CN112294965B - Mdm2抑制剂的药物组合物及其在预防和/或治疗疾病中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种包含MDM2抑制剂和抗癌剂的药物组合物，所述药物组合物提供了在预防和/或治疗疾病(例如，癌症)的用途。

Description

MDM2抑制剂的药物组合物及其在预防和/或治疗疾病中的 用途

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种含有MDM2抑制剂和抗癌剂的药物组合物及其在预防和/或治疗疾病(例如，癌症)中的用途。

背景技术

MDM2抑制剂干扰MDM2癌蛋白与肿瘤抑制因子p53蛋白的结合，从而起到药物 p53激活剂的作用。不断出现的证据表明，p53功能障碍也会加剧炎症并支持肿瘤免疫逃避，因此，p53功能障碍可作为肿瘤发生的免疫驱动因子(Guo G，Cancer Research，2017； 77(9)：2292)。

MDM2和p53是自调节反馈回路的一部分(Wu等，Genes Dev.7:1126(1993))。MDM2在转录上是由p53和MDM2激活的，进而，通过至少三种机制来抑制p53活性(Wu 等,GenesDev.7:1126(1993))。第一，MDM2蛋白直接结合到p53反式激活结构域，并且因此抑制p53介导的反式激活。第二，MDM2蛋白含有核输出信号序列，并且在结合到 p53时，诱导p53的核输出，从而阻止p53与所靶向的DNA结合。第三，MDM2蛋白是一种E3泛素连接酶并且在结合到p53时，能够促进p53降解。

随着分子生物学的研究进展，分子靶向治疗已成为医药研究(特别是肿瘤研究)的热点，大部分肿瘤的生物学行为并非由单一信号传导通路所支配，而是多个信号传导通路共同起作用。因此，现有技术中存在针对不同靶蛋白和/或不同信号转导通路的联合用药的方案和产品存在需求，所述联合用药的方案和产品能够减少单药剂量、降低单药毒副作用和/ 或以协同作用的方式起作用，实现预防和/或治疗疾病的目的。

发明内容

本发明申请人现已发现，MDM2抑制剂或其可接受的盐、载体、稀释剂或赋形剂和抗癌剂、尤其是与高三尖杉酯碱、去甲基化药物和/或抗代谢药物共同给药可协同治疗癌症。特别地，如本发明实施例1-10中所示，通过联合MDM2抑制剂(例如化合物2)和抗癌剂 (例如地西他滨、阿扎胞苷、阿糖胞苷、曲美替尼、达拉菲尼和曲美替尼的组合、或氟维司琼和阿培利司的组合)能够出乎意料的更加显著地上调P21蛋白、有效诱导P21的蓄积，延迟肿瘤生长，或导致肿瘤消退。

在本发明一个方面中，提供一种药物组合物，所述药物组合物包含MDM2抑制剂和一种或多种抗癌剂及任选的药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

在优选实施方式中，其中所述MDM2抑制剂为下述结构式化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物：

其中：

选自由以下各项组成的组：

B是C_4-7碳环；

R₁是H、取代或未取代的C_1-4烷基、取代或未取代的C_3-8环烷基、取代或未取代的杂环烷基、OR^a或NR^aR^b；

n是0、1或2；

R₂,R₃,R₄,R₅,R₇,R₈,R₉,以及R₁₀独立地选自由H、F、Cl、CH₃、以及CF₃组成的组；

R₆是

R^a是氢或取代或未取代的C_1-4烷基；

R^b是氢或取代或未取代的C_1-4烷基；

R^c和R^d是环B的一个碳原子上的取代基，其中

R^c是H,C_1-3烷基,C_1-3亚烷基-OR^a,OR^a,或卤代；

R^d是H,C_1-3烷基,C_1-3亚烷基-OR^a,OR^a,或卤代；或

R^c和R^d与它们所连接的碳一起形成4元至6元螺环取代基，所述取代基任选地含有氧原子或氮原子；并且

R^e是—C(＝O)OR^a,—C(＝O)NR^aR^b,或—C(＝O)NHSO₂CH₃。

在优选实施方式中，

是

B是

R^c和R^d是F和F、H和H、OH和CH₃、CH₃和CH₃、CH₃和OH、H和OH、CH₂CH₃和CH₂CH₃、以及CH₂OH和CH₂OH。

在优选实施方式中，所述的药物组合物，其中—(CH₂)_nR₁是H,CH₃,或CH₂CH₃。

在优选实施方式中，R₂是H；R₃是卤代；R₄和R₅均是H。

在优选实施方式中，R₇是卤代；R₈,R₉,以及R₁₀中的每一个是H；R^e是—C(═O)OH, —C(═O)NH₂,或—C(═O)NHSO₂CH₃。

在优选实施方式中，所述MDM2抑制剂是化合物1及其药学上可接受的盐或溶剂化物：

在优选实施方式中，所述MDM2抑制剂是化合物2及其药学上可接受的盐或溶剂化物：

在优选实施方式中，抗癌剂选自化疗药，包括高三尖杉酯碱、去甲基化药物和/或抗代谢药物；优选地，所述去甲基化药物包括阿扎胞苷、地西他滨、折布拉林、法扎拉滨或二氢-5’-胞苷；优选地，所述抗代谢药物包括阿糖胞苷、安西他滨、吉西他滨或曲沙他滨。

在优选实施方式中，抗癌剂选自MEK抑制剂；

更优选地，所述MEK抑制剂包括匹马替尼、PD184352、PD0325901、塞鲁米替尼、PD98059、U0126-EtOH、TAK-733、瑞法替尼、GDC-0623、RO4987655、RO5126766 (CH5126766)、SL-327、BI-847325或曲美替尼。

在优选实施方式中，抗癌剂选自以下的一种或多种：BRAF抑制剂、MEK抑制剂、雌激素受体抑制剂、PI3k抑制剂；其中所述BRAF抑制剂选自索拉非尼、PLX-4720、瑞戈非尼(BAY73-4506)、GDC-0879、RAF265、SB590885、AZ 628、ML 7866二盐酸盐、 PF-04880594、TAK-632、CEP-32496、RO5126766或达拉非尼；所述MEK抑制剂选自匹马替尼、PD184352、PD0325901、塞鲁米替尼、PD98059、U0126-EtOH、TAK-733、瑞法替尼、GDC-0623、RO4987655、RO5126766(CH5126766)、SL-327、BI-847325 或曲美替尼；所述雌激素受体抑制剂选自托瑞米芬、柠檬酸托瑞米芬、雌三醇、丙基吡唑三醇、AZD9496、LY88074、GDC-0924外消旋体、CMP8、OSpemifene D4、Bazedoxifene、哌多昔芬盐酸盐、拉索昔芬酒石酸酯、4-羟基他莫昔芬、克罗米芬枸橼酸盐、美曲诺、伊多西芬、4,4-亚氨基二苯酚、H3B-6545、H3B-6545盐酸盐、绞股蓝皂苷SVII、DPN、 Prinaberel、Way-200070、Nitromifene、ERB-196、Elacestrant、LSZ-102、(E/Z)-4-羟基他莫昔芬、二盐酸Elacestrant、GDC-0927、AZD-9833、Endoxifen、LY117018、雌二醇、WAY-204688、他莫昔芬、柠檬酸他莫昔芬或氟维司琼；所述PI3K抑制剂选自伊达拉西布(CAL-101)、科潘立西(BAY80-6946)、布帕利西、AZD6482、GSK1059615、GSK2126458，GSK2636771，PQR309，PF-04691502，AMG319、3-甲基腺嘌呤、ly294002、Wortmannin、槲皮素、α-亚麻酸、Zandelisib、匹克替尼、IPI549、Dactolisib、Fimepinostat、SAR405、Duvelisib、PI-103、GDC-0077、阿培利司；

更优选地，抗癌剂选自以下的一种或多种：达拉非尼、曲美替尼、氟维司琼、阿培利司。

在优选实施方式中，抗癌剂选自以下的一种或多种：达拉非尼、曲美替尼、氟维司琼、阿培利司。

在优选实施方式中，所述MDM2抑制剂是化合物2及其药学上可接受的盐或溶剂化物，其具有下式结构：

所述抗癌剂是阿扎胞苷(Azacitidine)、地西他滨(Decitabine)或阿糖胞苷(Cytarabine)。

在优选实施方式中，所述MDM2抑制剂是化合物2及其药学上可接受的盐或溶剂化物，其具有下式结构：

所述抗癌剂是高三尖杉酯碱(HHT，Homoharringtonine，Omacetaxinemepesuccinate)。

在优选实施方式中，所述MDM2抑制剂是化合物2及其药学上可接受的盐或溶剂化物，其具有下式结构：

所述抗癌剂是选自以下的一种或多种：BRAF抑制剂、MEK抑制剂、雌激素受体抑制剂、PI3k抑制剂；其中，所述BRAF抑制剂选自索拉非尼、PLX-4720、瑞戈非尼(BAY 73-4506)、GDC-0879、RAF265、SB590885、AZ 628、ML 7866二盐酸盐、PF-04880594、 TAK-632、CEP-32496、RO5126766或达拉非尼；所述MEK抑制剂选自匹马替尼、PD184352、 PD0325901、塞鲁米替尼、PD98059、U0126-EtOH、TAK-733、瑞法替尼、GDC-0623、RO4987655、 RO5126766(CH5126766)、SL-327、BI-847325或曲美替尼；所述雌激素受体抑制剂选自托瑞米芬、柠檬酸托瑞米芬、雌三醇、丙基吡唑三醇、AZD9496、LY88074、GDC-0924外消旋体、CMP8、OSpemifene D4、Bazedoxifene、哌多昔芬盐酸盐、拉索昔芬酒石酸酯、 4-羟基他莫昔芬、克罗米芬枸橼酸盐、美曲诺、伊多西芬、4,4-亚氨基二苯酚、H3B-6545、H3B-6545盐酸盐、绞股蓝皂苷SVII、DPN、Prinaberel、Way-200070、Nitromifene、ERB-196、 Elacestrant、LSZ-102、(E/Z)-4-羟基他莫昔芬、二盐酸Elacestrant、GDC-0927、AZD -9833、Endoxifen、LY117018、雌二醇、WAY-204688、他莫昔芬、柠檬酸他莫昔芬或氟维司琼；所述PI3K抑制剂选自伊达拉西布(CAL-101)、科潘立西(BAY80-6946)、布帕利西、AZD6482、GSK1059615、GSK2126458，GSK2636771，PQR309，PF-04691502，AMG319、 3-甲基腺嘌呤、ly294002、Wortmannin、槲皮素、α-亚麻酸、Zandelisib、匹克替尼、 IPI549、Dactolisib、Fimepinostat、SAR405、Duvelisib、PI-103、GDC-0077、阿培利司。

在优选实施方式中，所述MDM2抑制剂是化合物2及其药学上可接受的盐或溶剂化物，其具有下式结构：

所述抗癌剂选自以下的一种或多种：达拉非尼、曲美替尼、氟维司琼、阿培利司；

优选地，抗癌剂为：达拉非尼与曲美替尼的组合，或者氟维司琼与阿培利司的组合；

更优选地，化合物2与抗癌剂达拉非尼、曲美替尼二者的组合或任意之一的重量比为100:1至1:100,包括100:1，95:1，90:1，85:1，80:1，75:1，70:1，65:1，60:1，55:1， 50:1，45:1，40:1，35:1，30:1，25:1，20:1，15:1，10:1，9:1，8:1，7:1，6:1，5:1，4:1， 3:1，2:1，0.8:1，1:1，1.6:1，8:15，1:2，1:3，1:4，1:5，1:6，1:7，1:8，1:9，1:10，1:15， 1:20，1:25，1:30，1:35，1:40，1:45，1:50，1:55，1:60，1:65，1:70，1:75，1:80，1:85， 1:90，1:95或1:100；甚至更优选地，化合物2与达拉非尼、曲美替尼的重量比为(40-60)： (20-40)：(1-3)，优选为50：30：1；

或者化合物2与抗癌剂氟维司琼、阿培利司的二者组合或任意之一的重量比为100:1 至1:100,包括100:1，95:1，90:1，85:1，80:1，75:1，70:1，65:1，60:1，55:1，50:1，45:1，40:1，35:1，30:1，25:1，20:1，15:1，10:1，9:1，8:1，7:1，6:1，5:1，4:1，3:1， 2:1，0.8:1，1:1，1.6:1，8:15，1:2，1:3，1:4，1:5，1:6，1:7，1:8，1:9，1:10，1:15， 1:20，1:25，1:30，1:35，1:40，1:45，1:50，1:55，1:60，1:65，1:70，1:75，1:80，1:85， 1:90，1:95或1:100；甚至更优选地，化合物2与氟维司琼、阿培利司的重量比为(40-60)：(10-30)：(20-40)，优选为50：20：25。

在优选实施方式中，所述药物组合物呈片剂、胶囊剂、颗粒剂、糖浆剂、粉剂、锭剂、药囊、扁囊剂、酏剂、混悬剂、乳剂、溶液、糖浆剂、气雾剂、软膏剂、乳膏剂和注射剂的形式。

在优选实施方式中，所述MDM2抑制剂或所述抗癌剂的重量比(或摩尔比)是100:1至1:100,包括100:1，95:1，90:1，85:1，80:1，75:1，70:1，65:1，60:1，55:1，50:1， 45:1，40:1，35:1，30:1，25:1，20:1，15:1，10:1，9:1，8:1，7:1，6:1，5:1，4:1，3:1， 2:1，0.8:1，1:1，1.6:1，8:15，1:2，1:3，1:4，1:5，1:6，1:7，1:8，1:9，1:10，1:15， 1:20，1:25，1:30，1:35，1:40，1:45，1:50，1:55，1:60，1:65，1:70，1:75，1:80，1:85， 1:90，1:95或1:100。

在本发明另一方面中，提供所述药物组合物在制备用于预防和/或治疗疾病的药物中的用途，所述疾病是癌症。

在本发明另一方面中，提供预防和/或治疗疾病的方法，对有需要的个体施用所述的药物组合物，包括施用预防和/或治疗有效量的所述MDM2抑制剂和抗癌剂，所述疾病是癌症。

在优选实施方式中，所述癌症选自肾上腺皮质癌，晚期癌症，肛门癌，再生障碍性贫血，胆管癌，膀胱癌，骨癌，骨转移，成人脑/中枢神经系统肿瘤，儿童脑/中枢神经系统肿瘤，乳腺癌癌症，男性乳腺癌，儿童癌症，原发癌未知癌症，Castleman病，宫颈癌，结肠/直肠癌，子宫内膜癌，食道癌，Ewing肿瘤家族，眼癌，胆囊癌，胃肠道类癌，胃肠道间质瘤肿瘤(GIST)，妊娠滋养细胞疾病，头颈癌，霍奇金病，卡波西肉瘤，肾癌，喉癌和下咽癌，成人白血病急性淋巴细胞白血病(ALL)，急性髓细胞白血病(AML)，慢性淋巴细胞白血病(CLL)，慢性粒细胞白血病(CML)，慢性粒单核细胞白血病 (CMML)，儿童白血病，肝癌，非小细胞肺癌，小细胞肺癌，肺癌肿瘤，皮肤淋巴瘤，恶性间皮瘤，多发性骨髓瘤，骨髓增生异常综合征(MDS)，鼻腔和鼻窦癌，鼻咽癌，神经母细胞瘤，非霍奇金淋巴瘤，儿童非霍奇金淋巴瘤，口腔和口咽癌，骨肉瘤，卵巢癌癌症，胰腺癌，阴茎癌，垂体瘤，前列腺癌，视网膜母细胞瘤，横纹肌肉瘤，唾液腺癌，成人软组织癌，皮肤癌、诸如基底和鳞状细胞癌、黑色素瘤，小肠癌，胃癌，睾丸癌症，胸腺癌，甲状腺癌，子宫肉瘤，阴道癌，外阴癌，瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症和威尔姆斯肿瘤。

在优选实施方式中，癌症选自急性髓细胞白血病(AML)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、骨髓增生异常综合征(MDS)、黑色素瘤和乳腺癌。

在优选实施方式中，所述MDM2抑制剂或其药学上可接受的盐或溶剂化物以约0.0025-5000mg/日的量给药。例如约0.005、0.05、0.5、5、10、20、30、40、50、100、 150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、 950、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500或5000mg/日的量给药。

在优选实施方式中，将所述MDM2抑制剂或其药学上可接受的盐或溶剂化物以每单位剂量约1ng/kg至约200mg/kg、约1μg/kg至约100mg/kg或者约1mg/kg至约50mg/kg 的量给药，例如以每单位剂量约1μg/kg、约10μg/kg、约25μg/kg、约50μg/kg、约75μg/kg、约100μg/kg、约125μg/kg、约150μg/kg、约175μg/kg、约200μg kg、约225μg/kg、约250μg kg、约275μgkg、约300μg/kg、约325μg kg、约350μg/kg、约375μg/kg、约400μg/kg、约425μg/kg、约450μg/kg、约475μg/kg、约500μg/kg、约525μg kg、约550μg/kg、约575μg kg、约600μg/kg、约625μg/kg、约650μg/kg、约675μg/kg、约700μg/kg、约725μg/kg、约750μg/kg、约775μg/kg、约800μg/kg、约825μg/kg、约850μg/kg、约875μg/kg、约900μg/kg、约925μg/kg、约950μg/kg、约975μg/kg、约1mg/kg、约5mg/kg、约10mg/kg、约15mg/kg、约20mg/kg、约25mg/kg、约30mg/kg、约35mg/kg、约40mg/kg、约45mg/kg、约50mg/kg、约60mg/kg、约70mg/kg、约 80mg/kg、约90mg/kg、约100mg/kg、约125mg/kg、约150mg/kg、约175mg/kg、约 200mg/kg的量给药。

在优选实施方式中，将一种或多种所述抗癌剂或其药学上可接受的盐或溶剂化物以约0.0025-5000mg/日的量给药，包括约0.005、0.05、0.5、5、10、20、30、40、50、100、 150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、 950、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500或5000mg/日的量给药。

在优选实施方式中，将一种或多种所述抗癌剂或其药学上可接受的盐或溶剂化物以每单位剂量约1ng/kg至约200mg/kg、约1μg/kg至约100mg/kg或者约1mg/kg至约 50mg/kg的量给药，例如以每单位剂量约1μg/kg、约10μg/kg、约25μg/kg、约50μg/kg、约75μg/kg、约100μg/kg、约125μg/kg、约150μg/kg、约175μg/kg、约200μg kg、约 225μg/kg、约250μg kg、约275μg kg、约300μg/kg、约325μg kg、约350μg/kg、约 375μg/kg、约400μg/kg、约425μg/kg、约450μg/kg、约475μg/kg、约500μg/kg、约525μg kg、约550μg/kg、约575μg kg、约600μg/kg、约625μg/kg、约650μg/kg、约 675μg/kg、约700μg/kg、约725μg/kg、约750μg/kg、约775μg/kg、约800μg/kg、约 825μg/kg、约850μg/kg、约875μg/kg、约900μg/kg、约925μg/kg、约950μg/kg、约 975μg/kg、约1mg/kg、约5mg/kg、约10mg/kg、约15mg/kg、约20mg/kg、约25mg/kg、约30mg/kg、约35mg/kg、约40mg/kg、约45mg/kg、约50mg/kg、约60mg/kg、约 70mg/kg、约80mg/kg、约90mg/kg、约100mg/kg、约125mg/kg、约150mg/kg、约 175mg/kg、约200mg/kg的量给药。

在优选实施方式中，将所述MDM2抑制剂、一种或多种所述抗癌剂同时、并行或组合给药。

在优选实施方式中，将所述MDM2抑制剂、一种或多种所述抗癌剂连续给药至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少11天、至少12天、至少13天、至少14天、至少15天、至少16天、至少17天、至少18天、至少19天、至少20天、至少21天、至少22天、至少23天、至少24天、至少25天、至少30天、至少35天、至少40天、至少45天或至少50天。

在优选实施方式中，将所述MDM2抑制剂、一种或多种所述抗癌剂连续给药一个或多个疗程，包括1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个疗程，其中每个疗程持续至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少11 天、至少12天、至少13天、至少14天、至少15天、至少16天、至少17天、至少18 天、至少19天、至少20天、至少21天、至少22天、至少23天、至少24天、至少25 天、至少30天、至少35天、至少40天、至少45天或至少50天；并且每两个疗程之间间隔0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10天、两周、三周或四周。

在优选实施方式中，将所述MDM2抑制剂、一种或多种所述抗癌剂以相同(如口服)或不同途径(如分别以口服及肠胃外(如注射))给药，包括口服、口腔、吸入喷雾、舌下、直肠、透皮、阴道粘膜、透黏膜、局部给药，鼻或肠道给药，注射给药，如肌肉注射、皮下注射、髓内注射，以及鞘内、脑部直接给药、原位给药、皮下、腹腔内、静脉注射、关节内滑膜、胸骨、内、肝内、病灶内，颅内、腹腔、鼻腔、或眼内注射或其他药物递送途径。

在本发明另一方面中，提供一种药盒，其包含：

(a)位于第一容器中的第一组分，所述第一组分包含所述MDM2抑制剂和任选的药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂；

(b)位于第二容器中的第二组分，所述第二组分包含所述的一种或多种抗癌剂和任选的药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

附图说明

图1.化合物2单药体外对TP53野生型和突变型AML细胞系的增殖抑制作用图。

图2A.化合物2与地西他滨、阿扎胞苷联合用药对TP53野生型AML细胞系的生长抑制作用图。

图2B.化合物2与阿糖胞苷联合用药对TP53野生型AML细胞系的生长抑制作用图。

图3A-3C.化合物2与曲美替尼联合用药对STK11和KRAS共突变的非小细胞肺癌(NSCLC)细胞系的抗增殖作用图。

图4A-4B.化合物2与曲美替尼联合用药对KRAS野生型且STK11野生型非小细胞肺癌(NSCLC)细胞系NCI-H226和NCI-H292的抗增殖作用图。

图5A.化合物2单药以不同浓度处理MOLM-13细胞后的细胞凋亡示意图。

图5B.为图5A图中化合物2诱导凋亡的流式分析代表图示。

图6.化合物2与地西他滨、阿扎胞苷或阿糖胞苷联合处理MOLM-13细胞后的细胞凋亡示意图。

图7.化合物2单药在TP53野生型AML细胞中以剂量依赖性方式降低S期细胞比例示意图。

图8.化合物2与地西他滨、阿扎胞苷、阿糖胞苷联合处理MOLM-13、OCI-AML-3 及MV-4-11细胞的周期阻滞协同作用图。

图9A.化合物2骨髓中人CD45+AML细胞的流式分析图。

图9B.化合物2脾脏中人CD45+AML细胞的流式分析图。

图9C.化合物2骨髓中人CD45+AML细胞比例汇总分析图。

图9D.化合物2脾脏中人CD45+AML细胞比例汇总分析图。

图10.化合物2单药在两组动物的生存曲线进行分析比较图。

图11A.分组治疗前DMBA诱导大鼠外周血PLT、WBC水平显著下降的MDS表征示意图。

图11B.化合物2单药对MDS大鼠外周血PLT、WBC和RBC水平无显著影响示意图。

图11C.化合物2单药可显著恢复MDS大鼠骨髓PLT、WBCB和RBC水平示意图。

图12.化合物2与阿扎胞苷联用在两组动物的生存曲线进行分析比较图。

图13A-B.化合物2、阿扎胞苷及两者联合用药的抑制肿瘤生长曲线图和小鼠体重变化图。

图14A-B.化合物2、地西他滨及两者联合用药的抑制肿瘤生长曲线图和小鼠体重变化图。

图15.化合物2单一药剂剂量依赖的显著延长荷系统性MOLM-13AML异种移植物瘤小鼠的存活。植入1×10⁷个MOLM-13细胞的NOD SCID小鼠(n＝10/组)在细胞植入后三天用载体、20mg/kg(每隔一天口服，持续21天)、50mg/kg(每日口服，持续7天)或100mg/kg(每日口服持续七天)的化合物2治疗。数据显示为描绘小鼠存活的Kaplan-Meier曲线。使用Bonferroni多重检验的对数秩检验用于存活曲线比较，*P<0.05。

图16.化合物2增强AML异种移植模型中Aza或Dec的体内抗白血病活性。

(A)植入1×10⁷个MOLM-13细胞的NOD SCID小鼠(n＝15/组)在细胞植入后三天用载体、化合物2 50mg/kg(每天PO，持续7天)、Aza 2mg/kg(每日，持续 7天)单独或联合地治疗。数据显示为描绘小鼠存活的Kaplan-Meier曲线。使用 Bonferroni多重比较的对数秩用于存活比较。*P<0.05。

(B)携带皮下OCI-AML-3肿瘤的NOD SCID小鼠用化合物2 50mg/kg(每隔一天PO，持续15天)、Aza 2mg/kg(每天IV，持续7天)、Dec 1mg/kg(每天IV，持续7天)单独或联合地治疗，并测定肿瘤生长抑制(TGI)。

图17.单独或联合使用化合物2和AZA或Ara-C处理的MOLM-13细胞的 RNA-Seq分析。(A-B)图表显示化合物2和AZA或Ara-c单独或联合作用24小时后差异表达基因的数量具有统计学意义。(C-D)化合物2与AZA或Ara-c联合处理后，变化最为显著的信号通路。(E-F)在MOLM-13细胞中，针对化合物2和AZA或Ara-C 单独或联合作用，部分p53调控基因的变化。

图18.化合物2与DEC、AZA、Ara-C联合处理AML细胞，协同诱导DNA损伤，上调P21表达。(A-B)DEC(100nM),AZA(0.33μM)处理24小时后，随后单独或联合应用新的DEC(100nM),AZA(0.33μM)与化合物2(40nM)再处理24小时，蛋白在MOLM-13细胞中的表达。(C)单独或联合应用Ara-C(100nM)或化合物2(40nM) 处理48小时后，MOLM-13细胞中的蛋白表达。(D-F)如图所示化合物2(40nM), RG-7388(40nM),DEC(100nM),AZA(3μM),Ara-C单独或联合处理48小时后， MOLM-13细胞中的蛋白表达。β-actin被用来确认相同加载的蛋白质。(G)所提出的化合物2与DEC、AZA或Ara-C联合作用于AML细胞的作用机制。其结果代表了三个独立的结果。以RG-7388为对照，β-actin被用来确认相同加载的蛋白质。

图19A-B.化合物2与达拉非尼和曲美替尼联合治疗皮下A375皮肤黑色素瘤异种移植瘤(SZ-EF-20-2020)小鼠的肿瘤生长曲线和小鼠的体重变化(％)。

图20A-B.化合物2和氟维司琼和阿培利司联合治疗皮下MCF-7ER⁺乳腺癌异种移植瘤(SZ-EF-04-2020)小鼠的肿瘤生长曲线和小鼠的体重变化(％)。

具体实施方式

除非在下文中另有定义，本文中所用的所有技术术语和科学术语的含义意图与本领域技术人员通常所理解的相同。提及本文中使用的技术意图指在本领域中通常所理解的技术，包括那些对本领域技术人员显而易见的技术的变化或等效技术的替换。虽然相信以下术语对于本领域技术人员很好理解，但仍然阐述以下定义以更好地解释本发明。

本申请中引用的所有参考文献(包括参考文献、授权专利、公开的专利申请和待审查的专利申请)的内容，特此作为参考，明确地包含在本发明中。除非另有规定，本发明中所使用的所有技术和科学术语均符合本领域普通技术人员所熟知的含义。

定义

在本文中所使用的术语“包括”、“包含”、“具有”、“含有”或“涉及”及其在本文中的其它变体形式为包含性的(inclusive)或开放式的，且不排除其它未列举的元素或方法步骤。

在本文中使用的术语“MDM2抑制剂”是指竞争结合MDM2的物质、影响MDM2与 p53蛋白结合的物质、抑制MDM2活性的物质、或降解MDM2的物质或降低MDM2水平的基因工具。

在本文中使用的术语“MDM2相关蛋白质”指的是与MDM2具有至少25％序列同源性并且与p53或p53相关蛋白质相互作用并抑制p53或p53相关蛋白质的蛋白质。MDM2 相关蛋白质的实例包括但不限于MDMX。

在本文中使用的术语“功能性p53”指的是在正常水平、高水平或低水平表达的野生型 p53和p53的突变变体或等位基因变体，这些变体保留野生型p53的活性的至少约5％，例如野生型活性的至少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、或更多。

在本文中使用的术语“p53相关蛋白质”指的是与p53具有至少25％序列同源性，具有肿瘤抑制因子活性，并且通过与MDM2或MDM2相关蛋白质的相互作用而受到抑制的蛋白质。p53相关蛋白质的实例包括但不限于p63和p73。

在本文中使用的术语“药学上可接受的盐”是指游离酸或游离碱的盐，通常通过将游离碱与合适的有机或无机酸反应或者通过将酸与合适的有机或无机碱反应而进行制备。该术语可以用于本发明中的任何化合物。代表性的盐包括：乙酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、碳酸氢盐、硫酸氢盐、酒石酸氢盐、硼酸盐、溴化物、依地酸钙盐、樟脑磺酸盐、碳酸盐、氯化物、克拉维酸盐、柠檬酸盐、二盐酸盐、依地酸盐、乙二磺酸盐、丙酸酯月桂硫酸盐(estolate)、乙磺酸盐(esylate)、富马酸盐、葡庚糖酸盐、葡萄糖酸盐、谷氨酸盐、甘苯砷酸盐(glycollylarsanilate)、己基间苯二酚酸盐(hexylres或cinate)、哈胺盐 (hydrabamine)、氢溴酸盐、盐酸盐、羟萘酸盐、碘化物、羟乙基磺酸盐、乳酸盐、乳糖酸盐、月桂酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、甲溴酸盐、甲硝酸盐、甲硫酸盐、马来酸单钾盐、粘酸盐(Mucate)、萘磺酸盐、硝酸盐、N-甲葡萄糖胺盐、草酸盐、巴莫酸盐(双羟萘酸盐)、棕榈酸盐、泛酸盐、磷酸盐/二磷酸盐、聚半乳糖醛酸盐、钾盐、水杨酸盐、钠盐、硬脂酸盐、次乙酸盐、琥珀酸盐、丹宁酸盐、酒石酸盐、茶氯酸盐、对甲苯磺酸盐、三乙基碘盐(triethiodide)、三甲胺盐和戊酸盐。当酸性取代基存在时，例如-COOH，可以形成铵盐、吗啉盐、钠盐、钾盐、钡盐、钙盐等以供剂型使用。当碱性基团存在时(例如在柠檬苦素类化合物或1，1-二甲基双胍中)，例如氨基或碱性杂芳基如吡啶基，可形成酸性盐，如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐、三氟乙酸盐、三氯乙酸盐、乙酸盐、草酸盐、马来酸盐、丙酮酸盐、丙二酸盐、琥珀酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、富马酸盐、扁桃酸盐、苯甲酸盐、肉桂酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苦味酸盐等。适合的盐的综述参见Stahl及Wermuth的“Handbook of Pharmaceutical Salts:Properties,Selection,and Use”(Wiley-VCH,2002)。

在本文中使用的术语“溶剂化物”是本发明所涉及的化合物与溶剂分子的组合、物理结合、和/或溶剂合，例如二溶剂化物、单溶剂化物、半溶剂化物。本发明涉及的化合物可以以与例如水、甲醇、乙醇等药学上可接受溶剂形成溶剂化形式，其不显著影响化合物的药理学活性或毒性且这样可以作为药理学等价物起作用。

一种类型的溶剂化物为水合物。“水合物”涉及溶剂合物的特定子集，其中溶剂分子为水。溶剂合物通常可以药理学等同物的形式发挥作用。溶剂合物的制备是本领域已知的，参见例如M.Caira等人,J.Pharmaceut.Sci.,93(3):601-611(2004)，其记载用乙酸乙酯和用水制备氟康唑的溶剂合物。溶剂合物、半溶剂合物、水合物等的类似制备描述于vanTonder等人,AAPS Pharm.Sci.Tech.,5(1):Article 12(2004)以及A.L. Bingham等人,Chem.Commun.603-604(2001)中。溶剂合物的代表性、非限制性制备方法涉及将本发明的化合物在期望的溶剂(有机溶剂、水或其混合物)中于高于20℃至约25℃的温度下溶解，然后将溶液以足以形成晶体的速率冷却，并通过已知的方法(例如过滤)分离晶体。可使用分析技术(诸如红外光谱法)确证溶剂存在于溶剂合物的晶体中。

在本文中使用的“药学上可接受的载体”是指与治疗剂一同给药的稀释剂、辅剂、赋形剂或媒介物，并且其在合理的医学判断的范围内适于接触人类和/或其它动物的组织而没有过度的毒性、刺激、过敏反应或与合理的益处/风险比相应的其它问题或并发症。

在本发明的药物组合物或药盒中可使用的药学上可接受的载体包括但不限于无菌液体，例如水和油，包括那些石油、动物、植物或合成来源的油，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当所述药物组合物通过静脉内给药时，水是示例性载体。还可以使用生理盐水和葡萄糖及甘油水溶液作为液体载体，特别是用于注射液。适合的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽糖、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙二醇、水、乙醇等。所述药物组合物还可以视需要包含少量的湿润剂、乳化剂或pH缓冲剂。口服制剂可以包含标准载体，如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。适合的药学上可接受的载体的实例如在Remington’sPharmaceutical Sciences(1990) 中所述。

本发明的药物组合物及药盒中的各组分可以全身性地作用和/或局部地作用。为此目的，它们可以适合的途径给药，例如通过注射(如静脉内、动脉内、皮下、腹膜内、肌内注射，包括滴注)或经皮给药；或通过口服、含服、经鼻、透粘膜、局部、以眼用制剂的形式或通过吸入给药。对于这些给药途径，可以适合的剂型给药本发明的药物组合物及药盒中的各组分。

在本文中使用的术语“容器”为用于容纳药物组分的容器。此容器可用于制备、储存、运输和/或独立/批量销售，其意图涵盖瓶、罐、小瓶、烧瓶、注射器、管(例如用于乳膏制品)，或者用于制备、容纳、储存或分配药物产品的任何其它容器。

在本文使用的术语“预防”是指当用于疾病或病症(例如癌症)时，与未施用化合物或药物(例如，本申请要求保护的药物组合物)的个体相比，所述化合物或药物能降低个体体内的医学病症症状的频率或推迟其发病。

在本文中使用的术语“治疗”是指减轻、缓解或改善疾病或病症的症状，改善潜在的代谢引起的症状，抑制疾病或症状，例如阻止疾病或病症的房展、缓解疾病或病症、引起疾病或病症的消退、缓解疾病或病症引起的病况、或阻止疾病或病症的症状。术语“治疗”还包括复发预防或阶段预防、以及治疗急性或慢性体征、症状和/或功能失调。治疗可以是以症状为导向的，例如以抑制症状。它可以在短时间内实现、在中期内被导向、或者可以是长期治疗，例如在维持治疗的背景下。

在本文中使用的术语“癌症”是指由异常的不受控制的细胞生长引起的新生物或肿瘤。非限制性的例子包括那些在发明详述中所描述的示例性癌症。术语“癌症”包括同时涉及恶化前癌细胞和恶性癌细胞的疾病。

在本文中使用的术语“个体”包括人或非人动物。示例性人个体包括患有疾病(例如本文所述的疾病)的人个体(称为患者)或正常个体。本发明中“非人动物”包括所有脊椎动物，例如非哺乳动物(例如鸟类、两栖动物、爬行动物)和哺乳动物，例如非人灵长类、家畜和/或驯化动物(例如绵羊、犬、猫、奶牛、猪等)。当个体是人类患者(通常体重按 60kg来计算)时，除非另有说明，本发明所述的剂量可采用与实验动物的转换因子(例如，人用剂量＝小鼠剂量/12.3)进行换算得到(请参考Kin Tam.“Estimating the“First in human”dose-a revisit with particular emphasis on oncology drugs,ADMET&DMPK 1(4)(2013)63-75)。本领域的普通技术人员能够根据一般常识，根据个体的具体体重、疾病的种类和严重程度以及其它因素对所述剂量进行合理调整，这些调整的技术方案均落入本发明要求保护的技术方案的范围之内。

在本文中使用的术语“有效量”或“预防和/或治疗有效量”是指施用的药物或化合物的足够量(例如，剂量)，其将在一定程度上减轻被治疗的疾病或病症的一种或多种症状。结果可以是缩小和/或减轻病症或疾病原因或任意其它期望的生物系统的改变。例如，用于治疗用途的“有效量”是提供以使疾病或病症的临床症状显著减轻、而不产生过度的毒副作用的化合物或药物(例如，本申请要求保护的药物组合物)的量。有效量的所述药剂可以减少(即在某种程度上延缓并且优选地阻止)有害的细胞增殖；减少癌细胞数目；减小肿瘤大小；抑制(即在某种程度上延缓并且优选地阻止)癌细胞浸润到外周器官中；抑制 (即在某种程度上延缓并且优选地阻止)肿瘤转移；在某种程度上抑制肿瘤生长；减少 MDM2和MDM2相关蛋白质与p53和p53相关蛋白质的相互作用；和/或在某种程度上将与癌症相关的症状中的一个或多个缓解至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少 60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或100％。就所施用的化合物或组合物阻止生长和/或杀灭现有的癌细胞来说，它可以具有细胞抑制性和/或细胞毒性。

在本文中使用的术语“并行给药”、“组合给药”、“同时给药”以及类似的短语意指向所治疗的受试者并行地施用两种或更多种药剂。“并行地”意指同时或者按照任何顺序在不同的时间点依次施用每一种药剂。然而，如果不同时施用，那么意指它们是按一定的顺序向个体施用并且在时间上是足够接近的以提供所期望的治疗作用并且可以起协同作用。举例来说，本发明MDM2抑制剂(如化合物1和化合物2)可以与抗癌剂同时或按照任何顺序在不同的时间点依次施用。本发明的MDM2抑制剂和抗癌剂可以任何适当的形式并且通过任何合适的途径分开施用。在本发明的MDM2抑制剂和抗癌剂不是被并行施用时，应当了解的是，它们可以按照任何顺序向有需要的受试者施用。举例来说，本发明的MDM2抑制剂可以在施用抗癌剂治疗模式(例如放射治疗)之前(例如之前5分钟、 15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周、或12周)、同时、或之后(例如之后5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、 12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8 周、或12周)向有需要的个体施用。在各种实施方案中，本发明MDM2抑制剂(如化合物1和化合物2)和抗癌剂是相隔1分钟、相隔10分钟、相隔30分钟、相隔少于1小时、相隔1小时、相隔1小时至2小时、相隔2小时至3小时、相隔3小时至4小时、相隔4 小时至5小时、相隔5小时至6小时、相隔6小时至7小时、相隔7小时至8小时、相隔8小时至9小时、相隔9小时至10小时、相隔10小时至11小时、相隔11小时至12 小时、相隔不超过24小时或相隔不超过48小时施用的。在一个实施方案中，联合治疗的组分是相隔1分钟至24小时施用的。

在本文中使用的术语“剂量”是指每千克(kg)个体体重的活性物质的重量(例如，毫克(mg))。

在本文中使用的术语“IC₅₀”是指在测量这样的效应的试验中获得最大效应的50％抑制，例如BCL-2或MDM2的抑制的特定测试化合物或药物的量、浓度或剂量。

在本文使用的术语“室温”是指25℃±1℃。同时，若没有具体指明实验温度，均为室温。

在本文使用的术语“约”是指该术语所修饰的数值的±10％，更优选为±5％，最优选为±2％，因此本领域的普通技术人员能够清楚地根据所修饰的数值确定术语“约”的范围。

术语“C_1-4烷基”指的是任意的含有1－4个碳原子的直链或支链基团，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基等。

术语“C_1-3烷基”指的是任意的含有1－3个碳原子的直链或支链基团，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基等。

术语“C_1-3亚烷基”指的是上述“C_1-3烷基”去除一个氢原子所获得的基团。

在本文中使用的术语“杂环”指的是杂芳基环系和杂环烷基环。术语“C_3-8环烷基”意指含有三个至八个碳原子的单环或双环、饱和或部分不饱和的环系，包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、以及环辛基，所述环系任选地被独立选择的例如卤代、三氟甲基、三氟甲氧基、羟基、烷氧基、硝基、氰基、烷氨基、或氨基中的一个或多个，并且通常一个至三个取代。术语“杂环烷基”意指总共含有4个至12个原子的单环或双环、饱和或部分不饱和的环系，其中所述原子中的一个至五个独立地选自氮、氧、以及硫并且其余原子是碳。杂环烷基的非限制性实例是氮杂环丁基、吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、二氢吡咯基、吗啉基、硫代吗啉基、二氢吡啶基、氧杂环庚基、二氧杂环庚基、硫杂环庚基、二氮杂环庚基，它们各自任选地在环的原子上被独立选择的卤代、C1-6烷基、C1-6 烷氧基、氰基、氨基、氨甲酰基、硝基、羧基、C2-7烯基、C2-7炔基等中的一个或多个，并且通常一个至三个取代。术语“卤素”或“卤代”意指周期系ⅦA族元素和原子，包括氟 (F)、氯(Cl)、溴(Br)、碘(I)、砹(At)、石田(Ts)。

在本文中使用的类似“杂环”、“杂环烷基”、“C_3-8环烷基”和“卤素”等具有本领域通常的含义，且本领域的普通技术人员通过一般知识或参考现有技术(例如WO2015/161032，通过全文引入本发明作为参参考)能够知晓其含义。

药物组合物和药盒

本发明第一方面涉及一种药物组合物，包含MDM2抑制剂和抗癌剂，及任选的药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。所公开的MDM2抑制剂抑制p53或p53相关蛋白与 MDM2或MDM2相关蛋白之间的相互作用。通过抑制MDM2或MDM2相关蛋白对p53 或p53相关蛋白的负面影响，本发明MDM2抑制剂使细胞敏感以诱导细胞凋亡和/或细胞周期阻滞。

在优选实施方式，所述MDM2抑制剂为下述结构式化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物：

其中：

选自由以下各项组成的组：

B是C_4-7碳环；

R₁是H、取代或未取代的C_1-4烷基、取代或未取代的C_3-8环烷基、取代或未取代的杂环烷基、OR^a或NR^aR^b；

n是0、1或2；

R₂,R₃,R₄,R₅,R₇,R₈,R₉,以及R₁₀独立地选自由H、F、Cl、CH₃、以及CF₃组成的组；

R₆是

R^a是氢或取代或未取代的C_1-4烷基；

R^b是氢或取代或未取代的C_1-4烷基；

R^c和R^d是环B的一个碳原子上的取代基，其中

R^c是H,C_1-3烷基,C_1-3亚烷基-OR^a,OR^a,或卤代；

R^d是H,C_1-3烷基,C_1-3亚烷基-OR^a,OR^a,或卤代；或

R^c和R^d与它们所连接的碳一起形成4元至6元螺环取代基，所述取代基任选地含有氧原子或氮原子；并且

R^e是—C(＝O)OR^a,—C(＝O)NR^aR^b,或—C(＝O)NHSO₂CH₃。

在优选实施方式中，其中

是

B是

R^c和R^d是F和F、H和H、OH和CH₃、CH₃和CH₃、CH₃和OH、H和OH、CH₂CH₃和CH₂CH₃、以及CH₂OH和CH₂OH。

在优选实施方式中，—(CH₂)_nR₁是H,CH₃,或CH₂CH₃。

在优选实施方式中，R₂是H。

在优选实施方式中，R₃是卤代。

在优选实施方式中，R₄和R₅均是H。

在优选实施方式中，R₇是卤代。

在优选实施方式中，R₈,R₉,以及R₁₀中的每一个是H。

在优选实施方式中，R^e是—C(═O)OH,—C(═O)NH₂或—C(═O)NHSO₂CH₃。

在优选实施方式中，R_c和R_d连同环B一起形成

在优选实施方式中，R₆是：

在优选实施方式中，MDM2抑制剂选自：

在优选实施方式中，MDM2抑制剂是化合物1及其药学上可接受的盐或溶剂化物：

在优选实施方式中，MDM2抑制剂是化合物2及其药学上可接受的盐或溶剂化物：

在优选实施方式中，抗癌剂选自化疗药，包括高三尖杉酯碱、去甲基化药物和/或抗代谢药物；优选地，所述去甲基化药物包括阿扎胞苷、地西他滨、折布拉林、法扎拉滨或二氢-5’-胞苷；优选地，所述抗代谢药物包括阿糖胞苷、安西他滨、吉西他滨或曲沙他滨。

在优选实施方式中，所述MDM2抑制剂是化合物2及其药学上可接受的盐或溶剂化物，其具有下式结构：

所述抗癌剂是阿扎胞苷、地西他滨和/或阿糖胞苷，结构如下：

阿扎胞苷(Azacitidine)，CAS号：320-67-2，

地西他滨(Decitabine)，CAS号：2353-33-5，

阿糖胞苷(Cytarabine)，CAS号：147-94-4，

达拉非尼(dabrafenib)、曲美替尼(trametinib)、氟维司琼(fulvestrant)和阿培利司(alpelisib)。

在优选实施方式中，所述MDM2抑制剂是化合物2及其药学上可接受的盐或溶剂化物，其具有下式结构：

所述抗癌剂是高三尖杉酯碱(HHT，Homoharringtonine，Omacetaxinemepesuccinate，HHRT)，CAS号：26833-87-4，结构如下：

本发明所用的高三尖杉酯碱、阿扎胞苷、地西他滨和/或阿糖胞苷均为市购，可在Selleck 官网购买。

在优选实施方式中，药物组合物或所述MDM2抑制剂或所述抗癌剂呈片剂、胶囊剂、颗粒剂、糖浆剂、粉剂、锭剂、药囊、扁囊剂、酏剂、混悬剂、乳剂、溶液、糖浆剂、气雾剂、软膏剂、乳膏剂和注射剂的形式。

在优选实施方式中，所述MDM2抑制剂和抗癌剂各自呈单独的制剂形式。

本发明所提供的药盒，其包含：

(a)位于第一容器中的第一组分，所述第一组分包含所述MDM2抑制剂和任选的药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂，所述MDM2抑制剂优选为本发明第一方面所具体描述的化合物及其药学上可接受的盐或溶剂化物，例如化合物1和化合物2。

(b)位于第二容器中的第二组分，所述第二组分包含所述的一种或多种抗癌剂和任选的药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂，所述抗癌剂优选为本发明第一方面所具体描述的高三尖杉酯碱、去甲基化药物和/或抗代谢药物，例如阿扎胞苷、地西他滨和/或阿糖胞苷。

用途和治疗方法

本发明第二方面涉及所述药物组合物在制备用于预防和/或治疗疾病的药物中的用途，所述疾病是癌症。

在优选实施方式中，所述药物组合物包含MDM2抑制剂和抗癌剂，及任选的药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。MDM2抑制剂优选为本发明第一方面所具体描述的化合物及其药学上可接受的盐或溶剂化物，例如化合物1和化合物2。抗癌剂优选为本发明第一方面所具体描述的高三尖杉酯碱、去甲基化药物和/或抗代谢药物，例如阿扎胞苷、地西他滨和/或阿糖胞苷。

在优选实施方式中，所述癌症选自肾上腺皮质癌，晚期癌症，肛门癌，再生障碍性贫血，胆管癌，膀胱癌，骨癌，骨转移，成人脑/中枢神经系统肿瘤，儿童脑/中枢神经系统肿瘤，乳腺癌癌症，男性乳腺癌，儿童癌症，原发癌未知癌症，Castleman病，宫颈癌，结肠/直肠癌，子宫内膜癌，食道癌，Ewing肿瘤家族，眼癌，胆囊癌，胃肠道类癌，胃肠道间质瘤肿瘤(GIST)，妊娠滋养细胞疾病，头颈癌，霍奇金病，卡波西肉瘤，肾癌，喉癌和下咽癌，成人白血病急性淋巴细胞白血病(ALL)，急性髓细胞白血病(AML)，慢性淋巴细胞白血病(CLL)，慢性粒细胞白血病(CML)，慢性粒单核细胞白血病 (CMML)，儿童白血病，肝癌，非小细胞肺癌，小细胞肺癌，肺癌肿瘤，皮肤淋巴瘤，恶性间皮瘤，多发性骨髓瘤，骨髓增生异常综合征(MDS)，鼻腔和鼻窦癌，鼻咽癌，神经母细胞瘤，非霍奇金淋巴瘤，儿童非霍奇金淋巴瘤，口腔和口咽癌，骨肉瘤，卵巢癌癌症，胰腺癌，阴茎癌，垂体瘤，前列腺癌，视网膜母细胞瘤，横纹肌肉瘤，唾液腺癌，成人软组织癌，皮肤癌、诸如基底和鳞状细胞癌、黑色素瘤，小肠癌，胃癌，睾丸癌症，胸腺癌，甲状腺癌，子宫肉瘤，阴道癌，外阴癌，瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症和威尔姆斯肿瘤。

在更优选实施方式中，癌症选自急性髓细胞白血病(AML)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、骨髓增生异常综合征(MDS)、黑色素瘤和乳腺癌。

另外，本发明涉及化合物2单药及联合阿扎胞苷或阿糖胞苷在制备用于治疗成人复发或难治性急性髓性白血病和复发或难治性高危/极高危骨髓增生异常综合征的药物中的用途。

再另外，本发明涉及化合物2在制备用于治疗骨髓增生异常综合征(MDS)的药物中的用途：

或者，本发明涉及化合物2与达拉非尼、曲美替尼的组合在制备用于治疗黑色素瘤的药物中的用途；优选地，化合物2与达拉非尼、曲美替尼的重量比为50：30：1。

再或者，本发明涉及化合物2与氟维司琼、阿培利司的组合在制备用于治疗乳腺癌的药物中的用途；优选地，化合物2与氟维司琼、阿培利司的重量比为50：20：25。

本发明第三方面涉及一种预防和/或治疗疾病的方法，对有需要的个体施用所述的药物组合物，包括施用预防和/或治疗有效量的所述MDM2抑制剂和抗癌剂，所述疾病是癌症。

在优选实施方式中，所述药物组合物包含MDM2抑制剂和抗癌剂，及任选的药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。MDM2抑制剂优选为本发明第一方面所具体描述的化合物及其药学上可接受的盐或溶剂化物，例如化合物2。抗癌剂优选为本发明第一方面所具体描述的高三尖杉酯碱、去甲基化药物和/或抗代谢药物，例如阿扎胞苷、地西他滨和/ 或阿糖胞苷。例如施用化合物2和阿扎胞苷，化合物2和地西他滨，化合物2和阿糖胞苷。

在优选实施方式中，所述癌症选自肾上腺皮质癌，晚期癌症，肛门癌，再生障碍性贫血，胆管癌，膀胱癌，骨癌，骨转移，成人脑/中枢神经系统肿瘤，儿童脑/中枢神经系统肿瘤，乳腺癌癌症，男性乳腺癌，儿童癌症，原发癌未知癌症，Castleman病，宫颈癌，结肠/直肠癌，子宫内膜癌，食道癌，Ewing肿瘤家族，眼癌，胆囊癌，胃肠道类癌，胃肠道间质瘤肿瘤(GIST)，妊娠滋养细胞疾病，头颈癌，霍奇金病，卡波西肉瘤，肾癌，喉癌和下咽癌，成人白血病急性淋巴细胞(ALL)，白血病-急性髓细胞白血病(AML)，慢性淋巴细胞白血病(CLL)，白血病-慢性粒细胞白血病(CML)，白血病-慢性粒单核细胞白血病(CMML)，儿童白血病，肝癌，肺癌-非小细胞，肺癌-小细胞，肺癌肿瘤，皮肤淋巴瘤，恶性间皮瘤，多发性骨髓瘤，骨髓增生异常综合征(MDS)，鼻腔和鼻窦癌，鼻咽癌，神经母细胞瘤，非霍奇金淋巴瘤，儿童非霍奇金淋巴瘤，口腔和口咽癌，骨肉瘤，卵巢癌癌症，胰腺癌，阴茎癌，垂体瘤，前列腺癌，视网膜母细胞瘤，横纹肌肉瘤，唾液腺癌，成人软组织癌，皮肤癌、诸如基底和鳞状细胞癌、黑色素瘤，小肠癌，胃癌，睾丸癌症，胸腺癌，甲状腺癌，子宫肉瘤，阴道癌，外阴癌，瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症和威尔姆斯肿瘤。

在更优选实施方式中，癌症选自急性髓细胞白血病(AML)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、骨髓增生异常综合征(MDS)、黑色素瘤和乳腺癌。

在优选实施方式中，将所述MDM2抑制剂或其药学上可接受的盐或溶剂化物以约0.0025-5000mg/日的量给药。例如约0.005、0.05、0.5、5、10、20、30、40、50、100、 150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、 950、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500或5000mg/日的量给药，以及各量之间的范围，例如1mg-2000mg、1mg-1000mg、30mg-900mg、30mg-800mg、 30mg-900mg、30mg-800mg、30mg-700mg、30mg-600mg、30mg-500mg、30mg-490mg、 30mg-487mg等。

在优选实施方式中，将所述MDM2抑制剂或其药学上可接受的盐或溶剂化物以每单位剂量约1ng/kg至约200mg/kg、约1μg/kg至约100mg/kg或者约1mg/kg至约50mg/kg 的量给药，例如以每单位剂量约1μg/kg、约10μg/kg、约25μg/kg、约50μg/kg、约75μg/kg、约100μg/kg、约125μg/kg、约150μg/kg、约175μg/kg、约200μg kg、约225μg/kg、约250μg kg、约275μgkg、约300μg/kg、约325μg kg、约350μg/kg、约375μg/kg、约400μg/kg、约425μg/kg、约450μg/kg、约475μg/kg、约500μg/kg、约525μg kg、约550μg/kg、约575μg kg、约600μg/kg、约625μg/kg、约650μg/kg、约675μg/kg、约700μg/kg、约725μg/kg、约750μg/kg、约775μg/kg、约800μg/kg、约825μg/kg、约850μg/kg、约875μg/kg、约900μg/kg、约925μg/kg、约950μg/kg、约975μg/kg、约1mg/kg、约5mg/kg、约10mg/kg、约15mg/kg、约20mg/kg、约25mg/kg、约30mg/kg、约35mg/kg、约40mg/kg、约45mg/kg、约50mg/kg、约60mg/kg、约70mg/kg、约 80mg/kg、约90mg/kg、约100mg/kg、约125mg/kg、约150mg/kg、约175mg/kg、约 200mg/kg的量给药。例如，将化合物2或其药学上可接受的盐或溶剂化物以每单位剂量约20mg/kg、30mg/kg、50mg/kg、80mg/kg的量向个体给药。

在优选实施方式中，将一种或多种所述抗癌剂或其药学上可接受的盐或溶剂化物以约0.0025-5000mg/日的量给药，包括约0.005、0.05、0.5、5、10、20、30、40、50、100、 150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、 950、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500或5000mg/日的量给药。以及各量之间的范围，例如1mg-2000mg、1mg-1000mg、30mg-900mg、30mg-800mg、 30mg-900mg、30mg-800mg、30mg-700mg、30mg-600mg、30mg-500mg、30mg-490mg、 30mg-487mg等。

在优选实施方式中，将一种或多种所述抗癌剂或其药学上可接受的盐或溶剂化物以每单位剂量约1ng/kg至约200mg/kg、约1μg/kg至约100mg/kg或者约1mg/kg至约 50mg/kg的量给药，例如以每单位剂量约1μg/kg、约10μg/kg、约25μg/kg、约50μg/kg、约75μg/kg、约100μg/kg、约125μg/kg、约150μg/kg、约175μg/kg、约200μg kg、约 225μg/kg、约250μg kg、约275μg kg、约300μg/kg、约325μg kg、约350μg/kg、约 375μg/kg、约400μg/kg、约425μg/kg、约450μg/kg、约475μg/kg、约500μg/kg、约 525μg kg、约550μg/kg、约575μg kg、约600μg/kg、约625μg/kg、约650μg/kg、约 675μg/kg、约700μg/kg、约725μg/kg、约750μg/kg、约775μg/kg、约800μg/kg、约 825μg/kg、约850μg/kg、约875μg/kg、约900μg/kg、约925μg/kg、约950μg/kg、约 975μg/kg、约1mg/kg、约5mg/kg、约10mg/kg、约15mg/kg、约20mg/kg、约25mg/kg、约30mg/kg、约35mg/kg、约40mg/kg、约45mg/kg、约50mg/kg、约60mg/kg、约 70mg/kg、约80mg/kg、约90mg/kg、约100mg/kg、约125mg/kg、约150mg/kg、约 175mg/kg、约200mg/kg的量给药。例如将阿扎胞苷或其药学上可接受的盐或溶剂化物以每单位剂量约1.5mg/kg、2mg/kg、5mg/kg给药。例如将地西他滨或其药学上可接受的盐或溶剂化物以每单位剂量约1mg/kg、2mg/kg给药。

在优选实施方式中，将所述MDM2抑制剂(如化合物2)、一种或多种所述抗癌剂同时、并行或组合给药。

在更优选实施方式中，所述MDM2抑制剂和所述抗癌剂先后施用的时间间隔可为约1分钟、约5分钟、约10分钟、约15分钟、约30分钟、约45分钟、约1小时、约 2小时、约4小时、约6小时、约12小时、约24小时、约48小时、约72小时、约 96小时、约1周、约2周、约3周、约4周、约5周、约6周、约8周、或约12周。

在优选实施方式中，将包含所述MDM2抑制剂(如化合物2)、一种或多种所述抗癌剂(如阿扎胞苷、地西他滨、阿糖胞苷)的药物组合物作为整体剂量单元施用，每天施用包括但不限于：1次、2次、3次、4次、5次或6次。

在优选实施方式中，将所述MDM2抑制剂(如化合物2)、一种或多种所述抗癌剂 (如阿扎胞苷、地西他滨、阿糖胞苷)各自呈单独的剂量单元施用，每天施用包括但不限于：1次、2次、3次、4次、5次或6次。

在优选实施方式中，将所述MDM2抑制剂(如化合物2)、一种或多种所述抗癌剂 (如阿扎胞苷、地西他滨、阿糖胞苷)连续给药至少3天、至少4天、至少5天、至少6 天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少11天、至少12天、至少13天、至少14天、至少15天、至少16天、至少17天、至少18天、至少19天、至少20天、至少21天、至少22天、至少23天、至少24天、至少25天、至少30天、至少35天、至少40天、至少45天或至少50天。

在优选实施方式中，将所述MDM2抑制剂(如化合物2)、一种或多种所述抗癌剂 (如阿扎胞苷、地西他滨、阿糖胞苷)连续给药一个或多个疗程，包括1、2、3、4、5、 6、7、8、9或10个疗程，其中每个疗程持续至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少11天、至少12天、至少13天、至少14天、至少15天、至少16天、至少17天、至少18天、至少19天、至少20天、至少21天、至少22天、至少23天、至少24天、至少25天、至少30天、至少35天、至少40天、至少45天或至少50天；并且每两个疗程之间间隔0、1、2、3、4、5、6、7、 8、9、10天、两周、三周或四周。

在优选实施方式中，将所述MDM2抑制剂(如化合物2)、一种或多种所述抗癌剂 (如阿扎胞苷、地西他滨、阿糖胞苷)以相同(如口服)或不同途径(如分别以口服及肠胃外(如注射))给药，包括口服、口腔、吸入喷雾、舌下、直肠、透皮、阴道粘膜、透黏膜、局部给药，鼻或肠道给药，注射给药，如肌肉注射、皮下注射、髓内注射，以及鞘内、脑部直接给药、原位给药、皮下、腹腔内、静脉注射、关节内滑膜、胸骨、内、肝内、病灶内，颅内、腹腔、鼻腔、或眼内注射或其他药物递送途径。

另外，本发明涉及治疗成人复发或难治性急性髓性白血病和复发或难治性高危/极高危骨髓增生异常综合征的方法，包括施用化合物2单药及联合阿扎胞苷或阿糖胞苷。

在优选实施方式中，给药方法为：

化合物2按照标准3+3方案进行剂量递增，起始剂量为150mg，依次递增至200mg、250mg、300mg，每日口服一次，每周期从第1天开始使用，连续服用7天后休息21 天，每28天为一个给药周期；

当第一阶段化合物2单药剂量递增结束后，可进入第二阶段，即化合物2联合用药剂量递增；联合用药方案中化合物2的剂量从100mg开始，依次递增至150mg、 200mg；阿扎胞苷为固定剂量，75mg/m²皮下注射，每日一次，每周期从第1天开始使用，连续7天后休息21天，每28天为一个给药周期；阿糖胞苷为固定剂量，1g/m²静脉注射，静脉输注时间不少于4小时，每日一次，每周期从第3天开始使用，连续 5天后休息21天，每28天为一个给药周期。

在优选实施方式中，阿扎胞苷或阿糖胞苷均于化合物2口服4小时后给药；两药联合治疗后进入休息期。

另外，本发明涉及预防和/或治疗疾病的方法，对有需要的个体施用化合物2，包括施用预防和/或治疗有效量的所述化合物2，其中所述疾病是骨髓增生异常综合征(MDS)：

或者，本发明涉及治疗黑色素瘤的方法，包括施用化合物2与达拉非尼、曲美替尼的组合；优选地，化合物2与达拉非尼、曲美替尼的重量比为50：30：1。

再或者，本发明涉及治疗乳腺癌的方法，包括施用化合物2与氟维司琼、阿培利司的组合；优选地，化合物2与氟维司琼、阿培利司的重量比为50：20：25。

实施例

为了使本发明的目的和技术方案更加清楚，以下结合具体实施例进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。并且，下列实施例中未提及的具体实验方法，均按照常规实验方法进行。

数据分析

绘制肿瘤生长曲线，其中X轴显示观察时间，Y轴显示相应肿瘤体积(几何平均值)。三组或多组间比较用one-way ANOVA。如果F值有显著性差异，应在ANOVA分析之后再进行多重比较。用SPSS 18.0进行所有数据分析。Prism第6版用于图形绘制。赛默飞世尔科技的Attune NxT流式细胞仪用于分析肿瘤浸润淋巴细胞。数据采集和分析采用 AnalystSoftware 1.6.3工作站(AB sciex，安大略，加拿大)。对于MOLM-13全身性模型，最后一只小鼠死亡的日期用于分析中位总存活期和生成Kaplan-Meier曲线。使用对数秩检验和Bonferroni多重检验比较不同治疗组的存活曲线。

(CTG)细胞增殖实验

通过

(CTG)实验检测抗增殖作用。细胞接种于96孔板中，并以不同浓度受试物处理24-72小时。通常，选择受试物9个系列剂量，5μl/孔加到96孔板。对于联合实验，2个受试物的终体积为5μl/孔。每个测试剂量做3复孔。在同一培养板上选3-6孔加入100μl稀释液作为对照组，另设3-6孔作为空白对照。除空白对照孔外，每孔加入95μl细胞悬液(含有合适细胞数，以确保需要检测时细胞对照组的细胞刚好铺满孔底面)到相同96孔板。培养板于37℃，CO₂培养箱中培养24-72小时。培养结束时， 96孔板和CellTiter-Glo试剂于室温平衡30分钟，每孔加入100μL CellTiter-Glo试剂。在摇床上混匀2分钟，室温放置10分钟后用Biotek synergy HIMF酶标仪读取荧光值。使用3复孔平均荧光值，通过下列公式计算细胞存活率百分比：

细胞存活率(％)＝(测试孔荧光值-阴性对照孔)/(溶剂对照组荧光值-阴性对照组) ×100％

使用Graphpad Prism 6.0软件(Golden software,Golden,ColORado,USA)的非线性回归数据分析方法计算IC₅₀。

对于联合实验，通过单药对照的3个复孔平均荧光值归一化处理后计算细胞存活率。通过联合曲线与单药曲线的IC50进行比较以通过观察联合用药组曲线左移是否左移来确定2个化合物的协同作用。对细胞水平联合用药实验，采用CalcuSyn程序计算联合指数(combination index,CI)，对结果进一步分析(Chou,T.C.(2010).Drug combinationstudies and their synergy quantification using the Chou-Talalay method.Cancerresearch 70,440-446)。两药联合的CI值<0.9，表示两药联合具有协同作用；CI值＝0.9，表示两药联合具有相加作用；CI值>0.9，大于0.9表示两药联合具有拮抗作用。

体内药效实验评估方法

动物接种肿瘤细胞后，每天监测动物的健康及死亡情况，例行检查包括观察肿瘤生长和药物治疗对动物日常行为表现的影响，如行为活动、摄食摄水量、体重变化(每周测量两次体重)，外观体征或其它不正常情况。基于各组动物数量记录组内动物死亡数和副作用。所有过程包括给药以及肿瘤和体重测量均在超净工作台中进行。

细胞接种法建立人肿瘤免疫缺陷小鼠皮下异种移植瘤模型(请参考Gould SE etal. Translational value of mouse models in oncology drug development.Naturemedicine.2015 21,431-439.和Souers AJ et al.ABT-199,a potent and selectiveBCL-2inhibit或,achieves antitum或activity while sparing platelets.Naturemedicine.2012 19.202-208)：收集对数生长期的肿瘤细胞，计数后重悬于1×PBS，调整细胞悬液浓度至2.5-5×10⁷/mL。用1mL 注射器(4号针头)在免疫缺陷小鼠右侧背部皮下接种肿瘤细胞，5-10×10⁶/0.2mL/鼠(实验动物购自北京维通利华实验动物技术有限公司SCXK(京)2016-0006)。所有动物实验操作严格遵守吉玛基因股份有限公司和苏州亚盛药业有限公司实验动物使用和管理规范。相关参数的计算参考中国CFDA《细胞毒类抗肿瘤药物非临床研究技术指导原则》。

在雌性NOD SCID小鼠中产生全身性和皮下AML异种移植模型。所有动物实验均在GenePharma(中国苏州)的动物设施中进行。

对于全身性AML模型，用环磷酰胺(150mg/kg，腹膜内)预处理六至八周龄的雌性NOD SCID小鼠连续两天。然后通过静脉内接种1×10⁷个细胞到尾静脉中建立 MOLM-13全身性AML异种移植模型。

对于皮下模型，将OCI-AML-3细胞(1×10⁶)皮下注射到6-8周龄的小鼠的右侧腹中。在细胞接种后大约10天，基于达到约100-150mm³的平均肿瘤体积的原发肿瘤大小将小鼠随机分组。

实验期间每周测定两次动物体重和肿瘤大小。每天观察动物的状态以及有无死亡等情况发生。常规监测包括了肿瘤生长及治疗对动物正常行为的影响，具体内容有实验动物的活动性、摄食和饮水情况、体重增加或降低情况、眼睛、被毛及其它异常情况。实验过程中观察到的死亡和临床症状均记录在原始数据中。整个给药、小鼠体重及肿瘤体积的测量操作均在超净工作台中进行。根据实验方案要求，末次给药结束后，收集血浆和肿瘤组织，称重并拍照记录。血浆和肿瘤样本-80℃冻存备用。

每周两次用游标卡尺测量肿瘤直径。肿瘤体积(Tum或volume，TV)的计算公式为：TV＝a×b²/2。其中a、b分别代表肿瘤测量长和宽。相对肿瘤体积(relative tum或 volume，RTV)计算公式为：RTV＝V_t/V₁。其中V₁为分组给药时的肿瘤体积，V_t为给药后某天测量时的肿瘤体积。

抗肿瘤活性的评价指标为相对肿瘤增殖率T/C(％)，计算公式分别为：相对肿瘤增殖率T/C(％)＝(T_RTV/C_RTV)×100％，T_RTV为治疗组RTV，C_RTV为溶媒(vehicle) 对照组RTV；肿瘤缓解率(％)为治疗后荷瘤小鼠出现SD(疾病稳定)、PR(肿瘤部分消退)及CR(肿瘤完全消退)的数目除以本组小鼠总数×100％。

动物体重变化(Change of body weight，％)＝(测量体重-分组时体重)/分组时体重×100％。

疗效评价标准：根据中国CFDA《细胞毒类抗肿瘤药物非临床研究技术指导原则》(2006年11月)，T/C(％)值≤40％并经统计学分析p<0.05为有效。若小鼠的体重下降超过20％或药物相关的死亡数超过20％，则认为该药物剂量具有严重毒性，表示为过量毒性剂量。T/C百分比值是抗肿瘤有效性的指示：T/C<42％的值NCI认定是显著抗肿瘤活性。T/C值<10％认定为高度显著的抗肿瘤活性，并且如果满足毒性和某些其他要求 (称为DN-2水平活性)，则NCI将其作为临床试验的合理性证明。

协同性分析采用以下公式(请参考Gould SE et al.Translational value ofmouse models in oncology drug development.Nature medicine.2015 21,431-439.)：协同因子＝((A/C)× (B/C))/(AB/C)；A＝A药单药组的RTV值；B＝B药单药组的RTV值；C＝溶媒对照组的 RTV值，AB＝AB联合用药组的RTV值(Clarke R.Issues in experimentaldesign and endpoint analysis in the study of experimental cytotoxic agents invivo in breast cancer and other models[J].Breast Cancer Research&Treatment,1997,46(2-3):255-278)。若协同因子>1，则具有协同作用；若协同因子＝1，则具有相加作用；若协同因子<1，则具有拮抗作用。

实施例1.化合物2的制备

MDM2抑制剂化合物2根据美国专利No.9745314、WO2015/161032及Aguilar et al.J.Med.Chem.2017(60)2819-2839文章中所示一步或多步法制成。

实施例2.化合物2单药或联合用药对人源AML癌细胞系的抗增殖作用

2.1.化合物2单药对人源AML癌细胞系的抗增殖作用

参照前述“

(CTG)细胞增殖实验”。在CTG实验中，检测化合物2 单药对三种TP53野生型的AML(急性髓细胞白血病)细胞MOLM-13、MV-4-11和 OCI-AML-3，及两种TP53突变型的AML细胞系HL-60和SKM-1体外增殖的抑制作用。其中，MOLM-13和MV-4-11细胞系均为TP53野生型且FLT3-ITD突变的AML细胞系，OCI-AML-3细胞系是TP53野生型不携带FLT3-ITD突变的AML细胞系。MV-4-11 细胞系来自

CRL-9591TM,biphenotypic Bmyelomonocytic leukemia(双表型B 骨髓单核细胞白血病)，HL-60细胞系来自

CCL-240^TM,acute promyelocytic leukemia(急性早幼粒细胞白血病)，MOLM-13细胞系来自北纳生物资源编号： BNCC340568人急性髓系白血病细胞。OCI-AML-3细胞系购自Cobioer(中国南京)。 SKM-1购自Japanese Collection of Research Bioresources Cell Bank(JCRB)。急性髓细胞白血病细胞系在含有10％胎牛血清(AUSGENEX，Cat#FBSSA500-S)的RPMI 1640培养基(Gibco，Cat#C11875500BT)中培养，MV-4-11除外，其在IMDM培养基(Gibco，Cat#C12440500BT)中培养。所有细胞系都经过遗传鉴定并且没有微生物污染。除非特殊说明，CTG实验中一般采用药物处理细胞72小时。如图1所示，为了研究化合物2单药体外对TP53野生型和突变型AML细胞系的增殖抑制作用，用递增剂量的化合物2单药处理MOLM-13、MV-4-11、OCI-AML-3、HL-60和SKM-1细胞。 72小时后，CTG法测量细胞存活，并使用GraphPad Prism 6绘制生长抑制曲线。细胞存活百分比以Mean±SEM表示，n＝2或3。

研究结果表明，在测试的上述五个AML细胞系中，TP53野生型的细胞系对化合物 2药物作用敏感，TP53突变型的细胞系对化合物2作用不敏感。具体地，如表1所示，化合物2在TP53野生型的MOML-13、MV-4-11及OCI-AML-3细胞系中的IC50值分别为26.8±4.9nM、165.9±42.4nM和315.6±97nM。其中，对化合物2单药最为敏感的细胞系为TP53野生型且FLT3-ITD突变的AML细胞系MOLM-13和MV-4-11。其次，对化合物2单药较为敏感的是TP53野生型不携带FLT3-ITD突变的OCI-AML-3细胞系。相比较而言，化合物2在TP53突变的细胞系中的抗增殖作用效果微弱，在HL-60和 SKM-1细胞系中的IC50值分别为2558.3±581.5nM和8947.3±569.6nM。

表1.化合物2在携带不同遗传突变AML细胞系的IC50值(nM)

注：wt，wild-type，野生型；mut，mutant，突变型；Del，deletion，缺失

2.2.化合物2联合用药对人源AML癌细胞系的抗增殖作用

图2A和图2B所示化合物2与地西他滨(Decitabine)、阿扎胞苷(Azacitidine)、或阿糖胞苷(Cytarabine,Ara-C)联合用药对TP53野生型AML细胞系的生长抑制作用。用梯度浓度的化合物2、地西他滨、阿扎胞苷、阿糖胞苷单药或联合用药处理AML细胞 3天，通过CellTiter-Glo发光法检测细胞生长抑制活性。细胞存活百分比以Mean±SEM 表示，n＝3。

结果显示，当化合物2与去甲基化药物，包括地西他滨(Decitabine,Dec)和阿扎胞苷(Azacitidine,Aza)及阿糖胞苷(Cytarabine,Ara-C)联用时，均发现上述联合用药具有增强的抗增殖作用。

由图2A可见具体CI值及化合物2与去甲基化药物地西他滨和阿扎胞苷联合用药的原始量效生长抑制曲线。由图2B可见具体CI值及化合物2与阿糖胞苷联合用药的原始量效生长抑制曲线。化合物2联合地西他滨的联合用药反应曲线左移，联合指数(CI值) 小于0.9，显示地西他滨两药联合具有协同作用。

由此可见，体外实验中，化合物2不仅作为单药在TP53野生型AML细胞系，尤其在TP53野生型且FLT3-ITD突变的AML细胞系中具有显著的抗AML细胞增殖的作用，而且突出的是，化合物2联合其它治疗药物，包括去甲基化药物(地西他滨和阿扎胞苷)、传统化疗药物阿糖胞苷，表现为联合用药后IC50值减小，且通过联合给药曲线与单药曲线的IC50进行比较，观察到联合用药组曲线左移。因此，当化合物2与其它治疗药物，包括去甲基化药物(地西他滨和阿扎胞苷)、传统化疗药物阿糖胞苷，联用具有协同作用，其抗增殖作用明显增强。

实施例3.化合物2单药或联合用药对非小细胞肺癌(NSCLC)细胞系的抗增殖作用

3.1.化合物2单药对STK11和KRAS共突变的非小细胞肺癌(NSCLC)细胞系A549、NCI-H460、NCI-H2122的抗增殖作用

参照前述“

(CTG)细胞增殖实验”。在CTG实验中，检测化合物2 单药对三种STK11和KRAS共突变的非小细胞肺癌(NSCLC)细胞A549、NCI-H460、 NCI-H2122体外增殖的抑制作用。其中，A549细胞系、NCI-H460细胞系、NCI-H2122 细胞系均购自南京科佰生物科技有限公司。所有细胞系都经过遗传鉴定并且没有微生物污染。除非特殊说明，CTG实验中一般采用药物处理细胞72小时。

研究结果表明，在测试的上述STK11和KRAS共突变的非小细胞肺癌(NSCLC) 细胞A549、NCI-H460、NCI-H2122中，如图3A-3C所示，化合物2在STK11和KRAS 共突变的非小细胞肺癌(NSCLC)细胞A549、NCI-H460、NCI-H2122细胞系中的IC50 值分别为33nM、330μM和79nM。

3.2化合物2与曲美替尼的联合用药对STK11和KRAS共突变的非小细胞肺癌(NSCLC)细胞系A549、NCI-H460、NCI-H2122的抗增殖作用

参照前述“

(CTG)细胞增殖实验”。在CTG实验中，检测化合物2 与曲美替尼的联合用药对三种STK11和KRAS共突变的非小细胞肺癌(NSCLC)细胞 A549、NCI-H460、NCI-H2122体外增殖的抑制作用。除非特殊说明，CTG实验中一般采用药物处理细胞72小时。

如图3A-3C所示，化合物2与曲美替尼联合用药对STK11和KRAS共突变的非小细胞肺癌(NSCLC)细胞A549、NCI-H460、NCI-H2122细胞系的生长抑制作用。用梯度浓度的化合物2、曲美替尼单药或联合用药分别处理上述三种细胞系3天，通过CellTiter-Glo发光法检测细胞生长抑制活性。细胞存活百分比以Mean±SEM表示，n＝3。

结果显示，当化合物2与曲美替尼联用时，均发现上述联合用药具有增强的抗增殖作用。

由图3A、3B、3C可见具体CI值及化合物2与曲美替尼联合用药的原始量效生长抑制曲线。化合物2联合曲美替尼的联合用药反应曲线左移，联合指数(CI值)小于0.9，显示化合物2联合曲美替尼两药联合具有协同作用。

由此可见，体外实验中，化合物2不仅作为单药在STK11和KRAS共突变的非小细胞肺癌(NSCLC)细胞A549、NCI-H460、NCI-H2122细胞系中具有显著的抗增殖的作用，而且突出的是，化合物2联合曲美替尼表现为联合用药组曲线左移。因此，当化合物2与曲美替尼联用具有协同作用，其抗增殖作用明显增强。

3.3化合物2与曲美替尼的联合用药对KRAS野生型且STK11野生型非小细胞肺癌(NSCLC)细胞系NCI-H226和NCI-H292的抗增殖作用

参照前述“

(CTG)细胞增殖实验”。在CTG实验中，检测化合物2 与曲美替尼的联合用药对两种KRAS野生型且STK11野生型非小细胞肺癌(NSCLC) 细胞系NCI-H226和NCI-H292体外增殖的抑制作用。

其中，NCI-H226细胞系购自南京科佰生物科技有限公司，NCI-H292细胞系购自中国科学院生物化学与细胞生物学研究所。所有细胞系都经过遗传鉴定并且没有微生物污染。除非特殊说明，CTG实验中一般采用药物处理细胞72小时。

如图4A-4B所示，化合物2与曲美替尼联合用药对KRAS野生型且STK11野生型非小细胞肺癌(NSCLC)细胞系NCI-H226和NCI-H292细胞系的生长抑制作用。用梯度浓度的化合物2、曲美替尼单药或联合用药分别处理上述两种细胞系3天，通过CellTiter-Glo发光法检测细胞生长抑制活性。细胞存活百分比以Mean±SEM表示， n＝3。

结果显示，当化合物2与曲美替尼联用时，均发现上述联合用药具有增强的抗增殖作用。

由图4A、4B可见具体CI值及化合物2与曲美替尼联合用药的原始量效生长抑制曲线。摩尔浓度比大约为1：3的曲美替尼与化合物2的联合用药(尤其在二者的摩尔浓度比为0.33μM:1μM至1μM:3μM时)反应曲线左移，联合指数(CI值)小于 0.9，显示化合物2联合曲美替尼两药联合具有协同作用。

由此可见，体外实验中，化合物2不仅作为单药在KRAS野生型且STK11野生型非小细胞肺癌(NSCLC)细胞系NCI-H226和NCI-H292中具有显著的抗增殖的作用，而且突出的是，化合物2联合曲美替尼，表现为联合用药组曲线左移。因此，当化合物2与曲美替尼联用具有协同作用，其抗增殖作用明显增强。

实施例4.化合物2单药或联合用药体外诱导癌细胞凋亡和周期阻滞

4.1.化合物2单药诱导MOLM-13AML细胞凋亡

P53信号通路的激活可诱导细胞发生凋亡、周期阻滞、或衰老。在所有测试的AML细胞系中，携带野生型TP53且FLT3-ITD突变的MOLM-13细胞系对化合物2的药物作用表现出比OCI-AML-3和MV-4-11更高的敏感性。因此，进一步使用Annexin V-PI荧光探针并通过流式细胞仪分析化合物2单药或与地西他滨(Decitabine)、阿扎胞苷 (Azacitidine)或阿糖胞苷(Ara-C)联合作用后MOML-13细胞的凋亡情况。

如图5A和图5B所示，图5A为MOLM-13细胞在体外水平经剂量为0.01μM、0.04 μM、0.11μM、0.33μM或1μM的化合物2处理48小时后收集细胞，使用Annenix V-FITC/PI染色，流式细胞仪检测细胞凋亡。凋亡细胞百分比以Mean±SEM表示，n＝3。图5B为图5A图中化合物2诱导凋亡的流式分析代表图示。与阴性对照组相比，P<0.0001。

结果显示，化合物2可显著诱导细胞凋亡(P<0.0001)，其作用呈剂量依赖性。化合物2单药呈剂量依赖性诱导MOLM-13细胞凋亡。例如，40nM、110nM及1000nM 的化合物2作用48小时后凋亡的MOLM-13细胞(Annexin V+细胞)分别约为31.0％、 55.1％及96.8％。这些数据表明化合物2对AML细胞的生长抑制作用与其诱导细胞发生程序性细胞死亡有关。

4.2.化合物2与地西他滨、阿扎胞苷或阿糖胞苷协同诱导MOLM-13AML细胞凋亡

研究报道地西他滨、阿扎胞苷或阿糖胞苷均可诱导AML细胞凋亡(Hollenbach etal., 2010；Ossenkoppele and Lowenberg,2015；Ram et al.,2017)。本发明进一步在MOLM-13 细胞中评估了化合物2联合去甲基化药物(如地西他滨、阿扎胞苷)或阿糖胞苷对细胞凋亡的影响。

将MOLM-13细胞用0.04μM的化合物2(化合物2单药对AML细胞的研究显示该浓度为最小起效浓度)及适当浓度的地西他滨、阿扎胞苷或阿糖胞苷联合处理48小时。如图6所示，MOLM-13细胞在体外经0.04μM的化合物2与0.1μM地西他滨(Dec)、 3μM阿扎胞苷(Aza)或0.1μM阿糖胞苷(Ara-C)联合处理48小时后收集细胞，使用Annenix V-FITC/PI染色，流式细胞仪检测细胞凋亡。与空白组比较，P<0.05；与化合物2单药组比较，P<0.05；与化疗药物(地西他滨、阿扎胞苷或阿糖胞苷)单药组比较，P<0.05；凋亡细胞(Annexin V+细胞)百分比以Mean±SEM表示，n＝3。结果显示，与对照或单一药剂处理相比，化合物2与阿扎胞苷、地西他滨或阿糖胞苷(Ara-C) 联合可显著增加细胞凋亡的比例，协同诱导细胞凋亡。

4.3.化合物2单药对AML细胞周期进程的影响

将不同浓度的化合物2处理MOML-13、OCI-AML-3和MV-4-11细胞(TP53野生型AML细胞系)48小时后用碘化丙锭(PI)对细胞进行染色，通过流式细胞分析方法测定G0/G1、S及G2/M期细胞占总细胞的百分比，以此来研究化合物2对AML细胞周期进程的影响。

如图7所示，化合物2单药在TP53野生型AML细胞中以剂量依赖性方式降低S 期细胞比例。将MOLM-13(A)、OCI-AML-3(B)和MV-4-11(C)细胞在体外经 0.01μM、0.04μM、0.11μM、0.33μM或1μM的化合物2处理48小时后收集细胞并用 PI染色，流式细胞仪检测细胞周期阻滞。图中结果为两次独立实验的代表性结果，其中， MOLM-13细胞中，结果代表Mean±SEM,n＝2；OCI-AML-3及MV-4-11细胞中，数值为单孔实验结果。在所测试的三种AML细胞系中，化合物2处理组与对照组相比，化合物2以剂量依赖方式降低S期细胞的百分比。

结果显示化合物2单药对AML细胞的生长抑制作用可能与细胞周期阻滞有关。化合物2单药可以明显减少MOML-13、OCI-AML-3和MV-4-11细胞系中S期的细胞百分比。

4.4.化合物2与地西他滨、阿扎胞苷或阿糖胞苷联合用药对AML细胞周期进程的影响

将化合物2(0.01μM或0.33μM)与适当浓度的地西他滨、阿扎胞苷或阿糖胞苷联合处理MOML-13、OCI-AML-3和MV-4-11细胞48小时，并同样用流式细胞仪进行检测细胞的周期分布。

图8所示化合物2与地西他滨(Decitabine)、阿扎胞苷(Azacitidine)、或阿糖胞苷(Cytarabine,Ara-C)联合处理MOLM-13、OCI-AML-3及MV-4-11细胞未发现协同的周期阻滞效果。MOLM-13细胞用0.01μM化合物2联合0.05μM地西他滨、1μM阿扎胞苷及0.05μM阿糖胞苷处理；OCI-AML-3细胞用0.33μM化合物2联合1μM地西他滨、3μM阿扎胞苷及0.33μM阿糖胞苷处理；MV-4-11细胞用0.33μM化合物2联合 0.33μM地西他滨、3μM阿扎胞苷及0.33μM阿糖胞苷处理。药物作用48小时后收集细胞并用PI染色。使用流式细胞仪检测样品后用FlowJo软件细胞周期程序进行数据分析。图中结果为单孔实验结果。

结果显示，化合物2与地西他滨、阿扎胞苷或阿糖胞苷联合处理MOML-13、 OCI-AML-3和MV-4-11细胞未对细胞周期阻滞产生协同增强的效果。表明化合物2和地西他滨、阿扎胞苷或阿糖胞苷的协同抗增殖活性可能与细胞周期阻滞无关。

实施例5.体内药效实验评估

对于全身性AML模型，用环磷酰胺(150mg/kg，腹膜内)预处理六至八周龄的雌性NOD SCID小鼠连续两天。然后通过静脉内接种1×10⁷个细胞到尾静脉中建立MOLM-13全身性AML异种移植模型。使细胞生长3天，然后随机分组用于使用载体、化合物2(50mg/kg，每天口服，持续7天)、Aza(1.5mg/kg，每天静脉注射，持续7 天)单独或联合治疗。在治疗过程中以及治疗完成后，监测小鼠的后肢麻痹(HLP) 的发生或由疾病进展引起的腹部肿胀，以及>20％的体重减轻。

对于皮下模型，将OCI-AML-3细胞(1×10⁶)皮下注射到6-8周龄的小鼠的右侧腹中。在细胞接种后大约10天，基于达到约100-150mm³的平均肿瘤体积的原发肿瘤大小将小鼠随机分组。单独或联合施用化合物2(50mg/kg，口服，每隔一天，持续 15天)和Aza(2mg/kg，每天静脉注射，持续7天)或Dec(1mg/kg，每天静脉注射，持续7天)。通过卡尺每周两次测量肿瘤体积，并使用以下公式以mm³表示：V＝0.5 a×b²；其中a和b分别是肿瘤的长径和短径。作为效力的测量，根据下式计算T/C(％) 值：T/C(％)＝(T_RTV/C_RTV)×100％；其中T_RTV是治疗组的相对肿瘤体积(RTV)， C_RTV是对照组的RTV。RTV＝V_t/V₁；其中V₁和V_t分别是治疗第一天(第1天)的平均肿瘤体积和某一时间点(第t天)的平均肿瘤体积。根据下式计算肿瘤生长抑制 (TGI)：TGI(％)＝100-T/C(％)。

5.1.化合物2单药在人MOLM-13AML细胞小鼠异种移植瘤模型中的抗肿瘤作用

在体外细胞实验中，MOLM-13是对化合物2敏感的人AML细胞系之一，IC50值为26.8±4.9nM。建立了MOLM-13小鼠全身性异种移植瘤模型，在该模型中评估化合物2按80mg/kg剂量，口服(po),每两日一次(q2d)给药方案的抗白血病作用(与表7中编号57方案对应)。实验共2组，每组15只动物，其中每组5只动物用于人CD45+ AML细胞比例分析，其余10只动物用于记录小鼠生存状况。在细胞接种后18天，依据实验方案，各组随机选取5只动物，采集骨髓和脾脏，应用流式细胞术分析骨髓和脾脏中人CD45+AML细胞的比例，以此评估动物的疾病负荷。

如图9A和图9B所示，化合物2显著减少人源MOLM-13AML小鼠异种移植瘤小鼠骨髓和脾脏中人CD45+细胞比例。图9A为骨髓中人CD45+AML细胞的流式分析图；图9B为脾脏中人CD45+AML细胞的流式分析图；图9C和图9D为骨髓和脾脏中人 CD45+AML细胞比例汇总分析图；其中CD45+AML细胞比例为占所有活细胞的比例，采用Mann-Whitney U test方法进行统计分析。溶媒组中一只用于记录生存状态的小鼠在分析人CD45+AML细胞比例当天，体重下降>20％达到人道终点，将该动物安乐死后采集了骨髓和脾脏进行人CD45+AML细胞比例分析，所示溶媒组n＝6，化合物2组n＝5。

结果显示，溶媒对照组中人CD45+AML细胞的比例组内个体差异较大，骨髓中 CD45+AML细胞比例在0.41％到16.7％之间，脾脏中的比例为0.39％至1.40％。但是，化合物2给药组中，实验动物骨髓和脾脏中人CD45+AML细胞比例均小于0.1％，两组数据比较具有统计学显著性差异。以上数据寿命化合物2可显著减少小鼠的白血病负荷。

生存分析显示，如图10所示，P<0.0001，在接种MOLM-13细胞后第三天开始给予化合物2或溶媒，n＝10。采用log-rank法对两组动物的生存曲线进行分析比较。开始给药治疗后第15天，溶媒对照组开始有动物死亡，并且在第21天，全部动物死亡。如表2所示，溶媒对照组动物的中位生存期为18.5天，而化合物2(80mg/kg)治疗可使中位生存期延长18.5天(延长100％)，达到37.0天。

由于所建立的MOLM-13为弥散性全身性系统肿瘤，恶性程度及疾病进展均较为凶险。结果显示，化合物2显著延长荷人MOLM-13(AML)异种移植瘤小鼠的生存时间，而且化合物2显著延长荷人MOLM-13(AML)异种移植瘤小鼠的中位生存时间，并且化合物2作为单一药剂具有显著的抗AML作用。

表2.化合物2显著延长荷人MOLM-13(AML)异种移植瘤小鼠的中位生存时间

5.2化合物2单药在二甲基苯蒽诱导的大鼠骨髓增生异常综合征(MDS)模型中的抗MDS作用

骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndromes，MDS)是起源于造血干细胞的一组异质性髓系克隆性疾病，特点是髓系细胞分化及发育异常，表现为无效造血、难治性血细胞减少、造血功能衰竭，高风险向急性髓细胞白血病(AML)转化。采用多种人源大鼠MDS模型评估化合物2单药的体内抗肿瘤作用。表3所示在二甲基苯蒽诱导的大鼠骨髓增生异常综合征(MDS)模型中所进行的抗肿瘤作用，化合物2按照口服(po)、每两天一次(q2d)方案给药。

表3.化合物2在二甲基苯蒽诱导的大鼠骨髓增生异常综合征(MDS)模型中的抗肿瘤作用

采用化学诱变剂二甲基苯蒽(DMBA)构建大鼠骨髓增生异常综合征(MDS)模型，该大鼠MDS模型中大鼠的骨髓象和血象变化与人骨髓增生异常综合征相似，已被证实可用于药物的抗MDS作用研究。将DMBA按50mg/kg，i.v.，每周一次方案给药，共给药 4周，建立大鼠MDS模型。DMBA给药结束后一周(第28天)，经尾静脉采集外周血进行血常规检测以确定模型是否建立成功。

血常规结果显示，与正常动物比较，接受DMBA处理的大鼠血小板总数(PLT)、红细胞总数(RBC)、网织红细胞数量(RET)、血红蛋白(HGB)和白细胞总数(WBCB) 均显著降低。根据第28天的PLT水平将动物进行随机分组，共设置溶媒对照组(Vehicle)、化合物2(10mg/kg)和化合物2(30mg/kg)两个剂量组(与表3中编号23方案对应)、健康对照组(Naive)，每组5只动物。

如图11A所示分组治疗前DMBA诱导大鼠外周血PLT、WBC水平显著下降的MDS 表征。给予DMBA后，根据PLT的水平将动物进行随机分组后，溶媒对照组和化合物2 两个剂量组的PLT和WBCB水平相当，但均比健康对照组低(P<0.0001)。溶媒对照组和化合物2两个剂量组的RBC水平与健康对照组比较略有降低，但无统计学显著性差异。

将化合物2按10mg/kg或30mg/kg，p.o.，q2d×21d方案给药。给药结束，采集各组动物的外周血和骨髓细胞进行血常规分析。外周血的血常规分析，结果如图11B所示，化合物2单药对MDS大鼠外周血的PLT、WBCB和RBC水平没有明显影响。

但骨髓常规分析，结果如图11C所示，化合物2单药可显著恢复MDS大鼠骨髓中PLT、WBCB和RBC的水平。具体地，健康对照大鼠骨髓PLT平均值为168±16.44 (cells/μl)，MDS模型组大鼠骨髓PLT平均值为52±2.49(cells/μl)，与健康对照组比较具有统计学显著性差异(P<0.001)。而接受化合物2(10mg/kg)和化合物2(mg/kg) 30治疗的大鼠骨髓PLT水平均有升高，平均值分别为116±9.35(cells/μl，与MDS模型组比较，P>0.05)和124.2±23.8(cells/μl，与MDS模型组比较，P<0.05)。

另一方面，骨髓常规分析结果中，对照组大鼠的WBCB平均值为90.42±9.65(cells/μl)， MDS模型组大鼠骨髓WBCB平均值为16.89±2.75(cells/μl)，与健康对照租大鼠组比较，具有统计学显著性差异(P<0.001)。接受化合物2(10mg/kg)和化合物2(30mg/kg)治疗的大鼠骨髓WBCB水平均有升高，平均值分别为47.5±10.13(cells/μl，与溶媒对照组比较，P>0.05)和62.53±13.08(cells/μl，与MDS模型组比较，P<0.05)。

并且，健康对照组大鼠的RBC平均值为0.19±0.02(cells/μl)，MDS模型组大鼠骨髓RBC平均值为0.04±0.01(cells/μl)，与健康对照大鼠组比较，具有统计学显著性差异(P<0.001)。接受化合物2 10mg/kg和30mg/kg治疗的大鼠骨髓RBC水平均有升高，平均值分别为0.10±0.01(cells/μl，与MDS模型组比较，P<0.05)和0.08±0.02 (cells/μl，与溶媒对照组比较，P>0.05)

MDS体外结果显示，MDS模型组动物在给药结束后，骨髓中的PLT、WBCB和RBC 水平与健康对照组动物比较，均显著显著降低，显示在所检测的时间点，实验动物仍具有MDS的血液学改变。通过化合物2给药可显著恢复MDS骨髓中PLT、WBCB和RBC 水平。

5.3化合物2与阿扎胞苷联合用药在人MOLM-13AML小鼠异种移植瘤模型中的抗肿瘤作用

在体外实验中，TP53野生型的MOLM-13细胞系对化合物2中度敏感。通过尾静脉接种MOLM-13肿瘤细胞建立全身性瘤模型，在细胞接种后第三天开始给药，并将给药当天定义为第一天。化合物2按30mg/kg，q2d方案给药21天。阿扎胞苷按1.5mg/kg， qd方案给药七天(与表7中编号81方案对应)。

如图12所示，在接种MOLM-13细胞后第三天开始给予化合物2或溶媒，n＝15。采用log-rank法对两组动物的生存曲线进行分析比较。经Bonferrion多重检验校正，P<0.05。参见表4，溶媒对照组小鼠在第15天(细胞接种后17天)开始出现动物死亡，并在第20天小鼠全部死亡，中位生存期为16天。化合物2给药组动物的中位生存时间为 24天(与溶媒对照组比较，P<0.01)。阿扎胞苷单药在该模型中也可以显著延长小鼠生存期，中位生存时间为24天(与溶媒对照组比较，P<0.01)。化合物2与阿扎胞苷联合用药组可进一步延长小鼠生存时间，中位生存时间达到30天(与溶媒对照组比较，与化合物2单药组比较，与阿扎胞苷单药组比较，P值均<0.01)。

表4.化合物2与阿扎胞苷联合用药显著延长荷人MOLM-13(AML)异种移植瘤小鼠的中位生存时间

结果显示，在口服给药方案中，化合物2单药对MOLM-13人AML细胞小鼠异种移植瘤表现出显著的肿瘤生长抑制作用。在良好耐受的剂量下，化合物2与阿扎胞苷联合治疗能够显著延长荷人MOLM-13(AML)异种移植瘤小鼠的生存时间，在MOLM-13 全身性瘤模型中显著延长小鼠生存时间。

5.4化合物2与阿扎胞苷或地西他滨联合用药在人OCI-AML-3AML小鼠异种移植瘤模型中的抗肿瘤作用

在体外细胞实验中，OCI-AML-3是对化合物2处理较为敏感的人AML细胞系，IC50值为315.6±97nM。采用OCI-AML-3细胞建立小鼠异种移植瘤模型以评估化合物2与阿扎胞苷或地西他滨联合用药的抗AML作用。

如图13和表5所示，化合物2按50mg/kg剂量，口服，q2d×15天方案给药在该模型中未能抑制肿瘤生长，T/C值为84.8％(P>0.05)。阿扎胞苷按2mg/kg，尾静脉注射，qd×7d,停药7天，再qd×2天方案给药(与表7中编号68方案对应)。在实验结束时(d15)，均未显示显著的抗肿瘤活性，T/C值为56.6％(P>0.05)。化合物2(50mg/kg) 与阿扎胞苷(2mg/kg)联合用药表现出明显增强的抗肿瘤作用，T/C值为43.4％，协同因子为1.11，结果显示两药联合用药具有协同作用。

表5.化合物2与阿扎胞苷联合给药在人OCI-AML-3AML小鼠异种移植瘤模型中的抗肿瘤作用

如图14和表6所示，地西他滨(1mg/kg)，尾静脉注射，qd×7d,停药7天，再qd ×2天方案给药，在实验结束时(d15)，也未显示明显的抗肿瘤活性，T/C值为64.9％(P>0.05)。但化合物2(50mg/kg)与地西他滨(1mg/kg)联合用药显示明显增强的抗肿瘤作用，在给药后第15天的T/C值为44.9％。协同分析分析显示药物联合使用具有协同作用，协同因子是1.22。

结果显示，从RTV值、T/C值和协同因子看，化合物2与阿扎胞苷或地西他滨联合用药优于阿扎胞苷、地西他滨单独用药。在各治疗组中均未观察到显著的体重减轻。

表6化合物2与地西他滨联合用药在人OCI-AML-3AML小鼠异种移植瘤模型中的抗肿瘤作用

5.5化合物2单药及联合用药在人源MOLM-13和OCI-AML-3AML小鼠异种移植瘤模型中的体内抗肿瘤作用

阿扎胞苷和地西他滨在新诊断和晚期AML患者中的反应率均较低。完全缓解和完全缓解伴不完全计数恢复的综合反应率通常为20％至30％(Kim et al.,2015)。即使持续接受Aza和Dec治疗，患者均会出现疾病复发。采用两种人源AML癌细胞小鼠移植瘤模型评估化合物2单药及联合用药的体内抗肿瘤作用。表7所示在人源AML癌细胞小鼠异种移植瘤模型中所进行的抗肿瘤作用，化合物2按照口服(po)、每两天一次(q2d)方案给药。

结果如图15所示，使用化合物2单一药剂的治疗显著延长了荷MOLM-13全身性 AML异种移植瘤小鼠的存活，并呈剂量依赖性。

表7.化合物2在人源AML细胞小鼠异种移植瘤模型中的药效学实验设计

如图16所示，化合物2增强AML异种移植模型中Aza或Dec的体内抗白血病活性。

(A)植入1×10⁷个MOLM-13细胞的NOD SCID小鼠(n＝15/组)在细胞植入后三天用载体、化合物2 50mg/kg(每天PO，持续7天)、Aza 2mg/kg(每日，持续 7天)单独或联合地治疗。数据显示为描绘小鼠存活的Kaplan-Meier曲线。使用 Bonferroni多重比较的对数秩用于存活比较。*P<0.05。

(B)携带皮下OCI-AML-3肿瘤的NOD SCID小鼠用化合物2 50mg/kg(每隔一天PO，持续15天)、Aza 2mg/kg(每天IV，持续7天)、Dec 1mg/kg(每天IV，持续7天)单独或联合地治疗，并测定肿瘤生长抑制(TGI)。

上述结果表明，化合物2单药在人MOLM-13AML小鼠全身性异种移植瘤模型中显示出显著的肿瘤生长抑制作用，在二甲基苯蒽诱导的大鼠骨髓增生异常综合征(MDS) 模型中表现出显著的抗MDS作用。联合用药中，化合物2与其他抗癌剂在人MOLM-13 AML小鼠全身性异种移植瘤模型和人OCI-AML-3AML小鼠皮下异种抑制瘤模型中能够获得优于单药的抗肿瘤作用，取得了协同效果。在单药和联合用药研究中，荷瘤动物对上述治疗耐受性良好，显示化合物2可以用作单一药剂或与其他治疗剂联合用于临床上AML和MDS的治疗。

在本研究中，我们在AML细胞系和异种移植物中测试了作为单一药剂或与其他抗癌治疗剂联合的最有效的MDM2抑制剂之一(化合物2)。体外实验证明化合物2 对TP53野生型AML细胞系具有有效的抗增殖活性。抗增殖活性在TP53野生型和 FLT3-ITD突变型AML细胞中特别显著。在联合治疗中，化合物2增强了其他治疗剂 (包括去甲基化药物(阿扎胞苷和地西他滨)和化疗剂阿糖胞苷)的抗增殖活性。在人MOLM-13全身性异种移植物中，用化合物2单一药剂处理显著抑制肿瘤生长，最小有效剂量为20mg/kg。更高剂量的化合物2(80mg/kg)实现了更强的抗肿瘤活性。当化合物2与以下联合时：(1)在皮下OCI-AML-3和全身性MOLM-13模型中与阿扎胞苷；(2)在皮下OCI-AML-3模型中与地西他滨，记录了增强的抗白血病活性。

值得注意的是，AML是一种具有复杂核型的高度异质性疾病。其中，FLT3和NPM1 是最常见的突变基因。在新发AML中，FLT3和NPM1的突变频率可分别高达28％和27％。如上所述，作为单一药剂的化合物2在体外和体内在携带FLT3-ITD突变的 AML细胞中具有有效的抗白血病活性。在携带FLT3-ITD突变的MOLM-13AML全身异种移植模型中，化合物2单独地可以显著减轻疾病负担并延长小鼠存活。与单一药物相比，用化合物2和阿扎胞苷或FLT3抑制剂的联合治疗实现了更强的抗AML 活性。在携带NPM1突变的OCI-AML-3AML异种移植模型中，用化合物2和去甲基化药物(阿扎胞苷和地西他滨)、传统化疗药物(Ara)的联合治疗产生协同抗AML 效应。这些结果表明化合物2在显示FLT3和NPM1突变的AML中具有广泛的应用潜力。

实施例6.化合物2剂量递增的单药及联合阿扎胞苷或阿糖胞苷的I期临床研究本研究的目的是确定化合物2单药及联合阿扎胞苷(Azacitidine)或阿糖胞苷 (Cytarabine)在成人复发或难治性急性髓性白血病(Relapsed or refractory acute myeloidleukemia,R/R AML)和复发或难治性高危/极高危骨髓增生异常综合征(MyelodysplasticSyndrome,MDS)等血液肿瘤患者的安全性和耐受性。

试验药物，剂量和给药方法

试验药物化合物2为胶囊剂，每粒含化合物2 5mg或50mg，唯一的辅料为微晶纤维素。试验药物化合物2应遮光、密封、2-8℃下存贮。

化合物2按照标准3+3方案进行剂量递增，起始剂量为150mg，依次递增至200mg、250mg、300mg，每日口服一次(QD)，每周期从第1天开始使用，连续服用7天后休息21天，每28天为一个给药周期。

当第一阶段化合物2单药剂量递增结束后，可进入第二阶段，即化合物2联合用药剂量递增。联合用药方案中化合物2的剂量从100mg开始，依次递增至150mg、 200mg。阿扎胞苷为固定剂量，75mg/m²皮下注射，每日一次，每周期从第1天开始使用，连续7天后休息21天，每28天为一个给药周期。阿糖胞苷为固定剂量，1g/m²静脉注射，静脉输注时间不少于4小时，每日一次，每周期从第3天开始使用，连续 5天后休息21天，每28天为一个给药周期。阿扎胞苷或阿糖胞苷均于化合物2口服4 小时后给药。两药联合治疗后进入休息期。

实施例7.化合物2与DEC、AZA或Ara-C联合处理AML细胞，协同激活P53 通路，下调参与细胞周期进展和失配修复的基因

为了探知化合物2与AZA或Ara-C协同作用的潜在作用机制，我们对经化合物2、AZA或Ara-C各自单独或联合处理24小时的MOLM-13细胞进行RNA-Seq分析。差异基因表达分析显示，与DMSO对照相比，化合物2与AZA或Ara-C联合处理差异基因表达数量最多(图17A-B)。KEGG信号通路分析表明，化合物2与AZA联合使用导致p53信号通路相关基因上调，DNA复制、错配修复、及细胞周期进展相关基因下调(图17C)。化合物2和Ara-C组合导致p53信号通路相关基因上调，细胞周期相关基因下调(图17D)。鉴于化合物2和AZA或Ara-C协同上调p53相关通路，进一步对p53调控基因的差异表达进行分析。热图结果显示化合物2可在体外诱导MOLM-13细胞p53靶基因显著上调。总的来说这两种组合的诱导效果明显优于单独的两种药剂(图17E-F)。这包括替代的P53激活标记物GDF15(又名MIC-1)、促凋亡基因、BBC3(编码PUMA)、MDM2、BAX和FAS。以及细胞周期进展相关的负调控因子，CDKN1A(编码P21)和GADD45的。类似地，化合物2+AZA或Ara-C联合处理后，SESN1和SESN2均升高，两者均为MTORC1的负调节因子。联合处理后，包括CDC20、CCNB1和PLK1在内的后，参与细胞周期进展的癌蛋白编码基因显著下调。在参与DNA复制的基因、MCM4和MCM2中也观察到类似的效应。化合物2+Ara-C联合治疗中P53调控基因增加程度更显著。这些数据表明，化合物2与DEC、 AZA或Ara-C联合治疗可协同激活P53通路，下调参与细胞周期进展和失配修复的基因。

如图17中所示，(A-B)图表显示化合物2和AZA或Ara-c单独或联合作用24小时后差异表达基因的数量具有统计学意义。(C-D)化合物2与AZA或Ara-C联合处理后，变化最为显著的信号通路。(E-F)在MOLM-13细胞中，针对化合物2和AZA 或Ara-C单独或联合作用，部分p53调控基因的变化。

实施例8.化合物2与DEC、AZA或Ara-C联合处理AML细胞可诱导DNA损伤并协同上调P21的表达

因此，我们评估了这些被识别的信号通路所涉及的蛋白变化。如图18A-C所示，联合治疗可显著增加DNA损伤，由γ-H2AX表达量增加证明。如前所述，化合物2 激活P53后，进一步诱导P53和P21蛋白的积累。DEC和AZA是通过抑制甲基转移酶I(DNMT1)的功能而诱导细胞DNA低甲基化的低甲基化药物。多项研究表明， DNMT1与肿瘤细胞中的UHRF1和HDAC1蛋白形成复合物，结合并抑制各种抑癌基因(如P16INK4A、P14ARF、P21)启动子的表达，促进肿瘤生长。阿糖胞苷是一种嘧啶核苷类似物，诱导DNA损伤，进而激活ATM/ATR-P53-P21信号级联，抑制细胞 DNA合成，干扰细胞增殖。

基于上述证据，我们进一步检测了化合物2与低甲基化的药物DEC、AZA或药物Ara-C联合治疗对P53、去甲基化标记蛋白DNMT1、共同靶标蛋白P21的调节作用，以及凋亡标志物蛋白裂解PARP-1的表达。与预期一致，使用化合物2对表达野生型 TP53的癌细胞进行处理，稳定了P53，激活了P53通路，导致P53和P21的积累。用 AZA或DEC处理几乎完全消除DNMT1。单独Ara-C对P21有显著的上调作用。最重要的是，与单独药物处理相比，化合物2与DEC、AZA或Ara-C联合治疗可协同上调P21蛋白(图18D-F)。此外，化合物2与DEC、AZA或Ara-C协同作用，诱导凋亡生物标志物的产生，即PARP-1裂解(图18D-F)。RG-7388是作为本实验的比较而引入。其对P53和P21的影响与化合物2相似。RG-7388联合DEC、AZA、Ara-C也能显著上调P53、P21的表达，进而诱导PARP-1裂解的产生(图18D-F)。潜在的潜在作用机制如图18所示。简言之，化合物2是MDM2-P53相互作用的小分子抑制剂。通过与MDM2蛋白结合，消除MDM2对P53的抑制作用，恢复P53的抑癌功能。化合物2可以恢复P53的抑癌功能，进而诱导P21表达。DEC,AZA和Ara-C诱导γ-H2AX 表达增加，提示DNA损伤增加。DNA损伤进一步激活P53、P21。此外，AZA或 DEC处理可防止DNMT1-UHRF1-HDAC1复合物对P21的抑制，从而与化合物2协同诱导P21的表达。Ara-C处理也激活了P53-P21通路，从而协同诱导P21蛋白表达。

如图18中所示，(A-B)DEC(100nM),AZA(0.33μM)处理24小时后，随后单独或联合应用新的DEC(100nM),AZA(0.33μM)与化合物2(40nM)再处理24小时，蛋白在MOLM-13细胞中的表达。(C)单独或联合应用Ara-C(100nM)或化合物2(40nM) 处理48小时后，MOLM-13细胞中的蛋白表达。(D-F)如图所示化合物2(40nM), RG-7388(40nM),DEC(100nM),AZA(3μM),Ara-C单独或联合处理48小时后， MOLM-13细胞中的蛋白表达。β-actin被用来确认相同加载的蛋白质。(G)所提出的化合物2与DEC、AZA或Ara-C联合作用于AML细胞的作用机制。其结果代表了三个独立的结果。以RG-7388为对照，β-actin被用来确认相同加载的蛋白质。

综上所述，这些数据强烈表明在联合处理中观察到的P21诱导是强有力的，至少部分是源于协同抗增殖活性的作用，经化合物2与AZA、DEC或Ara-C联合处理后均可增加细胞凋亡的诱导。

实施例9.化合物2与达拉非尼(dabrafenib)和曲美替尼(trametinib)的联合在BALB/c免疫缺陷小鼠皮下A375皮肤黑色素瘤异种移植瘤模型中的体内功效研究

进行了体内研究，评估化合物2作为单一药物以及化合物2与达拉非尼和曲美替尼的联合在皮下A375皮肤黑色素瘤异种移植瘤模型中的治疗效果，实验设计见表8。

表8.化合物2与达拉非尼(dabrafenib)和曲美替尼(trametinib)的联合在人源A375皮肤黑色素瘤小鼠异种移植瘤模型中药效学实验设计(肿瘤细胞系：A375；5×10⁶细胞/小鼠皮下植入)

人A375细胞系购自Cobioer。该细胞系经过遗传鉴定，没有微生物污染。将A375 细胞保存在DMEM(Cat.#C11995500BT,GIBCO)中，所述DMEM补充有10％胎牛血清(Cat.#10099-141C,GIBCO)、100U/mL青霉素G和100μg/mL链霉素(Cat. #15140-122,GIBCO)。将细胞在加有5％CO₂的加湿培养箱中于37℃孵育。

化合物2通过用研钵将化合物2悬浮在0.2％HPMC中而制成均质混悬液。混悬液每周制备一次，并保存在4℃下。在使用前，使制剂恢复至室温并充分混合。将化合物2 通过口服管饲法(PO)给药，剂量为10mL/kg。达拉非尼购自selleck。通过使用超声波将达拉非尼悬浮在0.5％HPMC中制备成均质混悬液。混悬液每周制备一次，并保存在4℃下。将达拉非尼通过口服管饲法(PO)给药，剂量为10mL/kg。曲美替尼购自Selleck。通过悬浮在1％CMC、0.5％Tween 80和0.5％MC中获得澄清溶液，将曲美替尼制成均质混悬液。每三天制备一次溶液，并储存在4℃下。将曲美替尼通过口服管饲法(PO) 给药，剂量为10mL/kg。

使用六至八周大的雌性BALB/c免疫缺陷小鼠。接种动物数为55只，证书编号为202003066，许可证编号为SCXK(苏)2018-0008，动物供应商为GemPharmatech Co， Ltd。

结果如图19和表9所示，将化合物2单药每天以50mg/kg施用7天发挥了有效的抗肿瘤活性，T/C值为58.25％。每天给药30mg/kg的达拉非尼和1mg/kg的曲美替尼的组合持续3周，显示出显著的抗肿瘤活性，T/C值为11.78％(与溶媒对照相比，p<0.001)。在达拉非尼和曲美替尼的组合中增加化合物2表现出显著增强的抗肿瘤活性，达到0.75％的T/C值(与溶媒对照相比，p<0.01；与“化合物2”组相比，p<0.05)。相应的协同因子为9.10，表明协同抗肿瘤作用。重要的是，在化合物2与达拉非尼和曲美替尼联合治疗的组中，动物在研究期间获得了2/5CR和3/5PR的100％总体缓解率。

图19以及表9结果表明，化合物2与达拉非尼加加曲美替尼的联合在皮肤黑色素瘤异种移植模型中发挥协同抗肿瘤活性，表明该组合在皮肤黑色素瘤治疗中的潜在治疗应用。

表9.化合物2与达拉非尼(dabrafenib)和曲美替尼(trametinib)的联合在人源A375皮肤黑色素瘤小鼠异种移植瘤模型中的抗肿瘤作用

实施例10.化合物2与氟维司琼(fulvestrant)和阿培利司(alpelisib)的联合在BALB/c免疫缺陷小鼠皮下MCF-7ER⁺乳腺癌异种移植瘤模型中的体内功效研究进行了体内研究，评估化合物2与氟维司琼和阿培利司的联合在皮下MCF-7ER⁺乳腺癌异种移植模型中的治疗效果，实验设计见表10。

表10.化合物2与氟维司琼(fulvestrant)和阿培利司(alpelisib)的联合在小鼠皮下MCF-7ER⁺乳腺癌异种移植瘤模型中的药效学实验设计(肿瘤细胞系：MCF-7；1×10⁷细胞/小鼠皮下植入)

人MCF-7细胞系购自Cobioer。该细胞系经过遗传鉴定，没有微生物污染。将MCF-7细胞保存在MEM(Cat.#C12571500BT,GIBCO)中，所述MEM补充有10％的胎牛血清(Cat.#10099-141C,GIBCO)、100U/mL青霉素G和100μg/mL链霉素(Cat.#15140-122, GIBCO)。将细胞在加有5％CO₂的加湿培养箱中于37℃孵育。

化合物2通过用研钵将化合物2悬浮在0.2％HPMC中而制成均质混悬液。混悬液每周制备一次，并保存在4℃下。在使用前，使制剂恢复至室温并充分混合。将化合物2 通过口服管饲法(PO)给药，剂量为10mL/kg。氟维司琼(批次编号：S119117)购自 Selleck。通过溶解在玉米油中、涡旋并超声处理成澄清溶液来制备氟维司琼。在使用前制备该溶液。以10mL/kg的剂量皮下注射(SC)给予氟维司琼。阿培利司(批次号： HY-15244)购自MCE。通过悬浮在0.5％CMC-Na中，涡旋并超声处理，将阿培利司制成均匀的混悬液。每周制备一次阿培利司，并保存在4℃下。在使用前，使制剂恢复至室温并充分混合。通过口服管饲法(PO)施用阿培利司，剂量为10mL/kg。

使用六至八周大的雌性BALB/c免疫缺陷小鼠。接种动物数为70只，证书编号为202001895，许可证编号为SCXK(苏)2018-0008，动物供应商为GemPharmatech Co， Ltd。

结果如图20和表11所示，50mg/kg的化合物2与25mg/kg的阿培利司联合发挥了有效的抗肿瘤活性，T/C值为38.92％。每天服用20mg/kg的氟维司琼和25mg/kg的阿培利司联用3周，显示出显著的抗肿瘤活性，T/C值为31.19％。在氟维司琼和阿培利司的组合中增加化合物2表现出显著增强的抗肿瘤活性，T/C值达到0％。此外，化合物2 与氟维司琼和阿培利司的三联组合能够达到100％的总体缓解率，研究期间的CR为2/2。

在所有治疗期间均未观察到明显的体重减轻。

图20以及表11表明，化合物2与氟维司琼和阿培利司的联合在ER⁺乳腺癌异种移植模型中发挥协同抗肿瘤活性，表明该组合在ER⁺乳腺癌治疗中的潜在治疗应用。

表11.化合物2与氟维司琼(fulvestrant)和阿培利司(alpelisib)的联合在小鼠皮下MCF-7ER⁺乳腺癌异种移植瘤模型中的抗肿瘤作用

除本文中描述的那些外，根据前述描述，本发明的各种修改对本领域技术人员而言会是显而易见的。这样的修改也意图落入所附权利要求书的范围内。本申请中所引用的各参考文献(包括所有专利、专利申请、期刊文章、书籍及任何其它公开)均以其整体援引加入本文。

Claims (15)

1.药物组合物，其包含MDM2抑制剂和一种或多种抗癌剂以及任选的药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂，其中所述MDM2抑制剂是化合物2及其药学上可接受的盐：

其中抗癌剂选自阿扎胞苷、地西他滨、阿糖胞苷中的一种或多种；

其中所述MDM2抑制剂与所述抗癌剂的重量比为100:1至1:100。

2.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述药物组合物呈片剂、胶囊剂、颗粒剂、糖浆剂、粉剂、锭剂、药囊、扁囊剂、酏剂、混悬剂、乳剂、溶液、气雾剂、软膏剂、乳膏剂和注射剂的形式。

3.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述MDM2抑制剂与所述抗癌剂的重量比为100:1，95:1，90:1，85:1，80:1，75:1，70:1，65:1，60:1，55:1，50:1，45:1，40:1，35:1，30:1，25:1，20:1，15:1，10:1，9:1，8:1，7:1，6:1，5:1，4:1，3:1，2:1，0.8:1，1:1，1.6:1，8:15，1:2，1:3，1:4，1:5，1:6，1:7，1:8，1:9，1:10，1:15，1:20，1:25，1:30，1:35，1:40，1:45，1:50，1:55，1:60，1:65，1:70，1:75，1:80，1:85，1:90，1:95或1:100。

4.MDM2抑制剂与一种或多种抗癌剂相结合在制备用于预防和/或治疗癌症的药物中的用途，其中所述MDM2抑制剂是化合物2及其药学上可接受的盐：

其中所述抗癌剂选自阿扎胞苷、地西他滨、阿糖胞苷中的一种或多种；

所述癌症选自急性髓细胞白血病(AML)、骨髓增生异常综合征(MDS)；

其中所述MDM2抑制剂与所述抗癌剂的重量比为100:1至1:100。

5.根据权利要求4所述的用途，其中所述药物被制备成将所述MDM2抑制剂或其药学上可接受的盐以0.0025-5000mg/日的量给药的形式。

6.根据权利要求4所述的用途，其中所述药物被制备成将所述MDM2抑制剂或其药学上可接受的盐以下列日剂量给药的形式：0.005、0.05、0.5、5、10、20、30、40、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500或5000mg/日。

7.根据权利要求4所述的用途，其中所述药物被制备成将一种或多种所述抗癌剂或其药学上可接受的盐以0.0025-5000mg/日的量给药的形式。

8.根据权利要求4所述的用途，其中所述药物被制备成将一种或多种所述抗癌剂或其药学上可接受的盐以下列日剂量给药的形式：0.005、0.05、0.5、5、10、20、30、40、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500或5000mg/日的量给药。

9.根据权利要求4至8中任一项所述的用途，其中所述药物被制备成将所述MDM2抑制剂与一种或多种所述抗癌剂同时、并行或组合给药的形式。

10.根据权利要求4至8中任一项所述的用途，其中所述药物用于将所述MDM2抑制剂与一种或多种所述抗癌剂连续给药至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少11天、至少12天、至少13天、至少14天、至少15天、至少16天、至少17天、至少18天、至少19天、至少20天、至少21天、至少22天、至少23天、至少24天、至少25天、至少30天、至少35天、至少40天、至少45天或至少50天。

11.根据权利要求4至8中任一项所述的用途，其中所述药物用于将所述MDM2抑制剂与一种或多种所述抗癌剂连续给药一个或多个疗程，包括1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个疗程，其中每个疗程持续至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少11天、至少12天、至少13天、至少14天、至少15天、至少16天、至少17天、至少18天、至少19天、至少20天、至少21天、至少22天、至少23天、至少24天、至少25天、至少30天、至少35天、至少40天、至少45天或至少50天；并且每两个疗程之间间隔0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10天、两周、三周或四周。

12.根据权利要求4至8中任一项所述的用途，其中所述药物被制备成将所述MDM2抑制剂与一种或多种所述抗癌剂以相同或不同途径给药的形式。

13.根据权利要求12所述的用途，其中所述药物被制备成将所述MDM2抑制剂与一种或多种所述抗癌剂均以口服给药的形式，或分别以口服或肠胃外给药的形式。

14.药盒，其包含：

(a)位于第一容器中的第一组分，所述第一组分包含MDM2抑制剂和任选的药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂，其中所述MDM2抑制剂是化合物2及其药学上可接受的盐：

(b)位于第二容器中的第二组分，所述第二组分包含一种或多种抗癌剂和任选的药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂，其中所述抗癌剂选自阿扎胞苷、地西他滨、阿糖胞苷中的一种或多种；

其中所述MDM2抑制剂与所述抗癌剂的重量比为100:1至1:100。

15.化合物2及其药学上可接受的盐与抗癌剂阿扎胞苷、阿糖胞苷二者组合或任意之一相结合在制备用于治疗成人复发或难治性急性髓性白血病和复发或难治性高危/极高危骨髓增生异常综合征的药物中的用途，

其中所述化合物2与所述抗癌剂的重量比为100:1至1:100。

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