MX2013009351A - Terapia de combinacion de inhibidor de objetivo de rapamicina en mamifero/janus cinasa (mtor/jak). - Google Patents

Abstract

Se proporciona en la presente una terapia de combinación que comprende un inhibidor de mTOR y un inhibidor de JAK. La terapia de combinación es útil para el tratamiento de una variedad de cánceres, incluyendo MPN. La terapia de combinación es también útil para el tratamiento de cualquier número de enfermedades asociadas a JAK.

Description

TERAPIA DE COMBINACION DE INHIBIDOR DE OBJETIVO DE RAPAMICINA EN MAMIFERO/JANUS CINASA (MTOR/JAK) Antecedentes de la Invención Los neoplasmas mieloproliferativos (MNP por sus siglas en inglés) son un grupo de desórdenes que provocan una sobreproducción de células sanguíneas (plaquetas, glóbulos blancos y glóbulos rojos) en la médula ósea. Los MPN incluyen policitemia vera (PV por sus siglas en inglés), trombocitemia primaria o esencial (ET por sus siglas en inglés), mielofibrosis primaria o idiopática, leucemia mielogenosa crónica (mielocítica) (CML por sus siglas en inglés), Zleucemia neutrofílica crónica (CNL por sus siglas en inglés), leucemia mielomonocítica juvenil (JML por sus siglas en inglés) y leucemia eosinofílica crónica (CEL por sus siglas en inglés ) /síndrome hipereosinofílico (HES por sus siglas en inglés). Estos desórdenes son agrupados entre si ya que comparten algunas o todas de las siguientes características: implicamiento de una célula progenitora hematopoyética multipotente, dominancia del clon transformado sobre las células progenitoras hematopoyéticas no transformadas, sobre producción de uno o más : linajes hematopoyéticos en la ausencia de un estímulo definible, formación de colonias independiente a factor de crecimiento ín vitro, hipercelularidad de médula, hiperplasia Ref.243077 megacariocita y displasia, anormalidades que implican predominantemente cromosomas 1, 8, 9, 13 y 20, diátesis trombótica y hemorrágica, hematopoyesis extramedular exuberante, y transformación espontánea para leucemia aguda o desarrollo de fibrosis de médula pero en una proporción baja, como se compara con la proporción en CML. La incidencia de MPN varia ampliamente, en el intervalo de aproximadamente 3 por 100,000 individuos más viejos A 60 años anualmente para CML a 0.13 por 100,000 niños desde el nacimiento a 14 años anualmente para JML (Vardiman J et al., Blood 100 (7):2292-302, 2002).

Por consiguiente, permanece una necesidad para nuevos tratamientos de MPN, asi como también otros cánceres .

Sumario de la Invención Se proporciona en la presente una terapia t de combinación que comprende un inhibidor de mTOR y un inhibidor de JAK. La terapia de combinación es útil para el tratamiento de una variedad de cánceres, incluyendo MPN. La terapia' de combinación es también útil para el tratamiento de cualquier número de enfermedades asociadas a JAK.

Por consiguiente, en un aspecto, se proporciona en la presente una terapia de combinación que comprende un inhibidor de mTOR y un inhibidor de JAK. En una modalidad, el inhibidor de JAK tiene la' fórmula general indicada" é"n. la fórmula I: ÍD O estereoisómeros , tautómeros, mezclas racémicas, solvatos, metabolitos, o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos. En otro aspecto, se proporciona en la presente una composición que comprende un inhibidor de mTOR y un inhibidor de JAK. En una modalidad particular, el compuesto de la fórmula I es (3R) -3-ciclopentil-3-[4- (7H-pirrol[2, 3-d]pirimidin-4-il ) -lH-pirazol-l-il]propanonitrilo (Compuesto A), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

En otra modalidad, el inhibidor de JAK es 5-cloro- N2-[ (1S) -1- (5-fluoropirimidin-2-il) etil]-N4- (5-metil-lH-pirazol-3-il ) -pirimidina-2 , 4-diamina (AZD1480), o una... sal farmacéuticamente aceptable de la misma.

En otra modalidad el inhibidor de mTOR es Everolimus (RAD001) o 2- (4-amino-l-isopropil-lH-pirazol[3, 4-d]pirimidin-3-il) -lH-indol-5-ol (PP242) .

En una modalidad particular, la terapia de combinación comprende Everolimus y el Compuesto A, o :una;; sal farmacéuticamente aceptable' del mismo. En otra módalidad ' particular, la terapia de combinación comprende PP242 y el Compuesto A, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

En una modalidad de la terapia de combinación proporcionada en la presente, el inhibidor de mTOR y el inhibidor de JAK (por ejemplo, un compuesto de la fórmula I (por ejemplo, el compuesto A o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo) ) están en una formulación sencilla o forma de dosis de unidad. La formulación sencilla o forma de dosis de unidad puede además comprender un portador farmacéuticamente aceptable. En otra modalidad, el inhibidor de mTOR y el inhibidor de JAK son administrados separadamente .

La terapia de combinación proporcionada en la presente es útil para el tratamiento de una enfermedad asociada a JAK en un sujeto. Por consiguiente, en un aspecto, se proporciona en la presente un método para tratar el cáncer en un sujeto en necesidad del mismo que comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de un inhibidor de mTOR y un inhibidor de JAK (por ejemplo, un compuesto de la fórmula I (por ejemplo, el compuesto A, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo) . En una modalidad, el cáncer es un neoplasmo mieloproliferativo . Ejemplos no limitantes de neoplasmos mieloproliferativos que pueden ser tratados usando la terapia de combinación de la invención incluyen, pero no se limitan a, leucemia mieloide crónica (CML por sus: siglas en inglés), policitemia vera (PV), trombocitemia esencial (ET) , mielofibrosis primaria o idiopática (PMF por sus siglas en inglés), leucemia neutrofilica crónica, leucemia eosinofilica crónica, leucemia mielomonocitica crónica, leucemia mielomonocitica juvenil, síndrome hipereosinofílico, mastocitosis sistémica, y leucemia mielogenosa crónica atípica. En otra modalidad, la terapia de combinación puede ser usada para el tratamiento de mielofibrosis intermedia o de alto riesgo, incluyendo mielofibrosis primaria, mielofibrosis de post policitemia vera o mielofibrosis de trombocitemia post esencial.

En una modalidad de estos métodos de tratamiento, el sujeto es humano. En otra modalidad, el tratamiento comprende co-administrar un inhibidor de mTOR y un inhibidor de JAK (por ejemplo, un compuesto de la fórmula I (por ej . El compuesto A, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo) ) . En otra modalidad, el inhibidor de mTOR y el inhibidor de JAK (por ejemplo un compuesto de la fórmula I (por ejemplo, el compuesto A, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo)) están en una formulación sencilla *o una forma de dosis de unidad. El inhibidor de mTOR y el inhibidor de JAK (por ejemplo, un compuesto de la fórmula I. (por ejemplo, el compuesto A, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo) ) puede estar en formulaciones separadas o formas de dosis de unidad. En todavía otra modalidad, el tratamiento comprende administrar el inhibidor de mTOR y el inhibidor de JAK (por ejemplo, un compuesto de la fórmula I (por ejemplo, el compuesto A, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo) ) en substancialmente el mismo tiempo, o en diferentes tiempos. En otra modalidad del método, el inhibidor de mTOR es administrado al sujeto, seguido por administración del inhibidor de JAK (por ejemplo, un compuesto de la fórmula I (por ejemplo, el compuesto A, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo) ) . En todavía otra modalidad, el inhibidor de JAK (por ej . Un compuesto de la fórmula I (por ej . El compuesto A, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo) ) se administra al sujeto, seguido por administración del inhibidor de mTOR. En otra modalidad del método, el inhibidor de mTOR y/o el inhibidor de JAK (por. ejemplo un compuesto de la fórmula I (por ejemplo el compuesto A, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo) ) se administra en cantidades que no pueden ser efectivas cuando uno o ambos del inhibidor de mTOR y el inhibidor de JAK (por ejemplo un compuesto de la fórmula I (por ejemplo el compuesto A, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo) ) es administrado solo, pero en el cual las cantidades son efectivas en combinación.

La terapia de combinación proporcionada en la presente es también útil para inhibir la fosforilacióiv STAT5. La fosforilación STAT5 puede ser inhibida en un sujeto en necesidad del mismo. En una modalidad, la inhibición de fosforilación de STAT5 en un sujeto trata un neoplasma mieloproliferativo en el sujeto. El neoplasma mieloproliferativo puede ser seleccionado del grupo que consiste de leucemia mieloide crónica (CIVIL por sus siglas en inglés), policitemia vera (PV) , trombocitemia esencial (ET) , mielofibrosis primaria o idiopática (PMF) , leucemia neutrofilica crónica, leucemia eosinofilica crónica, leucemia mielomonocitica crónica, leucemia mielomonocitica juvenil, síndrome hipereosinofílico, mastocitosis sistémica, y leucemia mielogenosa crónica atipica.

En otro aspecto, se proporciona en la presente un método para tratar un neoplasma mieloproliferativo que comprende administrar a un sujeto en necesidad del mismo Everolimus y el compuesto A, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. En otro aspecto, se proporciona en la presente un método para tratar un neoplasma mieloproliferativo que comprende administrar a un sujeto en necesidad del mismo PP242 y el compuesto A, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. En una modalidad de estos aspectos, el neoplasma mieloproliferativo es mielofibrosis primaria, mielofibrosis de post-policitemia vera o mielofibrosis de trombocitemia post-esencial. '. ' Breve Descripción de las Figuras Las Figuras 1A-1E muestran el efecto de inhibidores de mTOR seleccionados, un inhibidor de JA 1/JAK2, inhibidores de histona deacetilasa e hidroxiurea en apoptosis celular y ciclo celular en células SET2 ó HEL.

La Figura 2 muestra el efecto de inhibidores de mTOR seleccionados, un inhibidor de JAK1/JAK2, inhibidores de histona deacetilasa e hidroxiurea en señalización de mTOR y JAK/STAT en células SET2.

Descripción Detallada de la Invención Se ha descubierto que administrar una combinación de un inhibidor de mTOR y un inhibidor de JAK cinasa (por ejemplo un inhibidor de JAK cinasa de la fórmula I (por ejemplo el compuesto A, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo) ) proporciona sorpresivamente, efectos sinergisticos para tratar cáncer, por ejemplo, neoplasmos mieloproliferativos (MNP), en un sujeto. El procedimiento -combinación o co-administración de los dos tipos de agentes -puede ser útil para tratar individuos que sufren de - cáncer quienes no responden a o son resistentes a terapias actualmente disponibles. La terapia de combinación proporcionada en la presente es también útil para mejorar la eficacia y/o reducir los efectos laterales de terapias de cáncer actualmente disponibles para individuos quienes responden a las terapias.

Ciertos términos usados en la presente son descritos posteriormente. Los compuestos de la presente invención son descritos usando nomenclatura estándar. A menos que se defina de otra forma, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente tienen el mismo significado como es entendido comúnmente por un experto en la técnica a la cual pertenece esta invención.

Combinación de Inhibidor de mTOR/Inhibidor de JAK Se proporciona en la presente una combinación de agentes terapéuticos y métodos de administración para la combinación de agentes para tratar cáncer, por ejemplo, MPN. Como se usa en la presente, una "combinación de agentes" y términos similares se refiere a una combinación de dos tipos de agentes: (1) un inhibidor de mTOR y (2) un inhibidor de JAK (por ejemplo, un inhibidor de JAK cinasa de la fórmula I (por ejemplo el compuesto A, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo) ) .

El objetivo de rapamicina en mamífero, comúnmente conocido como mTOR es una proteína cinasa serina/treoñina que regula el crecimiento celular, proliferación celular, motilidad celular, sobrevivencia celular, síntesis de proteína, y transcripción. mTOR es un intermediario clave en trayectorias de señalización mitogénica múltiple y juega un papel central en modular la proliferación y angiogénesis en tejidos normales y procesos neoplásticos. La hiperactivación de señalización de mTOR ha sido implicada en tumorigénesis, y estudios en varios tipos de tumor sugiere que las propiedades antiproliferativas y antiangiogénicas de inhibidores de mTOR son útiles en terapia de cáncer. mTOR existe dentro de dos complejos, mTORCl y mTORC2. mTORCl es sensible a análogos de rapamicina (como temsirolimus o everolimus) y mTORC2 es bastante insensible a rapamicina. Varios inhibidores de mTOR han sido o están siendo evaluados en pruebas clínicas para el tratamiento de cáncer.

Como se usa en la presente, el término "inhibidor de mTOR" se refiere a un compuesto o un ligando que inhibe por lo menos una actividad de mTOR, como la actividad de proteína cinasa serina/treonina proteína en por lo menos uno de sus substratos (por ejemplo p70S6 cinasa 1, 4E-BP1, AKT/PKB y eEF2) . Una persona experta en la técnica puede determinar fácilmente si un compuesto, como rapamicina o un análogo o derivado del mismo, es un inhibidor de mTOR. Métodos para identificar los compuestos o ligandos son conocidos- en la técnica. Ejemplos de inhibidores de mTOR incluyen, sin limitación, rapamicina (sirolimus), derivados de rapamicina, CI-779, everolimus (Certican™) , ABT-578, tacrolimus (FK 506), ABT-578, AP-23675, BEZ-235, OSI-027, QLT-0447, ABI-009, BC-210, salirasib, TAFA-93, deforolimus (AP-23573), temsirolimus (Torisel™) , 2- ( 4-amino-l-isopropil-lH-pirazol[3, 4-d]pirimidin-3-il) -lH-indol-5-ol (PP242) y AP-23841.

Como se usa en la presente, el término "inhibidor de mTOR selectivo" se refiere a un compuesto o un liga"ndo que inhibe la actividad de mTOR pero no inhibe la actividad de PI3K. Los inhibidores de mTOR selectivos adecuados incluyen RAD001. Por consiguiente, en un aspecto, se proporciona en la presente una terapia de combinación que comprende un inhibidor de mTOR selectivo y un inhibidor de JAK.

La rapamicina es un antibiótico macrolido conocido producido por Streptomyces hygroscopicus . Los derivados adecuados de rapamicina incluyen por ejemplo, compuestos de la fórmula II: 2-metil-propanoilo o tetrazolilo y Xaa es =0, (?,?) o (?, OH) 0 un profármaco del mismo cuando R2aa es -CH2-CH2-OH, por ejemplo, un éter hidrolizable fisiológicamente del mismo.

Los compuestos de la fórmula II son descritos, por ejemplo, en la solicitud WO 94/09010, O 95/16691, WO 96/41807, Patente de los Estados Unidos de Norteamérica No. 5,362,718 y WO 99/15530, las cuales son incorporadas en la presente para referencia. Pueden ser preparados usando los procedimientos descritos en estas referencias.

Los derivados de rapamicina representativos de la fórmula II son, por ejemplo 32-deoxorapamicina, 12-pent-2-iniloxi-32-deoxorapamicina, 16-pent-2-iniloxi-32 (S o R) -dihidroxirapamiciná, 16-pent-2-iniloxi-32 (S o R) -dihidro-40-O- ( 2-hidroxietil ) -rapamicina, 40-[3-hidroxi-2- (hidroximetil ) -2-metilpropanoato]-rapamicina (también llamado CCI1779) o 40-epi- (tetrazolil) -rapamicina (también llamado ABT578). Los derivados de rapamicina pueden incluir también los asi llamados rapalogos, por ejemplo, como se describe en la solicitud WO 98/02441 y WO 01/14387, por ejemplo AP23573, AP23464, AP23675 ó AP23841. Ejemplos adicionales' de' un derivado de rapamicina son aquellos descritos bajo el nombre TAFA-93 (un profármaco de rapamicina) , biolimus-7 ó biolimus-9. ¦ En una modalidad preferida, el inhibidor : de mTOR usado en la terapia de combinación proporcionada en la presente es Everolimus (RAD001) ó 2- ( -amino-l-isopropil-lH-pirazol[3, 4-d]pirimidin-3-il) -lH-indol-5-ol (PP242) (ver, por ejemplo, Apsel et al., Nature Chemical Biology 4, 691-699 (2008) ) .

La familia JAK juega un papel en la regulación dependiente a citosina de proliferación y función de células implicadas en respuesta inmunologica. Actualmente, hay cuatro miembros de la familia JAK de mamífero conocidos: JAK1 (también conocido como Janus cinasa-1) , JAK2 (también conocido como Janus cinasa-2) , JAK3 (también conocido como Janus cinasa, leucocito; JAKL; L-JAK y Janus cinasa-3) y TYK2 (también conocido como proteína-tirosina cinasa 2) . Las proteínas JAK están en el intervalo de tamaño de 120 a 140 kDa y comprenden siete dominios de homología JAK conservada ( JH) ; una de estas es un dominio de cinasa catalítica funcional, y otra es un dominio de pseudocinasa que sirve potencialmente a una función regulatoria y/o que sirve como un sitio de acoplamiento para STAT (Scott, M. J. C. J. Godsahll, et al. (2002) Clin Diagn Lab Immunol 9(6) : 1153-9) .

Como se usa en la presente, un "inhibidor de JAK" se refiere a un compuesto o ligando que inhibe por lo menos una actividad de una JAK cinasa. Un "inhibidor de JAK" puede también ser un inhibidor de "JAK1/JAK2". En ciertas modalidades, el inhibidor de JAK induce un estado inhibido de JAK. Ejemplos de inhibidores de JAK incluyen compuestos de la fórmula I y AZD1480.

El compuesto de la fórmula I es definido como a continuación : (I) 0 estereoisómeros , tautómeros, mezclas racémicas, solvatos, metabolitos o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, En donde R1, R2 y R3 son seleccionados independientemente de H, halo, y alquilo de Ci_4; y * ;· Z es un cicloalquilo de C3- 6 (por ejemplo, ciclopentilo) .

Ejemplos de compuestos de la fórmula I incluyen los compuestos descritos en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica No. 7,598,257, la cual se incorpora ' en la presente para referencia en su totalidad. Los métodos para hacer compuestos de la fórmula I, incluyendo el compuesto A, pueden ser encontrados en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica No. 7,598,257 y la publicación del PCT WO/2010/083283 (PCT/US2010/021003) , ambos los cuales se incorporan en la presente para referencia en sus totalidades.

En una modalidad particular, el compuesto de la fórmula I es un 3-ciclopentil-3-[4- ( 7H-pirrol[2 , 3-d]pirimidin-4-il) -lH-pirazol-l-il]propanitrilo o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. En otra modalidad, el compuesto de la fórmula I es ( 3R) -3-ciclopentilo-3-[4- ( 7H-pirrol[2, 3-d]pirimidin-4-il) -lH-pirazol-l-il]propanitrilo (Compuesto A) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. En todavía otra modalidad, el compuesto de la fórmula I es (3S) -3-ciclopentil-3-[4- ( 7H-pirrol[2 , 3-d]pirimidin-4-il) -lH-pirazol-l-il]propanitrilo o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. La síntesis de estos compuestos son descritos en, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos NO. 7,598,257 y publicación del PCT WO/2010/083283 (PCT/US2010/021003) .

En otra modalidad, el compuesto de la fórmula I es sal de ácido ( 3R) -3-ciclopentil-3-[4- ( 7H-pirrol[2 , 3- d]pirimidin-4-il ) -lH-pirazol-l-il]propanitrilmaleico . En todavía otra modalidad, el compuesto de la fórmula I es sal de ácido (3R) -3-ciclopentil-3-[4- ( 7H-pirrol[2 , 3-d]pirimidin- 4-il) -lH-pirazol-l-il]propanitril sulfúrico. En aún . otra modalidad, el compuesto es de la fórmula I sal de ácido (3R)-3-ciclopentil-3-[4- ( 7H-pirrol[2 , 3-d]pirimidin-4 -il ) -1H- . pirazol-l-il]propanitril fosfórico ("sal de ácido fosfórico del Compuesto A") . La síntesis de estos compuestos son descritos en, por ejemplo, la solicitud de Patente de los Estados Unidos de Norteamérica NO. 12/137,892, la cual se incorpora en la presente para referencia en su totalidad.

En una modalidad, proporcionada en la presente es una terapia de combinación que comprende la sal de ácido fosfórico del compuesto A y un inhibidor de mTOR, por ejemplo, Everolimus o PP242.

Como se usa en la presente, la expresión "alquilo Cx-Cy", en donde x es 1-5 y y es 2-10 indica un grupo alquilo particular (cadena lineal o ramificada) de un intervalo particular de carbonos. Por ejemplo, la expresión alquilo de C1-C4 incluye, pero no se limita a, metilo, etilo, propilo, butilo, isopropilo, tert-butilo e isobutilo.

Como se usa en la presente, el término "cicloalquilo de C3-6" se refiere a grupos de hidrocarburo monocíclicos o biciclicos saturados o insaturados' : .d >. » 3- 6 ¦ átomos de carbono, preferentemente 5 átomos de carbono. Grupos de hidrocarburo monocíclicos de ejemplo incluyen,' pero no se limitan a, ciclopropilo, ciclobutilo y ciclopentilo .* El término "halógeno", o "halo" se refiere a grupos cloro, bromo, fluoro y yodo. : : Los agentes pueden contener uno o más elementos asimétrico.s como centros estereogénicos o. - «ejes estereogénicos, por ejemplo, átomos de carbono asimétricos, de tal forma que los compuestos pueden existir en diferentes formas estereoisoméricas diferentes. Estos compuestos pueden ser por ejemplo, mezclas racémicas o formas activas ópticamente. Para compuestos con dos o más elementos asimétricos, estos compuestos pueden adicionalmente ser mezclas de diastereómeros . Para compuestos que tienen centros asimétricos, debe ser entendido que todos los isómeros ópticos y mezclas de los mismos están comprendidos. Además, los compuestos con enlaces de doble carbono-carbono pueden ocurrir en formas Z y E; todas las formas isoméricas de los compuestos están incluidos en la presente invención. En estas situaciones, los enantiómeros sencillos (formas ópticamente activas) pueden ser obtenidos por síntesis asimétrica, síntesis de precursores ópticamente puros, o por resolución de las mezclas racémicas. Resolución de las mezclas racémicas pueden también ser realizada, por ejemplo, por "métodos convencionales como cristalización en la presencia de un agente de resolución, o cromatografía, usando, por "ejemplo una columna HPLC quiral.

A menos que se especifique de otra forma, o indique claramente por el texto, la referencia a compuestos útiles en la terapia de combinación de la invención incluye tanto ' la base libre de los compuestos, y todas las , sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos.

Como se usa en la presente, el término ' "sales farmacéuticamente aceptables" se refiere a ácido no tóxico o sales de metal alcalino térreas de los compuestos de pirimidina de la invención. Estas sales pueden ser preparadas in situ durante el aislamiento y purificación final de los compuestos de pirimidina o por reaccionar separadamente las funciones de base o ácidas con una base o ácido orgánico u orgánico adecuados, respectivamente. Las sales representativas incluyen, pero no se limitan a, los siguientes: acetato, adipato, alginato, citrato, aspartato, benzoato, bencensulfonato, bisulfato, butirato, alcanfor, alcanforsulfonato, digluconato, ciclopentanopropionato, dodecilsulfato, etansulfonato, glucoheptanoato, glicerofosfato, hemisulfato, heptanoato, hexanoato, fumarato, clorhidrato, bromohidrato , yodohidrato, 2-hidroxietansulfonato, lactato, maleato, metansulfonato, nicotinato, 2-naft-alenosulfonato, oxalato, pampato, pectinato, persulfato, 3-fenilproyonato , picrato, pivaláto, propionato, succinato, sulfato, tartrato, tiocianáto, : p-toluensulfonato y undecanoato. También, los grupos que contienen nitrógeno básico pueden ser cuaternizados "con los agentes como haluros de alquilo, como cloruro, bromuros, y yoduros de metilo, etilo, propilo, y butilo; sulfat¾sj de dialquilo como sulfatos de dimetilo, dietilo, dibutilo diamilo, haluros de cadena larga como cloruros, bromuros y yoduros de decilo, laurilo, miristilo y estearilo, ' halüros de aralquilo como bromuros de bencilo y fenetilo y otros. Los productos dispersables o solubles en agua o aceite son por lo mismo obtenidos.

Ejemplos de ácidos que pueden ser empleados para formar sales de adición de ácido farmacéuticamente aceptable incluyen ácidos inorgánicos como ácido clorhídrico, ácido hidrobórico, ácido nítrico, ácido sulfúrico y ácido fosfórico y ácidos orgánicos como ácido fórmico, ácido acético, ácido trifluroacético, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido oxálico, ácido maleico, ácido metansulfónico, ácido succínico, ácido málico, ácido metansulfónico, ácido bencensulfónico, y ácido p-toluensulfónico, ácido cítrico, y aminoácidos ácidos como ácido aspártico y ácido glutámico.

Se proporciona en la presente una terapia de combinación que comprende un inhibidor de mTOR y un inhibidor de JAK (por ejemplo, el inhibidor de JAK de la fórmula I (por ejemplo, Compuesto A, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo) . La administración de la combinación (e.s decir, una combinación de un inhibidor de mTOR y un inhibidor de JAK (por ejemplo, el inhibidor de JAK de la fórmula I (por ejemplo, el compuesto A, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo) ) incluye administración · de la combinación en una formulación sencilla o forma de dosis de unidad, la administración de los agentes individuales de la combinación actualmente pero separadamente, o administración de los agentes individuales de la combinación secuencialmente por cualquier ruta adecuada. La dosis de los agentes individuales de la combinación puede requerir administración más frecuente de uno de los agentes como se compara con los otros agentes en la combinación. Por lo tanto, para permitir dosificación apropiada, productos farmacéuticos empacados pueden contener una o más formas de dosis que contienen la combinación de agentes, y una o más formas de dosis que contienen una de la combinación de agentes, pero no el otro agente de la combinación.

El término "formulación sencilla" como se usa en la presente se refiere a un solo portador o vehículo formulado para suministrar cantidades efectivas de tanto agentes terapéuticos a un paciente. El vehículo sencillo es diseñado para suministrar una cantidad efectiva de cada uno de los agentes junto con cualesquiera portadores o excipientes farmacéuticamente aceptables. En algunas modalidades, el vehículo es una tableta, cápsula, pildora o un parche. En otras modalidades, el vehículo es una solución o una suspensión.

El término "dosis de unidad" se usa en la presente para significar administración simultánea de ambos agentes juntos, en una forma de dosis, a un paciente que es tratado. En algunas modalidades, la dosis de unidad es una formulación sencilla. En ciertas modalidades, la dosis de unidad incluye uno o más vehículos de tal forma que cada vehículo incluye una cantidad efectiva de por lo menos uno de los agentes junto con portadores y excipientes farmacéuticamente aceptables. En algunas modalidades, la dosis de unidad es una o más tabletas, cápsulas, pildoras, o parches administrados al paciente al mismo tiempo.

El término "tratar" es usado en la presente para significar recuperar, reducir, o aliviar, por lo menos un síntoma de una enfermedad en un sujeto. Dentro del significado de la presente invención, el término "tratamiento" también denota, detener, retrasar el inicio (es decir, el periodo antes a la manifestación clínica de una enfermedad o síntoma de una enfermedad) y/o reducir el riesgo de desarrollar o empeorar un síntoma de una enfermedad.

El término "sujeto" se propone para incluir animales. Ejemplos de sujetos incluyen mamíferos, por ejemplo, humanos, perros, vacas, caballos, cerdos, borregos, cabras, gatos, ratones, conejos, ratas, y animales no' humanos transgénicos . En ciertas modalidades, el sujeto es un humano, por ejemplo, un humano que sufre de, en riesgo de sufrir de, o capaz potencialmente de sufrir de- cáncer, por ejemplo neoplasmas mieloproliferativos . : El término "aproximadamente" o "cerca de" usualmente significa dentro de 20%, más preferentemente dentro de 10%, y más preferentemente todavía dentro de 5% de un valor o intervalo dado. Alternativamente, especialmente en sistemas biológicos, el término "aproximadamente" significa dentro de aproximadamente un log (es decir, un orden de magnitud) preferentemente dentro de un factor de dos de un valor dado.

El término "terapia de combinación" se refiere a la administración de dos o más agentes terapéuticos para tratar una afección o trastorno terapéutico descrito en la presente descripción. La administración comprende co-administración de estos agentes terapéuticos en una forma simultánea substancialmente , como una cápsula sencilla que tiene una proporción fija de ingredientes activos o en contenedores múltiples, o separados (por ejemplo, cápsulas) para cada ingrediente activo. Además, la administración también comprende uso de cada tipo de agente terapéutico en una forma secuencial, ya sea aproximadamente el mismo tiempo o en diferentes tiempos. En cualquier caso,- el régimen de tratamiento proporcionará efectos benéficos de la combinación de fármacos para tratar las afecciones o desórdenes descritos en la presente.

La combinación de agentes descritos en la presente exhibe un efecto sinergistico . El término " "efecto sinergistico" como se usa en la presente, se refiere a la acción de dos agentes como, por ejemplo, un inhibidor de mTOR y un inhibidor de JAK (por ejemplo, un inhibidor de JAK de 'la fórmula I) , producir un efecto, por ejemplo, alentar la progresión sintomática de cáncer o síntomas del mismo, lo cual es mayor que la simple adición de los efectos de cada fármaco administrado por ellos mismos. Un efecto sinergístico puede ser calculado, por ejemplo, usando métodos adecuados como la ecuación Sigmoid-Emax (Holford, N.H.G and Scheiner, L. B., Clin. Pharmacokinet . 6:429-453 (1981)), la ecuación de la actividad de Loewe (L.oewe, S. and Muischnek, H. , Aren. Exp. Pathol. Pharmacol. 114:313:326 (1926)) y la ecuación de efecto promedio (Chou, T.C. and Talalay, P., Adv. Enzyme Regul. 22:27-55 (1984)) . Cada ecuación referida a lo anterior puede ser aplicada a los datos experimentales para generar una gráfica correspondiente para ayudar a evaluar los efectos de la combinación de fármaco. Las gráficas correspondientes asociadas con las ecuaciones referidas a lo anterior son la curva de concentración-efecto, curva de isobolograma y curva de índice de combinación, respectivamente.

En una modalidad, se proporciona en la presente una terapia de combinación que comprende una cantidad efectiva de un inhibidor de JAK y un inhibidor de mTOR. Una cantidad efectiva" de una combinación de agentes (es decir, un inhibidor de mTOR y un inhibidor de JAK (por ejemplo, un inhibidor de JAK de la fórmula I)) es una cantidad suficiente para proporcionar una mejora observable sobre los Asigno' s clínicamente observables de la línea base y síntomas .de los trastornos tratados con la combinación.

Una "forma de dosis oral" incluye una forma de dosis de unidad prescrita o propuesta para administración oral.

Métodos de Tratamiento Usando una Combinación de Inhibidor de mTOR/Inhibidor de JAK La invención proporciona un método para tratar enfermedades asociadas a JAK, por ejemplo, cáncer, por ejemplo neoplasmas mieloproliferativos , en un individuo por administrar al individuo una combinación de un inhibidor de mTOR y un inhibidor de JAK (por ejemplo, un inhibidor de JAK de la fórmula I) .

En una modalidad, se proporciona en la presente métodos para tratar una enfermedad o trastorno asociado a JAK en un sujeto (por ejemplo, un paciente) por administrar al individuo en necesidad del tratamiento una cantidad efectiva terapéuticamente de una dosis de una combinación de ' la presente invención o una composición farmacéutica del mismo. Una enfermedad asociada a JAK puede incluir cualquier enfermedad, trastorno o afección que se enlaza di ecea o indirectamente a expresión o actividad del JAK, incluyendo niveles de sobre expresión y/o actividad anormal. ¡Una enfermedad asociada a JAK puede también incluir cualquier enfermedad, trastorno, o afección que puede ser evitada, mejorada, o curada por modular la actividad JAK.

Ejemplos de enfermedades asociados a JAK incluyen enfermedades que implican el sistema inmunológico incluyendo, por ejemplo, rechazo de trasplante de órganos (por ejemplo, rechazo de aloinjerto y enfermedad de injerto contra huésped) .

Ejemplos adicionales de enfermedades asociadas a JAK incluyen enfermedades autoinmunes como esclerosis múltiple, artritis reumatoide, artritis juvenil, diabetes tipo I, lupus, psoriasis, enfermedad inflamatoria intestinal, colitis ulcerativa, enfermedad de Crohn, miastenia gravis, nefropatias de inmunoglobulina, trastornos autoinmunológicos de la tiroides, y similares. En algunas modalidades,' el sistema inmunológico es un trastorno de la piel hullosa autoinmunológica como penfigus vulgaris (PV) o penfigoide hullosa (BP, por sus siglas en inglés) .

Ejemplos adicionales de enfermedades asociadas a JAK incluyen afecciones alérgicas como asma, aleirglias a alimentos, dermatitis atópica y rinitis. Ejemplos adicionales de enfermedades asociadas a JAK incluyen enfermedades! irales como virus Epstein Barr (EBV, por sus siglas en inglés), hepatitis B, hepatitis C, HIV, HTLVl, Virus de Váriteélla Zoster (VZV, por sus siglas en inglés) y virus de papiloma humano (HPV, por sus siglas en inglés). ¦; ' ¡I.; Ejemplos adicionales de enfermedades o afecciones asociadas a JAK incluyen trastornos de la piel como psoriasis (por ejemplo, psoriasis vulgaris) , dermatitis atópica, sarpullido de la piel, irritación de la piel, sensibilización de la piel (por ejemplo, dermatitis de contacto o dermatitis de contacto alérgica) . Por ejemplo, ciertas substancias que incluyen algunos farmacéuticos cuando se aplican tópicamente pueden provocar sensibilización en la piel. En algunas modalidades, el trastorno de la piel es tratado por administración tópica de la terapia de combinación.

En modalidades adiciónales, la enfermedad asociada a JAK es cáncer incluyendo aquella caracterizada por tumores sólidos (por ejemplo, cáncer de próstata, cáncer renal, cáncer hepático, cáncer pancreático, cáncer gástrico, cáncer de mama, cáncer pulmonar, cánceres de la cabeza y cuello, cáncer tiroidal, glioblastoma, sarcoma de Kaposi, enfermedad de Castleman, melanoma, etc.), cánceres hematológicos (por ejemplo, linfoma, leucemia como leucemia linfoblástica; aguda, o mieloma múltiple) y cáncer de la piel como linfoma de células T cutáneas (CTCL por sus siglas en inglés) y linfoma de células B cutáneas. Ejemplos de linfomas de células T cutáneas incluyen síndrome de Sezary y micosis fungoides.

Enfermedades asociadas a JAK pueden además incluir aquellas caracterizadas por expresión de un JAK2 mutante como aquellos que tienen por lo menos una mutación en el dominio pseudo-cinasa (por ejemplo, JAK2V617F) . : : Las enfermedades asociadas JAK pueden además incluir trastornos mieloproliferativos (MPD por sus siglas en inglés) como policitemia vera (PV), trombocitemia esencial (ET) , metaplasia mieloide con mielofibrosis (MMM por sus siglas en inglés), leucemia mielogenosa crónica (CML por sus siglas en inglés) , leucemia mielomonocítica crónica (CMML por sus siglas en inglés) , síndrome hipereosinofílico (HES por sus siglas en inglés), enfermedad celular de mastocitos sistémica (SMCD por sus siglas en inglés) y similares.

Enfermedades asociadas a JAK adicionales incluyen inflamación y enfermedades inflamatorias. Enfermedades inflamatorias de ejemplo incluyen enfermedades inflamatorias del ojo (por ejemplo, iritis, uveitis, escleritis, conj untitivis , o enfermedad relacionada) , enfermedades inflamatorias del tracto respiratorio (por ejemplo, el tracto respiratorio superior que incluye la nariz y sinusitis como rinitis o sinusitis o el tracto respiratorio inferior que incluye bronquitis, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, y similares), miopatia inflamatoria como miocarditis, .y otras enfermedades inflamatorias.

La terapia de combinación descrita en la presente puede además ser usada para tratar daños de reperfusión de isquemia o una enfermedad o afección relacionada a un' evento isquémico inflamatorio como infarto o arresto cardiaco. La terapia de combinación descrita en la presente puede .además ser usada para tratar anorexia, caquexia o fatiga como aquella que resulta de o asociada con cáncer. La terapia de combinación descrita en la presente puede además ser usada para tratar restenosis, esclerodermitis o fibrosis. La terapia de combinación descrita en la presente puede además ser usada para tratar afecciones asociadas con hipoxia o astrogliosis como, por ejemplo, retinopatia diabética, cáncer, o neurodegeneración . Ver, por ejemplo, Dudley, A.C. et al. Biochem. J. 2005, 390 (Pt 2):427-36 y Sriram, K, et al. J. Biol. Chem. 2004, 270 (19) : 19936-47. Epub 2004 Marzo 2.

Los neoplasmas mieloproliferativos crónicos (MPN por sus siglas en inglés) , los cuales incluyen policitemia vera (PV) , trombocitemia esencial (ET) y mielofibrosis primaria (PMF por sus siglas en inglés), son caracterizados por una mutación de punto V617F en exon 14 de Janus cinasa 2 (JAK2) que ocurre en más de 95% de PV y 60% de pacientes ET o PMF. Se detectan otras JAK2 mutaciones exon 12 en pacientes raros con PV mientras que las mutaciones en MPL han sido reportadas en 5-10% de pacientes ET o PMF (Vannucchi AM, Guglielmelli, P, Tefferi, A. Advances in understanding and management of myeloproliferative neoplasms. AC-A Cáncer Journal for Clinicians. 2009;59:171-191). Estas anormalidades moleculares son todas asociadas con activación constitutiva del JA /transductor de señal y activador de trayectoria de señalización de transcripción (STAT, por sus siglas en inglés) y contribuir a hipersensibilidad de citosina y crecimiento independiente a citosina de las células mutantes, como se ejemplifica por las colonias de eritroides independientes a eritropoyetina (EEC por sus siglas en inglés) . La trasplantación de células hematopoyéticas que sobreexpresan JAK2V617F en ratones es suficiente para recapitular un fenotipo PV, que en algunos modelos se desarrolla a mielofibrosis . Un trastorno de MPN con el fenotipo de PV o ET ha sido obtenido también en ratones desnudos condicionales. La desregulación de la trayectoria JAK/STAT se asocia con el desarrollo de cánceres sólidos y hematológicos y activa constitutivamente STAT5A o mutantes STAT5B (caSTAT5) exhiben propiedades oncogénicas in vitro e in vivo. Adicionalmente , JAK2 representa un objetivo terapéutico potencialmente valioso en pacientes MPN (Id) , como se soporta por efectos en modelos de murino de MPN y evidencia actual en pruebas clínicas.

La activación de otras trayectorias cadena . abajo a través de fosfatidilinositol 3-cinasa (PI3K) y' cínasa regulada por señal extracelular (ERK por sus siglas en inglés) ha sido documentada en células mutadas por JAK2V617F. La proteína cinasa serina/treonina B/Akt es cadena abajo de PI3K; es un regulador clave de muchos procesos celulares incluyendo sobrevivencia, proliferación y diferenciación celular y es desregulada comúnmente en células cancerígenas.

Aunque Akt resulta constitutivamente activado en células mutadas por JAK2V617F in vitro y en ratones transgénicos V617f o desnudos (Akada H, Yan D, Zou H, Fiering S, Hutchison RE, Moni MG. Expresión condicional de Jak2V617F heterocigoto u homocigoto a partir de su promotor endógeno induce una enfermedad similar a policitemia vera. Blood. 2010; 115 : 3589-3597), la contribución de señalización de PI3K/Akt a la patogénesis de MPN es todavía caracterizada deficientemente. Akt es fosforilada y activada por medio de PI3K en respuesta a acoplamiento de ligando del receptor de eritropoyetina (EPO por sus siglas en inglés) y tiene un papel en diferenciación' eritroide normal. En particular, Akt es capaz de soportar diferenciación de eritroides en células progenitoras de hígado fetal deficiente en JAK2 a través de un mecanismo cadena abajo de EpoR y por lo menos en parte relacionado a fosforilación GATA-1. Akt resulta activado en eritroblastos a partir de la médula ósea o el vaso de ratones con alelo desnudo JAK2V617F condicional, especialmente en -animales homocigotos V617F. Comparablemente la fosforilación incrementada de STAT5 y Akt es demostrada por inmunocitoquímica en la médula ósea de pacientes MPN, particularmente en megacariocitos. La activación preferencial de Akt en megacariocitos puede ser reconciliada con la inhibición fuerte de proliferación de progenitores; de megacariocitos humanos después del bloqueo de señalización de mTOR por rapamicina . Adicionalmente, los inhibidores de molécula pequeña de la trayectoria JAK/STAT o PI3K/Akt provocan inhibición comparable de diferenciación de eritroides inducidos por EP y espontáneos en células progenitoras PV cultivadas.

Por consiguiente, en una cierta modalidad, el cáncer que puede ser tratado usando la combinación proporcionada en la presente es un trastorno mieloproliferativo . Los trastornos mieloproliferativos (MPD por sus siglas en inglés), ahora comúnmente referidos como neoplasmas mieloproliferativos (MPN por sus siglas en inglés) , está en la clase de malignidades hematológicas que son trastornos clónales de progenitores hematopoyéticos . Tefferi, A. and Vardiman, J. W. , Classification and diagnosis of myeloproliferative neoplasms: The 2008 World Health Organization criteria and point-of-care diágnostic algorithms, Leukemia, September 2007, 22.14-22, es por lo tanto incorporado en la presente para referencia: Se caracterizan por proliferación incrementada y sobrevivencia de uno o más tipos celulares de linaje mieloide maduros. Esta categoría incluye pero no se limita a, leucemia mieloide crónica (CIVIL por sus siglas en inglés), policitemia vera (PV), trombocitemia esencial (ET) , mielofibrosis primaria o idiopática (PMF) , leucemia neutrofílica crónica, leucemia eosinofílica crónica, leucemia mielomonocítica crónica, leucemia mielomonocitica juvenil, síndrome hipereosinofilico, mastocitosis sistémica, y leucemia mielogenosa crónica atípica. Tefferi, A. And Gilliland, D.G., Oncogenes in myeloproliferative disorders, Cell Cycle . March 2007 , 6 ( 5 ) : 550-566 es incorporada en la presente totalmente para referencia en su totalidad para todos los propósitos.

En otra modalidad, la terapia de combinación proporcionada en la presente es útil para el tratamiento de mielofibrosis primaria, mielofibrosis de post-policitemia vera, mielofibrosis de trombocitemia post-esencial , y leucemia mielogenosa aguda secundaria.

En otra modalidad, la terapia de combinación proporcionada en la presente puede ser usada para tratar pacientes con mielofibrosis intermediaria o de alto riesgo, incluyendo mielofibrosis primaria, mielofibrosis post-policitemia vera y mielofibrosis trombocitemia post-esencial.

En algunas modalidades, el sujeto a ser .tratado (por ejemplo un humano) se determina para ser no responsivo o resistente a una o más terapias para trastornos mieloproliferativos .

En una modalidad particular, se proporciona en la presente un método para tratar un neoplasma mieloproliferativo en un sujeto en necesidad del mismo, que comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de una composición que comprende Everolimus y el compuesto Av¦ d- Una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

En una modalidad, se proporciona en la presente el uso de un inhibidor de mTOR y un inhibidor de JAK en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de cáncer, por ejemplo un trastorno mieloproliferativo, por ejemplo, mielofibrosis intermedia o de alto riesgo, incluyendo mielofibrosis primaria, mielofibrosis post-policitemia vera y mielofibrosis trombocitemia post-esencial .

En otra modalidad, se proporciona en la presente un método para tratar un neoplasma mieloproliferativo en. un sujeto en necesidad del mismo, que comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de una composición que comprende PP242 y el compuesto A, o una sal. farmacéuticamente aceptable del mismo.

Se proporciona en la presente métodos para tratar enfermedad, por ejemplo, un trastorno mieloproliferativo, por administrar una cantidad efectiva de un compuesto de un inhibidor de mTOR y un inhibidor de JAK a un individuo que sufre de una enfermedad. La cantidad de la combinación de agentes es efectiva para tratar la enfermedad. Es importante notar que los efectos sinergisticos de la combinación de agentes: a pesar de que uno o más de los agentes administrados solos en una dosis particular no puede ser efectiva, cuando se administra en combinación, en la misma dosis de cada agente, el tratamiento es efectivo. Las dosis de uno o más de los agentes en la combinación por lo tanto puede ser menor que las dosis aprobadas de FDA de cada agente .

Dosis La dosis óptima de la combinación de agentes para el tratamiento de enfermedad puede ser determinada empíricamente para cada individuo usando métodos conocidos y dependerá de una variedad de factores, incluyendo, aunque no limitado a, el grado de avance de la enfermedad: la edad, peso corporal, salud general, género y dieta del individuo: el tiempo y ruta de administración; y otros medicamentos que está tomando el individuo. Las dosis óptimas pueden ser establecidas usando prueba de rutina y procedimientos que son-bien conocidos en la técnica.

N La cantidad de combinación de agentes que pueden ser combinados con los materiales portadores para producir una forma de dosis sencilla variará dependiendo del individuo tratado y el modo particular de administración. En. -algunas modalidades las formas de dosis de unidad que contienen la combinación de agentes como se describe en la presente contendrán las cantidades de cada agente de la combinación que son administradas típicamente cuando los agentes 'son administrados solos.

La frecuencia de dosis puede variar dependiendo del compuesto usado y la afección particular a ser tratada o evitada. En general, el uso de la dosis mínima que es suficiente para proporcionar terapia efectiva es preferida. Los pacientes pueden generalmente ser monitoreados para efectividad terapéutica usando ensayos adecuados para la afección que es tratada o evitada, lo cual será familiar a aquellos de experiencia ordinaria en la técnica.

La forma de dosis puede ser preparada por varias técnicas de mezclado, molido y de fabricación convencionales fácilmente aparentes para aquellos expertos en la química de formulaciones de fármacos.

La forma de dosis oral que contiene la combinación de agentes o agentes individuales de la combinación de agentes puede estar en la forma de microtabletas encerradas dentro de una cápsula, por ejemplo, una cápsula de gelatina. Para esto, una cápsula de gelatina como es empleada en formulaciones farmacéuticas puede ser usada, como la cápsula de gelatina dura conocida como CAPSUGEL, disponible de Pfizer . : : Muchas de las formas de dosis oral útiles en la presente contienen la combinación de agentes o ' agentes individuales de la combinación de agentes en la forma de partículas. Las partículas pueden estar comprimidas; en una tableta, presentes en un elemento núcleo de una forma de dosis recubierta, como una forma de dosis enmascarada' de sabor, una forma de dosis recubierta por prensa, o u a forma de dosis recubierta entérica, o puede estar contenida en una cápsula, forma de dosis de bomba osmótica, u otra forma de dosis .

Los compuestos de fármaco de la presente invención (por ejemplo, un inhibidor de mTOR y un inhibidor de JAK) están presentes en las combinaciones, formas de dosis, composiciones farmacéuticas y formulaciones farmacéuticas descritas en la presente en una proporción en el intervalo de 100:1 a 1:100. Por ejemplo, la proporción de un compuesto de la fórmula I: un inhibidor de mTOR puede estar en el intervalo de 1:100 a 1:1, por ejemplo, 1:100, 1:90, 1:80, 1:70, 1:60, 1:50, 1:40, 1:30, 1:20, 1:10, 1:5, 1:2 ó 1:1 de la fórmula I: un inhibidor de mTOR. En otro ejemplo, la proporción de un inhibidor de mTOR: un compuesto de la fórmula I puede estar en el intervalo de 1:100 a 1:1, por ejemplo, 1:100, 1:90, 1:80, 1:70, 1:60, 1:50, 1:40, 1:30, 1:20, 1:10, 1:5, 1:2, ó 1:1 de un inhibidor de mTOR; ? un compuesto de la fórmula I.

Las proporciones óptimas, dosis individuales y combinadas, y concentraciones de los compuestos de ; fármaco que producen eficacia sin toxicidad son basados ; en las cinéticas de la disponibilidad de ingredientes activos a sitios objetivos, y son determinados usando métodos conocidos para aquellos expertos en la técnica.

Las composiciones o combinaciones farmacéuticas proporcionadas en la presente (es decir, un inhibidor de mTOR, y un inhibidor de JAK (por ejemplo, un inhibidor de JAK de la fórmula K) ) pueden ser probadas en estudios clínicos. Los estudios clínicos adecuados pueden ser, por ejemplo, etiqueta abierta, estudios de escalación de dosis en pacientes con enfermedades proliferativas . Los estudios prueban en particular el sinergismo de los ingredientes activos de la combinación de la invención. Los efectos benéficos en enfermedades proliferativas pueden ser determinados directamente a través de los resultados de estos estudios los cuales son conocidos para una persona experta en la técnica. Los estudios pueden ser, en particular, adecuados para comparar los efectos de una monoterapia usando los ingredientes activos y una combinación de la invención. En una modalidad, la dosis de un compuesto de un inhibidor de mTOR, por ejemplo Everolimus (RAD001) , o PP242, es escalado hasta que es alcanzada la dosis máxima tolerada, y: un inhibidor de JAK (por ejemplo, un inhibidor de JAK de la fórmula I) es administrada con una dosis . fija. Alternativamente, un inhibidor de JAK (por ejemplo, un inhibidor de JAK de la fórmula I), puede · ser administrada en una dosis fija y la dosis del inhibidor de mTOR puede ser escalada. Cada paciente puede recibir dosis de los compuestos ya sea diaria o intermitentemente. La eficacia del tratamiento puede ser determinada en los estudios, por ejemplo, después de 12, 18 ó 24 semanas por evaluación de clasificaciones de síntoma cada 6 semanas.

La administración de una terapia de combinación de la invención puede resultar no solamente en un efecto benéfico, por ejemplo, un efecto terapéutico sinergístico, por ejemplo con respecto a aliviar, retrasar la progresión de o inhibir los síntomas, sino también además en efectos benéficos sorprendentes, por ejemplo pocos efectos laterales, una calidad mejorada de vida o morbilidad disminuida con una monoterapia que aplica solamente uno de los ingredientes activos farmacéuticamente usados en la combinación de la invención.

Un beneficio adicional puede ser que dosis menores de los ingredientes activos de la combinación de la invención puede ser usada, por ejemplo, que las dosis no necesitan solamente con frecuencia ser más pequeñas sino también ser aplicadas menos frecuentemente, lo cual puede disminui la incidencia o severidad de efectos laterales. Esto es de acuerdo con los deseos y requerimientos de los pacientes a ser tratados.

Es un objetivo de esta invención proporcionar una composición farmacéutica que comprende una cantidad, la cual puede ser efectiva unida terapéuticamente al objetivo o evitar cáncer, por ejemplo, un trastorno mieloprolif rativo . En esta composición, un inhibidor de mTOR y un inhibidor de JAK (por ejemplo, un inhibidor de JAK de la fórmula I) puede ser administrado junto, uno después del otro o separadamente en una forma de dosis de unidad combinada o en dos formas de dosis de unidad separada. La forma de dosis de unidad puede también ser una combinación fija.

Las composiciones farmacéuticas para administración separada de ambos compuestos, o para la administración en una combinación fija, es decir, una composición galénica sencilla que comprende ambos compuestos de acuerdo a la invención puede ser preparada en una forma conocida per se y son aquellos adecuados para administración enteral, como oral o rectal y parental a mamíferos (animales de sangre caliente) , incluyendo humanos, que comprenden una cantidad efectiva terapéuticamente de por lo menos un patrón de combinación activo farmacológicamente, por ejemplo como se indica anteriormente, o en combinación con uno o más portadores o diluyentes farmacéuticamente aceptables, especialmente adecuados para aplicación enteral o parental.

Formulaciones Las combinaciones de fármaco proporcionadas en la presente pueden ser formuladas por una variedad de métodos aparentes para aquellos expertos en la técnica de formulación farmacéutica. Las varias propiedades de liberación descritas anteriormente pueden ser logradas en una variedad de . formas diferentes. Las formulaciones adecuadas incluyen, por ejemplo, tabletas, cápsulas, formulaciones de recubrimiento de prensa, y otras formulaciones administradas fácilmente.

Las formulaciones farmacéuticas adecuadas pueden contener, por ejemplo, de aproximadamente 0.1% a aproximadamente 99.9%, preferentemente de aproximadamente 1% a aproximadamente 60%, del ingrediente activo. Las formulaciones farmacéuticas para la terapia de combinación para administración enteral o parental son, por ejemplo, aquellas en formas de dosis de unidad, como tabletas recubiertas por azúcar, tabletas, cápsulas o supositorios, o ampolletas. Si no se indica de otra forma, estos son preparados en una forma conocida per se, por ejemplo por medio de mezclado, granulación, recubrimiento con azúcar, procedimientos de disolución o liofilización convencionales. Será apreciado que el contenido de unidad de un patrón de combinación contenido en una dosis individual de cada forma de dosis no necesita por si misma constituir una cantidad efectiva ya que la cantidad efectiva necesaria püéde" ser alcanzada por administración de una pluralidad de unidadés de dosis . : : " 1 En particular, una cantidad efectiva terapéuticamente de cada uno del patrón de combinación de la combinación de la invención puede ser administrada simultánea o secuencialmente y en cualquier orden, y los componentes pueden ser administrados separadamente o como una combinación fija. Por ejemplo, el método para tratar una enfermedad de acuerdo a la invención puede comprender (i) administración de un primer agente en forma de sal aceptable farmacéuticamente o libre y(ii) administración del segundo agente en forma de sal farmacéuticamente aceptable o libre, simultánea o secuencialmente en cualquier orden, en cantidades efectivas terapéuticamente unidas, preferentemente en cantidades efectivas sinergísticamente, por ejemplo en dosis diarias o intermitentes que corresponden a las cantidades descritas en la presente. Los patrones de combinación individuales de la combinación de la invención pueden ser administrados separadamente en diferentes tiempos durante el curso de la terapia o concurrentemente en formas de combinación divididas o sencillas. Adicionalmente, el término administrar también comprende el uso de un profármaco de un patrón de combinación que convierte in vivo al patrón de combinación como tal. La presente invención es por lo tanto para ser entendida cómo que comprende todos los regímenes de tratamiento simultáneo o alternativo y el término "administrar" es paira v" ser interpretado por consiguiente.

La dosis efectiva de cada uno de los patrones de combinación empleados en la combinación de la invención puede variar dependiendo del compuesto particular o composición farmacéutica empleada, el modo de administración, la afección a ser tratada, la severidad de la afección a ser tratada. De esta forma, el régimen de dosis de la combinación de la invención es seleccionada de acuerdo con una variedad de factores incluyendo la ruta de administración y la función renal y hepática del paciente. Un médico o doctor de experiencia ordinaria puede determinar fácilmente y prescribir la cantidad efectiva de los ingredientes activos sencillos requeridos para aliviar, contrarrestar o detener el progreso de la afección.

Las dosis adecuadas preferidas para los compuestos usados en el tratamiento descrito en la presente están en el orden de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 600 mg, preferente y aproximadamente 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 90, 95, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220, 240, 26Q, 280, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 420, 460, 480, 500, 520, 540, 560, 580 a aproximadamente 600 mg total. En una modalidad, el inhibidor de; .JAK es administrado en una dosis de 5 mg, 10 mg, 15 mg, 20 mg ó 25 mg . ; Por consiguiente, en una modalidad, se proporciona en la presente una composición que comprende un inhibidor de mTOR y un compuesto de la fórmula I . · En una modalidad, el compuesto de la fórmula I es ( 3R) -3-ciclopentil-3-[4~ ( 7H- pirrol[2, 3-d]pirimidin-4-il ) -lH-pirazol-l-il]propanitrilo, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. En " otra modalidad, el inhibidor de mTOR es Everolimus (RAD001) , o 2- (4-amino-l-isopropil-lH-pirazol[3, 4-d]pirimidin-3-il) -1H-indol-5-ol (PP242) . En todavía otra modalidad, la composición además comprende un portador farmacéuticamente aceptable.

Ejemplos La invención es además ilustrada por los siguientes ejemplos. Los ejemplos no pueden ser construidos como limitantes adicionalmente .

Se presenta posteriormente evidencia que fármacos que objetivan la señalización mTOR evitan proliferación celular inducida por citosina o independiente a citosina en varios modelos celulares de MPN y que tratamiento simultáneo con un inhibidor de JAK1/JAK2 o interferon-alfa resulta en actividad sinergística . Estos descubrimientos proporcionan un racional para explorar la eficacia de objetivar Akt/mTOr en el tratamiento de neoplasmas mieloproliferativas .

Métodos y Materiales Reactivos RAD001 (un inhibidor alostérico específico a' mTOR) , PP242 (un inhibidor de dominio ATP de mTOR) e hidroxiurea" son obtenidos de Sigma-Aldrich (St. Louis, Alemania). Se obtiene interferon-alfa a partir de Pegasys. Los anticuerpos contra fosfo (p) -STAT5 (Tyr694), STAT5, p-4EBPl (Thr70), 4EBP1, . m.TOr, P-JAK2 (Tyrl007/1008) y JAK2, son de Cell Signaling Technology (Danvers, Ma, US) . El anticuerpo tubulina anti humano es de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, Ca, US) .

Se compra IL-3, GM-CSF, SCF y EPO humano recombinante de Miltenyi Biotec (Gladbach, Alemania) . SiRNA contra mTOR son de Dharmacon siGENOME Smart pool (Termo Scientific, Waltham, MA, US); se usa siRNA no objetivo siGENOME No objetivo Agrupación #1 (Termo Scientific) como un control negativo.

Lineas celulares y cultivo celular Las lineas celulares humanas HEL, SET2 y K562 son compradas de la Germán Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ, Braunschweig, Alemania). Las células Baf/3 y BaF/3-EPOR de murino gue expresan JAK2 del tipo silvestre (wt por sus siglas en inglés) o JAK2V617F son donadas por R. Skoda (Basel, Suiza) . Las lineas celulares son cultivadas en RPMI 1640 complementadas con 10% de suero bovino fetal (FBS; Lonza, Bélgica) (20% para células SET2), antibióticos y L-glutamina, mIL-3 y EPO se agregan al medio de cultivo de células JAK2 WT BaF/3 y BaF/3-EP0R, respectivamente. ¡ Células Humanas Las muestras de sangre periférica (PB) o médula ósea (BM) son obtenidas de pacientes diagnosticados con PV o PMF (criterios 2008 WHO) bajo un protocolo aprobado por Institutional Review Board of Azienda Ospedaliera-Universitaria Careggi y después de obtener un consentimiento informado. Donadores saludables de células germinales hematopoyéticas proporcionan consentimiento informadó' para donar células CD34+ en exceso. Se realiza la investigación de acuerdo a los principios de Declaración de Helsinki. Las células CD34+ son seleccionadas inmunomagnéticamente como se describe. El estado mutacional JAK2V617F se determina por un ensayo de PCR de tiempo real cuantitativo en granulocitos. Inhibición de Ensayo de Proliferación, Ensayo clonogénico, y Apoptosis o análisis de ciclo celular Se colocan en placas las células (2xl04) en placas de tejido de cultivo de 96 pozos con concentraciones incrementadas de los fármacos, por triplicado; se evalúan las células viables usando el ensayo WST-1 (Roche, USA) y se normalizan los pozos que contienen un volumen equivalente de vehículo (D SO por sus siglas en inglés) solamente. La concentración en la cual 50% de inhibición de proliferación ocurre (IC50) es calculada usando el software Origen (V 7.5, OriginLab Northampston, MA) . En algunos experimentos, las pruebas clonogénicas son también empleadas. Las células (5xl03) son colocadas en placas en agar 0.5% en medio complementado con FBS, y se agrega cantidad variable del fármaco (o un volumen equivalente de vehículo en placas de control) una vez en el inicio de cultivo. Las colonias son enumeradas por microscopía invertida después de la incubación de 7 días. La cuantificación de células apoptóticas se realiza por citometría de flujo usando el kit de tinción Annexin-V-FLUOS (Roche); por lo menos 20,000 eventos" son adquiridos. Para el análisis de distribución de ciclo ' celular por citometría de flujo, se tratan IxlO6 células con etanol 95%, RNAsa 10 µg/ml y yoduro de propidio 50 rag/ml.

Ensayos de Colonias para Progenitores Hematopoyéticos Humanos y Genotipificación de Colonias Las células raononucleares B a partir de pacientes con MPN o sujetos de control son colocadas en placas en IxlO5 /mi en metilcelulosa (MethoCult; StemCell Technologies, Vancouver, Canadá) complementado con SCF 50 ng/ml, IL-3 10 ng/ml, IL-6 10 ng/ml, GM-CSF 10 ng/ml, G-CSF 10 ng/ml y EPO 3U/ml para el crecimiento de BFU-E y CFU-GM. Se realiza el ensayo EEC por colocar en placa 2.5 x 105/ml PB células mononucleares a partir de pacientes PV en metilcelulosa que contiene medio acondicionado con leucocitos sin EPO (StemCell Technol., cat . No#04531). Para el crecimiento de CFU-Mk, 5xl0 /ml células CD34+ son colocadas en placas en una placa de 24 pozos en Megacult Collagen y medio con lipidos (StemCell Technol.) complementado con Trombopoyetina 50 ng/ml, IL-3 10 ng/ml, IL-6 10 ng/ml. Se enumeran las colonias en el día 1 de acuerdo a los criterios estándar.

Para genotipificación de colonias sencillas JAK2V617F se usa un ensayo PCR específico a alelo. Las colonias separadas por pozos (por lo menos 40 colonias por punto) son arrancadas individualmente del medio semisólido en 5 µ? de agua libre de ADNasa/ARNasa , lisada en 95°C por 5 minutos, y sometida a amplificación de PCR y electrófoirésis de gel.

Lisis Celular y Western blotting SDS-PA6E Las células son resuspendidas en amortiguador de lisis RIPA (50 mM pH 7.4 Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1% NP-40, lm EDTA) que contiene un cóctel de inhibidor de proteinasa (Kit Halt Protease Inhibitor Cocktail, PIERCE, Rockford, IL, US) y sometido a separación de electroforesis de gel de poliacrilamida de sulfato de dodecilo de sodio y western blotting sobre membrana PVDF inmunoblot (BioRad,. Hercules, CA, US), de acuerdo a protocolos estándar. Las membranas son probadas con anticuerpos primarios seguido por anticuerpo anti-Ig conjugado a peroxidasa de rábano producido en conejos ( Sigma-Aldrich) ; las proteínas inmunoreactivas son reveladas con ECL usando el aparato Image Quant 350 (GE Healthcare, Little Chalfont, UK) .

Aislamiento de ARN y PCR cuantitativo de tiempo real (RTQ- PCR) Se purifica ARN total usando Trizol (Invitrogen-Life Technologies, Paisley, UK) y la pureza/integridad y concentración de ARN se determinan usando el espectrofotómetro NanoDrop ND-1000 (NanoDrop Techn. Wilmington, DE, USA) . Un microgramo de ARN es transcrito inverto usando kit de Archive de ADNc de alta capacidad (Applied Biosystems, Foster City, CA) . Se realizan las reacciones de RT-QPCR con TaqMan Universal PCR Master. Mix usando ABI PRISM 7300 HT . y ensayos de expresión de gen TaqMan® (Applied Biosystems) , por triplicado. Se logra el perfil de expresión de genes usando el método de umbral de ciclo comparativo (CT) de cuantificación relativa usando la sonda RnaseP etiquetada VIC como el gen de mantenimiento de casa (ACTT) .

Transfección Celular Las células HEL de crecimiento exponencial son electroporadas con siRNA en el nucleofactor Amaxa (Amaxa Biosystems, Gaithersburg, D, USA) usando el kit Amaxa R. Brevemente, las células 2-5 x 106 en volumen de 0.1 mi son transíectadas con 1 µ? de siRNa e inmediatamente transferidas a placas de 24 pozos que contienen el medio de cultivo precalentado . La eficiencia de transfección y viabilidad celular son evaluadas por citometria de flujo con pmaxGFP® (Amaxa Biosystems), y resulta siempre mayor a 85%.

Métodos Estadísticos Se realiza la comparación entre grupos por. .la prueba Mann-Whitney U o Fisher como sea apropiado, usando el SPSS (StatSoft, Inc., Tulsa, OK) o software de Origen, El nivel significativo de pruebas de dos lados es P<0..05. El índice de combinación (CI, por sus siglas en inglés), :que ¡es una medición de la interacción entre dos fármacQS , ' 'es calculada de acuerdo al principio del efecto medio del método Chou and Talalay usando el software CalcuSyin. De acuerdo a esta fórmula, cuando CI<1 la interacción de dos fármacos es considerada sinergistica, cuando CI=1 la interacción es aditiva, y cuando CI>1 la interacción es antagonista .

Resultados Inhibidores de mTOR abrogan la proliferación de lineas celulares mutantes JAK2V617F Para determinar si las lineas celulares de leucemia humanas mutantes JAK2V617F son sensibles a inhibición de mTOR, se emplean el inhibidor RAD001 de' mTOR alostérico selectivo y el inhibidor competitivo ATP del sitio activo de mTOR, PP242. Se descubre que las células HEL y SET2 mutantes JAK2V617F son por lo menos sensibles a inhibición de mTOR como las células K562 positivas a BCR/ABL usadas como valores IC50 de control son mostrados en la Tabla 1. Los efectos de inhibidores de mTOR en las células IL-3 dependientes a (Ba/Fe) o EPO-dependiente a (Ba/F3-EPOR) de murino dell tipo silvestre JAK2 o la contraparte JAK2V617F independiente a citosina son investigadas. Se ha encontrado que las células V617F Ba/F3 son más sensibles a RAD001 que la contraparte JAK2 wt ya sea en la ausencia o la presencia de IL-3 en, el medio de cultivo. Similarmente, en células Ba/F3-EPOR, la IC50 de células mutantes V617F es 651nM y 1,213 nM en la ausencia y presencia de EPO, respectivamente, comparado con] ' I'Cso > 10,000 nM en células JA 2 wt . PP242 es similarmente efectiva: en células V617F Ba/F3 IC50 es 800 nM y 1,600 nM, respectivamente, en la ausencia o presencia de IL-3 contra 3, 400 nM en células wt, en células Ba/F3-EPOR wt, IC50 es 5,931 nM contra 500 nM y 750 nM en células V617F complementadas o no con EPO, respectivamente (Tabla 1) . En su concentración IC50, RAD001 y PP242 (no mostrada) provoca detención de ciclo celular de células SET2 y HEL en la fase G0/G1 del ciclo celular (Figura 1A) . Por otra parte, el tratamiento con RAD001 es bastante inefectivo en inducir muerte celular, mientras que PP242 promueve una apoptosis celular, modesta aún dependiente a dosis en concentraciones más altas en células SET2 (Figura IB) o HEL (no mostrada). Además de la inhibición de proliferación celular se encuentra que RAD001 también daña el potencial clonogénico de células HEL, SET2 y UKE-1 mutante a JAK2V617 F más eficientemente que 552. También, la formación de colonia por las células .¿V617F Ba/F3 es inhibida en concentraciones RAD001 significativamente menores, independientemente de citosina en el medio, que la contraparte wt (datos no mostrados) . Por otra parte, estos datos indican que las células jtiu 'áñtes JAK2V617F son uniformemente sensibles a inhibición de mTOR y sugieren que la abrogación de proliferación celular refleja principalmente un efecto citostático más que apoptótico.

Enseguida, los mecanismos de inhibición de proliferación celular inducidos por inhibidores mTOR con aquellos del compuesto A del inhibidor de JAK1/JAK2 y el inhibidor de histona deacetilasa (HDAC por sus siglas en inglés) Panobinostat son comparados. Aquellas moléculas son todas inhibitorias de crecimiento en células HEL y SET2 en concentraciones IC50 significativamente menores a aquellas medidas en la linea celular K562 (Tabla 1) . Sin embargo, a diferencia de los inhibidores mTOR, son inductores potentes dependientes a dosis de apoptosis celular (Figuras 1C,1D). Las células HEL (IC50=410 µ?) y SET2 (IC50=330 µ?) resultan ser más sensibles a la hidroxiurea inhibidor de reductasa difosfato ribonucleósido que las células K562 (ICso=4,910 µ?) (Tabla 1); apoptosis celular dependiente a dosis inducida por hidroxiurea (Figura 1E) .

El efecto del inhibidor de JAK1/JAK2 es también evaluado en las células Ba/F3 para explotar el papel de exposición de citosina a sensibilidad de fármacos. Se encuentra que las células V617F Ba/F3 y Ba/F3-EPOR :Son más sensibles al compuesto A (IC50=34 nM y 220 nM, respectivamente) que su contraparte wt (1, 600 nM ó 457 nM para el compuesto A, respectivamente) . Sin embargo, la adición de la citosina apropiada a medio de cultivo abroga el efecto inhibitorio de crecimiento preferencial del inhibidor de JAK1/JAK2 en células mutantes V617F (IC50=1600 nM para el compuesto A, en células Ba/F3; IC50=521 nM para el compuesto a, en células Ba/F3-EPOR) (Tabla 1) .

Sobre todo, estos datos indican que la actividad inhibitoria de crecimiento de JAK1/JAK2 e inhibidores de HDAC en lineas celulares de leucemia JAK2V617F es princpalmente mediada por apoptosis celular. Adicionalmente, se confirma que las citosinas reducen marcadamente la sensibilidad celular a inhibidores de JAK1/JAK2.

Las Figuras 1A-1E muestran el efecto de inhibidores de mTOR seleccionados, un inhibidor de JAK1/JAK2, inhibidores de histona deacetilasa e hidroxiurea en apoptosis celular y ciclo celular en células SET2 o HEL. En paneles (B) a (E) , el porcentaje de células apoptóticas positivas a V anexina es medido por citometria de flujo en las células SET2 que han sido expuestas por 48 horas a cantidad variada de los inhibidores mTOR RAD001 ó PP242 (B) , compuesto A(C) del inhibidor de JA 1/JAK2, panobinostat inhibidor de HDAC (D) o hidroxiurea (E) . Los resultados son expresados -como porcentaje de células viables comparadas con pozos de control que contienen vehículo (DMSO) solamente. La fracción de células necróticas es identificada como las células de yoduro anexina V/yoduro de propidio doble positivo . :¦ Un representativo de tres experimentos similares. *, P<0.05, **, PO.01.

La tabla 4 muestra la inhibición de crecimiento clonogénico de líneas celulares mutantes JAK2V617F por inhibidores mTOR, RAD001 ó PP242 y compuesto A inhibidor de JAK1/JAK2. Las líneas celulares de origen humano mutantes JAK2V617F, ya sea heterocigotas (SET-2) u homocigotas (HEL) , y la linea celular K562 mutante BCR/ABL (usada como control), son expuestas a concentraciones incrementadas de RAD001, PP242 ó compuesto A. Las células 103 son colocadas en placas en agar en la presencia de cantidad variable del fármaco; las colonias son contadas en el día 7 y expresadas como un porcentaje de crecimiento de número de colonias en placas de control que contienen vehículo. Las células BaF/3 de murino que sobre expresan JAK2V617F son expuestas similarmente a RAD001, PP242 o compuesto A, y se comparan a células del tipo silvestre (wt) . Se agrega interleucina-3 (10- ng/ml) o no al medio de cultivo. Los valores IC5o mostrados son el promedio + SD de por lo menos tres experimentos independientes.

Inhibidores de mTOR atenúan la señalización cadena abajo de trayectoria mTOR y reducen la fosforilación STAT5 en lineas celulares imitadas JAK2V617F Se investiga el efecto de inhibición de mTO en transducción de señal en células mutantes JAK2V617F , usando células SET2 como un modelo a continuación (Figura 2) . Se observa que el tratamiento con RAD001 y PP242 reduce ,1a fosforilación dependiente a dosis del 4E-BP1 objetivo mTOR e, inesperadamente de STAT5, mientras que tanto JA 2 fosforilado y total resultan no afectados. En comparación, el compuesto A inhibidor de JAK1/JAK2 reduce marcadamente y dependiente a dosis la fosforilación de JAK2 y STAT5 que dejan 4EBP1 no afectado. El inhibidor de HDAC panobinostat reduce dependiente a dosis la fosforilación y JAK2 total, STAT5 fosforilado y muestra un efecto modesto en 4E-BP1 fosforilado. Inversamente, la hidroxiurea no afecta el nivel o el estado de fosforilación de 4EBP1 ó STAT5.

Para caracterizar mejor la correlación entre mutación JAK2V617F y activación de mTOR, asi como también las consecuencias de inhibición de mTOR en fosforilación STAT5, se usan las células BA/F3 y Ba/F3-EPOR. Primero, se observa que 4E-BP1 es fosforilado mínimamente en células JAK2 wt Ba/F3 y Ba/F3-EPOR privadas de citosinas, mientras que es hiperfosforilada en células V617F, suportando datos previos en activación constitutiva Akt en células mutadas por JAK2V617. La adición de citosinas resulta en fosforilación de 4E-BP1 incrementada en JAK2 y células Ba/F3 y Ba/F3-EPOR mutadas con V617F (datos no mostrados) . En células incubadas con RAD001, una inhibición marcada de fosforilación 4E-BP1 ocurre (datos no mostrados) y persiste hasta por lo menos 24 horas (datos no mostrados) . La fosforilación STAT5 es ' mayor en células V617F comparadas con las células IL-3 ó células Ba/F3 o Ba/F3-EPOR privadas en IL-3 o EPO e incrementa substancialmente después de exposición a citosina. La fosforilación STAT5 es regulada descendente y significativamente espejeando los efectos en 4EBP1; La inhibición es ya evidente en 60 minutos es mantenida hasta 24 horas (no mostrada) .

Para confirmar que la atenuación de fosforilación de STAT5 es actualmente mediada por inhibición de mTOR más que resultando de un efecto directo de RAD001 en fosforilación STAT5, se silencia mTOR con siRNa en células HEL específicas. Aunque el tratamiento de si RNA disminuye los niveles de mTOR por solamente 50-60% en 24 horas, el nivel de 4E-BP1 fosforilado disminuye dramáticamente comparada con células que han sido tratadas con siRNA de control irrelevante; el contenido de proteína 4E-BP1 total no cambia en nada (datos no mostrados) . En 48 horas, tanto mTOR y 4E-BP1 fosforilado son apenas detectables. Al mismo tiempo, el nivel de STAT5 fosforilado parece marcadamente reducido en 24-48 h en células que han sido nucleoafectadas con siRNA específico a mTOR comparado con el control; la concentración de STAT5 total no cambia . . . ·¾¦ « La Figura 2 muestra el efecto de inhibidores de mTOR seleccionados; un inhibidor de JAK1/JAK2, inhibidores de histona deacetilasa e hidroxiurea en mTOR y señalización de JAK/STAT en células SET2. Las células SET2 son incubadas por 24 horas con concentraciones incrementadas de los fármacos, y el nivel de JAK2, STAT5 y 4EBP1 total y fosforilado, es analizado por western blot . La tubulina es usada para normalización de carga. Los resultados mostrados ,.„ son representativos de dos a cuatro experimentos similares para los diferentes fármacos.

Combinación de RADOOl ó PP242 con el Compuesto A resulta en inhibición sinergistica de proliferación de linea celular leucémica JAK2V617F y formación de colonias Los efectos de inhibición concurrente de mTOR y JAK1/JAK2 en SET2 y células Ba/F3-EP0R V617F son evaluados por medir los efectos inhibitorios de proliferación. Las células son incubadas con diferentes concentraciones de RADOOl ó PP242 y; por usar estas combinaciones de fármacos se mide un índice de combinación (CI por sus siglas en inglés) en el intervalo de 0.12 a 0.44 sugiriendo fuerte actividad sinergistica de los dos fármacos (Tabla 3) .

Experimentos adicionales usando células SET2 y Ba/F3 epoR V617F se realizan en un ensayo de agar clonogénico (Tabla 5); una CI en el intervalo de 0.22 a 0.81 es medida en estos cultivos, otra vez indicando a sinergismos de fármaco.

Combinación de RADOOl ó PP242 con el compuesto A resulta en inhibición sinergistica de células progenitoras hematopoyéticas a partir de pacientes con MPN en ensayo de formación de colonia de EEC Para determinar si la proliferación de células leucémicas de pacientes MPN puede ser afectada por objetivación simultánea de la trayectoria mTOR y JAKf PBMC a partir de pacientes con PV son incubados con concentración incrementada de RADOOl, PP242, Compuesto A o una combinación de RADOOl ó PP242 y el compuesto A en un ensayo EEC. Las células mononucleares derivados de sangre periférica a partir de pacientes PV son cultivadas en medio de metilcelulosa libre de EPO para crecimiento de EEC, en la ausencia o la presencia de una cantidad fija de RADOOl, PP242, y/o compuesto A. EEC son clasificadas en 12 días y expresadas como porcentaje del número de colonias medidas en placas de control que contiene vehículo solamente. *<0.05, **, P<0.01. Los resultados indicados en la Tabla 6 muestran CI de 0.2 y 0.26 en estos cultivos, además demostrando sinergismo entre inhibidores de mTOR y JAK en la inhibición de crecimiento celular de JAK2V617F.

Discusión La mutación JAK2V617 F asociada a MPN determina una activación constitutiva de la trayectoria JAK2/STAT; ~ los inhibidores de JAK2 reducen la proliferación de células 1 mutantes JAK2V617F in vitro, mitigan la mieloprolif¿ración en animales transgénicos JAK2V617F (Liu PC, Caulder E; L'í 'J, et al. Combined inhibition of Janus kinase ½ para el tratamiento de neoplasmas accionados por JAK2V617F; efectos selectivos en células mutantes y mejoras en mediciones de severidad de enfermedad. Efectos selectivos en células de mutantes y mejoras en mediciones de severidad de enfermedad. Clin Cáncer Res. 2009: 15:6891-6900) y producen mejora clínica medible en pacientes con mielofibrosis (Verstovsek S, Kantarjian H, Mesa RA, et al. Safety and efficacy of INCB018424, un inhibidor de JAK1 y JAK2, en mielofibrosis . N Engl J Med. 2010;363:1117-1127) ó PV o ET resistente a hidroxiurea. Sin embargo, las variaciones en volumen de JAK2V617F son modestas y no se reporta aún remisión molecular. Adicionalmente, la población celular de inicio de enfermedad en ratones desnudos JAK2V617F no es afectado por tratamiento con el inhibidor de JAK2 TG101348. Sobre todo, estas observaciones presentan la posibilidad que la objetivación efectiva del clon MPN no puede ser lograble con inhibidores de JAK disponibles. Por lo tanto, un conocimiento más detallado de señales celulares implicadas en la proliferación desregulada de células mutantes es deseable con el fin de diseñar estrategias terapéuticas más efectivas. En este aspecto, se ha mostrado que , el cotratamiento de panobinostat HDACi y el inhibidor de JAK TG101209 determina mayor atenuación de señalización JAK/STAT en células mutadas por JAK2V617F de humano y murino e incrementa la citotoxicidad contra células MPN .' CD34+ comparadas con fármacos individuales.

Este estudio enfocado en el objetivo mamífero de rapamicina (mTOR) , un objetivo cadena abajo clave de la trayectoria PI3 /Akt. Las funciones mTOR de ;cihasa ' " ! '?' serina/treonina como un regulador central de metabolismo celular, sobrevivencia, crecimiento, proliferación y autofagia. MTOR es inhibido por una familia de moléculas, es decir rapalogos después de su descubrimiento de miembro rapamicina, que han sido empleados recientemente en pruebas clínicas en cánceres. mTOR existe en dos complejos, TORCI y T0RC2. TORCI, formado con raptor, controla el nivel de traducción de ARNm' dependiente a tapa y fosforila los efectores como el factor de inicio eucariótico proteína de enlace 1 (4E-BP1) y S6 cinasa 1 (S6K1) . A su vez, 4E-BP1 fosforilado lleva a enlace inhibido para el factor 4E de inicio eucariótico (eIF4E) y evita la activación de traducción de varios genes, incluyendo DI ciclina, Bcl-1, Bcl-XL, y factor de crecimiento endotelial vascular. Por otra parte, S6K1 regula el crecimiento celular por objetivos clave fosforilantes como eIFe4, mTOR, factor de inicio eucariótico 4B y 2-cinasa de alargamiento. Tanto eIF4E y SKI han sido implicados en transformación celular y son sobreexpresados en algunos cánceres de prognosis deficiente. Los componentes adicionales de TORCI incluyen proteína similar a LST8 mamífera/G-proteína beta-subunidad (mLST8/GbetaL) y los patrones identificados recientemente PRAS40 y DEPTOR. mTOR también combina con Rictor en mTORC2, que es bastante insensible a rapamicina, y está compuesto de GbetaL y proteína 1 de interacción de proteína -ciñ sa activada por tensión mamífera (mSINl) ; TORC 2 es implicada en la fosforilación de Akt en Ser473. Este circuito de retroalimentación negativa a partir de mTORC2 a Akt puede, en algunos casos, resultar en progresión de tumor exacerbada, aunque RAD001 es reportada para actividad Akt inhibida potencialmente en células leucémicas por medio de supresión de tanto mTORCl y mTORC2. Para solucionar posibles limitaciones y desventajas de inhibidores de mTOR alostéricos, como RAD001, moléculas novedosas que actúan como inhibidores competitivos del sitio activo ATP mTOR han sido desarrollados; uno de estos, PP242 suprime fuertemente tanto actividades mediadas por TORCI y TORC-2 y ejercen citotoxicidad potente contra células de leucemia. RAD001 y PP242 son usadas para explorar in vitro el papel putativo de mTOR como objetivo para terapia en MPN.

Se demuestra primero que los inhibidores mTOR detienen rápidamente la proliferación celular de lineas celulares de leucemia de humano y murino mutadas . por JAK2V617F en concentraciones de fármaco significativamente menores a las células de control (Tabla 1) . Inversamente, RAD001 no induce muerte celular mientras que PP242 provoca alguna apoptosis celular como altas concentraciones; de esta forma, en estas fijaciones experimentales, inhibidores mTOR son principalmente citostáticos . Este modo de acción difiere del inhibidor de JAK1/JAK2 compuesto A e inhibidor de HDAC panobinostat que todos potencialmente inducen la apoptosis celular (Figuras 1A-1E) . Por otra parte, se demuestra que la inhibición de proliferación celular provocada por inhibidores de mTOR no es afectada por activación maximizada de la trayectoria JAK/STAT que sigue a la exposición de citosina de las células Ba/FE y Ba/F3-EPOR, a diferencia del caso para el inhibidor de JAK1/JAK2. La última observación está en linea con la demostración que la sensibilización a inhibidores de JAK2 de progenitores de eritroides a partir de pacientes PV resulta suprimida por la adición de EPO al medio de cultivo, y sugiere indirectamente que los mecanismos que subyacen a la inhibición de proliferación celular por RAD001 son por lo menos en parte independientes de activación de JAK/STAT inducida por citosina. Se demuestra que RAD001 es más selectiva contra JAK2V617F mutada que progenitores del tipo silvestre en pacientes con PV ya que el número de colonias V617F disminuye ' de" un promedio de 39% a favor de unos del tipo silvestre . (Tabla 2) .

Un efecto ant iproliferativo prevaleciente más que el pro-apoptótico de RAD001 ha sido demostrado en -va ias células de cáncer diferentes, y representa la terapia racional por combinación con agentes que inducen preferentemente apoptosis. Teniendo esto en mente, los efectos de combinar inhibidor de mTOR y JAK1/JAK2 in vitro es explorado y evidencia de sinergismo significativo con relación a la inhibición de · proliferación (Tabla 3) potencial clonogénico (Tabla 5) de lineas celulares de leucemia es demostrado. Además, la formación de colonias hematopoyéticas por células progenitoras de pacientes MPN es inhibida sinergí sticamente por combinar RAD001 ó PP242 con el compuesto A del inhibidor de JAK1/JAK2 (Tabla 6) .

El análisis de moléculas de señalización clave muestra que RAD001 y PP242 inhibe la fosforilación del objetivo 4EBP1 cadena abajo, mientras que los inhibidores JA 1/JAK2 y los inhibidores HDAC reducen la fosforilación de tanto JAK2 y STAT; de notar, inhibidores de HDAC también reducen la expresión de JAK2 total (Figura 2) . Una observación intrigante es que la inhibición de mTOR debido a RAD001 y PP242 es asociada con una disminución apreciable de fosforilación de STAT5, la cual no se cuenta para contenido de proteina de STAT5 total reducida. Esta retroalimehtación positiva entre mTOR y STAT5 es substanciada por demostrar una atenuación concurrente de fosforilación 4E-BP1 y S.TAT5 con el uso de ARN inhibitorio específico (siARN) contra mTOR (Datos no mostrados) . El grado de inhibición de fosforilación STAT5 mediada por RAD001 es mucho menor a los inhibidores de JAK1/JAK2 que no afectan la fosforilación 4E-BP1, sugiriendo que la activación mTOR en células MPN pueden ser bastante independiente a JAK2. Por otra parte, un inhibidor de HDAC demuestra una inhibición modesta de fosforilación de 4EBP1, aunque datos actuales no permiten concluir si este efecto es directo o no. Como un todo, estas observaciones indican que fosforilación de STAT5 puede ser afectada por objetivar señalización iniciada por JAK2 y mTOR. En este aspecto, la activación sensible a rapamicina de STAT3 por medio de tirosina cinasa receptor/PI3 /señalización de Akt ha sido demostrada en varias células de cáncer y tumores de ratón o humano.

Tabla 1. Determinación de IC50 de inhibidores de mTOR, un inhibidor de JAK1/JAK2, inhibidores de HDAC e hidroxiurea usando ensayo de inhibición de proliferación en lineas celulares de control del tipo silvestre JAK2 y JAK2V617F mutado de humano y murino. *<0.05, **P<0.00. N.D., no hecho Tabla 2. Efectos de RAD001 en la proporción de colonias V617F y JAK2 del tipo silvestre en ensayos clonogenicos de células CD34+ a partir de pacientes MPN Genotipo de JAK2 Tabla 3. Combinación de inhibidor de mTOR e inhibidor de JAK1/JA 2 resulta en actividad sinergistica en inhibición de proliferación de linea celular SET2 y células ba/F3 EPOR JAK2V617F.

Línea celular IC50 (nM) Combinación de fármaco Indice CI dCso. nM) SET2 RAD001 Compuesto A RAD001 Cmp A 0.20 17,000 ± 160 ± 24 3, 0983 29 3000 PP242 Compuesto A PP242 Cmp A 0.43 .285 ± 11 160 ± 24 66 47 JAK2V167F RAD001 Compuesto A RAD001 Cmp A Indice CI Ba/F3-EPOR 651 ± 50 220 ± 20 363 125 0.44 PP242 Compuesto A PP242 Cmp A 500 ± 100 220 ± 20 400 121 0.98 Se calcula el valor IC50 en ensayo de inhibición de proliferación en la presencia de combinaciones de fármaco diferentes. Se reporta el valor IC50 medio de por lo menos 3 experimentos de los fármacos usados en combinación. El- Índice de combinación (CI) es calculado de acuerdo a Chou y Talaly como se describe en Materiales y Métodos. Una CK1 indica que la interacción de los dos fármacos es sinergistica. Las primeras dos columnas (en gris) reportan, para conveniencia, el valor IC50 de los fármacos individuales como se calcula a partir de los datos en la Tabla 1.

Tabla 4. Determinación de IC50 de RAD001, PP242 y INC242 usando ensayo clonogénico para lineas celulares mutadas JAK2V617F de humano y murino y controles Línea celular IC50 (nM) RAD001 PP242 Cmp A K562 10,000 ± 3,500 .3, 800 ± 200 >15, 00 HEL 85 ± 30** 172 ± 59** 374 ± 177** SET2 130 ± 30** 62 ± 19** 27 ± 9** Ba/F3 JAK2 tipo 120 ± 13 100 ± 10 380 ± 120 silvestre Ba/F3 JAK2 V167F 6 + 2** 18 ± 7** 15 ± 10** Ba/F3 epoR JAK2 22 ± 10 308 ± 100 740 ± 100 Tipo silvestre Ba/F3 epoR 4 ± 2** 47 + 12*+ 20 ± 15** JAK2 V167F El valor IC50 (es decir, la concentración de fármaco que reduce el número de colonias a 50% que mide en placáis de control con vehículo solamente) es calculada en . ensayo clonogénico de agar por enumerar las colonias en el día en la presencia de diferentes concentraciones de fármaco. En el caso de líneas celulares humanas, la línea celular de control es K562, mientras que en el caso de células de mu ino la referencia es células del tipo silvestre Ba/F3 mantenido, en la presencia de IL-3. **, P<0.01.

Tabla 5. Combinación de RAD001 ó PP242 y INC242 resulta en actividad sinergistica en inhibición de potencial clonogénico de lineas celulares mutadas JAK2V617F de humano y murino Combinación de fármacos Linea RADOOl Cmp A RADOOl Cmp A Indice CI celular SET2 44 + 15 27 + 9 7 4 0.22 PP242 Cmp A PP242 Cmp A 62 ± 19 27 ± 9 17 7.6 0.81 Ba/F3 epoR RADOOl Cmp A RADOOl Cmp A Indice CI JAK2 V617F 4 + 2 20 + 15 1.1(1.3-1) 5.9(6.8- 0.59(0.85- 5.1) 0.34) PP242 Cmp A PP242 Cmp A 47 + 12 20 + 15 6.3(10-2.5) 2.7 (4.4- 0.24 (0.38- 1.1) •0.1) El valor IC50 es calculado en ensayo clonogénico en agar por enumerar las colonias crecidas en el día 7 de cultivo establecido en la presencia de di ferentes combinaciones de fármaco. Reportado es el valor medio de por lo menos 3 experimentos de IC50 de los dos fármacos usados en combinación. El Índice de combinación (CI) es calculado como se describe en materiales y métodos. Un CK1 indica .que la interacción de los dos fármacos es sinergistica. Lás "dos primeras columnas (en gris) indican el valor IC50 calculado para los fármacos individuales y son reportados en la presente a partir de la Tabla 4 para conveniencia.

Tabla 6. Combinación de RAD001 ó PP242 y INC242 resulta en actividad sinergistica en inhibición de potencial clonogénico de células mononucleares de sangre periférica humana a partir de pacientes PV ic50 (nM) Combinación de Fármacos Células RAD001 Cmp A RAD001 Cmp A índice CI Forma PBMC 15 + 10 1.8 ± 1 1.9 0.2 0.26 Pacientes PP242 Cmp A PP242 Cmp A de PV 1 ± 0.7 1.8 ± 1 0.05 0.1 0.2 El valor IC50 es calculado en ensayo clonogénico en agar por enumerar las colonias crecidas en el día 7 de cultivo establecido en la presencia de diferentes combinaciones de fármaco. El índice de combinación (CI) es calculado como se describe en materiales y métodos. Un CI<1 indica que la interacción de los dos fármacos es sinergistica . .' .

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro . de > la presente descripción de la invención.

Claims (30)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Un método para tratar cáncer en un sujeto en necesidad del mismo, caracterizado porque comprende administrar al sujeto un inhibidor de mTOR y un compuesto de la fórmula I: (I) o estereoisómeros , tautómeros, mezclas racémicas, solvatos, metabolitos, o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, en donde R1, R2 y R3 son seleccionados independientemente de H, halo, y alquilo de Ci_4; y Z es cicloalquilo de C3-6. ;

2. El método de conformidad con la reivindicación I, caracterizado porque el compuesto de la fórmula I es (3R)- 3-ciclopentil-3-[4- (7H-pirrol[2, 3-d]pirimidin-4-il) -1H- pirazol-l-il]propanonitrilo, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el inhibidor de mTOR es Everolimus (RAD001) ó 2- (4-amino-l-isopropil-lH-pirazol[3, 4-d]pirimidin-3-il) -lH-indol-5-ol (PP242).

4. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 ó 3, caracterizado porque el inhibidor de mTOR y el compuesto de la fórmula I están en una formulación sencilla o una forma de dosis de unidad. ,

5. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque además comprende un portador farmacéuticamente aceptable.

6. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 ó 3, caracterizado porque el inhibidor de mTOR y el compuesto de la fórmula I son administrados separadamente .

7. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el cáncer es un neoplasma mieloproliferativo .

8. El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque el neoplasma mieloproliferativo se selecciona del grupo que consiste de leucemia mieloide crónico (CML) , vera policitemia (PV), trombocitemia esencial (ET) , mielofibrosis primaria o idiopática (PMF), leucemia neutrofílica crónica, leucemia eosinofilica crónica, leucemia mielomonocítica crónica, leucemia mielomonocitica juvenil, síndrome hipereosinofílico, mastocitosis sistémica, y leucemia mielogenosa crónica atípica.

9. El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque el neoplasmo mieloproliferativo es mielofibrosis primaria, mielofibrosis de post-policitemia vera, mielofibrosis de trombocitemia post-esencial.

10. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6-9, caracterizado porque el sujeto es humano .

11. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6-9, caracterizado porque el tratamiento comprende administrar el inhibidor de mTOR y el compuesto de la fórmula I en substancialmente el mismo tiempo.

12. El método de conformidad con cualquiera ' de ": las reivindicaciones 6-9, caracterizado porque el tratamiento comprende administrar el inhibidor de mTOR y el compuesto de la fórmula I en diferentes tiempos.

13. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el inhibidor de mTOR es administrado al sujeto, seguido por administración de un compuesto de la fórmula I .

14. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el compuesto de la fórmula I es administrado al sujeto, seguido por la administración del inhibidor de mTOR.

15. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6-9, caracterizado porque el inhibidor de mTOR y (3R) -3-ciclopentil-3-[4- (7H-pirrol-[2, 3-d]pirimidin-4-il ) -lH-pirazol-l-il]propanonitrilo, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, están en una formulación sencilla o forma de dosis de unidad.

16. El método de' conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6-9, caracterizado porque el inhibidor de mTOR y (3R) -3-ciclopentil-3-[4- ( 7H-pirrol[2 , 3-d]pirimidin-4-il ) -lH-pirazol-l-il]propanonitrilo, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, están en formulaciones separadas o formas de dosis de unidad.

17. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6-9, caracterizado porque el inhibidor de mTOR y/o compuesto de la fórmula I son administrados en dosis que no pueden ser efectivas cuando uno o ambos del inhibidor de mTOR y compuesto de la fórmula I son administrados solos, pero cuyas cantidades son efectivas en combinación. ..

18. Un método para inhibir la fosforilación de STAT5, caracterizado porque comprende administrar un inhibidor de mTOR y un compuesto de la fórmula I .

19. El método de conformidad con la reivindlca'iSi'ón 18, caracterizado porque la composición es administrada a un sujeto en necesidad del mismo.

20. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque la administración de la formulación trata un neoplasma mieloproliferativo en el sujeto.

21. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el neoplasma mieloproliferativo es seleccionado del grupo que consiste de leucemia mieloide crónica (CML) , policitemia vera (PV) , trombocitemia esencial (ET) , mielofibrosis primaria o idiopática (PMF), leucemia neutrofilica crónica, leucemia eosinofilica crónica, leucemia mielomonocitica crónica, leucemia mielomonocitica juvenil, síndrome hipereosinofílico, mastocitosis sistémica, y leucemia mielogenosa crónica atípica.

22. El método de conformidad la reivindicación 20, caracterizado porque el neoplasma mieloproliferativo es mielofibrosis primaria, mielofibrosis de post-policifcemia vera y mielofibrosis de trombocitemia post-esencial .

23. Un método para tratar un neoplasma mieloproliferativo caracterizado porque comprende administrar a un sujeto en necesidad del mismo Everolimus y (3R) -3-ciclopentil-3-[4- ( 7H-pirrol[2 , 3-d]pirimidin-4-il) -lH-pir-azol<-l-il]propanonitrilo, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma.

24. Un método para tratar un neoplasma mieloproliferativo caracterizado porque comprende administrar a un sujeto en necesidad del mismo PP242 y (3R)-3-ciclopentil-3-[4- (7-pirrol[2, 3-d]pirimidin-4-il ) -lH-pirazol-1- il]propanonitrilo, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo .

25. Una composición caracterizada porque comprende un inhibidor de mTOR y un compuesto de la fórmula I: incluyendo estereoisómeros, tautoméros, mezclas racémicas, solvatos, metabolitos y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, en donde R1, . R2 y R3 son independientemente seleccionados ' de H, halo, y alquilo de Ci_4, y Z es cicloalquilo de C3-6

26. La composición de conformidad con la reivindicación 25, caracterizada porque el compuesto de la fórmula I es ( 3R) -3-ciclopentil-3-[4- (7H-pirrol[2 , 3-d]pirimidin-4-il) -lH-pirazol-l-il]propanonitrilo, o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos.

27. La composición de conformidad con la reivindicación 25, caracterizada porque el inhibidor de mTOR es Everolimus (RAD001) ó 2- (4-amino-l-isopropil-lH-pirazol[3, 4-d]pirimidin-3-il) -lH-indol-5-ol (PP242) .

28. La ' composición de conformidad con la reivindicación 25, caracterizada porque además comprende un portador farmacéuticamente aceptable.

29. Un método para tratar cáncer en un sujeto en necesidad del mismo caracterizado porque comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de la composición de conformidad con la reivindicación 25.

30. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque el cáncer es un neoplasma mieloproliferativo .