BR112014007852B1 - Polinucleotídeo isolado modificado e composição farmacêutica - Google Patents

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Atanu Roy
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Suhaib Siddiqi
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Abstract

polinucleotídeo isolado modificado, composição farmacêutica que o compreende e uso do mesmo. a presente invenção refere-se a composições e métodos usando ácidos nucleicos modificados para modular a função celular. os ácidos nucleicos modificados da invenção podem codificar peptídeos, polipeptídeos ou proteínas múltiplas. as moléculas codificadas podem ser usadas como agentes terapêuticos e/ou de diagnóstico.

Description

REFERÊNCIA À LISTAGEM DE SEQUÊNCIA
[0001] O presente pedido está sendo depositado junto com uma Listagem de Sequência em formato eletrônico. O arquivo da Listagem de Sequência, intitulado M009SQLST.txt, foi criado em 3 de outubro de 2012 e tem 9.859 bytes de tamanho. A informação em formato eletrônica da Listagem de Sequência é aqui incorporada a título de referência em sua totalidade.
REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS
[0002] O presente pedido reivindica prioridade para o Pedido de Patente Provisório U.S. No. 61/542.533, depositado em 3 de outubro de 2011, intitulado "Modified Nucleosides, Nucleotides, and Nucleic Acids, and Uses Thereof", cujos conteúdos são aqui incorporados a título de referência em sua totalidade.
CAMPO DA TÉCNICA
[0003] A presente invenção refere-se a composições e métodos usando ácidos nucleicos modificados para modular a função celular. Os ácidos nucleicos modificados da invenção podem codificar peptídeos, polipeptídeos ou proteínas múltiplas. As moléculas codificadas podem ser usadas como agentes terapêuticos e/ou de diagnóstico.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[0004] RNAs de ocorrência natural são sintetizados a partir de quatro ribonucleotídeos básicos: ATP, CTP, UTP e GTP, mas podem conter nucleotídeos pós-transcricionalmente modificados. Ainda, aproximadamente cem modificações de nucleosídeo diferentes foram identificadas em RNA (Rozenski, J., Crain, P. e McCloskey, J. (1999) The RNA Modification Database: 1999 update. Nucl. Acids Res. 27: 196197). O papel de modificações de nucleosídeo sobre o potencial imunoestimulador e sobre a eficiência de tradução de RNA, no entanto, não está claro.
[0005] Há vários problemas com as metodologias anteriores de realização de expressão de proteína. Por exemplo, DNA heterólogo introduzido em uma célula pode ser herdado por células filhas (quer ou não o DNA heterólogo tendo integrado ao cromossomo) ou pela prole. DNA introduzido pode integrar ao DNA genômico de célula hospedeiro com certa frequência, resultando em alterações e/ou dano ao DNA genômico da célula hospedeiro. Ainda, etapas múltiplas podem ocorrer antes de uma proteína ser feita. Uma vez dentro da célula, DNA deve ser transportado para o núcleo, onde ele é transcrito em RNA. RNA transcrito a partir do DNA deve então entrar no citoplasma onde ele é traduzido em proteína. Esta necessidade de etapas de processamento múltiplas cria tempos de latência antes da geração de uma proteína de interesse. Ainda, é difícil obter expressão de DNA em células; frequentemente o DNA entra nas células, mas não é expresso ou não expresso em taxas ou concentrações razoáveis. Isso pode ser um problema particular quando DNA é introduzido em células tais como células primárias ou linhagens de célula modificadas.
[0006] Há uma necessidade na técnica de modalidades biológicas para se endereçar à modulação de tradução intracelular de ácidos nucleicos.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0007] A presente invenção provê, inter alia, nucleosídeos modificados, nucleotídeos modificados e ácidos nucleicos modificados que podem exibir uma resposta imune inata reduzida quando introduzidos em uma população de células, ambos in vivo e ex vivo.
[0008] A presente invenção provê polinucleotídeos que podem ser isolados ou purificados. Esses polinucleotídeos podem codificar um ou mais polipeptídeos de interesse e compreendem uma sequência de número n de nucleosídeos ou nucleotídeos ligados compreendendo pelo menos um nucleosídeo ou nucleotídeo modificado comparado com a estrutura química de um nucleosídeo ou nucleotídeo A, G, U ou C. Os polinucleotídeos podem também conter uma UTR 5’ compreendendo pelo menos uma sequência Kozak, uma UTR 3’ e pelo menos uma estrutura cap 5’. Os polinucleotídeos isolados podem conter ainda uma cauda poli-A e podem ser purificados.
[0009] Os polinucleotídeos isolados da invenção também compreendem pelo menos uma estrutura cap 5’ selecionada do grupo consistindo em Cap0, Cap1, ARCA, inosina, N1-metil-guanosina, 2’fluor-guanosina, 7-desaza-guanosina, 8-oxo-guanosina, 2-amino- guanosina, LNA-guanosina e 2-azido-guanosina.
[00010] Modificações dos polinucleotídeos da invenção podem ser na base do nucleosídeo e/ou porção açúcar dos nucleosídeos que compreendem o polinucleotídeo.
[00011] Em algumas modalidades, a modificação está na nucleobase e é selecionada do grupo consistindo em pseudouridina ou N1- metilpseudouridina.
[00012] Em algumas modalidades, o nucleosídeo modificado não é pseudouridina (^) ou 5-metil-citidina (m5C).
[00013] Em algumas modalidades, modificações múltiplas estão incluídas no ácido nucleico modificado ou em um ou mais nucleosídeo ou nucleotídeo individual. Por exemplo, modificações em um nucleosídeo podem incluir uma ou mais modificações na nucleobase e no açúcar.
[00014] Em algumas modalidades são providos novos blocos de construção, por exemplo, nucleosídeos e nucleotídeos, para a preparação de polinucleotídeos modificados e seu método de síntese e fabricação.
[00015] A presente invenção também provê composições farmacêuticas compreendendo os polinucleotídeos modificados descritos aqui. Esses podem também incluir ainda um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis selecionados de um solvente, solvente aquoso, solvente não aquoso, meios de dispersão, diluente, dispersão, auxiliar de suspensão, agente tensoativo, agente isotônico, agente espessante ou emulsificante, conservante, lipídeo, lipossomo lipidoide, nanopartícula de lipídeo, nanopartículas de núcleo-casca, polímero, peptídeo lipoplexo, proteína, célula, hialuronidase e suas misturas.
[00016] Métodos de uso dos polinucleotídeos e ácidos nucleicos modificados da invenção são também providos. Neste caso, os polinucleotídeos podem ser formulados através de quaisquer meios conhecidos na técnica ou administrados através de qualquer uma de várias vias incluindo injeção através de meios intradérmicos, subcutâneos ou intramuscular.
[00017] Administração dos ácidos nucleicos modificados da invenção pode ser através de duas ou mais doses separadas iguais ou não. Em algumas modalidades, o nível de polipeptídeo produzido pelo indivíduo através da administração de doses separadas do polinucleotídeo é maior do que os níveis produzidos através da administração da mesma dose diária total de polinucleotídeos como uma administração única.
[00018] Detecção dos ácidos nucleicos modificados ou dos polipeptídeos codificados pode ser realizada no fluido corporal do indivíduo ou paciente onde o fluido corporal é selecionado do grupo consistindo em sangue periférico, soro, plasma, ascite, urina, fluido cérebro-espinhal (CSF), esputo, saliva, medula óssea, fluido sinovial, humor aquoso, fluido amniótico, cerume, leite materno, fluido de lavagem broncoalveolar, sêmen, fluido prostático, fluido de Cowper ou fluido pré-ejaculatório, suor, matéria fecal, cabelo, lágrimas, fluido de cisto, fluidos pleural e peritoneal, fluido pericardial, linfo, quimo, quilo, bile, fluido intersticial, menstruação, pus, sebo, vômito, secreções vaginais, secreção de mucosa, água de fezes, suco pancreático, fluidos de lavagem de cavidades nasais, aspiratos broncopulmonares, fluido do blastocélio e sangue do cordão umbilical.
[00019] Em algumas modalidades, administração é de acordo com um regime de dosagem que ocorre durante o curso de horas, dias, semanas, meses ou anos e pode ser obtida usando um ou mais dispositivos selecionados de sistemas de injeção multiagulha, cateter ou sistemas de lúmen e sistemas de ultrassom, elétricos ou baseados em radiação.
[00020] A menos que de outro modo definido, todos os termos técnicos e científicos usados aqui têm os mesmos significados geralmente conhecido por um versado comum na técnica à qual a presente invenção pertence. Métodos e materiais são descritos aqui para uso na presente invenção; outros métodos e materiais adequados conhecidos na técnica podem ser também usados. Os materiais, métodos e exemplos são ilustrativos apenas e não pretendem ser limitantes. Todas as publicações, pedidos de patente, patentes, sequências, registros de banco de dados e outras referências mencionadas aqui são incorporados a título de referência em sua totalidade. No caso de conflito, o presente pedido, incluindo definições, prevalecerá.
[00021] Outras características e vantagens da presente invenção serão aparentes a partir da descrição detalhada e figuras que seguem e a partir das reivindicações.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[00022] Os objetivos, características e vantagens acima e outros serão aparentes a partir da descrição que segue de modalidades particulares da invenção, conforme ilustrado nos desenhos acompanhantes onde caracteres de referência similares se referem às mesmas partes em vistas diferentes. Os desenhos não estão necessariamente em escala, ênfase sendo posta em vez disso dada à ilustração dos princípios de várias modalidades da invenção.
[00023] A FIG. 1 provê o espectro e gráficos dos resultados analíticos para N4-Me-CTP (NTP do composto 1). A Figura 1A provê o espectro de ressonância magnética nuclear (RMN) (Nuclear Magnetic Resonance) em DMSO e a Figura 1B provê o espectro de RMN em D2O, a Figura 1C provê os resultados de espectrometria de massa (MS) (Mass Spectrometry) e a Figura 1D são os resultados de cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) (High Performance Liquid Chromatography) para N4-metilcitidina (N4-Me-citidina, composto 1).
[00024] A FIG. 2 mostra os resultados de HPLC para N4-Me-CTP (NTP de composto 1).
[00025] A FIG. 3 provê os resultados analíticos para 2’-OMe-N,N-di- Me-CTP (NTP de composto 2). A Figura 3A provê o espectro de RMN. A Figura 3B provê os resultados de MS. A Figura 3C provê resultados de HPLC para 2’-O-metil-N4,N4-dimetilcitidina (2’-OMe-N,N-di-Me- citidina, composto 2).
[00026] A FIG. 4 mostra os resultados de HPLC para 2’-OMe-N,N-di- Me-CTP (NTP de composto 2).
[00027] A FIG. 5 provê os resultados de HPLC para 5-metoxicarbo- nilmetóxi-UTP (NTP de composto 3).
[00028] A FIG. 6 provê os resultados analíticos de 3-metil pseudouridina (composto 4). A Figura 6A provê o espectro de RMN de 3-metil pseudouridina (composto 4) e a Figura 6B provê os resultados de HPLC para 3-metil pseudouridina (composto 4).
[00029] A FIG. 7 provê os resultados analíticos de 5-TBDMS-OCH2- citidina (composto 6). A Figura 7A provê o espectro de RMN, a Figura 7B provê os resultados de MS e a Figura 7C provê os resultados de HPLC para 5-TBDMS-OCH2-citidina (composto 6).
[00030] A FIG. 8 provê os resultados analíticos de 5-trifluormetil uridina (composto 8). A Figura 8A provê o espectro de RMN, a Figura 8B provê resultados de MS e Figura 8C provê resultados de HPLC para 5-trifluormetil uridina (composto 8).
[00031] A FIG. 9 provê os resultados de espectro de RMN para 5- (metoxicarbonil)metil uridina (composto 9).
[00032] A FIG. 10 provê um gráfico mostrando a variabilidade de proteína (GSCF; linha B) e citocina (interferon-alfa (IFNa); linha A e fator alfa de necrose de tumor (TNFa); linha C) expressão como função de modificação percentual.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[00033] A presente invenção provê, inter alia, nucleosídeos modificados, nucleotídeos modificados e ácidos nucleicos modificados que exibem propriedades terapêuticas aperfeiçoadas incluindo, mas não limitado a uma resposta imune inata reduzida quando introduzidos em uma população de células.
[00034] Com permanece uma necessidade na técnica de modalidades terapêuticas para se endereçar à miríade de barreiras que circundam a modulação eficaz de tradução intracelular e processamento de polipeptídeos codificando ácidos nucleicos ou seus fragmentos, os inventores mostraram que certas sequências de mRNA modificadas têm o potencial como agentes terapêuticos com benefícios além de apenas evasão, prevenção ou diminuição da resposta imune.
[00035] A presente invenção se direciona a esta necessidade através da provisão de compostos baseados em ácido nucleico ou polinucleotídeos que codificam um polipeptídeo de interesse (por exemplo, mRNA modificado) e que têm características estruturais e/ou químicas que evitam um ou mais dos problemas na técnica, por exemplo, características que são úteis para otimização de agentes terapêuticos baseados em ácido nucleico enquanto retendo integridades estrutural e funcional, superando o limiar de expressão, aperfeiçoando as taxas de expressão, meia-vida e/ou concentrações de proteína, otimizando localização de proteína e evitando biorrespostas prejudiciais tais como a resposta imune e/ou cursos de degradação.
[00036] São providos aqui, em parte, polipeptídeos codificando polinucleotídeos de interesse que foram quimicamente modificados para aperfeiçoar um ou mais da estabilidade e/ou eliminação em tecidos, absorção e/ou cinética de receptor, acesso celular pelas composições, compromisso com maquinário de tradução, meia-vida do mRNA, eficiência de tradução, evasão imune, capacidade de produção de proteína, eficiência de secreção (quando aplicável), acessibilidade para circulação, meia-vida da proteína e/ou modulação do estado, função e/ou atividade de uma célula.
[00037] Os nucleosídeos, nucleotídeos e ácidos nucleicos modificados da invenção, incluindo a combinação de modificações ensinadas aqui, têm propriedades superiores que os tornam mais adequados como modalidades terapêuticas.
[00038] Foi determinado que o modelo "tudo ou nada" na técnica é extremamente insuficiente para descrever os fenômenos biológicos associados com a utilidade terapêutica de mRNA modificado. Os presentes inventores determinaram que para melhorar a produção de proteína, deve ser considerada a natureza da modificação, ou combinação de modificações, a modificação percentual e pesquisar mais de uma citocina ou métrica para determinar o perfil de eficácia e risco de um mRNA modificado particular.
[00039] Em um aspecto da invenção, métodos de determinação da eficácia de um mRNA modificado comparado com não modificado envolvem a medição e a análise de uma ou mais citocinas cuja expressão é disparada pela administração do ácido nucleico exógeno da invenção. Esses valores são comparados com uma administração de um ácido nucleico não modificado ou com uma métrica padrão tal como resposta de citocina, PolyIC, R-848 ou outro padrão conhecido na técnica.
[00040] Um exemplo de uma métrica padrão desenvolvida aqui é a medida da razão do nível ou quantidade de polipeptídeo (proteína) codificado produzido na célula, tecido ou organismo para o nível ou quantidade de uma ou mais (ou um painel de) citocinas cuja expressão é disparada na célula, tecido ou organismo como um resultado de administração ou contato com o ácido nucleico modificado. Tais razões são referidas aqui como a Razão Proteína:Citocina ou Razão "PC". Quanto maior a razão PC, mais eficaz o ácido nucleico modificado (polinucleotídeo codificando a proteína medida). Razões PC preferidas, pela citocina, da presente invenção podem ser maiores do que 1, maiores do que 10, maiores do que 100, maiores do que 1000, maiores do que 10000 ou mais. Ácidos nucleicos modificados tendo Razões PC maiores do que um ácido nucleico modificado de um construto diferente ou não modificado são preferidos.
[00041] A razão PC pode ser qualificada adicionalmente pela modificação percentual presente no polinucleotídeo. Por exemplo, normalizada para um ácido nucleico 100% modificado, a produção de proteína como uma função de citocina (ou risco) ou perfil de citocina pode ser determinada.
[00042] Em uma modalidade, a presente invenção provê um método para determinação, através de químicas, citocinas ou modificação percentual, da eficácia relativa de qualquer polinucleotídeo modificado particular através da comparação da Razão PC do ácido nucleico modificado (polinucleotídeo).
[00043] Em outra modalidade, os mRNA quimicamente modificados são substancialmente não tóxicos e não mutagênicos.
[00044] Em uma modalidade, os nucleosídeos modificados, nucleotídeos modificados e ácidos nucleicos modificados podem ser quimicamente modificados na face de ranhura principal, desta maneira rompendo as interações de contraparte de ligação de ranhura principal, que pode causar respostas imunes inatas. Ainda, esses nucleosídeos modificados, nucleotídeos modificados e ácidos nucleicos modificados podem ser usados para administrar uma carga útil, por exemplo, agente detectável ou terapêutico, a um alvo biológico. Por exemplo, os ácidos nucleicos podem ser covalentemente ligados a uma carga útil, por exemplo, um agente detectável ou terapêutico, através de um ligante ligado à nucleobase ou à porção açúcar. As composições e os métodos descritos aqui podem ser usados, in vivo e in vitro, ambos extracelularmente ou intracelularmente, bem como em ensaios tais como ensaios livres de célula.
[00045] Em algumas modalidades, a presente invenção provê compostos compreendendo um nucleotídeo que rompe a ligação de uma interação da ranhura principal, por exemplo, ligação, de contraparte com um ácido nucleico, onde o nucleotídeo tem afinidade de ligação diminuída com contrapartes de interação da ranhura principal.
[00046] Em outro aspecto, a presente invenção provê nucleotídeos que contêm modificações químicas, onde o nucleotídeo tem ligação alterada com contrapartes de interação da ranhura principal.
[00047] Em algumas modalidades, as modificações químicas estão localizadas na face da ranhura principal da nucleobase, e onde as modificações químicas podem incluir substituição de um átomo de uma nucleobase de pirimidina com uma amina, uma SH, uma alquila (por exemplo, metila ou etila) ou um halo (por exemplo, cloro ou flúor).
[00048] Em outro aspecto, a presente invenção provê modificações químicas localizadas na porção açúcar do nucleotídeo.
[00049] Em outro aspecto, a presente invenção provê modificações químicas localizadas na estrutura principal de fosfato do ácido nucleico.
[00050] Em algumas modalidades, as modificações químicas alteram a eletroquímica na face da ranhura principal do ácido nucleico.
[00051] Em outro aspecto, a presente invenção provê nucleotídeos que contêm modificações químicas, onde o nucleotídeo reduz a resposta imune inata celular, comparado com a imune inata celular induzida por um ácido nucleico não modificado correspondente.
[00052] Em outro aspecto, a presente invenção provê sequências de ácido nucleico compreendendo pelo menos dois nucleotídeos, a sequência de ácido nucleico compreendendo um nucleotídeo que rompe ligação de uma contraparte de interação da ranhura principal com a sequência de ácido nucleico, onde o nucleotídeo tem afinidade de ligação diminuída com a contraparte de ligação da ranhura principal.
[00053] Em outro aspecto, a presente invenção provê composições compreendendo um composto conforme aqui descrito. Em algumas modalidades, a composição é uma mistura de reação. Em algumas modalidades, a composição é uma composição farmacêutica. Em algumas modalidades, a composição é uma cultura celular. Em algumas modalidades, a composição compreende ainda uma polimerase de RNA e um molde de cDNA. Em algumas modalidades, a composição compreende ainda um nucleotídeo selecionado do grupo consistindo em adenosina, citosina, guanosina e uracila.
[00054] Em um aspecto adicional, a presente invenção provê métodos de fabricação de uma formulação farmacêutica compreendendo uma proteína secretada fisiologicamente ativa compreendendo transfecção de uma primeira população de células humanas com o ácido nucleico farmacêutico feito através dos métodos descritos aqui, onde a proteína secretada é ativa em uma segunda população de células humanas.
[00055] Em algumas modalidades, a proteína secretada é capaz de interagir com um receptor na superfície de pelo menos uma célula presente na segunda população.
[00056] Em algumas modalidades, a proteína secretada é Fator de Estimulação de Colônia de Granulócito (G-CSF).
[00057] Em algumas modalidades, a segunda população contém células de mieloblasto que expressam o receptor de G-CSF.
[00058] Em certas modalidades, são providos aqui agentes terapêuticos de combinação contendo um ou mais ácidos nucleicos modificados contendo regiões traduzíveis que codificam uma proteína ou proteínas que reforçam a imunidade de um indivíduo mamífero junto com uma proteína que induz toxicidade celular dependente de anticorpo. Por exemplo, são providos aqui agentes terapêuticos contendo um ou mais ácidos nucleicos que codificam trastuzumabe e fator de estimulação de colônia de granulócito (G-CSF). Em particular, tais agentes terapêuticos de combinação são úteis em pacientes com câncer de mama Her2+ que desenvolvem resistência induzida a trastuzumabe. (Vide, por exemplo, Albrecht, Immunotherapy. 2(6):795- 8 (2010)).
[00059] Em uma modalidade, é pretendido que os compostos da presente invenção sejam estáveis. É ainda compreendido que certas características da presente invenção, que são, por questão de clareza, descritas no contexto de modalidades separadas, podem ser providas em combinação em uma única modalidade. Por outro lado, várias características da presente invenção, que são, por questão de brevidade, descritas no contexto de uma modalidade única, são também providas separadamente ou em qualquer subcombinação adequada.
Nucleotídeos, Nucleosídeos e Polinucleotídeos Modificados da invenção
[00060] Aqui, em um nucleotídeo, nucleosídeo ou polinucleotídeo (tais como os ácidos nucleicos da invenção, por exemplo, molécula de mRNA), os termos "modificação" e, conforme apropriado, "modificado", se referem à modificação com relação a ribonucleotídeos A, G, U ou C. Em geral, aqui, esses termos não pretendem se referir às modificações de ribonucleotídeos em porções cap de mRNA 5’-terminal de ocorrência natural. Em um polipeptídeo, o termo "modificação" se refere a uma modificação comparada com o conjunto cônico de 20 aminoácidos, porção.
[00061] As modificações podem ser várias modificações distintas. Em algumas modalidades, onde o ácido nucleico é um mRNA, a região de codificação, as regiões de flanqueamento e/ou as regiões terminais podem conter uma, duas ou mais modificações de nucleosídeo ou nucleotídeo (opcionalmente diferentes). Em algumas modalidades, um polinucleotídeo modificado introduzido em uma célula pode exibir degradação reduzida na célula comparada com um polinucleotídeo não modificado.
[00062] Os polinucleotídeos podem incluir qualquer modificação útil, tal como no açúcar, na nucleobase ou na ligação internucleosídeo (por exemplo, a um fosfato de ligação / a uma ligação fosfodiéster / à estrutura principal de fosfodiéster). Por exemplo, a ranhura principal de um polinucleotídeo ou a face de ranhura principal de uma nucleobase pode compreender uma ou mais modificações. Um ou mais átomos de uma nucleobase de pirimidina (por exemplo, na face de estrutura principal) podem ser substituídos com amino opcionalmente substituído, tiol opcionalmente substituído, alquila opcionalmente substituída (por exemplo, metila ou etila) ou halo (por exemplo, cloro ou flúor). Em certas modalidades, modificações (por exemplo, uma ou mais modificações) estão presentes em cada uma da ligação açúcar e internucleosídeo. Modificações de acordo com a presente invenção podem ser modificações de ácidos ribonucleicos (RNAs) para ácidos desoxirribonucleicos (DNAs), por exemplo, a substituição do 2’OH do anel ribofuranisila para 2’H, ácidos nucleicos de treose (TNAs), ácidos nucleicos de glicol (GNAs), ácidos nucleicos de peptídeo (PNAs), ácidos nucleicos bloqueados (LNAs) ou seus híbridos). Modificações adicionais são descritas aqui.
[00063] Conforme aqui descrito, os polinucleotídeos da invenção não induzem substancialmente uma resposta imune inata de uma célula na qual o polinucleotídeo (por exemplo, mRNA) é introduzido. Características de uma resposta imune inata induzida incluem 1) expressão aumentada de citocinas pró-inflamatórias, 2) ativação de PRRs intracelulares (RIG-I, MDA5, etc, e/ou 3) término ou redução em tradução de proteína.
[00064] Em certas modalidades, pode ser desejável que uma molécula de ácido nucleico modificada introduzida em uma célula seja degradada intracelularmente. Por exemplo, degradação de uma molécula de ácido nucleico modificada pode ser preferível se cronometragem precisa de produção de proteína for desejada. Desta maneira, em algumas modalidades, a invenção provê uma molécula de ácido nucleico modificada contendo um domínio de degradação, que é capaz de ser atuada de uma maneira direta dentro de uma célula. Em outro aspecto, a presente invenção provê polinucleotídeos compreendendo um nucleosídeo ou nucleotídeo que pode romper a ligação de uma interação da ranhura principal, por exemplo, ligação, de contraparte com o polinucleotídeo (por exemplo, onde o nucleotídeo modificado tem afinidade de ligação diminuída com contraparte de interação da ranhura principal, comparado com um nucleotídeo não modificado).
[00065] Os polinucleotídeos podem opcionalmente incluir outros agentes (por exemplo, agentes de indução de RNAi, agentes RNAi, siRNAs, shRNAs, miRNAs, RNAs de antissentido, ribozimas, DNA catalítico, tRNA, RNAs que induzem formação de hélice tripla, aptâmeros, vetores, etc). Em algumas modalidades, os polinucleotídeos podem incluir um ou mais RNAs mensageiros (mRNAs) tendo um ou mais nucleosídeo ou nucleotídeos modificados (isto é, moléculas de mRNA modificadas). Detalhes desses polinucleotídeos são encontrados abaixo.
Polinucleotídeos
[00066] Os polinucleotídeos da invenção incluem uma primeira região de nucleosídeos ligados codificando um polipeptídeo de interesse, uma primeira região de flanqueamento localizada no terminal 5’ da primeira região e uma segunda região de flanqueamento localizada no terminal 3’ da primeira região.
[00067] Em algumas modalidades, o polinucleotídeo (por exemplo, a primeira região, primeira região de flanqueamento ou segunda região de flanqueamento) inclui um número n de nucleosídeos ligados tendo Fórmula (Ia) ou Fórmula (Ia-1):
Figure img0001
(Ia-1) ou um sal farmaceuticamente aceitável ou estereoisômero do mesmo, onde U é O, S, N(RU)nu ou C(RU)nu, onde nu é um número inteiro de a partir de 0 a 2 e cada RU é, independentemente, H, halo ou alquila opcionalmente substituída;
[00068] — é uma ligação simples ou está ausente; cada um de R1’, R2’, R1", R2", R1, R2, R3, R4 e R5, se presente, é, independentemente, H, halo, hidróxi, tiol, alquila opcionalmente substituída, alcóxi opcionalmente substituído, alquenilóxi opcionalmente substituído, alquinilóxi opcionalmente substituído, aminoalcóxi opcionalmente substituído, alcoxialcoxi opcionalmente substituído, hidroxialcóxi opcionalmente substituído, amino opcionalmente substituído, azido, arila opcionalmente substituída, aminoalquila opcionalmente substituída, aminoalquenila opcionalmente substituída, aminoalquinila opcionalmente substituída ou ausente; onde a combinação de R3 com um ou mais de R1’, R1", R2’, R2" ou R5 (por exemplo, a combinação de R1’ e R3, a combinação de R1" e R3, a combinação de R2’ e R3, a combinação de R2" e R3 ou a combinação de R5 e R3) pode se unir para formar alquileno opcionalmente substituído ou heteroalquileno opcionalmente substituído e junto com os carbonos aos quais ele estão ligados proveem uma heterociclila opcionalmente substituída (por exemplo, uma heterociclila bicíclica, tricíclica ou tetracíclica); onde a combinação de R5 com um ou mais de R1’, R1", R2’ ou R2" (por exemplo, a combinação de R1’ e R5, a combinação de R1" e R5, a combinação de R2‘ e R5 ou a combinação de R2" e R5) pode ser unida para formar alquileno opcionalmente substituído ou heteroalquileno opcionalmente substituído e junto com os carbonos aos quais ele estão ligados proveem uma heterociclila opcionalmente substituída (por exemplo, uma heterociclila bicíclica, tricíclica ou tetracíclica); e onde a combinação de R4 e um ou mais de R1’, R1", R2’, R2", R3 ou R5 pode ser unida para formar alquileno opcionalmente substituído ou heteroalquileno opcionalmente substituído e junto com os carbonos aos quais ele estão ligados proveem uma heterociclila opcionalmente substituída (por exemplo, uma heterociclila bicíclica, tricíclica ou tetracíclica);cada um de m’ e m" é, independentemente, um número inteiro de a partir de 0 a 3 (por exemplo, de a partir de 0 a 2, de a partir de 0 a 1, de a partir de 1 a 3 ou de a partir de 1 a 2); cada um de Y1, Y2 e Y3 é, independentemente, O, S, Se, - NRN1-, alquileno opcionalmente substituído, ou heteroalquileno opcionalmente substituído, onde RN1 é H, alquila opcionalmente substituída, alquenila opcionalmente substituída, alquinila opcionalmente substituída, arila opcionalmente substituída ou ausente; cada Y4 é, independentemente, H, hidróxi, tiol, boranila, alquila opcionalmente substituída, alquenila opcionalmente substituída, alquinila opcionalmente substituída, alcóxi opcionalmente substituído, alquenilóxi opcionalmente substituído, alquinilóxi opcionalmente substituído, tioalcóxi opcionalmente substituído, alcoxialcóxi opcionalmente substituído ou amino opcionalmente substituído; cada Y5 é, independentemente, O, S, Se, alquileno opcionalmente substituído (por exemplo, metileno) ou heteroalquileno opcionalmente substituído; n é um número inteiro de a partir de 1 a 100.000; e B é uma nucleobase (por exemplo, uma purina, uma pirimidina ou derivados das mesmas), onde a combinação de B e R1’, a combinação de B e R2’, a combinação de B e R1" ou a combinação de B e R2" pode junto com os carbonos aos quais eles estão ligados formar opcionalmente um grupo bicíclico (por exemplo, uma heterociclila bicíclica) ou onde a combinação de B, R1" e R3 ou uma combinação de B, R2" e R3 pode opcionalmente formar um grupo tricíclico ou tetracíclico (por exemplo, uma heterociclila tricíclica ou tetracíclica, tal como na presente Fórmula (IIo)-(IIp)).
[00069] Em algumas modalidades, o polinucleotídeo inclui uma ribose modificada. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo (por exemplo, a primeira região, a primeira região de flanqueamento ou a segunda região de flanqueamento) inclui um número n de nucleosídeos ligados tendo Fórmula (Ia-2)-(Ia-5) ou um sal farmaceuticamente aceitável ou estereoisômero do mesmo.
Figure img0002
[00070] Em algumas modalidades, o polinucleotídeo (por exemplo, a primeira região, a primeira região de flanqueamento ou a segunda região de flanqueamento) inclui um número n de nucleosídeos ligados tendo Fórmula (Ib) ou Fórmula (Ib-1):
Figure img0003
ou um sal farmaceuticamente aceitável ou estereoisômero do mesmo, onde
[00071] U é O, S, N(RU)nu ou C(RU)nu, onde nu é um número inteiro de a partir de 0 a 2 e cada RU é, independentemente, H, halo ou alquila opcionalmente substituída;— é uma ligação simples ou está ausente;cada um de R1, R3’, R3" e R4 é, independentemente, H, halo, hidróxi, alquila opcionalmente substituída, alcóxi opcionalmente substituído, alquenilóxi opcionalmente substituído, alquinilóxi opcionalmente substituído, aminoalcóxi opcionalmente substituído, alcoxialcóxi opcionalmente substituído, hidroxialcóxi opcionalmente substituído, amino opcionalmente substituído, azido, arila opcionalmente substituída, aminoalquila opcionalmente substituída, aminoalquenila opcionalmente substituída, aminoalquinilaopcionalmente substituída ou ausente; e onde a combinação de R1 e R3’ ou a combinação de R1 e R3" pode ser unida para formar alquileno opcionalmente substituído ou heteroalquileno opcionalmente substituído (por exemplo, para produzir um ácido nucleico bloqueado);cada R5 é, independentemente, H, halo, hidróxi, alquila opcionalmente substituída, alcóxi opcionalmente substituído, alquenilóxi opcionalmente substituído, alquinilóxi opcionalmente substituído, aminoalcóxi opcionalmente substituído, alcoxialcóxi opcionalmente substituído ou ausente;cada um de Y1, Y2 e Y3 é, independentemente, O, S, Se, NRN1-, alquileno opcionalmente substituído ou heteroalquileno opcionalmente substituído, onde RN1 é H, alquila opcionalmente substituída, alquenila opcionalmente substituída, alquinila opcionalmente substituída ou arila opcionalmente substituída;cada Y4 é, independentemente, H, hidróxi, tiol, boranila, alquila opcionalmente substituída, alquenila opcionalmente substituída, alquinila opcionalmente substituída, alcóxi opcionalmente substituído, alquenilóxi opcionalmente substituído, alquinilóxi opcionalmente substituído, alcoxialcóxi opcionalmente substituído ou amino opcionalmente substituído;n é um número inteiro de a partir de 1 a 100.000; eB é uma nucleobase.
[00072] Em algumas modalidades, o polinucleotídeo (por exemplo, a primeira região, primeira região de flanqueamento ou segunda região de flanqueamento) inclui um número n de nucleosídeos ligados tendo Fórmula (Ic):
Figure img0004
ou um sal farmaceuticamente aceitável ou estereoisômero do mesmo, ondeU é O, S, N(RU)nu ou C(RU)nu, onde nu é um número inteiro de a partir de 0 a 2 e cada RU é, independentemente, H, halo ou alquila opcionalmente substituída;— é uma ligação simples ou está ausente;cada um de B1, B2 e B3 é, independentemente, a nucleobase(por exemplo, uma purina, uma pirimidina ou derivados das mesmas, conforme aqui descrito), H, halo, hidróxi, tiol, alquila opcionalmente substituída, alcóxi opcionalmente substituído, alquenilóxi opcionalmente substituído, alquinilóxi opcionalmente substituído, aminoalcóxi opcionalmente substituído, alcoxialcóxi opcionalmente substituído, hidroxialcóxi opcionalmente substituído, amino opcionalmente substituído, azido, arila opcionalmente substituída, aminoalquila opcionalmente substituída, aminoalquenila opcionalmente substituída ou aminoalquinila opcionalmente substituída, onde um e apenas um de B1, B2 e B3 é uma nucleobase;cada um de Rb1, Rb2, Rb3, R3 e R5 é, independentemente, H, halo, hidróxi, tiol, alquila opcionalmente substituída, alcóxi opcionalmente substituído, alquenilóxi opcionalmente substituído, alquinilóxi opcionalmente substituído, aminoalcóxi opcionalmente substituído, alcoxialcóxi opcionalmente substituído, hidroxialcóxi opcionalmente substituído, amino opcionalmente substituído, azido, arila opcionalmente substituída, aminoalquila opcionalmente substituída, aminoalquenila opcionalmente substituída ou aminoalquinila opcionalmente substituída;cada um de Y1, Y2 e Y3 é, independentemente, O, S, Se, - NRN1-, alquileno opcionalmente substituído ou heteroalquileno opcionalmente substituído, onde RN1 é H, alquila opcionalmente substituída, alquenila opcionalmente substituída, alquinila opcionalmente substituída ou arila opcionalmente substituída;cada Y4 é, independentemente, H, hidróxi, tiol, boranila, alquila opcionalmente substituída, alquenila opcionalmente substituída, alquinila opcionalmente substituída, alcóxi opcionalmente substituído, alquenilóxi opcionalmente substituído, alquinilóxi opcionalmente substituído, tioalcóxi opcionalmente substituído, alcoxialcóxi opcionalmente substituído ou amino opcionalmente substituído;cada Y5 é, independentemente, O, S, Se, alquileno opcionalmente substituído (por exemplo, metileno) ou heteroalquileno opcionalmente substituído;n é um número inteiro de a partir de 1 a 100.000; eonde o anel incluindo U pode incluir uma ou mais ligações duplas.
[00073] Em modalidades particulares, o anel incluindo U não tem uma ligação dupla entre U-CB3Rb3 ou entre CB3Rb3-CB2Rb2.
[00074] Em algumas modalidades, o polinucleotídeo (por exemplo, a primeira região, primeira região de flanqueamento ou segunda região de flanqueamento) inclui um número n de nucleosídeos ligados tendo Fórmula (Id):
Figure img0005
, ou um sal farmaceuticamente aceitável ou estereoisômero do mesmo, onde U é O, S, N(RU)nu ou C(RU)nu, onde nu é um número inteiro de a partir de 0 a 2 e cada RU é, independentemente, H, halo ou alquila opcionalmente substituída;cada R3 é, independentemente, H, halo, hidróxi, tiol, alquila opcionalmente substituída, alcóxi opcionalmente substituído, alquenilóxi opcionalmente substituído, alquinilóxi opcionalmente substituído, aminoalcóxi opcionalmente substituído, alcoxialcóxi opcionalmente substituído, hidroxialcóxi opcionalmente substituído, amino opcionalmente substituído, azido, arila opcionalmente substituída, aminoalquila opcionalmente substituída, aminoalquenila opcionalmente substituída ou aminoalquinila opcionalmente substituída;cada um de Y1, Y2 e Y3, é, independentemente, O, S, Se, - NRN1-, alquileno opcionalmente substituído ou heteroalquileno opcionalmente substituído, onde RN1 é H, alquila opcionalmente substituída, alquenila opcionalmente substituída, alquinila opcionalmente substituída ou arila opcionalmente substituída;cada Y4 é, independentemente, H, hidróxi, tiol, boranila, alquila opcionalmente substituída, alquenila opcionalmente substituída, alquinila opcionalmente substituída, alcóxi opcionalmente substituído, alquenilóxi opcionalmente substituído, alquinilóxi opcionalmente substituído, tioalcóxi opcionalmente substituído, alcoxialcóxi opcionalmente substituído ou amino opcionalmente substituído;cada Y5 é, independentemente, O, S, alquileno opcionalmente substituído (por exemplo, metileno) ou heteroalquileno opcionalmente substituído;n é um número inteiro de a partir de 1 a 100.000; eB é uma nucleobase (por exemplo, uma purina, uma pirimidina ou derivados das mesmas).
[00075] Em algumas modalidades, o polinucleotídeo (por exemplo, a primeira região, primeira região de flanqueamento ou segunda região de flanqueamento) inclui um número n de nucleosídeos ligados tendo Fórmula (Ie):
Figure img0006
(Ie), ou um sal farmaceuticamenteaceitável ou estereoisômero do mesmo, onde cada um de U’ e U" é, independentemente, O, S, N(RU)nu ou C(RU)nu, onde nu é um número inteiro de a partir de 0 a 2 e cada RU é, independentemente, H, halo ou alquila opcionalmente substituída;cada R6 é, independentemente, H, halo, hidróxi, tiol, alquila opcionalmente substituída, alcóxi opcionalmente substituído, alquenilóxi opcionalmente substituído, alquinilóxi opcionalmente substituído, aminoalcóxi opcionalmente substituído, alcoxialcóxi opcionalmente substituído, hidroxialcóxi opcionalmente substituído, amino opcionalmente substituído, azido, arila opcionalmente substituída, aminoalquila opcionalmente substituída, aminoalquenila opcionalmente substituída ou aminoalquinila opcionalmente substituída;cada Y5’ é, independentemente, O, S, alquileno opcionalmente substituído (por exemplo, metileno ou etileno) ou heteroalquileno opcionalmente substituído;n é um número inteiro de a partir de 1 a 100.000; eB é uma nucleobase (por exemplo, uma purina, uma pirimidina ou derivados das mesmas).
[00076] Em algumas modalidades, o polinucleotídeo (por exemplo, a primeira região, primeira região de flanqueamento ou segunda região de flanqueamento) inclui um número n de nucleosídeos ligados tendo Fórmula (If) ou (If-1):
Figure img0007
ou um sal farmaceuticamente aceitável ou estereoisômero do mesmo,onde cada um de U’ e U" é, independentemente, O, S, N, N(Ru)nu ou C(Ru)nu, onde nu é um número inteiro de a partir de 0 a 2 e cada Ru é, independentemente, H, halo ou alquila opcionalmente substituída (por exemplo, U’ é O e U" é N);— é uma ligação simples ou está ausente;cada um de R1’, R2’, R1", R2", R3 e R4 é, independentemente, H, halo, hidróxi, tiol, alquila opcionalmente substituída, alcóxi opcionalmente substituído, alquenilóxi opcionalmente substituído, alquinilóxi opcionalmente substituído, aminoalcóxi opcionalmente substituído, alcoxialcóxi opcionalmente substituído, hidroxialcóxi opcionalmente substituído, amino opcionalmente substituído, azido, arila opcionalmente substituída, aminoalquila opcionalmente substituída, aminoalquenila opcionalmente substituída, aminoalquinila opcionalmente substituída ou ausente; e onde a combinação de R1’ e R3, a combinação de R1" e R3, a combinação de R2’ e R3 ou a combinação de R2" e R3 pode ser unida para formar alquileno opcionalmente substituído ou heteroalquileno opcionalmente substituído (por exemplo, para produzir um ácido nucleico bloqueado); cada um de m’ e m" é, independentemente, um número inteiro de a partir de 0 a 3 (por exemplo, de a partir de 0 a 2, de a partir de 0 a 1, de a partir de 1 a 3 ou de a partir de 1 a 2);cada um de Y1, Y2 e Y3, é, independentemente, O, S, Se, - NRN1-, alquileno opcionalmente substituído ou heteroalquileno opcionalmente substituído, onde RN1 é H, alquila opcionalmente substituída, alquenila opcionalmente substituída, alquinila opcionalmente substituída, arila opcionalmente substituída ou ausente;cada Y4 é, independentemente, H, hidróxi, tiol, boranila, alquila opcionalmente substituída, alquenila opcionalmente substituída, alquinila opcionalmente substituída, alcóxi opcionalmente substituído, alquenilóxi opcionalmente substituído, alquinilóxi opcionalmente substituído, tioalcóxi opcionalmente substituído, alcoxialcóxi opcionalmente substituído ou amino opcionalmente substituído;cada Y5 é, independentemente, O, S, Se, alquileno opcionalmente substituído (por exemplo, metileno) ou heteroalquileno opcionalmente substituído;n é um número inteiro de a partir de 1 a 100.000; eB é uma nucleobase (por exemplo, uma purina, uma pirimidina ou derivados das mesmas).
[00077] Em algumas modalidades dos polinucleotídeos (por exemplo, Fórmulas (Ia)-(Ia-5), (Ib)-(If-1), (IIa)-(IIp), (IIb-1), (IIb-2), (IIc-1)- (IIc-2), (IIn-1), (IIn-2), (IVa)-(IVl) e (IXa)-(IXr)), o anel incluindo U tem uma ou duas ligações duplas.
[00078] Em algumas modalidades dos polinucleotídeos (por exemplo, Fórmulas (Ia)-Ia-5), (Ib)-(If-1), (IIa)-(IIp), (IIb-1), (IIb-2), (IIc-1)- (IIc-2), (IIn-1), (IIn-2), (IVa)-(IVl) e (IXa)-(IXr)), cada um de R1, R1’ e R1", se presente, é H. Em modalidades adicionais, cada um de R2, R2, e R2", se presente, é, independentemente, H, halo (por exemplo, flúor), hidróxi, alcóxi opcionalmente substituído (por exemplo, metóxi ou etóxi) ou alcoxialcóxi opcionalmente substituído. Em modalidades particulares, alcoxialcóxi é -(CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR’, onde s1 é um número inteiro de a partir de 1 a 10 (por exemplo, de a partir de 1 a 6 ou de a partir de 1 a 4), cada um de s2 e s3, independentemente, é um número inteiro de a partir de 0 a 10 (por exemplo, de a partir de 0 a 4, de a partir de 0 a 6, de a partir de 1 a 4, de a partir de 1 a 6 ou de a partir de 1 a 10) e R’ é H ou C1-20 alquila). Em algumas modalidades, s2 é 0, s1 é 1 ou 2, s3 é 0 ou 1 e R’ é C1-6 alquila.
[00079] Em algumas modalidades dos polinucleotídeos (por exemplo, Fórmulas (Ia)-(Ia-5), (Ib)-(If), (IIa)-(IIp), (IIb-1), (IIb-2), (IIc-1)- (IIc-2), (IIn-1), (IIn-2), (IVa)-(IVl) e (IXa)-(IXr)), cada um de R2, R2’ e R2", se presente, é H. Em modalidades adicionais, cada um de R1, R1’ e R1", se presente, é, independentemente, H, halo (por exemplo, flúor), hidróxi, alcóxi opcionalmente substituído (por exemplo, metóxi ou etóxi) ou alcoxialcóxi opcionalmente substituído. Em modalidades particulares, alcoxialcóxi é -(CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR’, onde s1 é um número inteiro de a partir de 1 a 10 (por exemplo, de a partir de 1 a 6 ou de a partir de 1 a 4), cada um de s2 e s3, independentemente, é um número inteiro de a partir de 0 a 10 (por exemplo, de a partir de 0 a 4, de a partir de 0 a 6, de a partir de 1 a 4, de a partir de 1 a 6 ou de a partir de 1 a 10) e R’ é H ou C1-20 alquila). Em algumas modalidades, s2 é 0, s1 é 1 ou 2, s3 é 0 ou 1 e R’ é C1-6 alquila.
[00080] Em algumas modalidades dos polinucleotídeos (por exemplo, Fórmulas (Ia)-(Ia-5), (Ib)-(If-1), (IIa)-(IIp), (IIb-1), (IIb-2), (IIc-1)- (IIc-2), (IIn-1), (IIn-2), (IVa)-(IVl) e (IXa)-(IXr)), cada um de R3, R4 e R5 é, independentemente, H, halo (por exemplo, flúor), hidróxi, alquila opcionalmente substituída, alcóxi opcionalmente substituído (por exemplo, metóxi ou etóxi) ou alcoxialcóxi opcionalmente substituído. Em modalidades particulares, R3 é H, R4 é H, R5 é H ou R3, R4 e R5 são todos H. Em modalidades particulares, R3 é C1-6 alquila, R4 é C1-6 alquila, R5 é C1-6 alquila ou R3, R4 e R5 são todos C1-6 alquila. Em modalidades particulares, R3 e R4 são ambos H e R5 é C1-6 alquila.
[00081] Em algumas modalidades dos polinucleotídeos (por exemplo, Fórmulas (Ia)-(Ia-5), (Ib)-(If-1), (IIa)-(IIp), (IIb-1), (IIb-2), (IIc-1)- (IIc-2), (IIn-1), (IIn-2), (IVa)-(IVl) e (IXa)-(IXr)), R3 e R5 se unem para formar alquileno opcionalmente substituído ou heteroalquileno opcionalmente substituído e, junto com os carbonos aos quais eles estão ligados, proveem uma heterociclila opcionalmente substituída (por exemplo, uma heterociclila bicíclica, tricíclica ou tetracíclica, tais como análogos de trans-3’-4’, onde R3 e R5 se unem para formar heteroalquileno (por exemplo, -(CH2)b1O(CH2)b2O(CH2)b3-, onde cada um de b1, b2 e b3 é, independentemente, um número inteiro de a partir de 0 a 3).
[00082] Em algumas modalidades dos polinucleotídeos (por exemplo, Fórmulas (Ia)-(Ia-5), (Ib)-(If-1), (IIa)-(IIp), (IIb-1), (IIb-2), (IIc-1)- (IIc-2), (IIn-1), (IIn-2), (IVa)-(IVl) e (IXa)-(IXr)), R3 e um ou mais de R1’, R1", R2‘, R2" ou R5 se unem para formar alquileno opcionalmente substituído ou heteroalquileno opcionalmente substituído e, junto com os carbonos aos quais eles estão ligados, proveem uma heterociclila opcionalmente substituída (por exemplo, uma heterociclila bicíclica, tricíclica ou tetracíclica, R3 e um ou mais de R1’, R1", R2‘, R2" ou R5 se unem para formar heteroalquileno (por exemplo, - (CH2)b1O(CH2)b2O(CH2)b3-, onde cada um de b1, b2, e b3 é, independentemente, um número inteiro de a partir de 0 a 3).
[00083] Em algumas modalidades dos polinucleotídeos (por exemplo, Fórmulas (Ia)-(Ia-5), (Ib)-(If-1), (IIa)-(IIp), (IIb-1), (IIb-2), (IIc-1)- (IIc-2), (IIn-1), (IIn-2), (IVa)-(IVl) e (IXa)-(IXr)), R5 e um ou mais de R1’, R1", R2‘ ou R2" se unem para formar alquileno opcionalmente substituído ou heteroalquileno opcionalmente substituído e, junto com os carbonos aos quais eles estão ligados, proveem uma heterociclila opcionalmente substituída (por exemplo, uma heterociclila bicíclica, tricíclica ou tetracíclica, R5 e um ou mais de R1’, R1", R2‘ ou R2" se unem para formar heteroalquileno (por exemplo, -(CH2)b1O(CH2)b2O(CH2)b3-, onde cada um de b1, b2 e b3 é, independentemente, um número inteiro de a partir de 0 a 3).
[00084] Em algumas modalidades dos polinucleotídeos (por exemplo, Fórmulas (Ia)-(Ia-5), (Ib)-(If-1), (IIa)-(IIp), (IIb-1), (IIb-2), (IIc-1)- (IIc-2), (IIn-1), (IIn-2), (IVa)-(IVl) e (IXa)-(IXr)), cada Y2 é, independentemente, O, S ou -NRN1-, onde RN1 é H, alquila opcionalmente substituída, alquenila opcionalmente substituída, alquinila opcionalmente substituída ou arila opcionalmente substituída. Em modalidades particulares, Y2 é NRN1-, onde RN1 é H ou alquila opcionalmente substituída (por exemplo, C1-6 alquila, tal como metila, etila, isopropila ou n-propila).
[00085] Em algumas modalidades dos polinucleotídeos (por exemplo, Fórmulas (Ia)-(Ia-5), (Ib)-(If-1), (IIa)-(IIp), (IIb-1), (IIb-2), (IIc-1)- (IIc-2), (IIn-1), (IIn-2), (IVa)-(IVl) e (IXa)-(IXr)), cada Y3 é, independentemente, O ou S.
[00086] Em algumas modalidades dos polinucleotídeos (por exemplo, Fórmulas (Ia)-(Ia-5), (Ib)-(If-1), (IIa)-(IIp), (IIb-1), (IIb-2), (IIc-1)- (IIc-2), (IIn-1), (IIn-2), (IVa)-(IVl) e (IXa)-(IXr)), R1 é H; cada R2 é, independentemente, H, halo (por exemplo, flúor), hidróxi, alcóxi opcionalmente substituído (por exemplo, metóxi ou etóxi) ou alcoxialcóxi opcionalmente substituído (por exemplo, -(CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR’, onde s1 é um número inteiro de a partir de 1 a 10 (por exemplo, de a partir de 1 a 6 ou de a partir de 1 a 4), cada um de s2 e s3, independentemente, é um número inteiro de a partir de 0 a 10 (por exemplo, de a partir de 0 a 4, de a partir de 0 a 6, de a partir de 1 a 4, de a partir de 1 a 6 ou de a partir de 1 a 10) e R’ é H ou C1-20 alquila, tal como onde s2 é 0, s1 é 1 ou 2, s3 é 0 ou 1, e R’ é C1-6 alquila); cada Y2 é, independentemente, O ou -NRN1-, onde RN1 é H, alquila opcionalmente substituída, alquenila opcionalmente substituída, alquinila opcionalmente substituída ou arila opcionalmente substituída (por exemplo, onde RN1 é H ou alquila opcionalmente substituída (por exemplo, C1-6 alquila, tal como metila, etila, isopropila ou n-propila)); e cada Y3 é, independentemente, O ou S (por exemplo, S). Em modalidades adicionais, R3 é H, halo (por exemplo, flúor), hidróxi, alquila opcionalmente substituída, alcóxi opcionalmente substituído (por exemplo, metóxi ou etóxi) ou alcoxialcóxi opcionalmente substituído. Em ainda outras modalidades adicionais, cada Y1 é , independentemente, O ou -NRN1-, onde RN1 é H, alquila opcionalmente substituída, alquenila opcionalmente substituída, alquinila opcionalmente substituída ou arila opcionalmente substituída (por exemplo, onde RN1 é H ou alquila opcionalmente substituída (por exemplo, C1-6 alquila, tal como metila, etila, isopropila ou n-propila)); e cada Y4 é, independentemente, H, hidróxi, tiol, alquila opcionalmente substituída, alcóxi opcionalmente substituído, tioalcóxi opcionalmente substituído, alcoxialcóxi opcionalmente substituído ou amino opcionalmente substituído.
[00087] Em algumas modalidades dos polinucleotídeos (por exemplo, Fórmulas (Ia)-(Ia-5), (Ib)-(If-1), (IIa)-(IIp), (IIb-1), (IIb-2), (IIc-1)- (IIc-2), (IIn-1), (IIn-2), (IVa)-(IVl) e (IXa)-(IXr)), cada R1 é, independentemente, H, halo (por exemplo, flúor), hidróxi, alcóxi opcionalmente substituído (por exemplo, metóxi ou etóxi) ou alcoxialcóxi opcionalmente substituído (por exemplo, -(CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR’, onde s1 é um número inteiro de a partir de 1 a 10 (por exemplo, de a partir de 1 a 6 ou de a partir de 1 a 4), cada um de s2 e s3, independentemente, é um número inteiro de a partir de 0 a 10 (por exemplo, de a partir de 0 a 4, de a partir de 0 a 6, de a partir de 1 a 4, de a partir de 1 a 6 ou de a partir de 1 a 10) e R’ é H ou C1-20 alquila, tal como onde s2 é 0, s1 é 1 ou 2, s3 é 0 ou 1, e R’ é C1-6 alquila); R2 é H; cada Y2 é, independentemente, O ou -NRN1-, onde RN1 é H, alquila opcionalmente substituída, alquenila opcionalmente substituída, alquinila opcionalmente substituída ou arila opcionalmente substituída (por exemplo, onde RN1 é H ou alquila opcionalmente substituída (por exemplo, C1-6 alquila, tal como metila, etila, isopropila ou n-propila)); e cada Y3 é, independentemente, O ou S (por exemplo, S). Em modalidades adicionais, R3 é H, halo (por exemplo, flúor), hidróxi, alquila opcionalmente substituída, alcóxi opcionalmente substituído (por exemplo, metóxi ou etóxi) ou alcoxialcóxi opcionalmente substituído. Em ainda modalidades adicionais, cada Y1 é , independentemente, O ou - NRN1-, onde RN1 é H, alquila opcionalmente substituída, alquenila opcionalmente substituída, alquinila opcionalmente substituída ou arila opcionalmente substituída (por exemplo, onde RN1 é H ou alquila opcionalmente substituída (por exemplo, C1-6 alquila, tal como metila, etila, isopropila ou n-propila)); e cada Y4 é, independentemente, H, hidróxi, tiol, alquila opcionalmente substituída, alcóxi opcionalmente substituído, tioalcóxi opcionalmente substituído, alcoxialcóxi opcionalmente substituído ou amino opcionalmente substituído.
[00088] Em algumas modalidades dos polinucleotídeos (por exemplo, Fórmulas (Ia)-(Ia-5), (Ib)-(If-1), (IIa)-(IIp), (IIb-1), (IIb-2), (IIc-1)- (IIc-2), (IIn-1), (IIn-2), (IVa)-(IVl) e (IXa)-(IXr)), o anel incluindo U está na configuração β-D (por exemplo, β-D-ribo).
[00089] Em algumas modalidades dos polinucleotídeos (por exemplo, Fórmulas (Ia)-(Ia-5), (Ib)-(If-1), (IIa)-(IIp), (IIb-1), (IIb-2), (IIc-1)- (IIc-2), (IIn-1), (IIn-2), (IVa)-(IVl) e (IXa)-(IXr)), o anel incluindo U está na configuração α-L (por exemplo, α-L-ribo).
[00090] Em algumas modalidades dos polinucleotídeos (por exemplo, Fórmulas (Ia)-(Ia-5), (Ib)-(If-1), (IIa)-(IIp), (IIb-1), (IIb-2), (IIc-1)- (IIc-2), (IIn-1), (IIn-2), (IVa)-(IVl) e (IXa)-(IXr)), um ou mais B não é pseudouridina (Φ) ou 5-metil-citidina (m5C).
[00091] Em algumas modalidades, cerca de 10% a cerca de 100% de número n de nucleobases B não são Φ ou m5C (por exemplo, de a partir de 10% a 20%, de a partir de 10% a 35%, de a partir de 10% a 50%, de a partir de 10% a 60%, de a partir de 10% a 75%, de a partir de 10% a 90%, de a partir de 10% a 95%, de a partir de 10% a 98%, de a partir de 10% a 99%, de a partir de 20% a 35%, de a partir de 20% a 50%, de a partir de 20% a 60%, de a partir de 20% a 75%, de a partir de 20% a 90%, de a partir de 20% a 95%, de a partir de 20% a 98%, dea partir de 20% a 99%, de a partir de 20% a 100%, de a partir de 50% a60%, de a partir de 50% a 75%, de a partir de 50% a 90%, de a partir de 50% a 95%, de a partir de 50% a 98%, de a partir de 50% a 99%, dea partir de 50% a 100%, de a partir de 75% a 90%, de a partir de 75% a95%, de a partir de 75% a 98%, de a partir de 75% a 99% e de a partir de 75% a 100% de número n de B não são Φ ou m 5C). Em algumas modalidades, B não é Φ ou m5C.
[00092] Em algumas modalidades dos polinucleotídeos (por exemplo, Fórmulas (Ia)-(Ia-5), (Ib)-(If-1), (IIa)-(IIp), (IIb-1), (IIb-2), (IIc-1)- (IIc-2), (IIn-1), (IIn-2), (IVa)-(IVl) e (IXa)-(IXr)), quando B é uma nucleobase não modificada selecionada de citosina, guanina, uracila e adenina, então pelo menos um de Y1, Y2 ou Y3 não é O.
[00093] Em algumas modalidades, o polinucleotídeo inclui uma ribose modificada. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo (por exemplo, a primeira região, a primeira região de flanqueamento ou a segunda região de flanqueamento) inclui um número n de nucleosídeos ligados tendo Fórmula (IIa)-(IIc):
Figure img0008
[00094] (IIc) ou um sal farmaceuticamente aceitável ou estereoisômero do mesmo. Em modalidades particulares, U é O ou C(RU)nu, onde nu é um número inteiro de a partir de 0 a 2 e cada RU é, independentemente, H, halo ou alquila opcionalmente substituída (por exemplo, U é -CH2- ou -CH-). Em outras modalidades, cada um de R1, R2, R3, R4 e R5 é, independentemente, H, halo, hidróxi, tiol, alquila opcionalmente substituída, alcóxi opcionalmente substituído, alquenilóxi opcionalmente substituído, alquinilóxi opcionalmente substituído, aminoalcóxi opcionalmente substituído, alcoxialcóxi opcionalmente substituído, hidroxialcóxi opcionalmente substituído, amino opcionalmente substituído, azido, arila opcionalmente substituída, aminoalquila opcionalmente substituída, aminoalquenila opcionalmente substituída, aminoalquinila opcionalmente substituída ou está ausente (por exemplo, cada R1 e R2 é, independentemente H, halo, hidróxi, alquila opcionalmente substituída ou alcóxi opcionalmente substituído; cada R3 e R4 é, independentemente, H ou alquila opcionalmente substituída; e R5 é H ou hidróxi), e — é uma ligação simples ou dupla.
[00095] Em modalidades particulares, o polinucleotídeo (por exemplo, a primeira região, a primeira região de flanqueamento ou a segunda região de flanqueamento) inclui um número n de nucleosídeos ligados tendo Fórmula (IIb-1)-(IIb-2):
Figure img0009
um sal farmaceuticamente aceitável ou estereoisômero do mesmo. Em algumas modalidades, U é O ou C(RU)nu, onde nu é um número inteiro de a partir de 0 a 2 e cada RU é, independentemente, H, halo ou alquila opcionalmente substituída (por exemplo, U é -CH2- ou - CH-). Em outras modalidades, cada um de R1 e R2 é, independentemente, H, halo, hidróxi, tiol, alquila opcionalmente substituída, alcóxi opcionalmente substituído, alquenilóxi opcionalmente substituído, alquinilóxi opcionalmente substituído, aminoalcóxi opcionalmente substituído, alcoxialcóxi opcionalmente substituído, hidroxialcóxi opcionalmente substituído, amino opcionalmente substituído, azido, arila opcionalmente substituída, aminoalquila opcionalmente substituída, aminoalquenila opcionalmente substituída, aminoalquinila opcionalmente substituída ou está ausente (por exemplo, cada R1 e R2 é, independentemente, H, halo, hidróxi, alquila opcionalmente substituída ou alcóxi opcionalmente substituído, por exemplo, H, halo, hidróxi, alquila ou alcóxi). Em modalidades particulares, R2 é hidróxi ou alcóxi opcionalmente substituído (por exemplo, metóxi, etóxi ou qualquer um descrito aqui).
[00096] Em modalidades particulares, o polinucleotídeo (por exemplo, a primeira região, a primeira região de flanqueamento ou a segunda região de flanqueamento) inclui um número n de nucleosídeos ligados tendo Fórmula (IIc-1)-(IIc-4):
Figure img0010
Figure img0011
ou um sal farmaceuticamente aceitável ou estereoisômero do mesmo.
[00097] Em algumas modalidades, U é O ou C(RU)nu, onde nu é um número inteiro de a partir de 0 a 2 e cada RU é, independentemente, H, halo ou alquila opcionalmente substituída (por exemplo, U é -CH2- ou -CH-). Em algumas modalidades, cada um de R1, R2 e R3 é, independentemente, H, halo, hidróxi, tiol, alquila opcionalmente substituída, alcóxi opcionalmente substituído, alquenilóxi opcionalmente substituído, alquinilóxi opcionalmente substituído, aminoalcóxi opcionalmente substituído, alcoxialcóxi opcionalmente substituído, hidroxialcóxi opcionalmente substituído, amino opcionalmente substituído, azido, arila opcionalmente substituída, aminoalquila opcionalmente substituída, aminoalquenila opcionalmente substituída, aminoalquinila opcionalmente substituída ou está ausente (por exemplo, cada R1 e R2 é, independentemente, H, halo, hidróxi, alquila opcionalmente substituída ou alcóxi opcionalmente substituído, por exemplo, H, halo, hidróxi, alquila ou alcóxi; e cada R3 é, independentemente, H ou alquila opcionalmente substituída)). Em modalidades particulares, R2 é alcóxi opcionalmente substituído (por exemplo, metóxi ou etóxi ou qualquer um descrito aqui). Em modalidades particulares, R1 é alquila opcionalmente substituída e R2 é hidróxi. Em outras modalidades, R1 é hidróxi e R2 é alquila opcionalmente substituída. Em modalidades adicionais, R3 é alquila opcionalmente substituída.
[00098] Em algumas modalidades, o polinucleotídeo inclui uma ribose acíclica modificada. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo (por exemplo, a primeira região, a primeira região de flanqueamento ou a segunda região de flanqueamento) inclui um número n de nucleosídeos ligados tendo Fórmula (IId)-(IIf):
Figure img0012
(Ilf) ou um sal farmaceuticamente aceitável ouestereoisômero do mesmo.
[00099] Em algumas modalidades, o polinucleotídeo inclui um hexitol acíclico modificado. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo (por exemplo, a primeira região, a primeira região de flanqueamento ou a segunda região de flanqueamento) inclui um número n de nucleosídeos ligados tendo Fórmula (IIg)-(IIj):
Figure img0013
Figure img0014
um sal farmaceuticamente aceitável ou estereoisômero do mesmo.
[000100] Em algumas modalidades, o polinucleotídeo inclui uma porção açúcar tendo um anel ribose contraído ou expandido. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo (por exemplo, a primeira região, a primeira região de flanqueamento ou a segunda região de flanqueamento) inclui um número n de nucleosídeos ligados tendo Fórmula (IIk)-(IIm):
Figure img0015
(IIm) ou um sal farmaceuticamente aceitável ou estereoisômero do mesmo, onde cada um de R1’, R1", R2’ e R2" é, independentemente, H, halo, hidróxi, alquila opcionalmente substituída, alcóxi opcionalmente substituído, alquenilóxi opcionalmente substituído, alquinilóxi opcionalmente substituído, aminoalcóxi opcionalmente substituído, alcoxialcóxi opcionalmente substituído ou ausente; e onde a combinação de R2’ e R3 ou a combinação de R2" e R3 pode ser unida para formar alquileno opcionalmente substituído ou heteroalquileno opcionalmente substituído.
[000101] Em algumas modalidades, o polinucleotídeo includes uma ribose modificada bloqueada. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo (por exemplo, a primeira região, a primeira região de flanqueamento ou a segunda região de flanqueamento) inclui um número n de nucleosídeos ligados tendo Fórmula (IIn):
Figure img0016
, ou um sal farmaceuticamente aceitável ou estereoisômero do mesmo, onde R3’ é O, S ou -NRN1-, onde RN1 é H, alquila opcionalmente substituída, alquenila opcionalmente substituída, alquinila opcionalmente substituída ou arila opcionalmente substituída e R3" é alquileno opcionalmente substituído (por exemplo, -CH2-, -CH2CH2- ou -CH2CH2CH2-) ou heteroalquileno opcionalmente substituído (por exemplo, -CH2NH-, -CH2CH2NH-, -CH2OCH2- ou - CH2CH2OCH2-) (por exemplo, R3’ é O e R3" é alquileno opcionalmente substituído (por exemplo, -CH2-, -CH2CH2- ou -CH2CH2CH2-)).
[000102] Em algumas modalidades, o polinucleotídeo (por exemplo, a primeira região, a primeira região de flanqueamento ou a segunda região de flanqueamento) inclui um número n de nucleosídeos ligados tendo Fórmula (IIn-1)-(II-n2):
Figure img0017
ou um sal farmaceuticamente aceitável ou estereoisômero do mesmo, onde R3’ é O, S ou -NRN1-, onde RN1 é H, alquila opcionalmente substituída, alquenila opcionalmente substituída, alquinila opcionalmente substituída ou arila opcionalmente substituída e R3" é alquileno opcionalmente substituído (por exemplo, -CH2-, -CH2CH2- ou - CH2CH2CH2-) ou heteroalquileno opcionalmente substituído (por exemplo, -CH2NH-, -CH2CH2NH-, -CH2OCH2- ou -CH2CH2OCH2-) (por exemplo, R3’ é O e R3" é alquileno opcionalmente substituído (por exemplo, -CH2-, -CH2CH2- ou -CH2CH2CH2-)).
[000103] Em algumas modalidades, o polinucleotídeo includes uma ribose modificada bloqueada que forma uma heterociclila tetracíclica. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo (por exemplo, a primeira região, a primeira região de flanqueamento ou a segunda região de flanqueamento) inclui um número n de nucleosídeos ligados tendo Fórmula (IIo):
Figure img0018
(IIp), ou um sal farmaceuticamente aceitável ou estereoisômero do mesmo, onde R12a, R12c, T1’, T1",T2’, T2", V1 e V3 são conforme aqui descrito.
[000104] Qualquer uma das fórmulas para os polinucleotídeos pode incluir uma ou mais nucleobase descritas aqui (por exemplo, Fórmulas (b1)-(b43)).
[000105] Em uma modalidade, a presente invenção provê métodos de preparação de um polinucleotídeo compreendendo pelo menos um nucleotídeo que rompe a ligação de uma contraparte de interação da ranhura principal com o ácido nucleico, onde o polinucleotídeo compreende número n de nucleosídeos tendo Fórmula (Ia), conforme definido aqui:
Figure img0019
[000106] o método compreendendo reação de um composto de Fórmula (IIIa), conforme aqui definido:
Figure img0020
com uma polimerase de RNA e um modelo de cDNA.
[000107] Em uma modalidade adicional, a presente invenção provê métodos de amplificação de um polinucleotídeo compreendendo pelo menos um polinucleotídeo que rompe a ligação de uma contraparte de ligação da ranhura principal com a sequência de polinucleotídeo, o método compreendendo: reação de um composto de Fórmula (IIIa), conforme aqui definido, com um iniciador , um modelo de cDNA e uma polimerase de RNA.
[000108] Em uma modalidade, a presente invenção provê métodos de preparação de um polinucleotídeo compreendendo pelo menos um nucleotídeo que rompe ligação de uma contraparte de interação da ranhura principal com o ácido nucleico, onde o polinucleotídeo compreende número n de nucleosídeos tendo Fórmula (Ia-1), conforme aqui definido:
Figure img0021
(Ia-1), o método compreendendo reação de um composto de Fórmula (IIIa-i), conforme aqui definido:
Figure img0022
(IIIa-i), com uma polimerase de RNA e um modelo de cDNA.
[000109] Em uma modalidade adicional, a presente invenção provê métodos de amplificação de um polinucleotídeo compreendendo pelo menos um nucleotídeo (por exemplo, molécula de mRNA modificada) que rompe ligação de uma contraparte de ligação da ranhura principal com a sequência de polinucleotídeo, o método compreendendo: reação de um composto de fórmula (IIIa-i), conforme aqui definido, com um iniciador , um modelo de cDNA e uma polimerase de RNA.
[000110] Em uma modalidade, a presente invenção provê métodos de preparação de um polinucleotídeo compreendendo pelo menos um nucleotídeo que rompe ligação de uma contraparte de interação da ranhura principal com a sequência de ácido nucleico, onde o polinucleotídeo compreende número n de nucleosídeos tendo Fórmula (Ia-2), conforme aqui definido:
Figure img0023
composto de Fórmula (IIIa-2), conforme aqui definido:
Figure img0024
(IIIa-2), com uma polimerase de RNA e um modelo de cDNA.
[000111] Em uma modalidade adicional, a presente invenção provê métodos de amplificação de um polinucleotídeo compreendendo pelo menos um nucleotídeo (por exemplo, molécula de RNA modificada) que rompe ligação de uma contraparte de ligação da ranhura principal com o polinucleotídeo, o método compreendendo reação de um composto de Fórmula (III-2), conforme aqui definido, com um iniciador , um modelo de cDNA e uma polimerase de RNA.
[000112] Em algumas modalidades, a reação pode ser repetida de a partir de 1 a cerca de 7.000 vezes. Em qualquer uma das presentes modalidades, B pode ser uma nucleobase de Fórmula (b1)-(b43).
[000113] Os polinucleotídeos podem incluir opcionalmente regiões de flanqueamento 5’ e/ou 3’, que são descritas aqui.
Nucleotídeos e nucleosídeos modificados
[000114] A presente invenção também inclui blocos de construção, por exemplo, ribonucleosídeos modificados, ribonucleotídeos modificados, dos polinucleotídeos, por exemplo, moléculas de RNA (ou mRNA) modificadas. Por exemplo, esses blocos de construção podem ser úteis para a preparação dos polinucleotídeos da invenção.
[000115] Em algumas modalidades, a molécula do bloco de construção tem a Fórmula (IIIa) ou (IIIa-1):
Figure img0025
um sal farmaceuticamente aceitável ou estereoisômero do mesmo, onde os substituintes são conforme aqui descrito (por exemplo, para Fórmulas (Ia) e (Ia-1)), e onde quando B é uma nucleobase não modificada selecionada de citosina, guanina, uracila e adenina, então pelo menos um de Y1, Y2 ou Y3 não é O.
[000116] Em algumas modalidades, a molécula do bloco de construção, que pode ser incorporada a um polinucleotídeo, tem a (IVa) ou HO OH (IVb),
Figure img0026
ou um sal farmaceuticamente aceitável ou estereoisômero do mesmo, onde B é conforme aqui descrito (por exemplo, qualquer um de (b1)-(b43)).
[000117] Em modalidades particulares, a Fórmula (IVa) ou (IVb) é combinada com uma uracila modificada (por exemplo, qualquer uma das fórmulas (b1)-(b9), (b21)-(b23) e (b28)-(b31), tal como fórmula (b1), (b8), (b28), (b29) ou (b30)). Em modalidades particulares, a Fórmula (IVa) ou (IVb) é combinada com uma citosina modificada (por exemplo, qualquer uma de fórmulas (b10)-(b14), (b24), (b25) e (b32)-(b36), tal como fórmula (b10) ou (b32)). Em modalidades particulares, a Fórmula (IVa) ou (IVb) é combinada com uma guanina modificada (por exemplo, qualquer uma das fórmulas (b15)-(b17) e (b37)-(b40)). Em modalidades particulares, a Fórmula (IVa) ou (IVb) é combinada com uma adenina modificada (por exemplo, qualquer uma das fórmulas (b18)-(b20) e (b41)-(b43)).
[000118] Em algumas modalidades, a molécula do bloco de construção, que pode ser incorporada a um polinucleotídeo, tem a Fórmula (IVc)-(IVk):
Figure img0027
Figure img0028
ou um sal farmaceuticamente aceitável ou estereoisômero do mesmo, onde B é conforme aqui descrito (por exemplo, qualquer um de (b1)- (b43)).
[000119] Em modalidades particulares, uma das Fórmulas (IVc)-(IVk) é combinada com uma uracila modificada (por exemplo, qualquer uma das Fórmulas (b1)-(b9), (b21)-(b23) e (b28)-(b31), tal como fórmula (b1), (b8), (b28), (b29) ou (b30)).
[000120] Em modalidades particulares, uma das Fórmulas (IVc)-(IVk) é combinada com uma citosina modificada (por exemplo, qualquer uma das Fórmulas (b10)-(b14), (b24), (b25) e (b32)-(b36), tal como fórmula (b10) ou (b32)).
[000121] Em modalidades particulares, uma das Fórmulas (IVc)-(IVk) é combinada com uma guanina modificada (por exemplo, qualquer uma das Fórmulas (b15)-(b17) e (b37)-(b40)).
[000122] Em modalidades particulares, uma das Fórmulas (IVc)-(IVk) é combinada com uma adenina modificada (por exemplo, qualquer uma das Fórmulas (b18)-(b20) e (b41)-(b43)).
[000123] Em outras modalidades, a molécula de bloco de construção, que pode ser incorporada a um polinucleotídeo, tem a Fórmula (Va) ou (Vb):
Figure img0029
(Vb), ou um sal farmaceuticamente aceitável ou estereoisômero do mesmo, onde B é conforme aqui descrito (por exemplo, qualquer um de (b1)-(b43)).
[000124] Em outras modalidades, a molécula de bloco de construção, que pode ser incorporada a um polinucleotídeo, tem a Fórmula (IXa)- (IXd):
Figure img0030
, ou um sal farmaceuticamente aceitável ou estereoisômero do mesmo, onde B é conforme aqui descrito (por exemplo, qualquer um de (b1)-(b43)).
[000125] Em modalidades particulares, uma das Fórmulas (IXa)-(IXd) é combinada com uma uracila modificada (por exemplo, qualquer uma das Fórmulas (b1)-(b9), (b21)-(b23) e (b28)-(b31), tal como fórmula (b1), (b8), (b28), (b29) ou (b30)). Em modalidades particulares, uma das Fórmulas (IXa)-(IXd) é combinada com uma citosina modificada (por exemplo, qualquer uma das Fórmulas (b10)-(b14), (b24), (b25) e (b32)- (b36), tal como fórmula (b10) ou (b32)).
[000126] Em modalidades particulares, uma das Fórmulas (IXa)-(IXd) é combinada com uma guanina modificada (por exemplo, qualquer uma das Fórmulas (b15)-(b17) e (b37)-(b40)).
[000127] Em modalidades particulares, uma das Fórmulas (IXa)-(IXd) é combinada com uma adenina modificada (por exemplo, qualquer uma das Fórmulas (b18)-(b20) e (b41)-(b43)).
[000128] Em outras modalidades, a molécula de bloco de construção, que pode ser incorporada a um polinucleotídeo, tem a Fórmula (IXe)- (IXg):
Figure img0031
aceitável ou estereoisômero do mesmo, onde B é conforme aqui descrito (por exemplo, qualquer um de (b1)-(b43)).
[000129] Em modalidades particulares, uma das Fórmulas (IXe)-(IXg) é combinada com uma uracila modificada (por exemplo, qualquer uma das Fórmulas (b1)-(b9), (b21)-(b23) e (b28)-(b31), tal como fórmula (b1), (b8), (b28), (b29) ou (b30)).
[000130] Em modalidades particulares, uma das Fórmulas (IXe)-(IXg) é combinada com uma citosina modificada (por exemplo, qualquer uma das Fórmulas (b10)-(b14), (b24), (b25) e (b32)-(b36), tal como fórmula (b10) ou (b32)).
[000131] Em modalidades particulares, uma das Fórmulas (IXe)-(IXg) é combinada com uma guanina modificada (por exemplo, qualquer uma das Fórmulas (b15)-(b17) e (b37)-(b40)).
[000132] Em modalidades particulares, uma das Fórmulas (IXe)-(IXg) é combinada com uma adenina modificada (por exemplo, qualquer uma das Fórmulas (b18)-(b20) e (b41)-(b43)).
[000133] Em outras modalidades, a molécula de bloco de construção,que pode ser incorporada a um polinucleotídeo, tem a Fórmula (IXh)-(IXk):
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ou um sal farmaceuticamente aceitável ou estereoisômero do mesmo, onde B é conforme aqui descrito (por exemplo, qualquer um de (b1)-(b43)). Em modalidades particulares, uma das Fórmulas (IXh)-(IXk) é combinada com uma uracila modificada (por exemplo, qualquer uma das Fórmulas (b1)-(b9), (b21)-(b23) e (b28)-(b31), tal como fórmula (b1), (b8), (b28), (b29) ou (b30)). Em modalidades particulares, uma das Fórmulas (IXh)- (IXk) é combinada com uma citosina modificada (por exemplo, qualquer uma das Fórmulas (b10)-(b14), (b24) (b25), e (b32)-(b36), tal como fórmula (b10) ou (b32)).
[000134] Em modalidades particulares, uma das Fórmulas (IXh)-(IXk) é combinada com uma guanina modificada (por exemplo, qualquer uma das Fórmulas (b15)-(b17) e (b37)-(b40)). Em modalidades particulares, uma das Fórmulas (IXh)-(IXk) é combinada com uma adenina modificada (por exemplo, qualquer uma das Fórmulas (b18)-(b20) e (b41)-(b43)).
[000135] Em outras modalidades, a molécula de bloco de construção, que pode ser incorporada a um polinucleotídeo, tem a Fórmula (IXl)-(IXr):
Figure img0033
estereoisômero do mesmo, oπde cada r1 e r2 é, iπdepeπdeπtemeπte, um número inteiro de a partir de 0 a 5 (por exemplo, de a partir de 0 a 3, de a partir de 1 a 3 ou de a partir de 1 a 5) e B é conforme aqui descrito (por exemplo, qualquer um de (b1)-(b43)).
[000136] Em modalidades particulares, uma das Fórmulas (IXl)-(IXr) é combinada com uma uracila modificada (por exemplo, qualquer uma das Fórmulas (b1)-(b9), (b21)-(b23) e (b28)-(b31), tal como fórmula (b1), (b8), (b28), (b29) ou (b30)).
[000137] Em modalidades particulares, uma das Fórmulas (IXl)-(IXr) é combinada com uma citosina modificada (por exemplo, qualquer uma das Fórmulas (b10)-(b14), (b24), (b25) e (b32)-(b36), tal como fórmula (b10) ou (b32)).
[000138] Em modalidades particulares, uma das Fórmulas (IXl)-(IXr) é combinada com uma guanina modificada (por exemplo, qualquer uma das Fórmulas (b15)-(b17) e (b37)-(b40)). Em modalidades particulares, uma das Fórmulas (IXl)-(IXr) é combinada com uma adenina modificada (por exemplo, qualquer uma das Fórmulas (b18)-(b20) e (b41)-(b43)).
[000139] Em algumas modalidades, a molécula de bloco de construção, que pode ser incorporada a um polinucleotídeo, pode ser selecionada do grupo consistindo em:
Figure img0034
Figure img0035
l farmaceuticamente aceitável ou estereoisômero do mesmo, onde cada r é, independentemente, um número inteiro de a partir de 0 a 5 (por exemplo, de a partir de 0 a 3, de a partir de 1 a 3 ou de a partir de 1 a 5).
[000140] Em algumas modalidades, a molécula de bloco de construção, que pode ser incorporada a um polinucleotídeo, pode ser selecionada do grupo consistindo em:
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farmaceuticamente aceitável ou estereoisômero do mesmo, onde cada r é, independentemente, um número inteiro de a partir de 0 a 5 (por exemplo, de a partir de 0 a 3, de a partir de 1 a 3 ou de a partir de 1 a 5) e s1 é conforme aqui descrito.
[000141] Em algumas modalidades, a molécula do bloco de construção, que pode ser incorporada a um ácido nucleico (por exemplo, RNA, mRNA, polinucleotídeo), é uma uridina modificada (por exemplo, selecionada do grupo consistindo em:
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ou um sal farmaceuticamente aceitável ou estereoisômero do mesmo, onde Y1, Y3, Y4, Y6 e r são conforme aqui descrito (por exemplo, cada r é, independentemente, um número inteiro de a partir de 0 a 5, tal como de a partir de 0 a 3, de a partir de 1 a 3 ou de a partir de 1 a 5)).
[000142] Em algumas modalidades, a molécula do bloco de construção, que pode ser incorporada a um polinucleotídeo, é uma citidina modificada (por exemplo, selecionada do grupo consistindo em:
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farmaceuticamente aceitável ou estereoisômero do mesmo, onde Y1, Y3, Y4, Y6 e r são conforme aqui descrito (por exemplo, cada r é, independentemente, um número inteiro de a partir de 0 a 5, tal como de a partir de 0 a 3, de a partir de 1 a 3 ou de a partir de 1 a 5)). Por exemplo, a molécula do bloco de construção, que pode ser incorporada a um polinucleotídeo, pode ser:
Figure img0055
ou um sal farmaceuticamente aceitável ou estereoisômero do mesmo, onde cada r é, independentemente, um número inteiro de a partir de 0 a 5 (por exemplo, de a partir de 0 a 3, de a partir de 1 a 3 ou de a partir de 1 a 5).
[000143] Em algumas modalidades, a molécula do bloco de construção, que pode ser incorporada a um polinucleotídeo, é uma adenosina modificada (por exemplo, selecionada do grupo consistindo em:
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farmaceuticamente aceitável ou estereoisômero do mesmo, onde Y1, Y3, Y4, Y6 e r são conforme aqui descrito (por exemplo, cada r é, independentemente, um número inteiro de a partir de 0 a 5, tal como de a partir de 0 a 3, de a partir de 1 a 3 ou de a partir de 1 a 5)).
[000144] Em algumas modalidades, a molécula de bloco de construção, que pode ser incorporada a um polinucleotídeo, é uma guanosina modificada (por exemplo, selecionada do grupo consistindo em:
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farmaceuticamente aceitável ou estereoisômero do mesmo, onde Y1,Y3, Y4, Y6 e r são conforme aqui descrito (por exemplo, cada r é, independentemente, um número inteiro de a partir de 0 a 5, tal como de a partir de 0 a 3, de a partir de 1 a 3 ou de a partir de 1 a 5)).
[000145] Em algumas modalidades, a modificação química da ranhura principal pode incluir substituição de grupo C em C-5 do anel (por exemplo, para um nucleosídeo pirimidina, talcomo citosina ou uracila) com N (por exemplo, substituição do grupo >CH em C-5 com grupo >NRN1, onde RN1 é H ou alquila opcionalmente substituída). Por exemplo, a molécula do bloco de construção, que pode ser incorporada a um polinucleotídeo, pode ser:
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(BB- 241), ou um sal farmaceuticamente aceitável ou estereoisômero do mesmo, onde cada r é, independentemente, um número inteiro de a partir de 0 a 5 (por exemplo, de a partir de 0 a 3, de a partir de 1 a 3 ou de a partir de 1 a 5).
[000146] Em outra modalidade, a modificação química da ranhura principal pode incluir substituição do hidrogênio em C-5 de citosina com halo (por exemplo, Br, Cl, F ou I) ou alquila opcionalmente substituída (por exemplo, metila). Por exemplo, a molécula do bloco de construção, que pode ser incorporada a um polinucleotídeo, pode ser:
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aceitável ou estereoisômero do mesmo, onde cada r é, independentemente, um número inteiro de a partir de 0 a 5 (por exemplo, de a partir de 0 a 3, de a partir de 1 a 3 ou de a partir de 1 a 5).
[000147] Em ainda uma modalidade adicional, a modificação química da ranhura principal pode incluir um anel fundido que é formado pelo NH2 na posição C-4 e o átomo de carbono na posição C-5. Por exemplo, a molécula do bloco de construção, que pode ser incorporada a um polinucleotídeo, pod ser:
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aceitável ou estereoisômero do mesmo, onde cada r é, independentemente, um número inteiro de a partir de 0 a 5 (por exemplo, de a partir de 0 a 3, de a partir de 1 a 3 ou de a partir de 1 a 5).
Modificações no açúcar
[000148] Os nucleosídeos e nucleotídeos modificados (por exemplo, moléculas de bloco de construção), que podem ser incorporados a um polinucleotídeo (por exemplo, RNA ou mRNA, conforme aqui descrito), podem ser modificados no açúcar do ácido ribonucleico. Por exemplo, o grupo 2’ hidroxila (OH) pode ser modificado ou substituído com vários substituintes diferentes. Substituições exemplares na posição 2’ incluem, mas não estão limitadas a, H, halo, C1-6 alquila opcionalmente substituída; C1-6 alcóxi opcionalmente substituído; C6-10 arilóxi opcionalmente substituído; C3-8 cicloalquila opcionalmente substituída; C3-8 cicloalcóxi opcionalmente substituído; C6-10 arilóxi opcionalmente substituído; C6-10 aril-C1-6 alcóxi opcionalmente substituído, C1-12 (heterociclila)óxi opcionalmente substituído; um açúcar (por exemplo, ribose, pentose ou qualquer um descrito aqui); um polietilenoglicol (PEG), -O(CH2CH2O)nCH2CH2OR, onde R é H ou alquila opcionalmente substituída e n é um número inteiro de a partir de 0 a 20 (por exemplo,de a partir de 0 a 4, de a partir de 0 a 8, de a partir de 0 a 10, de a partir de 0 a 16, de a partir de 1 a 4, de a partir de 1 a 8, de a partir de 1 a 10, de a partir de 1 a 16, de a partir de 1 a 20, de a partir de 2 a 4, de a partir de 2 a 8, de a partir de 2 a 10, de a partir de 2 a 16, de a partir de 2 a 20, de a partir de 4 a 8, de a partir de 4 a 10, de a partir de 4 a 16 e de a partir de 4 a 20); ácidos nucleicos "bloqueados" (LNA) ("Locked" Nucleic Acids) onde 2’-hidroxila é conectada por uma ponte C1-6 alquileno ou C1-6 heteroalquileno ao 4’-carbono do mesmo açúcar ribose, onde pontes exemplares incluíam pontes metileno, propileno, éter ou amino; aminoalquila, conforme aqui definido; aminoalcóxi, conforme aqui definido; amino conforme aqui definido; e aminoácido, conforme aqui definido.
[000149] Em geral, RNA inclui grupo de açúcar ribose, que é um anel de 5 membros tendo um oxigênio. Nucleotídeos modificados não limitantes, exemplares, incluem substituição do oxigênio em ribose (por exemplo, com S, Se ou alquileno, tal como metileno ou etileno); adição de uma ligação dupla (por exemplo, para substituir ribose com ciclopentenila ou ciclo-hexenila); contração do anel de ribose (por exemplo, para formar um anel de 4 membros de ciclobutano ou oxetano); expansão de anel de ribose (por exemplo, para formar um anel de 6 ou 7 membros tendo um carbono ou heteroátomo adicional, tal como anidroexitol, altritol, manitol, ciclo-hexenila, ciclo-hexenila e morfolino que também tem uma estrutura principal fosforamidato); formas multicíclicas (por exemplo, triciclo; e formas "não bloqueadas", tal como ácido nucleico de glicol (GNA) (por exemplo, R-GNA ou S- GNA, onde ribose é substituída por unidades glicol ligadas a ligações fosfodiéster), ácido nucleico de treose (TNA, onde ribose é substituída com α-L-treofuranosil-(3‘^2‘)), e ácido nucleico de peptídeo (PNA, onde ligações 2-amino-etil-glicina substituem a estrutura principal de ribose e fosfodiéster). O grupo açúcar pode também conter um ou mais carbonos que possuem a configuração estereoquímica oposta àquela do carbono correspondente em ribose. Desta maneira, uma molécula de polinucleotídeo pode incluir nucleotídeos contendo, por exemplo, arabinose, como o açúcar.
Modificações da Nucleobase
[000150] A presente invenção provê nucleosídeos e nucleotídeos modificados. Conforme aqui descrito, "nucleosídeo" é definido como um composto contendo uma molécula de açúcar (por exemplo, uma pentose ou ribose) ou derivado da mesma em combinação com uma base orgânica (por exemplo, uma purina ou pirimidina) ou um derivado da mesma (também referido aqui como "nucleobase"). Conforme aqui descrito, "nucleotídeo" é definido como um nucleosídeo incluindo um grupo fosfato. Em algumas modalidades, os nucleosídeos e nucleotídeos descritos aqui são geralmente quimicamente modificados na face da ranhura principal. Modificações não limitantes exemplares incluem um grupo amino, um grupo tiol, um grupo alquila, um grupo halo ou qualquer um descrito aqui. Os nucleotídeos modificados podem ser sintetizados através de qualquer método útil, conforme aqui descrito (por exemplo, quimicamente, enzimaticamente ou recombinantemente para incluir um ou mais nucleosídeos modificados ou não naturais).
[000151] O emparelhamento de base de nucleotídeo modificado compreende não apenas os pares de base adenosina-timina, adenosina-uracila ou guanosina-citosina, mas também pares de base formados entre nucleotídeos e/ou nucleotídeos modificados compreendendo bases não padrão ou modificadas, onde a disposição de doadores de ligação hidrogênio e aceitadores de ligação hidrogênio permite ligação hidrogênio entre uma base não padrão e uma base- padrão ou entre duas estruturas de base não padrão complementares. Um exemplo de tal emparelhamento de base não padrão é um emparelhamento de base entre o nucleotídeo modificado inosina e adenina, citosina ou uracila.
[000152] Os nucleosídeos e nucleotídeos modificados podem incluir uma nucleobase modificada. Exemplos de uma nucleobase encontrada em RNA incluem, mas não estão limitados a, adenina, guanina, citosina e uracila. Exemplos de nucleobase encontrada em DNA incluem, mas não estão limitados a, adenina, guanina, citosina e timina. Essas nucleobases podem ser modificadas ou totalmente substituídas para prover moléculas de polinucleotídeo tendo propriedades melhoradas, por exemplo, resistência a nucleases, estabilidade, e essas propriedades podem se manifestar através do rompimento da ligação de uma contraparte de ligação da ranhura principal. Por exemplo, os nucleosídeos ou nucleotídeos descritos podem ser quimicamente modificados na face da estrutura principal. Em algumas modalidades, as modificações químicas de ranhura principal podem incluir um grupo amino, um grupo tiol, um grupo alquila ou um grupo halo.
[000153] A Tabela 1 abaixo identifica as faces químicas de cada nucleotídeo canônico. Círculos identificam os átomos compreendendo as respectivas regiões químicas. Tabela 1
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[000154] Em algumas modalidades, B é uma uracila modificada. Uracilas modificadas exemplares incluem aquelas de Fórmula (b1)-(b5):
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(b4), ou
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(b5), ou um sal farmaceuticamente aceitável ouestereoisômero do mesmo, onde
Figure img0079
é uma ligação simples ou dupla;cada um de T1’, T1", T2‘ e T2" é, independentemente, H, alquila opcionalmente substituída, alcóxi opcionalmente substituído ou tioalcóxi opcionalmente substituído ou a combinação de T1’ e T1" ou a combinação de T2‘ e T2" se une (por exemplo, como em T2) para formar O (oxo), S (tio) ou Se (seleno);cada um de V1 e V2 é, independentemente, O, S, N(RVb)nv ou C(RVb)nv, onde nv é um número inteiro de a partir de 0 a 2 e cada RVb é, independentemente, H, halo, aminoácido opcionalmente substituído, alquila opcionalmente substituída, haloalquila opcionalmente substituída, alquenila opcionalmente substituída, alquinila opcionalmente substituída, alcóxi opcionalmente substituído, alquenilóxi opcionalmente substituído, alquinilóxi opcionalmente substituído, hidroxialquila opcionalmente substituída, hidroxialquenilaopcionalmente substituída, hidroxialquinila opcionalmente substituída, aminoalquila opcionalmente substituída (por exemplo, substituída com um grupo de proteção N, tal como qualquer um descrito aqui, por exemplo, trifluoracetila), aminoalquenila opcionalmente substituída, aminoalquinila opcionalmente substituída, acilaminoalquilaopcionalmente substituída (por exemplo, substituída com um grupo de N-proteção, tal como qualquer um descrito aqui, por exemplo, trifluoracetila), alcoxicarbonilalquila opcionalmente substituída, alcoxicarbonilalquenila opcionalmente substituída,alcoxicarbonilalquinila opcionalmente substituída oualcoxicarbonilalcóxi opcionalmente substituído (por exemplo, opcionalmente substituído com qualquer substituinte descrito aqui, tais como aqueles selecionados de (1)-(21) para alquila);R10 é H, halo, aminoácido opcionalmente substituído, hidróxi, alquila opcionalmente substituída, alquenila opcionalmente substituída, alquinila opcionalmente substituída, aminoalquila opcionalmente substituída, hidroxialquila opcionalmente substituída, hidroxialquenila opcionalmente substituída, hidroxialquinila opcionalmente substituída, aminoalquenila opcionalmente substituída, aminoalquinilaopcionalmente substituída, alcóxi opcionalmente substituído, alcoxicarbonilalquila opcionalmente substituída, alcoxicarbonilalquenila opcionalmente substituída, alcoxicarbonilalquinila opcionalmente substituída, alcoxicarbonilalcóxi opcionalmente substituído, carboalcóxi opcionalmente substituído, carboxialquila opcionalmente substituída ou carbamoilalquila opcionalmente substituída;R11 é H ou alquila opcionalmente substituída;R12a é H, alquila opcionalmente substituída, hidroxialquila opcionalmente substituída, hidroxialquenila opcionalmente substituída, hidroxialquinila opcionalmente substituída, aminoalquila opcionalmente substituída, aminoalquenila opcionalmente substituída ou aminoalquinila opcionalmente substituída, carboxialquila opcionalmente substituída (por exemplo, opcionalmente substituída com hidróxi), carboalcóxi opcionalmente substituído, carboxiaminoalquilaopcionalmente substituída ou carbamoilalquila opcionalmente substituída; eR12c é H, halo, alquila opcionalmente substituída, alcóxi opcionalmente substituído, tioalcóxi opcionalmente substituído, amino opcionalmente substituído, hidroxialquila opcionalmente substituída, hidroxialquenila opcionalmente substituída, hidroxialquinilaopcionalmente substituída, aminoalquila opcionalmente substituída, aminoalquenila opcionalmente substituída ou aminoalquinila opcionalmente substituída.
[000155] Outras uracilas modificadas exemplares incluem aquelas tendo a Fórmula (b6)-(b9):
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estereoisômero do mesmo, onde
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é uma ligação simples ou dupla; cada um de T1’, T1", T2’ e T2" é, independentemente, H, alquila opcionalmente substituída, alcóxi opcionalmente substituído ou tioalcóxi opcionalmente substituído ou a combinação de T1’ e T1" juntos (por exemplo, como em T1) ou a combinação de T2’ e T2" juntos (por exemplo, como em T2) para formar O (oxo), S (tio) ou Se (seleno) ou cada T1 e T2 é, independentemente, O (oxo), S (tio) ou Se (seleno);cada um de W1 e W2 é, independentemente, N(RWa)nw ou C(RWa)nw, onde nw é um número inteiro de a partir de 0 a 2 e cada RWa é, independentemente, H, alquila opcionalmente substituída ou alcóxi opcionalmente substituído;cada V3 é, independentemente, O, S, N(RVa)nv ou C(RVa)nv, onde nv é um número inteiro de a partir de 0 a 2 e cada RVa é, independentemente, H, halo, aminoácido opcionalmente substituído, alquila opcionalmente substituída, hidroxialquila opcionalmente substituída, hidroxialquenila opcionalmente substituída, hidroxialquinila opcionalmente substituída, alquenila opcionalmente substituída, alquinila opcionalmente substituída, heterociclila opcionalmente substituída, alquil heterociclila opcionalmente substituída, alcóxi opcionalmente substituído, alquenilóxi opcionalmente substituído ou alquinilóxi opcionalmente substituído, aminoalquila opcionalmente substituída (por exemplo, substituída com um grupo de proteção N, tal como qualquer um descrito aqui, por exemplo, trifluoroacetila ou sulfoalquila), aminoalquenila opcionalmente substituída, aminoalquinila opcionalmente substituída, acilaminoalquila opcionalmente substituída (por exemplo, substituída com um grupo de proteção N, tal como qualquer um descrito aqui, por exemplo, trifluoracetila), alcoxicarbonilalquila opcionalmente substituída, alcoxicarbonilalquenila opcionalmente substituída, alcoxicarbonilalquinila opcionalmente substituída, alcoxicarbonilacila opcionalmente substituída,alcoxicarbonilalcóxi opcionalmente substituído, carboxialquila opcionalmente substituída (por exemplo, opcionalmente substituída com hidróxido e/ou um grupo de proteção O), carboalcóxi opcionalmente substituído, carboxiaminoalquila opcionalmente substituída ou carbamoilalquila opcionalmente substituída (por exemplo, opcionalmente substituída com qualquer substituinte descrito aqui, tais como aqueles selecionados de (1)-(21) para alquila), e onde RVa e R12c junto com os átomos de carbono aos quais eles estão ligados podem formar cicloalquila opcionalmente substituída, arila opcionalmente substituída ou heterociclila opcionalmente substituída (por exemplo, um anel de 5 ou 6 membros);R12a é H, alquila opcionalmente substituída, hidroxialquila opcionalmente substituída, hidroxialquenila opcionalmente substituída, hidroxialquinila opcionalmente substituída, aminoalquila opcionalmente substituída, aminoalquenila opcionalmente substituída, aminoalquinila opcionalmente substituída, carboxialquila opcionalmente substituída (por exemplo, opcionalmente substituída com hidróxi e/ou um grupo de proteção O), carboalcóxi opcionalmente substituído,carboxiaminoalquila opcionalmente substituída, carbamoilalquila opcionalmente substituída ou está ausente;R12b é H, alquila opcionalmente substituída, alquenila opcionalmente substituída, alquinila opcionalmente substituída, hidroxialquila opcionalmente substituída, hidroxialquenila opcionalmente substituída, hidroxialquinila opcionalmente substituída, aminoalquila opcionalmente substituída, aminoalquenila opcionalmente substituída, aminoalquinila opcionalmente substituída, alcarila opcionalmente substituída, heterociclila opcionalmente substituída, alquil heterociclila opcionalmente substituída, aminoácido opcionalmente substituído, alcoxicarbonilacila opcionalmente substituída, alcoxicarbonilalcóxi opcionalmente substituído, alcoxicarbonilalquila opcionalmente substituída, alcoxicarbonilalquenila opcionalmente substituída, alcoxicarbonilalquinila opcionalmente substituída, alcoxicarbonilalcóxi opcionalmente substituído, carboxialquila opcionalmente substituída (por exemplo, opcionalmente substituída com hidróxido e/ou um grupo de proteção O), carboalcóxi opcionalmente substituído, carboxiaminoalquila opcionalmente substituída ou carbamoilalquila opcionalmente substituída, onde a combinação de R12b e T1’ ou a combinação de R12b e R12c pode se unir para formar heterociclila opcionalmente substituída; e R12c é H, halo, alquila opcionalmente substituída, alcóxi opcionalmente substituído, tioalcóxi opcionalmente substituído, amino opcionalmente substituído, aminoalquila opcionalmente substituída, aminoalquenila opcionalmente substituída ou aminoalquinila opcionalmente substituída.
[000156] Uracilas modificadas exemplares adicionais incluem aquelas tendo a Fórmula (b28)-(b31):
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Figure img0083
farmaceuticamente aceitável ou estereoisômero do mesmo, onde cada um de T1 e T2 é, independentemente, O (oxo), S (tio) ouSe (seleno);cada um de RVb’ e RVb" é, independentemente, H, halo, aminoácido opcionalmente substituído, alquila opcionalmente substituída, haloalquila opcionalmente substituída, hidroxialquila opcionalmente substituída, hidroxialquenila opcionalmente substituída, hidroxialquinila opcionalmente substituída, alquenila opcionalmente substituída, alquinila opcionalmente substituída, alcóxi opcionalmente substituído, alquenilóxi opcionalmente substituído, alquinilóxi opcionalmente substituído, aminoalquila opcionalmente substituída (por exemplo, substituída com um grupo de proteção N, tal como qualquerum descrito aqui, por exemplo, trifluoracetila ou sulfoalquila), aminoalquenila opcionalmente substituída, aminoalquinilaopcionalmente substituída, acilaminoalquila opcionalmente substituída (por exemplo, substituída com um grupo de proteção N, tal como qualquer um descrito aqui, por exemplo, trifluoracetila), alcoxicarbonilalquila opcionalmente substituída, alcoxicarbonilalquenila opcionalmente substituída, alcoxicarbonilalquinila opcionalmente substituída, alcoxicarbonilacila opcionalmente substituída,alcoxicarbonilalcóxi opcionalmente substituído, carboxialquila opcionalmente substituída (por exemplo, opcionalmente substituída com hidróxi e/ou um grupo de proteção O), carboalcóxi opcionalmente substituído, carboxiaminoalquila opcionalmente substituída ou carbamoilalquila opcionalmente substituída (por exemplo, opcionalmente substituída com qualquer substituinte descrito aqui, tais como aqueles selecionados de (1)-(21) para alquila) (por exemplo, RVb’ é alquila opcionalmente substituída, alquenila opcionalmente substituída ou aminoalquila opcionalmente substituída, por exemplo, substituída com um grupo de proteção N, tal como qualquer um descrito aqui, por exemplo, trifluoracetila ou sulfoalquila);R12a é H, alquila opcionalmente substituída,carboxiaminoalquila opcionalmente substituída, aminoalquila opcionalmente substituída (por exemplo, substituída com um grupo de proteção N, tal como qualquer um descrito aqui, por exemplo, trifluoracetila ou sulfoalquila), aminoalquenila opcionalmente substituída ou aminoalquinila opcionalmente substituída; eR12b é H, alquila opcionalmente substituída, alquenila opcionalmente substituída, alquinila opcionalmente substituída, hidroxialquila opcionalmente substituída, hidroxialquenilaopcionalmente substituída, hidroxialquinila opcionalmente substituída, aminoalquila opcionalmente substituída, aminoalquenila opcionalmente substituída, aminoalquinila opcionalmente substituída (por exemplo, substituída com um grupo de proteção N, tal como qualquer um descrito aqui, por exemplo, trifluoracetila ou sulfoalquila), alcoxicarbonilacila opcionalmente substituída, alcoxicarbonilalcóxi opcionalmente substituído, alcoxicarbonilalquila opcionalmente substituída, alcoxicarbonilalquenila opcionalmente substituída,alcoxicarbonilalquinila opcionalmente substituída, alcoxicarbonilalcóxi opcionalmente substituído, carboalcóxi opcionalmente substituído, carboxialquila opcionalmente substituída ou carbamoilalquila opcionalmente substituída.
[000157] Em modalidades particulares, T1 é O (oxo) e T2 é S (tio) ou Se (seleno). Em outras modalidades, T1 é S (tio) e T2 é O (oxo) ou Se (seleno). Em algumas modalidades, RVb’ é H, alquila opcionalmente substituída ou alcóxi opcionalmente substituído.
[000158] Em outras modalidades, cada R12a e R12b é,independentemente, H, alquila opcionalmente substituída, alquenila opcionalmente substituída, alquinila opcionalmente substituída ou hidroxialquila opcionalmente substituída. Em modalidades particulares, R12a é H. Em outras modalidades, ambos R12a e R12b são H.
[000159] Em algumas modalidades, cada RVb’de R12b é,independentemente, aminoalquila opcionalmente substituída (por exemplo, substituída com um grupo de proteção N, tal como qualquer um descrito aqui, por exemplo, trifluoracetila ou sulfoalquila), aminoalquenila opcionalmente substituída, aminoalquinila opcionalmente substituída ou acilaminoalquila opcionalmente substituída (por exemplo, substituída com um grupo de proteção N, tal como qualquer um descrito aqui, por exemplo, trifluoracetila). Em algumas modalidades, o amino e/ou alquila da aminoalquila opcionalmente substituída é substituído com um ou mais de alquila opcionalmente substituída, alquenila opcionalmente substituída, sulfoalquila opcionalmente substituída, carbóxi opcionalmente substituído (por exemplo, substituído com um grupo de proteção O), hidróxi opcionalmente substituído (por exemplo, substituído com um grupo de proteção O), carboxialquila opcionalmente substituída (por exemplo, substituída com um grupo de proteção O),alcoxicarbonilalquila opcionalmente substituída (por exemplo, substituída com um grupo de proteção O) ou grupo de proteção N. Em algumas modalidades, aminoalquila opcionalmente substituída é substituída com uma sulfoalquila opcionalmente substituída ou alquenila opcionalmente substituída. Em modalidades particulares, R12a e RVb" são ambos H. Em modalidades particulares, T1 é O (oxo) e T2 é S (tio) ou Se (seleno).
[000160] Em algumas modalidades, RVb’ é alcoxicarbonilalquila opci-onalmente substituída ou carbamoilalquila opcionalmente substituída.
[000161] Em modalidades particulares, o substituinte opcional para R12a, R12b, R12c ou RVa é um grupo polietileno glicol (por exemplo, - (CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR’, onde s1 é um número inteiro de a partir de 1 a 10 (por exemplo, de a partir de 1 a 6 ou de a partir de 1 a 4), cada um de s2 e s3, independentemente, é um número inteiro de a partir de 0 a 10 (por exemplo, de a partir de 0 a 4, de a partir de 0 a 6, de a partir de 1 a 4, de a partir de 1 a 6 ou de a partir de 1 a 10) e R’ é H ou C1-20 alquila); ou um grupo amino-polietileno glicol (por exemplo, - NRN1(CH2)s2(CH2CH2O)s1(CH2)s3NRN1, onde s1 é um número inteiro de a partir de 1 a 10 (por exemplo, de a partir de 1 a 6 ou de a partir de 1 a 4), cada um de s2 e s3, independentemente, é um número inteiro de a partir de 0 a 10 (por exemplo, de a partir de 0 a 4, de a partir de 0 a 6, de a partir de 1 a 4, de a partir de 1 a 6 ou de a partir de 1 a 10), e cada RN1 é, independentemente, hidrogênio ou C1-6 alquila opcionalmente substituída).
[000162] Em algumas modalidades, B é uma citosina modificada. Citosinas modificadas exemplares incluem compostos de Fórmula (b10)-(b14):
Figure img0084
farmaceuticamente aceitável ou estereoisômero do mesmo, onde cada um de T3’ e T3" é, independentemente, H, alquila opcionalmente substituída, alcóxi opcionalmente substituído ou tioalcóxi opcionalmente substituído ou a combinação de T3’ e T3" juntos (por exemplo, como em T3) para formar O (oxo), S (tio) ou Se (seleno);cada V4 é, independentemente, O, S, N(RVc)nv ou C(RVc)nv, onde nv é um número inteiro de a partir de 0 a 2 e cada RVc é, independentemente, H, halo, aminoácido opcionalmente substituído, alquila opcionalmente substituída, alquenila opcionalmente substituída, alquinila opcionalmente substituída, alcóxi opcionalmente substituído, alquenilóxi opcionalmente substituído, heterociclila opcionalmente substituída, alquil heterociclila opcionalmente substituída ou alquinilóxi opcionalmente substituído (por exemplo, opcionalmente substituído com qualquer substituinte descrito aqui, tais como aqueles selecionados de (1)-(21) for alquila), onde a combinação de R13b e RVc pode ser unida para formar heterociclila opcionalmente substituída;cada V5 é, independentemente, N(RVd)nv ou C(RVd)nv, onde nv é um número inteiro de a partir de 0 a 2 e cada RVd é, independentemente, H, halo, aminoácido opcionalmente substituído, alquila opcionalmente substituída, alquenila opcionalmente substituída, alquinila opcionalmente substituída, alcóxi opcionalmente substituído, alquenilóxi opcionalmente substituído, heterociclila opcionalmente substituída, alquil heterociclila opcionalmente substituída ou alquinilóxi opcionalmente substituído (por exemplo, opcionalmente substituído com qualquer substituinte descrito aqui, tais como aqueles selecionados de (1)-(21) para alquila) (por exemplo, V5 é -CH ou N);cada um de R13a e R13b é, independentemente, H, acila opcionalmente substituída, aciloxialquila opcionalmente substituída, alquila opcionalmente substituída ou alcóxi opcionalmente substituído, onde a combinação de R13b e R14 pode ser unida para formar heterociclila opcionalmente substituída;cada R14 é, independentemente, H, halo, hidróxi, tiol, acila opcionalmente substituída, aminoácido opcionalmente substituído, alquila opcionalmente substituída, haloalquila opcionalmente substituída, alquenila opcionalmente substituída, alquinila opcionalmente substituída, hidroxialquila opcionalmente substituída (por exemplo, substituída com um grupo de proteção O), hidroxialquenila opcionalmente substituída, hidroxialquinila opcionalmente substituída, alcóxi opcionalmente substituído, alquenilóxi opcionalmente substituído, alquinilóxi opcionalmente substituído, aminoalcóxi opcionalmente substituído, alcoxialcóxi opcionalmente substituído, aciloxialquila opcionalmente substituída, amino opcionalmente substituído (por exemplo, -NHR, onde R é H, alquila, arila ou fosforila), azido, arila opcionalmente substituída, heterociclila opcionalmente substituída, alquil heterociclila opcionalmente substituída, aminoalquila opcionalmente substituída, aminoalquenila opcionalmente substituída ou aminoalquinila opcionalmente substituída; ecada um de R15 e R16 é, independentemente, H, alquila opcionalmente substituída, alquenila opcionalmente substituída ou alquinila opcionalmente substituída.
[000163] Citosinas modificadas exemplares adicionais incluem aquelas de Fórmula (b32)-(b35):
Figure img0085
estereoisômero do mesmo, ondecada um de T1 e T3 é, independentemente, O (oxo), S (tio) ou Se (seleno);cada um de R13a e R13b é, independentemente, H, acila opcionalmente substituída, aciloxialquila opcionalmente substituída, alquila opcionalmente substituída ou alcóxi opcionalmente substituído, onde a combinação de R13b e R14 pode ser unida para formar heterociclila opcionalmente substituída;cada R14 é, independentemente, H, halo, hidróxi, tiol, acila opcionalmente substituída, aminoácido opcionalmente substituído, alquila opcionalmente substituída, haloalquila opcionalmente substituída, alquenila opcionalmente substituída, alquinila opcionalmente substituída, hidroxialquila opcionalmente substituída (por exemplo, substituída com um grupo de proteção O), hidroxialquenila opcionalmente substituída, hidroxialquinila opcionalmente substituída, alcóxi opcionalmente substituído, alquenilóxi opcionalmente substituído, alquinilóxi opcionalmente substituído, aminoalcóxi opcionalmente substituído, alcoxialcóxi opcionalmente substituído, aciloxialquila opcionalmente substituída, amino opcionalmente substituído (por exemplo, -NHR, onde R é H, alquila, arila ou fosforila), azido, arila opcionalmente substituída, heterociclila opcionalmente substituída, alquil heterociclila opcionalmente substituída, aminoalquila opcionalmente substituída (por exemplo, hidroxialquila, alquila, alquenila ou alquinila), aminoalquenila opcionalmente substituída ou aminoalquinila opcionalmente substituída; ecada um de R15 e R16 é, independentemente, H, alquila opcionalmente substituída, alquenila opcionalmente substituída ou alquinila opcionalmente substituída (por exemplo, R15 é H e R16 é H ou alquila opcionalmente substituída).
[000164] Em algumas modalidades, R15 é H e R16 é H ou alquila opcionalmente substituída. Em modalidades particulares, R14 é H, acila ou hidroxialquila. Em algumas modalidades, R14 é halo. Em algumas modalidades, ambos R14 e R15 são H. Em algumas modalidades, ambos R15 e R16 são H. Em algumas modalidades, cada um de R14 e R15 e R16 é H. Em modalidades adicionais, cada um de R13a e R13b é independentemente, H ou alquila opcionalmente substituída.
[000165] Exemplos não limitantes adicionais de citosinas modificadas incluem compostos de Fórmula (b36):
Figure img0086
, ou um sal farmaceuticamente aceitável ou estereoisômero do mesmo, ondecada R13b é, independentemente, H, acila opcionalmente substituída, aciloxialquila opcionalmente substituída, alquila opcionalmente substituída ou alcóxi opcionalmente substituído, onde a combinação de R13b e R14b pode ser unida para formar heterociclila opcionalmente substituída;cada R14a e R14b é, independentemente, H, halo, hidróxi, tiol,acila opcionalmente substituída, aminoácido opcionalmente substituído, alquila opcionalmente substituída, haloalquila opcionalmente substituída, alquenila opcionalmente substituída, alquinila opcionalmente substituída, hidroxialquila opcionalmente substituída (por exemplo, substituída com um grupo de proteção O), hidroxialquenila opcionalmente substituída, alcóxi opcionalmente substituído, alquenilóxi opcionalmente substituído, alquinilóxi opcionalmente substituído, aminoalcóxi opcionalmente substituído, alcoxialcóxi opcionalmente substituído, aciloxialquila opcionalmente substituída, amino opcionalmente substituído (por exemplo, -NHR, onde R é H, alquila, arila, fosforila, aminoalquila opcionalmente substituída ou carboxiaminoalquila opcionalmente substituída), azido, arila opcionalmente substituída, heterociclila opcionalmente substituída, alquil heterociclila opcionalmente substituída, aminoalquila opcionalmente substituída, aminoalquenila opcionalmente substituída ou aminoalquinila opcionalmente substituída; ecada um de R15 é, independentemente, H, alquilaopcionalmente substituída, alquenila opcionalmente substituída ou alquinila opcionalmente substituída.
[000166] Em modalidades particulares, R14b é um aminoácido opcionalmente substituído (por exemplo, lisina opcionalmente substituída). Em algumas modalidades, R14a é H.
[000167] Em algumas modalidades, B é uma guanina modificada. Guaninas modificadas exemplares incluem compostos de Fórmula (b15)-(b17):
Figure img0087
estereoisômero do mesmo, ondecada um de T4’, T4", T5‘, T5", T6’ e T6" é, independentemente,H, alquila opcionalmente substituída ou alcóxi opcionalmente substituído, e onde a combinação de T4’ e T4" (por exemplo, como em T4) ou uma combinação de T5’ e T5" (por exemplo, como em T5) ou uma combinação de T6’ e T6" junta (por exemplo, como em T6) forma O (oxo), S (tio) ou Se (seleno);cada um de V5 e V6 é, independentemente, O, S, N(RVd)nv ou C(RVd)nv, onde nv é um número inteiro de a partir de 0 a 2 e cada RVd é, independentemente, H, halo, tiol, aminoácido opcionalmente substituído, ciano, amidina, aminoalquila opcionalmente substituída, aminoalquenila opcionalmente substituída, aminoalquinilaopcionalmente substituída, alquila opcionalmente substituída, alquenila opcionalmente substituída, alquinila opcionalmente substituída, alcóxi opcionalmente substituído, alquenilóxi opcionalmente substituído, alquinilóxi opcionalmente substituído (por exemplo, opcionalmente substituído com com qualquer substituinte descrito aqui, tais como aqueles selecionados de (1)-(21) for alquila), tioalcóxi opcionalmente substituído ou amino opcionalmente substituído; ecada um de R17, R18, R19a, R19b, R21, R22, R23 e R24 é,independentemente, H, halo, tiol, alquila opcionalmente substituída, alquenila opcionalmente substituída, alquinila opcionalmente substituída, tioalcóxi opcionalmente substituído, amino opcionalmente substituído ou aminoácido opcionalmente substituído.
[000168] Guanosinas modificadas exemplares incluem compostos de Fórmula (b37)-(b40):
Figure img0088
aceitável ou estereoisômero do mesmo, ondecada um de T4’ é, independentemente, H, alquila opcionalmente substituída ou alcóxi opcionalmente substituído e cada T4 é, independentemente, O (oxo), S (tio) ou Se (seleno);cada um de R18, R19a, R19b e R21 é, independentemente, H, halo, tiol, alquila opcionalmente substituída, alquenila opcionalmente substituída, alquinila opcionalmente substituída, tioalcóxi opcionalmente substituído, amino opcionalmente substituído ou aminoácido opcionalmente substituído.Em algumas modalidades, R18 é H ou alquila opcionalmente substituída. Em modalidades adicionais, T4 é oxo. Em algumasmodalidades, cada um de R19a e R19b é, independentemente, H ou alquila opcionalmente substituída.
[000169] Em algumas modalidades, B é uma adenina modificada. Adeninas modificadas exemplares incluem compostos de Fórmula (b18)-(b20):
Figure img0089
estereoisômero do mesmo, ondecada V7 é, independentemente, O, S, N(RVe)nv ou C(RVe)nv,onde nv é um número inteiro de a partir de 0 a 2 e cada RVe é, independentemente, H, halo, aminoácido opcionalmente substituído, alquila opcionalmente substituída, alquenila opcionalmente substituída, alquinila opcionalmente substituída, alcóxi opcionalmente substituído, alquenilóxi opcionalmente substituído ou alquinilóxi opcionalmente substituído (por exemplo, opcionalmente substituído com qualquer substituinte descrito aqui, tais como aqueles selecionados de (1)-(21) para alquila);cada R25 é, independentemente, H, halo, tiol, alquila opcionalmente substituída, alquenila opcionalmente substituída, alquinila opcionalmente substituída, tioalcóxi opcionalmente substituído ou amino opcionalmente substituído;cada um de R26a e R26b é, independentemente, H, acila opcionalmente substituída, aminoácido opcionalmente substituído, carbamoilalquila opcionalmente substituída, alquila opcionalmente substituída, alquenila opcionalmente substituída, alquinila opcionalmente substituída, hidroxialquila opcionalmente substituída, hidroxialquenila opcionalmente substituída, hidroxialquinila opcionalmente substituída, alcóxi opcionalmente substituído ou grupo polietileno glicol (por exemplo, -(CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR’, onde s1 é um número inteiro de a partir de 1 a 10 (por exemplo, de a partir de 1 a 6 ou de a partir de 1 a 4), cada um de s2 e s3, independentemente, é um número inteiro de a partir de 0 a 10 (por exemplo, de a partir de 0 a 4, de a partir de 0 a 6, de a partir de 1 a 4, de a partir de 1 a 6 ou de a partir de 1 a 10) e R’ é H ou C1-20 alquila); ou um grupo amino-polietileno glicol (por exemplo, -NRN1(CH2)s2(CH2CH2O)s1(CH2)s3NRN1, onde s1 é um número inteiro de a partir de 1 a 10 (por exemplo, de a partir de 1 a6 ou de a partir de 1 a 4), cada um de s2 e s3, independentemente, éum número inteiro de a partir de 0 a 10 (por exemplo, de a partir de 0 a4, de a partir de 0 a 6, de a partir de 1 a 4, de a partir de 1 a 6 ou de apartir de 1 a 10), e cada RN1 é, independentemente, hidrogênio ou C1-6 alquila opcionalmente substituída);cada R27 é, independentemente, H, alquila opcionalmente substituída, alquenila opcionalmente substituída, alquinila opcionalmente substituída, alcóxi opcionalmente substituído, tioalcóxi opcionalmente substituído ou amino opcionalmente substituído;cada R28 é, independentemente, H, alquila opcionalmente substituída, alquenila opcionalmente substituída ou alquinila opcionalmente substituída; ecada R29 é, independentemente, H, acila opcionalmente substituída, aminoácido opcionalmente substituído, carbamoilalquila opcionalmente substituída, alquila opcionalmente substituída, alquenila opcionalmente substituída, alquinila opcionalmente substituída, hidroxialquila opcionalmente substituída, hidroxialquenila opcionalmente substituída, alcóxi opcionalmente substituído ou amino opcionalmente substituído.
[000170] Adeninas modificadas exemplares incluem compostos de Fórmula (b41)-(b43):
Figure img0090
estereoisômero do mesmo, ondecada R25 é, independentemente, H, halo, tiol, alquila opcionalmente substituída, alquenila opcionalmente substituída, alquinila opcionalmente substituída, tioalcóxi opcionalmente substituído ou amino opcionalmente substituído;cada um de R26a e R26b é, independentemente, H, acila opcionalmente substituída, aminoácido opcionalmente substituído, carbamoilalquila opcionalmente substituída, alquila opcionalmente substituída, alquenila opcionalmente substituída, alquinila opcionalmente substituída, hidroxialquila opcionalmente substituída, hidroxialquenila opcionalmente substituída, hidroxialquinilaopcionalmente substituída, alcóxi opcionalmente substituído ou grupo polietileno glicol (por exemplo, -(CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR’, onde s1 é um número inteiro de a partir de 1 a 10 (por exemplo, de a partir de 1 a 6 ou de a partir de 1 a 4), cada um de s2 e s3, independentemente, é um número inteiro de a partir de 0 a 10 (por exemplo, de a partir de 0 a 4, de a partir de 0 a 6, de a partir de 1 a 4, de a partir de 1 a 6 ou de a partir de 1 a 10), e R’ é H ou C1-20 alquila); ou um grupo amino-polietileno glicol (por exemplo, -NRN1(CH2)s2(CH2CH2O)s1(CH2)s3NRN1, onde s1 é um número inteiro de a partir de 1 a 10 (por exemplo, de a partir de 1 a6 ou de a partir de 1 a 4), cada um de s2 e s3, independentemente, éum número inteiro de a partir de 0 a 10 (por exemplo, de a partir de 0 a4, de a partir de 0 a 6, de a partir de 1 a 4, de a partir de 1 a 6 ou de apartir de 1 a 10), e cada RN1 é, independentemente, hidrogênio ou C1-6 alquila opcionalmente substituída); ecada R27 é, independentemente, H, alquila opcionalmente substituída, alquenila opcionalmente substituída, alquinila opcionalmente substituída, alcóxi opcionalmente substituído, tioalcóxi opcionalmente substituído ou amino opcionalmente substituído.
[000171] Em algumas modalidades, R26a é H e R26b é alquila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, cada um de R26a e R26b é, independentemente, alquila opcionalmente substituída. Em modalidades particulares, R27 é alquila opcionalmente substituída, alcóxi opcionalmente substituído ou tioalcóxi opcionalmente substituído. Em outras modalidades, R25 é alquila opcionalmente substituída, alcóxi opcionalmente substituído ou tioalcóxi opcionalmente substituído.
[000172] Em modalidades particulares, o substituinte opcional para R26a, R26b ou R29 é um grupo polietileno glicol (por exemplo, - (CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR’, onde s1 é um número inteiro de a partir de 1 a 10 (por exemplo, de a partir de 1 a 6 ou de a partir de 1 a 4), cada um de s2 e s3, independentemente, é um número inteiro de a partir de 0 a 10 (por exemplo, de a partir de 0 a 4, de a partir de 0 a 6, de a partir de 1 a 4, de a partir de 1 a 6 ou de a partir de 1 a 10), e R’ é H ou C1-20 alquila); ou um grupo amino-polietileno glicol (por exemplo, - NRN1(CH2)s2(CH2CH2O)s1(CH2)s3NRN1, onde s1 é um número inteiro de a partir de 1 a 10 (por exemplo, de a partir de 1 a 6 ou de a partir de 1 a 4), cada um de s2 e s3, independentemente, é um número inteiro de a partir de 0 a 10 (por exemplo, de a partir de 0 a 4, de a partir de 0 a 6, de a partir de 1 a 4, de a partir de 1 a 6 ou de a partir de 1 a 10) e cada RN1 é, independentemente, hidrogênio ou C1-6 alquila opcionalmente substituída).
[000173] Em algumas modalidades, B pode ter a Fórmula (b21):
Figure img0091
(b21), onde X12é, independentemente, O, S,alquileno opcionalmente substituído (por exemplo, metileno) ou heteroalquileno opcionalmente substituído, xa é um número inteiro de a partir de 0 a 3 e R12a e T2 são conforme aqui descrito.
[000174] Em algumas modalidades, B pode ter Fórmula (b22):
Figure img0092
(b22), onde R10’ é, independentemente,alquila opcionalmente substituída, alquenila opcionalmente substituída, alquinila opcionalmente substituída, arila opcionalmente substituída, heterociclila opcionalmente substituída, aminoalquila opcionalmente substituída, aminoalquenila opcionalmente substituída, aminoalquinila opcionalmente substituída, alcóxi opcionalmente substituído, alcoxicarbonilalquila opcionalmente substituída, alcoxicarbonilalquenila opcionalmente substituída, alcoxicarbonilalquinila opcionalmente substituída, alcoxicarbonilalcóxi opcionalmente substituído, carboalcóxi opcionalmente substituído, carboxialquila opcionalmente substituída ou carbamoilalquila opcionalmente substituída e R11, R12a, T1 e T2 são conforme aqui descrito.
[000175] Em algumas modalidades, B pode ter a Fórmula (b23):
Figure img0093
, onde R10 é heterociclila opcionalmentesubstituída (por exemplo, furila opcionamente substituída, tienila opcionalmente substituída ou pirrolila opcionalmente substituída), arila opcionalmente substituída (por exemplo, fenila opcionalmente substituída ou naftila opcionalmente substituída) ou com qualquer substituinte descrito aqui (por exemplo, para R10) ;e onde R11 (por exemplo, H ou qualquer substituinte descrito aqui), R12a (por exemplo, H ou qualquer substituinte descrito aqui), T1 (por exemplo, oxo ou qualquer substituinte descrito aqui) e T2 (por exemplo, oxo ou qualquer substituinte descrito aqui) são conforme aqui descrito.
[000176] Em algumas modalidades, B pode ter a Fórmula (b24):
Figure img0094
, onde R14’ é, independentemente,alquila opcionalmente substituída, alquenila opcionalmente substituída,alquinila opcionalmente substituída, arila opcionalmente substituída, heterociclila opcionalmente substituída, alcarila opcionalmente substituída, alquil heterociclila opcionalmente substituída, aminoalquila opcionalmente substituída, aminoalquenila opcionalmente substituída, aminoalquinila opcionalmente substituída, alcóxi opcionalmente substituído, alcoxicarbonilalquila opcionalmente substituída, alcoxicarbonilalquenila opcionalmente substituída,alcoxicarbonilalquinila opcionalmente substituída, alcoxicarbonilalcóxi opcionalmente substituído, carboalcóxi opcionalmente substituído, carboxialquila opcionalmente substituída ou carbamoilalquila opcionalmente substituída e R13a, R13b, R15 e T3 são conforme aqui descrito.
[000177] Em algumas modalidades, B pode ter a Fórmula (b25):
Figure img0095
, onde R14’ é heterociclila opcionalmente substituída (por exemplo, furila opcionamente substituída, tienila opcionalmente substituída ou pirrolila opcionalmente substituída), arila opcionalmente substituída (por exemplo, fenila opcionalmente substituída ou naftila opcionalmente substituída) ou qualquer substituinte descrito aqui (por exemplo, para R14 ou R14’); e onde R13a (por exemplo, H ou qualquer substituinte descrito aqui), R13b (por exemplo, H ou qualquer substituinte descrito aqui), R15 (por exemplo, H ou qualquer substituinte descrito aqui) e T3 (por exemplo, oxo ou com qualquer substituinte descrito aqui) são conforme aqui descrito.
[000178] Em algumas modalidades, B é uma nucleobase selecionada do grupo consistindo em citosina, guanina, adenina e uracila. Em algumas modalidades, B pode ser:
Figure img0096
[000179] Em algumas modalidades, a nucleobase modificada é uma uracila modificada. Nucleobases e nucleosídeos exemplares tendo uma uracila modificada incluem pseudouridina (^), ribonucleosídeo de piridin-4-ona, 5-aza-uridina, 6-aza-uridina, 2-tio-5-aza-uridina, 2-tio- uridina (s2U), 4-tio-uridina (s4U), 4-tio-pseudouridina, 2-tio-pseudouridina, 5-hidróxi-uridina (ho5U), 5-aminoalil-uridina, 5-halo- uridina (por exemplo, 5-iodo-uridine ou 5-bromo-uridina), 3-metil-uridina (m3U), 5-metóxi-uridina (mo5U), ácido uridino 5-oxiacético (cmo5U), metil éster do ácido uridino 5-acético (mcmo5U), 5-carboximetil-uridina (cm5U), 1-carboximetil-pseudouridina, 5-carboxidroximetil-uridina (chm5U), metil éster de 5-carboxidroximetil-uridina (mchm5U), 5- metoxicarbonilmetil-uridina (mcm5U), 5-metoxicarbonilmetil-2-tio-uridina (mcm5s2U), 5-aminometil-2-tio-uridina (nm5s2U), 5-metilaminometil- uridina (mnm5U), 5-metilaminometil-2-tio-uridina (mnm5s2U), 5- metilaminometil-2-seleno-uridina (mnm5se2U), 5-carbamoilmetil-uridina (ncm5U), 5-carboximetilaminometil-uridina (cmnm5U), 5- carboximetilaminometil-2-tio-uridina (cmnm5s2U), 5-propinil-uridina, 1- propinil-pseudouridina, 5-taurinometil-uridina (Tm5U), 1-taurinometil- pseudouridina, 5-taurinometil-2-tio-uridina (Tm5s2U), 1-taurinometil-4- tio-pseudouridina, 5-metil-uridina (m5U, isto é, tendo a nucleobase desoxitimina), 1-metil-pseudouridina (m1Φ), 5-metil-2-tio-uridina (m5s2U), 1-metil-4-tio-pseudouridina (m1s4Φ), 4-tio-1-metil- pseudouridina, 3-metil-pseudouridina (m3Φ), 2-tio-1-metil- pseudouridina, 1-metil-1-desaza-pseudouridina, 2-tio-1-metil-1-desaza- pseudouridina, di-hidrouridina (D), di-hidropseudouridina, 5,6-di- hidrouridina, 5-metil-di-hidrouridina (m5D), 2-tio-di-hidrouridina, 2-tio-di- hidropseudouridina, 2-metóxi-uridina, 2-metóxi-4-tio-uridina, 4-metóxi- pseudouridina, 4-metóxi-2-tio-pseudouridina, N1-metil-pseudouridina, 3-(3-amino-3-carboxipropil)uridina (acp3U), 1-metil-3-(3-amino-3-carboxipropil)pseudouridina (acp3 Φ), 5-(isopentenilaminometil)uridina (inm5U), 5-(isopentenilaminometil)-2-tio-uridina (inm5s2U), α-tio-uridina, 2‘-O-metil-uridina (Um), 5,2‘-O-dimetil-uridina (m5Um), 2‘-O-metil- pseudouridina (Φm), 2-tio-2‘-O-metil-uridina (s2Um), 5-metoxicarbonilmetil-2‘-O-metil-uridina (mcm5Um), 5-carbamoilmetil-2‘- O-metil-uridina (ncm5Um), 5-carboximetilaminometil-2‘-O-metil-uridina (cmnm5Um), 3,2‘-O-dimetil-uridina (m3Um) e 5-(isopentenilaminometil)- 2-O-metil-uridina (inm5Um), 1-tio-uridina, desoxitimidina, 2'-F-ara- uridina, 2'-F-uridina, 2'-OH-ara-uridina, 5-(2-carbometoxivinil)uridina e 5-[3-(1-E-propenilamino)uridina.
[000180] Em algumas modalidades, a nucleobase modificada é uma citosina modificada. Nucleobases e nucleosídeos exemplares tendo uma citosina modificada incluem 5-aza-citidina, 6-aza-citidina, pseudo- isocitidina, 3-metil-citidina (m3C), N4-acetil-citidina (ac4C), 5-formil- citidina (f5C), N4-metil-citidina (m4C), 5-metil-citidina (m5C), 5-halo- citidina (por exemplo, 5-iodo-citidina), 5-hidroximetil-citidina (hm5C), 1- metil-pseudo-isocitidina, pirrol-citidina, pirrol-pseudo-isocitidina, 2-tio- citidina (s2C), 2-tio-5-metil-citidina, 4-tio-pseudo-isocitidina, 4-tio-1- metil-pseudo-isocitidina, 4-tio-1-metil-1-desaza-pseudo-isocitidina, 1- metil-1-desaza-pseudo-isocitidina, zebularina, 5-aza-zebularina, 5- metil-zebularina, 5-aza-2-tio-zebularina, 2-tio-zebularina, 2-metóxi- citidina, 2-metóxi-5-metil-citidina, 4-metóxi-pseudo-isocitidina, 4-metóxi- 1-metil-pseudo-isocitidina, lisidina (k2C), α-tio-citidina, 2‘-O-metil-citidina (Cm), 5,2‘-O-dimetil-citidina (m5Cm), N4-acetil-2-O-metil-citidina (ac4Cm), N4,2‘-O-dimetil-citidina (m4Cm), 5-formil-2‘-O-metil-citidina (f5Cm), N4,N4,2‘-O-trimetil-citidina (m42Cm), 1-tio-citidina, 2'-F-ara- citidina, 2'-F-citidina e 2'-OH-ara-citidina.
[000181] Em algumas modalidades, a nucleobase modificada é uma adenina modificada. Nucleobases e nucleosídeos exemplares tendo uma adenina modificada incluem
[000182] 2-amino-purina, 2, 6-diaminopurina, 2-amino-6-halo-purina (por exemplo, 2-amino-6-cloro-purina), 6-halo-purina (por exemplo, 6- cloro-purina), 2-amino-6-metil-purina, 8-azido-adenosina, 7-desaza- adenina, 7-desaza-8-aza-adenina, 7-desaza-2-amino-purina, 7-desaza- 8-aza-2-amino-purina, 7-desaza-2,6-diaminopurina, 7-desaza-8-aza- 2,6-diaminopurina, 1-metil-adenosina (m1A), 2-metil-adenina (m2A), N6- metil-adenosina (m6A), 2-metiltio-N6-metil-adenosina (ms2m6A), N6- isopentenil-adenosina (i6A), 2-metiltio-N6-isopentenil-adenosina (ms2i6A), N6-(cis-hidroxiisopentenil)adenosina (io6A), 2-metiltio-N6-(cis- hidroxiisopentenil)adenosina (ms2io6A), N6-glicinilcarbamoil-adenosina (g6A), N6-treonilcarbamoil-adenosina (t6A), N6-metil-N6-treonilcarbamoil-adenosina (m6t6A), 2-metiltio-N6-treonilcarbamoil-adenosina (ms2g6A), N6,N6-dimetil-adenosina (m62A), N6-hidroxinorvalilcarbamoil-adenosina (hn6A), 2-metiltio-N6-hidroxinorvalilcarbamoil-adenosina (ms2hn6A), N6-acetil-adenosina(ac6A), 7-metil-adenina, 2-metiltio-adenina, 2-metóxi-adenina, α-tio- adenosina, 2‘-O-metil-adenosina (Am), N6,2‘-O-dimetil-adenosina (m6Am), N6,N6,2‘-O-trimetil-adenosina (m62Am), 1,2-O-dimetil-adenosina (m1Am), 2-O-ribosiladenosina (fosfato) (Ar(p)), 2-amino-N6- metil-purina, 1-tio-adenosina, 8-azido-adenosina, 2'-F-ara-adenosina, 2'-F-adenosina, 2'-OH-ara-adenosina e N6-(19-amino-pentaoxanonadecil)-adenosina.
[000183] Em algumas modalidades, a nucleobase modificada é uma guanina modificada. Nucleobase e nucleosídeos exemplares tendo uma guanina modificada incluem inosina (I), 1-metil-inosina (m1I), vinosina (imG), metilvinosina (mimG), 4-desmetil-vinosina (imG-14), isovinosina (imG2), vibutosina (yW), peroxivibutosina (o2yW), hidroxivibutosina (OHyW), hidroxivibutosina submodificada (OHyW*), 7-desaza- guanosina, queuosina (Q), epoxiqueuosina (oQ), galactosil-queuosina (galQ), manosil-queuosina (manQ), 7-ciano-7-desaza-guanosina (preQ0), 7-aminometil-7-desaza-guanosina (preQ1), arqueosina (G+), 7- desaza-8-aza-guanosina, 6-tio-guanosina, 6-tio-7-desaza-guanosina, 6- tio-7-desaza-8-aza-guanosina, 7-metil-guanosina (m7G), 6-tio-7-metil- guanosina, 7-metil-inosina, 6-metóxi-guanosina, 1-metil-guanosina (m1G), N2-metil-guanosina (m2G), N2,N2-dimetil-guanosina (m22G), N2,7-dimetil-guanosina (m2,7G), N2,N2,7-dimetil-guanosina (m2,2,7G), 8- oxo-guanosina, 7-metil-8-oxo-guanosina, 1-metil-6-tio-guanosina, N2- metil-6-tio-guanosina, N2,N2-dimetil-6-tio-guanosina, α-tio-guanosina, 2-O-metil-guanosina (Gm), N2-metil-2‘-O-metil-guanosina (m2Gm), N2,N2-dimetil-2‘-O-metil-guanosina (m22Gm), 1-metil-2‘-O-metil-guanosina (m1Gm), N2,7-dimetil-2‘-O-metil-guanosina (m2,7Gm), 2‘-O- metil-inosina (Im), 1,2-O-dimetil-inosina (m1Im), 2-O-ribosilguanosina (fosfato) (Gr(p)) , 1-tio-guanosina, O6-metil-guanosina, 2'-F-ara-guanosina e 2'-F-guanosina.
[000184] Em algumas modalidades, o nucleotídeo pode ser modificado na face da ranhura principal. Por exemplo, tais modificações incluem substituição de hidrogênio em C-5 de uracila ou citosina com alquila (por exemplo, metila) ou halo.
[000185] A nucleobase do nucleotídeo pode ser independentemente selecionada de uma purina, uma pirimidina, um análogo purina ou de pirimidina. Por exemplo, a nucleobase pode ser cada uma independentemente selecionada de adenina, citosina, guanina, uracila ou hipoxantina. Em outra modalidade, a nucleobase pode também incluir, por exemplo, derivados de ocorrência natural ou sintéticos de uma base, incluindo pirazol[3,4-d]pirimidina, 5-metilcitosina (5-me-C), 5- hidroximetil citosina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, 6-metila e outros derivados alquila de adenina e guanina, 2-propila e outros derivados alquila de adenina e guanina, 2-tiouracila, 2-tiotimina e 2- tiocitosina, 5-propinil uracila e citosina, 6-azo uracila, citosina e timina, 5-uracila (pseudouracila), 4-tiouracila, 8-halo (por exemplo, 8-bromo), 8- amino, 8-tiol, 8-tioalquila, 8-hidroxila e outras adeninas e guaninas 8 substituídas, 5-halo particularmente 5-bromo, 5-trifluormetila e outras uracilas e citosinas 5-substituídas, 7-metilguanina e 7-metiladenina, 8- azaguanina e 8-azaadenina, desazaguanina, 7-desazaguanina, 3- desazaguanina, desazaadenina, 7-desazaadenina, 3-desazaadenina, pirazol[3,4-d]pirimidina, imidazo[1,5-a]1,3,5 triazinonas, 9-desazapurinas, imidazo[4,5-d]pirazinas, tiazol[4,5-d]pirimidinas, pirazin- 2-onas, 1,2,4-triazina, piridazina; e 1,3,5 triazina. Quando os nucleotídeos são mostrados usando a estenografia A, G, C, T ou U, cada letra se refere à base representativa e/ou seus derivados, por exemplo, A inclui adenina ou análogos de adenina, por exemplo, 7- desazaadenina).
[000186] Em algumas modalidades, o nucleotídeo modificado é um composto de Fórmula XI:
Figure img0097
em que:
Figure img0098
significa uma ligação simples ou dupla;---significa uma ligação simples opcional;U é O, S, -NRa- ou -CRaRb- quando significa uma ligaçãosimples ou U é -CRa- quando significa uma ligação dupla;Z é H, C1-12 alquila ou C6-20 arila ou Z está ausente quando significa uma ligação dupla; eZ pode ser -CRaRb- e forma uma ligação com A;A é H, OH, NHR onde R= alquila ou arila ou fosforila, sulfato, -NH2, N3, azido, -SH, amino ácido N ou um peptídeo compreendendo 1 a 12 aminoácidos;D é H, OH, NHR onde R= alquila ou arila ou fosforila, -NH2, - SH, um aminoácido, um peptídeo compreendendo 1 a 12 aminoácidos ou um grupo de Fórmula XII:
Figure img0099
ou A e D junto com os átomos de carbono aos quais eles estão ligados formam um anel de 5 membros;X é O ou S;cada um de Y1 é independentemente selecionado de -ORa1, -NRa1Rb1 e -SRa1;cada um de Y2 e Y3 é independentemente selecionado de O, -CRaRb-, NRc, S ou um ligante compreendendo um ou mais átomos selecionados do grupo consistindo em C, O, N, e S;n é 0, 1, 2 ou 3;m é 0, 1, 2 ou 3;B é nucleobase;Ra e Rb são cada um independentemente H, C1-12 alquila, C212 alquenila, C2-12 alquinila ou C6-20 arila;Rc é H, C1-12 alquila, C2-12 alquenila, fenila, benzila, um grupo polietileno glicol ou um grupo amino-polietileno glicol;Ra1 e Rb1 são cada um independentemente H ou um contra- íon; e-ORc1 é OH em um pH de cerca de 1 ou -ORc1 é O- em pH fisiológico;contanto que o anel compreendendo as variáveis A, B, D, U, Z, Y2 e Y3 não possa ser ribose.
[000187] Em algumas modalidades, B é uma nucleobase selecionada do grupo consistindo em citosina, guanina, adenina e uracila.
[000188] Em algumas modalidades, a nucleobase é uma pirimidina ou derivado da mesma.
[000189] Em algumas modalidades, os nucleotídeos modificados são um composto de Fórmula XI-a:
Figure img0100
[000190] Em algumas modalidades, os nucleotídeos modificados são um composto de Fórmula XI-b:
Figure img0101
[000191] Em algumas modalidades, os nucleotídeos modificados são um composto de Fórmula XI-c1, XI-c2 ou XI-c3:
Figure img0102
[000192] Em algumas modalidades, os nucleotídeos modificados são um composto de Fórmula XI:
Figure img0103
em que:
Figure img0104
significa uma ligação simples ou dupla;---significa uma ligação simples opcional;U é O, S, -NRa- ou -CRaRb- quando significa uma ligação simples ou U é -CRa- quando significa uma ligação dupla;Z é H, C1-12 alquila ou C6-20 arila ou Z está ausente quando significa uma ligação dupla; eZ pode ser -CRaRb- e e forma uma ligação com A;A é H, OH, sulfato, -NH2, -SH, um aminoácido ou um peptídeo compreendendo 1 a 12 aminoácidos;D é H, OH, -NH2, -SH, um aminoácido, um peptídeo compreendendo 1 a 12 aminoácidos ou um grupo de Fórmula XII:
Figure img0105
ou A e D junto com os átomos de carbono aos quais eles estão ligados formam um anel de 5 membros;X é O ou S;cada um de Y1 é independentemente selecionado de -ORa1, -NRa1Rb1 e -SRa1;cada um de Y2 e Y3 é independentemente selecionado de O, -CRaRb-, NRc, S ou um ligante compreendendo um ou mais átomos selecionados do grupo consistindo em C, O, N e S;n é 0, 1, 2 ou 3;m é 0, 1, 2 ou 3;
[000193] B é uma nucleobase de Fórmula XIII:
Figure img0106
em que:V é N ou NRc positivamente carregado;R3 é NRcRd, -ORa ou -SRa;R4 é H ou pode opcionalmente formar uma ligação com Y3;R5 é H, -NRcRd ou -ORa;Ra e Rb são cada um independentemente H, C1-12 alquila, C212 alquenila, C2-12 alquinila ou C6-20 arila;Rc é H, C1-12 alquila, C2-12 alquenila, fenila, benzila, um grupo polietileno glicol ou um grupo amino-polietileno glicol;Ra1 e Rb1 são cada um independentemente H ou um contra- íon; e-ORc1 é OH em um pH de cerca de 1 ou -ORc1 é O- em pH fisiológico.
[000194] Em algumas modalidades, B é:
Figure img0107
onde R3 é -OH, -SH ou
[000195] Em algumas modalidades, B é:
Figure img0108
[000196] Em algumas modalidades, B é:
Figure img0109
[000197] Em algumas modalidades, os nucleotídeos modificados são um composto de Fórmula I-d:
Figure img0110
[000198] Em algumas modalidades, os nucleotídeos modificados são um composto selecionado do grupo consistindo em:
Figure img0111
Figure img0112
farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[000199] Em algumas modalidades, os nucleotídeos modificados são um composto selecionado do grupo consistindo em:
Figure img0113
Figure img0114
ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
Modificações na Ligação Internucleosídeo
[000200] Os nucleotídeos modificados, que podem ser incorporados a uma molécula de polinucleotídeo, podem ser modificados na ligação internucleosídeo (por exemplo, estrutura principal de fosfato). Aqui, no contexto da estrutura principal de polinucleotídeo, as expressões "fosfato" e "fosfodiéster" são usadas intercomutavelmente. Grupos fosfato de estrutura principal podem ser modificados através de substituição de um ou mais dos átomos de oxigênio com um substituinte diferente. Ainda, os nucleosídeos e nucleotídeos modificados podem incluir a substituição completa de uma porção fosfato não modificada com outras ligações internucleosídeo conforme descrito aqui. Exemplos de grupos fosfato modificados incluem, mas não estão limitados a, fosforotioato, fosforoselenatos, boranofosfatos, ésteres de boranofosfato, hidrogênio fosfonatos, fosforamidatos, osforodiamidatos, alquila ou aril fosfonatos e fosfotriésteres. Fosforoditioatos têm ambos oxigênios de não ligação substituídos por enxofre. A ligação fosfato pode ser também modificada pela substituição de um oxigênio de ligação com nitrogênio (fosforamidatos em ponte), enxofre (fosforotioatos em ponte) e carbono (metileno-fosfonatos em ponte).
[000201] A porção fosfato substituída com α-tio é provida para conferir estabilidade a polímeros de RNA e DNA através das ligações de estrutura principal de fosforotioato não naturais. DNA e RNA de fosforotioato têm resistência à nuclease aumentada e susequentemente uma meia-vida mais longa em um ambiente celular. Embora não desejando ser limitado pela teoria, moléculas de polinucleotídeo ligadas por fosforotioato são esperadas também ser reduzidas na resposta imune inata através de ligação/ativação mais fraca de moléculas imunes inatas celulares.
[000202] Em modalidades específicas, um nucleosídeo modificado inclui um alfa-tio-nucleosídeo (por exemplo, 5’-O-(1-tiofosfato)-adeno- sina, 5‘-O-(1-tiofosfato)-citidina (α-tio-citidina), 5‘-O-(1-tiofosfato)-gua- nosina, 5‘-O-(1-tiofosfato)-uridina ou 5‘-O-(1-tiofosfato)-pseudouridina).
[000203] Outras ligações internucleosídeo podem ser empregadas de acordo com a presente invenção, incluindo ligações internucleosídeo que não contêm um átomo de fosforo, conforme descrito aqui abaixo. Combinações de Ligações de Açúcares, Nucleobases e Internucleosídeo Modificadas
[000204] Os polinucleotídeos da presente invenção podem incluir uma combinação de modificações na ligação de açúcar, nucleobase e/ou internucleosídeo. Essas combinações podem incluir qualquer uma ou mais modificações descritas aqui. Por exemplo, qualquer um dos nucleotídeos descritos aqui nas Fórmulas (Ia), (Ia-1)-(Ia-3), (Ib)-(If), (IIa)-(IIp), (IIb-1), (IIb-2), (IIc-1)-(IIc-2), (IIn-1), (IIn-2), (IVa)-(IVl) e (IXa)- (IXr) pode ser combinado com qualquer uma das nucleobase descritas aqui (por exemplo, nas Fórmulas (b1)-(b43)) ou qualquer outra descrita aqui.
Síntese de Moléculas de Polinucleotídeo
[000205] As moléculas de polinucleotídeo para uso de acordo com a invenção podem ser preparadas de acordo com qualquer técnica útil, conforme aqui descrito. Os nucleosídeos e nucleotídeos modificados usados na síntese de moléculas de polinucleotídeo reveladas aqui podem ser preparados a partir de materiais de partida prontamente disponíveis usando os métodos e procedimentos gerais que seguem. Onde condições de processo típicas ou preferidas (por exemplo, temperaturas de reação, tempos, razões em mol de reagentes, solventes, pressões, etc) são providas, um versado na técnica seria capaz de otimizar e desenvolver condições de processo adicionais. Condições de reação ótimas podem variar com os reagentes ou solvente em particular usados, mas tais condições podem ser determinadas por um versado na técnica através de procedimentos de otimização de rotina.
[000206] Os processos descritos aqui podem ser monitorados de acordo com qualquer método adequado conhecido na técnica. Por exemplo, formação de produção pode ser monitorada através de meios espectroscópicos, tal como espectroscopia de ressonância magnética nuclear (por exemplo, 1H ou 13C), espectroscopia infravermelha, espectrofotometria (por exemplo, visível UV) ou espectrometria de massa, ou através de cromatografia tal como cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) ou cromatografia de camada fina.
[000207] Preparação de moléculas de polinucleotídeo da presente invenção pode envolver a proteção e a desproteção de vários grupos químicos. A necessidade de proteção e desproteção e a seleção de grupos de proteção apropriados podem ser prontamente determinadas por um versado na técnica. A química de grupos de proteção pode ser encontrada, por exemplo, em Greene e outros, Protective Groups in Organic Synthesis, 2a ed., Wiley & Sons, 1991, que é aqui incorporado a título de referência em sua totalidade.
[000208] As reações dos processos descritos aqui podem ser realizadas em solventes adequados, que podem ser prontamente selecionados por um versado na técnica de síntese orgânica. Solventes adequados podem ser substancialmente não reativos com os materiais de partida (reagentes), os intermediários ou produtos nas temperaturas nas quais as reações são realizadas, isto é, temperaturas que podem variar da temperatura de congelamento do solvente até a temperatura de ebulição do solvente. Uma dada reação pode ser realizada em um solvente ou uma mistura de mais de um solvente. Dependendo da etapa de reação particular, solventes adequados para uma etapa de reação particular podem ser selecionados.
[000209] Separação de misturas racêmicas de polinucleotídeos ou ácidos nucleicos modificados (por exemplo, polinucleotídeos ou moléculas de mRNA modificadas) pode ser realizada através de qualquer um de vários métodos conhecidos na técnica. Um método exemplar inclui recristalização fracional usando um "ácido de separação quiral" que é um ácido orgânico de formação de sal, opticamente ativo. Agentes de separação adequados para métodos de recristalização fracionais são, por exemplo, ácidos opticamente ativos, tais como as formas D e L de ácido tartárico, ácido diacetiltartárico, ácido dibenzoiltartárico, ácido mandélico, ácido málico, ácido láctico ou os vários ácidos canforsulfônicos opticamente ativos. Separação de misturas racêmicas pode também ser realizada através de eluição em uma coluna embalada com um agente opticamente ativo (por exemplo, dinitrobenzoilfenilglicina). Composição de solvente de eluição adequada pode ser determinada por um versado na técnica.
[000210] Nucleosídeos e nucleotídeos modificados (por exemplo, moléculas de bloco de construção) podem ser preparados de acordo com os métodos sintéticos descritos em Ogata e outros, J. Org. Chem. 74:2585-2588 (2009); Purmal e outros, Nucl. Acids Res. 22(1): 72-78, (1994); Fukuhara e outros, Biochemistry, 1(4): 563-568 (1962); e Xu e outros, Tetrahedron, 48(9): 1729-1740 (1992), cada um deles é aqui incorporado a título de referência em sua totalidade.
[000211] Os polinucleotídeos da invenção podem ou não ser uniformemente modificados ao longo de todo o comprimento da molécula. Por exemplo, um ou mais ou todos os tipos de nucleotídeo (por exemplo, purina ou pirimidina ou qualquer um ou mais ou todos de A, G, U, C) podem ou não ser uniformemente modificados em um polinucleotídeo da invenção ou em uma dada região de sequência predeterminada do mesmo. Em algumas modalidades, todos os nucleotídeos X em um polinucleotídeo da invenção (ou em uma dada região de sequência do mesmo) são modificados, onde X pode ser qualquer um dos nucleotídeos A, G, U, C ou qualquer uma das combinações A+G, A+U, A+C, G+U, G+C, U+C, A+G+U, A+G+C, G+U+C ou A+G+C.
[000212] Modificações de açúcar, modificações de nucleotídeo e/ou ligações internucleosídeo diferentes (por exemplo, estruturas de estrutura principal) podem existir em várias posições no polinucleotídeo. Um versado comum na técnica vai compreender que os análogos de nucleotídeo ou outra modificação(ões) podem estar localizados em qualquer posição(ões) de um polinucleotídeo de maneira que a função do polinucleotídeo não seja substancialmente diminuída. Uma modificação pode ser também uma modificação 5’ ou 3’ terminal. O polinucleotídeo pode conter de a partir de cerca de 1% a cerca de 100% de nucleotídeos modificados (ou em relação ao teor de nucleotídeo total, ou em relação a um ou mais tipos de nucelotídeo, isto é, qualquer um ou mais de A, G, U ou C) ou qualquer porcentagem entre eles (por exemplo, de a partir de 1% a 20%, de a partir de 1% a 25%, de a partir de 1% a 50%, de a partir de 1% a 60%, de a partir de 1% a 70%, de a partir de 1% a 80%, de a partir de 1% a 90%, de a partir de 1% a 95%, de a partir de 10% a 20%, de a partir de 10% a 25%, de a partir de 10% a 50%, de a partir de 10% a 60%, de a partir de 10% a 70%, de a partir de 10% a 80%, de a partir de 10% a 90%, de a partir de 10% a 95%, de a partir de 10% a 100%, de a partir de 20% a 25%, de a partir de 20% a 50%, de a partir de 20% a 60%, de a partir de 20% a 70%, de a partir de 20% a 80%, de a partir de 20% a 90%, de a partir de 20% a 95%, de a partir de 20% a 100%, de a partir de 50% a 60%, de a partir de 50% a 70%, de a partir de 50% a 80%, de a partir de 50% a 90%, de a partir de 50% a 95%, de a partir de 50% a 100%, de a partir de 70% a 80%, de a partir de 70% a 90%, de a partir de 70% a 95%, de a partir de 70% a 100%, de a partir de 80% a 90%, de a partir de 80% a 95%, de a partir de 80% a 100%, de a partir de 90% a 95%, de a partir de 90% a 100% e de a partir de 95% a 100%).
[000213] Em algumas modalidades, o polinucleotídeo inclui uma pirimidina modificada (por exemplo, uma uracila/uridina/U modificada ou citosina/citidina/C modificada). Em algumas modalidades, a uracila ou uridina (geralmente: U) na molécula de polinucleotídeo pode ser substituída com de a partir de cerca de 1% a cerca de 100% de uma uracila modificada ou uridina modificada (por exemplo, de a partir de 1% a 20%, de a partir de 1% a 25%, de a partir de 1% a 50%, de a partir de 1% a 60%, de a partir de 1% a 70%, de a partir de 1% a 80%, de a partir de 1% a 90%, de a partir de 1% a 95%, de a partir de 10% a 20%, de a partir de 10% a 25%, de a partir de 10% a 50%, de a partir de 10% a 60%, de a partir de 10% a 70%, de a partir de 10% a 80%, de a partir de 10% a 90%, de a partir de 10% a 95%, de a partir de 10% a 100%, de a partir de 20% a 25%, de a partir de 20% a 50%, de a partir de 20% a 60%, de a partir de 20% a 70%, de a partir de 20% a 80%, de a partir de 20% a 90%, de a partir de 20% a 95%, de a partir de 20% a 100%, de a partir de 50% a 60%, de a partir de 50% a 70%, de a partir de 50% a 80%, de a partir de 50% a 90%, de a partir de 50% a 95%, de a partir de 50% a 100%, de a partir de 70% a 80%, de a partir de 70% a 90%, de a partir de 70% a 95%, de a partir de 70% a 100%, de a partir de 80% a 90%, de a partir de 80% a 95%, de a partir de 80% a 100%, de a partir de 90% a 95%, de a partir de 90% a 100% e de a partir de 95% a 100% de uma uracila modificada ou uridina modificada). A uracila ou uridina modificada pode ser substituída por um composto tendo uma estrutura única simples ou por uma pluralidade de compostos tendo estruturas diferentes (por exemplo, 2, 3, 4 ou mais estruturas únicas, conforme aqui descrito). Em algumas modalidades, a citosina ou citidina (geralmente: C) na molécula de polinucleotídeo pode ser substituída com de a partir de cerca de 100% de uma citosina modificada ou citidina modificada (por exemplo, de a partir de (por exemplo, de a partir de 1% a 20%, de a partir de 1% a 25%, de a partir de 1% a 50%, de a partir de 1% a 60%, de a partir de 1% a 70%, de a partir de 1% a 80%, de a partir de 1% a 90%, de a partir de 1% a 95%, de a partir de 10% a 20%, de a partir de 10% a 25%, de a partir de 10% a 50%, de a partir de 10% a 60%, de a partir de 10% a 70%, de a partir de 10% a 80%, de a partir de 10% a 90%, de a partir de 10% a 95%, de a partir de 10% a 100%, de a partir de 20% a 25%, de a partir de 20% a 50%, de a partir de 20% a 60%, de a partir de 20% a 70%, de a partir de 20% a 80%, de a partir de 20% a 90%, de a partir de 20% a 95%, de a partir de 20% a 100%, de a partir de 50% a 60%, de a partir de 50% a 70%, de a partir de 50% a 80%, de a partir de 50% a 90%, de a partir de 50% a 95%, de a partir de 50% a 100%, de a partir de 70% a 80%, de a partir de 70% a 90%, de a partir de 70% a 95%, de a partir de 70% a 100%, de a partir de 80% a 90%, de a partir de 80% a 95%, de a partir de 80% a 100%, de a partir de 90% a 95%, de a partir de 90% a 100% e de a partir de 95% a 100% de uma citosina modificada ou citidina modificada). A citosina ou citidina modificada pode ser substituída por um composto tendo uma estrutura única simples ou por uma pluralidade de compostos tendo estruturas diferentes (por exemplo, 2, 3, 4 ou mais estruturas únicas, conforme descrito aqui).
[000214] Em algumas modalidades, a presente invenção provê métodos de síntese de um polinucleotídeo (por exemplo, a primeira região, primeira região de flanqueamento ou segundo região de flanqueamento) incluindo vários nucleosídeos ligados tendo a Fórmula (Ia-1):
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(Ia-1), compreendendo:
[000215] reação de um nucleotídeo de Fórmula (IV-1):
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[000216] com um composto fosforamidita de Fórmula (V-1):
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onde Y9 é H, hidróxi, fosforila, pirofosfato, sulfato, amino, tiol, aminoácido opcionalmente substituído ou um peptídeo (por exemplo, incluindo de a partir de 2 a 12 aminoácidos); e cada P1, P2 e P3 é, independentemente, um grupo de proteção adequado; e O significa um apoio sólido;
[000217] para prover um polinucleotídeo de Fórmula (VI-1):
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[000218] b) oxidação ou sulfurização do polinucleotídeo de Fórmula (V) para fornecer um polinucleotídeo de Fórmula (VII-1):
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c) remoção dos grupos de proteção para fornecer o polinucleotídeo de Fórmula (Ia).
[000219] Em algumas modalidades, as etapas a) e b) são repetidas de 1 a cerca de 10.000 vezes. Em algumas modalidades, os métodos compreendem ainda um nucleotídeo selecionado do grupo consistindo em A, C, G e U adenosina, citosina, guanosina e uracila. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo é um traduzível.
[000220] Outros componentes de polinucleotídeos são opcionais e são benéficos em algumas modalidades. Por exemplo, uma região não traduzida 5’ (UTR) e/ou uma UTR 3’ são providas, onde ou uma ou ambas podem conter independentemente uma ou mais modificações de nucleotídeo diferentes. Em tais modalidades, modificações de nucleotídeo podem também estar presentes na região traduzível. São também providos polinucleotídeos contendo uma sequência Kozak.
Combinação de Nucleotídeos
[000221] Exemplos adicionais de nucleotídeos modificados e combinações de nucleotídeo modificado são providos abaixo na Tabela 2. Essas combinações de nucleotídeos modificados podem ser usadas para formar os polinucleotídeos da invenção. A menos que de outro modo declarado, os nucleotídeos modificados podem substituir completamente os nucleotídeos naturais dos polinucleotídeos da invenção. Como um exemplo não limitante, a uridina de nucleotídeo natural pode ser substituída com um nucleosídeo modificado descrito aqui. Em outro exemplo não limitante, a uridina de nucleotídeo natural pode ser parcialmente substituída (por exemplo, cerca de 0,1%, 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99,9%) com pelo menos um dos nucleosídeos modificados revelados aqui. Tabela 2
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[000222] Certos nucleotídeos modificados e combinações de nucleotídeo foram explorados pelos presentes inventores. Essas constatações são descritas no Pedido de Patente Provisório U.S. No. 61/404.413 depositado em 1 de outubro de 2010 intitulado Engineered Nucleic Acids and Methods of Use Thereof, Pedido de Patente U.S. No. 13/251.840 depositado em 3 de outubro de 2011, intitulado
[000223] Modified Nucleotides, and Nucleic Acids, and Uses Thereof, agora abandonado, Pedido de Patente U.S. No. 13/481.127, depositado em 25 de maio de 2012, intitulado Modified Nucleotides, and Nucleic Acids, and Uses Thereof, Publicação de Pedido de Patente Internacional No. WO2012045075, depositado em 31 de outubro de 2011, intitulado Modified Nucleosides, Nucleotides, and Nucleic Acids, and Uses Thereof, Publicação de Patente U.S. No. US20120237975 depositado em 3 de outubro de 2011, intitulado Engineered Nucleic Acids and Method of Use Thereof e Publicação de Patente Internacional No. WO2012045082, que são aqui incorporados a título de referência em suas totalidades.
[000224] Exemplos adicionais de combinações de nucleotídeo modificado são providos abaixo na Tabela 3. Essas combinações de nucleotídeos modificados podem ser usadas para formar os polinucleotídeos da invenção.Tabela 3
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[000225] Em algumas modalidades, pelo menos 25% das citosinas são substituídos por um composto de Fórmula (b10)-(b14), (b24), (b25) ou (b32)-(b35) (por exemplo, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 45%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 55%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95% ou cerca de 100% de, por exemplo, de um composto de Fórmula (b10) ou (b32)).
[000226] Em algumas modalidades, pelo menos 25% das uracilas são substituídos por um composto de Fórmula (b1)-(b9), (b21)-(b23) ou (b28)-(b31) (por exemplo, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 45%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 55%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95% ou cerca de 100% de, por exemplo, de um composto de Fórmula (b1), (b8), (b28), (b29) ou (b30)).
[000227] Em algumas modalidades, pelo menos 25% das citosinas são substituídos por um composto de Fórmula (b10)-(b14), (b24), (b25) ou (b32)-(b35) (por exemplo, Fórmula (b10) ou (b32)), e pelo menos 25% das uracilas são substituídos por um composto de Fórmula (b1)- (b9), (b21)-(b23) ou (b28)-(b31) (por exemplo, Fórmula (b1), (b8), (b28), (b29) ou (b30)) (por exemplo, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 45%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 55%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95% ou cerca de 100%).
Modificações incluindo Ligante e Carga Útil
[000228] A nucleobase do nucleotídeo pode ser covalentemente ligada em qualquer posição quimicamente apropriada a uma carga útil, por exemplo, agente detectável ou agente terapêutico. Por exemplo, a nucleobase pode ser desaza-adenosina ou desaza-guanosina e o ligante pode ser ligado às posições C-7 ou C-8 da desaza-adenosina ou desaza-guanosina. Em outras modalidades, a nucleobase pode ser citosina ou uracila e o ligante pode ser ligado às posições N-3 ou C-5 de citosina ou uracila. O Esquema 1 abaixo mostra um nucleotídeo modificado exemplar onde a nucleobase, adenina, é ligada a um ligante na C-7 carbono de 7-desaza adenina. Ainda, o Esquema 1 mostra o nucleotídeo modificado com o ligante e carga útil, por exemplo, um agente detectável, incorporado à extremidade 3’ do mRNA. Clivagem de dissulfeto e 1,2-adição do grupo tiol no éster de propargila liberam o agente detectável. A estrutura restante (mostrada, por exemplo, como pApC5Parg no Esquema 1) é o inibidor. A lógica para a estrutura dos nucleotídeos modificados é que o inibidor ligado em corrente interfere estericamente com a habilidade da polimerase em incorporar uma segunda base. Desta maneira, é crítico que a corrente seja longa o suficiente para realizar sua função e que o inibidor esteja em uma orientação estereoquímica que iniba ou proíba segundo e seguintes nucleotídeos no fita do polinucleotídeo em formação. Esquema 1
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Ligante
[000229] O termo "ligante" conforme aqui usado se refere a um grupo de átomos, por exemplo, 10-1.000 átomos, e pode ser compreendido dos átomos ou grupos tais como, mas não limitado a, carbono, amino, alquilamino, oxigênio, enxofre, sulfóxido, sulfonila, carbonila e imina. O ligante pode ser ligado a um nucleosídeo ou nucleotídeo modificado na nucleobase ou porção açúcar em uma primeira extremidade e a uma carga útil, por exemplo, agente detectável ou terapêutico, em uma segunda extremidade. O ligante é de comprimento suficiente de maneira a não interferir com a incorporação em uma sequência de ácido nucleico.
[000230] Exemplos de grupos químicos que podem ser incorporados ao ligante incluem, mas não estão limitados a, um grupo alquila, alceno, uma alcina, um amido, um éter, um tio éter ou um éster. A cadeia de ligante pode também compreender parte de um anel saturado, insaturado ou aromático, incluindo anéis policíclicos ou heteroaromáticos onde o anel heteroaromático é um grupo arila contendo de a partir de um a quatro heteroátomos, N, O ou S. Exemplos específicos de ligantes incluem, mas não estão limitados a, alcanos insaturados, polietileno glicóis e polímeros de dextrano.
[000231] Por exemplo, o ligante pode incluir unidades monoméricas de etileno ou propileno glicol, por exemplo, dietileno glicol, dipropileno glicol, trietileno glicol, tripropileno glicol, tetraetileno glicol ou tetraetileno glicol. Em algumas modalidades, o ligante pode incluir uma porção alquila, alquenila e/ou alquinila divalente. O ligante pode incluir uma porção éster, amida ou éter.
[000232] Outros exemplos incluem porções cliváveis dentro do ligante, tal como, por exemplo, uma ligação dissulfeto (-S-S-) ou uma ligação azo (-N=N-), que podem ser clivadas usando um agente de redução ou fotólise. Uma ligação clivável incorporada ao ligante e ligada a um nucleotídeo modificado, quando clivada, resulta em, por exemplo, uma "cicatriz" curta ou modificação química no nucleotídeo. Por exemplo, após clivagem, a cicatriz resultante em uma base de nucleotídeo, que fazia parte do nucleotídeo modificado, e é incorporada a uma fita de polinucleotídeo, é não reativa e não precisa ser quimicamente neutralizada. Isso aumenta a facilidade com a qual um nucleotídeo subsequente pode ser incorporado durante sequenciamento de um modelo de polímero de ácido nucleico. Por exemplo, condições incluem o uso de tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP), ditiotreitol (DTT) e/ou outros agentes de redução para clivagem de uma ligação dissulfeto. Uma ligação seletivamente separável que inclui uma ligação amido pode ser clivada, por exemplo, através do uso de TCP ou outros agentes de redução e/ou fotólise. Uma ligação seletivamente separável que inclui uma ligação éster pode ser clivada, por exemplo, através de hidrólise ácida ou básica.
Carga Útil
[000233] Os métodos e composições descritos aqui são úteis para aplicação de uma carga útil a um alvo biológico. A carga útil pode ser usada, por exemplo, para marcação (por exemplo, um agente detectável tal como um fluoróforo) ou para propósitos terapêuticos (por exemplo, uma citotoxina ou outro agente terapêutico).
Carga Útil: Agentes Terapêuticos
[000234] Em algumas modalidades, a carga útil é um agente terapêutico tal como uma citotoxina, íon radioativo, agente quimioterapêutico ou outro agente terapêutico. Uma citotoxina ou agente citotóxico inclui qualquer agente que seja prejudicial para células. Exemplos incluem taxol, citocalasina B, gramicidina D, brometo de etídio, emetina, mitomicina, etoposídeo, tenoposídeo, vincristina, vimblastina, colchidina, doxorrubicina, daunorrubicina, di-hidroxi antracino diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-desidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lodocaína, propranolol, puromicina, maitansinoides, por exemplo, maitansinol (vide, por exemplo, Patente U.S. No. 5.208.020), CC-1065 (Patentes U.S. Nos. 5.475.092, 5.585.499, 5.846.545) e seus análogos e homólogos. Íons radioativos incluem, mas não estão limitados a, iodo (por exemplo, iodo 125 ou iodo 131), estrôncio 89, fósforo, paládio, césio, irídio, fosfoato, cobalto, ítrio 90, Samário 153 e praseodímio. Outros agentes terapêuticos incluem, mas não estão limitados a, antimetabolitos (por exemplo, metotrexato, 6-mercaptopurina, 6- tioguanina, citarabina, 5-fluoruracila descarbazina), agentes de alquilação (por exemplo, mecloretamina, tiotepa clorambutil, CC-1065, melfalano, carmustina (BSNU) e lomustina (CCNU), ciclofosfamida, bussulfano, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C e cis- diclorodiamino platina (II) (DDP) cisplatina), antraciclinas (por exemplo, daunorrubicina (antes daunomicina) e doxorrubicina), antibióticos (por exemplo, dactinomicina (antes actinomicina), bleomicina, mitramicina e antramicina (AMC)) e agentes antimitóticos (por exemplo, vincristina, vimblastina, taxol e maitansinoides).
Carga Útil: Agentes Detectáveis
[000235] Exemplos de substâncias detectáveis incluem várias moléculas pequenas orgânicas, compostos inorgânicos, nanopartículas, enzimas ou substratos de enzima, materiais fluorescentes, materiais luminescentes, materiais bioluminescentes, materiais quimioluminescentes, materiais radioativos e agentes de contraste. Tais marcadores opticamente detectáveis incluem, por exemplo, sem limitação, ácido 4-acetamido-4'-isotiocianatoestilbeno-2,2'dissulfônico; acridina e derivados: acridina, isotiocianato de acridina; ácido 5-(2'- aminoetil)aminonaftaleno-1 -sulfônico (EDANS); 4-amino-N-[3- vinilsulfonil)fenil]naftalimido-3,5 dissulfonato; N-(4-anilino-l- naftil)maleimida; antranilamida; BODIPY; Amarelo Brilhante; cumarina e derivados; cumarina; 7-amino-4-metilcumarina (AMC, Coumarin 120), 7-amino-4-trifluormetilcouluarina (Coumaran 151); corantes cianina; cianosina; 4',6-diaminidino-2-fenilindol (DAPI); 5' 5"-dibromopirogalol- sulfonaftaleína (Vermelho de Bromopirogalol); 7-dietilamino-3-(4'- isotiocianatofenil)-4-metilcumarina; pentaacetato de dietilenetriamina; ácido 4,4'-diisotiocianatodi-hidro-estilbeno-2,2'-dissulfônico; ácido 4,4'- diisotiocianatoestilbeno-2,2'-dissulfônico; cloreto de 5-[dimetilamino]- naftaleno-1-sulfonila (DNS, cloreto de dansila); 4-dimetilaminofenilazofenil-4'-isotiocianato (DABITC); eosina e derivados; eosina, isotiocianato de eosina, eritrosina e derivados; eritrosina B, eritrosina, isotiocianato; etídio; fluoresceína e derivados; 5- carboxifluoresceína (FAM), 5-(4,6-diclorotriazin-2-il)aminofluoresceína (DTAF), 2',7'-dimetóxi-4'5'-dicloro-6-carboxifluoresceína, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, QFITC, (XRITC); fluorescamina; IR144; IR1446; isotiocianato de Verde Malaquita; 4-metilumbeliferoneorto cresolftaleína; nitrotirosina; pararosanilina; Vermelho Fenol; B- ficoeritrina; o-ftaldialdeído; pireno e derivados: pireno, butirato de pireno, succinimidil 1-pireno; pontos quânticos de butirato; Vermelho Reativo 4 (CibacronTM Brilliant Red 3B-A) rodamina e derivados: 6- carbóxi-X-rodamina (ROX), 6-carboxirrodamina (R6G), lissamina rodamina B cloreto de sulfonila rodamina (Rhod), rodamina B, rodamina 123, isotiocianato de rodamina X, sulforrodamina B, sulforrodamina 101, derivado de cloreto de sulfonila de sulforrodamina 101 (Vermelho Texas); N,N,N',N'tetrametil-6-carboxirrodamina (TAMRA); tetrametil rodamina; isotiocianato de tetrametil rodamina (TRITC); riboflavina; ácido rosólico; derivados de quelato de térbio; Cianina-3 (Cy3); Cianina- 5 (Cy5); Cianina-5.5 (Cy5.5), Cianina-7 (Cy7); IRD 700; IRD 800; Alexa 647; La Jolta Blue; ftalo cianina; e naftalo cianina. Em algumas modalidades, o marcador detectável é corante fluorescente, tais como Cy5 e Cy3.
[000236] Exemplos de materiais luminescentes incluem luminol; exemplos de materiais bioluminescentes incluem luciferase, luciferina e aequorina.
[000237] Exemplos de materiais radioativos adequados incluem 18F, 67Ga, 81mKr, 82Rb, 111In, 123I, 133Xe, 201Tl, 125I, 35S, 14C ou 3H, 99mTc (por exemplo, pertecnetato (tecnetato(VII), TcO4-) ou diretamente ou indiretamente ou outro radioisótopo detectável através de contagem direta de radioemissão ou através de contagem por cintilação.
[000238] Ainda, agentes de contraste, por exemplo, agentes de contraste para MRI ou RMN, para CT de raios X, imagem Raman, tomografia de coerência óptica, imagem por absorção, imagem por ultrassom ou imagem térmica podem ser usados. Agentes de contraste exemplares incluem ouro (por exemplo, nanopartículas de ouro), gadolínio (por exemplo, Gd quelado), óxidos de ferro (por exemplo, óxido de ferro superparamagnético) (SPIO) (Superparamagnetic Iron Oxide), nanopartículas de óxido de ferro monocristalino (MIONs) (Monocrystalline Iron Oxide Nanoparticles) e óxido de ferro superparamagnético ultrapequeno (USPIO) (Ultrasmall Superparamagnetic Iron Oxide)), quelato de manganês (por exemplo, Mn-DPDP), sulfato de bário, meio de contraste iodado (ioexol), microbolhas ou perfluorcarbonos podem ser também usados.
[000239] Em algumas modalidades, o agente detectável é um percursor não detectável que se torna detectável quando da ativação. Exemplos incluem construtos de tetrazina fluorgênica-fluoróforo (por exemplo, tetrazina-BODIPY FL, tetrazina-Verde Oregon 488 ou tetrazina-BODIPY TMR-X) ou agentes fluorgênicos ativáveis por enzima (por exemplo, PROSENSE (VisEn Medical)).
[000240] Quando os compostos são enzimaticamente marcados com, por exemplo, peroxidase de rábano silvestre, fosfatase alcalina ou luciferase, o marcador enzimático é marcado através da determinação de conversão de um substrato apropriado em produto.
[000241] Ensaios in vitro onde essas composições podem ser usadas incluem ensaios imunoabsorventes ligados à enzima (ELISAs), imunoprecipitações, imunofluorescência, imunoensaio de enzima (EIA), radioimunoensaio (RIA) e análise Western blot.
[000242] Marcadores que não aqueles descritos aqui são compreendidos pela presente invenção, incluindo outros marcadores opticamente detectáveis. Marcadores podem ser ligados ao nucleotídeo modificado da presente invenção em qualquer posição usando químicas-padrão de maneira que o marcador pode ser removido da base incorporada quando da clivagem do ligante clivável.
Carga Útil: Cargas Úteis de Penetração em Célula
[000243] Em algumas modalidades, os nucleotídeos modificados e os ácidos nucleicos modificados podem também incluir uma carga útil que pode ser uma porção de penetração de célula ou agente que aumenta a aplicação intracelular das composições. Por exemplo, as composições podem incluir uma sequência de peptídeo de penetração de célula que facilita a aplicação ao espaço intracelular, por exemplo, peptídeo TAT derivado de HIV, penetratins, transportans, ou peptídeos de penetração na célula derivados de hCT, vide, por exemplo, Caron e outros (2001), (2001) Mol Ther. 3(3):310-8; Langel, Cell-Penetrating Peptides: Processes and Applications (CRC Press, Boca Raton FL 2002); El-Andaloussi e outros, (2005) Curr Pharm Des. 11(28):3597-611; e Deshayes e outros, (2005) Cell Mol Life Sci. 62(16):1839-49. As composicoes podem também ser formuladas para incluir um agente de penetração de célula, por exemplo, lipossomos, que aumentam a aplicação das composições ao espaço intracelular.
Carga Útil: Alvos Biológicos
[000244] Os nucleotídeos modificados e ácidos nucleicos modificados descritos aqui podem ser usados para aplicar uma carga útil a qualquer alvo biológico para o qual um ligante específico existe ou pode ser gerado. O ligante pode se ligar ao alvo biológico ou covalentemente ou não covalentemente.
[000245] Alvos biológicos exemplares incluem biopolímeros, por exemplo, anticorpos, ácidos nuclicos tais como RNA e DNA, proteínas, enzimas; proteínas exemplares incluem enzimas, receptores e canais de íon. Em algumas modalidades, o alvo é um marcador específico de tipo de célula ou tecido, por exemplo, uma proteína que é expressa especificamente em um tipo de tecido ou célula específico. Em algumas modalidades, o alvo é um receptor, tal como, mas não limitado a, receptores de membrana do plasma e receptores nucleares; exemplos mais específicos incluem receptores acoplados à proteína G, proteínas de poro de célula, proteínas transportadoras, anticorpos expressos na superfície, proteínas HLA, proteínas MHC e receptores de fator de crescimento.
Síntese de Nucleotídeos Modificados
[000246] Os nucleosídeos e os nucleotídeos modificados revelados aqui podem ser preparados a partir de materiais de partida prontamente disponíveis usando os métodos e procedimentos gerais que seguem. É compreendido que onde condições de processo típicas ou preferidas (isto é, temperaturas de reação, tempos, razões em mol de reagentes, solventes, pressões, etc.) são dadas, outras condições de processo podem ser usadas a menos que de outro modo declarado. Condições de reação ótimas podem variar com os reagentes ou solvente particulares usados, mas tais condições podem ser determinadas por aqueles versados na técnica através de procedimentos de otimização de rotina.
[000247] Os processos descritos aqui podem ser monitorados de acordo com qualquer método adequado conhecido na técnica. Por exemplo, formação de produto pode ser monitorada através de dispositivos espectroscópicos, tal como espectroscopia de ressonância magnética nuclear (por exemplo, 1H ou 13C), espectroscopia infravermelha, espectrofotometria (por exemplo, visível por UV), ou espectrometria de massa, ou através de cromatografia tal como cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) ou cromatografia de camada fina.
[000248] Preparação de nucleosídeos e nucleotídeos modificados pode envolver a proteção e a desproteção de vários grupos químicos. A necessidade de proteção e desproteção e a seleção de grupos de proteção adequados podem ser prontamente determinadas por um versado na técnica. A química de grupos de proteção pode ser encontrada, por exemplo, em Greene e outros, Protective Groups in Organic Synthesis, 2d. Ed., Wiley & Sons, 1991, o qual é aqui incorporado a título de referência em sua totalidade.
[000249] As reações dos processos descritos aqui podem ser realizadas em solventes adequados, que podem ser prontamente selecionados por um versado na técnica de síntese orgânica. Solventes adequados podem ser substancialmente não reativos com os materiais de partida (reagentes), os intermediários ou produtos nas temperaturas nas quais as reações são realizadas, isto é, temperaturas que podem variar da temperatura de congelamento do solvente até a temperatura de ebulição do solvente. Uma dada reação pode ser realizada em um solvente ou uma mistura de mais de um solvente. Dependendo da etapa de reação particular, solventes adequados para uma etapa de reação particular podem ser selecionados.
[000250] Separação de misturas racêmicas de nucleosídeos e nucleotídeos modificados pode ser realizada através de qualquer um de vários métodos conhecidos na técnica. Um método exemplar inclui recristalização fracional usando um "ácido de separação quiral" que é um ácido orgânico de formação de sal, opticamente ativo. Agentes de separação adequados para métodos de recristalização fracional são, por exemplo, ácidos opticamente ativos, tais como as formas D e L de ácido tartárico, ácido diacetiltartárico, ácido dibenzoiltartárico, ácido mandélico, ácido málico, ácido láctico ou os vários ácidos conforsulfônicos opticamente ativos. Separação de misturas racêmicas pode também ser realizada através de eluição em uma coluna embalada com um agente de separação opticamente ativo (por exemplo, dinitrobenzoilfenilglicina). Composição de solvente de eluição pode ser determinada por um versado na técnica.
[000251] Síntese exemplar de nucleotídeos modificados, que são incorporados em polinucleotídeos, por exemplo, RNA ou mRNA, é provida abaixo no Esquema 1 até o Esquema 12. O Esquema 2 provê um método geral para fosforilação de nucleosídeos, incluindo nucleosídeos modificados. Esquema 2
Figure img0126
[000252] Vários grupos de proteção podem ser usados para controlar a reação. Por exemplo, o Esquema 3 provê o uso de etapas de proteção e desproteção múltiplas para promover fosforilação na posição 5’ do açúcar ao invés dos grupos 2’ e 3’ hidroxila. Esquema 3
Figure img0127
[000253] Nucleotídeos modificados podem ser sintetizados de qualquer maneira útil. Os Esquemas 4, 5 e 8 proveem métodos exemplares para síntese de nucleotídeos modificados tendo uma nucleobase de purina modificada; e os Esquemas 6 e 7 proveem métodos exemplares para síntese de nucleotídeos modificados tendo uma pseudouridina ou pseudo-isocitidina modificada, respectivamente. Esquema 4
Figure img0128
Esquema 5
Figure img0129
Esquema 6
Figure img0130
Esquema 7
Figure img0131
Esquema 8
Figure img0132
[000254] Os Esquemas 9 e 10 proveem sínteses exemplares de nucleotídeos modificados. O Esquema 11 provê um método biocatalítico não limitante para produção de nucleotídeos. Esquema 9
Figure img0133
Esquema 10
Figure img0134
Esquema 11
Figure img0135
[000255] O Esquema 12 provê uma síntese exemplar de uma uracila modificada, onde a posição N1 na face da ranhura principal é modificada com R12b, conforme provido em outro ponto, e a posição 5’ de ribose é fosforilada. T1, T2, R12a, R12b e r são conforme aqui provido. Esta síntese, bem como suas versões modificadas, pode ser usada para modificar a face de ranhura principal de outras nucleobases de pirimidina e nucleobases de purina (vide, por exemplo, Fórmulas (b1)-(b43)) e/ou instalar um ou mais grupos fosfato (por exemplo, na posição 5’ do açúcar). Esta reação de alquilação pode ser também usada para incluir um ou mais grupos alquila opcionalmente substituídos em qualquer grupo reativo (por exemplo, grupo amino) em qualquer nucleobase descrita aqui (por exemplo, os grupos amino na face de emparelhamento de base Watson-Crick para citosina, uracila, adenina e guanina). Esquema 12
Figure img0136
[000256] Nucleosídeos e nucleotídeos modificados podem ser também preparados de acordo com os métodos sintéticos descritos em Ogata e outros, Journal of Organic Chemistry 74:2585-2588, 2009; Purmal e outros, Nucleic Acids Research 22(1): 72-78, 1994; Fukuhara e outros, Biochemistry 1(4): 563-568, 1962; e Xu e outros, Tetrahedron 48(9): 1729-1740, 1992, cada um aqui incorporado a título de referência em sua totalidade.
Ácidos Nucleicos Modificados
[000257] A presente invenção provê ácidos nucleicos (ou polinucleotídeos), incluindo RNAs tais como mRNAs que contêm um ou mais nucleosídeos modificados (chamados "ácidos nucleicos modificados") ou nucleotídeos conforme aqui descrito, que têm propriedades úteis incluindo a falta de uma indução substancial da resposta imune inata de uma célula na qual no mRNA é introduzido. Devido ao fato desses ácidos nucleicos modificados terem aumentado a eficiência de produção de proteína, retenção intracelular de ácidos nucleicos e viabilidade de células contatadas, bem como possuírem imunogenicidade reduzida, esses ácidos nucleicos tendo essas propriedades também são chamados aqui "ácidos nucleicos melhorados".
[000258] Ainda, a presente invenção provê ácidos nucleicos, que têm afinidade de ligação menor com uma contraparte de interação da ranhura principal, por exemplo, ligação. Por exemplo, os ácidos nucleicos são compreendidos de pelo menos um nucleotídeo que foi quimicamente modificado na face da ranhura principal conforme descrito aqui.
[000259] O termo "ácido nucleico", em seu sentido mais amplo, inclui qualquer composto e/ou substância que é ou pode ser incorporado a uma cadeia de oligonucleotídeo. Neste contexto, o termo ácido nucleico é usado sinonimamente com polinucleotídeo. Ácidos nucleicos exemplares para uso de acordo com a presente invenção incluem, mas não estão limitados a, um ou mais de DNA, RNA incluindo RNA mensageiro (mRNA), seus híbridos, agentes de indução de RNAi, agentes de RNAi, siRNAs, shRNAs, miRNAs, RNAs antissentido, ribozimas, DNA catalítico, RNAs que induzem formação de hélice tripla, aptâmeros, vetores, etc, descritos em detalhes aqui.
[000260] São providos aqui ácidos nucleicos modificados contendo uma região traduzível e uma, duas ou mais de duas modificações de nucleosídeo diferentes. Em algumas modalidades, o ácido nucleico modificado exibe degradação reduzida em uma célula na qual o ácido nucleico é introduzido, com relação a um ácido nucleico não modificado correspondente. Ácidos nucleicos exemplares incluem ácidos ribonucleicos (RNAs), ácidos desoxirribonucleicos (DNAs), ácidos nucleicos de treose (TNAs), ácidos nucleicos de glicol (GNAs) ou um híbrido do mesmo. Em modalidades preferidas, o ácido nucleico modificado inclui RNAs mensageiros (mRNAs). Conforme aqui descrito, os ácidos nucleicos da presente invenção não induzem substancialmente uma resposta imune inata de uma célula na qual o mRNA é introduzido.
[000261] Em certas modalidades, é desejável degradar intracelularmente um ácido nucleico modificado introduzido na célula, por exemplo, se cronometragem precisa de produção de proteína for desejada. Desta maneira, a presente invenção provê um ácido nucleico modificado contendo um domínio de degradação, que é capaz de ser atuado de uma maneira direta dentro de uma célula.
[000262] Outros componentes de ácido nucleico são opcionais e benéficos em algumas modalidades. Por exemplo, uma região não traduzida 5’ (UTR) (Untraslated Region) e/ou uma UTR 3’ são providas, onde uma ou ambas podem conter independentemente uma ou mais modificações de nucleosídeo diferentes. Em tais modalidades, modificações de nucleosídeo podem também estar presentes na região traduzível. São também providos aqui ácidos nucleicos contendo uma sequência Kozak.
[000263] Ainda, são providos aqui ácidos nucleicos contendo uma ou mais sequências de nucleotídeo intrônicas capazes de ser excisadas do ácido nucleico.
[000264] Ainda, são providos aqui ácidos nucleicos contendo um sítio interno de entrada do ribossomo (IRES) (Internal Ribosome Entry Site). Um IRES pode agir como o único sítio de ligação de ribossomo ou pode servir como um de múltiplos sítios de ligação de ribossomo de um mRNA. Um mRNA contendo mais de um sítio de ligação de ribossomo funcional pode codificar vários peptídeos ou polipeptídeos que são traduzidos independentemente pelos ribossomos ("mRNA multicistrônico"). Quando ácidos nucleicos são providos com IRES, opcionalmente adicionalmente provida é uma segunda região traduzível. Exemplos de sequências de IRES que podem ser usadas de acordo com a presente invenção incluem, sem limitação, aquelas de picornavírus (por exemplo, FMDV), vírus da peste (CFFV), vírus da pólio (PV), vírus da encefalomiocardite (ECMV), vírus da doença pé-e-boca (FMDV), vírus da hepatite C (HCV), vírus da febre suína clássica (CSFV), vírus da leucemia do murino (MLV), vírus da imunodeficiência simiana (SIV) ou vírus da paralisia cricket (CrPV).
[000265] Em outro aspecto, a presente invenção provê sequências de ácido nucleico compreendendo pelo menos dois nucleotídeos, a sequência de ácido nucleico compreendendo um nucleotídeo que rompe a ligação de uma contraparte de ligação da ranhura principal com a sequência de ácido nucleico, onde o nucleotídeo tem afinidade de ligação menor com a contraparte de ligação da ranhura principal.
[000266] Em algumas modalidades, o ácido nucleico é um composto de Fórmula XI-a:
Figure img0137
em que:
Figure img0138
significa uma ligação dupla opcional;---significa uma ligação simples opcional;U é O, S, -NRa- ou -CRaRb- quando significa uma ligação simples ou U é -CRa- quando significa uma ligação dupla;A é H, OH, fosforila, pirofosfato, sulfato, -NH2, -SH, um aminoácido, um peptídeo compreendendo 2 a 12 aminoácidos;X é O ou S;cada um de Y1 é independentemente selecionado de -ORa1, -NRa1Rb1 e -SRa1;cada um de Y2 e Y3 é independentemente selecionado de O, -CRaRb-, NRc, S ou um ligante compreendendo um ou mais átomos selecionados do grupo consistindo em C, O, N e S;Ra e Rb são cada um independentemente H, C1-12 alquila, C212 alquenila, C2-12 alquinila ou C6-20 arila;Rc é H, C1-12 alquila, C2-12 alquenila, fenila, benzila, um grupo polietileno glicol ou um grupo amino-polietileno glicol;Ra1 e Rb1 são cada um independentemente H ou um contra- íon;-ORc1 é OH em um pH de cerca de 1 ou -ORc1 é O- em pH fisiológico; eB é nucleobase;contanto que o anel compreendendo as variáveis A, B, D, U, Z, Y2 e Y3 não seja ribose.
[000267] Em algumas modalidades, B é uma nucleobase de Fórmula XII-a, XII-b ou XII-c:
Figure img0139
em que:
Figure img0140
significa uma ligação simples ou dupla;X é O ou S;U e W são cada um independentemente C ou N;V é O, S, C ou N;onde quando V é C então R1 é H, C1-6 alquila, C1-6 alquenila, C1-6 alquinila, halo ou -ORc, onde C1-20 alquila, C2-20 alquenila, C2-20 alquinila são cada uma opcionalmente substituídas com -OH, -NRaRb, - SH, -C(O)Rc, -C(O)ORc, -NHC(O)Rc ou -NHC(O)ORc;e onde quando V é O, S ou N então R1 está ausente;R2 é H, -ORc, -SRc, -NRaRb ou halo;ou quando V é C então R1 e R2 junto com os átomos de carbono aos quais eles estão ligados podem formar um anel de 5 ou 6 membros opcionalmente substituído com 1-4 substituintes selecionados de halo, -OH, -SH, -NRaRb, C1-20 alquila, C2-20 alquenila, C2-20 alquinila, C1-20 alcóxi ou C1-20 tioalquila;R3 é H ou C1-20 alquila;R4 é H ou C1-20 alquila; onde quando significa uma ligação dupla então R4 está ausente ou N-R4, juntos, formam um N positivamente carregado substituído com C1-20 alquila;Ra e Rb são cada um independentemente H, C1-20 alquila, C220 alquenila, C2-20 alquinila ou C6-20 arila; eRc é H, C1-20 alquila, C2-20 alquenila, fenila, benzila, um grupo polietileno glicol ou um grupo amino-polietileno glicol.
[000268] Em algumas modalidades, B é uma nucleobase de Fórmula XII-a1, XII-a2, XII-a3, XII-a4 ou XII-a5:
Figure img0141
[000269] Em algumas modalidades, a nucleobase é uma pirimidina ou derivado da mesma.
[000270] Em algumas modalidades, o ácido nucleico contém uma pluralidade de compostos estruturalmente únicos de Fórmula XI-a.
[000271] Em algumas modalidades, pelo menos 25% das citosinas são substituídas por um composto de Fórmula XI-a (por exemplo, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 45%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 55%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95% ou cerca de 100%).
[000272] Em algumas modalidades, pelo menos 25% das uracilas são substituídos por um composto de Fórmula XI-a (por exemplo, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 45%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 55%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95% ou cerca de 100%).
[000273] Em algumas modalidades, pelo menos 25% das citosinas e 25% das uracilas são substituídos por um composto de Fórmula XI-a (por exemplo, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 45%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 55%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95% ou cerca de 100%).
[000274] Em algumas modalidades, o ácido nucleico é traduzível.
[000275] Em algumas modalidades, quando o ácido nucleico inclui um nucleotídeo modificado com um ligante e carga útil, por exemplo, conforme aqui descrito, o nucleotídeo modificado com um ligante e carga útil está na extremidade 3’ do ácido nucleico.
Contrapartes de Interação de Ranhura Principal
[000276] Conforme aqui descrito, a expressão "contraparte de interação da ranhura principal" se refere a receptores de reconhecimento de RNA que detectam e respondem a ligantes de RNA através de interações, por exemplo, ligação, com a face da ranhura principal de um nucleotídeo ou ácido nucleico. Desta maneira, ligantes de RNA compreendendo nucleotídeos ou ácidos nucleicos modificados conforme aqui descrito diminuem as interações com contrapartes de ligação da ranhura principal, e então diminuem uma resposta inata, ou expressão e secreção de citocinas pró-inflamatórias, ou ambas.
[000277] Exemplos de contrapartes de interação de ranhura principal, por exemplo, ligação, incluem, mas não estão limitados a, nucleases e helicases. Dentro das membranas, TLRs (Receptores tipo Toll) (Toll- like-Receptors) 3, 7 e 8 podem responder a RNAs de fita simples e dupla. Dentro do citoplasma, membros da superfamília classe 2 de DEX(D/H) helicases e ATPases podem sentir RNAs para iniciar respostas antivirais. Essas helicases incluem o RIG-I (Gene-I Induzível por Ácido Retinoico) (Retinoic Acid-Inducible Gene I) e MDA5 (gene 5 associado à diferenciação de melanoma) (Melanoma Differentiation- Associated Gene 5). Outros exemplos incluem laboratório de genética e fisiologia 2 (LGP2) (Laboratory of Genetics and Physiology 2), proteínas contendo domínio HIN-200 ou proteínas contendo domínio Helicase.
Prevenção ou redução de resposta imune celular inata
[000278] O termo "resposta imune inata" inclui uma resposta celular a ácidos nucleicos de fita simples exógenos, geralmente de origem viral ou bacteriana, que envolve a indução de expressão e liberação de citocina, particularmente o interferon, e morte celular. Síntese de proteína é também reduzida durante a resposta imune celular inata. Embora seja vantajoso eliminar a resposta imune inata em uma célula que é disparada pela introdução de ácidos nucleicos exógenos, a presente invenção provê ácidos nucleicos modificados tais como mRNAs que reduzem substancialmente a resposta imune, incluindo sinalização de interferon, sem eliminar totalmente tal resposta. Em algumas modalidades, a resposta imune é reduzida em 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 99,9% ou mais do que 99,9% comparado com a resposta imune induzida por um ácido nucleico não modificado correspondente. Tal redução pode ser medida através do nível de expressão ou atividade de interferons Tipo 1 ou a expressão de genes regulados por interferon tais como receptores tipo toll (por exemplo, TLR7 e TLR8). Redução ou falta de indução de resposta imune inata pode ser também medida através da diminuição de morte celular seguindo uma ou mais administrações de RNAs modificados a uma população de célula, por exemplo, a morte celular é 10%, 25%, 50%, 75%, 85%, 90%, 95% ou mais de 95% menor do que a frequência de morte celular observada com um ácido nucleico não modificado correspondente. Além disso, morte celular pode afetar menos de 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 1%, 0,1%, 0,01% ou menos de 0,01% de células contatadas com os ácidos nucleicos modificados.
[000279] Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos modificados, incluindo polinucleotídeos e/ou moléculas de RNA, são modificados de maneira a não induzir, ou induzir apenas minimamente, uma resposta imune pela célula ou organismo recipiente. Tal evasão ou prevenção de disparo ou ativação de resposta imune é uma característica nova dos polinucleotídeos modificados da presente invenção.
[000280] A presente invenção provê a introdução repetida (por exemplo, transfecção) de ácidos nucleicos modificados em uma população de célula-alvo, por exemplo, in vitro, ex vivo ou in vivo. A etapa de contato da população celular pode ser repetida uma ou mais vezes (tal como duas, três, quatro, cinco ou mais de cinco vezes). Em algumas modalidades, a etapa de contato da população celular com os ácidos nucleicos modificados é repetida várias vezes o suficiente de maneira que uma eficiência predeterminada de tradução de proteína na população celular é obtida. Dada a citotoxicidade reduzida da população de célula-alvo provida pelas modificações de ácido nucleico, tais transfecções repetidas são obtidas em uma disposição diversa de tipos de célula in vitro e/ou in vivo.
Variantes de polipeptídeo
[000281] São providos ácidos nucleicos que codificam polipeptídeos variantes, que têm uma certa identidade com uma sequência de polipeptídeo de referência. O termo "identidade" como conhecido na técnica se refere a uma relação entre as sequências de dois ou mais peptídeos, conforme determinado comparando as sequências. Na técnica, "identidade" também significa o grau de relação de sequência entre os peptídeos, conforme determinado pelo número de compatibilidades entre as fitas de dois ou mais resíduos de aminoácido. "Identidade" mede a porcentagem de compatibilidades idênticas entre a menor de duas ou mais sequências com alinhamentos de lacuna (se algum) endereçados por um modelo matemático ou programa de computador particular (isto é, "algoritmos"). Identidade de peptídeos relacionados pode ser prontamente calculada através de métodos conhecidos. Tais métodos incluem, mas não estão limitados a, aqueles descritos em Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics e Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A. M., e Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Sequence Analysis Iniciador , Gribskov, M. e Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York, 1991; e Carillo e outros, SIAM J. Applied Math. 48, 1073 (1988).
[000282] Em algumas modalidades, a variante de polipeptídeo tem a mesma atividade ou atividade similar ao peptídeo de referência. Alternativamente, a variante tem uma atividade alterada (por exemplo, aumentada ou diminuída) com relação a um polipeptídeo de referência. Em geral, variantes de um polinucleotídeo ou polipeptídeo particular da presente invenção terão pelo menos cerca de 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com o polinucleotídeo ou polipeptídeo de referência particular conforme determinado pelos programas e parâmetros de alinhamento de sequência descritos aqui e conhecidos daqueles versados na técnica.
[000283] Conforme reconhecido por aqueles versados na técnica, fragmentos de proteína, domínios de proteína funcionais e proteínas homólogas são também considerados estar dentro do escopo da presente invenção. Por exemplo, é provido aqui um fragmento de proteína de uma proteína de referência (significando uma sequência de polipeptídeo pelo menos um resíduo de aminoácido menor do que uma sequência de polipeptídeo de referência, mas de outra maneira idêntica) 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 ou maior do que 100 aminoácidos de comprimento. Em outro exemplo, qualquer proteína que inclua uma extensão de cerca de 20, cerca de 30, cerca de 40, cerca de 50 ou cerca de 100 aminoácidos que são cerca de 40%, cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 80%, cerca de 90%, cerca de 95% ou cerca de 100% idênticos a qualquer uma das sequências descritas aqui pode ser utilizada de acordo com a presente invenção. Em certas modalidades, uma sequência de proteína a ser utilizada de acordo com a presente invenção inclui 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais mutações conforme mostrado em qualquer uma das sequências providas ou referidas aqui.
Bibliotecas de polipeptídeo
[000284] São também providas bibliotecas de polinucleotídeo contendo modificações de nucleosídeo, onde os polinucleotídeos contêm individualmente uma primeira sequência de ácido nucleico codificando um polipeptídeo, tal como um anticorpo, contraparte de ligação de proteína, proteína de base e outros polipeptídeos conhecidos na técnica. Preferivelmente, os polinucleotídeos são mRNA em uma forma adequada para introdução direta em um hospedeiro de célula- alvo, que por sua vez sintetiza o polipeptídeo codificado.
[000285] Em certas modalidades, variantes múltiplas de uma proteína, cada uma com modificação(ões) de aminoácido diferente, são produzidas e testadas para determinar a melhor variante em termos de farmacocinética, estabilidade, biocompatibilidade e/ou atividade biológica, ou uma propriedade biofísica tal como nível de expressão. Tal biblioteca pode conter 10, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109 ou mais de 109 variantes possíveis (incluindo substituições, deleções de um ou mais resíduos e inserção de um ou mais resíduos).
Complexos de polipeptídeo-ácido nucleico
[000286] Tradução de proteína apropriada envolve a agregação física de vários polipeptídeos e ácidos nucleicos associados com o mRNA. São providos pela presente invenção complexos de proteína-ácido nucleico contendo um mRNA traduzível tendo uma ou mais modificações de nucleosídeo (por exemplo, pelo menos duas modificações de nucleosídeo diferentes) e um ou mais polipeptídeos ligados ao mRNA. Em geral, as proteínas são providas em uma quantidade eficaz para prevenir ou reduzir uma resposta imune inata de uma célula na qual o complexo é introduzido.
Ácidos nucleicos modificados não traduzíveis
[000287] Conforme aqui descrito, são providos mRNAs tendo sequências que são substancialmente não traduzíveis. Tal mRNA é eficaz como uma vacina quando administrado a um indivíduo mamífero.
[000288] São também providos ácidos nucleicos modificados que contêm uma ou mais regiões de não codificação. Tais ácidos nucleicos modificados são geralmente não traduzidos, mas são capazes de ligação a e sequestro de um ou mais componente de maquinário traducional tal como uma proteína ribossomal ou um RNA de transferência (tRNA), desta maneira eficazmente reduzindo expressão de proteína na célula. O ácido nucleico modificado pode conter um RNA nucleolar pequena (sno-RNA), micro RNA (miRNA), RNA de interferência pequeno (siRNA) ou RNA de interação Piwi (piRNA).
Síntese de Ácidos Nucleicos Modificados
[000289] Ácidos nucleicos para uso de acordo com a presente invenção podem ser preparados de acordo com qualquer técnica disponível incluindo, mas não limitado a, síntese química, síntese enzimática, que é geralmente chamada transcrição in vitro, clivagem enzimática ou química de um precursor mais longo, etc. Métodos de síntese de RNAs são conhecidos na técnica (vide, por exemplo, Gait, M.J. (ed.) Oligonucleotide synthesis: a practical approach, Oxford [Oxfordshire], Washington, DC: IRL Press, 1984; e Herdewijn, P. (ed.) Oligonucleotide synthesis: methods and applications, Methods in Molecular Biology, v. 288 (Clifton, N.J.) Totowa, N.J.: Humana Press, 2005; ambos aqui incorporados a título de referência).
[000290] Ácidos nucleicos modificados não precisam ser uniformemente modificados ao longo de todo o comprimento da molécula. Modificações de nucleotídeo e/ou estruturas de estrutura principal diferentes podem existir em várias posições no ácido nucleico. Um versado comum na técnica compreenderá que os análogos de nucleotídeo ou outra modificação(ões) podem estar localizados em qualquer posição(ões) de um ácido nucleico de maneira que a função do ácido nucleico não seja substancialmente diminuída. Uma modificação pode ser também uma modificação 5’ ou 3’ terminal. Os ácidos nucleicos podem conter no mínimo um e no máximo 100% de nucleotídeos modificados, ou qualquer porcentagem entre elas, tal como pelo menos 5% de nucleotídeos modificados, pelo menos 10% de nucleotídeos modificados, pelo menos 25% de nucleotídeos modificados, pelo menos 50% de nucleotídeos modificados, pelo menos 80% de nucleotídeos modificados ou pelo menos 90% de nucleotídeos modificados. Por exemplo, os ácidos nucleicos podem conter uma pirimidina modificada tal como uracila ou citosina. Em algumas modalidades, pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 25%, pelo menos 50%, pelo menos 80%, pelo menos 90% ou 100% da uracila no ácido nucleico são substituídos com uma uracila modificada. A uracila modificada pode ser substituída por um composto tendo uma estrutura única simples ou pode ser substituída por uma pluralidade de compostos tendo estruturas diferentes (por exemplo, 2, 3, 4 ou mais estruturas únicas). Em algumas modalidades, pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 25%, pelo menos 50%, pelo menos 80%, pelo menos 90% ou 100% da citosina no ácido nucleico são substituídos com uma citosina modificada. A citosina modificada pode ser substituída por um composto tendo uma estrutura única simples ou pode ser substituída por uma pluralidade de compostos tendo estruturas diferentes (por exemplo, 2, 3, 4 ou mais estruturas únicas).
[000291] Em geral, o comprimento mais curto do mRNA modificado da presente invenção pode ser o comprimento de uma sequência de um mRNA que é suficiente para codificar um dipeptídeo. Em outra modalidade, o comprimento da sequência de um mRNA é suficiente para codificar um tripeptídeo. Em outra modalidade, o comprimento da sequência de um mRNA é suficiente para codificar um tetrapeptídeo. Em outra modalidade, o comprimento da sequência de um mRNA é suficiente para codificar um pentapeptídeo. Em outra modalidade, o comprimento da sequência de um mRNA é suficiente para codificar um hexapeptídeo. Em outra modalidade, o comprimento da sequência de um mRNA é suficiente para codificar um heptapeptídeo. Em outra modalidade, o comprimento da sequência de um mRNA é suficiente para codificar um octapeptídeo. Em outra modalidade, o comprimento da sequência de um mRNA é suficiente para codificar um nonapeptídeo. Em outra modalidade, o comprimento da sequência de um mRNA é suficiente para codificar um decapeptídeo.
[000292] Exemplos de dipeptídeos que as sequências de ácido nucleico modificadas podem codificar incluem, mas não estão limitados a, carnosina e anserina.
[000293] Em uma modalidade adicional, o mRNA é maior do que 30 nucleotídeos de comprimento. Em outra modalidade, a molécula de mRNA é maior do que 35 nucleotídeos de comprimento. Em outra modalidade, o comprimento é pelo menos de 40 nucleotídeos. Em outra modalidade, o comprimento é pelo menos 45 nucleotídeos. Em outra modalidade, o comprimento é pelo menos 55 nucleotídeos. Em outra modalidade, o comprimento é pelo menos de 60 nucleotídeos. Em outra modalidade, o comprimento é pelo menos 60 nucleotídeos. Em outramodalidade, o comprimento é pelo menos 80 nucleotídeos. Em outramodalidade, o comprimento é pelo menos 90 nucleotídeos. Em outramodalidade, o comprimento é pelo menos 100 nucleotídeos. Em outramodalidade, o comprimento é pelo menos 120 nucleotídeos. Em outramodalidade, o comprimento é pelo menos 140 nucleotídeos. Em outramodalidade, o comprimento é pelo menos 160 nucleotídeos. Em outramodalidade, o comprimento é pelo menos 180 nucleotídeos. Em outramodalidade, o comprimento é pelo menos 200 nucleotídeos. Em outramodalidade, o comprimento é pelo menos 250 nucleotídeos. Em outramodalidade, o comprimento é pelo menos 300 nucleotídeos. Em outra modalidade, o comprimento é pelo menos 350 nucleotídeos. Em outramodalidade, o comprimento é pelo menos 400 nucleotídeos. Em outramodalidade, o comprimento é pelo menos 450 nucleotídeos. Em outramodalidade, o comprimento é pelo menos 500 nucleotídeos. Em outramodalidade, o comprimento é pelo menos 600 nucleotídeos. Em outramodalidade, o comprimento é pelo menos 700 nucleotídeos. Em outramodalidade, o comprimento é pelo menos 800 nucleotídeos. Em outramodalidade, o comprimento é pelo menos 900 nucleotídeos. Em outramodalidade, o comprimento é pelo menos 1000 nucleotídeos. Em outramodalidade, o comprimento é pelo menos 1100 nucleotídeos. Em outramodalidade, o comprimento é pelo menos 1200 nucleotídeos. Em outramodalidade, o comprimento é pelo menos 1300 nucleotídeos. Em outramodalidade, o comprimento é pelo menos 1400 nucleotídeos. Em outramodalidade, o comprimento é pelo menos 1500 nucleotídeos. Em outramodalidade, o comprimento é pelo menos 1600 nucleotídeos. Em outramodalidade, o comprimento é pelo menos 1800 nucleotídeos. Em outramodalidade, o comprimento é pelo menos 2000 nucleotídeos. Em outramodalidade, o comprimento é pelo menos 2500 nucleotídeos. Em outramodalidade, o comprimento é pelo menos 3000 nucleotídeos. Em outramodalidade, o comprimento é pelo menos 4000 nucleotídeos. Em outramodalidade, o comprimento é pelo menos 5000 nucleotídeos ou mais do que 5000 nucleotídeos.
[000294] Por exemplo, os ácidos nucleicos modificados descritos aqui podem ser preparados usando métodos que são conhecidos daqueles versados na técnica de síntese de ácido nucleico.
[000295] Em algumas modalidades, a presente invenção provê métodos, por exemplo, enzimáticos, de preparação de uma sequência de ácido nucleico compreendendo um nucleotídeo que rompe a ligação de uma contraparte de ligação da ranhura principal com a sequência de nucleotídeo, onde a sequência de ácido nucleico compreende um composto de Fórmula XI-a:
Figure img0142
em que:o nucleotídeo tem afinidade de ligação diminuída com a contraparte de ligação da ranhura principal;
Figure img0143
significa uma ligação dupla opcional;---significa uma ligação simples opcional;U é O, S, -NRa- ou -CRaRb- quando significa uma ligação simples ou U é -CRa- quando significa uma ligação dupla;A é H, OH, fosforila, pirofosfato, sulfato, -NH2, -SH, um aminoácido, um peptídeo compreendendo 2 a 12 aminoácidos;X é O ou S;cada um de Y1 é independentemente selecionado de -ORa1, -NRa1Rb1 e -SRa1;cada um de Y2 e Y3 é independentemente selecionado de O, -CRaRb-, NRc, S ou um ligante compreendendo um ou mais átomos selecionados do grupo consistindo em C, O, N e S;Ra e Rb são cada um independentemente H, C1-12 alquila, C212 alquenila, C2-12 alquinila ou C6-20 arila;Rc é H, C1-12 alquila, C2-12 alquenila, fenila, benzila, um grupo polietileno glicol ou um grupo amino-polietileno glicol;Ra1 e Rb1 são cada um independentemente H ou um contraíon;-ORc1 é OH em um pH de cerca de 1 ou -ORc1 é O- em pH fisiológico; e B é nucleobase;contanto que o anel compreendendo as variáveis A, B, D, U, Z, Y2 e Y3 não seja ribose o método compreendendo reação de um composto de Fórmula XIII:
Figure img0144
com uma polimerase de RNA e um modelo de cDNA.
[000296] Em algumas modalidades, a reação é repetida de 1 a cerca de 7.000 vezes.
[000297] Em algumas modalidades, B é uma nucleobase de Fórmula XII-a, XII-b ou XII-c:
Figure img0145
em que:
Figure img0146
significa uma ligação simples ou dupla;X é O ou S;U e W são cada um independentemente C ou N;V é O, S, C ou N;onde quando V é C então R1 é H, C1-6 alquila, C1-6 alquenila, C1-6 alquinila, halo ou -ORc, onde C1-20 alquila, C2-20 alquenila, C2-20 alquinila são cada uma opcionalmente substituídas com -OH, -NRaRb, - SH, -C(O)Rc, -C(O)ORc, -NHC(O)Rc ou -NHC(O)ORc;e onde quando V é O, S ou N então R1 está ausente;R2 é H, -ORc, -SRc, -NRaRb ou halo; ou quando V é C então R1 e R2 junto com junto com os átomos de carbono aos quais eles estão ligados podem formar um anel de 5 ou 6 membros opcionalmente substituído com 1-4 substituintes selecionados de halo, -OH, -SH, -NRaRb, C1-20 alquila, C2-20 alquenila, C2-20 alquinila, C1-20 alcóxi ou C1-20 tioalquila;R3 é H ou C1-20 alquila;R4 é H ou C1-20 alquila; onde quando significa uma ligação dupla então R4 está ausente ou N-R4, juntos, formam um N positivamente carregado substituído com C1-20 alquila;Ra e Rb são cada um independentemente H, C1-20 alquila, C220 alquenila, C2-20 alquinila ou C6-20 arila; eRc é H, C1-20 alquila, C2-20 alquenila, fenila, benzila, um grupo polietileno glicol ou um grupo amino-polietileno glicol.
[000298] Em algumas modalidades, B é uma nucleobase de Fórmula XII-a1, XII-a2, XII-a3, XII-a4 ou XII-a5:
Figure img0147
[000299] Em algumas modalidades, os métodos compreendem ainda um nucleotídeo selecionado do grupo consistindo em adenosina, citosina, guanosina e uracila.
[000300] Em algumas modalidades, a nucleobase é uma pirimidina ou um derivado da mesma.
[000301] Em outro aspecto, a presente invenção provê métodos de amplificação de uma sequência de ácido nucleico compreendendo um nucleotídeo que rompe a ligação de uma contraparte de ligação da ranhura principal com a sequência de ácido nucleico, o método compreendendo: reação de um composto de Fórmula XI-d:
Figure img0148
em que:o nucleotídeo tem afinidade de ligação diminuída com a contraparte de ligação da ranhura principal;
Figure img0149
significa uma ligação simples ou dupla;---significa uma ligação simples opcional;U é O, S, -NRa- ou -CRaRb- quando significa uma ligação simples ou U é -CRa- quando significa uma ligação dupla;Z é H, C1-12 alquila ou C6-20 arila ou Z está ausente quando significa uma ligação dupla; eZ pode ser -CRaRb- e formar uma ligação com A;A é H, OH, fosforila, pirofosfato, sulfato, -NH2, -SH, um aminoácido ou um peptídeo compreendendo 1 a 12 aminoácidos;X é O ou S;cada um de Y1 é independentemente selecionado de -ORa1, -NRa1Rb1 e -SRa1;cada um de Y2 e Y3 é independentemente selecionado de O, -CRaRb-, NRc, S ou um ligante compreendendo um ou mais átomos selecionados do grupo consistindo em C, O, N e S;n é 0, 1, 2 ou 3;m é 0, 1, 2 ou 3;B é nucleobase;Ra e Rb são cada um independentemente H, C1-12 alquila, C212 alquenila, C2-12 alquinila ou C6-20 arila;Rc é H, C1-12 alquila, C2-12 alquenila, fenila, benzila, um grupo polietileno glicol ou um grupo amino-polietileno glicol; Ra1 e Rb1 são cada um independentemente H ou um contra- íon; e-ORc1 é OH em um pH de cerca de 1 ou -ORc1 é O- em pH fisiológico;contanto que o anel compreendendo as variáveis A, B, D, U, Z, Y2 e Y3 não seja ribose com um iniciador , um modelo de cDNA e uma polimerase de RNA.
[000302] Em algumas modalidades, B é uma nucleobase de Fórmula XII-a, XII-b ou XII-c:
Figure img0150
em que:
Figure img0151
significa uma ligação simples ou dupla;X é O ou S;U e W são cada um independentemente C ou N;V é O, S, C ou N;onde quando V é C então R1 é H, C1-6 alquila, C1-6 alquenila, C1-6 alquinila, halo ou -ORc, onde C1-20 alquila, C2-20 alquenila, C2-20 alquinila são cada uma opcionalmente substituídas com -OH, -NRaRb, - SH, -C(O)Rc, -C(O)ORc, -NHC(O)Rc ou -NHC(O)ORc;e onde quando V é O, S ou N então R1 está ausente;R2 é H, -ORc, -SRc, -NRaRb ou halo;ou quando V é C então R1 e R2 junto com junto com os átomos de carbono aos quais eles estão ligados podem formar um anel de 5 ou 6 membros opcionalmente substituído com 1-4 substituintes selecionados de halo, -OH, -SH, -NRaRb, C1-20 alquila, C2-20 alquenila, C2-20 alquinila, C1-20 alcóxi ou C1-20 tioalquila;R3 é H ou C1-20 alquila; R4 é H ou C1-20 alquila; onde quando significa uma ligação dupla então R4 está ausente ou N-R4, juntos, formam um N positivamente carregado substituído com C1-20 alquila;Ra e Rb são cada um independentemente H, C1-20 alquila, C220 alquenila, C2-20 alquinila ou C6-20 arila; eRc é H, C1-20 alquila, C2-20 alquenila, fenila, benzila, um grupo polietileno glicol ou um grupo amino-polietileno glicol.
[000303] Em algumas modalidades, B é uma nucleobase de Fórmula XII-a1, XII-a2, XII-a3, XII-a4 ou XII-a5:
Figure img0152
[000304] Em algumas modalidades, os métodos compreendem ainda um nucleotídeo selecionado do grupo consistindo em adenosina, citosina, guanosina e uracila.
[000305] Em algumas modalidades, a nucleobase é uma pirimidina ou derivado da mesma.
[000306] Em algumas modalidades, a presente invenção provê métodos de síntese de um ácido nucleico farmacêutico compreendendo as etapas de:a) provisão de um ácido desoxirribonucleico complementar (cDNA) que codifica uma proteína farmacêutica de interesse;b) seleção de um nucleotídeo que é conhecido romper uma ligação de uma contraparte de ligação da ranhura principal com um ácido nucleico, onde o nucleotídeo tem afinidade de ligação diminuída com a contraparte de ligação da ranhura principal; ec) contato do cDNA provido e do nucleotídeo selecionado com uma polimerase de RNA, sob condições de maneira que o ácido nucleico farmacêutico seja sintetizado.
[000307] Em modalidades adicionais, o ácido nucleico farmacêutico é um ácido ribonucleico (RNA).
[000308] Em ainda um aspecto adicional da presente invenção, os ácidos nucleicos modificados podem ser preparados usando métodos de síntese de fase sólida.
[000309] Em algumas modalidades, a presente invenção provê métodos de síntese de um ácido nucleico compreendendo um composto de Fórmula XI-a:
Figure img0153
em que:
Figure img0154
significa uma ligação dupla opcional;---significa uma ligação simples opcional;U é O, S, -NRa- ou -CRaRb- quando significa uma ligação simples ou U é -CRa- quando significa uma ligação dupla;A é H, OH, fosforila, pirofosfato, sulfato, -NH2, -SH, um aminoácido, um peptídeo compreendendo 2 a 12 aminoácidos;X é O ou S;cada um de Y1 é independentemente selecionado de -ORa1, -NRa1Rb1 e -SRa1;cada um de Y2 e Y3 é independentemente selecionado de O, -CRaRb-, NRc, S ou um ligante compreendendo um ou mais átomos selecionados do grupo consistindo em C, O, N e S;Ra e Rb são cada um independentemente H, C1-12 alquila, C212 alquenila, C2-12 alquinila ou C6-20 arila;Rc é H, C1-12 alquila, C2-12 alquenila, fenila, benzila, um grupo polietileno glicol ou um grupo amino-polietileno glicol;Ra1 e Rb1 são cada um independentemente H ou um contra- íon;-ORc1 é OH em um pH de cerca de 1 ou -ORc1 é O- em pH fisiológico; eB é nucleobase;contanto que o anel compreendendo as variáveis A, B, U, Z,Y2 e Y3 não seja ribose;compreendendo:a) reação de um nucleotídeo de Fórmula XIII-a:
Figure img0155
com um composto fosforamidita de Fórmula XIII-b:
Figure img0156
em que:
Figure img0157
significa um apoio sólido; eP1, P2 e P3 são cada um independentemente grupos de proteção adequados; para prover um ácido nucleico de Fórmula XIV-a:
Figure img0158
e b) oxidação ou sulfurização do ácido nucleico de Fórmula XIV-a para fornecer um ácido nucleico de Fórmula XIVb:
Figure img0159
e c) remoção dos grupos de proteção para fornecer o ácido nucleico de Fórmula XI-a.
[000310] Em algumas modalidades, os métodos compreendem ainda um nucleotídeo selecionado do grupo consistindo em adenosina, citosina, guanosina e uracila.
[000311] Em algumas modalidades, B é uma nucleobase de Fórmula XIII:
Figure img0160
em que:V é N ou NRc positivamente carregado;R3 é NRcRd, -ORa ou -SRa;R4 é H ou pode opcionalmente formar uma ligação com Y3;R5 é H, -NRcRd ou -ORa;Ra e Rb são cada um independentemente H, C1-12 alquila, C212 alquenila, C2-12 alquinila ou C6-20 arila; eRc é H, C1-12 alquila, C2-12 alquenila, fenila, benzila, um grupo polietileno glicol ou um grupo amino-polietileno glicol.
[000312] Em algumas modalidades, as etapas a) e b) são repetidas de 1 a cerca de 10.000 vezes.
Usos de Ácidos Nucleicos Modificados Agentes Terapêuticos
[000313] Os ácidos nucleicos modificados descritos aqui podem ser usados como agentes terapêuticos. Por exemplo, um ácido nucleico modificado descrito aqui pode ser administrado a um animal ou indivíduo, onde o ácido nucleico modificado é traduzido in vivo para produzir um peptídeo terapêutico no animal ou indivíduo. Desta maneira, são providos aqui composições, métodos, kits e reagentes para tratamento ou prevenção de doenças ou condições em humanos e outros mamíferos. Os agentes terapêuticos ativos da presente invenção incluem ácidos nucleicos modificados, células contendo ácidos nucleicos ou polipeptídeos modificados traduzidos dos ácidos nucleicos modificados, polipeptídeos traduzidos dos ácidos nucleicos modificados, células contatadas com células contendo ácidos nucleicos modificados ou polipeptídeos traduzidos dos ácidos nucleicos modificados, tecidos contendo células contendo ácidos nucleicos modificados e órgãos contendo tecidos contendo células contendo ácidos nucleicos modificados.
[000314] São providos aqui métodos de indução de tradução de um polinucleotídeo sintético ou recombinante para produzir um polipeptídeo em uma população de célula usando os ácidos nucleicos modificados descritos aqui. Tal tradução pode ser in vivo, ex vivo, in cultura ou in vitro. A população de célula é contatada com uma quantidade eficaz de uma composição contendo um ácido nucleico que tem pelo menos uma modificação de nucleosídeo e uma região traduzível codificando o polipeptídeo. A população é contatada sob condições de maneira que o ácido nucleico é localizado em uma ou mais células da população de célula e o polipeptídeo recombinante é traduzido na célula a partir do ácido nucleico.
[000315] Uma quantidade eficaz da composição é provida com base, pelo menos em parte, no tecido alvo, tipo de célula-alvo, dispositivos de administração, características físicas do ácido nucleico (por exemplo, tamanho e extensão de nucleosídeos modificados) e outros determinantes. Em geral, uma quantidade eficaz da composição provê produção de proteína eficiente na célula, preferivelmente mais eficiente do que uma composição contendo um ácido nucleico não modificado correspondente. Eficiência aumentada pode ser demonstrada através de transfecção de célula aumentada (isto é, a porcentagem de células transfectadas com o ácido nucleico), tradução de proteína aumentada a partir do ácido nucleico, degradação de ácido nucleico diminuída (conforme demonstrado, por exemplo, pela duração aumentada de tradução de proteína a partir de um ácido nucleico modificado) ou resposta imune inata reduzida da célula hospedeiro ou utilidade terapêutica aperfeiçoada.
[000316] Aspectos da presente invenção se referem a métodos de indução de tradução in vivo de um polipeptídeo recombinante em um indivíduo mamífero com necessidade dos mesmos. Neles, uma quantidade eficaz de uma composição contendo um ácido nucleico que tem pelo menos uma modificação de nucleosídeo e uma região traduzível codificando o polipeptídeo é administrada ao indivíduo usando os métodos de aplicação descritos aqui. O ácido nucleico é provido em uma quantidade e sob outras condições de maneira que o ácido nucleico está localizado em uma célula ou células do indivíduo e o polipeptídeo recombinante é traduzido na célula a partir do ácido nucleico. A célula onde o ácido nucleico está localizado, ou o tecido no qual a célula está presente, pode ser direcionado com uma ou mais de uma rodada de administração de ácido nucleico.
[000317] Outros aspectos da presente invenção se referem a transplante de células contendo ácidos nucleicos modificados para um indivíduo mamífero. Administração de células a indivíduos mamíferos é conhecida daqueles versados na técnica, tais como implante local (por exemplo, administração tópica ou subcutânea), injeção de aplicação a órgão ou sistêmica (por injeção, injeção intravenosa ou inalação), como é a formulação de células em veículo farmaceuticamente aceitável. Composições contendo ácidos nucleicos modificados são formuladas para administração intramuscularmente, transarterialmente, interaperitonealmente, intravenosamente, intranasalmente,subcutaneamente, endoscopicamente, transdermalmente ou intratecalmente. Em algumas modalidades, a composição é formulada para aplicação prolongada.
[000318] O indivíduo ao qual o agente terapêutico é administrado sofre de um risco de desenvolver uma doença, distúrbio ou condição prejudicial. São providos métodos de identificação, diagnóstico e classificação de indivíduos sob essas bases, os quais podem incluir diagnóstico clínico, níveis de biomarcador, estudos de associação genômica ampla (GWAS) (Genome-wide Association Studies) e outros métodos conhecidos na técnica.
[000319] Em certas modalidades, o ácido nucleico modificado administrado se direciona à produção de um ou mais polipeptídeos recombinantes que proveem uma atividade funcional que está substancialmente ausente na célula onde o polipeptídeo recombinante é traduzido. Por exemplo, a atividade funcional ausente pode ser de natureza enzimática, estrutural ou reguladora de gene.
[000320] Em outras modalidades, o ácido nucleico modificado administrado se direciona à produção de um ou mais polipeptídeos recombinantes que substituem um polipeptídeo (ou polipeptídeos múltiplos) que está substancialmente ausente na célula onde o polipeptídeo recombinante é traduzido. Tal ausência pode ser devido à mutação genética do gene de codificação ou seu curso regulador. Em outras modalidades, o ácido nucleico modificado administrado se direciona à produção de um ou mais polipeptídeos recombinantes para suplementar a quantidade de polipeptídeo (ou polipeptídeos múltiplos) que está presente na célula onde o polipeptídeo recombinante é traduzido. Alternativamente, o polipeptídeo recombinante funciona para antagonizar a atividade de uma proteína endógena presente em, na superfície de ou secretada a partir da célula. Geralmente, a atividade da proteína endógena é prejudicial para o indivíduo, por exemplo, devido à mutação da proteína endógena resultando em atividade ou localização alterada. Ainda, o polipeptídeo recombinante antagoniza, diretamente ou indiretamente, a atividade de uma porção biológica presente em, na superfície de ou secretada a partir da célula. Exemplos de porções biológicas antagonizadas incluem lipídeos (por exemplo, colesterol), uma lipoproteína (por exemplo, lipoproteína de baixa densidade), um ácido nucleico, um carboidrato ou uma toxina de molécula pequena.
[000321] As proteínas recombinantes descritas aqui são engenheiradas para localização dentro da célula, potencialmente dentro de um compartimento específico tal como o núcleo, ou são engenheiradas para secreção a partir da célula ou translocação para a membrana plasmática da célula.
[000322] Conforme aqui descrito, uma característica útil dos ácidos nucleicos modificados da presente invenção é a capacidade de reduzir, evadir, evitar ou eliminar a resposta imune inata de uma célula a um ácido nucleico exógeno. São providos métodos para realização da titulação, redução ou eliminação da resposta imune em uma célula ou uma população de células. Em algumas modalidades, a célula é contatada com uma primeira composição que contém uma primeira dose de um primeiro ácido nucleico endógeno incluindo uma região traduzível e pelo menos uma modificação de nucleosídeo, e o nível da resposta imune inata da célula ao primeiro ácido nucleico exógeno é determinado. Subsequentemente, a célula é contatada com uma segunda composição, que inclui uma segunda dose do primeiro ácido nucleico exógeno, a segunda dose contendo uma quantidade menor do primeiro ácido nucleico exógeno comparado com a primeira dose. Alternativamente, a célula é contatada com uma primeira dose de um segundo ácido nucleico exógeno. O segundo ácido nucleico exógeno pode conter um ou mais nucleosídeos modificados, que podem ser iguais ou diferentes do primeiro ácido nucleico exógeno ou, alternativamente, o segundo ácido nucleico exógeno pode não conter nucleosídeos modificados. As etapas de contato da célula com a primeira composição e/ou a segunda composição podem ser repetidas uma ou mais vezes. Ainda, eficiência de produção de proteína (por exemplo, tradução de proteína) na célula é opcionalmente determinada, e a célula pode ser retransfectada com a primeira e/ou segunda composição repetidamente até que eficiência de produção de uma proteína alvo seja obtida.
Agentes terapêuticos para doenças e condições
[000323] São providos aqui métodos para tratamento ou prevenção de um sintoma de doença caracterizada por atividade de proteína ausente ou aberrante, através da substituição da atividade de proteína ausente ou superação da atividade de proteína aberrante. Devido ao início rápido de produção de proteína seguindo introdução de mRNAs modificados, comparado com vetores de DNA virais, os compostos da presente invenção são particularmente vantajosos no tratamento de doenças agudas tais como sepse, derrame e infarto do miocárdio. Além disso, a falta de regulagem transcripcional dos mRNAs modificados da presente invenção é vantajosa pelo fato de que titulação precisa de produção de proteína é obtida. Doenças múltiplas são caracterizadas pela falta (ou substancialmente diminuição de maneira que a função de proteína apropriada não ocorre) de atividade de proteína. Tais proteínas podem não estar presentes, estão presentes em quantidades muito baixas ou são essencialmente não funcionais. A presente invenção provê um método para tratamento de tais condições ou doenças em um indivíduo através da introdução de agentes terapêuticos baseados em ácido nucleico ou célula contendo os ácidos nucleicos providos aqui, onde os ácidos nucleicos modificados codificam uma proteína que substitui a atividade de proteína ausente das células alvo do indivíduo.
[000324] Doenças caracterizadas pela atividade de proteína disfuncional ou aberrante incluem, mas não estão limitadas a, câncer e doenças proliferativas, doenças genéticas (por exemplo, fibrose cística), doenças autoimunes, diabetes, doenças neurodegenerativas, doenças cardiovasculares e doenças metabólicas. A presente invenção provê um método para tratamento de tais condições ou doenças em um indivíduo através de introdução de agentes terapêuticos baseados em ácido nucleico ou célula contendo os ácidos nucleicos modificados providos aqui, onde os ácidos nucleicos modificados codificam uma proteína que antagoniza ou de outra maneira supera a atividade de proteína aberrante presente na célula do indivíduo.
[000325] Exemplos específicos de uma proteína disfuncional são variantes de mutação sem sentido do gene regulador de condutância de transmembrana de fibrose cística (CFTR) (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator), que produzem uma variante de proteína disfuncional ou não funcional, respectivamente, de proteína CFTR, que causa fibrose cística.
[000326] Desta maneira, são providos métodos de tratamento de fibrose cística em um indivíduo mamífero através de contato de uma célula do indivíduo com um ácido nucleico modificado tendo uma região traduzível que codifica um polipeptídeo de CFTR funcional, sob condições de maneira que uma quantidade eficaz do polipeptídeo de CFTR esteja presente na célula. Células alvo preferidas são células epiteliais, tal como o pulmão, e métodos de administração são determinados em vista do tecido alvo, isto é, para aplicação ao pulmão, as moléculas de RNA são formuladas para administração através de inalação.
[000327] Em outra modalidade, a presente invenção provê um método para tratamento de hiperlipidemia em um indivíduo, através de introdução em uma população de célula do indivíduo de uma molécula de mRNA modificada codificando Sortilina, uma proteína recentemente caracaterizada por estudos genômicos, desta maneira melhorando a hiperlipidemia em um indivíduo. O gene SORT1 codifica uma proteína de transmembrana de rede trans-Golgi (TGN) (Trans-Golgi Network) chamada Sortilina. Estudos genéticos mostraram que um dos cinco indivíduos tem um polimorfismo de nucleotídeo simples, rs12740374, no locus 1p13 do gene SORT1 que o predispõe a ter níveis baixos de lipoproteína de baixa densidade (LDL) (Low-Density Lipoprotein) e lipoproteína de densidade muito baixa (VLDL) (Very-Low-Density Lipoprotein). Cada cópia do alelo secundário, presente em cerca de 30% de pessoas, altera colesterol LDL em 8 mg/dL, enquanto duas cópias do alelo secundário, presentes em cerca de 5% da população, diminuem o colesterol LDL 16 mg/dL. Veículos do alelo secundário foram também mostrados ter um risco 40% menor de infarto do miocárdio. Estudos funcionais in vivo em camundongos descreve que superexpressão de SORT1 em tecido de fígado de camundongo levou a níveis de colesterol LDL significantemente menores, mais de 80% menor, e que silenciamento de SORT1 aumentou o colesterol LDL aproximadamente 200% (Musunuru K e outros. "From noncoding variant to phenotype via SORT1 at the 1p13 cholesterol locus". Nature 2010; 466: 714-721).
Métodos de entrega de ácido nucleico celular
[000328] Os métodos da presente invenção aumentam a entrega de ácido nucleico em uma população de célula, in vivo, ex vivo ou in culture (em cultura). Por exemplo, uma cultura de célula contendo uma pluralidade de células hospedeiro (por exemplo, células eucarióticas tais como células de levedura ou mamífero) é contatada com uma composição que contém um ácido nucleico melhorado tendo pelo menos uma modificação de nucleosídeo e, opcionalmente, uma região traduzível. A composição também contém geralmente um reagente de transfecção ou outro composto que aumenta a eficiência de absorção de ácido nucleico melhorado nas células hospedeiro. O ácido nucleico aperfeiçoado exibe retenção aumentada na população de célula, com relação a um ácido nucleico não modificado correspondente. A retenção do ácido nucleico aperfeiçoado é maior do que a retenção do ácido nucleico não modificado. Em algumas modalidades, ela é pelo menos cerca de 50%, 75%, 90%, 95%, 100%, 150%, 200% ou mais do que 200% maior do que a retenção de ácido nucleico não modificado. Tal vantagem de retenção pode ser obtida através de uma rodada de transfecção com o ácido nucleico aperfeiçoado ou pode ser obtida seguindo rodadas repetidas de transfecção.
[000329] Em algumas modalidades, o ácido nucleico aperfeiçoado é aplicado a uma população de célula-alvo com um ou mais ácidos nucleicos adicionais. Tal aplicação pode ser ao mesmo tempo ou o ácido nucleico aperfeiçoado é aplicado antes da aplicação do um ou mais ácidos nucleicos adicionais. O um ou mais ácidos nucleicos adicionais podem ser ácidos nucleicos modificados ou ácidos nucleicos não modificados. É compreendido que a presença inicial dos ácidos nucleicos aperfeiçoados não induz substancialmente uma resposta imune inata da população de célula e, além disso, que a resposta imune inata não será ativada pela presença posterior dos ácidos nucleicos não modificados. Com relação a isso, o ácido nucleico aperfeiçoado pode não conter uma região traduzível, se a proteína desejada estar presente na população de célula-alvo for traduzida a partir dos ácidos nucleicos não modificados.
Porções-alvo
[000330] Em modalidades da presente invenção, ácidos nucleicos modificados são providos para expressar uma contraparte de ligação de proteína ou um receptor sobre a superfície da célula, que funciona para direcionar a célula-alvo para um espaço de tecido específico ou interagir com uma porção específica, ou in vivo ou in vitro. Contrapartes de ligação de proteína adequadas incluem anticorpos e seus fragmentos funcionais, proteínas de base ou peptídeos. Ainda, ácidos nucleicos modificados podem ser empregados para direcionar a síntese e localização extracelular de lipídeos, carboidratos ou outras porções biológicas.
Silenciamento de Expressão de gene Permanente
[000331] Um método para silenciar epigeneticamente expressão de gene em um indivíduo mamífero, que compreendeo um ácido nucleico onde a região traduzível codifica um polipeptídeo ou polipeptídeos capazes de direcionar metilação de histona H3 específica de sequência para iniciar formação de heterocromatina e reduzir transcrição de gene em torno de genes específicos para o propósito de silenciamento do gene. Por exemplo, uma mutação de ganho de função no gene Janus Kinase 2 é responsável pela família de Doenças Mieloproliferativas.
Aplicação de Agente Detectável ou Terapêutico a um Alvo Biológico
[000332] Os nucleosídeos modificados, nucleotídeos modificados e ácidos nucleicos modificados descritos aqui podem ser usados em vários cenários diferentes onde aplicação de uma substância (a "carga útil") a um alvo biológico é desejada, por exemplo, aplicação de substância detectável para detecção do alvo, ou aplicação de um agente terapêutico. Métodos de detecção podem incluir ambos métodos de imagem in vitro e imagem in vivo, por exemplo, imunoistoquímica, imagem por bioluminescência (BLI) (Bioluminescence Imaging), Imagem de Ressonância Magnética (MRI) (Magnetic Resonance Imaging), tomografia de emissão de pósitron (PET) (Positron Emission Tomography), microscopia eletrônica, tomografia computadorizada de raios X, imagem Raman, tomografia de coerência óptica, imagem por absorção, imagem térmica, imagem de fluorescência e refletância, microscopia de fluorescência, imagem tomográfica molecular de fluorescência, imagem de ressonância magnética nuclear, imagem de raios X, imagem ultrassônica, imagem fotoacústica, ensaios de laboratório ou qualquer situação onde marcação/tingimento/imagem é requerido.
[000333] Por exemplo, os nucleosídeos modificados, nucleotídeos modificados e ácidos nucleicos modificados descritos aqui podem ser usados em reprogramação de células tronco pluripotentes induzidas (células iPs), que podem então ser usadas para traçar diretamente o caminho de células que são transfectadas comparado com células totais no grupo. Em outro exemplo, um fármaco que é ligado ao ácido nucleico modificado via um ligante e é fluorescentemente marcado pode ser usado para traçar o caminho do fármaco in vivo, por exemplo, intracelularmente. Outros exemplos incluem o uso de um ácido nucleico modificado em administração de fármaco reversível em células.
[000334] Os nucleosídeos modificados, nucleotídeos modificados e ácidos nucleicos modificados descritos aqui podem ser usados em direcionamento intracelular de uma carga útil, por exemplo, agente detectável ou terapêutico, à organela específica. Alvos intracelulares exemplares podem incluir a localização nuclear para processamento de mRNA avançado ou uma sequência de localização nuclear (NLS) (Nuclear Localization Sequence) ligada ao mRNA contendo um inibidor.
[000335] Ainda, os nucleosídeos modificados, nucleotídeos modificados e ácidos nucleicos modificados descritos aqui podem ser usados para aplicar agentes terapêuticos a células ou tecidos, por exemplo, em animais vivos. Por exemplo, os nucleosídeos modificados, nucleotídeos modificados e ácidos nucleicos modificados descritos aqui podem ser usados para aplicar agentes quimioterapêuticos altamente polares a células de câncer assassinas. Os ácidos nucleicos modificados ligados ao agente terapêutico através de um ligante podem facilitar permeação de membro permitindo que o agente terapêutico viaje para uma célula para atingir um alvo intracelular.
[000336] Em outro exemplo, os nucleosídeos modificados, nucleotídeos modificados e ácidos nucleicos modificados podem ser ligados a um peptídeo inibidor viral (VIP) (Viral Inhibitory Peptide) através de um ligante clivável. O ligante clivável vai liberar o VIP e tingi- lo na célula. Em outro exemplo, os nucleosídeos modificados, nucleotídeos modificados e ácidos nucleicos modificados podem ser ligados através de um ligante a um ADP-ribosilato, que é responsável pelas ações de algumas toxinas bacterianas, tal como toxina do cólera, toxina da difteria e toxina pertussica. Essas proteínas de toxina são ADP-ribosiltransferases que modificam proteínas alvo em células humanas. Por exemplo, proteínas G ADP-ribosilato da toxina do cólera, que causam secreção de fluido massiva a partir do revestimento do intestino delgado, resultando em diarreia ameaçadora à vida.
Composições Farmacêuticas
[000337] A presente invenção provê proteínas geradas a partir de mRNAs modificados. As composições farmacêuticas podem compreender opcionalmente uma ou mais substâncias terapeuticamente ativas. De acordo com algumas modalidades, um método de administração de composições farmacêuticas compreendendo um ácido nucleico modificado codificando uma ou mais proteínas a serem administradas a um indivíduo com necessidade do mesmo é provido. Em algumas modalidades, composições são administradas a humanos. Para os propósitos da presente invenção, a expressão "ingrediente ativo" geralmente se refere a uma proteína, complexo de codificação de proteína ou contendo proteína conforme aqui descrito.
[000338] Embora as descrições de composições farmacêuticas providas aqui sejam principalmente direcionadas a composições farmacêuticas que são adequadas para administração a humanos, será compreendido pelo versado na técnica que tais composições são geralmente adequadas para administração a animais de todos os tipos. Modificação de composições farmacêuticas adequadas para administração a humanos a fim de tornar as composições adequadas para administração a vários animais é bem compreendida, e o farmacologista veterinário versado comum pode planejar e/ou realizar tal modificação com experimentação apenas comum, se alguma. Indivíduos aos quais administração das composições farmacêuticas é compreendida incluem, mas não estão limitados a, seres humanos e/ou outros primatas; mamíferos, incluindo mamíferos comercialmente relevantes tais com gado, porcos, cavalos, ovelha, gatos, cachorros, camundongos e/ou ratos; e/ou aves, incluindo aves comercialmente relevantes tais como galinhas, patos, gansos e/ou perus.
[000339] Formulações das composições farmacêuticas descritas aqui podem ser preparadas através de qualquer método conhecido ou desenvolvido posteriormente na técnica de farmacologia. Em geral, tais métodos preparatórios incluem a etapa de trazer o ingrediente ativo em associação com um excipiente e/ou um ou mais ingrediente acessórios e, então, se necessário e/ou desejável, modelagem e/ou embalagem do produto em uma unidade de dose única ou múltipla desejável.
[000340] Uma composição farmacêutica de acordo com a presente invenção pode ser preparada, embalada e/ou vendida a granel, como uma dose unitária única e/ou como uma pluralidade de doses unitárias únicas. Conforme aqui usado, uma "dose unitária" é quantidade separada da composição farmacêutica compreendendo uma quantidade predeterminada do ingrediente ativo. A quantidade do ingrediente ativo é geralmente igual à dosagem do ingrediente ativo que seria administrada ao indivíduo e/ou uma fração conveniente de tal dosagem tal como, por exemplo, metade ou um terço de tal dosagem.
[000341] Quantidades relativas do ingrediente ativo, do excipiente farmaceuticamente aceitável e/ou quaisquer ingredientes adicionais em uma composição farmacêutica de acordo com a presente invenção variarão, dependendo da identidade, tamanho e/ou configuração do indivíduo tratado e dependendo ainda da via através da qual a composição deve ser administrada. A título de exemplo, a composição pode compreender entre 0,1% e 100% (p/p) de ingrediente ativo.
[000342] Formulações farmacêuticas podem compreender ainda um excipiente farmaceuticamente aceitável que, conforme aqui usado, inclui qualquer um e todos os solventes, meios de dispersão, diluentes ou outros veículos líquidos, auxiliares de dispersão ou suspensão, agentes tensoativos, agentes isotônicos, agentes espessantes ou emulsificantes, conservantes, ligantes sólidos, lubrificantes e similar, conforme adequado para a forma de dosagem particular desejada. Remington’s The Science e Practice of Pharmacy, 21st Edição, A. R. Gennaro (Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2006; incorporado aqui a título de referência) revela vários excipientes usados na formulação de composições farmacêuticas e técnicas conhecidas para a sua preparação. Exceto até o ponto que qualquer meio excipiente convencional for incompatível com uma substância ou seus derivados, tal como através da produção de qualquer efeito biológico indesejável ou de outra maneira interagindo de uma maneira prejudicial com qualquer outro componente(s) da composição farmacêutica, seu uso é compreendido estar dentro do escopo da presente invenção.
[000343] Em algumas modalidades, um excipiente farmaceuticamente aceitável é pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% puro. Em algumas modalidades, um excipiente é aprovado para uso em humanos e para uso veterinário. Em algumas modalidades, um excipiente é aprovado pelo United States Food and Drug Administration. Em algumas modalidades, um excipiente é de grau farmacêutico. Em algumas modalidades, um excipiente satisfaz os padrões da United States Pharmacopoeia (USP), da European Pharmacopoeia (EP), da British Pharmacopoeia e/ou da International Pharmacopoeia.
[000344] Excipientes farmaceuticamente aceitáveis usados na fabricação de composições farmacêuticas incluem, mas não estão limitados a, diluentes inertes, agentes de dispersão e/ou granulação, agentes tensoativos e/ou emulsificantes, agentes de desintegração, agentes de ligação, conservantes, agentes de tamponamento, agentes lubrificantes e/ou óleos. Tais excipientes podem opcionalmente ser incluídos em formulações farmacêuticas. Excipientes tais como manteiga de cacau e ceras de supositório, agentes de coloração, agentes de revestimento, agentes adoçantes, saborizantes e/ou de perfume podem estar presentes na composição, de acordo com o julgamento do formulador.
[000345] Diluentes exemplares incluem, mas não estão limitados a, carbonato de cálcio, carbonato de sódio, fosfato de cálcio, fosfato de dicálcio, sulfato de cálcio, hidrogeno fosfato de cálcio, fosfato lactose de sódio, sacarose, celulose, celulose microcristalina, caulim, manitol, sorbitol, inositol, cloreto de sódio, amido seco, amido de milho, açúcar de confeiteiro, etc e/ou suas combinações.
[000346] Agentes de granulação e/ou dispersão exemplares incluem, mas não estão limitados a, amido de batata, amido de milho, amido de tapioca, amido glicolato de sódio, argilas, ácido algínico, goma guar, polpa cítrica, ágar, bentonita, celulose e produtos de madeira, esponja natural, resina de troca de cátion, carbonato de cálcio, silicatos, carbonato de sódio, poli(vinil-pirrolidona) reticulada (crospovidona), carboximetil amido de sódio (amido glicolato de sódio), carboximetil celulose, carboximetil celulose de sódio reticulada (croscarmelose), metilcelulose, amido pré-gelatinizado (amido 1500), amido microcristalino, amido insolúvel em água, carboximetil celulose de cálcio, alumínio silicato de magnésio (Veegum), lauril sulfato de sódio, compostos de amônio quaternário, etc. e/ou combinações dos mesmos.
[000347] Agentes tensoativos e/ou emulsificantes exemplares incluem, mas não estão limitados a, emulsificantes naturais (por exemplo, acácia, ágar, ácido algínico, alginato de sódio, tragacanto, condrux, colesterol, xantana, pectina, gelatina, gema de ovo, lanolina, colesterol, cera e lecitina), argilas coloidais (por exemplo, bentonita [silicato de alumínio] e Veegum® [silicato de magnésio alumínio]), derivados de aminoácido de cadeia longa, álcoois de peso molecular alto (por exemplo, álcool de estearila, álcool cetílico, álcool de oleíla, monoestearato de triacetina, diestearato de etileno glicol, monoestearato de glicerila e monoestearato de propileno glicol, álcool de polivinila), carbômero (por exemplo, carbóxi polimetileno, ácido poliacrílico, polímero de ácido acrílico e polímero de carboxivinila), carragenana, derivados celulósicos (por exemplo, carboximetilcelulose de sódio, celulose em pó, hidroximetil celulose, hidroxipropil celulose, hidroxipropil metilcelulose, metilcelulose), ésteres de ácido graxo sorbitano (por exemplo, monolaurato de polioxietileno sorbitano [Tween®20], polioxietileno sorbitano [Tween®60], monooleato de polioxietileno sorbitano [Tween®80], monopalmitato sorbitano [Span®40], monoestearato sorbitano [Span®60], triestearato sorbitano [SPan®65], mono-oleato de glicerila, mono-oleato sorbitano [Span®80]), ésteres de polioxietileno (por exemplo, monoestearato de polioxietileno [Myrj®45], óleo de rícino hidrogenado com polioxietileno, óleo de rícino polietoxilado, estearato de polioximetileno e Solutol®), ésteres de ácido graxo de sacarose, ésteres de ácido graxo de polietileno glicol (por exemplo, Cremophor®), ésteres de polioxietileno (por exemplo, lauril éter de polioxietileno [Brij®30]), poli(vinil-pirrolidona), monolaurato de dietileno glicol, oleato de trietanolamina, oleato de sódio, oleato de potássio, oleato de etila, ácido oleico, laurato de etila, lauril sulfato de sódio, Pluronic® F 68, Poloxamer®188, brometo de cetrimonio, cloreto de cetilpiridínio, cloreto de benzalcônio, codusato de sódio, etc e/ou suas combinações.
[000348] Agentes de ligação exemplares incluem, mas não estão limitados a, amido (por exemplo, amino de milho e pasta de amido); gelatina; açucares (por exemplo, sacarose, glicose, dextrose, dextrina, molassas, lactose, lactitol, manitol); gomas naturais e sintéticas (por exemplo, acácia, alginato de sódio, extrato de musgo Irlandês, goma panwar, goma ghatti, mucilagem de cascas de isapol, carboximetilcelulose, metilcelulose, etilcelulose, hidroximetilcelulose, hidroxipropil celulose, hidroxipropil metilcelulose, celulose microcristalina, acetato de celulose, poli(vinil-pirrolidona), silicato de magnésio alumínio (Veegum®) e arabinogalactana de lariço); alginato; óxido de polietileno; polietileno glicol; sais de cálcio inorgânico; ácido silícico; polimetacrilatos; ceras; água; álcool; etc.; e combinações dos mesmos.
[000349] Conservantes exemplares podem incluir, mas não estão limitados a, antioxidantes, agentes de quelação, conservantes antimicrobianos, conservantes antifúngicos, conservantes de álcool, conservantes de ácido e/ou outros conservantes. Antioxidantes exemplares incluem, mas não estão limitados a, alfa tocoferol, ácido ascórbico, palmitato de ascorbila, hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado, monotioglicerol, metabissulfito de potássio, ácido propiônico, propil galato, ascorbato de sódio, bissulfito de sódio, metabissulfito de sódio e/ou sulfito de sódio. Agentes de quelação exemplares incluem ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA), monoidrato de ácido cítrico, edetato dissódico, edetato dipotássico, ácido edético, ácido fumárico, ácido málico, ácido fosfórico, edetato sódico, ácido tartárico e/ou edetato trissódico. Conservantes antimicrobianos exemplares incluem, mas não estão limitados a, cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio, álcool de benzila, bronopol, cetrimida, cloreto de cetilpiridínio, clorexidina, clorobutanol, clorocresol, cloroxilenol, cresol, álcool de etila, glicerina, hexetidina, imidoureia, fenol, fenoxietanol, álcool de feniletila, nitrato fenilmercúrico, propileno glicol e/ou timerossal. Conservantes antifúngicos exemplares incluem, mas não estão limitados a, butil parabeno, metil parabeno, etil parabeno, propil parabeno, ácido benzoico, ácido hidroxibenzoico, benzoato de potássio, sorbato de potássio, benzoato de sódio, propionato de sódio e ácido sórbico. Conservantes de álcool exemplares incluem, mas não estão limitados a, etanol, polietileno glicol, fenol, compostos fenólicos, bisfenol, clorobutanol, hidroxibenzoato e/ou álcool de feniletila. Conservantes ácidos exemplares incluem, mas não estão limitados a, vitamina A, vitamina C, vitamina E, beta-caroteno, ácido cítrico, ácido acético, ácido desidroacético, ácido ascórbico, ácido sórbico e/ou ácido fítico. Outros conservantes incluem, mas não estão limitados a, tocoferol, acetato de tocoferol, mesilato de deteroxima, cetrimida, hidroxianisol butilado (BHA) (Butylated Hydroxyanisol), Butylated Hydroxytoluene (BHT), etilenodiamina, lauril sulfato de sódio (SLS) (Sodium Lauryl Sulfate), lauril éter sulfato de sódio (SLES) (Sodium Lauryl Ether Sulfate), bissulfito de sódio, metabissulfito de sódio, sulfite de potássio, metabissulfito de potássio, Glydant Plus®, Phenonip®, metilparabeno, Germall®115, Germaben®II, Neolone®, Kathon® e/ou Euxyl®.
[000350] Agentes de tamponamento exemplares incluem, mas não estão limitados a, soluções tampão de citrato, soluções tampão de acetato, soluções tampão de fosfato, cloreto de amônio, carbonato de cálcio, cloreto de cálcio, citrato de cálcio, glubionato de cálcio, gluceptato de cálcio, gluconato de cálcio, ácido d-glucônico, glicerofosfato de cálcio, lactato de cálcio, ácido propanoico, levulinato de cálcio, ácido pentanoico, fosfato de cálcio dibásico, ácido fosfórico, fosfato de cálcio tribásico, fosfato de hidróxido de cálcio, acetato de potássio, cloreto de potássio, gluconato de potássio, misturas de potássio, fosfato de potássio dibásico, fosfato de potássio monobásico, misturas de fosfato de potássio, acetato de sódio, bicarbonato de sódio, cloreto de sódio, citrato de sódio, lactato de sódio, fosfato de sódio dibásico, fosfato de sódio monobásico, misturas de fosfato de sódio, trometamina, hidróxido de magnésio, hidróxido de alumínio, acido algínico, água livre de pirógeno, solução salina isotônica, solução de Ringer, álcool de etila, etc. e/ou suas combinações.
[000351] Agentes de lubrificação exemplares incluem, mas não estão limitados a estearato de magnésio, estearato de cálcio, ácido esteárico, sílica, talco, malte, beenato de glicerila, óleos vegetais hidrogenados, polietileno glicol, benzoato de sódio, acetato de sódio, cloreto de sódio, leucina, lauril sulfato de magnésio, lauril sulfato de sódio, etc, e combinações dos mesmos.
[000352] Óleos exemplares incluem, mas não estão limitados a, óleo de amêndoa, semente de abricó, abacate, babaçu, bergamota, semente de cassis, borrage, cade, camomila, canola, caraway, canaúba, rícino, canela, manteiga de cacau, coco, fígado de bacalhau, café, milho, semente de algodão, emu, eucalipto, prímula da manhã, peixe, semente de cânhamo, geraniol, cabaça, semente de uva, avelã, orégano, miristato de isopropila, jojoba, noz de kukui, lavandin, lavanda, limão, litsea cubeba, noz de macadâmia, malva, semente de manga, semente de meadowfoam, pele de marta, noz-moscada, oliva, laranja, casca de laranja, palma, semente de palma, semente de pêssego, amendoim, semente de papoula, semente de abóbora, semente de colza, farelo de arroz, Rosemary, açafrão, sândalo, sasquana, segurelha, espinheiro- marítimo, sésamo, manteiga de karité, silicone, soja, girassol, árvore do chá, cardo, tsubaki, vetiver, noz e germe de trigo. Óleos exemplares incluem, mas não estão limitados a, estearato de butila, triglicerídeo caprílico, triglicerídeo cáprico, ciclometicona, sebacato de dietila, dimeticona 360, miristato de isopropila, óleo mineral, octildodecanol, álcool de oleíla, óleo de silicone e/ou combinações dos mesmos.
[000353] Formas de dosagem líquidas para administrações oral e parenteral incluem, mas não estão limitadas a, emulsões, microemulsões, soluções, suspensões, xaropes e/ou elixires farmaceuticamente aceitáveis. Em adição a ingredientes ativos, formas de dosagem líquidas podem compreender diluentes inertes geralmente usados na técnica tais como, por exemplo, água ou outros solventes, agentes de solubilização e emulsificantes tais como álcool de etila, álcool de isopropila, carbonato de etila, acetato de etila, álcool de benzila, benzoato de benzila, propileno glicol, 1,3-butileno glicol, dimetilformamida, óleos (em particular, óleos de semente de algodão, noz, milho, germe, oliva, rícino e sésamo), glicerol, álcool de tetra- hidrofurfurila, polietileno glicóis e ésteres de ácido graxo de sorbitano e misturas dos mesmos. Além de diluentes inertes, composições orais podem incluir adjuvantes tais como agentes umectantes, agentes emulsificantes e de suspensão, agentes adoçantes, saborizantes e/ou de perfume. Em certas modalidades para administração parenteral, composições são misturadas com agentes de solubilização tais como Cremophor®, álcoois, óleos, óleos modificados, glicóis, polissorbato, ciclodextrinas, polímeros e/ou combinações dos mesmos.
[000354] Preparações injetáveis, por exemplo, suspensões aquosas ou oleaginosas injetáveis estéreis, podem ser formuladas de acordo com a técnica conhecida usando agentes de dispersão, agentes umectantes e/ou agentes de suspensão adequados. Preparações injetáveis estéreis podem ser soluções, suspensões e/ou emulsões injetáveis estéreis em diluentes e/ou solventes parenteralmente aceitáveis não tóxicos, por exemplo, como uma solução em 1,3- butanodiol. Dentre os veículos e solventes aceitáveis que podem ser empregados são água, solução de Ringer, U.S.P. e solução de cloreto de sódio isotônica. Óleos estéreis, fixos, são convencionalmente empregados como um solvente ou meio de suspensão. Para este propósito, qualquer óleo fixo suave pode ser empregado, incluindo mono- ou diglicerídeos sintéticos. Ácidos graxos tal como ácido oleico podem ser usados na preparação de injetáveis.
[000355] Formulações injetáveis podem ser esterilizadas, por exemplo, através de filtragem em um filtro de retenção bacteriana e/ou através de incorporação de agentes de esterilização na forma de composições sólidas estéreis que podem ser dissolvidas ou dispersas em água estéril ou outro meio injetável estéril antes do uso.
[000356] A fim de prolongar o efeito de um ingrediente ativo, é frequentemente desejável deixar mais lenta a absorção do ingrediente ativo a partir de injeção subcutânea ou intramuscular. Isso pode ser realizado através do uso de uma suspensão líquida de material cristalino ou amorfo com solubilidade em água pobre. A taxa de absorção do fármaco então depende de sua taxa de dissolução que, por sua vez, pode depender do tamanho do cristal e da forma do cristal. Alternativamente, absorção retardada de uma forma de fármaco parenteralmente administrada é realizada dissolvendo ou suspendendo o fármaco em um veículo óleo. Formas depósito injetáveis são feitas através de formação de matrizes microencapsuladas do fármaco em polímeros biodegradáveis tal como polilactídeo-poliglicolídeo. Dependendo da razão de fármaco para polímero e da natureza do polímero particular empregado, a taxa de administração de fármaco pode ser controlada. Exemplos de outros polímeros biodegradáveis incluem poli(ortoésteres) e poli(anidridos). Formulações injetáveis depósito são preparadas aprisionando o fármaco em lipossomos ou microemulsões que são compatíveis com os tecidos do corpo.
[000357] Composições para administração retal ou vaginal são tipicamente supositórios que podem ser preparados misturando composições com excipientes não irritantes adequados tais como manteiga de cacau, polietileno ou uma cera de supositório que são sólidos em temperatura ambiente, mas líquidos na temperatura do corpo e então derretem no reto ou cavidade vaginal e liberam o ingrediente ativo.
[000358] Formas de dosagem sólidas para administração oral incluem cápsulas, comprimidos, pílulas, pós e grânulos. Em tais formas de dosagem sólicas, um ingrediente ativo é misturado com pelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitável, inerte, tal como citrato de amônio ou fosfato de dicálcio e/ou cargas ou extensores (por exemplo, amidos, lactose, sacarose, glicose, manitol e ácido silícico), ligantes (por exemplo, carboximetilcelulose, alginato, gelatina, polivinilpirrolidona, sacarose e acácia), umectantes (por exemplo, glicerol), agentes desintegrantes (por exemplo, ágar, carbonato de cálcio, amido de batata ou tapioca, ácido algínico, certos silicatos e carbonato de sódio), agentes de retardo de solução (por exemplo, parafina), aceleradores de absorção (por exemplo, composto de amônio quaternário), agentes umectantes (por exemplo, álcool cetílico e monoestearato de glicerol), absorventes (por exemplo, caulim e argila bentonita) e lubrificantes (por exemplo, talco, estearato de cálcio, estearato de magnésio, polietileno glicóis sólidos, lauril sulfato de sódio) e misturas dos mesmos. No caso de cápsulas, comprimidos e pílulas, a forma de dosagem pode compreender agentes de tamponamento.
[000359] Composições sólidas de um tipo similar podem ser empregadas como cargas em cápsulas de gelatina cheias macias e duras usando excipientes tais como lactose ou açúcar do leite bem como polietileno glicóis de alto peso molecular e similar. Formas de dosagem sólidas de comprimidos, drágeas, cápsulas, pílulas e grânulos podem ser preparadas com revestimentos e cascas tais como revestimentos entéricos e outros revestimentos bem conhecidos na técnica de formulação farmacêutica. Elas podem compreender opcionalmente agentes opacificantes e podem ser de uma composição que elas liberam o ingrediente(s) ativo apenas ou, preferivelmente, em uma certa parte do trato intestinal, opcionalmente, de uma maneira retardada. Exemplos de composições de encrustamento que podem ser usadas incluem substâncias e ceras poliméricas. Composições sólidas de um tipo similar podem ser empregadas como cargas em cápsulas de gelatina cheias macias e duras usando excipientes tais como lactose ou açúcar do leite bem como polietileno glicóis de alto peso molecular e similar.
[000360] Formas de dosagem para administração tópica e/ou transdermal de uma composição podem incluir unguentos, pastas, cremes, loções, géis, pós, soluções, sprays, inalantes e/ou emplastros. Em geral, um ingrediente ativo é misturado sob condições estéreis com um excipiente farmaceuticamente aceitável e/ou quaisquer conservantes e/ou tampões necessários conforme necessário. Ainda, a presente invenção compreende o uso de emplastros transdermais, que frequentemente têm a vantagem de provisão de administração controlada de um composto ao corpo. Tais formas de dosagem podem ser preparadas, por exemplo, dissolvendo e/ou dispersando o composto no meio apropriado. Alternativamente ou adicionalmente, a taxa pode ser controlada ou provendo uma membrana de controle de taxa e/ou dispersando o composto em uma matriz de polímero e/ou gel.
[000361] Dispositivos adequados para uso em administração de composições farmacêuticas intradermais descritas aqui incluem dispositivos de agulha curta tais como aqueles descritos nas Patentes U.S. Nos 4.886.499; 5.190.521; 5.328.483; 5.527.288; 4.270.537;5.015.235; 5.141.496; e 5.417.662. Composições intradermais podem ser administradas por dispositivos que limitam o comprimento de penetração eficaz de uma agulha na pele, tais como aqueles descritos na publicação PCT WO 99/34850 e seus equivalentes funcionais. Dispositivos de injeção de jato que administram as composições líquidas à derme via um injetor de jato de líquido e/ou via uma agulha que perfura o estrato córneo e produz um jato que atinge a derme são adequados. Dispositivos de injeção de jato são descritos, por exemplo, nas Patentes U.S. Nos 5.480.381; 5.599.302; 5.334.144; 5.993.412; 5.649.912; 5.569.189; 5.704.911; 5.383.851; 5.893.397; 5.466.220;5.339.163; 5.312.335; 5.503.627; 5.064.413; 5.520.639; 4.596.556;4.790.824; 4.941.880; 4.940.460; e publicações PCT WO 97/37705 e WO 97/13537. Dispositivos de administração de pó/partícula balísticos que usam gás comprimido para acelerar vacina em forma de pó através das camadas externas da pele para a derme são adequados. Alternativamente ou adicionalmente, seringas convencionais podem ser usadas no método mantoux clássico de administração intradermal.
[000362] Formulações adequadas para administração tópica incluem, mas não estão limitadas a, preparações liquidas e/ou semilíquidas tais como linimentos, loções, emulsões óleo-em-água e/ou água-em-óleo tais como cremes, unguentos e/ou pastas e/ou soluções e/ou suspensões. Formulações topicamente administráveis podem, por exemplo, compreender de a partir de cerca de 1% a cerca de 10% (p/p) de ingrediente ativo, embora a concentração de ingrediente ativo possa ser tão alta quanto o limite de solubilidade do ingrediente ativo no solvente. Formulações para administração tópica podem compreender ainda um ou mais dos ingredientes ativos adicionais descritos aqui.
[000363] Uma composição farmacêutica pode ser preparada, embalada e/ou vendida em uma formulação adequada para administração pulmonar via a cavidade bucal. Tal formulação pode compreender partículas secas que compreendem o ingrediente ativo e que têm um diâmetro na faixa de a partir de cerca de 0,5 nm a cerca de 7 nm ou de a partir de cerca de 1 nm a cerca de 6 nm. Tais composições estão convenientemente na forma de pós secos para administração usando um dispositivo compreendendo um reservatório de pó seco ao qual uma corrente de propelente pode ser direcionada para dispersar o pó e/ou usando um recipiente de administração de solvente/pó autopropelente tal como um dispositivo compreendendo o ingrediente ativo dissolvido e/ou suspenso em um propelente de baixa ebulição em um recipiente vedado. Tais pós compreendem partículas onde pelo menos 98% das partículas em peso têm um diâmetro maior do que 0,5 nm e pelo menos 95% das partículas em número têm um diâmetro de menos do que 7 nm. Alternativamente, pelo menos 95% das partículas em peso têm um diâmetro maior do que 1 nm e pelo menos 90% das partículas em número têm um diâmetro de menos do que 6 nm. Composições de pó seco podem incluir um diluente em pó fino sólido tal como açúcar e são convenientemente providas em uma forma de dose unitária.
[000364] Propelentes de baixa ebulição geralmente incluem propelentes líquidos tendo um ponto de ebulição abaixo de (65° F) em pressão atmosférica. Em geral o propelente pode constituir 50% a 99,9% (p/p) da composição, e o ingrediente ativo pode constituir 0,1% a 20% (p/p) da composição. Um propelente pode compreender ainda ingredientes adicionais tais como um tensoativo não iônico líquido e/ou aniônico sólido e/ou um diluente sólido (que pode ter um tamanho de partícula da mesma ordem que as partículas compreendendo o ingrediente ativo).
[000365] As composições farmacêuticas formuladas para administração pulmonar podem prover um ingrediente ativo na forma de gotículas de uma solução e/ou suspensão. Tais formulações podem ser preparadas, embaladas e/ou vendidas como soluções e/ou suspensões alcoólicas aquosas e/ou diluídas, opcionalmente estéreis, compreendendo ingrediente ativo, e podem ser convenientemente administradas usando qualquer dispositivo de nebulização e/ou atomização. Tais formulações podem compreender ainda um ou mais ingredientes adicionais incluindo, mas não limitado a, um agente saborizante tal como sacarina sódica, um óleo volátil, um agente de tamponamento, um agente tensoativo e/ou um conservante tal como metil hidroxibenzoato. Gotículas providas por esta via de administração podem ter um diâmetro médio na faixa de a partir de cerca de 0,1 nm a cerca de 200 nm.
[000366] Formulações descritas aqui como sendo úteis para administração pulmonar são úteis para administração intranasal de uma composição farmacêutica. Outra formulação adequada para administração intranasal é um pó grosso compreendendo o ingrediente ativo e tendo um tamanho de partícula médio de a partir de cerca de 0,1 μm a 500 μm. Tal formulação é administrada da maneira que "fungadela" é dada, isto é, inalando rapidamente através da passagem nasal a partir de um recipiente do pó mantido próximo do nariz.
[000367] Formulações adequadas para administração nasal podem, por exemplo, compreender de a partir de cerca de um mínimo de 0,1% (p/p) a no máximo 100% (p/p) de ingrediente ativo, e podem compreender um ou mais dos ingredientes ativos descritos aqui. Uma composição farmacêutica pode ser preparada, embalada e/ou vendida em uma formulação adequada para administração bucal. Tais formulações podem, por exemplo, estar na forma de comprimidos e/ou pastilhas feitos usando métodos convencionais e podem, por exemplo, ter 0,1% a 20% (p/p) de ingrediente ativo, o equilíbrio compreendendo uma composição oralmente dissolvível e/ou degradável e, opcionalmente, um ou mais dos ingredientes adicionais descritos aqui. Alternativamente, formulações adequadas para administração bucal podem compreender um pó e/ou uma solução e/ou suspensão aerossolizada e/ou atomizada compreendendo ingrediente ativo. Tais formulações em pó, aerossolizadas e/ou atomizadas, quando dispersas, podem ter um tamanho de partícula e/ou gotícula médio na faixa de a partir de cerca de 0,1 nm a cerca de 200 nm, e podem compreender ainda um ou mais de quaisquer ingredientes adicionais descritos aqui.
[000368] Uma composição farmacêutica pode ser preparada, embalada e/ou vendida em uma formulação adequada para administração oftálmica. Tais formulações podem, por exemplo, estar na forma de colírios incluindo, por exemplo, uma solução e/ou suspensão a 0,1/1,0% (p/p) do ingrediente ativo em um excipiente líquido aquoso ou oleoso. Tais colírios podem compreender ainda agentes de tamponamento, sais e/ou um ou mais outros de quaisquer ingredientes adicionais descritos aqui. Outras formulações oftalmicamente administráveis que são úteis incluem aquelas que compreendem o ingrediente ativo em forma cristalina e/ou em uma preparação lipossomal. Gotas para o ouvido e/ou colírios são compreendidos como estando dentro do escopo da presente invenção.
[000369] Considerações gerais na formulação e/ou fabricação de agentes farmacêuticos podem ser encontradas, por exemplo, em Remington: The Science e Practice of Pharmacy 21st ed., Lippincott Williams & Wilkins, 2005 (incorporado aqui a título de referência).
Administração
[000370] A presente invenção provê métodos compreendendo administração de proteínas ou complexos de acordo com a presente invenção a um indivíduo com necessidade dos mesmos. Proteínas ou complexos, ou suas composições farmacêuticas, de imagem, diagnóstico ou profiláticas, podem ser administrados a um indivíduo usando qualquer quantidade e qualquer via de administração eficaz para prevenção, tratamento, diagnóstico ou imagem de uma doença, distúrbio e/ou condição (por exemplo, uma doença, distúrbio e/ou condição com relação a déficits de memória de trabalho). A quantidade exata requerida variará de indivíduo para indivíduo, dependendo da espécie, idade e condição geral do indivíduo, da severidade da doença, da composição particular, seu modo de administração, seu modo de atividade e similar. As composições de acordo com a presente invenção são tipicamente formuladas em forma de unidade de dosagem para facilidade de administração e uniformidade de dosagem. Será compreendido, no entanto, que o uso diário total das composições da presente invenção será decidido pelo médico acompanhante dentro do escopo de julgamento médico importante. O nível de dose terapeuticamente eficaz, profilaticamente eficaz ou apropriado específico para qualquer paciente particular dependerá de uma variedade de fatores incluindo o distúrbio sendo tratado e a severidade do distúrbio; da atividade do composto específico empregado; da composição específica empregada; da idade, peso do corpo, saúde, geral, sexo e dieta do paciente; do tempo de administração, via de administração e taxa de excreção do composto específico empregado; da duração do tratamento; fármacos usados na combinação ou coincidentais com o composto específico empregado; e fatores similares bem conhecidos na técnica médica.
[000371] Proteínas a serem administradas e/ou suas composições farmacêuticas, profiláticas, de diagnóstico ou imagem podem ser administradas a animais, tais como mamíferos (por exemplo, humanos, animais domesticados, gatos, cachorros, camundongos, ratos, etc.). Em algumas modalidades, suas composições farmacêuticas, profiláticas, de diagnóstico ou imagem são administradas a seres humanos.
[000372] As proteínas a serem administradas e/ou suas composições farmacêuticas, profiláticas, de diagnóstico ou imagem de acordo com a presente invenção podem ser administradas através de qualquer via. Em algumas modalidades, as proteínas e/ou suas composições farmacêuticas, profiláticas, de diagnóstico ou imagem são administradas através de uma ou mais de uma variedade de vias, incluindo oral, intravenosa, intramuscular, intra-arterial, intramedular, intratecal, subcutânea, intraventricular, transdermal, interdermal, retal, intravaginal, intraperitoneal, tópica (por exemplo, através de pós, unguentos, cremes, géis, loções e/ou gotas), mucosal, nasal, bucal, enteral, vítrea, intratumoral, sublingual; através de instilação intratraqueal, instilação brônquica e/ou inalação; como um spray oral, spray nasal e/ou aerossol e/ou através de um cateter de veia porta. Em algumas modalidades, proteínas ou complexos e/ou suas composições farmacêuticas, profiláticas, de diagnóstico ou imagem são administrados através de injeção intravenosa sistêmica. Em modalidades específicas, proteínas ou complexos e/ou suas composições farmacêuticas, profiláticas, de diagnóstico ou imagem podem ser administrados intravenosamente e/ou oralmente. Em modalidades específicas, proteínas ou complexos, e/ou suas composições farmacêuticas, profiláticas, de diagnóstico ou imagem, podem ser administrados de uma maneira que permita a proteção ou complexo cruzar a barreira sangue-cérebro, barreira vascular ou outra barreira epitelial.
[000373] No entanto, a presente invenção compreende a administração de proteínas ou complexos, e/ou suas composições farmacêuticas, profiláticas, de diagnóstico ou imagem, através de uma via apropriada levando em consideração prováveis avanços na ciência de administração de fármaco.
[000374] Em geral, a via de administração mais apropriada dependerá de uma variedade de fatores incluindo a natureza da proteína ou complexo compreendendo proteínas associadas com pelo menos um agente a ser administrado (por exemplo, sua estabilidade no ambiente do trato gastrintestinal, corrente sanguínea, etc), da condição do paciente (por exemplo, se o paciente é capaz de tolerar vias de administração particulares), etc. A presente invenção compreende a administração das composições farmacêuticas, profiláticas, de diagnóstico ou imagem através de via apropriada levando em consideração prováveis avanços na ciência de administração de fármaco.
[000375] Em certas modalidades, as composições de acordo com a presente invenção podem ser administradas em níveis de dosagem suficientes para administração de a partir de cerca de 0,0001 mg/kg a cerca de 100 mg/kg, de a partir de cerca de 0.01 mg/kg to cerca de 50 mg/kg, de a partir de cerca de 0.1 mg/kg to cerca de 40 mg/kg, de a partir de cerca de 0.5 mg/kg to cerca de 30 mg/kg, de a partir de cerca de 0.01 mg/kg to cerca de 10 mg/kg, de a partir de cerca de 0.1 mg/kg to cerca de 10 mg/kg ou de a partir de cerca de de 1 mg/kg a cerca de 25 mg/kg, de peso do corpo por dia, uma ou mais vezes por dia, para obter o efeito terapêutico, de diagnóstico, profilático ou imagem desejado. A dosagem desejada pode ser administrada três vezes por dia, duas vezes por dia, uma vez por dia, dia-sim-dia-não, a cada três dias, toda semana, a cada duas semanas, a cada três semanas ou a cada quatro semanas. Em certas modalidades, a dosagem desejada pode ser administrada usando administrações múltiplas (por exemplo, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, novo, dez, onze, doze, treze, quatorze ou mais administrações).
[000376] Proteínas ou complexos podem ser usados em combinação com um ou mais outros agentes terapêuticos, profiláticos ou de diagnóstico ou imagem. Por "em combinação com" não pretende implicar que os agentes devem ser administrados ao mesmo tempo e/ou formulados para administração juntos, embora esses métodos de administração estejam dentro do escopo da presente invenção. As composições podem ser administradas concomitantemente com, antes da ou subsequente a, um ou mais outros procedimentos terapêuticos ou médicos desejados. Em geral, cada agente será administrado em uma dose e/ou em um programa de tempo determinado para este agente. Em algumas modalidades, a presente invenção compreende a administração de composições farmacêuticas, profiláticas, de diagnóstico ou imagem em combinação com agentes que melhoram sua biodisponibilidade, reduzem ou modificam seu metabolismo, inibem sua excreção e/ou modificam sua distribuição no corpo.
[000377] Será ainda compreendido que agentes terapeuticamente, profilaticamente, diagnosticamente ou de imagem utilizados em combinação podem ser administrados juntos em uma composição única ou administrados separadamente em composições diferentes. Em geral, é esperado que agentes utilizados em combinação sejam utilizados em níveis que não excedam os níveis nos quais eles são utilizados individualmente. Em algumas modalidades, os níveis utilizados em combinação serão menores do que aqueles utilizados individualmente.
[000378] A combinação particular de terapias (agentes terapêuticos ou procedimentos) para empregar em um regime de combinação levará em consideração a compatibilidade dos agentes terapêuticos desejados e/ou procedimentos e o efeito terapêutico desejado a ser obtido. Será também compreendido que as terapias empregadas podem obter um efeito desejado para o mesmo distúrbio (por exemplo, uma composição útil para tratamento de câncer de acordo com a presente invenção pode ser administrada concomitantemente com um agente quimioterapêutico) ou elas podem obter efeitos diferentes (por exemplo, controle de quaisquer efeitos adversos).
Kits
[000379] A presente invenção provê uma variedade de kits para convenientemente e/ou eficazmente realizar métodos da presente invenção. Kits típicos compreenderão quantidades e/ou números suficientes de componentes para permitir que um usuário realizar múltiplos tratamentos de um indivíduo(s) e/ou realize experimentos múltiplos.
[000380] Em um aspecto, a invenção provê kits para produção de proteína compreendendo um primeiro ácido nucleico isolado compreendendo uma região traduzível e uma modificação de ácido nucleico, onde o ácido nucleico é capaz de evadir ou prevenir indução de uma resposta imune inata de uma célula onde o primeiro ácido nucleico isolado é introduzido; e embalagem e instruções.
[000381] Em um aspecto, a invenção provê kits para produção de proteína compreendendo: um primeiro ácido nucleico modificado isolado compreendendo uma região traduzível, provido em uma quantidade eficaz para produzir uma quantidade desejada de uma proteína codificada pela região traduzível quando introduzida em uma célula-alvo; um segundo ácido nucleico compreendendo um ácido nucleico inibidor, provido em uma quantidade eficaz para substancialmente inibir a resposta imune inata da célula; e embalagem e instruções.
[000382] Em um aspecto, a invenção provê kits para produção de proteína compreendendo um primeiro ácido nucleico isolado compreendendo uma região traduzível e uma modificação de nucleosídeo, onde o ácido nucleico exibe degradação reduzida por uma nuclease celular; e embalagem e instruções.
[000383] Em um aspecto, a invenção provê kits para produção de proteína compreendendo um primeiro ácido nucleico isolado compreendendo uma região traduzível e pelo menos duas modificações de nucleosídeo diferentes, onde o ácido nucleico exibe degradação reduzida por uma nuclease celular; e embalagem e instruções.
[000384] Em um aspecto, a invenção provê kits para produção de proteína compreendendo um primeiro ácido nucleico isolado compreendendo uma região traduzível e pelo menos uma modificação de nucleosídeo, onde o ácido nucleico exibe degradação reduzida por uma nuclease celular; um segundo ácido nucleico compreendendo um ácido nucleico inibidor; e embalagem e instruções.
[000385] Em algumas modalidades, o primeiro ácido nucleico isolado compreende RNA mensageiro (mRNA). Em algumas modalidades, o mRNA compreende pelo menos um nucleosídeo selecionado do grupo consistindo em ribonucleosídeo de piridin-4-ona, 5-aza-uridina, 2-tio-5- uridina, 2-tiouridina, 4-tio-pseudouridina, 2-tio-pseudouridina, 5-hidro- xiuridina, 3-metiluridina, 5-carboximetil-uridina, 1-carboximetil-pseudo- uridina, 5-propinil-uridina, 1-propinil-pseudouridina, 5-taurinometilu- ridina, 1-taurinometil-pseudouridina, 5-taurinometil-2-tio-uridina, 1-tau- rinometil-4-tio-uridina, 5-metil-uridina, 1-metil-pseudouridina, 4-tio-1- metil-pseudouridina, 2-tio-1-metil-pseudouridina, 1-metil-1-desaza- pseudouridina, 2-tio-1-metil-1-desaza-pseudouridina, di-hidrouridina, di- hidropseudouridina, 2-tio-di-hidrouridina, 2-tio-di-hidropseudouridina, 2- metoxiuridina, 2-metóxi-4-tio-uridina, 4-metóxi-pseudouridina, 4-metóxi- 2-tio-pseudouridina ou qualquer um revelado aqui.
[000386] Em algumas modalidades, o mRNA compreende pelo menos um nucleosídeo selecionado do grupo consistindo em 5-aza-citidina, pseudo-isocitidina, 3-metil-citidina, N4-acetilcitidina, 5-formilcitidina, N4- metilcitidina, 5-hidroximetilcitidina, 1-metil-pseudo-isocitidina, pirrol- citidina, pirrol-pseudo-isocitidina, 2-tio-citidina, 2-tio-5-metil-citidina, 4- tio-pseudo-isocitidina, 4-tio-1-metil-pseudo-isocitidina, 4-tio-1-metil-1- desaza-pseudo-isocitidina, 1-metil-1-desaza-pseudo-isocitidina, zebularina, 5-aza-zebularina, 5-metil-zebularina, 5-aza-2-tio-zebularina, 2-tio-zebularina, 2-metóxi-citidina, 2-metóxi-5-metil-citidina, 4-metóxi- pseudo-isocitidina, 4-metóxi-1-metil-pseudo-isocitidina ou qualquer um revelado aqui.
[000387] Em algumas modalidades, o mRNA compreende pelo menos um nucleosídeo selecionado do grupo consistindo em 2-aminopurina, 2,6-diaminopurina, 7-desaza-adenina, 7-desaza-8-aza-adenina, 7- desaza-2-aminopurina, 7-desaza-8-aza-2-aminopurina, 7-desaza-2,6- diaminopurina, 7-desaza-8-aza-2,6-diaminopurina, 1-metiladenosina, N6-metiladenosina, N6-isopenteniladenosina, N6-(cis- hidroxiisopentenil)adenosina, 2-metiltio-N6-(cis-hidroxiisopentenil) adenosina, N6-glicinilcarbamoiladenosina, N6-treonilcarbamoiladeno- sina, 2-metiltio-N6-treonil carbamoiladenosina, N6,N6-dimetiladeno- sina, 7-metiladenina, 2-metiltio-adenina, 2-metóxi-adenina ou qualquer um revelado aqui.
[000388] Em algumas modalidades, o mRNA compreende pelo menos um nucleosídeo selecionado do grupo consistindo em 1-metil-inosina, vinosina, vibutosina, 7-desaza-guanosina, 7-desaza-8-aza-guanosina, 6-tio-guanosina, 6-tio-7-desaza-guanosina, 6-tio-7-desaza-8-aza- guanosina, 7-metil-guanosina, 6-tio-7-metil-guanosina, 7-metilinosina, 6-metóxi-guanosina, 1-metilguanosina, N2-metilguanosina, N2,N2- dimetilguanosina, 8-oxo-guanosina, 7-metil-8-oxo-guanosina, 1-metil-6- tio-guanosina, N2-metil-6-tio-guanosina, N2,N2-dimetil-6-tio-guanosina ou qualquer um revelado aqui.
[000389] Em outro aspecto, a invenção provê composições para produção de proteína compreendendo um primeiro ácido nucleico isolado compreendendo uma região traduzível e uma modificação de nucleosídeo, onde o primeiro ácido nucleico exibe degradação reduzida por uma nuclease celular, e uma célula de mamífero adequada para tradução da região traduzível do primeiro ácido nucleico.
Definições
[000390] Em vários momentos no presente relatório, substituintes de compostos da presente invenção são revelados em grupos ou em faixas. É especificamente pretendido que a presente invenção inclua cada e toda subcombinação individual dos membros de tais grupos e faixas. Por exemplo, o termo "C1-6 alquila" é especificamente pretendido revelar individualmente metila, etila, C3 alquila, C4 alquila, C5 alquila e C6 alquila.
[000391] Cerca de: Conforme aqui usado, o termo "cerca de" significa +/- 10% do valor mencionado.
[000392] Administrado em combinação: Conforme aqui usado, o termo "administrado em combinação" ou "administração combinada" significa que dois ou mais agentes são administrados a um indivíduo ao mesmo tempo ou dentro de um intervalo de maneira que haja uma sobreposição de um efeito de cada agente no paciente. Em algumas modalidades, eles são administrados dentro de cerca de 60, 30, 15, 10, 5 ou 1 minuto um do outro. Em algumas modalidades, a administração dos agentes é espaçada suficientemente próxima de maneira que um efeito combinatorial (por exemplo, um sinérgico) é obtido.
[000393] Animal: Conforme aqui usado, o termo "animal" se refere a qualquer membro no reino animal. Em algumas modalidades, "animal" se refere a seres humanos em qualquer estágio de desenvolvimento. Em algumas modalidades, "animal" se refere a animais não humanos em qualquer estágio de desenvolvimento. Em certas modalidades, o animal não humano é um mamífero (por exemplo, um roedor, um camundongo, um rato, um coelho, um macaco, um cachorro, um gato, uma ovelha, gado, um primata ou um porco). Em algumas modalidades, animais incluem, mas não estão limitado a, mamíferos, aves, répteis, anfíbios, peixe e vermes. Em algumas modalidades, o animal é um animal transgênico, animal geneticamente engenheirado ou um clone.
[000394] Antígenos de interesse ou antígenos desejados: Conforme aqui usado, os termos "antígeno de interesse" e "antígenos desejados" incluem aquelas proteínas e outras biomoléculas providas aqui que são imunoespecificamente ligadas pelos anticorpos e fragmentos, mutantes, variantes e suas alterações descritos aqui. Exemplos de antígenos de interesse incluem, mas não estão limitados a, insulina, fator de crescimento tipo insulina, hGH, tPA, citocinas, tais como interleucina (IL), por exemplo, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, interferon (IFN) alfa, IFN beta, IFN gama, IFN omega ou IFN tau, fator de necrose de tumor (TNF), tais como TNF alfa e TNF beta, TNF gama, TRAIL; G-CSF, GM- CSF, M-CSF, MCP-1 e VEGF.
[000395] Aproximadamente: Conforme aqui usado, o termo "aproximadamente" ou "cerca de", conforme aplicado a um ou mais valores de interesse, se refere a um valor que é similar a um valor de referência declarado. Em certas modalidades, o termo "aproximadamente" ou "cerca de" se refere a uma faixa de valores que se encaixa em 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% ou menos em qualquer direção (maior que ou menor que) do valor de referência declarado a menos que de outro modo declarado ou de outro modo evidente a partir do contexto (exceto onde tal número exceder 100% de um possível valor).
[000396] Associado com: Conforme aqui usado, os termo "associado com", "conjugado", "ligado", "anexado" e "em corrente", quando usado com relação a duas ou mais porções, significa que as porções estão fisicamente associadas ou conectadas umas com as outras, ou diretamente ou via uma ou mais porções adicionais que servem como um agente de ligação, para formar uma estrutura que é suficientemente estável de maneira que as porções permanecem fisicamente associadas sob as condições onde a estrutura é usada, por exemplo, condições fisiológicas. Uma "associação" não precisa ser estritamente através de ligação química covalente direta. Ela pode também sugerir ligação iônica ou hidrogênio ou uma conectividade baseada em hibridização suficientemente estável de maneira que as entidades associadas permanecem fisicamente associadas.
[000397] Biocompatível: Conforme aqui usado, o termo "biocompatível" significa compatível com células, tecidos, órgãos ou sistemas vivos impondo pouco ou nenhum risco de lesão, toxicidade ou rejeição pelo sistema imune.
[000398] Biodegradável: Conforme aqui usado, o termo "biodegradável" significa capaz de ser quebrado em produtos inócuos pela ação de seres vivos.
[000399] Biologicamente ativo: Conforme aqui usado, a expressão "biologicamente ativo" se refere a uma característica de qualquer substância que tem atividade em um sistema e/ou organismo biológico. Por exemplo, uma substância que, quando administrada a um organismo, tem um efeito biológico sobre esse organismo, é considerada ser biologicamente ativa. Em modalidades particulares, um polinucleotídeo da presente invenção pode ser considerado biologicamente ativo se mesmo uma porção do polinucleotídeo for biologicamente ativa ou imitar uma atividade considerada biologicamente relevante.
[000400] Termos químicos: A seguir é provida a definição de vários termos químicos de "acila" a "tiol".
[000401] O termo "acila", conforme aqui usado, representa um hidrogênio ou um grupo alquila (por exemplo, um grupo haloalquila), conforme aqui definido, que é ligado ao grupo molecular parental através de um grupo carbonila, conforme aqui definido, e é exemplificado por formila (isto é, um grupo carboxialdeído), acetila, trifluoracetila, propionila, butanoíla e similar. Grupos acila não substituídos exemplares incluem de a partir de 1 a 7, de a partir de 1 a 11 ou de a partir de 1 a 21 carbonos. Em algumas modalidades, o grupo alquila é substituído adicionalmente com 1, 2, 3 ou 4 substituintes conforme aqui descrito.
[000402] O termo "acilamino", conforme aqui usado, representa um grupo acila, conforme aqui definido, ligado ao grupo molecular parental através de um grupo amino, conforme aqui definido (isto é, -N(RN1)- C(O)-R, onde R é H ou um grupo C1-6, C1-10 ou C1-20 alquila opcionalmente substituído (por exemplo, haloalquila) e RN1 é conforme aqui definido). Grupos acilamino não substituídos exemplares incluem de a partir de 1 a 41 carbonos (por exemplo, de a partir de 1 a 7, de a partir de 1 a 13, de a partir de 1 a 21, de a partir de 2 a 7, de a partir de 2 a 13, de a partir de 2 a 21 ou de a partir de 2 a 41 carbonos). Em algumas modalidades, o grupo alquila é adicionalmente substituído com 1,2 3 ou 4 substituintes conforme aqui descrito, e/ou o grupo amino é - NH2 ou -NHRN1, onde RN1 é, independentemente, OH, NO2, NH2, NRN22, SO2ORN2, SO2RN2, SORN2, alquila, arila, acila (por exemplo, acetila, trifluoracetila ou outros descritos aqui) ou alcoxicarbonilalquila, e cada RN2 pode ser H, alquila ou arila.
[000403] O termo "acilaminoalquila", conforme usado aqui, representa um grupo acila, conforme aqui definido, ligado a um grupo amino que é por sua vez ligado ao grupo molecular parental através de um grupo alquila, conforme aqui definido (isto é, -alquil-N(RN1)-C(O)-R, onde R é H ou um grupo C1-6, C1-10 ou C1-20 alquila opcionalmente substituído (por exemplo, haloalquila) e RN1 é conforme aqui definido). Grupos acilamino não substituídos exemplares incluem de a partir de 1 a 41 carbonos (por exemplo, de a partir de 1 a 7, de a partir de 1 a 13, de a partir de 1 a 21, de a partir de 2 a 7, de a partir de 2 a 13, de a partir de 2 a 21 ou de a partir de 2 a 41 carbonos). Em algumas modalidades, o grupo alquila é adicionalmente substituído com 1, 2 3 ou 4 substituintes conforme aqui descrito, e/ou o grupo amino é -NH2 ou -NHRN1, onde RN1 é, independentemente, OH, NO2, NH2, NRN22, SO2ORN2, SO2RN2, SORN2, alquila, arila, acila (por exemplo, acetila, trifluoracetila ou outros descritos aqui) ou alcoxicarbonilalquila, e cada RN2 pode ser H, alquila ou arila.
[000404] O termo "acilóxi", conforme usado aqui, representa um grupo acila, conforme aqui definido, ligado ao grupo molecular parental através de um átomo de oxigênio (isto é, -O-C(O)-R, onde R é H ou um grupo C1-6, C1-10ou C1-20alquila opcionalmente substituído). Grupos acilóxi não substituídos exemplares incluem de a partir de 1 a 21 carbonos (por exemplo, de a partir de 1 a 7 ou de a partir de 1 a 11 carbonos). Em algumas modalidades, o grupo alquila é adicionalmente substituído com 1, 2 3 ou 4 substituintes conforme aqui descrito.
[000405] O termo "aciloxialquila", conforme usado aqui, representa um grupo acila, conforme aqui definido, ligado a um átomo de oxigênio que por sua vez é ligado ao grupo molecular parental através de um grupo alquila (isto é, -alquil-O-C(O)-R, onde R é H ou um grupo C1-6, C1-10 ou C1-20 alquila opcionalmente substituído). Grupos aciloxialquila não substituídos exemplares incluem de a partir de 1 a 21 carbonos (por exemplo, de a partir de 1 a 7 ou de a partir de 1 a 11 carbonos). Em algumas modalidades, o grupo alquila é, independentemente, substituído adicionalmente com 1, 2, 3 ou 4 substituintes conforme aqui descrito.
[000406] O termo "alcarila", conforme aqui usado, representa um group arila, conforme aqui definido, ligado ao grupo molecular parental através de um grupo alquileno, conforme aqui definido. Grupos alcarila não substituídos exemplares são de a partir de 7 a 30 carbonos (por exemplo, de a partir de 7 a 16 ou de a partir de 7 a 20 carbonos, tal como C1-6 alc-C6-10 arila, C1-10 alc-C6-10 arila ou C1-20 alc-C6-10 arila). Em algumas modalidades, o alquileno e a arila podem ser cada um substituídos com 1, 2, 3 ou 4 grupos substituintes conforme aqui definido para os respectivos grupos. Outros grupos precedidos pelo prefixo "alqu-" são definidos da mesma maneira, onde "alqu" se refere a C1-6 alquileno, a menos que de outro modo mencionado, e a estrutura química ligada é conforme aqui definido.
[000407] O termo "alquicicloalquila" representa um grupo cicloalquila, conforme aqui definido, ligado ao grupo molecular parental através de um grupo alquileno, conforme aqui definido (por exemplo, um grupo alquileno de a partir de 1 a 4, de a partir de 1 a 6, de a partir de 1 a 10 ou de a partir de 1 a 20 carbonos). Em algumas modalidades, o alquileno e a cicloalquila podem ser cada um substituídos adicionalmente com 1, 2, 3 ou 4 grupos substituintes conforme aqui definido para o respectivo grupo.
[000408] O termo "alquenila," conforme aqui usado, representa grupos de cadeia reta ou ramificada monovalentes de, a menos que de outro modo especificado, a partir de 2 a 20 carbonos (por exemplo, de a partir de 2 a 6 ou de a partir de 2 a 10 carbonos) contendo uma ou mais ligações duplas carbono-carbono e é exemplificado por etenila, 1- propenila, 2-propenila, 2-metil-1-propenila, 1-butenila, 2-butenila e similar. Alquenilas incluem ambos os isômeros cis e trans. Grupos alquenila podem ser opcionalmente substituídos com 1, 2, 3 ou 4 grupos substituintes que são selecionados, independentemente, de amino, arila, cicloalquila ou heterociclila (por exemplo, heteroarila), conforme aqui definido, ou qualquer um dos grupos substituintes alquila exemplares descritos aqui.
[000409] O termo "alquenilóxi" representa um substiruinte químico de fórmula -OR, onde R é um grupo C2-20 alquenila (por exemplo, C2-6 ou C2-10 alquenila), a menos que de outro modo especificado. Grupos alquenilóxi exemplares incluem etenilóxi, propenilóxi e similar. Em algumas modalidades, o grupo alquenila pode ser substituído adicionalmente com 1, 2, 3 ou 4 grupos substituintes conforme aqui definido (por exemplo, um grupo hidróxi).
[000410] O termo "alquieteroarila" se refere a um grupo heteroarila, conforme aqui definido, ligado ao grupo molecular parental através de um grupo alquileno, conforme aqui definido. Grupos alquieteroarila não substituídos exemplares são de a partir de 2 a 32 carbonos (por exemplo, de a partir de 2 a 22, de a partir de 2 a 18, de a partir de 2 a 17, de a partir de 2 a 16, de a partir de 3 a 15, de a partir de 2 a 14, de a partir de 2 a 13 ou de a partir de 2 a 12 carbonos, tal como C1-6 alqui- C1-12 heteroarila, C1-10 alqui-C1-12 heteroarila ou C1-20 alqui-C1-12 heteroarila). Em algumas modalidades, o alquileno ou a heteroarila podem, cada um, ser substituídos adicionalmente com 1, 2, 3 ou 4 grupos substituintes conforme aqui definido para o respectivo grupo. Grupos alquieteroarila são um subconjunto de grupos alquieterociclila.
[000411] O termo "alquieterociclila" representa um grupo heterociclila, conforme aqui definido, ligado ao grupo molecular parental através de um grupo alquila, conforme aqui definido. Grupos alquieterociclila não substituídos exemplares são de 2 a 32 carbonos (por exemplo, de a partir de 2 a 22, de a partir de 2 a 18, de a partir de 2 a 17, de a partir de 2 a 16, de a partir de 3 a 15, de a partir de 2 a 14, de a partir de 2 a 13 ou de a partir de 2 a 12 carbonos, tal como C1-6 alqui-C1-12 heterociclila-C1-10 alqui-C1-12 heterociclila ou C1-20 alqui-C1-12 heterociclila). Em algumas modalidades, o alquileno e a heterociclila podem ser cada um substituídos adicionalmente com 1, 2, 3 ou 4 grupos substituintes conforme aqui definido para o respectivo grupo.
[000412] O termo "alcóxi" representa um substituinte químico de fórmula -OR, onde R é um grupo C1-20 alquila (por exemplo, C1-6 ou Ci— 10 alquila), a menos que de outro modo especificado. Grupos alcóxi exemplares incluem metóxi, etóxi, propóxi (por exemplo, n-propóxi e isopropóxi), t-butóxi e similar. Em algumas modalidades, o grupo alquila pode ser substituído adicionalmente com 1, 2, 3 ou 4 grupos substituintes conforme aqui definido (por exemplo, hidróxido ou alcóxi).
[000413] O termo "alcoxialcóxi" representa um group alcóxi que é substituído com um grupo alcóxi. Grupos alcoxialcóxi não substituídos exemplares incluem entre 2 a 40 carbonos (por exemplo, de a partir de 2 a 12 ou de a partir de 2 a 20 carbonos, tal como C1-6 alcóxi-C1-6 alcóxi, C1-10 alcóxi-C1-10 alcóxi ou C1-20 alcóxi-C1-20 alcóxi). Em algumas modalidades, cada grupo alcóxi pode ser substituído adicionalmente com 1, 2, 3 ou 4 grupos substituintes conforme aqui definido.
[000414] O termo "alcoxialquila" representa um grupo alquila que é substituído com um grupo alcóxi. Grupos alcoxialquila não substituídos exemplares incluem entre 2 a 40 carbonos (por exemplo, de a partir de 2 a 12 ou de a partir de 2 a 20 carbonos, tal como C1-6 alcóxi-C1-6 alquila, C1-10 alcóxi-C1-10 alquila ou C1-20 alcóxi-C1-20 alquila). Em algumas modalidades, a alquila e o alcóxi podem ser cada um substituídos adicionalmente com 1, 2, 3 ou 4 grupos substituintes conforme aqui definido para o respectivo grupo.
[000415] O termo "alcoxicarbonila", conforme aqui usado, representa um alcóxi, conforme aqui definido, ligado ao grupo molecular parental através de um átomo de carbono (por exemplo, -C(O)-OR, onde R é H ou um grupo C1-6, C1-10 ou C1-20 alquila opcionalmente substituído). Alcoxicarbonila não substituída exemplar inclui de a partir de 1 a 21 carbonos (por exemplo, de a partir de 1 a 11 ou de a partir de 1 a 7 carbonos). Em algumas modalidades, o grupo alcóxi é adicionalmente substituído com 1, 2, 3 ou 4 substituintes conforme aqui descrito.
[000416] O termo "alcoxicarbonilacila, conforme usado aqui, representa um grupo acila, conforme aqui definido, que é substituído com um grupo alcoxicarbonila, conforme aqui definido (por exemplo, - C(O) -alqui-C(O)-OR, onde R é um grupo C1-6, C1-10 ou C1-20 alquila opcionalmente substituído). Alcoxicarbonilacila não substituída exemplar inclui de a partir de 3 a 41 carbonos (por exemplo, de a partir de 3 a 10, de a partir de 3 a 13, de a partir de 3 a 17, de a partir de 3 a 21 ou de a partir de 3 a 31 carbonos, tal como C1-6 alcoxicarbonil-C1-6 acila, C1-10 alcoxicarbonil-C1-10 acila ou C1-20 alcoxicarbonil-C1-20 acila). Em algumas modalidades, cada grupo alcóxi e alquila é adicionalmente independentemente substituído com 1, 2, 3 ou 4 substituintes, conforme aqui descrito (por exemplo, um grupo hidróxi) para cada grupo.
[000417] O termo "alcoxicarbonilalcóxi", conforme aqui usado, representa um grupo alcóxi, conforme aqui definido, que é substituído com um grupo alcoxicarbonila, conforme aqui definido (por exemplo, - O-alquil-C(O)-OR, onde R é um grupo C1-6, C1-10 ou C1-20 alquila opcionalmente substituído). Alcoxicarbonilalcóxi não substituído exemplar inclui de a partir de 3 a 41 carbonos (por exemplo, de a partir de 3 a 10, de a partir de 3 a 13, de a partir de 3 a 17, de a partir de 3 a 21 ou de a partir de 3 a 31 carbonos, tal como C1-6 alcoxicarbonil-C1-6 alcóxi, C1-10 alcoxicarbonil-C1-10 alcóxi ou C1-20 alcoxicarbonil-C1-20 alcóxi). Em algumas modalidades, cada grupo alcóxi é adicionalente independentemente substituído com 1, 2, 3 ou 4 substituintes, conforme aqui descrito (por exemplo, um grupo hidróxi).
[000418] O termo "alcoxicarbonilalquila", conforme aqui usado, representa um grupo alquila, conforme aqui definido, que é substituído com um grupo alcoxicarbonila, conforme aqui definido, (por exemplo, - alquil-C(O)-OR, onde R é um grupo C1-20, C1-10 ou C1-6 alquila opcionalmente substituído). Alcoxicarbonilalquila não substituída exemplar inclui de a partir de 3 a 41 carbonos (por exemplo, de a partir de 3 a 10, de a partir de 3 a 13, de a partir de 3 a 17, de a partir de 3 a 21 ou de a partir de 3 a 31 carbonos, tal como C1-6 alcoxicarbonil-C1-6 alquila, C1-10 alcoxicarbonil-C1-10 alquila ou C1-20 alcoxicarbonil-C1-20 alquila). Em algumas modalidades, cada grupo alquila e alcóxi é adicionalmente independentemente substituído com 1, 2, 3 ou 4 substituintes conforme aqui descrito (por exemplo, um grupo hidróxi).
[000419] O termo "alcoxicarbonilalquenila", conforme aqui usado, representa um grupo alquenila, conforme aqui definido, que é substituído com um grupo alcoxicarbonila, conforme aqui definido (por exemplo, -alquenil-C(O)-OR, onde R é um grupo C1-20, C1-10 ou C1-6 alquila opcionalmente substituído). Alcoxicarbonilalquenila não substituída exemplar inclui de a partir de 4 a 41 carbonos (por exemplo, de a partir de 4 a 10, de a partir de 4 a 13, de a partir de 4 a 17, de a partir de 4 a 21 ou de a partir de 4 a 31 carbonos, tal como C1-6 alcoxicarbonil-C2-6 alquenila, C1-10 alcoxicarbonil-C2-10 alquenila ou C1-20 alcoxicarbonil-C2-20 alquenila). Em algumas modalidades, cada grupo alquila, alquenila e alcóxi é independentemente adicionalmente substituído com 1, 2, 3 ou 4 substituintes conforme aqui descrito (por exemplo, um grupo hidróxi).
[000420] O termo "alcoxicarbonilalquinila", conforme aqui usado, representa um grupo alquinila, conforme aqui definido, que é substituído com um grupo alcoxicarbonila, conforme aqui definido (por exemplo, - alquinil-C(O)-OR, onde R é um grupo C1-20, C1-10 ou C1-6 alquila opcionalmente substituído). Alcoxicarbonilalquinila não substituída exemplar inclui de a partir de 4 a 41 carbonos (por exemplo, de a partir de 4 a 10, de a partir de 4 a 13, de a partir de 4 a 17, de a partir de 4 a 21 ou de a partir de 4 a 31 carbonos, tal como C1-6 alcoxicarbonil-C2-6 alquinila, C1-10 alcoxicarbonil-C2-10 alquinila ou C1-20 alcoxicarbonil-C2-20 alquinila). Em algumas modalidades, cada grupo alquila, alquinila e alcóxi é adicionalmente independentemente substituído com 1, 2, 3 ou 4 substituintes conforme aqui descrito (por exemplo, um grupo hidróxi).
[000421] O termo "alquila", conforme aqui usado, inclui ambos os grupos saturados de cadeia reta ou cadeia ramificada de a partir de 1 a 20 carbonos (por exemplo, de a partir de 1 a 10 ou de a partir de 1 a 6), a menos que de outro modo especificado. Grupos alquila são exemplificados por metila, etila, n- e isopropila, n-, sec-, iso- e terc-butila, neopentila, e similar, e podem ser opcionalmente substituídos com um, dois, três ou, no caso de grupos alquila de dois carbonos ou mais, quatro substituintes independentemente selecionados do grupo consistindo em: (1) C1-6 alcóxi; (2) C1-6 alquilsulfinila; (3) amino, conforme aqui definido (por exemplo, amino não substituído (isto é, -NH2) ou amino substituído (isto é, -N(RN1)2, onde RN1 é é conforme definido para amino); (4) C6-10 aril-C1-6 alcóxi; (5) azido; (6) halo; (7) (C2-9 heterociclil)óxi; (8) hidróxi, opcionalmente substituído com um grupo de proteção O; (9) nitro; (10) oxo (por exemplo, carboxialdeído ou acila); (11) C1-7 espirociclila; (12) tioalcóxi; (13) tiol; (14) -CO2RA’, opcionalmente substituído com um grupo de proteção O e onde RA’ é selecionado do grupo consistindo em (a) C1-20 alquila (por exemplo, C16 alquila), (b) C2-20 alquenila (por exemplo, C2-6 alquenila), (c) C6-10 arila, (d) hidrogênio, (e) C1-6 alquil-C6-10 arila, (f) amino-C1-20 alquila, (g) polietileno glicol de -(CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR’, onde s1 é um número inteiro de a partir de 1 a 10 (por exemplo, de a partir de 1 a 6 ou de a partir de 1 a 4), cada um de s2 e s3, independentemente, é um número inteiro de a partir de 0 a 10 (por exemplo, de a partir de 0 a 4, de a partir de 0 a 6, de a partir de 1 a 4, de a partir de 1 a 6 ou de a partir de 1 a 10), e R’ é H ou C1-20 alquila, e (h) amino-polietileno glicol de - NRN1(CH2)s2(CH2CH2O)s1(CH2)s3NRN1, onde s1 é um número inteiro de a partir de 1 a 10 (por exemplo, de a partir de 1 a 6 ou de a partir de 1 a 4), cada um de s2 e s3, independentemente, é um número inteiro de a partir de 0 a 10 (por exemplo, de a partir de 0 a 4, de a partir de 0 a 6, de a partir de 1 a 4, de a partir de 1 a 6 ou de a partir de 1 a 10), e cada RN1 é, independentemente, hidrogênio ou C1-6 alquila opcionalmente substituída; (15) -C(O)NRB’RC’, onde cada um de RB’ e RC’ é, independentemente, selecionado do grupo consistindo em (a) hidrogênio, (b) C1-6 alquila, (c) C6-10 arila e (d) C1-6 alquil-C6-10 arila; (16) -SO2RD’, onde RD’ é selecionado do grupo consistindo em (a) C1-6 alquila, (b) C6-10 arila, (c) C1-6 alquil-C6-10 arila e (d) hidróxi; (17) - SO2NRE’RF’, onde cada um de RE’ e RF’ é, independentemente, selecionado do grupo consistindo em (a) hidrogênio; (b) C1-6 alquila, (c) C6-10 arila e (d) C1-6 alqui-C6-10 arila; (18) -C(O)RG’, onde RG’ é selecionado do grupo consistindo em (a) C1-20 alquila (por exemplo, C16 alquila), (b) C2-20 alquenila (por exemplo, C2-6 alquenila), (c) C6-10 arila, (d) hidrogênio; (e) C1-6 alqui-C6-10 arila, (f) amino-C1-20 alquila, (g) polietileno glicol de -(CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR’, onde s1 é um número inteiro de a partir de 1 a 10 (por exemplo, de a partir de 1 a 6 ou de a partir de 1 a 4), cada um de s2 e s3, independentemente, é um número inteiro de a partir de 0 a 10 (por exemplo, de a partir de 0 a 4, de a partir de 0 a 6, de a partir de 1 a 4, de a partir de 1 a 6 ou de a partir de 1 a 10), e R’ é H ou C1-20 alquila, e (h) amino-polietileno glicol de - NRN1(CH2)s2(CH2CH2O)s1(CH2)s3NRN1, onde s1 é um número inteiro de a partir de 1 a 10 (por exemplo, de a partir de 1 a 6 ou de a partir de 1 a 4), cada um de s2 e s3, independentemente, é um número inteiro de a partir de 0 a 10 (por exemplo, de a partir de 0 a 4, de a partir de 0 a 6, de a partir de 1 a 4, de a partir de 1 a 6 ou de a partir de 1 a 10), e cada RN1 é, independentemente, hidrogênio ou C1-6 alquila opcionalmente substituída; (19) -NRH’C(O)RI’, onde RH’ é selecionado do grupo consistindo em (a1) hidrogênio e (b1) C1-6 alquila, e RI’ é selecionado do grupo consistindo em (a2) C1-20 alquila (por exemplo, C1-6 alquila), (b2) C2-20 alquenila (por exemplo, C2-6 alquenila), (c2) C6-10 arila, (d2) hidrogênio; (e2) C1-6 alqui-C6-10 arila, (f2) amino-C1-20 alquila, (g2) polietileno glicol de -(CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR’, onde s1 é um número inteiro de a partir de 1 a 10 (por exemplo, de a partir de 1 a 6 ou de a partir de 1 a 4), cada um de s2 e s3, independentemente, é um número inteiro de a partir de 0 a 10 (por exemplo, de a partir de 0 a 4, de a partir de 0 a 6, de a partir de 1 a 4, de a partir de 1 a 6 ou de a partir de 1 a 10), e R’ é H ou C1-20 alquila, e (h2) amino-polietileno glicol de - NRN1(CH2)s2(CH2CH2O)s1(CH2)s3NRN1, onde s1 é um número inteiro de a partir de 1 a 10 (por exemplo, de a partir de 1 a 6 ou de a partir de 1 a 4), cada um de s2 e s3, independentemente, é um número inteiro de a partir de 0 a 10 (por exemplo, de a partir de 0 a 4, de a partir de 0 a 6, de a partir de 1 a 4, de a partir de 1 a 6 ou de a partir de 1 a 10), e cada RN1 é, independentemente, hidrogênio ou C1-6 alquila opcionalmente substituída; (20) -NRJ’C(O)ORK’, onde RJ’ é selecionado do grupo consistindo em (a1) hidrogênio e (b1) C1-6 alquila, e RK’ é selecionado do grupo consistindo em (a2) C1-20 alquila (por exemplo, C1-6 alquila), (b2) C2-20 alquenila (por exemplo, C2-6 alquenila), (c2) C6-10 arila, (d2) hidrogênio; (e2) C1-6 alquil-C6-10 arila, (f2) amino-C1-20 alquila, (g2) polietileno glicol de -(CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR’, onde s1 é um número inteiro de a partir de 1 a 10 (por exemplo, de a partir de 1 a 6 ou de a partir de 1 a 4), cada um de s2 e s3, independentemente, é um número inteiro de a partir de 0 a 10 (por exemplo, de a partir de 0 a 4, de a partir de 0 a 6, de a partir de 1 a 4, de a partir de 1 a 6 ou de a partir de 1 a 10), e R’ é H ou C1-20 alquila, e (h2) amino-polietileno glicol de - NRN1(CH2)s2(CH2CH2O)s1(CH2)s3NRN1, onde s1 é um número inteiro de a partir de 1 a 10 (por exemplo, de a partir de 1 a 6 ou de a partir de 1 a 4), cada um de s2 e s3, independentemente, é um número inteiro de a partir de 0 a 10 (por exemplo, de a partir de 0 a 4, de a partir de 0 a 6, de a partir de 1 a 4, de a partir de 1 a 6 ou de a partir de 1 a 10), e cada RN1 é, independentemente, hidrogênio ou C1-6 alquila opcionalmente substituída; e (21) amidina. Em algumas modalidades, cada um desses grupos pode ser substituído adicionalmente conforme aqui descrito. Por exemplo, o grupo alquileno de uma C1-alcarila pode ser substituído adicionalmente com um grupo oxo para fornecer o respectivo substituinte ariloíla.
[000422] O termo "alquileno" e o prefixo "alqui-", conforme aqui usado, representam um grupo hidrocarboneto divalente saturado derivado de um hidrocarboneto saturado de cadeia reta ou ramificada através da remoção de dois átomos de hidrogênio, e é exemplificado por metileno, etileno, isopropileno e similar. O termo "Cx-y alquileno" e o prefixo "Cx-y alqui-" representam grupos alquileno tendo entre x e y carbonos. Valores exemplares para x são 1, 2, 3, 4, 5 e 6 e valores exemplares para y são 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18 ou 20 (por exemplo, C1-6, C1-10, C2-20, C2-6, C2-10 ou C2-20 alquileno). Em algumas modalidades, o alquileno pode ser substituído adicionalmente com 1, 2, 3 ou 4 grupos substituintes conforme aqui definido para um grupo alquila.
[000423] O termo "alquilsulfinila", conforme aqui usado, representa um grupo alquila ligado ao grupo molecular parental através de um grupo - S(O)-. Grupos alquilsulfinila não substituídos exemplares são de a partir de 1 a 6, de a partir de 1 a 10 ou de a partir de 1 a 20 carbonos. Em algumas modalidades, o grupo alquila pode ser substituído adicionalmente com 1, 2, 3 ou 4 grupos substituintes conforme aqui definido.
[000424] O termo "alquilsulfinilalquila", conforme aqui usado, representa um group alquila, conforme aqui definido, substituído por um grupo alquilsulfinila. Grupos alquilsulfinilalquila não substituídos exemplares são de a partir de 2 a 12, de a partir de 2 a 20 ou de a partir de 2 a 40 carbonos. Em algumas modalidades, cada grupo alquila pode ser substituído adicionalmente com 1, 2, 3 ou 4 grupos substituintes conforme aqui definido.
[000425] O termo "alquinila", conforme aqui usado, representa grupos de cadeia reta ou ramificada monovalentes de a partir de 2 a 20 átomos de carbono (por exemplo, de a partir de 2 a 4, de a partir de 2 a 6 ou de a partir de 2 a 10 carbonos) contendo uma ligação tripla carbono- carbono e é exemplificado por etinila, 1-propinila e similar. Grupos alquinila podem ser opcionalmente substituídos com 1, 2, 3 ou 4 grupos substituintes que são selecionados, independentemente de arila, cicloalquila ou heterociclila (por exemplo, heteroarila), conforme aqui definido ou qualquer um dos grupos substituintes alquila exemplares descritos aqui.
[000426] O termo "alquinilóxi" representa um substituinte químico de fórmula -OR, onde R é um grupo C2-20 alquinila (por exemplo, C2-6 ou C2-10 alquinila), a menos que de outro modo especificado. Grupos alquinilóxi exemplares incluem etinilóxi, propinilóxi e similar. Em algumas modalidades, o grupo alquinila pode ser substituído adicionalmente com 1, 2, 3 ou 4 grupos substituintes conforme aqui definido (por exemplo, um grupo hidróxi).
[000427] O termo "amidina", conforme aqui usado, representa um grupo -C(=NH)NH2.
[000428] O termo "amino", conforme aqui usado, representa um grupo -N(RN1)2, onde cada RN1 é, independentemente, H, OH, NO2, N(RN2)2, SO2ORN2, SO2RN2, SORN2, um grupo de proteção N, alquila, alquenila, alquinila, alcóxi, arila, alcarila, cicloalquila, alquilcicloalquila, carboxialquila (por exemplo, opcionalmente substituído com um grupo de proteção O, tais como grupos arilalcoxicarbonila opcionalmente substituídos ou qualquer um descrito aqui), sulfoalquila, acila (por exemplo, acetila, trifluoracetila ou outros descritos aqui), alcoxicarbonilalquila (por exemplo, opcionalmente substituído com um grupo de proteção O, tais como grupos arilalcoxicarbonila opcionalmente substituídos ou qualquer um descrito aqui), heterociclila (por exemplo, heteroarila) ou alquieterociclila (por exemplo, alquieteroarila), onde cada um desses grupos RN1 mencionados pode ser opcionalmente substituído, conforme aqui definido para cada group; ou dois RN1 combinam para formar um grupo heterociclila ou de proteção N, e onde cada RN2 é, independentemente, H, alquila ou arila. Os grupos amino da invenção podem ser um grupo amino não substituído (isto é, -NH2) ou um grupo amino substituído (isto é, - N(RN1)2). Em uma modalidade preferida, amino é -NH2 ou -NHRN1, onde RN1 é, independentemente, OH, NO2, NH2, NRN22, SO2ORN2, SO2RN2, SORN2, alquila, carboxialquila, sulfoalquila, acila (por exemplo, acetila, trifluoracetila ou outros descritos aqui), alcoxicarbonilalquila (por exemplo, t-butoxicarbonilalquila) ou arila, e cada RN2 pode ser H, C1-20 alquila (por exemplo, C1-6 alquila) ou C6-10 arila.
[000429] O termo "aminoácido," conforme aqui descrito, se refere a uma molécula tendo uma cadeia lateral, um grupo amino e um grupo ácido (por exemplo, um grupo carbóxi de -CO2H ou um grupo sulfo de -SO3H), onde o aminoácido é ligado ao grupo molecular parental pela cadeia lateral, grupo amino ou grupo ácido (por exemplo, a cadeia lateral). Em algumas modalidades, o aminoácido é ligado ao grupo molecular parental por um grupo carbonila, onde a cadeia lateral ou grupo amino é ligado ao grupo carbonila. Cadeias laterais exemplares incluem uma alquila, arila, heterociclila, alcarila, alquieterociclila, aminoalquila, carbamoilalquila e carboxialquila opcionalmente substituída. Aminoácidos exemplares incluem alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, ácido glutâmico, glutamina, glicina, histidina, hidroxinorvalina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, norvalina, ornitina, fenilalanina, prolina, pirrolisina, selenocisteína, serina, taurina, treonina, triptofano, tirosina e valina. Grupos de aminoácido podem ser opcionalmente substituídos com um, dois, três ou, no caso de grupos de aminoácido de dois carbonos ou mais, quatro substituintes independentemente selecionados do grupo consistindo em: (1) C1-6 alcóxi; (2) C1-6 alquilsulfinila; (3) amino, conforme aqui definido (por exemplo, amino não substituído (isto é, -NH2) ou um amino substituído (isto é, -N(RN1)2, onde RN1 é é conforme definido para amino); (4) C6-10 aril-C1-6 alcóxi; (5) azido; (6) halo; (7) (C2-9 heterociclil)óxi; (8) hidróxi; (9) nitro; (10) oxo (por exemplo, carboxialdeído ou acila); (11) C1-7 espirociclila; (12) tioalcóxi; (13) tiol; (14) -CO2RA’, onde RA’ é selecionado do grupo consistindo em (a) C1-20 alquila (por exemplo, C1-6 alquila), (b) C2-20 alquenila (por exemplo, C2-6 alquenila), (c) C6-10 arila, (d) hidrogênio; (e) C1-6 alquil-C6-10 arila, (f) amino-C1-20 alquila, (g) polietileno glicol de - (CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR’, onde s1 é um número inteiro de a partir de 1 a 10 (por exemplo, de a partir de 1 a 6 ou de a partir de 1 a 4), cada um de s2 e s3, independentemente, é um número inteiro de a partir de 0 a 10 (por exemplo, de a partir de 0 a 4, de a partir de 0 a 6, de a partir de 1 a 4, de a partir de 1 a 6 ou de a partir de 1 a 10), e R’ é H ou C1-20 alquila, e (h) amino-polietileno glicol de - NRN1(CH2)s2(CH2CH2O)s1(CH2)s3NRN1, onde s1 é um número inteiro de a partir de 1 a 10 (por exemplo, de a partir de 1 a 6 ou de a partir de 1 a 4), cada um de s2 e s3, independentemente, é um número inteiro de a partir de 0 a 10 (por exemplo, de a partir de 0 a 4, de a partir de 0 a 6, de a partir de 1 a 4, de a partir de 1 a 6 ou de a partir de 1 a 10), e cada RN1 é, independentemente, hidrogênio ou C1-6 alquila opcionalmente substituída; (15) -C(O)NRB’RC’, onde cada um de RB’ e RC’ é, independentemente, selecionado do grupo consistindo em (a) hidrogênio; (b) C1-6 alquila, (c) C6-10 arila e (d) C1-6 alquil-C6-10 arila; (16) -SO2RD’, onde RD’ é selecionado do grupo consistindo em (a) C1-6 alquila, (b) C6-10 arila, (c) C1-6 alqui-C6-10 arila e (d) hidróxi; (17) - SO2NRE’RF’, onde cada um de RE’ e RF’ é, independentemente, selecionado do grupo consistindo em (a) hidrogênio; (b) C1-6 alquila, (c) C6-10 arila e (d) C1-6 alquil-C6-10 arila; (18) -C(O)RG’, onde RG’ é selecionado do grupo consistindo em (a) C1-20 alquila (por exemplo, C16 alquila), (b) C2-20 alquenila (por exemplo, C2-6 alquenila), (c) C6-10 arila, (d) hidrogênio; (e) C1-6 alqui-C6-10 arila, (f) amino-C1-20 alquila, (g) polietileno glicol de -(CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR’, onde s1 é um número inteiro de a partir de 1 a 10 (por exemplo, de a partir de 1 a 6 ou de a partir de 1 a 4), cada um de s2 e s3, independentemente, é um número inteiro de a partir de 0 a 10 (por exemplo, de a partir de 0 a 4, de a partir de 0 a 6, de a partir de 1 a 4, de a partir de 1 a 6 ou de a partir de 1 a 10), e R’ é H ou C1-20 alquila, e (h) amino-polietileno glicol de - NRN1(CH2)s2(CH2CH2O)s1(CH2)s3NRN1, onde s1 é um número inteiro de a partir de 1 a 10 (por exemplo, de a partir de 1 a 6 ou de a partir de 1 a 4), cada um de s2 e s3, independentemente, é um número inteiro de a partir de 0 a 10 (por exemplo, de a partir de 0 a 4, de a partir de 0 a 6, de a partir de 1 a 4, de a partir de 1 a 6 ou de a partir de 1 a 10), e cada RN1 é, independentemente, hidrogênio ou C1-6 alquila opcionalmente substituída; (19) -NRH’C(O)RI’, onde RH’ é selecionado do grupo consistindo em (a1) hidrogênio e (b1) C1-6 alquila e RI’ é selecionado do grupo consistindo em (a2) C1-20 alquila (por exemplo, C1-6 alquila), (b2) C2-20 alquenila (por exemplo, C2-6 alquenila), (c2) C6-10 arila, (d2) hidrogênio; (e2) C1-6 alquil-C6-10 arila, (f2) amino-C1-20 alquila, (g2) polietileno glicol de -(CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR’, onde s1 é um número inteiro de a partir de 1 a 10 (por exemplo, de a partir de 1 a 6 ou de a partir de 1 a 4), cada um de s2 e s3, independentemente, é um número inteiro de a partir de 0 a 10 (por exemplo, de a partir de 0 a 4, de a partir de 0 a 6, de a partir de 1 a 4, de a partir de 1 a 6 ou de a partir de 1 a 10), e R’ é H ou C1-20 alquila, e (h2) amino-polietileno glicol de - NRN1(CH2)s2(CH2CH2O)s1(CH2)s3NRN1, onde s1 é um número inteiro de a partir de 1 a 10 (por exemplo, de a partir de 1 a 6 ou de a partir de 1 a 4), cada um de s2 e s3, independentemente, é um número inteiro de a partir de 0 a 10 (por exemplo, de a partir de 0 a 4, de a partir de 0 a 6, de a partir de 1 a 4, de a partir de 1 a 6 ou de a partir de 1 a 10), e cada RN1 é, independentemente, hidrogênio ou C1-6 alquila opcionalmente substituída; (20) -NRJ’C(O)ORK’, onde RJ’ é selecionado do grupo consistindo em (a1) hidrogênio e (b1) C1-6 alquila, e RK’ é selecionado do grupo consistindo em (a2) C1-20 alquila (por exemplo, C1-6 alquila), (b2) C2-20 alquenila (por exemplo, C2-6 alquenila), (c2) C6-10 arila, (d2) hidrogênio; (e2) C1-6 alquil-C6-10 arila, (f2) amino-C1-20 alquila, (g2) polietileno glicol de -(CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR’, onde s1 é um número inteiro de a partir de 1 a 10 (por exemplo, de a partir de 1 a 6 ou de a partir de 1 a 4), cada um de s2 e s3, independentemente, é um número inteiro de a partir de 0 a 10 (por exemplo, de a partir de 0 a 4, de a partir de 0 a 6, de a partir de 1 a 4, de a partir de 1 a 6 ou de a partir de 1 a 10), e R’ é H ou C1-20 alquila, e (h2) amino-polietileno glicol de - NRN1(CH2)s2(CH2CH2O)s1(CH2)s3NRN1, onde s1 é um número inteiro de a partir de 1 a 10 (por exemplo, de a partir de 1 a 6 ou de a partir de 1 a 4), cada um de s2 e s3, independentemente, é um número inteiro de a partir de 0 a 10 (por exemplo, de a partir de 0 a 4, de a partir de 0 a 6, de a partir de 1 a 4, de a partir de 1 a 6 ou de a partir de 1 a 10), e cada RN1 é, independentemente, hidrogênio ou C1-6 alquila opcionalmente substituída; e (21) amidina. Em algumas modalidades, cada um desses grupos pode ser substituído adicionalmente conforme aqui descrito.
[000430] O termo "aminoalcóxi", conforme aqui usado, representa um grupo alcóxi, conforme aqui definido, substituído por um grupo amino, conforme aqui definido. A alquila e o amino podem ser cada um substituídos adicionalmente com 1, 2, 3 ou 4 grupos substituintes conforme aqui descrito para o respectivo grupo (por exemplo, CO2RA’, onde RA’ é selecionado do grupo consistindo em (a) C1-6 alquila, (b) C610 arila, (c) hidrogênio; e (d) C1-6 alqui-C6-10 arila, por exemplo, carbóxi).
[000431] O termo "aminoalquila", conforme aqui usado, representa um grupo alquila, conforme aqui definido, substituído por um grupo amino, conforme aqui definido. A alquila e o amino pode ser cada um substituídos adicionalmente com 1, 2, 3 ou 4 grupos substituintes conforme aqui descrito para o respectivo grupo (por exemplo, CO2RA’, onde RA’ é selecionado do grupo consistindo em (a) C1-6 alquila, (b) C610 arila, (c) hidrogênio; e (d) C1-6 alqui-C6-10 arila, por exemplo, carbóxi, e/ou um grupo de proteção N).
[000432] O termo "aminoalquenila", conforme aqui usado, representa um grupo alquenila, conforme aqui definido, substituído por um grupo amino, conforme aqui definido. A alquenila e o amino podem ser substituídos adicionalmente com 1, 2, 3 ou 4 grupos substituintes conforme aqui descrito para grupo (por exemplo, CO2RA’, onde RA’ é selecionado do grupo consistindo em (a) C1-6 alquila, (b) C6-10 arila, (c) hidrogênio; e (d) C1-6 alqui-C6-10 arila, por exemplo, carbóxi, e/ou um grupo de proteção N).
[000433] O termo "aminoalquinila", conforme aqui usado, representa um grupo alquinila, conforme aqui definido, substituído por um grupo amino, conforme aqui definido. A alquinila e o amino podem ser substituídos adicionalmente com 1, 2, 3 ou 4 grupos substituintes conforme aqui descrito para o respectivo grupo (por exemplo, CO2RA’, onde RA’ é selecionado do grupo consistindo em (a) C1-6 alquila, (b) C610 arila, (c) hidrogênio; e (d) C1-6 alquil-C6-10 arila, por exemplo, carbóxi, e/ou um grupo de proteção N).
[000434] O termo "arila", conforme aqui usado, representa um sistema de anel carbocíclico mono-, bicíclico ou multicíclico tendo um ou dois anéis aromáticos e é exemplificado por fenila, naftila, 1,2-di-hidronaftila, 1,2,3,4-tetra-hidronaftila, antaracenila, fenantrenila, fluorenila, indanila, indenila, e similar, e pode ser opcionalmente substituído com 1, 2, 3, 4 ou 5 substituintes independentemente selecionados do grupo consistindo em: (1) C1-7 acila (por exemplo, carboxialdeído); (2) C1-20 alquila (por exemplo, C1-6 alquila, C1-6 alcóxi-C1-6 alquila, C1-6 alquilsulfinil-C1-6 alquila, amino-C1-6 alquila, azido-C1-6 alquila, (carboxialdeído)-C1-6 alquila, halo-C1-6 alquila (por exemplo, perfluoralquila), hidróxi-C1-6 alquila, nitro-C1-6 alquila ou C1-6 tioalcóxi-C1- 6 alquila); (3) C1-20 alcóxi (por exemplo, C1-6 alcóxi, tal como perfluoralcóxi); (4) C1-6 alquilsulfinila; (5) C6-10 arila; (6) amino; (7) C1-6 alqui-C6-10 arila; (8) azido; (9) C3-8 cicloalquila; (10) C1-6 alquil-C3-8 cicloalquila; (11) halo; (12) C1-12 heterociclila (por exemplo, C1-12 heteroarila); (13) (C1-12 heterociclil)óxi; (14) hidróxi; (15) nitro; (16) C1-20 tioalcóxi (por exemplo, Ci-6 tioalcóxi); (17) -(CH2)qCO2RA‘, onde q é um número inteiro de a partir de zero a quatro, e RA’ é selecionado do grupo consistindo em (a) C1-6 alquila, (b) C6-10 arila, (c) hidrogênio; e (d) C1-6 alqui-C6—io arila; (18) -(CH2)qCONRB’RC’, onde q é um número inteiro de a partir de zero a quatro e onde RB’ e RC’ são independentemente selecionados do grupo consistindo em (a) hidrogênio; (b) C1-6 alquila, (c) C6-10 arila e (d) C1-6 alqui-C6-w arila; (19) -(CH2)qSO2RD‘, onde q é um número inteiro de a partir de zero a quatro e onde RD’ é selecionado do grupo consistindo em (a) alquila, (b) C6-10 arila, e (c) alqui-C6-10 arila; (20) -(CH2)qSO2NRE’RF, onde q é um número inteiro de a partir de zero a quatro e onde cada um de RE’ e RF’ é, independentemente, selecionado do grupo consistindo em (a) hidrogênio; (b) C1-6 alquila, (c) C6-10 arila e (d) C1-6 alqui-C6-10 arila; (21) tiol; (22) C6-10 arilóxi; (23) C3-8 cicloalcóxi; (24) C6-10 aril-C1-6 alcóxi; (25) C1-6 alqui-C1-12 heterociclila (por exemplo, C1-6 alqui-C1-12 heteroarila); (26) C2-20 alquenila e (27) C2-20 alquinila. Em algumas modalidades, cada um desses grupos pode ser substituído adicionalmente conforme aqui descrito. Por exemplo, o grupo alquileno de uma C1-alcarila ou uma C1-alquieterociclila pode ser substituído adicionalmente com um grupo oxo para fornecer o respectivo grupo substituinte ariloíla e (heterociclil)oíla.
[000435] O termo "arilalcóxi", conforme aqui usado, representa um grupo alcarila, conforme aqui definido, ligado ao grupo molecular parental através de um átomo de oxigênio. Grupos arilalcóxi não substituídos exemplares incluem de a partir de 7 a 30 átomos de carbono (por exemplo, de a partir de 7 a 16 ou de a partir de 7 a 20 carbonos, tal como C6-10 aril-C1-6 alcóxi, C6-10 aril-C1-10 alcóxi ou C6-10 aril- C1-20 alcóxi). Em algumas modalidades, o grupo arilalcóxi pode ser substituído com 1, 2, 3 ou 4 substituintes conforme aqui definido
[000436] O termo "arilalcoxicarbonila", conforme aqui usado, representa um grupo arilalcóxi, conforme aqui definido, ligado ao grupo molecular parental através de uma carbonila (por exemplo, -C(O)-O- alquil-arila). Grupo arilalcóxi não substituídos exemplares incluem de a partir de 8 a 31 carbonos (por exemplo, de a partir de 8 a 17 ou de a partir de 8 a 21 carbonos, tal como C6-10 aril-C1-6 alcóxi-carbonila, C6-10 aril-C1-10 alcóxi-carbonila ou C6-10 aril-C1-20 alcóxi-carbonila). Em algumas modalidades, o grupo arilalcoxicarbonila pode ser substituído com 1, 2, 3 ou 4 substituintes conforme aqui definido.
[000437] O termo "arilóxi" representa um substituinte químico de fórmula -OR’, onde R‘ é um grupo arila de 6 a 18 carbonos, a menos que de outro modo especificado. Em algumas modalidades, o grupo arila pode ser substituído com 1, 2, 3 ou 4 substituintes conforme aqui definido.
[000438] O termo "ariloíla", conforme aqui usado, representa um grupo arila, conforme aqui definido, que é ligado ao grupo molecular parental através de um grupo carbonila. Grupos ariloíla não substituídos exemplares são de 7 a 11 carbonos. Em algumas modalidades, o grupo arila pode ser substituído com 1, 2, 3 ou 4 substituintes conforme aqui definido.
[000439] O termo "azido" representa um grupo -N3, que pode ser também representado como -N=N=N.
[000440] O termo "bicíclico", conforme aqui usado, se refere a uma estrutura tendo dois anéis, que podem ser aromáticos ou não aromáticos. Estruturas bicíclicas incluem grupos espirociclila, conforme aqui definido, e dois anéis que compartilham uma ou mais pontes, onde tais pontes podem incluir um átomo ou uma cadeia incluindo dois, três ou mais átomos. Grupos bicíclicos exemplares incluem um grupo carbociclila bicíclico, onde os primeiro e segundo anéis são grupos carbociclila, conforme aqui definido; um grupo arila bicíclico, onde os primeiro e segundo anéis são grupos arila, conforme aqui definido; grupos heterociclila bicíclicos, onde o primeiro anel é um grupo heterociclila e o segundo anel é um grupo carbociclila (por exemplo, arila) ou heterociclila (por exemplo, heteroarila); e grupos heteroarila bicíclicos, onde o primeiro anel é um grupo heteroarila e o segundo anel é um grupo carbociclila (por exemplo, arila) ou heterociclila (por exemplo, heteroarila). Em algumas modalidades, o grupo bicíclico pode ser substituído com 1, 2, 3 ou 4 substituintes conforme aqui definido para grupos cicloalquila, heterociclila e arila.
[000441] O termo "boranila", conforme aqui usado, representa - B(RB1)3, onde cada RB1 é, independentemente, selecionado do grupo consistindo em H e alquila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, o grupo boranila pode ser substituído com 1, 2, 3 ou 4 substituintes conforme aqui definido for alquila.
[000442] Os termos "carbocíclico" e "carbociclila", conforme aqui usado, se referem a uma estrutura C3-12 monocíclica, bicíclica ou tricíclica opcionalmente substituída onde os anéis, que podem ser aromáticos ou não aromáticos, são formados por átomos de carbono. Estruturas carbocíclica incluem grupos cicloalquila, cicloalquenila e arila.
[000443] O termo "carbamoíla", conforme aqui usado, representa - C(O)-N(RN1)2, onde o significado de cada RN1 é encontrado na definição de "amino" provida aqui.
[000444] O termo "carbamoilalquila", conforme aqui usado, representa um grupo alquila, conforme aqui definido, substituído por um grupo carbamoíla, conforme aqui definido. O grupo alquila pode ser substituído adicionalmente com 1, 2, 3 ou 4 grupos substituintes conforme aqui descrito.
[000445] O termo "carbamila", conforme aqui, usado, se refere a um grupo carbamato tendo a estrutura -NRN1C(=O)OR ou -OC(=O)N(RN1)2, onde o significado de cada RN1 é encontrado na definição de "amino" provida aqui, e R é alquila, cicloalquila, alquilcicloalquila, arila, alcarila, heterociclila (por exemplo, heteroarila) ou alquieterociclila (por exemplo, alquieteroarila), conforme aqui definido.
[000446] O termo "carbonila", conforme aqui usado, representa um grupo C(O), que pode ser também representado por C=O.
[000447] O termo "carboxialdeído" representa um grupo acila tendo a estrutura -CHO.
[000448] O termo "carbóxi", conforme aqui usado, significa -CO2H.
[000449] O termo "carboxialcóxi", conforme aqui usado, representa um grupo alcóxi, conforme aqui definido, substituído por um grupo carbóxi, conforme aqui definido. O grupo alcóxi pode ser substituído adicionalmente com 1, 2, 3 ou 4 grupos substituintes conforme aqui descrito para o grupo alquila, e o grupo carbóxi pode ser opcionalmente substituído com um ou mais grupos de proteção O.
[000450] O termo "carboxialquila", conforme aqui usado, representa um grupo alquila, conforme aqui definido, substituído por um grupo carbóxi, conforme aqui definido. O grupo alquila pode ser substituído adicionalmente com 1, 2, 3 ou 4 grupos substituintes conforme aqui descrito, e o grupo carbóxi pode ser opcionalmente substituído com um ou mais grupos de proteção O.
[000451] O termo "carboxiaminoalquila", conforme aqui usado, representa um grupo aminoalquila, conforme aqui definido, substituído por um carbóxi, conforme aqui definido. O carbóxi, a alquila e o amino podem ser substituídos adicionalmente com 1, 2, 3 ou 4 grupos substituintes conforme aqui descrito para o respectivo grupo (por exemplo, CO2RA’, onde RA’ é selecionado do grupo consistindo em (a) C1-6 alquila, (b) C6-10 arila, (c) hidrogênio; e (d) C1-6 alquil-C6-10 arila, por exemplo, carbóxi, e/ou um grupo de proteção N e/ou um grupo de proteção O).
[000452] O termo "ciano", conforme aqui usado, representa um grupo -CN.
[000453] O termo "cicloalcóxi" representa um substituinte químico de fórmula -OR, onde R é um grupo C3-8 cicloalquila, conforme aqui definido, a menos que de outro modo especificado. O grupo cicloalquila pode ser substituído adicionalmente com 1, 2, 3 ou 4 grupos substituintes conforme aqui descrito. Grupos cicloalcóxi não substituídos exemplares são de 3 a 8 carbonos. Em algumas modalidades, o grupo cicloalquila pode ser substituído adicionalmente com 1, 2, 3 ou 4 grupos substituintes conforme aqui descrito.
[000454] O termo "cicloalquila", conforme aqui usado, representa um grupo hidrocarboneto cíclico não aromático saturado ou não saturado monovalente de três a oito carbonos, a menos que de outro modo especificado, e é exemplificado por ciclopropila, ciclobutila, ciclopentila, ciclo-hexila, ciclo-heptila, biciclo heptila e similar. Quando o grupo cicloalquila inclui uma ligação dupla carbono-carbono, o grupo cicloalquila pode ser referido como um grupo "cicloalquenila". Grupos cicloalquenila exemplares incluem ciclopentenila, ciclo-hexenila e similar. Os grupos cicloalquila da presente invenção podem ser referidos como um grupo "cicloalquenila". Grupos cicloalquenila exemplares incluem ciclopentenila, ciclo-hexenila e similar. Os grupos cicloalquila da presente invenção podem ser opcionalmente substituídos com: (1) C1-7 acila (por exemplo, carboxialdeído); (2) C1-20 alquila (por exemplo, C1-6 alquila, C1-6 alcóxi-C1-6 alquila, C1-6 alquilsulfinil-C1-6 alquila, amino- C1-6 alquila, azido-C1-6 alquila, (carboxialdeído)-C1-6 alquila, halo-C1-6 alquila (por exemplo, perfluoralquila), hidróxi-C1-6 alquila, nitro-C1-6 alquila ou C1-6 tioalcóxi-C1-6 alquila); (3) C1-20 alcóxi (por exemplo, C1-6 alcóxi, tal como perfluoralcóxi); (4) C1-6 alquilsulfinila; (5) C6-10 arila; (6) amino; (7) C1-6 alqui-C6-10 arila; (8) azido; (9) C3-8 cicloalquila; (10) C1-6 alqui-C3-8 cicloalquila; (11) halo; (12) C1-12 heterociclila (por exemplo, C112 heteroarila); (13) (C1-12 heterociclil)óxi; (14) hidróxi; (15) nitro; (16) C120 tioalcóxi (por exemplo, C1-6 tioalcóxi); (17) -(CH2)qCO2RA‘, onde q é um número inteiro de a partir de zero a quatro, e RA’ é selecionado do grupo consistindo em (a) C1-6 alquila, (b) C6-10 arila, (c) hidrogênio; e (d) C1-6 alqui-C6—io arila; (18) -(CH2)qCONRB’RC’, onde q é um número inteiro de a partir de zero a quatro e onde RB’ e RC’ são independentemente selecionados do grupo consistindo em (a) hidrogênio; (b) C6-10 alquila, (c) C6-10 arila, e (d) C1-6 alqui-C6-w arila; (19) -(CH2)qSO2RD‘, onde q é um número inteiro de a partir de zero a quatro e onde RD’ é selecionado do grupo consistindo em (a) C6-10 alquila, (b) C6-10 arila, e (c) C1-6 alquil- C6-10 arila; (20) -(CH2)qSO2NRE’RF, onde q é um número inteiro de a partir de zero a quatro e onde cada um de RE’ e RF’ é, independentemente, selecionado do grupo consistindo em (a) hidrogênio; (b) C6-10 alquila, (c) C6-10 arila e (d) C1-6 alquil-C6-10 arila; (21) tiol; (22) C6-10 arilóxi; (23) C3-8 cicloalcóxi; (24) C6-10 aril-C1-6 alcóxi; (25) C1-6 alqui-C1-12 heterociclila (por exemplo, C1-6 alqui-C1-12 heteroarila); (26) oxo; (27) C2-20 alquenila; e (28) C2-20 alquinila. Em algumas modalidades, cada um desses grupos pode ser substituído adicionalmente conforme aqui descrito. Por exemplo, o grupo alquileno de uma C1-alcarila ou uma C1-alquieterociclila pode ser substituído adicionalmente com um grupo oxo para fornecer o respectivo grupo substituinte ariloíla e (heterociclil)oíla.
[000455] O termo "diastereômero", conforme aqui usado, significa estereoisômeros que não são imagens espelhadas um do outro e são não superpostos uns sobre os outros.
[000456] O termo "quantidade eficaz" de um agente, conforme aqui usado, é aquela quantidade suficiente para obter resultados benéficos ou desejados, por exemplo, resultados clínicos e, desta maneira, uma "quantidade eficaz" depende do contexto onde ele está sendo aplicado. Por exemplo, no contexto de administração de um agente que trata câncer, uma quantidade eficaz de um agente é, por exemplo, uma quantidade suficiente para obter tratamento, conforme aqui definido, de câncer, comparado com a resposta obtida sem administração do agente.
[000457] O termo "enantiômero", conforme aqui usado, significa cada forma opticamente ativa individual de um composto da invenção, tendo uma pureza óptica ou excesso enantiomérico (conforme determinado através de métodos padrão na técnica) de pelo menos 80% (isto é, pelo menos 90% de um enantiômero e no máximo 10% do outro enantiômero), preferivelmente pelo menos 90% e mais preferivelmente pelo menos 98%.
[000458] O termo "halo", conforme aqui usado, representa um halogênio selecionado de bromo, cloro, iodo ou flúor.
[000459] O termo "haloalcóxi", conforme aqui usado, representa um grupo alcóxi, conforme aqui definido, substituído por um grupo halogênio (isto é, Fl, Cl, Br ou I). Um haloalcóxi pode ser substituído com um, dois, três ou, no caso de grupos alquila de dois carbonos ou mais, quatro halogênios. Grupos haloalcóxi incluem perfluoralcóxi (por exemplo, -OCF3), -OCHF2, -OCH2F, -OCCl3, -OCH2CH2Br, - OCH2CH(CH2CH2Br)CH3 e -OCHICH3. Em algumas modalidades, o grupo haloalcóxi pode ser substituído adicionalmente com 1, 2, 3 ou 4 grupos substituintes conforme aqui descrito para grupos alquila.
[000460] O termo "haloalquila", conforme aqui usado, representa um grupo alquila, conforme aqui definido, substituído por um grupo halogênio (isto é, F, Cl, Br ou I). Uma haloalquila pode ser substituída com um, dois, três ou, no caso de grupos alquila de dois carbonos ou mais, quatro halogênios. Grupos haloalquila incluem perfluoralquila (por exemplo, -CF3), -CHF2, -CH2F, -CCl3, -CH2CH2Br, - CH2CH(CH2CH2Br)CH3 e -CHICH3. Em algumas modalidades, o grupo haloalquila pode ser substituído adicionalmente com 1, 2, 3 ou 4 grupos substituintes conforme aqui descrito para grupos alquila.
[000461] O termo "heteroalquileno", conforme aqui usado, se refere a um grupo alquileno, conforme aqui definido, onde um ou dois dos átomos de carbono substituintes foram cada um substituídos por nitrogênio, oxigênio ou enxofre. Em algumas modalidades, o grupo heteroalquileno pode ser substituído adicionalmente com 1, 2, 3 ou 4 grupos substituintes conforme aqui descrito para grupos alquileno.
[000462] O termo "heteroarila", conforme aqui usado, representa aquele subconjunto de heterociclilas, conforme aqui definido, que são aromáticas, isto é, elas contêm 4n+2 pi elétrons dentro do sistema de anel mono- ou multicíclico. Grupos heteroarila não substituídos exemplares são de 1 a 12 (por exemplo, 1 a 11, 1 a 10, 1 a 9, 2 a 12, 2 a 11, 2 a 10 ou 2 a 9) carbonos. Em algumas modalidades, a heteroarila é substituída com 1, 2, 3 ou 4 grupos substituintes conforme definido para o grupo heterociclila.
[000463] O termo "heterociclila", conforme usado aqui, representa um anel de 5, 6 ou 7 membros, a menos que de outro modo especificado, contendo um, dois, três ou quatro heteroátomos independentemente selecionados do grupo consistindo em nitrogênio, oxigênio e enxofre. O anel de 5 membros tem zero a duas ligações duplas e os anéis de 6 e 7 membros têm zer a três ligações duplas. Grupos heterociclila não substituídos exemplares são de 1 a 12 (por exemplo, 1 a 11, 1 a 10, 1 a 9, 2 a 12, 2 a 11, 2 a 10 ou 2 a 9) carbonos. O termo "heterociclila" também representa um composto heterocíclico tendo uma estrutura multicíclica em ponte onde um ou mais carbonos e/ou heteroátomos se ligam em ponte com dois membros não adjacentes de um anel monocíclico, por exemplo, um grupo quinuclidinila. O termo "heterociclila" inclui grupos bicíclicos, tricíclicos e tetracíclicos onde qualquer um dos anéis heterocíclicos acima é fundido a um, dois ou três anéis carbocíclicos, por exemplo, um anel arila, um anel ciclo-hexano, um anel ciclo-hexeno, um anel ciclopentano, um anel ciclopenteno ou outro anel heterocíclico monocíclico, tal como indolila, quinolila, isoquinolila, tetra-hidroquinolila, benzofurila, benzotienila e similar. Exemplos de heterociclilas fundidas incluem tropanos e 1,2,3,5,8,8a- hexa-hidroindolizina. Heterocíclicos incluem pirrolila, pirrolinila, pirrolidinila, pirazolila, pirazolinila, pirazolidinila, imidazolila, imidazolinila, imidazolidinila, piridila, piperidinila, homopiperidinila, pirazinila, piperazinila, pirimidinila, piridazinila, oxazolila, oxazolidinila, isoxazolila, isoxazolidinila, morfolinila, tiomorfolinila, tiazolila, tiazolidinila, isotiazolila, isotiazolidinila, indolila, indazolila, quinolila, isoquinolila, quinoxalinila, di-hidroquinoxalinila, quinazolinila, cinolinila, ftalazinila, benzimidazolila, benzotiazolila, benzoxazolila, benzotiadiazolila, furila, tienila, tiazolidinila, isotiazolila, triazolila, tetrazolila, oxadiazolila (por exemplo, 1,2,3-oxadiazolila), purinila, tiadiazolila (por exemplo, 1,2,3-tiadiazolila), tetra-hidrofuranila, di- hidrofuranila, tetra-hidrotienila, di-hidrotienila, di-hidroindolila, di- hidroquinolila, tetra-hidroquinolila, tetra-hidroisoquinolila, di- hidroisoquinolila, piranila, di-hidropiranila, ditiazolila, benzofuranila, isobenzofuranila, benzotienila e similar, incluindo suas formas di-hidro e tetra-hidro, onde uma ou mais ligações duplas são reduzidas e substituídas com hidrogênios. Outras heterociclilas exemplares incluem: 2,3,4,5-tetra-hidro-2-oxo-oxazolila; 2,3-di-hidro-2-oxo-1H-imidazolila; 2,3,4,5-tetra-hidro-5-oxo-1H-pirazolila (por exemplo, 2,3,4,5-tetra-hidro- 2-fenil-5-oxo-1H-pirazolila); 2,3,4,5-tetra-hidro-2,4-dioxo-1H-imidazolila (por exemplo, 2,3,4,5-tetra-hidro-2,4-dioxo-5-metil-5-fenil-1H- imidazolila); 2,3-di-hidro-2-tioxo-1,3,4-oxadiazolila (por exemplo, 2,3-di- hidro-2-tioxo-5-fenil-1,3,4-oxadiazolila); 4,5-di-hidro-5-oxo-1H-triazolila (por exemplo, 4,5-di-hidro-3-metil-4-amino 5-oxo-1H-triazolila); 1,2,3,4- tetra-hidro-2,4-dioxopiridinila (por exemplo, 1,2,3,4-tetra-hidro-2,4- dioxo-3,3-dietilpiridinila); 2,6-dioxo-piperidinila (por exemplo, 2,6-dioxo- 3-etil-3-fenilpiperidinila); 1,6-di-hidro-6-oxopiridiminila; 1,6-di-hidro-4- oxopirimidinila (por exemplo, 2-(metiltio)-1,6-di-hidro-4-oxo-5- metilpirimidin-1-ila); 1,2,3,4-tetra-hidro-2,4-dioxopirimidinila (por exemplo, 1,2,3,4-tetra-hidro-2,4-dioxo-3-etilpirimidinila); 1,6-di-hidro-6- oxo-piridazinila (por exemplo, 1,6-di-hidro-6-oxo-3-etilpiridazinila); 1,6- di-hidro-6-oxo-1,2,4-triazinila (por exemplo, 1,6-di-hidro-5-isopropil-6- oxo-1,2,4-triazinila); 2,3-di-hidro-2-oxo-1H-indolila (por exemplo, 3,3- dimetil-2,3-di-hidro-2-oxo-1 H-indolila e 2,3-di-hidro-2-oxo-3,3‘- espiropropano-1H-indol-1-ila); 1,3-di-hidro-1-oxo-2H-iso-indolila; 1,3-di- hidro-1,3-dioxo-2H-iso-indolila; 1H-benzopirazolila (por exemplo, 1- (etoxicarbonil)- 1H-benzopirazolila); 2,3-di-hidro-2-oxo-1H- benzimidazolila (por exemplo, 3-etil-2,3-di-hidro-2-oxo-1H- benzimidazolila); 2,3-di-hidro-2-oxo-benzoxazolila (por exemplo, 5- cloro-2,3-di-hidro-2-oxo-benzoxazolila); 2,3-di-hidro-2-oxo- benzoxazolila; 2-oxo-2H-benzopiranila; 1,4-benzodioxanila; 1,3- benzodioxanila; 2,3-di-hidro-3-oxo,4H-1,3-benzotiazinila; 3,4-di-hidro-4- oxo-3H-quinazolinila (por exemplo, 2-metil-3,4-di-hidro-4-oxo-3H- quinazolinila); 1,2,3,4-tetra-hidro-2,4-dioxo-3H-quinazolila (por exemplo, 1-etil-1,2,3,4-tetra-hidro-2,4-dioxo-3H-quinazolila); 1,2,3,6- tetra-hidro-2,6-dioxo-7H-purinila (por exemplo, 1,2,3,6-tetra-hidro-1,3- dimetil-2,6-dioxo-7 H -purinila); 1,2,3,6-tetra-hidro-2,6-dioxo-1 H - purinila (por exemplo, 1,2,3,6-tetra-hidro-3,7-dimetil-2,6-dioxo-1 H - purinila); 2-oxobenz[c,d]indolila; 1,1-dioxo-2H-naft[1,8-c,d]isotiazolila; e 1,8-naftilenodicarboxamido. Heterocíclicos adicionais incluem 3,3a,4,5,6,6a-hexa-hidro-pirrol[3,4-b]pirrol-(2H)-ila e 2,5- diazabiciclo[2.2.1]heptan-2-ila, homopiperazinila (ou diazepanila), tetra- hidropiranila, ditiazolila, benzofuranila, benzotienila, oxepanila, tiepanila, azocanila, oxecanila e tiocanila. Grupos heterocíclicos também incluem grupos da formula
Figure img0161
, onde
[000464] E‘ é selecionado do grupo consistindo em -N- e -CH-; F‘ é selecionado do grupo consistindo em -N=CH-, -NH-CH2-, -NH-C(O)-, - NH-, -CH=N-, -CH2-NH-, -C(O)-NH-, -CH=CH-, -CH2-, -CH2CH2-, -CH2O- , -OCH2-, -O- e -S-; e G‘ é selecionado do grupo consistindo em -CH- e -N-. Qualquer um dos grupos heterociclila mencionados aqui pode ser opcionalmente substituído com um, dois, três, quatro ou cinco substituintes independentemente selecionados do grupo consistindo em: (1) C1-7 acila (por exemplo, carboxialdeído); (2) C1-20 alquila (por exemplo, C1-6 alquila, C1-6 alcóxi-C1-6 alquila, C1-6 alquilsulfinil-C1-6 alquila, amino-C1-6 alquila, azido-C1-6 alquila, (carboxialdeído)-C1-6 alquila, halo-C1-6 alquila (por exemplo, perfluoralquila), hidróxi-C1-6 alquila, nitro-C1-6 alquila ou C1-6 tioalcóxi-C1-6 alquila); (3) C1-20 alcoxi (por exemplo, C1-6 alcóxi, tal como perfluoralcóxi); (4) C1-6 alquilsulfinila; (5) C6-10 arila; (6) amino; (7) C1-6 alquil-C6-10 arila; (8) azido; (9) C3-8 cicloalquila; (10) C1-6 alquil-C3-8 cicloalquila; (11) halo; (12) C1-12 heterociclila (por exemplo, C2-12 heteroarila); (13) (C1-12 heterociclil)óxi; (14) hidróxi; (15) nitro; (16) C1-20 tioalcóxi (por exemplo, C1-6 tioalcóxi); (17) -(CH2)qCO2RA’, onde q é um número inteiro de a partir de zero a quatro e RA’ é selecionado do grupo consistindo em (a) C1-6 alquila, (b) C6-10 arila, (c) hidrogênio; e (d) C1-6 alqui-C6-10 arila; (18) - (CH2)qCONRB’RC’, onde q é um número inteiro de a partir de zero a quatro e onde RB’ e RC’ são independentemente selecionados do grupo consistindo em (a) hidrogênio; (b) C1-6 alquila, (c) C6-10 arila e (d) C1-6 alqui-C6-10 arila; (19) -(CH2)qSO2RD’, onde q é um número inteiro de a partir de zero a quatro e onde RD’ é selecionado do grupo consistindo em (a) C1-6 alquila, (b) C6-10 arila, e (c) C1-6 alquil-C6-10 arila; (20) - (CH2)qSO2NRE’RF’, onde q é um número inteiro de a partir de zero a quatro e onde cada um de RE’ e RF’ é, independentemente, selecionado do grupo consistindo em (a) hidrogênio; (b) C1-6 alquila, (c) C6-10 arila, e (d) C1-6 alqui-C6-10 arila; (21) tiol; (22) C6-10 arilóxi; (23) C3-8 cicloalcóxi; (24) arilalcóxi; (25) C1-6 alqui-C1-12 heterociclila (por exemplo, C1-6 alqui- C1-12 heteroarila); (26) oxo; (27) (C1-12 heterociclil)imino; (28) C2-20 alquenila; e (29) C2-20 alquinila. Em algumas modalidades, cada um desses grupos pode ser substituído adicionalmente conforme aqui descrito. Por exemplo, o grupo alquileno de uma C1-alcarila ou uma C1- alquieterociclila pode ser substituído adicionalmente com um grupo oxo para fornecer o respectivo grupo substituinte ariloíla e (heterociclil)oíla.
[000465] O termo "(heterociclil) imino", conforme aqui usado, representa um grupo heterociclila, conforme aqui definido, ligado ao grupo molecular parental através de um grupo imino. Em algumas modalidades, o grupo heterociclila pode ser substituído com 1, 2, 3 ou 4 grupos substituintes conforme aqui definido.
[000466] O termo "(heterociclil)óxi", conforme aqui usado, representa um grupo heterociclila, conforme aqui definido, ligado ao grupo molecular parental através de um átomo de oxigênio. Em algumas modalidades, o grupo heterociclila pode ser substituído com 1, 2, 3 ou 4 grupos substituintes conforme aqui definido.
[000467] O termo "(heterociclil)oíla", representa um grupo heterociclila, conforme aqui definido, ligado ao grupo molecular parental através de um grupo carbonila. Em algumas modalidades, o grupo heterociclila pode ser substituído com 1, 2, 3 ou 4 grupos substituintes conforme aqui definido.
[000468] O termo "hidrocarboneto", conforme aqui usado, representa um grupo consistindo apenas em átomos de carbono e hidrogênio.
[000469] O termo "hidróxi", conforme aqui usado, representa um grupo -OH. Em algumas modalidades, o grupo hidróxi pode ser substituído com 1, 2, 3 ou 4 grupos substituintes (por exemplo, grupos de proteção O) conforme aqui definido para uma alquila.
[000470] O termo "hidroxialquenila", conforme aquiusado, representa um grupo alquenila, conforme aqui definido, substituído por um a três grupos hidróxi, contanto que não mais do que um grupo hidróxi possa ser ligado a um átomo de carbono únido do grupo alquila, e é exemplificado por di-hidroxipropenila, hidroxiisopentenila e similar. Em algumas modalidades, o grupo hidroxialquenila pode ser substituído com 1, 2, 3 ou 4 grupos substituintes (por exemplo, grupos de proteção O) conforme aqui definido para uma alquila.
[000471] O termo "hidroxialquila", conforme aqui usado, representa um grupo alquila, conforme aqui definido, substituído por um ou três grupos hidróxi, contanto que não mais do que um grupo hidróxi possa ser ligado a um átomo de carbono simples do grupo alquila, e é exemplificado por hidroximetila, di-hidroxipropila e similar. Em algumas modalidades, o grupo hidroxialquila pode ser substituído com 1, 2, 3 ou 4 grupos substituintes (por exemplo, grupos de proteção O) conforme aqui definido para uma alquila.
[000472] O termo "hidroxialquinila", conforme aqui usado, representa um grupo alquinila, conforme aqui definido, substituído por um a três grupos hidróxi, contanto que não mais do que um grupo hidróxi possa ser ligado a um átomo de carbono simples do grupo alquila. Em algumas modalidades, o grupo hidroxialquinila pode ser substituído com 1, 2, 3 ou 4 grupos substituintes (por exemplo, grupos de proteção O) conforme aqui definido para uma alquila.
[000473] O termo "isômero", conforme aqui usado, significa qualquer tautômero, estereoisômero, enantiômero ou diastereômero de qualquer composto da invenção. É reconhecido que os compostos da invenção podem ter um ou mais centros quirais e/ou ligações duplas e, então, existem como estereoisômeros, tais como isômeros de ligação dupla (isto é, isômeros E/Z geométricos) ou diastereômeros (por exemplo, enantiômeros (isto é, (+) ou (-)) ou isômeros cis/trans). De acordo co a invenção, as estruturas químicas mostradas aqui e, então, os compostos da invenção, compreendem todos os estereoisômeros correspondentes, isto é, ambas a forma estereomericamente pura (por exemplo, geometricamente pura, enantiomericamente pura ou diastereomericamente pura) e misturas enantioméricas e estereoisoméricas, por exemplo, racematos. Misturas enantioméricas e estereoisoméricas de compostos da invenção podem ser tipicamente separadas em seus enantiômeros ou estereoisômeros componentes através de métodos bem conhecidos, tais como cromatografia de gás de fase quiral, cromatografia líquida de alto desempenho de fase quiral, cristalização do composto como um complexo de sal quiral ou cristalização do composto em um solvente quiral. Enantiômeros e estereoisômeros podem ser também obtidos a partir de intermediários estereomericamente ou enantiomericamente puros, reagentes e catalisadores através de métodos sintéticos assimétricos bem conhecidos.
[000474] O termo "amino N-protegido", conforme aqui usado, se refere a um grupo amino, conforme aqui definido, ao qual são ligados um ou dois grupos de proteção N, conforme aqui definido.
[000475] O termo "grupo de proteção N", conforme aqui usado, representa aqueles grupos pretendidos proteger um grupo amino contra reações indesejáveis durante procedimentos sintéticos. Grupos de proteção N geralmente usados são revelados em Greene, "Protective Groups in Organic Synthesis", 3a Edição (John Wiley & Sons, New York, 1999), que é aqui incorporado a título de referência. Grupos de proteção N incluem grupos acila, ariloíla ou carbamila, tais como formila, acetila, propionila, pivaloíla, t-butilacetila, 2-cloroacetila, 2-bromoacetila, trifluoracetila, tricloroacetila, fthalila, o-nitrofenoxiacetila, α-clorobutirila, benzoíla, 4-clorobenzoíla, 4-bromobenzoíla, 4-nitrobenzoíla e auxiliares quirais tais como D, L ou D,L-aminoácidos protegidos ou não protegidos tais como alanina, leucina, fenilalanina e similar; grupos contendo sulfonila tais como benzenesulfonila, p-toluenossulfonila e similar; grupos de formação de carbamato tais como benziloxicarbonila, p- p-metoxibenziloxicarbonila, p 2-nitrobenziloxicarbonila 3,4-dimetoxibenziloxicarbonila 2,4-dimetoxibenziloxicarbonila 2-nitro-4,5-dimetoxibenziloxicarbonila 3,4,5-trimetoxibenziloxicarbonila, 1-(p-bifenilil)-1-metiletoxicarbonila, α,α-dimetil-3,5-dimetoxibenziloxicarbonila, benzidriloxi carbonila, t- butiloxicarbonila, diisopropilmetoxicarbonila, isopropiloxicarbonila, etoxicarbonila, metoxicarbonila, aliloxicarbonila, 2,2,2,- tricloroetoxicarbonila, fenoxicarbonila, 4-nitrofenoxi carbonila, fluorenil- 9-metoxicarbonila, ciclopentiloxicarbonila, adamantiloxicarbonila, ciclo- hexiloxicarbonila, feniltiocarbonila e similar, grupos alcarila tais como como benzila, trifenilmetila, benziloximetila e similar e grupos silila tal como trimetilsilila e similar. Grupos de proteção N preferidos são formila, acetila, benzoíla, pivaloíla, t-butilacetila, alanila, fenilsulfonila, benzila, t- butiloxicarbonila (Boc) e benziloxicarbonila (Cbz).
[000476] O termo "nitro", conforme aqui usado, representa um grupo -NO2.
[000477] O termo "grupo de proteção O", conforme aqui usado, representa aqueles grupos pretendidos proteger um grupo contendo oxigênio (por exemplo, fenol, hidroxila ou carbonila) contra reações indesejadas durante procedimentos sintéticos. Grupos de proteção O geralmente usados são revelados em Greene, "Protective Groups in Organic Synthesis", 3a Edição (John Wiley & Sons, New York, 1999), que é aqui incorporado a título de referência. Grupos de proteção O exemplares incluem grupos acila, ariloíla ou carbamila, tais como formila, acetila, propionila, pivaloíla, t-butilacetila, 2-cloroacetila, 2- bromoacetila, trifluoracetila, tricloroacetila, fthalila, o-nitrofenoxiacetila, α-clorobutirila, benzoíla, 4-clorobenzoíla, 4-bromobenzoíla, t- butildimetilsilila, tri-iso-propilsililoximetila, 4,4'-dimetoxitritila, isobutirila, fenoxiacetila, 4-isopropilfenoxiacetila, dimetilformamidino e 4- nitrobenzoíla; grupos alquilcarbonila, tais como acila, acetila, propionila, pivaloíla e similar; grupos arilcarbonila opcionalmente substituídos, tal como benzoíla; grupos silila, tais como trimetilsilila (TMS), terc- butildimetilsilila (TBDMS), tri-iso-propilsililoximetila (TOM), triisopropilsilila (TIPS) e similar; grupos de formação de éter com a hidroxila, tais como metila, metoximetila, tetra-hidropiranila, benzila, p- metoxibenzila, tritila e similar; alcoxicarbonilas, tais como metoxicarbonila, etoxicarbonila, isopropoxicarbonila, n- isopropoxicarbonila, n-butiloxicarbonila, isobutiloxicarbonila, sec- butiloxicarbonila, t-butiloxicarbonila, 2-etilexiloxicarbonila, ciclo- hexiloxicarbonila, metiloxicarbonila e similar; grupos alkoxialcoxicarbonila, tais como metoximetoxicarbonila, etoximetoxicarbonila, 2-metoxietoxicarbonila, 2-etoxietoxicarbonila, 2- butoxietoxicarbonila, 2-metoxietoximetoxicarbonila, aliloxicarbonila, propargiloxicarbonila, 2-butenoxicarbonila, 3-metil-2-butenoxicarbonila e similar; haloalcoxicarbonilas, tais como 2-cloroetoxicarbonila, 2- cloroetoxicarbonila, 2,2,2-tricloroetoxicarbonila e similar; grupos arilcarbonila opcionalmente substituídos, tais como benziloxicarbonila, p-metilbenziloxicarbonila, p-metoxibenziloxicarbonila, p- nitrobenziloxicarbonila, 2,4-dinitrobenziloxicarbonila, 3,5- dimetilbenziloxicarbonila, p-clorobenziloxicarbonila, p-bromobenzilóxi- carbonila, fluorenilmetiloxicarbonila e similar; e grupos arilcarbonila opcionalmente substituídos, tais como fenoxicarbonila, p- nitrofenoxicarbonila, o-nitrofenoxicarbonila, 2,4-dinitrofenoxicarbonila, p-metil-fenoxicarbonila, m-metilfenoxicarbonila, o- bromofenoxicarbonila, 3,5-dimetilfenoxicarbonila, p- clorofenoxicarbonila, 2-cloro-4-nitrofenóxi-carbonila e similar); éteres de alquila, arila e alcarila substituída (por exemplo, tritila; metiltiometila; metoximetila; benziloximetila; siloximetila; 2,2,2,-tricloroetoximetila; tetra-hidropiranila; tetra-hidrofuranila; etoxietila; 1-[2- (trimetilsilil)etoxi]etila; 2-trimetilsililetila; t-butil éter; p-clorofenila, p- metoxifenila, p-nitrofenila, benzila, p-metoxibenzila e nitrobenzila); éteres de silila (por exemplo, trimetilsilila; trietilsilila; triisopropilsilila; dimetilisopropilsilila; t-butildimetilsilila; t-butildifenilsilila; tribenzilsilila; trifenilsilila; e difenilmetilsilila); carbonatos (por exemplo, metila, metoximetila, 9-fluorenilmetila; etila; 2,2,2-tricloroetila; 2- (trimetilsilil)etila; vinila, allila, nitrofenila; benzila; metoxibenzila; 3,4- dimetoxibenzila; e nitrobenzila); grupos de proteção de carbonila (por exemplo, grupos acetais e cetais, tais como dimetil acetal, 1,3-dioxolano e similar; grupos acilal; e grupos ditiano, tais como 1,3-ditianos, 1,3- ditiolano e similar); grupos de proteção de ácido carboxílico (por exemplo, grupos éster, tais como metil éster, benzil éster, t-butil éster ortoésteres e similar; e grupos oxazolina.
[000478] O termo "oxo", conforme aqui usado, representa =O.
[000479] O termo "perfluoralquila", conforme aqui usado, representa um grupo alquila, conforme aqui definido, onde cada radical hidrogênio ligado ao grupo alquila foi substituído por um radical fluoreto. Grupos perfluoralquila são exemplificados por trifluorometila, pentafluoretila e similar.
[000480] O termo "perfluoroalcóxi", conforme aqui usado, representa um grupo alcóxi, conforme aqui definido, onde cada radical hidrogênio ligado ao grupo alcóxi foi substituído por um radical fluoreto. Grupos perfluoralcóxi são exemplificados por trifluormetóxi, pentafluoretóxi e similar.
[000481] O termo "espirociclila", conforme aqui usado, representa um dirradical C2-7 alquileno, cujas ambas as extremidades são ligadas ao mesmo átomo de carbono do grupo parental para formar um grupo espirocíclico, e também um dirradical C1-6 heteroalquileno, cujas ambas as extremidades são ligadas ao mesmo átomo. O radical heteroalquileno formando o grupo espirociclila pode conter um, dois, três ou quatro heteroátomos independentemente selecionados do grupo consistindo em nitrogênio, oxigênio e enxofre. Em algumas modalidades, o grupo espirociclila inclui um a sete carbonos, excluindo o átomo de carbono ao qual o birradical é ligado. Os grupos espirociclila da invenção podem ser opcionalmente substituídos com 1, 2, 3 ou 4 substituintes providos aqui como substituintes opcionais para grupos cicloalquila e/ou heterociclila.
[000482] O termo "estereoisômero", conforme aqui usado, se refere a todas as formas isoméricas diferentes possíveis bem como conformacionais que um composto pode possuir (por exemplo, um composto de qualquer fórmula descrita aqui), em particular todas as formas isoméricas estereoquimicamente e conformacionalmente possíveis, todos os diastereômeros, enantiômeros e/ou confôrmeros da estrutura molecular básica. Alguns compostos da presente invenção podem existir em formas tautoméricas diferentes, todas as últimas sendo incluídas no escopo da presente invenção.
[000483] O termo "sulfoalquila", conforme aqui usado, representa um grupo alquila, conforme aqui definido, substituído por um grupo sulfo de -SO3H. Em algumas modalidades, o grupo alquila pode ser substituído adicionalmente com 1, 2, 3 ou 4 grupos substituintes conforme aqui descrito, e o grupo sulfo pode ser substituído adicionalmente com um ou mais grupos de proteção O (por exemplo, conforme descrito aqui).
[000484] O termo "sulfonila", conforme aqui usado, representa um grupo - S(O)2-.
[000485] O termo "tioalcarila", conforme aqui usado, representa um substituinte químico de fórmula -SR, onde R é um grupo alcarila. Em algumas modalidades, o grupo alcarila pode ser substituído adicionalmente com 1, 2, 3 ou 4 grupos substituintes conforme aqui descrito.
[000486] O termo "tioalquieterociclila", conforme aqui usado, representa um substituinte químico de fórmula -SR, onde R é um grupo alquieterociclila. Em algumas modalidades, o grupo alquieterociclila pode ser substituído adicionalmente com 1, 2, 3 ou 4 grupos substituintes conforme descrito aqui.
[000487] O termo "tioalcóxi", conforme aqui usado, representa um substituinte químico de fórmula -SR, onde R é um grupo alquila, conforme aqui definido. Em algumas modalidades, o grupo alquila pode ser substituído adicionalmente com 1, 2, 3 ou 4 grupos substituintes conforme aqui descrito.
[000488] Composto: Conforme aqui usado, o termo "composto" pretende incluir todos os estereoisômeros, isômeros geométricos, tautômeros e isótopos das estruturas mostradas.
[000489] Os compostos descritos aqui podem ser assimétricos (por exemplo, tendo um ou mais estereocentros). Todos os estereoisômeros, tais como enantiômeros e diastereômeros, são pretendidos a menos que de outro modo indicado. Os compostos da presente invenção que contêm átomos de carbono assimetricamente substituídos podem ser isolados em formas opticamente ativas ou racêmicas. Métodos de como preparar formas opticamente ativas a partir de materiais de partida opticamente ativos são conhecidos na técnica, tal como através de separação de misturas racêmicas ou através de síntese estereosseletiva. Muitos isômeros geométricos de olefinas, ligações duplas C=N e similar podem também estar presentes nos compostos descritos aqui, e todos tais isômeros estáveis são compreendidos na presente invenção. Isômeros geométricos cis e trans dos compostos da presente invenção são descritos e podem ser isolados como uma mistura de isômeros ou como formas isoméricas separadas.
[000490] Os compostos da presente invenção também incluem formas tautoméricas. Formas tautoméricas resultam da permuta de uma ligação simples com uma ligação dupla adjacente e a migração concomitante de um próton. Formas tautoméricas incluem tautômeros prototrópicos que são estados de protonação isoméricos tendo as mesmas fórmula empírica e carga total. Exemplos de tautômeros prototrópicos incluem pares enol - cetona, pares amida - ácido imídico, pares lactama - lactim, pares amida - ácido imídico, pares enamina - imina e formas anulares onde um próton pode ocupar duas ou mais posições de um sistema heterocíclico, tais como 1H e 3H-imidazol, 1H, 2H- e 4H-1,2,4-triazol, 1H- e 2H-isoindol e 1H- e 2H-pirazol. Formas tautoméricas podem estar em equilíbrio ou estericamente bloqueadas em uma forma através de substituição apropriada.
[000491] Os compostos da presente invenção também incluem todos os isótopos dos átomos que ocorrem nos compostos intermediários ou finais. "Isótopos" se referem a átomos do mesmo número atômico, mas números de massa diferentes, resultante de um número diferente de nêutrons nos núcleos. Por exemplo, isótopos de hidrogênio incluem trítio e deutério.
[000492] Os compostos e sais da presente invenção podem ser preparados em combinação com solvente ou moléculas de água para formar solvatos e hidratos através de métodos de rotina.
[000493] Conservado: Conforme aqui usado, o termo "conservado" se refere a resíduos de nucleotídeos ou aminoácido de uma sequência de polinucleotídeo ou sequência de polipeptídeo, respectivamente, que são aqueles que ocorrem sem alteração na mesma posição de duas ou mais sequências sendo comparadas. Nucleotídeos ou aminoácidos que são relativamente conservados são aqueles que são conservados dentre as sequências mais relacionadas do que nucleotídeos ou aminoácidos que aparecem em outro ponto nas sequências.
[000494] Em algumas modalidades, duas ou mais sequências são ditas ser "completamente conservadas" se elas forem 100% idênticas uma à outra. Em algumas modalidades, duas ou mais sequências são ditas ser "altamente conservadas" se elas forem pelo menos 70% idênticas, pelo menos 80% idênticas, pelo menos 90% identical ou pelo menos 95% idênticas umas às outras. Em algumas modalidades, duas ou mais sequências são ditas ser "altamente conservadas" se elas forem cerca de 70% idênticas, cerca de 80% idênticas, cerca de 90% idênticas, cerca de 95%, cerca de 98% ou cerca de 99% idênticas umas às outras. Em algumas modalidades, duas ou mais sequências são ditas ser "conservadas" se elas forem pelo menos 30% idênticas, pelo menos 40% idênticas, pelo menos 50% idênticas, pelo menos 60% idênticas, pelo menos 70% idênticas, pelo menos 80% idênticas, pelo menos 90% identical ou pelo menos 95% idênticas umas às outras. Em algumas modalidades, duas ou mais sequências são ditas ser "conservadas" se elas forem cerca de 30% idênticas, cerca de 40% idênticas, cerca de 50% idênticas, cerca de 60% idênticas, cerca de 70% idênticas, cerca de 80% idênticas, cerca de 90% idênticas, cerca de 95% idênticas, cerca de 98% idênticas ou cerca de 99% idênticas umas às outras. Conservação de sequência pode se aplicar ao comprimento total de um oligonucleotídeo ou polipeptídeo ou pode se aplicar a uma porção, região ou característica da mesma.
[000495] Cíclico ou Ciclizado: Conforme aqui usado, o termo "cíclico" se refere à presença de uma alça contínua. Moléculas cíclicas não precisam ser circulares, apenas unidas para formar uma cadeia sem rompimento de subunidades. Moléculas cíclicas tal como o mRNA da presente invenção podem ser unidades simples ou multímeros ou compreendem um ou mais componentes de um complexo ou estrutura de ordem superior.
[000496] Citostático: Conforme aqui usado, "citostático" se refere à inibição, redução, supressão do crescimento, divisão ou multiplicação de uma célula (por exemplo, uma célula de mamífero (por exemplo, uma célula humana)), bactéria, vírus, fungo, protozoário, parasita, príon ou uma combinação dos mesmos.
[000497] Citotóxico: Conforme aqui usado, "citotóxico" se refere à morte de ou provocação de efeito prejudicial, tóxico ou mortal em uma célula por exemplo, uma célula de mamífero (por exemplo, uma célula humana)), bactéria, vírus, fungo, protozoário, parasita, príon ou uma combinação dos mesmos.
[000498] Administração: Conforme aqui usado, "administração" se refere ao ato ou maneira de administrar de um composto, substância, entidade, porção, carga ou carga útil.
[000499] Agente de Administração: Conforme aqui usado, "agente de administração" se refere a qualquer substância que facilite, pelo menos em parte, a administração in vivo de um polinucleotídeo a células alvo.
[000500] Desestabilizado: Conforme aqui usado, o termo "instável", "desestabilizar" ou "região de desestabilização" significa uma região ou molécula que é menos estável do que uma forma de partida, do tipo selvagem ou nativa da mesma região ou molécula.
[000501] Marcador detectável: Conforme aqui usado, "marcador detectável" se refere a um ou mais marcadores, sinais ou porções que são ligados, incorporados ou associados com outra entidade que são prontamente detectados através de métodos conhecidos na técnica incluindo radiografia, fluorescência, quimioluminescência, atividade enzimática, absorbância e similar. Marcadores detectáveis incluem radioisótopos, fluoróforos, cromóforos, enzimas, corantes, íons de metal, ligantes tais como biotina, avidina, estreptavidina e haptenos, pontos quânticos e similar. Marcadores detectáveis podem estar localizados em qualquer posição nos peptídeos ou proteínas revelados aqui. Eles podem estar dentro dos aminoácidos, peptídeos ou proteínas ou localizados nos terminais N ou C.
[000502] Digestão: Conforme aqui usado, o termo "digerir" significa quebrar em pedaços ou componentes menores. Quando se referindo a polipeptídeos ou proteínas, digestão resulta na produção de peptídeos.
[000503] Distal: Conforme aqui usado, o termo "distal" significa situado distante do centro ou distante de um ponto ou região de interesse.
[000504] Sinal de clivagem de proteína codificada: Conforme aqui usado, "sinal de clivagem de proteína codificada" se refere à sequência de nucleotídeo que codifica um sinal de clivagem de proteína.
[000505] Engenheirado: Conforme aqui usado, as modalidades da invenção são "engenheiradas" quando elas são projetadas para ter uma característica ou propriedade, seja estrutural ou química, que varia de uma molécula de partida, do tipo selvagem ou nativa.
[000506] Expressão: Conforme aqui usado, "expressão" de uma sequência de ácido nucleico se refere a um ou mais dos eventos seguintes: (1) produção de um modelo de RNA a partir de uma sequência de DNA (por exemplo, por transcrição); (2) processamento de um transcrito de RNA (por exemplo, por combinação, edição, formação de cap 5, e/ou processamento de extremidade 3‘ ); (3) tradução de um RNA em um polipeptídeo ou proteína; e (4) modificação pós-traducional de um polipeptídeo ou proteína.
[000507] Característica: Conforme aqui usado, um "traço" se refere a uma característica, uma propriedade ou um elemento distintivo.
[000508] Formulação: Conforme aqui usado, uma "formulação" inclui pelo menos um polinucleotídeo e um agente de administração.
[000509] Fragmento: Um "fragmento", conforme aqui usado, se refere a uma porção. Por exemplo, fragmentos de proteínas podem compreender polipeptídeos obtidos pela digestão proteína integral isolada de células de cultura.
[000510] Funcional: Conforme aqui usado, uma molécula biológica "funcional" é uma molécula biológica em uma forma na qual ela exibe uma propriedade e/ou atividade pela qual é caracterizada.
[000511] Homologia: Conforme aqui usado, o termo "homologia" se refere à relação total entre as molécula poliméricas, por exemplo, entre moléculas de ácido nucleico (por exemplo moléculas de DNA e/ou moléculas de RNA) e/ou entre as moléculas de polipeptídeo. Em algumas modalidades, as moléculas poliméricas são consideradas ser "homólogas" umas às outras se suas sequências forem pelo menos 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% idênticas ou similares. O termo "homólogo" se necessariamente refere a uma comparação entre pelo menos duas sequências (sequências de polinucleotídeo ou polipeptídeo). De acordo com a invenção, duas sequências de polinucleotídeos são consideradas ser homólogas se os polipeptídeos que elas codificam forem pelo menos cerca de 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou ainda 99% para pelo menos uma extensão de pelo menos cerca de 20 aminoácidos. Em algumas modalidades, as sequências de polinucleotídeos homólogas são caracterizadas pela habilidade em codificar uma extensão de pelo menos 4-5 aminoácidos singularmente especificados. Para sequências de polinucleotídeos com menos de 60 nucleotídeos de comprimento, homologia é determinada pela habilidade de codificar uma extensão de pelo menos 4-5 aminoácidos singularmente especificados. De acordo com a invenção, duas sequências de proteína são consideradas serem homólogas se as proteínas forem pelo menos cerca de 50%, 60%, 70%, 80%, ou 90% idênticas para pelo menos uma extensão de pelo menos cerca de 20 aminoácidos.
[000512] Identidade: Conforme aqui usado, o termo "identidade" se refere à relação total entre moléculas poliméricas, por exemplo, entre moléculas de oligonucleotídeos (por exemplo moléculas de DNA e/ou moléculas de RNA) e/ou entre as moléculas de polipeptídeo. Cálculo da identidade percentual de duas sequências de polinucleotídeos, por exemplo, pode ser realizado ao alinhar as duas sequências para propósitos de comparação ótima (por exemplo lacunas podem ser introduzidas em uma ou ambas uma primeira e uma segunda sequências de ácido nucleico para alinhamento ótimo e as sequências não-idênticas podem ser desconsideradas para propósitos de comparação). Em determinadas modalidades, o comprimento de uma sequência alinhada para propósitos de comparação é de pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou 100% do comprimento da sequência em referência. Os nucleotídeos em posições de nucleotídeo correspondentes são então comparados. Quando uma posição na primeira sequência é ocupada pelo mesmo nucleotídeo que a posição correspondente na segunda sequência, então as moléculas são idênticas naquela posição. A identidade percentual entre as duas sequências é uma função do número de posições idênticas compartilhada pelas sequências, levando em consideração o número de lacunas, o comprimento de cada lacuna, que precisa ser introduzido para alinhamento ótimo das duas sequências. A comparação das sequências e a determinação de identidade percentual entre as duas sequências podem ser conseguidas usando-se um algoritmo matemático. Por exemplo, a identidade percentual entre duas sequências de nucleotídeos pode ser determinada usando métodos tais como aqueles descritos em Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M. e Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; e Sequence Analysis Iniciador , Gribskov, M. e Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; cada um desses é incorporado aqui a título de referência. Por exemplo, a identidade percentual entre duas sequências de nucleotídeos pode ser determinada usando o algoritmo de Meyers e Miller (CABIOS, 1989, 4:11-17), que foi incorporado ao programa ALIGN (versão 2.0) usando uma tabela de resíduo de peso PAM120, uma penalidade de comprimento de lacuna de 12 e uma penalidade de lacuna de 4. A identidade percentual entre as duas sequências de nucleotídeos pode, alternadamente, ser determinada usando o programa GAP no pacote de software GCG usando uma matriz NWSgapdna.CMP. Métodos geralmente empregados para determinar identidade percentual entre as sequência incluem, mas não estão limitados àqueles descritos em Carillo, H. e Lipman, D., SIAM J Applied Math., 48:1073 (1988); incorporado aqui a título de referência. Técnicas para determinar identidade são codificadas em programas de computador disponíveis publicamente. Software de computador exemplar para determinar homologia entre as duas sequências inclui, mas não está limitado a, pacote programa GCG, Devereux, J., e outros, Nucleic Acids Research, 12(1), 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, e FASTA Altschul, S. F. e outros, J. Molec. Biol., 215, 403 (1990)).
[000513] Inibir expressão de um gene: Conforme aqui usado, a expressão "inibir a expressão de um gene" significa causar uma redução na quantidade de um produto de expressão do gene. O produto de expressão pode ser um RNA transcrito do gene (por exemplo, um mRNA) ou um polipeptídeo traduzido de um mRNA transcrito do gene. Tipicamente, uma redução no nível de um mRNA resulta em uma redução no nível de um polipeptídeo traduzido a partir dele. O nível de expressão pode ser determinado usando técnicas padrão para medir mRNA ou proteína.
[000514] In vitro: Conforme aqui usado, o termo "in vitro" se refere a eventos que ocorrem em um ambiente artificial, por exemplo, em um tubo de teste ou recipiente de reação, em cultura celular, em uma placa de Petri, etc., em vez de estar dentro de um organismo (por exemplo, animal, planta ou micróbio).
[000515] In vivo: Conforme aqui usado, o termo "in vivo" se refere a eventos que ocorrem dentro de um organismo (por exemplo, animal, planta ou micróbio ou célula ou tecido do mesmo).
[000516] Isolado: Conforme aqui usado, o termo "isolado" se refere a uma substância ou entidade que foi separada de pelo menos alguns componentes com os quais era associada (seja na natureza ou em um ambiente experimental). Substâncias isoladas podem ter níveis variantes de pureza em referência às substâncias das quais elas eram associadas. Substâncias e/ou entidades isoladas podem ser separadas de pelo menos cerca de 10%, cerca de 20%, cerca de 30%, cerca de 40%, cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 80%, cerca de 90%, ou mais dos outros componentes com os quais elas eram inicialmente associadas. Em algumas modalidades, agentes isolados são mais do que cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99%, ou mais do que cerca de 99% puros. Conforme aqui usado, uma substância é "pura" se for substancialmente livre de outros componentes. Substancialmente isolada: Por "substancialmente isolada" entende-se que o composto é substancialmente separado do meio-ambiente no qual foi formado ou detectado. A separação parcial pode incluir, por exemplo, uma composição enriquecida no composto da presente invenção. Separação substancial pode incluir composições que contêm pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 97%, ou pelo menos cerca de 99% em peso do composto da presente invenção ou seus sais. Métodos para isolar compostos e seus sais são rotina na técnica.
[000517] Ligante: Conforme aqui usado, um ligante se refere a um grupo de átomos, por exemplo, 10-1.000 átomos, e pode ser compreendido dos átomos ou grupos tais como, mas não limitados a, carbono, amino, alquilamino, oxigênio, enxofre, sulfóxido, sulfonila, carbonila, e imina. O ligante pode ser ligado a um nucleosídeo ou nucleotídeo modificado na nucleobase ou porção açúcar em uma primeira extremidade, e a uma carga útil, por exemplo, um agente detectável ou terapêutico, em uma segunda extremidade. O ligante pode ser de comprimento suficiente de maneira a não interferir com a incorporação em uma sequência de ácido nucleico. O ligante pode ser usado para qualquer propósito útil, tal como para formar multímeros (por exemplo, através de ligação de dois ou mais polinucleotídeos) ou conjugados, assim como para administrar uma carga útil, conforme aqui descrito. Exemplos de grupos químicos que podem ser incorporados ao ligante incluem, mas não estão limitados a, alquila, alquenila, alquinila, amido, amino, éter, tioéter, éster, alquileno, heteroalquileno, arila ou heterociclila, cada um desses pode ser opcionalmente substituído, conforme aqui descrito. Exemplos de ligantes incluem, mas não estão limitados a, alcanos insaturados, polietileno glicóis (por exemplo, unidades monoméricas de etileno ou propileno glicol, por exemplo, dietileno glicol, dipropileno glicol, trietileno glicol, tripropileno glicol, tetraetileno glicol ou tetraetileno glicol) e polímeros de dextrano. Outros exemplos incluem, mas não estão limitados a, porções cliváveis dentro do ligante, tais como, por exemplo, uma ligação dissulfeto (-S-S-) ou uma ligação azo (-N=N-), que pode ser clivada usando um agente de redução ou fotólise. Exemplos não limitantes de uma ligação seletivamente clivável incluem uma ligação amido que pode ser clivada por exemplo pelo uso de tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP), ou outros agentes de redução, e/ou fotólise, assim como uma ligação éster que pode ser clivada, por exemplo, por hidrólise ácida ou básica.
[000518] Modificado: Conforme aqui usado, "modificado" se refere a um estado ou estrutura modificado de uma molécula da invenção. Moléculas podem ser modificadas de várias maneiras incluindo quimicamente, estruturalmente e funcionalmente. Em uma modalidade, as moléculas de mRNA da presente invenção são modificadas pela introdução de nucleosídeos e/ou nucleotídeos não naturais, por exemplo, uma vez que ele se relaciona aos ribonucleotídeos naturais A, U, G e C. Nucleotídeos não canônicos tais como estruturas cap não são considerados "modificados", embora eles exibam diferença da estrutura química dos ribonucleotídeos A, C, G e U.
[000519] De ocorrência natural: Conforme aqui usado, "de ocorrência natural" significa existir na natureza sem ajuda artificial.
[000520] Vertebrado não-humano: Conforme aqui usado, um "vertebrado não-humano" inclui todos os vertebrados exceto Homo sapiens, incluindo espécies selvagens e domesticadas. Exemplos de vertebrados não-humanos incluem, mas não estão limitados a, mamíferos, tais como alpaca, tembadau, bisão, camelo, gato, gado, veado, cachorro, jumento, boi selvagem, cabra, porquinho da índia, cavalo, llama, mula, porco, coelho, alce, ovelha, búfalo e boi tibetano.
[000521] Fora do alvo: Conforme aqui usado, "fora do alvo" se refere a qualquer efeito não pretendido em qualquer um ou mais alvo, gene ou transcrito celular.
[000522] Janela de leitura aberta: Conforme aqui usado, "janela de leitura aberta" ou "ORF" (Open Reading Frame) se refere a uma sequência que não contém um códon de parada em uma determinada janela de leitura.
[000523] Operacionalmente ligado: Conforme aqui usado, a frase "operacionalmente ligado" se refere a uma conexão funcional entre dois ou mais moléculas, construtos, transcritos, entidades, porções ou similar. .
[000524] Parátopo: Conforme aqui usado, um "parátopo" se refere ao sítio de ligação de antígeno de um anticorpo.
[000525] Paciente: Conforme aqui usado, "paciente" se refere um indivíduo que pode procurar ou estar precisando de tratamento, requer tratamento, está recebendo tratamento, irá receber tratamento, ou um indivíduo que está sob cuidado de um profissional treinado para uma condição ou doença particular.
[000526] Opcionalmente substituído: Aqui a expressão da forma "X opcionalmente substituído" (por exemplo, alquila opcionalmente substituída) pretende ser equivalente a "X, onde X é opcionalmente substituído" (por exemplo, "alquila, onde a dita alquila é opcionalmente substituída"). Ela não pretende significar que a característica "X" (por exemplo, alquila) per se seja opcional.
[000527] Peptídeo: Conforme aqui usado, "peptídeo" é menor ou igual a 50 aminoácidos de comprimento, por exemplo, cerca de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ou 50 aminoácidos de comprimento.
[000528] Farmaceuticamente aceitável: A expressão "farmaceuticamente aceitável" é empregada aqui para se referir àqueles compostos, materiais, composições e/ou formas de dosagem que são, dentro do escopo do julgamento médico relevante, adequados para uso em contato com os tecidos dos seres humanos e animais sem toxicidade, irritação, resposta alérgica, ou outro problema ou complicação excessivo, proporcional a uma relação de risco/benefício razoável.
[000529] Excipientes farmaceuticamente aceitáveis: A expressão "excipiente farmaceuticamente aceitável", conforme aqui usado, se refere a qualquer ingrediente que não os compostos descritos aqui (por exemplo, um veículo capaz de suspender ou dissolver o composto ativo) e tendo as propriedades de ser substancialmente não tóxico e não inflamatórios em um paciente. Excipientes podem incluir, por exemplo: antiaderentes, antioxidantes, ligantes, revestimentos, aditivos de compressão, desintegrantes, corantes (cores), emolientes, emulsificantes, cargas (diluentes), formadores de película ou revestimentos, sabores, fragrâncias, glidantes (melhoradores de fluxo), lubrificantes, conservantes, tintas para impressão, absorvedores, agentes de suspensão ou dispersão, adoçantes e águas para hidratação. Excipientes exemplares incluem, mas não estão limitados a: hidroxitolueno butilado (BHT), carbonato de cálcio, fosfato de cálcio (dibásico), estearato de cálcio, croscarmelose, polivinil pirrolidona reticulada, ácido cítrico, crospovidona, cisteína, etilcelulose, gelatina, hidroxipropil celulose, hidroxipropil metilcelulose, lactose, estearato de magnésio, maltitol, manitol, metionina, metilcelulose, metil parabeno, celulose microcristalina, polietileno glicol, polivinil pirrolidona, povidona, amido pré-gelatinizado, propil parabeno, palmitato de retinila, goma laca, dióxido de silício, carboximetil celulose de sódio, citrato de sódio, amido glicolato de sódio, sorbitol, amido (milho), ácido esteárico, sacarose, talco, dióxido de titânio, vitamina A, vitamina E, vitamina C e xilitol.
[000530] Sais farmaceuticamente aceitáveis: A presente invenção também inclui sais farmaceuticamente aceitáveis dos compostos descritos aqui. Conforme aqui usado, "sais farmaceuticamente aceitáveis" se refere a derivados dos compostos descritos em que o composto parental é modificado pela conversão de um ácido ou porção base existente em sua forma de sal (por exemplo, ao reagir o grupo de base livre com um ácido orgânico adequado). Exemplos de sais farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não estão limitados a, sais de ácido mineral ou orgânico de resíduos básicos tais como aminas; sais alcalinos ou orgânicos de resíduos ácidos tais como ácidos carboxílicos; e similar. Sais de adição ácidos representativos incluem acetato, adipato, alginato, ascorbato, aspartato, benzenossulfonato, benzoato, bissulfato, borato, butirato, canforato, canforsulfonato, citrato, ciclopentanopropionato, digluconato, dodecilsulfato, etanossulfonato, fumarato, glucoeptonato, glicerofosfato, hemissulfato, heptonato, hexanoato, bromidrato, cloridrato, iodrato, 2-hidróxi-etanossulfonato, lactobionato, lactato, laurato, lauril sulfato, malato, maleato, malonato, metanossulfonato, 2-naftalenossulfonato, nicotinato, nitrato, oleato, oxalato, palmitato, pamoato, pectinato, persulfato, 3-fenilpropionato, fosfato, picrato, pivalato, propionato, estearato, succinato, sulfato, tartarato, tiocianato, toluenossulfonato, undecanoato, sais de valerato e similar. Sais de metal alcalino ou alcalino-terroso representativos incluem sódio, lítio, potássio, cálcio, magnésio e similar, assim como amônio não-tóxico, amônio quaternário e cátions de amina, incluindo, mas não limitado a amônio, tetrametilamônio, tetraetilamônio, metilamina, dimetilamina, trimetilamina, trietilamina, etilamina e similar. Os sais farmaceuticamente aceitáveis da presente invenção incluem os sais nãotóxicos convencionais do composto parental formado, por exemplo, de ácidos inorgânicos ou orgânicos não tóxicos. Os sais farmaceuticamente aceitáveis da presente invenção podem ser sintetizados a partir do composto parental que contém uma porção básica ou ácida atraves de métodos químicos convencionais. De modo geral, tais sais podem ser preparados pela reação de formas de ácido ou base livre desses compostos com uma quantidade estequiométrica da base ou ácido apropriado em água ou em um solvente orgânico, ou em uma mistura dos dois; geralmente, meio não aquoso como éter, acetato de etila, etanol, isopropanol ou acetonitrila é preferido. Listas de sais adequados são encontradas em Remington’s Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1985, p. 1418, Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use, P.H. Stahl e C.G. Wermuth (eds.), Wiley-VCH, 2008, e Berge e outros, Journal of Pharmaceutical Science, 66, 1-19 (1977), cada um é incorporado aqui a título de referência em sua totalidade.
[000531] Farmacocinética: Conforme aqui usado, "farmacocinética" se refere a qualquer uma ou mais propriedades de uma molécula ou composto uma vez que ela se refere à determinação do destino de substâncias administradas a um organismo vivo. A farmacocinética é dividida em várias áreas incluindo o grau e taxa de absorção, distribuição, metabolismo e excreção. Isso é geralmente referido como ADME em que: (A) Absorção é o processo de uma substância entrar na circulação sanguínea; (D) Distribuição é a dispersão ou disseminação de substâncias pelos fluidos e tecidos do corpo; (M) Metabolismo (ou Biotransformação) é a transformação irreversível de compostos parentais em metabólitos filhos; e (E) Excreção (ou Eliminação) se refere à eliminação das substâncias do corpo. Em raros casos, alguns fármacos se acumulam irreversivelmente no tecido do corpo.
[000532] Solvato farmaceuticamente aceitável: O termo "solvato farmaceuticamente aceitável", conforme aqui usado, significa um composto da invenção onde as moléculas de um solvente adequado são incorporadas no látice cristal. Um solvente adequado é fisiologicamente tolerável na dosagem administrada. Por exemplo, solvatos podem ser preparados por cristalização, recristalização ou precipitação a partir de uma solução que inclui solventes orgânicos, água ou uma mistura dos mesmos. Exemplos de solventes adequados são etanol, água (por exemplo, mono-, di-, and tri-hidratos), N- metilpirrolidinona (NMP), sulfóxido de dimetila (DMSO), N,N’- dimetilformamida (DMF), N,N’-dimetilacetamida (DMAC), 1,3-dimetil-2- imidazolidinona (DMEU), 1,3-dimetil-3,4,5,6-tetra-hidro-2-(1H)- pirimidinona (DMPU), acetonitrila (ACN), propileno glicol, acetato de etila, álcool benzílico, 2-pirrolidona, benzoato de benzila e similar. Quando água é o solvente, o solvato é referido como um "hidrato."
[000533] Físico-química: Conforme aqui usado, "físico-química" significa ou se refere a uma propriedade física e/ou química.
[000534] Prevenção: Conforme aqui usado, o termo "prevenção" se refere a parcialmente ou completamente retardar o começo de uma infecção, doença, distúrbio e/ou condição; parcialmente ou completamente retardar o começo de um ou mais sintomas, características ou manifestações clínicas de uma infecção, doença, distúrbio e/ou condição particular; parcialmente ou completamente retardar o começo de um ou mais sintomas, características ou manifestações de uma infecção doença, distúrbio e/ou condição particular; parcialmente ou completamente retardar a progressão de uma infecção, uma doença, distúrbio e/ou condição particular; e/ou diminuir o risco de desenvolver patologia associada com a infecção, a doença, o distúrbio e/ou condição.
[000535] Profármaco: A presente invenção também inclui profármacos dos compostos descritos aqui. Conforme aqui usado, "profármacos" se refere a qualquer substância, molécula ou entidade que está em uma forma estabelecida para aquela substância, molécula ou entidade para agir como um agente terapêutico mediante alteração química ou física. Profármacos podem ser covalentemente ligados ou sequestrados de algum modo e que liberam ou são convertidos na porção de fármaco ativo antes da, mediante ou após ser administrado a um indivíduo mamífero. Profármacos podem ser preparados ao modificar grupos funcionais presentes nos compostos de tal modo que as modificações são clivadas, tanto em manipulação de rotina ou in vivo, nos compostos parentais. Profármacos incluem compostos onde grupos hidroxila, amino, sulfidrila ou carboxila são ligados a qualquer grupo que, quando administrado a um indivíduo mamífero, cliva para formar um grupo hidroxila, amino, sulfidrila ou carboxila livre, respectivamente. Preparação e uso de profármacos são discutidos em T. Higuchi e V. Stella, "Pro-drugs as Novel Delivery Systems", Vol. 14 do A.C.S. Symposium Series e em Bioreversible Carriers in Drug Design, ed. Edward B. Roche, American Pharmaceutical Association and Pergamon Press, 1987, ambos são aqui incorporados a título de referência em sua totalidade.
[000536] Proliferar: Conforme aqui usado, o termo "proliferar" significa crescer, expandir ou aumentar ou causar o crescimento, expansão ou aumento rapidamente. "Proliferativo" significa ter a habilidade de proliferar. "Antiproliferativo" significa ter propriedades contra ou inoportunas para propriedades proliferativas.
[000537] Sítio de clivagem de proteína: Conforme aqui usado, "sítio de clivagem de proteína" se refere a um sítio onde clivagem controlada da cadeia de aminoácidos pode ser alcançada por meios químicos, enzimáticos ou fotoquímicos.
[000538] Sinal de clivagem de proteína: Conforme aqui usado "sinal de clivagem de proteína" se refere a pelo menos um aminoácido que assinala ou marca um polipeptídeo para clivagem.
[000539] Proteína de interesse: Conforme aqui usado, os termos "proteínas de interesse" e "proteínas desejadas" incluem aquelas providas aqui e fragmentos, mutantes, variantes e suas alterações.
[000540] Proximal: Conforme aqui usado, o termo "proximal" significa situado mais próximo do centro ou em um ponto ou região de interesse.
[000541] Purificado: Conforme aqui usado, "purificar" "purificado", "purificação" significam tornar substancialmente puro ou limpo de componentes indesejados, impureza material, mistura ou imperfeição.
[000542] Amostra: Conforme aqui usado, o termo "amostra" ou "amostra biológica" se refere a um subconjunto de seus tecidos, células ou partes componentes (por exemplo, fluidos corporais, incluindo, mas não limitados a sangue, muco, fluido linfático, fluido sinovial, fluido cérebro-espinhal, saliva, líquido amniótico, sangue do cordão amniótico, urina, fluido vaginal e sémen). Uma amostra ainda pode incluir um homogenato, lisato ou extrato preparado de um organismo completo ou de subconjunto de seus tecidos, células ou partes componentes, ou uma fração ou suas porções, incluindo, mas não limitados a, por exemplo, plasma, soro, fluido espinhal, fluido de linfa, as partes externas da pele, tratos respiratório, intestinal e geniturinário, lágrima, saliva, leite, células do sangue, tumores, órgãos. Uma amostra ainda se refere a um meio, tal como caldo ou gel nutriente, que pode conter componentes celulares, tais como proteínas ou molécula de ácido nucleico.
[000543] Sequências de sinal: Conforme aqui usado, a expressão "sequências de sinal" se refere a uma sequência que pode direcionar o transporte ou a localização de uma proteína.
[000544] Significante ou Significantemente: Conforme aqui usado, os termos "significante" e "significantemente" são usados de maneira sinônima ao termo "substancialmente."
[000545] Dose unitária única: Conforme aqui usado, uma "dose unitária única" é uma dose de qualquer agente terapêutico administrado em uma dose/em um momento/via única/único ponto de contato, isto é, evento de administração único.
[000546] Similaridade: Conforme aqui usado, o termo "similaridade" se refere à relação total entre as moléculas poliméricas, por exemplo entre as moléculas de polinucleotídeos (por exemplo moléculas de DNA e/ou moléculas de RNA) e/ou entre moléculas de polipeptídeo. Cálculo de similaridade percentual de moléculas poliméricas de uma para a outra pode ser realizado da mesma forma como um cálculo de identidade percentual, exceto que cálculo de similaridade percentual leva em consideração substituições conservadoras como é entendido na técnica.
[000547] Dose fracionada: Conforme aqui usado, uma "dose fracionada" é a divisão de uma dose unitária única ou dose diária total em duas ou mais doses.
[000548] Estável: Conforme aqui usado "estável" se refere a um composto que é suficientemente robusto para sobreviver ao isolamento em um grau útil de pureza a partir de uma mistura de reação, e preferivelmente capaz de formulação em um agente terapêutico eficaz.
[000549] Estabilizado: Conforme aqui usado, o termo "estabilizar", "estabilizado", "região estabilizada" significa se tornar estável.
[000550] Indivíduo: Conforme aqui usado, o termo "indivíduo" ou "paciente" se refere a qualquer organismo ao qual uma composição de acordo com a invenção pode ser administrada, por exemplo, para propósitos experimentais, de diagnóstico, profiláticos e/ou terapêuticos. Indivíduos típicos incluem animais (por exemplo, mamíferos tais como camundongos, camundongos, coelhos, primatas não humanos e seres humanos) e/ou plantas.
[000551] Substancialmente: Conforme aqui usado, o termo "substancialmente" se refere à condição qualitativa de exibir extensão ou grau de uma característica ou propriedade de interesses total ou quase total. Uma pessoa de habilidade comum nas técnicas biológicas vai entender que fenômenos biológicos e químicos raramente, se alguma vez, finalizam e/ou progridem para integridade ou alcançam ou evitam um resultado absoluto. O termo "substancialmente" é, portanto, usado aqui para capturar a falta potencial de integridade inerente em muitos fenômenos biológicos e químicos.
[000552] Substancialmente igual: Conforme aqui usado, se refere às diferenças de horário entre as doses, o termo significa mais/menos 2%.
[000553] Substancialmente simultaneamente: Conforme aqui usado e como se refere à pluralidade de doses, o termo significa dentro de 2 segundos.
[000554] Sofrendo de: Um indivíduo que está "sofrendo de" uma doença, distúrbio e/ou condição foi diagnosticado com ou mostra um ou mais sintomas de uma doença, distúrbio e/ou condição.
[000555] Suscetível a: Um indivíduo que é "suscetível a" uma doença, distúrbio e/ou condição não foi diagnosticado com e/ou pode não exibir sintomas da doença, distúrbio e/ou condição, mas carrega uma propensão a desenvolver uma doença ou seus sintomas. Em algumas modalidades, um indivíduo que é suscetível a uma doença, distúrbio e/ou condição (por exemplo, câncer) pode ser caracterizado por um ou mais dos seguintes: (1) uma mutação genética associada com o desenvolvimento da doença, distúrbio e/ou condição; (2) um polimorfismo genético associado com o desenvolvimento da doença, distúrbio e/ou condição; (3) expressão e/ou atividade aumentada e/ou diminuída de uma proteína e/ou ácido nucleico associado com a doença, distúrbio, e/ou condição; (4) hábitos e/ou estilos de vida associados com o desenvolvimento da doença, distúrbio e/ou condição; (5) um histórico familiar da doença, distúrbio e/ou condição; e (6) exposição a e/ou infecção com um micróbio associada com o desenvolvimento da doença, distúrbio e/ou condição. Em algumas modalidades, um indivíduo que é suscetível a uma doença, distúrbio e/ou condição vai desenvolver a doença, distúrbio e/ou condição. Em algumas modalidades, um indivíduo que é suscetível a uma doença, distúrbio e/ou condição não vai desenvolver a doença, distúrbio e/ou condição.
[000556] Sintético: O termo "sintético" significa produzido, preparado, e/ou fabricado pelas mãos do homem. A síntese de polinucleotídeos ou polipeptídeos ou outras moléculas da presente invenção pode ser química ou enzimática.
[000557] Células alvo: Conforme aqui usado, "células alvo" se referem a qualquer uma ou mais células de interesse. As células podem ser encontradas in vitro, in vivo, in situ ou no tecido ou órgão de um organismo. O organismo pode ser um animal, preferivelmente um mamífero, mais preferivelmente um ser humano, e ainda mais preferivelmente um paciente.
[000558] Agente terapêutico: O termo "agente terapêutico" se refere a qualquer agente que, quando administrado a um indivíduo, tem um efeito terapêutico, de diagnóstico e/ou profilático e/ou obtém um efeito biológico e/ou farmacêutico desejado.
[000559] Quantidade terapeuticamente eficaz: Conforme aqui usado, o termo "quantidade terapeuticamente eficaz" significa uma quantidade de um agente a ser administrado (por exemplo, ácido nucleico, fármaco, agente terapêutico, agente de diagnóstico, agente profilático, etc.) que é suficiente, quando administrado a um indivíduo que sofre de ou é suscetível a uma infecção, doença, distúrbio e/ou condição, para tratar, melhorar sintomas de , diagnosticar, prevenir e/ou retardar o começo da infecção, doença, distúrbio e/ou condição.
[000560] Resultado terapeuticamente eficaz: Conforme aqui usado, o termo "resultado terapeuticamente eficaz" significa um resultado que é suficiente em um indivíduo que sofre de um ou é suscetível a uma infecção, doença, distúrbio e/ou condição para tratar, melhorar sintomas de, diagnosticar, prevenir e/ou retardar o começo da infecção, doença, distúrbio e/ou condição.
[000561] Dose total diária: Conforme aqui usado, uma "dose total diária" é uma quantidade dada ou prescrita em um período de 24 horas. Pode ser administrada como uma dose unitária única.
[000562] Fator de transcrição: Conforme aqui usado, o termo "fator de transcrição" se refere a uma proteína de ligação de DNA que regula a transcrição de DNA em RNA, por exemplo, pela ativação ou repressão de transcrição. Alguns fatores de transcrição efetuam a regulação da transcrição sozinhos, enquanto outros agem de acordo com outras proteínas. Alguns fatores de transcrição podem tanto ativar e reprimir a transcrição sob certas condições. Em geral, fatores de transcrição se ligam a uma determinada sequência-alvo ou sequências altamente similares a uma sequência de consenso específica em uma região reguladora de um gene-alvo. Fatores de transcrição podem regular a transcrição de um gene-alvo sozinhos ou em um complexo com outras moléculas.
[000563] Tratamento: Conforme aqui usado, o termo "tratamento" se refere a parcialmente ou completamente aliviar, melhorar, aprimorar, remediar, retardar o começo de, inibir progressão de, reduzir a gravidade de e/ou reduzir a incidência de um ou mais sintomas ou
[000564] características de uma infecção, doença, distúrbio e/ou condição particular. Por exemplo, "tratar" câncer pode se referir a inibir a sobrevivência, crescimento e/ou espalhamento de um tumor. Tratamento pode ser administrado a um indivíduo que não exibe sinais de uma doença, distúrbio e/ou condição e/ou a um indivíduo que exibe somente sinais iniciais de uma doença, distúrbio e/ou condição para o propósito de diminuir o risco de desenvolver patologia associada com a doença, distúrbio e/ou condição.
[000565] Não modificado: Conforme aqui usado, "não modificado" se refere a qualquer substância, composto ou molécula antes de ser modificado de qualquer maneira. Não modificado pode, mas nem sempre, se referir a tipo selvagem ou forma nativa de uma biomolécula. Moléculas podem sofrer uma série de modificações de maneira que cada molécula modificada pode servir como a molécula de partida "não modificada" para uma modificação subsequente.
Equivalentes e Escopo
[000566] Aqueles versados na técnica vão reconhecer, ou serão capazes de determinar usando não mais do que experimentação de rotina, muitos equivalentes às modalidades específicas de acordo com a invenção descrita aqui. O escopo da presente invenção não pretende ser limitado à descrição acima, mas de preferência como exposto nas reivindicações anexas.
[000567] Nas reivindicações, artigos tais como "um", "uma" e "o", "a" significa um ou mais do que um a menos que indicado ao contrário ou de outro modo evidente a partir do contexto. Reivindicações ou descrições que incluem "ou" entre um ou mais membros de um grupo são consideradas satisfeitas se um, mais do que um ou todos dos membros do grupo estiverem presentes, empregados ou de outro modo relevantes a um dado produto ou processo a menos que indicado ao contrário ou de outro modo evidente a partir do contexto. A invenção inclui modalidades nas quais exatamente um membro do grupo está presente, empregado ou de outro modo relevante para o dato produto ou processo. A invenção inclui modalidades nas quais mais de um, ou todos os membros do grupo estão presentes, empregados ou de outro modo são relevantes a um dado produto ou processo.
[000568] É também notado que o termo "compreendendo" pretende estar aberto e permite, mas não requer a inclusão de elementos ou etapas adicionais. Quando o termo "compreendendo" é usado aqui, o termo "consistindo em" também está incluído e descrito.
[000569] Quando faixas são dadas, pontos finais são incluídos. Além disso, deve ser compreendido que a menos que de outro modo indicado ou de outro modo evidente a partir do contexto e entendimento de um versado comum na técnica, valores que estão expressos como faixas podem assumir qualquer valor específico ou subfaixa dentro dos limites fixados em diferentes modalidades da invenção, até o décimo da unidade do menor limite das faixas, a menos que o contexto claramente dite de outro modo.
[000570] Além disso, deve ser compreendido que qualquer modalidade particular da presente invenção que se encaixe na técnica anterior pode ser explicitamente excluída de qualquer uma ou mais reivindicações. Já que tais modalidades são consideradas conhecidas de um versado comum na técnica, elas podem ser excluídas mesmo que a exclusão não esteja exposta de forma explícita aqui. Qualquer modalidade particular das composições da invenção (por exemplo, qualquer ácido nucleico ou proteína codificada pelo mesmo; qualquer método de produção; qualquer método de uso; etc.) pode ser excluída de qualquer uma ou mais reivindicações, por qualquer razão, estando ou não relacionado à existência de técnica anterior.
[000571] Todas as fontes citadas, por exemplo, referências, publicações, bandos de dados, e técnica citada aqui, são incorporadas ao presente pedido a título de referência, mesmo se não expressamente declarado na citação. No caso de exposições conflitantes de uma fonte citada e o presente pedido, a exposição no presente pedido deve prevalecer.
EXEMPLOS
[000572] A presente invenção é ainda descrita nos exemplos a seguir, os quais não limitam o escopo da invenção descrita nas reivindicações.
Exemplo 1. Transcrição de mRNA modificado In Vitro A. Materiais e Métodos
[000573] mRNAs modificados de acordo com a invenção são feitos usando métodos de laboratório padrão e materiais para transcrição in vitro com a exceção de mistura de nucleotídeos que contém nucleotídeos modificados. A janela de leitura aberta (ORF) do gene de interesse é flanqueada por uma região não-traduzida 5' (UTR) que contém um sinal de iniciação translacional forte Kozak e uma 3' UTR alfa-globina que termina com uma sequência oligo(dT) para a adição modular de uma cauda poli-A para mRNAs que não incorporam análogos de adenosina. mRNAs que contêm adenosina são sintetizados sem uma sequência oligo (dT) para permitir a filamentação pós-transcrição de poli (A) polimerase poli-(A).
[000574] Os mRNAs modificados podem ser modificados para reduzir a resposta imune celular inata. As modificações para reduzir a resposta celular podem incluir pseudouridina (^) e 5-metil-citidina (5meC, 5mc ou m5C). (Vide, Kariko, K. e outros Immunity 23:165-75 (2005), Kariko, K. e outros, Mol. Ther. 16:1833-40 (2008), Anderson, B.R. e outros, NAR (2010); aqui incorporados a título de referência).
[000575] A ORF pode também incluir várias adições a montante ou a jusante (tais como, mas não limitado a, β-globina, marcadores, etc.) que podem ser solicitadas de um serviço de otimização tal como, mas não limitado a, DNA2.0 (Menlo Park, CA) e pode conter múltiplos sítios de clonagem que têm um reconhecimento XbaI. Mediante recebimento do construto, ele pode ser reconstituído e transformado em E. coli quimicamente competente.
[000576] Para a presente invenção, E. coli NEB DH5-alfa Competente são usadas. Transformações são realizadas de acordo com as instruções NEB usando 100 ng de plasmídeo. O protocolo é como segue:
[000577] Descongelar um tubo de células de E. coli NEB 5-alpha Competente em gelo por 10 minutos.
[000578] Adicionar 1-5 μl contendo 1 pg-100 ng de plasmídeo DNA à mistura celular. Com cuidado, mexer o tubo 4-5 vezes para misturar as células e o DNA. Não turbilhonar.
[000579] Colocar a mistura em gelo por 30 minutos. Não misturar.
[000580] Aquecer bruscamente a 42°C por exatamente 30 segundos. Não misturar.
[000581] Colocar em gelo por 5 minutos. Não misturar.
[000582] Pipetar 950 μl de SOC a temperatura ambiente na mistura.
[000583] Colocar a 37°C por 60 minutos. Sacudir vigorosamente (250 rpm) ou girar.
[000584] Aquecer placas de seleção para 37°C.
[000585] Misturar as células completamente sacudindo levemente o tubo e invertendo.
[000586] Espalhar vigorosamente 50-100 μl de cada diluição em uma placa de seleção e incubar durante a noite a 37°C. De forma alternativa, incubar a 30°C por 24-36 horas ou 25°C por 48 horas.
[000587] Uma única colônia é então usada para inocular 5 ml de meio de crescimento LB usando o antibiótico apropriado e depois deixando crescer (250 RPM, 37° C) por 5 horas. Isso é então usado para inocular um meio de cultura de 200 ml e deixado crescer durante a noite sob as mesmas condições.
[000588] Para isolar o plasmídeo (até 850 μg), uma preparação maxi é realizada usando o kit Invitrogen PURELINK® HiPure Maxiprep (Carlsbad, CA), seguindo as instruções do fabricante.
[000589] De modo a gerar cDNA para transcrição In Vitro (IVT), o plasmídeo (cujo exemplo é mostrado na Figura 3) é primeiro linearizado usando uma enzima de restrição tal como XbaI. Uma digestão de restrição típica com XbaI compreenderá o seguinte: Plasmídeo 1,0 μg; 10x Tampão 1,0 μl; XbaI 1,5 μl; dH20 até 10 μl; incubados a 37° C por 1 h. Se for realizada em uma escala de laboratório (< 5μg), a reação é limpa usando kit PURELINK® PCR Micro da Invitrogen (Carlsbad, CA) seguindo as instruções do fabricante. Purificações em escala maior podem precisar ser feitas com um produto que tenha uma maior capacidade de carga tal como kit padrão PURELINK® PCR da Invitrogen (Carlsbad, CA). Após a limpeza, o vetor linearizado é quantificado usando o NanoDrop e analisado para confirmar a linearização usando eletroforese em gel de agarose.
B. Eletroforese em Gel de Agarose de mRNA modificado
[000590] mRNAs individuais modificados (200-400 ng em um volume de 20 μl) são carregados em uma cavidade em um E-Gel de Agarose 1,2% não desnaturante (Invitrogen, Carlsbad, CA) e ativados por 12-15 minutos de acordo com o protocolo do fabricante.
C. Eletroforese em Gel de Agarose de produtos de RT-PCR
[000591] Produtos de PCR que sofreram transcrição reversa (200400ng) são carregados em uma cavidade de um E-Gel de Agarose 1,2% não desnaturante (Invitrogen, Carlsbad, CA) e ativados por 12-15 minutos de acordo com o protocolo do fabricante.
D. Quantificação de mRNA modificado Nanodrop e dados espectrais de UV
[000592] mRNAs modificados no tampão TE (1 μl) são usados para leituras de absorbância de UV Nanodrop para quantificar o rendimento de cada mRNA modificado em uma reação de transcrição in vitro (traços de absorbância de UV não são mostrados).
Exemplo 2. Transfecção de mRNA modificado A. Transfecção Reversa
[000593] Para experimentos realizados em uma placa de cultura de tecidos revestida por colágeno de 24 cavidades, Queratinócitos são semeados em uma densidade de célula de 1 x 105. Para experimentos realizados em uma placa de cultura de tecidos revestida por colágeno de 96 cavidades, queratinócitos são semeados em uma densidade de célula de 0,5 x 105. Para cada mRNA modificado a ser transfectado, mRNA modificado: RNAIMAX® são preparados como descrito e misturados com as células em uma placa de múltiplas cavidades dentro de 6 horas da semeadura da célula antes que as células tenham aderido à placa de cultura de tecidos.
B. Transfecção Avançada
[000594] Em uma placa de cultura de tecidos revestida por colágeno de 24 cavidades, queratinócitos são semeados em uma densidade de célula de 0,7 x 105. Para experimentos realizados em uma placa de cultura de tecido revestida por colágeno de 96 cavidades, queratinócitos são semeados em uma densidade de célula de 0,3 x 105. Queratinócitos são então cultivados para uma confluência de >70% por mais de 24 horas. Para cada mRNA modificado a ser transfectado, mRNA modificado: RNAIMAX® são preparados como descrito e transfectados nas células em uma placa de múltiplas cavidades por mais de 24 horas após semeadura das células e a aderência à placa de cultura de tecidos.
C. Avaliação de tradução de mRNA modificado: G-CSF ELISA
[000595] Queratinócitos são cultivados em um meio EpiLife com Supplement S7 da Invitrogen em uma confluência de >70%. Queratinócitos são transfectados de maneira reversa com 300 ng do mRNA modificado quimicamente indicado complexado com RNAIMAX® da Invitrogen. Alternativamente, queratinócitos são transfectados de maneira avançada com 300 ng de mRNA modificado complexado com RNAIMAX® da Invitrogen. O complexo RNA: RNAIMAX® é formado ao primeiro incubar o RNA com meio EPILIFE® livre de suplemento em uma diluição volumétrica de 5X por 10 minutos em temperatura ambiente.
[000596] Em um segundo frasco, o reagente RNAIMAX® é incubado com meio EPILIFE® livre de suplemento em uma diluição volumétrica de 10X por 10 minutos em temperatura ambiente. O frasco de RNA é então misturado com o frasco de RNAIMAX® e incubado por 20-30 _ em temperatura ambiente antes de ser adicionado às células em gotas. A concentração de huG-CSF secretada no meio de cultura é medida 18 horas após a transfecção para cada dos mRNAs quimicamente modificados em triplicata. A secreção de fator estimulante de colônia de granulócitos humanos (G-CSF) dos queratinócitos transfectados humanos é quantificada usando um kit ELISA da Invitrogen ou R&D Systems (Minneapolis, MN) seguindo as instruções recomendadas pelos fabricantes.
D. Dose e Duração de mRNA modificado: ELISA de G-CSF
[000597] Queratinócitos são cultivados em um meio EPILIFE® com Supplement S7 da Invitrogen em uma confluência de >70%. Queratinócitos são transfectados de forma reversa com 0ng, 46,875 ng, 93,75 ng, 187,5 ng, 375 ng, 750 ng ou 1500 ng de mRNA modificado complexo com RNAIMAX® da Invitrogen. O complexo mRNA modificado: RNAIMAX® é formado como descrito. A concentração de huG-CSF secretado no meio de cultura é medido em 0, 6, 12, 24 e 48 hours após a transfecção para cada concentração de cada mRNA modificado em triplicata. A separação de fator estimulante de colônia de granulócitos humanos (G-CSF) de queratinócitos humanos transfectados é quantificada usando um kit ELISA da Invitrogen ou R&D Systems seguindo as instruções recomendadas pelos fabricantes.
Exemplo 3. Resposta imune celular inata a ácidos nucleicos modificados: ELISA de IFN-beta e ELISA de TNF-alfa
[000598] Um ensaio imunoabsorvente ligado à enzima (ELISA) para Fator-α de necrose de tumor humano (TNF-α), Interferon-β humano (IFN-β) e fator estimulante de colônia de granulócitos (G-CSF) secretados de células de queratinócito humano transfectadas in vitro é testado para a detecção de uma resposta imune celular inata.
[000599] Queratinócitos são cultivados em meio EPILIFE® com suplemento de cultivo de queratinócito humano na ausência de hidrocortisona da Invitrogen em uma confluência de >70%. Queratinócitos são transfectados de forma reversa com 0 ng, 93,75 ng, 187,5 ng, 375 ng, 750 ng, 1500 ng ou 3000 ng do mRNA indicado quimicamente modificado complexado com RNAIMAX® da Invitrogen como descrito em triplicata. TNF-α secretado no meio de cultura é medido 24 horas após a transfecção para cada dos mRNAs quimicamente modificados usando um kit ELISA da Invitrogen de acordo com os protocolos do fabricante.
[000600] IFN-β secretado é medido 24 horas após a transfecção para cada dos mRNAs quimicamente modificados usando um kit ELISA da Invitrogen de acordo com os protocolos do fabricante. A concentração do hu-G-CSF separado é medida em 24 horas após a transfecção para cada um dos mRNAs quimicamente modificados. A secreção de fator estimulante de colônia de granulócitos humanos (G-CSF) de queratinócitos humanos transfectados é quantificada usando um kit ELISA da Invitrogen ou R&D Systems (Minneapolis, MN) seguindo as instruções recomendadas pelos fabricantes. Esses dados indicam em quais mRNA modificados são capazes de elicitar uma resposta imune celular inata em comparação a polinucleotídeos naturais e outros modificados quimicamente ou compostos de referência ao medir citocinas do tipo exemplar 1 TNF-alfa e IFN-beta.
Exemplo 4. Ensaio de proliferação celular induzida por mRNA modificado por fator estimulante de colônia de granulócitos humano
[000601] Queratinócitos humanos são cultivados em um meio EPILIFE® com Supplement S7 da Invitrogen em uma confluência de >70% em uma placa de cultura de tecidos de co-cultura de 24 cavidades revestida com colágeno TRANSWELL® (Corning, Lowell, MA).Queratinócitos são transfectados de forma reversa com 750ng do mRNA modificado quimicamente indicado complexado com RNAIMAX® da Invitrogen como descrito em triplicata. O complexo mRNA modificado: RNAIMAX® é formado como descrito. O meio de queratinócito é trocado 6-8 horas após a transfecção. 42-horas após a transfecção, a inserção da placa de 24 cavidades TRANSWELL® com uma membrana de poliéster semipermeável de poro de 0,4 μm é colocada no queratinócito transfectado com mRNA modificado hu-G- CSF que contém a placa de cultura.
[000602] Células de mieloblasto humano, células Kasumi-1 ou KG-1 (células de 0,2 x 105), são semeadas na cavidade de inserção e a proliferação celular é quantificada 42 horas após o início da co-cultura usando um Direct Cell Proliferation Assay CyQuant (Invitrogen) em um volume 100-120 μl de 96 placas de cavidade. A proliferação de células de mieloblasto induzida por hu-G-CSF que codifica mRNA modificado é expressa como uma proliferação de células percentual normalizada para cavidades controle de co-cultura de queratinócito/mieloblasto não- transfectado. A concentração de hu-G-CSF secretado em ambas as cavidades de co-cultura de inserção de queratinócito e mieloblasto é medida 42 horas após o início da co-cultura para cada mRNA modificado em duplicata. Secreção de fator estimulante de colônia de granulócito humano (G-CSF) é quantificada usando um kit ELISA da Invitrogen seguindo as instruções recomendadas pelos fabricantes.
[000603] mRNA modificado transfectado com hu-G-CSF em células de alimentação de queratinócito humano e células de mieloblasto humano não transfectadas são detectados por RT-PCR. RNA total das células de amostra é extraído e lisado usando kit RNAEASY® (Qiagen, Valencia, CA) de acordo com as instruções do fabricante. RNA total extraído é submetido a RT-PCR para amplificação específica de mRNA- G-CSF modificado usando kit PROTOSCRIPT® M-MuLV Taq RT-PCR (New England BioLabs, Ipswich, MA) de acordo com as instruções do fabricante com iniciador s específicos para hu-G-CSF. Os produtos RT- PCR são visualizados por eletroforese em gel agarose 1,2%.
Exemplo 5. Citotoxicidade e Apoptose
[000604] Esse experimento demonstra viabilidade, citotoxicidade e apoptose celular para células de queratinócito humano transfectadas com mRNA modificado in vitro. Queratinócitos são cultivados em um meio EPILIFE® com suplemento de cultivo de queratinócito humano na ausência de hidrocortisona da Invitrogen em uma confluência de >70%. Queratinócitos são transfectados de modo reverso com 0 ng, 46,875 ng, 93,75 ng, 187,5 ng, 375 ng, 750 ng, 1500 ng, 3000 ng ou 6000 ng de mRNA modificado complexo com RNAIMAX® da Invitrogen. O complexo de mRNA modificado: RNAIMAX® é formado. A concentração de huG- CSF secretado no meio de cultura é medido a 0, 6, 12, 24 e 48 horas após a transfecção para cada concentração de cada mRNA modificado em triplicata. A secreção do fator estimulante de colônia de granulócito humano (G-CSF) de queratinócitos humanos transfectados é quantificada usando um kit ELISA da Invitrogen ou R&D Systems seguindo as instruções recomendadas dos fabricantes. Viabilidade, citotoxicidade e apoptose celular são medidas em 0, 12, 48, 96, e 192 horas após a transfecção usando um kit APOTOX-GLO® da Promega (Madison, WI) de acordo com as instruções do fabricante.
Exemplo 6. Ambiente de Co-Cultura
[000605] O mRNA modificado compreendido de nucleotídeos modificados quimicamente distintos que codificam fator estimulante de colônia de granulócito humano (G-CSF) pode estimular a proliferação celular de uma célula incompetente em transfecção em um ambiente de cocultura. A cocultura inclui um tipo de célula altamente transfectável tal como um queratinócito humano e um tipo de célula incompetente em transfecção tal como uma célula branca do sangue (WBC). O mRNA modificado que codifica G-CSF pode ser transfectado em uma célula altamente transfectável permitindo a produção e secreção de proteína G-CSF no ambiente extracelular onde G-CSF age de modo similar a parácrino para estimular a célula branca do sangue expressando o receptor G-CSF a proliferar. A população de WBC aumentada pode ser usada para tratar pacientes imunocomprometidos ou parcialmente reconstituir a população de WBC de um paciente imunossuprimido e assim reduz o risco de infecções oportunistas.
[000606] Em outro exemplo, uma célula altamente transfectável tal como um fibroblasto é transfectada com certos fatores de crescimento para auxiliar e simular o crescimento, manutenção, ou diferenciação de células-tronco embrionárias pobremente transfectáveis ou células- tronco pluripotentes induzidas.
Exemplo 7. Capeamento de 5’-Guanosina em ácidos nucleicos modificados (mRNAs modificados) A. Materiais e Métodos
[000607] A clonagem, a síntese do gene e o sequenciamento de vetores foram realizados pela DNA2.0 Inc. (Menlo Park, CA). A ORF foi digerida por restrição usando XbaI e usada para síntese de cDNA usando PCR cauda ou sem cauda. O produto de cDNA de PCR com cauda foi usado como o modelo para reação de síntese de mRNA modificado usando 25 mM de cada mistura de nucleotídeo modificado (todos os nucleotídeos modificados foram sintetizados sob encomenda ou comprados da TriLink Biotech, San Diego, CA exceto pirrol-C trifosfato comprado de Glen Research, Sterling VA; nucleotídeos não- modificados foram comprados de Epicenter Biotechnologies, Madison, WI) e kit de síntese de mRNA completo CellScript MEGASCRIPT® (Epicenter Biotechnologies, Madison, WI). A reação de transcrição in vitro foi realizada por 4 horas a 37°C. mRNAS modificados que incorporam análogos de adenosina foram filamentados com poli (A) usando Poly (A) Polymerase de levedura (Affymetrix, Santa Clara, CA). A reação de PCR usou HiFi PCR 2X MASTER MIX® (Kapa Biosystems, Woburn, MA). mRNAs modificados foram capeados após a transcrição usando Vaccinia Virus Capping Enzyme recombinante (New England BioLabs, Ipswich, MA) e uma 2’-o-metiltransferase recombinante (Epicenter Biotechnologies, Madison, WI) para gerar a estrutura Cap1 5’-guanosina. Estrutura Cap 2 e estruturas Cap 2 podem ser geradas usando 2’-o-metiltransferases adicionais. O produto de mRNA transcrito In vitro foi administrado em gel de agarose e visualizado. mRNA modificado foi purificado com kit Ambion/Applied Biosystems (Austin, Tx) MEGAClear RNA® (Austin, TX). PCR usou kit de purificação PURELINK® PCR (Invitrogen, Carlsbad, CA). O produto foi quantificado em NANODROP®UV Absorbance (ThermoFisher, Waltham, MA). Qualidade, qualidade de absorbância de UV e visualização do produto foram realizadas em um gel agarose 1,2%. O produto foi ressuspenso em tampão TE.
B. Estrutura de Ácido nucleico modificado (mRNA) com Capeamento 5’
[000608] Capeamento 5’ de mRNA modificado pode ser completado concomitantemente durante a reação de transcrição in vitro usando os análogos de cap de RNA químicos que seguem para gerar a estrutura de cap 5’-guanosina de acordo com os protocolos do fabricante: 3'-0- Me-m7G(5')ppp(5')G (o cap ARCA); G(5')ppp(5')A; G(5')ppp(5')G; m7G(5')ppp(5')A; m7G(5')ppp(5')G (New England BioLabs, Ipswich, MA). Capeamento 5’ de mRNA modificado pode ser completado após a transcrição usando uma Enzima de Capeamento do Vírus Vaccínia para gerar a estrutura "Cap 0": m7G(5')ppp(5')G (New England BioLabs, Ipswich, MA). A estrutura Cap 1 pode ser gerada usando ambas a Enzima de Capeamento do Vírus Vaccínia e a 2’-O metil-transferase para gerar: m7G(5')ppp(5')G-2’-O-metila. A estrutura Cap 2 pode ser gerada a partir da estrutura Cap 1 seguido pela 2’-o-metilação do antepenúltimo nucleotídeo 5’ usando uma 2’-O metil-transferase. A estrutura Cap 3 pode ser gerada a partir da estrutura Cap 2 seguido pela 2’-o-metilação do preantepenúltimo nucleotídeo 5’ usando uma 2’-O metil-transferase. Enzimas são preferivelmente derivadas de uma fonte recombinante.
[000609] Quando transfectados em células de mamíferos, os mRNAs modificados têm a estabilidade de 12-18 horas ou mais do que 18 horas, por exemplo, 24, 36, 48, 60, 72 ou mais do que 72 horas. Exemplo 8. Síntese de N4-metil citidina (composto 1) e N4-metil CTP (NTP de dito composto)
Figure img0162
[000610] Uridina foi sililada para prover um composto trissililado, o qual foi purificado por coluna, ativado com POCl3/triazol redestilado sob condição anidra, e depois seguido de substituição nucleofílica com solução aquosa de metilamina 40%. N4-Metil-2’,3’,5’-tri-O-TBDMS- citidina foi assim obtida após purificação cromatográfica. O produto resultante foi desprotegido com TBAF e então purificado com um sistema solvente de acetato de etila-etanol (3:1) para obter o composto 1. O produto final foi caracterizado por RMN (em DMSO); MS: 258 (M + H)+, 280 (M + Na)+ e 296 (M + K)+; e HPLC: pureza, 99,35% (FIGS. 1A- 1D). HPLC, pureza 98% (FIG. 2). Exemplo 9. Síntese de 2’-OMe-N,N-di-Me-citidina (composto 2) e 2’- OMe-N,N-di-Me-CTP (NTP de dito composto)
Figure img0163
[000611] 2’-O-Metiluridina foi sililada para fornecer o composto disililado. 2’-O-metil-3’,5’-di-O-TBDMS uridina purificada foi ativada com POCl3 redestilado e imidazol sob condição anidra, seguido pela substituição nucleofílica com cloridrato de dimetilamina sob ambiente de trietilamina para aprisionar HCl. Composto intermediário N4,N4,2’-tri-Ometil-3’,5’-bis- O-TBDMS uridina foi purificado por cromatografia flash e obtido com uma espuma branca. O composto resultante foi desprotegido com TBAF e então purificado para prover ~400 mg de produto final composto 2 como espuma branca. ES MS: m/z 308 (M + Na)+, 386 (M + H)+; HPLC: pureza, 99,49% (FIGS. 3A-3C).
[000612] Para sintetizar o NTP correspondente, 70 mg de composto 2 nucleosídeo proveram 23 mg de 2’-OMe-N,N-di-Me-CTP após a purificação por troca de íons e colunas de fase reversas. HPLC: pureza, 95% (FIG. 4). Exemplo 10. Síntese de 5-metoxicarbonilmetoxi uridina (composto 3) e 5-metoxicarbonilmetóxi-UTP (NTP de dito composto)
Figure img0164
[000613] Uridina 3-a em água foi tratada com quantidade de bromo em excesso e depois recebeu fluxo de ar para remover o bromo. A mistura de reação foi tratada com piridina a velocidade e temperatura controladas. Durante a reação, bromo instável-intermediário 3-b gradualmente convertido em intermediário 3-c di-hidroxila, o qual presumidamente desidratou para a 5-hidroxiuridina 3-d estável. Então, a 5-hidroxiuridina foi protegida com um grupo 2’,3’-isopropilideno para prover composto 3-g. A reação com composto 3-f proveu composto 3.
[000614] 60-70 mg do nucleosídeo proveram >21 mg do trifosfato desejado após duas etapas de purificação por coluna HPLC e duas etapas de liofilização. HPLC: pureza, 98% (FIG. 5). Exemplo 11. Síntese de 3-metil pseudouridina (composto 4) e 3-metil pseudo-UTP (NTP de dito composto)
Figure img0165
[000615] Pseudouridina 4-a foi reagida com Ac2O para prover pseudouridina 4-b protegida por acetila. Então, N1 foi seletivamente protegido com POM para prover composto 4-c. Metilação de N3, seguida por composto 4 provido, desprotegido (~400 mg). Fórmula molecular: C10H14N2O6, peso molecular: 258.23g/mol; aparência: sólido branco; condições de armazenamento: armazenar a 25 °C; HPLC: pureza, 98,51%; 1H RMN (DMSO-d6): δ 11,17 (d, 1H, J = 3,0 Hz), 7,56 (d, 1H, J = 3,6 Hz), 4,91 (d, 1H, J = 3,6 Hz), 4,79 (t, 1H, J = 4,2Hz), 4,70 (d, 1H, J = 4,2Hz), 4,49 (d, 1H, J = 3,0Hz), 3,82-3,88 (m, 2H), 3,66-3,67 (m, 1H), 3,57-3,61 (m, 1H), 3,40-3,47 (m, 1H), 3,09 (s, 3H); MS: 281 (M + Na)+) (FIGURAS, 6A e 6B).
[000616] Rotas alternativas poderiam ser aplicadas para se obter o composto 4. Por exemplo, pseudouridina pode ser reagida com um grupo de proteção O (por exemplo, conforme aqui descrito, tal como TMS) e reagido com um grupo de proteção N (por exemplo, conforme aqui descrito, tal como acetila em N1). Então, N3 da nucleobase poderia ser reagido com um agente de alquilação (por exemplo, dimetilamina/dimetoximetila) para prover composto 4 que tem grupos de proteção N e O. Finalmente, o composto resultante seria desprotegido (por exemplo, sob condições básicas, tais como NH3/MeOH) para prover o composto 4. Exemplo 12. Síntese de N-Ac, 5-Ac-OCH2-citidina (composto 5)
Figure img0166
[000617] Uridina 5-a foi protegida para obter o composto 5-b isopropilideno, o qual foi reagido com (CHCO)n. Ácido acético com quantidade de catalisador de TFA foi empregado para obter o composto 5-f seletivamente acilado desejado (30% de rendimento). Além disso, a tritilação do grupo 5’-OH resultou no composto 5-g desejado ortogonalmente protegido.
[000618] O composto 5-g foi tratado com POCl3 e triazol para prover composto 5-h junto com o composto 5-i desacilado. Acetilação desses dois compostos proveu composto 5-j di-acilado, amplamente protegido. A desproteção do composto 5-j com ácido acético sob condição de aquecimento resultou em três produtos, um dos quais foi o composto 5.
[000619] Para obter o NTP correspondente, uma reação de trifosfato pode ser conduzida (por exemplo, qualquer uma descrita aqui). Opcionalmente, o NTP pode ser purificado (por exemplo, usando uma coluna Sephadex DEAE-A25), liofilizado ou evaporado (por exemplo, a partir de EtOH).
[000620] Rotas alternativas poderiam ser aplicadas para obter o composto 5, tal como começar com citidina como material de partida. Em tais métodos, a posição 5 poderia ser reagida com um halogênio ou um agente de halogenação (por exemplo, qualquer um descrito aqui, tal como ácido I2/ meta-cloroperoxibenzoico), o qual pode ser deslocado com um agente de alquilação. Além disso, ditos métodos poderiam incluir o uso de um ou mais grupos de proteção N ou Os (por exemplo, qualquer um descrito aqui, tal como sililação ou acetilação) para proteger o grupo amino de citidina e/ou grupos hidroxila da porção açúcar. Exemplo 13. Síntese de 5-TBDMS-OCH2-citidina (composto 6)
Figure img0167
[000621] Um composto 5-hidroxiuracila’-b foi glicosilado para obter o composto 6’-d (rendimento de 28%), o qual foi sililado para prover o composto 6’-e. A ativação da uridina protegida proveu o composto 6 desejado após aminação e desproteção adicionais (800 mg do composto final). Fórmula molecular: C16H29N3O6Si; peso molecular: 387,50 g/mol; aparência: sólido branco; condições de armazenagem: armazenar a 25 °C; HPLC: pureza, 97,57%; 1H RMN (CDCl3): d 7,81 (s, 1H), 7,40 (s amplo, 1H), 6,49 (s amplo, 1H), 5,79 (d, 1H, J = 2,4 Hz), 5,3-5,32 (m, 1H), 5,00-5,07 (m, 2H), 4,30-4,45 (m, 2H), 3,90-3,94 (m, 2H), 3,80-3,83 (m, 1H), 3,50-3,70 (m, 2H), 0,87 (s, 9H), 0,05 (S, 6H); MS: 388 (M + H)+, 410 (M + Na)+) (FIGURAS 7A-7C).
[000622] Para obter o NTP correspondente, uma reação de trifosfato pode ser conduzida (por exemplo qualquer uma descrita aqui). Opcionalmente, o NTP pode ser purificado (por exemplo, usando uma coluna Sephadex DEAE-A25), liofilizado ou evaporado (por exemplo a partir de EtOH). Exemplo 14. Síntese de 5-trifluorometil citidina (composto 7)
Figure img0168
[000623] Composto 7-A foi glicosilado para prover composto 7-B, o qual foi tratado com cloreto de 2,4,6-triisopropilbenzeno sulfonila (TPSCl) para ativar o grupo carbonila e para prover a aminação redutora. A desproteção proveu o composto 7. Agentes de ativação alternativos poderiam ser usados em vez de TPSCl, tal como cloreto de 2,4,6-trimetilbenzeno sulfonila.
[000624] Para obter o NTP correspondente, uma reação de trifosfato pode ser conduzida (por exemplo, qualquer uma descrita aqui). Opcionalmente, o NTP pode ser purificado (por exemplo, usando uma coluna Sephadex DEAE-A25), liofilizado ou evaporado (por exemplo, a partir de EtOH). Exemplo 15. Síntese de 5-trifluormetil uridina (composto 8)
Figure img0169
[000625] 5-Trifluormetiluracila 8-A foi glicosilada com tetra-O-acetil ribose e a 5-trifluorometiluridina triprotegida 8-B desejada foi obtida em bom rendimento. Além disso, a desproteção forneceu o composto 8 desejado, o qual foi caracterizado com resultados de RMN, MS e HPLC. MS: 313 (M + H)+, 335 (M + Na)+; HPLC: pureza, 98,87%, ((FIGURAS 8A-8C).
[000626] Para obter o NTP correspondente, uma reação de trifosfato pode ser conduzida (por exemplo, qualquer uma descrita aqui). Opcionalmente, o NTP pode ser purificado (por exemplo, usando uma coluna Sephadex DEAE-A25), liofilizado ou evaporado (por exemplo, a partir de EtOH). Exemplo 16. Síntese de 5-(metoxicarbonil)metil uridina (composto 9)
Figure img0170
[000627] Uridina 9-a foi protegida para prover composto 9-b (rendimento de 98%). Este composto foi brominado com excesso de bromo na presença de anidrido de ácido acético e ácido acético. O análogo de 5-bromo 9-c foi obtido (60% de rendimento) e ainda benzoilado para prover o composto 9-d desejado (rendimento de 64%). Composto 5-bromo 9-d foi condensado com malonato de dimetila sob condição básica fornecer dar o malonato arilado e diéster 9-e totalmente protegido (50% de rendimento). Após a descarboxilação e desproteção, o composto 9 foi obtido verificado por RMN (FIG. 9).
[000628] Para obter o NTP correspondente, uma reação de trifosfato pode ser conduzida (por exemplo, qualquer uma descrita aqui). Opcionalmente, o NTP pode ser purificado (por exemplo, usando uma coluna Sephadex DEAE-A25), liofilizado ou evaporado (por exemplo, a partir de EtOH). Exemplo 17. Síntese de 5-(metoxicarbonil)metil-2'-O-metil uridina (2- OMe-MCM5U) (composto 10)
Figure img0171
Composto 10
[000629] Estratégia similar à síntese do composto 9 acima, 2’-O- metiluridina 10-a foi acilada e brominada para obter o composto 10-c. Benzoilação adicional proveu análogo de 5-bromo 10-d, o qual foi condensado com malonato de dimetila para prover o produto 10-e desejado (rendimento de 45%). Descarboxilação e desproteção proveram o composto 10.
[000630] Para se obter o NTP correspondente, uma reação de trifosfato pode ser conduzida (por exemplo, qualquer uma descrita aqui). Opcionalmente, o NTP pode ser purificado (por exemplo, usando uma coluna Sephadex DEAE-A25), liofilizado ou evaporado (por exemplo, a partir de EtOH). Exemplo 18. Síntese de 5-trifluoroacetil-aminometil-2-tiouridina (composto 11)
Figure img0172
Composto 11
[000631] Glicosilação de 2-tiouracila 11-a proveu o composto 11-c, o qual pode ser desprotegido com qualquer reagente de desproteção útil. Em particular, LiOH proveu o produto desejado 11-d (rendimento de 80-90%). A proteção com isopropilideno proveu composto 11-e (rendimento de 90%). Além disso, 5-hidroxilmetilação adicional proveu composto 11-f. Cloração, azidação e redução adicional proveram o composto de metilamina 11-i, o qual foi acetilado para prover o composto 11.
[000632] Para obter o NTP correspondente, uma reação de trifosfato pode ser conduzida (por exemplo, qualquer uma descrita aqui). Opcionalmente, o NTP pode ser purificado (por exemplo, usando uma coluna Sephadex DEAE-A25), liofilizado ou evaporado (por exemplo, a partir de EtOH). Exemplo 19. Síntese de 5-metilaminometil-2-uridina (composto 12)
Figure img0173
[000633] Composto 12 pode ser obtido através qualquer método útil (por exemplo, vide esquemas (i) e (ii) acima). Por exemplo, uracila protegida pode ser glicosilada e subsequentemente aminada para prover o composto 12. Etapas adicionais de proteção, desproteção e ativação podem ser conduzidas conforme necessário. Para obter o NTP correspondente, uma reação com trifosfato pode ser conduzida (por exemplo qualquer uma descrita aqui). Opcionalmente, o NTP pode ser purificado (por exemplo, usando uma coluna Sephadex DEAE-A25), liofilizado ou evaporado (por exemplo, a partir de EtOH). Exemplo 20. Síntese de 5-TFA-metilaminometil-2-uridina (composto 13)
Figure img0174
[000634] Uridina 13-a foi protegida com isopropilideno para prover o composto 13-b e depois 5-hidroximetilada para prover o composto 13- c. Cloração e subsequente aminação proveram composto 13-e, que pode ser protegido para prover 13-f. Desproteção subsequente proveu composto 13.
[000635] Para obter o NTP correspondente, uma reação com trifosfato pode ser conduzida (por exemplo, qualquer uma descrita aqui). Opcionalmente, o NTP pode ser purificado (por exemplo, usando uma coluna Sephadex DEAE-A25), liofilizado ou evaporado (por exemplo, a partir de EtOH). Exemplo 21. Síntese de 5-carboximetilaminometil uridina (composto 14)
Figure img0175
[000636] Uridina 14-a foi protegida com isopropilideno para prover composto 14-b e então 5-aminoalquilada com a reação de Mannich para prover composto 14-c. Metilação proveu amina quaternária 14-d. As etapas de aminação e desproteção subsequentes podem ser usadas para prover composto 14. Para obter o NTP correspondente, uma reação de trifosfato pode ser conduzida (por exemplo qualquer uma descrita aqui). Opcionalmente, o NTP pode ser purificado (por exemplo, usando uma coluna Sephadex DEAE-A25), liofilizado ou evaporado (por exemplo, a partir de EtOH). Exemplo 22. Síntese alternativa de 5-metilaminometil-2-uridina (composto 12) e 5-carboximetilaminometil-2-uridina (composto 14)
Figure img0176
[000637] Além daquelas estratégias providas acima para os compostos 12 e 14, a estratégia a seguir pode também ser implementada. 5-Metiluridina A pode ser sililada para prover o composto B. Após monobrominação radical, o brometo intermediário resultante C pode ser usado para a preparação dos análogos do composto 12 e composto 14. Alquilaminação subsequente do composto brometo C poderia prover compostos D e E, os quais podem ser desprotegidos para prover compostos 14 e 12, respectivamente. Para obter o NTP correspondente, uma reação com trifosfato pode ser conduzida (por exemplo, qualquer uma descrita aqui). Opcionalmente, o NTP pode ser purificado (por exemplo, usando uma coluna Sephadex DEAE-A25), liofilizado ou evaporado (por exemplo, a partir de EtOH). ,Exemplo 23. Síntese de dimetil-pseudouridina (composto 15) e dimetil- pseudo-UTP (NTP do dito composto)
Figure img0177
[000638] Nucleosídeos podem ser fosforilados através de qualquer método útil. Por exemplo, como mostrado acima, nucleosídeos podem ser reagidos com oxicloreto fosforoso e subsequentemente tratados com um intermediário monofosfato com bis(tributilamonio)pirofosfato (TBAPP) para dar o trifosfato. Exemplo 24. Síntese de 2’-C-metil adenosina (composto 16) e 2’-C-metil ATP (NTP do dito composto)
Figure img0178
[000639] Cerca de 5 g de composto 16-2 foram preparados de 5 g de composto 16-1 via uma reação com periodinana de Dess-Martin. O composto 16-2 foi reagido com MeMgI/TiCl4/-78oC para prover o composto 16-3 e composto bruto 16-3 (6 g) foi diretamente reagido com cloreto de benzila para preparar o composto 16-4. Reação com a nucleobase e a desproteção proveram o composto 16 (0,56 g). Exemplo 25. Síntese de isômeros de 2’-C-metil-citidina (composto 17 e composto 18) e 2’-C-metil UTP (NTP dos ditos compostos)
Figure img0179
[000640] Cerca de 17,4 g de composto 17-3 foram preparados a partir de 20 g de composto 17-1. Então, 2’-oxidação e a alquilação com MeMgI proveram 300 mg de composto 17-5 a e 80 mg de composto 17-5b. Cerca de 9 g de composto 17-5a (cerca de 90% puro) e 2,1g de composto 17-5b (puro) foram preparados a partir de 17,4g de composto 17-3 em 2 bateladas. Desproteção N e O proveu os compostos 17 e 18. Exemplo 26. Síntese de 2’-C-metil guanosina (composto 19) e 2’-C-metil GTP (NTP do dito composto)
Figure img0180
[000641] 2’-Oxidação de ribose protegida 19-1 e alquilação subsequente com MeMgCl proveram composto 19-3. O composto resultante foi ainda protegido para prover o composto 19-4, e 1,56 g de composto 19-5a foi preparado a partir de 3,1 g de composto 19-4. Oxidação e desproteção subsequentes proveram composto 19 (cerca de 90% puro, 50 mg).
[000642] Para obter o NTP correspondente, uma reação com trifosfato pode ser conduzida (por exemplo, qualquer uma descrita aqui). Opcionalmente, o NTP pode ser purificado (por exemplo, usando uma coluna Sephadex DEAE-A25), liofilizado ou evaporado (por exemplo, a partir de EtOH). Exemplo 27. Síntese de 2’-C-metil uridina (composto 20) e 2’-C-metil UTP (NTP do dito composto)
Figure img0181
[000643] 2’-Oxidação de ribose 20-1 protegida e alquilação subsequente com MeMgCl proveram composto 20-3. O composto resultante foi ainda protegido para prover o composto 20-4. Reação com uracila e a desproteção proveram composto puro 20 (50 mg).
[000644] Para obter o NTP correspondente, uma reação com trifosfato pode ser conduzida (por exemplo, qualquer uma descrita aqui). Opcionalmente, o NTP pode ser purificado (por exemplo, usando uma coluna Sephadex DEAE-A25), liofilizado ou evaporado (por exemplo, a partir de EtOH). Exemplo 28. Síntese de (S)-2’-C-metil adenosina (composto 21) e (S)- 2’-C-metil ATP (NTP do dito composto)
Figure img0182
[000645] O Composto 21-1 (5 g) foi protegido para formar composto 21-2a, e a oxidação com cromo proveu composto 21-3a. Alquilação via rota [i] (MeMgI 5 eq. em éter a -50°C) proveu composto 21-4. Opcionalmente, o rendimento poderia ser melhorado via rota [ii] ao proteger o grupo amino para prover composto 21-3b e então alquilação na posição 2’-C para prover o composto 21-4a. Composto 21-3a foi alquilado para prover composto bruto 21-4 (3 g, 20% de composto 3a neste produto bruto), onde o produto pode ser opcionalmente purificado. A desproteção do composto 21-4 rendeu composto 21 (rendimento de 50%).
[000646] Para obter o NTP correspondente, uma reação com trifosfato pode ser conduzida (por exemplo, qualquer uma descrita aqui). Opcionalmente, o NTP pode ser purificado (por exemplo, usando uma coluna Sephadex DEAE-A25), liofilizado ou evaporado (por exemplo, a partir de EtOH). Exemplo 29. Síntese de (S)-2’-C-metil guanosina (composto 22) e (S)- 2’-metil GTP (NTP do dito composto)
Figure img0183
[000647] Cerca de 30 g do composto 22-1 foram sililados para prover composto 22-2 em três etapas. Proteção adicional proveu composto 223 e oxidação com periodinana de Dess-Martin proveu composto 22-4 (1,6 g) em duas bateladas. Alquilação 2’-C (MeMgI 5 eq. em éter, -50°C a TA) proveu composto 22-5 e etapas de desproteção adicionais proveram composto 22.
[000648] Para obter o NTP correspondente, uma reação com trifosfato pode ser conduzida (por exemplo, qualquer uma descrita aqui). Opcionalmente, o NTP pode ser purificado (por exemplo, usando uma coluna Sephadex DEAE-A25), liofilizado ou evaporado (por exemplo, a partir de EtOH). Exemplo 30. Síntese de (S)-2’-C-metil uridina (composto 23) e de (S)- 2’-C-metil UTP (NTP do dito composto)
Figure img0184
[000649] Uridina 23-1 (2,0 g) foi protegida com TIPDSCl2 (1,3-dicloro- 1,1,3,3-tetraisopropildisiloxano) para prover composto 23-2. Oxidação proveu composto 23-3 e alquilação 2’-C proveu composto 23-4, que pode ser opcionalmente purificado com Prep-HPLC antes da próxima etapa. Depois, a desproteção proveu o composto desejado 23.
[000650] Para obter o NTP correspondente, uma reação com trifosfato pode ser conduzida (por exemplo, qualquer uma descrita aqui). Opcionalmente, o NTP pode ser purificado (por exemplo, usando uma coluna Sephadex DEAE-A25), liofilizado ou evaporado (por exemplo, a partir de EtOH). Exemplo 31. Síntese de 4’-C-metil adenosina (composto 24) e 4’-C-metiI ATP (NTP do dito composto)
Figure img0185
[000651] 1,2:5,6-Di-O-isopropilideno-α-D-glucofuranose 24-1 foi convertido via etapas de oxidação, redução e proteção sequenciais para prover composto 24-4. A primeira etapa de oxidação para prover composto 24-2 pode ser implementada com quaisquer reagentes úteis, tais como de dicromato de piridínio 0,75 eq. (PDC) com Ac2O 1 eq. ou periodana de Dess-Martin1,2 eq. Desproteção, formilação e redução subsequentes proveram composto 24-7, o qual foi seguido com etapas de proteção e desoxigenação para prover o composto 24-10. Cerca de 0,4 g de composto 24-14 foi preparado a partir de 1 g de composto 2410 via etapas de proteção e desproteção sequenciais. Adição de N6- benzoiladenina e desproteção subsequente proveram composto 24.
[000652] Para obter o NTP correspondente, uma reação com trifosfato pode ser conduzida (por exemplo, qualquer uma descrita aqui). Opcionalmente, o NTP pode ser purificado (por exemplo, usando uma coluna Sephadex DEAE-A25), liofilizado ou evaporado (por exemplo, a partir de EtOH). Exemplo 32. Síntese de 4’-C-metil citidina (composto 25) e 4’-C-metil CTP (NTP do dito composto)
Figure img0186
[000653] Similar à estratégia provida acima para o composto 24, composto 25-14 foi produzido com composto 25-1. Adição de citidina e desproteção subsequente proveram o composto 25.
[000654] Para obter o NTP correspondente, uma reação com trifosfato pode ser conduzida (por exemplo, qualquer uma descrita aqui). Opcionalmente, o NTP pode ser purificado (por exemplo, usando uma coluna Sephadex DEAE-A25), liofilizado ou evaporado (por exemplo, a partir de EtOH). Exemplo 33. Síntese de 4’-C-metil guanosina (composto 26) e 4’-C-metil GTP (NTP do dito composto)
Figure img0187
[000655] Similar à estratégia provida acima para o composto 24,composto 26-14 foi produzido com composto 26-1. Adição de 2-amino- 6-cloropurina, oxidação subsequente e então desproteção proveram o composto 26.
[000656] Para obter o NTP correspondente, uma reação com trifosfato pode ser conduzida (por exemplo, qualquer uma descrita aqui). Opcionalmente, o NTP pode ser purificado (por exemplo, usando uma coluna Sephadex DEAE-A25), liofilizado ou evaporado (por exemplo, a partir de EtOH). Exemplo 34. Síntese de 4’-C-metil uridina (composto 27) e 4’-C-metil UTP (NTP do dito composto)
Figure img0188
Legenda: triflato, pirofosfato de tributilamônio, composto
[000657] Similar à estratégia provida acima para o composto 24, composto 27-14 foi produzido com composto 27-1. Adição de uracila e desproteção subsequente proveram o composto 27.
[000658] Para obter o NTP correspondente, uma reação com trifosfato pode ser conduzida (por exemplo, qualquer uma descrita aqui). Opcionalmente, o NTP pode ser purificado (por exemplo, usando uma coluna Sephadex DEAE-A25), liofilizado ou evaporado (por exemplo, a partir de EtOH). Exemplo 35. Síntese de 2’-O,4’-C-metileno adenosina (composto 28) e 2’-O,4’-C-metileno ATP (NTP do dito composto)
Figure img0189
Legenda: piridin
[000659] Similar à estratégia provida acima para o composto 24, composto 28-7 foi produzido com composto 28-1. Metilação, desproteção e acetilação subsequentes proveram composto 28-10, o qual foi seguido pela adição de N6-benzoiladenina e ciclização interna subsequente. Várias etapas de proteção e desproteção proveram composto 28. Exemplo 36. Síntese de 5-metil-2’-O,4’-C-metileno citidina (composto 29) e 5-metil-2’-O,4’-C-metileno CTP (NTP do dito composto)
Figure img0190
Legenda:triazol,
[000660] Composto aldofuranose 29-1 foi reagido por várias etapas de proteção, e então 5-metiluracila foi adicionada para prover composto 29 5. Etapas de ciclização, desproteção, proteção e aminação internas proveram o composto 29. Exemplo 37. Síntese de 2’-O,4’-C-metileno guanosina (composto 30) e 2’-O,4’-C-metileno GTP (NTP do dito composto)
Figure img0191
legenda: sem referência, etapa, base
[000661] Similar à estratégia provida acima para o composto 29, composto aldofuranose 30-1 foi reagido via várias etapas de proteção, e depois 2-amino-6-cloropurina foi adicionada para prover o composto 30-5. Etapas de ciclização, desproteção, proteção e aminação internas proveram composto 30.
[000662] Para obter o NTP correspondente, uma reação com trifosfato pode ser conduzida (por exemplo, qualquer uma descrita aqui). Opcionalmente, o NTP pode ser purificado (por exemplo, usando uma coluna Sephadex DEAE-A25), liofilizado ou evaporado (por exemplo, a partir de EtOH)., Exemplo 38. Síntese de 2’-O,4’-C-metileno uridina (composto 31) e 2’- O,4’-C-metileno UTP (NTP do dito composto)
Figure img0192
[000663] Similar à estratégia provida acima para o composto 24, composto 31-7 foi produzido com composto 31-1. Mesilação, desproteção e acetilação subsequentes proveram composto 30-10. Adição de uracila e a ciclização interna subsequente proveram composto 31-12, e várias etapas de proteção e desproteção proveram o composto 31. Uma reação de trifosfato subsequente (por exemplo, conforme aqui descrito) proveu o NTP do composto 31, o qual pode ser opcionalmente purificado (por exemplo, com HPLC). Exemplo 39. Síntese de 2’-cloro adenosina (composto 32) e 2’-cloro ATP (NTP do dito composto)
Figure img0193
Legenda: tetra-isopropildissiloxano,
[000664] Arabinoadenosina 32-1 foi protegida via etapas 1 e 2 e então clorada para prover o composto 32-4. Desproteção subsequente proveu composto 32, e a reação com trifosfato proveu o NTP do composto 32. Exemplo 40. Síntese de 2’-iodo adenosina (composto 33) e 2’-iodo ATP (NTP do dito composto)
Figure img0194
[000665] Arabinoadenosina 33-1 foi protegida via etapas 1 e 2 e então iodada para prover o composto 33-4. Desproteção subsequente proveu composto 33, e a reação com trifosfato em DMF proveu o NTP do composto 33. Exemplo 41. Síntese de 2’-bromo citidina (composto 34) e 2’-bromo CTP(NTP do dito composto)
Figure img0195
[000666] Arabinocitidina 34-1 foi protegida sob várias condições e então bromada para prover o composto 34-4. Opcionalmente, a reação pode prover composto 34-4 via composto 34-3a sob quaisquer reações de proteção úteis, tais como (i) Et3N 1,5 eq., DMAP 1 eq., TfCl 1,2 eq., em DCM (10 mL); (ii) DMAP 3 eq., TfCl 1,2 eq. em DCM (15 mL); ou (iii) DMAP 15 eq., Tf2O 1,5 eq., em DCM (15mL) a -10°C até 0°C por 2 horas. Em particular, 55 mg de composto 34-3a foram obtido a partir da condição de reação (iii). Desproteção subsequente proveu o composto 34, e a reação de trifosfato em DMF proveu o NTP do composto 34. Produto bruto 34 poderia ser opcionalmente purificado antes da fosforilação. Exemplo 42. Síntese de 2’-cloro guanosina (composto 35) e 2’-cloro GTP (NTP do dito composto)
Figure img0196
[000667] Guanosina 35-1 foi protegida sob várias condições e então acetilada para prover composto 35-4. A reação a partir do composto 352 para composto 35-3 foi conduzida com DMAR 2 eq., Et3N 2 eq., Tf2O 3 eq. em 1,2-dicloroetano (10 mL) a 40°C por 4 horas. Cerca de 55 mg de composto 35-3 foram obtidos após a purificação.
[000668] O composto desejado 35 pode ser obtido através de qualquer método útil. Ror exemplo, como mostrado acima, o composto 35-4 pode ser tratado com etapas de proteção, cloração e desproteção subsequentes para prover o composto 35. Rara obter o NTR correspondente, uma reação de trifosfato pode ser conduzida (por exemplo, qualquer uma descrita aqui). Opcionalmente, o NTR pode ser purificado (por exemplo, usando uma coluna Sephadex DEAE-A25), liofilizado ou evaporado (por exemplo, a partir de EtOH). Exemplo 43. Síntese de 2’-iodo uridina (composto 36) e 2’-iodo UTR (NTP do dito composto
Figure img0197
[000669] O2,2‘-Ciclouridina 36-1 foi protegida para prover composto 36-2. Iodação subsequente, opcionalmente mediada com selênio, proveu composto 36. Uma reação com trifosfato foi conduzida para prover o NTP do composto 36. Opcionalmente, o NTP pode ser purificado (por exemplo, usando uma coluna Sephadex DEAE-A25), liofilizado ou evaporado (por exemplo, a partir de EtOH). Exemplo 44. Síntese de 2’-O,4‘-C-metileno adenosina (composto 37) e 2’-O,4‘-C-metileno ATP (NTP do dito composto)
Figure img0198
[000670] Similar à estratégia provida acima para o composto 24, composto 37-7 foi produzido com composto 37-1. Mesilação, desproteção e acetilação subsequentes proveram o composto 37-10. Adição de uracila e ciclização interna subsequente proveram composto 37-12. Várias etapas de proteção e desproteção proveram o composto 37.
[000671] Para obter o NTP correspondente, uma reação com trifosfato pode ser conduzida (por exemplo, qualquer uma descrita aqui). Opcionalmente, o NTP pode ser purificado (por exemplo, usando uma coluna Sephadex DEAE-A25), liofilizado ou evaporado (por exemplo, a partir de EtOH). Exemplo 45. Síntese de ciclopenteno diol citidina (composto 38) e ciclopentene diol CTP (NTP do dito composto)
Figure img0199
[000672] D-ribose foi protegida e então alilada para prover composto 38-4, que foi subsequentemente ciclizado e reduzido para prover composto 38-7. Metátese de olefina e subsequente oxidação proveram composto 38-9, e reações de redução e adição adicionais de N- benzoiluracila proveram composto 38-14. Reações de desproteção e proteção adicionais proveram composto 38, e a reação de trifosfato (por exemplo, com qualquer condição de reação útil, tais como aquelas descritas aqui ou na Patente Norte-americana No. 7.893.227, incorporada aqui a título de referência) proveu o NTP do composto 38. Exemplo 46. Síntese de 2’-metil uridina (composto 39) e 2’-metil UTP (NTP do dito composto)
Figure img0200
[000673] Uridina 39-1 foi protegida e depois oxidada com 2 eq. de periodinana de Dess-Martin para prover composto 39-3. Etapas de reação de Wittig, hidrogenação e de desproteção subsequentes proveram o composto 39. Exemplo 47. Síntese de 2’-metil citidina (composto 40) e 2’-metil CTP (NTP do dito composto)
Figure img0201
[000674] Citidina 40-1 foi protegida e depois oxidada para prover composto 40-3. Etapas de reação de Wittig, hidrogenação e desproteção subsequentes proveram o composto 40. Exemplo 48. Síntese de N-acetil citidina (composto 41) e N-acetil CTP (NTP do dito composto)
Figure img0202
Legenda: esponja de prótons, pirofosfato bis(tributilamônio), tampão TEAB, massa exata
[000675] Uma solução de N-acetil-citidina (composto 41) (103,0 mg, 0,36 mmol) foi adicionada à esponja de prótons (115,72 mg, 0,54 mmol, 1,50 equiv.) em 1,0 mL de trimetilfosfato (TMP) e 1,0 mL de tetra- hidrofurano anidro (THF). A solução foi agitada por 10 minutos a 0°C. Oxicloreto fosforoso (POCl3) (67,2 ul, 0,72 mmol, 2,0 equiv.) foi adicionado em gotas à solução antes de ser mantida em agitação por 2 horas sob atmosfera de N2. Após 2 horas, a solução foi reagida com uma mistura de pirofosfato de bistributilamônio (TBAPP ou (n-Bu3NH)2H2P2O7) (1,28 g, 2,34 mmol, 6,5 equiv.) e tributilamina (350,0 ul, 1,45 mmol, 4,0 equiv.) em 2,5 ml de dimetilformamida. Após aproximadamente 15 minutos, a reação foi extinta com 24,0 ml de bicarbonato de trietilamônio 0,2M (TEAB) e a solução clara foi agitada em temperatura ambiente por uma hora. A mistura de reação foi liofilizada durante a noite e a mistura de reação bruta foi purificada por HPLC (Shimadzu, Kyoto Japan, coluna preparativa Phenomenex C18 , 250 x 21,20 mm, 10,0 mícrons; gradiente: A 100% por 3,0 min, então B 1%/min, A = 100 mM tampão TEAB, B = ACN; taxa de fluxo: 10,0 mL/min; tempo de retenção: 16,81-17,80 min). Frações que contêm o composto desejado foram agrupadas e liofilizadas para produzir o NTP do composto 41. As reações de trifosforilação foram realizadas em um frasco de dois gargalos seco sob chamada sob uma atmosfera de N2. Nucleosídeos e a esponja de proteína foram secos sob P2O5 sob vácuo durante a noite antes do uso. A formação de monofosfatos foi monitorada por LCMS. Exemplo 49. Síntese de 5-metoxiuridina (composto 42) e 5-metóxi UTP (NTP do dito composto)
Figure img0203
[000676] Uma solução de 5-metoxiuridina (composto 42) (69,0 mg, 0,25 mmol, mais calor para torná-la solúvel) foi adicionada à esponja de prótons (80,36 mg, 0,375 mmol, 1,50 equiv.) em 0,7 mL de trimetilfosfato (TMP) e foi agitada por 10 minutos a 0°C. Oxicloreto fosforoso (POCI3) (46.7 ul, 0,50 mmol, 2,0 equiv.) foi adicionado em gotas à solução antes de manter em agitação por 2 horas sob atmosfera N2. Após 2 horas, a solução foi reagida com uma mistura de pirofosfato de bistributilamônio (TBAPP ou (n-Bu3NH)2H2P2O7) (894,60 mg, 1,63 mmol, 6,50 equiv.) e tributilamina (243,0 ul, 1,00 mmol, 4,0 equiv.) em 2,0 ml de dimetilformamida. Após aproximadamente 15 minutos, a reação foi extinta com 17.0 ml de bicarbonato de trietilamônio 0,2 M (TEAB) e a solução clara foi agitada em temperatura ambiente por uma hora. A mistura de reação foi liofilizada durante a noite e a mistura de reação bruta foi purificada por HPLC (Shimadzu, Kyoto Japan, coluna preparativa Phenomenex C18, 250 x 21,20 mm, 10,0 mícrons; gradiente: A 100% por 3,0 min, então B 1%/min, A = tampão TEAB 100 mM , B = ACN; taxa de fluxo: 10,0 mL/min; tempo de retenção: 16,57-17,51 min). Frações que contêm o composto desejado foram agrupadas e liofilizadas para produzir o NTP do composto 42. As reações de trifosforilação foram realizadas em um frasco de dois gargalos seco sob chama sob uma atmosfera de N2. Nucleosídeos e a esponja de proteína foram secos sob P2O5 sob vácuo durante a noite antes do uso. A formação de monofosfatos foi monitorada por LCMS. Exemplo 50. Síntese de 5-formil citidina (composto 43) e 5-formil CTP (NTP do dito composto)
Figure img0204
[000677] Uma solução de 5-formil citidina (composto 43) (48,4 mg, 0,18 mmol, mais calor para torná-la solúvel) foi adicionada à esponja de prótons (57,86 mg, 0,27 mmol, 1,50 equiv.) em 0,7 mL de trimetilfosfato (TMP) e foi agitada por 10 minutos a 0°C. Oxicloreto fosforoso (POCI3) (33,6 ul, 0,36 mmol, 2,0 equiv.) foi adicionado em gotas à solução antes de ser mantida em agitação por 2 horas sob atmosfera de N2. Após 2 horas, a solução foi reagida com uma mistura de pirofosfato de bistributilamônio (TBAPP ou (n-Bu3NH)2H2P2O7) (642,0 mg, 1,17 mmol, 6,50 equiv.) e tributilamina (175,0 ul, 0,72 mmol, 4.0 equiv.) em 1,7 ml de dimetilformamida. Após aproximadamente 15 minutos, a reação foi extinta com 12,0 ml de bicarbonato de trietilamônio 0,2M (TEAB) e a solução clara foi agitada em temperatura ambiente por uma hora. A mistura de reação foi liofilizada durante a noite e a mistura de reação bruta foi purificada por HPLC (Shimadzu, Kyoto Japan, coluna preparativa Phenomenex C18, 250 x 21,20 mm, 10,0 mícrons; gradiente: A 100% por 3,0 min, então B 1%/min, A = tampão TEAB 100 mM, B = ACN; taxa de fluxo: 10,0 mL/min; tempo de retenção: 17.04-17.87 min). Frações que contêm o composto desejado foram agrupadas e liofilizadas para prover o NTP do composto 43. As reações de trifosforilação foram realizadas em um frasco de dois gargalos seco sob chama sob uma atmosfera de N2. Nucleosídeos e a esponja de proteína foram secos sob P2O5 sob vácuo durante a noite antes do uso. A formação de monofosfatos foi monitorada por LCMS. Exemplo 51. Síntese de 3-metil uridina (composto 44) e 3-metil UTP (NTP do dito composto)
Figure img0205
[000678] Uma solução de 3-metil uridina (composto 44) (45,80 mg, 0,18 mmol) foi adicionada à esponja de prótons (57,86 mg, 0,27 mmol, 1,50 equiv.) em 0,5 mL de trimetilfosfato (TMP) e foi agitada por 10 minutos a 0°C. Oxicloreto fosforoso (POCh) (33,6 ul, 0,36 mmol, 2,0 equiv.) foi adicionado em gotas à solução antes de ser mantida em agitação por 2 horas sob atmosfera de N2. Após 2 horas, a solução foi reagida com uma mistura de pirofosfato de bistributilamônio (TBAPP ou (n-Bu3NH)2H2P2O7) (652,0 mg, 1,19 mmol, 6,60 equiv.) e tributilamina (175,0 ul, 0,72 mmol, 4,0 equiv.) em 1,3 ml de dimetilformamida. Após aproximadamente 15 minutos, a reação foi extinta com 12,0 ml de bicarbonato de trietilamônio 0,2M (TEAB) e a solução clara foi agitada em temperatura ambiente por uma hora. A mistura de reação foi liofilizada durante a noite e mistura de reação bruta foi purificada por HPLC (Shimadzu, Kyoto Japan, coluna preparativa Phenomenex C18, 250 x 21,20 mm, 10,0 mícrons; gradiente: A 100% por 3,0 min, então B 1%/min, A = tampão TEAB 100 mM, B = ACN; taxa de fluxo: 10,0 mL/min; tempo de retenção: 18,52-19,57 min). Frações que contêm o composto desejado foram agrupadas e liofilizadas para prover o NTP do composto 44. As reações de trifosforilação foram realizadas em um frasco de dois gargalos seco sob chama sob uma atmosfera de N2. Nucleosídeos e a esponja de proteína foram secos sob P2O5 sob vácuo durante a noite antes do uso. A formação de monofosfatos foi monitorada por LCMS. Exemplo 52. Síntese de N1-metil pseudouridina (composto45) e N1- metil pseudoUTP (NTP do dito composto)
Figure img0206
[000679] Uma solução de N1-metil pseudouridina (composto 45) (96,6 mg, 0,374 mmol, mais calor para torná-la solúvel) foi adicionada à esponja de prótons (120,0 mg, 0,56 mmol, 1,50 equiv.) em 0,8 mL de trimetilfosfato (TMP) e foi agitada por 10 minutos a 0°C. Oxicloreto fosforoso (POCl3) (70,0 ul, 0,75 mmol, 2,0 equiv.) foi adicionado em gotas à solução antes de ser mantida em agitação por 2 horas sob atmosfera de N2. Após 2 horas, a solução foi reagida com uma mistura de pirofosfato de bistributilamônio (TBAPP ou (n-Bu3NH)2H2P2O7) (1,36 g, 2,47 mmol, 6,60 equiv.) e tributilamina (362,0 ul, 1,5 mmol, 4,0 equiv.) em 2,5 ml de dimetilformamida. Após aproximadamente 15 minutos, a reação foi extinta com 17.0 ml de bicarbonato de trietilamônio (TEAB) 0,2M e a solução clara foi agitada em temperatura ambiente por uma hora. A mistura de reação foi liofilizada durante a noite e a mistura de reação bruta foi purificada por HPLC (Shimadzu, Kyoto Japan, coluna preparativa Phenomenex C18, 250 x 21,20 mm, 10,0 mícrons; gradiente: A 100% por 3,0 min, então B 1%/min, A = tampão TEAB 100 mM, B = ACN; taxa de fluxo: 10,0 mL/min; tempo de retenção: 15,91-17,01 min). Frações que contêm o composto desejado foram agrupadas e liofilizadas e submetidas a uma reação de trifosforilação para prover o NTP do composto 45. As reações de trifosforilação foram realizadas em um frasco de dois gargalos seco sob chama sob uma atmosfera de N2. Nucleosídeos e a esponja de proteína foram secos sob P2O5 sob vácuo durante a noite antes do uso. A formação de monofosfatos foi monitorada por LCMS. Exemplo 53. Síntese de 5-metoxicarboniletenil uridina (composto 46) e 5-metoxicarboniletenil UTP (NTP do dito composto)
Figure img0207
[000680] Uma solução de 5-metoxicarboniletenil uridina (composto 46) (102,0 mg, 0,31 mmol) foi adicionada à esponja de próton (99,65 mg, 0,46 mmol, 1,50 equiv.) em 0,8 mL de trimetilfosfato (TMP) e foi agitada por 10 minutos a 0 °C. Oxicloreto fosforoso (POCI3) (57,8 ul, 0,62 mmol, 2,0 equiv.) foi adicionado em gotas à solução antes de ser mantida em agitação por 2 horas sob atmosfera de N2. Após 2 horas, a solução foi reagida com uma mistura de pirofosfato de bistributilamônio (TBAPP ou (n-Bu3NH)2H2P2O7) (1,12 g, 2,05 mol, 6,60 equiv.) e tributilamina (300,0 ul, 1,24 mmol, 4.0 equiv.) em 2,5 ml de dimetilformamida. Após aproximadamente 15 minutos, a reação foi extinta com 20,0 ml de bicarbonato de trietilamônio 0,2 M (TEAB) e a solução clara foi agitada em temperatura ambiente por uma hora. A mistura de reação foi liofilizada durante a noite e a mistura de reação bruta foi purificada por HPLC (Shimadzu, Kyoto Japan, coluna preparativa Phenomenex C18, 250 x 21,20 mm, 10,0 mícrons; gradiente: A 100% por 3,0 min, então B 1%/min, A = tampão TEAB 100 mM, B = ACN; taxa de fluxo: 10,0 mL/min; tempo de retenção: 21,56-23,21 min). Frações que contêm o composto desejado foram agrupadas e liofilizadas para prover o NTP do composto 46. As reações de trifosforilação foram realizadas em um frasco de dois gargalos seco sob chama sob uma atmosfera de N2. Nucleosídeos e a esponja de proteína foram secos sob P2O5 sob vácuo durante a noite antes do uso. A formação de monofosfatos foi monitorada por LCMS. Exemplo 54. Síntese de 5-aminopropenil uridina (composto 47) e 5- aminopropenil UTP (NTP do dito composto)
Figure img0208
[000681] 5-Aminopropenil uridina 47 foi protegida e uma solução de composto protegido 47 (86,0 mg, 0,22 mmol) foi adicionada à esponja de prótons (70,7 mg, 0,33 mmol, 1,50 equiv.) em 0,7 mL de trimetilfosfato (TMP) e foi agitada por 10 minutos a 0 °C. Oxicloreto fosforoso (POCl3) (41,1 ul, 0,44 mmol, 2,0 equiv.) foi adicionado em gotas à solução antes de ser mantida em agitação por 2 horas sob atmosfera de N2. Após 2 horas, a solução foi reagida com uma mistura de pirofosfato de bistributilamônio (TBAPP ou (n-Bu3NH)2H2P2O7) (784.6 mg, 1,43 mmol, 6,50 equiv.) e tributilamina (213.0 ul, 0,88 mmol, 4.0 equiv.) em 1,6 ml de dimetilformamida. Após aproximadamente 15 minutos, a reação foi extinta com 15,0 ml de bicarbonato de trietilamônio 0,2 M (TEAB) e a solução clara foi agitada em temperatura ambiente por uma hora. 18.0 ml de hidróxido de amônio concentrado foram adicionados à mistura de reação para remover o grupo trifluoracetila. Ela foi então armazenada em agitação durante a noite. A mistura de reação foi liofilizada durante a noite e a mistura de reação bruta foi purificada por HPLC (Shimadzu, Kyoto Japan, coluna preparativa Phenomenex C18, 250 x 21,20 mm, 10,0 mícrons; gradiente: A 100% por 3,0 min, então B 1%/min, A = tampão TEAB 100 mM, B = ACN; taxa de fluxo: 10,0 mL/min; tempo de retenção: 16,14-17,02 min). Frações que contêm o composto desejado foram agrupadas e liofilizadas para prover o NTP do composto 47. As reações de trifosforilação foram realizadas em um frasco de dois gargalos seco sob chama sob uma atmosfera de N2. Nucleosídeos e a esponja de proteína foram secos sob P2O5 sob vácuo durante a noite antes do uso. A formação de monofosfatos foi monitorada por LCMS. Exemplo 55. Síntese de N-PEG adenosina (composto 48) e N-PEG ATP (NTP do dito composto)
Figure img0209
[000682] N-PEG adenosina 48 foi protegida e uma solução do composto protegido 48 (100,0 mg, 0,15 mmol) foi adicionada à esponja de próton (49,3 mg, 0,23 mmol, 1,50 equiv.) em 0,65 mL de trimetilfosfato (TMP) e foi agitada por 10 minutos a 0°C. Oxicloreto fosforoso (POCl3) (28,0 ul, 0,3 mmol, 2,0 equiv.) foi adicionado em gotas à solução antes de manter em agitação por 2 horas sob atmosfera N2. Após 2 horas, a solução foi reagida com uma mistura de pirofosfato de bistributilamônio (TBAPP ou (n-Bu3NH)2H2P2O7) (537,7 mg, 0,98 mmol, 6,50 equiv.) e tributilamina (146,0 ul, 0,6 mmol, 4,0 equiv.) em 1,2 ml de dimetilformamida. Após aproximadamente 15 minutos, a reação foi extinta com 10,0 mL de bicarbonato de trietilamônio 0,2 M (TEAB) e a solução clara foi agitada em temperatura ambiente por uma hora. 18.0 ml de hidróxido de amônio concentrado foram adicionados à mistura de reação para remover o grupo trifluoracetila. Ela foi então armazenada em agitação durante a noite. A mistura de reação foi liofilizada durante a noite e a mistura de reação bruta foi purificada por HPLC (Shimadzu, Kyoto Japan, coluna preparativa Phenomenex C18, 250 x 21,20 mm, 10,0 mícrons; gradiente: A 100% por 3,0 min, então B 1%/min, A = tampão TEAB 100 mM, B = ACN; taxa de fluxo: 10,0 mL/min; tempo de retenção: 24,5-25,5 min). Frações que contêm o composto desejado foram agrupadas e liofilizadas para prover o NTP do composto 48. As reações de trifosforilação foram realizadas em um frasco de dois gargalos seco sob chama sob uma atmosfera de N2. Nucleosídeos e a esponja de proteína foram secos sob P2O5 sob vácuo durante a noite antes do uso. A formação de monofosfatos foi monitorada por LCMS. Exemplo 56. Síntese de N-metil adenosina (composto 49) e N-metil ATP (NTP do dito composto)
Figure img0210
[000683] Uma solução de N-metil adenosina (composto 49) (70,0 mg, 0,25 mmol) foi adicionada à esponja de prótons (79,29 mg, 0,37 mmol, 1,50 equiv.) em 0,7 mL de trimetilfosfato (TMP) e foi agitada por 10 minutos a 0°C. Oxicloreto fosforoso (POCh) (46,66 ul, 0,50 mmol, 2,0 equiv.) foi adicionado em gotas à solução antes de ser mantida em agitação por 2 horas sob atmosfera N2. Após 2 horas, a solução foi reagida com uma mistura de pirofosfato de bistributilamônio (TBAPP ou (n-Bu3NH)2H2P2O7) (888,85 mg, 1,62 mmol, 6,50 equiv.) e tributilamina (241,0 ul, 1,0 mmol, 4,0 equiv.) em 1,3 ml de dimetilformamida. Após aproximadamente 15 minutos, a reação foi extinta com 16,0 ml de bicarbonato de 0,2 M trietilamônio (TEAB) e a solução clara foi agitada em temperatura ambiente por uma hora. A mistura de reação foi liofilizada durante a noite e a mistura de reação bruta foi purificada por HPLC (Shimadzu, Kyoto Japan, coluna preparativa Phenomenex C18, 250 x 21,20 mm, 10,0 mícrons; gradiente: A 100% por 3,0 min, então B 1%/min, A = tampão TEAB 100 mM, B = ACN; taxa de fluxo: 10,0 mL/min; tempo de retenção: 19.62-20.14 min). Frações que contêm o composto desejado foram agrupadas e liofilizadas para prover o NTP do composto 49. As reações de trifosforilação foram realizadas em um frasco de dois gargalos seco sob chama sob uma atmosfera de N2. Nucleosídeos e a esponja de proteína foram secos sob P2O5 sob vácuo durante a noite antes do uso. A formação de monofosfatos foi monitorada por LCMS. Exemplo 57. Síntese de N,N-dimetil guanosina (composto 50) e N,N- dimetil GTP (NTP do dito composto)
Figure img0211
[000684] Uma solução de N,N-dimetil guanosina (composto 50) (65,8 mg, 0,21 mmol) foi adicionada à esponja de prótons (68,58 mg, 0,32 mmol, 1,50 equiv.) em 0,7 mL de trimetilfosfato (TMP) e foi agitada por 10 minutos a 0°C. Oxicloreto fosforoso (POCI3) (39,20 ul, 0,42 mmol, 2,0 equiv.) foi adicionado em gotas à solução antes de ser mantida em agitação por 2 horas sob atmosfera N2. Após 2 horas, a solução foi reagida com uma mistura de pirofosfato de bistributilamônio (TBAPP ou (n-Bu3NH)2H2P2O?) (751,67 mg, 1,37 mmol, 6,50 equiv.) e tributilamina (204,0 ul, 0,84 mmol, 4,0 equiv.) em 1,5 ml de dimetilformamida. Após aproximadamente 15 minutos, a reação foi extinta com 14,0 ml de bicarbonato de trietilamônio 0,2M (TEAB) e a solução clara foi agitada em temperatura ambiente por uma hora. A mistura de reação foi liofilizada durante a noite e a mistura de reação bruta foi purificada por HPLC (Shimadzu, Kyoto Japan, coluna preparativa Phenomenex C18, 250 x 21,20 mm, 10,0 mícrons; gradiente: A 100% por 3,0 min, então B 1%/min, A = tampão TEAB 100 mM, B = ACN; taxa de fluxo: 10,0 mL/min; tempo de retenção: 19.27-19.95 min). Frações que contêm o composto desejado foram agrupadas e liofilizadas para prover o NTP do composto 50. As reações de trifosforilação foram realizadas em um frasco de dois gargalos seco sob chama sob uma atmosfera de N2. Nucleosídeos e a esponja de proteína foram secos sob P2O5 sob vácuo durante a noite antes do uso. A formação de monofosfatos foi monitorada por LCMS. Exemplo 58. Métodos gerais para a síntese de trifosfato de NTPS
Figure img0212
[000685] O nucleosídeo i pode ser fosforilado através de qualquer método útil para prover um composto ii trifosfato. Por exemplo, o nucleosídeo pode ser adicionado à esponja de prótons e trimetilfosfato (TMP) e resfriado (por exemplo a -40°C). Oxicloreto fosforoso (POCl3) pode ser adicionado em gotas antes de reagir com pirofosfato de bistributilamônio (TBAPP ou (n-Bu3NH)2H2P2O7) e tributilamina. A reação pode ser rapidamente extinta com bicarbonato de trietilamônio (TEAB). Condições exemplares são providas na Patente Norte- americana No. 7.893.227, que é incorporada aqui a título de referência.
[000686] Após a reação de fosforilação, a mistura de reação pode ser opcionalmente liofilizada, purificada (por exemplo, por cromatografia de troca de íon e/ou HPLC) ou convertida em um sal de sódio (por exemplo, dissolvendo em MeOH e adicionando perclorato de sódio em acetona).
Exemplo 59: PCR para produção de cDNA
[000687] Procedimentos de PCR para a preparação de cDNA são realizados usando 2x KAPA HIFI® HotStart ReadyMix da Kapa Biosystems (Woburn, MA). Esse sistema inclui 2x KAPA ReadyMix 12,5 μl; Iniciador avançado (10 uM) 0,75 μl; Iniciador Reverso (10 uM) 0,75 μl; cDNA Modelo 100 ng; e dH20 diluído para 25,0 μl. As condições da reação são a 95° C por 5 min e 25 ciclos de 98° C por 20 s, então 58° C por 15 seg, então 72° C por 45 seg, então 72° C por 5 min, então 4° C até o fim.
[000688] O iniciador reverso da presente invenção incorpora uma poli- T120 para uma poli-A120 no mRNA. Outros iniciadores reversos com tratos Poli-T mais longos ou mais curtos podem ser usados para ajustar o comprimento da cauda poli-A no mRNA.
[000689] A reação é limpa usando PURELINK® PCR Micro Kit da Invitrogen (Carlsbad, CA) conforme instruções do fabricante (até 5 μg). Reações maiores necessitarão uma limpeza usando um produto com uma capacidade maior. Após a limpeza, o cDNA é quantificado usando o NanoDrop e analisado através de eletroforese em gel de agarose para confirmar se o cDNA é do tamanho esperado. O cDNA é então submetido à análise de sequenciamento antes de prosseguir para a reação de transcrição in vitro.
Exemplo 60. Transcrição In vitro (IVT)
[000690] A reação de transcrição in vitro gera mRNA contendo nucleotídeos modificados ou RNA modificado. A mistura de trifosfato de nucleotídeo (NTP) de entrada é feita internamente usando NTPs naturais e não-naturais.
[000691] Uma reação de transcrição in vitro típica inclui o seguinte: Modelo de cDNA 1,0 μg 10x tampão de transcrição (Tris-HCl 400 mM pH 8,0, 2,0 μl MgCl2190 mM, DTT 50 mM, Espermidina 10 mM) NTPs customizados (25mM cada 7,2 μl Inibidor de RNase 20 U Polimerase de RNA T7 3000 U dH20 até 20,0 μl
[000692] Incubação a 37° C por 3 hr-5 h.
[000693] A mistura IVT bruta pode ser armazenada a 4° C durante a noite para limpeza no dia seguinte. 1 U de DNase livre de RNase é então usado para digerir o modelo original. Após 15 minutos de incubação a 37° C, o mRNA é purificado usando MEGACLEAR® Kit da Ambion (Austin, TX) seguindo as instruções do fabricante. Este kit pode purificar até 500 μg de RNA. Seguindo a limpeza, o RNA é quantificado usando o NanoDrop e analisado por eletroforese em gel agarose para confirmar que o RNA está no tamanho apropriado e que nenhuma degradação do RNA tenha ocorrido.
[000694] A polimerase de RNA T7 pode ser selecionada a partir de polimerase de RNA T7, polimerase de RNA T3 e polimerases mutantes tais como, mas não limitado a, as novas polimerases capazes de incorporar NTPs modificados assim como aquelas polimerases descritas por Liu (Esvelt e outros (Nature (2011) 472(7344):499-503 e publicação Norte-americana No. 20110177495) a qual reconhece promotores alternativos, Ellington (Chelliserrykattil e Ellington, Nature Biotechnology (2004) 22(9):1155-1160) descrevendo uma polimerase de RNA T7 variante para transcrever 2’-O-methyl RNA e Sousa (Padilla e Sousa, Nucleic Acids Research (2002) 30(24): e128) descrevendo uma polimerase de RNA T7 dupla mutante; aqui incorporada a título de referência em sua totalidade.
Exemplo 61. Capeamento enzimático de mRNA
[000695] Capeamento do mRNA é realizado como a seguir onde a mistura inclui: RNA IVT 60 μg-180μg e dH20 até 72 μl. A mistura é incubada a 65° C por 5 minutos para desnaturar o RNA e depois é transferida imediatamente para gelo.
[000696] O protocolo então envolve a mistura de 10x de Tampão de Capeamento (Tris-HCl 0,5 M (pH 8,0), KC l60 mM, 12,5 mM de MgCl2) (10,0 μl); GTP 20 mM (5,0 μl); S-Adenosil Metionina 20 mM (2,5 μl); inibidor de RNase (100 U); 2-O-Metiltransferase (400U); enzima de capeamento de Vaccínia (Guanilil transferase) (40 U); dH20 (até 28 μl); e incubação a 37° C por 30 minutos para 60 μg de RNA ou até 2 horas para 180 μg de RNA.
[000697] O mRNA é então purificado usando kit da Ambion MEGACLEAR® (Austin, TX) seguindo as instruções do fabricante. Após a limpeza, o RNA é quantificado usando o NANODROP® (ThermoFisher, Waltham, MA) e analisado por eletroforese em gel de agarose para confirmar que o RNA está no tamanho apropriado e nenhuma degradação do RNA tenha ocorrido. O produto de RNA pode também ser sequenciado ao realizar uma PCR para gerar o cDNA para sequenciamento.
Exemplo 62. Reação de Formação da Cauda Poli-A
[000698] Sem um poli-T no cDNA, uma reação formação da poli-A deve ser realizada antes da limpeza do produto final. Isso é feito ao misturar RNA capeado IVT (100 μl); Inibidor de RNase (20 U); 10x Tampão de formação da cauda (Tris-HCl 0,5 M (pH 8,0), NaCl 2,5 M, MgCl2 100 mM)(12,0 μl); ATP 20 mM (60 μl); Polimerase de Poli-A (20 U); dH20 até 1235 μl e incubação a 37° C por 30 min. Se a cauda poli-A já estiver no transcrito, então a reação de formação da cauda pode ser omitida e prosseguir diretamente para limpeza com o kit da Ambion MEGACLEAR® (Austin, TX) (até 500 μg). Polimerase de Poli-A é de preferência uma enzima recombinante expressa em levedura.
[000699] Para estudos realizados e descritos aqui, a cauda poli-A é codificada no modelo IVT para compreender 160 nucleotídeos de comprimento. No entanto, deve ser entendido que a capacidade de processamento ou integridade da reação de formação da cauda poli-A pode nem sempre resultar em exatamente 160 nucleotídeos. Portanto, caudas poli-A de aproximadamente 160 nucleotídeos, por exemplo, cerca de 150-165, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164 ou 165 estão dentro do escopo da invenção.
Exemplo 63. Método de Avaliação para Expressão de Proteínas A. Ionização por Eletropulverização
[000700] Uma amostra biológica que pode conter proteínas codificadas por RNA modificado administrada ao indivíduo é preparada e analisada de acordo com o protocolo do fabricante para ionização por eletropulverização (ESI) usando 1, 2, 3 ou 4 analisadores de massa. Uma amostra biológica pode também ser analisada usando um sistema de espectrometria de massa ESI em tandem.
[000701] Padrões de fragmentos de proteína, ou proteínas inteiras, são comparados a controles conhecidos quanto a uma dada proteína e a identidade é determinada por comparação.
B. Dessorção/Ionização a Laser Auxiliada por Matriz
[000702] Uma amostra biológica que pode conter proteínas codificadas por RNA modificado administrada ao indivíduo é preparada e analisada de acordo com o protocolo do fabricante para dessorção/ionização a laser auxiliada por matriz (MALDI).
[000703] Padrões de fragmentos de proteína, ou proteínas inteiras, são comparados a controles conhecidos quanto uma dada proteína e a identidade é determinada por comparação.
C. Cromatografia líquida-Espectrometria de Massa-Espectrometria de Massa
[000704] Uma amostra biológica, a qual pode conter proteínas codificadas por RNA modificado, pode ser tratada com uma enzima tripsina para digerir as proteínas contidas nela. Os peptídeos resultantes são analisados por cromatografia líquida-espectrometria de massa- espectrometria de massa (LC/MS/MS). Os peptídeos são fragmentados no espectrômetro de massa para fornecer padrões de diagnóstico que podem ser compatíveis com bancos de dados de sequência de proteína através de algoritmos de computador. A amostra digerida pode ser diluída para obter 1 ng ou menos do material de partida para uma dada proteína. Amostras biológicas que contêm uma base de tampão simples (por exemplo água ou sais voláteis) são condescendentes à digestão em solução direta; bases mais complexas (por exemplo detergente, sais não-voláteis, glicerol) requerem uma etapa de limpeza para facilitar a análise da amostra.
[000705] Padrões de fragmentos de proteína, ou proteínas inteiras, são comparados a controles conhecidos para uma dada proteína e a identidade é determinada por comparação.
Exemplo 64. Estudo da Citocina: PBMC A. Isolamento e Cultura de PBMC
[000706] 50 mL de sangue humano de dois doadores foram recebidos da Research Blood Components (lotes KP30928 e KP30931) em tubos de heparina de sódio. Para cada doador, o sangue foi agrupado e diluído para 70 mL com DPBS (SAFC Bioscience 59331C, lote 071M8408) e separado igualmente entre dois tubos cônicos de 50 mL. 10 mL de Ficoll Paque (GE Healthcare 17-5442-03, lote 10074400) foram suavemente despejados abaixo da camada de sangue. Os tubos foram centrifugados a 2000 rpm por 30 minutos com baixa aceleração e freio. Os tubos foram removidos e as camadas de células brancas PBMC foram suavemente transferidas a um tubo cônico novo de 50 mL e lavadas com DPBS. Os tubos foram centrifugados a 1450 rpm por 10 minutos.
[000707] O sobrenadante foi aspirado e os peletes de PBMC foram ressuspensos e lavados em 50 mL de DPBS. Os tubos foram centrifugados a 1250 rpm por 10 minutos. Esta etapa de lavagem foi repetida, e os peletes de PBMC foram ressuspensos em 19 mL de Optimem I (Gibco 11058, lote 1072088) e contados. As suspensões de célula foram ajustadas para uma concentração de 3,0 x 106 células / mL células vivas.
[000708] Essas células foram então plaqueadas em cinco placas de fundo redondo tratadas com cultura de tecido de 96 cavidades (Costar 3799) por doador em 50 uL por cavidade. Dentro de 30 minutos, as misturas de transfecção foram adicionadas a cada cavidade em um volume de 50 uL por cavidade. Após 4 horas pós- transfecção, o meio foi suplementado com 10 uL de Soro Fetal Bovino (Gibco 10082, lote 1012368)
B. Preparação da Transfecção
[000709] mRNA modificado que codifica G-CSF humano (sequência de mRNA mostrada em SEQ ID NO: 1; cauda poli-A de aproximadamente 160 nucleotídeos não mostrada em sequência; cap 5’, Cap1) (contendo ou (1) NTPs naturais, (2) 100% de substituição com 5-metil citidina e pseudouridina ou (3) 100% de substituição com 5-metil citidina e N1-metil pseudouridina; mRNA que codifica luciferase (sequência de cDNA IVT mostrada na SEQ ID NO: 2; sequência de mRNA mostrada em SEQ ID NO: 3, cauda poli-A de aproximadamente 160 nucleotídeos não mostrada em sequência, cap’ 5, Cap1, completamente modificado com 5-metilcitosina em cada substituição de citosina e pseudouridina em cada sítio de uridina) (contendo ou (1) NTPs naturais ou (2) 100% de substituição com 5-metil citidina e pseudouridina) e agonista de TLR R848 (tlrl-r848 da Invitrogem) foram diluídos até 38,4 ng / uL em um volume final de 2500 uL de Optimem I.
[000710] Separadamente, 110 uL de Lipofectamina 2000 (Invitrogen 11668-027, lote 1070962) foram diluídos com 6,76 mL de Optimem I. Em uma placa de 96 cavidades, nove alíquotas de 135 uL de cada mRNA, controle positivo (R-848) ou controle negativo (Optimem I) foram adicionadas a 135 uL da Lipofectamina 2000 diluída. A placa que contém o material a ser transfectado foi incubada por 20 minutos. As misturas de transfecção foram então transferidas para cada uma das placas de PBMC humano em 50 uL por cavidade. As placas foram então incubadas a 37°C. Em 2, 4, 8, 20, e 44 horas, cada placa foi removida da incubadora, e os sobrenadantes foram congelados.
[000711] Após a última placa ser removida, os sobrenadantes foram testados usando um kit ELISA de G-CSF humano (Invitrogen KHC2032) e kit ELISA de IFN-alfa humano (Thermo Scientific 41105-2). Cada condição foi feita em duplicata.
C. Análise de Resposta Imune Inata e de Proteína
[000712] A capacidade de mRNA modificado e não-modificado em produzir a proteína codificada foi avaliada (produção de G-CSF) com o tempo assim como a capacidade do mRNA de disparar o reconhecimento imune inato como medido pela produção de interferon- alfa. Uso de culturas PBMC in vitro é uma forma aceitável de medir o potencial imunoestimulador de oligonucleotídeos (Robbins e outros, Oligonucleotides 2009 19:89-102).
[000713] Resultados foram interpolados contra a curva padrão de cada placa de ELISA usando um ajuste de curva logística de quatro parâmetros. São mostradas nas Tabelas 4 e 5 médias de 3 doadores de PBMC separados da produção de G-CSF, interferon-alfa (IFN-alfa) e fator de necrose de tumor alfa (TNF-alfa) com o tempo como medido por ELISA específico.
[000714] No ELISA de G-CSF, sinal de base da condição não-tratada de Lipofectamina 2000 (LF2000) foi subtraído a cada ponto de tempo. Os dados demonstraram que produção específica de proteína G-CSF humana por sangue periférico humano mononuclear é vista com mRNA de G-CSF que contém NTPs naturais, 100% de substituição com 5-metil citidina e pseudouridina ou 100% de substituição com 5-metil citidina e N1-metil pseudouridina. Produção de G-CSF foi significativamente aumentada através do uso de mRNA modificado com 5-metil citidina e N1-metil pseudouridina com relação a mRNA modificado com 5-metil citidina e pseudouridina.
[000715] Com relação ao reconhecimento imune inato, embora ambas as químicas de mRNA modificado tenham prevenido amplamente a produção de IFN-alfa e TNF-alfa com relação aos controles positivos (R848, p(I)p(C)), diferenças significativas realmente existiam entre as químicas. mRNA modificado por 5-metil citidina e pseudouridina resultou em níveis baixos, mas detectáveis de produção de IFN-alfa e TNF-alfa, enquanto mRNA modificado por 5-metil citidina e N1-metil pseudouridina resultou em nenhuma produção detectável de IFN-alfa e TNF-alfa.
[000716] Consequentemente, foi determinado que, além da necessidade de rever mais do que um marcador de citocina da ativação da resposta imune inata, verificou-se surpreendentemente que combinações de modificações proveem níveis diferentes de resposta celular (produção de proteína e ativação imune). A modificação, N1- metil pseudouridina, neste estudo mostrou transmitir proteção adicional com relação à combinação padrão de 5-metilcitidina/pseudouridina explorada por outros resultando em duas vezes mais proteína e redução de quase 150 vezes em ativação imune (TNF-alfa).
[000717] Dado que o PBMC contém uma disposição grande de sensores de reconhecimento de RNA imune inato e também são capazes de tradução de proteínas, elas oferecem um sistema útil para testar a interdependência desses dois cursos. Sabe-se que a tradução de mRNA pode ser negativamente afetada pela ativação de tais cursos imunes inatos. (Kariko e outros, Immunity (2005) 23:165-175; Warren e outros, Cell Stem Cell (2010) 7:618-630). Ao usar PBMC como um sistema de teste in vitro, é possível estabelecer uma correlação entre tradução (neste caso produção de proteína G-CSF) e a produção de citocina (neste caso exemplificado pela produção de proteínas IFN-alfa e TNF-alfa). A melhor produção de proteína está correlacionada com a indução mais baixa de curso de ativação imune inato, e novas químicas podem ser julgadas favoravelmente com base nesta razão (Tabela 6).
[000718] Neste estudo, a proporção PC para as duas modificações químicas, pseudouridina e N1-metil pseudouridina, ambas com 5-metil citosina foi de 4742/141=34 quando comparado a 9944/1=9944 para a citocina IFN-alfa. Para a citocina TNF-alfa, as duas químicas tinham razões PC de 153 e 1243, respectivamente, sugerindo que para cada citocina, a N1-metilpseudouridina é a modificação superior. Nas tabelas 4 e 5, "NT" significa não testado. Tabela 4. G-CSF
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Tabela 5. IFN-alfa e TNF-alfa
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Tabela 6. Razões G-CSF para Citocina
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Exemplo 65. Faixas de Modificação Química de mRNA modificado
[000719] Nucleosídeos modificados tais como, mas não limitados a, modificações químicas 5-metilcitosina e pseudouridina foram mostrados diminuir a resposta imune inata e aumentar a expressão de RNA em células de mamíferos. Surpreendentemente, e não conhecido anteriormente, os efeitos manifestados por essas modificações químicas podem ser titulados quando a quantidade de modificação química de um nucleotídeo particular é menor do que 100%. Anteriormente, acreditou-se que o benefício de modificação química poderia ser derivado usando menos do que substituição completa de um nucleosídeo modificado e relatórios publicados sugeriam nenhuma perda de benefício até o nível de substituição sendo menos do que 50% (Kariko e outros, Immunity (2005) 23:165-175).
[000720] No entanto, foi agora mostrado que os benefícios de modificação química estão diretamente correlacionados com o grau de modificação química e devem ser considerados em vista de mais do que uma única medida de resposta imune. Tais benefícios incluem a produção de proteína ou tradução de mRNA aumentada e estimulação reduzida ou prevenida da resposta imune inata como medido por perfis de citocina e métricas de gatilhos de respostas imunes.
[000721] Tradução de mRNA aumentada e imunoestimulação inata reduzida ou ausente são vistas com substituição 100% com um nucleosídeo modificado. Percentuais menores de substituição resultam em menos tradução de mRNA e mais imunoestimulação inata, com mRNA não modificado mostrando a tradução mais baixa e a imunoestimulação mais alta.
Estudos de PBC In Vitro: Modificação de Percentual
[000722] 480 ng de mRNA de G-CSF modificado com 5-metilcitosina (5mC) e pseudouridina (pseudoU) ou mRNA de G-CSF não-modificado foram transfectados com 0,4 uL de Lipofectamina 2000 em células mononucleares do sangue periférico (PBMC) a partir de três doadores de sangue normais (D1, D2 e D3). O mRNA de G-CSF (SEQ ID NO: 1; cauda poli-A de aproximadamente 160 nucleotídeos não mostrada na sequência; cap 5’, Cap1) foi completamente modificado com 5mC e pseudo (100% de modificação), não modificado com 5mC e pseudo (0% de modificação) ou foi parcialmente modificado com 5mC e pseudoU de modo que o mRNA conteria 75% de modificação, 50% de modificação ou 25% de modificação. Uma amostra controle de Luciferase (sequência de mRNA mostrada em SEQ ID NO: 3; cauda poli-A de aproximadamente 160 nucleotídeos não mostrada em sequência; cap 5’, Cap1; totalmente modificados 5meC e pseudoU) foi também analisada pela expressão de G-CSF. Para amostras controle de TNF- alfa e IFN-alfa de Lipofectamina 2000, LPS, R-848, Luciferase (sequência de mRNA mostrada em SEQ ID NO: 3; cauda poli-A de aproximadamente 160 nucleotídeos não mostrada em sequência; cap 5’, Cap1; totalmente modificado 5mC e pseudo) e P(I)P(C) foram também analisados. O sobrenadante foi colhido e administrado por ELISA 22 horas após a transfecção para determinar a expressão da proteína. A expressão de G-CSF é mostrada na Tabela 7 e a expressão de IFN-alfa e TNF-alfa são mostradas na Tabela 8. A expressão de IFN- alfa e TNF-alfa pode ser um efeito secundário da transfecção do mRNA de G-CSF. As tabelas 7, 8 e FIG. 10 mostram que a quantidade de modificação química de G-CSF, interferon alfa (IFN-alfa) e fator alfa de necrose de tumor (TNF-alfa) é titulável quando o mRNA não é totalmente modificado e a tendência titulável não é a mesma para cada alvo.
[000723] Como mencionado acima, ao usar PBMC como um sistema de teste in vitro, é possível estabelecer uma correlação entre tradução (neste caso produção da proteína G-CSF) e produção de citocina (neste caso exemplificado pela produção de proteína IFN-alfa). Melhor produção de proteína está correlacionada com menor indução de curso de ativação imune inata, e a modificação de percentual de uma química pode ser julgada favoravelmente baseado nesta proporção (Tabela 9). Como calculado das Tabelas 7 e 8 e mostrado na Tabela 9, modificação integral com 5-metilcitidina e pseudouridina mostra uma razão muito melhor de produção de proteína/citocina do que sem qualquer modificação (mRNA de G-CSF natural) (100 vezes para IFN-alfa e 27 vezes para TNF-alfa). Modificação parcial mostra uma relação linear com cada vez menos modificação resultando em uma razão menor de proteína/citocina. Tabela 7. Expressão de G-CSF
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Tabela 8. Expressão de IFN-alfa e TNF-alfa
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Tabela 9. Razão de PC e Efeito de percentual de modificação
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Exemplo 66. RNA modificado transfectado em PBMC
[000724] 500 ng de mRNA de G-CSF modificado com 5-metilcitosina (5mC) e pseudouridina (pseudoU) ou mRNA de G-CSF não modificado foram transfectados com 0,4 uL de Lipofectamina 2000 em células mononucleares de sangue periférica (PBMC) a partir de três doadores de sangue normais (D1, D2 e D3). O mRNA de G-CSF (SEQ ID NO: 1; cauda poli-A de aproximadamente 160 nucleotídeos não mostrada em sequência; cap 5’, Cap1) foi completamente modificado com 5mC e pseudo (100% de modificação), não modificado com 5mC e pseudo (0% de modificação) ou parcialmente modificado com 5mC e pseudoU de modo que o mRNA conteria 50% de modificação, 25% de modificação, 10% de modificação, 5% de modificação, 1% de modificação ou 0,1% de modificação. Uma amostra controle de mCherry (sequência de mRNA mostrada em SEQ ID NO: 6; cuada poli-A de aproximadamente 160 nucleotídeos não mostrada em sequência; cap 5’, Cap1; totalmente modificado 5meC e pseudouridina) e G-CSF totalmente modificado com 5-metilcitosina e pseudouridina (G-CSF controle) foi também analisada quanto à expressão de G-CSF. Para fator alfa (TNT-alfa) de necrose de tumor e interferon-alfa (IFN-alfa), as amostras controle de Lipofectamina2000, LPS, R-848, Luciferase (sequência de mRNA mostrada em SEQ ID NO: 3; cauda poli-A de aproximadamente 160 nucleotídeos não mostrada em sequência; cap 5’, Cap1; totalmente modificado 5mC e pseudo), e P(I)P(C) foram também analisados. O sobrenadante foi coletado 6 horas e 18 horas após a transfecção e administrados por ELISA para determinar a expressão da proteína. A expressão de G-CSF, IFN-alfa e TNF-alfa para Doador 1 é mostrada na Tabela 10, Doador 2 é mostrada na Tabela 11 e Doador 3 é mostrada na Tabela 12.
[000725] 100% de modificação total com 5-metilcitidina e pseudouridina resultou na maior tradução de proteína (G-CSF) e na menor quantidade de citocina produzida em todos os três doadores de PBMC humanos. Quantidades menores de modificação resulta em maior produção de citocina (IFN-alfa e TNF-alfa), assim destacando mais a importância de modificação total para reduzir as citocinas e melhorar a tradução de proteína (como evidenciado aqui pela produção de G-CSF). Tabela 10. Doador 1
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Tabela 11. Doador 2
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Tabela 12. Doador 3
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Exemplo 67. Avaliação de Mutação Reversa Microames de Modificações Histórico e Métodos
[000726] A avaliação de microames é uma versão do teste de pré- incubação Ames completo. Ela detecta ambas as mutações de substituição de pares de base e mudanças de estrutura usando quatro cepas de teste de Salmonella (TA97a, TA98, TA100 e TA1535) e uma cepa de Escherichia coli (pKM101 uvrA WP2). As cepas TA97a e TA98 detectam mutações de mudança de estrutura e TA100, TA1535 e pKM101 uvrA WP2 detectam mutações de substituição de par de base. Esse teste Ames reduzido usa composto mínimo, é conduzido com ou sem ativação metabólica (fração S9) e usa placas de múltiplas cavidades. Esse teste é um teste microbiano para detectar o potencial mutagênico de compostos de teste.
[000727] A avaliação microAmes para artigo de teste de 5-Metilci- tidina, Pseudouridina ou N’-metilpseudouridina foi testada em duplicata com cepas TA97a, TA98, TA100, TA1535 e pKM101 uvrA WP2 na presença ou ausência de um sistema de ativação metabólico (fração microssomal S9 de fígado de camundongos induzida por AROCLOR® 1254) em 0,25, 2,5, 12,5, 25, 75 e 250 ug/cavidade. Compostos controle positivos foram usados em 4 diferentes concentrações para assegurar que o sistema de teste fosse sensível a compostos mutagênicos conhecidos. DMSO foi usado como o controle veículo. Controles veículo e positivos forneceram os resultados esperados, demonstrando que a avaliação microAmes é suficientemente sensível para detectar mutações.
Resultados
[000728] Para 5-metilcitosina, precipitados não foram observados com nenhuma cepa teste tanto com ou sem ativação metabólica. A citotoxicidade (redução do crescimento bacteriano e/ou número de revertedoras) não foi observada em qualquer cepa tanto com ou sem ativação metabólica. Não houve nenhum aumento no número de colônias revertedoras comparado com o controle veículo em qualquer cepa com ou sem ativação metabólica. Portanto, 5-Metilcitidina não foi mutagênica até 250 ug/cavidade em cepas TA97a, TA98, TA100, TA1535 e pKM101 uvrA WP2 com ou sem ativação metabólica sob as condições da avaliação microAmes.
[000729] Precipitados não foram observados com qualquer cepa de teste tanto com ou sem ativação metabólica para pseudouridina. Citotoxicidade (redução no número de revertedoras) foi observada com cepa TA100 sem ativação metabólica. Citotoxicidade (redução do crescimento bacteriano e/ou número de revertedores) não foi observada em qualquer outra cepa tanto com ou sem ativação metabólica. Não houve aumento no número de colônias revertedoras comparado com o controle veículo em qualquer cepa com ou sem ativação metabólica. Portanto, pseudouridina não foi mutagênica até 75 ug/cavidade em cepa TA100 sem ativação metabólica e até 250 μg/cavidade em cepas TA97a, TA98, TA1535 e pKM101 uvrA WP2 com ou sem ativação metabólica e cepa TA100 sem ativação metabólica sob as condições desta avaliação microAmes.
[000730] Para a modificação, precipitados de N1-metilpseudouridina não foram observados com qualquer cepa de teste tanto com ou sem ativação metabólica. Citotoxicidade (redução do crescimento bacteriano e/ou número de revertedoras) não foi observada em qualquer cepa tanto com ou sem ativação metabólica. Não houve aumento no número de colônias revertedoras comparado com o controle veículo em qualquer cepa com ou sem ativação metabólica. N1-metilpseudouridina não foi mutagênica até 250 μg/cavidade em cepas TA97a, TA98, TA100, TA1535 e pKM101 uvrA WP2 com ou sem ativação metabólica sob as condições desta avaliação. Verificou-se que a N1-metilpseudouridina é menos mutagênica que a pseudouridina.
[000731] A comparação neste teste microAmes de 5 metil citidina, pseudouridina e N1-metilpseudouridina os revela como geralmente não- mutagênicos. De nota particular, no entanto, foi a diferença entre a pseudouridina e N1-metilpseudouridina, onde a pseudouridina mostrou uma resposta citotóxica em uma cepa bacteriana em que a N1- metilpseudouridina não mostrou. Esses testes microAMES são rotineiramente usados como parte da avaliação pré-clínica de segurança do composto e destacam uma diferença importante entre N1- metilpseudouridina e pseudouridina.
Exemplo 68. Toxicidade de Trifosfatos de Nucleosídeo (NTPs)
[000732] A citotoxicidade de trifosfatos de nucleosídeo naturais e modificados (NTPs) sozinhos ou em combinação com outras bases foi analisada em células de rim embrionário humano 293 (HEK293) na ausência de reagente de transfecção. Células HEK293 foram semeadas em placas de 96 cavidades em uma densidade de 30.000 células por cavidade tendo 0,75ul de RNAiMAX® (Invitrogen, Carlsbad, CA) por cavidade em um volume de cavidade total de 100 ul. 10 ul dos NTPs descritos na Tabela 12 foram combinados com 10 ul de diluição lipídica e incubados por 30 minutos para formar um complexo antes que 80 ul da suspensão da célula HEK293 fossem adicionados ao complexo de NTP.
[000733] NTPs naturais e modificados foram transfectados em uma concentração de 2,1 nM, 21 nM, 210 nM, 2,1 um, 21 uM, 210 um ou 2,1 mM. NTPs em combinação foram transfectados em uma concentração total de NTPs de 8.4 nM, 84 nM, 840 nM, 8.4 uM, 84 uM, 840 uM e 8.4 mM. Como um controle, mRNA de G-CSF modificado (SEQ ID NO: 1; cauda poli-A de aproximadamente 160 nucleotídeos não mostrada em sequência; cap 5’, Cap1; 5-metilcitosina e pseudouridina totalmente modificadas) foi transfectado em células HEK293 em uma concentração de 8,4 nM. A citotoxicidade dos NTPs e do mRNA de G-CSF modificado foi testada em 4, 24, 48 e 72 hours após a adição às células HEK293 usando teste CYTO TOX-GLO® da Promega (Madison, WI) seguindo o protocolo do fabricante exceto quando pipetagem foi usada para lisar as células em vez de agitar as placas.
[000734] As Tabela 13 e 14 mostram o percentual de células viáveis para cada um dos NTPs, combinações de NTP e controles testados. Não houve toxicidade vista com os NTPs individuais quando comparado com células não-tratadas. Esses dados demonstram que a introdução de NTPs individuais, incluindo 5- metilcitidina, pseudouridina e N1-metil- pseudouridina, em células de mamíferos não é tóxica em doses 1.000.000 vezes uma dose eficaz quando introduzida como um mRNA modificado. Tabela 13. Citotoxicidade de NTPs individuais
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Tabela 14. Citotoxicidade de NTPs em Combinação
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Exemplo 69. Estudo de Resposta Imune Inata em Fibroblastos BJ
[000735] Fibroblastos do prepúcio primário humano (fibroblastos BJ) foram obtidos da American Type Culture Collection (ATCC) (No. catálogo CRL-2522) e cultivados em meio essencial mínimo da Eagle (ATCC, No. Catálogo 30-2003) suplementados com soro fetal bovino 10% a 37°C, sob CO2 5%. Fibroblastos BJ foram semeados em uma placa de 24 cavidades em uma densidade de 300.000 células por cavidade em 0,5 ml de meio de cultura. 250 ng de mRNA de G-CSF modificado (sequência de mRNA mostrada em SEQ ID NO: 1; cauda poli-A de aproximadamente 160 nucleotídeos não mostrada em sequência; cap 5’, Cap1) totalmente modificado com 5-metilcitosina e pseudouridina (Gen1) ou totalmente modificado com 5-metilcitosina e N1-metilpseudouridina (Gen2) tendo Cap0, Cap1 ou nenhum cap foi transfectado usando Lipofectamina 2000 (Invitrogen, No. catálogo 11668-019), seguindo o protocolo do fabricante. Amostras controle de poli I:C (PIC), Lipofectamina 2000 (Lipo), mRNA de luciferase natural (sequência de mRNA mostrada em SEQ ID NO: 3; cauda poli-A de aproximadamente 160 nucleotídeos não mostrada em sequência; cap 5’, Cap1) e mRNA de G-CSF natural também foram transfectados. As células foram coletadas após 18 horas, o RNA total foi isolado e tratado com DNASE® usando o kit micro RNeasy (No. de catálogo 74004) seguindo o protocolo do fabricante. 100 ng de RNA total foram usados para síntese de cDNA usando cDNA Reverse Transcription kit (No. catálogo 4368814) seguindo o protocolo do fabricante. O cDNA foi então analisado quanto à expressão de genes de resposta imune inata por PCR em tempo real quantitativo usando SybrGreen em um instrumento Biorad CFX 384 seguindo o protocolo do fabricante. A Tabela 15 mostra o nível de expressão de transcritos de resposta imune inata com relação a HPRT (hipoxantina fosforibossinstransferase) do gene de regulagem e é expresso como indução em vezes com relação HPRT. Na tabela, o painel de métrica padrão inclui: RIG-I é o gene do ácido retinóico que pode ser induzido 1, IL6 é interleucina-6, OAS-1 é oligoadenilato sintetase 1, IFNb é interferon-beta, AIM2 está ausente em melanoma-2, IFIT-1 é proteína induzida por interferon com repetições de tetratricopeptídeo 1, PKR é proteína cinase R, TNFa é o fator alfa de necrose de tumor e IFNa é interferon alfa. Tabela 15. Níveis transcritos de Resposta Imune Inata
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Exemplo 70. Detecção In vivo de Resposta Imune Inata
[000736] Em um esforço para distinguir a importância de modificação química diferente de mRNA em produção de proteína in vivo e resposta de citocina in vivo, camundongos fêmea BALB/C (n=5) são injetados intramuscularmente com mRNA de G-CSF (mRNA de GCSF não modificado) (sequência de mRNA mostrada em SEQ ID NO: 1; cauda poliA de aproximadamente 160 nucleotídeos não mostrada em sequência;) com uma cap 5’ de Cap1 , mRNA de G-CSF totalmente modificado com 5- metilcitosina e pseudouridina (mRNA de GCSF 5mc/pU), mRNA de G-CSF totalmente modificado com 5-metilcitosina e N1-metilpseudouridina com (mRNA de GCSF 5mc/N1pU) ou sem uma cap 5’ (mRNA de GCSF 5mc/N1 pU nenhum cap) ou de R848 ou sacarose 5% como descrito na Tabela 16. Tabela 16. Gráfico de Dosagem
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[000737] Sangue é coletado em 8 horas após a dosagem. Usando ELISA, os níveis de proteína G-CSF, TNF-alfa e IFN-alfa é determinado por ELISA. 8 horas após dosagem, músculo é coletado do local da injeção e reação em cadeia da polimerase em tempo real quantitativa (QPCR) é usada para determinar os níveis de mRNA de RIG-I, PKR, AIM-2, IFIT-1, OAS-2, MDA-5, IFN-beta, TNF-alfa, IL-6, G-CSF, CD45 no músculo.
Exemplo 71. Detecção In vivo de Estudo de Resposta Imune Inata
[000738] Camundongos fêmeas BALB/C (n=5) foram injetados intramuscularmente com mRNA de G-CSF (mRNA de GCSF não modificado) (sequência de mRNA mostrada em SEQ ID NO: 1; cauda poli-A de aproximadamente 160 nucleotídeos não mostrada em sequência;) com uma cap 5’ de Cap1, mRNA de G-CSF totalmente modificado com 5-metilcitosina e pseudouridina (mRNA de GCSF 5mc/pU), mRNA de G-CSF totalmente modificado com 5-metilcitosina e N1-metilpseudouridina com (mRNA de GCSF 5mc/N1pU) ou sem uma cap 5’ (mRNA de GCSF 5mc/N1 pU nenhum cap) ou um controle ou de R848 ou sacarose a 5% como descrito na Tabela 17. Sangue é coletado em 8 horas após a dosagem e usando ELISA, os níveis de proteína de G-CSF e interferon-alfa (IFN-alfa) são determinados por ELISA e são mostrados na Tabela 17.
[000739] Como mostrado na Tabela 17, mRNA de G-CSF não modificado e modificado com 5mc/pU e 5mc/N1pU resultou na expressão de G-CSF humano no soro de camundongo. mRNA de G- CSF modificado com 5mC/N1pU não capeado nao mostrou nenhuma expressão de G-CSF humano em soro, destacando a importância de ter uma cap 5’ para tradução de proteína.
[000740] Como esperado, nenhuma proteína G-CSF humana foi expressa no R848, sacarose 5% somente, e grupos não-tratados. Importantemente, diferenças significativas foram vistas na produção de citocina como medido por IFN-alfa de camundongo no soro. Como esperado, mRNA de G-CSF não modificado demonstrou uma resposta à citocina robusta in vivo (maior que o controle positivo de R848). O mRNA de G-CSF modificado com 5mc/pU realmente mostrou uma baixa resposta à citocina, mas detectável in vivo, enquanto mRNA modificado com 5mc/N1pU não mostrou nenhum IFN-alfa detectável no soro (e mesmo que veículo ou animais não-tratados).
[000741] Também, a resposta de mRNA modificado com 5mc/N1pU foi a mesma independente se estava capeado ou não. Esses resultados in vivo reforçam a conclusão que 1) mRNA não modificado produz uma resposta imune inata robusta, 2) esta é reduzida, mas não abolida, através de 100% de incorporação de modificação de 5mc/pU e 3) que a incorporação de modificações 5mc/N1pU resulta em nenhuma resposta de citocina detectável.
[000742] Por fim, dado que essas injeções estão em sacarose 5% (que não tem nenhum efeito sozinho), esses resultados devem refletir com precisão o potencial imunoestimulador dessas modificações.
[000743] A partir desses dados é evidente que moléculas modificadas com N1pU produzem mais proteína enquanto concomitantemente tem pouco ou nenhum efeito sobre expressão alfa IFN-alfa. Também é evidente que capeamento é requerido para produção de proteína para esta modificação química. A Proteína: Razão de Citocina de 748 comparado com a Razão PC para o mRNA não modificado (PC=9) significa que esta modificação química é bem mais superior em relação aos efeitos ou implicações biológicas associados com IFN-alfa. Tabela 17. G-CSF humano e IFN-alfa de camundongos em soro
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Exemplo 72: Administração In Vivo usando lipoplexos A. RNA modificado com G-CSF humano
[000744] Uma formulação que contém 100 μg de uma ou duas versões de mRNA de G-CSF modificado humano (sequência de mRNA mostrada em SEQ ID NO: 1; cauda poli-A de aproximadamente 160 nucleotídeos não mostrada em sequência; cap 5’, Cap1) (G-CSF totalmente modificada com 5-metilcitosina e pseudouridina (G-CSF) ou G-CSF totalmente modificada com 5-metilcitosina e N1-metil- pseudouridina (G-CSF-N1) lipoplexada com 30% em volume de RNAIMAX® e administrado em 150 uL intramuscularmente (I.M.) e em 225uL intravenosamente (I.V.) a camundongos C57/BL6.
[000745] Três grupos controle foram administrados ou com 100 μg de mRNA de luciferase modificado (sequência de cDNA IVT mostrada em SEQ ID NO: 2; sequência de mRNA mostrada em SEQ ID NO: 3, cauda poli-A de aproximadamente 160 nucleotídeos não mostrada em sequência, cap 5’, Cap1, totalmente modificado com 5-metilcitosina em cada substituição de citosina e pseudouridina em cada sítio de uridina) intramuscularmente (Luc-unsp I.M.) ou 150 μg de mRNA de luciferase modificado intravenosamente (Luc-unsp I.V.) ou 150 uL do tampão de formulação intramuscularmente (Tampão I.M.). 6 horas após a administração de uma formulação, soro foi coletado para medir a quantidade de proteína G-CSF humana no soro de camundongos por ELISA de G-CSF humano e os resultados são mostrados na Tabela 18.
[000746] Esses resultados demonstram que mRNA de G-CSF humano modificado com ambas 5-metilcitosina/pseudouridina e 5-metilci- tosina/N1-metilpseudouridina pode resultar em expressão de proteína G-CSF humana específica em soro quando administrado via administração I.V. ou I.M. em uma formulação lipoplex. Tabela 18. G-CSF humano em soro (Via de Injeção I.M. e I.V.)
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B. Comparação de RNA Modificado com G-CSF Humano
[000747] Uma formulação que contém 100 μg ou de mRNA de G-CSF humano modificado lipoplexado com 30% em volume de RNAIMAX® com uma modificação de 5-metilcitosina (5mc) e uma de pseudouridina (Φ) (G-CSF-Gen1-Lipoplex), mRNA de G-CSF modificado humano com um modificação 5mc e uma Φ em solução salina (G-CSF-Gen1-Solução salina), mRNA de G-CSF humano modificado com uma N1-5- metilcitosina (N1-5mc) e uma modificação Φ lipoplexado com 30% em volume de RNAIMAX® (G-CSF-Gen2-Lipoplex), mRNA de G-CSF humano modificado com uma modificação N1-5mc e uma Φ em solução salina (G-CSF-Gen2-Solução salina), luciferase modificada com uma modificação 5mc e uma Φ lipoplexada com 30% em volume de RNAIMAX® (Luc-Lipoplex) ou mRNA de luciferase totalmente modificado com modificações 5mc e Φ em solução salina (Luc-Solução salina) foram administrados intramuscularmente (I.M.) ou subcutaneamente (S.C.) e um grupo controle para cada método de administração recebeu uma dose de 80uL do tampão de formulação (Tampão F.) a camundongos C57/BL6. 13 horas após injeção soro e tecido do local da injeção foram coletados de cada camundongo e analisados por ELISA de G-CSF para comparar níveis de proteína G- CSF humana. Os resultados da proteína G-CSF humana em soro de camundongos a partir da administração intramuscular e os resultados da administração subcutânea são mostrados na Tabela 19.
[000748] Esses resultados demonstram que mRNA de G-CSF humano modificado com 5-metilcitosina/pseudouridina e 5-metilcito- sina/N1-metilpseudouridina pode resultar na expressão de proteína G- CSF humana específica em soro quando administrado via administração I.M. ou S.C. seja em uma formulação salina ou em uma formulação lipoplex. Como mostrado na Tabela 19, mRNA de G-CSF humano modificado com 5-metilcitosina/N1-metilpseudouridina geralmente demonstra produção de proteína G-CSF humana aumentada com relação a mRNA de G-CSF humano modificado com 5- metilcitosina/pseudouridina. Tabela 19. Proteína G-CSF Humana em soro de camundongos
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Exemplo 73. Administração em múltiplos locais: Intramuscular e subcutânea
[000749] mRNA de G-CSF modificado humano (sequência de mRNA mostrada em SEQ ID NO: 1; cauda poli-A de aproximadamente 160 nucleotídeos não mostrada em sequência; cap 5', Cap1) modificado ou com Gen1 ou Gen2 (uma modificação 5-metilcitosina (5mc) e pseudouridina (^), G-CSF-Gen1; ou uma modificação N1-5-metilcito- sina (N1-5mc) e uma Φ, G-CSF-Gen2) e formulado em solução salina foi administrado a camundongos via injeção intramuscular (IM) ou subcutânea (SC). Injeção de quatro doses ou 2x de 50ug (dois locais) diariamente por três dias (intervalo de 24 h) foi realizada. A quarta dose foi administrada 6 horas antes da coleta de sangue e análise de CBC. Controles incluíam Luciferase (sequência de cDNA para IVT mostrada em SEQ ID NO: 2; Sequência de mRNA mostrada em SEQ ID NO: 3, cauda poli-A de aproximadamente 160 nucleotídeos não mostrada em sequência, cap 5’, Cap1, totalmente modificado com 5-metilcitosina em cada substituição de citosina e pseudouridina em cada local de uridina) ou a formulação tampão (Tampão F.). Os camundongos sofreram sangria em 72 horas após a primeira injeção de mRNA (6 horas após a última dose de mRNA) para determinar o efeito de G-CSF humano codificado por mRNA sobre a contagem de neutrófilos. O regime de dosagem é mostrado na Tabela 20 como as contagens de neutrófilos resultantes (milhares/uL). Na tabela 20, um asterisco (*) indica significância estatística em p<0,05.
[000750] Para administração intramuscular, os dados revelam um aumento de quatro vezes em contagem de neutrófilos acima do controle no dia 3 para o mRNA de G-CSF Gen1 e um aumento de duas vezes para o mRNA de G-CSF Gen2. Para administração subcutânea, os dados revelam um aumento de duas vezes na contagem de neutrófilos acima do controle no dia 3 para o mRNA de G-CSF Gen2.
[000751] Esses dados demonstraram que mRNA modificados por ambas 5-metilcitidina/pseudouridina e 5-metilcitidina/N1-metilpseu- douridina pode ser biologicamenteativo, como evidenciado por aumentos específicos em contagens de neutrófilo no sangue. Tabela 20. Regime de Dosagem
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Exemplo 74. Administração Intravenosa
[000752] mRNA de G-CSF humano modificado (sequência de mRNA mostrada em SEQ ID NO: 1; cauda poli-A de aproximadamente 160 nucleotídeos não mostrada em sequência; cap 5’, Cap1) modificado com 5-metilcitosina (5mc) e uma modificação de pseudouridina (^) (Gen1); ou não tendo nenhuma modificação e formulado em lipoplex 10% (RNAIMAX®) foi administrado a camundongos em uma dose de 50 ug de RNA e em um volume de 100 uL via injeção intravenosa (IV) em dias 0, 2 e 4. Neutrófilos foram medidos nos dias 1, 5 e 8. Controles incluíam RNA de mamífero não-específico ou a formulação tampão sozinha (Tampão F.). Os camundongos sofreram sangria nos dias 1, 5 e 8 para determinar o efeito de G-CSF humana codificada por mRNA em aumentar contagem de neutrófilos. O regime de dosagem é mostrado na Tabela 21 como as contagens de neutrófilo resultantes. (milhares/uL; K/uL).
[000753] Para administração intravenosa, os dados revelaram um aumento de quatro a cinco vezes em contagem de neutrófilos acima do controle no dia 5 com mRNA modificado de G-CSF, mas não com controles de mRNA não modificado de G-CSF ou não-específicos. Contagem do sangue retornou ao nível basal quatro dias após a injeção final. Quaisquer outras mudanças em populações de leucócitos foram observada.
[000754] Na Tabela 21, um asterisco (*) indica significância estatística em p<0,001 comparada ao tampão.
[000755] Esses dados demonstram que mRNA modificado por 5- metilcitidina/pseudouridina formulado com lipoplex pode ser biologicamente ativo, quando administrado através de uma via de administração I.V. como evidenciado por aumentos específicos em contagens de neutrófilo no sangue. Quaisquer outros subconjuntos de células foram significativamente alterados. mRNA de G-CSF não modificado similarmente administrado não mostrou nenhum efeito farmacológico sobre contagens de neutrófilo. Tabela 21. Regime de dosagem
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Exemplo 75: Vias de administração
[000756] Estudos foram realizados para investigar dosagem dividida usando diferentes vias de administração. Estudos que utilizam locais de injeção subcutânea ou intramuscular múltiplos em um único ponto foram planejados e realizados para investigar maneiras de aumentar exposição ao fármaco de mRNA modificado e melhorar a produção de proteína. Além da detecção do produto de proteína expresso, uma avaliação da função fisiológica das proteínas também foi determinada através de análise de amostras dos animais testados.
[000757] Surpreendentemente, foi determinado que dosagem dividida de mRNA modificado permite produção de proteína e respostas de fenótipo maiores do que aquelas produzidas por esquemas de dosagem unitária única ou múltiplas dosagens.
[000758] O planejamento de um experimento de dose dividida envolveu uso de mRNA modificado com eritropoietina humana (EPO) (sequência de mRNA mostrada em SEQ ID NO: 5; cauda poli-A de aproximadamente 160 nucleotídeos não mostrada em sequência; cap 5’, Cap1) ou mRNA modificado de luciferase (sequência mRNA mostrada em SEQ ID NO: 3; cauda poli-A de aproximadamente 160 nucleotídeos não mostrada em sequência; cap 5’, Cap1) administrado em tampão sozinho ou formulado com lipoplex a 30% (RNAIMAX®). O veículo de dosagem (tampão) consistia em NaCl 150 mM, CaCl2 2 mM, Na+-fosfato 2 mM (fosfato de sódio monobásico 1,4 mM; fosfato de sódio dibásico 0,6 mM) e EDTA 0,5 mM, pH 6,5. O pH foi ajustado usando hidróxido de sódio e a solução final foi esterilizada com filtro. O mRNA foi modificado com 5metilC (5meC) em cada substituição de citosina e pseudouridina em cada sítio de uridina.
[000759] 4 camundongos por grupo foram dosados intramuscularmente (I.M.), intravenosamente (I.V.) ou subcutaneamente (S.C.) pelo gráfico de dosagem esquematizado na Tabela 22. Soro foi coletado 13 horas após a injeção em todos os camundongos, tecido foi coletado do sítio da injeção do grupo subcutâneo e intramuscular e o baço, fígado e rins foram coletados do grupo intravenoso. Os resultados do grupo intramuscular e os resultados do grupo subcutâneo são mostrados na Tabela 23. Tabela 22. Gráfico de Dosagem
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Tabela 23. Proteína EPO Humana em soro de camundongos (via de injeção I.M.)
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Exemplo 76: Administração In Vivo Usando Razões de Lipídeo Variáveis
[000760] mRNA modificado foi administrado a camundongos C57/BL6 para avaliar as razões de lipídeos variáveis e a expressão da proteína resultante. Formulações de 100 μg de mRNA de EPO humano modificado (sequência de mRNA mostrada em SEQ ID NO: 5; cauda poli-A de aproximadamente 160 nucleotídeos não mostrada em sequência; cap 5’, Cap1; totalmente modificado com 5-metilcitosina e pseudouridina) lipoplexado com RNAIMAX® 10%, 30% ou 50%, 100 μg de mRNA de luciferase modificado (sequência de cDNA de IVT mostrada em SEQ ID NO: 2; sequência de mRNA mostrada na SEQ ID NO: 3, cauda poli-A de aproximadamente 160 nucleotídeos não mostrada em sequência, cap 5’, Cap1, totalmente modificado com 5- metilcitosina em cada substituição de citosina e pseudouridina em cada sítio de uridina) lipoplexado com RNAIMAX® 10%, 30% ou 50% ou um tampão de formulação foram administrados intramuscularmente a camundongos em uma única dose de 70 μl. Soro foi coletado 13 horas após a injeção para sofrer um ELISA de EPO humana para determinar o nível de proteína EPO humana em cada camundongo. Os resultados de ELISA de EPO humana, mostrados na Tabela 24, mostram que EPO humana expressa no músculo é secretada no soro para cada uma da porcentagem diferente de RNAIMAX®. Tabela 24. Proteína EPO Humana em soro de Camundongo (Via de Injeção IM)
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Exemplo 77: Administração In Vivo de RNA modificado em Camundongos
[000761] Produção de Proteína de mRNA modificado foi avaliada através da administração de mRNA de G-CSF modificado ou mRNA de Fator IX modificado a ratos fêmeas Sprague Dawley (n=6). Os ratos foram injetados com 400 ug em 100 ul de mRNA de G-CSF (sequência mRNA mostrada em SEQ ID NO: 1; cauda poli-A de aproximadamente 160 nucleotídeos não mostrada em sequência; cap 5’, Cap1) totalmente modificados com 5-metilcitosina e pseudouridina (G-CSF Gen1), mRNA de G-CSF totalmente modificado com 5-metilcitosina e N1- metilpseudouridina (G-CSF Gen2) ou mRNA de Fator IX (sequência de mRNA mostrada em SEQ ID NO: 6; cauda poli-A de aproximadamente 160 nucleotídeos não mostrada em sequência; cap 5’, Cap1) totalmente modificado com 5-metilcitosina e pseudouridina (Fator IX Gen1) reconstituído da forma liofilizada em sacarose 5%. Sangue foi coletado 8 horas após a injeção e o nível de proteína G-CSF no soro foi medido por ELISA. Tabela 25 mostra os níveis de proteína G-CSF no soro após 8 horas.
[000762] Esses resultados demonstram que mRNA modificado com ambos G-CSF Gen 1 e G-CSF Gen 2 pode produzir proteína G-CSF humana em um rato seguindo uma injeção intramuscular única, e que a produção de proteína G-CSF humana é melhorada quando usando a química de Gen 2 com relação à química de Gen 1. Tabela 25. Proteína G-CSF em Soro de Rato (Via de injeção I.M.)
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Exemplo 78. Modificação Química: Estudos In vitro A. Avaliação In vitro em PBMC
[000763] 500 ng de G-CSF (sequência de mRNA mostrada em SEQ ID NO: 1; cauda poli-A de aproximadamente 160 nucleotídeos não mostrada em sequência; cap 5’, Cap1) mRNA totalmente modificado com a modificação química mostrada nas Tabelas 26 e 27 foi transfectado com 0,4 uL de Lipofectamina 2000 em células de sangue mononucleares periférico (PBMC) de três doadores de sangue normais. Amostras de controle de LPS, R848, P(I)P(C) e mCherry (sequência de mRNA mostrada em SEQ ID NO: 4; cauda poli-A de aproximadamente 160 nucleotídeos não mostrada em sequência, cap 5’, Cap1; totalmente modificado com 5-metilcitosina e pseudouridina) foram também analisadas. O sobrenadante foi coletado e armazenado congelado até ser analisado por ELISA para determinar a expressão da proteína G- CSF, e a indução das citocinas interferon-alfa (IFN-α) e fator de necrose de tumor alfa (TNF-α). A expressão da proteína de G-CSF é mostrada na Tabela 26, a expressão de IFN-α e TNF-α é mostrada na Tabela 27.
[000764] Os dados na Tabela 26 demonstram que muitas, mas não todas, as modificações químicas podem ser usadas para produzir de forma produtiva G-CSF humana em PBMC. De importância, 100% de substituição de N1-metilpseudouridina demonstra o mais alto nível de produção de G-CSF humano (quase 10 vezes maior que a pseudouridina sozinha). Quando N1-metilpseudouridina é usada em combinação com 5-metilcitidina um alto nível de proteína G-CSF humana também é produzido (isto é também mais alto do que quando pseudouridina é usada em combinação com 5 metilcitidina).
[000765] Dada a relação inversa entre produção de proteína e produção de citocina em PBMC, uma tendência similar também é vista na Tabela 27, onde 100% de substituição com N1-metilpseudouridina resulta em nenhuma indução de citocina (similar à transfecção apenas com controles) e pseudouridina mostra indução de citocina detectável que está acima da base.
[000766] Outras modificações tais como N6-metiladenosina e α- tiocitidina parecem aumentar a estimulação de citocina. Tabela 26. Modificações químicas e expressão da proteína G-CSF
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Tabela 27. Modificações químicas e expressão da citocina
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B. Avaliação In vitro em células HeLa
[000767] No dia antes da transfecção, 20.000 células HeLa (ATCC no. CCL-2; Manassas, VA) foram coletadas por tratamento com solução de Tripsina-EDTA (LifeTechnologies, Grand Island, NY) e semeadas em um volume total de 100 ul de meio EMEM (suplementado com FCS 10% e Glutamax 1x) por cavidade em uma placa de cultura de 96 cavidades (Corning, Manassas, VA). As células foram cultivadas a 37 oC em uma atmosfera de CO2 a 5% durante a noite. No dia seguinte, 83 ng de RNA modificado por Luciferase (sequência de mRNA mostrada em SEQ ID NO: 3; cauda poli-A de aproximadamente 160 nucleotídeos não mostrada em sequência; cap 5’, Cap1) com a modificação química mostrada na Tabela 28, foram diluídos em 10 uL de volume final de OPTI-MEM (LifeTechnologies, Grand Island, NY). Lipofectamina 2000 (LifeTechnologies, Grand Island, NY) foi usada como reagente de transfecção e 0,2 uL foi diluído em um volume final de 10 uL de OPTI- MEM. Após 5 minutos de incubação em temperatura ambiente, ambas as soluções foram combinadas e incubadas por mais 15 em temperatura ambiente. Então a solução combinada de 20 uL foi adicionada ao meio de cultura de célula 100ul que contém as células HeLa e incubada em temperatura ambiente.
[000768] Após 18 a 22 horas de incubação, as células que expressam luciferase foram lisadas com 100 uL de Passive Lysis Buffer (Promega, Madison, WI) de acordo com as instruções do fabricante. Alíquotas dos lisatos foram transferidas para placas de 96 cavidades de poliestireno opacas brancas (Corning, Manassas, VA) e combinadas com 100 uL de solução de teste de luciferase completa (Promega, Madison, WI). Os volumes de lisato foram ajustados ou diluídos até não mais do que 2 mio de unidades de luz relativa (RLU) (Relative Light Units) por cavidade, foram detectados para as amostras que produzem o sinal mais forte e as RLUs para cada química testada são mostradas na Tabela 28. O leitor da placa era um BioTek Synergy H1 (BioTek, Winooski, VT). O sinal histórico das placas sem reagente foi de cerca de 200 unidades de luz relativa por cavidade.
[000769] Esses resultados demonstraram que muitas, mas não todas, as modificações químicas podem ser usadas para de forma produtiva produzir G-CSF humano em células HeLa. De importância, 100% da substituição de N1-metilpseudouridina demonstra o nível mais alto da produção de G-CSF humana. Tabela 28. Unidades de Luz relativa de Luciferase
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C. Avaliação In vitro em Lisatos de Reticulócito de Coelho
[000770] mRNA de luciferase (sequência de mRNA mostrada em SEQ ID NO: 3; cauda poli-A de aproximadamente 160 nucleotídeos não mostrada em sequência; cap 5’, Cap1) foi modificado com a modificação química listada na Tabela 29 e foi diluído em água livre de nuclease estéril para uma quantidade final de 250 ng em 10 ul. A luciferase diluída foi adicionada a 40 ul de lisato de reticulócito de coelho recém- preparado e a reação de tradução in vitro foi feita em um tubo de reação de polipropileno padrão de 1,5 mL (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) a 30°C em um bloco de aquecimento seco. O teste de tradução foi feito com o kit para lisato de reticulócito de coelho (tratado com nuclease) (Promega, Madison, WI) de acordo com as instruções do fabricante. O tampão da reação foi suplementado com uma mistura um- para-um de soluções de estoque de aminoácido desprovidas ou de Leucina ou Metionina que resultam em uma mistura de reação que contém quantidades suficientes de ambos aminoácidos para permitir a tradução in vitro eficaz.
[000771] Após 60 minutos de incubação, a reação foi parada pondo os tubos de reação em gelo. Alíquotas da reação de tradução in vitro que contêm RNA modificado de luciferase foram transferidas para placas de 96 cavidades de poliestireno opacas brancas (Corning, Manassas, VA) e combinadas com 100 ul de solução de teste de luciferase completa (Promega, Madison, WI). Os volumes das reações de tradução in vitro foram ajustados ou diluídos até não mais do que 2 mio de unidades de luz relativa (RLUs) por cavidade fossem detectados para as amostras de produção de sinal mais forte e as RLUs para cada química testada são mostradas na Tabela 29. O leitor de placa era um BioTek Synergy H1 (BioTek, Winooski, VT). O sinal histórico das placas sem reagente era de cerca de 200 unidades de luz relativa por cavidade.
[000772] Esses resultados de tradução livre de células se correlacionam muito bem com os resultados da produção de proteína em HeLa, com as mesmas modificações geralmente funcionando ou não em ambos os sistemas. Uma exceção notável é o mRNA de luciferase modificado por 5-formilcitidina que funcionou no sistema de tradução livre de células, mas não no sistema de transfecção baseado em células HeLa. Uma diferença similar entre os dois ensaios foi também vista com mRNA de G-CSF modificado com 5-formilcitidina. Tabela 29. Unidades de Luz Relativa de Luciferase
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Exemplo 79. Modificação química: Estudos In vivo Avaliação In vivo de mRNA modificado de G-CSF
[000773] Camundongos Balb-C (n=4) são injetados intramuscularmente em cada perna com mRNA de G-CSF modificado (sequência de mRNA mostrada em SEQ ID NO: 1; cauda poli-A de aproximadamente 160 nucleotídeos não mostrado em sequência; cap 5’, Cap1), totalmente modificado com as modificações químicas mostradas na Tabela 30, é formulado em 1xPBS. Um controle de mRNA modificado de luciferase (sequência de mRNA mostrada em SEQ ID NO: 3; cauda poli-A de aproximadamente 160 nucleotídeos não mostrada em sequência; cap 5’, Cap1; totalmente modificado com pseudouridina e 5-metilcitosina) e um controle de PBS são também testados. Após 8 horas, o soro é coletado para determinar níveis de proteína G-CSF e níveis de citocina por ELISA. Tabela 30. G-CSF
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Avaliação In vivo de mRNA modificado de Luciferase
[000774] Camundongos Balb-C (n=4) foram injetados subcutaneamente com 200 ul contendo 42 a 103 ug de mRNA de luciferase modificado (sequência de mRNA mostrada em SEQ ID NO: 3; cauda poli-A de aproximadamente 160 nucleotídeos não mostrada em sequência; cap 5’, Cap1), totalmente modificado com as modificações químicas mostradas na Tabela 31, foi formulado em 1xPBS. Um PBS controle foi também testado. As dosagens do mRNA de luciferase modificado são também esquematizadas na Tabela 31. 8 horas após a dosagem, os camundongos foram submetidos a exame de imagem para determinar a expressão da luciferase. Vinte minutos antes de serem submetidos a exame de imagem, os camundongos foram injetados intraperitonealmente com uma solução de D-luciferina em 150 mg/kg. Animais foram então anestesiados e as imagens foram adquiridas com um sistema de representação gráfica de imagens IVIS Lumina II (Perkin Elmer). Bioluminescência foi medida como o fluxo total (fótons/segundo) do camundongo inteiro.
[000775] Como demonstrado na Tabela 31, todas as químicas modificadas de mRNA de luciferase demonstraram atividade in vivo, com a exceção de 2’-fluoruridina. Adicionalmente, mRNA modificado com 1-metilpseudouridina demonstrou expressão muito alta de luciferase (expressão 5 vezes maior do que mRNA que contém pseudouridina). Tabela 31. Avaliação de Luciferase
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Exemplo 80. Avaliação In vivo de Combinação de mRNA Modificado de Luciferase
[000776] Camundongos Balb-C (n=4) foram injetados subcutaneamente com 200 ul de 100 ug de mRNA modificado de luciferase (sequência de mRNA mostrada em SEQ ID NO: 3; cauda poli-A de aproximadamente 160 nucleotídeos não mostrada em sequência; cap 5’, Cap1), totalmente modificado com as modificações químicas mostradas na Tabela 32, foi formulado em 1x PBS. Um PBS controle também foi testado. As dosagens de mRNA de luciferase modificado são também mostradas na Tabela 29. 8 horas após a dosagem, os camundongos passaram por exame de imagem para determinar a expressão de luciferase. Vinte minutos antes do exame de imagem, os camundongos foram injetados intraperitonealmente com uma solução de D-luciferina em 150 mg/kg. Os animais foram então anestesiados e as imagens foram obtidas com um sistema imagem IVIS Lumina II (Perkin Elmer). Bioluminescência foi medida como fluxo total (fótons/segundo) do camundongo inteiro.
[000777] Como demonstrado na Tabela 32, todas as químicas modificadas de mRNA de luciferase (em combinação) demonstraram atividade in vivo. Ainda, a presença de N1-metilpseudouridina no mRNA modificado (com N4-acetilcitidina ou 5 metilcitidina) demonstrou expressão mais alta do que quando as mesmas combinações foram testadas usando pseudouridina. Juntos, esses dados demonstram que mRNA de luciferase contendo N1-metilpseudouridina resulta em expressão de proteína aperfeiçoada in vivo se usada sozinho (Tabela 31) ou quando usado em combinação com outros nucleotídeos modificados (Tabela 32). Tabela 32. Combinações de Avaliação de Luciferase
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Exemplo 81. Estabilidade de RNA modificado A. Armazenamento de RNA modificado
[000778] Experimentos de estabilidade foram conduzidos para obter um melhor entendimento de condições de armazenamento para reter a integridade de RNA modificado. mRNA de G-CSF não modificado (sequência de mRNA mostrada em SEQ ID NO: 1; cauda poli-A de aproximadamente 160 nucleotídeos não mostrada em sequência; cap 5’, Cap1), mRNA de G-CSF totalmente modificado com 5-metilcitosina e pseudouridina e mRNA de G-CSF totalmente modificado com 5- metilcitosina e pseudouridina lipoplexados com 0,75% em volume de RNAIMAX® foram armazenados a 50°C, 40°C, 37°C, 25°C, 4°C ou - 20°C. Após o mRNA ter sido armazenado por 0 hora, 2 horas, 6 horas, 24 horas, 48 horas, 5 dias e 14 dias, o mRNA foi analisado por eletroforese em gel usando um sistema Bio-Rad EXPERION®. O mRNA de G-CSF modificado, não modificado e lipoplexado foi também armazenado em RNASTABLE® (Biomatrica, Inc. San Diego, CA) a 40°C ou água em -80 °C ou 40°C por 35 dias antes de ser analisado por eletroforese de gel.
[000779] Todas as amostras de mRNA sem estabilizador estavam estáveis após 2 semanas após armazenamento em 4°C ou -20°C. mRNA de G-CSF modificado, com ou sem lipoplex, era mais estável do que G-CSF não modificado quando armazenado a 25°C (estáveis até 5 dias versus 48 horas), 37°C (estáveis até 24 horas versus 6 horas) e 50°C (estáveis até 6 horas versus 2 horas). mRNA de G-CSF não modificado, mRNA de G-CSF modificado com ou sem lipoplex toleraram 12 ciclos de congelamento/descongelamento.
[000780] Amostras de mRNA armazenadas em estabilizador a 40°C mostraram estabilidade similar às amostras de mRNA armazenadas em água a -80°C após 35 dias enquanto que o mRNA armazenado em água a 40°C mostrou degradação pesada após 18 dias.
Exemplo 82. Viabilidade celular em Fibroblastos BJ
[000781] Fibroblastos de prepúcio primários humano (fibroblastos BJ) foram obtidos da American Type Culture Collection (ATCC) (No. catálogo CRL-2522) e cultivados em Meio Essencial Mínimo de Eagle (ATCC, No. cat 30-2003) suplementado com soro fetal bovino 10% a 37°C, sob CO2 5%. Fibroblastos BJ foram semeados em uma placa de 24 cavidades em uma densidade de 130.000 células por cavidade em 0,5 ml de meio de cultura. 250 ng de mRNA de G-CSF modificado (sequência de mRNA mostrada em SEQ ID NO: 1; cauda poli-A de aproximadamente 160 nucleotídeos não mostrada em sequência; cap 5’, Cap1) totalmente modificado com 5-metilcitosina e pseudouridina (Gen1) ou totalmente modificado com 5-metilcitosina e N1- metilpseudouridina (Gen2) foram transfectados usando Lipofectamina 2000 (Invitrogen, No. cat. 11668-019), seguindo o protocolo do fabricante. Amostras controle de Lipofectamina 2000 (LF2000) e mRNA de G-CSF não modificado foram também transfectadas. O mRNA modificado ou amostras controle foram transfectados diariamente por 4 dias. A viabilidade das células após a transfecção foi avaliada 6 horas e 24 horas após a primeira transfecção (T1, 6 horas ou T1, 24 horas), e 24 horas após a segunda (T2, 24 horas) e quarta transfecções (T4, 24 horas).
[000782] Para determinar a viabilidade celular, o meio de cultura foi completamente removido e as células lavadas uma vez com 600 ul de PBS estéril sem Ca2+/Mg2+ (Gibco/Life Technologies, Manassas, VA) de modo a retirar células soltas. PBS foi removido e descartado. Os fibroblastos limpos em cada cavidade foram tratados com 220 ul de uma solução de estoque diluída CELL TITER GLO® (Promega, No. catálogo G7570) (a solução de estoque CELL TITER GLO® foi diluída mais 1:1 com uma quantidade igual de PBS estéril). Uma ponta de pipeta estéril foi usada para raspar as células da placa e acelerar o processo de lise.
[000783] Para dois intervalos de tempo, T1, 24 horas e T2, 24 horas, um protocolo alternativo foi aplicado. As células foram lavadas com PBS, como descrito acima, e subsequentemente tripsinizadas com solução de Tripsina/EDTA (Gibco/Life Technologies, Manassas, VA). As células foram separadas e coletadas em 500 ul de meio que contém inibidor de tripsina. As células foram coletadas através de centrifugação a 1200 rcf por 5 minutos. O pelete de célula foi ressuspenso em 500 ul de PBS. Essa suspensão de célula foi mantida em gelo e 100 ul desta foram combinados com 100 ul de solução Cell Titer Glo não diluída.
[000784] Todos dos lisatos de CELL TITER GLO® foram então incubados em temperatura ambiente por 20 minutos. 20 ul dos lisatos foram transferidos para uma placa de 96 cavidades de poliestireno opacas brancas (Corning, Manassas, VA) e combinados com 100 ul de solução CELL TITER GLO® diluída. O leitor de placa usado era da BioTek Synergy H1 (BioTek, Winooski, VT) e os valores absolutos foram normalizados para sinal dos fibroblastos BJ não tratados para 100% de viabilidade celular. O percentual de viabilidade para os fibroblastos BJ fibroblastos é mostrado na Tabela 33.
[000785] Importantemente, todos esses experimentos são conduzidos na ausência de qualquer interferon ou outros inibidores de citocina e assim representam uma medida precisa da citotoxicidade do mRNA diferente.
[000786] Esses resultados demonstram que a transfecção repetida de fibroblastos de BJ com mRNA não modificado resulta em perda de viabilidade celular que é aparente logo 24 horas após a primeira transfecção (T1, 24 hours) e continua a ser aparente e mais pronunciada em pontos de tempo subsequentes.
[000787] Há também uma perda de viabilidade com transfecção repetida de mRNA modificado com 5-metilcitidina e pseudouridina que é aparente 24 horas após a quarta transfecção diária (T4, 24 horas). Nenhuma perda de viabilidade celular ao longo desse experimento é vista usando mRNA modificado com 5-metilcitidina e N1-metilpseudouridina. Esses resultados demonstraram que mRNA que contém 5-metilcitidina e N1-metilpseudouridina têm viabilidade celular aperfeiçoada quando analisado sob transfecção repetida. A capacidade de repetidamente administrar mRNA modificado é importante na maioria das aplicações terapêuticas, e tal capacidade de fazer tal coisa sem citotoxicidade também é importante. Apesar de não desejar estar limitado à teoria, acredita-se que genes de resposta que seguem uma transfecção única podem levar a uma diminuição na produção de proteína, indução de citocina e eventualmente perda de viabilidade celular. Esses resultados estão de acordo com mRNA contendo N1-metilpseudouridina que mostra um perfil aperfeiçoado a esse respeito com relação a ambos mRNA não modificado e mRNA modificado com pseudouridina. Tabela 33.Viabilidade percentual
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Exemplo 83. Resposta Imune Inata em Fibroblastos de BJ
[000788] Fibroblastos do prepúcio primário humano (fibroblastos de BJ) são obtidos a partir da American Type Culture Collection (ATCC) (No. catálogo CRL-2522) e cultivados em Meio Essencial Mínimo da Eagle (ATCC, No. cat 30-2003) suplementado com soro bovino fetal 10% a 37 °C, sob CO2 5%. Fibroblastos de BJ são semeados em uma placa de 24 cavidades em uma densidade de 130.000 células por cavidade em 0,5 ml de meio de cultura. 250 ng de mRNA de G-CSF modificado (sequência de mRNA mostrada em SEQ ID NO: 1; cauda poli-A de aproximadamente 160 nucleotídeos não mostrada em sequência; cap 5’, Cap1) totalmente modificado com 5-metilcitosina e pseudouridina (Gen1) ou totalmente modificado com 5-metilcitosina e N1-metilpseudouridina (Gen2) é transfectado usando Lipofectamina 2000 (Invitrogen, No. cat 11668-019), seguindo o protocolo do fabricante. Amostras controle de Lipofectamina 2000 e mRNA de G-CSF não modificado (G-CSF natural) são também transfectadas. As células são transfectadas por cinco dias consecutivos. Os complexos da transfecção são removidos quatro horas após cada etapa de transfecção.
[000789] O sobrenadante de cultura é ensaiado quanto a G-CSF (R&D Systems, No. catálogo DCS50), fator alfa de necrose de tumor (TNF- alfa) e interferon alfa (IFN-alfa) secretados através de ELISA todos os dias após a transfecção, seguindo os protocolos do fabricante. As células são analisadas quanto à viabilidade usando CELL TITER GLO® (Promega, No. catálogo G7570) 6 horas e 18 horas após a primeira rodada de transfecção e dia-sim-dia-não seguindo esta. Ao mesmo tempo a partir das células coletadas, RNA total é isolado e tratado com DNASE® usando micro kit RNAEASY (No. catálogo 74004) seguindo o protocolo do fabricante. 100 ng de RNA total são usados para síntese de cDNA usando o kit High Capacity cDNA Reverse Transcription (Applied Biosystems, No. cat 4368814) seguindo o protocolo do fabricante. O cDNA é então analisado quanto à expressão de genes de resposta imune inata por PCR em tempo real quantitativa usando SybrGreen em um instrumento Biorad CFX 384 seguindo o protocolo do fabricante.
Exemplo 84. Transcrição In vitro com polimerase T7do tipo selvage
[000790] mRNA de luciferase (sequência de mRNA mostrada em SEQ ID NO: 3; cauda poli-A de aproximadamente 160 nucleotídeos não mostrada em sequência; cap 5’, Cap1) e mRNA de G-CSF (sequência de mRNA mostrada em SEQ ID NO: 1; cauda poli-A de aproximadamente 160 nucleotídeos não mostrada em sequência; cap 5’, Cap1) foram totalmente modificados com químicas e combinações químicas diferentes listadas nas Tabelas 34-37 usando polimerase T7do tipo selvagem como previamente descrito.
[000791] O rendimento das reações de tradução foi determinado pela medição de espectrofotometria (OD260) e o rendimento de Luciferase é mostrado na Tabela 34 e G-CSF é mostrado na Tabela 36.
[000792] Os mRNAs modificados de luciferase e de G-CSF foram também submetidos a uma reação de capeamento enzimático e cada reação de capeamento de mRNA modificado foi avaliada quanto a rendimento através medição espectrofotométrica (OD260) e o tamanho correto avaliado usando bioanalisador. O rendimento da reação de capeamento para luciferase é mostrado na Tabela 35 e G-CSF é mostrado na Tabela 37. Tabela 34. Química de transcrição In vitro para Luciferase
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Tabela 35. Química de Capeamento e rendimento para mRNA
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Tabela 36. Química de transcrição In vitro e rendimento para mRNA modificado de G-CSF
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Tabela 37. Química de Capeamento e rendimento para mRNA modificado de G-CSF
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Exemplo 85. Transcrição In vitro com polimerase T7 mutante
[000793] mRNA de luciferase (sequência de mRNA mostrada em SEQ ID NO: 3; cauda poli-A de aproximadamente 160 nucleotídeos não mostrada em sequência; cap 5’, Cap1) e mRNA de G-CSF (sequência de mRNA mostrada em SEQ ID NO: 1; cauda poli-A de aproximadamente 160 nucleotídeos não mostrada em sequência; cap 5’, Cap1) foram totalmente modificados com químicas e combinações químicas diferentes listadas nas Tabelas 38-41 usando uma polimerase T7 mutante (kit de Transcrição Durascribe® T7 (Cat. No. DS010925) (Epicentre®, Madison, WI).
[000794] O rendimento das reações de tradução foi determinado por medição espectrofotométrica (OD260) e o rendimento para Luciferase é mostrado na Tabela 38 e G-CSF é mostrado na Tabela 40.
[000795] Os mRNAs modificados de luciferase e G-CSF foram também submetidos a uma reação de capeamento enzimático e cada reação de capeamento de mRNA modificado foi avaliada quanto a rendimento através medição espectrofotométrica (OD260) e o tamanho correto avaliado usando bioanalisador. O rendimento a partir da reação de capeamento para luciferase é mostrado na Tabela 39 e G-CSF é mostrado na Tabela 41. Tabela 38. Química de transcrição In vitro e rendimento para mRNA modificado de Luciferase
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Tabela 39. Química de Capeamento e rendimento para mRNA modificado de Luciferase
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Tabela 40. Química de transcrição In vitro e rendimento para mRNA modificado de G-CSF
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Tabela 41. Química de Capeamento e rendimen to para mRNA de G- CSF
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Exemplo 86. Compostos 2’O-metila e 2’Flúor
[000796] mRNAs de luciferase (sequência de mRNA mostrada em SEQ ID NO: 3; cauda poli-A de aproximadamente 160 nucleotídeos não mostrada em sequência; cap 5’, Cap1) foram produzidos como versões totalmente modificadas com as químicas na Tabela 42 e transcritos usando polimerase T7 mutante (kit de transcrição Durascribe® T7 (No. Cat. DS010925) (Epicentre®, Madison, WI). mRNA contendo 2’ flúor foi feito usando Durascribe T7, no entanto, mRNA contendo 2’Ometila não pôde ser transcrito usando Durascribe T7.
[000797] Incorporação de mRNA modificado com 2’Ometila poderia talvez ser realizada usando outras polimerases T7 mutantes (Nat Biotechnol. (2004) 22:1155-1160; Nucleic Acids Res. (2002) 30:e138). Alternativamente, modificações de 2’OMe poderiam ser introduzidas após transcrição usando meio enzimático.
[000798] Introdução de modificações no grupo 2’ do açúcar tem muitas vantagens potenciais. Substituições 2’OMe, como substituições 2’ flúor são conhecidas proteger contra as nucleases e também foram mostradas abolir reconhecimento imune inato quando incorporadas em outros ácidos nucleicos tais como siRNA e anti-sentido (incorporados em sua totalidade, Crooke, ed. Antisense Drug Technology, 2a edição; Boca Raton: CRC press).
[000799] Os mRNAs modificados com 2’Flúor foram então transfectados em células HeLa para avaliar a produção de proteína em um contexto celular e o mesmo mRNA foi também avaliado em um sistema de reticulócito de coelhos livre de célula. Um controle de luciferase não modificada (luciferase natural) foi usado para ambos os experimentos de transcrição, um controle de falso transfectado e não tratado (Lipofectamina 2000 sozinha) foi também analisado quanto à transfecção de HeLa e um controle de nenhum RNA foi analisado quanto aos reticulatos de coelhos.
[000800] Para os experimentos de transfecção de HeLa, no dia anterior à transfecção, 20.000 células HeLa (ATCC no. CCL-2; Manassas, VA) foram coletadas por tratamento com solução de Tripsina-EDTA (LifeTechnologies, Grand Island, NY) e semeadas em um volume total de 100 ul de meio EMEM (suplementado com FCS 10% e 1x Glutamax) por cavidade em uma placa de cultura de 96 cavidades (Corning, Manassas, VA). As células foram cultivadas 37 oC em uma atmosfera de CO2 5% durante a noite. No dia seguinte, 83 ng do RNA modificado de luciferase contendo 2’ flúor (sequência de mRNA mostrada em SEQ ID NO: 3; cauda poli-A de aproximadamente 160 nucleotídeos não mostrada em sequência; cap 5’, Cap1) com a modificação química descrita na Tabela 42 foram diluídos em um volume final de 10 uL de OPTI-MEM (LifeTechnologies, Grand Island, NY). Lipofectamina 2000 (LifeTechnologies, Grand Island, NY) foi usada como reagente de transfecção e 0,2 uL foi diluído em um volume final de 10 uL de OPTI-MEM. Após 5 minutos de incubação em temperatura ambiente, ambas as soluções foram combinadas e incubadas mais 15 minutos em temperatura ambiente. Então a solução combinada de 20 uL foi adicionada ao meio de cultura de célula 100ul que contém as células HeLa e incubados em temperatura ambiente. Após 18 a 22 horas de incubação, as células que expressam luciferase foram lisadas com 100 uL de Passive Lysis Buffer (Promega, Madison, WI) de acordo com as instruções do fabricante. Alíquotas dos lisatos foram transferidas para placas de 96 cavidades de poliestireno opacas brancas (Corning, Manassas, VA) e combinadas com 100 uL de solução de ensaio de luciferase completa (Promega, Madison, WI). Os volumes de lisato foram ajustados ou diluídos até não mais do que 2 mil de unidades de luz relativa (RLU) por cavidade fossem detectados para as amostras de produção de sinal mais forte e as RLUs para cada química testada são mostradas na Tabela 42. O leitor de placa era um BioTek Synergy H1 (BioTek, Winooski, VT). O sinal de base das placas sem reagente era de cerca de 200 unidades de luz relativa por cavidade.
[000801] Para o ensaio de lisato de reticulato de coelho, mRNA de luciferase contendo 2’-flúor foi diluído em água livre de nuclease estéril para uma quantidade final de 250 ng em 10 uL e adicionado a 40 uL de Lisato de Reticulócito de Coelho recém-preparado e a reação de tradução in vitro foi feita em um tubo de reação de polipropileno de 1,5 mL padrão (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) a 30°C em um bloco de aquecimento seco. O ensaio de tradução foi feito com kit de Lisato de Reticulócito de Coelho (tratado com nuclease) (Promega, Madison, WI) de acordo com as instruções do fabricante. O tampão da reação foi suplementado com uma mistura um-para-um de soluções de estoque de aminoácido providas destituídas ou Leucina ou Metionina resultando em uma mistura de reação que contém quantidades suficientes de ambos os aminoácidos para permitir a tradução in vitro eficaz. Após 60 minutos de incubação, a reação foi parada ao colocar os tubos de reação em gelo.
[000802] Alíquotas da reação de tradução in vitro contendo RNA modificado de luciferase foram transferidas para placas de 96 cavidades de poliestireno opacas brancas (Corning, Manassas, VA) e combinadas com 100 ul de solução de ensaio de luciferase completa (Promega, Madison, WI). Os volumes das reações de tradução in vitro foram ajustados ou diluídos até que não mais do que 2 mio de unidades de luz relativa (RLUs) por cavidade fossem detectadas para as amostras de produção de sinal mais forte e as RLUs para cada química testada são mostradas na Tabela 43. O leitor da placa era um BioTek Synergy H1 (BioTek, Winooski, VT). O sinal de base das placas sem reagente era de cerca de 160 unidades de luz relativa por cavidade.
[000803] Como pode ser visto na Tabela 42 e 43, compostos contendo 2’Flúor múltiplos são ativos in vitro e produzem proteína luciferase. Tabela 42. Células HeLa
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Tabela 43. Reticulato de Coelho
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Exemplo 87. Luciferase em células HeLa usando uma combinação de modificações
[000804] Para avaliar o uso de mRNA modificado com 2’flúor em combinação com outra modificação, uma série de mRNA foi transcrita usando ou polimerase T7 do tipo selvagem (compostos que não contêm fluoro) ou usando polimerases T7 mutantes (compostos que contêm fluoro) como descrito no Exemplo 86. Todos os mRNAs modificados foram testados através de transfecção in vitro em células HeLa.
[000805] O dia anterior à transfecção, 20.000 células HeLa (ATCC no. CCL-2; Manassas, VA) foram coletadas por tratamento com solução de Tripsina-EDTA (LifeTechnologies, Grand Island, NY) e semeadas em um volume total de 100 uL de meio EMEM (suplementado com FCS 10% e 1x Glutamax) por cavidade em uma placa de cultura de 96 cavidades (Corning, Manassas, VA). As células foram cultivadas a 37 °C em uma atmosfera de CO2 5% durante a noite. No dia seguinte, 83 ng do mRNA modificado de luciferase (sequência de mRNA mostrada em SEQ ID NO: 3; cauda poli-A de aproximadamente 160 nucleotídeos não mostrada em sequência; cap 5’, Cap1) com a modificação química descrita na Tabela 44, foram diluídos em um volume final de 10 uL de OPTI-MEM (LifeTechnologies, Grand Island, NY). Lipofectamina 2000 (LifeTechnologies, Grand Island, NY) foi usada como reagente de transfecção e 0,2 uL foi diluído em um volume final de 10 uL de OPTI- MEM. Após 5 minutos de incubação em temperatura ambiente, ambas as soluções foram combinadas e incubadas por mais 15 minutos em temperatura ambiente. Então, a solução combinada de 20 uL foi adicionada aos 100 uL de meio de cultura celular contendo as células HeLa e incubada em temperatura ambiente.
[000806] Após 18 a 22 horas de incubação, as células que expressam luciferase foram lisadas com 100 uL de Passive Lysis Buffer (Promega, Madison, WI) de acordo com as instruções do fabricante. Alíquotas dos lisatos foram transferidas para placas de 96 cavidades de poliestireno opacas brancas (Corning, Manassas, VA) e combinadas com 100 uL de solução de ensaio de luciferase completa (Promega, Madison, WI). Os volumes de lisato foram ajustados ou diluídos até que não mais do que 2 mio de unidades de luz relativa (RLU) por cavidade fossem detectados para as amostras que produzem sinal mais forte e as RLUs para cada química testada são mostradas na Tabela 44. O leitor de placa era um BioTek Synergy H1 (BioTek, Winooski, VT). O sinal de base das placas sem reagente era de cerca de 200 unidades de luz relativa por cavidade.
[000807] Como evidenciado na Tabela 44, a maior parte das combinações de modificações resultou em mRNA que produziu proteína luciferase funcional, incluindo todos os compostos contendo flúor e muitas das combinações contendo modificações com 2’flúor. Tabela 44. Luciferase
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Exemplo 88. Transcrição de G-CSF In Vitro
[000808] Para avaliar a atividade de todas as quatro modificações químicas diferentes da requerente no contexto de uma segunda janela de leitura aberta, foram replicados experimentos conduzidos anteriormente usando mRNA de luciferase, com mRNA de G-CSF humano. mRNA de G-CSF (sequência de mRNA mostrada em SEQ ID NO: 1; cauda poli-A de aproximadamente 160 nucleotídeos não mostrada em sequência; cap 5’, Cap1) foram totalmente modificados com as químicas nas Tabelas 45 e 46 usando polimerase T7 do tipo selvagem (para todos os compostos que não contêm flúor) ou polimerase T7 mutante (para todos os compostos que contêm flúor). A polimerase T7 mutante foi obtida comercialmente (kit de transcrição Durascribe® T7 (No.Cat. DS010925) (Epicentre®, Madison, WI).
[000809] O RNA modificado nas Tabelas 45 e 46 foi transfectado in vitro em células HeLa ou adicionado a reticulatos de coelho (250ng de mRNA modificado) como indicado. Um controle de G-CSF não tratado, falso transfectado (reagente de transfecção sozinho), totalmente modificado com 5-metilcitosina e N1-metilpseudouridina ou controle de luciferase (sequência de mRNA mostrada em SEQ ID NO: 3; cauda poliA de aproximadamente 160 nucleotídeos não mostrada em sequência; cap 5’, Cap1) totalmente modificados com 5-metilcitosina e N1- metilpseudouridina foram também analisados. A expressão de proteína G-CSF foi determinada através ELISA e os valores são mostrados em Tabelas 45 e 46. Na tabela 45, "NT" significa não testado.
[000810] Como mostrado na Tabela 45, muitas, mas não todas, as modificações químicas resultaram em produção de proteína G-CSF humana. Esses resultados de sistemas de tradução livres de célula e baseados em célula se correlacionam muito bem com as mesmas modificações que geralmente funcionam ou não funcionam em ambos os sistemas. Uma exceção notável é o mRNA de G-CSF modificado com 5-formilcitidina que funcionou no sistema de tradução livre de células, mas não no sistema de transfecção baseado em célula HeLa. Uma diferença similar entre os dois ensaios foi também vista com mRNA de luciferase modificado com 5-formilcitidina.
[000811] Como demonstrado na Tabela 46, muitas, mas não todas, das químicas modificadas de mRNA de G-CSF (quando usadas em combinação) demonstraram atividade in vivo. Ainda, a presença de N1- metilpseudouridina no mRNA modificado (com N4-acetilcitidina ou 5 metilcitidina) demonstrou expressão mais alta do que quando as mesmas combinações foram testadas usando pseudouridina. Juntos, esses dados demonstram que mRNA de G-CSF contendo N1-metilpseudouridina resulta em expressão de proteína in vitro melhorada. Tabela 45. Expressão de G-CSF
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Tabela 46. Químicas de combinação em células HeLa
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Exemplo 89. Avaliação de Químicas
[000812] As tabelas listadas abaixo (Tabelas 47-49) sumarizam muito dos dados de avaliação in vitro e in vivo com os compostos diferentes apresentados nos exemplos anteriores. Uma boa correlação existe entre ensaios de tradução livres de célula e baseados em células. As mesmas substituições químicas geralmente mostram boa concordância se testados no contexto de mRNA de luciferase ou G-CSF. Por último, mRNA contendo N1- metilpseudouridina mostra um nível de expressão de proteína muito alto com pouco ou nenhum estímulo de citocina detectável in vitro e in vivo, e é superior a mRNA que contém pseudouridina ambos in vitro e in vivo.
[000813] mRNA de luciferase (sequência de mRNA mostrada em SEQ ID NO: 3; cauda poli-A de aproximadamente 160 nucleotídeos não mostrada em sequência; cap 5’, Cap1) e mRNA de G-CSF (sequência de mRNA mostrada em SEQ ID NO: 1; cauda poli-A de aproximadamente 160 nucleotídeos não mostrada em sequência; cap 5’, Cap1) foram modificados com químicas que ocorrem naturalmente e não naturalmente descritas nas Tabelas 47 e 48 ou químicas de combinação descritas na Tabela 48 e testados usando os métodos descritos aqui.
[000814] Nas tabelas 47 e 48, "*" se refere à reação de transcrição in vitro usando uma polimerase T7 mutante (kit de transcrição Durascribe® T7 (Cat. No. DS010925) (Epicentre®, Madison, WI); "**" se refere ao segundo resultado da reação de transcrição in vitro usando uma polimerase T7 mutante (kit de transcrição Durascribe® T7 (Cat. No. DS010925) (Epicentre®, Madison, WI); "***" se refere à produção vista em traduções livres de células (lisatos de reticulócito de coelho); a produção de proteína de HeLa é julgada por "+", "+/-" e "-"; quando se refere a G-CSF PBMC "++++" significa maior que 6.000 pg/ml G-CSF, "+++" significa maior que 3.000 pg/ml G-CSF, "++" significa maior que 1.500 pg/ml G-CSF, "+" significa maior que 300 pg/ml G-CSF, "+/-" significa maior que 150-300 pg/ml G-CSF e a base era cerca de 110 pg/ml; quando se referindo à PBMC de citocina "++++" significa maior que 1.000 pg/ml de interferon-alfa (IFN-alfa), "+++" significa maior que 600 pg/ml de IFN-alfa, "++" significa maior que 300 pg/ml de IFN-alfa, "+" significa maior que 100 pg/ml de IFN-alfa, "-" significa menos do que 100 pg/ml e a base foi de cerca de 70 pg/ml; e "NT" significa não testado. Na tabela 48, a produção de proteína foi avaliada usando uma polimerase T7 mutante (kit de transcrição Durascribe® T7 (Cat. No. DS010925) (Epicentre®, Madison, WI). Tabela 47. Ocorrência Natural
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Tabela 48. Ocorrência Não natural
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[000815] Na Tabela 49, a produção de proteína de HeLa é julgada por "+", "+/-" e "-"; quando se refere a G-CSF PBMC "++++" significa mais que 6.000 pg/ml G-CSF, "+++" significa mais que 3.000 pg/ml G-CSF, "++" significa mais que 1,500 pg/ml G-CSF, "+" significa mais que 300 pg/ml G-CSF, "+/-" significa 150-300 pg/ml G-CSF e a base foi de cerca de 110 pg/ml; quando se referindo à citocina de PBMC "++++" significa mais que 1.000 pg/ml de interferon-alfa (IFN-alfa), "+++" significa mais que 600 pg/ml de IFN-alfa, "++" significa mais que 300 pg/ml de IFN- alfa, "+" significa mais que 100 pg/ml de IFN-alfa, "-" significa menos do que 100 pg/ml e a base foi de cerca de 70 pg/ml; "WT" se refere à polimerase T7 do tipo selvagem, "MT" se refere à polimerase T7 mutante (kit de transcrição Durascribe® T7 (Cat. No. DS010925) (Epicentre®, Madison, WI) e "NT" significa não testado. Tabela 49. Química de combinação
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Exemplo 90. Químicas de 2’Flúor em PBMC
[000816] A capacidade de mRNA modificado de G-CSF (sequência de mRNA mostrada em SEQ ID NO: 1; cauda poli-A de aproximadamente 160 nucleotídeos não mostrada em sequência; cap 5’, Cap1) em disparar uma resposta imune foi determinada pela medição de interferon-alfa (IFN-alfa) e a produção de fator alfa de necrose de tumor (TNF-alfa). Uso de culturas de PBMC in vitro é um caminho aceito para medir o potencial imunoestimulador de oligonucleotídeos (Robbins e outros, Oligonucleotides 2009 19:89-102) e métodos de transfecção são descritos aqui. São mostradas na Tabela 50 as médias de 2 ou 3 doadores de PBMC separados da produção de interferon-alfa (IFN-alfa) e fator alfa de necrose de tumor (TNF-alfa) com o tempo conforme medido por ELISA específico. Controles de R848, P(I)P(C), LPS e Lipofectamina 2000 (L2000) também foram analisados.
[000817] Com relação ao reconhecimento imune inato, enquanto ambas químicas de mRNA modificado amplamente preveniram a produção de IFN-alfa e TNF-alfa com relação a controles positivos (R848, P(I)P(C)), compostos 2’flúor reduzem a produção de IFN-alfa e TNF-alfa ainda menor do que outras combinações e as combinações de N4-acetylcitidina aumentaram o perfil de citocina. Tabela 50. IFN-alfa e TNF-alfa
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OUTRAS MODALIDADES
[000818] Deve ser entendido que embora a presente invenção tenha sido descrita em conjunto com a descrição detalhada da mesma, a descrição acima pretende ilustrar e não limitar o escopo da presente invenção, o qual é definido pelo escopo das reivindicações anexas. Outros aspectos, vantagens e modificações estão dentro do escopo das reivindicações que seguem.

Claims (6)

1. Polinucleotídeo isolado codificando um polipeptídeo de interesse, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) uma sequência de número n de nucleosídeos ligados, (b) uma região não traduzida (UTR) 5’, (c) uma região não traduzida (UTR) 3’, e (d) uma ou mais de uma estrutura cap 5’, o dito polinucleotídeo isolado compreendendo uma ou mais de uma modificação química, em que a dita modificação é 1 - metil-pseudouridina, opcionalmente em combinação com 5-metil- citidina (m5C), em que o dito polinucleotídeo isolado proporciona uma razão Proteína:Citocina (P:C) maior que 100 para ambos Fator de Necrose Tumoral alfa (TNF-alfa) e Interferon alfa (IFN -alfa), e em que a dita razão P:C é maior do que a de um polinucleotídeo correspondente compreendendo pseudouridina (^) no lugar de 1- metil-pseudouridina; em que o dito polinucleotídeo está encapsulado em nanopartícula de lipídeo.
2. Polinucleotídeo isolado de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma cauda poli-A.
3. Polinucleotídeo isolado de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que é purificado.
4. Polinucleotídeo isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a uma ou mais de uma estrutura cap 5’ é selecionada do grupo consistindo em Cap0, Cap1, Análogo Anti-Reverso Cap (ARCA), inosina, N1-metil-guanosina, 2’-fluor-guanosina, 7-desaza-guanosina, 8-oxo-guanosina, 2-amino- guanosina, Ácido Nucleoico Bloqueado-Guanosina (LNA-guanosina) e 2-azido-guanosina.
5. Polinucleotídeo isolado de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a razão P:C é determinada usando-se PBMC como um sistema de teste in vitro.
6. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o polinucleotídeo isolado como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, e um excipiente farmaceuticamente aceitável.
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