JP2014533294A

JP2014533294A - ホスホイノシチド３−キナーゼ阻害剤およびヤヌスキナーゼ２−シグナル伝達兼転写活性化因子５経路の調節剤の組合せ

Info

Publication number: JP2014533294A
Application number: JP2014541652A
Authority: JP
Inventors: ベンティレス−エーエルジェイ，モハメド; ブリッシュギ，アドリアン
Original assignee: ノバルティスアーゲー
Priority date: 2011-11-15
Filing date: 2012-11-14
Publication date: 2014-12-11
Also published as: AU2012338869A1; AU2016202503A1; CA2855619A1; BR112014011645A2; HK1197020A1; WO2013072392A1; EP2780017A1; RU2014124184A; KR20140091695A; CN103945850A; US20140343128A1; MX2014005927A

Abstract

本発明は、増殖性疾患、特には固形腫瘍疾患を治療するための、（ａ）ホスホイノシチド３−キナーゼ阻害剤化合物および（ｂ）ＪＡＫ２−ＳＴＡＴ５経路を調節する化合物を含む組合せ医薬（pharmaceutical combination）；このような組合せを含む医薬組成物；増殖性疾患を治療するための医薬の調製のための、このような組合せの使用；同時、個別または逐次使用のための組合せ製剤（combined preparation）としてこのような組合せを含む商業的パッケージまたは製品；ならびに温血動物、特にはヒトを治療する方法に関する。

Description

本発明は、同時、個別または逐次使用のための、特に増殖性疾患、特にはＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路が同時に調節不全となる増殖性疾患を治療するための、（ａ）ホスホイノシチド３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）阻害剤化合物および（ｂ）ヤヌスキナーゼ２（ＪＡＫ２）−シグナル伝達兼転写活性化因子５（Signal Transducer and Activator of Transcription 5、ＳＴＡＴ５）経路を調節する化合物、および場合により少なくとも１つの薬学的に許容される担体を含む組合せ医薬（pharmaceutical combination）；このような組合せを含む医薬組成物；増殖性疾患を治療するための医薬の調製のための、このような組合せの使用；同時、個別または逐次使用のための組合せ製剤（combined preparation）としてこのような組合せを含む商業的パッケージまたは製品；および温血動物、特にはヒトを治療する方法に関する。

主要なシグナル経路（例えば、ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ）を標的にする高度に特異的な阻害剤が急速に開発され、癌研究学界に多くの興奮を引き起こしている。これらの合理的にデザインされた幾つかの療法の臨床的有効性および低い毒性は、癌治療の新たな時代への期待を抱かせた。残念ながら、単剤標的癌療法は、適応耐性、腫瘍再発および避けられない悪化により多くの場合妨げられる。発癌シグナル経路間のクロストークをよりよく理解することが、標的療法に対する耐性の抑制に不可欠であり、新規の、根治的と期待される併用療法（combination therapy）をもたらすはずである。

多様な正常細胞機能の中心的制御因子、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）経路は、多くの場合、腫瘍性形質転換中に破壊される。癌におけるＰＩ３Ｋ経路の活性化の機構には、該キナーゼのアルファ触媒サブユニットであるｐ１１０αをコードする遺伝子であるＰＩＫ３ＣＡの変異および／または増幅；ＰＩ３Ｋ活性を逆転するホスファターゼであるＰＴＥＮの発現の喪失；発癌受容体チロシンキナーゼの下流の活性化；およびＡｋｔ増幅が含まれる。細胞死の減少、細胞増殖、遊走、浸潤、代謝、血管新生および化学療法に対する耐性の増加により、異常なＰＩ３Ｋ経路は、癌細胞に競合優位性を与える。当然のことながら、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲカスケードは、魅力的な治療標的であり、この経路の幾つかの阻害剤は現在、臨床試験中である。

トリプルネガティブ乳癌の幾つかの細胞株および原発性腫瘍モデルを用いて、本発明者らは、ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ阻害が、ＪＡＫ２−ＳＴＡＴ５シグナル伝達を活性化して悪性の正のフィードバックループを誘発し、転移において重要な役割を有する走化性サイトカインＩＬ−８の分泌を誘導することを見出した。ＩＬ−８は今度はＪＡＫ２／ＳＴＡＴ５にフィードバックし、これによりループを完了する。特に、誘導性ＪＡＫ２ｓｈＲＮＡおよびＪＡＫ２阻害剤は、このフィードバックを抑制し、腫瘍の播種および転移を低減した。

ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ阻害の機構的理解から得られた洞察に基づき、本発明者らは、ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲおよびＪＡＫ２−ＳＴＡＴ５経路の複合阻害（combined inhibition）の治療有効性を実証した。実際、ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲおよびＪＡＫ２−ＳＴＡＴ５の複合阻害は、腫瘍の増殖および播種（seed）ならびに転移を低減した。

ＷＯ２００６／１２２８０６は、ＰＩ３−キナーゼなどの脂質キナーゼの活性を阻害することが記載されているイミダゾキノリン誘導体を記載している。本発明に適した特定のイミダゾキノリン誘導体、この調製および該誘導体を含有する適切な医薬製剤はＷＯ２００６／１２２８０６に記載されており、式Ｉ

［式中、
Ｒ_１は、ナフチルまたはフェニルであり（前記フェニルは、ハロゲン；非置換またはハロゲン、シアノ、イミダゾリルもしくはトリアゾリルにより置換されている低級アルキル；シクロアルキル；低級アルキル、低級アルキルスルホニル、低級アルコキシおよび低級アルコキシ低級アルキルアミノからなる群から独立に選択される、１つまたは２つの置換基により置換されているアミノ；低級アルキルおよび低級アルキルスルホニルからなる群から独立に選択される、非置換または１つもしくは２つの置換基により置換されているピペラジニル；２−オキソ−ピロリジニル；低級アルコキシ低級アルキル；イミダゾリル；
ピラゾリル；およびトリアゾリル；からなる群から独立に選択される、１つまたは２つの置換基により置換されている）；
Ｒ_２は、ＯまたはＳであり；
Ｒ_３は、低級アルキルであり；
Ｒ_４は、非置換もしくはハロゲン、シアノ、低級アルキル、低級アルコキシにより置換されているピリジル、または非置換もしくは低級アルキルにより置換されているピペラジニル；非置換または低級アルコキシにより置換されているピリミジニル；非置換またはハロゲンにより置換されているキノリニル；
キノキサリニル；またはアルコキシで置換されているフェニルであり
Ｒ_５は、水素またはハロゲンであり；
ｎは、０または１であり；
Ｒ_６は、オキシドであり；
（ただし、ｎ＝１の場合、基Ｒ_６を有するＮ原子は正の電荷を有する）；
Ｒ_７は、水素またはアミノである］の化合物、もしくはその互換異性体、または薬学的に許容されるその塩、またはその水和物もしくは溶媒和物を含む。

式Ｉの化合物の定義において使用されている基および記号は、ＷＯ２００６／１２２８０６に開示されている意味を有し、該公報は参照により本出願に組み込まれている。

本発明の化合物は、ＷＯ２００６／１２２８０６に詳細に記載されている化合物である。本発明の化合物は、２−メチル−２−［４−（３−メチル−２−オキソ−８−キノリン−３−イル−２，３−ジヒドロ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル）−フェニル］−プロピオニトリルおよびこのモノトシル酸塩（monotosylate salt）（ＢＥＺ−２３５としても知られる化合物Ａ）である。２−メチル−２−［４−（３−メチル−２−オキソ−８−キノリン−３−イル−２，３−ジヒドロ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル）−フェニル］−プロピオニトリルの合成は、例えば、実施例７としてＷＯ２００６／１２２８０６に記載されている。本発明の別の化合物は、８−（６−メトキシ−ピリジン−３−イル）−３−メチル−１−（４−ピペラジン−１−イル−３−トリフルオロメチル−フェニル）−１，３−ジヒドロ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２−オン（化合物Ｂ）である。８−（６−メトキシ−ピリジン−３−イル）−３−メチル−１−（４−ピペラジン−１−イル−３−トリフルオロメチル−フェニル）−１，３−ジヒドロ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２−オンの合成は、例えば、実施例８６としてＷＯ２００６／１２２８０６に記載されている。

ＷＯ０７／０８４７８６は、ＰＩ３−キナーゼなどの脂質キナーゼの活性を阻害することが見出されたピリミジン誘導体を記載している。本発明に適した特定のピリミジン誘導体、この調製および該誘導体を含有する適切な医薬製剤はＷＯ０７／０８４７８６に記載されており、式ＩＩ

の化合物、
またはその立体異性体、その互換異性体、または薬学的に許容されるその塩を含み、式中、
Ｗは、ＣＲ_ｗまたはＮ（ここで、Ｒ_ｗは、
（１）水素、
（２）シアノ、
（３）ハロゲン、
（４）メチル、
（５）トリフルオロメチル、
（６）スルホンアミド
からなる群から選択される）であり；
Ｒ_１は、
（１）水素、
（２）シアノ、
（３）ニトロ、
（４）ハロゲン、
（５）置換および非置換アルキル、
（６）置換および非置換アルケニル、
（７）置換および非置換アルキニル、
（８）置換および非置換アリール、
（９）置換および非置換ヘテロアリール、
（１０）置換および非置換ヘテロシクリル、
（１１）置換および非置換シクロアルキル、
（１２）−ＣＯＲ_１ａ、
（１３）−ＣＯ_２Ｒ_１ａ、
（１４）−ＣＯＮＲ_１ａＲ_１ｂ、
（１５）−ＮＲ_１ａＲ_１ｂ、
（１６）−ＮＲ_１ａＣＯＲ_１ｂ、
（１７）−ＮＲ_１ａＳＯ_２Ｒ_１ｂ、
（１８）−ＯＣＯＲ_１ａ、
（１９）−ＯＲ_１ａ、
（２０）−ＳＲ_１ａ、
（２１）−ＳＯＲ_１ａ、
（２２）−ＳＯ_２Ｒ_１ａ、ならびに
（２３）−ＳＯ_２ＮＲ_１ａＲ_１ｂ
（ここで、Ｒ_１ａおよびＲ_１ｂは、
（ａ）水素、
（ｂ）置換または非置換アルキル、
（ｃ）置換および非置換アリール、
（ｄ）置換および非置換ヘテロアリール、
（ｅ）置換および非置換ヘテロシクリル、ならびに
（ｆ）置換および非置換シクロアルキルからなる群から独立に選択される）からなる群から選択され；
Ｒ_２は、
（１）水素、
（２）シアノ、
（３）ニトロ、
（４）ハロゲン、
（５）ヒドロキシ、
（６）アミノ、
（７）置換および非置換アルキル、
（８）−ＣＯＲ_２ａ、ならびに
（９）−ＮＲ_２ａＣＯＲ_２ｂ、
（ここで、Ｒ_２ａおよびＲ_２ｂは、
（ａ）水素、および
（ｂ）置換または非置換アルキルからなる群から独立に選択される）からなる群から選択され；
Ｒ_３は、
（１）水素、
（２）シアノ、
（３）ニトロ、
（４）ハロゲン、
（５）置換および非置換アルキル、
（６）置換および非置換アルケニル、
（７）置換および非置換アルキニル、
（８）置換および非置換アリール、
（９）置換および非置換ヘテロアリール、
（１０）置換および非置換ヘテロシクリル、
（１１）置換および非置換シクロアルキル、
（１２）−ＣＯＲ_３ａ、
（１３）−ＮＲ_３ａＲ_３ｂ、
（１４）−ＮＲ_３ａＣＯＲ_３ｂ、
（１５）−ＮＲ_３ａＳＯ_２Ｒ_３ｂ、
（１６）−ＯＲ_３ａ、
（１７）−ＳＲ_３ａ、
（１８）−ＳＯＲ_３ａ、
（１９）−ＳＯ_２Ｒ_３ａ、ならびに
（２０）−ＳＯ_２ＮＲ_３ａＲ_３ｂ、
（ここで、Ｒ_３ａおよびＲ_３ｂは、
（ａ）水素、
（ｂ）置換または非置換アルキル、
（ｃ）置換および非置換アリール、
（ｄ）置換および非置換ヘテロアリール、
（ｅ）置換および非置換ヘテロシクリル、ならびに
（ｆ）置換および非置換シクロアルキルからなる群から独立に選択される）からなる群から選択され；ならびに
Ｒ_４は、
（１）水素、および
（２）ハロゲンからなる群から選択される。

式ＩＩの化合物の定義において使用されている基および記号は、ＷＯ０７／０８４７８６に開示されている意味を有し、該公報は参照により本出願に組み込まれている。

本発明の化合物は、ＷＯ０７／０８４７８６に詳細に記載されている化合物である。本発明の化合物は、５−（２，６−ジ−モルホリン−４−イル−ピリミジン−４−イル）−４−トリフルオロメチル−ピリジン−２−イルアミン（ＢＫＭ−１２０としても知られる化合物Ｃ）である。５−（２，６−ジ−モルホリン−４−イル−ピリミジン−４−イル）−４−トリフルオロメチル−ピリジン−２−イルアミンの合成は、実施例１０としてＷＯ０７／０８４７８６に記載されている。

本発明の文脈において、および実施例で実証されているように、ＰＩ３Ｋ阻害剤は、哺乳類ラパマイシン標的（ｍＴＯＲ）の阻害剤に置き換えられてもよい。故に、本明細書で使用されるとき、用語「ＰＩ３Ｋ阻害剤」および「ホスホイノシチド３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）阻害剤」化合物は、ｍＴＯＲ阻害剤も含む。さらに、本明細書で使用されるとき、用語「ＰＩ３Ｋ阻害剤」および「ホスホイノシチド３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）阻害剤」は、ＡＫＴなどの他のＰＩ３Ｋ経路成分の阻害剤も包含する。ｍＴＯＲ阻害剤は、ラパマイシン標的（ｍＴＯＲ）経路の活性を低下させる化合物である。ラパマイシン標的経路の活性低下は、ラパマイシンの標的の生物学的機能の低下により定義される。ラパマイシン生物学的機能の標的には、例えば、インターロイキン−２（ＩＬ−２）に対する応答の阻害、ＴおよびＢ細胞の活性化のブロック、増殖の制御、および細胞増殖の制御が含まれる。ｍＴＯＲ阻害剤は、例えば、タンパク質ＦＫ−結合タンパク質１２（ＦＫＢＰ１２）に結合して作用する。ｍＴＯＲ阻害剤は、当技術分野で知られており、または本明細書に記載された方法を用いて同定される。ｍＴＯＲ阻害剤は、例えば、ラパマイシン、テムシロリムス（２，２−ビス（ヒドロキシメチル）プロピオン酸；ＣＣＩ−７７９）またはエベロリムス（ＲＡＤ００１）；ＡＰ２３５７３またはこれらの模倣体もしくは誘導体などのマクロライド抗生物質である。さらなるｍＴＯＲ阻害剤は、テムシロリムス、リダフォロリムス（ＡＰ２３５７３としても知られる）、ＭＫ−８６６９（正式にはデフォロリムスとして知られる）、シロリムス、ゾタロリムスおよびバイオリムスである。ラパマイシンの模倣体および誘導体は、米国特許第ＲＥ３７．４２１号；５，９８５，８９０号；５，９１２，２５３号；５，７２８，７１０号；５，７１２，１２９号；５，６４８，３６１号；７，３３２，６０１号；７，２８２，５０５号；６，６８０，３３０号に記載されているものなど、当技術分野で知られている。故に、本明細書で使用されるとき、用語ＰＩ３Ｋ阻害剤は、ＰＩ３ＫおよびｍＴＯＲの両方を阻害するｍＴＯＲ阻害剤および／または化合物、例えば化合物Ａも含む。

ヤヌスキナーゼ（ＪＡＫ）は、４つのメンバー、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３およびＴＹＫ２を有する細胞内タンパク質チロシンキナーゼの一ファミリーを形成する。これらのキナーゼは、細胞増殖、分化および細胞生存を含むさまざまな生物学的応答を誘導するサイトカイン受容体シグナル伝達の媒介において重要である。マウスにおけるノックアウト実験は、ＪＡＫがとりわけ造血において重要であることを示した。さらに、ＪＡＫ２は、骨髄増殖性疾患および癌に関与することが示された。染色体再配列および／または負のＪＡＫ／ＳＴＡＴ（ＳＴＡＴ＝シグナル伝達活性化因子（signal transducing and activating factor）（複数可））経路制御因子の喪失によるＪＡＫ２活性化は、血液悪性腫瘍および特定の固形腫瘍で観察されている。

ヤヌスキナーゼ２（一般にＪＡＫ２と呼ばれる）は、ＩＩ型サイトカイン受容体ファミリー（例えばインターフェロン受容体）、ＧＭ−ＣＳＦ受容体ファミリー（ＩＬ−３Ｒ、ＩＬ−５ＲおよびＧＭ−ＣＳＦ−Ｒ）、ｇｐ１３０受容体ファミリー（例えばＩＬ−６Ｒ）、および一本鎖受容体（例えばＥｐｏ−Ｒ、Ｔｐｏ−Ｒ、ＧＨ−Ｒ、ＰＲＬ−Ｒ）のメンバーによるシグナル伝達に関与しているヒトタンパク質である。ＪＡＫ２シグナル伝達は、プロラクチン受容体から下流で活性化される。ＪＡＫ２遺伝子はＴＥＬ（ＥＴＶ６）（ＴＥＬ−ＪＡＫ２）と融合し、ＰＣＭ１遺伝子は、白血病患者において見出されている。さらに、ＪＡＫ２における変異は、真性赤血球増加症、本態性血小板血症、および他の骨髄増殖性障害に関与している。この変異（６１７位でのバリンのフェニルアラニンへの変化）は、エリスロポエチンおよびトロンボポエチンなどの増殖因子に対して造血細胞をより感受性にするようである。ＪＡＫ２の喪失は、マウスにおいて胎生１２日目までは致死的である。ＪＡＫ２オルソログは、完全なゲノムデータが利用可能な全ての哺乳類で同定されている。

ＪＡＫ−ＳＴＡＴシグナル伝達経路は、細胞の外側の化学シグナルからの情報を、細胞膜を通じて細胞核中のＤＮＡ上の遺伝子プロモーターに伝達し、細胞におけるＤＮＡ転写および活性をもたらす。ＪＡＫ−ＳＴＡＴ系は、セカンドメッセンジャー系に代わる主なシグナル伝達である。ＪＡＫ−ＳＴＡＴ系は、３つの主成分、すなわち、受容体、ＪＡＫおよびＳＴＡＴからなる。ＪＡＫはヤヌスキナーゼの略であり、ＳＴＡＴはシグナル伝達兼転写活性化因子の略である。受容体は、インターフェロン、インターロイキン、増殖因子、または他の化学的メッセンジャーからのシグナルにより活性化される。これが、自らを自己リン酸化する（リン酸基がタンパク質上の「オン」および「オフ」スイッチとして作用する）ＪＡＫのキナーゼ機能を活性化する。ＳＴＡＴタンパク質が、次いでリン酸化受容体に結合する。ＳＴＡＴはリン酸化され、細胞核に移行し、ＤＮＡに結合し、ＳＴＡＴに応答した遺伝子の転写を促進する。哺乳類では、７つのＳＴＡＴ遺伝子があり、１つ１つが異なるＤＮＡ配列に結合する。ＳＴＡＴは、プロモーターと呼ばれるＤＮＡ配列に結合し、他のＤＮＡ配列の発現を制御する。これは、細胞増殖、分化および死のような基本的な細胞機能に影響を与える。ＪＡＫ−ＳＴＡＴ経路は、哺乳類に対する粘菌および寄生虫から（ただし、菌類または植物ではない）進化的に保存される。破壊されたまたは調節不全のＪＡＫ−ＳＴＡＴ機能性（通常、遺伝的または後天的遺伝子欠陥による）は、免疫不全症候群および癌をもたらす可能性がある。

チロシンキナーゼ活性を有するＪＡＫは、幾つかの細胞表面サイトカインおよびホルモン受容体に結合する。受容体へのリガンドの結合は、ＪＡＫの活性化を誘発する。キナーゼ活性が増えるにつれ、ＪＡＫは、受容体上のチロシン残基をリン酸化し、ホスホチロシン結合ＳＨ２ドメインを含有するタンパク質と相互作用するための部位を作る。これらのホスホチロシン残基を結合することができるＳＨ２ドメインを有するＳＴＡＴが受容体に動員され、ＪＡＫにより自らチロシンリン酸化される。これらのホスホチロシンは、次いで他のＳＴＡＴのＳＨ２ドメインに対する結合部位として作用し、該ＳＴＡＴの二量体化を媒介する。種々のＳＴＡＴがヘテロまたはホモ二量体を形成する。活性化されたＳＴＡＴ二量体は細胞核に蓄積し、この標的遺伝子の転写を活性化する。ＳＴＡＴはまた、上皮増殖因子受容体などの受容体チロシンキナーゼ、およびｃ−ｓｒｃなどの非受容体チロシンキナーゼによっても直接チロシン−リン酸化され得る。該経路は、複数のレベルで負に調節される。タンパク質チロシンホスファターゼは、サイトカイン受容体および活性化ＳＴＡＴからリン酸塩を除去する。他のサイトカインシグナル抑制因子（ＳＯＣＳ）は、ＪＡＫを結合および阻害すること、またはサイトカイン受容体上のホスホチロシン結合部位をＳＴＡＴと競合することにより、ＳＴＡＴリン酸化を阻害する。ＳＴＡＴはまた、幾つかの機構を通じて核で作用する活性化ＳＴＡＴのタンパク質阻害剤（ＰＩＡＳ）によっても負に調節される。例えば、ＰＩＡＳ１およびＰＩＡＳ３は、ＳＴＡＴ１およびＳＴＡＴ３による転写活性化を、それぞれ、これらが認識するＤＮＡ配列への結合および該配列へのアクセスのブロックにより阻害する。

ヤヌスキナーゼ阻害剤は、１つまたは複数のヤヌスキナーゼファミリーの酵素（ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３、ＴＹＫ２）の効果を阻害すること、ＪＡＫ−ＳＴＡＴシグナル伝達経路を妨げることにより機能する薬の一クラスである。

幾つかのＪＡＫ２阻害剤が、真性赤血球増加症、本態性血小板血症、および骨髄線維症を伴う骨髄化生の治療のために開発中である。ＪＡＫ２の幾つかの阻害剤は、例えば乾癬について臨床試験中である。

ＪＡＫ２阻害剤の例は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）についてのＪＡＫ２に対するレスタウルチニブ、乾癬、骨髄線維症、および関節リウマチについてのＪＡＫ１／ＪＡＫ２に対するルクソリチニブ、再発リンパ腫、進行骨髄性腫瘍、骨髄線維症およびＣＩＭＦについてのＪＡＫ２に対するＳＢ１５１８、骨髄増殖性障害についてのＪＡＫ２に対するＣＹＴ３８７、関節リウマチについての第ＩＩｂ相試験が開始しているＪＡＫ１／ＪＡＫ２に対するＬＹ３００９１０４（ＩＮＣＢ２８０５０）、ＪＡＫ２に対するＩＮＣ４２４（ＩＮＣＢ０１８４２としても知られる）、ＪＡＫ２に対する化合物Ｄ、ＪＡＫ２に対するＴＧ１０１３４８（骨髄線維症に対する第Ｉ相試験結果が公開されている）、ＪＡＫ２に対するＬＹ２７８４５４４、ＪＡＫ２に対するＢＭＳ−９１１５４３、およびＮＳ−０１８（Nakayaら、2011、Blood Cancer Journal、1、e29；doi：10.1038/bcj.2011.29）である。

ＷＯ２００５／０８０３９３は、とりわけ、異常または調節不全キナーゼ活性を伴う障害の治療において有用な７Ｈ−ピロロ［２，３ｄ］ピリミジン−２イル−アミノ誘導体を開示している。

Bioorganic & Medical Chemistry Letters 16（2006）、2689頁は、焦点接着キナーゼ阻害剤としての特定の７Ｈ−ピロロ［２，３ｄ］ピリミジンの設計および合成を開示している。

ＷＯ２００９／０９８２３６に開示されているように、下に示された式ＩＩＩの７−フェニル−７Ｈ−ピロロ［２，３ｄ］ピリミジン−２イル−アミノ誘導体は、有利な薬理学的特性を有し、例えば、ＪＡＫ２キナーゼおよび／またはＪＡＫ３キナーゼ（ただしＪＡＫ１キナーゼも）などのヤヌスキナーゼのチロシンキナーゼ活性を阻害することが見出された。故に、式ＩＩＩの化合物は、ＪＡＫ２（および／またはＪＡＫ３）キナーゼのチロシンキナーゼ活性に依存する疾患、特には腫瘍疾患、白血病、真性赤血球増加症、本態性血小板血症、および骨髄化生を伴う骨髄線維症などの増殖性疾患を治療するために本発明の組合せにおいて使用されるのに例えば適している。

一態様において、本発明は、式ＩＩＩ

［式中、
Ｒ^１は、非置換または置換ヘテロシクリル、非置換または置換アリール、非置換または置換シクロアルキルを表し；
Ｒ^２は、水素、ハロゲン、低級アルキル、低級アルキルオキシ、低級ハロアルキル、シクロアルキル、シクロアルキルオキシ、ハロシクロアルキル、シクロアルキルオキシ、ハロシクロアルキルオキシを表し；
Ｒ^３は、水素、ハロゲン、低級アルキル、低級アルキルオキシ、低級ハロアルキル、シクロアルキル、シクロアルキルオキシ、ハロシクロアルキル、シクロアルキルオキシ、ハロシクロアルキルオキシを表し；
またはＲ^２および／もしくはＲ^３は、Ｒ^５もしくはＲ^７に連結されて、Ｒ^２／Ｒ^３が付着しているフェニル環に縮合した環状部分を形成し；
Ｒ^２ａは、水素、ハロゲン、低級アルキル、低級アルキルオキシ、低級ハロアルキル、シクロアルキル、シクロアルキルオキシ、ハロシクロアルキル、シクロアルキルオキシ、ハロシクロアルキルオキシを表し；
Ｒ^３ａは、水素、ハロゲン、低級アルキル、低級アルキルオキシ、低級ハロアルキル、シクロアルキル、シクロアルキルオキシ、ハロシクロアルキル、シクロアルキルオキシ、ハロシクロアルキルオキシを表し；
Ｒ^４は、基：

（ここで、Ａ^１は、以下の基：

の１つを表し、
^＊を付された原子は、フェニル環に結合されている）を表し；
または
Ｒ^４は、以下の基：

の１つを表し；
Ｒ^５は、互いに独立に水素、低級アルキル、低級ハロアルキル、シクロアルキル、ハロシクロアルキルを表し、またはこれらが付着している炭素と一緒になってシクロアルキルを形成し；
Ｒ^６およびＲ^７は、これらが付着している窒素と一緒になって、場合により置換されている複素環を表し、
または
Ｒ^６は、水素もしくは場合により置換されているアルキルを表し、および
Ｒ^７は、場合により置換されているアルキルを表し；
Ｒ^８は、アルキル、ヒドロキシ、低級アルキルオキシ、低級ハロアルキルオキシ、シクロアルキルオキシ、ハロシクロアルキルオキシ、低級アルキルスルホニル、低級ハロアルキルスルホニル、シクロアルキルスルホニル、ハロシクロアルキルスルホニル、低級アルキルスルフィニル、低級ハロアルキルスルフィニル、シクロアルキルスルフィニル、ハロシクロアルキルスルフィニルを表し；
Ｒ^９は、Ｈまたは低級アルキルを表し；
Ｒ^１０は、水素、低級アルキル、低級ハロアルキル、シクロアルキル、ハロシクロアルキルを表し；
ｎは、０、１または２を表す］の化合物
またはその塩に関する。

式ＩＶの化合物の定義において使用されている基および記号は、ＷＯ２００９／０９８２３６に開示されている意味を有し、該公報は参照により本出願に組み込まれている。

ＷＯ２００８／１４８８６７は、式（ＩＶ）

（式中、キノキサリン環の２および８位は、環状基により置換されている）のキノキサリン化合物を開示している。化合物は、ＪＡＫ２およびＪＡＫ３キナーゼを含むヤヌスキナーゼのチロシンキナーゼ活性の阻害剤として有用であり得る。ＷＯ２００８／１４８８６７の実施例９８は、８−（３，５−ジフルオロ−４−モルホリン−４−イルメチル−フェニル）−２−（１−ピペリジン−４−イル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−キノキサリン（ＢＳＫ８０５またはＢＳＫ−８０５としても知られる化合物Ｄ）を記載している。

式ＩＶの化合物の定義において使用されている基および記号は、ＷＯ２００８／１４８８６７に開示されている意味を有し、該公報は参照により本出願に組み込まれている。

本明細書で使用されるとき、ＳＴＡＴ５は、２つの高度に関連したタンパク質、ＳＴＡＴ５ＡおよびＳＴＡＴ５Ｂを指し、これらは、別個の遺伝子によりコードされているがアミノ酸レベルでは９０％同一である（Grimley PM、Dong F、Rui H、1999、Cytokine Growth Factor Rev. 10（2）:131〜157頁）。シグナル伝達兼転写活性化因子５Ａ（ＳＴＡＴ５Ａ）は、ヒトにおいてＳＴＡＴ５Ａ遺伝子によりコードされるタンパク質である。ＳＴＡＴ５Ａオルソログは、完全なゲノムデータが利用可能な幾つかの胎盤で同定されている。この遺伝子によりコードされたタンパク質は、転写因子のＳＴＡＴファミリーのメンバーである。サイトカインおよび増殖因子に応答して、ＳＴＡＴファミリーメンバーは受容体関連キナーゼによりリン酸化され、次いでホモまたはヘテロ二量体を形成し、該二量体は細胞核へ移行し、転写活性化因子として作用する。このタンパク質は、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ７ＧＭ−ＣＳＦ、エリスロポエチン、トロンボポエチン、および種々の成長ホルモンなどの多くの細胞リガンドの応答により活性化され、ならびに該応答を媒介する。ＴＥＬ／ＪＡＫ２遺伝子融合に関連した骨髄腫およびリンパ腫においてこのタンパク質の活性化は、細胞刺激とは無関係であり、腫瘍形成に不可欠であることが示されている。この遺伝子のマウス対応物は、ＢＣＬ２Ｌ１／ＢＣＬ−Ｘ（Ｌ）の発現を誘導することが見出され、細胞におけるこの遺伝子の抗アポトーシス機能を示唆している。ＳＴＡＴ５Ａは、ＣＲＫＬ、上皮増殖因子受容体、ＥＲＢＢ４、エリスロポエチン受容体、ヤヌスキナーゼ１、ヤヌスキナーゼ２、ＭＡＰＫ１、ＮＭＩ、およびＰＴＰＮ１１と相互作用することが示されている。シグナル伝達兼転写活性化因子５Ｂは、ヒトにおいてＳＴＡＴ５Ｂ遺伝子によりコードされるタンパク質である。ＳＴＡＴ５Ｂオルソログは、完全なゲノムデータが利用可能なほとんどの胎盤で同定されている。この遺伝子にコードされたタンパク質は、転写因子のＳＴＡＴファミリーのメンバーである。このタンパク質は、ＩＬ２、ＩＬ４、ＣＳＦ１、および種々の成長ホルモンなどのさまざまな細胞リガンドにより誘発されるシグナル伝達を媒介する。該タンパク質は、ＴＣＲシグナル伝達、アポトーシス、成人の乳腺発達、および肝臓遺伝子発現の性的二形性などの多様な生物学的プロセスに関与することが示されている。この遺伝子は、急性前骨髄球性白血病（ＡＰＭＬ）の小さいサブセットにおいてレチノイン酸受容体アルファ（ＲＡＲＡ）遺伝子に融合することが見出された。ＳＴＡＴ５Ｂは、ＰＴＰＮ１１、ヤヌスキナーゼ２、ヤヌスキナーゼ１およびグルココルチコイド受容体と相互作用することが示されている。

ＳＴＡＴ５阻害剤は当技術分野で知られている。例えばCumaraswamyら、2011、MedChemComm、DOI: 10.1039/c1md00175bを参照のこと。これらには、ピモジド、Ｎ’−（（４−オキソ−４Ｈ−クロメン−３−イル）メチレン）ニコチノヒドラジド（化合物Ｅ）、「ＩＱＤＭＡ」（Ｎ１−（１１Ｈ−インドロ［３，２−ｃ］キノリン−６−イル）−Ｎ２，Ｎ２−ジメチルエタン−１，２−ジアミン；（化合物Ｆ）、ならびにCumaraswamyら、2011、（MedChemComm、DOI: 10.1039/c1md00175b；それぞれ化合物Ｇ、ＨおよびＩ）に記載された化合物１２、１３および１４が含まれる。

故に、本発明はまた、（ａ）ホスホイノシチド３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）阻害剤化合物および（ｂ）ヤヌスキナーゼ２（ＪＡＫ２）−シグナル伝達兼転写活性化因子５（ＳＴＡＴ５）経路を調節する化合物を含む組合せ製剤または医薬組成物などの組合せにも関する。より具体的には、第１の実施形態において本発明は、（ａ）ホスホイノシチド３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）阻害剤化合物および（ｂ）ＪＡＫ２調節剤（modulator）を含む組合せに関する。

用語「組合せ（combination）」および「組合せ製剤（combined preparation）」は本明細書で使用されるとき、上に定義された組合せパートナー（ａ）および（ｂ）が、独立に投与され得る、または区別された量の組合せパートナー（ａ）および（ｂ）を用いた種々の固定された組合せの使用により投与され得る（すなわち、同時にまたは異なる時点で）という意味で、「キット・オブ・パーツ（kit of parts）」も定義する。キット・オブ・パーツのパーツは、次いで、例えば、同時にまたは経時的に交互に（すなわち、キット・オブ・パーツの任意のパーツに対し、異なる時点でおよび同等のまたは異なる時間間隔で）投与され得る。組合せ製剤において投与される、組合せパートナー（ａ）対組合せパートナー（ｂ）の合計量の比は、例えば、治療される患者亜集団のニーズまたは単一患者のニーズに対処するために変えることができる。

実施例に示されているように、ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ阻害剤およびＪＡＫ２−ＳＴＡＴ５阻害剤による併用療法は、腫瘍疾患の治療において予期せぬ改善をもたらすことが見出された。同時、逐次または個別に投与される場合、ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ阻害剤およびＪＡＫ２−ＳＴＡＴ５阻害剤は、相乗的に相互作用して細胞数および腫瘍増殖を低減し、ならびに循環腫瘍細胞の数および転移を減少させる。この予期せぬ相乗効果は、各化合物に求められる用量の低下を可能にし、副作用の低減ならびに化合物および治療の臨床効果の増大をもたらす。

１つまたは複数の成分間の相乗的相互作用を判定しながら、該効果に対する最適範囲および該効果に対する各成分の絶対用量範囲は、治療を必要としている患者に種々のｗ／ｗ比範囲および用量にわたる成分を投与して、確定的に測定することができる。ヒトに関して、患者に対し臨床試験を実施することの複雑さおよび費用は、相乗効果に関する１次モデルとしてのこの形態の試験の使用を非実用的にする。しかし、１つの種における相乗効果の観察は、他の種における該効果を予測することができ、ならびに相乗効果を測定するための本明細書に記載されたような動物モデルが存在し、このような試験の結果も、薬物動態的/薬力学的方法を適用して、有効用量および血漿濃度比範囲ならびに他の種において必要とされる絶対用量および血漿濃度を予測するのに使用することができる。ヒトにおいて見られる腫瘍モデルと効果の間の確立された相関は、動物における相乗効果が、例えば、下の実施例に記載されているような腫瘍モデルで実証され得ることを示唆している。

一態様において本発明は、相乗的相互作用を同定するのに使用される、例えば下の実施例に記載されているような腫瘍モデルで観察された範囲に対応する組合せ範囲（ｗ／ｗ）で、（ａ）ＰＩ３Ｋ阻害剤化合物および（ｂ）ＪＡＫ２−ＳＴＡＴ５経路を調節する化合物、または薬学的に許容される塩もしくはその溶媒和物を含む、ヒト投与のための相乗的組合せを提供する。適切には、ヒトにおける比範囲は、５０：１〜１：５０重量部、５０：１〜１：２０、５０：１〜１：１０、５０：１〜１：１、２０：１〜１：５０、２０：１〜１：２０、２０：１〜１：１０、２０：１〜１：１、１０：１〜１：５０、１０：１〜１：２０、１０：１〜１：１０、１０：１〜１：１、１：１〜１：５０、１．１〜１：２０および１：１〜１：１０の間から選択される非ヒト範囲に対応する。より適切には、ヒト範囲は、１０：１〜１：１または５：１〜１：１または２：１〜１：１重量部の順の非ヒト範囲に対応する。

さらなる態様により、本発明は、（ａ）ＰＩ３Ｋ阻害剤化合物および（ｂ）ＪＡＫ２−ＳＴＡＴ５経路を調節する化合物、または薬学的に許容されるその塩を含み、各成分の用量範囲が、相乗的相互作用を同定するのに主に使用される適切な腫瘍モデル、例えば下の実施例に記載された腫瘍モデルで観察された相乗的範囲に対応する、ヒトに投与するための相乗的組合せを提供する。適切には、ヒトにおけるＰＩ３Ｋ阻害剤化合物の用量範囲は、適切な腫瘍モデル、例えば下の実施例に記載されているようなマウスモデルにおける１〜１０００ｍｇ／ｋｇ、例えば、１〜５００ｍｇ／ｋｇ、１〜１０００ｍｇ／ｋｇ、１〜２００ｍｇ／ｋｇ、１〜１００ｍｇ／ｋｇ、１〜５０ｍｇ／ｋｇ、１〜３０ｍｇ／ｋｇ（例えば化合物Ａについては１〜３５ｍｇ／ｋｇまたは１〜１０ｍｇ／ｋｇ、化合物Ｂについては１〜２５ｍｇ／ｋｇ）の用量範囲に対応する。

ＪＡＫ２−ＳＴＡＴ５経路を調節する化合物に関して、ヒトにおける用量範囲は、適切な腫瘍モデル、例えば下の実施例に記載されているようなマウスモデルにおける１〜５０ｍｇ／ｋｇまたは１〜３０ｍｇ／ｋｇ（例えば１〜２５ｍｇ／ｋｇ、１〜１０ｍｇ／ｋｇまたは１〜２．５ｍｇ／ｋｇ）の相乗的範囲に適切には対応する。

適切には、ヒトで使用するためのＰＩ３Ｋ阻害剤化合物の用量は、１日１回または１日２回（ｂ．ｉ．ｄ．）または１日３回（ｔ．ｉ．ｄ．）、１〜１２００ｍｇ、１〜５００ｍｇ、１〜１００ｍｇ、１〜５０ｍｇ、１〜２５ｍｇ、５００〜１２００ｍｇ、１００〜１２００ｍｇ、１００〜５００ｍｇ、５０〜１２００ｍｇ、５０〜５００ｍｇ、または５０〜１００ｍｇ、適切には５０〜１００ｍｇから選択される範囲にあり、ＪＡＫ２−ＳＴＡＴ５経路を調節する化合物の用量は、１日１回、ｂ．ｉ．ｄまたはｔ．ｉ．ｄ、１〜１０００ｍｇ、１〜５００ｍｇ、１〜２００ｍｇ、１〜１００ｍｇ、１〜５０ｍｇ、１〜２５ｍｇ、１０〜１００ｍｇ、１０〜２００ｍｇ、５０〜２００ｍｇまたは１００〜５００ｍｇから選択される範囲にある。

さらなる態様によって本発明は、（ａ）ＰＩ３Ｋ阻害剤化合物を最大耐用量（maximal tolerable dose、ＭＴＤ）の１０％〜１００％、好ましくは５０％〜１００％、またはより好ましくは７０％〜１００％、８０％〜１００％もしくは９０％〜１００％で、および（ｂ）ＪＡＫ２−ＳＴＡＴ５経路を調節する化合物をＭＴＤの１０％〜１００％、好ましくは５０％〜１００％、またはより好ましくは７０％〜１００％、８０％〜１００％もしくは９０％〜１００％で含む、ヒトに投与するための相乗的組合せを提供する。一実施形態において化合物の１つ、好ましくはＰＩ３Ｋ阻害剤化合物は、ＭＴＤで投与され、他の化合物、好ましくはＪＡＫ２−ＳＴＡＴ５経路を調節する化合物は、ＭＴＤの５０％〜１００％、好ましくはＭＴＤの６０％〜９０％で投与される。ＭＴＤは、容認できない副作用なしに投与することができる薬の最高用量に対応する。ＭＴＤを決定することは当技術分野の範囲内である。例えば、ＭＴＤは、用量制限毒性を明らかにするための用量漸増試験、および生物学的に活性な耐量レベルの決定を含む第Ｉ相試験において適切に決定することができる。

本発明の一実施形態において、（ａ）ホスホイノシチド３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）阻害剤化合物阻害剤は、化合物Ａ、化合物Ｂまたは化合物Ｃからなる群から選択される。

本発明の一実施形態において、（ｂ）ＪＡＫ２−ＳＴＡＴ５調節剤は、レスタウルチニブ、ルクソリチニブ、ＳＢ１５１８、ＣＹＴ３８７、ＬＹ３００９１０４（ＩＮＣＢ２８０５０）、ＩＮＣ４２４（ＩＮＣＢ０１８４２としても知られる）、化合物Ｄ（ＢＳＫ−８０５）、ＴＧ１０１３４８、ＬＹ２７８４５４４、ＢＭＳ−９１１５４３およびＮＳ−０１８からなる群から選択される阻害剤である。

本発明のさらなる態様は、対象の腫瘍におけるＩＬ−８および／もしくはＪＡＫ２／ＳＴＡＴ５の発現、または前記対象の血漿中のＩＬ−８の存在に基づき、どの対象がＢＥＺに対し抵抗することになるかを予測するためのキットおよび方法を含む。

用語「治療（処理）する（treating）」または「治療（処理）（treatment）」は本明細書で使用されるとき、疾患の進行の遅延をもたらす治療を含む。用語「進行の遅延」は本明細書で使用されるとき、治療される増殖性疾患の前段階または初期相にある患者への該組合せの投与を意味し、患者は、例えば対応する疾患の前形態が診断され、または患者は、例えば薬物治療中の状態、もしくは偶然の結果、対応する疾患が発生する可能性がある状態にある。

治療される対象は、通常はヒトである。大部分はヒトを指すが、しかし、本発明はヒトに限定されない。本発明において、対象は、ヒトに次いでウシ、ブタ、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌ、ラクダ等などの動物を含むがこれらに限定されない、任意の温血動物であってもよい。

本発明の一実施形態において、増殖性疾患は乳癌、特に転移性乳癌またはトリプルネガティブ型の乳癌である。

本発明の別の実施形態において、増殖性疾患は固形腫瘍である。用語「固形腫瘍」は、特には、乳癌、卵巣癌、結腸および一般にはＧＩ（胃腸）管の癌、頸癌、肺癌、特に小細胞肺癌および非小細胞肺癌、頭部および頸部癌、膀胱癌、前立腺の癌またはカポジ肉腫を意味する。本組合せは、固形腫瘍の増殖を阻害するが、液性腫瘍も阻害する。さらに、腫瘍型および使用される特定の組合せに応じて、腫瘍体積の減少が得られる可能性がある。本明細書に開示された組合せは、腫瘍、例えば乳癌の転移拡大、および微小転移の増殖または発生を防ぐのにも適している。本明細書に開示された組合せは、予後不良患者の治療に特に適している。

コード番号、一般名または商標名により特定された活性剤の構造は、標準的概論「The Merck Index」の現行版、またはデータベース、例えばPatents International（例えばIMS World Publications）から得ることができる。対応するこの内容は、参照により本明細書に組み込まれている。

組合せパートナー（ａ）および（ｂ）への言及は、薬学的に許容される塩も含むことが意図されると理解されるであろう。これらの組合せパートナー（ａ）および（ｂ）が、例えば、少なくとも１つの塩基性中心を有する場合、これらは酸付加塩を形成することができる。所望の場合、さらに存在する塩基性中心を有する、対応する酸付加塩も形成することができる。酸性基（例えばＣＯＯＨ）を有する組合せパートナー（ａ）および（ｂ）も、塩基との塩を形成することができる。組合せパートナー（ａ）または（ｂ）または薬学的に許容されるその塩は、水和物の形態で使用することもでき、または結晶化に使用される他の溶媒を含むこともできる。

（ａ）ホスホイノシチド３−キナーゼ阻害剤化合物および（ｂ）ＪＡＫ２−ＳＴＡＴ５経路を調節する化合物（該活性成分が、各々の場合において遊離形態、または薬学的に許容される塩の形態で存在する）、および場合により少なくとも１つの薬学的に許容される担体を含む組合せは、以下、本発明の組合せと呼ばれる。

本発明の組合せは、有効性および安全性の両方に対し相乗的および相加的利点の両方を有する。ホスホイノシチド３−キナーゼ阻害剤化合物と、ＪＡＫ２−ＳＴＳＡＴ５経路を調節する化合物との組合せの治療効果は、該組合せにおける各成分のより低い安全な投与量範囲をもたらすことができる。

本発明の組合せの薬理学的活性は、例えば、臨床試験または以下に本質的に記載される試験手順において実証することができる。適切な臨床試験は、例えば、進行固形腫瘍を有する患者における非盲検非無作為化用量漸増試験である。このような試験は、本発明の組合せの活性成分の相加または相乗効果を証明することができる。増殖性疾患に対する有益な効果は、これらの試験の結果を通じて直接、または当業者にそれ自体知られている試験デザインの変更により、実証することができる。このような試験は、特に、活性成分を用いた単剤療法および本発明の組合せの効果を比較するのに適している。好ましくは、組合せパートナー（ａ）は固定用量で投与され、組合せパートナー（ｂ）の用量は、最大耐用量（Maximum Tolerated Dosage、ＭＴＤ）に達するまで漸増される。

本発明の組合せを含む、増殖性疾患に対して治療的に有効である量を含む医薬組成物を提供することが、本発明の１つの目的である。この組成物において、組合せパートナー（ａ）および（ｂ）は、１つの組み合わせ単位剤形（combined unit dosage form）または２つの別個の単位剤形で、一緒に、順々に（one after the other）または個別に投与されてもよい。単位剤形はまた、固定された組合せであってもよい。

本発明による医薬組成物は、それ自体が知られている方法で調製することができ、ヒトを含む哺乳類（温血動物）への経口または直腸投与などの経腸投与、および非経口投与に適したものである。あるいは、薬剤が個別に投与される場合、一方は経腸製剤であってもよく、他方は非経口的に投与されてもよい。

新規の医薬組成物は、例えば、活性成分の約１０％〜約１００％、好ましくは約２０％〜約６０％を含有する。経腸または非経口投与用の併用療法のための医薬製剤は、例えば、糖衣錠、錠剤、カプセルまたは坐薬、およびさらにアンプルなどの単位剤形にあるものである。特に指示がなければ、これらは、それ自体が知られている方法で、例えば、従来の混合、造粒、糖衣、溶解または凍結乾燥プロセスによって調製される。必要な有効量は、複数の投与単位の投与により達することができるため、各剤形の個々の用量に含有される組合せパートナーの単位含量は、それ自体で有効量を構成する必要はないことが理解されよう。

経口剤形用の組成物の調製において、例えば、水、グリコール、油、アルコール、香味剤、保存料、着色剤などの通常の医薬媒体；または固形経口製剤が液体製剤より好ましい、例えば、粉末、カプセルおよび錠剤などの経口固形製剤の場合、デンプン、糖、微結晶性セルロース、希釈剤、造粒剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤等などの担体のいずれかが使用されてもよい。投与の容易さのため、錠剤およびカプセルは最も有利な経口単位剤形であり、この場合、固形医薬担体が明らかに使用される。

特に、本発明の組合せの各組合せパートナーの治療的に有効な量は、同時にまたは逐次任意の順番で投与されてもよく、成分は個別にまたは固定された組合せとして投与されてもよい。例えば、本発明による増殖性疾患の進行の遅延または治療の方法は、同時にまたは逐次任意の順番で、共同して治療的に有効な量で、好ましくは相乗的有効量で、（ｉ）遊離形態または薬学的に許容される塩形態での第１の組合せパートナーを投与すること、および（ｉｉ）遊離形態または薬学的に許容される塩形態での第２の組合せパートナーを投与することを含んでもよい。本発明の組合せの個々の組合せパートナーは、療法の過程中の異なる時間で個別に、または分割併用形態もしくは単回併用形態で同時に投与されてもよい。さらに、用語、投与する（administering）は、インビボで組合せパートナーそれ自体に変換する、組合せパートナーのプロドラッグの使用も包含する。従って、本発明は、同時または交互の治療の全てのこのような投与計画（regime）を包含すると理解されるべきであり、用語「投与する（administering）」は、これに応じて解釈されるべきである。

本発明の組合せは、組合せ製剤または医薬組成物であってもよい。

さらに、本発明は、増殖性疾患を有する温血動物に、前記増殖性疾患に対して治療的に有効である量で本発明の組合せを投与することを含む、該動物を治療する方法に関する。

さらに、本発明は、増殖性疾患を治療するための、および増殖性疾患を治療するための医薬の調製のための、本発明の組合せの使用に関する。

さらに、本発明は、指示書と一緒に、本発明の組合せを活性成分として含む、増殖性疾患の進行の遅延または治療におけるその同時、個別または逐次使用のための、商業的パッケージを提供する。

本発明の実施形態は、以下を含む組合せにより代表される。
− レスタウルチニブならびに化合物Ａ、化合物Ｂ、化合物Ｃ、ラパマイシン、テムシロリムス、エベロリムス、テムシロリムス、リダフォロリムス、ＭＫ−８６６９シロリムス、ゾタロリムスおよびバイオリムスからなる群から選択される１つまたは複数の化合物。
− ルクソリチニブならびに化合物Ａ、化合物Ｂ、化合物Ｃ、ラパマイシン、テムシロリムス、エベロリムス、テムシロリムス、リダフォロリムス、ＭＫ−８６６９シロリムス、ゾタロリムスおよびバイオリムスからなる群から選択される１つまたは複数の化合物。
− ＳＢ１５１８ならびに化合物Ａ、化合物Ｂ、化合物Ｃ、ラパマイシン、テムシロリムス、エベロリムス、テムシロリムス、リダフォロリムス、ＭＫ−８６６９シロリムス、ゾタロリムスおよびバイオリムスからなる群から選択される１つまたは複数の化合物。
− ＣＹＴ３８７ならびに化合物Ａ、化合物Ｂ、化合物Ｃ、ラパマイシン、テムシロリムス、エベロリムス、テムシロリムス、リダフォロリムス、ＭＫ−８６６９シロリムス、ゾタロリムスおよびバイオリムスからなる群から選択される１つまたは複数の化合物。
− ＬＹ３００９１０４ならびに化合物Ａ、化合物Ｂ、化合物Ｃ、ラパマイシン、テムシロリムス、エベロリムス、テムシロリムス、リダフォロリムス、ＭＫ−８６６９シロリムス、ゾタロリムスおよびバイオリムスからなる群から選択される１つまたは複数の化合物。
− ＩＮＣ４２４ならびに化合物Ａ、化合物Ｂ、化合物Ｃ、ラパマイシン、テムシロリムス、エベロリムス、テムシロリムス、リダフォロリムス、ＭＫ−８６６９シロリムス、ゾタロリムスおよびバイオリムスからなる群から選択される１つまたは複数の化合物。
− 化合物Ｄならびに化合物Ａ、化合物Ｂ、化合物Ｃ、ラパマイシン、テムシロリムス、エベロリムス、テムシロリムス、リダフォロリムス、ＭＫ−８６６９シロリムス、ゾタロリムスおよびバイオリムスからなる群から選択される１つまたは複数の化合物。
− ＴＧ１０１３４８ならびに化合物Ａ、化合物Ｂ、化合物Ｃ、ラパマイシン、テムシロリムス、エベロリムス、テムシロリムス、リダフォロリムス、ＭＫ−８６６９シロリムス、ゾタロリムスおよびバイオリムスからなる群から選択される１つまたは複数の化合物。
− ＬＹ２７８４５４４ならびに化合物Ａ、化合物Ｂ、化合物Ｃ、ラパマイシン、テムシロリムス、エベロリムス、テムシロリムス、リダフォロリムス、ＭＫ−８６６９シロリムス、ゾタロリムスおよびバイオリムスからなる群から選択される１つまたは複数の化合物。
− ＢＭＳ−９１１５４３ならびに化合物Ａ、化合物Ｂ、化合物Ｃ、ラパマイシン、テムシロリムス、エベロリムス、テムシロリムス、リダフォロリムス、ＭＫ−８６６９シロリムス、ゾタロリムスおよびバイオリムスからなる群から選択される１つまたは複数の化合物。
− ＮＳ−０１８ならびに化合物Ａ、化合物Ｂ、化合物Ｃ、ラパマイシン、テムシロリムス、エベロリムス、テムシロリムス、リダフォロリムス、ＭＫ−８６６９シロリムス、ゾタロリムスおよびバイオリムスからなる群から選択される１つまたは複数の化合物。
− 化合物（ＣＯＵＭＰＯＵＮＤ）Ｅならびに化合物Ａ、化合物Ｂ、化合物Ｃ、ラパマイシン、テムシロリムス、エベロリムス、テムシロリムス、リダフォロリムス、ＭＫ−８６６９シロリムス、ゾタロリムスおよびバイオリムスからなる群から選択される１つまたは複数の化合物。
− 化合物（ＣＯＵＭＰＯＵＮＤ）Ｆならびに化合物Ａ、化合物Ｂ、化合物Ｃ、ラパマイシン、テムシロリムス、エベロリムス、テムシロリムス、リダフォロリムス、ＭＫ−８６６９シロリムス、ゾタロリムスおよびバイオリムスからなる群から選択される１つまたは複数の化合物。
− 化合物（ＣＯＵＭＰＯＵＮＤ）Ｇならびに化合物Ａ、化合物Ｂ、化合物Ｃ、ラパマイシン、テムシロリムス、エベロリムス、テムシロリムス、リダフォロリムス、ＭＫ−８６６９シロリムス、ゾタロリムスおよびバイオリムスからなる群から選択される１つまたは複数の化合物。
− 化合物（ＣＯＵＭＰＯＵＮＤ）Ｈならびに化合物Ａ、化合物Ｂ、化合物Ｃ、ラパマイシン、テムシロリムス、エベロリムス、テムシロリムス、リダフォロリムス、ＭＫ−８６６９シロリムス、ゾタロリムスおよびバイオリムスからなる群から選択される１つまたは複数の化合物。
− 化合物（ＣＯＵＭＰＯＵＮＤ）Ｉならびに化合物Ａ、化合物Ｂ、化合物Ｃ、ラパマイシン、テムシロリムス、エベロリムス、テムシロリムス、リダフォロリムス、ＭＫ−８６６９シロリムス、ゾタロリムスおよびバイオリムスからなる群から選択される１つまたは複数の化合物。

別の実施形態において、本発明は、以下を含む組合せを提供する。
− 化合物Ａならびにレスタウルチニブ、ルクソリチニブ、ＳＢ１５１８、ＣＹＴ３８７、ＬＹ３００９１０４、ＩＮＣ４２４、ＬＹ２７８４５４４、ＢＭＳ−９１１５４３、ＮＳ−０１８、化合物（ＣＯＵＭＰＯＵＮＤ）Ｄ、ＴＧ１０１３４８、化合物Ｅ、化合物Ｆ、化合物Ｇ、化合物Ｈおよび化合物Ｉからなる群から選択される１つまたは複数の化合物。
− 化合物Ｂならびにレスタウルチニブ、ルクソリチニブ、ＳＢ１５１８、ＣＹＴ３８７、ＬＹ３００９１０４、ＩＮＣ４２４、ＬＹ２７８４５４４、ＢＭＳ−９１１５４３、ＮＳ−０１８、化合物（ＣＯＵＭＰＯＵＮＤ）Ｄ、ＴＧ１０１３４８、化合物Ｅ、化合物Ｆ、化合物Ｇ、化合物Ｈおよび化合物Ｉからなる群から選択される１つまたは複数の化合物。
− 化合物Ｃならびにレスタウルチニブ、ルクソリチニブ、ＳＢ１５１８、ＣＹＴ３８７、ＬＹ３００９１０４、ＩＮＣ４２４、ＬＹ２７８４５４４、ＢＭＳ−９１１５４３、ＮＳ−０１８、化合物（ＣＯＵＭＰＯＵＮＤ）Ｄ、ＴＧ１０１３４８、化合物Ｅ、化合物Ｆ、化合物Ｇ、化合物Ｈおよび化合物Ｉからなる群から選択される１つまたは複数の化合物。
− ラパマイシンならびにレスタウルチニブ、ルクソリチニブ、ＳＢ１５１８、ＣＹＴ３８７、ＬＹ３００９１０４、ＩＮＣ４２４、ＬＹ２７８４５４４、ＢＭＳ−９１１５４３、ＮＳ−０１８、化合物（ＣＯＵＭＰＯＵＮＤ）Ｄ、ＴＧ１０１３４８、化合物Ｅ、化合物Ｆ、化合物Ｇ、化合物Ｈおよび化合物Ｉからなる群から選択される１つまたは複数の化合物。
− テムシロリムスならびにレスタウルチニブ、ルクソリチニブ、ＳＢ１５１８、ＣＹＴ３８７、ＬＹ３００９１０４、ＩＮＣ４２４、ＬＹ２７８４５４４、ＢＭＳ−９１１５４３、ＮＳ−０１８、化合物（ＣＯＵＭＰＯＵＮＤ）Ｄ、ＴＧ１０１３４８、化合物Ｅ、化合物Ｆ、化合物Ｇ、化合物Ｈおよび化合物Ｉからなる群から選択される１つまたは複数の化合物。
− エベロリムスならびにレスタウルチニブ、ルクソリチニブ、ＳＢ１５１８、ＣＹＴ３８７、ＬＹ３００９１０４、ＩＮＣ４２４、ＬＹ２７８４５４４、ＢＭＳ−９１１５４３、ＮＳ−０１８、化合物（ＣＯＵＭＰＯＵＮＤ）Ｄ、ＴＧ１０１３４８、化合物Ｅ、化合物Ｆ、化合物Ｇ、化合物Ｈおよび化合物Ｉからなる群から選択される１つまたは複数の化合物。
− テムシロリムスならびにレスタウルチニブ、ルクソリチニブ、ＳＢ１５１８、ＣＹＴ３８７、ＬＹ３００９１０４、ＩＮＣ４２４、ＬＹ２７８４５４４、ＢＭＳ−９１１５４３、ＮＳ−０１８、化合物（ＣＯＵＭＰＯＵＮＤ）Ｄ、ＴＧ１０１３４８、化合物Ｅ、化合物Ｆ、化合物Ｇ、化合物Ｈおよび化合物Ｉからなる群から選択される１つまたは複数の化合物。
− リダフォロリムスならびにレスタウルチニブ、ルクソリチニブ、ＳＢ１５１８、ＣＹＴ３８７、ＬＹ３００９１０４、ＩＮＣ４２４、ＬＹ２７８４５４４、ＢＭＳ−９１１５４３、ＮＳ−０１８、化合物（ＣＯＵＭＰＯＵＮＤ）Ｄ、ＴＧ１０１３４８、化合物Ｅ、化合物Ｆ、化合物Ｇ、化合物Ｈおよび化合物Ｉからなる群から選択される１つまたは複数の化合物。
− ＭＫ−８６６９ならびにレスタウルチニブ、ルクソリチニブ、ＳＢ１５１８、ＣＹＴ３８７、ＬＹ３００９１０４、ＩＮＣ４２４、ＬＹ２７８４５４４、ＢＭＳ−９１１５４３、ＮＳ−０１８、化合物（ＣＯＵＭＰＯＵＮＤ）Ｄ、ＴＧ１０１３４８、化合物Ｅ、化合物Ｆ、化合物Ｇ、化合物Ｈおよび化合物Ｉからなる群から選択される１つまたは複数の化合物。
− シロリムスならびにレスタウルチニブ、ルクソリチニブ、ＳＢ１５１８、ＣＹＴ３８７、ＬＹ３００９１０４、ＩＮＣ４２４、ＬＹ２７８４５４４、ＢＭＳ−９１１５４３、ＮＳ−０１８、化合物（ＣＯＵＭＰＯＵＮＤ）Ｄ、ＴＧ１０１３４８、化合物Ｅ、化合物Ｆ、化合物Ｇ、化合物Ｈおよび化合物Ｉからなる群から選択される１つまたは複数の化合物。
− ゾタロリムスならびにレスタウルチニブ、ルクソリチニブ、ＳＢ１５１８、ＣＹＴ３８７、ＬＹ３００９１０４、ＩＮＣ４２４、ＬＹ２７８４５４４、ＢＭＳ−９１１５４３、ＮＳ−０１８、化合物（ＣＯＵＭＰＯＵＮＤ）Ｄ、ＴＧ１０１３４８、化合物Ｅ、化合物Ｆ、化合物Ｇ、化合物Ｈおよび化合物Ｉからなる群から選択される１つまたは複数の化合物。
− バイオリムスならびにレスタウルチニブ、ルクソリチニブ、ＳＢ１５１８、ＣＹＴ３８７、ＬＹ３００９１０４、ＩＮＣ４２４、ＬＹ２７８４５４４、ＢＭＳ−９１１５４３、ＮＳ−０１８、化合物（ＣＯＵＭＰＯＵＮＤ）Ｄ、ＴＧ１０１３４８、化合物Ｅ、化合物Ｆ、化合物Ｇ、化合物Ｈおよび化合物Ｉからなる群から選択される１つまたは複数の化合物。

さらなる態様において、本発明は以下を提供する。
− （ａ）本発明の組合せ、および場合により少なくとも１つの薬学的に許容される担体を含み、活性成分が、各々の場合において遊離形態、または薬学的に許容されるその塩もしくは任意のその水和物の形態で存在する、同時、個別または逐次使用のための組合せ；
− 増殖性疾患に対し共同して治療的に有効である量の本発明の組合せ、および少なくとも１つの薬学的に許容される担体を含む医薬組成物；
− 増殖性疾患を治療するための、本発明の組合せの使用；
− 増殖性疾患を治療するための医薬の調製のための、本発明の組合せの使用；
− ＰＩ３Ｋ阻害剤が、化合物Ａ、化合物Ｂ、化合物Ｃ、ラパマイシン、テムシロリムス、エベロリムス、テムシロリムス、リダフォロリムス、ＭＫ−８６６９シロリムス、ゾタロリムスおよびバイオリムスから選択される、本発明の組合せである組合せの使用；ならびに
− ＪＡＫ２−ＳＴＡＴ５経路を調節する化合物が、ＪＡＫ２を阻害する化合物、例えばレスタウルチニブ、ルクソリチニブ、ＳＢ１５１８、ＣＹＴ３８７、ＬＹ３００９１０４（ＩＮＣＢ２８０５０）、ＩＮＣ４２４（ＩＮＣＢ０１８４２としても知られる）、ＬＹ２７８４５４４、ＢＭＳ−９１１５４３、ＮＳ−０１８、またはＴＧ１０１３４８である、本発明の組合せの使用。

さらに、特に、本発明は、（ａ）ホスホイノシチド３−キナーゼ阻害剤化合物の１つまたは複数の単位剤形、および（ｂ）ＪＡＫ２−ＳＴＡＴ５経路を調節する化合物を含む組合せ製剤に関する。

さらに、特に、本発明は、増殖性疾患を治療するための医薬の調製のための、（ａ）ホスホイノシチド３−キナーゼ阻害剤化合物、および（ｂ）ＪＡＫ２−ＳＴＡＴ５経路を調節する化合物を含む組合せの使用に関する。

本発明の組合せに使用される各組合せパートナーの有効投与量は、使用される特定の化合物または医薬組成物、投与様式、治療中の状態、治療中の状態の重症度に応じて異なってもよい。故に、本発明の組合せの投与計画は、投与経路ならびに患者の腎臓および肝臓機能を含むさまざまな要因に従って選択される。当業の医師、臨床医または獣医師は、状態の進行を防ぎ、対抗し、または阻止するのに必要とされる単一活性成分の有効量を容易に決定および処方することができる。毒性なしに有効性をもたらす範囲内の活性成分の濃度を達成するうえで最適な精度は、標的部位への活性成分の利用可能性の動態に基づく投与計画を必要とする。

本発明の組合せにおいて使用される組合せパートナーが、単剤として市販されているような形態で適用される場合、これらの投与量および投与様式は、特に本明細書に言及されていなければ、本明細書に記載された有益な効果をもたらすためにそれぞれの市販薬の添付文書に提供された情報に従って行われてよい。

化合物Ａは、約５０〜１０００ｍｇ／日までさまざまである投与量範囲でヒトに投与することができる。化合物Ｂは、約２５〜８００ｍｇ／日までさまざまである投与量範囲でヒトに投与することができる。化合物Ｃは、約２５〜８００ｍｇ／日までさまざまである投与量範囲でヒトに投与することができる。

実施例で実証されているように、用語「化合物」は本明細書で使用されるとき、標的遺伝子の発現を減少させるまたはサイレンシングするｓｉＲＮＡも含む。「ＲＮＡｉ」は、動物および植物における配列特異的転写後遺伝子サイレンシングのプロセスである。ＲＮＡｉは、二本鎖でありサイレント（標的）遺伝子と配列において相同である低分子干渉ＲＮＡ分子（ｓｉＲＮＡ）を使用する。故に、標的遺伝子の転写により生成されたｍＲＮＡとのｓｉＲＮＡ分子の配列特異的結合は、遺伝子発現の極めて特異的な標的ノックダウンを可能にする。本発明による「ｓｉＲＮＡ」または「低分子干渉リボ核酸」は、以下の態様を含む当技術分野で公知の意味を有する。ｓｉＲＮＡは、生理学的条件下で相補領域に沿ってハイブリダイズする二本鎖のリボヌクレオチドからなる。二本鎖は通常は分かれている。二本鎖は細胞において別々の役割を有するため、一方の鎖は、「ガイド」配列としても知られる「アンチセンス」鎖と呼ばれ、機能的ＲＩＳＣ複合体において使用されて切断のため正しいｍＲＮＡにこれをガイドする。「アンチセンス」のこの使用は、ＲＮＡ化合物に関連しているため、本明細書の他の場所で言及されているアンチセンス標的ＤＮＡ化合物とは異なる。他方の鎖は、「アンチガイド」配列として知られ、標的配列と同じヌクレオチド配列を含有するため、センス鎖としても知られている。鎖は、特定の実施形態において分子リンカーにより結合されてもよい。個々のリボヌクレオチドは、非修飾自然発生リボヌクレオチド、非修飾自然発生デオキシリボヌクレオチドであってもよく、またはこれらは本明細書の他の場所で記載されているように化学的に修飾されてもよく、もしくは合成であってもよい。

幾つかの実施形態において、ｓｉＲＮＡ分子は、標的遺伝子の下方制御を可能にするために該遺伝子のコード配列の少なくとも一領域と実質的に同一である。幾つかの実施形態において、ｓｉＲＮＡ分子の配列と遺伝子の標的領域の間の同一性の程度は、少なくとも６０％配列同一性、幾つかの実施形態においては少なくとも７５％配列同一性、例えば少なくとも８５％同一性、９０％同一性、少なくとも９５％同一性、少なくとも９７％、または少なくとも９９％同一性である。

異なるアミノ酸／ポリペプチド／核酸配列間のパーセンテージ同一性の計算は、次のように行うことができる。マルチプルアライメントが、ＣｌｕｓｔａｌＸプログラム（ペアワイズパラメータ：ギャップ開始１０．０、ギャップ伸長０．１、タンパク質マトリックスＧｏｎｎｅｔ２５０、ＤＮＡマトリックスＩＵＢ；マルチプルパラメータ：ギャップ開始１０．０、ギャップ伸長０．２、遅延分岐配列３０％、ＤＮＡ移行重み（transition weight）０．５、ネガティブマトリックスオフ、タンパク質マトリックスｇｏｎｎｅｔシリーズ、ＤＮＡ重みＩＵＢ；タンパク質ギャップパラメータ、残基特異的ペナルティオン、親水性ペナルティオン、親水性残基ＧＰＳＮＤＱＥＲＫ、ギャップ分離距離４、エンドギャップ分離オフ）により最初に生成される。パーセンテージ同一性が、次いで、（Ｎ／Ｔ）^＊１００（Ｎは、２つの配列が同一残基を共有する位置の数であり、Ｔは、比較される位置の合計数である）としてマルチプルアライメントから計算される。あるいは、パーセンテージ同一性は、（Ｎ／Ｓ）^＊１００（Ｓは、比較されているより短い配列の長さである）として計算することができる。アミノ酸／ポリペプチド／核酸配列は、デノボ合成されてもよく、または天然のアミノ酸／ポリペプチド／核酸配列、もしくはその誘導体であってもよい。実質的に類似したヌクレオチド配列は、ストリンジェントな条件下で、本明細書に言及された核酸配列またはその相補体のいずれかにハイブリダイズする配列によりコードされる。ストリンジェントな条件とは、ヌクレオチドが、約４５℃、６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中でフィルター結合ＤＮＡまたはＲＮＡにハイブリダイズし、この後、約５〜６５℃、０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で少なくとも１回洗浄することを意味する。あるいは、実質的に類似したポリペプチドは、本発明によるペプチド配列と少なくとも１個（ただし５、１０、２０、５０または１００個未満）のアミノ酸が異なる可能性がある。遺伝コードの縮重のため、任意の核酸配列が、その機能的バリアントを提供するために、該配列によりコードされたタンパク質の配列に実質的に影響を与えることなく異なり得または変更され得ることは明らかである。適切なヌクレオチドバリアントは、配列内に同じアミノ酸をコードする異なるコドンを置換して改変された配列を有し、故にサイレント変化を生じさせるものである。他の適切なバリアントは、相同なヌクレオチド配列を有するものであるが、保存的変化を生じさせるために、置換するアミノ酸と類似した生物物理学的特性の側鎖を有するアミノ酸をコードする異なるコドンを置換して改変される配列の全て、または部分を含むものである。例えば小さな非極性疎水性アミノ酸には、グリシン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、およびメチオニンが含まれ、大きな非極性疎水性アミノ酸には、フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンが含まれ；極性中性アミノ酸には、セリン、スレオニン、システイン、アスパラギンおよびグルタミンが含まれ；正に荷電された（塩基性）アミノ酸には、リシン、アルギニンおよびヒスチジンが含まれ、ならびに負に荷電された（酸性）アミノ酸には、アスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれる。タンパク質またはＤＮＡ配列の正確なアライメントは複雑なプロセスであり、多くの研究者により詳細に調べられている。特に重要なのは、配列の最適マッチング間のトレードオフ、このようなマッチを得るためのギャップの導入である。タンパク質の場合には、マッチがスコア化される手段も重要である。ＰＡＭマトリックスのファミリー（例えば、Dayhoff, M.ら、1978、Atlas of protein sequence and structure、Natl. Biomed. Res. Found.）およびＢＬＯＳＵＭマトリックスは、保存的置換の性質および可能性を定量化し、マルチプルアライメントアルゴリズムにおいて使用されるが、他の同等に適用可能なマトリックスが当業者に知られるであろう。一般的なマルチプルアライメントプログラムＣｌｕｓｔａｌＷ、およびこのウィンドウズ（登録商標）バージョンＣｌｕｓｔａｌＸ（Thompsonら、1994、Nucleic Acids Research、22、4673〜4680頁；Thompsonら、1997、Nucleic Acids Research、24、4876〜4882頁）は、タンパク質およびＤＮＡのマルチプルアライメントを作成するための効率的な方法である。しばしば、自動的に作成されたアライメントは、試験されているタンパク質ファミリーに関する訓練されたユーザーの知識、例えば、主な保存部位に関する生物学的知識を活用する手動のアライメントを必要とする。１つのこのようなアライメントエディタープログラムは、Ａｌｉｇｎ（http://www.gwdg. de/dhepper/download/; Hepperle、D.、2001: Multicolor Sequence Alignment Editor. Institute of Freshwater Ecology and Inland Fisheries、16775シュテヒリン、ドイツ）であるが、ＪａｌＶｉｅｗまたはＣｉｎｅｍａなどの他のものも適している。タンパク質間のパーセンテージ同一性の計算は、Ｃｌｕｓｔａｌによるマルチプルアライメントの作成中に起こる。しかし、これらの値は、アライメントが手動で改善された場合、または２つの配列を意図的に比較するために再計算される必要がある。アライメント内のタンパク質配列の対に対するこの値を計算するプログラムには、アミノ酸置換のモデルとして「ＳｉｍｉｌａｒｉｔｙＴａｂｌｅ」オプション（Ｐ）を用いるＰＨＹＬＩＰ系統発生パッケージ（Felsenstein；http://evolution.gs. washington.edu/ phylip.html）内のＰＲＯＴＤＩＳＴが含まれる。ＤＮＡ／ＲＮＡについては、同一のオプションがＰＨＹＬ１ＰのＤＮＡＤＩＳＴプログラム内に存在する。

本発明によればｄｓＲＮＡ分子は、標的遺伝子のｍＲＮＡ領域と実質的に同一である二本鎖領域を含む。標的遺伝子の対応する配列と１００％同一性を有する領域が適している。この状態は、「完全に相補的」と呼ばれる。しかし、該領域は、標的化されたｍＲＮＡの領域の長さに応じて、標的遺伝子の対応する領域と比較して１個、２個または３個のミスマッチも含有し得、そのため完全に相補的でない可能性がある。一実施形態において、本発明のＲＮＡ分子は、１つの所与の遺伝子を特異的に標的にする。所望のｍＲＮＡのみを標的にするために、ｓｉＲＮＡ試薬は、標的ｍＲＮＡとの１００％相同性、および細胞または生物に存在する全ての他の遺伝子に対する少なくとも２個のミスマッチヌクレオチドを有し得る。特定の標的配列の発現を効果的に阻害するために十分な配列同一性を有するｓｉＲＮＡを解析および同定する方法は、当技術分野で知られている。配列同一性は、当技術分野で公知の配列比較およびアライメントアルゴリズム（Gribskov and Devereux、Sequence Analysis Primer、Stockton Press、1991、およびそこに引用されている参考文献を参考のこと）、ならびに例えば、デフォルトパラメータを用いてＢＥＳＴＦＩＴソフトウェアプログラムにおいて実行されるＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム（例えば、University of Wisconsin Genetic Computing Group）により、ヌクレオチド配列間のパーセント差を計算して最適化することができる。

本発明によれば、標的に相補的なｓｉＲＮＡの領域の長さは、１０〜１００ヌクレオチド、１２〜２５ヌクレオチド、１４〜２２ヌクレオチドまたは１５、１６、１７または１８ヌクレオチドであってもよい。対応する標的領域に対するミスマッチがある場合、相補領域の長さは、幾分より長いことが一般に求められる。一実施形態において、阻害剤はｓｉＲＮＡ分子であり、および約５ｂｐ〜５０ｂｐを含み、幾つかの実施形態においては１０ｂｐ〜３５ｂｐ、または１５ｂｐ〜３０ｂｐ、例えば１８ｂｐ〜２５ｂｐを含む。幾つかの実施形態において、ｓｉＲＮＡ分子は、２０ｂｐ超および２３ｂｐ未満を含む。

ｓｉＲＮＡは、オーバーハング末端（標的に相補的であっても相補的でなくてもよい）、またはｓｉＲＮＡ自体に相補的であるが標的遺伝子には相補的でない追加のヌクレオチドを有し得るため、ｓｉＲＮＡの各個別の鎖の全長は、１０〜１００ヌクレオチド、１５〜４９ヌクレオチド、１７〜３０ヌクレオチドまたは１９〜２５ヌクレオチドであってもよい。語句「各鎖は４９ヌクレオチド以下である」は、全ての修飾または非修飾ヌクレオチドを含むが、鎖の３’または５’末端に付加され得る任意の化学的部分は含まない、鎖中の連続するヌクレオチドの合計数を意味する。鎖に挿入される短い化学的部分はカウントされないが、２本の別個の鎖を合わせるようにデザインされた化学リンカーは、連続するヌクレオチドを作製するとは見なされない。

語句「５’末端または３’末端の少なくとも一方における１〜６ヌクレオチドオーバーハング」は、生理学的条件下で２本の別個の鎖から形成する相補的ｓｉＲＮＡの構造を指す。末端ヌクレオチドがｓｉＲＮＡの二本鎖領域の部分であるならば、ｓｉＲＮＡは平滑末端と見なされる。１つまたは複数ヌクレオチドが一末端で不対であるならば、オーバーハングが作製される。オーバーハング長は、オーバーハングヌクレオチドの数により測定される。オーバーハングヌクレオチドは、どちらかの鎖の５’末端または３’末端のどちらにでもあり得る。

本発明によるｓｉＲＮＡは、高いインビボ安定性を示し、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを鎖の少なくとも一方に含むことにより、経口送達に特に適し得る。故に本発明によるｓｉＲＮＡは、少なくとも１つの修飾または非天然リボヌクレオチドを含有する。多くの公知の化学的修飾の長い記載が、ＰＣＴ特許出願公開ＷＯ２００３７０９１８に示されている。送達に適切な修飾には、ａ）３’キャップ；ｂ）５’キャップ、ｃ）修飾ヌクレオシド間連結；またはｄ）修飾糖もしくは塩基部分の中から選択され得る化学的修飾が含まれる。適切な修飾には、糖部分（すなわち、例えば２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）または２’−ＭＯＥ）（Martinら、Helv. Chim. Acta、1995、78、486〜504頁）などの糖部分の２’位、すなわち、アルコキシアルコキシ基）または塩基部分（すなわち、別のヌクレオチド鎖中の別の特定の塩基と対合する能力を維持する非天然または修飾塩基）に対する修飾が含まれるが、これらに限定されない。他の修飾には、例えばホスホロチオエート、キラルホスホロチオエートまたはホスホロジチオエートとのリン酸エステル基（隣接するリボヌクレオチドを連結する）の置換を含むがこれらに限定されない、いわゆる「骨格」修飾が含まれる。本明細書で３’キャップまたは５’キャップと呼ばれることもある末端修飾は、重要となり得る。キャップは、ｓｉＲＮＡに安定性を与えることが見出された「Ｔ−Ｔ」などの追加のヌクレオチドを単純に付加することからなり得る。キャップは、当業者に知られている多くの錯体化学からなり得る。

適切なｓｉＲＮＡ分子のデザインは複雑なプロセスであり、標的ｍＲＮＡ分子の配列の極めて慎重な解析を伴う。ｓｉＲＮＡをデザインするための１つの例示的方法が、ＷＯ２００５／０５９１３２に例示されている。次いで、相当な発明的努力により、本発明者らは、ＲＮＡ干渉を引き起こすのに必要とされる親和性および同様に安定性を有する、ヌクレオチド塩基の特定の組成を有するｓｉＲＮＡの定義された配列を選択しなければならない。ｓｉＲＮＡ分子は、デノボ合成されてもよく、または微生物により産生されてもよい。例えば、ｓｉＲＮＡ分子は、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの細菌により産生されてもよい。少なくとも１つの修飾または非天然リボヌクレオチドを含有するｓｉＲＮＡを含むｓｉＲＮＡの合成方法は、当業者によく知られており、容易に利用可能である。例えば、さまざまな合成化学反応が、ＰＣＴ特許出願公開ＷＯ２００５０２１７４９およびＷＯ２００３７０９１８に示されている。該反応は、溶液中で、または幾つかの実施形態においては、固相上で行うことができ、またはポリマー担持試薬の使用と、これに続く、ＲＮＡｉを媒介することができるｓｉＲＮＡ分子が形成される条件下での合成ＲＮＡ鎖の結合により行うことができる。ｓｉＮＡｓ（低分子干渉核酸）は、ウラシル（ｓｉＲＮＡ）またはチリミジン（thyrimidine）（ｓｉＤＮＡ）を含み得ると理解されるべきである。従って、上に言及されたヌクレオチドＵおよびＴは、交換することができる。しかし、ｓｉＲＮＡが使用されることが好ましい。誤解を避けるために、用語ｓｉＲＮＡは本明細書で使用されるとき、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡおよびｓｈＲＮＡｍｉｒも含む。

本発明により使用される遺伝子サイレンシング分子、すなわち阻害剤は、幾つかの実施形態において核酸（例えば、ｓｉＲＮＡまたはアンチセンスまたはリボザイム）である。このような分子は、治療中の対象の細胞のＤＮＡに組み込まれるようになるものであってもよい（ただし、必ずしもではない）。未分化細胞は、遺伝子サイレンシング分子により安定に形質転換され得、遺伝子修飾娘細胞の産生をもたらす（この場合、例えば特異的転写因子、または遺伝子活性化因子による、対象における発現の制御が必要とされ得る）。遺伝子サイレンシング分子は、デノボ合成されてもよく、および標的細胞に遺伝子サイレンシングを誘導する（例えばＲＮＡ干渉により）のに十分な量で導入されてもよい。あるいは、該分子は、微生物、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）により産生されてもよく、次いで、標的細胞に遺伝子サイレンシングを誘導するのに十分な量で導入されてもよい。該分子は、遺伝子サイレンシング配列をコードする核酸を有するベクターにより産生されてもよい。ベクターは、核酸の発現を制御および／または増強することができるエレメントを含むことができる。ベクターは、組換えベクターであってもよい。ベクターは、例えばプラスミド、コスミド、ファージ、またはウイルスＤＮＡを含むことができる。遺伝子サイレンシング分子を合成するためのベクターに加えて、または該ベクターを使用する代わりに、ベクターは、遺伝子サイレンシング配列により標的細胞を形質転換するための送達系として使用されてもよい。

組換えベクターは、他の機能性エレメントも含むことができる。例えば、組換えベクターは、ベクターが標的細胞において自律複製するようにデザインされてもよい。この場合、核酸複製を誘導するエレメントが、組換えベクターにおいて必要とされ得る。あるいは、組換えベクターは、ベクターおよび組換え核酸分子が標的細胞のゲノムに組み込まれるようにデザインされてもよい。この場合、標的化された組み込み（例えば相同な組換えによる）を促す核酸配列が望ましい。組換えベクターはまた、クローニングプロセスにおいて選択可能なマーカーとして使用することができる遺伝子をコードするＤＮＡも有することができる。

組換えベクターはまた、必要に応じて核酸の発現を制御するためのプロモーターまたは制御因子またはエンハンサーも含むことができる。組織特異的プロモーター／エンハンサーエレメントは、特定の細胞型、例えば、内皮細胞における核酸の発現を制御するのに使用することができる。プロモーターは、構成的または誘導的であってもよい。

あるいは、遺伝子サイレンシング分子は、ベクターに組み込まれた状態または組み込まれていない状態で、対象における標的細胞または組織に投与することができる。例えば、該分子は、リポソームまたはウイルス粒子（例えばレトロウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、レンチウイルス等）内に組み込まれてもよい。あるいは「裸の」ｓｉＲＮＡまたはアンチセンス分子が、適切な手段、例えば直接的エンドサイトーシス取り込みにより対象の細胞に挿入されてもよい。

遺伝子サイレンシング分子はまた、トランスフェクション、感染、マイクロインジェクション、細胞融合、プロトプラスト融合または弾道衝撃（ballistic bombardment）により、治療される対象の細胞に導入することもできる。例えば、導入は、コーティングされた金粒子を用いた弾道トランスフェクション；ｓｉＮＡ分子を含有するリポソーム；遺伝子サイレンシング配列を含むウイルスベクター、または遺伝子サイレンシング分子の直接適用による直接核酸取り込みを提供する手段（例えばエンドサイトーシス）によってもよい。

本発明の一実施形態において、ｓｉＮＡ分子は、標的細胞に送達され得（ベクター中であるか「裸」であるかにかかわらず）、次いで複製を宿主細胞に依存し得、これにより治療的に有効なレベルに達し得る。この場合、ｓｉＮＡは、幾つかの実施形態において、ｓｉＮＡが細胞において転写され、次いで翻訳を妨げる（標的遺伝子産物をコードする内因性ｍＲＮＡの破壊を誘導することにより）ことを可能にする発現カセットに組み込まれる。

以下の実施例は、上に記載された本発明を例示する。しかし、これらは、本発明の範囲をいかなる形でも制限することを意図しない。本発明の組合せの有益な効果も、当業者にそれ自体公知の他の試験モデルにより判定することができる。

化合物Ａによる二重ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ阻害が、インビトロおよびインビボでＪＡＫ２／ＳＴＡＴ５を活性化することを示す図である。（Ａ）示されているように化合物Ａ（ＢＥＺ−２３５）で処理された３つの異なる乳癌株で行われた経時的実験からの溶解物（lysate）の免疫ブロット（ヒト株：ＭＤＡ４６８およびＭＤＡ２３１ＬＭ２）。インビボデータについては、異種移植片担持ＳＣＩＤ／ベージュマウスが、示された時点で解剖前にビヒクルまたは３０ｍｇ／ｋｇの化合物Ａで１回処理された。（Ｂ）ＪＡＫ２およびＪＡＫ１がｓｉＲＮＡにより枯渇されたＭＤＡ４６８およびＭＤＡ２３１ＬＭ２ヒト細胞株由来の溶解物の免疫ブロット。ｓｉＮＴ＝非標的対照ｓｉＲＮＡ。（Ｃ）ＪＡＫ２／ＳＴＡＴ５シグナル伝達が、ｓｉＲＮＡ（左のパネル）またはＪＡＫ２特異的阻害剤ＢＳＫ−８０５（化合物Ｄ）（右のパネル）によりブロックされた、８時間ＢＥＺ処理されたＭＤＡ４６８細胞由来の溶解物の免疫ブロット。ｐＪＡＫ２がＥＬＩＳＡにより測定され、合計ＪＡＫ２レベルに対して正規化された。濃度測定定量化（densitometric quantification）は、合計ＳＴＡＴ５に対して正規化されたｐＳＴＡＴ５について示されている。化合物ＡとＪＡＫ２阻害剤である化合物（ＣＯＵＭＰＯＵＮＤ）Ｄとの組合せが、細胞生存能を低下させ、アポトーシスを誘発することを示す図である。（Ａ）低血清条件下（０．５％）で増殖され、３００ｎＭＢＥＺ（化合物Ａ）および／または３５０ｎＭＢＳＫ（化合物Ｄ）で７２時間処理された細胞株のＷＳＴ−１生存アッセイにより測定された細胞生存能の平均パーセンテージを示す棒グラフ（左のパネル）。処理８時間後の同じ細胞株由来の溶解物の免疫ブロット（右のパネル）。データは、４つの独立した実験の平均±ＳＤである；^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１。（Ｂ）単独処理および組合せ処理２０時間後の３つの細胞株由来の溶解物の免疫ブロット。（Ｃ）示されているように３００ｎＭＢＥＺ（化合物Ａ）および／または３５０ｎＭＢＳＫ（化合物Ｄ）で処理されたアネキシンＶおよびＰＩ染色細胞のＦＡＣＳ分析により測定された、処理４８時間後のアポトーシス細胞の平均パーセンテージを示す棒グラフ（左）。３００ｎＭＢＥＺ（化合物Ａ）および／または３５０ｎＭＢＳＫ（化合物Ｄ）で２４時間処理された細胞由来の溶解物の免疫ブロット（右）。データは、平均±ＳＤである（ｎ＝５、^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１。（Ｃ）示されているように３００ｎＭＢＥＺおよび／または３５０ｎＭＢＳＫで処理されたアネキシンＶおよびＰＩ染色細胞のＦＡＣＳ分析により測定された、処理４８時間後のアポトーシス細胞の平均パーセンテージを示す棒グラフ（左）。３００ｎＭＢＥＺおよび／または３５０ｎＭＢＳＫで２４時間処理された細胞由来の溶解物の免疫ブロット（右）。データは、平均±ＳＤである（ｎ＝５、^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１。化合物Ａ（二重ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ阻害）が、乳癌においてＩＬ−８分泌を誘導することを示す図である。（Ａ）ＢＥＺ処理細胞由来の可溶性因子は、ＪＡＫ２／ＳＴＡＴ５を活性化する。示されているのは、３００ｎＭＢＥＺで２４時間処理された細胞由来の条件培地で３０分間処理された細胞の溶解物の免疫ブロットである。条件培地中に存在するＢＥＺの対照として、本発明者らは、ＢＥＺ（ＳＮＢＥＺ対照）を含有する培地で処理された細胞の溶解物を使用した。（Ｂ）ＩＬ−８は、ＢＥＺで乳癌細胞を処理すると分泌される。上清中の示されたサイトカインの発現を示すサイトカインアレイ（上のパネル）、またはそれぞれ３００ｎＭＢＥＺで２４時間処理された細胞もしくは３０ｍｇ／ｋｇＢＥＺで１０日間処理された同種移植片担持マウスの腫瘍溶解物（下のパネル）。マウスＭＩＰ２は、ヒトＩＬ−８の機能的相同体である。化合物Ａ（二重ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ阻害）が、乳癌においてＩＬ−８分泌を誘導することを示す図である。（Ｃ）ＢＥＺ処理した時のＩＬ−８過剰発現の動態。示されているように３００ｎＭＢＥＺで処理された細胞におけるＩＬ−８分泌（左のパネル）およびｍＲＮＡ上方制御（右のパネル）の時間経過を示す棒グラフ。ＩＬ−８のレベルが、それぞれＥＬＩＳＡおよびＲＱ−ＰＣＲにより測定され、平均±ＳＤとして示されている（ｎ＝４、^＊Ｐ＜０．０５）。（Ｄ）ＢＥＺは、乳癌細胞株パネルにおいてＩＬ−８分泌およびＪＡＫ２／ＳＴＡＴ５のリン酸化を増加させた。３００ｎＭのＢＥＺ−２３５で８時間処理されたトリプルネガティブ乳癌および管腔乳癌細胞株のパネルにおけるＩＬ−８分泌とＪＡＫ２活性化の間の相関グラフ（計数＝０．７７）（表１を参照のこと）。化合物Ａ（ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ阻害）が、ＪＡＫ２／ＳＴＡＴ５の二相性活性化を誘導することを示す図である。（Ａ）溶解３０分前に添加されたＤＭＳＯまたは３００ｎＭＢＥＺ単独またはＩｇＧもしくはＣＸＣＲ１ブロッキング抗体との組合せで処理された細胞由来の溶解物の免疫ブロット。（Ｂ）示されているように３００ｎＭのＢＥＺで処理された細胞由来の溶解物の免疫ブロット。（Ｃ）ＤＭＳＯまたは３００ｎＭＢＥＺで８時間処理された細胞由来の溶解物の免疫沈降（ＩＰ）および免疫ブロッティング。ＷＣＬ：全細胞溶解物。化合物Ａ（ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ阻害）が、ＪＡＫ２／ＳＴＡＴ５の二相性活性化を誘導することを示す図である。（Ｄ）ＤＭＳＯまたは３００ｎＭＢＥＺで８時間処理される前に、ＩＲＳ１がｓｉＲＮＡにより枯渇された細胞由来の溶解物の免疫ブロット。ｓｉＮＴは非標的ｓｉＲＮＡを指す。（Ｅ）３００ｎＭＢＥＺおよび／または３５０ｎＭＢＳＫで２０時間（左）または８時間（左）処理した時の、ＩＬ−８分泌（左）およびｍＲＮＡ（右）のレベルを示す棒グラフ。ＩＬ−８のレベルは、それぞれＥＬＩＳＡおよびＲＱ−ＰＣＲにより測定され、平均±ＳＤとして示されている（ｎ＝４、^＊Ｐ＜０．０５）。共標的ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ（化合物Ａ）およびＪＡＫ２／ＳＴＡＴ５（化合物Ｄ）が、原発性腫瘍増殖および転移を減少させることを示す図である。（Ａ）〜（Ｄ）ビヒクル対照（ＶＨＣ）、３０ｍｇ／ｋｇＢＥＺ、１２０ｍｇ／ｋｇＢＳＫまたは２５ｍｇ／ｋｇＢＥＺおよび１００ｍｇ／ｋｇＢＳＫで処理されたマウスの腫瘍の増殖曲線ならびに腫瘍溶解物の免疫ブロット。Ｃでは、ＪＡＫ２がｄｏｘ投与により阻害されてＪＡＫ２ｓｈＲＮＡ（ｓｈＪＡＫ２）の活性化をもたらす。ｓｈＮＴは非標的ｓｈＲＮＡを指し、注入は同所細胞注入を指し、および矢印は、処理および／またはｄｏｘの投与の開始を示す。Ｂでは、示されているのは、処理の終了１日前のルシフェラーゼ発現ＭＤＡ２３１ＬＭ２腫瘍の代表的な生物発光画像である。免疫ブロッティングは、ＭＤＡ４６８については処理の１４日後、ＭＤＡ２３１ＬＭ２については処理の１０日後、および４Ｔ−１については処理の６日後に回収された腫瘍で行われた。結果は、平均腫瘍体積±ＳＥＭとして表されている（ｎ＝４〜８、^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊Ｐ＜０．００１）。共標的ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ（化合物Ａ）およびＪＡＫ２／ＳＴＡＴ５（化合物Ｄ）が、原発性腫瘍増殖および転移を減少させることを示す図である。（Ａ）〜（Ｄ）ビヒクル対照（ＶＨＣ）、３０ｍｇ／ｋｇＢＥＺ、１２０ｍｇ／ｋｇＢＳＫまたは２５ｍｇ／ｋｇＢＥＺおよび１００ｍｇ／ｋｇＢＳＫで処理されたマウスの腫瘍の増殖曲線ならびに腫瘍溶解物の免疫ブロット。Ｃでは、ＪＡＫ２がｄｏｘ投与により阻害されてＪＡＫ２ｓｈＲＮＡ（ｓｈＪＡＫ２）の活性化をもたらす。ｓｈＮＴは非標的ｓｈＲＮＡを指し、注入は同所細胞注入を指し、および矢印は、処理および／またはｄｏｘの投与の開始を示す。Ｂでは、示されているのは、処理の終了１日前のルシフェラーゼ発現ＭＤＡ２３１ＬＭ２腫瘍の代表的な生物発光画像である。免疫ブロッティングは、ＭＤＡ４６８については処理の１４日後、ＭＤＡ２３１ＬＭ２については処理の１０日後、および４Ｔ−１については処理の６日後に回収された腫瘍で行われた。結果は、平均腫瘍体積±ＳＥＭとして表されている（ｎ＝４〜８、^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊Ｐ＜０．００１）。共標的ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ（化合物Ａ）およびＪＡＫ２／ＳＴＡＴ５（化合物Ｄ）が、原発性腫瘍増殖および転移を減少させることを示す図である。（Ｅ）Ａ〜Ｄのような処理の開始２１日後（ＭＤＡ２３１ＬＭ２）または５日後（４Ｔ−１）に実施された尾静脈血中のＧＦＰ＋細胞のＦＡＣＳ分析により測定された循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）数を示す棒グラフ。データは、１０５抹消血細胞（ＰＢＣ）に対して正規化されたＧＦＰ＋ＣＴＣとして表され、平均±ＳＥＭである（ｎ＝４）。（Ｆ）上段左および真ん中：Ｂ〜Ｃのように処理された腫瘍担持マウスからの原発性腫瘍の除去４週間後に回収された肺の代表的な画像。上段右：Ｄのような処理の１９日後の腫瘍担持マウスから回収された肺の代表的な画像。棒グラフは、Ｂ〜Ｄのように処理されたマウスの転移指数を示す。転移指数は、目に見える肺転移結節の合計数を腫瘍体積で除して計算された。結果は、平均±ＳＤとして表されている（ｎ＝４〜８、^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１）。インビボでのＩＬ−８分泌が、化合物Ａ（ＢＥＺ）処理すると増強され、化合物Ｄ（ＪＡＫ２／ＳＴＡＴ５の遮断）により低減されることを示す図である。（Ａ）図５Ａ〜Ｄのように処理されたマウスの腫瘍における、ＥＬＩＳＡ（左および真ん中）またはサイトカインアレイの定量化（右）により測定されたＩＬ−８レベルを示す棒グラフ。結果は、平均±ＳＤである（ｎ＝３〜８）。（Ｂ）図５Ａ〜Ｃのように処理された腫瘍担持マウスの血漿における、ＥＬＩＳＡにより測定されたＩＬ−８レベルを示す棒グラフ。結果は、平均±ＳＤである（ｎ＝４）。インビボでのＩＬ−８分泌が、化合物Ａ（ＢＥＺ）処理すると増強され、化合物Ｄ（ＪＡＫ２／ＳＴＡＴ５の遮断）により低減されることを示す図である。（Ｃ）ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲおよびＪＡＫ２／ＳＴＡＴ５阻害によるこの遮断の阻害により誘発された、同定された正のフィードバックループを例示する概略図。化合物Ａ（ＢＥＺ処理）が、ヒト原発性トリプルネガティブ乳房腫瘍におけるＪＡＫ２／ＳＴＡＴ５およびＩＬ−８分泌を活性化することを示す図である。（Ａ）免疫不全マウスで増殖され３０ｍｇ／ｋｇＢＥＺまたはビヒクル（ＶＨＣ）で４日間処理された、原発性トリプルネガティブ乳房腫瘍由来の溶解物の免疫ブロット。（Ｂ）３０ｍｇ／ｋｇＢＥＺまたはビヒクル（ＶＨＣ）による処理の３日目にマウスから切開された腫瘍、またはマウスの血漿中における、ＥＬＩＳＡにより測定されたＩＬ−８レベルを示す棒グラフである。二重ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ阻害および単一ＰＩ３Ｋまたは単一ｍＴＯＲ阻害が、ＪＡＫ２／ＳＴＡＴ５を活性化することを示す図である。（Ａ）示されているようなＢＥＺ処理による経時的実験からの細胞溶解物の免疫ブロット。（Ｂ）示されているようなＲＡＤ００１またはＢＫＭ１２０処理による経時的実験からの細胞溶解物の免疫ブロット。組み合わされたＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲおよびＪＡＫ２／ＳＴＡＴ５阻害が、細胞生存能を低下させることを示す図である。（Ａ）３００ｎＭ化合物Ａ（ＢＥＺ）および／または３５０ｎＭ化合物Ｄ（ＢＳＫ）で４８時間処理された３つの乳癌細胞株のＦＡＣＳ細胞サイクル分析。データは、平均±ＳＤである（ｎ＝４、^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１）。（Ｂ）および（Ｃ）完全血清条件（１０％ＦＣＳ）での３００ｎＭ化合物Ａ（ＢＥＺ）および／または３５０ｎＭ化合物Ｄ（ＢＳＫ）による処理、または低血清条件（０．５％ＦＣＳ）での化合物Ａ（ＢＥＺ）およびＪＡＫ２のドキシサイクリン誘導下方制御による処理の７２時間後のＷＳＴ−１生存アッセイを示す棒グラフ。両方の細胞株におけるＪＡＫ２のノックダウンを示す細胞溶解物の免疫ブロット（（Ｃ）、右のパネル）。ＩＬ−８受容体ＣＸＣＲ１が乳癌細胞で発現され、ＩＬ−８がＪＡＫ２／ＳＴＡＴ５を活性化することを示す図である。（Ａ）細胞におけるＣＸＣＲ１表面受容体の存在を確認する、ＭＤＡ４６８（上のパネル）およびＭＤＡ２３１ＬＭ２（下のパネル）における２つのＩＬ−８受容体ＣＸＣＲ１およびＣＸＣＲ２の発現レベルのＦＡＣＳ分析を示す棒グラフ。データは、平均±ＳＤである（ｎ＝３、^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１）。（Ｂ）組換えサイトカイン（ＩＬ−８、ＩＬ−６、Ｇ−ＣＳＦ１０ｎｇ／ｍｌ、ＥＰＯ２０単位／ｍｌ）による刺激３０分後の溶解された細胞の免疫ブロット。二重ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲおよびＪＡＫ／ＳＴＡＴ５阻害が、原発性腫瘍増殖を低減させ、マウスの体重に対する有害な影響を与えないことを示す図である。（Ａ）ＭＤＡ４６８腫瘍担持マウスの体重が週１回モニターされ、処理／組合せでの有意な変化は観察されなかった（左のパネル）。処理前の切開された腫瘍の重量（右のパネル）。データは、それぞれｎ＝６〜８の平均±ＳＥＭである。（Ｂ）増殖に関する尺度として、有糸分裂像がＨ＆Ｅ染色腫瘍スライスで評価され、有糸分裂指数として示されている。データは、それぞれｎ＝６〜８腫瘍／処理群の平均±ＳＥＭである。二重ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲおよびＪＡＫ／ＳＴＡＴ５阻害が、原発性腫瘍増殖を低減させ、マウスの体重に対する有害な影響を与えないことを示す図である。（Ｃ）ｐＳＴＡＴ５、ｐＡＫＴおよびｐＳ６に対するＩＨＣ染色が処理された腫瘍で行われ、代表的な写真が示されている。二重ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲおよびＪＡＫ／ＳＴＡＴ５阻害が、原発性腫瘍増殖を低減させ、マウスの体重に対する有害な影響を与えないことを示す図である。（Ｄ）ＭＤＡ２３１ＬＭ２モデルにおける体重および腫瘍の重量（（Ａ）を参照のこと）。データは、それぞれｎ＝７〜８の平均±ＳＤである。（Ｅ）および（Ｆ）処理終了時点の処理された４Ｔ−１腫瘍の有糸分裂指数、（Ｂ）を参照のこと。データは、それぞれｎ＝５〜７腫瘍／処理群の平均±ＳＤである。二重ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲおよびＪＡＫ／ＳＴＡＴ５阻害が、原発性腫瘍増殖を低減させ、マウスの体重に対する有害な影響を与えないことを示す図である。（Ｅ）および（Ｆ）処理終了時点の処理された４Ｔ−１腫瘍の有糸分裂指数、（Ｂ）を参照のこと。データは、それぞれｎ＝５〜７腫瘍／処理群の平均±ＳＤである。二重ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲおよびＪＡＫ／ＳＴＡＴ５阻害が、原発性腫瘍増殖を低減させ、マウスの体重に対する有害な影響を与えないことを示す図である。（Ｇ）ｐＳＴＡＴ５、ｐＡＫＴおよびｐＳ６に対するＩＨＣ染色が処理された腫瘍で行われ、代表的な写真が示されている。ＩＬ−８およびＪＡＫ２シグナル伝達が、転移細胞でより高いことを示す図である。（Ａ）親乳癌株（１６８ＦＡＲＮおよびＭＤＡ２３１）対これらの転移亜株（４Ｔ−１およびＭＤＡ２３１ＬＭ２）由来の細胞溶解物の免疫ブロットおよびＥＬＩＳＡ測定。（Ｂ）ＭＤＡ２３１およびＭＤＡ２３１ＬＭ２細胞におけるＩＬ−８上清ＥＬＩＳＡおよびＩＬ−８ＲＱ−ＰＣＲを示すグラフ。示された結果は、平均±ＳＤである（ｎ＝３、^＊Ｐ＜０．０５）。（Ｄ）ＦＡＣＳにより測定された、処理された腫瘍におけるＩＬ−８受容体ＣＸＣＲ１のエンドポイント発現レベルを示す棒グラフ、ＭＦＩ＝平均蛍光強度。（Ｅ）管腔細胞株（グレー）およびトリプルネガティブ細胞株（黒）の浸潤能に対してブロットされた基礎ＩＬ−８分泌を示すグラフ。ＩＬ−８およびＪＡＫ２シグナル伝達が、転移細胞でより高いことを示す図である。（Ｃ）ＭＤＡ２３１およびＭＤＡ２３１ＬＭ２細胞でのＣＸＣＲ１およびＣＸＣＲ２発現のＦＡＣＳ分析の写真。示された結果は、３つの独立した実験の代表的なグラフである。化合物Ａ（ＢＥＺ）媒介ＪＡＫ２およびＩＬ−８活性化が、阻害剤に対する感受性と相関することを示す図である。（Ｅ）ＢＥＺ非感受性乳癌株（Brachmannら、2009）は、感受性株より高いＢＥＺ誘導ＪＡＫ２リン酸化およびＩＬ−８分泌を示す。ＢＥＺ処理した時のｐＪＡＫ２（左）およびＩＬ−８分泌（右）のレベル、およびＢＥＺに対する感受性に基づきブロットされた、表１に示された乳癌株を示すグラフ。細胞生存能を示す図である。０．５％血清下で増殖され３００ｎＭＢＥＺおよび／または３５０ｎＭＢＳＫで７２時間処理された、２つのＢＥＺ非感受性株（左のパネル）および２つのＢＥＺ感受性株（右のパネル）のＷＳＴ−１アッセイにより測定された細胞生存能の平均パーセンテージを示す棒グラフ。データは、平均±ＳＥＭである（ｎ＝４、^＊ｐ＜０．０５）。共標的ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲおよびＪＡＫ２／ＳＴＡＴ５が、原発性腫瘍増殖、腫瘍播種および転移を低減させることを示す図である。（Ａ）実験セットアップの図。（Ｂ）ＶＨＣ、ＢＥＺ、ＢＳＫおよびＢＥＺ／ＢＳＫ処理動物からの肺の代表的なＩＨＣ写真。左のパネル：記載されているように処理されたＭＤＡ２３１ＬＭ２担持動物からのＨ＆Ｅ（左）およびビメンチン（右）染色肺。スケールバー２５０μｍ。右のパネル：記載されているように処理された４Ｔ−１担持動物からのＨ＆Ｅ染色肺。矢印は転移を示し、右の画像は単一転移巣の拡大図である。スケールバー２００μｍ。（Ａ）記載されているように処理されたマウスの１切片当たりのビメンチン陽性肺面積のパーセンテージを示す棒グラフ。結果は、平均±ＳＥＭとして表されている（ｎ＝８）。（Ｂ）ＢＳＫは、腫瘍細胞自律的に転移を低減させる。左のパネル：実験セットアップの図。ＭＤＡ２３１ＬＭ２ｓｈＪＡＫ２またはＭＤＡ２３１ＬＭ２ｓｈＮＴ腫瘍を担持するマウスが、記載されているようにＢＳＫで処理された。右のパネル：目に見える肺転移結節の合計数を腫瘍体積で除して計算された転移指数を示す棒グラフ。結果は、平均±ＳＥＭとして表されている（ｎ＝３〜４、^＊ｐ＜０．０５）。（Ａ）マトリゲルコートボイデンチャンバーに播種され、３００ｎＭＢＥＺ、３５０ｎＭＢＳＫおよび／またはＣＸＣＲ１ブロッキング抗体で処理された、ＭＤＡ２３１ＬＭ２細胞の相対浸潤を示す棒グラフである。浸潤は、４８時間後に評価された。データは、細胞数に対して正規化された相対浸潤値を表し、平均±ＳＥＭである（ｎ＝４、^＊ｐ＜０．０５）。（Ｂ）記載されているように処理されたマウスのＭＤＡ２３１ＬＭ２腫瘍におけるＣＸＣＲ１^＋細胞のパーセンテージを示す棒グラフ。データは、平均±ＳＥＭである（ｎ＝４〜６、^＊ｐ＜０．０５）。（Ｃ）記載されているように阻害剤で処理されたＣＸＣＲ１染色（上のパネル）、アネキシンＶおよびＰＩ染色（下のパネル）ＭＤＡ２３１ＬＭ２細胞で行われたＦＡＣＳ分析の代表的なドットプロット。処理の４８時間後のアポトーシス細胞および死細胞の平均パーセンテージを示す棒グラフ。データは、平均±ＳＥＭである（ｎ＝４、^＊ｐ＜０．０５）。（Ｄ）上のパネル：実験セットアップの図である。ＭＤＡ２３１ＬＭ２腫瘍を担持するマウスが、記載されているように処理された。腫瘍は、切開され、分離され、異なる希釈で再移植された。再移植の前の細胞生存能がＰＩ−ＦＡＣＳ染色により分析され、全ての処理群において同等であることが見出された（データ不図示）。下のパネル：記載されているような処理後のＴＩＣ頻度を示す棒グラフ。データは、３つの独立した実験からの平均推定値であり、合計ｎ＝７マウス、^＊ｐ＜０．０５、^＊＊＊ｐ＜０．０００１。ＢＥＺ２３５処理が、原発性ヒトＴＮＢＣ異種移植片におけるＪＡＫ２／ＳＴＡＴ５およびＩＬ−８分泌を活性化することを示す図である。（Ａ）３０ｍｇ／ｋｇＢＥＺまたはＶＨＣで４日間処理された原発性ＴＮＢＣ異種移植片由来の溶解物の免疫ブロット。ＥＬＩＳＡデータは、平均±ＳＤである（ｎ＝３）。（Ｂ）３０ｍｇ／ｋｇＢＥＺまたはＶＨＣによる処理の３日目にマウスから切開された腫瘍、またはマウスの血漿中における、ＥＬＩＳＡにより測定されたＩＬ−８レベルを示す棒グラフ。データは、平均±ＳＥＭである（ｎ＝３〜４、^＊ｐ＜０．０５）。共標的ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲおよびＪＡＫ２が、転移性乳癌の２つのモデルにおける無イベント生存率および全生存率を向上させることを示す図である。（Ａ）上のパネル：実験セットアップの図。下のパネル：記載されているようにＢＥＺおよび／またはＢＳＫで処理されたＭＤＡ２３１ＬＭ２（左）および４Ｔ−１（右）腫瘍担持マウスのカプラン−マイヤー生存曲線を示す図。イベントは、腫瘍が１ｃｍ^３に達した時にスコア化された（ｎ＝４、^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１）。（Ｂ）上のパネル：実験セットアップの図。下のパネル：記載されているようにＢＥＺおよび／またはＢＳＫで処理されたＭＤＡ２３１ＬＭ２（左）および４Ｔ−１（右）腫瘍担持マウスのカプラン−マイヤー生存曲線を示す図。イベントは、マウスが苦痛のいずれかの徴候を示した時にスコア化された；（ｎ＝４、^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１）。ＣＸＣＲ１の阻害がｐ−ＦＡＫをブロックし、ＪＡＫ２／ＳＴＡＴ５活性化の第１相がＥＧＦＲ非依存的であることを示す図である。（Ａ）非標的ｓｉＲＮＡ（ｓｉＮＴ）およびＣＸＣＲ１を標的にする２つの異なるｓｉＲＮＡでトランスフェクトされたＭＤＡ４６８およびＭＤＡ２３１ＬＭ２細胞におけるＣＸＣＲ１ｍＲＮＡのレベルを示す棒グラフ。ＣＸＣＲ１レベルはＲＴ−ｑＰＣＲにより測定され、平均±ＳＥＭとして示されている（ｎ＝２）。（Ｂ）非標的ｓｉＲＮＡ（ｓｉＮＴ）またはＣＸＣＲ１を標的にするｓｉＲＮＡ（ｓｉＣＸＣＲ）で一過性にトランスフェクトされた細胞、およびＤＭＳＯまたは３００ｎＭＢＥＺで処理された細胞由来の溶解物の免疫ブロット。ＥＬＩＳＡデータは、平均±ＳＤである（ｎ＝３）。（Ｃ）３００ｎＭＢＥＺ２３５および／または１００ｎＭＡＥＥ７８８で８時間処理された細胞由来の溶解物の免疫ブロット。ＪＡＫ２／ＳＴＡＴ５およびＩＬ−８／ＣＸＣＲ１シグナル伝達が、浸潤および転移を促進することを示す図である。（Ａ）３００ｎＭＢＥＺ２３５および／または３５０ｎＭＢＳＫで４８時間処理されたＭＤＡ２３１ＬＭ２細胞を用いて行われた浸潤アッセイからの代表的な写真。スケールバー５０μｍ。（Ｂ）記載されているように処理されたマウス由来の腫瘍の生着率（take rate）を示す表。腫瘍開始細胞（ＴＩＣ）頻度および信頼区間の推定値は、Ｒおよび「ｓｔａｔｍｏｄ」パッケージ（HuおよびSmyth、2009）を用いて計算された。

化合物および製剤ＮＶＰ−ＢＥＺ２３５（ＡＮ４）（ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ阻害剤）、ＮＶＰ−ＢＳＫ８０５（ＪＡＫ２阻害剤）、ＮＶＰ−ＢＫＭ−１２０（汎（ｐａｎ）−ＰＩ３Ｋ阻害剤）およびＲＡＤ００１（ｍＴＯＲＣ１阻害剤）は、全てＮｏｖａｒｔｉｓ（バーゼル、スイス）製であった。化合物を１０ｍｍｏｌ／ＬＤＭＳＯストック溶液として調製し、-２０℃で光から保護して貯蔵した。マウスの投与のため、ＮＶＰ−ＢＳＫ８０５をＮＭＰ／ＰＥＧ３００／ソルトールＨＳ１５（５％／８０％／１５％）中で新しく調製し、ＮＶＰ−ＢＥＺ２３５をＮＭＰ／ＰＥＧ３００（１０％／９０％）中で新しく調製し、両方を強制経口投与により１０ｍＬ／ｋｇで適用した。

細胞株、細胞培養およびインビトロ実験親ＭＤＡ−ＭＢ−２３１の肺転移亜株、ＭＤＡ２３１ＬＭ２（または４１７５）は、ＪｏａｎＭａｓｓａｇｕｅ（メモリアルスローン−ケタリング癌センター、ニューヨーク）から入手した。ＭＣＦ１０Ａ細胞は、５％ウマ血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、２０ｎｇ／ｍｌの上皮増殖因子（ＥＧＦ）（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、０．５μｇ／ｍｌのヒドロコルチゾン（Ｓｉｇｍａ）、１００ｎｇ／ｍｌのコレラ毒素（Ｓｉｇｍａ）、１０μｇ／ｍｌのインスリン（Ｓｉｇｍａ）、１００ＩＵ／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で培養した。ＳＵＭ１５９ＰＴ細胞は、ＣｈａｒｌｏｔｔｅＫｕｐｅｒｗａｓｓｅｒ（タフツ大学、ボストン、ＭＡ）による好意により提供され、ハムＦ１２、５％ＦＣＳ、１μｇ／ｍｌインスリン、０．５μｇ／ｍｌヒドロコルチゾン中で増殖させた。Ｂａｌｂ／ｃ株４Ｔ−１、４Ｔ−１−ＧＦＰおよび１６８ＦＡＲＮは、ＮａｎｃｙＨｙｎｅｓ（ＦＭＩ、バーゼル、スイス）により提供された。他の細胞株は全てＡＴＣＣからであり、培養条件はＡＴＣＣプロトコルに従った。阻害剤での処理のため、細胞を血清なしで一晩同期化し、次いで示されているように刺激し、処理した。ドキシサイクリン誘導性ｓｈＲＮＡを用いた実験のため、５００ｎｇ／ｍｌのドキシサイクリン（Ｓｉｇｍａ）を培地に添加し、実験を４８時間後に開始して標的の効率的なノックダウンを確保した。インビトロでの細胞生存能は、細胞増殖試薬ＷＳＴ−１（Ｒｏｃｈｅ）を用いて測定した。手短には、細胞（２．５〜４×１０^３個）を２００μｌ通常増殖培地において四連で９６ウェルプレートに播種し、培養培地にＤＭＳＯまたは阻害剤を添加する前に２４時間付着させた。７２時間後、２０μｌ／ウェルのホルマザン色素を添加した。インキュベーション後（４時間、３７℃、５％ＣＯ_２雰囲気）、４９０ｎＭの吸光度をＥＬＩＳＡプレートリーダーを用いて記録した。ヒトサイトカインインターロイキン−６、インターロイキン−８、ＧＣＳＦおよびエリスロポエチン（ＥＰＯ）をＰｅｐｒｏｔｅｃｈから入手し、ＥＰＯについては１０ｍｇ／ｍｌ／５０００単位／ｍｌでＰＢＳに溶解した。サイトカイン刺激は、細胞を低血清条件下で維持しながら１０ｎｇ／ｍｌ（ＥＰＯについては１０単位／ｍｌ）で３０分間行った。抗体ブロッキング実験は、細胞の溶解の前に抗ＣＸＣＲ１（Ｒ＆Ｄ、ＭＡＢ３３０、１μｇ／ｍｌ）、抗ＣＸＣＲ２（Ｒ＆Ｄ、ＭＡＢ３３１、２．５μｇ／ｍｌ）またはマウスＩｇＧ抗体（Ｒ＆Ｄ、１μｇ／ｍｌ）を用いて４５分間行った。

免疫ブロッティングおよび免疫沈降ウエスタンブロッティングおよびＥＬＩＳＡ用の細胞は、ＲＩＰＡ緩衝液で溶解させた。異種移植片溶解物は、ＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ８、１５０ｍＭＮａＣｌ、１％ＮＰ−４０、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ）に低温均質化腫瘍粉末を溶解して調製した。ＲＩＰＡは、１×プロテアーゼ阻害剤カクテル（ＣｏｍｐｌｅｔｅＭｉｎｉ、Ｒｏｃｈｅ）、０．２ｍｍｏｌ／Ｌバナジウム酸ナトリウム、２０ｍＭフッ化ナトリウムおよび１ｍｍｏｌ／Ｌフッ化フェニルメチルスルホニルを補充した。ＩＲＳ−１免疫沈降のため、５００〜１０００μｇのタンパク質を含有する細胞溶解物を、１μｇの抗体および２０〜５０μｌのプロテインＡセファロースビーズ（ＺｙｍｅｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、サウスサンフランシスコ、ＣＡ）と４℃で一晩インキュベートした。免疫沈降物または全細胞溶解物（３０〜８０μｇ）をＳＤＳ-ＰＡＧＥに供し、ＰＶＤＦ膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に移し、ＰＢＳ０．１％Ｔｗｅｅｎ２０中５％乳により室温で１時間ブロックした。膜は次いで、示されているように抗体と一晩インキュベートし、室温で１時間、１：５〜１０，０００でＨＲＰ結合抗マウスまたは抗ウサギ２次抗体に曝露させた。タンパク質は、ＥＣＬキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ）または増強化学発光検出システム（ＰｉｅｒｃｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて可視化した。示された試験のそれぞれにおいて、示されている結果は、少なくとも３つの独立した実験の典型である。以下の抗体を使用した：抗ＪＡＫ２（ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇ）、抗ＪＡＫ１（ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇ）、抗ｐＳＴＡＴ５（Ｔｙｒ６９４、ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇ）、抗ＳＴＡＴ５（ＳＴＡＴ５Ａ＆Ｂ、ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇ）、抗ＳＴＡＴ３（ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇ）、抗ｐＳＴＡＴ３（Ｔｙｒ７０５、ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇ）、抗ＡＫＴ汎（ｐａｎ）（ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇ）、抗ｐＡＫＴ（Ｔｈｒ３０８およびＳｅｒ４７３、ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇ）、抗ＥＲＫ２（ＳａｎｔａＣｒｕｚ）、抗Ｓ６（ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇ）、抗ｐＳ６（Ｓｅｒ２３５／２３６、ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇ）、抗ＰＡＲＰ（ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇ）、抗ＭＣＬ１（ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇ）、抗ＢＩＭ（ＥＬ、ＬおよびＳアイソフォーム、ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇ）、抗ｐＩＧＦ１Ｒ／ｐＩｎｓＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、抗ＩＧＦ１Ｒｂｅｔａ（ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇ）、抗ＩｎｓＲｂｅｔａ（ＳａｎｔａＣｒｕｚ）、抗ＩＲＳ１（Ｕｐｓｔａｔｅ）、抗ｐＩＲＳ１（Ｔｙｒ６１２、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）。

ＥＬＩＳＡおよびサイトカインアレイｐＪＡＫ２レベルを評価するために、試験した全てのｐＪＡＫ２抗体の交差反応性のためＥＬＩＳＡアッセイ（Ｔｙｒ１００７／１００８、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を適用した。ＲＩＰＡ溶解物、細胞培養上清およびマウス尾静脈血血漿中のインターロイキン−８レベルを、同様にＥＬＩＳＡ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）により測定した。細胞培養上清およびマウス腫瘍溶解物でのサイトカインアレイを、製造者のプロトコル（Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ、ヒトおよびマウスサイトカインアレイパネルＡ）に従って行った。

ＲＮＡ調製およびＲＱ−ＰＣＲ全ＲＮＡは、製造者のプロトコル（Ｑｉａｇｅｎ）に従ってＲＮｅａｓｙＭｉｎｉＫｉｔおよびＤＮａｓｅ除去カラムを用いて抽出した。１μｇの全ＲＮＡを、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製のＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔＲＴ−ＰＣＲＳｙｓｔｅｍを用いて転写した。ＰＣＲおよび蛍光検出は、１×ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＵｎｉｖｅｒｓａｌＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）および２５ｎｇｃＤＮＡを含有する２０μｌの反応体積で、製造者のプロトコルに従ってＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓＳｅｑｕｅｎｃｅＤｅｔｅｃｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ロートクロイツ、スイス）を用いて行った。ＩＬ−８、ＧＡＰＤＨおよびＲＰＬＰ０ｍＲＮＡの定量化には、１×Ｔａｑｍａｎ（登録商標）ＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＡｓｓａｙｓＨｓ００１７４１０３＿ｍ１、Ｈｓ０２７５８９９１＿ｇ１およびＨｓ９９９９９９０２＿ｍ１（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用した。全ての測定は二連で行い、Ｃｔ値の算術平均を計算に使用した：標的遺伝子平均Ｃｔ値は、それぞれのハウスキーピング遺伝子（ＧＡＰＤＨおよびＲＰＳ０）、平均Ｃｔ値（内部標準遺伝子、Ｃｔ）に対して正規化し、次いで実験対照に対して正規化した。得られた値を２の累乗（-ΔΔＣｔ）して、相対的定量化の実験対照（２（-ΔΔＣｔ）法（LivakおよびSchmittgen、2001）と比較した制御のｎ倍変化として表した。

遺伝子サイレンシング手順ｓｉＲＮＡは、Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈからＲＰ−ＨＰＬＣ精製二本鎖として注文し、配列は以下であった：ｓｉＪＡＫ１＿１５’−ＧＣＡＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＡＧＧＡＡＡＵＧＧＵＡＵ−３’（配列番号１）、ｓｉＪＡＫ１＿２５’−ＧＣＣＵＵＡＡＧＧＡＡＵＡＵＣＵＵＣＣＡＡＡＧＡＡ−３’（配列番号２）、ｓｉ−ＩＲＳ１：５’−ＡＡＣＡＡＧＡＣＡＧＣＵＧＧＵＡＣＣＡＧＧ−３’（配列番号３）、ｓｉＮＴ（非標的対照）５’−ＡＵＵＣＵＡＵＣＡＣＵＡＧＣＧＵＧＡＣＵＵ−３’（配列番号４）。ＪＡＫ２として、ＶａｌｉｄａｔｅｄＳｔｅａｌｔｈＲＮＡｉ（商標）ｓｉＲＮＡをＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから注文した（ＶＨＳ４１２４６）。ｓｉＲＮＡのトランスフェクションは、製造者のガイドライン（ＤｈａｒｍａＦｅｃｔ１、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）に従って行った。レンチウイルス産生のため、２９３Ｔ細胞を１０ｃｍ培養皿当たり細胞２．５×１０^６個の密度で播種した。細胞を、ｐＬＫＯ１−ｔｅｔ−ｏｎ−ＪＡＫ２ｓｈＲＮＡ（＃６２９、標的配列：ＴＧＧＡＴＡＧＴＴＡＣＡＡＣＴＣＧＧＣＴＴ（配列番号５））またはｐＬＫ０１−ｔｅｔ−ｏｎ−非サイレンシングｓｈＲＮＡ（Wiederschainら、2009）のいずれか１５μｇおよび１０μｇの第３世代パッケージングプラスミドミックスで、ＰＥＩ法（ＰＥＩ：ＤＮＡ比＝４：１）によりコトランスフェクトした。培養培地を１６時間後に新鮮培地と交換した。上清を、トランスフェクション４８および７２時間後に回収した。ウイルス価を判定するため、１０^５ＭＤＡ−ＭＢ−４６８およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＬＭ２細胞を６ウェルプレートに播種し、１ミリリットル当たり８μのポリブレン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の存在下、ベクターのさまざまな希釈物を形質導入した。培養培地を、１．５μｇ／ｍｌの濃度でピューロマイシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有する新鮮培地と７２時間後に交換した。感染多重度２０でウイルスベクターを形質導入したＭＤＡ−ＭＤ−４６８およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＬＭ２細胞を実験に使用した。

フローサイトメトリ細胞をトリプシン−ＥＤＴＡを用いて剥離し、通常の増殖培地に再懸濁し、カウントした。腫瘍は機械的および酵素的に解離した（コラゲナーゼＩＩおよびＨｙＱｔａｓｅ消化を用いて）。アネキシンＶ染色のため、細胞０．５×１０^６個を冷ＰＢＳ／５％ＢＳＡで洗浄し、７０μｌ結合緩衝液に再懸濁し、製造者のプロトコル（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ）に従ってアネキシンＶに対するフィコエリトリン（ＰＥ）標識抗体で標識した。細胞サイクル分析のため、細胞１×１０^６個をＰＢＳ中で洗浄し、４℃で６０分間、７０％エタノールに固定し、２回洗浄し、ＰＩ緩衝液（５０μｇ／ｍｌヨウ化プロピジウム、１０μｇ／ｍｌＲＮＡｓｅＡ、０．１％クエン酸ナトリウムおよび０．１％トリトンＸ−１００を補充したＰＢＳ）に再懸濁した。ＣＸＣＲ１およびＣＸＣＲ２細胞表面発現の分析のため、細胞を、２．５μｇ／細胞１０^６個抗ＣＸＣＲ１（Ｒ＆Ｄ、ＭＡＢ３３０）、抗ＣＸＣＲ２（Ｒ＆Ｄ、ＭＡＢ３３１）または１μｇ／１０^６細胞マウスＩｇＧ抗体（Ｒ＆Ｄ）と４℃で２０分間インキュベートし、次いで洗浄および分析前に暗所で、抗マウス２次ＩｇＧ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）と４℃で１５分間インキュベートした。１試料当たり少なくとも１０^４細胞を、ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーター（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ、バーゼル、スイス）で分析した。

動物実験ＳＣＩＤ／ベージュ、ＳＣＩＤ／ＮＯＤおよびＢａｌｂ／ｃマウス（ＪａｃｋｓｏｎＬａｂｓ）は、特定の病原体フリー条件下で維持し、実験動物利用に関する施設および国の規制基準に従った、ＦＭＩのＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌＡｎｉｍａｌＣａｒｅａｎｄＵｓｅＣｏｍｍｉｔｔｅｅｓにより承認されたプロトコルを順守して使用した。乳癌細胞株の同所生着のため、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞１×１０^６個、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＬＭ２細胞１×１０^６個および４Ｔ−１または４Ｔ−１−ＧＦＰ細胞０．５×１０^６個を、基底膜マトリックスフェノールレッドフリー（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびＰＢＳ１：１の１００μｌ混合物に懸濁し、乳腺４または乳腺２と３の間に注入した。原発性患者乳房腫瘍を１ｍｍ×１ｍｍ片にカットし、乳腺４に移植した。腫瘍担持マウスを、処理の開始前に腫瘍体積に基づき無作為化し、処理は、平均腫瘍体積が少なくとも１００ｍｍ^３であった場合に開始した。ＢＥＺ−２３５およびＢＫＳ−８０５を連続６日間毎日経口投与し（上記の処方を参照のこと）、この後１日休薬した。ｓｈＲＮＡの発現は、４８時間ごとに新しくする飲料水（５％ショ糖液２ｇ／ｌ）にドキシサイクリンを添加して誘導した。腫瘍を３〜４日ごとにノギスで測定し、腫瘍体積を式０．５×（大きいほうの直径）×（小さいほうの直径）^２により計算した。エンドポイント腫瘍サイズを、式ＡＢ／Ｃ＜Ａ／Ｃ×Ｂ／Ｃ（Ｃ＝腫瘍体積ＶＨＣ、Ａ＝腫瘍体積化合物１、Ｂ＝腫瘍体積化合物２、ＡＢ＝腫瘍体積組合せ）（Clarke、1997）を用いて相乗作用について分析した。

免疫組織化学腫瘍を、１０％ＮＢＦ（中性緩衝ホルマリン）に４℃で２４時間固定し、７０％ＥｔＯＨで洗浄し、パラフィンに包埋し、Ｈ＆Ｅ、抗Ｋｉ６７（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、抗ｐＳＴＡＴ５（Ｔｙｒ６９４、ｃｅｌｌｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、抗ｐＡＫＴ（Ｓｅｒ４７３、ｃｅｌｌｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、抗ｐＳ６（Ｓｅｒ２３５／２３６、ｃｅｌｌｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、抗ＰＡＲＰ（ｃｅｌｌｓｉｇｎａｌｉｎｇ）および抗マウスＦ４／８０（ＡｂＤＳｅｒｏｔｅｃ）抗体で染色した。マウス肺をブアン固定液に固定し、目に見える転移肺結節を双眼によりカウントした。

統計解析報告されている各値は、少なくとも３つの独立した実験の平均±ｓ．ｄ．またはｓ．ｅ．を表している。データを正規分布について試験し、スチューデントｔ検定またはノンパラメトリックなマンホイットニーＵ検定は、プログラムＪＭＰ４（ＳＡＳ、ケーリー、ＮＣ、ＵＳＡ）を用いて適用した。Ｐ値＜０．０５を統計的に有意と見なした。

本発明者らは、化合物Ａ、二重ＰＩ３ＫおよびｍＴＯＲ阻害剤の単一用量を適用し、処理の２、４、８および２０時間後の標的阻害および潜在的シグナル伝達経路クロストークを分析した。本発明者らは、化合物Ａが、ＰＴＥＮ不全ＭＤＡ４６８およびＲＡＳ変異ＭＤＡ２３１ＬＭ２乳癌株、ならびにマウス乳癌株４Ｔ−１においてｐＡＫＴを減少させ、処理２０時間後までｐＳ６レベルを完全にブロックすることを見出した。本発明者らはさらに、インビボモデルを使用してこれらの結果を確認した。驚くべきことに、本発明者らは、インビトロでのＢＥＺ処理の４時間〜８時間後およびインビボでの処理の８時間後に、ｐＪＡＫ２およびｐＳＴＡＴ５のかなりの上方制御を検出した。しかし、ｐＳＴＡＴ３のレベルは、ＢＥＺ処理により概して影響を受けないままであった。二重阻害剤化合物Ａのどちらの群が、ＪＡＫ２に対する観察されたクロストークに関与し得るのかを解明するために、本発明者らはＰＩ３Ｋ特異的阻害剤（ＢＫＭ１２０）およびｍＴＯＲ阻害剤（ＲＡＤ００１）を使用した。本発明者らは、ＰＩ３ＫおよびｍＴＯＲの単一阻害が両方ともｐＪＡＫ２およびｐＳＴＡＴ５を、ただし異なる時点で上方制御することを見出した。ＲＡＤ００１はＪＡＫ２を容易に活性化する（処理の４時間目に始まる）が、本発明者らは、ＢＫＭ１２０処理では該化合物の添加後８時間で始まるより遅い応答を観察した。ＪＡＫ２およびＪＡＫ１は両方とも、細胞型および関連する受容体に応じてＳＴＡＴ５およびＳＴＡＴ３にシグナル伝達できるという事実を踏まえ（Desrivieresら、2006；Bezbradicaら、2009）、本発明者らは両方のＪＡＫのｓｉＲＮＡ枯渇を行い、ＪＡＫ２のみがＳＴＡＴ５の活性化に関与し、一方ＪＡＫ１は、使用した実験モデルではＳＴＡＴ３の上流にあることを見出した。次に、本発明者らは、ＪＡＫ２活性化がＢＥＺ処理によるｐＳＴＡＴ５の上方制御に必要かどうか、および高度に特異的なＪＡＫ２阻害剤、化合物（ＣＯＵＭＰＯＵＮＤ）Ｄ（Radimerskiら、2010）は、このクロストークをブロックするのに十分かどうかを調べた。結果は、ＪＡＫ２のｓｉＲＮＡ枯渇およびＪＡＫ２の活性の阻害が両方とも、ＢＥＺによるｐＳＴＡＴ５の上方制御を妨害する（counteract）ことを示している。故に、本発明者らは、二重ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ阻害に対する耐性をもたらす、ＪＡＫ２／ＳＴＡＴ５に惹起された正のフィードバックループを見出した。機構的に、ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ阻害は、幾つかの細胞株および原発性トリプルネガティブ乳癌において、ＪＡＫ２／ＳＴＡＴ５のＩＲＳ１依存的活性化およびＩＬ−８の分泌を増加させた。ＪＡＫ２の遺伝的または薬理学的阻害は、このフィードバックループを無効にした。本発明者らは、ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲおよびＪＡＫ２阻害の組合せが、インビトロでの癌細胞数、ならびにインビボでの腫瘍増殖、循環腫瘍細胞の数および転移を相乗的に低減することをさらに示した。本発明者らの研究は、故に、増殖因子シグナル伝達、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ活性化とサイトカイン分泌の間の新たな関連を明らかにした。本発明者らの結果は、増殖性疾患におけるＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲおよびＪＡＫ２／ＳＴＡＴ５経路の複合標的化に根拠を提供するものである。

表１ＢＥＺは、乳癌細胞株パネルにおけるＪＡＫ２／ＳＴＡＴ５のリン酸化およびＩＬ−８分泌を増加させた。示されているのは、トリプルネガティブ（太字）および管腔（グレー）乳癌細胞株を３００ｎＭＢＥＺでそれぞれ８時間または２０時間処理した時の、ＪＡＫ２／ＳＴＡＴ５リン酸化およびＩＬ−８分泌のレベルである。ｐＳＴＡＴ５／ＳＴＡＴ５レベルは免疫ブロッティングにより評価され、濃度測定により定量化された。ｐＪＡＫ２／ＪＡＫ２およびＩＬ−８レベルは、ＥＬＩＳＡにより測定された。ＤＭＳＯ細胞と比べたＢＥＺ処理からの値が示されている。データは、平均±ＳＤとして示されている（ｎ＝３）。

Claims

（ａ）ホスホイノシチド３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）阻害剤化合物および（ｂ）ヤヌスキナーゼ２（ＪＡＫ２）−シグナル伝達兼転写活性化因子５（ＳＴＡＴ５）経路を調節する化合物、および場合により少なくとも１つの薬学的に許容される担体を含み、活性成分が、各々の場合において遊離形態、または薬学的に許容されるその塩もしくは任意のその水和物の形態で存在する、同時、個別または逐次使用のための、医薬として使用するための組合せ。
ホスホイノシチド３−キナーゼ阻害剤化合物が、化合物Ａ、化合物Ｂ、化合物Ｃ、ラパマイシン、テムシロリムス、エベロリムス、テムシロリムス、リダフォロリムス、ＭＫ−８６６９、シロリムス、ゾタロリムスおよびバイオリムスからなる群から選択される、請求項１に記載の組合せ。
ＪＡＫ２−ＳＴＡＴ５経路を調節する化合物が、レスタウルチニブ、ルクソリチニブ、ＳＢ１５１８、ＣＹＴ３８７、ＬＹ３００９１０４、ＩＮＣ４２４、ＬＹ２７８４５４４、ＢＭＳ−９１１５４３、ＮＳ−０１８、ＴＧ１０１３４８、化合物（ＣＯＵＭＰＯＵＮＤ）Ｄ、化合物Ｅ、化合物Ｆ、化合物Ｇ、化合物Ｈおよび化合物Ｉからなる群から選択される、請求項１または２に記載の組合せ。
ホスホイノシチド３−キナーゼ阻害剤化合物および／またはＪＡＫ２−ＳＴＡＴ５経路を調節する化合物がｓｉＲＮＡである、請求項１から３のいずれかに記載の組合せ。
ＪＡＫ２−ＳＴＡＴ５経路を調節する化合物が、インターロイキン８（ＩＬ８）の分泌を阻害する、請求項１から４のいずれかに記載の組合せ。
ホスホイノシチド３−キナーゼ阻害剤が化合物Ａである、請求項１から５のいずれかに記載の組合せ。
ホスホイノシチド３−キナーゼ阻害剤が化合物Ｃである、請求項１から６のいずれかに記載の組合せ。
ホスホイノシチド３−キナーゼ阻害剤がエベロリムスである、請求項１から７のいずれかに記載の組合せ。
増殖性疾患の治療において使用するための、請求項１から８のいずれかに記載の組合せ。
固形腫瘍の治療において使用するための、請求項１から９のいずれかに記載の組合せ。
乳癌の治療において使用するための、請求項１から１０のいずれかに記載の組合せ。
転移性乳癌の治療において使用するための、請求項１から１１のいずれかに記載の組合せ。
トリプルネガティブ乳癌の治療において使用するための、請求項１から１２のいずれかに記載の組合せ。
前記製剤が、（ａ）ホスホイノシチド−３キナーゼ阻害剤（ＰＩ３Ｋ）の１つまたは複数の単位剤形および（ｂ）ＪＡＫ２−ＳＴＡＴ５経路を調節する化合物の１つまたは複数の単位剤形を含む、請求項１から１３のいずれかに記載の組合せ。