BR112013020798B1 - Uso e composição contendo uma combinação de um inibidor mtor e de um inibidor de jak para tratamento de neoplasisas mieloproliferativas - Google Patents

Uso e composição contendo uma combinação de um inibidor mtor e de um inibidor de jak para tratamento de neoplasisas mieloproliferativas Download PDF

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Abstract

TERAPIA DE COMBINAÇÃO DO INIBIDOR MTOR/JAK E COMPOSIÇÃO. A presente invenção refere-se a uma terapia de combinação que compreende um inibidor de mTOR e um inibidor de JAK. A terapia de combinação é útil para o tratamento de uma variedade de cânceres, incluindo MPNs. A terapia de combinação também é útil para o tratamento de uma série de doenças associadas a JAK.

Description

Pedidos de Patente relacionados
[0001] Este pedido de patente reivindica a prioridade dos pedidos de patente provisórios US 61/444,581, depositado em 18 de fevereiro de 2011, US 61/503,789, depositado em 1 de julho de 2011, e US 61/503,785, depositado em 1° de julho de 2011, o conteúdo dos quais é incorporado aqui por referência sua totalidade. Os teores de todas as patentes, pedidos de patentes, e referências citadas ao longo deste relatório descritivo são incorporados no presente pedido por meio de referência na sua totalidade.
Antecedentes
[0002] Neoplasias mieloproliferativas (MPNs) são um grupo de do enças que provocam uma produção excessiva de células do sangue (plaquetas, glóbulos brancos e de glóbulos vermelhos do sangue) na medula óssea. MPNs incluem policitemia vera (PV), trombocitemia primária ou essencial (TE), mielofibrose primária ou idiopática, mielói- de crônica (mielóide) (LMC), leucemia neutrofílica crônica (CNL), leucemia mielomonocítica juvenil (JML) e leucemia eosinofílica crônica (CEL)/síndrome hiper eosinofílica (HES). Esses distúrbios são agrupados juntos, porque eles compartilham alguns ou todos os seguintes critérios: o envolvimento de uma célula progenitora hematopoiética multipotentes, dominância do clone transformado sobre as células progenitoras hematopoiéticas não transformadas, a superprodução de uma ou mais linhagens hematopoiéticas, na ausência de um estímulo definido, o crescimento da formação de colônias de fator independente in vitro, hipercelularidade da medula, hiperplasia megacariocítica e displasia, anormalidades predominantemente envolvendo os cromos- somos 1, 8, 9, 13, e 20, diáteses trombóticas e hemorrágicas, exuberante hematopoiese extramedular e transformação espontânea de leucemia aguda ou o desenvolvimento de mielofibrose, mas a uma taxa baixa, em comparação com a taxa na LMC. A incidência de MPNs varia muito, variando de cerca de 3 por 100.000 indivíduos com mais de 60 anos por ano para a LMC para 0,13 por 100 mil crianças desde o nascimento até 14 anos anualmente para JML (Vardiman JW et al., Sangue 100 (7): 2292 a 302, 2002).
[0003] Por conseguinte, continua a haver uma necessidade de no vos tratamentos de MPNs, bem como outros cânceres.
Sumário da invenção
[0004] É proporcionado na presente invenção uma terapia de combinação que compreende um inibidor de mTOR e um inibidor de JAK. A terapia de combinação é útil para o tratamento de uma variedade de cânceres, incluindo MPNs. A terapia de combinação também é útil para o tratamento de uma série de doenças associadas a JAK.
[0005] Por conseguinte, em um aspecto, é proporcionada na presente invenção uma terapia de combinação que compreende um inibidor de mTOR e um inibidor de JAK. Em uma modalidade, o inibidor de JAK tem a Fórmula geral apresentada na Fórmula (i):
Figure img0001
ou estereoisômeros, tautômeros, racematos, solvatos, metabolitos ou os sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos. Em um outro as pecto, é proporcionada na presente invenção uma composição que compreende um inibidor de mTOR e um inibidor de JAK. Em uma modalidade particular, o composto de Fórmula (I) é (3R)-3-ciclopentil-3-[4 - (7H-pirrol [2,3-d] pirimidin-4-il)-1H-pirazol-1-il] propanonitrila (Composto A), ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[0006] Em uma outra modalidade, o inibidor de JAK é (AZD1480) 5-Cloro-N2-[(1S)-1-(5-fluoropirimidin-2-il)etil]-N4-(5-metil-1H-pirazol-3- il)-pirimidina-2,4-diamina, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[0007] Em uma outra modalidade o inibidor de mTOR é everolimus (RAD001) ou 2-(4-amino-1-isopropil-1H-pirazol[3,4-d] pirimidin-3-il)-1H- indol-5-ol (PP242) .
[0008] Em uma modalidade particular, a terapia de combinação compreende everolimus e o composto A, ou um sal farmaceuticamente aceitável. Em uma outra modalidade particular, a terapia de combinação compreende PP242 e Composto A, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[0009] Em uma modalidade da terapia de combinação fornecida na presente invenção, o inibidor de mTOR e o inibidor de JAK (por exemplo, um composto de Fórmula (I) (por exemplo, Composto A, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo)) estão em uma única formulação ou forma de dosagem unitária. A única formulação ou forma de dosagem unitária pode ainda conter um veículo farmaceutica- mente aceitável. Em uma outra modalidade, o inibidor de mTOR e o inibidor de JAK são administrados de uma forma separada.
[00010] A terapia de combinação é proporcionada na presente invenção útil para o tratamento de uma doença associada a JAK em um indivíduo. Por conseguinte, em um aspecto, proporcionado na presente invenção um método de tratamento de câncer em um indivíduo com necessidade, que compreende a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de um inibidor de mTOR e de um inibidor de JAK (por exemplo, um composto de Fórmula (I) (por exemplo, o Composto A, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo)). Em uma modalidade, o câncer é uma neoplasia mieloproliferativa. Exemplos de neoplasias mieloproliferativas que podem ser tratadas utilizando a terapia de combinação da presente invenção incluem a não limitar, mas não estão limitados a, leucemia mielóide crônica (LMC), policitemia vera (PV), trombocitemia essencial (TE), mielofibrose primária ou idiopática (PMF), leucemia neutrofílica crônica, leucemia eosinofílica crônica, leucemia mielomonocítica crônica, leucemia mielomonocítica juvenil, síndrome hipereosinofílica, mastocitose sistêmica e leucemia mielóide crônica atípica. Em uma outra modalidade, a terapia de combinação pode ser utilizada para o tratamento de mielofibrose intermediária ou de alto risco, incluindo mielofibrose, pós-policitemia vera mielofibrose primária ou pós-mielofibrose trombocitemia essencial.
[00011] Em uma modalidade destes métodos de tratamento, o indivíduo é um ser humano. Em uma outra modalidade, o tratamento compreende a co-administração de um inibidor de mTOR e de um inibidor de JAK (por exemplo, um composto de Fórmula (I) (por exemplo, Composto A, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo)). Em uma outra modalidade, o inibidor de mTOR e o inibidor de JAK (por exemplo, um composto de Fórmula (I) (por exemplo, Composto A, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo)) estão em uma única formulação ou forma de dosagem unitária. O inibidor de mTOR e o inibidor de JAK (por exemplo, um composto de Fórmula (I) (por exemplo, Composto A, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo)) podem estar em formulações separadas ou em formas de dosagem unitárias. Ainda em uma outra modalidade, o tratamento compreende administrar o inibidor de mTOR e o inibidor de JAK (por exemplo, um composto de Fórmula (I) (por exemplo, Composto A, ou um sal farma- ceuticamente aceitável do mesmo)) substancialmente ao mesmo tempo, ou em tempos diferentes. Em uma outra modalidade do método, o inibidor de mTOR é administrado ao indivíduo, seguido da administração do inibidor de JAK (por exemplo, um composto de Fórmula (I) (por exemplo, Composto A, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo)). Ainda em uma outra modalidade, o inibidor de JAK (por exemplo, um composto de Fórmula (I) (por exemplo, Composto A, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo)) é administrado ao indivíduo, seguido da administração do inibidor de mTOR. Em uma outra modalidade do método, o inibidor de mTOR e/ou o inibidor de JAK (por exemplo, um composto de Fórmula (I) (por exemplo, Composto A, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo)) é administrada em quantidades que não seriam eficazes quando um ou tanto do inibidor de mTOR e o inibidor de JAK (por exemplo, um composto de Fórmula (I) (por exemplo, Composto A, ou um sal farmaceutica- mente aceitável do mesmo)) é administrado sozinho, mas que são eficazes quantidades em combinação.
[00012] A terapia de combinação também é proporcionada na presente invenção útil para a inibição da fosforilação de STAT5. A fosfori- lação STAT5 pode ser inibida em um indivíduo com necessidade dos mesmos. Em uma modalidade, a inibição da fosforilação STAT5 em um indivíduo trata uma neoplasia mieloproliferativa no indiv]iduo. A neoplasia mieloproliferativa pode ser selecionada a partir do grupo que consiste em leucemia mielóide crônica (LMC), policitemia vera (PV), trombocitemia essencial (TE), mielofibrose primária ou idiopática (PMF), leucemia neutrofílica crônica, leucemia eosinofílica crônica, leucemia mielomonocítica crônica leucemia mielomonocítica juvenil, síndrome hipereosinofílica, mastocitose sistêmica e leucemia mielóide crônica atípica.
[00013] Em um outro aspecto proporcionado na presente invenção um método de tratamento de uma neoplasia mieloproliferativa que compreende a administração a um indivíduo com essa necessidade everolimus e Composto A, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. Em um outro aspecto, proporcionado na presente invenção um método de tratamento de uma neoplasia mieloproliferativa que compreende a administração a um indivíduo com essa necessidade PP242 e Composto A, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. Em uma modalidade destes aspectos, a neoplasia é mielopro- liferativa mielofibrose, pós-policitemia vera mielofibrose primária ou mielofibrose pós-trombocitemia essencial.
Breve Descrição dos Desenhos
[00014] As Figuras 1A - 1E mostram o efeito de inibidores de mTOR selecionados, um inibidor JAK1/JAK2, os inibidores da histona deaceti- lase e hidroxiureia na apoptose das células e ciclo celular em células SET2 ou células HEL.
[00015] A Figura 2 mostra o efeito de inibidores selecionados, um inibidor da mTOR, inibidores JAK1/JAK2 deacetilase histonas e hidro- xiureia em mTOR e de JAK/STAT em células SET2.
Descrição Detalhada
[00016] Foi constatado que a administração de uma combinação de um inibidor de mTOR e de um inibidor de cinase JAK (por exemplo, um inibidor da cinase de JAK da Fórmula (I) (por exemplo, o Composto A, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo)) proporciona efeitos surpreendentes e sinérgicos para o tratamento do câncer, por exemplo, neoplasias mieloproliferativas (MPNs), em um indivíduo. Esta abordagem - combinação ou co-administração dos dois tipos de agentes - pode ser útil para o tratamento de indivíduos que sofrem de câncer que não respondem ou que são resistentes a terapias atualmente disponíveis no mercado. A terapia de combinação proporcionada na presente invenção também é útil para melhorar a eficácia e/ou reduzir os efeitos colaterais de terapias do câncer disponíveis atualmente para os indivíduos que não respondem a estas terapêuticas.
[00017] Certos termos usados na presente invenção são descritos a seguir. Os compostos da presente invenção são descritos utilizando a nomenclatura padrão. A menos que seja definido de uma outra forma, todos os termos técnicos e científicos tilizadosna presente invenção u têm o mesmo significado que é vulgarmente entendido por uma pessoa que seja versada na técnica à qual pertence esta presente invenção. Combinação do Inibidor mTOR/Inibidor JAK
[00018] É proporcionada na presente invenção uma combinação de agentes terapêuticos e métodos para a administração da combinação de agentes para tratar câncer, por exemplo, MPNs. Como usado na presente invenção, uma "combinação de agentes" e termos semelhantes se referem a uma combinação de dois tipos de agentes: (1) um inibidor de mTOR e (2) um inibidor de JAK (por exemplo, um inibidor da quinase de JAK da Fórmula (I) (por exemplo, O Composto A, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo)).
[00019] O alvo da rapamicina em mamíferos, vulgarmente conhecido como mTOR, é uma serina/treonina proteína quinase, que regula o crescimento celular, proliferação celular, motilidade celular, sobrevivência celular, a síntese da proteína, e a transcrição. mTOR é um intermediário chave em múltiplas vias de sinalização mitogênicas e desempenha um papel central na modulação da proliferação e da angio- gênese em tecidos normais e neoplásicos. Hiperativação sinalização do mTOR tem sido implicada em tumorigênese, e estudos em diversos tipos de tumores sugerem que as propriedades anti-proliferativas e an- ti-angiogênico de inibidores de mTOR são úteis na terapia do câncer. mTOR existe dentro de dois complexos, mTORC1 e mTORC2. mTORC1 é sensível aos análogos da rapamicina (como temsirolimus ou everolimus) e mTORC2 é em grande parte rapamicina-insensitive. Vários inibidores de mTOR têm sido ou estão a ser avaliados em ensaios clínicos para o tratamento do câncer.
[00020] Tal como usado na presente invenção, o termo "inibidor de mTOR" diz respeito a um composto ou um ligante que inibe pelo menos uma atividade de um mTOR, tais como a serina/treonina proteína quinase atividade em pelo menos um dos seus substratos (por exemplo, p70S6 cinase 1, 4E-BP1, AKT/PKB e eEF2). Um perito na arte pode prontamente determinar se um composto, tal como a rapamicina ou um seu análogo ou derivado, é um inibidor de mTOR. Os métodos de identificação de tais compostos ou ligantes são conhecidos na arte. Exemplos de inibidores de mTOR incluem, sem limitação, a rapamici- na (sirolimus), derivados de rapamicina, CI-779, everolimus (Certi- canTM), ABT-578, tacrolimus (FK 506), ABT-578, PA-23675, BEZ-235, OSI 027, QLT-0447, ABI-009, SP-210, salirasib, TAFA-93, deforolimus (AP-23573), temsirolímus (ToriselTM), 2-(4-amino-1-isopropil-1H- pirazol [3,4 -d] pirimidin-3-il)-1H-indol-5-ol (PP242) e AP-23841.
[00021] Tal como usado na presente invenção, o termo "inibidor de mTOR seletivo" se refere a um composto ou de um ligante que inibe a atividade da mTOR, mas não inibe a atividade de PI3K. Inibidores de mTOR seletivos adequados incluem RAD001. Por conseguinte, em um aspecto, é proporcionada na presente invenção uma terapia de combinação que compreende um inibidor de mTOR e de um inibidor seletivo de JAK.
[00022] A rapamicina é um conhecido antibiótico macrólido produzido por Streptomices higroscopicus. Derivados adequados de rapami- cina incluem por exemplo, os compostos de Fórmula (I)I:
Figure img0002
em que R1aa representa um grupo CH3 ou C3-6alquinila, R2aa é H ou-CH2-CH2-OH, 3-hidróxi-2-(hidroximetil)-2-metil- propanoíla ou tetrazolila, e Xaa é = O, (H, H) ou (H, OH) ou um pró-fármaco do mesmo, quando R2aa é-CH2-CH2-OH, por exemplo, um éter fisiologicamente hidrolisável do mesmo.
[00023] Os compostos de Fórmula (I)I são descritos, por exemplo, em WO 94/09010, WO 95/16691, WO 96/41807, Patente U.S. No. 5.362.718 e WO 99/15530, que são incorporados na presente invenção por referência. Eles podem ser preparados utilizando os processos descritos nestas referências.
[00024] Derivados da rapamicina representativos da Fórmula (I)I são, por exemplo, 32-deoxorapamicin, 16-pent-2-inilóxi-32- deoxorapamicin, 16-pent-2-inilóxi-32 (S ou R)-di-hidro-rapamicina, 16- pent-2 -inilóxi-32 (S ou R)-di-hidro-40-O-(2-hidroxietil)-rapamicina, 40 - [3-hidróxi-2-(hidroximetil)-2-metilpropanoato]-rapamicina (também chamado CCI779) ou 40 -epi-(tetrazolil)-rapamicina (também chamado ABT578). Derivados de rapamicina podem também incluir os assim chamados rapalogs, por exemplo, como descrito em WO 98/02441 e WO 01/14387, por exemplo, AP23573, AP23464, ou AP23675 AP23841. Outros exemplos de um derivado de rapamicina são os descritos sob o nome TAFA-93 (um pró-fármaco rapamicina), Biolimus-7 ou Biolimus-9.
[00025] Em uma modalidade preferida, o inibidor de mTOR utilizado na terapia de combinação proporcionado na presente invenção é eve- rolimus (RAD001) ou 2 - (4-amino-1-isopropil-1H-pirazol [3,4-d] pirimi- din-3-il)-1H -indol-5-ol (PP242) (vide, por exemplo, Apsel et al., Nature Chemical Biology 4, 691 a 699 (2008)).
[00026] A família JAK desempenha um papel na regulação de cito- cinas dependentes de proliferação e função das células envolvidas na resposta imune. Atualmente, existem quatro conhecidos membros da família de mamíferos JAK : JAK1 (também conhecida como Janus qui- nase-1), JAK2 (também conhecida como Janus quinase-2), JAK3 (também conhecida como Janus quinase, leucócitos; JAKL, L-JAK e Janus quinase-3) e TIK2 (também conhecida como proteína-tirosina quinase 2). A proporção de proteínas de JAK de tamanho 120-140 kDa e compreendem sete domínios de homologia conservadas JAK (HA), um deles é um domínio quinase catalítico funcional, e o outro é um domínio pseudokinase potencialmente servindo de uma função de regulação e/ou servindo como um encaixe local para STATs (Scott, MJ, CJ Godshall, et al. (2002) Clin Diagn Lab Immunol 9 (6) :. 1153 a 9).
[00027] Tal como usado na presente invenção, um "inibidor de JAK" se refere a um composto ou de um ligante que inibe pelo menos uma atividade de uma cinase de JAK. Um "inibidor de JAK" pode também ser um "inibidor JAK1/JAK2." Em certas modalidades, o inibidor de JAK induz um estado inibido JAK. Exemplos de inibidores de JAK incluem compostos de Fórmula (I) e AZD1480.
[00028] O composto de Fórmula (I) é definido como se segue:
Figure img0003
ou estereoisômeros, tautômeros, racematos, solvatos, metabolitos ou os sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos, em que R1, R2 e R3 são selecionados independentemente de H, halo, e C1-4 alquila; e Z é cicloalquila C3-6 (por exemplo, ciclopentila).
[00029] Exemplos de compostos de Fórmula (I) incluem os compostos descritos na patente de USUS 7.598.257, que é incorporada na presente invenção por referência na sua totalidade. Métodos de preparação de compostos de Fórmula (I), incluindo o Composto A, podem ser encontrados na Patente U.S. No. 7.598.257 e Publicação PCT WO/2010/083283 (PCT/US2010/021003), ambas as quais são incorporados na presente invenção por referência na sua totalidade.
[00030] Em uma modalidade particular, o composto de Fórmula (I) é 3-ciclopentil-3-[4 - (7H-pirrol [2,3-d] pirimidin-4-il)-1H-pirazol-1-il] pro- panonitrila ou de um farmaceuticamente sal aceitável. Em uma outra modalidade, o composto de Fórmula (I) é (3R)-3-ciclopentil-3-[4 - (7H- pirrol [2,3-d] pirimidin-4-il)-1H-pirazol-1-il] propanonitrila; (Composto A) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. Ainda em uma outra modalidade, o composto de Fórmula (I) é (3S)-3-ciclopentil-3-[4 - (7H-pirrol [2,3-d] pirimidin-4-il)-1H-pirazol-1-il] propanonitrila ou de um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. A síntese destes compostos estão descritos, por exemplo, Patente U.S. No. 7.598.257 e Publicação PCT WO/2010/083283 (PCT/US2010/021003).
[00031] Em uma outra modalidade, o composto de Fórmula (I) é (3R)-3-ciclopentil-3-[4 - (7H-pirrol [2,3-d] pirimidin-4-il)-1H-pirazol-1-il] propanonitrila; sal de ácido maleico. Ainda em uma outra modalidade, o composto de Fórmula (I) é (3R)-3-ciclopentil-3-[4 - (7H-pirrol [2,3-d] pirimidin-4-il)-1H-pirazol-1-il] sal de ácido sulfúrico propanenitrile. Ainda em uma outra modalidade, o composto é de Fórmula (I) é (3R)-3- ciclopentil-3-[4 - (7H-pirrol [2,3-d] pirimidin-4-il)-1H-pirazol-1-il ] propa- nonitrila sal de ácido fosfórico ("sal de ácido fosfórico do Composto A"). A síntese destes compostos está descrita, por exemplo, Pedido de Patente U.S. N ° 12/137, 892, que é incorporado na presente invenção por referência na sua totalidade.
[00032] Em uma modalidade, é proporcionada na presente inven ção uma terapia de combinação que compreende o sal de ácido fosfórico do Composto A e de um inibidor de mTOR, por exemplo, everoli- mus ou PP242.
[00033] Tal como usado na presente invenção, a expressão "Cx-Ci- alquila", em que x é 1-5 e i é de 2-10 indica um grupo alquila em particular (de cadeia linear ou ramificada) de um determinado intervalo de carbonos. Por exemplo, o termo C1-C4 inclui, mas não está limitado a, metila, etila, propila, butila, isopropila, terc-butila e isobutila.
[00034] Tal como usado na presente invenção, o termo "cicloalquila C3-6" se refere a monocíclico saturado ou insaturado ou grupos hidro- carbonados bicíclicos de 3 a 6 átomos de carbono, de preferência 5 átomos de carbono. Exemplos de grupos hidrocarbonetos monocícli- cos incluem, mas não estão limitados a, ciclopropila, ciclobutila, e ci- clopentila.
[00035] O termo "halogênio" ou "halo" se refere aos grupos cloro, bromo, flúor e iodo.
[00036] Os agentes podem conter um ou mais elementos assimétricos, tais como centros estereogênicos ou eixos estereogênicos, por exemplo, os átomos de carbono assimétricos, de modo que os compostos podem existir em diferentes formas estereoisoméricas. Estes compostos podem ser, por exemplo, racematos ou formas opticamente ativas. Para os compostos com dois ou mais elementos assimétricos, estes compostos podem, adicionalmente, ser misturas de diastereô- meros. Para os compostos possuindo centros assimétricos, deve ser entendido que todos os isômeros ópticos e suas misturas estão englo-bados. Além disso, os compostos com duplas ligações carbono- carbono podem ocorrer nas formas Z- e E-, todas as formas isoméri- cas dos compostos estão incluídas na presente invenção. Nestas situações, os enantiômeros individuais (formas opticamente ativas) podem ser obtidos por meio da síntese assimétrica, a síntese a partir de precursores opticamente puros, ou por resolução dos racematos. A resolução dos racematos pode ser conseguida, por exemplo, por meio dos métodos convencionais tais como cristalização na presença de um agente de resolução, ou por cromatografia, utilizando-se, por exemplo, uma coluna de HPLC quiral.
[00037] A menos que seja indicado de uma outra maneira, ou claramente indicado pelo texto, a referência a compostos úteis na terapia de combinação da presente invenção inclui tanto a base livre dos compostos, e todos os sais farmaceuticamente aceitáveis dos compostos.
[00038] Tal como usado na presente invenção, o termo "sais farma- ceuticamente aceitáveis" se refere ao ácido não tóxico ou de sais de metais alcalinos dos compostos de pirimidina da presente invenção. Estes sais podem ser preparados in situ durante o isolamento e purificação finais dos compostos pirimidina, ou de uma forma separada por re- acção das funções de base ou de ácido, com um ácido ou base orgânico ou inorgânico adequado, respectivamente. Os sais representativos incluem, mas não estão limitados a, os seguintes: acetato, adipato, alginato, citrato, aspartato, benzoato, benzenossulfonato, bissulfato, butirato, canforato, canforsulfonato, digluconato, ciclopentanopropiona- to, dodecilsulfato, etanossulfonato, gluco-heptanoato, glicerofosfato, hemi-sulfato, heptanoato, hexanoato, fumarato, cloridrato, bromidrato, iodidrato, 2 hidroxietanossulfonato, lactato, maleato, metanossulfonato, nicotinato, 2-naf alenesulfonate, oxalato, pamoato, pectinato, persulfa- to, 3 phenilproionate, picrato, pivalato, propionato, succinato, sulfato, tartarato, tiocianato, p toluenossulfonato e undecanoato. Também, os grupos básicos contendo azoto podem ser quaternizados com agentes tais como halogenetos de alquila, tais como metila, etila, propila, e cloreto butila, brometos, e iodetos, sulfatos de dialquila como dimetila, dietila, dibutila e diamila, de cadeia longa halogenetos, tais como decila, laurila, miristila e cloretos de estearila, brometos e iodetos, haloge- netos de aralquila como brometos de benzila e fenetila, e outros. Água ou produtos solúveis em óleo ou dispersíveis são assim obtidos.
[00039] Exemplos de ácidos que podem ser empregues para formar sais de adição de ácido farmaceuticamente aceitáveis incluem ácidos inorgânicos tais como ácido clorídrico, ácido hidroboric, ácido nítrico, ácido sulfúrico e ácido fosfórico e ácidos orgânicos tais como ácido fórmico, ácido acético, ácido trifluoroacético, ácido fumárico, ácido tar- tárico, ácido oxálico, ácido maleico, ácido metanossulfônico, ácido succínico, ácido málico, ácido metanossulfônico, ácido benzenossulfô- nico, e ácido p-toluenossulfônico, ácido cítrico, e aminoácidos tais como ácido aspártico e ácido glutâmico.
[00040] É proporcionada na presente invenção uma terapia de combinação que compreende um inibidor de mTOR e de um inibidor de JAK (por exemplo, o inibidor de JAK Fórmula (I) (por exemplo, Composto A, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo). Administração da combinação (isto é, uma combinação de um inibidor de mTOR e um inibidor de JAK (por exemplo, o inibidor de JAK da Fórmu- la (I) (por exemplo, Composto A, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo)) inclui a administração da combinação em uma única formulação ou forma de dosagem unitária, a administração dos agentes individuais da combinação concorrentemente mas em separado, ou administração dos agentes individuais da combinação sequencialmente, por qualquer via adequada. A dosagem dos agentes individuais da combinação podem exigir uma administração mais frequente de um dos agente (s) quando comparado com o (s) outro (s) agente (s) em uma combinação. Portanto, para permitir que a dosagem adequada, os produtos farmacêuticos embalados pode conter uma ou mais formas de dosagem que contêm a combinação de agentes, e uma ou mais formas de dosagem que contêm uma combinação de agentes, mas não o (s) outro (s) agente (s) da combinação.
[00041] O termo "formulação única" tal como é usado na presente invenção se refere a um único veículo ou veículo formulado para distribuir quantidades eficazes de ambos os agentes terapêuticos a um paciente. O único veículo é concebido para fornecer uma quantidade eficaz de cada um dos agentes, juntamente com quaisquer veículos ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis. Em algumas modalidades, o veículo é um comprimido, cápsula, pílula, ou um remendo. Em outras modalidades, o veículo é uma solução ou uma suspensão.
[00042] O termo "dose unitária" é usado na presente invenção para significar a administração simultânea de ambos os agentes em conjunto, em uma forma de dosagem, para o doente a ser tratado. Em algumas modalidades, a dose unitária é uma única formulação. Em certas modalidades, a unidade de dosagem inclui um ou mais veículos tais que cada veículo inclui uma quantidade eficaz de pelo menos um dos agentes, juntamente com veículos e excipientes farmaceuticamente aceitáveis. Em algumas modalidades, a unidade de dosagem é de um ou mais comprimidos, cápsulas, pílulas, emplastros ou administrados ao paciente ao mesmo tempo.
[00043] O termo "tratar" é usado na presente invenção para significar a aliviar, reduzir ou atenuar, pelo menos, um sintoma de uma doença em um indivíduo. Dentro do significado da presente invenção, o termo "tratar" indica também, para deter, retardar o início da doença (isto é, o período antes da manifestação clínica da doença ou sintoma de uma doença) e/ou reduzir o risco de desenvolvimento ou agravamento um sintoma de uma doença.
[00044] O termo "indivíduo" destina-se a incluir os animais. Exemplos de indivíduos incluem os mamíferos, por exemplo, seres humanos, cães, vacas, cavalos, porcos, ovelhas, cabras, gatos, ratos, coelhos, camundongos e animais transgênicos não humanos. Em certas modalidades, o indivíduo é um humano, por exemplo, um humano que sofra de, em risco de sofrer de, ou potencialmente capaz de sofrer de câncer, por exemplo, neoplasias mieloproliferativas.
[00045] O termo "cerca de" ou "aproximadamente" geralmente significa dentro de 20 %, mais preferencialmente dentro de 10 %, e ainda mais preferencialmente dentro de 5 % de um dado valor ou intervalo. Em alternativa, especialmente nos sistemas biológicos, o termo "cerca de" significa dentro de cerca de um log (isto é, uma ordem de magnitude), de preferência dentro de um fator de dois de um determinado valor.
[00046] O termo "terapia de combinação" significa a administração de dois ou mais agentes terapêuticos para tratar um distúrbio ou condição terapêutica descritos na presente divulgação. Tal administração engloba a coadministração destes agentes terapêuticos de uma maneira substancialmente simultânea, tal como em uma única cápsula tendo uma proporção fixa de ingredientes ativos ou em múltiplas, ou em recipientes separados (por exemplo, comprimidos) para cada ingrediente ativo. Além disso, essa administração também abrange a utilização de cada tipo de agente terapêutico de uma maneira sequencial, ou aproximadamente ao mesmo tempo ou em momentos diferentes. Em qualquer dos casos, o regime de tratamento irá proporcionar efeitos benéficos da combinação do fármaco no tratamento das afec- ções ou distúrbios descritos na presente invenção.
[00047] A combinação de agentes descritos na presente invenção exibem um efeito sinergético. O termo "efeito sinérgico", tal como usado na presente invenção, se refere à acção de dois agentes, tais como, por exemplo, um inibidor de mTOR e de um inibidor de JAK (por exemplo, um inibidor de JAK da Fórmula (I)), produzindo um efeito, por exemplo, retardando a progressão sintomática do câncer ou seus sintomas, que é maior do que a simples soma dos efeitos de cada fárma- co administrado sozinho. Um efeito sinérgico pode ser calculado, por exemplo, usando métodos adequados, tais como a equação sigmóide- Emax (Holford, NHG e Scheiner, LB, Clin Pharmacokinet 6 : 429 a 453 (1981)), a equação de aditividade de Loewe (Loewe, S. e Muischnek, H., Arch Exp Pathol Pharmacoi 114 : 313-326 (1926)) e a equação de efeitos medianos (Chou, TC e Talalai, P., Adv Regul Enzime 22 : 27 - 55 (1984)). Cada equação acima referida pode ser aplicada aos dados experimentais para gerar um gráfico correspondente para auxiliar na avaliação dos efeitos da combinação de fármacos. Os gráficos correspondentes associados com as equações acima referidas são a curva de concentração-efeito, e curva isobolograma da curva de índice de combinação, respectivamente.
[00048] Em uma modalidade, é proporcionada na presente invenção uma terapia de combinação que compreende uma quantidade eficaz de um inibidor de JAK e de um inibidor de mTOR. Uma "quantidade eficaz" de uma combinação de agentes (isto é, um inibidor de mTOR e de um inibidor de JAK (por exemplo, um inibidor de JAK da Fórmula (I))), é uma quantidade suficiente para proporcionar uma melhoria observável sobre a linhagem de base sinais e sintomas observáveis clinicamente do distúrbios tratados com a combinação.
[00049] Uma "forma de dosagem oral" inclui uma forma de unidade de dosagem prescrita ou destinada a administração oral. Métodos de tratamento com uma Combinação do inibidor de mTOR/Inibidor de JAK
[00050] A presente invenção proporciona um método de tratamento de doenças associadas a JAK, por exemplo, câncer, por exemplo, neoplasias mieloproliferativas, em um indivíduo, por meio da administração ao indivíduo de uma combinação de um inibidor de mTOR e de um inibidor de JAK (por exemplo, um inibidor de JAK da Fórmula (I)).
[00051] Em uma modalidade, são proporcionados na presente invenção métodos de tratamento de uma doença associada a JAK ou distúrbio em um indivíduo (por exemplo, doente) por meio da administração a um indivíduo em necessidade de tal tratamento de uma quantidade terapeuticamente eficaz ou dose de uma combinação da presente invenção ou um seu sua composição farmacêutica. A doença JAK-associado pode incluir qualquer doença, distúrbio ou condição que está direta ou indiretamente ligada à liberdade de expressão ou atividade da JAK, incluindo a sobre-expressão e/ou níveis de atividade anormais. Uma doença JAK-associado também pode incluir qualquer doença, distúrbio ou condição que pode ser prevenida, melhorada ou curada por modulação da atividade de JAK.
[00052] Exemplos de doenças associadas a JAK incluem as doenças que envolvem o sistema imune incluindo, por exemplo, rejeição de órgãos transplantados (por exemplo, rejeição de aloenxertos e doença de enxerto versus hospedeiro).
[00053] Outros exemplos de doenças associadas a JAK incluem doenças autoimunes, tais como esclerose múltipla, artrite reumatóide, artrite juvenil, diabetes tipo I, lúpus, psoríase, doença inflamatória do intestino, colite ulcerativa, doença de Crohn, miastenia grave, nefropa- tia da imunoglobulina, distúrbios da tiróide auto-imunes, e semelhantes. Em algumas modalidades, a doença auto-imune é uma doença auto- imune da pele bolhosas, tais como pênfigo vulgar (PV) ou penfigóide bolhoso (BP).
[00054] Outros exemplos de doenças associadas a JAK incluem condições alérgicas, tais como asma, alergias alimentares, rinite e dermatite atópica. Outros exemplos de doenças associadas a JAK incluem doenças virais, tais como vírus de Epstein Barr (EBV), Hepatite B, Hepatite C, HIV, HTLV 1, vírus varicela-zoster (VZV) e vírus de pa- pilama humano (HPV).
[00055] Outros exemplos de doenças ou condições associadas a JAK incluem doenças da pele tais como a psoríase (por exemplo, a psoríase vulgar), dermatite atópica, erupções cutâneas, irritação da pele, sensibilização da pele (por exemplo, dermatite de contacto ou dermatite de contacto alérgica). Por exemplo, certas substâncias, incluindo alguns fármacos quando aplicados topicamente podem causar sensibilização da pele. Em algumas modalidades, o distúrbio da pele é tratada com a administração tópica de a terapia de combinação.
[00056] Em outras variantes, a doença associada a JAK é o câncer, incluindo aqueles caracterizados por tumores sólidos (por exemplo, câncer de próstata, câncer renal, câncer hepático, câncer pancreático, câncer gástrico, câncer de mama, câncer de pulmão, câncer de cabeça e pescoço, câncer de tireóide, o glioblastoma, o sarcoma de Kaposi, doença de Castleman, melanoma, etc), os cânceres hematológicos (por exemplo, linfomas, leucemias, como a leucemia linfocítica aguda, ou mieloma múltiplo), e câncer da pele, tais como linfoma cutâneo de células T (LCCT) e cutânea B- linfoma de células. Exemplo linfomas cutâneos de células T incluem a síndrome Sezari e micose fungóide.
[00057] Doenças associadas a JAK podem incluir ainda aquelas caracterizadas por meio da expressão de uma JAK2 mutante tal como aqueles que têm pelo menos uma mutação no domínio de pseudo- quinase (por exemplo, JAK2V617F).
[00058] As doenças associadas JAK podem ainda incluir distúrbios mieloproliferativas (MPDs) como policitemia vera (PV), trombocitemia essencial (TE), metaplasia mielóide com mielofibrose (MMM), leucemia mielóide crônica (LMC), leucemia mielomonocítica crônica (CMML), síndrome hipereosinofílica (HES), doença sistêmica de mas- tócitos (SMCD), e semelhantes.
[00059] As doenças associadas a JAK incluem inflamação e doenças inflamatórias. Exemplos de doenças inflamatórias incluem doenças inflamatórias do olho (por exemplo, irite, uveite, esclerite, conjunti- vite, ou doença relacionada), doenças inflamatórias das vias respiratórias (por exemplo, do tracto respiratório superior, incluindo o nariz e os seios, tais como a rinite ou sinusite ou o tracto respiratório inferior, que inclui bronquite, doença pulmonar obstrutiva crônica, e afins), miopati- as inflamatórias, tais como miocardite, e outras doenças inflamatórias.
[00060] A terapia de combinação descrita na presente invenção pode ainda ser utilizado para tratar lesões de reperfusão de isquemia ou uma doença ou condição relacionada com um evento isquêmico inflamatórias, tais como acidente vascular cerebral ou paragem cardíaca. A terapia de combinação descrita na presente invenção pode ainda ser usado para tratar a anorexia, caquexia, ou fadiga, tais como a resultante de ou associada a câncer. A terapia de combinação descrita na presente invenção pode ainda ser usada para tratar a restenose, scle- rodermitis ou fibrose. A terapia de combinação descrita na presente invenção pode ainda ser utilizada para tratar condições associadas a hipoxia ou astrogliose, tal como, por exemplo, retinopatia diabética, câncer, ou neurodegeneração. Vide, por exemplo, Duda, R. C. et al.. Bioquímica. J. 2005, 390 (Pt 2) : 427-36 e Sriram, K. et al.. J. Biol. Chem. 2004, 279 (19) : 19936-47. Epub 2004 02 de março.
[00061] As neoplasias mieloproliferativas crônicas (NMP), que incluem policitemia vera (PV), trombocitemia essencial (TE) e mielofi- brose primária (PMF), são caracterizadas por um ponto de mutação no exão 14 V617F de Janus quinase 2 (JAK2), ocorrendo em mais de 95 % do PV e 60 % dos pacientes com TE ou PMF. Outros JAK2 exon 12 mutações são detectadas em raros pacientes com PV, enquanto mutações MPL foram relatadas em 5-10 % dos pacientes com TE ou PMF (Vannucchi AM, Guglielmelli, P, Tefferi, A. Avanços na compreensão e gestão de neoplasias mieloproliferativas. AC-A Cancer Journal for Clinicians 2009; 59:171-191). Estas anormalidades moleculares estão associadas com a ativação constitutiva do transdutor de JAK/sinal e ativador de transcrição (STAT) via de sinalização e contribuir para a hipersensibi- lidade de citocinas e crescimento independente de citocina das células mutantes, tal como exemplificado pelas colônias eritróides eritropoietina independente (CEE). O transplante de células que sobre-expressam- JAK2V617F hematopoiéticas em camundongos é suficiente para recapitular um fenótipo de PV, que em alguns modelos evoluiu para mielo- fibrose. Um distúrbio NMP com o fenótipo de PV ou TE foi obtido também em camundongo nocauteado condicional. A desregulação da via de JAK/STAT está associada ao desenvolvimento de tumores sólidos e hematológicos e constitutivamente ativada STAT5A ou mutantes STAT5B (caSTAT5) exibir propriedades oncogênicas in vitro e in vivo. No agregado, JAK2 representa um alvo terapêutico potencialmente valioso em pacientes com NMP (Id.), conforme suportado pelos efeitos em modelos murinos de NMP e evidência atual em ensaios clínicos.
[00062] Ativação de outras vias a jusante através da fosfatidilinosi- tol-3-quinase (PI3K) e extracelulares da cinase regulada por sinal (ERK) tem sido documentada em células mutantes JAK2V617F. A se- rina/treonina proteína quinase B/Akt a jusante de PI3K, que é um regu- lador chave de muitos processos celulares, incluindo a sobrevivência celular, a proliferação e diferenciação, e é vulgarmente desreguladas em células de câncer. Embora Akt constitutivamente ativada resultou em células mutantes JAK2V617F in vitro e in V617F transgênicos ou camundongos nocauteados (Akada H, Ian D, Zou H, Fiering S, Hutchison RE, Mohi MG. Expressão condicional de JAK2V617F heterozigóti- ca ou homozigótica a partir do seu promotor endógeno induz uma poli- citemia vera-like sangue doença 2010; 115 : 3589-3597), a contribuição de sinalização PI3K/Akt para a patogênese da MPN é ainda pouco caracterizada. Akt é fosforilada e ativada através da PI3K em resposta ao acoplamento do ligando a eritropoietina (EPO) e do receptor tem um papel na diferenciação eritróide normal. Em particular, a Akt é capaz de suportar a diferenciação de células progenitoras eritróides em fígado fetal de JAK2 com deficiência de jusante através de um meca-nismo de EpoR e, pelo menos em parte relacionada com a fosforilação do GATA-1. Akt ativada resultou em eritroblastos da medula óssea ou do baço de camundongos com knock-JAK2V617F condicional no alelo, especialmente em animais homozigóticos V617F. Comparativamente aumentou a fosforilação de Akt e STAT5 foi demonstrada por imunoci- toquímica na medula óssea de pacientes de NMP, particularmente em megacariócitos. A ativação preferencial de Akt em megakariocitos pode ser conciliada com a forte inibição da proliferação de progenitores megacariocíticas humanos após o bloqueio da sinalização mTOR por rapamicina. Além disso, pequenas moléculas inibidoras da JAK/STAT ou via PI3K/Akt causaram inibição comparável de diferenciação eritrói- de espontânea e induzida por EPO nas células progenitoras cultivadas PV.
[00063] Por conseguinte, em uma determinada modalidade, o câncer que pode ser tratados com a combinação é proporcionado na presente invenção a um distúrbio mieloproliferativo. Distúrbios mieloprolife- rativos (MPDs), agora comumente referido como neoplasias meiloproli- ferativas (MPNs), estão na classe de doenças malignas hematológicas que são doenças clonais de progenitores hematopoiéticos. Tefferi, A. e Vardiman, JW, classificação e diagnóstico de neoplasias mieloprolife- rativas : The World 2008 critérios de Saúde Organização e algoritmos de diagnóstico point-of-care, leucemia, setembro de 2007, 22: 14-22, fica incorporada por referência. Elas são caracterizadas por uma maior proliferação e sobrevivência de um ou mais tipos de células da linha- gemgem mieloide maduras. Esta categoria inclui, mas não está limitado a, leucemia mielóide crônica (LMC), policitemia vera (PV), tromboci- temia essencial (TE), mielofibrose primária ou idiopática (PMF), leucemia neutrofílica crônica, leucemia eosinofílica crônica, leucemia mi- elomonocítica crônica juvenil mielomonocítica leucemia, síndrome hi- pereosinofílica, mastocitose sistêmica e leucemia mielóide crônica atípica. Tefferi, A. e Gilliland, DG, Oncogenes em doenças reumáticas, do ciclo celular. Março 2007, 6 (5) : 550-566 é totalmente incorporada na presente invenção por referência na sua totalidade para todos os fins.
[00064] Em uma outra modalidade, a terapia de combinação proporcionada na presente invenção é útil para o tratamento de mielofi- brose primária, pós-mielofibrose policitemia vera, mielofibrose pós- trombocitemia essencial, e leucemia mielóide aguda secundária.
[00065] Em uma outra modalidade, a terapia de combinação proporcionada na presente invenção podem ser usada para tratar pacientes com mielofibrose intermediário ou de alto risco, incluindo mielofi- brose primária, pós-policitemia vera mielofibrose e mielofibrose pós- trombocitemia essencial.
[00066] Em algumas modalidades, o indivíduo a ser tratado (por exemplo, um ser humano) é determinado como sendo não-responsivo ou resistente a uma ou mais terapias para distúrbios mieloproliferativos.
[00067] Em uma modalidade particular, é proporcionado na presente invenção um método de tratamento de uma neoplasia mieloprolife- rativa em um indivíduo com necessidade do mesmo, incluindo a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de uma composição que compreende everolimus e composto A, ou um sal farmaceutica- mente aceitável do mesmo.
[00068] Em uma modalidade, é proporcionada na presente invenção a utilização de um inibidor de mTOR e de um inibidor de JAK, na fabricação de um medicamento para o tratamento de câncer, por exemplo, umo distúrbio mieloproliferativo, por exemplo, médio ou alto risco mielofibrose, incluindo mielofibrose primária, pós- mielofibrose policitemia vera e mielofibrose pós-trombocitemia essencial.
[00069] Em uma outra modalidade, proporcionado na presente invenção um método de tratamento de uma neoplasia mieloproliferativa em um indivíduo com necessidade do mesmo, incluindo a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de uma composição que compreende PP242 e Composto A, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00070] São proporcionados na presente invenão métodos de tratamento de doenças, por exemplo, umo distúrbio mieloproliferativo, por meio da administração de uma quantidade eficaz de um composto de um inibidor de mTOR e de um inibidor de JAK a um indivíduo que sofre de uma doença. A quantidade da combinação de agentes é eficaz para tratar a doença. É importante observar que os efeitos sinérgicos da combinação de agentes : embora um ou mais dos agentes administrados isoladamente em uma dosagem particular podem não ser eficazes, quando administrada em combinação com a mesma dosagem de cada agente, o tratamento é eficaz. As doses de um ou mais dos agentes da combinação, por conseguinte, pode ser menor do que a FDA aprovou a doses de cada agente. Dosagens
[00071] A dose óptima da combinação de agentes para o tratamento da doença pode ser determinada empiricamente para cada indivíduo usando métodos conhecidos, e irá depender de uma variedade de fatores, incluindo, embora não limitado a, o grau de avanço da doença, a idade, o corpo peso, saúde geral, sexo e dieta do indivíduo, o tempo e via de administração, e de outros medicamentos que o indivíduo está a tomar. As dosagens óptimas podem ser estabelecidas utilizando testes e procedimentos que são bem conhecidos na técnica de rotina.
[00072] A quantidade de combinação de agentes que podem ser combinados com os materiais veiculares para produzir uma forma de dosagem única irá variar consoante o indivíduo tratado e o modo particular de administração. Em algumas modalidades das formas de dosagem unitárias contendo a combinação de agentes, tal como descrito na presente invenção vai conter as quantidades de cada agente da combinação que são tipicamente administrados quando os agentes são administrados sozinhos.
[00073] A frequência de dosagem pode variar, dependendo do composto usado e da condição particular a ser tratada ou prevenida. Em geral, é preferido o uso da dose mínima que é suficiente para proporcionar uma terapia eficaz. Os pacientes podem ser monitorizados, geralmente para a eficácia terapêutica usando ensaios adequados para a condição a ser tratada ou evitada, o que será familiar para aqueles que são versados na técnica.
[00074] A forma de dosagem pode ser preparada por meio dos vários processos convencionais de mistura, pulverização e as técnicas de fabricação prontamente evidentes para os especialistas na química de formulações de fármacos.
[00075] A forma de dosagem oral contendo a combinação de agentes ou agentes individuais da combinação de agentes pode ser na forma de micro-comprimidos colocados dentro de uma cápsula, por exemplo, em uma cápsula de gelatina. Para isso, uma cápsula de gelatina, como é empregue em formulações farmacêuticas pode ser usada, tal como a cápsula de gelatina dura conhecida como CAPSUGEL, disponível a partir da Pfizer.
[00076] Muitas das formas de dosagem oral úteis na presente invenção contêm a combinação de agentes ou agentes individuais da combinação de agentes sob a forma de partículas. Tais partículas podem ser comprimidos em um comprimido, presente em um elemento de núcleo de uma forma de dosagem revestida, tal como uma forma de dosagem de sabor mascarado, uma forma de dosagem revestida prima, ou uma forma de dosagem com revestimento entérico, ou podem estar contidas em uma cápsula, forma de dosagem de bomba osmótica, ou outra forma de dosagem.
[00077] Os compostos farmacêuticos da presente invenção (por exemplo, um inibidor de mTOR e de um inibidor de JAK) estão presentes nas combinações de formas de dosagem farmacêuticas, composições e formulações farmacêuticas descritas na presente invenção em uma proporção na proporção de 100 : 1 a 1 : 100. Por exemplo, a proporção de um composto de Fórmula (I): inibidor de mTOR pode estar na proporção de 1 : 100 a 1 : 1, por exemplo, 1 : 100, 1 : 90, 1 : 80, 1 : 70, 1 : 60, 1 : 50, 1 : 40, 1 : 30, 1 : 20, 1 : 10, 1 : 5, 1 : 2, ou 1 : 1 de Fórmula (I) : um inibidor de mTOR. Em outro exemplo, a proporção de um inibidor de mTOR : um composto de Fórmula (I) pode estar na proporção de 1 : 100 a 1 : 1, por exemplo, 1 : 100, 1 : 90, 1 : 80, 1 : 70, 1 : 60, 1 : 50, 1 : 40, 1 : 30, 1 : 20, 1 : 10, 1 : 5, 1 : 2, ou 1 : 1 de um inibidor de mTOR : um composto de Fórmula (I).
[00078] As proporções óptimas, as dosagens individuais e combinados, e as concentrações dos compostos de fármacos que produzam eficácia, sem a toxicidade são baseadas sobre a cinética da disponibi- lidade dos componentes ativos para locais alvo, e são determinadas usando métodos conhecidos dos versados na técnica.
[00079] As composições farmacêuticas ou combinações proporcionada na presente invenção (isto é, um inibidor de mTOR e de um inibidor de JAK (por exemplo, um inibidor de JAK da Fórmula (I))) pode ser testado em estudos clínicos. Estudos clínicos adequados podem ser, por exemplo, o rótulo aberto, os estudos de escalonamento de dose em doentes com doenças proliferativas. Tais estudos provam em particular o sinergismo dos ingredientes ativos da combinação da presente invenção. Os efeitos benéficos sobre doenças proliferativas podem ser determinados diretamente através dos resultados destes estudos que são conhecidos como tal por um perito na arte. Tais estudos podem ser, em particular, adequado para comparar os efeitos de uma monoterapia utilizando os ingredientes ativos e uma combinação da presente invenção. Em uma modalidade, a dose de um composto de um inibidor de mTOR, por exemplo, everolimus (RAD001) ou PP242, é aumentada até a dose máxima tolerada é atingido, e um inibidor de JAK (por exemplo, um inibidor de JAK da Fórmula (I)) é administrado com uma dose fixa. Alternativamente, um inibidor de JAK (por exemplo, um inibidor de JAK da Fórmula (I)), pode ser administrado em uma dose fixa e a dose do inibidor de mTOR pode ser aumentada. Cada paciente receberá doses dos compostos quotidianas ou intermitentemente. A eficácia do tratamento pode ser determinada em tais estudos, por exemplo, após 12, 18 ou 24 semanas por avaliação da pontuação de sintomas a cada 6 semanas.
[00080] A administração de uma terapia de combinação da presente invenção pode resultar não apenas num efeito benéfico, por exemplo, um efeito terapêutico sinergético, e.g. no que diz respeito a aliviar, ou retardar a progressão da inibição dos sintomas, mas também em efeitos benéficos surpreendentes ainda mais, por exemplo, menor nú- mero de efeitos colaterais, uma qualidade de vida melhorada ou uma diminuição da morbidade, em comparação com uma monoterapia aplicando apenas um dos ingredientes farmaceuticamente ativos utilizados na combinação da presente invenção.
[00081] Uma vantagem adicional pode ser que podem ser utilizadas doses inferiores dos ingredientes ativos da combinação da presente invenção, por exemplo, que as dosagens precisam muitas vezes não apenas ser menor, mas também podem ser aplicados com menos frequência, o que pode diminuir a incidência ou gravidade Os efeitos colaterais. Isto está de acordo com os desejos e necessidades dos pacientes a serem tratados.
[00082] É um objectivo da presente invenção proporcionar uma composição farmacêutica que compreende uma quantidade, que pode ser conjuntamente terapeuticamente eficaz na segmentação ou prevenção do câncer, por exemplo, umo distúrbio mieloproliferativo. Nesta composição, de um inibidor de mTOR e de um inibidor de JAK (por exemplo, um inibidor de JAK da Fórmula (I)) podem ser administrados conjuntamente, um após o outro ou de uma forma separada em uma forma de dosagem unitária combinada ou em duas formas de dosagem unitárias separadas. A forma de dosagem unitária pode também ser uma combinação fixa.
[00083] As composições farmacêuticas para administração separada de ambos os compostos, ou para a administração em uma combinação fixa, isto é uma composição galénica única que compreende ambos os compostos de acordo com a presente invenção podem ser preparados de uma maneira conhecida per se e são aquelas adequadas para administração entérica, tal como oral ou retal, e administração parentérica a mamíferos (animais de sangue quente), incluindo humanos, que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos um parceiro da combinao farmacologicamente ativo sozinho, por exemplo, como indicado acima, ou em combinação com um ou mais veículos ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis, especialmente adequados para aplicação entérica ou parentérica. Formulações
[00084] As combinações de fármacos proporcionada na presente invenção podem ser formuladas por uma variedade de métodos evidentes para os versados na técnica da formulação farmacêutica. As várias propriedades de libertação descritos acima pode ser conseguida em uma variedade de maneiras diferentes. As formulações adequadas incluem, por exemplo, comprimidos, cápsulas, formulações de revestimento, pressionar e outras formulações facilmente administrados.
[00085] As formulações farmacêuticas adequadas podem conter, por exemplo, desde cerca de 0,1 % a cerca de 99,9 %, de preferência desde cerca de 1 % a cerca de 60 %, do ingrediente ativo (s). As formulações farmacêuticas para a terapia combinada para administração entérica ou parentérica são, por exemplo, aquelas em formas de dosagem unitárias, tais como comprimidos revestidos de açúcar, comprimidos, cápsulas ou supositórios, ou ampolas. Se não for indicado de outra forma, estes são preparados de uma maneira conhecida per se, por exemplo, por meio de, granulação, revestimento com açúcar, dissolução ou liofilização de processos de mistura convencionais. Será apreciado que o conteúdo unitário de um parceiro da combinao contido em uma dose individual de cada forma de dosagem não necessita em si constituir uma quantidade eficaz uma vez que a quantidade eficaz necessária pode ser alcançada através da administração de uma pluralidade de unidades de dosagem.
[00086] Em particular, uma quantidade terapeuticamente eficaz de cada um dos parceiros da combinação da combinação da presente invenção pode ser administrada simultaneamente ou sequencialmente e em qualquer ordem, e os componentes podem ser administrados de uma forma separada ou como uma combinação fixa. Por exemplo, o método de tratamento de uma doença de acordo com a presente invenção pode compreender (i) a administração do primeiro agente, em forma livre ou de sal farmaceuticamente aceitável e (ii) a administração do segundo agente na forma livre ou de sal farmaceuticamente aceitável, simultaneamente ou sequencialmente em qualquer ordem, em quantidades conjuntamente terapeuticamente eficazes, preferencialmente em quantidades sinergicamente eficazes, por exemplo, em doses diárias ou intermitentemente, correspondentes aos valores descritos na presente invenção. Os parceiros de combinao individuais da combinação da presente invenção pode ser administrada de uma forma separada em diferentes momentos durante o curso da terapia ou concorrentemente em formas de combinação divididas ou individuais. Além disso, o termo administração também abrange a utilização de um pró-fármaco de um elemento da combinação que se convertem in vivo no parceiro da combinao como tal. A presente invenção deve, portanto, ser entendida como abrangendo todos esses regimes de tratamento simultâneo ou alternado e o termo "administrar" deve ser interpretado em conformidade.
[00087] A dosagem eficaz de cada um dos parceiros da combinação empregues na combinação da presente invenção pode variar dependendo do composto particular ou da composição farmacêutica utilizada, do modo de administração, a condição a ser tratada, da gravidade da condição a ser tratada. Assim, o regime de dosagem da combinação da presente invenção é selecionado de acordo com uma variedade de fatores incluindo a via de administração e a função renal e hepática do paciente. Um clinico ou médico de habilidade vulgar pode prontamente determinar e prescrever a quantidade eficaz dos ingredientes ativos isolados necessaries para aliviar, contrariar ou parar o progresso da condição.
[00088] As dosagens adequadas preferidas para os compostos utilizados no tratamento descritos na presente invenção são da ordem de cerca de 1 mg até cerca de 600 mg, de preferência cerca de 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 90, 95, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220, 240, 260, 280, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 420, 440, 460, 480, 500, 520, 540, 560, 580 a cerca de 600 mg no total. Em uma modalidade, o inibidor de JAK é administrado em uma 5mg, 10mg, 15mg, 20mg, ou uma dose de 25 mg.
[00089] Deste modo, em uma modalidade, é proporcionada na presente invenção uma composição que compreende um inibidor de mTOR e de um composto de Fórmula (I). Em uma modalidade, o composto de Fórmula (I) é (3R)-3-ciclopentil-3-[4 - (7H-pirrol [ 2,3-d] pirimi- din-4-il)-1H-pirazol-1-il] propanonitrila, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. Em uma outra modalidade, o inibidor de mTOR é everolimus (RAD001) ou 2 - (4-amino-1-isopropil-1H-pirazol [3,4-d] pi- rimidin-3-il)-1H-indol-5-ol (PP242 ). Ainda em uma outra modalidade, a composição compreende ainda um veículo farmaceuticamente aceitável. Exemplos
[00090] A presente invenção é ainda ilustrada por meio dos exemplos seguintes. Os exemplos não devem ser interpretados como limitando ainda mais.
[00091] A seguir é apresentada evidência de que os fármacos que visam a sinalização mTOR impediram a citocina induzida por citoqui- nas e proliferação de células independente em vários modelos celulares de NMP, e que o tratamento simultâneo com um inibidor JAK1/JAK2 ou interferona-α resultou em atividade sinérgica. Estes resultados fornecem uma base racional para explorar a eficácia de atingir Akt/mTOR no tratamento de neoplasias mieloproliferativas. MÉTODOS E MATERIAIS Reagentes
[00092] RAD001 (um inibidor de mTOR alostérico específico), PP242 (um inibidor de mTOR domínio ATP) e hidroxiureia foram obtidos da Sigma-Aldrich (St. Louis, Alemanha). Interferona-α foi obtido a partir de Pegasis. Anticorpos contra fosfo (p)-STAT5 (Tir694), STAT5, p-4EBP1 (Thr70), 4EBP1, mTOR, p-JAK2 (Tir1007/1008) e JAK2, eram de Sinalização Celular Tecnologia (Danvers, MA, EUA). Anticorpo anti-tubulina humana foi a partir de Santa Cruz Biotechnologi (Santa Cruz, CA, EUA). Recombinante de IL-3 humana, a GM-CSF, SCF, EPO e foram adquiridos a partir de Miltenii Biotec (Gladbach, Alemanha). siRNAs contra mTOR eram de Dharmacon siGENOME Smart Pool (Thermo Scientific, Waltham, MA, EUA), o siGENOME não alvejando siRNA Pool # 1 (Thermo Scientific) foi utilizado como controle negativo. Linhagens de células e cultura de células
[00093] As linhagens de células HEL, SET2 e K562 humanas foram compradas da coleção alemã de microorganismos e culturas de células (DSMZ, Braunschweig, Alemanha). Murino BaF/3 e células BaF/3-EPOR expressando JAK2 do tipo selvagem (wt) ou JAK2V617F foram doadas por R. Skoda (Basileia, Suíça). As linhagens celulares foram cultivadas em RPMI 1640 suplementado com 10 % de soro fetal bovino (FBS; Lonza, Bélgica) (20 % para as células SET2), antibióticos e L-glutamina. mIL-3 e EPO foram adicionados ao meio de cultura de JAK2 WT BaF/3 e células BaF/3-EPOR, respectivamente. Células humanas
[00094] Amostras de sangue periférico (PB) ou medula óssea (BM) foram obtidas a partir de pacientes diagnosticados com PV ou PMF (2008 critérios da OMS), sob o protocolo aprovado pelo Conselho de Revisão Institucional da Azienda Ospedaliera-Universitaria Careggi e depois de obtido o consentimento informado. Doadores saudáveis de células-tronco hematopoéticas, desde o consentimento informado para doar células CD34 + em excesso. A pesquisa foi realizada de acordo com os princípios da Declaração de Helsinki. As células CD34 + foram selecionadas, como descrito imunomagneticamente. O estado mutaci- onal JAK2V617F foi determinado por meio de um ensaio de PCR em tempo real quantitativo em granulócitos. A inibição da proliferação de ensaio, ensaio clonogênico e apoptose ou a análise do ciclo celular
[00095] As células (2x104) foram plaqueadas em placas de cultura de tecidos de 96 cavidades com o aumento das concentrações do (s) fármaco (s), em triplicado, as células viáveis foram analisadas usando o ensaio de WST-1 (Roche, EUA) e normalizadas para os cavidades que contêm um volume equivalente de veículo (DMSO) apenas. A concentração para a qual ocorreu 50 % de inibição de proliferação (IC50) foi calculada utilizando o software Origin (V 7.5, OriginLab Northampton, MA). Em algumas experiências, os testes clonogênicos foram também empregues. As células (5x103) foram semeadas em 0,5 % de agar em meio suplementado com FBS e quantidade variável do fármaco (s) (ou um volume equivalente de veículo em placas de conto- le) foi adicionada uma vez no início da cultura. Colônias foram enume-radas por microscopia invertida após sete dias de incubação. A quantificação de células apoptóticas foi realizada por meio da citometria de fluxo, utilizando o kit de coloração Anexina-V-FLUOS (Roche), pelo menos, 20000 eventos foram adquiridas. Para a análise da distribuição do ciclo celular por citometria de fluxo, 1x106 células foram tratadas com etanol a 95 %, 10 ug RNase/ml de iodeto de propídio e 50 mg/mL. Ensaios de colônia de progenitores hematopoiéticos humanos e geno- tipagem de colônia
[00096] As células mononucleares de pacientes BM MPN ou indivíduos de contole foram plaqueadas a 1x105/mL em metilcelulose (Me- thocult; StemCell Technologies, Vancouvide, Canadá) suplementado com 50ng/mL SCF, IL-3 10ng/mL, 10ng/mL de IL-6, GM- 10ng/mL CSF, G-CSF e EPO 10ng/mL 3U/mL para o crescimento de BFU-E e CFU- GM. Ensaio CEE foi realizada por plaqueamento 2.5x105/mL células mononucleares de pacientes PB PV em metilcelulose contendo meio de leucócitos condicionados sem EPO (StemCell Tecno., Cat. Não. # 04531). Para o crescimento de CFU-MK, 5x104/mL células CD34 + foram semeadas em uma placa de 24 cavidades em meio de colagênio e Megacult com lipídios (StemCell Technol.) Suplementadas com trombopoietina 50ng/mL, 10ng/mL de IL-3, IL-6 10ng/mL. As colônias foram contadas no dia 14 de acordo com os critérios padrão.
[00097] Para genotipagem de colônia única JAK2V617F foi utilizado um ensaio de PCR específica de alelo. Colônias bem separados (pelo menos 40 colônias por pontos) foram retiradas individualmente fora do meio semi-sólido em 5 mL de DNase/água livre de RNase, Usadas, a 95°C durante 5 minutos, e submetidas a amplificação por PCR e eletroforese em gel. A lise celular e SDS-PAGE Western blotting
[00098] As células foram ressuspensas em tampão de lise RIPA (50 mM de pH 7,4 Tris-HCl, 150 mM de NaCl, 1 % de NP-40, 1mMEDTA), contendo um coquetel inibidor de protease (Halt Inibidor da Protease Coquetel Kit, Pierce, Rockford, IL, EUA) e submetido à sódio dodecil sulfato de gel de poliacrilamida eletroforese separação e transferência de western immunoblot para membrana PVDF (BioRad, Hercules, CA, EUA), de acordo com protocolos padrão. As membranas foram sondadas com anticorpos primários seguido de anticorpo conjugado com peroxidase de rábano silvestre anti-Ig produzido em coelhos (Sigma- Aldrich), as proteínas imunoreativas foram descritas com ECL utilizando o aparelho Quant Imagem 350 (GE Healthcare, Little Chalfont, Reino Unido). Isolamento de RNA e PCR quantitativa em tempo Real (RTQ-PCR)
[00099] O RNA total foi purificado utilizando o reagente Trizol (Invi- trogen Life Technologies, Paislei, Reino Unido), e a concentração e a pureza/ integridade do RNA foi determinada com NanoDrop ND-1000 espectrofotômetro (NanoDrop Techn., Wilmington, DE, EUA). Um mi- crograma de RNA foi transcrito reversamente usando um Kit de cDNA de alta capacidade arquivado (Applied Biosistems, Foster Citi, CA). Reações de RT-QPCR foram realizadas com o Universal PCR Master Mix TaqMan usando ABI PRISM 7300 HT e TaqMan ® Ensaios de Expressão Gênica (Applied Biosistems), em triplicata. O perfil de expressão do gene foi conseguida utilizando o método de quantificação relativo limiar do ciclo comparativo (CT) utilizando a sonda marcada com VIC RNaseP como o gene de arrumação (ΔCT). Transfecção celular
[000100] A fase de crescimento exponencial de células HEL foi ele- troporada com siRNAs na Amaxa Nucleofector (Amaxa Biosistems, Gaithersburg, MD, EUA) utilizando um kit de Amaxa R. Resumidamente, células 2-5x106 em 0,1 mL de volume foram transfectadas com 1 uM de siRNA e imediatamente transferidas para placas de 24 cavidades contendo meio de cultura de pré-aquecido. A eficiência de trans- fecção e a viabilidade das células foram avaliadas por meio da citome- tria de fluxo com pmaxGFP ® (Amaxa Biosistems), e resultaram sempre maior do que 85 % . Métodos estatísticos
[000101] A comparação entre grupos foi realizada pelo teste de Mann-Whitnei ou teste de Fisher, conforme apropriado, usando o SPSS (StatSoft, Inc., Tulsa, OK) ou software Origin. O nível de signifi- cância a partir de testes de dois lados foi de P < 0,05. O índice de combinação (IC), que é um medido da interação entre dois fármacos, foi calculado de acordo com o princípio do efeito mediano do método de Chou e Talalai utilizando o software CalcuSin. De acordo com esta Fórmula, quando CI < 1 a interação de dois fármacos é considerada sinérgica, quando CI = 1 a interação é aditiva e, quando IC > 1 a interação é antagônica. RESULTADOS inibidores de mTOR revogarão a proliferação de linhagens de células mutantes JAK2V617F
[000102] Para determinar se as linhagens celulares JAK2V617F mu- tantes de leucemia humana foram sensíveis à inibição do mTOR, o inibidor de mTOR seletiva alostérico RAD001 e o inibidor competitivo do ATP do local ativo da mTOR, PP242, foram empregues. Foi constatado que JAK2V617F mutante e células HEL e SET2 foram pelo menos tão sensíveis à inibição do mTOR como a BCR/ABL positivas células K562 utilizados como control. IC50 valores estão apresentados na Tabela 1. Os efeitos de inibidores de mTOR em JAK2 do tipo selvagem IL-3 de murídeo dependente (Ba/F3) ou células dependentes de EPO (Ba/F3-EPOR) ou a citocina independente homólogo JAK2V617F foram investigados. Verificou-se que células V617F Ba/F3 foram mais sensíveis à RAD001 em peso do que a contrapartida JAK2, quer na ausência ou na presença de IL-3 no meio de cultura. Do mesmo modo, em células Ba/F3-EPOR, CI50 de células mutantes V617F era 651nM e 1213 nM, na ausência e na presença de EPO, respectivamente, em comparação com uma IC50> 10000 nM em células wt JAK2. PP242 foi igualmente eficaz : V617F em células Ba/F3 IC50 foi 800nm e 1600 nm, respectivamente, na ausência ou na presença de IL-3 vs 3400 nM em células wt; Ba/F3-EPOR wt em células, era de IC50 5,931 nM contra 500 nM e 750nm em células V617F suplementados ou não com EPO, respectivamente (Tabela 1). Na sua concentração CI50, RAD001 e PP242 (não representada) provocou a parada do ciclo celular SET2 e células HEL na fase G0/G1 do ciclo celular (Figura 1A). Por outro lado, o tratamento com RAD001 foi amplamente ineficaz na indução de morte celular, enquanto PP242 promoveu um modesto, mas as células, apoptose dependente da dose em concentrações mais elevadas de células em SET2 (Figura 1B), ou HEL (não mostrado). Em adição à inibição da proliferação de células verificou-se que também RAD001 prejudicado o potencial de JAK2V617F mutante HEL, SET2 UKE-1 e as células de forma mais eficiente do que K562 clonogênico. Além disso, a formação de colônias por células Ba/F3 V617F foi inibida com concentrações significativamente mais baixas RAD001, independentemente da citocina no meio, que o homólogo em peso (dados não mostrados). No geral, estes dados indicam que as células do mutante JAK2V617F são uniformemente sensíveis à inibição do mTOR e sugerem que a supressão da proliferação celular reflete principalmente um citostático, em vez de um efeito apoptótico.
[000103] Em seguida, os mecanismos de inibição da proliferação de células induzidas por inibidores de mTOR com os do Composto A e inibidor JAK1/JAK2 deacetilase da histona (HDAC) Panobinostat inibidor foram comparados. Estas moléculas foram todos inibidor do crescimento em células HEL e SET2 em concentrações IC50 significativamente inferiores aos medidos na linhagemgem de células K562 (Tabela 1). No entanto, ao contrário dos inibidores de mTOR, eram dose- dependente potentes indutores de apoptose das células (Figura 1 C e D). HEL (IC50 = 410μM) e SET2 (IC50 = 330μM) resultou em células mais sensíveis ao ribonucleosídeo difosfato redutase hidroxiureia de células K562 (IC50 = 4,910 uM) (Tabela 1); hidroxiureia induziu a apop- tose celular dependente da dose (Figura 1E).
[000104] O efeito do inibidor JAK1/JAK2 também foi avaliado em células Ba/F3 para explorar os efeitos da exposição à citocina de sensibilidade ao fármaco. Verificou-se que as células V617F Ba/F3 e Ba/F3- EPOR eram mais sensíveis ao Composto A (CI50 = 34nm e 220 nm, res- pectivamente), que a sua contraparte em peso (1,600 nM ou 457nm para o Composto A, respectivamente). No entanto, a adição da citoquina adequada para meios de cultura anulou o efeito inibidor do crescimento preferencial do inibidor JAK1/JAK2 em células mutantes V617F (IC50 = 1600nm para o Composto A, em células Ba/F3; IC50 = 521nM para o Composto A, em Ba/F3-R-EPO de células) (Tabela 1).
[000105] No geral, estes dados indicam que a atividade inibidora do crescimento de inibidores de HDAC e JAK1/JAK2 em linhagens celulares de leucemia JAK2V617F é predominantemente mediada por meio da apoptose celular. Além disso, confirmou-se que as citocinas acen- tuadamente reduziram a sensibilidade das células aos inibidores JAK1/JAK2.
[000106] A Figura 1 mostra o efeito de inibidores selecionados, um inibidor da mTOR, inibidores JAK1/JAK2 deacetilase histonas e hidro- xiureia na apoptose de células e ciclo celular em SET2 ou células HEL. Em painéis (B) a (E), a percentagem de células em apoptose Anexina V positivas foi medida por citometria de fluxo em SET2 células que tinham sido expostas durante 48 horas a quantidade variável dos inibidores de mTOR RAD001 PP242 ou (B), JAK1/JAK2 Um composto inibidor (C), inibidor de HDAC Panobinostat (D) ou hidroxiureia (E). Os resultados são expressos por meio da porcentagem das células viáveis em comparação com cavidades de contole contendo veículo (DMSO) apenas. A fração de células necróticas foi identificado como as células de iodeto de anexina V/propídio duplo-positivos. Um representante de três experiências semelhantes. *, P < 0,05, **, P < 0,01.
[000107] A Tabela 4 mostra a inibição do crescimento clonogênico de linhagens celulares JAK2V617F mutantes por meio dos inibidores de mTOR, RAD001 ou PP242 e JAK1/JAK2 inibidores composto A. JAK2V617F mutantes linhagens celulares de origem humana, quer heterozigóticas (SET-2) ou homozigóticos (HEL) e a linhagem celular BCR/ABL mutante K562 (utilizada como contole) foram expostos a concentrações crescentes de RAD001, PP242 ou composto A. As células 103 foram semeadas em agar na presença de uma quantidade variável do fármaco ; as colônias foram contadas no dia 7 e expresso como uma percentagem do número de colônias cultivadas em placas de contole contendo veículo. As células BAF/3 de camundongo sobre- expressando JAK2V617F foram igualmente expostas a RAD001, PP242 ou o Composto A, e em comparação com as células de tipo selvagem (wt). A interleucina-3 (10 ng/mL) foi adicionado ou não ao meio de cultura. Os valores de IC50 apresentados são a média ± DP de pelo menos três experiências independentes. Os inibidores de mTOR atenuam a sinalização a jusante de mTOR e STAT5 reduz a fosforilação em linhagens celulares JAK2V617F muta- das
[000108] O efeito de inibição do mTOR na transdução de sinal em células mutantes JAK2V617F SET2 utilizando como modelo células foi investigado seguinte (Figura 2). Observou-se que o tratamento com fosforilação reduzida dependentemente da dose RAD001 e PP242 do alvo mTOR 4E-BP1 e, inesperadamente, de STAT5, enquanto ambos JAK2 fosforilado e total resultaram em inalterados. Em comparação, o composto inibidor JAK1/JAK2 A reduziu marcadamente a fosforilação e dose-dependente de JAK2 e STAT5 4EBP1 deixando inalterada. O inibidor dependente da dose HDAC panobinostat reduziu JAK2fosforilada e total STAT5, fosforilada e mostrou um efeito modes-to sobre fosforilada 4E-BP1. Por outro lado, a hidroxiureia não afetou o nível ou o estado de fosforilação de 4EBP1 ou STAT5.
[000109] Para caracterizar melhor a correlação entre a mutação JAK2V617F e ativação de mTOR, bem como as consequências da inibição da fosforilação de mTOR em STAT5, foram usadas células de Ba/F3 e Ba/F3-EPOR. Em primeiro lugar, foi observado que 4E-BP1 foi minimamente fosforilada em JAK2 em peso e as células Ba/F3 Ba/F3-EPOR privadas de citoquinas, enquanto era hiper-fosforilada em células V617F, suportando dados anteriores sobre a ativação constitutiva de Akt em JAK2V617F mutada células. A adição de cito- quinas resultou no aumento da fosforilação de 4E-BP1 em peso e JAK2 V617F mutado e células de Ba/F3 Ba/F3-EPOR (dados não mostrados). Em células incubadas com RAD001, uma acentuada inibição da fosforilação 4E-BP1 ocorreu (dados não mostrados) e persistiu até pelo menos 24 horas (dados não mostrados). STAT5 fosforilação foi maior em células de V617F em comparação com a IL-3 ou a EPO- destituído JAK2 em peso ou células Ba/F3 Ba/F3-EPOR, e fez aumentar substancialmente após a exposição de citoquinas. A fosforilação STAT5 foi significativamente baixo regulada espelhando os efeitos sobre 4EBP1; a inibição era já evidente aos 60 min foi mantida até 24 h (não mostrado).
[000110] Para confirmar que a atenuação da fosforilação STAT5 realmente foi mediada por meio da inibição do mTOR em vez de resultar de um efeito direto da fosforilação de RAD001 em STAT5, mTOR foi silenciado com siRNA específica em células HEL. Embora o tratamento com siRNAs diminuição dos níveis de mTOR por apenas 50 a 60 % em 24 horas, o nível de 4E-BP1 fosforilado diminuíram dramaticamente em comparação com as células que tinham sido tratadas com siRNA contole irrelevante, o conteúdo total de proteína 4E-BP1 não se alterou nada (dados não mostrados ). Às 48 h, tanto mTOR fosforilada e 4E-BP1 foram mal detectável. Ao mesmo tempo, o nível de fosforila- da STAT5 apareceu marcadamente reduzida em 24-48 h em células que tinham sido nucleoafetadas com mTOR siRNA específica em comparação com o contole ; total de STAT5 não se alterou.
[000111] A Figura 2 mostra o efeito de inibidores selecionados, um inibidor da mTOR, inibidores JAK1/JAK2 deacetilase histonas e hidro- xiureia em mTOR e de JAK/STAT em SET2 células. As células SET2 foram incubadas durante 24 h com concentrações crescentes do fár- maco, e o nível de total e fosforilada JAK2, STAT5, e 4EBP1 foi analisado por western blot. Tubulina foi utilizada para o carregamento de normalização. Os resultados apresentados são representativos de 2 a 4 experiências semelhantes para os diferentes fármacos. Combinação de RAD001 ou PP242 com o Composto A resulta em inibição sinergística da proliferação da linhagem de células JAK2V617F leucêmicas e a formação de colônias
[000112] Os efeitos de inibição concorrente de mTOR e JAK1/JAK2 em células SET2 e Ba/F3-EPOR V617F foram avaliados através da medição dos efeitos inibidores da proliferação. As células foram incubadas com diferentes concentrações de ou PP242 e RAD001; usando estas combinações de fármacos em um índice de combinação (IC) variando de 0,12 a 0,44 foi medido sugerindo uma forte atividade sinérgi- ca das dois fármacos (Tabela 3).
[000113] Mais experiências utilizando células Ba/F3 SET2 e V617F EpoR foram realizadas em um ensaio clonogênico de agar (Tabela 5), um IC variando de 0,22 a 0,81 foi medido nestas culturas, novamente apontando para a sinergia de fármacos. Combinação de RAD001 ou PP242 com o Composto A resulta em inibição sinergística de células progenitoras hematopoiéticas a partir de pacientes com NMP no ensaio de formação de colônias de CEE.
[000114] Para determinar se a proliferação de células leucêmicas de pacientes com NMP pode ser afetada pela simultânea segmentação da via mTOR e JAK, PBMC de pacientes com PV foram incubadas com concentrações crescentes de RAD001, PP242, o Composto A ou uma combinação de RAD001 ou PP242 e Composto Um num ensaio CEE. As células mononucleares do sangue periférico derivadas de pacientes PV foram cultivadas em meio livre de EPO-metilcelulose para o crescimento CEE, na ausência ou na presença de uma quantidade fixa de RAD001, PP242, e/ou o Composto A. A CEE foram pontuados às 12 dias e expressa como percentagem do número de colônias de placas de contole medida em que contêm apenas veículo. *, P < 0,05, **, P < 0,01. Os resultados apresentados na Tabela 6 mostram IC de 0,2 e 0,26, nestas culturas, o que demonstra ainda mais o sinergismo entre o mTOR e inibidores de JAK na inibição do crescimento das células JAK2V617F. DISCUSSÃO
[000115] A mutação JAK2V617F associada a NMP determina uma ativação constitutiva da via JAK2/STAT; inibidores de JAK2 reduzem a proliferação de células mutantes JAK2V617F in vitro, mitigar mielopro- liferação em animais transgênicos JAK2V617F (Liu PC, Caulder E, Li J., et al.. Inibição combinada. de Janus kinase 1/2 para o tratamento de neoplasias conduzidas por JAK2V617F : efeitos seletivos sobre as células mutantes e melhorias nas medidas de gravidade da doença Clin Cancer Res 2009; 15 : 6891 a 6900) e produzir melhora clínica mensurável em pacientes com mielofibrose ( Verstovsek S, Kantarjian H, Mesa RA, et al. segurança e eficácia do INCB018424, um inibidor JAK1 e JAK2, em mielofibrose N Engl J Med 2010; 363 : 1117 a 1127) ou hidroxiureia resistente a PV ou TE. No entanto, as variações na carga JAK2V617F eram modestas e a remissão molecular tem sido ainda relatada. Além disso, a população de células de iniciação da doença em camundongos JAK2V617F nocauteados não foi afetada pelo tratamento com o inibidor de JAK2 TG101348. No geral, estas observações apresentam a possibilidade de segmentação eficaz de MPN clone pode não ser alcançável com inibidores da JAK2 disponíveis. Portanto, um conhecimento mais detalhado de sinais celulares envolvidos na proliferação desregulada de células mutantes é desejável a fim de conceber estratégias terapêuticas mais eficazes. Neste sentido, tem sido demonstrado que a co-tratamento da HDACi panobinostat e os inibidores de JAK2 TG101209 determinada maior atenuação de JAK/STAT sinalização em células mutadas JAK2V617F-humanos e de murídeo e aumento da citotoxicidade contra NMP células CD34 +, em comparação com os fármacos individuais.
[000116] Este estudo centrou-se no alvo da rapamicina em mamíferos (mTOR), um alvo a jusante chave da via PI3K/AKT. A seri- na/treonina-quinase de mTOR funciona como um regulador de metabolismo central da célula, a sobrevivência, o crescimento, a proliferação e autofagia. mTOR é inibida por uma família de moléculas, denominadas rapalogs seguintes membro fundador de rapamicina, que foram recentemente utilizados em testes clínicos em cânceres. mTOR existe em dois complexos TORC1 e TORC2. TORC1, formado com raptor, controla o nível de cap-dependente tradução do mRNA e fosforila efe- toras, como a iniciação eucariótica fator proteína 4E-binding 1 (4E-BP1) e S6 quinase 1 (S6K1). Por sua vez, 4E-BP1 fosforilado leva a inibiu a ligação ao fator de iniciação eucariótico 4E (eIF4E) e impede a ativação de tradução de vários genes, incluindo a ciclina D1, Bcl-2, Bcl-XL, e fator de crescimento endotelial vascular. Por outro lado, regula o crescimento celular S6K1 por fosforilação principais alvos, tais como eIFe4, mTOR, fator de iniciação eucariótico 4B e alongamento-2 quinase. Ambos eIF4E e SK1 foram envolvidos na transformação celular e são su- perexpressos em alguns tipos de câncer de má prognóstico. Os componentes adicionais de TORC1 incluem mamíferos LST8/G- β- subunidade como proteínas (mLST8/GβL) e os parceiros recentemente identificado PRAS40 e DEPTOR. mTOR também combina com Ric- tor em mTORC2, que é em grande parte rapamicina insensível, e é composto de GβL e proteína de stress de mamífero-quinase ativada por interacção da proteína 1 (mSIN1); TORC 2 está envolvido na fosfo- rilação da Akt em Ser473. Este circuito de realimentação negativa para mTORC2 Akt pode, em alguns casos, resultar em progressão tumoral exacerbada, embora RAD001 foi relatado para inibiu a atividade de Akt na via de supressão de células leucêmicas de ambos mTORC1 e mTORC2. Para superar possíveis limitações e desvantagens dos inibidores de mTOR, tais como alostéricos RAD001, novas moléculas que actuam como inibidores competitivos do ATP de sítio ativo mTOR têm sido desenvolvidos, um deles, PP242 suprime fortemente ambas as atividades mediadas de TORC1 e TORC2 exercidas e citotoxicidade potente contra as células de leucemia. RAD001 e PP242 foram usadas in vitro para explorar o papel do mTOR putativa como alvo para a terapia em NMP.
[000117] Foi inicialmente demonstrado que os inibidores de mTOR solicitaram uma prisão da proliferação de células mutantes de linhagens celulares de leucemia humana e de murino JAK2V617F em concentrações significativamente menores do que as células de controle de fármacos (Tabela 1). Inversamente, RAD001 não induziu morte celular, enquanto PP242 causa alguma apoptose celular como concentrações mais elevadas, assim, nestas condições experimentais, os inibidores de mTOR são principalmente citostáticos. Este modo de acção diferente do Composto A e inibidor JAK1/JAK2 panobinostat inibidor HDAC que toda a apoptose celular induzida potente (Figura 1). Por outro lado, foi demonstrado que a inibição da proliferação celular provocada por inibidores de mTOR não foi afectada pela ativação maximizada da via de JAK/STAT que se seguiu a exposição citocina de Ba/EG e células Ba/F3-EPOR, ao contrário do caso da inibidor JAK1/JAK2. Esta última observação é on-line com a demonstração de que a sensibilidade aos inibidores JAK2 nos progenitores eritróides a partir de pacientes com PV resultou suprimida pela adição de EPO para o meio de cultura e, indiretamente, sugere que os mecanismos subjacentes à inibição da proliferação celular por RAD001 são pelo menos parcialmente independente da induzida por citocinas de JAK/STAT ativação. Foi demonstrado que RAD001 foi mais seletivo contra JAK2V617F mutado de progenitores do tipo selvagem em pacientes com PV vez que o número de colônias V617F diminuiu de uma média de 39 % a favor de onas do tipo selvagem (Tabela 2).
[000118] Um efeito predominante antiproliferativo em vez de pró- apoptótico de RAD001 tem sido demonstrado em vários outras células cancerosas, e representa o fundamento da terapia de combinação com agentes que induzem a apoptose, preferencialmente. Tendo isto em mente, os efeitos da combinação de um inibidor de mTOR e JAK1/JAK2 in vitro foi explorado e prova de uma sinergia significativa em relação à inibição da proliferação (tabela 3) potencial clonogênico (Tabela 5) de linhagens celulares de leucemia foi demonstrada. Além disso, a formação de colônias por meio das células progenitoras hema- topoiéticas a partir de pacientes de NMP foi inibida através da combinação sinérgica de RAD001 ou PP242 com o inibidor JAK1/JAK2 do Composto A (Tabela 6).
[000119] A análise de moléculas de sinalização importantes mostrou que RAD001 e PP242 inibiu a fosforilação do alvo a jusante 4EBP1, enquanto inibidores JAK1/JAK2 e inibidores de HDAC reduzida fosfori- lação de ambos JAK2 e STAT; de nota, os inibidores de HDAC, também reduziu a expressão do total de JAK2 (Figura 2 ). Uma observação interessante foi que a inibição da mTOR devido a RAD001 e PP242 foi associado com uma redução apreciável de STAT5 fosforila- ção, o que não foi contabilizada pela redução do teor de proteína total de STAT5. Esta reacção positiva entre o mTOR e STAT5 foi fundamentada por demonstrar uma atenuação concomitante de 4E-BP1 e STAT5 fosforilação com o uso de RNA específicao inibitório (siRNA) contra a mTOR (dados não mostrados). O grau de inibição da fosfori- lação mediada por STAT5 RAD001 era muito menor do que com JAK1/JAK2 inibidorsthat não afectou fosforilação 4E-BP1, sugerindo que a ativação de células mTOR em NMP pode ser em grande medida independente de JAK2. Por outro lado, um inibidor HDAC demonstrou uma inibição modesta do phoshorilation de 4EBP1, embora os dados atuais não permitem concluir se este efeito é direto ou não. No seu conjunto, estas observações indicam que a fosforilação STAT5 pode ser afetada, visando a sinalização iniciada por JAK2 e mTOR. A este respeito, a ativação sensível à rapamicina da STAT3 via a sinalização do receptor de tirosina kinase/PI3K/Akt foi demonstrada em várias células de câncer e os tumores de camundongos ou seres humanos. FÁRMACO BaF/3 -IL3 K562 HEL SET2 WT V617F V617F +IL3 RAD001 (nM) 16,000 ± 2,500 14,000 ±2,800 17,000 ± 3,000 ** 2,600 ± 1,200 10 ± 4 ** 10 ± 5 ** PP242 (nM) 8,300 ±1000 1,500 ±113** 285 ± 11 ** 3,400 ± 300 800 ± 200** 1,600 ± 200** Composto A (nM) >20,000 790 ±150 ** 160 ± 24 ** 1,600 ± 500 34 ± 2 ** 1,700 ± 300 Panobinostat (nM) 31 ± 8 8 ± 3 * 7 ± 2 * N.D. N.D. N.D. HuOH (μM) 4,910 ± 15 410±20 * 330 ±11 * N.D. N.D. N.D. Tabela 1. Determinação de IC50 de inibidores de mTOR, um inibidor JAK1/JAK2, os inibidores de HDAC e hidroxiureia utilizan-do o ensaio de inibição de proliferação em JAK2V617F humano e de murídeo e linhagens celulares mutantes de contole de tipo selvagem JAK2. *, P < 0,05, ** P < 0,00. N.D.,
Figure img0004
Tabela 2. Efeitos da RAD001 sobre a proporção de colônias JAK2 e V617F de tipo selvagem e em ensaios clonogênicos de células CD34 + de doentes com NMP.
Figure img0005
[000120] Tabela 3. A combinação de inibidor de mTOR e inibidores JAK1/JAK2 resulta na atividade sinergística na inibição da proliferação de linhagem de células SET2 e as células Ba/F3-EPOR JAK2V617F.
Figure img0006
[000121] O valor de IC50 foi calculado no ensaio de inibição de proli-feração, na presença de diferentes combinações de fármacos. Foi re-latado que o valor de CI50 mediano representa, pelo menos, em 3 ex-periências dos fármacos usados em combinação. O Índice de combi-nação (Cl) foi calculado de acordo com Chou e Talali como descrito em Materiais e Métodos. A CI < 1 indica que a interação das dois fár- macos é sinérgica. As primeiras duas colunas (em cinzento) relatam, por conveniência, o valor de CI50 dos fármacos individuais, calculado a partir dos dados da Tabela 1. Tabela 4. Determinação do IC50 de RAD001, PP242 e INC242 utilizando o ensaio clonogênico para linhagens celulares JAK2V617F mutan- tes humanas e murinos e controles.
Figure img0007
[000122] O valor de IC50 (isto é, a concentração de fármaco que re-duzisse o número de colônias a 50 % que foi medido em placas de contole com veículo apenas) foi calculado no ensaio clonogênico ágar enumerando as colônias no dia 7, na presença de diferentes concen-trações de fármaco. No caso das linhagens de células humanas, a li-nhagem de células de contole foi K562, enquanto que no caso de célu- las de murino a referência eram células Ba/F3 do tipo selvagem mantidas na presença de IL-3. **, P < 0,01. Tabela 5. Combinação de RAD001 ou PP242 e INC242 resulta em ati-vidade sinérgica na inibição do potencial clonogênico das linhagens celulares mutantes JAK2V617F humanas e de murino .
Figure img0008
[000123] O valor de IC50 foi calculado no ensaio clonogênico em ágar enumerando as colônias que cresceram no dia 7 da cultura estabelecida na presença de diferentes combinações de medicamentos. Relata-se o valor mediana de, pelo menos, 3 experiências de IC50 daos dois fármacos usadaos em combinação. O Índice de combinação (Cl) foi calculadao como descrito em Materiais e Métodos. A um CI < 1 indica que a interação daos dois fármacos é sinérgica. As primeiras du- as colunas (em cinzento) indicam o valor de IC50 calculados para aos fármacos individuais e são relatados na presente invenção a partir da Tabela 4 para conveniência. Tabela 6. Combinação de RAD001 ou PP242 e INC242 resulta em ati-vidade sinérgico na inibição do potencial clonogênico de células mo- nonucleares do sangue periférico humano de pacientes com PV.
Figure img0009
[000124] O valor de IC50 foi calculado no ensaio clonogênico em ágar enumerando as colônias que cresceram no dia 7 da cultura estabelecida na presença de diferentes combinações de medicamentos. O Índice de combinação (Cl) foi calculado como descrito em Materiais e Métodos. Um CI < 1 indica que a interação dos dois fármacos é sinér- gica.

Claims (15)

1. Uso de um inibidor de mTOR e de um composto de Fór-mula (I),
Figure img0010
sendo que o composto de Fórmula (I) é (3R)-3-ciclopentil-3- [4-(7H-pirrol[2,3-d]pirimidin-4-il)-1H-pirazol-1-il]propanonitrila, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo; e sendo que o inibidor de mTOR é everolimus (RAD001) ou 2-(4-amino-1-isopropil-1H-pirazol[3,4-d] pirimidin-3-il)-1H-indol-5-ol (PP242); o referido uso sendo caracterizado pelo fato de que é para preparação de uma composição para tratamento de uma neoplasma mieloproliferativo em um indivíduo em necessidade do mesmo.
2. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o inibidor de mTOR e o composto de Fórmula (I) são em uma única formulação ou forma de dosagem unitária.
3. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda um veículo farmaceuticamente aceitável.
4. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a neoplasia mieloproliferativa é selecionada a partir do grupo que consiste em leucemia mielóide crônica (LMC), policitemia vera (PV), trombocitemia essencial (TE), mielofibrose primária ou idio- pática (PMF), leucemia neutrofílica crônica, leucemia eosinofílica crônica, leucemia mielomonocítica crônica, leucemia mielomonocítica ju- venil, síndrome hipereosinofílica, mastocitose sistêmica e leucemia mielóide crônica atípica.
5. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a neoplasia é mieloproliferativa mielofibrose, pós- policitemia vera mielofibrose ou mielofibrose pós-trombocitemia essencial.
6. Uso, de acordo com a reivindicação 5 ou 6, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um ser humano.
7. Uso, de acordo com a reivindicação 5 ou 6, caracterizado pelo fato de que o tratamento compreende administrar o inibidor de mTOR e o composto de Fórmula (I), substancialmente ao mesmo tempo.
8. Uso, de acordo com a reivindicação 5 ou 6, caracterizado pelo fato de que o inibidor de mTOR e de (3R)-3-ciclopentil-3-[4-(7H- pirrol[2,3-d] pirimidin-4-il)-1H-pirazol-1-il]propanonitrila, ou um sal far- maceuticamente aceitável do mesmo, estão em uma única formulação ou em forma de dosagem unitária.
9. Uso, de acordo com a reivindicação 5 ou 6, caracterizado pelo fato de que o inibidor de mTOR e de (3R)-3-ciclopentil-3-[4-(7H- pirrol[2,3-d] pirimidin-4-il)-1H-pirazol-1-il]propanonitrila, ou um sal far- maceuticamente aceitável do mesmo, estão em formulações separadas ou em formas de dosagem unitárias.
10. Uso, de acordo com a reivindicação 5 ou 6, caracterizado pelo fato de que o inibidor de mTOR e/ou um composto de Fórmula (I) são administrados em doses que não seriam eficazes quando um ou ambos o inibidor de mTOR e de composto de Fórmula (I) são ad-ministrados sozinhos, mas as quantidades são eficazes em combinação.
11. Uso de everolimus e de (3R)-3-ciclopentil-3-[4-(7H- pirrol[2,3-d]pirimidin-4-il)-1H- pirazol-1-il] propanonitrila, ou de um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, caracterizado pelo fato de que é para preparação de uma composição para tratamento de uma neoplasia mieloproliferativa em um indivíduo em necessidade do mesmo.
12. Uso de PP242 e de (3R)-3-ciclopentil-3-[4-(7H- pirrol[2,3-d] pirimidin-4-il)-1H- pirazol-1-il] propanonitrila, ou de um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, caracterizado pelo fato de que é para preparação de uma composição para tratamento de uma neoplasia mieloproliferativa em um indivíduo em necessidade do mesmo.
13. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende um inibidor de mTOR e um composto de Fórmula (I),
Figure img0011
sendo que o composto de Fórmula (I) é (3R)-3-ciclopentil-3- [4-(7H-pirrol[2,3-d] pirimidin-4-il)-1H-pirazol-1-il]propanonitrila, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo; e sendo que o inibidor de mTOR é everolimus (RAD001) ou 2- (4-amino-1-isopropil-1H-pirazol[3,4-d]pirimidin-3-il)-1H-indol-5-ol (PP242).
14. Composição, de acordo com a reivindicação 13, carac-terizada pelo fato de que compreende ainda um veículo farmaceutica- mente aceitável.
15. Uso da composição, como definida na reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que é para preparação de um medicamento para tratamento de uma neoplasia mieloproliferativa em um indivíduo em necessidade do mesmo.
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