CN103784422B - 一种载rtPA纳米粒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种载rtPA纳米粒及其制备方法，该载rtPA纳米粒包含一内核,核芯为rtPA,核壳主要由PLGA和油酸修饰的Fe3O4组成，核壳表面覆盖或部分覆盖壳聚糖膜和附于壳聚糖膜表面的cRGD。该纳米粒对血栓具有靶向性，能够在MRI监控下，同时具有靶向治疗和诊断双重作用。
Description
技术领域
本发明属于药物制剂领域，涉及一种载rtPA纳米粒及其制备方法，具体涉及一种Fe3O4-PLGA-rtPA/CS-cRGD纳米粒。
背景技术
rtPA(RecombinantTissuePlasminogenActivator)又称为重组组织型纤溶酶原激活剂，又名艾通立、爱通立Actilyse，是主要用于急性心肌梗塞的溶栓治疗；血流不稳定的急性大面积肺栓塞的溶栓疗法的药物。rtPA是一种糖蛋白，可激活纤溶酶原成为纤溶酶，当静脉使用时，在循环系统中只有与其纤维蛋白结合后才表现出活性，其纤维蛋白亲和性很高。当和纤维蛋白结合后，本品被激活，诱导纤溶酶原成为纤溶酶，溶解血块，但对整个凝血系统各组分的系统性作用是轻微的，因而不会出现出血倾向。本品不具抗原性，所以可重复使用。用于急性心肌梗塞的溶栓治疗；用于血流不稳定的急性大面积肺栓塞的溶栓疗法；用于急性缺血性脑卒中的溶栓治疗时，必须在脑梗塞症状发生的3小时内进行治疗，且需经影像检查（如CT扫描）除外颅内出血的可能。
动脉血栓形成,如颈总动脉、冠状动脉、下肢动脉血栓形成等作为一种严重威胁人类生命的疾病，愈来愈受到广大医学工作者的重视。早期准确诊断、及时治疗能挽救缺血坏死组织，减少并发症，降低死亡率。超声、CT、MRI等新技术的发展，为动脉血栓形成的诊断提供了一种新的成像方法，但对其早期准确诊断仍然受限。动脉血栓形成的治疗方法主要包括溶栓治疗和介入治疗，后者虽然疗效快，但具有创伤性，而在早期仍主张溶栓治疗。然而，目前多用的溶栓剂如组织型纤溶酶原激活剂(tPA)和rtPA缺乏组织特异性，不能选择性地作用于病变部位，大剂量用药易引发出血或溶栓后血管再闭塞，限制了它的临床应用。将溶栓药物靶向血栓部位，增加血栓局部药物浓度，从而特异、高效地溶解血栓是目前溶栓治疗的一个研究热点。超声微泡造影剂作为载体工具运送基因、药物，以及在微泡表面结合配体对靶组织进行靶向显影已获得了巨大成功。分子影像学是传统的医学影像技术与现代分子生物学相结合而产生的一门新兴交叉学科，是非侵入性地对活体内的参与生理和病理过程的分子，进行定性或定量可视化的一种全新的科学观察方法与手段。在分子和细胞水平，对影像的深入研究，将带来方便快捷高质量的影像技术，将有可能解决目前研究方面存在的诸多问题。MRI分子影像学具有较高的组织分辨率、多参数、多方位成像等优点，近年来发展迅速，目前，MRI的分辨率已达到微米级，可同时获得解剖及生理信息，这些正是核医学、光学、超声成像等成像技术的劣势。因此，靶向造影剂和分子影像学尤其是MRI分子影像学的发展有望促进动脉血栓的准确诊断及溶栓治疗技术的发展。
发明内容
本发明提供了一种载rtPA纳米粒，包含一内核,核芯为rtPA,核壳主要由PLGA和油酸修饰的Fe3O4组成，核壳表面覆盖或部分覆盖壳聚糖膜和附于壳聚糖膜表面的cRGD。
上述本发明的载rtPA纳米粒，PLGA和油酸修饰Fe3O4的投料质量比为100：1～1.5,优选100：1.3，壳聚糖与cRGD的质量比为4～6:1，优选5：1，所述rtPA占纳米粒总重量的0.1～0.2%，优选0.12%。
本发明的另一目的在于提供了一种制备载rtPA纳米粒的方法，其中，所述载rtPA纳米粒包含一内核,核芯为rtPA,核壳主要由PLGA和油酸修饰的Fe3O4组成，核壳表面覆盖或部分覆盖壳聚糖膜和附于壳聚糖膜表面的cRGD，该方法包括以下步骤：
1）CS膜的制备：将CS溶解于1%醋酸溶液中，脱去气泡后，倒入成膜模具中，流延平整，放入烘箱中烘干，再浸泡于5%氢氧化钠溶液中，然后用双蒸水漂洗直至pH=7，得到CS膜，自然风干备用。
2）CS-cRGD膜的制备：摩尔比为1.5:1的适量的EDC和NHS溶于PBS溶液中，用氢氧化钠将其pH调节至7，加入cRGD后与步骤1）的CS膜反应，得到CS-cRGD膜，用双蒸水反复洗涤以除去未反应的物质，自然风干备用。
3）载rtPA纳米粒的制备：采用双乳化溶剂挥发法，将PLGA和油酸修饰Fe3O4溶解于二氯甲烷中，作为油相，加入1mg/mL的rtPA溶液作为内水相，冰浴冷却，超声声震，得到棕色产物，取步骤2）制得的CS-cRGD溶解于0.5%的醋酸溶液中，再与3%PVA溶液混合均匀，后加入到棕色产物中作为外水相，搅拌，并调节pH至6-7，搅拌均匀，最后加入2%异丙醇溶液，室温下搅拌使二氯甲烷充分挥发，离心分离洗涤得到Fe3O4-PLGA-rtPA/CS-cRGD纳米粒，冷冻干燥得到载rtPA纳米粒。
在一优选实施方案中，本发明的一种制备载rtPA纳米粒的方法，包括以下步骤：
1）CS膜的制备：100mgCS充分溶解于10ml1%醋酸溶液中，超声波脱去气泡后，倒入四氟乙烯模具中，流延平整，放入40℃烘箱中烘干，再将其取出置入5%氢氧化钠溶液中浸泡半小时，用双蒸水充分漂洗直至pH=7，得到CS膜自然风干备用。
2）CS-cRGD膜的制备：摩尔比为1.5:1的适量的EDC和NHS溶于PBS溶液中，用氢氧化钠将其pH调节至7，加入0.05mM的cRGD和步骤1）的CS膜，在4℃下反应24小时，得到CS-cRGD膜，用双蒸水反复洗涤以除去未反应的物质，自然风干备用。
3）载rtPA纳米粒的制备：采用双乳化溶剂挥发法，称取100mgPLGA和100uLFe3O4溶解于2ml二氯甲烷中，作为油相，加入0.2mL1mg/mL的rtPA溶液作为内水相，冰浴超声声震，得到棕色产物，取50mg步骤2）制得的CS-cRGD溶解于5ml0.5%的醋酸溶液中，再与5ml3%PVA溶液混合均匀后加入到棕色产物中作为外水相，搅拌，并调节pH至6-7，均质5分钟，最后加入20mL2%异丙醇溶液，室温下搅拌2小时以使有机溶剂充分挥发，离心洗涤Fe3O4-PLGA-rtPA/CS-cRGD纳米粒，冷冻干燥即得。
术语：“cRGD”定义为精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸环肽；“PLGA”定义为聚乳酸羟基乙酸；“CS”定义为壳聚糖，“rtPA”定义为重组组织型纤溶酶原激活剂；“EDC”定义为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺；“NHS”定义为N-羟基琥珀酰亚胺；“PBS溶液”又称磷酸盐缓冲溶液；PVA定义为聚乙烯醇，这些术语都是本领域惯用的。“CS-cRGD-Fe3O4-PLGA-rtPA纳米粒”与“Fe3O4-PLGA-rtPA/CS-cRGD纳米粒”具有等同含义，均是代表本发明的rtPA纳米粒的基本结构。
本发明的rtPA纳米粒,有益效果:本发明的rtPA纳米粒即Fe3O4-PLGA-rtPA/CS-cRGD纳米粒具有较高的载药量，更好的靶向性和成像质量，更好的发挥靶向诊断血栓和靶向溶栓的双重作用和功能。
附图说明
图1载rtPA纳米粒Fe3O4-PLGA-rtPA/CS-cRGD结构示意图
图2纳米粒透射电镜图。
图3Fe3O4-PLGA-rtPA/CS-cRGD纳米粒的激光扫描共聚焦图像
图4载rtPA纳米粒中rtPA的释放时间累积曲线
图5各试验组血栓的病理切片，其中，(a)Fe3O4-PLGA组,(b)Fe3O4-PLGA-rtPA组,(c)Fe3O4-PLGA-rtPA/CS组,(d)Fe3O4-PLGA-rtPA/CS-cRGD组
图6各试验组体外溶栓实验效果
图7不同纳米粒溶液的SNR值对比及T2*信号差异图
图8不同纳米粒溶液的R2*值与Fe3O4浓度变化趋势图
图9不同纳米粒体外靶向血栓的MR图
图10载rtPA纳米粒体内靶向溶栓的MRI图，a1-e1为T2加权像，a2-e2为Vs3DI图像，其中，a1和a2为注射纳米粒前，b1与b2，c1与c2，d1与d2，e1与e2分别代表注射后10min、20min、40min、60min时的T2加权像与Vs3DI图像
具体实施方式
以下实施例用于进一步理解本发明的实质,但不以此限制本发明的范围。
实施例1
1）CS膜的制备：100mgCS充分溶解于10ml1%醋酸溶液中，超声波脱去气泡后，倒入四氟乙烯模具中，流延平整，放入40℃烘箱中烘干，再将其取出置入5%氢氧化钠溶液中浸泡半小时，用双蒸水充分漂洗直至pH=7，得到CS膜自然风干备用。
2）CS-cRGD膜的制备：摩尔比为1.5:1的适量的EDC和NHS溶于PBS溶液中，用氢氧化钠将其pH调节至7，将0.05mM的cRGD和CS膜共同加入，4℃下反应24小时，得到CS-cRGD膜，用双蒸水反复洗涤以除去未反应的物质，自然风干备用。经分析测试CS与cRGD的质量为5：1。
3）载rtPA纳米粒的制备：采用双乳化溶剂挥发法，称取100mgPLGA和含1.3mg100uL油酸修饰Fe3O4溶解于2ml二氯甲烷中，作为油相，加入0.2mL1mg/mL的rtPA溶液作为内水相，冰浴超声声震，得到棕色产物，50mgCS-cRGD溶解于5ml0.5%的醋酸溶液中，再与5ml3%PVA溶液混合均匀后加入到棕色产物中作为外水相，搅拌，并调节pH至6-7，均质5分钟，最后加入20mL2%异丙醇溶液，室温下搅拌2小时以使有机溶剂充分挥发，离心洗涤Fe3O4-PLGA-rtPA/CS-cRGD纳米粒，冷冻干燥备即得。经测试，rtPA占整个纳米粒总重量的0.12%，。
对比例1含Fe3O4的PLGA纳米粒的制备
采用双乳化溶剂挥发法（水/油/水法），称取100mgPLGA和100uLFe3O4溶解于2ml二氯甲烷中，作为油相（O），加入0.4ml双蒸水（作为内水相）后超声声震60s，再将棕色产物加入到10mLof3%PVA溶液中（外水相）均质5分钟（15000rpm），最后加入20mL2%异丙醇溶液，室温下搅拌2小时以使有机溶剂充分挥发。离心洗涤Fe3O4-PLGA纳米粒，冷冻干燥备用。上清液都收集备检测。
对比例2Fe3O4-PLGA-rtPA纳米粒制备
方法与对比例1的方法类似，只是将内水相换成0.2mL1mg/mL的rtPA溶液，在包含rtPA微球的制备过程中，声震过程需要冰浴，以减少溶栓药物的失活。
对比例3制备含有CS的Fe3O4-PLGA-rtPA纳米粒，
采用双乳化溶剂挥发法（水/油/水法），称取100mgPLGA和100uLFe3O4溶解于2ml二氯甲烷中，作为油相（O），加入0.2mL1mg/mL的rtPA溶液作为内水相，超声声震60s(声震过程需要冰浴，以减少溶栓药物的失活）后得到棕色产物，将CS5ml溶解于0.5%的醋酸溶液中，并将5mlCS溶液和5mlPVA溶液共同作为外水相，将棕色产物加入到外水相中，均质5分钟（15000rpm），在搅拌时将pH调节至6-7，以加强CS对纳米粒表面的被覆，最后加入20mL2%异丙醇溶液，室温下搅拌2小时以使有机溶剂充分挥发。离心洗涤Fe3O4-PLGA纳米粒，冷冻干燥,得到Fe3O4-PLGA-rtPA/CS纳米粒备用。上清液都收集备检测。
实施例2rtPA纳米粒特性测定
1、形态、结构、大小、表面电位、Fe3O4和cRGD携带率的检测
将适量纳米粒子溶于双蒸水中，其形态及分散性用光镜观测，透射电镜观测其内部结构，激光共聚焦检测CS-cRGD膜对纳米粒子的包被（cRGD用FITC标记），粒径及表面电位用激光粒度仪检测。
Fe3O4浓度用原子吸收光谱仪检测。将10mg冻干纳米粒粉末溶解于1ml二甲基亚砜中以溶解掉PLGA膜，用1mLof36%HCl溶液与Fe3O4反应，得到游离的铁离子，用1%HCl.溶液定容至10ml，用原子吸收光谱仪检测其浓度。Fe3O4携带率计算公式=样本中所含Fe3O4量/加入Fe3O4总量×100%。cRGD携带率用流式细胞仪检测。随机计数10000个纳米粒子，测得FITC荧光标记的cRGD携带率。
检测结果：光镜下观测到纳米粒子表面光滑成球形，粒径较均一，分散性好。透射电镜证实Fe3O4均匀分布于纳米粒子壳上，在其外周还可看到一层浅淡的CS-cRGD膜，见图2，透射电镜图(a)Fe3O4-PLGA,(b)Fe3O4-PLGA-rtPA,(c)Fe3O4-PLGA-rtPA/CS,(d)Fe3O4-PLGA-rtPA/CS-cRGD。可见氧化铁（黑箭）相对均匀地分布在纳米壳核上，CS膜（白箭）包裹在纳米粒的表面。
激光共聚焦显微镜证实FITC荧光标记的cRGD均匀分布于Fe3O4-PLGA-rtPA/CS-cRGD纳米粒周围，在纳米粒的周围可以见到环状绿色荧光,粒子内部几乎未见荧光，见图3。，这证实了FITC标记的cRGD成功被覆于纳米粒子表面。平均粒径、表面电位、Fe3O4携带率和rtPA包封率如表1所示。表面被覆了CS-cRGD的纳米粒子粒径稍有增大，当纳米粒子表面被覆了CS-cRGD膜之后其表面电位由负变为正，并且Fe3O4和rtPA的携带率也少有提高。与Fe3O4-PLGA-rtPA/CS相比，表面含FITC的cRGD纳米粒子的波长发生变化，在随机计数的10000个粒子中，有8427个波长发生了变化，即是说cRGD携带率为84.27%。见表1.
2、rtPA包封率及活性测定
在595nm波长处用比色法测得上清液中rtPA含量。rtPA包封率=（加入rtPA总量－上清液中rtPA含量）/加入rtPA总量×100%。rtPA的活性释放采用其特异性生色底物S-2288测得。取5mg冻干粉溶于1mlPBS缓冲液中，37℃水浴，每隔五分钟离心（7500rpm）抽取0.5ml上清液，用S-2288测得其活性大小，再向其中加入0.5mlPBS溶液定容为1ml，放回37℃水浴箱中，继续测量。实验重复三次。
检测结果：rtPA活性释放实验证实Fe3O4-PLGA-rtPA、Fe3O4-PLGA-rtPA/CS和Fe3O4-PLGA-rtPA/CS-cRGD纳米粒子中的rtPA在15分钟以内释放缓慢，到60分钟为止，进入快速释放期，60-100分钟时释放量很少几乎检测不到。Fe3O4-PLGA-rtPA/CS和Fe3O4-PLGA-rtPA/CS-cRGD组中的rtPA释放活性在各个时间点均无明显差异，而在15-100分钟Fe3O4-PLGA-rtPA与Fe3O4-PLGA-rtPA/CS、Fe3O4-PLGA-rtPA/CS-cRGD之间均有显著差异。Fe3O4-PLGA-rtPA组rtPA活性释放量明显低于Fe3O4-PLGA-rtPA/CS和Fe3O4-PLGA-rtPA/CS-cRGD组。包封率见表1，rtPA活性释放见图4。
表1含Fe3O4的PLGA纳米粒特性
3、体外靶向血栓及溶栓实验
用含促凝剂的真空采血管采集健康志愿者静脉全血，37℃水浴2小时至血栓块形成，分别将Fe3O4-PLGA,Fe3O4-PLGA-rtPA,Fe3O4-PLGA-rtPA/CS,和Fe3O4-PLGA-rtPA/CS-cRGD纳米粒溶解于等量PBS溶液中，向各组溶液中加入直径约9mm的血栓块，37℃水浴下30作用分钟后，用流速为20cm/s的PBS缓冲液反复冲洗。将其做病理快速冰冻切片，以观测纳米粒对血栓的靶向。
在体外靶向溶栓实验中，血栓块均切成100mg/块，投入4组不同溶液中反应（游离rtPA溶液、Fe3O4-PLGA-rtPA、Fe3O4-PLGA-rtPA/CS和Fe3O4-PLGA-rtPA/CS-cRGD纳米粒），各组溶液中rtPA含量均一致。在溶栓前、溶栓15分钟、30分钟及60分钟分布用电子天平称重。具体过程：采用蠕动泵（流速为1ml/min）将各组溶液以脉冲注射方式与血栓作用，再用生理盐水持续冲洗。溶栓率（%）=（溶栓前血栓质量-溶栓后血栓质量）/溶栓前血栓质量×100%
体外靶向溶栓实验结果：冰冻切片证实Fe3O4-PLGA-rtPA/CS-cRGD组有大量纳米粒分布于血栓周边，Fe3O4-PLGA-rtPA/CS组有少许纳米粒，而Fe3O4-PLGAandFe3O4-PLGA-rtPA组几乎未观测到血栓周边有纳米粒子。见图5。
体外溶栓试验中各种血栓质量变化如图6所示。与游离rtPA溶液组比较，Fe3O4-PLGA-rtPA,Fe3O4-PLGA-rtPA/CS,andFe3O4-PLGA-rtPA/CS-cRGD组溶栓率在15分钟分别提高了1.88,1.63,and1.88倍，30分钟时分别为2.03,2.17,and2.64倍，60分钟时分别为1.98,2.41,and3.05倍。结果表明各试验组在15,30and60min有明显的差别(F=20.514,99.608,325.351,allwithP<0.05)。
4、含Fe3O4的PLGA纳米粒的MR性能检测
为检测含Fe3O4的PLGA纳米粒的MR性能，将6组（琼脂糖溶液，Fe3O4-PLGA,Fe3O4-PLGA-rtPA,Fe3O4-PLGA-rtPA/CS，Fe3O4-PLGA-rtPA/CS-cRGD和Fe3O4溶液）溶液置于EP管中（每一组中的Fe3O4浓度都一致0.01umol/L），由于PLGA纳米粒有沉降趋势，每组均采用0.9%琼脂糖溶液定容为4ml。将各EP管均置于装满水的塑料容器中，以减少伪影。采用1.5TMR扫描仪，头部线圈，GRE序列，TR=520ms,TE=10.7ms。翻转角=45°,层厚=3mm，选取各管中心位置作为ROI（100体素），测得各组平均信号强度（SI），信噪比（SNR）=SI/噪声强度。实验重复三次。
R2*值得测量：将各组含有Fe3O4的溶液固定于0.9%琼脂糖中，各组浓度均保持一致且递增（0.01-0.05umol/L），采用1.5TMR扫描仪，头部线圈，T2*-weightedpulse序列，TR=35ms,TE选取16个值（从1.5ms递增到18.8ms），矩阵320×192,激励次数(NEX)=1,层厚=1.5mm。数据导入ADW4.2工作站，利用R2*软件测量各组中的R2*值。实验重复三次取平均值。ROI为100像素。
测试结果：MR扫描显示各组含Fe3O4的溶液的信号及信噪比（SNR）与琼脂糖溶液比较均有明显降低，说明本文制备的含Fe3O4-PLGA纳米粒子可显著降低T2*信号(见图8)。琼脂糖组和Fe3O4溶液组与Fe3O4-PLGA纳米组之间的SNR有显著差异(F=2266.369,P<0.05)，各组含Fe3O4的PLGA纳米粒子之间SNR无显著差异(F=0.959,P>0.05)，各组含Fe3O4的PLGA纳米粒子与游离Fe3O4溶液组无显著差异(P>0.05)，见图7。R2*值随着Fe3O4浓度的增加（0.01to0.05umol/L）而增加，见图8，在相同浓度下，各组之间的R2*值差异不大，这证实PLGA、CS及CS-cRGD不会对Fe3O4的弛豫性能产生干扰。
5、体外靶向血栓的MR扫描
血栓块均切成9mm/块，共3块，置于装有PBS液的塑料瓶中，分别投入Fe3O4-PLGA-rtPA、Fe3O4-PLGA-rtPA/CS和Fe3O4-PLGA-rtPA/CS-cRGD纳米粒，反应15分钟后用PBS液冲洗干净，然后置于25ml烧杯中并用0.9%琼脂糖溶液包埋。采用3.0TMR扫描，T2*-FFE序列，大鼠动物线圈，扫描参数为：TR=119ms,TE=9ms,翻转角=45°,视野(FOV)=60mm,矩阵512x256,层厚1mm.
MR检测下的体外靶向血栓：在体外靶向血栓实验的MR扫描中，在Fe3O4-PLGA-rtPA/CS-cRGD组可见高信号的血栓周围有一圈信号减低区，Fe3O4-PLGA-rtPA/CS组血栓周围可见少许信号减低区，Fe3O4-PLGA-rtPA组不可见信号减低区（图9）。这证实了Fe3O4-PLGA-rtPA/CS-cRGD纳米粒对血栓的靶向性及显影能力，提示该纳米粒能够在MRI监控下靶向显示血栓，能够应用于血栓的早期诊断。
6、体内靶向溶栓的MR扫描：
用FeCl3诱导SD大鼠腹主动脉血栓形成，暴露腹主动脉，用浸有10%FeCl3溶液的滤纸条包裹3-5分钟，其外层用封口膜包裹，避免FeCl3溶液对周围组织的腐蚀。当血栓形成后，移走滤纸条并用生理盐水反复冲洗腹腔，关闭缝合腹腔。在建模前、建模并通过尾静脉注射1mlFe3O4-PLGA-rtPA/CS-cRGD溶液后10分钟、20分钟、40分钟及60分钟分别行MR扫描。T2-加权序列测定参数:TR=666ms,TE=62ms,FA=90°;FOV=50mm,层面厚度为1mm.Vs3DI序列测定参数:TR=20ms,TE=3ms,FA=12°,FOV=60mm。
测定结果：
MR检测下的体内靶向溶栓：用FeCl3诱导建立SD大鼠腹主动脉血栓模型，体内实验的MR扫描证实SD大鼠腹主动脉血栓成功形成，在注射了Fe3O4-PLGA-rtPA/CS-cRGD纳米粒后10、20、40及60分钟行MRI扫描，扫描序列包括T2加权像及Vs3DI序列图像，T2加权像显示注射纳米粒后10分钟以及20分钟，血栓周围可见信号减低区并逐渐扩大，Vs3DI图像显示40及60分钟后可见血管的部分再通，见图10。说明载rtPA纳米粒能够经过静脉注射，在MRI监控下靶向显示血栓及靶向溶栓，具有靶向诊断和靶向治疗的双重功能。
Claims (8)
1.一种载rtPA纳米粒，包含一内核，核芯为rtPA，核壳主要由PLGA和油酸修饰Fe3O4组成，核壳表面覆盖或部分覆盖壳聚糖CS膜和附于壳聚糖CS膜表面的cRGD，所述纳米粒由以下方法制得，该方法包括以下步骤：
1)CS膜的制备：将CS溶解于1％醋酸溶液中，脱去气泡后，倒入成膜模具中，流延平整，放入烘箱中烘干，再浸泡于5％氢氧化钠溶液中，然后用双蒸水漂洗直至pH＝7，得到CS膜，自然风干备用；
2)CS-cRGD膜的制备：摩尔比为1.5:1的适量的EDC和NHS溶于PBS溶液中，用氢氧化钠将其pH调节至7，加入cRGD与步骤1)的CS膜反应，得到CS-cRGD膜，用双蒸水反复洗涤以除去未反应的物质，自然风干备用；
3)载rtPA纳米粒的制备：采用双乳化溶剂挥发法，将PLGA和油酸修饰Fe3O4溶解于二氯甲烷中，作为油相，加入1mg/mL的rtPA溶液作为内水相，冰浴冷却，超声声震，得到棕色产物，将CS-cRGD溶解于0.5％的醋酸溶液中，再与3％PVA溶液混合均匀，后加入到棕色产物中作为外水相，搅拌，并调节pH至6-7，搅拌均匀，最后加入2％异丙醇溶液，室温下搅拌使二氯甲烷充分挥发，离心分离洗涤得到Fe3O4-PLGA-rtPA/CS-cRGD纳米粒，冷冻干燥得到载rtPA纳米粒。
2.如权利要求1所述的纳米粒，PLGA和油酸修饰Fe3O4的投料质量比为100:1～1.5。
3.如权利要求2所述的纳米粒，PLGA和油酸修饰Fe3O4的投料质量比为100:1.3。
4.如权利要求1所述的纳米粒,壳聚糖与cRGD的质量比为4～6:1。
5.如权利要求4所述的纳米粒,壳聚糖与cRGD的质量比为5:1。
6.如权利要求1所述的纳米粒,所述rtPA占纳米粒总重量的0.1～0.2％。
7.如权利要求6所述的纳米粒,所述rtPA占纳米粒总重量的0.12％。
8.如权利要求1所述的纳米粒,所述方法包括以下步骤，
1)CS膜的制备：100mgCS充分溶解于10ml1％醋酸溶液中，超声波脱去气泡后，倒入四氟乙烯模具中，流延平整，放入40℃烘箱中烘干，再将其取出置入5％氢氧化钠溶液中浸泡半小时，用双蒸水充分漂洗直至pH＝7，得到CS膜自然风干备用；
2)CS-cRGD膜的制备：摩尔比为1.5:1的适量的EDC和NHS溶于PBS溶液中，用氢氧化钠将其pH调节至7，加入0.05mM的cRGD和上步得到的CS膜，在4℃下反应24小时，得到CS-cRGD膜，用双蒸水反复洗涤以除去未反应的物质，自然风干备用；
3)载rtPA纳米粒的制备：采用双乳化溶剂挥发法，称取100mgPLGA和含1.3mg100uL油酸修饰Fe3O4溶解于2ml二氯甲烷中，作为油相，加入0.2mL1mg/mL的rtPA溶液作为内水相，冰浴超声声震，得到棕色产物，取步骤2)的50mgCS-cRGD膜溶解于5ml0.5％的醋酸溶液中，再与5ml3％PVA溶液混合均匀后加入到棕色产物中作为外水相，搅拌，并调节pH至6-7，均质5分钟，最后加入20mL2％异丙醇溶液，室温下搅拌2小时以使有机溶剂充分挥发，离心洗涤Fe3O4-PLGA-rtPA/CS-cRGD纳米粒，冷冻干燥备即得。
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