 275, 276, 278, 280, 281 , 284, 288 a 291-2( 97 za pří smých podmí nek a

(b) je alespoň z 80 % identická se sekvencí volenou ze souboru zahrnujícího SEQ ID N0:1, 3-26, 28-77, 142, 143, 146-152, 154166, 168-176, 178-192, 194-198, 200-204, 206, 207, 209-214, 216, 218, 219, 221-240, 243-245, 247, 250, 251, 253, 255, 257266, 268, 269, 271-273, 275, 276, 278, 280, 281, 284, 288 a

291-297.

• *
3. Izolovaná molekula DNA kódující epitop polypeptidu, přičemž polypeptid je zakódován

a) sekvencí nukleotidů tkanskribovanou ze sekvence SEQ ID N0:141, nebo

b) variantou uvedené sekvence nukleotidů, která obsahuje jednu nebo několik nukleot i dových substitucí, vypuštění, začlenění a/nebo modififíkací nukleotidů na méně než 20 % nuk 1eotidových pozic, takže antigenové nebo imunogenické vlastnosti polypeptidu zakódovaného sekvencí nukleotidů jsou zachovány.
4. Izolovaná molekula DNA nebo RNA obsahující nukleotidovou sekvenci komplementární k molekule DNA podle nároku 1 až 3.
5. Rekombinantní expresní vektor obsahující molekulu DNA podle nároku 1 až 3.
6. Hostící buňka transformovaná nebo transfektováná expresním vektorem podle nároku 5.
7. Polypeptid obsahující sekvenci aminokyselin kódovanou molekulou DNA podle nároku 1-3
8. Polypeptid podle nároku 7 obsahující epitop aminokyselinové sekvence zakódované alespoň jednou nukleotidovou sekvencí, volenou ze souboru zahrnujícího SEQ ID N0:1, 3-26, 2877, 142, 143, 146-152, 154-166, 168-176, 178-192, 194-198,

200-204, 206, 207, 209-214, 216, 218, 219, 221-240, 243-245,

247, 250, 251, 253, 255, 257-266, 268, 269, 271-273, 275, 276, 278, 280, 281, 284, 288 a 291-297.
9. Monoklonální protilátka, která se váže na polypeptid podle nároku 7.
10. Způsob zjištování přítomnosti rakoviny prsu, v y z n a č u j í c í s e t í m, že se zjišfuje v biologickém vzorku alespoň jeden polypeptid podle nároku 7 a z toho se určuje přítomnost rakoviny prsu pacienta.
11. Způsob zjištování přítomnosti rakoviny prsu, vyznačující se t í m , že se zjištuje v biologickém vzorku alespoň jeden polypeptid kódovaný sekvencí nukleotidů, volených ze souboru zahrnujícího SEQ ID NO: 78-S6, 144, 145,

153, 167, 177, 193, 199, 205, 208, 215, 217, 220, 241, 242,

246, 248, 249, 252, 256, 267, 270, 274, 277, 279, 282, 283,

285-287, 289, 290 a sekvencemi, které je hybridizují kromě toho za přísných podmínek.
12. Způsob podle nároku 10 nebo 11, v y z n a č u j ící se t í m, že biologický vzorek je částí nádoru prsu.
13. Způsob podle nároku 10, vyznačující se t í m , že stupeň detekce zahrnuje kontakt ování biologického vzorku s monoklonální protilátkou podle nároku 9.
14. Způsob podle nároku 11,vyznačuj ící se t í m , že stupeň detekce zahrnuje kontaktování biologického vzorku s monoklonální protilátkou, která se váže na polypeptid zakódovaný sekvencí nukleotidů, volených ze souboru zahrnujícího SEQ ID NO: 78-86, 144, 145, 153, 167, 177, 193, 199, 205, 208, 215, 217, 220, 241, 242, 246, 248, 249, 252, 256, 267, 270, 274, 277, 279, 282, 283, 285-287, 289, 290 a sekvencemi, které je kromě toho hybridizují za přísných podmínek.
15. Způsob zjištování přítomnosti rakoviny prsu, vyznačující se t í m, že se zjištuje v biologickém vzorku molekula RNA kódující alespoň jeden polypeptid podle nároku 7 a z toho se určuje přítomnost rakoviny prsu pacienta.
16. Způsob zjištování přítomnosti rakoviny prsu, vyznačující se t í m, že se zjištuje v biologickém vzorku alespoň jedna molekula RNA kódující polypeptid zakódo41 váný sekvencí nuk 1eot i dů,

ID NO: 78-86, 215, 217, 220, 274, 277, 279,

144, 145, 241, 242, 282, 283, volených ze souboru zahrnujícího SEQ 153, 167, 177, 193, 199, 205, 208, 246, 248, 249, 252, 256, 267, 270, 285-287,289, 290 a sekvencemi, které je kromě toho hybridizují čuje přítomnost rakoviny za přísných podmínek a z toho se prsu pacienta.

urZpůsob podle nároku 15 nebo 16, v t í m, že biologický vzorek je částí y z n a č u j nádoru prsu.
18. Způsob podle nároku 15, vyznačující se t í m, že detekční stupeň zahrnuje

a) přípravu cDNA z molekul RNA v biologickém vzorku a

b) specifické zesílení molekul cDNA, které jsou schopné kódovat alespoň část polypeptidů podle nároku 7, a z toho se určuje přítomnost rakoviny prsu pacienta.
19. Způsob podle nároku 16, vyznačující se t í m, že detekční stupeň zahrnuje

a) přípravu cDNA z molekul RNA v biologickém vzorku a

b) specifické zesílení molekul cDNA, které jsou schopné kódovat alespoň část polypeptidů zakódovaného sekvencí nukleotidů, volených ze souboru zahrnujícího SEQ ID NO: 78-86, 144, 145,

153, 167, 177, 193, 199, 205, 208, 215, 217, 220, 241, 242,

246, 248, 249, 252, 256, 267, 270, 274, 277, 279, 282, 283,

285-287, 289, 290 a sekvencemi, které je kromě toho hybridizují za přísných podmínek a z toho se určuje přítomnost rakoviny prsu pacienta.
20. Způsob sledování postupu rakoviny prsu, vyznačující se t í m, že se (a) napřed zjištuje množství alespoň jednoho polypeptidů podle nároku 7 v biologickém vzorku, (b) krok (a) se opakuje a nato (c) se porovnává množství zjištěných polypeptidů v kroku (a) a (b) a tím se sleduje postup rakoviny prsu pacienta.
21. Způsob sledování postupu rakoviny prsu, vyznačující se t i m, že se (a) napřed se zjištuje množství alespoň jednoho polypeptidů v biologickém vzorku, přičemž je polypeptid zakódován sekvencí nukleotidů, volených ze souboru zahrnujícího SEQ ID NO: 78-86, 144, 145, 153, 167, 177, 193, 193, 205, 208, 215, 217, 220, 241, 242, 246, 248, 249, 252, 256, 267, 270, 274, 277, 279, 282, 283, 285-287, 289, 290 a sekvencemi, které je hybridizují za přísných podmínek (b) krok (a) se opakuje a (c) porovnává se množství zjištěných polypeptidů v kroku (a) a (b) a tím se sleduje postup rakoviny prsu u pacienta.
22. Způsob podle nároku 20 nebo 21, v y z n a č u j i c i se t i m, že biologický vzorek je částí nádoru prsu.
23. Způsob podle nároku 20, vyznačující se t i m, že detekční stupeň zahrnuje uvedení do styku části biologického vzorku s monoklonální protilátkou podle nároku 9.
24. Způsob podle nároku 21,vyznačující se t í m, že detekční stupeň zahrnuje uvedení do styku části biologického vzorku s monoklonální protilátkou, která se váže na polypeptid zakódovaný sekvencí nukleotidů, volených ze souboru zahrnujícího SEQ ID NO: 78-86, 144, 145, 153, 167, 177, 193, 199, 205, 208, 215, 217, 220, 241, 242, 245, 248, 249, 252, 256, 267, 270, 274, 277, 279, 282, 283, 285-287, 289, 290 a sekvencemi, které je hybridizují za přísných podmínek.
25. Způsob podle nároku 20, vyznačující se t í m, že polypeptid obsahuje epitop sekvence aminokyseliny, kódovaný alespoň jednou sekvencí nukleotidů volenou ze souboru zahrnujícího SEQ ID NO: 1, 3-26, 28-77, 142, 143, 146-152, 154-166, 168-176, 178-192, 194-198, 200-204, 206, 207, 209-214, 216, 218, 219, 221-240, 243-245, 247, 250, 251, 253,

255, 257-266, 268, 269, 271-273, 275, 276, 278, 280, 281,

284, 288 a 291-297.
26. Způsob sledování postupu rakoviny prsu vyznačující se t í m, ž e (a) se napřed zjištuje množství alespoň jedné molekuly RNA kódující polypeptid podle nároku 7 v biologickém vzorku, (b) krok (a) se opakuje a nato (c) se porovnává množství zjištěných molekul RNA v kroku (a) a (b) a tím se sleduje postup rakoviny prsu pacienta.
27. Způsob podle nároku 26, vyznačující se t í m, že detekční stupeň zahrnuje

a) přípravu cDNA z molekul RNA v biologickém vzorku a

b) specifické zesílení molekul cDNA, které jsou schopné kódovat alespoň část polypeptidů podle nároku 7.
28. Způsob sledování postupu rakoviny prsu, vyznačující se tím,že (a) se napřed zjištuje množství alespoň jedné molekuly RNA kódující polypeptid zakódovaný sekvencí nukleotidů volených ze souboru zahrnujícího SEQ ID NO: 78-86, 144, 145, 153, 167,

177, 193 199, 205, 208, 215, 217, 220, 241, 242, 246, 248,

249, 252, 256, 267, 270, 274, 277, 279, 282, 283, 285-287,

289, 290 a sekvencemi, které je hybridizují za přísných podmínek, (b) krok (a) se opakuje a nato (c) se porovnává množství zjištěných molekul RNA v kroku (a) a (b) a tím se sleduje postup rakoviny prsu pacienta.
29. Farmaceutický prostředek, vyznačující se t í m, že obsahuje polypeptid podle nároku 7 a fyziologicky při j atelný nosí č.
30. Farmaceutický prostředek k inhibici rozvoje rakoviny prsu, vyznačující se t í m, že obsahuje póly44 peptid a fyziologicky přijatelný nosič, přičemž polypeptid je zakódovaný sekvencí nukleotidů volených ze souboru zahrnujícího SEQ ID NO: 78-36, 144, 145, 153, 167, 177, 193, 199, 205, 208, 215, 217, 220, 241, 242, 246, 248, 249, 252, 256, 267, 270, 274, 277, 279, 282, 283, 285-287, 289, 290 a sekvencemi, které je hybridizují za přísných podmínek.
31. Vakcina obsahující polypeptid podle nároku 7 a enhancer imunitní odezvy.
32. Vakcina obsahující molekulu DNA podle nároku 1 až 3.
33. Vakcina obsahující rekombinantηí expresní vektor obsahující molekulu DMA podle nároku 1 až 3.
34. Vakcina k inhibici rozvoje rakoviny prsu obsahující polypeptid a enhancer imunitní odezvy ,vyznačuj ící se t í m, že obsahuje polypeptid zakódovaný sekvencí nukleotidů volených ze souboru zahrnujícího SEQ ID NO: 78-86, 144, 145, 153, 167, 177, 193, 199, 205, 208, 215, 217, 220, 241, 242, 246, 248, 249, 252, 256, 267, 270, 274, 277, 279, 282, 283, 285-287, 289, 290 a sekvencemi, které je hybridizují za přísných podmínek.
35. Farmaceutický prostředek podle nároku 29 až 30 k použití při výrobě léčiva k inhibici rozvoje rakoviny prsu pacienta, zahrnující podávání pacientovi.
36. Vakcina podle nároku 31 až 34 k použití při výrobě léčiva k inhibici rozvoje rakoviny prsu pacienta.
37. Diagnostický kit vyznačující se t í m, že obsahuje

a) jednu nebo několik monoklonálních protilátek podle nároku 9

b) detekční reakční činidlo.
38. Diagnostický kit v y z n obsahu j e

a) alespoň jednu monoklonální polypeptid zakódovaný sekvenc zahrnujícího SEQ ID NO: 78-86 199, 205, 208, 215, 217, 220,

256, 267, 270, 274, 277, 279, 282, 283, 285-287,289 a 290 a

b) detekční reakční činidlo.

č u j í c í se t í m, že protilátku, která se váže na nukleotidů volenou ze souboru 144, 145, 153, 167 , 177, 193, 241, 242, 246, 248, 249, 252,
39. Diagnostický kit podle nároku 37 nebo 38, vyznačující se t í m , že monoklonální protilátka nebo protilátky jsou imobi1 izovány na pevném nosiči.
40. Diagnostický kit, vyznačující se tím, že obsahuje dva reakční primery polymerázového řetězce, přičemž alespoň jeden z primerů je specifický pro molekulu RNA podle nároku 4.
41. DiagnostickýKit podle nároku 40, vyznačuj ící se t í m, že alespoň jeden z reakčních primerů polymerázového řetězce obsahuje nejméně přibližně 10 sousedících nukleotidů molekuly RNA podle nároku 4.
42. Diagnostický kit vyznačující se tím, že obsahuje dva reakční primery polymerázového řetězce, přičemž alespoň jeden z primerů je specifický pro molekulu RNA kódující polypeptid zakódovaný sekvencí nukleotidů, volenou ze souboru zahrnujícího SEQ ID NO: 78-86, 144, 145, 153, 167, 177, 193, 199, 205, 208, 215, 217, 220, 241, 242, 246, 248, 249, 252, 256, 267, 270, 274, 277, 279, 282, 283, 285-287, 289 a 290.
43.

DiagnostickýKit podle nároku 42, vyznačuj ící * «

9 · • · se t í m, že alespoň jeden z reakčních primerů polymerázového řetězce obsahuje nejméně přibližně 10 sousedících nukleotidů molekuly RNA kódující polypeptid zakódovaný sekvencí nukleotidů volenou ze souboru zahrnujícího SEQ ID NO: 7S-86, 144,

145, 153, 167, 177, 193, 1 99 , 205, 208, 215, 217, 220, 241 , 242, 283, 246, 248, 249, 252, 285-287,289 a 290. 256, 267 , 270, 274, 277, 279, 282, 44. Di agnost i cký kit, v y z n a č u j ící s e t í m, že obsahuje alespoň jednu oligonukleotidovou sondu, přičemž o-

1 igonukleidová sonda obsahuje nejméně přibližně 15 sousedících nukleotidů molekuly DNA podle nároku 4.
45. Diagnostický kit, vyznačující se tím, že obsahuje alespoň jednu ol igonukleotidovou sondu, přičemž o1 igonukleidová sonda obsahuje nejméně přibližně 15 sousedících

nukleot i dů NO: 78-86, 217, 220, sekvence DNA volené ze souboru 177, 193 249, 252, 89 a 290. zahrnujícího SEQ ID 199, 205, 208, 215, 144, 145 241, 242, 282, 283, , 153, 167, 246, 248, 285-287, 2 256, 267, 270, 274, 277, 279, 46. Di agnost i cký kit, v y z n a č u j í c í se t í m,

že obsahuje alespoň jednu olígonukleotidovou sondu specifickou pro molekulu DNA podle nároku 4.
47. Diagnostický kit podle nároku 46, vyznačuj ící se t í m, že oligonukleotidová sonda obsahuje nejméně přibližně 15 sousedících nukleotidů molekuly DNA podle nároku 4.
48. Diagnostický kit, vyznačující se tím, že obsahuje alespoň jednu oligonukleotidovou sondu specifickou pro sekvenci DNA, volenou ze souboru zahrnujícího SEQ ID NO: 78-86, 144, 145, 153, 167, 177, 193, 199, 205, 208, 215, 217, 220, 241, 242, 246, 248, 249, 252, 256, 267, 270, 274, 277, 279, 282, 283, 285-287,289 a 290.