TW202118488A

TW202118488A - Mdm2抑制劑的藥物組合物及其在預防和/或治療疾病中的用途

Info

Publication number: TW202118488A
Application number: TW109125174A
Authority: TW
Inventors: 大俊楊; 一帆翟; 唐秋琼; 東方; 靜鄧
Original assignee: 大陸商蘇州亞盛藥業有限公司; 香港商亞盛醫藥集團（香港）有限公司
Priority date: 2019-07-26
Filing date: 2020-07-24
Publication date: 2021-05-16
Also published as: JP2022501394A; EP4003332A1; CN112294965A; WO2021018032A1; US20220142979A1; EP4003332A4; CN112294965B; AU2020323033A1

Abstract

本發明涉及一種包含MDM2抑制劑和抗癌劑的藥物組合物，該藥物組合物提供了在預防和/或治療疾病（例如，癌症）的用途。

Description

MDM2抑制劑的藥物組合物及其在預防和/或治療疾病中的用途

本發明屬醫藥技術領域，具體涉及一種含有MDM2抑制劑和抗癌劑的藥物組合物及其在預防和/或治療疾病（例如，癌症）中的用途。

MDM2抑制劑干擾MDM2癌蛋白與腫瘤抑制因子p53蛋白的結合，從而起到藥物p53啟動劑的作用。不斷出現的證據表明，p53功能障礙也會加劇炎症並支持腫瘤免疫逃避，因此，p53功能障礙可作為腫瘤發生的免疫驅動因子（Guo G，Cancer Research，2017；77（9）：2292）。

MDM2和p53是自調節反饋回路的一部分(Wu等，Genes Dev .7:1126(1993))。MDM2在轉錄上是由p53和MDM2啟動的，進而，藉由至少三種機制來抑制p53活性(Wu等,Genes Dev.7:1126(1993))。第一，MDM2蛋白直接結合到p53反式啟動結構域，並且因此抑制p53介導的反式啟動。第二，MDM2蛋白含有核輸出訊號序列，並且在結合到p53時，誘導p53的核輸出，從而阻止p53與所標靶的DNA結合。第三，MDM2蛋白是一種E3泛素連接酶並且在結合到p53時，能夠促進p53降解。

隨著分子生物學的研究進展，分子標靶治療已成為醫藥研究（特別是腫瘤研究）的熱點，大部分腫瘤的生物學行為並非由單一訊號傳導通路所支配，而是多個訊號傳導通路共同起作用。因此，現有技術中存在針對不同靶蛋白和/或不同訊號轉導通路的聯合用藥的方案和產品存在需求，該聯合用藥的方案和產品能夠減少單藥劑量、降低單藥毒副作用和/或以協同作用的方式起作用，實現預防和/或治療疾病的目的。

本發明申請人現已發現，MDM2抑制劑或其可接受的鹽、載體、稀釋劑或賦形劑和抗癌劑、尤其是與高三尖杉酯鹼、去甲基化藥物和/或抗代謝藥物共同給藥可協同治療癌症。特別地，如本發明實施例1-10中所示，藉由聯合MDM2抑制劑（例如化合物2）和抗癌劑（例如地西他濱、阿扎胞苷、阿糖胞苷、曲美替尼、達拉菲尼和曲美替尼的組合、或氟維司瓊和阿培利司的組合）能夠出乎意料的更加顯著地上調P21蛋白、有效誘導P21的蓄積，延遲腫瘤生長，或導致腫瘤消退。

在本發明一方面中，提供一種藥物組合物，該藥物組合物包含MDM2抑制劑和一種或多種抗癌劑及任選的藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。

在較佳實施方式中，其中該MDM2抑制劑為下述結構式化合物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物：

其中：

選自由以下各項組成的組：

; B是C_4-7 碳環； R₁ 是H、取代或未取代的C_1-4 烷基、取代或未取代的C₃ -₈ 環烷基、取代或未取代的雜環烷基、OR^a 或NR^a R^b ； n是0、1或2； R₂ 、R₃ 、R₄ 、R₅ 、R₇ 、R₈ 、R₉ ，以及R₁₀ 獨立地選自由H、F、Cl、CH₃ 、以及CF₃ 組成的組； R₆ 是

； R^a 是氫或取代或未取代的C_1-4 烷基； R^b 是氫或取代或未取代的 C_1-4 烷基； R^c 和R^d 是環B的一個碳原子上的取代基，其中 R^c 是 H，C_1-3 烷基，C_1-3 亞烷基-OR^a ，OR^a ，或鹵代； R^d 是 H，C_1-3 烷基，C_1-3 亞烷基-OR^a ，OR^a ，或鹵代；或 R^c 和R^d 與它們所連接的碳一起形成4元至6元螺環取代基，該取代基任選地含有氧原子或氮原子；並且 R^e 是—C(=O)OR^a 、—C(=O)NR^a R^b ，或 —C(=O)NHSO₂ CH₃ 。

在較佳實施方式中，

是

； B 是

； R^c 和R^d 是F和F、H和H、OH和CH₃ 、CH₃ 和CH₃ 、CH₃ 和OH、H和OH、CH₂ CH₃ 和CH₂ CH₃ 、以及CH₂ OH和CH₂ OH。

在較佳實施方式中，所述的藥物組合物，其中—(CH₂ )_n R₁ 是H，CH₃ ，或CH₂ CH₃ 。

在較佳實施方式中，R₂ 是H；R₃ 是鹵代；R₄ 和R₅ 均是H。

在較佳實施方式中，R₇ 是鹵代；R₈ 、R₉ ，以及R₁₀ 中的每一個是H；R^e 是—C(═O)OH、—C(═O)NH₂ ，或—C(═O)NHSO₂ CH₃ 。

在較佳實施方式中，該MDM2抑制劑是化合物1及其藥學上可接受的鹽或溶劑化物：

。

在較佳實施方式中，該MDM2抑制劑是化合物2及其藥學上可接受的鹽或溶劑化物：

。

在較佳實施方式中，抗癌劑選自化療藥，包括高三尖杉酯鹼、去甲基化藥物和/或抗代謝藥物；較佳地，該去甲基化藥物包括阿扎胞苷、地西他濱、折布拉林、法紮拉濱或二氫-5’-胞苷；較佳地，該抗代謝藥物包括阿糖胞苷、安西他濱、吉西他濱或曲沙他濱。

在較佳實施方式中，抗癌劑選自MEK抑制劑；更佳地，該MEK抑制劑包括匹馬替尼、PD184352、PD0325901、塞魯米替尼、PD98059、U0126-EtOH、TAK-733、瑞法替尼、GDC-0623、RO4987655、RO5126766（CH5126766）、SL-327、BI-847325或曲美替尼。

在較佳實施方式中，抗癌劑選自以下的一種或多種：BRAF抑制劑、MEK抑制劑、雌激素受體抑制劑、PI3k抑制劑；其中該BRAF抑制劑選自索拉非尼、PLX-4720、瑞戈非尼(BAY 73-4506)、GDC-0879、RAF265、SB590885、AZ 628、ML 7866二鹽酸鹽、PF-04880594、TAK-632、CEP-32496、RO5126766或達拉非尼；該MEK抑制劑選自匹馬替尼、PD184352、PD0325901、塞魯米替尼、PD98059、U0126-EtOH、TAK-733、瑞法替尼、GDC-0623、RO4987655、RO5126766（CH5126766）、SL-327、BI-847325或曲美替尼；該雌激素受體抑制劑選自托瑞米芬、檸檬酸托瑞米芬、雌三醇、丙基吡唑三醇、AZD9496、LY88074、GDC-0924外消旋體、CMP8、OSpemifene D4、Bazedoxifene、呱多昔芬鹽酸鹽、拉索昔芬酒石酸酯、4-羥基他莫昔芬、克羅米芬枸櫞酸鹽、美曲諾、伊多西芬、4,4-亞氨基二苯酚、H3B-6545、H3B-6545鹽酸鹽、絞股藍皂苷SVII、DPN、Prinaberel、Way-200070、Nitromifene、ERB-196、Elacestrant、LSZ-102、(E/Z)-4-羥基他莫昔芬、二鹽酸Elacestrant、GDC-0927、AZD -9833、Endoxifen、LY117018、雌二醇、WAY-204688、他莫昔芬、檸檬酸他莫昔芬或氟維司瓊；該PI3K抑制劑選自伊達拉西布(CAL-101)、科潘立西(BAY80-6946）、布帕利西、AZD6482、GSK1059615、GSK2126458，GSK2636771，PQR309，PF-04691502，AMG319、3-甲基腺嘌呤、ly294002、Wortmannin、槲皮素、α-亞麻酸、Zandelisib、匹克替尼、IPI549、Dactolisib、Fimepinostat、SAR405、Duvelisib、PI-103、GDC-0077、阿培利司；更佳地，抗癌劑選自以下的一種或多種：達拉非尼、曲美替尼、氟維司瓊、阿培利司。

在較佳實施方式中，抗癌劑選自以下的一種或多種：達拉非尼、曲美替尼、氟維司瓊、阿培利司。

在較佳實施方式中，該MDM2抑制劑是化合物2及其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，其具有下式結構：

，該抗癌劑是阿扎胞苷（Azacitidine）、地西他濱（Decitabine）或阿糖胞苷（Cytarabine）。

，該抗癌劑是高三尖杉酯鹼（HHT，Homoharringtonine，Omacetaxine mepesuccinate）。

較佳實施方式中，該MDM2抑制劑是化合物2及其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，其具有下式結構：

，該抗癌劑是選自以下的一種或多種：BRAF抑制劑、MEK抑制劑、雌激素受體抑制劑、PI3k抑制劑；其中，該BRAF抑制劑選自索拉非尼、PLX-4720、瑞戈非尼(BAY 73-4506)、GDC-0879、RAF265、SB590885、AZ 628、ML 7866二鹽酸鹽、PF-04880594、TAK-632、CEP-32496、RO5126766或達拉非尼；該MEK抑制劑選自匹馬替尼、PD184352、PD0325901、塞魯米替尼、PD98059、U0126-EtOH、TAK-733、瑞法替尼、GDC-0623、RO4987655、RO5126766（CH5126766）、SL-327、BI-847325或曲美替尼；該雌激素受體抑制劑選自托瑞米芬、檸檬酸托瑞米芬、雌三醇、丙基吡唑三醇、AZD9496、LY88074、GDC-0924外消旋體、CMP8、OSpemifene D4、Bazedoxifene、呱多昔芬鹽酸鹽、拉索昔芬酒石酸酯、4-羥基他莫昔芬、克羅米芬枸櫞酸鹽、美曲諾、伊多西芬、4,4-亞氨基二苯酚、H3B-6545、H3B-6545鹽酸鹽、絞股藍皂苷SVII、DPN、Prinaberel、Way-200070、Nitromifene、ERB-196、Elacestrant、LSZ-102、(E/Z)-4-羥基他莫昔芬、二鹽酸Elacestrant、GDC-0927、AZD -9833、Endoxifen、LY117018、雌二醇、WAY-204688、他莫昔芬、檸檬酸他莫昔芬或氟維司瓊；該PI3K抑制劑選自伊達拉西布(CAL-101)、科潘立西(BAY80-6946）、布帕利西、AZD6482、GSK1059615、GSK2126458，GSK2636771，PQR309，PF-04691502，AMG319、3-甲基腺嘌呤、ly294002、Wortmannin、槲皮素、α-亞麻酸、Zandelisib、匹克替尼、IPI549、Dactolisib、Fimepinostat、SAR405、Duvelisib、PI-103、GDC-0077、阿培利司。

，該抗癌劑選自以下的一種或多種：達拉非尼、曲美替尼、氟維司瓊、阿培利司；較佳地，抗癌劑為：達拉非尼與曲美替尼的組合，或者氟維司瓊與阿培利司的組合；更佳地，化合物2與抗癌劑達拉非尼、曲美替尼二者的組合或任意之一的重量比為100:1 至 1:100, 包括100:1，95:1，90:1，85:1，80:1，75:1，70:1，65:1，60:1，55:1，50:1，45:1，40:1，35:1，30:1，25:1，20:1，15:1，10:1，9:1，8:1，7:1，6:1，5:1，4:1，3:1，2:1，0.8:1，1:1，1.6:1，8:15，1:2，1:3，1:4，1:5，1:6，1:7，1:8，1:9，1:10，1:15，1:20，1:25，1:30，1:35，1:40，1:45，1:50，1:55，1:60，1:65，1:70，1:75，1:80，1:85，1:90，1:95或1:100；甚至更佳地，化合物2與達拉非尼、曲美替尼的重量比為（40-60）：（20-40）：（1-3），較佳為50：30：1；或者化合物2與抗癌劑氟維司瓊、阿培利司的二者組合或任意之一的重量比為100:1 至 1:100, 包括100:1，95:1，90:1，85:1，80:1，75:1，70:1，65:1，60:1，55:1，50:1，45:1，40:1，35:1，30:1，25:1，20:1，15:1，10:1，9:1，8:1，7:1，6:1，5:1，4:1，3:1，2:1，0.8:1，1:1，1.6:1，8:15，1:2，1:3，1:4，1:5，1:6，1:7，1:8，1:9，1:10，1:15，1:20，1:25，1:30，1:35，1:40，1:45，1:50，1:55，1:60，1:65，1:70，1:75，1:80，1:85，1:90，1:95或1:100；甚至更佳地，化合物2與氟維司瓊、阿培利司的重量比為（40-60）：（10-30）：（20-40），較佳為50：20：25。

在較佳實施方式中，該藥物組合物呈片劑、膠囊劑、顆粒劑、糖漿劑、粉劑、錠劑、藥囊、扁囊劑、酏劑、混懸劑、乳劑、溶液、糖漿劑、氣霧劑、軟膏劑、乳膏劑和注射劑的形式。

在較佳實施方式中，該MDM2抑制劑或該抗癌劑的重量比（或摩爾比）是100:1 至 1:100, 包括100:1，95:1，90:1，85:1，80:1，75:1，70:1，65:1，60:1，55:1，50:1，45:1，40:1，35:1，30:1，25:1，20:1，15:1，10:1，9:1，8:1，7:1，6:1，5:1，4:1，3:1，2:1，0.8:1，1:1，1.6:1，8:15，1:2，1:3，1:4，1:5，1:6，1:7，1:8，1:9，1:10，1:15，1:20，1:25，1:30，1:35，1:40，1:45，1:50，1:55，1:60，1:65，1:70，1:75，1:80，1:85，1:90，1:95或1:100。

在本發明另一方面中，提供該藥物組合物在製備用於預防和/或治療疾病的藥物中的用途，該疾病是癌症。

在本發明另一方面中，提供預防和/或治療疾病的方法，對有需要的個體施用所述的藥物組合物，包括施用預防和/或治療有效量的該MDM2抑制劑和抗癌劑，該疾病是癌症。

在較佳實施方式中，該癌症選自腎上腺皮質癌，晚期癌症，肛門癌，再生障礙性貧血，膽管癌，膀胱癌，骨癌，骨轉移，成人腦/中樞神經系統腫瘤，兒童腦/中樞神經系統腫瘤，乳腺癌癌症，男性乳腺癌，兒童癌症，原位癌未知癌症，Castleman病，子宮頸癌，結腸/直腸癌，子宮內膜癌，食道癌，Ewing腫瘤家族，眼癌，膽囊癌，胃腸道類癌，胃腸道間質瘤腫瘤（GIST），妊娠滋養細胞疾病，頭頸癌，何杰金氏症，卡波西肉瘤，腎癌，喉癌和下嚥癌，成人白血病急性淋巴性白血病（ALL），急性骨髓性白血病（AML），慢性淋巴細胞白血病（CLL），慢性粒細胞白血病（CML），慢性粒單核細胞白血病（CMML），兒童白血病，肝癌，非小細胞肺癌，小細胞肺癌，肺癌腫瘤，皮膚淋巴瘤，惡性間皮瘤，多發性骨髓瘤，骨髓增生不良症候群（MDS），鼻腔和鼻竇癌，鼻咽癌，神經母細胞瘤，非何杰金氏淋巴瘤，兒童非何杰金氏淋巴瘤，口腔和口咽癌，骨肉瘤，卵巢癌癌症，胰腺癌，陰莖癌，垂體瘤，前列腺癌，視網膜母細胞瘤，橫紋肌肉瘤，唾液腺癌，成人軟組織癌，皮膚癌、諸如基底和鱗狀細胞癌、黑色素瘤，小腸癌，胃癌，睾丸癌症，胸腺癌，甲狀腺癌，子宮肉瘤，陰道癌，外陰癌，瓦爾登斯特倫巨球蛋白血症和威爾姆斯腫瘤。

在較佳實施方式中，癌症選自急性骨髓性白血病（AML）、急性淋巴性白血病（ALL）、骨髓增生不良症候群（MDS）、黑色素瘤和乳腺癌。

在較佳實施方式中，該MDM2抑制劑或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物以約0.0025-5000mg/日的量給藥。例如約0.005、0.05、0.5、5、10、20、30、40、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500或5000 mg/日的量給藥。

在較佳實施方式中，將該MDM2抑制劑或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物以每單位劑量約1 ng/kg至約200 mg/kg、約1 μg/kg至約100 mg/kg或者約1 mg/kg至約50 mg/kg的量給藥，例如以每單位劑量約1 μg/kg、約10 μg/kg、約25 μg/kg、約50 μg/kg、約75 μg/kg、約100 μg/kg、約125 μg/kg、約150 μg/kg、約175 μg/kg、約200 μg kg、約225 μg/kg、約250 μg kg、約275 μg kg、約300 μg/kg、約325 μg kg、約350 μg/kg、約375 μg/kg、約400 μg/kg、約425 μg/kg、約450 μg/kg、約475 μg/kg、約500 μg/kg、約525 μg kg、約550 μg/kg、約575 μg kg、約600 μg/kg、約625 μg/kg、約650 μg/kg、約675 μg/kg、約700 μg/kg、約725 μg/kg、約750 μg/kg、約775 μg/kg、約800 μg/kg、約825 μg/kg、約850 μg/kg、約875 μg/kg、約900 μg/kg、約925 μg/kg、約950 μg/kg、約975 μg/kg、約1 mg/kg、約5 mg/kg、約10 mg/kg、約15 mg/kg、約20 mg/kg、約25 mg/kg、約30 mg/kg、約35 mg/kg、約40 mg/kg、約45 mg/kg、約50 mg/kg、約60 mg/kg、約70 mg/kg、約80 mg/kg、約90 mg/kg、約100 mg/kg、約125 mg/kg、約150 mg/kg、約175 mg/kg、約200 mg/kg的量給藥。

在較佳實施方式中，將一種或多種該抗癌劑或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物以約0.0025-5000mg/日的量給藥，包括約0.005、0.05、0.5、5、10、20、30、40、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500或5000 mg/日的量給藥。

在較佳實施方式中，將一種或多種該抗癌劑或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物以每單位劑量約1 ng/kg至約200 mg/kg、約1 μg/kg至約100 mg/kg或者約1 mg/kg至約50 mg/kg的量給藥，例如以每單位劑量約1 μg/kg、約10 μg/kg、約25 μg/kg、約50 μg/kg、約75 μg/kg、約100 μg/kg、約125 μg/kg、約150 μg/kg、約175 μg/kg、約200 μg kg、約225 μg/kg、約250 μg kg、約275 μg kg、約300 μg/kg、約325 μg kg、約350 μg/kg、約375 μg/kg、約400 μg/kg、約425 μg/kg、約450 μg/kg、約475 μg/kg、約500 μg/kg、約525 μg kg、約550 μg/kg、約575 μg kg、約600 μg/kg、約625 μg/kg、約650 μg/kg、約675 μg/kg、約700 μg/kg、約725 μg/kg、約750 μg/kg、約775 μg/kg、約800 μg/kg、約825 μg/kg、約850 μg/kg、約875 μg/kg、約900 μg/kg、約925 μg/kg、約950 μg/kg、約975 μg/kg、約1 mg/kg、約5 mg/kg、約10 mg/kg、約15 mg/kg、約20 mg/kg、約25 mg/kg、約30 mg/kg、約35 mg/kg、約40 mg/kg、約45 mg/kg、約50 mg/kg、約60 mg/kg、約70 mg/kg、約80 mg/kg、約90 mg/kg、約100 mg/kg、約125 mg/kg、約150 mg/kg、約175 mg/kg、約200 mg/kg的量給藥。

在較佳實施方式中，將該MDM2抑制劑、一種或多種該抗癌劑同時、並行或組合給藥。

在較佳實施方式中，將該MDM2抑制劑、一種或多種該抗癌劑連續給藥至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少11天、至少12天、至少13天、至少14天、至少15天、至少16天、至少17天、至少18天、至少19天、至少20天、至少21天、至少22天、至少23天、至少24天、至少25天、至少30天、至少35天、至少40天、至少45天或至少50天。

在較佳實施方式中，將該MDM2抑制劑、一種或多種該抗癌劑連續給藥一個或多個療程，包括1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個療程，其中每個療程持續至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少11天、至少12天、至少13天、至少14天、至少15天、至少16天、至少17天、至少18天、至少19天、至少20天、至少21天、至少22天、至少23天、至少24天、至少25天、至少30天、至少35天、至少40天、至少45天或至少50天；並且每兩個療程之間間隔0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10天、兩週、三週或四週。

在較佳實施方式中，將該MDM2抑制劑、一種或多種該抗癌劑以相同(如口服)或不同途徑(如分別以口服及腸胃外(如注射))給藥，包括口服、口腔、吸入噴霧、舌下、直腸、透皮、陰道黏膜、透黏膜、局部給藥，鼻或腸道給藥，注射給藥，如肌肉注射、皮下注射、髓內注射，以及鞘內、腦部直接給藥、原位給藥、皮下、腹腔內、靜脈注射、關節內滑膜、胸骨、內、肝內、病灶內，顱內、腹腔、鼻腔、或眼內注射或其他藥物遞送途徑。

在本發明另一方面中，提供一種藥盒，其包含： (a) 位於第一容器中的第一組分，該第一組分包含該MDM2抑制劑和任選的藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑； (b) 位於第二容器中的第二組分，該第二組分包含所述的一種或多種抗癌劑和任選的藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。

除非在下文中另有定義，本文中所用的所有技術術語和科學術語的含義意圖與本領域技術人員通常所理解的相同。提及本文中使用的技術意圖指在本領域中通常所理解的技術，包括那些對本領域技術人員顯而易見的技術的變化或等效技術的替換。雖然相信以下術語對於本領域技術人員很好理解，但仍然闡述以下定義以更好地解釋本發明。

本申請中引用的所有參考文獻（包括參考文獻、授權專利、揭露的專利申請和待審查的專利申請）的內容，特此作為參考，明確地包含在本發明中。除非另有規定，本發明中所使用的所有技術和科學術語均符合本領域普通技術人員所熟知的含義。定義

在本文中所使用的術語“包括”、“包含”、“具有”、“含有”或“涉及”及其在本文中的其它變體形式為包含性的(inclusive)或開放式的，且不排除其它未列舉的元素或方法步驟。

在本文中使用的術語“MDM2抑制劑”是指競爭結合MDM2的物質、影響MDM2與p53蛋白結合的物質、抑制MDM2活性的物質、或降解MDM2的物質或降低MDM2水準的基因工具。

在本文中使用的術語“MDM2相關蛋白質”指的是與MDM2具有至少25％序列同源性並且與p53或p53相關蛋白質相互作用並抑制p53或p53相關蛋白質的蛋白質。MDM2相關蛋白質的實例包括但不限於MDMX。

在本文中使用的術語“功能性p53”指的是在正常水準、高水準或低水準表達的野生型p53和p53的突變變體或等位基因變體，這些變體保留野生型p53的活性的至少約5％，例如野生型活性的至少約10％、約20％、約30％、約40％、約50％、或更多。

在本文中使用的術語“p53相關蛋白質”指的是與p53具有至少25％序列同源性，具有腫瘤抑制因子活性，並且藉由與MDM2或MDM2相關蛋白質的相互作用而受到抑制的蛋白質。p53相關蛋白質的實例包括但不限於p63和p73。

在本文中使用的術語“藥學上可接受的鹽”是指游離酸或游離鹼的鹽，通常藉由將游離鹼與合適的有機或無機酸反應或者藉由將酸與合適的有機或無機鹼反應而進行製備。該術語可以用於本發明中的任何化合物。代表性的鹽包括：乙酸鹽、苯磺酸鹽、苯甲酸鹽、碳酸氫鹽、硫酸氫鹽、酒石酸氫鹽、硼酸鹽、溴化物、依地酸鈣鹽、樟腦磺酸鹽、碳酸鹽、氯化物、克拉維酸鹽、檸檬酸鹽、二鹽酸鹽、依地酸鹽、乙二磺酸鹽、丙酸酯月桂硫酸鹽(estolate)、乙磺酸鹽(esylate)、富馬酸鹽、葡庚糖酸鹽、葡萄糖酸鹽、谷氨酸鹽、甘苯砷酸鹽(glycol lylarsanilate)、己基間苯二酚酸鹽(hexylres或cinate)、哈胺鹽(hydrabamine)、氫溴酸鹽、鹽酸鹽、羥萘酸鹽、碘化物、羥乙基磺酸鹽、乳酸鹽、乳糖酸鹽、月桂酸鹽、蘋果酸鹽、馬來酸鹽、扁桃酸鹽、甲磺酸鹽、甲溴酸鹽、甲硝酸鹽、甲硫酸鹽、馬來酸單鉀鹽、黏酸鹽(Mucate)、萘磺酸鹽、硝酸鹽、N-甲葡萄糖胺鹽、草酸鹽、巴莫酸鹽(雙羥萘酸鹽)、棕櫚酸鹽、泛酸鹽、磷酸鹽/二磷酸鹽、聚半乳糖醛酸鹽、鉀鹽、水楊酸鹽、鈉鹽、硬脂酸鹽、次乙酸鹽、琥珀酸鹽、丹寧酸鹽、酒石酸鹽、茶氯酸鹽、對甲苯磺酸鹽、三乙基碘鹽(triethiodide)、三甲胺鹽和戊酸鹽。當酸性取代基存在時，例如-COOH，可以形成銨鹽、嗎啉鹽、鈉鹽、鉀鹽、鋇鹽、鈣鹽等以供劑型使用。當鹼性基團存在時(例如在檸檬苦素類化合物或1，1-二甲基雙胍中)，例如氨基或鹼性雜芳基如吡啶基，可形成酸性鹽，如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、磷酸鹽、硫酸鹽、三氟乙酸鹽、三氯乙酸鹽、乙酸鹽、草酸鹽、馬來酸鹽、丙酮酸鹽、丙二酸鹽、琥珀酸鹽、檸檬酸鹽、酒石酸鹽、富馬酸鹽、扁桃酸鹽、苯甲酸鹽、肉桂酸鹽、甲磺酸鹽、乙磺酸鹽、苦味酸鹽等。適合的鹽的綜述參見Stahl及Wermuth的“Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use” (Wiley-VCH, 2002)。

在本文中使用的術語“溶劑化物”是本發明所涉及的化合物與溶劑分子的組合、物理結合、和/或溶劑合，例如二溶劑化物、單溶劑化物、半溶劑化物。本發明涉及的化合物可以以與例如水、甲醇、乙醇等藥學上可接受溶劑形成溶劑化形式，其不顯著影響化合物的藥理學活性或毒性且這樣可以作為藥理學等價物起作用。

一種類型的溶劑化物為水合物。“水合物”涉及溶劑合物的特定子集，其中溶劑分子為水。溶劑合物通常可以藥理學等同物的形式發揮作用。溶劑合物的製備是本領域已知的，參見例如M. Caira等人, J. Pharmaceut. Sci., 93(3):601-611 (2004)，其記載用乙酸乙酯和用水製備氟康唑的溶劑合物。溶劑合物、半溶劑合物、水合物等的類似製備描述於van Tonder等人, AAPS Pharm. Sci. Tech., 5(1):Article 12 (2004)以及A.L. Bingham等人, Chem. Commun. 603-604 (2001)中。溶劑合物的代表性、非限制性製備方法涉及將本發明的化合物在期望的溶劑(有機溶劑、水或其混合物)中於高於20°C至約25°C的溫度下溶解，然後將溶液以足以形成晶體的速率冷卻，並藉由已知的方法(例如過濾)分離晶體。可使用分析技術(諸如紅外光譜法)確證溶劑存在於溶劑合物的晶體中。

在本文中使用的“藥學上可接受的載體”是指與治療劑一同給藥的稀釋劑、輔劑、賦形劑或媒介物，並且其在合理的醫學判斷的範圍內適於接觸人類和/或其它動物的組織而沒有過度的毒性、刺激、過敏反應或與合理的益處/風險比相應的其它問題或併發症。

在本發明的藥物組合物或藥盒中可使用的藥學上可接受的載體包括但不限於無菌液體，例如水和油，包括那些石油、動物、植物或合成來源的油，例如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等。當該藥物組合物藉由靜脈內給藥時，水是示例性載體。還可以使用生理食鹽水和葡萄糖及甘油水溶液作為液體載體，特別是用於注射液。適合的藥物賦形劑包括澱粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽糖、白堊、矽膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、滑石、氯化鈉、脫脂奶粉、甘油、丙二醇、水、乙醇等。該藥物組合物還可以視需要包含少量的濕潤劑、乳化劑或pH緩衝劑。口服製劑可以包含標準載體，如藥物級的甘露醇、乳糖、澱粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等。適合的藥學上可接受的載體的實例如在Remington’s Pharmaceutical Sciences (1990)中所述。

本發明的藥物組合物及藥盒中的各組分可以全身性地作用和/或局部地作用。為此目的，它們可以適合的途徑給藥，例如藉由注射(如靜脈內、動脈內、皮下、腹膜內、肌內注射，包括滴注)或經皮給藥；或藉由口服、含服、經鼻、透黏膜、局部、以眼用製劑的形式或藉由吸入給藥。對於這些給藥途徑，可以適合的劑型給藥本發明的藥物組合物及藥盒中的各組分。

在本文中使用的術語“容器”為用於容納藥物組分的容器。此容器可用於製備、儲存、運輸和/或獨立/批量銷售，其意圖涵蓋瓶、罐、小瓶、燒瓶、注射器、管(例如用於乳膏製品)，或者用於製備、容納、儲存或分配藥物產品的任何其它容器。

在本文使用的術語“預防”是指當用於疾病或病症(例如癌症)時，與未施用化合物或藥物（例如，本申請要求保護的藥物組合物）的個體相比，該化合物或藥物能降低個體體內的醫學病症症狀的頻率或推遲其發病。

在本文中使用的術語“治療”是指減輕、緩解或改善疾病或病症的症狀，改善潛在的代謝引起的症狀，抑制疾病或症狀，例如阻止疾病或病症的房展、緩解疾病或病症、引起疾病或病症的消退、緩解疾病或病症引起的病況、或阻止疾病或病症的症狀。術語“治療”還包括復發預防或階段預防、以及治療急性或慢性體症、症狀和/或功能失調。治療可以是以症狀為導向的，例如以抑制症狀。它可以在短時間內實現、在中期內被導向、或者可以是長期治療，例如在維持治療的背景下。

在本文中使用的術語“癌症”是指由異常的不受控制的細胞生長引起的新生物或腫瘤。非限制性的例子包括那些在發明詳述中所描述的示例性癌症。術語“癌症”包括同時涉及惡化前癌細胞和惡性癌細胞的疾病。

在本文中使用的術語“個體”包括人或非人動物。示例性人個體包括患有疾病(例如本文所述的疾病)的人個體(稱為患者)或正常個體。本發明中“非人動物”包括所有脊椎動物，例如非哺乳動物(例如鳥類、兩棲動物、爬行動物)和哺乳動物，例如非人靈長類、家畜和/或馴化動物(例如綿羊、犬、貓、奶牛、豬等)。當個體是人類患者（通常體重按60kg來計算）時，除非另有說明，本發明所述的劑量可採用與實驗動物的轉換因子（例如，人用劑量=小鼠劑量/12.3）進行換算得到（請參考Kin Tam. “Estimating the “First in human” dose-a revisit with particular emphasis on oncology drugs, ADMET & DMPK 1(4)(2013)63-75）。本領域的普通技術人員能夠根據一般常識，根據個體的具體體重、疾病的種類和嚴重程度以及其它因素對該劑量進行合理調整，這些調整的技術方案均落入本發明要求保護的技術方案的範圍之內。

在本文中使用的術語“有效量”或“預防和/或治療有效量”是指施用的藥物或化合物的足夠量（例如，劑量），其將在一定程度上減輕被治療的疾病或病症的一種或多種症狀。結果可以是縮小和/或減輕病症或疾病原因或任意其它期望的生物系統的改變。例如，用於治療用途的“有效量”是提供以使疾病或病症的臨床症狀顯著減輕、而不產生過度的毒副作用的化合物或藥物（例如，本申請要求保護的藥物組合物）的量。有效量的該藥劑可以減少(即在某種程度上延緩並且較佳地阻止)有害的細胞增殖；減少癌細胞數目；減小腫瘤大小；抑制(即在某種程度上延緩並且較佳地阻止)癌細胞浸潤到外周器官中；抑制(即在某種程度上延緩並且較佳地阻止)腫瘤轉移；在某種程度上抑制腫瘤生長；減少MDM2和MDM2相關蛋白質與p53和p53相關蛋白質的相互作用；和/或在某種程度上將與癌症相關的症狀中的一個或多個緩解至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或100％。就所施用的化合物或組合物阻止生長和/或殺滅現有的癌細胞來說，它可以具有細胞抑制性和/或細胞毒性。

在本文中使用的術語“並行給藥”、“組合給藥”、“同時給藥”以及類似的短語意指向所治療的受試者並行地施用兩種或更多種藥劑。“並行地”意指同時或者按照任何順序在不同的時間點依次施用每一種藥劑。然而，如果不同時施用，那麼意指它們是按一定的順序向個體施用並且在時間上是足夠接近的以提供所期望的治療作用並且可以起協同作用。舉例來說，本發明MDM2抑制劑（如化合物1和化合物2）可以與抗癌劑同時或按照任何順序在不同的時間點依次施用。本發明的MDM2抑制劑和抗癌劑可以任何適當的形式並且藉由任何合適的途徑分開施用。在本發明的MDM2抑制劑和抗癌劑不是被並行施用時，應當瞭解的是，它們可以按照任何順序向有需要的受試者施用。舉例來說，本發明的MDM2抑制劑可以在施用抗癌劑治療模式(例如放射治療)之前(例如之前5分鐘、15分鐘、30分鐘、45分鐘、1小時、2小時、4小時、6小時、12小時、24小時、48小時、72小時、96小時、1週、2週、3週、4週、5週、6週、8週、或12週)、同時、或之後(例如之後5分鐘、15分鐘、30分鐘、45分鐘、1小時、2小時、4小時、6小時、12小時、24小時、48小時、72小時、96小時、1週、2週、3週、4週、5週、6週、8週、或12週)向有需要的個體施用。在各種實施方案中，本發明MDM2抑制劑（如化合物1和化合物2）和抗癌劑是相隔1分鐘、相隔10分鐘、相隔30分鐘、相隔少於1小時、相隔1小時、相隔1小時至2小時、相隔2小時至3小時、相隔3小時至4小時、相隔4小時至5小時、相隔5小時至6小時、相隔6小時至7小時、相隔7小時至8小時、相隔8小時至9小時、相隔9小時至10小時、相隔10小時至11小時、相隔11小時至12小時、相隔不超過24小時或相隔不超過48小時施用的。在一個實施方案中，聯合治療的組分是相隔1分鐘至24小時施用的。

在本文中使用的術語“劑量”是指每千克（kg）個體體重的活性物質的重量（例如，毫克（mg））。

在本文中使用的術語“IC₅₀ ”是指在測量這樣的效應的試驗中獲得最大效應的50%抑制，例如BCL-2或MDM2的抑制的特定測試化合物或藥物的量、濃度或劑量。

在本文使用的術語“室溫”是指25℃±1℃。同時，若沒有具體指明實驗溫度，均為室溫。

在本文使用的術語“約”是指該術語所修飾的數值的±10%，更佳為±5%，最佳為±2%，因此本領域的普通技術人員能夠清楚地根據所修飾的數值確定術語“約”的範圍。

術語“C₁ -₄ 烷基”指的是任意的含有1－4個碳原子的直鏈或支鏈基團，例如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、叔丁基、仲丁基等。

術語“C₁ -₃ 烷基”指的是任意的含有1－3個碳原子的直鏈或支鏈基團，例如甲基、乙基、正丙基、異丙基等。

術語“C₁ -₃ 亞烷基”指的是上述“C₁ -₃ 烷基”去除一個氫原子所獲得的基團。

在本文中使用的術語 “雜環”指的是雜芳基環系和雜環烷基環。術語“C₃ -₈ 環烷基”意指含有三個至八個碳原子的單環或雙環、飽和或部分不飽和的環系，包括環丙基、環丁基、環戊基、環己基、環庚基、以及環辛基，該環系任選地被獨立選擇的例如鹵代、三氟甲基、三氟甲氧基、羥基、烷氧基、硝基、氰基、烷氨基、或氨基中的一個或多個，並且通常一個至三個取代。術語“雜環烷基”意指總共含有4個至12個原子的單環或雙環、飽和或部分不飽和的環系，其中該原子中的一個至五個獨立地選自氮、氧、以及硫並且其餘原子是碳。雜環烷基的非限制性實例是氮雜環丁基、吡咯烷基、呱啶基、呱嗪基、二氫吡咯基、嗎啉基、硫代嗎啉基、二氫吡啶基、氧雜環庚基、二氧雜環庚基、硫雜環庚基、二氮雜環庚基，它們各自任選地在環的原子上被獨立選擇的鹵代、C1-6烷基、C1-6烷氧基、氰基、氨基、氨甲醯基、硝基、羧基、C2-7烯基、C2-7炔基等中的一個或多個，並且通常一個至三個取代。術語“鹵素”或“鹵代”意指週期系ⅦA族元素和原子，包括氟（F）、氯（Cl）、溴（Br）、碘（I）、砹（At）、石田（Ts）。

在本文中使用的類似 “雜環”、“雜環烷基”、 “C_3-8 環烷基”和“鹵素”等具有本領域通常的含義，且本領域的普通技術人員藉由一般知識或參考現有技術（例如WO2015/161032，藉由全文引入本發明作為參參考）能夠知曉其含義。藥物組合物和藥盒

本發明第一方面涉及一種藥物組合物，包含MDM2抑制劑和抗癌劑，及任選的藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。所揭露的MDM2抑制劑抑制p53或p53相關蛋白與MDM2或MDM2相關蛋白之間的相互作用。藉由抑制MDM2或MDM2相關蛋白對p53或p53相關蛋白的負面影響，本發明MDM2抑制劑使細胞敏感以誘導細胞凋亡和/或細胞週期阻滯。

在較佳實施方式，該MDM2抑制劑為下述結構式化合物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物：

其中：

選自由以下各项組成的組：

; B是C_4-7 碳環； R₁ 是H、取代或未取代的C_1-4 烷基、取代或未取代的C₃ -₈ 環烷基、取代或未取代的雜環烷基、OR^a 或NR^a R^b ； n是0、1或2； R₂ , R₃ , R₄ , R₅ , R₇ , R₈ , R₉ ,以及R₁₀ 獨立地選自由H、F、Cl、CH₃ 、以及CF₃ 組成的組； R₆ 是

; R^a 是氫或取代或未取代的C_1-4 烷基; R^b 是氫或取代或未取代的 C_1-4 烷基; R^c 和R^d 是環B的一個碳原子上的取代基，其中 R^c 是 H, C_1-3 烷基, C_1-3 亞烷基-OR^a , OR^a , 或鹵代; R^d 是 H, C_1-3 烷基, C_1-3 亞烷基-OR^a , OR^a , 或鹵代; 或 R^c 和R^d 與它們所連接的碳一起形成4元至6元螺環取代基，該取代基任選地含有氧原子或氮原子；並且 R^e 是—C(=O)OR^a ,—C(=O)NR^a R^b ,或—C(=O)NHSO₂ CH₃ 。

在較佳實施方式中，其中

是

; B 是

; R^c 和R^d 是F和F、H和H、OH和CH₃ 、CH₃ 和CH₃ 、CH₃ 和OH、H和OH、CH₂ CH₃ 和CH₂ CH₃ 、以及CH₂ OH和CH₂ OH。

在較佳實施方式中，—(CH₂ )_n R₁ 是H, CH₃ , 或CH₂ CH₃ 。

在較佳實施方式中，R₂ 是H。

在較佳實施方式中，R₃ 是鹵代。

在較佳實施方式中，R₄ 和R₅ 均是H。

在較佳實施方式中，R₇ 是鹵代。

在較佳實施方式中，R₈ , R₉ ,以及R₁₀ 中的每一個是H。

在較佳實施方式中，R^e 是—C(═O)OH, —C(═O)NH₂ 或—C(═O)NHSO₂ CH₃ 。

在較佳實施方式中，R_c 和R_d 連同環B一起形成

在較佳實施方式中，R₆ 是：

。

在較佳實施方式中，MDM2抑制劑選自：

在較佳實施方式中，MDM2抑制劑是化合物1及其藥學上可接受的鹽或溶劑化物：

在較佳實施方式中，MDM2抑制劑是化合物2及其藥學上可接受的鹽或溶劑化物：

，該抗癌劑是阿扎胞苷、地西他濱和/或阿糖胞苷，結構如下：阿扎胞苷（Azacitidine），CAS號：320-67-2，

，地西他濱（Decitabine），CAS號：2353-33-5，

，阿糖胞苷（Cytarabine），CAS號：147-94-4，

，達拉非尼（dabrafenib）、曲美替尼（trametinib）、氟維司瓊（fulvestrant）和阿培利司（alpelisib）。

，該抗癌劑是高三尖杉酯鹼（HHT，Homoharringtonine，Omacetaxine mepesuccinate，HHRT），CAS號：26833-87-4，結構如下：

。

本發明所用的高三尖杉酯鹼、阿扎胞苷、地西他濱和/或阿糖胞苷均為市購，可在Selleck官網購買。

在較佳實施方式中，藥物組合物或該MDM2抑制劑或該抗癌劑呈片劑、膠囊劑、顆粒劑、糖漿劑、粉劑、錠劑、藥囊、扁囊劑、酏劑、混懸劑、乳劑、溶液、糖漿劑、氣霧劑、軟膏劑、乳膏劑和注射劑的形式。

在較佳實施方式中，該MDM2抑制劑和抗癌劑各自呈單獨的製劑形式。

本發明所提供的藥盒，其包含： (a) 位於第一容器中的第一組分，該第一組分包含該MDM2抑制劑和任選的藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑，該MDM2抑制劑較佳為本發明第一方面所具體描述的化合物及其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，例如化合物1和化合物2。 (b) 位於第二容器中的第二組分，該第二組分包含所述的一種或多種抗癌劑和任選的藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑，該抗癌劑較佳為本發明第一方面所具體描述的高三尖杉酯鹼、去甲基化藥物和/或抗代謝藥物，例如阿扎胞苷、地西他濱和/或阿糖胞苷。用途和治療方法

本發明第二方面涉及該藥物組合物在製備用於預防和/或治療疾病的藥物中的用途，該疾病是癌症。

在較佳實施方式中，該藥物組合物包含MDM2抑制劑和抗癌劑，及任選的藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。MDM2抑制劑較佳為本發明第一方面所具體描述的化合物及其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，例如化合物1和化合物2。抗癌劑較佳為本發明第一方面所具體描述的高三尖杉酯鹼、去甲基化藥物和/或抗代謝藥物，例如阿扎胞苷、地西他濱和/或阿糖胞苷。

在更佳實施方式中，癌症選自急性骨髓性白血病（AML）、急性淋巴性白血病（ALL）、骨髓增生不良症候群（MDS）、黑色素瘤和乳腺癌。

另外，本發明涉及化合物2單藥及聯合阿扎胞苷或阿糖胞苷在製備用於治療成人復發或難治性急性髓性白血病和復發或難治性高危/極高危骨髓增生不良症候群的藥物中的用途。

再另外，本發明涉及化合物2在製備用於治療骨髓增生不良症候群（MDS）的藥物中的用途：

。

或者，本發明涉及化合物2與達拉非尼、曲美替尼的組合在製備用於治療黑色素瘤的藥物中的用途；較佳地，化合物2與達拉非尼、曲美替尼的重量比為50：30：1。

再或者，本發明涉及化合物2與氟維司瓊、阿培利司的組合在製備用於治療乳腺癌的藥物中的用途；較佳地，化合物2與氟維司瓊、阿培利司的重量比為50：20：25。

本發明第三方面涉及一種預防和/或治療疾病的方法，對有需要的個體施用所述的藥物組合物，包括施用預防和/或治療有效量的該MDM2抑制劑和抗癌劑，該疾病是癌症。

在較佳實施方式中，該藥物組合物包含MDM2抑制劑和抗癌劑，及任選的藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。MDM2抑制劑較佳為本發明第一方面所具體描述的化合物及其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，例如化合物2。抗癌劑較佳為本發明第一方面所具體描述的高三尖杉酯鹼、去甲基化藥物和/或抗代謝藥物，例如阿扎胞苷、地西他濱和/或阿糖胞苷。例如施用化合物2和阿扎胞苷，化合物2和地西他濱，化合物2和阿糖胞苷。

在較佳實施方式中，該癌症選自腎上腺皮質癌，晚期癌症，肛門癌，再生障礙性貧血，膽管癌，膀胱癌，骨癌，骨轉移，成人腦/中樞神經系統腫瘤，兒童腦/中樞神經系統腫瘤，乳腺癌癌症，男性乳腺癌，兒童癌症，原位癌未知癌症，Castleman病，子宮頸癌，結腸/直腸癌，子宮內膜癌，食道癌，Ewing腫瘤家族，眼癌，膽囊癌，胃腸道類癌，胃腸道間質瘤腫瘤（GIST），妊娠滋養細胞疾病，頭頸癌，何杰金氏症，卡波西肉瘤，腎癌，喉癌和下嚥癌，成人白血病急性淋巴性（ALL），白血病 - 急性骨髓性白血病（AML），慢性淋巴細胞白血病（CLL），白血病 - 慢性粒細胞白血病（CML），白血病 - 慢性粒單核細胞白血病（CMML），兒童白血病，肝癌，肺癌 - 非小細胞，肺癌 - 小細胞，肺癌腫瘤，皮膚淋巴瘤，惡性間皮瘤，多發性骨髓瘤，骨髓增生不良症候群（MDS），鼻腔和鼻竇癌，鼻咽癌，神經母細胞瘤，非何杰金氏淋巴瘤，兒童非何杰金氏淋巴瘤，口腔和口咽癌，骨肉瘤，卵巢癌癌症，胰腺癌，陰莖癌，垂體瘤，前列腺癌，視網膜母細胞瘤，橫紋肌肉瘤，唾液腺癌，成人軟組織癌，皮膚癌、諸如基底和鱗狀細胞癌、黑色素瘤，小腸癌，胃癌，睾丸癌症，胸腺癌，甲狀腺癌，子宮肉瘤，陰道癌，外陰癌，瓦爾登斯特倫巨球蛋白血症和威爾姆斯腫瘤。

在較佳實施方式中，將該MDM2抑制劑或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物以約0.0025-5000mg/日的量給藥。例如約0.005、0.05、0.5、5、10、20、30、40、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500或5000 mg/日的量給藥，以及各量之間的範圍，例如1mg-2000mg、1mg-1000mg、30mg-900mg、30mg-800mg、30mg-900mg、30mg-800mg、30mg-700mg、30mg-600mg、30mg-500mg、30mg-490mg、30mg-487mg 等。

在較佳實施方式中，將該MDM2抑制劑或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物以每單位劑量約1 ng/kg至約200 mg/kg、約1 μg/kg至約100 mg/kg或者約1 mg/kg至約50 mg/kg的量給藥，例如以每單位劑量約1 μg/kg、約10 μg/kg、約25 μg/kg、約50 μg/kg、約75 μg/kg、約100 μg/kg、約125 μg/kg、約150 μg/kg、約175 μg/kg、約200 μg kg、約225 μg/kg、約250 μg kg、約275 μg kg、約300 μg/kg、約325 μg kg、約350 μg/kg、約375 μg/kg、約400 μg/kg、約425 μg/kg、約450 μg/kg、約475 μg/kg、約500 μg/kg、約525 μg kg、約550 μg/kg、約575 μg kg、約600 μg/kg、約625 μg/kg、約650 μg/kg、約675 μg/kg、約700 μg/kg、約725 μg/kg、約750 μg/kg、約775 μg/kg、約800 μg/kg、約825 μg/kg、約850 μg/kg、約875 μg/kg、約900 μg/kg、約925 μg/kg、約950 μg/kg、約975 μg/kg、約1 mg/kg、約5 mg/kg、約10 mg/kg、約15 mg/kg、約20 mg/kg、約25 mg/kg、約30 mg/kg、約35 mg/kg、約40 mg/kg、約45 mg/kg、約50 mg/kg、約60 mg/kg、約70 mg/kg、約80 mg/kg、約90 mg/kg、約100 mg/kg、約125 mg/kg、約150 mg/kg、約175 mg/kg、約200 mg/kg的量給藥。例如，將化合物2或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物以每單位劑量約20 mg/kg、30 mg/kg、50 mg/kg 、80 mg/kg的量向個體給藥。

在較佳實施方式中，將一種或多種該抗癌劑或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物以約0.0025-5000mg/日的量給藥，包括約0.005、0.05、0.5、5、10、20、30、40、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500或5000 mg/日的量給藥。以及各量之間的範圍，例如1mg-2000mg、1mg-1000mg、30mg-900mg、30mg-800mg、30mg-900mg、30mg-800mg、30mg-700mg、30mg-600mg、30mg-500mg、30mg-490mg、30mg-487mg 等。

在較佳實施方式中，將一種或多種該抗癌劑或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物以每單位劑量約1 ng/kg至約200 mg/kg、約1 μg/kg至約100 mg/kg或者約1 mg/kg至約50 mg/kg的量給藥，例如以每單位劑量約1 μg/kg、約10 μg/kg、約25 μg/kg、約50 μg/kg、約75 μg/kg、約100 μg/kg、約125 μg/kg、約150 μg/kg、約175 μg/kg、約200 μg kg、約225 μg/kg、約250 μg kg、約275 μg kg、約300 μg/kg、約325 μg kg、約350 μg/kg、約375 μg/kg、約400 μg/kg、約425 μg/kg、約450 μg/kg、約475 μg/kg、約500 μg/kg、約525 μg kg、約550 μg/kg、約575 μg kg、約600 μg/kg、約625 μg/kg、約650 μg/kg、約675 μg/kg、約700 μg/kg、約725 μg/kg、約750 μg/kg、約775 μg/kg、約800 μg/kg、約825 μg/kg、約850 μg/kg、約875 μg/kg、約900 μg/kg、約925 μg/kg、約950 μg/kg、約975 μg/kg、約1 mg/kg、約5 mg/kg、約10 mg/kg、約15 mg/kg、約20 mg/kg、約25 mg/kg、約30 mg/kg、約35 mg/kg、約40 mg/kg、約45 mg/kg、約50 mg/kg、約60 mg/kg、約70 mg/kg、約80 mg/kg、約90 mg/kg、約100 mg/kg、約125 mg/kg、約150 mg/kg、約175 mg/kg、約200 mg/kg的量給藥。例如將阿扎胞苷或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物以每單位劑量約1.5mg/kg、2mg/kg、5 mg/kg給藥。例如將地西他濱或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物以每單位劑量約1mg/kg、2mg/kg給藥。

在較佳實施方式中，將該MDM2抑制劑（如化合物2）、一種或多種該抗癌劑同時、並行或組合給藥。

在更佳實施方式中，該MDM2抑制劑和該抗癌劑先後施用的時間間隔可為約1 分鐘、約5 分鐘、約10 分鐘、約15分鐘、約30 分鐘、約45 分鐘、約1 小時、約2 小時、約4 小時、約6 小時、約12 小時、約24 小時、約48 小時、約72 小時、約96 小時、約1 週、約2 週、約3 週、約4 週、約5 週、約6 週、約8 週、或約12 週。

在較佳實施方式中，將包含該MDM2抑制劑（如化合物2）、一種或多種該抗癌劑（如阿扎胞苷、地西他濱、阿糖胞苷）的藥物組合物作為整體劑量單元施用，每天施用包括但不限於：1 次、2 次、3 次、4 次、5 次或6 次。

在較佳實施方式中，將該MDM2抑制劑（如化合物2）、一種或多種該抗癌劑（如阿扎胞苷、地西他濱、阿糖胞苷）各自呈單獨的劑量單元施用，每天施用包括但不限於：1 次、2 次、3 次、4 次、5 次或6 次。

在較佳實施方式中，將該MDM2抑制劑（如化合物2）、一種或多種該抗癌劑（如阿扎胞苷、地西他濱、阿糖胞苷）連續給藥至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少11天、至少12天、至少13天、至少14天、至少15天、至少16天、至少17天、至少18天、至少19天、至少20天、至少21天、至少22天、至少23天、至少24天、至少25天、至少30天、至少35天、至少40天、至少45天或至少50天。

在較佳實施方式中，將該MDM2抑制劑（如化合物2）、一種或多種該抗癌劑（如阿扎胞苷、地西他濱、阿糖胞苷）連續給藥一個或多個療程，包括1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個療程，其中每個療程持續至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少11天、至少12天、至少13天、至少14天、至少15天、至少16天、至少17天、至少18天、至少19天、至少20天、至少21天、至少22天、至少23天、至少24天、至少25天、至少30天、至少35天、至少40天、至少45天或至少50天；並且每兩個療程之間間隔0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10天、兩週、三週或四週。

在較佳實施方式中，將該MDM2抑制劑（如化合物2）、一種或多種該抗癌劑（如阿扎胞苷、地西他濱、阿糖胞苷）以相同(如口服)或不同途徑(如分別以口服及腸胃外(如注射))給藥，包括口服、口腔、吸入噴霧、舌下、直腸、透皮、陰道黏膜、透黏膜、局部給藥，鼻或腸道給藥，注射給藥，如肌肉注射、皮下注射、髓內注射，以及鞘內、腦部直接給藥、原位給藥、皮下、腹腔內、靜脈注射、關節內滑膜、胸骨、內、肝內、病灶內，顱內、腹腔、鼻腔、或眼內注射或其他藥物遞送途徑。

另外，本發明涉及治療成人復發或難治性急性髓性白血病和復發或難治性高危/極高危骨髓增生不良症候群的方法，包括施用化合物2單藥及聯合阿扎胞苷或阿糖胞苷。

在較佳實施方式中，給藥方法為：化合物2按照標準3+3方案進行劑量遞增，起始劑量為150mg，依次遞增至200mg、250mg、300mg，每日口服一次，每週期從第1天開始使用，連續服用7天後休息 21天，每 28 天為一個給藥週期；當第一階段化合物2單藥劑量遞增結束後，可進入第二階段，即化合物2聯合用藥劑量遞增；聯合用藥方案中化合物2的劑量從100mg開始，依次遞增至150mg、200mg；阿扎胞苷為固定劑量，75mg/m² 皮下注射，每日一次，每週期從第1天開始使用，連續7天後休息21天，每28天為一個給藥週期；阿糖胞苷為固定劑量，1g/m² 靜脈注射，靜脈輸注時間不少於4小時，每日一次，每週期從第3天開始使用，連續5天後休息21天，每28天為一個給藥週期。

在較佳實施方式中，阿扎胞苷或阿糖胞苷均於化合物2口服4小時後給藥；兩藥聯合治療後進入休息期。

另外，本發明涉及預防和/或治療疾病的方法，對有需要的個體施用化合物2，包括施用預防和/或治療有效量的該化合物2，其中該疾病是骨髓增生不良症候群（MDS）：

。

或者，本發明涉及治療黑色素瘤的方法，包括施用化合物2與達拉非尼、曲美替尼的組合；較佳地，化合物2與達拉非尼、曲美替尼的重量比為50：30：1。

再或者，本發明涉及治療乳腺癌的方法，包括施用化合物2與氟維司瓊、阿培利司的組合；較佳地，化合物2與氟維司瓊、阿培利司的重量比為50：20：25。實施例

為了使本發明的目的和技術方案更加清楚，以下結合具體實施例進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。並且，下列實施例中未提及的具體實驗方法，均按照常規實驗方法進行。資料分析

繪製腫瘤生長曲線，其中X軸顯示觀察時間，Y軸顯示相應腫瘤體積（幾何平均值）。三組或多組間比較用one-way ANOVA。如果F值有顯著性差異，應在ANOVA分析之後再進行多重比較。用SPSS 18.0進行所有資料分析。Prism 第6版用於圖形繪製。賽默飛世爾科技的Attune NxT流式細胞儀用於分析腫瘤浸潤淋巴細胞。資料採集和分析採用Analyst Software 1.6.3工作站（AB sciex，安大略，加拿大）。對於MOLM-13全身性模型，最後一隻小鼠死亡的日期用於分析中位總存活期和生成Kaplan-Meier曲線。使用對數秩檢驗和Bonferroni多重檢驗比較不同治療組的存活曲線。 CellTiter-Glo®（CTG）細胞增殖實驗

藉由CellTiter-Glo® （CTG）實驗檢測抗增殖作用。細胞接種於96孔板中，並以不同濃度受試物處理24-72小時。通常，選擇受試物9個系列劑量，5 μl/孔加到96孔板。對於聯合實驗，2個受試物的終體積為5 μl/孔。每個測試劑量做3複孔。在同一培養板上選3-6孔加入100 μl稀釋液作為對照組，另設3-6孔作為空白對照。除空白對照孔外，每孔加入95 μl細胞懸液（含有合適細胞數，以確保需要檢測時細胞對照組的細胞剛好鋪滿孔底面）到相同96孔板。培養板於37℃，CO₂ 培養箱中培養24-72小時。培養結束時，96孔板和CellTiter-Glo試劑於室溫平衡30分鐘，每孔加入100 μL CellTiter-Glo試劑。在搖床上混勻2分鐘，室溫放置10分鐘後用Biotek synergy HIMF酶標儀讀取螢光值。使用3複孔平均螢光值，藉由下列公式計算細胞存活率百分比：細胞存活率（%）=（測試孔螢光值-陰性對照孔）⁄（溶劑對照組螢光值-陰性對照組）×100% 使用Graphpad Prism 6.0軟體（Golden software, Golden, ColORado, USA）的非線性回歸資料分析方法計算IC₅₀ 。

對於聯合實驗，藉由單藥對照的3個複孔平均螢光值歸一化處理後計算細胞存活率。藉由聯合曲線與單藥曲線的IC50進行比較以藉由觀察聯合用藥組曲線左移是否左移來確定2個化合物的協同作用。對細胞水準聯合用藥實驗，採用CalcuSyn程序計算聯合指數（combination index, CI），對結果進一步分析(Chou, T. C. (2010). Drug combination studies and their synergy quantification using the Chou-Talalay method. Cancer research 70, 440-446)。兩藥聯合的CI值＜0.9，表示兩藥聯合具有協同作用；CI值=0.9，表示兩藥聯合具有相加作用；CI值＞0.9，大於0.9表示兩藥聯合具有拮抗作用。體內藥效實驗評估方法

動物接種腫瘤細胞後，每天監測動物的健康及死亡情況，例行檢查包括觀察腫瘤生長和藥物治療對動物日常行為表現的影響，如行為活動、攝食攝水量、體重變化（每週測量兩次體重），外觀體症或其它不正常情況。基於各組動物數量記錄組內動物死亡數和副作用。所有過程包括給藥以及腫瘤和體重測量均在超淨工作臺中進行。

細胞接種法建立人腫瘤免疫缺陷小鼠皮下異種移植瘤模型（請參考Gould SE et al. Translational value of mouse models in oncology drug development. Nature medicine. 2015 21, 431-439.和Souers AJ et al. ABT-199, a potent and selective BCL-2 inhibit或, achieves antitum或 activity while sparing platelets. Nature medicine.2012 19.202-208）：收集對數生長期的腫瘤細胞，計數後重懸於1×PBS，調整細胞懸液濃度至2.5-5×10⁷ /mL。用1 mL注射器（4號針頭）在免疫缺陷小鼠右側背部皮下接種腫瘤細胞，5-10×10⁶ /0.2 mL/鼠 (實驗動物購自北京維通利華實驗動物技術有限公司SCXK（京）2016-0006)。所有動物實驗操作嚴格遵守吉瑪基因股份有限公司和蘇州亞盛藥業有限公司實驗動物使用和管理規範。相關參數的計算參考中國CFDA《細胞毒類抗腫瘤藥物非臨床研究技術指導原則》。

在雌性NOD SCID小鼠中產生全身性和皮下AML異種移植模型。所有動物實驗均在GenePharma（中國蘇州）的動物設施中進行。

對於全身性AML模型，用環磷醯胺（150mg/kg，腹膜內）預處理六至八週齡的雌性NOD SCID小鼠連續兩天。然後藉由靜脈內接種1×10⁷ 個細胞到尾靜脈中建立MOLM-13全身性AML異種移植模型。

對於皮下模型，將OCI-AML-3細胞（1×10⁶ ）皮下注射到6-8週齡的小鼠的右側腹中。在細胞接種後大約10天，基於達到約100-150 mm³ 的平均腫瘤體積的原發腫瘤大小將小鼠隨機分組。

實驗期間每週測定兩次動物體重和腫瘤大小。每天觀察動物的狀態以及有無死亡等情況發生。常規監測包括了腫瘤生長及治療對動物正常行為的影響，具體內容有實驗動物的活動性、攝食和飲水情況、體重增加或降低情況、眼睛、被毛及其它異常情況。實驗過程中觀察到的死亡和臨床症狀均記錄在原始資料中。整個給藥、小鼠體重及腫瘤體積的測量操作均在超淨工作臺中進行。根據實驗方案要求，末次給藥結束後，收集血漿和腫瘤組織，稱重並拍照記錄。血漿和腫瘤樣本-80℃凍存備用。

每週兩次用遊標卡尺測量腫瘤直徑。腫瘤體積（Tum或 volume，TV）的計算公式為：TV=a×b² /2。其中a、b分別代表腫瘤測量長和寬。相對腫瘤體積（relative tum或 volume，RTV）計算公式為：RTV=V_t /V₁ 。其中V₁ 為分組給藥時的腫瘤體積，V_t 為給藥後某天測量時的腫瘤體積。

抗腫瘤活性的評價指標為相對腫瘤增殖率T/C（%），計算公式分別為：相對腫瘤增殖率T/C（%）=（T_RTV /C_RTV ）×100%，T_RTV 為治療組RTV，C_RTV 為溶媒（vehicle）對照組RTV；腫瘤緩解率（%）為治療後荷瘤小鼠出現SD （疾病穩定）、PR（腫瘤部分消退）及CR（腫瘤完全消退）的數目除以本組小鼠總數×100%。

動物體重變化（Change of body weight，%）=（測量體重-分組時體重）/分組時體重×100%。

療效評價標準：根據中國CFDA《細胞毒類抗腫瘤藥物非臨床研究技術指導原則》（2006年11月），T/C（%）值≤40%並經統計學分析p＜0.05為有效。若小鼠的體重下降超過20%或藥物相關的死亡數超過20%，則認為該藥物劑量具有嚴重毒性，表示為過量毒性劑量。T/C百分比值是抗腫瘤有效性的指示：T/C ＜42％的值NCI認定是顯著抗腫瘤活性。T/C值＜10％認定為高度顯著的抗腫瘤活性，並且如果滿足毒性和某些其他要求（稱為DN-2水準活性），則NCI將其作為臨床試驗的合理性證明。

協同性分析採用以下公式（請參考Gould SE et al. Translational value of mouse models in oncology drug development. Nature medicine. 2015 21, 431-439.）：協同因子 = ((A/C) × (B/C))/(AB/C)；A= A藥單藥組的RTV值； B=B藥單藥組的RTV值；C=溶媒對照組的RTV值，AB= AB聯合用藥組的RTV值（Clarke R. Issues in experimental design and endpoint analysis in the study of experimental cytotoxic agents in vivo in breast cancer and other models[J]. Breast Cancer Research & Treatment, 1997, 46(2-3):255-278）。若協同因子＞1，則具有協同作用；若協同因子=1，則具有相加作用；若協同因子＜1，則具有拮抗作用。實施例1.化合物2的製備

MDM2抑制劑化合物2根據美國專利No. 9745314、WO2015/161032及Aguilar et al. J.Med. Chem. 2017(60) 2819-2839文章中所示一步或多步法製成。實施例2. 化合物2單藥或聯合用藥對人源AML癌細胞系的抗增殖作用 2.1.化合物2單藥對人源AML癌細胞系的抗增殖作用

參照前述“CellTiter-Glo®（CTG）細胞增殖實驗”。在CTG實驗中，檢測化合物2單藥對三種TP53野生型的AML（急性骨髓性白血病）細胞MOLM-13、MV-4-11和OCI-AML-3，及兩種TP53突變型的AML細胞系HL-60 和SKM-1體外增殖的抑制作用。其中，MOLM-13和MV-4-11細胞系均為TP53野生型且FLT3-ITD突變的AML細胞系，OCI-AML-3細胞系是TP53野生型不攜帶FLT3-ITD突變的AML細胞系。MV-4-11細胞系來自ATCC® CRL-9591TM, biphenotypic B myelomonocytic leukemia（雙表型B骨髓單核細胞白血病），HL-60細胞系來自ATCC® CCL-240™, acute promyelocytic leukemia（急性早幼粒細胞白血病），MOLM-13細胞系來自北納生物資源編號：BNCC340568 人急性髓系白血病細胞。OCI-AML-3細胞系購自Cobioer（中國南京）。SKM-1購自Japanese Collection of Research Bioresources Cell Bank（JCRB）。急性骨髓性白血病細胞系在含有10％胎牛血清（AUSGENEX，Cat＃FBSSA500-S）的RPMI 1640培養基（Gibco，Cat＃C11875500BT）中培養，MV-4-11除外，其在IMDM培養基（Gibco，Cat＃C12440500BT）中培養。所有細胞系都經過遺傳鑒定並且沒有微生物污染。除非特殊說明，CTG實驗中一般採用藥物處理細胞72小時。如圖1所示，為了研究化合物2單藥體外對TP53野生型和突變型AML細胞系的增殖抑制作用，用遞增劑量的化合物2單藥處理MOLM-13、MV-4-11、OCI-AML-3、HL-60和SKM-1細胞。72小時後，CTG法測量細胞存活，並使用GraphPad Prism 6繪製生長抑制曲線。細胞存活百分比以Mean ± SEM表示， n=2或3。

研究結果表明，在測試的上述五個AML細胞系中，TP53野生型的細胞系對化合物2藥物作用敏感，TP53突變型的細胞系對化合物2作用不敏感。具體地，如表1所示，化合物2在TP53野生型的MOML-13、MV-4-11及OCI-AML-3細胞系中的IC50值分別為26.8 ± 4.9 nM、165.9 ± 42.4 nM和315.6 ± 97 nM。其中，對化合物2單藥最為敏感的細胞系為TP53野生型且FLT3-ITD突變的AML細胞系 MOLM-13和MV-4-11。其次，對化合物2單藥較為敏感的是TP53野生型不攜帶FLT3-ITD突變的OCI-AML-3細胞系。相比較而言，化合物2在TP53突變的細胞系中的抗增殖作用效果微弱，在HL-60和SKM-1細胞系中的IC50值分別為2558.3 ± 581.5 nM 和8947.3± 569.6 nM。表1. 化合物2在攜帶不同遺傳突變AML細胞系的IC50 值（nM）

細胞系	TP53	FLT3	NPM1	RAS	IC₅₀ 值, nM (Mean ± SD, n=2或3) 化合物2
MOLM-13	wt	ITD	wt	wt	26.8 ± 4.9
MV-4-11	wt	ITD	wt	wt	165.9 ± 42.4
OCI-AML-3	wt	wt	mut	mut	315.6 ± 97
HL-60	Del	wt	wt	wt	2558.3 ± 581.5
SKM-1	mut	wt	wt	wt	8947.3 ± 569.6

注：wt，wild-type，野生型；mut，mutant，突變型；Del，deletion，缺失 2.2.化合物2聯合用藥對人源AML癌細胞系的抗增殖作用

圖2A和圖2B所示化合物2與地西他濱（Decitabine）、阿扎胞苷（Azacitidine）、或阿糖胞苷（Cytarabine, Ara-C）聯合用藥對TP53野生型AML細胞系的生長抑制作用。用梯度濃度的化合物2、地西他濱、阿扎胞苷、阿糖胞苷單藥或聯合用藥處理 AML細胞3天，藉由CellTiter-Glo發光法檢測細胞生長抑制活性。細胞存活百分比以Mean ± SEM表示，n=3。

結果顯示，當化合物2與去甲基化藥物，包括地西他濱（Decitabine, Dec）和阿扎胞苷（Azacitidine, Aza）及阿糖胞苷（Cytarabine, Ara-C）聯用時，均發現上述聯合用藥具有增強的抗增殖作用。

由圖2A可見具體CI值及化合物2與去甲基化藥物地西他濱和阿扎胞苷聯合用藥的原始量效生長抑制曲線。由圖2B可見具體CI值及化合物2與阿糖胞苷聯合用藥的原始量效生長抑制曲線。化合物2聯合地西他濱的聯合用藥反應曲線左移，聯合指數（CI值）小於0.9，顯示地西他濱兩藥聯合具有協同作用。

由此可見，體外實驗中，化合物2不僅作為單藥在TP53野生型AML細胞系，尤其在TP53野生型且FLT3-ITD突變的AML細胞系中具有顯著的抗AML細胞增殖的作用，而且突出的是，化合物2聯合其它治療藥物，包括去甲基化藥物（地西他濱和阿扎胞苷）、傳統化療藥物阿糖胞苷，表現為聯合用藥後IC50值減小，且藉由聯合給藥曲線與單藥曲線的IC50進行比較，觀察到聯合用藥組曲線左移。因此，當化合物2與其它治療藥物，包括去甲基化藥物（地西他濱和阿扎胞苷）、傳統化療藥物阿糖胞苷，聯用具有協同作用，其抗增殖作用明顯增強。實施例3. 化合物2單藥或聯合用藥對非小細胞肺癌（NSCLC）細胞系的抗增殖作用 3.1.化合物2單藥對STK11和KRAS共突變的非小細胞肺癌（NSCLC）細胞系A549、NCI-H460、NCI-H2122的抗增殖作用

參照前述“CellTiter-Glo®（CTG）細胞增殖實驗”。在CTG實驗中，檢測化合物2單藥對三種STK11和KRAS共突變的非小細胞肺癌（NSCLC）細胞A549、NCI-H460、NCI-H2122體外增殖的抑制作用。其中，A549細胞系、NCI-H460細胞系、NCI-H2122細胞系均購自南京科佰生物科技有限公司。所有細胞系都經過遺傳鑒定並且沒有微生物污染。除非特殊說明，CTG實驗中一般採用藥物處理細胞72小時。

研究結果表明，在測試的上述STK11和KRAS共突變的非小細胞肺癌（NSCLC）細胞A549、NCI-H460、NCI-H2122中，如圖3A-3C所示，化合物2在STK11和KRAS共突變的非小細胞肺癌（NSCLC）細胞A549、NCI-H460、NCI-H2122細胞系中的IC50值分別為33 nM、330 μM和79 nM。 3.2 化合物2與曲美替尼的聯合用藥對STK11和KRAS共突變的非小細胞肺癌（NSCLC）細胞系A549、NCI-H460、NCI-H2122的抗增殖作用

參照前述“CellTiter-Glo®（CTG）細胞增殖實驗”。在CTG實驗中，檢測化合物2與曲美替尼的聯合用藥對三種STK11和KRAS共突變的非小細胞肺癌（NSCLC）細胞A549、NCI-H460、NCI-H2122體外增殖的抑制作用。除非特殊說明，CTG實驗中一般採用藥物處理細胞72小時。

如圖3A至圖3D所示，化合物2與曲美替尼聯合用藥對STK11和KRAS共突變的非小細胞肺癌（NSCLC）細胞A549、NCI-H460、NCI-H2122細胞系的生長抑制作用。用梯度濃度的化合物2、曲美替尼單藥或聯合用藥分別處理上述三種細胞系3天，藉由CellTiter-Glo發光法檢測細胞生長抑制活性。細胞存活百分比以Mean ± SEM表示，n=3。

結果顯示，當化合物2與曲美替尼聯用時，均發現上述聯合用藥具有增強的抗增殖作用。

由圖3A、圖3B、圖3C可見具體CI值及化合物2與曲美替尼聯合用藥的原始量效生長抑制曲線。化合物2聯合曲美替尼的聯合用藥反應曲線左移，聯合指數（CI值）小於0.9，顯示化合物2聯合曲美替尼兩藥聯合具有協同作用。

由此可見，體外實驗中，化合物2不僅作為單藥在STK11和KRAS共突變的非小細胞肺癌（NSCLC）細胞A549、NCI-H460、NCI-H2122細胞系中具有顯著的抗增殖的作用，而且突出的是，化合物2聯合曲美替尼表現為聯合用藥組曲線左移。因此，當化合物2與曲美替尼聯用具有協同作用，其抗增殖作用明顯增強。 3.3 化合物2與曲美替尼的聯合用藥對KRAS野生型且 STK11野生型非小細胞肺癌（NSCLC）細胞系NCI-H226和NCI-H292的抗增殖作用

參照前述“CellTiter-Glo®（CTG）細胞增殖實驗”。在CTG實驗中，檢測化合物2與曲美替尼的聯合用藥對兩種KRAS野生型且 STK11野生型非小細胞肺癌（NSCLC）細胞系NCI-H226和NCI-H292體外增殖的抑制作用。

其中，NCI-H226細胞系購自南京科佰生物科技有限公司，NCI-H292細胞系購自中國科學院生物化學與細胞生物學研究所。所有細胞系都經過遺傳鑒定並且沒有微生物污染。除非特殊說明，CTG實驗中一般採用藥物處理細胞72小時。

如圖4A至圖4B所示，化合物2與曲美替尼聯合用藥對KRAS野生型且 STK11野生型非小細胞肺癌（NSCLC）細胞系NCI-H226和NCI-H292細胞系的生長抑制作用。用梯度濃度的化合物2、曲美替尼單藥或聯合用藥分別處理上述兩種細胞系3天，藉由CellTiter-Glo發光法檢測細胞生長抑制活性。細胞存活百分比以Mean ± SEM表示，n=3。

由圖4A、圖4B可見具體CI值及化合物2與曲美替尼聯合用藥的原始量效生長抑制曲線。摩爾濃度比大約為1：3的曲美替尼與化合物2的聯合用藥（尤其在二者的摩爾濃度比為0.33 μM : 1 μM至1μM : 3 μM時）反應曲線左移，聯合指數（CI值）小於0.9，顯示化合物2聯合曲美替尼兩藥聯合具有協同作用。

由此可見，體外實驗中，化合物2不僅作為單藥在KRAS野生型且 STK11野生型非小細胞肺癌（NSCLC）細胞系NCI-H226和NCI-H292中具有顯著的抗增殖的作用，而且突出的是，化合物2聯合曲美替尼，表現為聯合用藥組曲線左移。因此，當化合物2與曲美替尼聯用具有協同作用，其抗增殖作用明顯增強。實施例4.化合物2單藥或聯合用藥體外誘導癌細胞凋亡和週期阻滯 4.1.化合物2 單藥誘導MOLM-13 AML細胞凋亡

P53訊號通路的啟動可誘導細胞發生凋亡、週期阻滯、或衰老。在所有測試的AML細胞系中，攜帶野生型TP53且FLT3-ITD突變的MOLM-13細胞系對化合物2的藥物作用表現出比OCI-AML-3和MV-4-11更高的敏感性。因此，進一步使用Annexin V-PI 螢光探針並藉由流式細胞儀分析化合物2單藥或與地西他濱（Decitabine）、阿扎胞苷（Azacitidine）或阿糖胞苷（Ara-C）聯合作用後MOML-13細胞的凋亡情況。

如圖5A和圖5B所示，圖5A為MOLM-13細胞在體外水準經劑量為0.01 μM、 0.04 μM、0.11 μM、0.33 μM或1 μM的化合物2處理 48小時後收集細胞，使用Annenix V-FITC/PI染色，流式細胞儀檢測細胞凋亡。凋亡細胞百分比以Mean ± SEM表示，n=3。圖5B為圖5A圖中化合物2誘導凋亡的流式分析代表圖式。與陰性對照組相比，P ＜ 0.0001。

結果顯示，化合物2可顯著誘導細胞凋亡（P ＜ 0.0001），其作用呈劑量依賴性。化合物2 單藥呈劑量依賴性誘導MOLM-13細胞凋亡。例如，40 nM、110 nM及1000 nM的化合物2作用48 小時後凋亡的MOLM-13細胞（Annexin V+ 細胞）分別約為31.0% 、55.1%及96.8%。這些資料表明化合物2對AML細胞的生長抑制作用與其誘導細胞發生程序性細胞死亡有關。 4.2.化合物2與地西他濱、阿扎胞苷或阿糖胞苷協同誘導MOLM-13 AML細胞凋亡

研究報導地西他濱、阿扎胞苷或阿糖胞苷均可誘導AML細胞凋亡(Hollenbach et al., 2010; Ossenkoppele and Lowenberg, 2015; Ram et al., 2017)。本發明進一步在MOLM-13細胞中評估了化合物2聯合去甲基化藥物（如地西他濱、阿扎胞苷）或阿糖胞苷對細胞凋亡的影響。

將MOLM-13細胞用0.04 μM的化合物2（化合物2單藥對AML細胞的研究顯示該濃度為最小起效濃度）及適當濃度的地西他濱、阿扎胞苷或阿糖胞苷聯合處理48小時。如圖6所示，MOLM-13細胞在體外經0.04 μM的化合物2與0.1 μM地西他濱（Dec）、3 μM阿扎胞苷（Aza）或0.1 μM阿糖胞苷（Ara-C）聯合處理 48小時後收集細胞，使用Annenix V-FITC/PI染色，流式細胞儀檢測細胞凋亡。與空白組比較，P ＜ 0.05；與化合物2單藥組比較，P ＜ 0.05；與化療藥物（地西他濱、阿扎胞苷或阿糖胞苷）單藥組比較，P ＜ 0.05；凋亡細胞（Annexin V+細胞）百分比以Mean ± SEM表示，n = 3。結果顯示，與對照或單一藥劑處理相比，化合物2與阿扎胞苷、地西他濱或阿糖胞苷（Ara-C）聯合可顯著增加細胞凋亡的比例，協同誘導細胞凋亡。 4.3.化合物2單藥對AML細胞週期進程的影響

將不同濃度的化合物2處理MOML-13、OCI-AML-3和MV-4-11細胞（TP53野生型AML細胞系）48小時後用碘化丙錠（PI）對細胞進行染色，藉由流式細胞分析方法測定G0/G1、S及G2/M期細胞占總細胞的百分比，以此來研究化合物2對AML細胞週期進程的影響。

如圖7所示，化合物2 單藥在TP53野生型AML細胞中以劑量依賴性方式降低S期細胞比例。將MOLM-13（A）、OCI-AML-3 （B）和MV-4-11（C）細胞在體外經0.01 μM、0.04 μM、0.11 μM、0.33 μM或1 μM的化合物2處理 48小時後收集細胞並用PI染色，流式細胞儀檢測細胞週期阻滯。圖中結果為兩次獨立實驗的代表性結果，其中，MOLM-13細胞中，結果代表Mean ± SEM, n=2；OCI-AML-3及MV-4-11細胞中，數值為單孔實驗結果。在所測試的三種AML細胞系中，化合物2處理組與對照組相比，化合物2以劑量依賴方式降低S期細胞的百分比。

結果顯示化合物2單藥對AML細胞的生長抑制作用可能與細胞週期阻滯有關。化合物2單藥可以明顯減少MOML-13、OCI-AML-3和MV-4-11細胞系中S期的細胞百分比。 4.4.化合物2與地西他濱、阿扎胞苷或阿糖胞苷聯合用藥對AML細胞週期進程的影響

將化合物2（0.01 μM或0.33 μM）與適當濃度的地西他濱、阿扎胞苷或阿糖胞苷聯合處理MOML-13、OCI-AML-3和MV-4-11細胞48小時，並同樣用流式細胞儀進行檢測細胞的週期分佈。

圖8所示化合物2 與地西他濱（Decitabine）、阿扎胞苷（Azacitidine）、或阿糖胞苷（Cytarabine, Ara-C）聯合處理MOLM-13、OCI-AML-3及MV-4-11細胞未發現協同的週期阻滯效果。MOLM-13細胞用0.01 μM 化合物2聯合0.05 μM地西他濱、1 μM阿扎胞苷及0.05 μM阿糖胞苷處理；OCI-AML-3細胞用0.33 μM 化合物2聯合1 μM地西他濱、3 μM阿扎胞苷及0.33 μM阿糖胞苷處理；MV-4-11細胞用0.33 μM 化合物2聯合0.33 μM地西他濱、3 μM阿扎胞苷及0.33 μM阿糖胞苷處理。藥物作用48小時後收集細胞並用PI染色。使用流式細胞儀檢測樣品後用FlowJo軟體細胞週期程序進行資料分析。圖中結果為單孔實驗結果。

結果顯示，化合物2與地西他濱、阿扎胞苷或阿糖胞苷聯合處理MOML-13、OCI-AML-3和MV-4-11細胞未對細胞週期阻滯產生協同增強的效果。表明化合物2和地西他濱、阿扎胞苷或阿糖胞苷的協同抗增殖活性可能與細胞週期阻滯無關。實施例5.體內藥效實驗評估

對於全身性AML模型，用環磷醯胺（150mg/kg，腹膜內）預處理六至八週齡的雌性NOD SCID小鼠連續兩天。然後藉由靜脈內接種1×10⁷ 個細胞到尾靜脈中建立MOLM-13全身性AML異種移植模型。使細胞生長3天，然後隨機分組用於使用載體、化合物2（50mg/kg，每天口服，持續7天）、Aza（1.5mg/kg，每天靜脈注射，持續7天）單獨或聯合治療。在治療過程中以及治療完成後，監測小鼠的後肢麻痹（HLP）的發生或由疾病進展引起的腹部腫脹，以及＞ 20％的體重減輕。

對於皮下模型，將OCI-AML-3細胞（1×10⁶ ）皮下注射到6-8週齡的小鼠的右側腹中。在細胞接種後大約10天，基於達到約100-150 mm³ 的平均腫瘤體積的的原發腫瘤大小將小鼠隨機分組。單獨或聯合施用化合物2（50mg/kg，口服，每隔一天，持續15天）和Aza（2mg/kg，每天靜脈注射，持續7天）或Dec（1mg/kg，每天靜脈注射，持續7天）。藉由卡尺每週兩次測量腫瘤體積，並使用以下公式以mm³ 表示：V = 0.5 a × b² ；其中a和b分別是腫瘤的長徑和短徑。作為效力的測量，根據下式計算T/C（％）值：T/C（％）=（T_RTV /C_RTV ）× 100%；其中T_RTV 是治療組的相對腫瘤體積（RTV），C_RTV 是對照組的RTV。RTV = V_t /V₁ ；其中V₁ 和V_t 分別是治療第一天（第1天）的平均腫瘤體積和某一時間點（第t天）的平均腫瘤體積。根據下式計算腫瘤生長抑制（TGI）：TGI（％）= 100-T/C（％）。 5.1. 化合物2單藥在人MOLM-13 AML細胞小鼠異種移植瘤模型中的抗腫瘤作用

在體外細胞實驗中，MOLM-13是對化合物2敏感的人AML細胞系之一，IC50值為26.8 ± 4.9 nM。建立了MOLM-13小鼠全身性異種移植瘤模型，在該模型中評估化合物2按80 mg/kg 劑量，口服（po）, 每兩日一次（q2d）給藥方案的抗白血病作用（與表7中編號57方案對應）。實驗共2組，每組15隻動物，其中每組5隻動物用於人CD45+ AML 細胞比例分析，其餘10隻動物用於記錄小鼠生存狀況。在細胞接種後18天，依據實驗方案，各組隨機選取5隻動物，採集骨髓和脾臟，應用流式細胞術分析骨髓和脾臟中人CD45+ AML細胞的比例，以此評估動物的疾病負荷。

如圖9A和圖9B所示，化合物2顯著減少人源MOLM-13 AML小鼠異種移植瘤小鼠骨髓和脾臟中人CD45+細胞比例。圖9A為骨髓中人CD45+ AML細胞的流式分析圖；圖9B為脾臟中人CD45+ AML細胞的流式分析圖；圖9C和圖9D為骨髓和脾臟中人CD45+ AML細胞比例匯總分析圖；其中CD45+ AML細胞比例為占所有活細胞的比例，採用Mann-Whitney U test 方法進行統計分析。溶媒組中一隻用於記錄生存狀態的小鼠在分析人CD45+ AML細胞比例當天，體重下降＞ 20%達到人道終點，將該動物安樂死後採集了骨髓和脾臟進行人CD45+ AML細胞比例分析，所示溶媒組n=6，化合物2組n=5。

結果顯示，溶媒對照組中人CD45+ AML細胞的比例組內個體差異較大，骨髓中CD45+ AML細胞比例在0.41%到16.7%之間，脾臟中的比例為0.39%至1.40%。但是，化合物2給藥組中，實驗動物骨髓和脾臟中人CD45+AML細胞比例均小於0.1%，兩組資料比較具有統計學顯著性差異。以上資料壽命化合物2可顯著減少小鼠的白血病負荷。

生存分析顯示，如圖10所示，P ＜ 0.0001，在接種MOLM-13細胞後第三天開始給予化合物2或溶媒，n=10。採用log-rank法對兩組動物的生存曲線進行分析比較。開始給藥治療後第15天，溶媒對照組開始有動物死亡，並且在第21天，全部動物死亡。如表2所示，溶媒對照組動物的中位生存期為18.5天，而化合物2（80 mg/kg）治療可使中位生存期延長18.5 天（延長100%），達到37.0天。

由於所建立的MOLM-13為彌散性全身性系統腫瘤，惡性程度及疾病進展均較為兇險。結果顯示，化合物2 顯著延長荷人MOLM-13（AML）異種移植瘤小鼠的生存時間，而且化合物2 顯著延長荷人MOLM-13（AML）異種移植瘤小鼠的中位生存時間，並且化合物2作為單一藥劑具有顯著的抗AML作用。表2. 化合物2顯著延長荷人MOLM-13（AML）異種移植瘤小鼠的中位生存時間

	溶媒對照組	化合物2（80 mg/kg）
中位生存期	18.5 天	37.0 天
生存期延長天數	-	18.5 天
P值（log-rank）	＜ 0.0001

5.2 化合物2單藥在二甲基苯蒽誘導的大鼠骨髓增生不良症候群（MDS）模型中的抗MDS作用

骨髓增生不良症候群（myelodysplastic syndromes，MDS）是起源於造血幹細胞的一組異質性髓系複製性疾病，特點是髓系細胞分化及發育異常，表現為無效造血、難治性血細胞減少、造血功能衰竭，高風險向急性骨髓性白血病（AML）轉化。採用多種人源大鼠MDS模型評估化合物2單藥的體內抗腫瘤作用。表3所示在二甲基苯蒽誘導的大鼠骨髓增生不良症候群（MDS）模型中所進行的抗腫瘤作用，化合物2按照口服（po）、每兩天一次（q2d）方案給藥。表3.化合物2在二甲基苯蒽誘導的大鼠骨髓增生不良症候群（MDS）模型中的抗腫瘤作用

模型（適應症）	藥物	編號	動物品系	化合物2劑量	化合物2 給藥途徑和方案	聯合用藥方案
二甲基苯蒽誘導的大鼠骨髓增生不良症候群模型（MDS）	單藥	23	SD大鼠	10，30 mg/kg	p.o.，q2d × 3w	-
注： q2d為每2天一次；d為天數；w為週數

採用化學誘變劑二甲基苯蒽（DMBA）構建大鼠骨髓增生不良症候群（MDS）模型，該大鼠MDS模型中大鼠的骨髓象和血象變化與人骨髓增生不良症候群相似，已被證實可用於藥物的抗MDS作用研究。將DMBA按50 mg/kg，i.v.，每週一次方案給藥，共給藥4週，建立大鼠MDS模型。DMBA給藥結束後一週（第28天），經尾靜脈採集外周血進行血常規檢測以確定模型是否建立成功。

血常規結果顯示，與正常動物比較，接受DMBA處理的大鼠血小板總數（PLT）、紅細胞總數（RBC）、網織紅細胞數量（RET）、血紅蛋白（HGB）和白細胞總數（WBCB）均顯著降低。根據第28天的PLT水準將動物進行隨機分組，共設置溶媒對照組（Vehicle）、化合物2（10 mg/kg）和化合物2（30 mg/kg）兩個劑量組（與表3中編號23方案對應）、健康對照組（Naive），每組5隻動物。

如圖11A所示分組治療前DMBA誘導大鼠外周血PLT、WBC水準顯著下降的MDS表徵。給予DMBA後，根據PLT的水準將動物進行隨機分組後，溶媒對照組和化合物2兩個劑量組的PLT和WBCB水準相當，但均比健康對照組低（P ＜ 0.0001）。溶媒對照組和化合物2兩個劑量組的RBC水準與健康對照組比較略有降低，但無統計學顯著性差異。

將化合物2按10 mg/kg 或30 mg/kg，p.o.，q2d × 21 d方案給藥。給藥結束，採集各組動物的外周血和骨髓細胞進行血常規分析。外周血的血常規分析，結果如圖11B所示，化合物2單藥對MDS大鼠外周血的PLT、WBCB和RBC水準沒有明顯影響。

但骨髓常規分析，結果如圖11C所示，化合物2單藥可顯著恢復MDS大鼠骨髓中PLT、WBCB和RBC的水準。具體地，健康對照大鼠骨髓PLT平均值為168±16.44（cells/µl），MDS模型組大鼠骨髓PLT平均值為52±2.49（cells/µl），與健康對照組比較具有統計學顯著性差異（P＜0.001）。而接受化合物2 （10 mg/kg）和化合物2（mg/kg）30治療的大鼠骨髓PLT水準均有升高，平均值分別為116±9.35（cells/µl，與MDS模型組比較，P＞0.05）和124.2 ± 23.8（cells/µl，與MDS模型組比較，P＜ 0.05）。

另一方面，骨髓常規分析結果中，對照組大鼠的WBCB平均值為90.42±9.65（cells/µl），MDS模型組大鼠骨髓WBCB平均值為16.89±2.75（cells/µl），與健康對照租大鼠組比較，具有統計學顯著性差異（P＜0.001）。接受化合物2（10mg/kg）和化合物2（30mg/kg）治療的大鼠骨髓WBCB水準均有升高，平均值分別為47.5±10.13（cells/µl，與溶媒對照組比較，P＞ 0.05）和62.53±13.08（cells/µl，與MDS模型組比較，P＜ 0.05）。

並且，健康對照組大鼠的RBC平均值為0.19 ± 0.02（cells/µl），MDS模型組大鼠骨髓RBC平均值為0.04 ± 0.01（cells/µl），與健康對照大鼠組比較，具有統計學顯著性差異（P ＜ 0.001）。接受化合物2 10 mg/kg和30 mg/kg治療的大鼠骨髓RBC水準均有升高，平均值分別為0.10 ± 0.01 （cells/µl，與MDS模型組比較，P ＜ 0.05）和0.08±0.02 （cells/µl，與溶媒對照組比較，P ＞ 0.05）。

MDS體外結果顯示，MDS模型組動物在給藥結束後，骨髓中的PLT、WBCB和RBC水準與健康對照組動物比較，均顯著顯著降低，顯示在所檢測的時間點，實驗動物仍具有MDS的血液學改變。藉由化合物2給藥可顯著恢復MDS骨髓中PLT、WBCB和RBC水準。 5.3 化合物2與阿扎胞苷聯合用藥在人MOLM-13 AML小鼠異種移植瘤模型中的抗腫瘤作用

在體外實驗中，TP53野生型的MOLM-13細胞系對化合物2中度敏感。藉由尾靜脈接種MOLM-13腫瘤細胞建立全身性瘤模型，在細胞接種後第三天開始給藥，並將給藥當天定義為第一天。化合物2按30 mg/kg，q2d方案給藥21天。阿扎胞苷按1.5 mg/kg，qd方案給藥七天（與表7中編號81方案對應）。

如圖12所示，在接種MOLM-13細胞後第三天開始給予化合物2或溶媒，n=15。採用log-rank法對兩組動物的生存曲線進行分析比較。經Bonferrion多重檢驗校正，P ＜ 0.05。參見表4，溶媒對照組小鼠在第15天（細胞接種後17天）開始出現動物死亡，並在第20天小鼠全部死亡，中位生存期為16天。化合物2給藥組動物的中位生存時間為24天（與溶媒對照組比較，P ＜ 0.01）。阿扎胞苷單藥在該模型中也可以顯著延長小鼠生存期，中位生存時間為24天（與溶媒對照組比較，P ＜ 0.01）。化合物2與阿扎胞苷聯合用藥組可進一步延長小鼠生存時間，中位生存時間達到30天（與溶媒對照組比較，與化合物2單藥組比較，與阿扎胞苷單藥組比較，P 值均＜ 0.01）。表4.化合物2 與阿扎胞苷聯合用藥顯著延長荷人MOLM-13（AML）異種移植瘤小鼠的中位生存時間

	溶媒對照組	化合物2 30 mg/kg	阿扎胞苷 1.5 mg/kg	化合物2 與 Azacitidine
中位生存期（天）	16	24	24	30
延長生存期（天）	-	8	8	14

結果顯示，在口服給藥方案中，化合物2單藥對MOLM-13人AML細胞小鼠異種移植瘤表現出顯著的腫瘤生長抑制作用。在良好耐受的劑量下，化合物2與阿扎胞苷聯合治療能夠顯著延長荷人MOLM-13（AML）異種移植瘤小鼠的生存時間，在MOLM-13全身性瘤模型中顯著延長小鼠生存時間。 5.4 化合物2與阿扎胞苷或地西他濱聯合用藥在人OCI-AML-3 AML小鼠異種移植瘤模型中的抗腫瘤作用

在體外細胞實驗中，OCI-AML-3是對化合物2處理較為敏感的人AML細胞系，IC50值為315.6 ± 97 nM。採用OCI-AML-3細胞建立小鼠異種移植瘤模型以評估化合物2與阿扎胞苷或地西他濱聯合用藥的抗AML作用。

如圖13和表5所示，化合物2 按50 mg/kg劑量，口服，q2d × 15天方案給藥在該模型中未能抑制腫瘤生長，T/C 值為84.8%（P＞0.05）。阿扎胞苷按 2 mg/kg，尾靜脈注射，qd × 7d，停藥7天，再qd × 2天方案給藥（與表7中編號68方案對應）。在實驗結束時（d15），均未顯示顯著的抗腫瘤活性，T/C值為56.6%（P ＞ 0.05）。化合物2（50 mg/kg）與阿扎胞苷（2 mg/kg）聯合用藥表現出明顯增強的抗腫瘤作用，T/C值為43.4%，協同因子為1.11，結果顯示兩藥聯合用藥具有協同作用。表5.化合物2與阿扎胞苷聯合給藥在人OCI-AML-3 AML小鼠異種移植瘤模型中的抗腫瘤作用

治療	相對腫瘤體積 (RTV, Mean ± SEM)	T/C 值 (%) （d15）	協同因子^a
化合物2 溶媒 + 生理食鹽水	16.5 ± 4.1	-	-
化合物2 /50 mg/kg	14.0 ± 2.7	84.8	-
阿扎胞苷/2 mg/kg	9.3 ± 3.2	56.6	-
化合物2 /50 mg/kg + 阿扎胞苷/2 mg/kg	7.2 ± 1.3	43.4	1.11
注：生理食鹽水為阿扎胞苷的溶媒；^a 協同因子：＞1協同作用，=1 相加作用，＜1 拮抗作用

如圖14和表6所示，地西他濱（1 mg/kg），尾靜脈注射，qd × 7d，停藥7天，再qd × 2天方案給藥，在實驗結束時（d15），也未顯示明顯的抗腫瘤活性，T/C值為64.9% （P ＞ 0.05）。但化合物2（50 mg/kg）與地西他濱（1 mg/kg）聯合用藥顯示明顯增強的抗腫瘤作用，在給藥後第15天的T/C 值為44.9%。協同分析分析顯示藥物聯合使用具有協同作用，協同因子是1.22。

結果顯示，從RTV值、T/C值和協同因子看，化合物2與阿扎胞苷或地西他濱聯合用藥較佳於阿扎胞苷、地西他濱單獨用藥。在各治療組中均未觀察到顯著的體重減輕。表6 化合物2與地西他濱聯合用藥在人OCI-AML-3 AML小鼠異種移植瘤模型中的抗腫瘤作用

治療	相對腫瘤體積 (Mean ± SEM)	T/C 值(%) （d15）	協同因子^a
化合物2溶媒+ 生理食鹽水	16.5 ± 4.1	-	-
化合物2 /50 mg/kg	14.0 ± 2.7	84.8	-
地西他濱 /1 mg/kg	10.7 ± 1.7	64.9	-
化合物2 /50 mg/kg + 地西他濱/1 mg/kg	7.4 ± 1.0	44.9	1.22
注：生理食鹽水為地西他濱的溶媒；^a 協同因子：＞ 1協同作用，=1 相加作用，＜1 拮抗作用

5.5 化合物2單藥及聯合用藥在人源MOLM-13 和OCI-AML-3 AML小鼠異種移植瘤模型中的體內抗腫瘤作用

阿扎胞苷和地西他濱在新診斷和晚期AML患者中的反應率均較低。完全緩解和完全緩解伴不完全計數恢復的綜合反應率通常為20％至30％ (Kim et al., 2015)。即使持續接受Aza和Dec治療，患者均會出現疾病復發。採用兩種人源AML癌細胞小鼠移植瘤模型評估化合物2單藥及聯合用藥的體內抗腫瘤作用。表7所示在人源AML癌細胞小鼠異種移植瘤模型中所進行的抗腫瘤作用，化合物2按照口服（po）、每兩天一次（q2d）方案給藥。

結果如圖15所示，使用化合物2單一藥劑的治療顯著延長了荷MOLM-13全身性AML異種移植瘤小鼠的存活，並呈劑量依賴性。表7. 化合物2在人源AML細胞小鼠異種移植瘤模型中的藥效學實驗設計

模型（適應症）	藥物	編號	小鼠品系	劑量 (化合物2)	給藥途徑和給藥方案（化合物2）	聯合用藥方案
MOLM-13 （AML）	單藥	57	NOD SCID	80 mg/kg	p.o.，q2d × 3w	-
	聯合	81	NOD SCID	30 mg/kg	p.o.，q2d × 3w	阿扎胞苷 1.5 mg/kg，i.v.， qd × 7 d
	聯合	15	NOD SCID	50 mg/kg	p.o.，qd × 7d	阿扎胞苷 2 mg/kg，i.v.， qd × 7 d
OCI-AML-3 （AML）	聯合	68	NOD SCID	20， 50 mg/kg	p.o.，q2d × 3w	阿扎胞苷 2 mg/kg， i.v， qd × 7d, 7 days off, qd × 2d; 地西他濱， 1 mg/kg， i.v， qd × 7d, 7 days off, qd × 2d;
注：qd為每天一次； q2d為每2天一次；d為天數；w為週數

如圖16所示，化合物2增強AML異種移植模型中Aza或Dec的體內抗白血病活性。

（A）植入1×10⁷ 個MOLM-13細胞的NOD SCID小鼠（n = 15 /組）在細胞植入後三天用載體、化合物2 50mg/kg（每天PO，持續7天）、Aza 2mg/kg（每日，持續7天）單獨或聯合地治療。資料顯示為描繪小鼠存活的Kaplan-Meier曲線。使用Bonferroni多重比較的對數秩用於存活比較。*P ＜0.05。

（B）攜帶皮下OCI-AML-3腫瘤的NOD SCID小鼠用化合物2 50mg/kg（每隔一天PO，持續15天）、Aza 2mg/kg（每天IV，持續7天）、Dec 1mg/kg（每天IV，持續7天）單獨或聯合地治療，並測定腫瘤生長抑制（TGI）。

上述結果表明，化合物2單藥在人MOLM-13 AML小鼠全身性異種移植瘤模型中顯示出顯著的腫瘤生長抑制作用，在二甲基苯蒽誘導的大鼠骨髓增生不良症候群（MDS）模型中表現出顯著的抗MDS作用。聯合用藥中，化合物2與其他抗癌劑在人MOLM-13 AML小鼠全身性異種移植瘤模型和人OCI-AML-3 AML小鼠皮下異種抑制瘤模型中能夠獲得較佳於單藥的抗腫瘤作用，取得了協同效果。在單藥和聯合用藥研究中，荷瘤動物對上述治療耐受性良好，顯示化合物2可以用作單一藥劑或與其他治療劑聯合用於臨床上AML和MDS的治療。

在本研究中，我們在AML細胞系和異種移植物中測試了作為單一藥劑或與其他抗癌治療劑聯合的最有效的MDM2抑制劑之一（化合物2）。體外實驗證明化合物2對TP53野生型AML細胞系具有有效的抗增殖活性。抗增殖活性在TP53野生型和FLT3-ITD 突變型AML細胞中特別顯著。在聯合治療中，化合物2增強了其他治療劑（包括去甲基化藥物（阿扎胞苷和地西他濱）和化療劑阿糖胞苷）的抗增殖活性。在人MOLM-13全身性異種移植物中，用化合物2單一藥劑處理顯著抑制腫瘤生長，最小有效劑量為20mg/kg。更高劑量的化合物2（80mg/kg）實現了更強的抗腫瘤活性。當化合物2與以下聯合時：（1）在皮下OCI-AML-3和全身性MOLM-13模型中與阿扎胞苷；（2）在皮下OCI-AML-3模型中與地西他濱，記錄了增強的抗白血病活性。

值得注意的是，AML是一種具有複雜核型的高度異質性疾病。其中，FLT3 和NPM1 是最常見的突變基因。在新發AML中，FLT3 和NPM1 的突變頻率可分別高達28％和27％。如上所述，作為單一藥劑的化合物2在體外和體內在攜帶FLT3-ITD 突變的AML細胞中具有有效的抗白血病活性。在攜帶FLT3-ITD 突變的MOLM-13 AML全身異種移植模型中，化合物2單獨地可以顯著減輕疾病負擔並延長小鼠存活。與單一藥物相比，用化合物2和阿扎胞苷或FLT3抑制劑的聯合治療實現了更強的抗AML活性。在攜帶NPM1突變的OCI-AML-3 AML異種移植模型中，用化合物2和去甲基化藥物（阿扎胞苷和地西他濱）、傳統化療藥物（Ara）的聯合治療產生協同抗AML效應。這些結果表明化合物2在顯示FLT3 和NPM1 突變的AML中具有廣泛的應用潛力。實施例6. 化合物2劑量遞增的單藥及聯合阿扎胞苷或阿糖胞苷的I期臨床研究

本研究的目的是確定化合物2單藥及聯合阿扎胞苷（Azacitidine）或阿糖胞苷（Cytarabine）在成人復發或難治性急性髓性白血病（Relapsed or refractory acute myeloid leukemia, R/R AML）和復發或難治性高危/極高危骨髓增生不良症候群（Myelodysplastic Syndrome, MDS）等血液腫瘤患者的安全性和耐受性。試驗藥物、劑量和給藥方法

試驗藥物化合物2為膠囊劑，每粒含化合物2 5mg或 50mg，唯一的輔料為微晶纖維素。試驗藥物化合物2應遮光、密封、2-8℃下貯存。

化合物2按照標準3+3方案進行劑量遞增，起始劑量為150mg，依次遞增至200mg、250mg、300mg，每日口服一次（QD），每週期從第1天開始使用，連續服用7天後休息 21天，每 28 天為一個給藥週期。

當第一階段化合物2單藥劑量遞增結束後，可進入第二階段，即化合物2聯合用藥劑量遞增。聯合用藥方案中化合物2的劑量從100mg開始，依次遞增至150mg、200mg。阿扎胞苷為固定劑量，75mg/m² 皮下注射，每日一次，每週期從第1天開始使用，連續7天後休息21天，每28天為一個給藥週期。阿糖胞苷為固定劑量，1g/m² 靜脈注射，靜脈輸注時間不少於4小時，每日一次，每週期從第3天開始使用，連續5天後休息21天，每28天為一個給藥週期。阿扎胞苷或阿糖胞苷均於化合物2口服4小時後給藥。兩藥聯合治療後進入休息期。實施例7. 化合物2與DEC、AZA或Ara-C聯合處理AML細胞，協同啟動P53通路，下調參與細胞週期進展和失配修復的基因

為了探知化合物2與AZA或Ara-C協同作用的潛在作用機制，我們對經化合物2、AZA或Ara-C各自單獨或聯合處理24小時的MOLM-13細胞進行RNA-Seq分析。差異基因表達分析顯示，與DMSO對照相比，化合物2與AZA或Ara-C聯合處理差異基因表達數量最多 (圖17A至圖17B)。KEGG訊號通路分析表明，化合物2與AZA聯合使用導致p53訊號通路相關基因上調，DNA複製、錯配修復、及細胞週期進展相關基因下調(圖17C)。化合物2和Ara-C組合導致p53訊號通路相關基因上調，細胞週期相關基因下調 (圖17D)。鑒於化合物2和AZA或Ara-C協同上調p53相關通路，進一步對p53調控基因的差異表達進行分析。熱圖結果顯示化合物2可在體外誘導MOLM-13細胞 p53靶基因顯著上調。總的來說這兩種組合的誘導效果明顯較佳於單獨的兩種藥劑(圖17E-F)。這包括替代的P53啟動標記物GDF15 (又名MIC-1)、促凋亡基因、BBC3(編碼PUMA)、MDM2、BAX和FAS。以及細胞週期進展相關的負調控因子，CDKN1A(編碼P21)和GADD45的。類似地，化合物2 +AZA或Ara-C聯合處理後，SESN1和SESN2均升高，兩者均為MTORC1的負調節因子。聯合處理後，包括CDC20、CCNB1和PLK1在內的後，參與細胞週期進展的癌蛋白編碼基因顯著下調。在參與DNA複製的基因、MCM4和MCM2中也觀察到類似的效應。化合物2 + Ara-C聯合治療中P53調控基因增加程度更顯著。這些資料表明，化合物2與DEC、AZA或Ara-C聯合治療可協同啟動P53通路，下調參與細胞週期進展和失配修復的基因。

如圖17中所示，(A-B)圖表顯示化合物2和AZA或Ara-c單獨或聯合作用24小時後差異表達基因的數量具有統計學意義。(C-D) 化合物2與AZA或Ara-C聯合處理後，變化最為顯著的訊號通路。 (E-F)在MOLM-13細胞中，針對化合物2和AZA或Ara-C單獨或聯合作用，部分p53調控基因的變化。實施例8. 化合物2與DEC、AZA或Ara-C聯合處理AML細胞可誘導DNA損傷並協同上調P21的表達

因此，我們評估了這些被識別的訊號通路所涉及的蛋白變化。如圖18A至圖18C所示，聯合治療可顯著增加DNA損傷，由γ-H2AX表達量增加證明。如前所述，化合物2啟動P53後，進一步誘導P53和P21蛋白的積累。DEC和AZA是藉由抑制甲基轉移酶I (DNMT1)的功能而誘導細胞DNA低甲基化的低甲基化藥物。多項研究表明，DNMT1與腫瘤細胞中的UHRF1和HDAC1蛋白形成複合物，結合並抑制各種抑癌基因(如P16INK4A、P14ARF、P21)啟動子的表達，促進腫瘤生長。阿糖胞苷是一種嘧啶核苷類似物，誘導DNA損傷，進而啟動ATM/ATR-P53-P21訊號級聯，抑制細胞DNA合成，干擾細胞增殖。

基於上述證據，我們進一步檢測了化合物2與低甲基化的藥物DEC、AZA或藥物Ara-C聯合治療對P53、去甲基化標記蛋白DNMT1、共同靶標蛋白P21的調節作用，以及凋亡標誌物蛋白裂解PARP-1的表達。與預期一致，使用化合物2對表達野生型TP53的癌細胞進行處理，穩定了P53，啟動了P53通路，導致P53和P21的積累。用AZA或DEC處理幾乎完全消除DNMT1。單獨Ara-C對P21有顯著的上調作用。最重要的是，與單獨藥物處理相比，化合物2與DEC、AZA或Ara-C聯合治療可協同上調P21蛋白(圖18D-F)。此外，化合物2與DEC、AZA或Ara-C協同作用，誘導凋亡生物標誌物的產生，即PARP-1裂解(圖18D-F)。RG-7388是作為本實驗的比較而引入。其對P53和P21的影響與化合物2相似。RG-7388聯合DEC、AZA、Ara-C也能顯著上調P53、P21的表達，進而誘導PARP-1裂解的產生(圖18D-F)。潛在的潛在作用機制如圖18所示。簡言之，化合物2是MDM2-P53相互作用的小分子抑制劑。藉由與MDM2蛋白結合，消除MDM2對P53的抑制作用，恢復P53的抑癌功能。化合物2可以恢復P53的抑癌功能，進而誘導P21表達。DEC, AZA和Ara-C誘導γ-H2AX表達增加，提示DNA損傷增加。 DNA損傷進一步啟動P53、P21。此外，AZA或DEC處理可防止DNMT1-UHRF1-HDAC1複合物對P21的抑制，從而與化合物2協同誘導P21的表達。Ara-C處理也啟動了P53-P21通路，從而協同誘導P21蛋白表達。

如圖18中所示，(A-B) DEC (100 nM), AZA (0.33 µM)處理24小時後，隨後單獨或聯合應用新的DEC (100 nM), AZA (0.33 µM)與化合物2 (40 nM)再處理24小時，蛋白在MOLM-13細胞中的表達。(C)單獨或聯合應用Ara-C (100 nM)或化合物2 (40 nM)處理48小時後，MOLM-13細胞中的蛋白表達。(D-F) 如圖所示化合物2 (40 nM), RG-7388 (40 nM), DEC (100 nM), AZA (3 µM), Ara-C單獨或聯合處理48小時後，MOLM-13細胞中的蛋白表達。β-actin被用來確認相同加載的蛋白質。 (G)所提出的化合物2與DEC、AZA或Ara-C聯合作用於AML細胞的作用機制。其結果代表了三個獨立的結果。以RG-7388為對照，β-actin被用來確認相同加載的蛋白質。

綜上所述，這些資料強烈表明在聯合處理中觀察到的P21誘導是強有力的，至少部分是源於協同抗增殖活性的作用，經化合物2與AZA、DEC或Ara-C聯合處理後均可增加細胞凋亡的誘導。實施例9. 化合物2與達拉非尼（dabrafenib）和曲美替尼（trametinib）的聯合在BALB/c免疫缺陷小鼠皮下A375皮膚黑色素瘤異種移植瘤模型中的體內功效研究

進行了體內研究，評估化合物2作為單一藥物以及化合物2與達拉非尼和曲美替尼的聯合在皮下A375皮膚黑色素瘤異種移植瘤模型中的治療效果，實驗設計見表8。表8. 化合物2與達拉非尼（dabrafenib）和曲美替尼（trametinib）的聯合在人源A375皮膚黑色素瘤小鼠異種移植瘤模型中藥效學實驗設計（腫瘤細胞系：A375；5×10⁶ 細胞/小鼠皮下植入）

組	動物	治療	劑量(mg/kg)	給藥途徑	給藥方案
1	5	化合物2的溶媒	-	PO	QD × 7D
曲美替尼的溶媒	-	PO	QD × 21D
達拉非尼的溶媒	-	PO	QD × 21D
2	5	化合物2	50	PO	QD × 7D
3	5	曲美替尼	1	PO	QD × 21D
達拉非尼	30	PO	QD × 21D
4	5	化合物2	50	PO	QD × 7D
曲美替尼	1	PO	QD × 21D
達拉非尼	30	PO	QD × 21D

人A375細胞系購自Cobioer。該細胞系經過遺傳鑒定，沒有微生物污染。將A375細胞保存在DMEM（Cat. #C11995500BT, GIBCO）中，該DMEM補充有10％胎牛血清（Cat. #10099-141C, GIBCO）、100 U/mL青黴素G和100 μg/mL鏈黴素（Cat. #15140-122, GIBCO）。將細胞在加有5％CO₂ 的加濕培養箱中於37°C孵育。

化合物2藉由用研缽將化合物2懸浮在0.2％HPMC中而製成均質混懸液。混懸液每週製備一次，並保存在4°C下。在使用前，使製劑恢復至室溫並充分混合。將化合物2藉由口服管飼法（PO）給藥，劑量為10 mL/kg。達拉非尼購自selleck。藉由使用超音波波將達拉非尼懸浮在0.5％HPMC中製備成均質混懸液。混懸液每週製備一次，並保存在4°C下。將達拉非尼藉由口服管飼法（PO）給藥，劑量為10 mL/kg。曲美替尼購自Selleck。藉由懸浮在1％CMC、0.5％Tween 80和0.5％MC中獲得澄清溶液，將曲美替尼製成均質混懸液。每三天製備一次溶液，並儲存在4°C下。將曲美替尼藉由口服管飼法（PO）給藥，劑量為10 mL/kg。

使用六至八週大的雌性BALB/c 免疫缺陷小鼠。接種動物數為55隻，證書編號為202003066，許可證編號為SCXK（蘇）2018-0008，動物供應商為GemPharmatech Co，Ltd。

結果如圖19 和表9所示，將化合物2單藥每天以50 mg/kg施用7天發揮了有效的抗腫瘤活性，T/C值為58.25％。每天給藥30 mg/kg的達拉非尼和1 mg/kg的曲美替尼的組合持續3週，顯示出顯著的抗腫瘤活性，T/C值為11.78％（與溶媒對照相比，p ＜0.001）。在達拉非尼和曲美替尼的組合中增加化合物2表現出顯著增強的抗腫瘤活性，達到0.75％的T/C值（與溶媒對照相比，p ＜0.01；與“化合物2”組相比，p ＜0.05）。相應的協同因子為9.10，表明協同抗腫瘤作用。重要的是，在化合物2與達拉非尼和曲美替尼聯合治療的組中，動物在研究期間獲得了2/5 CR和3/5 PR的100％總體緩解率。

圖19以及表9結果表明，化合物2與達拉非尼加加曲美替尼的聯合在皮膚黑色素瘤異種移植模型中發揮協同抗腫瘤活性，表明該組合在皮膚黑色素瘤治療中的潛在治療應用。表9. 化合物2與達拉非尼（dabrafenib）和曲美替尼（trametinib）的聯合在人源A375皮膚黑色素瘤小鼠異種移植瘤模型中的抗腫瘤作用

治療	RTV @ D18(平均值 ± SEM)	T/C (%) @ D18	協同因子 @ D18	mRECIST	DCR (%)	ORR (%)
溶媒對照	17.36 ± 1.33	-	-	5/5 PD	0	0
化合物2	10.11 ± 1.83	58.25	-	5/5 PD	0	0
達拉非尼+曲美替尼	2.04 ± 0.88^***	11.78	-	1/5 PR,2/5 SD,2/5 PD	60	20
化合物2 +達拉非尼+曲美替尼	0.13 ± 0.06^**†	0.75	9.10	2/5 CR,3/5 PR	100	100
^ p ＜ 0.01;^* p ＜ 0.001, 相比於溶媒對照組;^† p ＜ 0.05, 相比於“化合物2”組; 協同因子＞1，具有協同作用；協同因子=1，具有相加作用；協同因子＜1，具有拮抗作用。 DCR：疾病控制率，DCR是根據mRECIST用顯示CR（腫瘤完全消退）、PR（腫瘤部分消退）或SD（疾病穩定）的動物的比例計算得出的； ORR：總體反應率，ORR是根據mRECIST以顯示CR或PR的動物的比例計算得出的。

實施例10. 化合物2與氟維司瓊（fulvestrant）和阿培利司（alpelisib）的聯合在BALB/c免疫缺陷小鼠皮下MCF-7 ER⁺ 乳腺癌異種移植瘤模型中的體內功效研究進行了體內研究，評估化合物2與氟維司瓊和阿培利司的聯合在皮下MCF-7 ER⁺ 乳腺癌異種移植模型中的治療效果，實驗設計見表10。表10. 化合物2與氟維司瓊（fulvestrant）和阿培利司（alpelisib）的聯合在小鼠皮下MCF-7 ER⁺ 乳腺癌異種移植瘤模型中的藥效學實驗設計（腫瘤細胞系：MCF-7；1×10⁷ 細胞/小鼠皮下植入）

組	動物	治療	劑量(mg/kg)	給藥途徑	給藥方案
1	2	化合物2的溶媒	-	PO	QD × 7D
氟維司瓊的溶媒	-	SC	BIW × 21D
阿培利司的溶媒	-	PO	QD × 21D
2	2	化合物2	50	PO	QD × 7D
阿培利司	25	PO	QD × 21D
3	2	氟維司瓊	20	SC	BIW × 21D
阿培利司	25	PO	QD × 21D
4	2	化合物2	50	PO	QD × 7D
氟維司瓊	20	SC	BIW × 21D
阿培利司	25	PO	QD × 21D

人MCF-7細胞系購自Cobioer。該細胞系經過遺傳鑒定，沒有微生物污染。將MCF-7細胞保存在MEM（Cat. # C12571500BT, GIBCO）中，該MEM補充有10％的胎牛血清（Cat. #10099-141C, GIBCO）、100 U/mL青黴素G和100μg/mL鏈黴素（Cat. #15140-122, GIBCO）。將細胞在加有5％CO₂ 的加濕培養箱中於37°C孵育。

化合物2藉由用研缽將化合物2懸浮在0.2％HPMC中而製成均質混懸液。混懸液每週製備一次，並保存在4°C下。在使用前，使製劑恢復至室溫並充分混合。將化合物2藉由口服管飼法（PO）給藥，劑量為10 mL/kg。氟維司瓊（批次編號：S119117）購自Selleck。藉由溶解在玉米油中、渦旋並超音波處理成澄清溶液來製備氟維司瓊。在使用前製備該溶液。以10 mL/kg的劑量皮下注射（SC）給予氟維司瓊。阿培利司（批次號：HY-15244）購自MCE。藉由懸浮在0.5％CMC-Na中，渦旋並超音波處理，將阿培利司製成均勻的混懸液。每週製備一次阿培利司，並保存在4°C下。在使用前，使製劑恢復至室溫並充分混合。藉由口服管飼法（PO）施用阿培利司，劑量為10 mL/kg。

使用六至八週大的雌性BALB/c 免疫缺陷小鼠。接種動物數為70隻，證書編號為202001895，許可證編號為SCXK（蘇）2018-0008，動物供應商為GemPharmatech Co，Ltd。

結果如圖20 和表11所示，50 mg/kg的化合物2與25 mg/kg的阿培利司聯合發揮了有效的抗腫瘤活性，T/C值為38.92％。每天服用20 mg/kg的氟維司瓊和25 mg/kg的阿培利司聯用3週，顯示出顯著的抗腫瘤活性，T/C值為31.19％。在氟維司瓊和阿培利司的組合中增加化合物2表現出顯著增強的抗腫瘤活性，T/C值達到0％。此外，化合物2與氟維司瓊和阿培利司的三聯組合能夠達到100％的總體緩解率，研究期間的CR為2/2。

在所有治療期間均未觀察到明顯的體重減輕。

圖20以及表11表明，化合物2與氟維司瓊和阿培利司的聯合在ER⁺ 乳腺癌異種移植模型中發揮協同抗腫瘤活性，表明該組合在ER⁺ 乳腺癌治療中的潛在治療應用。表11. 化合物2與氟維司瓊（fulvestrant）和阿培利司（alpelisib）的聯合在小鼠皮下MCF-7 ER⁺ 乳腺癌異種移植瘤模型中的抗腫瘤作用

治療	RTV @ D33(平均值 ± SEM)	T/C (%) @ D33	mRECIST	DCR (%)	ORR (%)
溶媒對照	1.98 ± 0.56	-	-	-	-
化合物2 + 阿培利司	0.77 ± 0.02	38.92	2/2 SD	100	0
氟維司瓊+ 阿培利司	0.62 ± 0.23	31.19	2/2 PR	100	50
化合物2 +氟維司瓊+ 阿培利司	0.00 ± 0.00	0.00	2/2 CR	100	100

除本文中描述的那些外，根據前述描述，本發明的各種修改對本領域技術人員而言會是顯而易見的。這樣的修改也意圖落入所附申請專利範圍的範圍內。本申請中所引用的各參考文獻(包括所有專利、專利申請、期刊文章、書籍及任何其它揭露)均以其整體援引加入本文。

無。

圖1.化合物2單藥體外對TP53野生型和突變型AML細胞系的增殖抑制作用圖。圖2A.化合物2與地西他濱、阿扎胞苷聯合用藥對TP53野生型AML細胞系的生長抑制作用圖。圖2B.化合物2與阿糖胞苷聯合用藥對TP53野生型AML細胞系的生長抑制作用圖。圖3A至圖3C.化合物2與曲美替尼聯合用藥對STK11和KRAS共突變的非小細胞肺癌（NSCLC）細胞系的抗增殖作用圖。圖4A至圖4B.化合物2與曲美替尼聯合用藥對KRAS野生型且 STK11野生型非小細胞肺癌（NSCLC）細胞系NCI-H226和NCI-H292的抗增殖作用圖。圖5A.化合物2單藥以不同濃度處理MOLM-13細胞後的細胞凋亡示意圖。圖5B.為圖5A圖中化合物2誘導凋亡的流式分析代表圖式。圖6. 化合物2與地西他濱、阿扎胞苷或阿糖胞苷聯合處理MOLM-13細胞後的細胞凋亡示意圖。圖7. 化合物2 單藥在TP53野生型AML細胞中以劑量依賴性方式降低S期細胞比例示意圖。圖8. 化合物2 與地西他濱、阿扎胞苷、阿糖胞苷聯合處理MOLM-13、OCI-AML-3及MV-4-11細胞的週期阻滯協同作用圖。圖9A. 化合物2骨髓中人CD45+ AML細胞的流式分析圖。圖9B. 化合物2脾臟中人CD45+ AML細胞的流式分析圖。圖9C. 化合物2骨髓中人CD45+ AML細胞比例匯總分析圖。圖9D. 化合物2脾臟中人CD45+ AML細胞比例匯總分析圖。圖10.化合物2單藥在兩組動物的生存曲線進行分析比較圖。圖11A.分組治療前DMBA誘導大鼠外周血PLT、WBC水準顯著下降的MDS表徵示意圖。圖11B.化合物2單藥對MDS大鼠外周血PLT、WBC和RBC水準無顯著影響示意圖。圖11C. 化合物2單藥可顯著恢復MDS大鼠骨髓PLT、WBCB和RBC水準示意圖。圖12.化合物2與阿扎胞苷聯用在兩組動物的生存曲線進行分析比較圖。圖13A至圖13B. 化合物2、阿扎胞苷及兩者聯合用藥的抑制腫瘤生長曲線圖和小鼠體重變化圖。圖14A至圖14B. 化合物2、地西他濱及兩者聯合用藥的抑制腫瘤生長曲線圖和小鼠體重變化圖。圖15.化合物2單一藥劑劑量依賴的顯著延長荷系統性MOLM-13 AML異種移植物瘤小鼠的存活。植入1×10⁷ 個MOLM-13細胞的NOD SCID小鼠（n = 10 /組）在細胞植入後三天用載體、20mg/kg（每隔一天口服，持續21天）、50mg/kg（每日口服，持續7天）或100mg/kg（每日口服持續七天）的化合物2治療。資料顯示為描繪小鼠存活的Kaplan-Meier曲線。使用Bonferroni多重檢驗的對數秩檢驗用於存活曲線比較，* P ＜0.05。圖16. 化合物2增強AML異種移植模型中Aza或Dec的體內抗白血病活性。（A）植入1×10⁷ 個MOLM-13細胞的NOD SCID小鼠（n = 15 /組）在細胞植入後三天用載體、化合物2 50mg/kg（每天PO，持續7天）、Aza 2mg/kg（每日，持續7天）單獨或聯合地治療。資料顯示為描繪小鼠存活的Kaplan-Meier曲線。使用Bonferroni多重比較的對數秩用於存活比較。*P ＜0.05。（B）攜帶皮下OCI-AML-3腫瘤的NOD SCID小鼠用化合物2 50mg/kg（每隔一天PO，持續15天）、Aza 2mg/kg（每天IV，持續7天）、Dec 1mg/kg（每天IV，持續7天）單獨或聯合地治療，並測定腫瘤生長抑制（TGI）。圖17. 單獨或聯合使用化合物2和AZA或Ara-C處理的MOLM-13細胞的RNA-Seq分析。 (A-B)圖表顯示化合物2和AZA或Ara-c單獨或聯合作用24小時後差異表達基因的數量具有統計學意義。(C-D) 化合物2與AZA或Ara-c聯合處理後，變化最為顯著的訊號通路。 (E-F)在MOLM-13細胞中，針對化合物2和AZA或Ara-C單獨或聯合作用，部分p53調控基因的變化。圖18. 化合物2與DEC、AZA、Ara-C聯合處理AML細胞，協同誘導DNA損傷，上調P21表達。(A-B) DEC (100 nM), AZA (0.33 µM)處理24小時後，隨後單獨或聯合應用新的DEC (100 nM), AZA (0.33 µM)與化合物2 (40 nM)再處理24小時，蛋白在MOLM-13細胞中的表達。(C)單獨或聯合應用Ara-C (100 nM)或化合物2 (40 nM)處理48小時後，MOLM-13細胞中的蛋白表達。(D-F) 如圖所示化合物2 (40 nM), RG-7388 (40 nM), DEC (100 nM), AZA (3 µM), Ara-C單獨或聯合處理48小時後，MOLM-13細胞中的蛋白表達。β-actin被用來確認相同加載的蛋白質。 (G)所提出的化合物2與DEC、AZA或Ara-C聯合作用於AML細胞的作用機制。其結果代表了三個獨立的結果。以RG-7388為對照，β-actin被用來確認相同加載的蛋白質。圖19A至圖19B. 化合物2與達拉非尼和曲美替尼聯合治療皮下A375皮膚黑色素瘤異種移植瘤（SZ-EF-20-2020）小鼠的腫瘤生長曲線和小鼠的體重變化（％）。圖20A至圖20B. 化合物2和氟維司瓊和阿培利司聯合治療皮下MCF-7 ER⁺ 乳腺癌異種移植瘤（SZ-EF-04-2020）小鼠的腫瘤生長曲線和小鼠的體重變化（％）。

Claims

一種藥物組合物，其包含一MDM2抑制劑和一種或多種抗癌劑及任選的藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
如請求項1所述的藥物組合物，其中該MDM2抑制劑為下述結構式化合物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物：
其中：
選自由以下各項組成的組：
; B是C_4-7 碳環； R₁ 是H、取代或未取代的C_1-4 烷基、取代或未取代的C₃ -₈ 環烷基、取代或未取代的雜環烷基、 OR^a 或NR^a R^b ； n是0、1或2； R₂ 、R₃ 、R₄ 、R₅ 、R₇ 、R₈ 、R₉ ，以及R₁₀ 獨立地選自由H、F、Cl、CH₃ 、以及CF₃ 組成的組； R₆ 是
； R^a 是氫或取代或未取代的C_1-4 烷基； R^b 是氫或取代或未取代的 C_1-4 烷基； R^c 和R^d 是环B的一個碳原子上的取代基，其中 R^c 是 H、C_1-3 烷基、C_1-3 亞烷基-OR^a 、OR^a ，或鹵代； R^d 是 H、C_1-3 烷基、C_1-3 亞烷基-OR^a 、OR^a ，或鹵代；或 R^c 和R^d 與它們所連接的碳一起形成4元至6元螺環取代基，該取代基任選地含有氧原子或氮原子；並且 R^e 是—C(=O)ORa、—C(=O)NR^a R^b ，或 —C(=O)NHSO₂ CH₃ 。
如請求項2所述的藥物組合物，其中
是
； B 是
； R^c 和R^d 是F和F、H和H、OH和CH₃ 、CH₃ 和CH₃ 、CH₃ 和OH、H和OH、CH₂ CH₃ 和CH₂ CH₃ 、以及CH₂ OH和CH₂ OH。
如請求項2至請求項3中任一項所述的藥物組合物，其中—(CH₂ )_n R₁ 是H, CH₃ , 或CH₂ CH₃ 。
如請求項2至請求項4中任一項所述的藥物組合物，其中R₂ 是H；R₃ 是鹵代；R₄ 和R₅ 均是H。
如請求項2至請求項5中任一項所述的藥物組合物，其中R₇ 是鹵代；R₈ 、R₉ ，以及R₁₀ 中的每一個是H；R^e 是—C(═O)OH、—C(═O)NH₂ ，或 —C(═O)NHSO₂ CH₃ 。
如請求項2至請求項6中任一項所述的藥物組合物，其中該MDM2抑制劑選自以下化合物及其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物：
如請求項2至請求項6中任一項所述的藥物組合物，其中該MDM2抑制劑是化合物1及其藥學上可接受的鹽或溶劑化物：
。
如請求項2至請求項6中任一項所述的藥物組合物，其中該MDM2抑制劑是化合物2及其藥學上可接受的鹽或溶劑化物：
。
如請求項1至請求項9中任一項所述的藥物組合物，其中該抗癌劑選自化療藥，包括一高三尖杉酯鹼、一去甲基化藥物和/或一抗代謝藥物；較佳地，該去甲基化藥物包括阿扎胞苷、地西他濱、折布拉林、法紮拉濱或二氫-5’-胞苷；較佳地，該抗代謝藥物包括阿糖胞苷、安西他濱、吉西他濱或曲沙他濱。
如請求項1至請求項9中任一項所述的藥物組合物，其中該抗癌劑選自一MEK抑制劑；較佳地，該MEK抑制劑包括匹馬替尼、PD184352、PD0325901、塞魯米替尼、PD98059、U0126-EtOH、TAK-733、瑞法替尼、GDC-0623、RO4987655、RO5126766（CH5126766）、SL-327、BI-847325或曲美替尼。
如請求項1至請求項11中任一項所述的藥物組合物，其中該MDM2抑制劑是化合物2及其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，其具有下式結構：
，該抗癌劑是阿扎胞苷、地西他濱和/或阿糖胞苷。或者，該抗癌劑是阿扎胞苷、地西他濱、阿糖胞苷和/或曲美替尼。
如請求項1至請求項10中任一項所述的藥物組合物，其中該MDM2抑制劑是化合物2及其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，其具有下式結構：
，該抗癌劑是高三尖杉酯鹼。
如請求項1至請求項9中任一項所述的藥物組合物，其中該抗癌劑選自以下的一種或多種：一BRAF抑制劑、一MEK抑制劑、一雌激素受體抑制劑、一PI3k抑制劑；其中該BRAF抑制劑選自索拉非尼、PLX-4720、瑞戈非尼(BAY 73-4506)、GDC-0879、RAF265、SB590885、AZ 628、ML 7866二鹽酸鹽、PF-04880594、TAK-632、CEP-32496、RO5126766或達拉非尼；該MEK抑制劑選自匹馬替尼、PD184352、PD0325901、塞魯米替尼、PD98059、U0126-EtOH、TAK-733、瑞法替尼、GDC-0623、RO4987655、RO5126766（CH5126766）、SL-327、BI-847325或曲美替尼；該雌激素受體抑制劑選自托瑞米芬、檸檬酸托瑞米芬、雌三醇、丙基吡唑三醇、AZD9496、LY88074、GDC-0924外消旋體、CMP8、OSpemifene D4、Bazedoxifene、呱多昔芬鹽酸鹽、拉索昔芬酒石酸酯、4-羥基他莫昔芬、克羅米芬枸櫞酸鹽、美曲諾、伊多西芬、4,4-亞氨基二苯酚、H3B-6545、H3B-6545鹽酸鹽、絞股藍皂苷SVII、DPN、Prinaberel、Way-200070、Nitromifene、ERB-196、Elacestrant、LSZ-102、(E/Z)-4-羥基他莫昔芬、二鹽酸Elacestrant、GDC-0927、AZD -9833、Endoxifen、LY117018、雌二醇、WAY-204688、他莫昔芬、檸檬酸他莫昔芬或氟維司瓊；該PI3K抑制劑選自伊達拉西布(CAL-101)、科潘立西(BAY80-6946）、布帕利西、AZD6482、GSK1059615、GSK2126458，GSK2636771，PQR309，PF-04691502，AMG319、3-甲基腺嘌呤、ly294002、Wortmannin、槲皮素、α-亞麻酸、Zandelisib、匹克替尼、IPI549、Dactolisib、Fimepinostat、SAR405、Duvelisib、PI-103、GDC-0077、阿培利司；較佳地，抗癌劑選自以下的一種或多種：達拉非尼、曲美替尼、氟維司瓊、阿培利司。
如請求項1至請求項9、請求項14中任一項所述的藥物組合物，其中該MDM2抑制劑是化合物2及其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，其具有下式結構：
，該抗癌劑選自以下的一種或多種：一BRAF抑制劑、一MEK抑制劑、一雌激素受體抑制劑、一PI3k抑制劑；其中，該BRAF抑制劑選自索拉非尼、PLX-4720、瑞戈非尼(BAY 73-4506)、GDC-0879、RAF265、SB590885、AZ 628、ML 7866二鹽酸鹽、PF-04880594、TAK-632、CEP-32496、RO5126766或達拉非尼；該MEK抑制劑選自匹馬替尼、PD184352、PD0325901、塞魯米替尼、PD98059、U0126-EtOH、TAK-733、瑞法替尼、GDC-0623、RO4987655、RO5126766（CH5126766）、SL-327、BI-847325或曲美替尼；該雌激素受體抑制劑選自托瑞米芬、檸檬酸托瑞米芬、雌三醇、丙基吡唑三醇、AZD9496、LY88074、GDC-0924外消旋體、CMP8、OSpemifene D4、Bazedoxifene、呱多昔芬鹽酸鹽、拉索昔芬酒石酸酯、4-羥基他莫昔芬、克羅米芬枸櫞酸鹽、美曲諾、伊多西芬、4,4-亞氨基二苯酚、H3B-6545、H3B-6545鹽酸鹽、絞股藍皂苷SVII、DPN、Prinaberel、Way-200070、Nitromifene、ERB-196、Elacestrant、LSZ-102、(E/Z)-4-羥基他莫昔芬、二鹽酸Elacestrant、GDC-0927、AZD -9833、Endoxifen、LY117018、雌二醇、WAY-204688、他莫昔芬、檸檬酸他莫昔芬或氟維司瓊；該PI3K抑制劑選自伊達拉西布(CAL-101)、科潘立西(BAY80-6946）、布帕利西、AZD6482、GSK1059615、GSK2126458，GSK2636771，PQR309，PF-04691502，AMG319、3-甲基腺嘌呤、ly294002、Wortmannin、槲皮素、α-亞麻酸、Zandelisib、匹克替尼、IPI549、Dactolisib、Fimepinostat、SAR405、Duvelisib、PI-103、GDC-0077、阿培利司；較佳地，該抗癌劑選自以下的一種或多種：達拉非尼、曲美替尼、氟維司瓊、阿培利司；更佳地，抗癌劑為：達拉非尼與曲美替尼的組合，或者氟維司瓊與阿培利司的組合；還更佳地，化合物2與抗癌劑達拉非尼、曲美替尼二者的組合或任意之一的重量比為100:1 至 1:100, 包括100:1，95:1，90:1，85:1，80:1，75:1，70:1，65:1，60:1，55:1，50:1，45:1，40:1，35:1，30:1，25:1，20:1，15:1，10:1，9:1，8:1，7:1，6:1，5:1，4:1，3:1，2:1，0.8:1，1:1，1.6:1，8:15，1:2，1:3，1:4，1:5，1:6，1:7，1:8，1:9，1:10，1:15，1:20，1:25，1:30，1:35，1:40，1:45，1:50，1:55，1:60，1:65，1:70，1:75，1:80，1:85，1:90，1:95或1:100；或者化合物2與抗癌劑氟維司瓊、阿培利司的二者組合或任意之一的重量比為100:1 至 1:100, 包括100:1，95:1，90:1，85:1，80:1，75:1，70:1，65:1，60:1，55:1，50:1，45:1，40:1，35:1，30:1，25:1，20:1，15:1，10:1，9:1，8:1，7:1，6:1，5:1，4:1，3:1，2:1，0.8:1，1:1，1.6:1，8:15，1:2，1:3，1:4，1:5，1:6，1:7，1:8，1:9，1:10，1:15，1:20，1:25，1:30，1:35，1:40，1:45，1:50，1:55，1:60，1:65，1:70，1:75，1:80，1:85，1:90，1:95或1:100。
如請求項1至請求項15中任一項所述的藥物組合物，其中該藥物組合物或該MDM2抑制劑或該抗癌劑呈片劑、膠囊劑、顆粒劑、糖漿劑、粉劑、錠劑、藥囊、扁囊劑、酏劑、混懸劑、乳劑、溶液、糖漿劑、氣霧劑、軟膏劑、乳膏劑和注射劑的形式。
如請求項1至請求項13中任一項所述的藥物組合物，其中該MDM2抑制劑與該抗癌劑的重量比是100:1 至 1:100，包括100:1，95:1，90:1，85:1，80:1，75:1，70:1，65:1，60:1，55:1，50:1，45:1，40:1，35:1，30:1，25:1，20:1，15:1，10:1，9:1，8:1，7:1，6:1，5:1，4:1，3:1，2:1，0.8:1，1:1，1.6:1，8:15，1:2，1:3，1:4，1:5，1:6，1:7，1:8，1:9，1:10，1:15，1:20，1:25，1:30，1:35，1:40，1:45，1:50，1:55，1:60，1:65，1:70，1:75，1:80，1:85，1:90，1:95或1:100。
一種藥物組合物在製備用於預防和/或治療一疾病的藥物中的用途，其中該藥物組合物包括如請求項1至請求項15中任一項所述的MDM2抑制劑和抗癌劑，較佳地，該疾病是癌症。
如請求項18所述的用途，其中該癌症選自腎上腺皮質癌，晚期癌症，肛門癌，再生障礙性貧血，膽管癌，膀胱癌，骨癌，骨轉移，成人腦/中樞神經系統腫瘤，兒童腦/中樞神經系統腫瘤，乳腺癌癌症，男性乳腺癌，兒童癌症，原位癌未知癌症，Castleman病，子宮頸癌，結腸/直腸癌，子宮內膜癌，食道癌，Ewing腫瘤家族，眼癌，膽囊癌，胃腸道類癌，胃腸道間質瘤腫瘤（GIST），妊娠滋養細胞疾病，頭頸癌，何杰金氏症，卡波西肉瘤，腎癌，喉癌和下嚥癌，成人白血病急性淋巴性白血病（ALL），急性骨髓性癌（AML），慢性淋巴細胞白血病（CLL），慢性粒細胞白血病（CML），慢性粒單核細胞（CMML），兒童白血病，肝癌，非小細胞肺癌，小細胞肺癌，肺癌腫瘤，皮膚淋巴瘤，惡性間皮瘤，多發性骨髓瘤，骨髓增生不良症候群（MDS），鼻腔和鼻竇癌，鼻咽癌，神經母細胞瘤，非何杰金氏淋巴瘤，兒童非何杰金氏淋巴瘤，口腔和口咽癌，骨肉瘤，卵巢癌癌症，胰腺癌，陰莖癌，垂體瘤，前列腺癌，視網膜母細胞瘤，橫紋肌肉瘤，唾液腺癌，成人軟組織癌，皮膚癌，諸如基底和鱗狀細胞癌、黑色素瘤，小腸癌，胃癌，睾丸癌症，胸腺癌，甲狀腺癌，子宮肉瘤，陰道癌，外陰癌，瓦爾登斯特倫巨球蛋白血症和威爾姆斯腫瘤。
一種預防和/或治療一疾病的方法，對有需要的個體施用如請求項1至請求項17中任一項所述的藥物組合物，包括施用預防和/或治療有效量的該MDM2抑制劑和抗癌劑，較佳地，該疾病是癌症。
如請求項20所述的方法，其中該癌症選自腎上腺皮質癌，晚期癌症，肛門癌，再生障礙性貧血，膽管癌，膀胱癌，骨癌，骨轉移，成人腦/中樞神經系統腫瘤，兒童腦/中樞神經系統腫瘤，乳腺癌癌症，男性乳腺癌，兒童癌症，原位癌未知癌症，Castleman病，子宮頸癌，結腸/直腸癌，子宮內膜癌，食道癌，Ewing腫瘤家族，眼癌，膽囊癌，胃腸道類癌，胃腸道間質瘤腫瘤（GIST），妊娠滋養細胞疾病，頭頸癌，何杰金氏症，卡波西肉瘤，腎癌，喉癌和下嚥癌，成人白血病急性淋巴性白血病（ALL），急性骨髓性癌（AML），慢性淋巴細胞白血病（CLL），慢性粒細胞白血病（CML），慢性粒單核細胞（CMML），兒童白血病，肝癌，非小細胞肺癌，小細胞肺癌，肺癌腫瘤，皮膚淋巴瘤，惡性間皮瘤，多發性骨髓瘤，骨髓增生不良症候群（MDS），鼻腔和鼻竇癌，鼻咽癌，神經母細胞瘤，非何杰金氏淋巴瘤，兒童非何杰金氏淋巴瘤，口腔和口咽癌，骨肉瘤，卵巢癌癌症，胰腺癌，陰莖癌，垂體瘤，前列腺癌，視網膜母細胞瘤，橫紋肌肉瘤，唾液腺癌，成人軟組織癌，皮膚癌，諸如基底和鱗狀細胞癌、黑色素瘤，小腸癌，胃癌，睾丸癌症，胸腺癌，甲狀腺癌，子宮肉瘤，陰道癌，外陰癌，瓦爾登斯特倫巨球蛋白血症和威爾姆斯腫瘤。
如請求項20至請求項21中任一項所述的方法，其中該癌症選自急性骨髓性白血病（AML）、急性淋巴性白血病（ALL）、骨髓增生不良症候群（MDS）、黑色素瘤和乳腺癌。
如請求項20至請求項22中任一項所述的方法，其中將該MDM2抑制劑或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物以約0.0025-5000mg/日的量給藥，包括約0.005、0.05、0.5、5、10、20、30、40、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500或5000 mg/日的量給藥。
如請求項20至請求項23中任一項所述的預防和/或治療疾病的方法，其中將該MDM2抑制劑或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物以每單位劑量約1 ng/kg至約200 mg/kg、約1 μg/kg至約100 mg/kg或者約1 mg/kg至約50 mg/kg的量給藥，例如以每單位劑量約1 μg/kg、約10 μg/kg、約25 μg/kg、約50 μg/kg、約75 μg/kg、約100 μg/kg、約125 μg/kg、約150 μg/kg、約175 μg/kg、約200 μg kg、約225 μg/kg、約250 μg kg、約275 μg kg、約300 μg/kg、約325 μg kg、約350 μg/kg、約375 μg/kg、約400 μg/kg、約425 μg/kg、約450 μg/kg、約475 μg/kg、約500 μg/kg、約525 μg kg、約550 μg/kg、約575 μg kg、約600 μg/kg、約625 μg/kg、約650 μg/kg、約675 μg/kg、約700 μg/kg、約725 μg/kg、約750 μg/kg、約775 μg/kg、約800 μg/kg、約825 μg/kg、約850 μg/kg、約875 μg/kg、約900 μg/kg、約925 μg/kg、約950 μg/kg、約975 μg/kg、約1 mg/kg、約5 mg/kg、約10 mg/kg、約15 mg/kg、約20 mg/kg、約25 mg/kg、約30 mg/kg、約35 mg/kg、約40 mg/kg、約45 mg/kg、約50 mg/kg、約60 mg/kg、約70 mg/kg、約80 mg/kg、約90 mg/kg、約100 mg/kg、約125 mg/kg、約150 mg/kg、約175 mg/kg、約200 mg/kg的量給藥。
如請求項20至請求項24中任一項所述的預防和/或治療疾病的方法，其中將一種或多種該抗癌劑或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物以約0.0025-5000mg/日的量給藥，包括約0.005、0.05、0.5、5、10、20、30、40、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500或5000 mg/日的量給藥。
如請求項20至請求項25中任一項所述的預防和/或治療疾病的方法，其中將一種或多種該抗癌劑或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物以每單位劑量約1 ng/kg至約200 mg/kg、約1 μg/kg至約100 mg/kg或者約1 mg/kg至約50 mg/kg的量給藥，例如以每單位劑量約1 μg/kg、約10 μg/kg、約25 μg/kg、約50 μg/kg、約75 μg/kg、約100 μg/kg、約125 μg/kg、約150 μg/kg、約175 μg/kg、約200 μg kg、約225 μg/kg、約250 μg kg、約275 μg kg、約300 μg/kg、約325 μg kg、約350 μg/kg、約375 μg/kg、約400 μg/kg、約425 μg/kg、約450 μg/kg、約475 μg/kg、約500 μg/kg、約525 μg kg、約550 μg/kg、約575 μg kg、約600 μg/kg、約625 μg/kg、約650 μg/kg、約675 μg/kg、約700 μg/kg、約725 μg/kg、約750 μg/kg、約775 μg/kg、約800 μg/kg、約825 μg/kg、約850 μg/kg、約875 μg/kg、約900 μg/kg、約925 μg/kg、約950 μg/kg、約975 μg/kg、約1 mg/kg、約5 mg/kg、約10 mg/kg、約15 mg/kg、約20 mg/kg、約25 mg/kg、約30 mg/kg、約35 mg/kg、約40 mg/kg、約45 mg/kg、約50 mg/kg、約60 mg/kg、約70 mg/kg、約80 mg/kg、約90 mg/kg、約100 mg/kg、約125 mg/kg、約150 mg/kg、約175 mg/kg、約200 mg/kg的量給藥。
如請求項20至請求項26中任一項所述的預防和/或治療疾病的方法，其中將該MDM2抑制劑、一種或多種該抗癌劑同時、並行或組合給藥。
如請求項20至請求項27中任一項所述的預防和/或治療疾病的方法，其中將該MDM2抑制劑、一種或多種該抗癌劑連續給藥至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少11天、至少12天、至少13天、至少14天、至少15天、至少16天、至少17天、至少18天、至少19天、至少20天、至少21天、至少22天、至少23天、至少24天、至少25天、至少30天、至少35天、至少40天、至少45天或至少50天。
如請求項20至請求項28中任一項所述的預防和/或治療疾病的方法，其中將該MDM2抑制劑、一種或多種該抗癌劑連續給藥一個或複數療程，包括1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個療程，其中每個療程持續至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少11天、至少12天、至少13天、至少14天、至少15天、至少16天、至少17天、至少18天、至少19天、至少20天、至少21天、至少22天、至少23天、至少24天、至少25天、至少30天、至少35天、至少40天、至少45天或至少50天；並且每兩個療程之間間隔0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10天、兩週、三週或四週。
如請求項20至請求項29中任一項所述的預防和/或治療疾病的方法，其中將該MDM2抑制劑、一種或多種該抗癌劑以相同(如口服)或不同途徑(如分別以口服及腸胃外(如注射))給藥。
一種藥盒，其包含： (a) 位於第一容器中的一第一組分，該第一組分包含如請求項1至請求項15中任一項所定義的MDM2抑制劑和任選的藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑； (b) 位於第二容器中的一第二組分，該第二組分包含如請求項1至請求項15中任一項所定義的一種或多種抗癌劑和任選的藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
一種化合物2單藥及聯合阿扎胞苷或阿糖胞苷在製備用於治療成人復發或難治性急性髓性白血病和復發或難治性高危/極高危骨髓增生不良症候群的藥物中的用途。
一種治療成人復發或難治性急性髓性白血病和復發或難治性高危/極高危骨髓增生不良症候群的方法，包括施用化合物2單藥及聯合阿扎胞苷或阿糖胞苷。
如請求項33所述的方法，其中，給藥方法為：化合物2按照標準3+3方案進行劑量遞增，起始劑量為150mg，依次遞增至200mg、250mg、300mg，每日口服一次，每週期從第1天開始使用，連續服用7天後休息 21天，每 28 天為一個給藥週期；當第一階段化合物2單藥劑量遞增結束後，可進入第二階段，即化合物2聯合用藥劑量遞增；聯合用藥方案中化合物2的劑量從100mg開始，依次遞增至150mg、200mg；阿扎胞苷為固定劑量，75mg/m² 皮下注射，每日一次，每週期從第1天開始使用，連續7天後休息21天，每28天為一個給藥週期；阿糖胞苷為固定劑量，1g/m² 靜脈注射，靜脈輸注時間不少於4小時，每日一次，每週期從第3天開始使用，連續5天後休息21天，每28天為一個給藥週期。
如請求項33或請求項34所述的方法，其中，阿扎胞苷或阿糖胞苷均於化合物2口服4小時後給藥；兩藥聯合治療後進入休息期。
一種化合物2在製備用於治療骨髓增生不良症候群（MDS）的藥物中的用途：
。
一種預防和/或治療一疾病的方法，對有需要的個體施用一化合物2，包括施用預防和/或治療有效量的該化合物2，其中該疾病是骨髓增生不良症候群（MDS）：
。
一種化合物2與達拉非尼、曲美替尼的組合在製備用於治療黑色素瘤的藥物中的用途；較佳地，化合物2與抗癌劑達拉非尼、曲美替尼二者的組合或任意之一的重量比為100:1 至 1:100, 包括100:1，95:1，90:1，85:1，80:1，75:1，70:1，65:1，60:1，55:1，50:1，45:1，40:1，35:1，30:1，25:1，20:1，15:1，10:1，9:1，8:1，7:1，6:1，5:1，4:1，3:1，2:1，0.8:1，1:1，1.6:1，8:15，1:2，1:3，1:4，1:5，1:6，1:7，1:8，1:9，1:10，1:15，1:20，1:25，1:30，1:35，1:40，1:45，1:50，1:55，1:60，1:65，1:70，1:75，1:80，1:85，1:90，1:95或1:100。
一種治療黑色素瘤的方法，包括施用化合物2與達拉非尼、曲美替尼的組合；較佳地，化合物2與抗癌劑達拉非尼、曲美替尼二者的組合或任意之一的重量比為100:1 至 1:100，包括100:1，95:1，90:1，85:1，80:1，75:1，70:1，65:1，60:1，55:1，50:1，45:1，40:1，35:1，30:1，25:1，20:1，15:1，10:1，9:1，8:1，7:1，6:1，5:1，4:1，3:1，2:1，0.8:1，1:1，1.6:1，8:15，1:2，1:3，1:4，1:5，1:6，1:7，1:8，1:9，1:10，1:15，1:20，1:25，1:30，1:35，1:40，1:45，1:50，1:55，1:60，1:65，1:70，1:75，1:80，1:85，1:90，1:95或1:100。
一種化合物2與氟維司瓊、阿培利司的組合在製備用於治療乳腺癌的藥物中的用途；較佳地，化合物2與抗癌劑氟維司瓊、阿培利司的二者組合或任意之一的重量比為100:1 至 1:100，包括100:1，95:1，90:1，85:1，80:1，75:1，70:1，65:1，60:1，55:1，50:1，45:1，40:1，35:1，30:1，25:1，20:1，15:1，10:1，9:1，8:1，7:1，6:1，5:1，4:1，3:1，2:1，0.8:1，1:1，1.6:1，8:15，1:2，1:3，1:4，1:5，1:6，1:7，1:8，1:9，1:10，1:15，1:20，1:25，1:30，1:35，1:40，1:45，1:50，1:55，1:60，1:65，1:70，1:75，1:80，1:85，1:90，1:95或1:100。
一種治療乳腺癌的方法，包括施用化合物2與氟維司瓊、阿培利司的組合；較佳地，化合物2與抗癌劑氟維司瓊、阿培利司的二者組合或任意之一的重量比為100:1 至 1:100，包括100:1，95:1，90:1，85:1，80:1，75:1，70:1，65:1，60:1，55:1，50:1，45:1，40:1，35:1，30:1，25:1，20:1，15:1，10:1，9:1，8:1，7:1，6:1，5:1，4:1，3:1，2:1，0.8:1，1:1，1.6:1，8:15，1:2，1:3，1:4，1:5，1:6，1:7，1:8，1:9，1:10，1:15，1:20，1:25，1:30，1:35，1:40，1:45，1:50，1:55，1:60，1:65，1:70，1:75，1:80，1:85，1:90，1:95或1:100。