CN115463152A - 多功能p53复活药物及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了多功能p53复活药物以及该药物的用途。本发明的p53复活药物是PANDA试剂。具体而言本发明公开了包含四乙酰基巯基葡萄糖的多功能p53复活药物、包含MDM2抑制剂的多功能p53复活药物和包含双硫仑(DSF)的多功能p53复活药物，以及所述多功能p53复活剂用于制备治疗p53疾病的药物的用途。

Description

多功能p53复活药物及其用途
技术领域
本发明涉及多功能p53复活药物，所述p53复活药物是PANDA试剂。本发明还涉及该药物的用途。 具体而言本发明涉及p53复活药物跟其他药物的偶联剂，以及所述偶联剂的用途。
背景技术
p53蛋白控制各种细胞命运，在抑制肿瘤发生和发展中发挥着重要的作用。目前在人体恶性肿瘤 中，有50％以上的肿瘤会出现p53基因的突变。先前申请的专利WO2019134650、WO2019134311和 WO2019134070中报道了p53复活药物(PANDA试剂)可以拯救突变型p53(mp53)蛋白，进而治疗p53 突变蛋白相关的疾病，比如癌症。
不过，PANDA试剂仍存在诸多缺陷。以三氧化二砷(Arsenic Trioxide，ATO)为例，ATO在体内 代谢排出较快、肿瘤靶向选择性较低、具有一定毒副作用；ATO复活的突变型p53又可被p53下游转 录激活的蛋白MDM2降解，进而反馈削弱复活效果等。因此单独使用PANDA试剂治疗肿瘤等疾病的效 果有进一步提高的空间。
发明内容
针对现有技术中使用p53复活药物(PANDA试剂)的缺陷，本发明提供多功能p53复活药物及其 用途，希望通过改造p53复活药物，主要是其发挥作用的核心元素砷(As)、铋(Bi)或锑(Sb)，以 获得毒性更低、抗肿瘤效果更好的多功能p53复活药物，满足药物应用的需求。
根据本发明的一个方面，本发明提供了一种多功能p53复活药物，所述药物具备如式(I)所示的 结构：
Figure BDA0003111978180000011
其中：(1)W是砷(As)、铋(Bi)或锑(Sb)；
(2)X、Y或Z是碳原子(C)以外的任意原子；
(3)X、Y或Z是同一原子，或不同原子；
(4)A、B或D中至少一个是功能基团，或单个原子，或空白；
(5)A、B或D这三个原子或基团成环，或任意两个成环，或者不成环。
根据本发明的某些实施方式，所述X、Y或Z可以任意两个是相同原子；或者三个都是相同原子。
根据本发明的某些实施方式，所述化合物的集合形状像三角锥。
根据本发明的某些实施方式，所述W是砷(As)。
根据本发明的某些实施方式，所述A、B或D中至少一个为具有生物学功能的基团。
根据本发明的某些实施方式，所述具有生物学功能的基团选自MDM2抑制剂、AcGlu或DSF。
根据本发明的某些实施方式，所述具有生物学功能的基团选自可以抑制MDM2的AMG232，可以主 动快速进入肿瘤细胞的AcGlu，或具抗肿瘤活性的DSF。
根据本发明的某些实施方式，所述A、B或D中其他两个成环。
根据本发明的某些实施方式，所述X、Y、Z是S、O、I或As。
根据本发明的某些实施方式，所述多功能p53复活药物是AcGlu-砷偶联剂、MDM2抑制剂-砷偶联 剂、DSF-砷偶联剂。
根据本发明的某些实施方式，所述MDM2抑制剂选自CGM097，AMG-232，HDM201，ALRN-6924，RG7112， RG7388，APG-115，BI-907828，DS-3032b或现有技术中已知的抑制剂。
根据本发明的一个方面，本发明提供了所述多功能p53复活药物用于制备治疗p53疾病药物的用 途。
根据本发明的某些实施方式，所述p53疾病包括癌症，神经疾病、发育疾病、免疫系统疾病和衰 老。
根据本发明的某些实施方式，所述肿瘤包括卵巢癌、肺癌、头颈癌、胰腺癌、结肠癌、脑癌、膀 胱癌、胃癌、肾癌、肝癌、乳腺癌、黑色素瘤、前列腺癌、急性髓细胞性白血病、子宫癌、恶性上皮 肿瘤、肉瘤、骨髓瘤、白血病、淋巴瘤、母细胞瘤或混合型癌症。
定义
p53复活药物
本发明所述p53复活药物是指能够是拯救突变型p53(mp53)蛋白、恢复p53蛋白活性的药物。根 据本发明某些实施方式，所述p53复活药物是专利申请WO2019134650、WO2019134311和WO2019134070 中报道的PANDA试剂。所述专利申请WO2019134650、WO2019134311和WO2019134070通过引用，全文 纳入本申请。
多功能p53复活药物
本发明所述多功能p53复活药物是能够克服现有技术中p53复活药物至少一个缺陷，具备至少两 种以上功能的药物，其中所述至少一种功能是拯救突变型p53(mp53)蛋白并且恢复p53蛋白活性。根 据本发明某些实施方式，所述p53蛋白活性是抑癌功能。
根据本发明某些实施方式，所述多功能p53复活药物是p53复活药物跟其他药物的偶联剂。根据 本发明某些实施方式，所述其他药物是治疗肿瘤的药物。根据本发明某些实施方式，所述多功能p53 复活药物四乙酰基巯基葡萄糖与p53复活药物的偶联剂，所述其他药物是四乙酰基巯基葡萄糖。根据 本发明某些实施方式，所述多功能p53复活药物MDM2抑制剂与p53复活药物的偶联剂，所述其他药 物是MDM2抑制剂。根据本发明某些实施方式，所述MDM2抑制剂是AMG232。根据本发明某些实施方式， 所述多功能p53复活药物双硫仑与p53复活药物的偶联剂，所述其他药物是双硫仑。
根据本发明的一个方面，本发明提供了一种多功能p53复活药物，所述药物具备如式(I)所示的 结构：
Figure BDA0003111978180000031
其中：(1)W是砷(As)、铋(Bi)或锑(Sb)；
(2)X、Y或Z是碳原子(C)以外的任意原子；
(3)X、Y或Z是同一原子，或不同原子；
(4)A、B或D中至少一个是功能基团，或单个原子，或空白；
(5)A、B或D这三个原子或基团成环，或任意两个成环，或者不成环。
根据本发明的某些实施方式，所述X、Y或Z可以任意两个是相同原子；或者三个都是相同原子。
根据本发明的某些实施方式，所述化合物的集合形状像三角锥。
根据本发明的某些实施方式，所述W是砷(As)。
根据本发明的某些实施方式，所述A、B或D中至少一个为具有生物学功能的基团。
根据本发明的某些实施方式，所述具有生物学功能的基团选自MDM2抑制剂、AcGlu或DSF。
根据本发明的某些实施方式，所述具有生物学功能的基团选自可以抑制MDM2的AMG232，可以主 动快速进入肿瘤细胞的AcGlu，或具抗肿瘤活性的DSF。
根据本发明的某些实施方式，所述A、B或D中其他两个成环。
根据本发明的某些实施方式，所述X、Y、Z是S、O、I或As。
根据本发明的某些实施方式，所述多功能p53复活药物是AcGlu-砷偶联剂、MDM2抑制剂-砷偶联 剂、DSF-砷偶联剂。
根据本发明的某些实施方式，所述MDM2抑制剂选自CGM097，AMG-232，HDM201，ALRN-6924，RG7112， RG7388，APG-115，BI-907828，DS-3032b或现有技术中已知的抑制剂。
包含四乙酰基巯基葡萄糖的多功能p53复活药物
根据本发明某些实施方式，所述包含四乙酰基巯基葡萄糖的多功能p53复活药物是四乙酰基巯基 葡萄糖-p53复活药物偶联剂。根据本发明某些实施方式，所述多功能p53复活药物是四乙酰基巯基葡 萄糖-含砷、铋或锑的复活药物偶联剂。
所述四乙酰基巯基葡萄糖-砷复活药物偶联剂是将As和四乙酰基巯基葡萄糖偶联，四乙酰基巯基 葡萄糖在体内能够与细胞膜表面巯基(-SH)发生巯基交换反应，还可以水解变成葡萄糖进而与细胞 膜中的葡萄糖受体结合，因此，四乙酰基巯基葡萄糖可以快速、主动进入肿瘤细胞。预期得到的四乙 酰基巯基葡萄糖-砷复活药物偶联剂(AcGluAs)，可主动识别肿瘤细胞并迅速被摄取，从而降低As使 用浓度以达到减小As毒副作用、增强As的肿瘤靶向性。
三氧化二砷ATO在细胞膜表面缺乏特异性受体，透膜慢；此外ATO在体内代谢排出快、且具有毒 副作用，如果能让砷主动识别肿瘤组织并迅速被摄取，那么给药剂量可以降下来，毒副作用有可能降 低。早在1995年，研究者就注意到一种促进化合物被细胞迅速地吸收的改造化合物手段，即为化合 物偶联上可与细胞表面巯基(-SH)发生巯基交换反应的配体(A Kichler et al.Efficient gene delivery with neutral complexes oflipospermine and thiol-reactive phospholipids. Biochemical and BiophysicalResearch Communications,1995,209(2):444-450)。利用细胞表 面普遍存在-SH、并且肿瘤细胞表面巯基的量往往高于正常细胞这一特点，人们已合成了许多生物分 子，小分子的如荧光染料，大分子的如多肽，药物载体如纳米粒子、多聚物等，它们都具有可与细胞 表面的-SH反应的部分，从而被细胞迅速吸收内化。砷(As)是典型的软金属，前人已报道一个含有 软金属金(Au)和四乙酰基巯基葡萄糖基团的化合物，该化合物可与细胞表面-SH反应，能被细胞迅 速吸收，这为我们设计合成能被肿瘤细胞靶向、快速吸收的含As化合物提供了支撑。此外，众所周 知肿瘤细胞对葡萄糖需求旺盛，肿瘤细胞膜往往含有较多的葡萄糖受体，因此将As偶联至葡萄糖或 者葡萄糖结构类似基团葡萄糖前体(即四乙酰基巯基葡萄糖)后，也可以使As通过肿瘤细胞膜上的 葡萄糖受体这一途径主动识别肿瘤细胞并快速进入肿瘤细胞。
根据本发明的某些实施方式，把As和四乙酰基巯基葡萄糖偶联，合成新化合物AcGluAs。在体内， AcGluAs能选择性地靶向肿瘤细胞并被迅速吸收，进入细胞后，配体和As之间的连接子(linker)会 断开，并释放出有活性的As离子，也可结合并复活突变型p53功能。
包含MDM2抑制剂的多功能p53复活药物
根据本发明某些实施方式，所述包含MDM2抑制剂的多功能p53复活药物是MDM2抑制剂-p53复活 药物偶联剂。根据本发明某些实施方式，所述多功能p53复活药物是MDM2抑制剂-含砷、铋或锑复活 药物偶联剂。
根据本发明某些实施方式，所述MDM2抑制剂是CGM097，AMG-232，HDM201，ALRN-6924，RG7112， RG7388，APG-115，BI-907828或DS-3032b等一系列众所周知的可以阻断MDM2和p53结合的化合物。 根据本发明某些实施方式，所述MDM2抑制剂是第三代MDM2抑制剂AMG232。根据本发明某些实施方式， 所述多功能p53复活药物是AMG232-p53复活药物偶联剂。根据本发明某些实施方式，所述多功能p53 复活药物是AMG232-含砷、铋或锑复活药物偶联剂。
将As与第三代MDM2抑制剂(即AMG232)偶联。ATO复活突变型p53后，突变型p53会转录上调 MDM2，上调的MDM2进而抑制p53(一个负反馈过程)，最终削弱ATO对突变型p53的复活效果，而MDM2 抑制剂可以解除MDM2对p53的抑制。因此，预期获得的AMG232和As的偶联化合物将既能保留As复 活p53的功能、又能利用AMG232减少被As复活的p53蛋白的降解。此外癌组织具有异质性，往往部 分细胞含有野生型p53，部分细胞含有突变型p53。因此，偶联ATO和AMG232后，预期该偶联剂中的 AS靶向杀死突变型p53细胞，AMG232则靶向杀死野生型p53细胞，那么可能可以克服临床上的耐药 问题。
根据本发明的某些实施方式，把As和AMG232偶联，合成新化合物AMG232-As。在体内，AMG232 和As之间的连接子(linker)会断开，并释放出AMG232和As离子，前者能上调野生型p53，后者则 可以结合并复活突变型p53。
包含双硫仑(DSF)的多功能p53复活药物
根据本发明某些实施方式，所述双硫仑(DSF)的多功能p53复活药物是双硫仑-p53复活药物偶 联剂。根据本发明某些实施方式，所述多功能p53复活药物是双硫仑-含砷、铋或锑复活药物偶联剂。
将As和双硫仑(DSF)偶联。DSF用于临床治疗酒精依赖已有超过60年的历史，近来Nature报 道DSF具有可以抑制蛋白酶体活性，进而具有抗肿瘤效果。例如2017年一篇《Nature》(Zdenek Skrott et al.Alcohol-abuse drug disulfiram targets cancer viap97 segregase adaptor NPL4,NATURE, 2017Dec 14；552(7684):194-199)研究阐释DSF靶向抑制肿瘤的机制——通过NPL4-p97途径实现对 肿瘤细胞中非正确折叠蛋白的清除，从而靶向抑制乳腺癌模型小鼠的肿瘤生长，且DSF有治疗BTZ耐 药骨髓瘤的潜力。将DSF与砷偶联，会实现1+1>2的抗肿瘤效果和更广泛的应用场景。
根据本发明某些实施方式，把As和DSF偶联，合成新化合物DSF-As。在体内，DSF和As之间的 连接子(linker)会断开，并释放出DSF和As离子，前者能抑制蛋白酶体活性并抗肿瘤，后者则可 以结合并复活突变型p53，进而达到协同抗肿瘤效果。
治病方法和制药用途
根据本发明的一个方面，本发明公开了多功能p53复活药物用于治疗p53疾病的方法。根据本发 明的某些实施方式，本发明公开了包含四乙酰基巯基葡萄糖的多功能p53复活药物用于治疗p53疾病 的方法。根据本发明的某些实施方式，本发明公开了包含MDM2抑制剂的多功能p53复活药物用于治 疗p53疾病的方法。根据本发明的某些实施方式，本发明公开了包含双硫仑(DSF)的多功能p53复 活药物用于治疗p53疾病的方法。
p53疾病示例包括癌症，例如恶性上皮肿瘤(例如腺癌和鳞状细胞癌)、肉瘤、骨髓瘤、白血病、 淋巴瘤、母细胞瘤和混合型癌症(例如腺鳞癌、混合的中胚叶肿瘤、癌肉瘤和畸胎瘤)；肿瘤(可来源 于结缔组织、内皮和间皮、血细胞和淋巴细胞、肌肉、上皮组织、神经、胺前体摄取和脱羧系统、其 他神经嵴细胞、乳腺、肾原基和/或性腺)；神经疾病、发育疾病、免疫系统疾病和衰老等等。
根据本发明的某些实施方式，所述p53疾疾病包括肿瘤。根据本发明的某些实施方式，所述肿瘤 包括卵巢癌、肺癌、头颈癌、胰腺癌、结肠癌、脑癌、膀胱癌、胃癌、肾癌、肝癌、乳腺癌、黑色素 瘤、前列腺癌、急性髓细胞性白血病、子宫癌等等任何含有p53突变的肿瘤。
根据本发明的一个方面，本发明公开了多功能p53复活药物用于制备治疗p53疾病的药物的用途。 根据本发明的某些实施方式，本发明公开了包含四乙酰基巯基葡萄糖的多功能p53复活药物用于制备 治疗p53疾病的药物的用途。根据本发明的某些实施方式，本发明公开了包含MDM2抑制剂的多功能 p53复活药物用于制备治疗p53疾病的药物的用途。根据本发明的某些实施方式，本发明公开了包含 双硫仑(DSF)的多功能p53复活药物用于制备治疗p53疾病的药物的用途。
p53疾病示例包括癌症，例如恶性上皮肿瘤(例如腺癌和鳞状细胞癌)、肉瘤、骨髓瘤、白血病、 淋巴瘤、母细胞瘤和混合型癌症(例如腺鳞癌、混合的中胚叶肿瘤、癌肉瘤和畸胎瘤)；肿瘤(可来源 于结缔组织、内皮和间皮、血细胞和淋巴细胞、肌肉、上皮组织、神经、胺前体摄取和脱羧系统、其 他神经嵴细胞、乳腺、肾原基和/或性腺)；神经疾病、发育疾病、免疫系统疾病和衰老等等。
根据本发明的某些实施方式，所述p53疾疾病包括肿瘤。根据本发明的某些实施方式，所述肿瘤 包括卵巢癌、肺癌、头颈癌、胰腺癌、结肠癌、脑癌、膀胱癌、胃癌、肾癌、肝癌、乳腺癌、黑色素 瘤、前列腺癌、急性髓细胞性白血病、子宫癌等等任何含有p53突变的肿瘤。
根据本发明的一个方面，本发明公开了用于治疗p53疾病的多功能p53复活药物。根据本发明的 某些实施方式，本发明公开了用于治疗p53疾病的包含四乙酰基巯基葡萄糖的多功能p53复活药物。 根据本发明的某些实施方式，本发明公开了用于治疗p53疾病的包含MDM2抑制剂的多功能p53复活 药物。根据本发明的某些实施方式，本发明公开了用于治疗p53疾病的包含双硫仑(DSF)的多功能 p53复活药物。
p53疾病示例包括癌症，例如恶性上皮肿瘤(例如腺癌和鳞状细胞癌)、肉瘤、骨髓瘤、白血病、 淋巴瘤、母细胞瘤和混合型癌症(例如腺鳞癌、混合的中胚叶肿瘤、癌肉瘤和畸胎瘤)；肿瘤(可来源 于结缔组织、内皮和间皮、血细胞和淋巴细胞、肌肉、上皮组织、神经、胺前体摄取和脱羧系统、其 他神经嵴细胞、乳腺、肾原基和/或性腺)；神经疾病、发育疾病、免疫系统疾病和衰老等等。
根据本发明的某些实施方式，所述p53疾疾病包括肿瘤。根据本发明的某些实施方式，所述肿瘤 包括卵巢癌、肺癌、头颈癌、胰腺癌、结肠癌、脑癌、膀胱癌、胃癌、肾癌、肝癌、乳腺癌、黑色素 瘤、前列腺癌、急性髓细胞性白血病、子宫癌等等任何含有p53突变的肿瘤。
在本申请中当“约”用于修饰数值时，是指所述数值可以上下浮动±10％、±9％、±8％、±7％、 ±6％、±5％、±4％、±3％、±2％或±1％的范围内。
除非在本申请中另有说明或与上下文明显矛盾，在描述本申请的上下文中(包括权利要求的上下 文中)使用的术语“一种”、“一个”、“所述”、“该”以及“至少一个”和类似指代被解释为覆盖单数 和复数。除非在本申请中另有说明或与上下文明显矛盾，本申请中所使用的术语“包含”、“具有”、 “包括”和“含有”被解释为开放式术语(即“包括但不限于”)。除非在本申请中另有说明或与上 下文明显矛盾，本申请所述的所有方法可以根据本领域技术人员的理解，以任何合适的顺序进行。
本申请中引用的所有专利、专利申请和参考文献均通过引用的方式全文并入本申请，其并入程度 就如同每一篇文献单独引用作为参考。如果本申请和本文提供的文献之间存在冲突，应以本申请中的 内容为准。
有益效果
本发明的优点包括：
1)本发明是针对PANDA试剂存在的缺陷，如体内代谢排出快、无肿瘤靶向性、有毒副作用等问 题，设计合成了多功能p53复活药物。
2)本发明涉及的多功能p53复活药物具有式(I)所示的结构，具有除p53复活功能之外的至少 一种能够克服PANDA试剂存在的缺陷的功能。
3)本发明以三种多功能p53复活药物为例，证明本发明设计的多功能p53复活药物的效果。这 三种多功能p53复活药物具体而言是p53复活药物分别与四乙酰基巯基葡萄糖、MDM2抑制剂、DSF偶 联，所得的偶联剂不仅保留甚至增强了复活p53的能力，还能提高肿瘤细胞靶向性、促进药物被迅速 摄取和(或)降低药物毒副作用。
附图说明
图1A和B分别为化合物四乙酰基巯基葡萄糖-砷偶联剂(AcGluAs)的1H NMR(500MHz,CDCl3)、 13C NMR(126MHz,CDCl3)核磁谱图，图1C为AcGluAs的单晶结构图；
图2A和B分别是AMG232-砷的1H NMR(500MHz,CDCl3)和13C NMR(126MHz,CDCl3)的核磁谱图；
图3A和B是DSF-砷偶联剂的1H NMR(500MHz,DMSO-d6)和13C NMR(126MHz,CDCl3)的核磁谱 图，图3C是DSF-砷偶联剂的单晶结构图；
图4A是加药处理10min、1h后HepG2细胞中的砷含量的ICP-MS分析，图4B是加AcGluAs处 理1min、5min后HepG2细胞中的砷含量的ICP-MS分析，图4C是细胞表面巯基抑制剂NEM对AcGluAs 透膜的ICP-MS分析；
图5A是化合物与突变型p53-R175H结构的PAb1620 IP分析，图5B是化合物对突变型p53-V272M 转录活性的Luciferase分析，图5C是化合物对突变型p53-V272M转录活性的qPCR分析，图5D是化 合物对突变型p53-V272M转录活性影响的Western印迹分析，图5E化合物对U937-V272M稳转细胞系 集落形成的克隆形成分析，图5F是化合物对U937-V272M稳转细胞系活力的CCK8分析；
图6A是化合物对肿瘤细胞和非肿瘤来源细胞的生长抑制效果的CCK8分析，图6B是非肿瘤来源 细胞系和肿瘤来源细胞系对化合物吸收的ICP-MS分析；
图7是AcGluAs在小鼠体内的抗肿瘤效果的活体成像分析(左)和小鼠生存期统计(右)；
图8A是ATO和AMG232-As对突变型p53-V272M转录活性的luciferase分析。图8B是AMG232和 AMG232-As上调野生型p53水平的Western印迹；
图9是luciferase分析，相同摩尔浓度处理相同时间下，AMG232-As相对ATO能更大幅度提高 p53-V272M的转录活性，该优势在药物处理10min即可体现，持续至处理24h依然存在且显著增大；
图10是在U937和Hct116细胞株中ATO、AMG232、ATO联用AMG232、AMG232-As分别处理下的CCK-8 实验；
图11是DSF-砷偶联剂处理检测泛素化蛋白的Western印迹实验；
图12A是DSF联用ATO对p53-V272M复活效果的Luciferase分析；图12B是DSF-砷偶联 剂对p53-V272M复活效果的Luciferase分析。
具体实施方式
实施例1：多功能p53复活药物的合成
本实施例中，所述多功能p53复活药物包括四乙酰基巯基葡萄糖-砷偶联剂、AMG232-As偶联剂和 DSF-As偶联剂。
实施例1-1：四乙酰基巯基葡萄糖-砷偶联剂的合成
四乙酰基巯基葡萄糖-砷偶联剂的合成路线如下
Figure BDA0003111978180000091
将化合物2,3,4,6-O-四乙酰基-1-巯基葡萄糖(1)(J Org Chem,2013,78,6,2680–2686)(364 mg，1mmol)溶于5mL的四氯化碳中，将化合物2-氯-1-胂代-2,3-二硫代环戊烷(2)(J Am Chem Soc, 1992,114,21,8147–8153)(203mg，1mmol)以摩尔比1:1的比例加入上述溶液中。氮气保护 下反应液在回流状态下反应5小时，TLC检测反应完成。溶液冷却至室温，减压蒸馏除去溶剂，残余 物经过柱层析得到化合物Glc-As(3)(340mg，64％)。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ5.22–5.06(m, 3H),4.74(d,J＝9.4Hz,1H),4.20(ddd,J＝14.8,12.4,3.7Hz,2H),3.76(ddd,J＝9.9, 4.9,2.5Hz,1H),3.58–3.32(m,4H),2.10(s,3H),2.04(s,3H),2.02(s,3H),1.99(s, 3H).13C NMR(126MHz,CDCl3)δ170.57,170.11,169.28,169.18,82.93,76.26,73.60,72.04, 68.12,61.91,42.74,42.70,20.78,20.74,20.56,20.53；ESI(+)-MS 553.25[M+Na]+；HRMS-ESI (m/z):[M+Na]+确定为C16H23AsO9S3Na,552.9616.
图1A和B分别为化合物四乙酰基巯基葡萄糖-砷偶联剂(AcGluAs)的1H NMR(500MHz,CDCl3)、 13C NMR(126MHz,CDCl3)核磁谱图，图1C为AcGluAs的单晶结构图，用于鉴定该化合物的组成和结 构。图1的结果表明根据耦合分裂峰数、偶合常数明确了各基团联结情况，根据各H峰积分面积确定 出各基团质子比，结果均与预期一致，表明化合物四乙酰基巯基葡萄糖-砷偶联剂已成功合成。
实施例1-2：AMG232-砷偶联剂的合成
AMG232-砷偶联剂合成路线如下：
Figure BDA0003111978180000092
将AMG232(1)(56.8mg，1mmol)加入3mL的二氯甲烷中，将化合物2-三苯甲巯基乙醇(2) (35.22mg，1.1mmol)，EDCI(22.67mg，1.1mmol)和DMAP(12.21mg，1mmol)依次加入上述溶液中。反应液在氮气保护室温条件下反应18小时。将反应液导入15mL二氯甲烷中，依次用1M HCl (2mL)，饱和碳酸氢钠(5mL)，饱和氯化钠(5mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，减压蒸馏除去溶剂， 残余物经柱层析得到巯基乙酯中间体3 62.1mg，收率71％。
将中间体3(62.1mg，0.071mmol)加入到3mL干燥的二氯甲烷中，冷却至0℃，在氮气保 护下将三氟乙酸(81.3mg，0.713mmol)和三乙基硅烷(41.45mg，0.356mmol)依次加入到上述 反应液中，反应液缓慢升至室温，在室温下反应20小时，TLC检测反应完成。将反应液倒入15mL 二氯甲烷中，用3mL饱和碳酸氢钠淬灭，分液，水相用15mL二氯甲烷萃取，合并有机相，用10mL 饱和氯化钠洗涤，无水硫酸钠干燥。减压蒸馏除去溶剂，残余物经柱层析分离得到硫醇中间体4 17.5 mg，收率39％。
将中间体4(17.5mg，0.0278mmol)溶于3mL四氯化碳中，将2-氯-1-胂代-2,3-二硫代环戊 烷5(5.64mg，0.0278mmol)以摩尔比1:1加入反应液中，氮气保护下反应液在回流状态下反应5 小时，TLC检测反应完成。溶液冷却至室温，减压蒸馏除去溶剂，残余物经过柱层析得到目标分子AMG-As 9.2mg，收率42％。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.25(d,J＝12.5Hz,4H),7.07(d,J＝6.4Hz, 2H),7.00(s,1H),6.94(d,J＝6.4Hz,1H),5.09(d,J＝11.0Hz,1H),4.37–4.24(m, 2H),4.05(dd,J＝13.4,10.5Hz,1H),3.59–3.35(m,5H),3.23(t,J＝8.5Hz,1H),3.10 (dt,J＝13.7,6.9Hz,1H),2.99(t,J＝6.6Hz,2H),2.93(d,J＝13.7Hz,1H),2.80(t, J＝12.7Hz,2H),2.32(t,J＝13.8Hz,1H),2.21(dq,J＝13.9,6.9Hz,1H),1.98(dd,J ＝13.8,2.8Hz,1H),1.43(d,J＝1.4Hz,3H),1.42(d,J＝1.4Hz,3H),1.41(s,3H),0.63 (d,J＝6.6Hz,3H),0.50(d,J＝6.9Hz,3H).13C NMR(126MHz,CDCl3)δ175.10,170.40,143.25,137.29,134.09,134.06,129.79,128.53,128.00,127.11,125.93,69.43,65.13,58.48,54.83, 46.53,44.68,43.57,43.26,42.38,41.82,39.20,32.65,31.28,25.94,21.00,20.45,15.72, 15.24；ESI(+)-MS 816.75[M+23]+；HRMS-ESI(m/z):[M+23]+确定为C32H42AsCl2NO5S4Na,816.0436.
图2A和B分别是AMG232-砷的1H NMR(500MHz,CDCl3)和13C NMR(126MHz,CDCl3)的结果。图 2的结果表明化合物AMG232-砷偶联剂已成功合成。
实施例1-3：DSF-砷偶联剂的合成
DSF-砷偶联剂合成路线如下：
Figure BDA0003111978180000111
化合物双硫仑胂(Dithiolatoarsenic,DTA)的合成：将化合物二乙基二硫代甲氨酸钠(51.4mg， 0.3mmol)溶于2mL的四氯化碳中，将2-氯-1-胂代-2,3-二硫代环戊烷(60.8mg，0.3mmol)以 摩尔比1：1的比例加入反应液中。氮气保护下反应液在回流状态下反应7小时，TLC检测反应完成。 溶液冷却至室温，减压蒸馏除去溶剂，残余物经过柱层析得到化合物双硫仑胂(61.5mg，65％)。1H NMR (500MHz,DMSO-d6)δ3.79(d,J＝5.3Hz,4H),3.52(s,4H),1.19(t,J＝7.1Hz,6H).13C NMR(126MHz,CDCl3)δ195.57,77.30,77.04,76.79,48.33,42.85,42.52,35.68,12.51,11.83.； ESI(+)-MS 338.5[M+Na]+；HRMS-ESI(m/z):[M]+确定为C7H15NAsS4,315.9298.
图3A和B是DSF-砷偶联剂的1H NMR(500MHz,DMSO-d6)和13C NMR(126MHz,CDCl3)结果。图 3C是DSF-砷偶联剂的单晶结构图。图3的结果表明成功合成DSF-砷偶联剂。
实施例2：包含四乙酰基巯基葡萄糖的多功能p53复活药物
本实施例中，所述包含四乙酰基巯基葡萄糖的多功能p53复活药物是四乙酰基巯基葡萄糖-As偶 联剂。
实施例2-1：四乙酰基巯基葡萄糖-砷偶联剂依赖于细胞表面-SH而迅速透膜
图4A的ICP-MS是分析加药处理10min、1h后HepG2细胞中的砷含量。使用的药物浓度是ATO， 1μg/mL；AcGluAs，5μg/mL(两者的砷原子浓度均为10μM)。由图4A可见在ATO和AcGluAs等 砷浓度(10μM)条件下，肿瘤细胞对AcGluAs的摄取量都明显多于对ATO的摄取量。并且，随着时 间延长，AcGluAs来源的As在细胞中的含量有降低的趋势(可能是细胞缓慢排出As)；而ATO来源的 As在细胞中是缓慢积累的。
图4B的ICP-MS分析是分析加AcGluAs处理1min、5min后HepG2细胞中的砷含量。AcGluAs 浓度：5μg/mL。图4B是进一步在更短时间加药处理条件下HepG2细胞的ICP-MS分析，结果表明 AcGluAs(砷原子浓度10μM)仅处理极短时间(1min、5min)，肿瘤细胞即可迅速、大量摄取化合物 中的As。
图4C的ICP-MS分析显示了细胞表面巯基抑制剂NEM对AcGluAs透膜的影响。NEM预处理HepG2 细胞30min，换液后加入5μg/mL AcGluAs处理10min。ICP-MS测定细胞砷含量。由图4C可见细 胞表面巯基抑制剂NEM的加入可显著抑制细胞对AcGluAs的As的摄取，且NEM的浓度越高、抑制效 果越显著，表明AcGluAs需依赖于细胞表面的巯基来使As进入细胞。
实施例2-2：四乙酰基巯基葡萄糖-砷偶联剂可高效复活p53
图5A PAb1620免疫沉淀(IP)分析化合物对突变型p53-R175H结构的影响。p53是癌症中突变 频率最高的蛋白，突变后的p53没有三级结构。As在细胞内能结合典型的突变型p53(这里为 p53-R175H)并恢复其三级结构。恢复三级结构的p53-R175H能被pAb1620抗体免疫沉淀下来(PAb1620 为p53结构依赖的抗体，只识别有三级结构的p53)。1μg/mL ATO的As含量约等于5μg/mL AcGluAs 的As含量(10μM)；处理浓度，AcGluAs的“1”表示5μg/mL，ATO的处理浓度“1”表示1μg/mL， 1/5、1/25、1/100分别表示相应药物浓度的1/5、1/25、1/100。
由图5A可见AcGluAs处理细胞仅2h，可有效促进p53-R175H重新折叠为野生型结构，并且存在 时间和浓度依赖情况。同时可见，在处理2h条件下，1/5、1/25、1/100浓度的AcGluAs对p53-R175H 的结构恢复效率均优于相应浓度的ATO，1/25浓度的AcGluAs对p53-R175H的恢复效率相当于、甚至 大于1浓度的ATO(浅灰色和黑色箭头)。进一步表明AcGluAs能进入细胞并释放出As，偶联四乙酰 基巯基葡萄糖提高了As的透膜效率和恢复p53-R175H三级结构的能力。
图5B Luciferase分析化合物对突变型p53-V272M转录活性的影响。化合物处理H1299-V272M-PUMA-Renilla稳转细胞系一定时间后，换液培养24h，检测报告基因luciferase的活 性。由图5B可见仅短时间(10min、1h)处理H1299-V272M-PUMA-Renilla稳转细胞系后，不同浓度 的AcGluAs(低至As浓度仅为0.3μM)能显著提高p53-V272M对PUMA的转录活性，最多升高达112 倍，而最高浓度的ATO(As浓度为10μM)对p53-V272M的激活效果仅在2.5倍以内。进一步表明AcGluAs 能进入细胞并释放出As，并且偶联四乙酰基巯基葡萄糖提高了As的透膜效率，使得在As等摩尔浓度、 处理时间较短的条件下，AcGluAs具有更好的突变型p53复活效果。
图5C qPCR分析化合物对突变型p53-V272M转录活性的影响。化合物处理U937-V272M稳转细胞 系1h后，换液培养4h，qPCR检测p53及典型的p53靶基因的mRNA水平。由图5C可见药物仅短时 间处理1h后换液培养细胞4h，AcGluAs能显著提高p53-V272M对典型的p53靶基因PUMA、CDKN1A、 MDM2的转录活性，最高达到60多倍，而最高浓度的ATO(0.05μg/mL，As浓度为0.5μM)对p53-V272M 的激活效果仅在2倍以内。再次表明AcGluAs能进入细胞并释放出As，并且偶联四乙酰基巯基葡萄糖 提高了As的透膜效率，使得在As等摩尔浓度、短时间处理条件下，AcGluAs具有更好的突变型p53 复活效果。
图5D Western印迹分析化合物对突变型p53-V272M转录活性的影响。化合物处理U937-V272M稳 转细胞系1h后，换液培养18h，western印迹检测p53靶基因的蛋白水平。由图5D可见药物仅短 时间处理U937-V272M细胞系1h后换液培养18h，AcGluAs能显著提高p21、PUMA、MDM2的蛋白水平， 明显高于等As浓度的ATO，更进一步表明AcGluAs能进入细胞并释放出As，并且偶联四乙酰基巯基 葡萄糖提高了As的透膜效率，使得在As等摩尔浓度、短时间处理条件下，AcGluAs具有更好的突变 型p53复活效果。
图5E克隆形成分析化合物对U937-V272M稳转细胞系集落形成的影响。化合物处理U937-V272M 稳转细胞系1h后，再于未加药的软琼脂上培养14d。由图5E可见仅处理U937-V272M细胞系1h条 件下，AcGluAs对细胞的克隆形成抑制效果明显强于ATO，在As浓度同为8μM时，AcGluAs组仅能形 成极少数的克隆。表明相比于ATO，偶联四乙酰基巯基葡萄糖提高了As的透膜效率，使得在As等摩 尔浓度条件下，AcGluAs具有更好抑制突变型p53肿瘤细胞集落形成效果。
图5F CCK8分析化合物对U937-V272M稳转细胞系活力的影响。化合物处理U937-V272M稳转细胞 系48h。由图5F可见AcGluAs对U937-V272M细胞系的生长抑制效果明显高于ATO，其IC50约为ATO 的1/5。表明相比于ATO，偶联四乙酰基巯基葡萄糖提高了As的透膜效率，使得在As等摩尔浓度条 件下，AcGluAs具有更好的突变型p53肿瘤细胞生长抑制效果。
实施例2-3：四乙酰基巯基葡萄糖-砷偶联剂具有肿瘤靶向性
图6A CCK8分析化合物对肿瘤细胞(前两排11株)和非肿瘤来源细胞(第三排6株)的生长抑 制效果。p53是癌症中突变频率最高的蛋白，突变后的p53没有三级结构。As在细胞内能结合典型的 突变型p53。
由图6A可见在11株肿瘤细胞系上，AcGluAs生长抑制效果均显著大于ATO；而在6株非肿瘤来 源的细胞系上AcGluAs与ATO的IC50较为接近。表明偶联四乙酰基巯基葡萄糖提高了AcGluAs对肿 瘤细胞的选择靶向性。
图6B ICP-MS分析非肿瘤来源细胞系和肿瘤来源细胞系对化合物的吸收情况。加药处理时间10 min。由图6B可见等As浓度(10μM)处理细胞10min条件下，无论正常细胞还是肿瘤细胞对AcGluAs 的As的吸收量都明显高于ATO。但是，AcGluAs样品之间比较，发现肿瘤细胞摄取AcGluAs的量高于 正常细胞。进一步表明AcGluAs在一定程度上被肿瘤细胞选择性吸收。
实施例2-4：四乙酰基巯基葡萄糖-砷偶联剂具有小鼠体内抗肿瘤活性
图7活体成像分析AcGluAs在小鼠体内的抗肿瘤效果。将构建的U937-V272M-luciferase稳转细 胞按照1×106个细胞/只来尾静脉注射于NSG小鼠，在注射细胞后的第7天，按照10mg/Kg AcGluAs 尾静脉注射给药，并于连续给药6天后，利用IVIS成像系统观察小鼠体内的肿瘤细胞信号(左图)。 右图为小鼠的生存期统计。
由图7可见按照10mg/Kg AcGluAs尾静脉注射给药6天后，小鼠体内的血液肿瘤细胞数量明显低 于PBS组，表明AcGluAs在体内具有较好的抗肿瘤细胞增殖的效果。AcGluAs给药组的小鼠生存期(中 位生存期22.5d)显著长于PBS组(中位生存期17.5d)，进一步表明AcGluAs在小鼠体内具有较好的 肿瘤抑制效果。
因此，实施例2的结果表明四乙酰基巯基葡萄糖-砷偶联剂(AcGluAs)通过与细胞表面的巯基反 应而迅速透膜，因而能比ATO更为高效地复活p53，在小鼠体内也表现出明显的抗肿瘤效果；与此同 时，该偶联剂还表现出肿瘤选择靶向性，这有利于降低含砷化合物的毒性、提高其靶向抑制肿瘤的效 率。
实施例3：包含MDM2抑制剂的多功能p53复活药物
本实施例中，所述MDM2抑制剂是第三代MDM2抑制剂AMG232，所述包含MDM2抑制剂的多功能p53 复活药物是AMG232-砷偶联剂。
实施例3-1：AMG232-As偶联剂同时具备As拯救突变型p53和AMG232激活WT-p53的 活性
图8A的Luciferase实验中，将H1299细胞以30％密度接种于96孔板，培养24h后用fugene转 染试剂同时转染p53-V272M质粒、PUMA荧光报告质粒和Renilla质粒转染进细胞，转染后24h按如图 所示浓度给药，处理24h后使用荧光素酶检测试剂盒(诺唯赞,DL101-01)裂解细胞并测定荧光值， 通过Renilla荧光值将报告基因荧光值归一化，并与不加药的对照样品进行比较。分析结果表明5uM ATO能提高大概35倍p53-V272M的转录活性，不同浓度的AMG232-As也可以提高最高30倍的p53-V272M 转录活性。图8A表明AMG232-As可以进入细胞并在细胞内释放出As，并复活突变型p53。
图8B的Western印迹实验中，A549细胞(p53-WT)50％接种，培养24h后按如图所示的浓度给药， 处理24h后加裂解液(lysis)(1％SDS+NP40)裂解细胞制备蛋白样品，跑SDS-PAGE胶分离蛋白在转移 到PVDF膜上，然后依次孵育一抗和HRP偶联的二抗，然后基于HRP活性显影检测。结果表明第一代 MDM2抑制剂Nutlin3和第三代MDM2抑制剂AMG232都可以上调野生型p53水平，偶联物AMG232-As 也可以上调野生型p53水平。图8B表明AMG232-As可以进入细胞并在细胞内释放出AMG232，并上调 野生型p53水平。
综合上述两个实验，由于AMG232-As需要释放砷原子才能结合p53-V272M蛋白，从而在luciferase 实验中激活转录活性，因此可以判断AMG232-As可以进入细胞并同时释放As和AMG232。
实施例3-2：AMG232-As偶联剂对p53-V272M复活能力优于三氧化二砷
图9的Luciferase实验中，H1299-V272M-PUMA-Renilla稳转细胞以40％汇合度铺板，培养24h 后分别按照如上图所示浓度添加ATO和AMG232-As偶联剂，分别于加完药10min后、2h后、6h后、 12h后、24h后换液，PBS洗一遍后加入新鲜培养基，继续培养24h后使用荧光素酶检测试剂盒(诺唯 赞,DL101-01)裂解细胞并测定荧光值，通过Renilla荧光值将报告基因荧光值归一化，并与不加药 的对照样品进行比较。
Luciferase分析结果表明相同摩尔浓度处理相同时间下，AMG232-As相对ATO能更大幅度提高 p53-V272M的转录活性，但随着摩尔浓度降低AMG232的优势也降低。其中处理2h情况下，2.5uM和 5uM AMG232-As对p53-V272M复活能力大约为ATO 30倍，而0.16μMAMG232-As对p53-V272M复活能 力仅为ATO 4倍。该优势在药物处理10min即可体现，持续至处理24h依然存在且显著增大。
因此，本实施例的结果表明AMG232-As在细胞内比ATO具有更强大的p53-V272M复活能力。
实施例3-3：AMG232-As偶联剂对肿瘤细胞的杀伤能力比单药和联用更强
图10的CCK-8实验中，在U937和Hct116-null中病毒感染p53-V272M后使其稳定表达，经流式 分选后获得U937-V272M和Hct116-V272M稳转细胞株。分别以3000个细胞/孔铺板，培养24h后分别 根据上图所示梯度稀释ATO、AMG232、ATO联用AMG232和AMG232-As后加入细胞，药物处理4天后， 加入CCK-8试剂于37℃孵育2h后检测吸光值，并与不加药的对照样品进行比较计算细胞存活率。
CCK-8分析结果表明在U937和Hct116细胞株中AMG232-As IC50显著低于ATO和AMG232以及两 者联用，且联用和ATO单用IC50基本一致。AMG232-As和ATO在U937-V272M中IC50分别约为0.15 μM和1.5μM，相差10倍。在Hct116-V272M中IC50分别约为5μM和40μM，相差8倍。
因此，本实施例表明AMG232-As对U937-V272M和Hct116-V272M肿瘤细胞的杀伤能力比单药和联 用更强。
实施例3的结果表明AMG232-As同时具备As拯救突变型p53和AMG232激活WT-p53的双端活性； 且等摩尔浓度不同药物处理时间下，AMG232-As对p53-V272M复活能力超过优于ATO，且对p53-V272M 细胞的杀伤能力优于比等摩尔浓度下的单药和ATO与AMG232联用。
实施例4：包含双硫仑(DSF)的多功能p53复活药物
本实施例中，所述包含双硫仑(DSF)的多功能p53复活药物是DSF-砷偶联剂。
实施例4-1：DSF-砷偶联剂在细胞内有增加蛋白泛素化的效果。
图11的western印迹中，将人类乳腺癌细胞MCF7按照百分之四十的汇合度接种于培养皿中，培 养24小时后，加入实施例4-1所示化合物，如ATO、MG132、DSF、DSF-砷偶联剂(下文称作LCA-1)、 DSF联合二水合氯化铜、LCA-1联合二水合氯化铜或二水合氯化铜，处理4.5小时后收集细胞裂解上 清，通过Western印迹检测不同处理下，全细胞裂解液中泛素化修饰的蛋白。图11结果表明阳性对 照MG132处理的泳道蛋白信号明显升高，说明MG132可以提高泛素化水平，而阴性对照ATO及二水合 氯化铜处理的泳道蛋白信号无明显变化，说明ATO及二水合氯化铜分别单独处理对泛素化没有影响。 另外，DSF和LCA-1分别单独处理的泳道蛋白信号轻微升高，说明DSF和LCA-1单独处理轻微提高泛 素化水平。图ZdenekSkrott等作者的Nature杂志报道，二价铜离子可以提高DSF的泛素化诱导能 力，如图DSF和LCA-1分别联合二水合氯化铜处理的泳道蛋白信号明显升高，说明DSF和LCA-1分别 联合二价铜离子明显提高泛素化水平，也说明LCA-1进入细胞后仍保持DSF活性。
实施例4-2：DSF-砷偶联剂在细胞内对p53-V272M复活能力优于三氧化二砷。
图12的luciferase分析中，将人类肺癌细胞H1299按照百分之三十的汇合度接种于培养皿；培 养24小时后，使用FuGENE转染试剂将p53-V272M质粒、PUMA荧光报告质粒和Renilla质粒转染进细 胞；转染24小时后，将用新鲜培养基稀的化合物，如ATO、ATO联合DSF或LCA-1加入培养皿；加药 24小时后，使用荧光素酶检测试剂盒(诺唯赞,DL101-01)裂解细胞并测定荧光值，通过Renilla 荧光值将报告基因荧光值归一化，并与不加药的对照样品进行比较。图12结果表明阳性对照5μM ATO 处理，p53-V272M转录活性升高42-59倍，说明ATO可明显提高p53-V272M转录活性。而阴性对照DSF 处理对p53-V272M转录活性没有影响，说明DSF不影响p53-V272M转录活性。另外，ATO与DSF联用 处理，p53-V272M转录活性提高倍数与单用ATO无明显差异，说明ATO联用DSF不能协同提高p53-V272M 转录活性。等摩尔比下，LCA-1比ATO促进p53-V272M转录活性的能力高1.5-2倍，证明偶联物有协 同效果。
实施例4的结果表明LCA-1(即DSF-砷偶联剂)在细胞中既能维持DSF活性，即在二价铜离子参 与下提高蛋白泛素化水平；又能保持As的活性，即能结合p53-V272M并提高其转录活性。并且偶联 物LCA-1有协同效应，即与ATO单独处理比较，LCA-1促进V272M转录活性能力更高。

Claims (10)

1.一种多功能p53复活药物，所述药物具备如式(I)所示的结构：
Figure FDA0003111978170000011
其中：(1)W是砷(As)、铋(Bi)或锑(Sb)；
(2)X、Y或Z是碳原子(C)以外的任意原子；
(3)X、Y或Z是同一原子，或不同原子；
(4)A、B或D中至少一个是功能基团，或单个原子，或空白；
(5)A、B或D这三个原子或基团成环，或任意两个成环，或者不成环。
2.根据权利要求1所述多功能p53复活药物，其中，所述W是砷(As)。
3.根据权利要求1所述多功能p53复活药物，其中，所述A、B或D中至少一个为具有生物学功能的基团。
4.根据权利要求3所述多功能p53复活药物，其中，具有生物学功能的基团选自MDM2抑制剂、四乙酰基巯基葡萄糖(AcGlu)或DSF。
5.根据权利要求3所述多功能p53复活药物，其中，所述A、B或D中其他两个成环。
6.根据权利要求1所述多功能p53复活药物，其中，所述X、Y、Z是S、O、I或As。
7.根据权利要求1所述多功能p53复活药物，其中，所述多功能p53复活药物是AcGlu-砷偶联剂、MDM2抑制剂-砷偶联剂、DSF-砷偶联剂。
8.如前述任一项权利要求所述的多功能p53复活药物用于制备治疗p53疾病药物的用途。
9.根据权利要求8所述的用途，其中所述p53疾病包括癌症，神经疾病、发育疾病、免疫系统疾病和衰老。
10.根据权利要求9所述的用途，所述癌症包括卵巢癌、肺癌、头颈癌、胰腺癌、结肠癌、脑癌、膀胱癌、胃癌、肾癌、肝癌、乳腺癌、黑色素瘤、前列腺癌、急性髓细胞性白血病、子宫癌、恶性上皮肿瘤、肉瘤、骨髓瘤、白血病、淋巴瘤、母细胞瘤、混合型癌症或任何含有p53突变的肿瘤。
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