KR102024948B1

KR102024948B1 - mTOR/JAK 저해제 병용 요법

Info

Publication number: KR102024948B1
Application number: KR1020137024424A
Authority: KR
Inventors: 알렉산드로 엠. 바누키; 코스탄차 보가니; 파올라 구글리엘멜리
Original assignee: 노파르티스 파르마 아게; 인사이트 코포레이션
Priority date: 2011-02-18
Filing date: 2012-02-17
Publication date: 2019-11-04
Anticipated expiration: 2032-02-17
Also published as: WO2012112847A1; EA026317B1; ES2547916T3; MX2013009351A; US20120214825A1; EP2675451A1; CA2827673A1; JP2014505735A; JP5936628B2; EP2675451B1; EP2675451B9; PT2675451E; US9993480B2; CN103732226A; AU2012219395A1; CN103732226B; AU2012219395B2; BR112013020798B1; BR112013020798A2; MX357939B

Abstract

본 발명은 mTOR 저해제 및 JAK 저해제를 포함하는 병용 요법을 제공한다. 상기 병용 요법은 MPN을 포함하는 다양한 암을 치료하는 데에 유용하다. 또한, 상기 병용 요법은 여러 JAK-관련 질환을 치료하는 데에 유용하다.

Description

mTOR/JAK 저해제 병용 요법{mTOR/JAK INHIBITOR COMBINATION THERAPY}

본 출원은 2011년 2월 18일 출원된 미국 특허 가출원 제61/444,581호, 2011년 7월 1일 출원된 제61/503,789호, 및 2011년 7월 1일 출원된 제61/503,785호의 우선권을 주장하며, 상기 출원의 내용은 그 전문이 본원에 참조로서 통합된다. 본 명세서 전반에 인용된 모든 특허, 특허 출원, 및 참고 문헌들은 그 전문이 본원에 참조로서 통합된다.

골수 증식성 종양 (Myeloproliferative neoplasms; MPNs)은 골수 내의 혈액 세포 (혈소판, 백혈구 및 적혈구)의 과잉 생산을 야기하는 질환의 한 군이다. MPN은 진성 적혈구 증가증 (polycythemia vera; PV), 원발성 (primary) 또는 본태성 혈소판 증가증 (essential thrombocythemia; ET), 원발성 또는 특발성 골수 섬유증 (idiopathic myelofibrosis), 만성 골수성 백혈병 (chronic myelogenous (myelocytic) leukemia; CML), 만성 호중구성 백혈병 (chronic neutrophilic leukemia; CNL), 소아 골수 단구성 백혈병 (juvenile myelomonocytic leukemia leukemia; JML) 및 만성 호산구성 백혈병 (chronic eosinophilic leukemia; CEL)/과호산구성 증후군 (hyper eosinophilic syndrome; HES)을 포함한다. 상기 질환들은 하기의 특징들의 일부 또는 전부를 공유하기 때문에 함께 군으로 분류될 수 있다: 다능 조혈 전구 세포 (multipotent hematopoietic progenitor cell)의 관여, 형질 전환되지 않은 조혈 전구 세포 대비 형질 전환된 클론의 우세, 정의될 수 있는 자극의 부재에서 1 또는 그 이상의 조혈 세포 계통의 과잉 생산, 시험관 내에서 성장 인자에 독립적인 콜로니 형성, 골수 과세포성, 거핵 세포 과형성 (hyperplasia) 및 이형성 (dysplasia), 주로 염색체 1, 8, 9, 13, 및 20과 관련된 기형, 혈전성 및 출혈 체질, 왕성한 골수 외 조혈, 및 CML에서의 속도와 비교하여 낮은 속도이긴 하나, 급성 백혈병으로의 자발적인 형질 전환 또는 골수 섬유증의 발병. MPN의 발병은 광범위하게 다양하며, 대략 매년 60 세 이상의 성인 100,000 명당 3명이 CML에 해당하고, 매년 신생아 내지 14세 어린이 100,000 명당 0.13명이 JML에 해당한다 [Vardiman JW 외, Blood 100 (7): 2292-302, 2002].

따라서, 다른 암뿐만 아니라 MPN의 새로운 치료 방법이 요구된다.

발명의 요약

본 발명은 mTOR 저해제 및 JAK 저해제를 포함하는 병용 요법을 제공한다. 상기 병용 요법은 MPN을 포함하는 다양한 암의 치료에 유용하다. 상기 병용 요법은 또한 JAK와 관련된 여러 질환의 치료에도 유용하다.

일 측면에 따르면, 본 발명은 mTOR 저해제 및 JAK 저해제를 포함하는 병용 요법을 제공한다. 일 구체예에서, 상기 JAK 저해제는 하기 화학식 I의 화합물 또는 이의 입체 이성질체 (stereoisomers), 토토머 (tautomers), 라세미체 (racemates), 용매화물 (solvates), 대사 산물 (metabolites), 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염이다:

(I)

또 다른 측면에서, 본 발명은 mTOR 저해제 및 JAK 저해제를 포함하는 조성물을 제공한다. 특정한 일 구체예에서, 상기 화학식 I의 화합물은 (3R)-3-사이클로펜틸-3-[4-(7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)-1H-피라졸-1-일]프로판나이트릴 (화합물 A), 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염이다.

또 다른 구체예에서, 상기 JAK 저해제는 5-클로로-N²-[(1S)-1-(5-플루오로피리미딘-2-일)에틸]-N⁴-(5-메틸-1H-피라졸-3-일)-피리미딘-2,4-디아민 (AZD1480), 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염이다.

또 다른 구체예에서, 상기 mTOR 저해제는 에베롤리무스 (Everolimus) (RAD001) 또는 2-(4-아미노-1-이소프로필-1H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-3-일)-1H-인돌-5-올 (PP242)이다.

특정한 일 구체예에서, 상기 병용 요법은 에베롤리무스 및 화합물 A, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다. 또 다른 특정 구체예에서, 상기 병용 요법은 PP242 및 화합물 A, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다.

본 발명의 상기 병용 요법의 일 구체예에서, 상기 mTOR 저해제 및 상기 JAK 저해제 (예를 들어, 화학식 I의 화합물 (예를 들어, 화합물 A, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염))는 단일 제제 (formulation) 또는 단위 용량 형태 (unit dosage form) 이다. 상기 단일 제제 또는 단위 용량 형태는 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 상기 mTOR 저해제 및 상기 JAK 저해제는 각각 별도로 투여된다.

본 발명의 상기 병용 요법은 개체에서 JAK-관련된 질환의 치료에 유용하다. 일 측면에 따르면, 본 발명은 mTOR 저해제 및 JAK 저해제 (예를 들어, 화학식 I의 화합물 (예를 들어, 화합물 A, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염))의 유효량을, 치료가 필요한 개체에 투여하는 것을 포함하는, 상기 개체에서 암을 치료하는 방법을 제공한다. 일 구체예에서, 상기 암은 골수 증식성 종양이다. 본 발명의 상기 병용 요법을 이용하여 치료할 수 있는 골수 증식성 종양의 비제한적인 예로는 만성 골수성 백혈병 (CML), 진성 적혈구 증가증 (PV), 본태성 혈소판 증가증 (ET), 원발성 또는 특발성 골수 섬유증 (PMF), 만성 호중구성 백혈병, 만성 호산구성 백혈병, 만성 골수 단구성 백혈병, 소아 골수 단구성 백혈병, 과호산구성 증후군, 전신성 비만 세포증 (systemic mastocytosis), 및 비정형 (atypical) 만성 골수성 백혈병을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 또 다른 구체예에서, 상기 병용 요법은 원발성 골수 섬유증, 후 (post)-진성 적혈구 증가성 골수 섬유증 또는 후-본태성 혈소판 증가성 골수 섬유증을 포함하는 중급 또는 고-위험 골수 섬유증의 치료에 사용될 수 있다.

상기 치료 방법의 일 구체예에서, 상기 개체는 사람이다. 또 다른 구체예에서, 상기 치료는 mTOR 저해제 및 JAK 저해제 (예를 들어, 화학식 I의 화합물 (예를 들어, 화합물 A, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염))의 공동-투여 (co-administering)를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 mTOR 저해제 및 상기 JAK 저해제 (예를 들어, 화학식 I의 화합물 (예를 들어, 화합물 A, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염))는 단일 제제 또는 단위 용량 형태이다. 상기 mTOR 저해제 및 상기 JAK 저해제 (예를 들어, 화학식 I의 화합물 (예를 들어, 화합물 A, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염))는 별개의 제제 또는 단위 용량 형태일 수 있다. 또 다른 구체예에서, 상기 치료는 상기 mTOR 저해제 및 상기 JAK 저해제 (예를 들어, 화학식 I의 화합물 (예를 들어, 화합물 A, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염))를 실질적으로 동시, 또는 이시 (異時)에 투여하는 것을 포함한다. 상기 방법의 또 다른 구체예에서, 상기 mTOR 저해제를 개체에 투여한 후, 상기 JAK 저해제 (예를 들어, 화학식 I의 화합물 (예를 들어, 화합물 A, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염))를 투여한다. 또 다른 구체예에서, 상기 JAK 저해제 (예를 들어, 화학식 I의 화합물 (예를 들어, 화합물 A, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염))를 개체에 투여한 후, 상기 mTOR 저해제를 투여한다. 상기 방법의 또 다른 구체예에서, 상기 mTOR 저해제 및/또는 상기 JAK 저해제 (예를 들어, 화학식 I의 화합물 (예를 들어, 화합물 A, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염))는 상기 mTOR 저해제 및 상기 JAK 저해제 (예를 들어, 화학식 I의 화합물 (예를 들어, 화합물 A, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염)) 중 한 가지 또는 두 가지를 단독으로 투여하는 경우에는 효과적이지 않으나, 이를 병용하는 경우에는 효과적인 양으로 투여된다.

본 발명의 상기 병용 요법은 또한 STAT5 인산화를 억제하는 데에 유용하다. 상기 STAT5 인산화의 억제를 필요로 하는 개체에서 상기 STAT5 인산화를 억제할 수 있다. 일 구체예에서, 개체에서 상기 STAT5 인산화의 억제는 상기 개체에서 골수 증식성 종양을 치료한다. 상기 골수 증식성 종양은 만성 골수성 백혈병 (CML), 진성 적혈구 증가증 (PV), 본태성 혈소판 증가증 (ET), 원발성 또는 특발성 골수 섬유증 (PMF), 만성 호중구성 백혈병, 만성 호산구성 백혈병, 만성 골수 단구성 백혈병, 소아 골수 단구성 백혈병, 과호산구성 증후군, 전신성 비만 세포증, 및 비정형 만성 골수성 백혈병으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 에베롤리무스 및 화합물 A, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 치료가 필요한 개체에 투여하는 것을 포함하는 골수 증식성 종양을 치료하는 방법을 제공한다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 PP242 및 화합물 A, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을, 치료가 필요한 개체에 투여하는 것을 포함하는 골수 증식성 종양의 치료 방법을 제공한다. 상기 측면들의 일 구체예에서, 상기 골수 증식성 종양은 원발성 골수 섬유증, 후-진성 적혈구 증가성 골수 섬유증 또는 후-본태성 혈소판 증가성 골수 섬유증이다.

도 1A 내지 1E는 선택된 mTOR 저해제, JAK1/JAK2 저해제, 히스톤 탈아세틸화 효소 저해제 및 수산화 요소가 SET2 또는 HEL 세포에서 세포 아팝토시스 (apoptosis) 및 세포 주기에 대해 미치는 효과를 나타낸 것이다.
도 2는 선택된 mTOR 저해제, JAK1/JAK2 저해제, 히스톤 탈아세틸화 효소 저해제 및 수산화 요소가 SET2 세포에서 mTOR 및 JAK/STAT 신호 전달에 대해 미치는 효과를 나타낸 것이다.

mTOR 저해제 및 JAK 키나아제 저해제 (예를 들어, 상기 화학식 I의 JAK 키나아제 저해제 (예를 들어, 화합물 A, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염))의 조합을 개체에 투여하면 예를 들어, 골수 증식성 종양 (MPNs)과 같은 암을 치료하는 데에 놀라운 시너지 효과가 나타난다는 것이 발견되었다. 상기 두 가지 종류의 물질의 병용 또는 공동 투여와 같은 접근은 현재 이용 가능한 치료법들에 반응하지 않거나 저항성을 나타내는 암으로 고통받는 개체를 치료하는 데에 유용할 수 있다. 본 발명의 상기 병용 요법은 또한 현재 이용 가능한 암 치료법들에 반응하는 사람들에 있어서 상기 치료법들의 효과를 개선시키거나, 및/또는 부작용을 감소시키는 데에 유용하다.

본 발명에서 사용되는 특정 용어들을 하기에서 설명한다. 본 발명의 화합물은 표준 명칭을 사용하여 설명한다. 달리 정의된 바가 없으면, 본 발명에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.

mTOR 저해제 / JAK 저해제 조합

본 발명은 치료 물질의 조합 및 암, 예를 들어 MPN을 치료하기 위하여 상기 물질의 조합을 투여하는 방법을 제공한다. 본 발명에서 사용되는 용어, "물질의 조합" 및 이와 유사한 용어는 다음 두 가지 종류의 물질의 조합을 말한다: (1) mTOR 저해제 및 (2) JAK 저해제 (예를 들어, 화학식 I의 JAK 키나아제 저해제 (예를 들어, 화합물 A, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염)).

통상적으로 mTOR로 알려진 라파마이신 포유류 표적 (mammalian target of rapamycin)은 세포 성장, 세포 증식, 세포 운동, 세포 생존, 단백질 합성, 및 전사를 조절하는 세린/트레오닌 단백질 키나아제이다. mTOR은 다중 유사 분열 (multiple mitogenic) 신호 전달 경로의 주요 중개자이며, 정상 조직 및 종양 형성 과정에서 세포 증식 및 혈관 형성을 조절하는 중심 역할을 수행한다. mTOR 신호 전달의 과잉 활성화는 종양 형성과 관련이 있으며, 몇몇 종양 유형에 대한 연구들은 mTOR 저해제의 항-증식성 및 항-혈관 형성 성질이 암 치료에 유용하다는 것을 시사한다. mTOR은 mTORC1 및 mTORC2 두 복합체 내에 존재한다. mTORC1은 라파마이신 유사체 (예를 들어, 템시롤리무스 (temsirolimus) 또는 에베롤리무스 (everolimus))에 민감하고, mTORC2는 대체로 라파마이신에 민감하지 않다. 몇몇 mTOR 저해제들은 암 치료를 위한 임상 시험에서 평가되었거나 평가되고 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, "mTOR 저해제"는 mTOR의 한 가지 이상의 활성, 예를 들어, 1 이상의 기질 (예를 들어, p70S6 키나아제 1, 4E-BP1, AKT/PKB 및 eEF2)에 대한 세린/트레오닌 단백질 키나아제의 활성을 저해하는 화합물 또는 리간드를 말한다. 당해 기술 분야에서 숙련된 자는 예를 들어, 라파마이신 또는 그의 유사체 또는 유도체와 같은 화합물이 mTOR 저해제인지 아닌지를 용이하게 판단할 수 있다. 상기와 같은 화합물 또는 리간드를 식별하는 방법은 당해 기술 분야에 공지되어 있다. mTOR 저해제의 예로, 라파마이신 (시롤리무스 (sirolimus)), 라파마이신 유도체, CI-779, 에베롤리무스 (써티칸 (Certican)^TM), ABT-578, 타크롤리무스 (tacrolimus) (FK 506), ABT-578, AP-23675, BEZ-235, OSI-027, QLT-0447, ABI-009, BC-210, 살리라십 (salirasib), TAFA-93, 데포롤리무스 (deforolimus) (AP-23573), 템시롤리무스 (토리셀 (Torisel)^TM), 2-(4-아미노-1-이소프로필-1H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-3-일)-1H-인돌-5-올 (PP242) 및 AP-23841을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 사용되는 용어, "선택적 mTOR 저해제"는 mTOR 활성을 저해하나, PI3K 활성은 저해하지 않는 화합물 또는 리간드를 말한다. 적합한 선택적 mTOR 저해제는 RAD001을 포함한다. 본 발명의 일 측면에 따르면, 선택적 mTOR 저해제 및 JAK 저해제를 포함하는 병용 요법을 제공한다.

라파마이신은 스트렙토마이세스 하이그로스코피커스 (Streptomyces hygroscopicus)에 의해 제조되는 마크로라이드계 (macrolide) 항생제이다. 적합한 라파마이신 유도체는 예를 들어, 하기 화학식 Ⅱ의 화합물:

(Ⅱ)

상기 식에서,

R_1aa는 CH₃ 또는 C₃ _-6 알키닐이고,

R_2aa는 H 또는 -CH₂-CH₂-OH, 3-하이드록시-2-(하이드록시메틸)-2-메틸-프로파노일 또는 테트라졸릴이고,

X_aa는 =O, (H,H) 또는 (H,OH)임;

또는 R_2aa이 -CH₂-CH₂-OH인 경우 이의 프로드러그 (prodrug), 예를 들어, 이의 생리학적으로 가수 분해 가능한 에테르를 포함한다.

화학식 Ⅱ의 화합물은 예를 들어, WO 94/09010, WO 95/16691, WO 96/41807, 미국 특허 제5,362,718호 및 WO 99/15530에 개시되어 있으며, 이들은 본원에 참조로서 통합된다. 상기 화학식 Ⅱ의 화합물은 상기 참고 문헌들에 개시된 공정을 이용하여 제조될 수 있다.

대표적인 화학식 Ⅱ의 라파마이신 유도체는, 예를 들어, 32-데옥소라파마이신, 16-펜트-2-이닐옥시-32-데옥소라파마이신, 16-펜트-2-이닐옥시-32 (S 또는 R)-디하이드로-라파마이신, 16-펜트-2-이닐옥시-32 (S 또는 R)-디하이드로-40-O-(2-하이드록시에틸)-라파마이신, 40-[3-하이드록시-2-(하이드록시메틸)-2-메틸프로파노에이트]-라파마이신 (또한, CCI779로 불림) 또는 40-에피-(테트라졸릴)-라파마이신 (또한, ABT578로 불림)이다. 라파마이신 유도체는 또한 소위 라팔로그 (rapalog), 예를 들어, WO 98/02441 및 WO 01/14387에 개시된, 예를 들어, AP23573, AP23464, AP23675 또는 AP23841을 포함할 수 있다. 라파마이신 유도체의 다른 예들로 TAFA-93 (라파마이신 프로드러그), 바이올리무스 (biolimus)-7 또는 바이올리무스-9의 이름으로 개시된 것들이 있다.

바람직한 일 구체예에서, 본 발명의 상기 병용 요법에서 사용되는 상기 mTOR 저해제는 에베롤리무스 (RAD001) 또는 2-(4-아미노-1-이소프로필-1H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-3-일)-1H-인돌-5-올 (PP242)이다 [참조: 예를 들어, Apsel 외, Nature Chemical Biology 4, 691-699 (2008)].

상기 JAK 패밀리는 사이토카인에 의존적인 세포 증식 및 면역 반응과 관련된 세포 기능을 조절하는 역할을 수행한다. 현재, 하기 4 가지의 포유류 JAK 패밀리 구성 멤버가 공지되어 있다: JAK1 (또한, 야누스 (Janus) 키나아제-1로 알려져 있음), JAK2 (또한, 야누스 키나아제-2로 알려져 있음), JAK3 (또한, 야누스 키나아제, 백혈구; JAKL; L-JAK 및 야누스 키나아제-3으로 알려져 있음) 및 TYK2 (또한, 단백질-티로신 (tyrosine) 키나아제 2로 알려져 있음). 상기 JAK 단백질의 크기 범위는 120 kDa 내지 140 kDa이며, 7 개의 보존된 JAK 상동 (homology) (JH) 도메인으로 구성되어 있다: 상기 도메인들 중 하나는 기능성 촉매 키나아제 도메인이고, 다른 하나는 잠재적으로 조절 기능 및/또는 STATs에 대한 도킹 (docking) 사이트를 제공하는 슈도키나아제 (pseudokinase) 도메인이다 [Scott, M. J., C. J. Godshall, 외. (2002), Clin Diagn Lab Immunol 9(6): 1153-9].

본 발명에서 사용되는, "JAK 저해제"는 JAK 키나아제의 한 가지 이상의 활성을 저해하는 화합물 또는 리간드를 말한다. "JAK 저해제"는 또한 "JAK1/JAK2 저해제"일 수 있다. 특정 구체예에서, 상기 JAK 저해제는 JAK가 저해된 상태를 유도한다. JAK 저해제의 예로 하기 화학식 I의 화합물 및 AZD1480을 포함한다.

화학식 I의 화합물, 또는 이의 입체 이성질체, 토토머, 라세미체, 용매화물, 대사 산물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 하기와 같이 정의된다:

(I)

상기 식에서,

R¹, R² 및 R³은 H, 할로, 및 C₁ _-4 알킬로부터 독립적으로 선택되고;

Z는 C₃ _-6 사이클로알킬 (예를 들어, 사이클로펜틸)이다.

화학식 I의 화합물의 예로, 미국 특허 제7,598,257호에 개시된 화합물을 포함하며, 상기 문헌은 전문이 본원에 참조로서 통합된다. 화합물 A를 포함하는 화학식 I의 화합물을 제조하는 방법은, 미국 특허 제7,598,257호 및 PCT 공보 WO/2010/083283 (PCT/US2010/021003)에서 확인할 수 있으며, 상기 양 문헌들은 전문이 본원에 참조로서 통합된다.

특정 일 구체예에서, 상기 화학식 I의 화합물은 3-사이클로펜틸-3-[4-(7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)-1H-피라졸-1-일]프로판나이트릴 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염이다. 다른 구체예에서, 상기 화학식 I의 화합물은 (3R)-3-사이클로펜틸-3-[4-(7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)-1H-피라졸-1-일]프로판나이트릴 (화합물 A) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염이다. 또 다른 구체예에서, 상기 화학식 I의 화합물은 (3S)-3-사이클로펜틸-3-[4-(7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)-1H-피라졸-1-일]프로판나이트릴 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염이다. 상기 화합물들의 합성은 예를 들어, 미국 특허 제7,598,257호 및 PCT 공보 WO/2010/083283 (PCT/US2010/021003)에 개시되어 있다.

다른 구체예에서, 상기 화학식 I의 화합물은 (3R)-3-사이클로펜틸-3-[4-(7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)-1H-피라졸-1-일]프로판나이트릴 말레산 (maleic acid) 염이다. 또 다른 구체예에서, 상기 화학식 I의 화합물은 (3R)-3-사이클로펜틸-3-[4-(7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)-1H-피라졸-1-일]프로판나이트릴 황산염이다. 또 다른 구체예에서, 상기 화학식 I의 화합물은 (3R)-3-사이클로펜틸-3-[4-(7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)-1H-피라졸-1-일]프로판나이트릴 인산염 ("화합물 A의 인산염")이다. 상기 화합물들의 합성은 예를 들어, 미국 특허 출원 제12/137,892호에 개시되어 있으며, 상기 문헌은 전문이 본원에 참조로서 통합된다.

일 구체예에서, 본 발명은 화합물 A의 인산염 및 mTOR 저해제, 예를 들어, 에베롤리무스 또는 PP242를 포함하는 병용 요법을 제공한다.

본 발명에서 사용되는 표현, "C_x-C_y-알킬"은, 특정 탄소수 범위의 특정 알킬기 (직쇄 또는 분쇄)를 가리키며, 여기서 x는 1 내지 5이고 y는 2 내지 10이다. 예를 들어, C₁-C₄-알킬이라는 표현은 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 이소프로필, tert-부틸 및 이소부틸을 포함하나 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 사용되는 용어, "C₃ _-6 사이클로알킬"은 3 내지 6 탄소 원자, 바람직하게는 5 탄소 원자의 포화 또는 불포화된 모노사이클릭 또는 바이사이클릭 탄화수소기를 말한다. 모노사이클릭 탄화수소기의 예로, 사이클로프로필, 사이클로부틸, 및 사이클로펜틸을 포함하나 이에 제한되지 않는다.

상기 용어, "할로겐" 또는 "할로"는 클로로, 브로모, 플루오로 및 아이오도기를 말한다.

본 발명의 물질은 입체 중심 (stereogenic centers) 또는 입체 축 (stereogenic axes)과 같은 1 이상의 비대칭 요소, 예를 들어, 비대칭 탄소 원자를 포함할 수 있으며, 따라서 상기 화합물은 상이한 입체 이성질체 형태를 가질 수 있다. 예를 들어, 상기 화합물들은 라세미체 또는 광학적 활성 형태일 수 있다. 2 이상의 비대칭 요소를 갖는 화합물에 있어서, 상기 화합물은 또한 부분 입체 이성질체 (diastereomers)의 혼합물일 수 있다. 비대칭 중심을 갖는 화합물에 있어서, 모든 광학적 이성질체 및 이의 혼합물이 포함되는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 탄소-탄소 이중 결합을 갖는 화합물은 Z- 및 E- 형태로 발생할 수 있으며; 상기 화합물의 모든 이성질체 형태는 본 발명에 포함된다. 상기 상황에서, 단일 거울상 이성질체 (광학적 활성 형태)는 비대칭 합성, 광학적으로 순수한 전구체로부터의 합성, 또는 라세미체의 분리에 의해 얻어질 수 있다. 라세미체의 분리는 또한 예를 들어, 분리 시약의 존재하에서의 결정화, 또는 예를 들어 카이랄 HPLC 칼럼을 이용한 크로마토그래피와 같은 통상적인 방법에 의해 수행될 수 있다.

본 명세서에 달리 특정되거나 명확하게 지시된 바가 없으면, 본 발명의 상기 병용 요법에서 유용한 화합물에 대한 언급은 상기 화합물들의 유리 염기 및 상기 화합물들의 약학적으로 허용 가능한 모든 염 모두를 포함한다.

본 발명에서 사용되는 용어, "악학적으로 허용 가능한 염"은 본 발명의 피리미딘 화합물의 비독성 산 또는 알칼리 토금속 염을 말한다. 상기 염은 상기 피리미딘 화합물의 최종 분리 및 정제 시 그 자리에서 (in situ), 또는 염기성 또는 산성 작용기에 각각 적합한 유기 또는 무기의 산 또는 염기를 개별적으로 반응시킴으로써 제조될 수 있다. 대표적인 염으로 하기의 염들을 포함하나 이에 제한되지 않는다: 아세테이트 (acetate), 아디페이트 (adipate), 알기네이트 (alginate), 시트레이트 (citrate), 아스파르테이트 (aspartate), 벤조에이트 (benzoate), 벤젠설포네이트 (benzenesulfonate), 바이설페이트 (bisulfate), 부티레이트 (butyrate), 캄포레이트 (camphorate), 캄포설포네이트 (camphorsulfonate), 디글루코네이트 (digluconate), 사이클로펜탄프로피오네이트 (cyclopentanepropionate), 도데실설페이트 (dodecylsulfate), 에탄설포네이트 (ethanesulfonate), 글루코헵타노에이트 (glucoheptanoate), 글리세로포스페이트 (glycerophosphate), 헤미-설페이트 (hemi-sulfate), 헵타노에이트 (heptanoate), 헥사노에이트 (hexanoate), 푸마레이트 (fumarate), 하이드로클로라이드 (hydrochloride), 하이드로브로마이드 (hydrobromide), 하이드로아이오다이드 (hydroiodide), 2-하이드록시에탄설포네이트 (2-hydroxyethanesulfonate), 락테이트 (lactate), 말레이트 (maleate), 메탄설포네이트 (methanesulfonate), 니코티네이트 (nicotinate), 2-나프탈렌설포네이트 (2-naphthalenesulfonate), 옥살레이트 (oxalate), 파모에이트 (pamoate), 펙티네이트 (pectinate), 퍼설페이트 (persulfate), 3-페닐프로피오네이트 (3-phenylpropionate), 피크레이트 (picrate), 피발레이트 (pivalate), 프로피오네이트 (propionate), 숙시네이트 (succinate), 설페이트 (sulfate), 타르트레이트 (tartrate), 티오시아네이트 (thiocyanate), p-톨루엔설포네이트 (p-toluenesulfonate), 및 운데카노에이트 (undecanoate). 또한, 상기 염기성 질소-함유 기는 메틸, 에틸, 프로필, 및 부틸 클로라이드, 브로마이드, 및 아이오다이드와 같은 알킬 할라이드; 디메틸, 디에틸, 디부틸, 및 디아밀 (diamyl) 설페이트와 같은 디알킬 설페이트, 데실 (decyl), 라우릴 (lauryl), 미리스틸 (myristyl), 및 스테아릴 (stearyl) 클로라이드, 브로마이드 및 아이오다이드와 같은 긴 사슬 할라이드, 벤질 및 페네틸 (phenethyl) 브로마이드와 같은 아랄킬 (aralkyl) 할라이드 등과 같은 물질로 4 기화될 수 있다. 이에 따라 수용성 또는 지용성, 또는 분산성 산물이 수득된다.

약학적으로 허용 가능한 산성 첨가 염을 형성하는 데에 이용할 수 있는 산의 예로 염산, 하이드로보릭산 (hydroboric acid), 질산, 황산 및 인산과 같은 무기산, 및 포름산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 푸말산, 타르타르산 (tartaric acid), 옥살산, 말레산, 메탄설폰산, 숙신산, 말산 (malic acid), 메탄설폰산, 벤젠설폰산, 및 p-톨루엔설폰산, 시트르산과 같은 유기산, 및 아스파르트산 및 글루탐산과 같은 산성 아미노산을 포함한다.

본 발명은 mTOR 저해제 및 JAK 저해제 (예를 들어, 화학식 I의 JAK 저해제 (예를 들어, 화합물 A, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염))를 포함하는 병용 요법을 제공한다. 상기 조합 (즉, mTOR 저해제 및 JAK 저해제 (예를 들어, 화학식 I의 JAK 저해제 (예를 들어, 화합물 A, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염))의 조합)의 투여는 단일 제제 또는 단위 용량 형태로 상기 조합을 투여하는 것, 상기 조합의 각 물질을 동시에, 그러나 따로따로 투여하는 것, 또는 임의의 적합한 경로에 의하여 상기 조합의 각 물질을 순차적으로 투여하는 것을 포함한다. 상기 조합의 각 물질의 용량은 상기 물질(들) 중 하나의 투여가 상기 조합 내의 다른 물질(들)과 비교하여 더 빈번하게 요구될 수 있다. 따라서, 적절한 투약이 허용되기 위하여, 포장된 약학적 제품은 상기 물질의 조합을 포함하는 1 이상의 용량 형태, 및 상기 물질의 조합의 하나를 포함하나, 상기 조합의 또 다른 물질은 포함하지 않는 1 이상의 용량 형태를 포함할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, "단일 제제"는 환자에게 상기 두 가지 치료 물질의 유효량을 전달하기 위하여 제제화된 단일 담체 또는 비히클을 말한다. 상기 단일 비히클은 약학적으로 허용 가능한 임의의 담체 또는 부형제와 함께, 상기 각 물질의 유효량을 전달할 수 있도록 디자인된다. 일부 구체예에서, 상기 비히클은 정제 (tablet), 캡슐, 알약 (pill), 또는 패치 (patch) 이다. 다른 구체예에서, 상기 비히클은 용액 또는 현탁액이다.

본 발명에서 사용되는 용어, "단위 용량"은 치료받을 환자에게 하나의 용량 형태로, 상기 두 가지 물질을 함께 동시에 투여하는 것을 의미한다. 일부 구체예에서, 상기 단위 용량은 단일 제제이다. 특정 구체예에서, 상기 단위 용량은 1 이상의 비히클을 포함하며, 상기 각 비히클은 약학적으로 허용 가능한 담체 및 부형제와 함께 1 이상의 상기 물질의 유효량을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 단위 용량은 환자에게 동시에 투여된 1 이상의 정제, 캡슐, 알약, 또는 패치이다.

본 발명에서 사용되는 용어, "치료"는 개체에서 질환의 1 이상의 증상을 개선, 감소 또는 완화하는 것을 의미한다. 본 발명의 상기 의미 내에서, 상기 용어 "치료"는 또한 질환의 증상을 중단하거나, 시작을 지연시키거나 (즉, 질환의 임상적 특성 또는 질환의 증상이 나타나기 전에) 및/또는 질환의 증상의 발달 또는 악화의 위험을 감소시키는 것을 의미한다.

상기 용어, "개체"는 동물을 포함한다. 개체의 예로, 사람, 개, 소, 말, 돼지, 양, 염소, 고양이, 마우스, 토끼, 랫트, 및 사람이 아닌 형질 전환 동물과 같은 포유류을 포함한다. 특정 구체예에서, 상기 개체는 사람, 예를 들어, 골수 증식성 종양과 같은 암으로부터 고통을 받거나, 고통을 받을 위험이 있거나, 잠재적으로 고통을 받을 가능성이 있는 사람이다.

상기 용어, "약", 또는 "대략"은 일반적으로, 제시된 수치 또는 범위의 20% 이내, 보다 바람직하게는 10% 이내, 가장 바람직하게는 5% 이내를 의미한다. 대안적으로, 특히 생물학적 시스템에서, 상기 용어, "약"은 제시된 수치의 약 1 로그 (즉, 10의 1승) 이내, 바람직하게는 두 배 이내를 의미한다.

상기 용어, "병용 요법"은 본 명세서에서 설명한 치료적 병증 또는 질환을 치료하기 위하여 2 이상의 치료 물질을 투여하는 것을 말한다. 상기 투여는 고정된 비율의 활성 성분을 갖는 단일 캡슐이나, 각 활성 성분에 대한 복수의, 또는 별개의 용기 (예를 들어, 캡슐)와 같이, 상기 치료 물질들을 실질적으로 동시에 공동 투여하는 것을 포함한다. 추가적으로, 상기 투여는 또한 각 유형의 치료 물질을 순차적인 방법으로 대략 동시에 또는 이시에 사용하는 것을 포함한다. 상기 경우들에서, 상기 치료 요법은 본 발명에서 설명된 병증 또는 질환을 치료함에 있어서 상기 약물 조합의 이로운 효과를 제공할 수 있다.

본 발명에서 설명하는 물질의 조합은 시너지 효과를 나타낸다. 본 발명에서 사용되는 상기 용어, "시너지 효과"는 예를 들어, mTOR 저해제 및 JAK 저해제 (예를 들어, 화학식 I의 JAK 저해제)와 같은 두 가지 물질의 작용이, 투여된 각 약물의 효과를 단순히 더하는 것보다 더 우수한 효과, 예를 들어, 암의 증상의 진행 또는 그의 증상을 느려지게 하는 효과를 발생시키는 것을 하는 것을 말한다. 시너지 효과는 예를 들어, 시그모이드-에맥스 방정식 (Sigmoid-Emax equation) [Holford, N. H. G. 및 Scheiner, L. B., Clin. Pharmacokinet. 6: 429-453 (1981)], 로에베 덧셈 공식 (Loewe additivity) [Loewe, S. 및 Muischnek, H., Arch. Exp. Pathol Pharmacol. 114: 313-326 (1926)], 및 중간-효과 (median-effect) 방정식 [Chou, T. C. 및 Talalay, P., Adv. Enzyme Regul. 22: 27-55 (1984)]과 같은 적합한 방법을 사용하여 계산할 수 있다. 상기 언급된 각 방정식은 상기 약물 조합의 효과를 평가하는 것을 돕기 위하여 대응하는 그래프를 생성하고자 실험적 데이터에 적용될 수 있다. 상기 언급된 방정식에 관련된 대응 그래프는 각각 농도-효과 곡선, 이소볼로그램 (isobologram) 곡선 및 조합 인덱스 곡선이다.

일 구체예에서, 본 발명은 JAK 저해제 및 mTOR 저해제의 유효량을 포함하는 병용 요법을 제공한다. 물질의 조합 (즉, mTOR 저해제 및 JAK 저해제 (예를 들어, 화학식 I의 JAK 저해제))의 "유효량"이란 상기 조합으로 치료된 장애의 임상적으로 관찰 가능한 징후 및 증상의 기준치를 초과하여 관찰 가능한 개선을 제공하기에 충분한 양을 말한다.

"경구 용량 형태"는 경구 투여용으로 규정되거나 의도된 단위 용량 형태를 포함한다.

mTOR 저해제 / JAK 저해제 조합을 이용한 치료 방법

본 발명은 mTOR 저해제 및 JAK 저해제 (예를 들어, 화학식 I의 JAK 저해제)의 조합을 개체에 투여함으로써, 개체에서 JAK-관련 질환, 예를 들어, 골수 증식성 종양과 같은 암을 치료하는 방법을 제공한다.

일 구체예에서, 본 발명은, 본 발명의 조합 또는 이의 약학적 조성물의 치료적 유효량 또는 투여량을, JAK-관련 질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 개체 (예를 들어, 환자)에 투여함으로써 상기 개체에서 상기 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다. JAK-관련 질환은 과발현 및/또는 비정상적인 활성 수준을 포함하는 JAK의 발현 또는 활성과 직접적 또는 간접적으로 관련된 임의의 질환, 장애 또는 병증을 포함할 수 있다. JAK-관련 질환은 또한 JAK의 활성을 조절함으로써 예방, 개선 또는 치료할 수 있는 임의의 질환, 장애 또는 병증을 포함할 수 있다.

JAK-관련 질환의 예로는, 예를 들어 장기 이식 거부 반응 (예를 들어, 동종 이식편 거부 반응 (allograft rejection) 및 이식 편대 숙주병 (graft versus host disease)을 포함하는 면역 체계 관련 질환들을 포함한다.

JAK-관련 질환의 추가적인 예로, 다발성 경화증 (multiple sclerosis), 류마티스 관절염 (rheumatoid arthritis), 아동 관절염 (juvenile arthritis), 제1형 당뇨병 (type I diabetes), 루푸스 (lupus), 건선 (psoriasis), 염증성 장 질환 (inflammatory bowel disease), 궤양성 대장염 (ulcerative colitis), 크론병 (Crohn's disease), 중증 근무력증 (myasthenia gravis), 면역 글로불린 신병증 (immunoglobulin nephropathies), 자가 면역성 갑상성 질환 (autoimmune thyroid disorders) 등과 같은 자가 면역 질환을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 자가 면역 질환은 심상성 천포창 (pemphigus vulgaris; PV) 또는 수포성 유사 천포창 (bullous pemphigoid; BP)과 같이 자가 면역 수포성 피부 질환이다.

JAK-관련 질환의 추가적인 예로, 천식, 식품 알레르기, 아토피성 피부염 (atopic dermatitis) 및 비염 (rhinitis)과 같은 알레르기성 병증을 포함한다. JAK-관련 질환의 추가적인 예로, 엡스테인 바 바이러스 (Epstein Barr Virus; EBV), B형 간염 (Hepatitis B), C형 간염 (Hepatitis C), HIV, HTLV 1, 수두 대상 포진 바이러스 (Varicella-Zoster Virus; VZV) 및 사람 유두종 바이러스 (Human Papilloma Virus; HPV)와 같은 바이러스성 질환을 포함한다.

JAK-관련 질환 또는 병증의 추가적인 예로, 건선 (예를 들어, 판상 건선 (psoriasis vulgaris)), 아토피성 피부염, 피부 발진 (skin rash), 피부 자극 (skin irritation), 피부 감작 (skin sensitization) (예를 들어, 접촉성 피부염 또는 알레르기성 접촉성 피부염)과 같은 피부 장애를 포함한다. 예를 들어, 몇몇 약을 포함하는 특정 물질을 국부적으로 바르는 경우 피부 감작이 야기될 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 피부 장애는 상기 병용 요법의 국부적 투여에 의해 치료된다.

추가적인 구체예에서, 상기 JAK-관련 질환은 고형 종양 (예를 들어, 전립선암, 신장암, 간암, 췌장암, 위암, 유방암, 폐암, 머리 및 목의 암, 갑상선암, 교모 세포종 (glioblastoma), 카포시 육종 (Kaposi's sarcoma), 캐슬만 병 (Castleman's disease), 흑색종 (melanoma) 등), 혈액암 (예를 들어, 림프종, 급성 림프구성 백혈병과 같은 백혈병, 또는 다발성 골수종 (multiple myeloma)), 및 피부 T-세포 림프종 (cutaneous T-cell lymphoma; CTCL) 및 피부 B-세포 림프종과 같은 피부암으로 특성화되는 암을 포함한다. 피부 T-세포 림프종의 예로, 세자리 증후군 (Sezary syndrome) 및 균상 식육종 (mycosis fungoides)을 포함한다.

JAK-관련 질환은 또한 슈도-키나아제 도메인 (예를 들어, JAK2V617F)에서 1 이상의 돌연변이를 갖는 것과 같은 JAK2 돌연변이의 발현으로 특성화되는 질환을 포함할 수 있다.

JAK-관련 질환은 또한 진성 적혈구 증가증 (PV), 본태성 혈소판 증가증 (ET), 골수 섬유증을 동반한 골수 화생 (myeloid metaplasia with myelofibrosis; MMM), 만성 골수성 백혈병 (CML), 만성 골수 단구성 백혈병 (CMML), 과호산구성 증후군 (HES), 전신 비만 세포 질환 (SMCD) 등과 같은 골수 증식성 (myeloproliferative) 장애를 포함할 수 있다.

추가적인 JAK-관련 질환으로, 염증 및 염증성 질환을 포함한다. 염증성 질환의 예로, 안구의 염증성 질환 (예를 들어, 홍채염 (iritis), 포도막염 (uveitis), 공막염 (scleritis), 결막염 (conjunctivitis), 또는 이와 관련된 질환), 기도의 염증성 질환 (예를 들어, 비염 (rhinitis) 또는 부비강염 (sinusitis)과 같은 코 및 부비강 (sinuses)을 포함하는 상부 (upper) 기도 염증, 또는 기관지염 (bronchitis), 만성 폐쇄성 폐질환 (chronic obstructive pulmonary disease)을 포함하는 하부 기도 염증 등), 심근염 (myocarditis)과 같은 염증성 근병증 및 다른 염증성 질환을 포함한다.

본 발명의 상기 병용 요법은 또한 허혈 재관류 손상 (ischemia reperfusion injuries), 또는 뇌졸중 또는 심장 마비와 같이 염증성 허혈증에 관련된 질환 또는 병증의 치료에 이용될 수 있다. 본 발명의 상기 병용 요법은 또한 암으로부터 유발되거나 암과 관련된 거식증 (anorexia), 악액질 (cachexia), 또는 피로의 치료에 사용될 수 있다. 본 발명의 상기 병용 요법은 또한 재발 협착증 (restenosis), 경피증 (sclerodermitis), 또는 섬유증 (fibrosis)의 치료에 이용될 수 있다. 본 발명의 상기 병용 요법은 또한 저산소증 (hypoxia) 또는 성상교세포증 (astrogliosis)과 관련된 병증, 예를 들어 당뇨병성 망막증 (diabetic retinopathy), 암, 또는 신경 퇴화 (neurodegeneration)를 치료하는 데에 이용될 수 있다 [참조: 예를 들어, Dudley, A. C. 외. Biochem. J. 2005, 390(Pt 2):427-36 및 Sriram, K. 외. J. Biol. Chem. 2004, 279(19):19936-47. Epub 2004 Mar 2].

진성 적혈구 증가증 (PV), 본태성 혈소판 증가증 (ET) 및 원발성 골수 섬유증 (PMF)을 포함하는 상기 만성 골수 증식성 종양 (MPN)은 PV 환자의 95% 및 ET 또는 PMF 환자의 60% 보다 더 많이 발생하는 야누스 키나아제 2 (JAK2)의 엑손 14 내의 V617F 위치 돌연변이에 의해 특성화된다. ET 또는 PMF 환자의 5 % 내지 10%에서, MPL에서의 돌연변이가 나타나는 것으로 보고된 반면, 다른 JAK2 엑손 12 돌연변이는 PV 환자에서 드물게 검출된다 [Vannucchi AM, Guglielmelli, P, Tefferi, A. Advances in understanding and management of myeloproliferative neoplasms. AC-A Cancer Journal for Clinicians. 2009;59:171-191]. 상기 분자적 이상은 모두 JAK/전사 신호 변환기 및 활성제 (STAT) 신호 전달 경로의 구성적 활성화와 관련되어 있으며, 에리스로포이에틴-독립적 적혈구 콜로니 (erythropoietin-independent erythroid colonies; EEC))에 의해 예시된 바와 같이, 돌연변이 세포의 사이토카인 과민 반응 및 사이토카인에 독립적인 성장에 기여한다. 마우스 내 JAK2V617F-과발현 조혈 세포 (hematopoietic cells)를 이식하여, 일부 모델에서 골수 섬유증으로 발달되는 PV 표현형을 충분히 재현할 수 있다. PV 또는 ET의 표현형을 갖는 MPN 장애는 또한, 조건부 낙-인 (knok-in) 마우스에서 얻어졌다. JAK/STAT 경로의 조절 장애는 고형 및 혈액암의 발달과 관련되며, 구성적으로 활성화된 STAT5A 또는 STAT5B 돌연변이 (caSTAT5)는 시험관 내 및 생체 내에서 발암 성질을 나타낸다. 종합적으로, JAK2는 쥣과 동물 (murine) 모델에서의 효과 및 임상적 시험에서의 종래 증거들에 의해 뒷받침되는 바와 같이, MPN 환자 (Id .) 내 잠재적으로 가치있는 치료 타겟의 대표가 된다.

JAK2V617F 돌연변이 세포에서, 포스파티딜이노시톨 (phosphatidylinositol) 3-키나아제 (PI3K) 및 세포 외 신호-조절 키나아제 (ERK)를 통한 다른 다운 스트림 (downstream) 경로의 활성화가 기록되어 있다. 세린/트레오닌 단백질 키나아제 B/Akt는 PI3K의 다운 스트림으로, 이는 세포 생존, 증식 및 분화를 포함하는 여러 세포 과정의 주요 조절자이며, 이는 암 세포에서 일반적으로 조절이 방해된다. 시험관 내 JAK2V617F 돌연변이 세포에서, 그리고 V617F 트랜스 제닉 또는 낙-인 마우스에서 Akt가 구성적으로 활성화된다는 결과에도 불구하고 [Akada H, Yan D, Zou H, Fiering S, Hutchison RE, Mohi MG. Conditional expression of heterozygous or homozygous Jak2V617F from its endogenous promoter induces a polycythemia vera-like disease. Blood. 2010;115:3589-3597], MPN의 발병에 대한 PI3K/Akt 신호 전달의 기여는 여전히 알려진 바가 미흡하다. Akt는 에리스로포이에틴 (EPO) 수용체의 리간드-결합에 대한 반응으로 PI3K를 통하여 인산화 및 활성화되며, 정상 적혈구 분화에 있어서 역할을 담당한다. 특히, Akt는 EpoR의 다운 스트림 및 GATA-1 인산화와 적어도 부분적으로 관련된 메카니즘을 통하여 JAK2가 결핍된 태아의 간 전구체 세포에서 적혈구의 분화를 도울 수 있다. Akt는 조건부 JAK2V617F 낙-인 대립 유전자를 갖는 마우스의 골수 또는 지라 (spleen) 유래의 적아 세포에서, 특히 V617F 동형 접합 (homozygous) 동물에서 활성화되는 것으로 나타났다. MPN 환자의 골수, 특히 거핵 세포 내 면역 세포 화학에 의하여 STAT5 및 Akt의 인산화가 비교적 증가되었음이 증명되었다. 거핵 세포 내 Akt의 우선적인 활성화는 라파마이신에 의하여 mTOR 신호 전달이 봉쇄된 후, 사람 거핵 세포 전구체의 증식이 강하게 억제되는 것을 동반하며 일어날 수 있다. 더욱이, JAK/STAT 또는 PI3K/Akt 경로의 소 분자 저해제는 배양된 PV 전구 세포에서 자발적인 적혈구 분화 및 EPO로 유도되는 적혈구 분화에 있어서 필적할만한 억제를 야기하였다.

따라서, 특정 구체예에서, 본 발명의 상기 조합을 이용하여 치료될 수 있는 암은 골수 증식성 장애 (Myeloproliferative disorders; MPDs)이다. 현재 일반적으로 골수 증식성 종양 (MPNs)으로 불리는 골수 증식성 장애는, 조혈 전구체의 클론 장애인 혈액암류에 속한다. 참고 문헌 [Tefferi, A. 및 Vardiman, J. W., Classification and diagnosis of meyloproliferative neoplasms: The 2008 World Health Organization criteria and point-of-care diagnostic algorithms, Leukemia, September 2007, 22: 14-22]은 본원에 참조로서 통합된다. 이들은 1 이상의 성숙된 골수 계통 세포 유형의 강화된 증식 및 생존으로 특성화된다. 상기 카테고리는 만성 골수성 백혈병 (CML), 진성 적혈구 증가증 (PV), 본태성 혈소판 증가증 (ET), 원발성 또는 특발성 골수 섬유증 (PMF), 만성 호중구성 백혈병, 만성 호산구성 백혈병, 만성 골수 단구성 백혈병, 소아 골수 단구성 백혈병, 과호산구성 증후군, 전신성 비만 세포증, 및 비정형 만성 골수성 백혈병을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 참고 문헌 [Tefferi, A. 및 Gilliland, D. G., Oncogenes in myeloproliferative disorders, Cell Cycle. March 2007, 6(5): 550-566]은 모든 목적에 대하여 그 전문이 본원에 모두 참조로서 통합된다.

또 다른 구체예에서, 본 발명의 상기 병용 요법은 원발성 골수 섬유증, 후-진성 적혈구 증가성 골수 섬유증, 후-본태성 혈소판 증가성 골수 섬유증, 및 2차 급성 골수성 백혈병을 치료하는 데에 유용하다.

또 다른 구체예에서, 본 발명의 상기 병용 요법은 원발성 골수 섬유증, 후-진성 적혈구 증가성 골수 섬유증 및 후-본태성 혈소판 증가성 골수 섬유증을 포함하는 중급 또는 고-위험의 골수 섬유증을 갖는 환자를 치료하는 데에 이용될 수 있다.

일부 구체예에서, 치료받는 개체 (예를 들어, 사람)는 골수 증식성 장애에 대한 1 이상의 치료법에 반응하지 않거나 저항성을 갖는다.

특정 구체예에서, 본 발명은 에베롤리무스 및 화합물 A, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 조성물의 유효량을, 치료가 필요한 개체에 투여하는 것을 포함하는, 골수 증식성 종양의 치료 방법을 제공한다.

일 구체예에서, 본 발명은 암, 예를 들어 골수 증식성 장애, 예를 들어 원발성 골수 섬유증, 후-진성 적혈구 증가성 골수 섬유증 및 후-본태성 혈소판 증가성 골수 섬유증을 포함하는 중급 또는 고-위험 골수 섬유증의 치료를 위한 의약 제조에 있어서의 mTOR 저해제 및 JAK 저해제의 용도를 제공한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 PP242 및 화합물 A, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 조성물의 유효량을, 치료가 필요한 개체에 투여하는 것을 포함하는, 골수 증식성 종양의 치료 방법을 제공한다.

본 발명은 질환으로 고통받는 개체에 mTOR 저해제 및 JAK 저해제 화합물의 유효량을 투여하여, 질환, 예를 들어 골수 증식성 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 상기 물질의 조합의 양은 상기 질환을 치료하기에 유효하다. 상기 물질의 조합의 시너지 효과에 주의하여야 한다: 비록 특정 용량으로 단독으로 투여된 1 이상의 물질이 효과가 없을 수 있다 하더라도, 각 물질이 동일한 용량으로 조합되어 투여되는 경우 치료에 효과적일 수 있다. 따라서, 상기 조합 내의 1 이상의 상기 물질의 용량은 FDA에서 승인된 각 물질의 용량보다 적을 수 있다.

용량 ( Dosages )

질환을 치료하기 위한 상기 물질의 조합의 최적 용량은 공지된 방법을 이용하여 각 개체에 대하여 경험적으로 결정될 수 있으며, 질환의 진행 정도; 개체의 연령, 체중, 전반적인 건강, 성별 및 식습관; 투여 시간 및 경로; 및 개체가 투여하고 있는 다른 약 등을 포함하는 다양한 인자들에 의존할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 최적의 용량은 당해 기술 분야에서 잘 알려진 일반적인 시험 및 방법을 이용하여 확립될 수 있다.

단일 용량 형태로 제조하기 위하여 담체 물질과 조합될 수 있는 상기 물질의 조합의 양은 치료받는 개체 및 투여의 특정 방식에 따라 다양할 수 있다. 일부 구체예에서, 본 발명에 따른 상기 물질의 조합을 포함하는 단위 용량 형태는 상기 물질이 단독으로 투여되는 경우에 통상적으로 투여되는 상기 조합의 각 물질의 양을 포함할 수 있다.

투여 빈도는 사용되는 화합물 및 치료되거나 예방되는 특정 병증에 따라 다양할 수 있다. 일반적으로, 효과적인 치료법을 제공하기에 충분한 최소한의 용량을 사용하는 것이 바람직하다. 환자는 치료되거나 예방되는 병증에 적합한 분석법을 이용하여 치료적 효과에 대하여 일반적으로 관찰될 수 있으며, 이는 당해 기술 분야에서 통상적으로 숙련된 자에게 익숙할 것이다.

상기 용량 형태는 약 제제 화학 분야에 있어서 숙련된 자에게 자명한, 다양한 통상적인 혼합, 분쇄 및 가공 (fabrication) 기술들에 의하여 제조될 수 있다.

상기 물질의 조합 또는 상기 물질의 조합의 각 물질을 함유하는 경구 투여 형태는 캡슐, 예를 들어 젤라틴 캡슐 내에 봉입된 마이크로-정제 (micro-tablets) 형태일 수 있다. 이를 위해, 약학적 제제로 사용되는 젤라틴 캡슐로서, 캡슈젤 (CAPSUGEL)로 알려진, 시판 중인 화이자 사의 경질의 젤라틴 캡슐을 사용할 수 있다.

본 발명에서 유용한 상기 여러 경구 투여 형태는 상기 물질의 조합 또는 상기 물질의 조합의 각 물질을 입자 형태로 함유한다. 이러한 입자는 맛이 차폐된 (taste-masked) 투여 형태, 압축 코팅된 투여 형태, 또는 장용 (enteric) 코팅된 투여 형태와 같이, 코팅된 투여 형태의 코어 성분에 존재하도록 정제안에 압축될 수 있으며, 또는 캡슐, 삼투 펌프 투여 형태, 또는 다른 투여 형태로 함유될 수 있다.

본 발명의 상기 약 화합물 (예를 들어, mTOR 저해제 및 JAK 저해제)은 100:1 내지 1:100의 범위의 비율로, 본 발명에서 설명하는 조합, 용량 형태, 약학적 조성물 및 약학적 제제로 존재할 수 있다. 예를 들어, 상기 화학식 I의 화합물:mTOR 저해제의 비율은, 1:100 내지 1:1, 예를 들어, 1:100, 1:90, 1:80, 1:70, 1:60, 1:50, 1:40, 1:30, 1:20, 1:10, 1:5, 1:2, 또는 1:1의 범위일 수 있다. 또 다른 예로서, 상기 mTOR 저해제:화학식 I의 화합물의 비율은 1:100 내지 1:1, 예를 들어, 1:100, 1:90, 1:80, 1:70, 1:60, 1:50, 1:40, 1:30, 1:20, 1:10, 1:5, 1:2, 또는 1:1의 범위일 수 있다.

독성없이 효과를 나타내는 상기 약 화합물의 최적의 비율, 개별 및 조합 용량, 및 농도는 타겟 부위에 대한 상기 활성 성분의 가용성의 역학에 기초하며, 당해 기술 분야에서 숙련된 자에게 공지된 방법을 사용하여 측정된다.

본 발명의 상기 약학적 조성물 또는 조합 (즉, mTOR 저해제 및 JAK 저해제 (예를 들어, 화학식 I의 JAK 저해제))은 임상 연구에서 시험될 수 있다. 적합한 임상 연구는 예를 들어, 증식성 질환 환자에 대하여, 오픈 라벨 (open label), 용량 에스컬레이션 (escalation) 연구일 수 있다. 이러한 연구는, 특히 본 발명의 상기 조합의 활성 성분의 시너지 효과를 증명한다. 증식성 질환에 대한 상기 이로운 효과는 당해 기술 분야에서 숙련된 자에게 공지된 상기 연구의 결과를 통해 직접적으로 측정될 수 있다. 이러한 연구는 특히, 본 발명의 상기 활성 성분 및 조합을 이용한 단일 요법의 효과와 비교하기에 적절할 수 있다. 일 구체예에서, mTOR 저해제 화합물, 예를 들어 에베롤리무스 (RAD001) 또는 PP242의 용량은 용인될 수 있는 최대 용량 (maximum tolerated dosage)에 이를 때까지 단계적으로 양을 증가시키고, JAK 저해제 (예를 들어, 화학식 I의 JAK 저해제)는 고정된 용량으로 투여한다. 대안적으로, JAK 저해제 (예를 들어, 화학식 I의 JAK 저해제)는 고정된 용량으로 투여하고, 상기 mTOR 저해제의 용량을 단계적으로 증가시킬 수 있다. 각 환자는 매일 또는 간헐적으로 상기 화합물의 용량을 투여받을 수 있다. 이러한 연구에서 상기 치료의 효험은 예를 들어, 매 6 주마다 증상의 점수를 평가하여 12, 18 또는 24 주 후에 측정될 수 있다.

본 발명의 병용 요법의 투여는 시너지적 치료 효과, 예를 들어 증상의 완화, 증상의 진행의 지연 또는 증상의 저해와 같은 이로운 효과뿐만 아니라, 본 발명의 상기 조합에 사용된 약학적으로 활성인 성분을 오로지 단독으로 사용하는 단일 요법과 비교하여, 보다 놀라운 이로운 효과, 예를 들어 보다 드문 부작용, 개선된 삶의 질 또는 감소된 병적 상태를 나타낼 수 있다.

추가적인 이점으로, 본 발명의 상기 조합의 활성 성분이 더 적은 양으로 사용될 수 있으며, 예를 들어, 상기 용량은 종종 더 적은 양으로 필요할 뿐만 아니라, 더 작은 빈도로 이용될 수 있고, 이는 부작용의 발생 정도 또는 심각성을 감소시킬 수 있다. 이는 치료받는 환자의 바람과 요구에 부합하는 것이다.

본 발명의 하나의 목적은, 표적으로 하거나 예방하려는 암, 예를 들어 골수 증식성 장애에서, 함께 연합하여 치료적으로 유효한 양을 포함하는 약학적 조성물을 제공하는 것이다. 상기 조성물에서, mTOR 저해제 및 JAK 저해제 (예를 들어, 화학식 I의 JAK 저해제)는 함께 투여되거나, 어느 하나가 투여된 후 다른 하나가 투여되거나, 하나의 복합된 단위 용량 형태로, 또는 두 개의 분리된 단위 용량 형태로 각각 투여될 수 있다. 상기 단위 용량 형태는 또한 고정된 조합일 수 있다.

상기 두 가지 화합물을 각각 투여하기 위하여, 또는 고정된 조합으로 즉, 본 발명에 따른 상기 두 가지 화합물을 포함하는 단일의 생약 조성물로 투여하기 위하여, 상기 약학적 조성물은 공지된 방법 그 자체로 제조될 수 있으며, 이들은 사람을 포함하는 포유 동물 (온혈 동물)에 경구 또는 직장과 같은 경장 (enteral), 및 비경구 (parenteral) 투여에 적합하며, 1 이상의 약학적 활성 조합 구성원 단독을, 또는 특히 경장 또는 비경구 투여에 적합한 1 이상의 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제와 조합하여 치료적으로 유효한 양으로 포함하는 것일 수 있다.

제제

본 발명의 상기 약 조합은 약학적 제제 분야에서 숙련된 자에게 자명한 다양한 방법에 의해 제제화될 수 있다. 상술한 상기 다양한 방출 특성은 여러 상이한 방식으로 얻어질 수 있다. 적합한 제제는 예를 들어, 정제, 캡슐, 압축 코팅 제제, 및 다른 용이하게 투여되는 제제를 포함한다.

적합한 약학적 제제는 예를 들어, 약 0.1% 내지 약 99.9%, 바람직하게는 약 1% 내지 약 60%의 활성 성분(들)을 함유할 수 있다. 상기 병용 요법을 경장 또는 비경구 투여하기 위한 약학적 제제로는, 예를 들어 설탕-코팅된 정제, 정제, 캡슐 또는 좌약 또는 앰플과 같은 단위 용량 형태를 들 수 있다. 달리 지시된 바가 없으면, 이들은 공지된 방법 그 자체, 예를 들어 통상적인 혼합, 입자화 (granulating), 설탕-코팅, 용해 또는 동결 건조 과정의 수단을 통해 제조될 수 있다. 필요한 유효량은 용량 단위의 복수의 투여에 의해 달성될 수 있기 때문에, 각 용량 형태의 개별 용량으로 함유된 조합 구성의 단위 함량은 그 자체로 유효량을 구성할 필요는 없다.

특히, 본 발명의 상기 조합의, 상기 조합 구성 각각의 치료적 유효량은 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있으며, 임의의 순서로 투여될 수 있고, 상기 구성 요소는 각각 또는 고정된 조합으로서 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 질환의 치료 방법은 동시에 또는 임의의 순서에 따라 순차적으로, (i) 유리 형태 또는 약학적으로 허용 가능한 염 형태의 제1 물질의 투여, 및 (ii) 유리 형태 또는 약학적으로 허용 가능한 염 형태의 제2 물질의 투여를 포함할 수 있으며, 이들은 연합하여 치료적 유효량으로, 바람직하게는 시너지적으로 유효한 양, 예를 들어 본 발명에서 개시된 양에 부합하는 일일 용량 또는 간헐적 용량으로 투여될 수 있다. 본 발명의 상기 조합의, 상기 각 조합 구성은 상기 치료법 과정 중 다른 시간에 각각 투여되거나, 분리된 또는 단일의 조합 형태로 동시에 투여될 수 있다. 추가적으로, 상기 용어 "투여"는 또한 생체 내 (in vivo)에서 상기 조합 구성으로 변환되는 조합 구성의 프로드러그를 사용하는 것을 포함한다. 따라서 본 발명은 이러한 동시 요법 또는 대체 치료를 모두 포함하는 것으로 이해되어야 하며, 상기 용어 "투여"는 이에 부합하게 해석되어야 한다.

본 발명의 상기 조합에 사용되는, 상기 조합 구성원의 각각의 유효 용량은 사용되는 특정 화합물 또는 약학적 조성물, 투여 방식, 치료되는 병증, 치료되는 병증의 심각성에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 본 발명의 상기 조합의 상기 투여 방법은 투여 경로, 및 환자의 신장 및 간 기능을 포함하는 다양한 인자에 부합하게 선택된다. 통상의 숙련된 임상 의사 (clinician) 또는 내과 의사 (physician)는 병증을 완화시키거나 병증에 대항하거나 또는 병증의 진행을 중단시키기 위하여 요구되는 단일 활성 성분의 유효량을 용이하게 결정하고 처방할 수 있다.

본 발명에서 설명하는 상기 치료에 사용되는 상기 화합물에 대한 바람직한 용량은 총, 약 1 mg 내지 약 600 mg, 바람직하게는 약 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 90, 95, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220, 240, 260, 280, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 420, 440, 460, 480, 500, 520, 540, 560, 580 내지 약 600 mg이다. 일 구체예에서, 상기 JAK 저해제는 5 mg, 10 mg, 15 mg, 20 mg, 또는 25 mg 용량으로 투여된다.

일 구체예에 따르면, 본 발명은 mTOR 저해제 및 화학식 I의 화합물을 포함하는 조성물을 제공한다. 일 구체예에서, 상기 화학식 I의 화합물은 (3R)-3-사이클로펜틸-3-[4-(7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)-1H-피라졸-1-일]프로판나이트릴, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염이다. 또 다른 구체예에서, 상기 mTOR 저해제는 에베롤리무스 (RAD001) 또는 2-(4-아미노-1-이소프로필-1H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-3-일)-1H-인돌-5-올 (PP242)이다. 또 다른 구체예에서, 상기 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함한다.

실시예

본 발명은 하기의 실시예들에 의하여 추가적으로 설명된다. 이들 실시예들이 추가적인 한정으로 이해되어서는 안된다.

하기의 내용은 mTOR 신호 전달을 타겟으로 하는 약이 MPN의 다양한 세포 모델에서 사이토카인으로 유도되는 세포 증식 및 사이토카인에 독립적인 세포 증식을 방해한다는 것을 입증하며, JAK1/JAK2 저해제 또는 인터페론 (interferon)-α를 이용한 동시적 치료가 시너지 활성을 발생시킨다는 것을 입증한다. 이러한 발견은 골수 증식성 종양의 치료에 있어서 Akt/mTOR 타겟팅의 유효성을 탐구하는 근거를 제공한다.

방법 및 재료

시약

시그마-알드리치 (Sigma-Aldrich; St. Louis, Germany)로부터 RAD001 (mTOR 특이적 알로스테릭 (allosteric) 저해제), PP242 (mTOR의 ATP 도메인 저해제) 및 수산화 요소를 입수하였다. 페가시스 (Pegasys)로부터 인터페론-α를 입수하였다. 셀 시그날링 테크놀로지 (Cell Signaling　Technology; Danvers, MA, US)로부터 포스포 (p)-STAT5 (Tyr694), STAT5, p-4EBP1 (Thr70), 4EBP1, mTOR, p-JAK2 (Tyr1007/1008) 및 JAK2에 대한 항체를 입수하였다. 산타 크루즈 바이오테크놀로지 (Santa Cruz Biotechnology; Santa Cruz, CA, US)로부터 항-인간 튜불린 (tubulin) 항체를 입수하였다. 밀테니 바이오텍 (Miltenyi Biotec; Gladbach, Germany)으로부터 재조합 인간 IL-3, GM-CSF, SCF, 및 EPO를 구입하였다. Dharmacon siGENOME 스마트 풀 (Thermo Scientific, Waltham, MA, US)로부터 mTOR에 대한 siRNA를 입수하였으며; 음성 대조군으로 상기 siGENOME 논 (non)-타겟팅 siRNA Pool#1 (Thermo Scientific)을 사용하였다.

세포주 및 세포 배양

독일 미생물 및 세포 배양 컬렉션 (German Collection of Microorganisms and Cell Cultures; DSMZ, Braunschweig, Germany)으로부터 HEL, SET2 및 K562 인간 세포주를 구입하였다. JAK2 야생형 (wt) 또는 JAK2V617F를 발현하는 쥐 BaF/3 및 BaF/3-EPOR 세포를 R. Skoda (Basel, Switzerland)로부터 제공받았다. 세포주를 10% 소 태아 혈청 (fetal bovine serum, FBS; Lonza, Belgium) (SET2 세포에 대하여 20%), 항생제 및 L-글루타민이 공급된 RPMI 1640에서 배양하였다. mIL-3 및 EPO를 상기 JAK2 WT BaF/3 및 BaF/3-EPOR 세포의 배양 배지에 각각 첨가하였다.

인간 세포

PV 또는 PMF로 진단받은 환자들 (2008 WHO 기준)로부터, 아지엔다 오스페달리에라 대학 카레기 (Azienda Ospedaliera-Universitaria Careggi)의 임상시험 심사위원회 (Institutional Review Board)에서 승인받은 프로토콜하에서 말초 혈액 (peripheral blood; PB) 또는 골수 (BM)의 샘플을 수득하고 동의를 구하였다. 사전 동의하에 조혈모세포의 건강한 기증자로부터 과량의 CD34⁺ 세포를 기증받았다. 연구는 헬싱키 선언 원칙에 따라 수행되었다. CD34⁺ 세포는 상술한 바와 같이 면역 자기적 (immunomagnetic)으로 선택되었다. 과립성 백혈구에서, 상기 JAK2V617F 돌연변이 상태를 양적 실시간 PCR 분석 (quantitative real-time PCR assay)을 통하여 측정하였다.

증식 저해 분석, 클론 형성 분석, 및 아팝토시스 또는 세포 주기 분석

세포 (2×10⁴)를 증가하는 농도의 상기 약(들)을 가진 96-웰 조직 배양 플레이트에 3 벌로 도말하고; WST-1 분석 (Roche, USA)을 이용하여 살아있는 세포를 측정하고 동일한 부피의 비히클 (DMSO)만을 포함하는 웰에 정규화하였다. 50 %의 증식 저해가 발생한 농도를 오리진 소프트웨어 (Origin software) (V 7.5, OriginLab Northampton, MA)를 이용하여 계산하였다. 일부 실험에서, 클론 형성 (clonogenic) 시험 또한 수행하였다. 세포 (5×10³)를 FBS가 포함된 0.5% 아가 배지에 도말하고, 다양한 양의 약(들) (또는 대조구 플레이트에 동일한 부피의 비히클)을, 배양 시작 시에 한차례 첨가하였다. 7일간 인큐베이션한 후, 도립 현미경으로 콜로니를 세어 보았다. 아팝토시스 사멸 세포의 양을 아넥신 (Annexin)-V-FLUOS 염색 키트 (Roche)를 이용하여 유동 세포 계수법에 의해 측정하였으며; 20,000 사건 이상 수득되었다. 유동 세포 계수법에 의한 세포 주기 분포 분석을 위하여, 1×10⁶ 세포를 에탄올 95%, RNase 10 ㎍/mL 및 프로피디움 아이오다이드 (propidium iodide) 50 mg/mL로 처리하였다.

인간 조혈 세포 전구체에 대한 콜로니 분석 및 콜로니 유전자형 검사

BFU-E 및 CFU-GM을 성장시키기 위하여, MPN 환자 또는 대조구 개체로부터 유래된 BM 단핵 세포를 SCF 50 ng/mL, IL-3 10 ng/mL, IL-6 10 ng/mL, GM-CSF 10 ng/mL, G-CSF 10 ng/mL 및 EPO 3 U/mL이 포함된 메틸셀룰로오스 (MethoCult; StemCell Technologies, Vancouver, Canada)에 1×10⁵/mL로 도말하였다. PV 환자로부터 유래된 PB 단핵 세포 2.5×10⁵/mL를 EPO가 없는 백혈구-조정 배지를 포함하는 메틸셀룰로오스 (StemCell Technol., cat. No.#04531)에 도말하여 EEC 분석을 수행하였다. CFU-Mk의 성장을 위하여, 메가컬트 콜라겐 (Megacult Collagen), 및 트롬보포이에틴 (Thrombopoietin) 50 ng/mL, IL-3 10 ng/mL, IL-6 10 ng/mL가 포함된 지질 배지 (StemCell Technol.)에서 24-웰 플레이트에 5×10⁴/mL CD34⁺ 세포를 도말하였다. 14일째에 표준 조건에 따라 콜로니를 세어 보았다.

JAK2V617F 단일 콜로니 유전자형 검사를 위하여, 대립 유전자에 특이적인 PCR 분석을 이용하였다. 웰에서 분리된 콜로니 (한 위치당 40 콜로니 이상)를 DNase/RNase가 불포함된 5 μL의 물에서 반고형 배지에 각각 떼어 놓고, 95℃에서 5분 동안 용해하고, PCR 증폭 및 겔 전기 영동을 수행하였다.

세포 용해 및 SDS - PAGE 웨스턴 블랏팅

세포를 단백질 분해 효소 저해제 칵테일 (Halt Protease Inhibitor Cocktail Kit, PIERCE, Rockford, IL,　US)을 포함하는 RIPA 용해 버퍼 (50 mM pH 7.4 트리스 (Tris)-HCl, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1 mM EDTA)에 재현탁하고, 표준 프로토콜에 따라 소듐 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동 분리 및 면역 블랏 (Immunoblot) PVDF 멤브레인 (BioRad, Hercules, CA, US)으로의 웨스턴 블랏팅을 수행하였다. 멤브레인을 1차 항체로 검사한 다음, 고추 냉이 (horseradish) 과산화효소와 컨쥬게이션된 항-Ig 항체를 토끼 (시그마-알드리치)에서 발생시키고; 이미지 콴트 350 장치 (Image Quant 350 apparatus (GE Healthcare, Little Chalfont, UK))를 이용하여 면역 반응성 단백질이 ECL임을 밝혀 내었다.

RNA 분리 및 실시간 양적 PCR ( RTQ - PCR )

트리졸 (Invitrogen-Life Technologies, Paisley, UK)을 이용하여 전체 RNA를 정제하고, 상기 RNA 농도 및 순도/온전성 (integrity)을 나노드랍 ND-1000 분광 광도계 (NanoDrop Techn., Wilmington, DE, USA)로 측정하였다. RNA 1 마이크로그램을 고성능 cDNA 아카이브 (Archive) 키트 (Applied Biosystems, Foster City, CA)를 이용하여 역전사시켰다. ABI PRISM 7300 HT 및 태크만 (TaqMan)^® 유전자 발현 분석 (Applied Biosystems)을 이용하여 태크만 유니버셜 PCR 마스터 믹스 (TaqMan Universal PCR Master Mix)로 RT-QPCR 반응을 3회 반복 수행하였다. 하우스키핑 (housekeeping) 유전자 (△C_T)로서 VIC-라벨된 RNaseP 프로브를 이용하는, 상대적인 정량의 비교 주기 한계 (C_T) 방법 (Comparative cycle threshold (C_T) method)을 이용하여 유전자 발현 프로파일링을 달성하였다.

세포 형질 감염

Amaxa 키트 R을 이용한 Amaxa 뉴클레오펙터 (Amaxa Biosystems, Gaithersburg, MD, USA)에서 기하급수적으로 성장하는 HEL 세포에 siRNA를 전기 천공하였다. 간단히, 0.1 mL 부피의 2-5x10⁶ 세포에 1 μM siRNA로 형질 감염시키고, 미리 가열된 배양 배지를 함유하는 24-웰 플레이트에 즉시 옮겼다. pmaxGFP^® (Amaxa Biosystems)를 이용한 유동 세포 계수법에 의해 형질 감염의 효율 및 세포 생존 능력을 평가하였으며, 그 결과는 항상 85 %를 초과하였다.

통계적 방법

SPSS (StatSoft, Inc., Tulsa, OK) 또는 오리진 소프트웨어를 이용하여, 적절한 만-위트니 U (Mann-Whitney U) 또는 피셔 (Fisher) 테스트에 의해 그룹간 비교를 수행하였다. 두 가지 측면의 시험으로부터 얻어진 유의성 수준은 P＜0.05 이었다. Chou 및 Talalay 방법의 중간-효과 원리에 따라 CalcuSyn 소프트웨어를 이용하여 두 가지 약 사이의 상호 작용을 측정하는 조합 인덱스 (combination index; CI)를 계산하였다. 상기 공식에 따라, CI＜1이면 두 가지 약의 상호 작용이 시너지적인 것으로 여겨지며, CI=1이면 상호 작용이 부가적인 것으로 여겨지고, CI＞1이면 상호 작용이 길항적인 것으로 여겨진다.

결과

mTOR 저해제는 JAK2 V617F 돌연변이 세포주의 증식을 차단한다.

JAK2V617F 돌연변이 인간 백혈병 세포주가 mTOR 저해에 민감한지 아닌지를 규명하기 위하여, 상기 선택적인 알로스테릭 mTOR 저해제 RAD001 및 mTOR의 활성 부위의 ATP 경쟁적 저해제인 PP242를 이용하였다. JAK2V617F 돌연변이 HEL 및 SET2 세포는 적어도 대조구로 사용된 BCR/ABL 양성 K562 세포만큼 mTOR 저해에 민감한 것으로 밝혀졌다. IC₅₀ 값은 표 1에 나타낸다. JAK2 야생형 쥐 IL-3-의존적 (Ba/F3) 또는 EPO-의존적 (Ba/F3-EPOR) 세포 또는 사이토카인-독립적 JAK2V617F 대응물에 대한 mTOR 저해제의 효과를 관찰하였다. 배양 배지에서 IL-3의 부재 또는 존재 시 모두, V617F Ba/F3 세포가 JAK2 wt 대응물보다 RAD001에 더 민감한 것으로 관찰되었다. 유사하게, JAK2 wt 세포에서 IC₅₀＞10,000 nM인 것과 비교하여, Ba/F3-EPOR 세포에서 V617F 돌연변이 세포의 IC₅₀는 EPO의 부재 및 존재 시 각각 651 nM 및 1,213 nM이었다. PP242도 유사한 효과를 나타내었다: wt 세포에서 3,400 nM인 것 대비, V617F Ba/F3 세포에서의 IC₅₀는 IL-3의 부재 또는 존재 시 각각 80 nM 및 1,600 nM이었고; V617F 세포에서 EPO의 존재 또는 부재 시 각각 500 nM 및 750 nM인 것 대비, wt Ba/F3-EPOR 세포에서 IC₅₀는 5,931 nM이었다 (표 1). 이들의 IC₅₀ 농도에서, RAD001 및 PP242 (나타내지 않음)는 세포 주기의 G0/G1 단계에서 SET2 및 HEL 세포의 세포 주기 중단을 야기하였다 (도 1A). 한편, PP242가 미미하게, 그러나 용량-의존적으로, SET2 (도 1B) 또는 HEL (나타내지 않음) 세포에서 가장 고농도에서 세포 아팝토시스를 촉진하는 반면, RAD001 처리는 세포 사멸 유도에 대체로 효력이 없었다. 세포 증식의 저해에 추가적으로, RAD001는 또한 K562 보다 더 효과적으로 JAK2V617F 돌연변이 HEL, SET2 및 UKE-1의 클론 형성 가능성을 손상시킨다는 것이 발견되었다. 또한, V617F Ba/F3 세포에 의한 콜로니 형성은 배지 내 사이토카인과 무관하게, wt 대응물 (데이터를 나타내지 않음)에 비하여 상당히 낮은 RAD001 농도에서 저해되었다. 종합적으로, 상기 데이터는 JAK2V617F 돌연변이 세포가 일괄적으로 mTOR 저해에 민감하다는 것을 나타내며, 세포 증식의 차단은 아팝토시스 효과보다 세포 분열 억제 효과를 주로 반영한다는 것을 시사한다.

다음으로, mTOR 저해제에 의해 유도되는 세포 증식 저해의 메카니즘과, JAK1/JAK2 저해제 화합물 A 및 히스톤 탈아세틸화 효소 (HDAC) 저해제 파노비노스태트 (Panobinostat)의 세포 증식 저해 메카니즘을 비교하였다. HEL 및 SET2 세포에서 상기 분자들은 모두 K562 세포주에서 측정된 것보다 상당히 낮은 IC₅₀ 농도에서 성장이 저해되었다 (표 1). 그러나, mTOR 저해제와 달리, 이들은 용량-의존적인 세포 아팝토시스의 강한 유도체였다 (도 1C, D). HEL (IC₅₀ = 410 μM) 및 SET2 (IC₅₀ = 330 μM) 세포는 K562 세포 (IC₅₀ = 4,910 μM)보다 리보뉴클레오사이드 디포스페이트 환원 효소 저해제 수산화 요소에 더욱 민감한 것으로 나타났으며 (표 1); 수산화 요소는 용량-의존적인 세포 아팝토시스를 유도하였다 (도 1E).

또한, 약에 대한 민감성을 나타내는 사이토카인의 역할을 이용하여 Ba/F3 세포에서 JAK1/JAK2 저해제의 효과를 평가하였다. 화합물 A에 대하여 V617F Ba/F3 및 Ba/F3-EPOR 세포 (각각, IC₅₀ = 34 nM 및 220 nM)는 이들의 wt 대응물 (화합물 A에 대하여 각각 1,600 nM 또는 457 nM) 보다 더 민감한 것으로 관찰되었다. 그러나, 배양 배지에 적절한 사이토카인을 첨가하는 경우, V617F 돌연변이 세포에서 JAK1/JAK2 저해제의 우선적인 성장 저해 효과가 차단되었다 (Ba/F3 세포에서 화합물 A에 대하여 IC₅₀ = 1600 nM; Ba/F3-EPOR 세포에서 화합물 A에 대하여 IC₅₀ = 521 nM) (표 1).

종합적으로, 상기 데이터는 JAK2V617F 백혈병 세포주에서 JAK1/JAK2 및 HDAC 저해제의 성장 저해 활성이 일반적으로 세포 아팝토시스에 의해 매개된다는 것을 나타낸다. 더욱이, 사이토카인은 JAK1/JAK2 저해제에 대한 세포 민감성을 현저하게 감소시킨다는 것이 확인되었다.

도 1은 선택된 mTOR 저해제, JAK1/JAK2 저해제, 히스톤 탈아세틸화 효소 저해제 및 수산화 요소가 SET2 또는 HEL 세포에서 세포 아팝토시스 및 세포 주기에 대해 미치는 효과를 보여준다. 패널 (B) 내지 (E)에서, 48 시간 동안 다양한 양의 mTOR 저해제 RAD001 또는 PP242 (B), JAK1/JAK2 저해제 화합물 A (C), HDAC 저해제 파노비노스태트 (D) 또는 수산화 요소 (E)에 노출시킨 SET2 세포에서 아넥신 V-양성 아팝토시스 사멸 세포의 백분율을 유동 세포 계수법으로 측정하였다. 결과는 비히클 (DMSO)만을 함유하는 대조구 웰과 비교하여 살아있는 세포의 백분율을 더하여 표현한다. 괴저성 사멸 (necrotic) 세포의 분획은 이중-양성 아넥신 V/프로피디움 아이오다이드 세포로 식별되었다. 유사한 세 가지 실험 중 하나를 대표로 제시한다. *, P＜0.05; **, P＜0.01.

표 4는 mTOR 저해제 RAD001 또는 PP242 및 JAK1/JAK2 저해제 화합물 A에 의한 JAK2V617F 돌연변이 세포주의 클론 형성성 성장의 저해를 보여준다. 이형 접합 (SET-2) 또는 동형 접합 (HEL) JAK2V617F 돌연변이 인간-기원 (origin) 세포주, 및 BCR/ABL 돌연변이 K562 세포주 (대조구로 사용된)를 증가되는 농도의 RAD001, PP242 또는 화합물 A에 노출시켰다. 10³ 세포를 다양한 양의 상기 약이 존재하는 아가에 도말하고; 7일째에 콜로니 수를 헤아리고 비히클을 함유하는 대조구 플레이트에 성장한 콜로니 수의 백분율로 표현하였다. JAK2V617F 과발현 쥐 BaF/3 세포를 RAD001, PP242 또는 화합물 A에 유사하게 노출시키고, 야생형 세포 (wt)와 비교하였다. 상기 배양 배지에 인터루킨 (Interleukin)-3 (10 ng/mL)을 첨가하거나 또는 첨가하지 않았다. 나타낸 IC₅₀ 값은 적어도 세 번의 독립적인 실험의 평균±표준 편차 (Mean±SD)이다.

mTOR 저해제는 mTOR 경로의 다운스트림 신호 전달을 약화시키고, JAK2 V617F 돌연변이 세포주에서 STAT5 인산화를 감소시킨다.

JAK2V617F 돌연변이 세포에서 신호 전달에 대한 mTOR 저해의 효과를, SET2 세포를 모델로 사용하여 하기에서 평가하였다 (도 2). 인산화된 JAK2 및 전체 JAK2는 영향을 받지 않는 것으로 나타난 반면, RAD001 및 PP242 처리는 mTOR 타겟 4E-BP1의 인산화 및 예상 밖으로 STAT5의 인산화를 용량에 의존적으로 감소시키는 것으로 관찰되었다. 비교에서, 상기 JAK1/JAK2 저해제 화합물 A는 영향받지 않는 4EBP1은 남겨두고, 현저하게 용량에 의존적으로 JAK2 및 STAT5의 인산화를 감소시켰다. 상기 HDAC 저해제 파노비노스태트는 인산화된 JAK2 및 전체 JAK2, 인산화된 STAT5를 용량에 의존적으로 감소시켰으며, 인산화된 4E-BP1에 대하여 미미한 효과를 나타내었다. 대조적으로, 수산화 요소는 4EBP1 또는 STAT5의 수준 또는 인산화 상태에 영향을 미치지 않았다.

STAT5 인산화에 대한 mTOR 저해 결과뿐만 아니라 JAK2V617 돌연변이 및 mTOR 활성화 사이의 상관 관계를 더욱 특성화하기 위하여, BA/F3 및 Ba/F3-EPOR 세포도 사용하였다. 첫째, 4E-BP1은 V617F 세포에서는 과잉-인산화된 반면, 사이토카인이 결핍된 JAK2 wt Ba/F3 및 Ba/F3-EPOR 세포에서 미량으로 인산화되는 것으로 관찰되었으며, 이는 JAK2V617F 돌연변이 세포에서 Akt 구성적 활성화에 대한 이전의 데이터를 뒷받침한다. 상기 사이토카인의 첨가는 JAK2 wt 및 V617F 돌연변이 Ba/F3 및 Ba/F3-EPOR 세포에서 4E-BP1 인산화의 증가를 야기하였다 (데이터를 나타내지 않음). RAD001과 함께 인큐베이션된 세포에서, 4E-BP1 인산화의 현저한 저해가 발생하였으며 (데이터를 나타내지 않음), 적어도 24 시간까지 지속되었다 (데이터를 나타내지 않음). STAT5 인산화는 IL-3 또는 EPO가 결핍된 JAK2 wt Ba/F3 또는 Ba/F3-EPOR 세포와 비교할 때, V617F 세포에서 더 우수하며, 이는 사이토카인에 노출시킨 후 대체로 증가되었다. STAT5 인산화는 4EBP1에 대한 효과를 반영하여 상당히 하향 조절되었으며; 저해는 60분째에 이미 두드러져서 24 시간까지 유지되었다 (나타내지 않음).

STAT5 인산화의 약화가 STAT5 인산화에 대한 RAD001의 직접적인 효과에 기인한 것이라기 보다, 실제로 mTOR 저해에 의하여 매개된다는 것을 확인하기 위하여, HEL 세포에서 mTOR을 특이적 siRNA로 사일런싱 (silencing)하였다. 24 시간째에서 siRNA 처리가 mTOR 수준을 단지 50% 내지 60% 감소시켰음에도 불구하고, 무관한 대조구 siRNA로 처리된 세포와 비교할 때, 인산화된 4E-BP1의 수준은 급격히 감소되었으며; 전체 4E-BP1 단백질 함량은 전혀 변하지 않았다 (데이터를 나타내지 않음). 8 시간째에, mTOR 및 인산화된 4E-BP1 모두 겨우 검출되었다. 이와 동시에, 인산화된 STAT5 수준은 대조구와 비교하여 mTOR 특이적 siRNA가 핵 안으로 도입된 세포에서 24 시간 내지 48 시간째에 현저하게 감소된 것으로 나타났으며; 전체 STAT5 함량은 변하지 않았다.

도 2는 선택된 mTOR 저해제, JAK1/JAK2 저해제, 히스톤 탈아세틸화 효소 저해제 및 수산화 요소가 SET2 세포에서 mTOR 및 JAK/STA 신호 전달에 미치는 효과를 보여준다. SET2 세포를 상기 약의 농도를 증가시키면서 24 시간 동안 인큐베이션하고, 전체 및 인산화된 JAK2, STAT5, 및 4EBP1의 수준을 웨스턴 블랏으로 분석하였다. 정규화 로딩을 위하여 튜불린 (Tubulin)을 사용하였다. 상기 제시된 결과는 상기 상이한 약에 대하여 2회 내지 4회의 유사한 실험 중 대표적인 것을 나타낸 것이다.

RAD001 또는 PP242 와 화합물 A의 조합은 JAK2 V617F 백혈병 세포주 증식 및 콜로니 형성의 시너지적인 저해를 발생시킨다.

SET2 및 V617F Ba/F3-EPOR 세포에서 mTOR 및 JAK1/JAK2의 동시 발생적인 저해의 효과를 증식 저해 효과 측정에 의하여 평가하였다. 세포를 상이한 농도의 RAD001 또는 PP242와 함께 인큐베이션하고; 상기 약 조합을 이용하여 상기 두 약의 강한 시너지적 활성을 뒷받침하는 0.12 내지 0.44의 범위의 조합 인덱스 (CI)가 측정되었다 (표 3).

SET2 및 Ba/F3 epoR V617F 세포를 이용한 추가적인 실험에서 클론 형성 아가 분석을 수행하였으며 (표 5); 상기 배양에서 약의 시너지 효과를 다시 한번 뒷받침하는 0.22 내지 0.81 범위의 CI가 측정되었다.

RAD001 또는 PP242 와 화합물 A의 조합은 EEC 콜로니 형성 분석에서 MPN 환자 유래의 조혈 전구 세포의 시너지적인 저해를 발생시킨다.

MPN 환자 유래의 백혈병 세포의 증식이 mTOR 및 JAK 경로의 동시적인 타겟팅에 영향을 받을 수 있는지를 결정하기 위하여, EEC 분석에서 PV 환자 유래의 PBMC를 RAD001, PP242, 화합물 A, 또는 RAD001 또는 PP242 및 화합물 A의 조합의 농도를 증가시키면서 인큐베이션하였다. PV 환자 유래의 단핵 세포로부터 유래된 말초-혈액을, EEC 성장을 위해 EPO가 없는 메틸셀룰로오스 배지에서 고정된 양의 RAD001, PP242, 및/또는 화합물 A의 부재 또는 존재하에 배양하였다.

12일째에 상기 EEC를 세어서, 비히클만을 함유하는 대조구 플레이트에서 측정된 콜로니 수의 백분율로 표현하였다. * P＜0.05, **, P＜0.01. 표 6에 제시된 결과는 상기 배양에서 0.2 내지 0.26의 CI를 나타내며, 이는 JAK2V617F 세포 성장의 저해에서 mTOR 및 JAK 저해제 사이의 시너지 효과를 추가적으로 증명한다.

논의

MPN-관련 JAK2V617F 돌연변이는 JAK2/STAT 경로의 구성적 활성화를 결정하며; JAK2 저해제는 시험관 내 (in vitro)에서 JAK2V617F 돌연변이 세포의 증식을 감소시키고, JAK2V617F 트랜스제닉 동물에서 골수 증식 (myeloproliferation)을 완화시키며 [Liu PC, Caulder E, Li J, 외, Combined inhibition of Janus kinase 1/2 for the treatment of JAK2V617F-driven neoplasms: selective effects on mutant cells and improvements in measures of disease severity. Clin Cancer Res. 2009;15:6891-6900], 골수 섬유증 [Verstovsek S, Kantarjian H, Mesa RA, 외, Safety and efficacy of INCB018424, a JAK1 and JAK2 inhibitor, in myelofibrosis. N Engl J Med. 2010;363:1117-1127] 또는 수산화 요소-내성 PV 또는 ET 환자에서 측정 가능한 임상적 개선을 발생시킨다. 그러나, JAK2V617F에 부여된 다양성은 미미하며 어떠한 분자적 완화도 아직 보고된 바가 없다. 더욱이, JAK2V617F 낙-인 마우스에서 질환이 시작되고 있는 세포는 JAK2 저해제 TG101348를 이용한 치료에 영향받지 않았다. 종합적으로, 이러한 관찰들은 현재 이용 가능한 JAK2 저해제로는 MPN 클론의 효과적인 타겟팅을 달성할 수 없을 것이라는 가능성을 제시한다. 따라서, 돌연변이 세포의 조절에 장애가 있는 증식과 관련된 세포 신호의 보다 상세한 지식은, 더욱 효과적인 치료 전략을 고안하기 위해 바람직하다. 이와 관련하여, HDACi 파노비노스태트 및 JAK2 저해제 TG101209의 공동-처리로, 인간 및 쥐 JAK2V617F 돌연변이 세포에서 JAK/STAT 신호 전달의 상당한 감소가 측정되었으며, 각각의 약과 비교할 때 MPN CD34⁺ 세포에 대한 세포 독성이 증가하였음을 보여주었다.

본 연구는 PI3k/Akt 경로의 주요 다운스트림 타겟인 라파마이신의 포유류 타겟 (mTOR)에 초점을 맞추었다. 상기 세린/트레오닌 키나아제 mTOR은 세포 대사, 생존, 성장, 증식 및 자가 소화 작용 (autophagy)의 중심적인 조절자로 기능한다. mTOR은 기반이 되는 멤버 라파마이신의 이름을 따라 라팔로그 (rapalog)라 이름 붙여진 분자의 패밀리에 의해 저해되며, 이는 최근 들어 암에 관한 임상 시험에서 사용되고 있다. mTOR은 두 개의 복합체, TORC1 및 TORC2이 존재한다. 랩터와 함께 형성된 TORC1은 캡 (cap)-의존적 mRNA 번역의 수준을 조절하고, 진핵 세포 개시 인자 (eukaryotic initiation factor) 4E-결합 단백질 1 (4E-binding protein 1; 4E-BP1) 및 S6 키나아제 1 (S6K1)과 같은 이펙터 (effector)를 인산화시킨다. 다시, 인산화된 4E-BP1은 진핵 세포 개시 인자 4E (eIF4E)에 대한 결합 저해를 유도하고, 사이클린 (cyclin) D1, Bcl-2, Bcl-X_L _, 및 혈관 내피 세포 성장 인자 (vascular endothelial growth factor)를 포함하는 몇 가지 유전자의 번역 활성화를 방해한다. 이와 달리, S6K1은 eIFe4, mTOR, 진핵 세포 개시 인자 4B 및 신장 (elongation)-2 키나아제와 같은 주요 타겟의 인산화에 의해 세포 성장을 조절한다. eIF4E 및 SK1는 모두 세포 형질 전환과 관련되어 있으며, 일부 예후가 좋지 않은 (poor-prognosis) 암에서 과발현된다. TORC1의 추가적인 구성으로, 단백질 (mLST8/GβL)과 같은 포유류 LST8/G-단백질 β-서브유닛 (subunit) 및 최근 확인된 구성 PRAS40 및 DEPTOR을 포함한다. mTOR은 또한 mTORC2에서 릭터 (Rictor)와 결합하며, 이는 라파마이신에 대체로 민감하지 않고, GβL 및 단백질 1과 상호 작용하는 포유류 자극-활성화 단백질 키나아제 (mammalian stress-activated protein kinase interacting protein 1; mSIN1)로 구성되며; TORC 2는 Ser473에서 Akt의 인산화와 관련된다. RAD001이 백혈병 세포에서 mTORC1 및 mTORC2 양자의 억제를 통하여 Akt 활성을 강하게 저해하는 것으로 보고되었음에도 불구하고, 일부 예에서, 상기 mTORC2로부터 Akt 까지의 음성 피드백 루프는 악화된 종양 증가를 야기한다. RAD001과 같은 알로스테릭 mTOR 저해제의 가능한 제한 및 문제점을 극복하기 위하여, mTOR ATP 활성 부위의 경쟁적 저해제로 작용하는 신규 분자가 개발되어 왔으며; 이들 중 하나인 PP242는 백혈병 세포에 대하여 TORC1 및 TORC2-매개 활성 및 가해진 강한 세포 독성 모두를 강하게 억제한다. RAD001 및 PP242는 시험관 내 (in vitro)에서 MPN에 대한 치료를 위한 타겟으로 추정되는 mTOR의 역할을 탐구하기 위하여 사용되었다.

mTOR 저해제가 대조구 세포에 비하여 상당히 낮은 약 농도에서 JAK2V617F 돌연변이 인간 및 쥐 백혈병 세포주의 세포 증식의 중단을 유발한다는 것을 처음으로 입증하였다 (표 1). 이와 대조적으로, PP242는 고농도에서 일부 세포 아팝토시스를 야기하는 반면, RAD001은 세포 사멸을 유도하지 않았으며; 따라서, 상기 실험적 환경에서, mTOR 저해제는 주요 세포 증식 억제제이다. 상기 작용 방식은, 모두 세포 아팝토시스를 강하게 유발하는 JAK1/JAK2 저해제 화합물 A 및 HDAC 저해제 파노비노스태트와 상이하였다. 이와 달리, mTOR 저해제로 야기되는 세포 증식 저해는, JAK1/JAK2 저해제에 관한 경우와 다르게 Ba/FE 및 Ba/F3-EPOR 세포의 사이토카인 노출에 따른 JAK/STAT 경로의 극대화된 활성화에 의해 영향을 받지 않는다는 것이 입증되었다. 상기 후자의 관찰은 PV 환자 유래의 적혈구 전구체의 JAK2 저해제에 대한 민감성이, 배양 배지에 EPO를 첨가함으로써 억제되는 결과임을 입증하는 것과 동일선상에 있으며, 이는 RAD001에 의한 근본적인 세포 증식 저해의 메카니즘이 적어도 부분적으로 사이토카인-유도 JAK/STAT 활성화에 독립적이라는 것을 간접적으로 시사한다. V617F 콜로니의 수가 야생형의 경우에 비해 평균 39%가 감소되었기 때문에, RAD001이 PV 환자에서 야생형 전구체에 비해 JAK2V617F 돌연변이에 대하여 더 선택적이라는 것이 입증되었다 (표 2).

몇 가지 다른 암 세포에서 RAD001의 프로 (pro)-아팝토시스 효과 대신, 일반적인 항증식 효과가 입증되었으며, 이는 우선적으로 아팝토시스를 유도하는 물질을 이용한 병용 요법에 대한 근거를 제시한다. 이를 명심하여, 시험관 내 (in vitro)에서 mTOR 및 a JAK1/JAK2 저해제 조합의 효과를 연구하였으며, 백혈병 세포주의 증식 저해 (표 3) 및 클론 형성 가능성 저해 (표 5)에 관한 상당한 시너지 효과의 증거가 입증되었다. 추가적으로, MPN 환자 유래의 전구체 세포에 의한 조혈 세포 콜로니의 형성은 JAK1/JAK2 저해제 화합물 A와, RAD001 또는 PP242의 조합에 의해 시너지적으로 저해되었다 (표 6).

주요 신호 전달 분자의 분석은 JAK1/JAK2 저해제 및 HDAC 저해제가 JAK2 및 STAT 양자의 인산화를 감소시킨 반면, RAD001 및 PP242가 다운스트림 타겟 4EBP1의 인산화를 저해하였다는 것을 보여주었으며; 흥미롭게도, HDAC 저해제는 또한 전체 JAK2의 발현을 감소시켰다 (도 2). 흥미로운 관찰은, 전체 STAT5 단백질 함량 감소로 설명되지 않았던 RAD001 및 PP242에 의한 mTOR 저해가, STAT5 인산화의 주목할만한 감소와 관련되어 있다는 것이다. mTOR 및 STAT5 사이의 양성 피드백은 mTOR에 대한 특이적 저해제 RNA (siRNA)의 사용으로 4E-BP1 및 STAT5 인산화의 동시 발생적인 약화를 입증함으로써 뒷받침되었다 (데이터를 나타내지 않음). RAD001에 의해 매개되는 STAT5 인산화의 저해 정도는 4E-BP1 인산화에 영향을 주지 않는 JAK1/JAK2 인히비터스태트 (inhibitorsthat)에 비하여 훨씬 작았으며, 이는 MPN 세포에서 mTOR 활성화는 대체로 JAK2-독립적이라는 것을 뒷받침한다. 한편, 현재의 데이터로는 이러한 효과가 직접적인 것인지 아닌지를 결론 내릴 수는 없으나, HDAC 저해제가 4EBP1의 인산화를 미미하게 저해하는 것으로 밝혀졌다. 종합적으로, 상기 관찰들은 STAT5 인산화가 JAK2- 및 mTOR-개시 신호 전달을 타겟팅함으로써 영향을 받을 수 있다는 것을 나타낸다. 이와 관련하여, 몇 가지 암 세포 및 마우스 또는 인간 종양에서 수용체 (receptor) 티로신 키나아제/PI3K/Akt 신호 전달을 통한 STAT3의 라파마이신-민감성 활성화가 입증되었다.

표 1. 인간 및 쥐 JAK2V617F 돌연변이 및 JAK2 야생형 대조구 세포주에서 증식 저해 분석을 이용한 mTOR 저해제, JAK1/JAK2 저해제, HDAC 저해제 및 수산화 요소의 IC₅₀의 측정. *, P＜0.05; ** P＜0.00. N.D., not done.

표. 2 MPN 환자 유래의 CD34⁺ 세포의 클론 형성 분석에서 JAK2 야생형 및 V617F 콜로니의 비율에 대한 RAD001의 효과.

표 3. mTOR 저해제 및 JAK1/JAK2 저해제의 조합은 SET2 세포주 및 JAK2V617F Ba/F3-EPOR 세포주의 증식 저해에서 시너지적인 활성을 발생시킨다.

상기 IC₅₀ 값은 상이한 약 조합의 존재하에 증식 저해 분석에서 계산되었다. 기록된 값은 조합으로 사용된 상기 약의 3회 이상의 실험으로부터 얻어진 IC₅₀ 평균값이다. 상기 조합 인덱스 (CI)는 재료 및 방법에서 설명한 바와 같이 Chou 및 Talaly에 따라 계산되었다. CI＜1은 상기 두 가지 약의 상호 작용이 시너지적임을 나타낸다. 편의를 위하여, 상기 첫 두 칼럼 (회색)은, 표 1의 데이터로부터 계산된 각 약의 IC₅₀ 값이다.

표 4. 인간 및 쥐 JAK2V617F 돌연변이 세포주 및 대조구에 대한 클론 형성 분석을 이용한 RAD001, PP242 및 INC242의 IC₅₀의 측정.

상기 IC₅₀ 값 (즉, 비히클만 포함하는 대조구 디쉬에서 측정된 콜로니 수가 50 %로 감소된 약의 농도)은 아가 클론 형성 분석에서, 상이한 농도의 약의 존재하에 7일째에 상기 콜로니를 세어서 계산하였다. 쥐 세포의 경우, IL-3의 존재하에 유지된 Ba/F3 야생형 세포가 기준인 반면, 인간 세포주의 경우에는 K562가 대조구 세포주였다. **, P＜0.01.

표 5. RAD001 또는 PP242 및 INC242의 조합은 인간 및 쥐 JAK2V617F 돌연변이 세포주의 클론 형성 가능성 저해에 대하여 시너지적인 활성을 발생시킨다.

상기 IC₅₀ 값은 아가에서 클론 형성 분석에서 상이한 약 조합의 존재하에 7일째에 상기 성장된 콜로니를 세어서 계산하였다. 기록된 값은 조합으로 사용된 상기 두 가지 약의 IC₅₀의 3회 이상의 실험으로부터 얻어진 평균값이다. 상기 조합 인덱스 (CI)는 재료 및 방법에서 설명한 바에 따라 계산하였다. CI＜1은 상기 두 가지 약의 상호 작용이 시너지적임을 나타낸다. 편의를 위하여, 상기 첫 두 칼럼 (회색)은 각 약에 대하여 계산된 IC₅₀ 값을 나타낸 것이며, 이는 표 4에 기록되어 있다.

표 6. RAD001 또는 PP242 및 INC242의 조합은 PV 환자 유래의 인간 말초 혈액 단핵 세포의 클론 형성 가능성의 저해에 대하여 시너지적인 활성을 발생시킨다.

상기 IC₅₀ 값은 아가에서의 클론 형성 분석에서, 상이한 약 조합의 존재하에 수행된 배양 7일째에 성장한 콜로니를 세어서 계산하였다. 상기 조합 인덱스 (CI)는 재료 및 방법에서 설명한 바에 따라 계산하였다. CI＜1은 상기 두 가지 약의 상호 작용이 시너지적임을 나타낸다.

Claims

mTOR 저해제, 및 하기 화학식 I의 화합물 또는 이의 입체 이성질체, 토토머, 라세미체, 용매화물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는, 골수 증식성 종양 (myeloproliferative neoplasm)의 치료가 필요한 개체에서 골수 증식성 종양을 치료하기 위한 약학적 조성물로서,
상기 mTOR 저해제가 에베롤리무스 (RAD001) 또는 2-(4-아미노-1-이소프로필-1H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-3-일)-1H-인돌-5-올 (PP242)이고,
상기 화학식 I의 화합물이 (3R)-3-사이클로펜틸-3-[4-(7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)-1H-피라졸-1-일]프로판나이트릴, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염인 약학적 조성물:

(I)
상기 식에서,
R¹, R² 및 R³은 H, 할로, 및 C_1-4 알킬로부터 독립적으로 선택되고;
Z는 C_3-6 사이클로알킬이다.
삭제
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제1항에 있어서, 상기 mTOR 저해제 및 화학식 I의 화합물은 단일 제제 또는 단위 용량 형태인 약학적 조성물.
제4항에 있어서, 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함하는 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 mTOR 저해제 및 화학식 I의 화합물이 따로 투여되는 약학적 조성물.
삭제
제1항에 있어서, 상기 골수 증식성 종양은 만성 골수성 백혈병 (CML), 진성 적혈구 증가증 (PV), 본태성 혈소판 증가증 (ET), 원발성 또는 특발성 골수 섬유증 (PMF), 만성 호중구성 백혈병, 만성 호산구성 백혈병, 만성 골수 단구성 백혈병, 소아 골수 단구성 백혈병, 과호산구성 증후군, 전신성 비만 세포증, 및 비정형 만성 골수성 백혈병으로 이루어지는 군에서 선택되는 것인 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 골수 증식성 종양은 원발성 골수 섬유증, 후-진성 적혈구 증가성 골수 섬유증 또는 후-본태성 혈소판 증가성 골수 섬유증인 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 개체가 사람인 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 치료는 상기 mTOR 저해제 및 화학식 I의 화합물을 실질적으로 동시에 투여하는 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 치료는 상기 mTOR 저해제 및 화학식 I의 화합물을 다른 시간에 투여하는 약학적 조성물.
제12항에 있어서, 상기 mTOR 저해제를 상기 개체에 투여한 후, 화학식 I의 화합물을 투여하는 약학적 조성물.
제12항에 있어서, 상기 화학식 I의 화합물을 상기 개체에 투여한 후, 상기 mTOR 저해제를 투여하는 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 mTOR 저해제 및 (3R)-3-사이클로펜틸-3-[4-(7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)-1H-피라졸-1-일]프로판나이트릴, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염이 단일 제제 또는 단위 용량 형태인 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 mTOR 저해제 및 (3R)-3-사이클로펜틸-3-[4-(7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)-1H-피라졸-1-일]프로판나이트릴, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염이 별개의 제제 또는 단위 용량 형태인 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 mTOR 저해제 및 화학식 I의 화합물 중 하나 또는 둘다가 단독으로 투여되는 경우에는 효과적이지 않으나, 상기 두 물질을 조합하는 경우에는 효과적인 용량으로 mTOR 저해제 및 화학식 I의 화합물을 투여하는 약학적 조성물.
제1항에 있어서, STAT5 인산화를 저해하는 약학적 조성물.
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에베롤리무스 및 (3R)-3-사이클로펜틸-3-[4-(7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)-1H-피라졸-1-일]프로판나이트릴, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는, 골수 증식성 종양을 치료하기 위한 약학적 조성물.
2-(4-아미노-1-이소프로필-1H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-3-일)-1H-인돌-5-올 (PP242) 및 (3R)-3-사이클로펜틸-3-[4-(7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)-1H-피라졸-1-일]프로판나이트릴, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는, 골수 증식성 종양을 치료하기 위한 약학적 조성물.
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