CN111556874A - Panda用作新型治疗剂 - Google Patents
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Abstract
本文公开了一种新型的p53复合物,以及一类能紧密结合p53并高效拯救其野生型结构和功能的化合物,以及制备和使用该复合物和化合物的方法,这些方法包括诊断、预后和治疗p53相关疾病,如癌症和衰老。
Description
1.技术领域
本文公开了多种生化复合物、候选药物以及它们的制备和使用方法。这些复合物、候选药物和方法具有广泛的医学和治疗用途,包括癌症治疗、化妆品、科学研究和工业应用。
2.背景
p53异常相关疾病(如癌症)的候选药物和方法被提出,但效果都不理想。在本领域内亟需更好的针对p53异常相关疾病的候选药物和方法。
3.概要
申请人在此描述了一种新型的由p53蛋白及化合物组成的复合物,命名为“PANDA”;描述了一类具有有用的特征并与“PANDA口袋”紧密结合的化合物,命名为“PANDA化合物”;描述了p53蛋白上能与PANDA试剂结合并形成PANDA的口袋状结构,命名为“PANDA口袋”(PANDA口袋和PANDA试剂形成的复合物称为“PANDA核心”);描述了p53上参与PANDA形成和PANDA核心形成的三个关键半胱氨酸,这三个半胱氨酸在野生型p53(wtp53)上即第124位半胱氨酸(“C124”)、第135位半胱氨酸(“C135”)、第141位半胱氨酸(“C141”),我们把这三个半胱氨酸命名为“PANDA半胱氨酸”,合起来命名为“PANDA半胱氨酸三联体”;描述了制备和使用PANDA和/或PANDA核心的方法,包括用于p53异常相关疾病(比如癌症、衰老)的诊断、预后分析、治疗等;描述了使用PANDA试剂的方法,包括用于p53异常相关疾病(比如癌症、衰老)的诊断、预后分析、治疗等。
在某些实施例中,PANDA核心是p53上的一个三级结构,包括PANDA口袋、PANDA试剂、以及PANDA口袋和PANDA试剂之间的至少一个紧密连接。在优选实施例中,PANDA口袋本质上是正确折叠的PANDA半胱氨酸周围约的区域,这个区域包括与一个或多个正确折叠的PANDA半胱氨酸相邻的所有氨基酸、和与一个或多个正确折叠的PANDA半胱氨酸接触的所有氨基酸、以及所有PANDA半胱氨酸。在优选实施例中,PANDA试剂是一类具有一个或多个有用特征物质,例如:(a)可以导致正确折叠的p53含量大量增加,优选比PRIMA-1引起的增加至少高3倍,更优选比PRIMA-1引起的增加至少高5倍,进一步优选比PRIMA-1引起的增加至少高10倍,更进一步优选比PRIMA-1引起的增加至少高100倍;(b)可显著改善p53的转录功能,优选比PRIMA-1引起的改善至少高3倍,更优选于比PRIMA-1引起的改善至少高5倍,进一步优选比PRIMA-1引起的改善至少高10倍,更进一步优选比PRIMA-1引起的改善至少高100倍;(c)可显著促进p53蛋白的稳定,例如增加p53的熔解温度(Tm),优选比PRIMA-1引起的增加至少高3倍,更优选比PRIMA-1引起的增加至少高5倍,进一步优选比PRIMA-1引起的增加至少高10倍,更进一步优选比PRIMA-1引起的增加至少高100倍。优选地,PANDA试剂具有两个或更多个有用特征。在更优选实施例中,PANDA试剂具有三个或更多个有用特征。
在某些实施例中,PANDA口袋本质上是由PANDA三联体和对应于wtp53上的S116、C275、R273、Y234、V122、T123、T125、Y126、M133、F134、Q136、L137、K139、T140、P142、V143、L114、H115、G117、T118、A119、K120、S121、A138、I232、H233、N235、Y236、M237、C238、N239、F270、E271、V272、V274、A276、C277、P278、G279、R280、D281和R282所组成。在某些优选实施例中,PANDA口袋的排列基本上如图14左图、图14的右图和/或图18所示。
优选的p53是任何野生型p53(“wtp53”)、任何突变型p53(“mp53”)、wtp53和mp53的所有天然和人工形式以及它们的任意组合。wtp53的优选实例包括p53α、p53β、p53γ、Δ40p53α、Δ40p53β、Δ40p53γ和任何可接受的变体,如具有一个或多个单核苷酸多态性(“SNP”)的变体。人wtp53异构体的示例序列,如第7.25节所示。
优选的mp53在wtp53基础上具有至少一个突变,包括任意单个氨基酸突变,该突变优选改变和/或部分改变p53的结构和/或功能。mp53的优选实例包括在R175、G245、R248、R249、R273、R282、C176、H179、Y220、P278、V143、I232和F270的一个或多个突变。mp53突变的例子包括R175H、G245D/S、R248Q/W、R249S、R273C/H、R282W、C176F、H179R、Y220C、P278S、V143A、I232T和F270C。
人工改造p53的优选实例包括p53融合蛋白、p53片段、p53肽段、p53衍生出来的融合大分子、p53重组蛋白、第二个氨基酸位点具有抑制作用的突变(“SSSM”)的p53和(功能强于wtp53的)超级p53。
在某些实施例中,PANDA试剂和PANDA口袋形成的紧密连接可以是键、共价键、非共价键(例如氢键)及它们的组合。在某些实例中,这种紧密连接在PANDA试剂和一个或多个PANDA半胱氨酸之间形成,优选在两个或多个PANDA半胱氨酸之间,更优选在所有三个PANDA半胱氨酸之间形成。
在某些实施例中,PANDA试剂可以调节一个或多个p53靶基因的水平,例如Apaf1、Bax、Fas、Dr5、mir-34、Noxa、TP53AIP1、Perp、Pidd、Pig3、Puma、Siva、YWHAZ、Btg2、Cdkn1a、Gadd45a、mir-34a、mir-34b/34c、Prl3、Ptprv、Reprimo、Pai1、Pml、Ddb2、Ercc5、Fancc、Gadd45a、Ku86、Mgmt、Mlh1、Msh2、P53r2、Polk、Xpc、Adora2b、Aldh4、Gamt、Gls2、Gpx1、Lpin1、Parkin、Prkab1、Prkab2、Pten、Sco1、Sesn1、Sesn2、Tigar、Tp53inp1、Tsc2、Atg10、Atg2b、Atg4a、Atg4c、Atg7、Ctsd、Ddit4、Dram1、Foxo3、Laptm4a、Lkb1、Pik3r3、Prkag2、Puma、Tpp1、Tsc2、Ulk1、Ulk2、Uvrag、Vamp4、Vmp1、Bai1、Cx3cl1、Icam1、Irf5、Irf9、Isg15、Maspin、Mcp1、Ncf2、Pai1、Tlr1–Tlr10、Tsp1、Ulbp1、Ulbp2、mir-34a、mir-200c、mir-145、mir-34a、mir-34b/34c和Notch1。
在某些实施例中,PANDA化合物和PANDA核心形成的紧密连接大幅度稳定了p53。这种紧密连接优选将p53的Tm提高至少约0.5℃,更优选地,提高至少约1℃,进一步优选地,提高至少约2℃,更进一步优选地,提高至少约5℃,再优选地,提高至少约8℃。
在某些实施例中,PANDA化合物和PANDA核心形成的紧密连接使正确折叠的p53至少增加约3倍,优选地,增加约5倍,更优选地,增加约10倍,进一步优选地,增加约100倍。在优选实施例中,测定这种增加的方法是PAb1620免疫沉淀测定法。
在某些实施例中,PANDA试剂包括一个或多个能够结合PANDA口袋上一个或多个氨基酸的PANDA口袋结合基团(“R”),优选于结合一个或多个半胱氨酸,更优选结合两个或多个半胱氨酸,进一步优选地,结合三个以上半胱氨酸,更进一步优选地,结合约三个到十二个半胱氨酸。R优选包括金属基团、准金属基团和其他能够与PANDA口袋结合的基团,例如迈克尔受体和巯基,R更优选包括一种或多种砷、锑和铋,及它们的任意类似物与任意组合。R示例包括含3价和/或5价砷原子、3价和/或5价锑原子、3价和/或5价铋原子和/或它们的组合的化合物。PANDA试剂示例包括表格1-6,申请人已预测所展示PANDA试剂可有效结合PANDA半胱氨酸,并在体外、体内和/或原位有效拯救p53。更多的PANDA试剂示例如As2O3、As2O5、KAsO2、NaAsO2、HAsNa2O4、HAsK2O4、AsF3、AsCl3、AsBr3、AsI3、AsAc3、As(OC2H5)3、As(OCH3)3、As2(SO4)3、(CH3CO2)3As、C8H4K2O12As2·xH2O、HOC6H4COOAsO、[O2CCH2C(OH)(CO2)CH2CO2]As、Sb2O3、Sb2O5、KSbO2、NaSbO2、HSbNa2O4、HSbK2O4、SbF3、SbCl3、SbBr3、SbI3、SbAc3、Sb(OC2H5)3、Sb(OCH3)3、Sb2(SO4)3、(CH3CO2)3Sb、C8H4K2O12Sb2·xH2O、HOC6H4COOSbO、[O2CCH2C(OH)(CO2)CH2CO2]Sb、Bi2O3、Bi2O5、KBiO2、NaBiO2、HBiNa2O4、HBiK2O4、BiF3、BiCl3、BiBr3、BiI3、BiAc3、Bi(OC2H5)3、Bi(OCH3)3、Bi2(SO4)3、(CH3CO2)3Bi、C8H4K2O12Bi2·xH2O、HOC6H4COOBiO、C16H18As2N4O2(NSC92909)、C13H14As2O6(NSC48300)、C10H13NO8Sb(NSC31660)、C6H12NaO8Sb+(NSC15609)、C13H21NaO9Sb+(NSC15623)和它们的组合。进一步的PANDA试剂示例包括表7,申请人已通过实验证实它们均表现出很强的结构拯救和转录活性拯救能力。
在某些实施例中,PANDA口袋和PANDA试剂之间反应产生PANDA核心。该反应优先由As、Sb和/或Bi基团氧化PANDA半胱氨酸的一个或多个巯基(PANDA半胱氨酸失去1-3个氢之间)和PANDA试剂中As、Sb和/或Bi基团减少(PANDA试剂失去氧)来调节。在某些实施例中,PANDA试剂是与p53紧密结合从而形成的还原产物。在某些实施例中,PANDA试剂是砷原子、锑原子、铋原子及其任意类似物或组合。
一个示例性PANDA核心与图14左图(附录A)、图14右图(附录B)和/或图18的三维结构上的对应氨基酸大致相似。在某些优选实施例中,PANDA核心在jCE循环排列(jCECircular Permutation)中有约3.00RMSD和/或0.50TM得分,对比图14左图(附录A)、图14右图(附录B)和/或图18的三维结构上的对应氨基酸,优选地,约2.00RMSD和/或0.75TM得分拟合,更优选地,约1.00RMSD和/或0.90TM得分拟合。在某些优选实施例中,PANDA核心对应于图14左图(附录A)、图14右图(附录B)和/或图18的三维结构上的氨基酸。在某些优选实施例中,PANDA核心对应wtp53上114-126、133-143、232-239和270-282的氨基酸位置与图14左图(附录A)、图14右图(附录B)和/或图18大致相似。
在某些实施例中,PANDA的结构与图14左图(附录A),图14右图(附录B)和/或图18的三维结构大致相似。在某些优选实施例中,PANDA在jCE循环排列中有约3.00RMSD和/或0.50TM得分,对比图14左图(附录A)、图14右图(附录B)和/或图18的三维结构,优选地,于约2.00RMSD和/或0.75TM得分拟合,更优选地,约1.00RMSD和/或0.90TM得分拟合。在某些优选实施例中,PANDA对应于图14左图(附录A),图14右图(附录B)和/或图18的三维结构。在某些优选实施例中,PANDA对应wtp53上114-126、133-143、232-239和270-282的氨基酸位置与图14左图(附录A),图14右图(附录B)和/或图18大致相似。
在某些实施例中,可以使用任意常规方法来纯化和分离形成的PANDA,包括在本申请中公开的任意方法,例如通过使用PAb1620免疫沉淀法。
在某些优选实施例中,与未结合PANDA试剂时相比,结合后PANDA获得一种或多种wtp53结构,优选DNA结合结构;获得一种或多种wtp53功能,优选转录功能;和/或丧失和/或减少一种或多种mp53功能,优选致癌功能。PANDA可以在体外和/或体内获得野生型p53功能。示例性获得野生型功能可以在分子水平上,例如与核酸结合,靶基因的转录激活或抑制,与wtp53或mp53伴侣结合,与wtp53或mp53伴侣的解离和接受翻译后修饰;在细胞水平上,例如对诸如营养缺乏、低氧、氧化应激、过度增殖信号、致癌性应激、DNA损伤、核糖核苷酸耗竭、复制性应激和端粒损耗等应激反应,促进细胞周期停滞、DNA修复、细胞凋亡、基因组稳定性、衰老和自噬,调节细胞代谢重编程、肿瘤微环境信号传导,抑制细胞干性、存活、侵袭和转移;在生物体水平上,例如延迟或预防癌症复发,提高癌症治疗效力,提高对癌症治疗的反应率,调节发育、衰老、寿命、免疫过程和老化。mp53功能可能在体外和/或体内丧失、受损和/或被废除。示例性丧失mp53功能可能包括任何功能,例如促进癌细胞转移、基因组不稳定、入侵、迁移、分散、血管生成,干细胞扩增、存活、增殖,组织重塑、抗药性和促有丝分裂缺陷的致癌功能。
在某些优选实施例中,在生物系统中形成的PANDA可以获得和/或丧失在RNA水平和/或蛋白质水平上调或下调一个或多个p53下游靶标的能力,优选为3倍,更优选为5倍,进一步优选为10-100倍。
在某些优选实施例中,前文阐述的任意PANDA试剂都可以治疗有mp53和/或没有功能性p53的个体的p53异常疾病,其中所述疾病是癌症、肿瘤、衰老的结果、发育性疾病、加速老化、免疫学疾病或其组合。
在某些优选实施例中,形成的PANDA具有抑制肿瘤的能力,优选地,至少是统计学上显著的水平,更优选地,具有以统计学上显著水平强烈抑制肿瘤的能力。在某些优选实施例中,形成的PANDA具有调节细胞生长或肿瘤生长的能力,优选地,将其调节至wtp53约10%的水平,更优选地,调节至wtp53至少约100%的水平,更进一步优选地,调节至超过wtp53水平的约100%。
在某些优选实施例中,可以通过将一种或多种PANDA试剂与p53,优选具有至少一个突变(包括一个氨基酸突变)的mp53结合来制备PANDA或PANDA核心。突变优选改变和/或部分改变p53的结构和/或功能。mp53的优选实例包括在R175、G245、R248、R249、R273、R282、C176、H179、Y220、P278、V143、I232和F270的一个或多个突变。示例性mp53突变包括R175H、G245D/S、R248Q/W、R249S、R273C/H、R282W、C176F、H179R、Y220C、P278S、V143A、I232T和F270C。
在某些优选实施例中,PANDA试剂可以拯救一种或多种wtp53结构,优选DNA结合结构;拯救一种或多种wtp53功能,优选转录功能;消除和/或减少一种或多种mp53功能,优选致癌功能。
在某些优选实施例中,可以通过将一种或多种PANDA试剂与p53(优选在p53上具有至少一个突变的mp53,包括单个氨基酸突变)结合形成PANDA从而拯救一种或多种wtp53结构,优选DNA结合结构。突变优选改变和/或部分改变p53的结构和/或功能。mp53的优选实例包括R175、G245、R248、R249、R273、R282、C176、H179、Y220、P278、V143、I232和F270的一个或多个突变。示例性mp53突变包括R175H、G245D/S、R248Q/W、R249S、R273C/H、R282W、C176F、H179R、Y220C、P278S、V143A、I232T和F270C。
在某些优选实施例中,可以通过将一种或多种PANDA试剂与p53(优选在p53上具有至少一个突变的mp53,包括单个氨基酸突变)结合形成PANDA从而拯救一种或多种wtp53功能,优选转录功能。突变优选改变和/或部分改变p53的结构和/或功能。mp53的优选实例包括R175、G245、R248、R249、R273、R282、C176、H179、Y220、P278、V143、I232和F270的一个或多个突变。示例性mp53突变包括R175H、G245D/S、R248Q/W、R249S、R273C/H、R282W、C176F、H179R、Y220C、P278S、V143A、I232T和F270C。
在某些优选实施例中,可以通过将一种或多种PANDA试剂与p53(优选在p53上具有至少一个突变的mp53,包括单个氨基酸突变)结合形成PANDA从而消除和/或减少一种或多种mp53功能,优选致癌功能。突变优选改变和/或部分改变p53的结构和/或功能。mp53的优选实例包括R175、G245、R248、R249、R273、R282、C176、H179、Y220、P278、V143、I232和F270的一个或多个突变。示例性mp53突变包括R175H、G245D/S、R248Q/W、R249S、R273C/H、R282W、C176F、H179R、Y220C、P278S、V143A、I232T和F270C。
在某些优选实施例中,可以通过将PANDA和/或PANDA试剂添加至细胞和/或个体(优选人细胞和/或个体),来拯救一种或多种wtp53结构,优选DNA结合结构。
在某些优选实施例中,可以通过将PANDA和/或PANDA试剂添加至细胞和/或个体(优选人细胞和/或个体),来拯救一种或多种wtp53功能,优选转录功能。
在某些优选实施例中,可以通过将PANDA和/或PANDA试剂添加至细胞和/或个体(优选人细胞和/或个体),来消除和/或减弱一种或多种mp53功能,优选致癌功能。
申请人在此公开了一种打开和关闭mp53的wtp53功能的方法,该方法包括以下步骤:
(a)将第一个PANDA试剂与mp53结合以开启mp53的wtp53功能;
(b)添加第二种化合物从mp53中去除PANDA试剂(i),例如抗路易氏药剂(BritishAnti-Lewisite)(BAL)、二硫琥珀酸(succimer)(DMSA)、二巯基丙磺酸钠(Unithiol)(DMPS)和/或其组合;(ii)抑制改造细胞或个体中p53的表达,例如强力霉素;和/或(iii)关闭改造细胞或个体中p53的表达,例如他莫昔芬。
申请人在此公开了一种在体外和/或体内使用PANDA或PANDA核心来拯救一个或多个wtp53结构的方法,优选DNA结合结构;拯救一种或多种wtp53功能,优选转录功能;消除和/或减少一种或多种mp53功能,优选致癌功能,该方法包括将PANDA和/或PANDA试剂添加至细胞和/或个体,优选人细胞和/或个体。
申请人在此公开了一组具有治疗mp53个体疾病能力的PANDA试剂,该疾病优选癌症。
申请人在本文中公开了一种治疗个体p53异常疾病的方法,该病例如癌症、肿瘤、衰老、发育性疾病、加速老化、免疫学疾病和/或其组合。该方法包括将有效剂量的治疗剂给予个体,其中治疗剂是(a)一种或多种PANDA试剂或(b)一种或多种PANDA或PANDA核心。在优选实施例中,将治疗剂与一种或多种其他治疗剂组合给药,优选任何已知的可有效治疗癌症的治疗剂和/或DNA损伤剂。
申请人进一步公开了在有需要的个体中治疗p53异常疾病的高效个性化方法。该方法包括以下步骤:(a)从个体获得p53 DNA样品;(b)对p53 DNA样品进行测序;(c)确定个体的p53是否可拯救并确定最适合拯救个体p53的一种或多种PANDA试剂和/或PANDA试剂的组合;(d)向个体给予有效剂量的PANDA试剂和/或PANDA试剂的组合;
其中步骤(c)包括步骤(i)在电脑上确定p53 DNA样品序列是否与数据库中可拯救p53的一致,并通过数据库确定最适合拯救p53的PANDA试剂和/或PANDA试剂的组合;和/或(ii)在体外和/或体内通过对一组PANDA试剂进行筛选来确定个体的p53是否可以被拯救。
申请人进一步公开了一种确定PANDA或PANDA核心的方法。该方法包括以下步骤:使用对正确折叠的PANDA有特异性识别能力的抗体,例如PAb1620、PAb246和/或PAb240,进行免疫沉淀;通过质谱检测分子量的增加;在荧光素酶测定中检测转录活性是否恢复;检测p53靶标的mRNA和蛋白质水平;共结晶构建3-D结构;和/或测量Tm增加。
申请人在此公开了一组具有在表达mp53或缺失功能性p53的生物系统中调节p53靶标水平能力的PANDA试剂。申请人进一步公开了控制一种或多种受p53和/或PANDA调节的蛋白质和/或RNA的方法,该方法包括将调节剂给予生物系统,其中该调节剂选自:
(i)一个或多个PANDA试剂;
(ii)一个或多个PANDA或PANDA核心;
(iii)一个或多个能从p53中去除PANDA试剂的化合物;
(iv)一个或多个mp53;
(v)一个或多个能去除PANDA的化合物,包括p53抗体、强力霉素和PANDA抗体;和
(vi)以上的组合。
申请人在此公开了一组具有在生物系统(优选表达mp53的系统)中抑制肿瘤能力的PANDA试剂。申请人进一步公开了一种抑制肿瘤的方法,该方法包括将有效剂量的治疗剂给予有需要的个体,其中该抑制剂选自:
(i)一个或多个PANDA试剂;和
(ii)一个或多个PANDA和/或PANDA核心。
在优选实施例中,该肿瘤抑制剂可与一种或多种其余肿瘤抑制剂联用,优选能有效抑制肿瘤生长和/或DNA损伤的已知肿瘤抑制剂。
申请人在此公开了一组具有在生物系统(优选表达mp53的系统)中调节细胞生长或肿瘤生长能力的PANDA试剂。申请人进一步公开了一种调节细胞生长或肿瘤生长的方法,该方法包括向有需要的个体给予有效剂量的调节剂,其中该调节剂选自:
(i)一种或多种PANDA试剂;(ii)一个或多个PANDA和/或PANDA核心。在优选实施例中,调节剂与一种或多种附加调节剂组合给予,优选任意有效减慢细胞生长和/或DNA损伤的已知调节剂。
申请人在此公开了一种在有需要的个体中诊断与p53异常疾病的方法,所述疾病例如癌症、肿瘤、衰老、发育性疾病、加速老化、免疫学疾病或其组合。该诊断方法包括向个体给予有效剂量的治疗剂,并检测是否形成PANDA或PANDA核心,其中治疗剂选自:
(i)一个或多个PANDA试剂;和
(ii)一个或多个PANDA和/或PANDA核心。
在优选实施例中,诊断方法包括将所述治疗剂与一种或多种附加治疗剂组合给予的治疗步骤,例如一种或多种附加PANDA试剂和/或任意有效治疗癌症和/或DNA损伤的已知化合物,以有效治疗个体的p53异常疾病。
在某些实施例中,PANDA试剂不是CP-31398;PRIMA-1;PRIMA-1-MET、SCH529074、锌;斑点酸(stictic acid)、p53R3;亚甲基奎宁环酮(methylene quinuclidinone);STIMA-1;3-亚甲基-2-降冰片烷酮;MIRA-1;MIRA-2;MIRA-3;NSC319725;NSC319726;SCH529074;PARP-PI3K;5,50-(2,5-呋喃二基)双-2-噻吩乙醇;MPK-09;Zn-curc或姜黄素基Zn(II)络合物;P53R3;(2-苯并呋喃基)喹唑啉衍生物;5-氟脲的核脂衍生物;盐酸2-氨基苯乙酮的衍生物;PK083;PK5174;或PK7088和其他先前确定的mp53拯救化合物。
在某些实施例中,可以将PANDA试剂配制成适于治疗患有p53异常疾病的个体的药物组合物。药物组合物通常含有药物学可接受的载体。尽管口服给药是优选给药途径,但是也可以考虑其他给药方式,例如鼻、局部或直肠给药或者通过注射或吸入。取决于预期给药方式,药物组合物可以是固体、半固体或液体剂型的形式,例如片剂、栓剂、丸剂、胶囊剂、散剂、液体剂、混悬剂、软膏剂或洗剂,优选适合单次精确剂量给药的单位剂型。本领域有经验的技术人员可以根据可以接受的具体情况,进一步以适当的方式配制该化合物,例如在《雷明顿药学大全》(作者:Alfonso R.Gennaro;出版社:宾夕法尼亚州伊斯顿州的Mack出版公司;出版年份:1990(Remington's Pharmaceutical Sciences,Gennaro,Ed.,MackPublishing Co.,Easton,Pa.1990))中所公开的。
在某些实施例中,载体可以是任意和所有溶剂、分散介质、媒介物、涂料、稀释剂、抗菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂、缓冲剂、载体溶液、悬浮液、胶体等。药物载体可以包括脂质体、白蛋白微球、可溶性合成聚合物、DNA复合物、蛋白质-药物缀合物、载体红细胞以及任何其他可改善药物递送和有效性的物质。这种介质和试剂用于药物活性物质是本领域众所周知的。除非有常规介质或试剂与活性成分不相容,否则考虑将其用于治疗组合物中。补充活性成分也可以掺入组合物中。
在某些实施例中,用于治疗p53异常疾病(例如癌症)的疗法包括手术、化学疗法和放射疗法。实验疗法包括但不限于基于病毒或基于病毒样颗粒的递送载体在肿瘤中表达野生型p53。
在某些实施例中,p53癌症治疗剂包括一般化学治疗剂。普通化学治疗剂的实例包括但不限于阿瓦斯汀,利妥昔单抗,赫赛汀,紫杉醇和格列卫。
在某些实施例中,“需要的人”可以指患有与p53异常疾病(例如癌症)的个体,其中癌症表达p53的突变形式。在一些实施例中,p53突变体对PANDA试剂敏感。
在某些实施例中,PANDA试剂可以配制成药学上可接受的盐。药学上可接受的盐可以是与抗衡离子结合形成中性复合物的可电离的药物。通过此过程将药物转化为盐可以提高其化学稳定性,使复合物更易于给予,并可以控制药物的药代动力学(Patel等,2009)。
在某些实施例中,PANDA试剂和PANDA具有以下特征:
(1)PANDA试剂ATO通过改变p53结构,包括折叠mp53直接与p53结合形成PANDA;
(2)PANDA试剂介导的PANDA形成可以在体内和体外进行,包括在人体内。
(3)PANDA在结构和功能上与wtp53非常相似;
(4)PANDA试剂ATO以惊人的高效率折叠结构型mp53的结构,使PANDA的结构与wtp53非常相似。
(5)PANDA试剂ATO通过PANDA以惊人的高效率拯救结构型mp53的转录活性;
(6)PANDA试剂ATO通过PANDA在体外和体内抑制表达mp53细胞的生长;
(7)PANDA试剂ATO处理的表达mp53细胞或含有PANDA的细胞对DNA损伤处理有积极反应。
(8)PANDA试剂ATO高效且特异于mp53和有效的mp53拯救剂;
(9)PANDA试剂ATO和PANDA可以直接对抗多种癌症,包括急性髓细胞性白血病(“AML”)和骨髓增生异常综合征(“MDS”);和
(10)首次接受ATO或PANDA治疗的癌症患者,包括AML和MDS患者,开始对抗癌药物有显著反应。
在某些实施例中,PANDA试剂通过形成PANDA可以广泛且有效地拯救mp53,例如含有砷元素的PANDA试剂。例如As2O3及其类似物可以在不同程度上拯救最常见的mp53。这些mp53包括但不限于:六个热点mp53(R175、G245、R249或R282突变的mp53(通常被视为结构型热点mp53),R248或R273突变的mp53(通常被视为结合型热点mp53)以及C176、H179、Y220、或P278、V143、F270、或I232突变的mp53。
在某些实施例中,PANDA试剂具有结合多个半胱氨酸的潜力,并且可以通过促进mp53折叠来选择性抑制表达结构型mp53的细胞。
在某些实施例中,PANDA试剂将促进癌症的mp53转化为肿瘤抑制性PANDA,并且与现有的治疗策略相比具有显著优势,例如通过在患者中重新引入wtp53或促进内源性mp53的降解或失活。PANDA试剂通过PANDA介导拯救mp53,高拯救效率和mp53选择性是先前报道的化合物的两个优越特征。在某些实施例中,使用可靠的PAb1620(或PAb246)IP测定,PANDA试剂ATO可以近乎完全拯救p53-R175H,相当于从wtp53约1%到约97%的水平。在某些实施例中,使用标准的萤光素酶报告基因检测法测定,PANDA试剂ATO还几乎完全拯救了p53-G245S和p53-R282W某些促凋亡靶标的转录活性,相当于从wtp53约4%到约80%的水平。与现有化合物相比,申请人在许多情况下都可靠地再现了这些优异的结果,并且在我们的实验中,还没有已知被报道化合物能够拯救热点mp53的结构或转录活性到相当于wtp53的5%的水平。
在某些实例中,PANDA试剂ATO和PANDA可以以惊人的高效率选择性地靶向结构型mp53,同时mp53也可以以中等效率被拯救。例如,申请人发现PANDA试剂ATO通过形成PANDA可以有效拯救各种结构型mp53,包括大部分热点mp53。另外,申请人还发现,ATO可以通过PANDA以有限效率来拯救结合型mp53。这一显著的性质不仅优越,而且在概念上与大多数已报道的化合物不同,如CP-31398(Foster等,1999)、PRIMA-1(Bykov等,2002)、SCH529074(Demma等,2010)、Zinc(Puca等,2011)、斑点酸(Wassman等,2013)、p53R3(Weinmann等,2008)和其他已报道的可以拯救两种类型mp53的化合物。
我们的发现进一步表明,PANDA试剂ATO可在临床试验中用于多种ATO响应癌症。患者优选募集遵循特定和高度精确的招募前提,以实现最大的功效。虽然ATO已获得FDA的批准可用于治疗急性早幼粒细胞白血病(APL),白血病的一种亚型。尽管ATO已在过去的二十年中进行了广泛的试验,旨在将其应用范围扩大到非APL癌症类型,但仍未被批准。这在很大程度上是因为尚未能揭示ATO影响的癌症图谱。实际上,仅通过区分mp53组和wtp53组是无法观察到NCI60细胞系的mp53依赖的ATO敏感性。通过进一步从mp53组中区分ATO可拯救的mp53,我们已成功揭示了ATO和PANDA依赖性响应的关键要素。我们发现ATO影响的癌症图谱范围相当广,估计涵盖了15%-30%的癌症病例。例如,我们确定了6个热点mp53中至少4个以及大量非热点mp53可被ATO和PANDA有效拯救。的确,在1971年中国进行的最早的ATO临床试验(n>1000例患者)中,ATO表现出对许多癌症类型(包括结直肠癌、食道癌、肝癌,尤其是APL)的治疗效果(Zhang等,2001;Zhu等,2002)。
尽管ATO和PANDA可用于治疗多种癌症,但如本申请中所述的部分测试所证明的那样,最好将ATO精确给药于携带ATO可拯救mp53的患者。众所周知,不同的错义突变赋予mp53不同的活性(Freed-Pastor和Prives,2012),这可能导致携带不同mp53的患者有不同的治疗结果。因此与他人相同,我们提倡应根据携带的mp53突变类型而不是根据是否存在mp53或wtp53来定制治疗方法(Muller和Vousden,2013,2014)。值得注意的是,我们在MDS患者携带的p53-S241F,p53-S241C以及其他人工生成的p53-S241突变体上的发现支持ATO拯救效率不仅取决于p53突变位点,还取决于生成的新残基。基于在AML/MDS小型临床试验中观察到的结果,我们针对AML/MDS患者启动了两项大型的多中心前瞻性临床试验(NCT03381781和NCT03377725)。在其中一项试验中,我们对300名盲选的MDS患者进行临床试验,旨在证实ATO对p53突变状态的依赖性。在另一项试验中,我们正在招募约1500-2000名AML患者,对通过桑格测序确认的mp53阳性患者进行临床试验,以确定ATO在治疗表达mp53的非APL白血病的功效。
尽管许多拯救原则已被提出,但是药理学拯救mp53的原子级机制空白长久以来阻碍着癌症研究的进展(Bullock和Fersht,2001;Joerger和Fersht,2007;Joerger和Fersht,2016)。这种空白严重阻碍了科学家鉴定有效且有选择性的mp53拯救化合物(Bullock和Fersht,2001;Joerger和Fersht,2007;Joerger和Fersht,2016)。合理设计和筛选mp53稳定剂尤其具有挑战性,因为p53上可结合mp53稳定剂的口袋尚未知(Joerger和Fersht,2016)。
申请人进一步阐述了一种合理的4C筛选方法。使用这种方法,申请人已经鉴定出能与mp53上的半胱氨酸对共价交联的化合物。申请人预测,共价交联半胱氨酸可能足够强有力地固定p53局部区域,中和由附近突变引起的柔韧性并全局稳定p53。
使用4C筛选,我们成功地鉴定了至少两种含砷化合物,它们可以作为多种mp53的拯救分子。当探索这些砷化合物的特征时,我们发现了稳定剂结合的意想不到且深埋的PANDA口袋。由此我们提供了一种原子级MOA,说明了如何通过化合物稳定mp53的广谱范围。
在某些实施例中,PANDA口袋在全局稳定mp53中起关键作用。我们发现PANDA口袋上有大量报告的SSSM。此外,我们合理设计的SSSM也位于PANDA口袋上并使其稳定。我们提出的拯救机制和高度可成药的PANDA口袋可以解释为什么先前报道的含迈克尔受体化合物几乎无法检测mp53拯救效率(Joerger和Fersht,2016;Muller和Vousden,2014)。计算机建模表明,这些化合物中有许多与C124位点结合(Wassman等,2013),这是PANDA半胱氨酸三联体的关键半胱氨酸之一,但仍有待实验确定(Joerger和Fersht,2016),因为这些含迈克尔受体的化合物接触PANDA半胱氨酸三联体的边缘,所以它们只能非常微弱地稳定PANDA口袋,从而以有限的效率拯救mp53。
砷对结构型mp53中PANDA半胱氨酸三联体的半胱氨酸的选择性格外引人注目。到目前为止,包括PRIMA-1、STIMA-1、MIRA-1、“化合物1”、PK11007和玫瑰树碱在内的许多化合物都具有一个迈克尔受体基团,并预计将结合单个半胱氨酸发挥功能(Bauer等,2016;Joerger和Fersht,2016;Wassman等,2013)。由于p53具有不止一个暴露的半胱氨酸,这些化合物可能与许多其他不被期望的半胱氨酸结合。实际上,已经报道PRIMA-1和“compound 1”在体外以高于1:1的比率结合mp53(Bauer等,2016;Lambert等,2009)。这些化合物也可能对具有暴露半胱氨酸的wtp53或其他细胞蛋白有脱靶趋势。
由于具有结合多个半胱氨酸的潜能,我们目前的含砷化合物在概念上与任何先前报道的化合物不同,这可以解释PANDA半胱氨酸三联体的选择性。砷选择性结合PANDA半胱氨酸三联体上的惰性半胱氨酸,而不是更易接近的半胱氨酸(例如C277和C182)或其他三半胱氨酸簇(例如锌区域中的C176/C238/C242)结合。这表明PANDA半胱氨酸三联体是独特的,并以一种格外包容砷的特殊形式排列。
我们还发现,尽管ATO与wtp53结合并与mp53接触以显著稳定它们并增强其功能,但到目前为止,结构型mp53从ATO结合中受益最大,原因之一是结构型mp53高度不稳定。
如在本申请其他部分中所讨论的,我们发现的结构型mp53的选择性在概念上也与大多数已报道的化合物不同,例如CP-31398(Foster等,1999)、PRIMA-1(Bykov等,2002)、SCH529074(Demma等,2010)、Zinc(Puca等,2011)、stictic acid(Wassman等,2013)和p53R3(Weinmann等,2008)。我们观察到的结构型mp53的选择性也具有特别高的临床价值,因为结合半胱氨酸的化合物的可成药性已经引起了激烈的争论(并且经常引起争议),原因是它们在细胞中脱靶的可能性很大(因此也具有毒性)。确实,其他人已经发现将目前对mp53拯救化合物的研究从其当前的概念验证研究转变为临床试验的主要里程碑之一,就是提高mp53的选择性(Joerger和Fersht,2016;Kaar等,2010)。与正在进行第二阶段临床试验的PRIMA-1及其类似物相比(Bauer等,2016;Joerger和Fersht,2016),而且越来越多的人认为PRIMA-1及其类似物其实靶向细胞中的氧化应激信号成分,而不是mp53,我们的PANDA试剂非常有效且针对p53。
我们在此揭示的明确拯救MOA和确定的可成药PANDA口袋将使我们和其他人能够进行超大规模筛查,以大大扩展我们的抗癌药物库并极大地加快我们抗击癌症的效率。如此处所公开的,我们确定了可以有效拯救mp53的大量含砷、锑和/或铋的化合物。我们很高兴看到某些已鉴定的砷类似物效果可能优于已临床批准的ATO。例如,尽管福勒液(KAsO2)具有明显的副作用,并且在过去的几十年中不再用于临床,但As4S4治疗APL患者与传统的静脉给予ATO一样有效,但As4S4可以方便地口服给药(Zhu等,2013)。我们确定的另一类Sb和Bi化合物,包括许多有机化合物,也具有重要的临床价值,因为已知它们对人体的毒性较小。
最后,有机的As、Sb和/或Bi化合物特别有趣。一方面,有机化合物的多样性提供了数百万种修饰选择以生成增强版的mp53拯救剂。例如,引入一个大的有机基团可能会对mp53结构产生更深远的影响,从而有助于鉴定有效的mp53抑制剂。一个具有清晰原子水平MOA的直接mp53抑制剂非常吸引人,因为现有的mp53抑制剂(HSP90抑制剂、HDAC抑制剂、RETRA、ATRA等)不能直接靶向mp53,其中一些影响许多普遍存在的细胞途径(Sabapathy和Lane,2018)。
我们在此阐述了无机和有机As、Sb和/或Bi化合物都是mp53拯救剂。此外,我们阐述了具有结合半胱氨酸或双半胱氨酸对潜力的As、Sb和/或Bi化合物也可以拯救mp53。我们还阐述了具有结合三个或更多半胱氨酸潜能的As、Sb和/或Bi化合物具有更高的拯救效率,其中一些化合物拯救后mp53与wtp53水平相当。
由于我们已经确定PANDA口袋是控制p53稳定性的开关,因此我们预测,除开As、Sb和/或Bi的化合物外,其他可与PANDA口袋结合的化合物也会对p53结构产生深远影响。这些化合物可以通过恢复野生型(或功能型)结构来拯救mp53,也可以通过扭曲mp53的致癌结构来抑制mp53。虽然前一种化合物可以发展成为mp53拯救剂,但后者作为mp53抑制剂也具有巨大价值。
使用4C筛选方法我们首次发现了许多具有显著功能的PANDA试剂,它们几乎可以将包括mp53-R175H在内的多种mp53的结构几乎完全拯救为野生型。我们进一步确定了至少31种主要的PANDA试剂(表7),包括临床药物化合物三氧化二砷(“ATO”)。因此在下文中ATO将用作示例。我们的同事先前已将ATO与全反式维甲酸(“ATRA”)组合使用,以有效靶向早幼粒细胞白血病(“PML”)中富含半胱氨酸的PML-RARα(Zhang等,2010),使早幼粒细胞白血病(“APL”)成为唯一可以通过靶向治疗彻底治愈的恶性肿瘤(Hu等,2009;Lo-Coco等,2013)。
4.附图说明
图1“4C”筛选概述。
图2曲线图展示了NCI60细胞系中ATO和KAsO2的GI50(由CellMiner检索)。Struc.:表达结构型热点突变mp53的细胞系(R175、G245、R249和R282);WT:表达wtp53的细胞系;Others:剩余的细胞系。
图3 ATO和KAsO2的羟基化和半胱氨酸反应。
图4用1μg/ml ATO或0.1μg/ml KAsO2处理转染了p53-R175H的H1299细胞2小时,裂解细胞后使用PAb1620(上图)或PAb240(中图)进行免疫沉淀(IP)。免疫沉淀的p53被免疫印迹。下图中ATO和KAsO2处理的Trp53-R172H/R172H MEFs细胞被裂解,进行PAb246 IP。检测到p53。
图5 mp53的分类。图片展示了Pymol生成的p53-DNA复合物(PDB ID:1TUP)。六个p53突变热点被标记为灰色实心球(与DNA接触:R248和R273)或黑色实心球(维持p53结构:R175、G245、R249和R282)。p53的10个半胱氨酸被标记。
图6细胞选择性。NCI60细胞系分为两类,即包含结构型热点突变mp53的和其余的。
图7化合物分析。结合多个半胱氨酸潜在化合物的实例,例如含有两个迈克尔受体基团,锑金属或两个硫醇的化合物。
图8蛋白质构象。卡通图显示了互斥的PAb1620表位和PAb240表位的位置,它们分别存在于折叠的p53和未折叠的p53上。PAb246表位特别存在于折叠的小鼠p53上,并且不与PAb1620重叠。
图9曲线图显示了NCI60细胞系中PRIMA-1和NSC319726的GI50(由CellMiner检索)。Struc.:表达结构型热点突变mp53的细胞系(R175、G245、R249和R282);Others:剩余的细胞系。
图10 ATO通过提高其Tm大大提高了mp53的稳定性。左图:通过差示扫描荧光法记录在不存在或存在ATO的情况下纯化的p53核心结构域R249S(94-293)的熔解曲线。右图:将不同浓度的ATO与5μM纯化的p53核心结构域R249S(94-293)孵育过夜。p53核心的熔解温度如图所示(平均值±标准差,n=3)。
图11 p53折叠测定,如图转染p53的H1299细胞用1μg/ml ATO处理2小时,裂解细胞后,使用PAb1620进行免疫沉淀。免疫沉淀的p53被免疫印迹。实验重复两次。p53转录活性测定,将H1299细胞与如图p53和PUMA报告基因共转染24小时,然后以1μg/ml ATO处理24小时。该图显示了ATO介导的mp53拯救谱,结果来自p53折叠测定和转录活性测定。X轴:PAb1620IP效率;Y轴:PUMA荧光素酶报告信号。空心圆:未经ATO处理;实心圆:经ATO处理。
图12纯化的重组p53(94-293)-R249S用DMSO(左图)或ATO(右图)以1:5摩尔比处理过夜,然后进行MS分析以测定分子量。光谱图像显示了在天然变性条件下纯化蛋白的去卷积光谱。
图13上图,用4μg/ml生物素-As处理转染了所示mp53的H1299细胞2小时,裂解细胞后,使用链霉亲和素珠进行拉下实验。检测到p53。下图,用4μg/ml Biotin-As处理了所示p53-R175H或wtp53质粒转染的H1299细胞2小时,裂解细胞后,使用链霉亲和素珠进行拉下实验,检测到p53。
图14将表达p53(94-293)-R249S的细菌与AsI3孵育,然后纯化PANDA复合物(另请参见图18)以进行结晶(左图)。将p53(94-293)-R249S晶体用2mM EDTA和2mM ATO浸泡19小时(右图)。PANDA的3D结构由Pymol生成。如图展示C124、C135和C141以及结合的砷原子。
图15砷原子穿过L1-S2-S3口袋进入PANDA半胱氨酸三联体。左图:现有的mp53拯救化合物只有在L1-S2-S3口袋打开时才能进入。右图:砷原子比任何报道的mp53拯救化合物都要小一个或两个数量级(报道化合物大小的约1/10–1/100)。所以即使关闭,它也可以随时自由进入L1-S2-S3口袋。此外,砷原子是如此之小,以至于它可以自由地穿过L1-S2-S3口袋,并进一步进入PANDA半胱氨酸三联体,这是一个很小的口袋,只能容纳一个原子。在PANDA半胱氨酸三联体中,砷原子起着高效PANDA试剂的作用。
图16 Pymol生成的p53(PDBID:1TUP)和PANDA的3D示意图。左图为六个p53突变热点,显示为灰色实心球(与DNA接触:R248和R273)或黑色实心球(维持p53结构:R175、G245、R249和R282)。PANDA半胱氨酸(C124、C135和C141)已被标记。中图,选择了六个p53突变热点和DNA进行展示。右图是PANDA,其中R248残基拿着竹子,而另一个R282残基吃竹子。PANDA口袋可视为熊猫幼崽的后颈,当母亲抓住后颈的失活,可以稳定幼崽。
图17纯化的重组p53(94-293)-R249S用所示化合物以1:5摩尔比处理过夜,然后进行MS分析以测定分子量。质谱图显示了天然变性条件下纯化蛋白的去卷积谱。
图18上图,PANDA的3D结构显示为带状。PANDA半胱氨酸三联体和砷原子显示为球形,PANDA口袋显示为深色。中图,PANDA的3D结构显示为球形。PANDA口袋显示为深色。下图是PANDA口袋的残基。
图19左图,将指示的p53突变p53-G245S质粒和PUMA报告基因或PIG3报告基因共转染H1299细胞24小时。柱形图显示了带有指定第二位点上抑制型突变的p53-G245S的转录活性(平均值±标准差,n=3)。右图,向上箭头和向下箭头显示左图中测试的突变位置。向上箭头(S116和Q136):可拯救p53-G245S的突变;向下箭头:无法拯救p53-G245S的突变。
图20 ATO强烈促进未折叠的p53正确折叠。左图展示了wtp53和mp53转染的H1299细胞用1μg/ml ATO处理2小时,裂解细胞,使用PAb1620进行免疫沉淀(IP)。免疫沉淀的p53被免疫印迹。右图展示了PAb1620相对IP效率,无ATO时wtp53的PAb1620 IP效率设为100%。
图21 ATO有效且正确地折叠mp53。左图,用图示试剂处理转染了p53-R175H的H1299细胞过夜,裂解细胞,使用PAb1620 IP。右图展示了与DMSO组相比,PAb1620 IP效率的标准化变化。
图22 ATO有效地重新折叠mp53。将表达内源性p53-R175H的Detroit 562细胞用CHX如图预处理。然后用1μg/ml ATO处理2小时,再用PAb1620进行IP。卡通图形图示了p53-R175H在正确折叠、展开和聚集状态之间的平衡。
图23 1stM1D ATO有效且正确地折叠mp53。用0、0.2、0.5和1μg/ml ATO处理用wtp53和p53-R175H转染的Saos-2细胞24小时。将细胞在4℃或37℃的CHAPS缓冲液中裂解15分钟,然后进行非变性PAGE和免疫印迹。
图24 ATO有效且正确地折叠mp53。wtp53和所示mp53转染的H1299细胞用0或1μg/ml ATO处理2小时,然后用PAB1620进行IP。
图25左上图,在指定条件下用ATO处理表达p53-R175H的H1299细胞,然后用PAb1620进行IP。左中图:Trp53+/+MEF(用10μM Nutlin3处理过夜以诱导高水平的p53),Trp53-R172H/R172H MEFs用1μg/ml ATO处理2小时,然后用PAb246进行IP。用CM5抗体检测p53。左下图,表达p53-R175H的H1299细胞用1μg/ml ATO处理2小时,然后用PAb240进行IP。右图,在指定条件下用ATO处理表达多种mp53的细胞,然后用PAb1620进行IP(MEF为PAb246)。
图26用图示试剂处理转染了p53-R175H的H1299细胞过夜,裂解细胞,然后用PAb1620 IP。
图27 Trp53+/+MEF(用10μM Nutlin3处理过夜以诱导高水平的p53),将Trp53-R172H/R172H MEF用指示浓度的ATO处理2小时,然后用PAb246 IP。
图28将表达IPTG可诱导的GST-p53-R175H的细菌与IPTG及所示化合物一起培养。将细菌裂解在NP40缓冲液中,然后使用PAb1620进行IP。GST-p53-R175H通过GST抗体被免疫印迹。
图29按指示用CHX处理表达内源性wtp53的MCF7细胞,检测p53。
图30将表达p53-R175H的H1299细胞用DMSO或50μg/ml CHX预处理0.5小时,再用ATO处理细胞,然后用PAb1620 IP。
图31按指示用ATO处理wtp53和p53-R175H转染的Saos-2细胞。在4℃M-
PER缓冲液中裂解细胞,然后进行非变性PAGE和蛋白印迹。
图32 Pymol生成的p53-DNA复合物(PDB ID:1TUP)。展示了3个半胱氨酸簇(C135/C141、C238/C242、C275/C277)和与R175相邻的C176。
图33砷直接与p53结合形成PANDA。(A)用4μg/ml生物素-As处理转染了指定wtp53或mp53的H1299细胞2小时,裂解细胞,然后使用抗生蛋白链菌素珠进行pull-down实验,检测p53。(B)将指示的细胞系用4μg/ml生物素-As处理2小时,裂解细胞,然后使用抗生蛋白链菌素珠进行pull-down实验。(C)将纯化的重组GST-p53-R175H与所示浓度的生物素-As或生物素一起孵育。将混合物分成三个等分试样,并进行变性蛋白质电泳(SDS-PAGE),然后进行考马斯亮蓝(Coomassie bule)染色,使用DO1抗体检测p53或使用抗生物素抗体检测生物。(D)p53(62-292)(上图)和p53(91-292)-R175H(下图)分别用100μM ZnSO4和10μM ATO在细菌中处理表达。纯化后,对重组蛋白进行MS分析,以测定分子量。质谱图展示了在天然或变性条件下纯化的重组蛋白的去卷积光谱。
图34表格显示了分别用100μM ZnSO4和50μM ATO处理表达重组p53(62-292)和p53(91-292)-R175H的细菌,纯化后蛋白的分子量(Mw)。应用天然和变性MS确定Mw。
图35表格总结了通过电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)测定的标准As2O3溶液和重组PANDA-R175H溶液中的砷含量。
图36 PANDA恢复了DNA结合能力。将表达p53-R175H的H1299细胞用图示的试剂处理过夜,裂解细胞,然后在10pM生物素化双链DNA存在的情况下使用链霉亲和素珠进行pull-down实验。p53-R175H被免疫印迹检测。
图37 PANDA重获转录活性。
图38 PANDA恢复DNA结合能力和p53转录活性。上图,使用或不使用强力霉素(“Dox”)预处理强力霉素条件性调控关闭的p53-R175H的H1299细胞48小时,然后在指定的时间内用1μg/ml ATO处理。通过qPCR确定所指示p53靶标的mRNA水平。作为对照,Nutlin被用于处理表达HCT116的wtp53。下图用1μg/ml ATO处理表达内源性p53-R249S的BT549细胞指定时间。通过qPCR确定指示p53靶标的mRNA水平。
图39 PANDA上调p53靶蛋白的水平。将强力霉素条件性调控关闭的p53-R175H的H1299细胞使用或不使用强力霉素(Dox)预处理48小时,然后用0.2μg/ml ATO处理48小时,测定p53靶标的蛋白质水平。
图40如指示用ATO处理表达内源性p53-R175H的Detroit 562细胞,然后进行p53免疫印迹。
图41将H1299细胞与p53-G245S和PIG3报告基因(左图)或p53-R282W和PUMA报告基因(右图)共转染24小时,然后用图示试剂处理24小时。柱形图展示了荧光素酶信号的标准化变化(平均值±标准差,n=3)。
图42指示mp53转染的HCT116细胞用1μg/ml ATO处理48小时。测定PUMA的蛋白质水平。
图43按指示用ATO处理表达内源性p53-R175H的CEM-C1细胞,然后进行p53免疫印迹。
图44 PANDA介导的肿瘤抑制。使用或不使用强力霉素(DOX)预处理强力霉素条件性调控关闭的p53-R175H的H1299细胞48小时,用ATO处理48小时,然后进行MTT细胞活力测定(左图)和克隆形成测定(右图)(平均值±标准差,n=3,*p<0.05)。
图45 PANDA介导的肿瘤抑制。在48小时ATO(左图)或Nutlin(右图)处理后10个细胞系的细胞活力(数值显示三个独立实验的平均值)。
图46 PANDA介导的肿瘤抑制。曲线图显示了NCI60细胞系ATO和Nutlin3的GI50(由CellMiner检索)(*p<0.05)。Struc.:R175、G245、R249和R282上的热点突变。Null:截短p53、移码p53和不含p53。Contact:R248和R273上的热点突变。通过IARC TP53数据库编辑p53状态。
图47 PANDA介导的肿瘤抑制。将强力霉素条件性调控关闭的p53-R175H的H1299细胞皮下注射到裸鼠的腹侧。当肿瘤面积达到0.1cm(第1天)时,每周连续6天腹膜内注射5mg/kg ATO。在DOX组中,饮用水中含有0.2mg/ml DOX。每3天重复测量一次肿瘤大小(左图)。在第28天处死小鼠,称重分离的肿瘤,然后进行p53 IHC染色(右图,刻度尺=50μm)。图片展示平均值±SEM(*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,n=4/组)。
图48 PANDA介导的肿瘤抑制。通过尾静脉将CEM-C1细胞注射到NOD/SCID小鼠中。从第7天到第26天,每3或4天从小鼠眶后窦获得外周血(PB)样品。CEM-C1(hCD45+)阳性细胞在PB中达到0.1%(第23天)后,用载体(n=6)或ATO(5mg/kg,n=7)静脉注射,每周连续6天。上图,第16、22和26天PB中mCD45+和hCD45+细胞的百分比。下图,对照或治疗小鼠的Mantel-Cox生存曲线。
图49将表达p53-R172H/R172H或不含p53的MEF用ATO处理48小时,然后进行细胞活力测定(左图)和克隆形成测定(右图)(平均值±标准差,n=3,*p<0.05)。
图50曲线图展示了NCI60细胞系PRIMA-1和NSC319726的GI50(由CellMiner检索)。Struc.:R175、G245、R249和R282上的热点突变。Null:截断p53、移码p53和不含p53。Contact:R248和R273上的热点突变。通过IARC TP53数据库编辑p53状态。
图51在不存在(左图)或存在(右图)1μg/ml的ATO处理下,H1299细胞(不含p53),表达p53-R175H的H1299细胞或表达wtp53(DOX诱导wtp53表达)并用Nutlin处理的H1299细胞的细胞活力(平均值±标准差,n=3,*p<0.05)。
图52如图47中所述,在第28天分离的肿瘤中测定了p53-R175H蛋白水平。
图53如图47所示,在第28天分离出肿瘤。将分离出的肿瘤固定并包埋在石蜡中,然后进行H&E染色(S4E,刻度尺=200μm),展示了代表性图像。
图54如图47所示,在第28天分离出肿瘤。将分离出的肿瘤固定并包埋在石蜡中,然后用DO1抗体(S4F,刻度尺=200μm)对p53进行IHC染色,展示了代表性图像。
图55第16、22和26天,PB中mCD45+和hCD45+细胞的百分比,如图48所示。
图56 ATO和DNA损伤剂组合处理癌细胞。在不存在ATO(p53-R175H组)或存在ATO(PANDA-R175H组)的情况下,用指定的化学治疗剂处理强力霉素条件性调控关闭的p53-R175H的H1299细胞12小时。检测指示的蛋白。柱形图展示了所检测蛋白质的相对水平。CIS:顺铂;ETO:依托泊苷;ADM:阿霉素(阿霉素)。
图57使用ATO和DNA损伤剂治疗AML.MDS病人试验。招募了50个AML/MDS病人用于基于p53突变的精确试验。携带ATO可拯救mp53的两名患者和携带治疗相关性mp53的一名患者接受一线药物地他滨联合ATO的治疗。
图58 ATO可以拯救一批S241突变的mp53。用指定mp53转染H1299细胞并用ATO处理,然后用PAb1620 IP(上图)和蛋白质水平测定(下图)。
图59 ATO拯救mp53结构及诱导PUMA和p21的潜力总结。
图60左图,在没有ATO的情况下(p53-R175H图)或在有ATO的情况下(PANDA-R175H图),用指示的化学治疗剂处理强力霉素条件性调控关闭的p53-R175H的H1299细胞12小时。检测指示的蛋白质。在mp53关闭组中,用Dox预处理细胞48小时以删除p53-R175H。柱形图展示了所检测蛋白质的相对水平。CIS:顺铂;ETO:依托泊苷;ADM:阿霉素(阿霉素);5-FU:5-氟尿嘧啶;ARA:阿糖胞苷;AZA:阿扎胞苷;DAC:地西他滨;
TAX:紫杉醇。右图,将上述细胞裂解物用CIP预处理以使细胞蛋白脱磷酸。检测指示的蛋白质。
图61将H1299细胞用指定的mp53转染并用ATO处理,然后用PAb1620 IP(上图)和蛋白质水平测定(下图)。
图62 H1299细胞用指定的mp53转染,并先后用ATO和PAb1620 IP处理。
图63卡通图比较了本申请中描述的先前报道的计算机建模的已知化合物与PANDA试剂的比较。左图,一些先前报道的化合物在计算机上预测会结合C124(位于PANDA口袋上的残基),但这些化合物无法有效拯救mp53。这些化合物与C124之间的结合需要通过实验确定。中图,在我们的PANDA共晶体中,发现As原子与PANDA半胱氨酸三联体紧密结合并稳定了mp53,随后有效地拯救了mp53。如果是5价砷,则R1和R2可以位于PANDA半胱氨酸三联体之外。右图,在当前申请中,PANDA试剂紧密结合PANDA口袋中的一个或多个残基,稳定mp53,然后有效地拯救mp53。
图64 PANDA试剂的示例性反应。具有能够结合第一半胱氨酸(C1)和/或第二半胱氨酸(C2)和/或第三半胱氨酸(C3)的能力的X基团的化合物与一个或多个PANDA半胱氨酸结合。C1、C2和C3的实例包括O、S、Cl、F、I、Br、OH和H。C1、C2和/或C3可以彼此结合。X基团包括金属,例如铋;准金属,例如砷和锑;基团,例如迈克尔受体和/或硫醇;和/或具有半胱氨酸结合能力的任何类似物。PANDA试剂在与p53形成PANDA并结合之前可以先进行水解。在某些实施例中,当基团不能进行水解,因而不能与半胱氨酸结合时,具有半胱氨酸结合潜能的其余基团与p53结合。R1和R2代表绑定到X的任何基团。R1和/或R2也可以为空。
图65具有结合三半胱氨酸潜力的PANDA试剂的示例性反应。三价ATO发生水解,与p53上的三个PANDA半胱氨酸共价结合。
图66具有结合三半胱氨酸潜力的PANDA试剂的示例性反应。五价砷化合物水解时,共价结合于p53上的三个PANDA半胱氨酸。
图67具有结合双半胱氨酸潜力的PANDA试剂的示例性反应。PANDA试剂可与PANDA半胱氨酸(Cys124,Cys135或Cys141),或Cys275,Cys277氨基酸对,或C238,C242氨基酸对结合。
图68具有结合单半胱氨酸潜力的PANDA试剂的示例性反应。PANDA试剂可以结合PANDA口袋上的PANDA半胱氨酸(即Cys124、Cys135或Cys141)或其他3个半胱氨酸(Cys238、Cys275或Cys277)。
图69挑选的人TP53变构体。
图70 ATO通过提高熔解温度极大地提高了mp53的稳定性。图A展示了通过示差扫描荧光法在pH 7.5HEPES缓冲液中以指定的ATO比例所记录的纯化p53核心结构域R175H(94-293)(“p53C”)的解链曲线。B图展示将纯化的重组p53C(p53C-WT、p53C-R175H、p53C-G245S、p53C-R249S和p53C-R282W,每个反应5μM)与ATO以指定比例在pH 7.5HEPES缓冲液中混合过夜。通过DSF测定在pH 7.5HEPES缓冲液中测量p53C的熔解曲线。在pH 7.5HEPES缓冲液中,p53C-R175H、p53C-G245S、p53C-R249S和p53C-R282W的表观Tm最高可提高1.1-6.5℃。展示了p53核心的熔解温度(平均值±标准差,n=3)。图C展示了在pH 7.5HEPES,150mMNaCl缓冲液中以指示的ATO比例通过差示扫描荧光法记录的纯化的p53核心结构域R175H(94-293)的熔解曲线。D图展示了将纯化的重组p53C(p53C-WT、p53C-R175H、p53C-G245S、p53C-R249S和p53C-R282W,每个反应5μM)与ATO以指定比例在pH 7.5HEPES,150mM NaCl中混合过夜。通过DSF测定在pH 7.5HEPES,150mM NaCl缓冲液中测量p53C的熔解曲线。在pH7.5HEPES,150mM NaCl缓冲液中,p53C-R175H、p53C-G245S、p53C-R249S和p53C-R282W的表观Tm最高可升高1.0-5.1℃。显示了p53核的熔解温度(平均值±标准差,n=3)。图E展示了在pH7.5HEPES缓冲液中以指示的ATO比例通过差示扫描荧光法记录纯化的p53核心结构域(p53C-WT、p53C-G245S、p53C-R249S和p53C-R282W)的解链曲线。图F展示了在pH 7.5HEPES,150mM NaCl缓冲液中以指示的ATO比例通过示差扫描荧光法记录的纯化的p53核心结构域(p53C-WT、p53C-G245S、p53C-R249S和p53C-R282W)的熔解曲线。
图71PANDA恢复了大多数p53靶基因的转录活性。用1μg/ml ATO处理用wtp53、p53-R273H或p53-R282W转染的Saos-2细胞24小时。通过RNA测序确定p53靶标的表达水平。图A展示了一组116个报道的p53激活靶标的倍数变化值(所示样品组与载体)的热图。B图展示了一组127个报道的p53靶标的倍数变化值的热图。灰度代表倍数变化。“vec”指空白载体。
5.详细描述
5.1解释和定义
除非另有说明,否则本说明将采用常规化学、生物化学、分子生物学、遗传学和药理学方法以及对本领域技术人员而言具有普通含义的术语。本文引用的所有出版物、参考文献、专利和专利申请均通过引用全文并入本文。
本文所用生物学样品对应于从个体获取的任何样品,并包括组织样品和流体样品,例如血液、淋巴液或间质液及其组合等。
本说明和所附权利要求书中所使用的,适用以下一般规则。除非内容清楚地另外指出,否则单数形式“一个”,“一种”和“该”包括复数形式。基因和蛋白质的通用命名规则也适用,即基因用斜体或下划线表示(例如:TP53或TP53),而基因产物(例如蛋白质和肽)则用标准字体显示,而不用斜体或下划线表示(例如:p53)。氨基酸位置命名的一般规则也适用,即氨基酸缩写后跟数字(例如:R175,R 175,R-175),其中氨基酸名称由缩写表示(例如:精氨酸以“R”,“arg”,“Arg”表示),蛋白质或肽上氨基酸的位置由数字表示(例如:位置175为175)。突变命名的一般规则也适用,例如R175H表示位置175处的精氨酸被组氨酸取代,再例如,p53的175位氨基酸从R到H的上的突变可以由例如“p53-R175H”或“mp53-R175H”表示。除非另有说明,否则任何氨基酸位置均对应于野生型p53,优选如7.24节中所列的人wtp53变构体“a”上的氨基酸位置。生物分类的通用命名规则也适用,即顺序、科目、属和种名用斜体表示。
本文所用以下术语应具有规定的含义。除非另有说明,否则术语“约”具有本领域技术人员应理解的“约”的普通和普通含义,并且通常为正负20%。术语“包含”、“包含有”、“含有”、“含有的”、“包括”、“包括有”、“包括但不限于”,或“其特征在于”是包括性的或开放性的,并且不排除其他未引用的元素。
本文中下列术语具有特定含义:
“诊断”是指识别特定疾病的任何方法,尤其包括检测疾病的症状,评估疾病的严重性,确定疾病的阶段以及监测疾病的进展。
“表达”或“表达水平”是指基因标记编码的mRNA或蛋白质的水平。
“预后”是指确定疾病的可能病程的任何方法,并且除其他外包括确定疾病的易感性,确定疾病发作的可能性,评估疾病的可能严重程度,确定疾病的各个可能阶段,并预测疾病的可能进展。
“有效治疗的筛选”是指用于治疗某些疾病的有效治疗产品或方法的筛选。它可以涉及体外和/或体外筛选方法,尤其包括治疗疾病的产品或组合物以及制备用于治疗的组合物的方法。
“个体”是指任何生物。它包括动物,包括脊椎动物,还包括哺乳动物,例如人。它还包括任何未出生的孩子和任意两个父母的未怀孕的假想孩子。
“治疗”是指向患有某种疾病的个体施用和/或应用治疗产品或方法,包括监测某一针对该疾病的治疗的功效。
“PANDA”指由一个或多个p53蛋白和一个或多个PANDA试剂组成的复合物。
“PANDA试剂”指一类具有一个或多个有用特征的能够结合到PANDA口袋的物质,这种有用特征的例子包括:(a)可以导致正确折叠的p53含量大量增加,优选比PRIMA-1引起的增加至少高3倍,更优选比PRIMA-1引起的增加至少高5倍,进一步优选比PRIMA-1引起的增加至少高10倍,更进一步优选比PRIMA-1引起的增加至少高100倍;(b)可显著促进p53的转录功能,优选比PRIMA-1引起的促进至少高3倍,更优选比PRIMA-1引起的促进至少高5倍,进一步优选比PRIMA-1引起的促进至少高10倍,更进一步优选比PRIMA-1引起的促进至少高100倍;(c)可显著促进p53蛋白的稳定,例如增加p53 Tm,优选比PRIMA-1引起的增加至少高3倍,更优选比PRIMA-1引起的增加至少高5倍,进一步优选比PRIMA-1引起的增加至少高10倍,更进一步优选比PRIMA-1引起的增加至少高100倍。在优选实施例中,PANDA试剂具有两个或更多个有用特征。在更优选实施例中,PANDA试剂具有三个或更多个有用特征。PANDA试剂示例是ATO及其类似物。表1-表7中提供了更多示例性PANDA试剂。
“PANDA口袋”本质上指由一个正确折叠的PANDA半胱氨酸构成的约的区域,这个区域包括与一个或多个正确折叠的PANDA半胱氨酸相邻及接触的所有氨基酸和所有PANDA半胱氨酸。可以在图14,图18,附录A和附录B中找到PANDA口袋的示例3D结构。例如,PANDA口袋可以包括所有上述氨基酸,上述氨基酸的子集,以及所有能使PANDA口袋的三级结构具有本申请中所述的一种或多种有用特征的其他氨基酸。因此,PANDA口袋可以包含或基本上由上述氨基酸或其子集组成。
“PANDA核心”指PANDA口袋和PANDA试剂之间形成至少一个紧密的连接时,在p53的PANDA口袋上形成的三级结构。
“PANDA半胱氨酸”是指对应于wtp53上124位半胱氨酸(“C124”或“cys124”)、135位半胱氨酸(“C135”或“cys135”)和141位半胱氨酸(“C141”或“cys141”)(统称为“PANDA半胱氨酸三联体”)。
“p53”指任何野生型p53(“wtp53”),包括所有天然和人工p53;任何突变的p53(“mp53”),包括所有天然和人工p53;或其组合。
“wtp53”指通常被认为野生型或具有野生型序列的所有野生型p53,包括任何通常可接受的变异,例如由单核苷酸多态性(“SNP”)引起的变异。示例wtp53可以在图64-68中找到。
“SNP”指单核苷酸多态性,是在基因组中特定位置处发生的单个核苷酸中的变异,其中每个变异在种群中以一定程度的呈现。表8列出了已知SNP的示例。
“mp53”指突变的p53,包括不是wtp53的所有p53和类似大分子的p53。mp53包括人工mp53,例如重组p53、嵌合p53、p53衍生物、融合p53、p53片段和p53肽。示例性mp53包含一个或多个对应于wtp53上R175、G245、R248、R249、R273、R282、C176、H179、Y220、P278、V143、I232和F270的突变。示例性mp53突变包括R175H、G245D/S、R248Q/W、R249S、R273C/H、R282W、C176F、H179R、Y220C、P278S、V143A、I232T和F270C突变。
“mp53热点突变”指发生在mp53上R175、G245、R248、R249、R273或R282的突变。
“热点mp53”指携带至少一个mp53热点突变的mp53,即R175、G245、R248、R249、R273、R282和以上组合。
“生物系统”指包含p53途径和相关蛋白质的细胞、细菌和人工系统。
“p53抑制蛋白”指抑制p53活性功能的蛋白,例如MDM2、p53凋亡刺激蛋白抑制剂(“iASPP”)和sirtuin-1(“SIRT1”)。
“结合型mp53”是指失去DNA结合能力但不会显著影响p53结构的mp53,例如p53-R273H、p53-R273C、p53-R248Q和p53-R248W。
“结构型mp53”是指与wtp53相比,三维结构明显被破坏的mp53,例如p53-R175H、p53-G245D、p53-G245S、p53-R249S和p53-R282W。
“有用的特征”指相对wtp53能够且有效地拯救mp53结构、转录活性、细胞生长抑制、肿瘤抑制功能中至少一种的能力。示例有用的特征包括:(a)可以导致正确折叠的p53含量大量增加,优选比PRIMA-1引起的增加至少高3倍,更优选比PRIMA-1引起的增加至少高5倍,进一步优选比PRIMA-1引起的增加至少高10倍,更进一步优选比PRIMA-1引起的增加至少高100倍;(b)可显著促进p53的转录功能,优选比PRIMA-1引起的促进至少高3倍,更优选比PRIMA-1引起的促进至少高5倍,进一步优选比PRIMA-1引起的促进至少高10倍,更进一步优选于比PRIMA-1引起的促进至少高100倍;(c)可显著促进p53蛋白的稳定,例如增加p53Tm,优选比PRIMA-1引起的增加至少高3倍,更优选比PRIMA-1引起的增加至少高5倍,进一步优选比PRIMA-1引起的增加至少高10倍,更进一步优选比PRIMA-1引起的增加至少高100倍。在优选实施例中,PANDA试剂具有两个或更多个有用特征。在更优选实施例中,PANDA试剂具有三个或更多个有用特征。
根据领域内普通人员的理解,“DTP”是指美国的治疗研发项目(DevelopmentalTherapeutics Program)。
“ATO”或“As2O3”指三氧化二砷和一般被当做三氧化二砷的化合物。
“类似物”指通过例如简单反应或取代原始化合物的原子、部分或官能团而改变原始化合物的化学结构而获得的新化合物。此类类似物可涉及一个或多个原子、基团或官能团的插入、缺失或取代,而不从根本上改变原始化合物的基本支架。此类原子、部分或官能团的实例包括但不限于甲基、乙基、丙基、丁基、羟基、酯、醚、酰基、烷基、羧基、卤化物、酮基、羰基、醛、烯基、叠氮化物、苄基、氟、甲酰基、酰胺、酰亚胺、苯基、腈、甲氧基、磷酸酯、磷酸二酯、乙烯基、硫醇、硫化物或亚砜原子、基团或官能团。由原始化合物产生化学类似物的许多方法是本领域已知的。
“有效治疗剂量”指有效预防、减轻或改善疾病症状或延长被治疗对象的存活率的化合物的量。有效治疗剂量的确定在本领域技术人员的能力范围内,尤其是根据本文提供的详细公开内容。体内使用的化合物的有效剂量、水平或量可以由本领域技术人员根据待治疗的疾病、个体患者的状况、给药部位、治疗方法、给药化合物的效价、生物利用度和代谢特征及其他因素来确定。
“有效地”指对有用特征的增强,例如拯救一种或多种wtp53的结构或功能,拯救一种或多种wtp53的转录活性,细胞生长抑制活性,抑制肿瘤的功能,一般表示与PRIMA-1相比有用特性提高了3倍以上,优选为5倍,更优选为10倍,进一步优选为100倍。例如,有效的增强指将mp53的Tm增强为PRIMA-1产生效果的3-100倍,和/或将mp53折叠为PRIMA-1产生效果的3-100倍,和/或刺激mp53的转录活性为PRIMA-1产生效果的3-100倍。
p53异常的疾病的例子包括癌症,例如肺癌、乳腺癌、结肠直肠癌、卵巢癌和胰腺癌;肿瘤,衰老、发育疾病、加速老化、免疫疾病。
5.2是细胞生物学中最重要的蛋白之一
p53是细胞生物学中最重要的蛋白质之一。53千道尔顿的p53蛋白显然是转录因子。野生型p53(wtp53)具有已鉴定的序列(参见公共基因库,例如gene bank、proteinbank、Uniport;另请参见第7.25节)。示例wtp53序列在第7.25节中列出。除非另有说明,否则本申请使用第7.25节中列出的人p53亚型“a”的wtp53序列。
人类wtp53具有4×393个氨基酸的同型四聚体的活性,具有多个域,包括内在无序的N末端反式激活域(“TAD”),脯氨酸富集域(“PRD”),结构化的DNA结合域(“DBD”),经由柔性接头连接的四聚结构域(“TET”),以及固有无序的C末端调节域(“CTD”)。存在许多表达多种变构型的p53家族基因,并且经常表现出拮抗作用。
Wtp53在细胞中起中枢作用,并且常被认为是最重要的肿瘤抑制子。在细胞受到压力(例如DNA损伤或致癌压力)后,p53被激活并转录调节一批基因(例如Apaf1、Bax、Fas、Dr5、mir-34、Noxa、TP53AIP1、Perp、Pidd、Pig3、Puma、Siva、YWHAZ、Btg2、Cdkn1a、Gadd45a、mir-34a、mir-34b/34c、Prl3、Ptprv、Reprimo、Pai1、Pml、Ddb2、Ercc5、Fancc、Gadd45a、Ku86、Mgmt、Mlh1、Msh2、P53r2、Polk、Xpc、Adora2b、Aldh4、Gamt、Gls2、Gpx1、Lpin1、Parkin、Prkab1、Prkab2、Pten、Sco1、Sesn1、Sesn2、Tigar、Tp53inp1、Tsc2、Atg10、Atg2b、Atg4a、Atg4c、Atg7、Ctsd、Ddit4、Dram1、Foxo3、Laptm4a、Lkb1、Pik3r3、Prkag2、Puma、Tpp1、Tsc2、Ulk1、Ulk2、Uvrag、Vamp4、Vmp1、Bai1、Cx3cl1、Icam1、Irf5、Irf9、Isg15、Maspin、Mcp1、Ncf2、Pai1、Tlr1–Tlr10、Tsp1、Ulbp1、Ulbp2、mir-34a、mir-200c、mir-145、mir-34a、mir-34b/34c和Notch1)触发细胞周期停滞,DNA修复,凋亡,细胞修复,细胞死亡等。除抗癌作用外,p53靶基因在衰老,血管生成和自噬,连接,调节氧化应激,调节代谢稳态,干细胞维持等方面也具有重要作用。
wtp53的突变具有广泛的意义。p53蛋白是一种强大的肿瘤抑制因子,在几乎一半人类癌症中p53蛋白均因突变而失活。wtp53的突变可能具有广泛的意义。首先,突变导致的p53蛋白,突变体p53(“mp53”)将基本上失去其肿瘤抑制功能。表达mp53的小鼠和人类在发病初期会发展成多种癌症。其次,一些mp53还将获得致癌特性,例如促进癌症转移,给予对治疗的抵抗力以及使癌症患者复发。
由此了解p53,更重要的是,实现mp53的结构和功能恢复是现代细胞生物学、医学和癌症研究的圣杯。p53是在癌症、医学和生物学中研究最活跃的蛋白质。此外,对p53的研究远远超出了对第二活跃蛋白质——TNF所进行研究的60%,并且超过了第三活跃蛋白质——EGFR所进行研究的80%(Dolgin,2017)。自2001年以来,p53一直是研究最活跃的蛋白质,远远超过其他蛋白质。原因之一是p53是癌症中最常见的突变蛋白,远远超过其他癌症突变(Kandoth等,2013)。
5.3 p53和癌症
在所有人类肿瘤中,大约一半具有部分功能性但沉默的wtp53,而另一半则携带突变型p53(Vogelstein等,2000)。小鼠研究表明,wtp53功能恢复可以完全或部分消退肿瘤生长(Feldser等,2010;Martins等,2006;Ventura等,2007;Xue等,2007)。
目前大多数恢复wtp53功能的努力都集中在p53抑制蛋白(“PIP”)上,包括MDM2、p53凋亡刺激蛋白抑制剂(“iASPP”)和sirtuin-1(“SIRT1”)。例如,由于MDM2的扩增或抑制蛋白p14ARF的缺失分别与肉瘤和胶质母细胞瘤密切相关(参阅TCGA数据库)(Gao等),因此已确定MDM2抑制化合物Nutlin可抵消MDM2的活性(Vassilev等,2004)。再例如,我们已报道了iASPP暴露了RaDAR核定位代码(Lu等,2014),进入细胞核(Lu等,2016a),并抑制了转移性黑素瘤中的wtp53(Lu等,2013),因此我们正在研究抑制iASPP的化合物。许多抗PIP化合物都是高效的,具有明确的作用机理(“MOA”),并且正在进行临床研究(Khoo等,2014)。
有研究人员正试图靶向mp53,该蛋白不仅失去其肿瘤抑制功能,而且经常获得致癌特性,这种方法虽然有吸引力,但并不容易实现。
仅将wtp53引入表达mp53的细胞是有问题的,因为mp53是显性抑制的,如在基于小鼠模型的研究中所见,mp53可以抑制引入的外源wtp53的作用(Wang等,2011)。
通过阻断mp53上游途径、下游途径或相关途径来选择性抑制mp53表达细胞也是有问题的。mp53上游抑制剂辛二氢氧肟酸(“SAHA”)可以抑制mp53上游组蛋白脱乙酰基酶(“HDAC”),从而促进mp53降解(Li等,2011);mp53下游抑制剂他汀类药物(一种胆固醇抑制剂)可阻断mp53下游甲羟戊酸途径,从而降低mp53表达细胞的存活率(Parrales等,2016);并且某些激酶抑制剂可以通过干扰mp53相关的受体酪氨酸激酶信号传导的激活来选择性抑制mp53表达的细胞,从而通过阻断整联蛋白再循环来抑制细胞的侵袭(Muller等,2009),以上策略都显示出了希望,但都无法恢复mp53的肿瘤抑制功能。因此,尚不清楚这些策略是否足以长期临床治疗癌症(Muller和Vousden,2014)。小鼠研究确实表明,消除mp53只会将表达mp53的动物的存活率提高到p53-/-(不含p53)的水平(Alexandrova等,2015)。
5.4拯救mp53的承诺和挑战
据1993年报道,mp53的肿瘤抑制功能是可以拯救的(Halazonetis和Kandil,1993;Hupp等,1993)。从那时起,确定一种有效且高效的mp53特异性拯救剂一直是癌症生物学和医学的圣杯。的确,仅2017年mp53患者的直接医疗费用就约为650亿美元。通过成功地找到一种高效且有效的mp53拯救剂,申请人试图解决mp53患者及其家人所面临的巨大财务、身体和情感上的困难。
尽管已有无数不同规模的筛选工作,但仍没有有效的mp53拯救剂。部分原因是拯救mp53的抑癌功能(Joerger和Fersht,2016;Muller和Vousden,2013,2014)极具挑战性(Joerger和Fersht,2016;Muller和Vousden,2013,2014)(Bykov等,2017)(Sabapathy和Lane,2018)。实际上,这可能是我们这一代面临的最困难的科学问题之一。要成功拯救mp53,拯救剂要做的不仅是简单地抑制或破坏mp53的特定功能,还必须修复或拯救mp53的野生型功能。
毫无疑问,拯救比破坏更具挑战性。可以理解,80多种临床批准的靶向药物中绝大多数是癌蛋白抑制剂,它们都无法拯救肿瘤抑制子的功能。
为了增加挑战,mp53表面如RAS一样没有明显的可成药的口袋(Joerger andFersht,2016)。因此尽管在过去20年中已报告了超过15个mp53候选拯救剂,至今已吸引了数千万甚至数亿美元的投资,但只有一个候选拯救剂(PRIMA-1/APR-246)进入了临床试验。即使在15个已报道的mp53候选拯救基因中,几乎都没有可检测到的功效,其中结构拯救的增加少于2倍,转录拯救的增加不到2倍。相比之下,完全拯救的p53-R175H大约是结构拯救的100倍,再如完全拯救的p53-282是功能拯救的20倍。另外这些拯救剂的MOA在很大程度上是未知的(Bykov等,2017)(Sabapathy和Lane,2018)。由于这些不利的结果且没有明确的MOA,这些候选拯救剂用于癌症治疗的用途非常有限。
因此,申请人已经优先选择一种高效且有效的拯救剂,其以清晰的MOA直接拯救mp53。
5.4.1体外筛选鉴定的mp53拯救剂不理想
最初筛选mp53拯救剂主要基于体外的mp53重组蛋白,包括CP-31398,因促进重组mp53稳定性而被鉴定(Foster等,1999);SCH529074和p53R3,因其改善了重组mp53与DNA的结合而被鉴定(Demma等,2010;Weinmann等,2008)。但这些拯救剂效率低下,缺乏特异性,在细胞中面临严峻挑战。
例如,CP-31398在细胞中作用效率有限,不仅对mp53具有有限的特异性,还可能对细胞产生实质性毒性,还可能难以进入细胞,而且据报道,这种毒性作用对mp53表达是非特异性的且不依赖于mp53表达(Rippin等,2002),表明CP-31398不能通过直接靶向mp53起作用。此外,与早期体外研究显示的CP-31398与mp53蛋白结合不同,后来的体内研究表明CP-31398反而是与细胞中的DNA结合(Rippin等,2002)。
5.4.2细胞筛选鉴定的mp53拯救剂不理想
2002年,通过细胞筛选发现PRIMA-1和MIRA选择性抑制mp53表达细胞(Bykov等,2002)。通过计算机筛选发现NSC319726可选择性抑制一组表达mp53的细胞系(Yu等,2012)。另一项细胞筛选发现壳聚糖可以增强细胞中mp53依赖的萤光素酶报道分子的活性(Hiraki等,2015)。但是像体外筛选一样,通过细胞筛选鉴定出的拯救剂也存在问题。
以PRIMA-1为例,研究表明其与其他拯救剂一样,拯救效率有限。此外,越来越多的研究报道了PRIMA-1及其结构类似物PRIMA-1Met(“APR-246”)不依赖mp53抑制细胞生长(Aryee等,2013;Grellety等,2015;Lu等,2016b;Patyka等,2016;Tessoulin等,2014)。此外,越来越多的研究报告称PRIMA-1靶向氧化应激信号成分(Bauer等,2016;Joerger和Fersht,2016;Lambert等,2009),并且观察到PRIMA-1和其他烷基化化合物(如PK11007)引起的mp53表达细胞敏感性是由mp53s失去抗氧化功能导致的(Bauer等,2016;Joerger和Fersht,2016;Lambert等,2009)。
此外,越来越多的研究报道了PRIMA-1令人困惑的结果,对其MOA提出了质疑,并指出了其有限的效率。虽然Lambert和Bykov报道称PRIMA-1在体外与mp53共价结合并促进mp53-DNA结合活性(Bykov等,2002;Lambert等,2009),但至少有一项研究报道称其实是CP-31398可在体外恢复与mp53的DNA结合活性,而不是PRIMA-1(Demma等,2004)。这些发现似乎与最初报道的PRIMA-1选择性抑制表达p53-R273H的Saos-2细胞相矛盾(Bykov等,2002)。实际上,这些后续的研究表明PRIMA-1并不直接靶向并拯救mp53,而是可能通过合成致死性杀死mp53细胞,即抑制其他对mp53细胞生存至关重要的蛋白质(如前述氧化应激信号成分),而不是mp53(Weidle等,2011)。支持该理论的研究表明,许多蛋白质(包括CHK1、WEE-1、PLK-1和ATM)是mp53细胞的合成致死靶标(Weidle等,2011)。在一项临床试验中,WEE-1抑制剂可有效治疗表达mp53的患者(Leijen等,2016a;Leijen等,2016b)。
5.4.3拥有一个确定的MOA对于确定有效且高效的mp53拯救剂至关重要
目前绝大多数已知的mp53拯救剂稳定p53的野生型结构(Muller和Vousden,2014),包括CP-31398(Foster等,1999)和PRIMA-1(Bykov等,2002),但如上所述它们并不理想,这些拯救剂的主要问题之一是MOA不清楚。
绝大多数已报道的拯救剂是通过随机筛选鉴定的,通过理性筛选仅鉴定出极少数,如PhiKan083和PK7088(Basse等,2010;Boeckler等,2008;Liu等,2013)。但这些化合物只能拯救Y220突变的p53,因此绝大多数拯救剂的MOA仍然未知。
这是一个大问题,如PRIMA-1,不知道拯救剂的MOA或它在细胞中靶向的蛋白质(Joerger和Fersht,2016)可能导致令人困惑的结果和相互矛盾的理论。更进一步举例,令人困惑的是为什么许多已确定的拯救剂可以在没有确定MOA的情况下拯救不同类别的mp53。
通常绝大多数wtp53被正确折叠因此发挥作用,而当p53发生突变时,大致可分为两类:(1)失去DNA结合能力而又不显著影响p53结构的mp53(“结合型mp53”);(2)与野生型p53相比,三维结构被破坏的mp53(“结构型mp53”)。代表性结合型mp53是p53-R273H,其他常见示例包括p53-R273C、p53-R248Q和p53-R248W。代表性结构型mp53是p53-R175H,其他常见示例p53-G245D、p53-G245S、p53-R249S和p53-R282W,因此对于结构型mp53,未折叠的p53的数量急剧增加。为了拯救结构型mp53,需要将未折叠p53的数量增加到折叠p53。
因为这些mp53以不同的方式丧失其野生型功能,所以一类mp53的拯救剂不会拯救另一类是合理的。实际上,有主张将mp53分为五个不同类别,其中每个类别都有其特定的一组拯救剂(Bullock和Fersht,2001;Bullock等,2000;Joerger和Fersht,2007)。
通常拯救结合型mp53比结构型mp53更具挑战性,如为了补偿结合型mp53丢失的DNA接触残基(例如R248和R273),拯救剂必须建立新的DNA结合接触(Joerger和Fersht,2007)。因此在没有确定MOA的情况下,如何使用单个拯救剂来拯救结构型mp53(例如p53-R175H)和结合型mp53(例如p53-R273H)(Joerger和Fersht,2016;Khoo等,2014)是令人困惑的,这样的拯救剂如CP-31398(Foster等,1999)、PRIMA-1(Bykov等,2002)、SCH529074(Demma等,2010)、锌(Puca等,2011)、硬脂酸(Wassman等,2013)和p53R3(Weinmann等,2008)。
我们相信现有基于蛋白质和基于细胞的筛选方法,最重要缺陷之一是它们的选择标准或多或少是随机的,因此它们无法阐明所确定拯救剂的MOA。在此申请人已着手开发一种新颖的方法,合理有效地筛选具有MOA的mp53拯救候选物。
5.5 4C筛选-一种对mp53拯救候选者进行合理有效筛选的方法
第一个合理设计的筛选于2008年进行,对mp53进行了差异处理和结构分析(Basse等,2010;Boeckler等,2008),由于mp53高度多样化,发展了分析单个mp53的合理依据(Joerger和Fersht,2007;Joerger和Fersht,2016;Muller和Vousden,2013;Muller和Vousden,2014)。通过该筛选鉴定出PhiKan083和PK7088,发现它们选择性结合并拯救p53-Y220C且有明了的MOA。但p53-Y220C不在六种最常见的mp53之中,所以有必要确定一种能够拯救更多mp53的拯救剂。
如上所述,我们需要一种有效且基于理性的筛选来识别具有需求特性和具体MOA的热点mp53拯救剂,其他人虽尝试过但并不满足。在这里,我们公开了一种有效且基于理性的筛选方法,该方法整合了mp53的计算机合理分类(in silico rational Classificationof mp53s),化合物结构的计算机合理分析(in silico rational analysis of Compoundstructure),细胞生长分析(Cell growth assay)和实验测定mp53构象(experimentalmp53 Conformation determination),称为“4C筛选”。通过4C筛选法,我们筛选了复合存储库,例如DTP化合物库(图1)。我们的目标是鉴定具有结合多种半胱氨酸潜力的化合物,这些化合物可通过促进mp53的正确折叠来选择性抑制表达结构型mp53的细胞。
我们能通过4C筛选鉴定出拯救候选剂,其可以在羟基化后同时与mp53的三个半胱氨酸结合;可以以惊人的高效率将p53-R175H复性至与wtp53相当的水平,该水平通过实验(例如通过PAb1620和PAb246免疫沉淀法)测得;可以将p53-R282W和p53-G245S的转录活性恢复到与wtp53相当的水平,该水平通过荧光素酶报告测定法测得;可以选择性抑制表达mp53的细胞系,例如表达结构型热点mp53的NCI60细胞系;可以抑制依赖于结构型mp53的小鼠异种移植;可以与DNA损伤剂联合用于治疗表达mp53的癌症病人。
例如,我们预测ATO(As2O3)和NSC3060(KAsO2)能够在羟基化后同时结合3个半胱氨酸(图3),并且发现ATO和NSC3060都可以选择性抑制表达NCI60细胞系的结构型热点mp53(图2)。有趣的是,尽管在同一试验中包括PRIMA-1和NSC319726在内的所有测试化合物均未在4C筛选中留到最后(图9),Nutlin3如我们所料选择性抑制表达wtp53的细胞系(图2)。我们还发现ATO和NSC3060都以高效率重新折叠p53-R175H,这可通过PAb1620表位和PAb246表位(针对小鼠p53-R172H)的检测值增加以及PAb240表位的检测值减少来证明(图4)。我们已进行了比较研究来确认PAb1620特异于野生型p53表位,因为PAb1620有效地免疫沉淀了折叠的wtp53,但未沉淀未折叠的p53-R175H(数据未展示)。
5.5.1 mp53的计算机合理分类
设计逻辑性筛选mp53拯救剂方法的挑战之一是mp53功能障碍的多样性,因此有必要针对不同类型的mp53突变设计合理的筛选策略。另外,筛选一种既能修正mp53s结构缺陷又能重新引入结合型mp53的DNA结合区域的拯救剂的策略可能是不现实的,因为这种拯救剂可能不存在。
有一类mp53主要在体温时展开,在较低温度时重折叠并恢复转录活性(Bullock等,1997;Bullock等,2000),例如四个稳定程度不同的结构型mp53(p53-R175H、p53-G245S/D、p53-R249S和p53-R282W)(图5)(Bullock等,1997;Bullock等,2000)。如代表性成员R282W突变破坏了局部环-片-螺旋基序中的氢键网络,从而降低熔解温度(“Tm”)并导致整体结构失稳。
我们因此预测可能存在一种能够拯救这类mp53的广谱拯救剂。
5.5.2细胞生长试验
一个独立进行的NCI60筛选项目提供了许多DTP化合物的细胞系敏感性概况(Shoemaker,2006)。我们假设能选择性抑制表达结构型mp53的NCI60细胞系的化合物具有较高的机会成为结构型mp53的稳定剂(图6)。
在DTP中储存的大约292000个结构中,大约21000个化合物具有通过CellMiner(Reinhold等,2012)质量控制的灵敏度曲线(图1)。因此,我们通过选择优选抑制表达结构型热点mp53的细胞(如我们预测的可以通过广谱药物拯救的mp53类别)来缩小范围至大约21000种化合物(参阅第6.5.1节)。使用此标准,我们发现1975种化合物可选择性抑制表达结构型热点mp53的NCI60细胞系,相关性得分>0.33,p值<0.05(图1),GI50在表达结构型mp53的细胞株中较低。
5.5.3化合物结构的计算机合理分析
基于上文第6.5.1节中所述的mp53分类分析,我们预测可能存在一种能够拯救结构型热点mp53的广谱拯救剂(p53-R175H、p53-G245S/D、p53-R249S和p53-R282W),此外我们假设固定突变区域可能会全局稳定此类mp53。重要的是,我们发现10个mp53半胱氨酸中有8个紧邻结构型mp53热点(图5),我们还发现这些半胱氨酸成对聚集,即C176/C182、C238/C242、C135/C141和C275/C277。因此我们假设共价交联半胱氨酸对和/或簇可以固定局部区域,从而足以抵消由附近热点突变引起的柔性。
我们在计算机上从DTP库中进一步缩小了化合物的范围,选择了具有结合多个半胱氨酸潜力的化合物,例如具有重金属(例如Zn、Hg、As和Au)的化合物;含硫醇的化合物;和迈克尔受体(图7)。我们的4C筛选方法在许多方面都不同于先前的筛选方法,并且在许多方面进行了改进,例如至少在概念上,我们选择了具有结合多个半胱氨酸潜能的拯救候选剂,适用于半胱氨酸交联,而不是选择具有结合单个半胱氨酸潜能的拯救候选剂,适用于半胱氨酸修饰(Kaar等,2010;Zache等,2008)。
在上述两步合理选择过程后,我们将1975种化合物的初始库范围缩小到约100个mp53拯救候选剂。
5.5.4实验测定mp53构象
我们接下来使用wtp53特异性抗体PAb1620抗体(Wang等,2001)通过免疫沉淀实验,检测拯救候选剂存在的情况下p53-R175H是否被正确折叠(Figure 8),对这些待测试的拯救候选剂进一步使用对折叠的小鼠p53(PAb246)和未折叠的p53(PAb240)特异的抗体进行免疫沉淀实验确认。这些构象分析可确保观察到的拯救效果是由拯救剂诱导的mp53稳定作用直接造成的,而非合成杀伤力。我们而后在可控的实验环境中仔细测试了经过验证的mp53拯救候选剂,以确定其能稳定结构型mp53,增加Tm,刺激转录活性以及以mp53依赖性方式抑制癌细胞的能力。
5.6 4C+筛选
为了扩大拯救剂候选池,我们进行了超大型4C+筛选。我们通过计算机分析了大约9420万种来自PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)的化合物。由于在4C筛选中确定了两种含砷化合物,所以在4C+筛选中我们选择了含有金属砷或其类似物(例如锑和铋)且具有至少结合一个半胱氨酸潜力的化合物,约32957种化合物包含As和/或Sb和/或Bi。在这些标准下,我们加入任何有机五价砷、五价锑和五价铋,只要它们具有结合一个或多个半胱氨酸的潜力即可。经过计算机内预筛选后,我们将大约9420万种化合物的初始范围缩小到千级拯救剂候选池。我们随后选择并实验测试了一些结构型mp53重新折叠蛋白,增加Tm和刺激转录活性的能力。
5.7通过4C筛选和4C+筛选确定mp53拯救剂
几乎一半的人类癌症都携带失去了肿瘤抑制功能并且/或者经常获得某些致癌功能的mp53,虽然功能失调的p53突变是通过多种机制在多种位点上产生的,但大约有三分之一的p53突变位于六个mp53热点之一:R175、G245、R248、R249、R273和R282(均为“mp53热点”)(Freed-Pastor和Prives,2012)。生成的mp53通常分为结合型mp53,失去与DNA结合的残基但mp53结构并不显著改变;结构mp53,失去wtp53结构。DNA结合能力和转录活性在接型触mp53和结构型mp53中都大大受损。大多数源自癌症的mp53还都失去了wtp53的肿瘤抑制功能,而且许多还具有致癌性。
使用高效且高度合理的4C筛选,我们可以通过实验确定至少两种拯救效率非常高的广谱mp53拯救剂,分别是三氧化二砷(ATO:NSC92859和NSC759274)和亚砷酸钾(KAsO2:NSC3060)。我们的结果表明,这些mp53拯救剂可以拯救mp53的结构;增加热力学稳定性;拯救mp53的转录活性;在体外、体内和患者中拯救mp53的肿瘤抑制功能;拯救不同的mp53;对mp53结构具有出色的拯救能力。我们还确定了这些拯救剂的原子级拯救机制。
使用高效且高度合理的超大规模4C+筛选,我们进一步发现了数千种临床相关且有效的mp53稳定剂,其中许多含有砷(表1-表6)。我们通过实验确定了31种mp53拯救剂,并提供关键支持数据(对mp53的结构和转录活性的拯救效率)(表7)。我们在此进一步公开了结构型热点mp53可以被药理稳定的原子水平机制。
使用4C筛选,我们发现元素砷及其类似物,无论是单独存在还是在化合物中,都能快速、有效和选择性地稳定p53。我们发现元素砷及其类似物对结构型mp53尤其有用,因为结构型mp53稳定性极差。我们进一步发现砷及其类似物直接共价结合mp53,并使许多p53,尤其是结构型mp53,包括四个热点结构型mp53(R175、G245、R249、R282突变p53)的熔解温度提高了1-8℃,表明砷与mp53结构共价结合。我们更进一步发现砷及其类似物通过形成高度稳定的复合物PANDA来有效拯救mp53的结构和转录活性。
我们在此首次公开了大约一批的高度解析的PANDA晶体结构。通过分析PANDA晶体结构,我们能够在原子水平上深入分析mp53(例如结构型mp53)如何在药理上稳定下来。我们由此发现了p53上的一个可成药的口袋,该口袋可被砷结合并固定,从而导致p53核心域的整体稳定性。基于这些发现并通过我们的超大型4C+筛选,我们发现了数千种临床相关的mp53稳定剂的巨大宝库(表1-表6)。
5.8具有结合三个或多个半胱氨酸潜力的砷化合物是mp53的广谱有效结构和功能拯救剂
5.8.1一类含有砷且可以显著提高mp53 Tm的拯救剂
我们的筛选方法基于以下假设:存在可以通过增加Tm从而稳定mp53来广泛拯救结构型mp53的化合物。我们在四个纯化的重组结构型热点mp53上测试了这一假设,发现ATO能够将四个mp53的Tm都提高约1-8℃,达到与wtp53相当的水平,如ATO将p53-R249S的Tm升高至4.9℃(图10)。ATO处理后显著增强的Tm表明mp53高度稳定。
5.8.2砷拯救剂有效拯救mp53的结构和功能
我们系统地且定量地确定了拯救剂ATO的结构和转录拯救概况。在ATO处理之前,我们通过PAb1620 IP效率确定了6个热点mp53的折叠状态与先前由Bullock及其同事确定的热力学稳定性一致(Bullock等,2000)(图11)。我们发现As2O3在拯救4个测试的结构型热点mp53(p53-R175H、p53-G245S、p53-R249S、p53-R282W)的结构上具有显著效果(图11),如我们发现,当将As2O3添加到p53-R175H中,wtp53样结构的数量增加了约50-100倍,相当于wtp53的95%。
在功能方面,As2O3显着增强了4个结构型热点mp53的PUMA(图11)等的转录活性,如在我们最成功的拯救结果中As2O3将p53-R282W的转录活性拯救了大约20倍,达到wtp53的80%,我们还观察到,As2O3有效地拯救了p53-G245S的转录活性,其水平相当于wtp53的77%。
我们进一步观察到,As2O3从结构和转录上拯救了结合型热点mp53,如mp53-
R248Q和mp53-R273H,但拯救效率较低。值得注意的是,mp53结构的拯救效率不一定与功能的拯救效率成正比。尽管p53-R282W的结构远未完全得到拯救,但其转录功能却得到了极大的拯救(相当于wtp53水平的80%)。这可能是因为PAb1620表位无法反映p53的局部结构,如对DNA结合有反应的关键LSH基序和L3环。
除了六个热点mp53之外,As2O3还拯救了其他最常见的mp53,如p53-C176F、p53-H179R、p53-Y220C(低效率)和p53-P278S(低效率)(http://p53.iarc.fr/,IACR)和代表性的携带DNA结合区以外突变的mp53(p53-V143A、p53-F270C和p53-I232T)(图11)。
部分mp53的结构和转录拯救谱展示在(图11)中。这些令人惊讶的结果证实As2O3和KAsO2代表了广谱、有效、高效和强大的mp53拯救化合物。
5.8.3p53通过结合单个砷原子或类似物来被拯救
我们进一步假设单个砷原子可以结合mp53上的关键半胱氨酸来改变其结构和/或功能。为了检验这一假设,我们创造了具有R249S突变的重组mp53(94-293)核心(“mp53(94 -293)-R249S”)。我们随后纯化了mp53(94-293)-R249S,将纯化的mp53(94-293)-R249S与As2O3孵育,并在变性条件下通过质谱法测量所得mp53的分子量。
我们发现孵育后重组mp53的分子量增加了约72道尔顿(Da),大致对应于砷原子(74.9)的获得和3个质子的丧失(图12)。再如当我们在mp53(94-293)-R249S中添加从超大规模4C+筛选中鉴定的PANDA试剂(如NaAsO2、SbCl3和HOC6H4COOBiO)时,与我们预测相同,所得mp53的分子量分别增加了约72Da,119Da和206Da(图17)。这表明单个砷原子(或其类似物,包括锑和铋)与p53共价结合。
5.8.4一类通过结合多半胱氨酸潜力与p53半胱氨酸结合的砷拯救剂
为了进一步了解此类砷拯救剂之间的相互作用,我们将目光投向DTP库。我们注意到DTP库包含许多含砷化合物(n=47),但其中大多数都无法在4C筛选中留下来。这表明砷必须以正确的支架形式存在才能结合p53。
为了了解成为砷拯救剂的先决条件,我们比较了47种砷拯救剂及其NCI60细胞系的抑制曲线。我们发现具有结合三个或多个半胱氨酸潜力的砷化合物,例如
NSC3060(KAsO2,皮尔森相关性0.837,p<0.01),NSC157382(皮尔森相关性0.812,p
<0.01)和NSC48300(皮尔森相关性0.627,p<0.01),以上化合物具有与ATO最相似的NCI60抑制曲线。此外,我们发现具有结合双半胱氨酸潜能的化合物也具有与ATO相似的NCI60抑制谱,但范围较广(NSC92909,皮尔森相关性,p<0.01;NSC92915,皮尔森相关性0.670,p<0.01;NSC33423,皮尔森相关性0.717,p<0.01)。
此外,我们发现结合单半胱氨酸的潜在化合物也具有与ATO相似的NCI60抑制谱,但程度更低(NSC727224,皮尔森相关性0.598,p<0.01;NSC724597,皮尔森相关性0.38,p<0.01;NSC724599,皮尔森相关性0.553)。总之,我们的结果表明具有结合三个或多个半胱氨酸潜力,结合双半胱氨酸潜力和结合单半胱氨酸潜力的化合物可以选择性抑制表达mp53的细胞的生长。此外,我们展示了这三类砷拯救剂的效率随其结合半胱氨酸的潜力数量降低而降低。
因此,我们首次发现了具有不同拯救潜力的三类独立mp53拯救化合物,具有结合三个或更多半胱氨酸潜能的分子可以将mp53还原至接近野生型的情况。
值得注意的是,上述NSC48300不仅具有同时结合3个半胱氨酸的潜力,而且还具有同时结合4个半胱氨酸的潜力。这表明当砷化合物具有结合至少三个半胱氨酸的潜力时,它是有效的mp53拯救者。具有结合三个以上半胱氨酸潜力的砷化合物可能与仅结合三个半胱氨酸的化合物有相同的拯救效率,因为我们发现三个半胱氨酸聚集在p53上(图5)。
5.9砷选择性结合结构型mp53的PANDA口袋
由于我们将p53和砷类似物形成的复合物命名为PANDA,因此我们决定遵循命名法。基于我们已得到的PANDA的晶体结构(在此描述),我们创建了以下名称。PANDA半胱氨酸为C124、C135或C141之一。PANDA半胱氨酸三联体分别为C124、C135、C141。PANDA口袋是以PANDA半胱氨酸三联体为中心的三维结构。PANDA口袋包括PANDA半胱氨酸三联体和直接接触的残基(S116接触C124、C275;R273接触C135;Y234接触C141),与PANDA半胱氨酸三联体相邻的残基(V122、T123、T125和Y126;M133、F134、Q136和L137;K139、T140、P142和V143)和距PANDA半胱氨酸三联体距离的残基(L114、H115、G117、T118、A119、K120、S121、A138、I232、H233、N235、Y236、M237、C238、N239、F270、E271、V272、V274、A276、C277、P278、G279、R280、D281和R282)(图18)。PANDA试剂能够与PANDA口袋形成至少一个紧密关联的拯救剂。PANDA试剂可以是任何可以通过与PANDA口袋的结合潜能而有效稳定mp53的化合物。PANDA试剂优选将mp53的Tm提高为PRIMA-1的3-100倍,和/或将折叠mp53提高为PRIMA-1的3-100倍,和/或将mp53的转录活性提高为PRIMA-1的3-100倍。PANDA试剂优选具有至少结合一个半胱氨酸潜能,更优选具有结合两个或更多个半胱氨酸潜能,进一步优选具有结合三个或更多个半胱氨酸潜能。PANDA试剂优选为包含一个或多个As、Bi或Sb原子的化合物,PANDA试剂更优选为选自表1-6中列出的数千种化合物,我们已经预测这些化合物可以有效结合PANDA半胱氨酸并有效地原位拯救mp53,PANDA试剂进一步优选为表7中列出的31种化合物之一,我们已经通过实验证实了其可拯救mp53的结构和转录活性,PANDA试剂更进一步优选为包括砷类似物,例如As2O3、NaAsO2、SbCl3和HOC6H4COOBiO,这些化合物已被我们证实直接结合p53-R249S(图12,图17)。
PANDA核心是结合PANDA试剂的PANDA口袋。PANDA是p53和PANDA试剂形成的复合物。PANDA的特征在于包含PANDA核心。
通过识别结合三个或多个半胱氨酸潜力作为高效PANDA试剂的重要标准,我们开始着手了解PANDA口袋的3D结构。我们特别致力于操纵PANDA口袋来稳定mp53。
5.9.1 PANDA的显著稳定性有助于PANDA的结晶和PANDA口袋的识别
尽管wtp53核心已有结晶,但众所周知,结构型热点mp53的核心很难结晶,这是因为结构型热点mp53具有非常低的稳定性。
但可以通过引入四个SSSM(M133L、V203A、N239Y和N268D)来人工稳定mp53,从而产生四突变的p53-QM。四个SSSM将p53的Tm升高5.2℃,稳定性的增强有助于结晶,并且解开了许多结构型mp53,包括热点mp53-G245S和mp53-R282W以及非热点mp53-V143A和mp53-F270L。
我们的PANDA非常稳定。
实际上,PANDA试剂可以将mp53的Tm提高到与QM相当的水平(图10)。
PANDA出色地稳定性可以帮助我们获得结构型热点mp53结晶,包括一系列条件下的p53-R249S和As,以及没有SSSM的p53-G245S和p53-R282Q。
基于PANDA晶体,我们确认了质谱结果,即单个砷(或类似物)原子与三个半胱氨酸共价结合。PANDA口袋的这三个半胱氨酸分别为:C124、C135和C141(分别为“PANDA半胱氨酸”和“PANDA半胱氨酸三联体”)。
5.9.2尽管有其他更易接近的半胱氨酸,并且有其他可替换的三半胱氨酸金属结合位点,但最有效的PANDA试剂仍与高惰性PANDA半胱氨酸三联体结合。
要了解PANDA半胱氨酸三联体的MOA,我们需要知道什么是PANDA半胱氨酸三联体以及它的位置。另外在临床研究中,结合半胱氨酸化合物的主要挑战之一是使不需要的半胱氨酸脱靶(Joerger和Fersht,2016;Kaar等,2010)。因此,确定与PANDA试剂结合的p53半胱氨酸至关重要。
我们列出了p53上所有10个半胱氨酸(图5),并研究了它们对砷的选择性。由于砷必须与p53半胱氨酸结合(图33B),因此我们希望PANDA半胱氨酸位于p53暴露于溶液的外表面。与先前的计算机模拟研究一致(Kaar等,2010),我们发现C182和C277在p53表面高度暴露(图5)。与Bauer的研究一致,mp53稳定剂PK11000与C182和C277结合(一个PK11000分子与一个半胱氨酸结合)(Bauer等,2016)。令我们惊讶的是,与高度暴露和高反应性的C277和C182不同,PANDA半胱氨酸中的两个具有高度惰性。实际上PANDA半胱氨酸C135和C141被深埋在内部,这与我们将PANDA口袋的位置与已报道的p53晶体关联时是一致的,这表明当用结合半胱氨酸化合物溶液浸泡晶体时PANDA Pocket没有被烷基化(Kaar等,2010)。
在我们的晶体中,砷存在的情况下发现砷在体内选择性结合高度惰性的PANDA半胱氨酸(C135和C141),从而在PANDA上形成PANDA核心(图14)。要强调的是,帮助我们解开PANDA口袋和PANDA半胱氨酸的PANDA晶体是通过用ATO处理表达mp53的细菌在体内形成的。这些数据明确表明,与正常预期相反,在活生物体中砷对PANDA半胱氨酸具有高亲和力,特别是从更容易接近的半胱氨酸(例如C182和C277)中选择它们。
体外实验也显示出这一结果,我们用砷浸泡mp53晶体产生PANDA晶体,这再次证明了砷被选择并与高惰性PANDA结合(图14)。更值得注意的是,在这种特殊条件下PANDA半胱氨酸三联体的可及性非常有限,并且结构可塑性降低。尽管如此,砷仍与PANDA半胱氨酸三联体结合,提供了令人信服的证据,表明砷在体外对PANDA半胱氨酸也具有高度选择性。
根据我们的晶体结构,我们推测砷被PANDA口袋上的惰性PANDA半胱氨酸吸引,而不是更容易接近的反应性半胱氨酸(如C277和C182),这可能是由于砷更倾向于结合三半胱氨酸簇而不是双半胱氨酸簇和单半胱氨酸。与该理论相一致,据报道砷更倾向于结合包含3和4个半胱氨酸的锌指结构域(CCCC锌指和CCHC锌指),而不是结合包含2个半胱氨酸的CCHH锌指结构域(Zhou等,2011)。因此我们评估了砷与其他三半胱氨酸簇的结合潜力,例如由C176/C238/C242组成的锌区域(“锌区域”)。
锌区域是砷结合的理想场所的原因很多。首先,锌区域包含三个mp53突变热点,即R175、G245和R249,与其他mp53(例如mp53-R282W)相比,As2O3在结构上更有效拯救这些突变热点(图11)。其次,锌很容易从mp53-R175H上解离(Butler和Loh,2003;Loh,2010),我们以前展示砷可以在诸如早幼粒细胞白血病蛋白(“PML”)之类的蛋白中占据锌的结合位点(Zhang等,L”2010)。ATO可以原位结合PML-RARα,并且可以临床治愈急性早幼粒细胞白血病(“APL”),这是唯一可以通过靶向治疗治愈的恶性肿瘤(Hu等,2009;Lo-Coco等,2013)。第三,我们的计算机(化合物-蛋白)结合模拟研究表明,锌区域的三半胱氨酸C176/C238/C242在空间上非常接近,形成了结合砷的绝佳口袋。
出乎意料的是,尽管具有这些令人鼓舞的特性,但我们的研究表明,砷原子并未与PANDA晶体结构上的锌区域结合,即使我们使用EDTA耗尽锌原子来促进砷结合也没有结合(数据未显示)。我们的研究表明,砷与PANDA口袋上深埋的位点结合。我们的结果表明,砷的半胱氨酸选择性是不一般的,不仅基于单个半胱氨酸的可及性,也不仅基于三半胱氨酸簇的存在,即使三半胱氨酸位点可以吸引并与其他金属元素(例如锌)形成键也是如此。
我们的结果强调PANDA半胱氨酸三联体(C124/C135/C141)和PANDA口袋对于砷及其类似物而言是特异且独特的。
5.10砷原子自由进入并穿过L1-S2-S3口袋,到达并停留在PANDA半胱氨酸三联体中
p53的3D结构已经在24年前被解开,可以在其表面上目视识别出数百个不同大小的口袋。但这些口袋都没有经过实验测试是否可以正常工作。我们在此确定PANDA半胱氨酸三联体位于p53的L1环,S2片和S3环的口袋下,我们将其认定为L1-S2-S3口袋。这个L1-S2-S3口袋以前被称为L1-S3口袋或L1/S3口袋(Joerger和Fersht,2016;Wassman等,2013)。
在计算机模型预测许多先前报道的化合物与L1-S2-S3口袋的C124结合(Joerger和Fersht,2016;Wassman等,2013)。临床上使用的大多数药物都含有约10-100个原子,以前报道的mp53拯救化合物也是如此。而L1-S2-S3口袋相对较小,因此先前报道的mp53拯救化合物仅在口袋打开时才偶尔进入其中(图15)。
我们的单原子PANDA试剂(例如单个砷原子)与任何临床使用的试剂及以前报道的mp53拯救化合物都根本不同,因为它只是一个原子。砷原子比任何报道的mp53拯救化合物都要小一个或两个数量级(报道化合物大小的约1/10–1/100)它小到即使L1-S2-S3口袋关闭也可以随时自由地进入(图15)。砷原子也从根本上不同于以前报道的mp53拯救化合物,因为它不会停留在L1-S2-S3口袋中,而是会穿过它,它小到可以自由地穿过L1-S2-S3口袋并进一步进入PANDA半胱氨酸三联体,这是一个很小的口袋,只能容纳一个原子。
5.11固定PANDA口袋足以稳定mp53
我们进一步发现砷通过固定PANDA口袋来稳定mp53。通过砷使mp53稳定的原子级机理,我们进一步发现PANDA口袋实际上是控制mp53稳定性的关键开关。更重要的是,它可以用来识别p53拯救剂(或PANDA试剂)。
通过分析PANDA口袋残基间的分子内相互作用(图18),我们预测了一组在控制p53PANDA口袋的稳定性起重要作用的关键残基,包括S116、F134、Q136、T140、P142和F270(图19)。通过在这些残基上引入一批人工突变,我们发现,例如S116N、S116F和Q136R可以显著拯救p53-G245S在PIG3上的转录活性(图19)。我们还发现S116N和Q136R等残基可以拯救p53-G245S在PUMA上的转录活性(图19)。因此S116N、S116F和Q136R可以通过模仿PANDA试剂拯救mp53而充当SSSM。我们的发现证实通过PANDA试剂或合理设计的SSSM固定PANDA口袋足以稳定mp53。
在过去的二十年已通过序列进化分析或功能指导的筛选鉴定出许多SSSM(Baroni等,2004;Nikolova等,1998)。有趣的是,大多数报道的SSSM位于PANDA口袋附近。此外我们合理设计和发现的一批SSSM有效地拯救了结构型mp53,稳定了PANDA口袋,并证明通过使用砷化合物固定PANDA口袋来拯救结构型mp53的新方法。
PANDA口袋顶部的L1环(F113-T123)特别有趣,它是癌症突变的冰点(IACR,http://p53.iarc.fr/TP53SomaticMutations.aspx),并且是最具活力的DNA结合元件(Lukman等,2013)。值得注意的是,这些残基上的突变通常会增强p53的功能,这再次支持了我们的发现,即操纵PANDA口袋可以拯救mp53。
简而言之,我们发现了PANDA口袋是控制mp53稳定性的关键开关。PANDA口袋位于“PANDA的背面”(图16)。众所周知,抓住哺乳动物新生儿的背部能够诱导“抓住背部动物就保持不动反应”(DIR)并使人、小鼠、狮子和其他哺乳动物的婴儿平静下来(Esposito等,2013)。操纵PANDA口袋可以拯救mp53的野生型结构和转录功能。PANDA口袋结合化合物可以潜在地充当PANDA试剂(mp53拯救剂)。通过PANDA口袋在拯救mp53中的关键作用,我们将4C筛选扩展为4C+筛选,以查找包含As、Sb或Bi,但仍可以与PANDA口袋形成至少一个紧密的结合的其他PANDA试剂,并且进一步说明其他非As、Sb和Bi化合物也可以用作有效的PANDA试剂。
5.12发现数千个有效,高效且广谱的mp53拯救者
我们借助对PANDA口袋的了解,以极高效率拯救mp53且具有MOA的结合三半胱氨酸砷,进行了超大型C4+筛选。我们预测成千的化合物都具有有效结合3个或更多半胱氨酸的潜力,因此可以作为有效的mp53拯救者(表1-表6)。我们从表1至表6中随机选择了一些化合物,以及一些仅具有结合一个或两个半胱氨酸潜能的化合物,通过实验确认了其中31种拿到主要支持证据(拯救mp53的结构;拯救mp53的转录活性)的mp53拯救剂。,已在表7列出。
我们发现Sb和Bi化合物与砷化合物一样,也可以拯救mp53(表7)。我们在质谱实验中证实,As、Sb和Bi可以直接共价结合mp53(图17)。
我们进一步发现,含As、Sb和/或Bi的有机化合物也可以有效拯救mp53(表7)。
我们进一步发现含3价和5价As、Sb和/或Bi的化合物均可有效拯救mp53。
我们进一步发现,成为有效mp53拯救者的先决条件之一是结合三半胱氨酸能力。,如NSC43800(可同时结合3-4个半胱氨酸)比NSC721951(只能结合1个半胱氨酸)有更高的拯救mp53的转录活性效率。
值得注意的是,尽管PANDA半胱氨酸三联体空间有限,不太可能容纳有机化合物,但有机As、Sb和/或Bi仍能通过PANDA口袋有效拯救mp53,尤其是那些含苯的有机化合物也可以,这表明砷的半胱氨酸结合潜能非常强,可以牢固地插入PANDA半胱氨酸三联体的小空间中,可能在L1-S2-S3口袋和PANDA半胱氨酸三联体外部留下笨重的有机基团,例如苯。此外当有机砷结合时,可能会对mp53的结构产生更深远的影响。
我们进一步发现具有结合单半胱氨酸潜力(例如:NSC721951)或结合双半胱氨酸潜力(例如:NSC92909)的As、Sb和/或Bi化合物也可以拯救mp53的结构和转录活性。当比较具有结合胱氨酸潜力的化合物时,我们发现具有结合三个或更多半胱氨酸潜力的化合物的拯救效率最高,其次是具有结合双半胱氨酸潜力的化合物,然后是具有结合单半胱氨酸潜力的化合物(图64-图68)。
我们发现含有Bi和/或Sb的化合物以及具有mp53拯救能力的有机As、Sb和/或Bi化合物具有巨大的临床价值,因为这些化合物在体内的毒性通常低于无机As化合物。
5.13临床试验
我们进行了一项小规模的治疗表达ATO可治疗mp53的患者的临床试验,结论是ATO是具有确定效力和mp53选择性的PANDA试剂。
根据目前的发现,我们已经对AML/MDS患者进行了两项大规模的多中心前瞻性试验(NCT03381781和NCT03377725)。
5.14 ATO在多种环境下且不受多种因素的影响,可强烈促进未折叠p53的正确折叠
由于通过4C筛选将确定了ATO是PANDA试剂,我们研究了ATO是否能指导未折叠的p53的正确折叠。使用对正确折叠的wtp53特异的PAb1620抗体,免疫沉淀(“IP”)正确折叠的p53。与预测一致,我们发现wtp53和结合型mp53(例如p53-R273H/C)在很大程度上折叠(图20)。相比之下,结构型mp53(例如p53-R175H、p53-G245S/D、p53-R249S和p53-R282W)和一些结合型mp53(例如R248Q/W)以不同程度展开(图20)。但经过ATO处理后,除p53-R282W外所有p53的未折叠群体均以显著的效率正确折叠至与wtp53相当的水平(图20)。其中p53-R175H的变化最为显著,正确折叠的p53百分比增加了92倍(图20)。即使用ATO处理wtp53和p53-R273H/C也检测到折叠含量增加,表明ATO是一种强力剂,它还可以进一步促进wtp53和p53-R273H/C的主要折叠含量的增加(图20)。
使用其他两种p53构象特异性抗体进一步支持ATO折叠mp53的能力,即对正确折叠的p53具有特异性的PAb246抗体(小鼠p53)和对未折叠的p53具有特异性的PAb240抗体(图25)。
我们还仔细表征了ATO在多种条件下介导的mp53折叠。我们发现,0.1μg/ml的ATO足以正确折叠一些mp53(图25)。此外折叠似乎是瞬时的,因为ATO只需15分钟即可进入细胞并正确折叠p53-R175H(见图25)。此外ATO介导的折叠在很大程度上不受多种因素的影响,包括细胞类型(如所有测试的细胞,包括MEF、H1299、ESO51、SK-MEL2和BT549都有响应),细胞处理过程中的汇合度(如所有测试的汇合度,包括40%和80%的汇合度都有响应),处理持续时间(如所有测试的时间,包括2小时和过夜都有响应),mp53来源(如所有测试的来源,包括人类mp53和鼠mp53都具有响应性),以及IP缓冲液的类型(如所有测试的缓冲液,无论有无EDTA都有响应)(图25)。
我们的关注重点之一是p53-R175H,它是癌症中最常见的mp53,也是最具代表性的结构型mp53(Freed-Pastor和Prives,2012)。我们仔细比较了ATO与先前报道的拯救化合物介导的mp53折叠效率,例如PRIMA-1、NSC319726、玫瑰树碱、STIMA、PhKan083等(图26)。我们选择这些化合物的原因之一是这些已报道的拯救化合物的功效仍存在大量争议(Joerger和Fersht,2016;Muller和Vousden,2013,2014)。为了准备我们的研究,我们对所报道化合物的处理条件进行了细致的梯度研究(图26)和优化(图21)。
我们观察到PRIMA-1处理后通过PAb1620测定的p53-R175H正确折叠含量增加了1.9倍(图21)。该结果与先前的研究一致,即纯化的重组GST-p53R175H增加了3倍,来自SKOV-His-175细胞裂解物的p53-R175H增加了1.46倍(Bykov等,2002)。NSC319726、玫瑰树碱和STIMA对p53-R175H也具有相似的作用,导致正确折叠的p53-R175H含量增加了1.8至2.6倍。PhiKan083没有有效折叠p53-R175H,这可能是因为它是p53-Y220C的特异拯救者(Boeckler等,2008)。
令人吃惊的是,我们观察到ATO将人p53-R175H的正确折叠含量增加了约74倍,通过PAb1620测定(图21)。如此水平下,p53-R175H结构已恢复到与wtp53相当的水平(或约wtp53的97%)(图21)。我们还观察到ATO除了能恢复人p53以外,也几乎将未折叠的小鼠p53-R172H完全恢复到了野生型水平(图27)。此外,我们发现ATO还可以在体内稳健地折叠细菌重组p53,其折叠速度比所有我们测试过的先前报道的化合物要快得多。如图28显示在细菌中向重组GST-p53-R175H添加ATO大大增加了正确折叠p53的表位(即PAb1620表位)。此外,ATO介导的p53折叠水平明显高于已知的拯救化合物,例如MIRA-1、PRIMA-1和NSC319726(图28)。
5.15 ATO广泛促进mp53稳定并防止mp53聚集
由于mp53的动力学稳定性低,因此其他人提出能拯救mp53结构的化合物必须在mp53翻译后立即起作用(Joerger和Fersht,2007)。我们通过使用翻译抑制剂环己酰亚胺(“CHX”)预处理细胞,从而使p53-R175H保持其展开或变性状态来检验该假设。我们还证实CHX预处理有效地阻断了我们系统中的p53翻译(图29)。值得注意的是,我们观察到即使使用CHX预处理,ATO仍然可以有效且适当地折叠细胞中的内源性p53-R175H(图22)和H1299细胞中的外源性p53-R175H(图30)。我们的结果甚至表明ATO可以正确折叠变性的mp53(图22,3D结构)。
其他人已经报道将p53稳定在其天然状态可以抑制p53聚集(Bullock等,1997)。在此,我们发现ATO介导的稳定作用减少了p53-R175H聚集的数量(图23和图31),通过CHAPS系统(图23)和M-PER系统(图31)在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中证实了这一点。因此我们证实了ATO介导恢复将mp53转换为原始、正确折叠和稳定的状态,并防止了mp53聚集。
5.16远离R175的C135/C141簇参与砷结合
据报道砷结合肽上多个紧密间隔的半胱氨酸而不是单个半胱氨酸(Donoghue等,
2000)。因此,我们探讨了As介导的mp53折叠,研究了所有三对半胱氨酸,包括C135/C141、C238/C242和C275/C277,以及与R175相邻的半胱氨酸,即C176(图32)。出人意料的是,我们首次发现在距离R175较远的C135/C141簇上的丙氨酸突变,而不是邻近的C176或C238/C242上的,极大地干扰了ATO介导的PANDA核心和PANDA的p53-R175H折叠(图24)。
ATO介导的折叠特征包括:
(a)能够以一定范围的效率,包括从高效率到极高效率,正确折叠所有经过测试的结构型热点mp53;
(b)瞬间折叠(<15分钟);
(c)折叠与细胞类型和处理条件无关,包括对IP缓冲液中EDTA的抗性;
(d)折叠比任何报道的化合物都有效得多;
(e)通过PAb1620表位测定,p53-R175H几乎完全恢复;
(f)对人类mp53和小鼠mp53均有效;
(g)在哺乳动物细胞和细菌细胞中均起作用;
(h)可以折叠先前不折叠的mp53;
(i)抑制mp53聚集;和
(j)Cys135和Cys141参与As介导的mp53折叠。
5.17 As与p53结合形成PANDA,而不考虑p53的来源
由于As能够快速有效地正确折叠结构型mp53,因此我们研究了As是否直接与p53-R175H相互作用。我们用生物素标记的As(“Bio-As”)(Zhang等,2010)处理p53,拉下Bio-As以确定所有As复合物(图33)。我们首次发现As可以结合mp53(图33)。我们进一步发现,在六个著名的mp53热点(R175H、G245S、R249S、R282W、R248Q和R273H)中,相比wtp53和结合型mp53(例如:p53-R248Q和p53-R273H),有更多的结构型mp53(例如:p53-R175H、p53-G245S、p53-R249S和p53-R282W)形成PANDA(图33)。我们对p53-R175H的详细研究进一步表明,无论来源如何,As(例如Bio-As)都可以快速有效地与mp53结合。例如,H1299中的外源性p53-R175H,ESO51中的内源性p53-R175H和小鼠胚胎成纤维细胞的p53-R172H都可以与Bio-As结合形成PANDA(图33)。
5.18砷对p53的选择性
我们进一步测试了细胞中砷对p53的选择性。我们用生物素标记砷原子以形成生物素-As,然后将其与表达多种p53的细胞孵育,然后裂解细胞并通过免疫印迹拉下生物素-As。我们的结果表明,生物素-As更倾向于结合结构型mp53,而不是与结合型mp53(图13)。有趣的是生物素-As与wtp53的结合效率甚至低于结合型mp53的效率(图13)。
在对生物素-As与p53-R175H或wtp53之间的结合效率进行细致的梯度研究时,发现生物素-As结合p53-R175H的效率至少是wtp53的10倍(图13)。
生物素-As相关数据需要仔细评估,因为生物素占据了生物素-As上半胱氨酸结合的键,因此结果可能无法准确反映ATO对wtp53和mp53的选择性。这些数据暗示潜在的砷选择性结合未折叠的mp53,而不是折叠的mp53和wtp53。
5.19半胱氨酸与As介导的PANDA形成有关
我们进一步发现半胱氨酸与As介导的PANDA形成有关。如我们发现用Bio-Dithi-As(一种As被二硫醇保护并且不能与半胱氨酸结合的化合物)(Heredia-Moya和Kirk,2008)处理不能拉下p53-R175H(图33)。这支持了p53半胱氨酸(如mp53)参与了PANDA的形成。
5.20元素As直接共价结合p53
为了进一步表征PANDA,将重组GST与全长p53-R175H(“GST-p53-R175H”)结合的融合蛋白在细菌中表达纯化,然后在体外与Bio-As一起孵育。值得注意的是,使用这种方法我们发现了能够在蛋白质变性和蛋白质电泳(例如SDS-PAGE)中保留下来的As-Biotin-
GST-p53-R175H复合物(图33)。此结果支持As直接与p53(如mp53)共价相互作用。
5.21元素As与p53核心结构域以As蛋白质比率1:1直接共价相互作用
我们进一步确定了p53核心域与含有As、Sb或Bi的化合物之间的直接共价相互作用。我们分别在ZnSO4和ATO的存在下表达了一个重组wtp53核心(“wtp53(62-292)”)和一个重组mp53核心(“mp53(91-292)-R175H”)。我们纯化了这些核心片段,并通过质谱(“MS”)确定了它们的分子量。在其天然条件下,wtp53(62-292)和mp53(91-292)-R175H的分子量比预期的高,分别高约64Da和约69Da,这支持了p53:金属以比例为1:1的wtp53(62-292/Zn复合物和mp53(91-292)-R175H/As复合物的形成(图33和图34)。但在变性条件下,我们发现wtp53(62-292)/Zn的质量下降了63.5Da,而mp53(91-292)-R175H/As的质量却没有下降(图33和图34),这进一步证实了As与p53(例如mp53)共价结合(见图33)。
我们进一步证实,通过电感耦合等离子体质谱法(“ICP-MS”),As以1:1的比率与p53结合。我们的结果不仅表明As与p53共价结合,而且表明每个p53与大约一个As原子结合(每个p53结合0.93±0.19个As)(图35)。
形成PANDA的反应特征包括:
(a)倾向于结合结构型mp53;
(b)在人类mp53和小鼠mp53中均起作用;
(c)在哺乳动物细胞和细菌细胞中均起作用;
(d)在体内(细胞中)和体外(反应缓冲液中)均起作用;
(e)涉及mp53半胱氨酸;
(f)mp53与As原子之间的摩尔比为1:1;
(g)直接反应;和
(h)共价反应。
5.22 PANDA恢复了野生型DNA结合能力和野生型转录活性
由于As介导PANDA形成并有效拯救p53的结构,因此我们进一步测试了PANDA的DNA结合能力和转录活性。
5.22.1 PANDA恢复野生型DNA结合能力
我们用生物素标记了多种p53靶标和结合p53的共有序列,发现包括p53-R175H形成的PANDA(“PANDA-R175H”)在内的多种PANDA可以结合多种p53靶标,如我们展示包括由p53-R175H形成的PANDA在内,可以与参与p53的自我调节的MDM2结合;结合CDKN1A,编码p21蛋白,参与衰老、侵袭、转移、细胞干性和细胞周期阻滞;结合PIG3,与细胞凋亡有关;结合PUMA,与细胞凋亡有关;结合BAX,与细胞凋亡有关;和结合p53的共有序列(图36)。我们进一步发现,PANDA相比对应的mp53(即当未形成PANDA时),对这些p53靶标以及与结合p53的共有序列相比具有显著更高的亲和力。与用其他拯救剂(例如ZMC1、PRIMA-1、MIRA-1或RITA)处理mp53相比,由As形成的PANDA与这些p53靶标以及与结合p53的共有序列的亲和力高得多。
当我们在萤光素酶实验中测定As2O3拯救p53转录活性的能力时,我们发现PANDA在萤光素酶实验中显著增强了p53靶标的转录活性,例如PUMA,CDKN1A和MDM2(图37)。增强的荧光素酶信号很大程度上依赖于mp53,因为通过强力霉素(“DOX”)关闭p53-R175H可以大大消除这种增强。我们还发现,PANDA-R282W在PUMA启动子上的转录活性显著增强(增加21倍,相当于wtp53水平的84%)(图37),PANDA-G245S在PIG3启动子上的转录活性显著提高(增加近3倍,相当于77%的wtp53水平)(图41)。
与其他拯救剂相比,我们发现ATO介导PANDA形成是p53转录活性的更好的拯救剂。特别是我们发现其他拯救剂如SCH529074、PhiKan083、MIRA-1和PRIMA-1均可忽略不计,NSC319726为1.5倍,CP31398为1.5倍,RITA和STIMA-1可忽略不计,玫瑰树碱为3.3倍,ATO为21倍(图37和图41)。
5.22.2 PANDA极大增强了野生型转录活性
特别是我们发现其他拯救剂如SCH529074、PhiKan083、MIRA-1和PRIMA-1均可忽略不计,NSC319726为1.5倍,CP31398为1.5倍,RITA和STIMA-1可忽略不计,玫瑰树碱为3.3倍,ATO为21倍(图37和图41)。比较而言,PANDA大大增强了野生型转录活性。
PANDA显著提高表达外源mp53或内源mp53的细胞中p53下游mRNA水平。在表达外源性p53-R175H的H1299细胞中加入ATO可以在24小时极大地刺激p53下游mRNA的水平,包括MDM2、PIG3、PUMA、CDKN1A和BAX。预期之中的,Nutlin刺激wtp53可显著提高表达wtp53的HCT116细胞中的PUMA、PIG3、CDKN1A和MDM2 mRNA水平。
在表达内源性p53-R249S的BT549细胞中加入ATO可以极大地刺激p53下游mRNA的水平,包括PUMA和CDKN1A(图38)。
在蛋白质水平上,PANDA可以显著提高表达mp53的细胞中p53下游蛋白质水平。例如,向表达mp53的细胞(例如表达p53-R175H的H1299细胞)加入ATO,我们检测到p53靶标(即下游蛋白)的增加,例如PUMA、BAX、PIG3、p21和MDM2(图39)。PANDA的形成对这些蛋白质的上调过程是必须的,因为DOX诱导的mp53耗竭很大程度上消除了这些上调。此外,我们发现ATO通过形成PANDA在表达结构型mp53的HCT116细胞(包括p53-R175H、p53-R249S或p53-R282W)中显著上调PUMA蛋白(图42)。
5.23 PANDA是体外肿瘤抑制子
我们还首次发现PANDA,例如PANDA-R175H,不仅恢复了wtp53转录活性,还在体外和体内恢复了wtp53的肿瘤抑制能力,包括在异种移植模型中。我们发现将ATO加入表达p53-R175H的细胞可显著提高mp53表达的细胞(例如H1299细胞)对细胞死亡的敏感性,这表明所形成的PANDA-R175H通过抑制细胞生长在细胞中起着肿瘤抑制作用(图44)。此外,我们发现将ATO加入表达p53-R175的细胞(例如H1299细胞)时,还可以显着抑制这些细胞的克隆形成,并且在很大程度是p53-R175H依赖的,这进一步表明所形成的PANDA-R175H具有抑制肿瘤的作用。通过抑制克隆形成发挥作用(例如图44中的克隆形成结果)。在小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)中观察到了相似的结果,其中PANDA-R172H的存在在细胞活力测定和克隆形成测定中均赋予了ATO处理敏感性(图49)。相反当不存在p53时(即在不含p53细胞中)无法形成PANDA,因此这些细胞对ATO处理更具抵抗力(图49)。这些证明ATO结合小鼠p53-R172H以形成肿瘤抑制物PANDA-R172H并抑制细胞生长和克隆形成。综上所述,我们的结果表明ATO在体外将mp53(例如p53-R175H)转化为抑癌的PANDA。
为了测试ATO是否靶向结构型mp53抑制恶性肿瘤,我们将ATO应用于10种具有不同p53状态的细胞系,包括wtp53、p53-/-(不含p53)、截短p53、p53-R249S、p53-R175L和p53-R175H。意料之中的,表达mp53结构的细胞系(R175和R249)的ATO IC50(范围在0.1-1μg/ml之间)比表达wtp53或无效/截短的p53(范围在0.5-10μg/ml之间)的低(图45)。在对照组中,Nutlin(一种MDM2抑制剂,是wtp53重新激活剂)优先靶向我们测试的wtp53细胞系(图45)。
这项独立进行的NCI60筛选项目提供了无偏见的细胞系敏感性概况,反映了化合物与细胞系遗传特征之间的关联。我们区分出表达ATO可拯救mp53(R175、G245、R249和R282)的细胞系,并将其命名为“Struc”。我们还区分出无法通过ATO拯救的表达wtp53,或不含p53或剪切型p53的细胞系(分别将其命名为“WT”和“Null”)。我们随后将剩余的细胞系合并在一起命名为“其他”,因为它们的拯救潜力不确定。我们发现NSC92859(ATO)表现出较低的GI50(引起50%生长抑制的浓度)(Shoemaker,2006)并选择性抑制携带结构型mp53的细胞系(图46)。如预期的那样,Nutlin选择性抑制了携带wtp53的细胞系(图46)。根据此p53分类,发现p53状态与NSC281668(PRIMA-1)或NSC319726敏感性之间无显著关联(图50)。综上所述,这些结果表明结构型mp53在抑制恶意肿瘤时是ATO的靶标。
5.24 PANDA协同wtp53激活剂杀伤p53表达细胞
我们进一步发现,PANDA的作用与wtp53激活剂(例如MDM2抑制剂或MDM4抑制剂)的协同作用杀死mp53表达细胞。p53拯救剂和wtp53激活剂协同作用(至少不是拮抗作用)的能力特别重要。一个原因是因为被拯救mp53的第一个目标之一是其负调节剂MDM2和MDM4,例如MDM2是p53的强大抑制剂,可有效降解p53,换句话说,当mp53获救时,其水平也会降低。确实,我们发现Detroit 562细胞中的p53-R175H和CEM-C1被ATO处理后下调(图40和图43)。但在存在wtp53激活剂的情况下,获救的mp53(PANDA)的寿命及其肿瘤抑制功能大大增加。PANDA可与多种MDM2抑制剂(例如Nutlin3)联用的能力,对癌症治疗极为有效且有吸引力。
我们发现,MDM2抑制剂Nutlin3与ATO协同作用(图51)。如在没有ATO的情况下,0-8μg/ml Nutlin剂量依赖地抑制表达wtp53的H1299细胞,但不抑制表达p53-R175H或不含p53的细胞(图51)。但是在存在ATO的情况下,Nutlin能够剂量依赖地抑制表达p53-R175H的H1299细胞。
我们的发现具有重要的临床价值,因为我们证明了ATO可以与其他癌症抑制疗法协同作用,这种包含ATO的抗癌联合疗法具有重大前景,并且ATO可以提高wtp53激活剂(例如MDM2抑制剂)的效果,其中许多目前正在临床试验中。
5.25 PANDA是体内肿瘤抑制子
我们还首次发现PANDA,例如PANDA-R175H,在体内(包括异种移植模型中)也恢复了wtp53肿瘤抑制能力。例如我们发现ATO和PANDA在至少两种异种移植模型中抑制体内肿瘤:强力霉素条件性调控关闭的p53-R175H的H1299细胞(实体瘤)(图47和图52-图54)和表达p53-R175H的血液CEM-C1细胞(血液恶性肿瘤)(图48和图55)。对于H1299系统,我们设计了可以通过添加强力霉素(“DOX”)来耗尽mp53的H1299细胞。
通过H1299系统,我们将H1299细胞皮下注射到接受和不接受5mg/kg ATO给药的小鼠中。我们根据肿瘤大小和重量,发现在第28天肿瘤被抑制了90%以上(图47和图52-图54)。此外我们发现肿瘤抑制主要依赖于PANDA-R175H,因为强力霉素对p53-R175H的消耗在很大程度上消除了ATO和PANDA介导的肿瘤抑制作用(图47,比较黑色实线和黑色虚线指示的肿瘤大小;比较最后两个柱形指示的肿瘤重量)。
通过血液学CEM-C1系统,我们在第1天将CEM-C1细胞通过尾静脉注射异种移植到小鼠上。我们能够在第22天从小鼠外周血(“PB”)中检测出异种化的CEM-C1癌细胞(图48和图55)。从第24天起,每周连续6天服用5mg/kg ATO。我们发现ATO给药明显减慢了第26天PB中CEM-C1细胞的增殖(图48和图55)。我们进一步发现ATO给药可以延长小鼠的生存期(图48)。
综上所述,我们在此证明了ATO和PANDA可以在体内显著抑制实体瘤和血液肿瘤,并延长个体的寿命。
5.26 ATO与临床用药有效联合治疗癌症
为了研究ATO的联合治疗作用,我们研究了ATO加药或不加药时广泛应用的DNA损伤剂的效果。
mp53与多种癌症,包括髓样白血病(AML/MDS)病人的总体生存和预后很差有关(Cancer Genome Atlas Research等,2013;Lindsley等,2017)。根据NCCN指南,除APL外大多数推荐的AML/MDS治疗方法都是使用DNA损伤剂。已知这些DNA损伤剂可激活wtp53功能,以通过p53翻译后修饰(“PTM”)杀死癌细胞(Murray-Zmijewski等,2008),这些PTM包括例如磷酸化、乙酰化、磺酰化、炔化、甲基化和泛素化。
值得注意的是,我们发现mp53(例如p53-R175H)和PANDA(例如PANDA-R175H)对DNA损伤剂的反应不同,例如顺铂、依托泊苷、阿霉素/阿霉素、5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷、阿扎胞苷、地西他滨和紫杉醇,提示它们可能会导致不同的处理结果。我们发现在DNA损伤剂处理后,p53-R175H的Ser15、Ser37和Lys382不容易被修饰。但在PANDA-R175H上它们被积极修饰(我们将这类PTM命名为1型PTM)(图56和图60)。我们发现Ser20在p53-R175H不容易被修饰,与DNA损伤压力无关。但它在PANDA-R175H容易被修饰,与DNA损伤压力无关(命名为2型PTM)。我们发现Ser392在p53-R175H和PANDA-R175H上均容易被修饰,即使没有DNA损伤压力(命名为3型PTM)。
对1型PTM和2型PTM的鉴定表明p53-R175H和PANDA-R175H对此疗法有不同反应,因此可能会导致不同处理结果(图56和图60),如图60验证了所用抗体对磷酸化的特异性。
除了展示ATO和DNA损伤剂的联合疗法可以刺激mp53 PTM从而重新激活mp53之外,我们还证明了p53-R175H与被拯救的结构型PANDA-R175H之间的PTM差异支持以前的观点,即结合型mp53(也适用于wtp53)与结构性mp53在DNA损伤压力下的磷酸化潜力不同(Gillotin等,2010)。
5.27 ATO和PANDA可有效治疗AML/MDAS患者且可以通过患者筛查进一步加强治疗
我们进一步发现,ATO和PANDA可有效治疗AML/MDS患者。
例如,我们测试了ATO和DNA损伤剂联合治疗AML/MDS患者的治疗效果。在我们的一项临床试验中,招募了50名AML/MDS患者用于TP53外显子组测序(图57),其中发现三名患者携带p53突变(mp53变异等位基因比例>10%)。我们特别确定了两名患者在同一残基上具有p53突变:患者S241F表达了p53-S241F,患者S214C表达了p53-S241C(图58)。我们进一步发现在IP分析中,这两名患者的p53-S241C和p53-S241F表现得像结构性mp53,并且对PAb1620的反应较差(图58),但用ATO处理后,形成的PANDA可以拯救p53-S241C和p53-S241F的结构(图58)。此外,我们发现ATO和PANDA通过诱导p21(一个负责细胞周期停滞,细胞衰老和肿瘤抑制的p53靶标)显著拯救p53-S241C和p53-S241F的转录活性(图58)。
我们还发现了第三位患者R273L(表达p53-R273L),发现该mp53表现得类似wtp53,并且ATO无法在4℃和生理温度37℃进一步增强其PAb1620表位(图62)。
着眼于S241,我们将所有可能的氨基酸替换到该位置,发现p53-S241R/N/C/Q/L/F可被ATO拯救,从其正确折叠的PAb1620表位以及PUMA和p21诱导能力得到证明(图58)。
所得的p53-S241A不是明显的结构型mp53,因此无法通过ATO进行拯救(图59和图61)。有趣的是,p53-S241D(一种明显的结构型mp53)无法被ATO拯救(图59和图61)。汇总结果如图59和图61所示。
为了进一步延伸该发现,我们在体外测试了至少35个AML/MDS来源的mp53,发现ATO可以以多种效率拯救这些mp53的结构。
因此,我们在试验中选择了两名表达ATO可拯救的p53-S241F和p53-S241C的MDS患者(但没有表达p53-R274L的患者),以测试在MDS患者中ATO和作为第一线药物的胞苷类似物的联合治疗效果,如地西他滨(“DAC”,一种与DNA结合并破坏DNA并使其脱甲基的化合物),这两名患者均明显的完全缓解。与标准一线DAC方案相比,我们发现表达mp53的患者可以从ATO和临床使用药物(如DAC)联合方案中更受益,这可以从他们的无复发生存时间延长到大约11个月来判断。总的来说,我们已经确认ATO和PANDA可有效治疗癌症患者,例如AML/MDS患者,尤其是那些具有PANDA可拯救mp53的患者。我们进一步发现,可以首先通过对p53状态进行测序,然后选择对ATO最敏感的mp53突变(例如S241C和S241F突变)的患者来增强治疗效果。
6.实施例
6.1质粒,抗体,细胞系,化合物和小鼠
表达人全长p53的pcDNA3.1由Xin Lu教授(牛津大学)赠予,表达融合GST和人全长p53蛋白的pGEX-2TK从Addgene购买(#24860),克隆表达p53核心的pET28a用于结晶实验,无需引入任何标签。
一抗购自以下公司:DO1(ab1101,Abcam),PAb1620(MABE339,EMD Millipore),PAb240(OP29,EMD Millipore),PAb246(sc-100,Santa Cruz),PUMA(4976,Cellsignaling),PIG3(ab96819,Abcam),BAX(sc-493,Santa Cruz),p21(sc-817,Santa Cruz),MDM2(OP46-100UG,EMD Millipore),Biotin(ab19221,Abcam),Tubulin(ab11308,Abcam),β-actin(A00702,Genscript),p53-S15(9284,Cell signaling),p53-S20(9287,Cellsignaling),p53-S37(9289,Cell signaling),p53-S392(9281,Cell signaling),p53-K382(ab75754,Abcam),KU80(2753,Cell signaling)。CM5抗体由Xin Lu教授赠予。HRP偶联的与轻链特异性反应的二抗购自Abcam(ab99632)。
表达不含p53的H1299和Saos-2细胞系是由Xin Lu教授赠予。按先前报道的方法制备强力霉素条件性调控关闭的p53-R175H或tet-on调节的wtp53的H1299细胞系(Fogal等,2005)。MEFs细胞从E13.5 TP53-/-和TP53-R172H/R172H胚胎中制备。其他细胞系获自ATCC。
化合物从以下公司购买:DMSO(D2650,sigma),CP31398(PZ0115,sigma),Arsenictrioxide(202673,sigma),STIMA-1(506168,Merck Biosciences),SCH 529074(4240,Tocris Bioscience),PhiKan 083(4326,Tocris Bioscience),MiRA-1(3362,TocrisBioscience),Ellipticine(3357,Tocris Bioscience),NSC 319726(S7149,selleck),PRIMA-1(S7723,selleck),RITA(NSC 652287,S2781,selleck),Cycloheximide(C7698,sigma),Biotin(A600078,Sangon Biotech),Doxycycline hyclate(D9891,sigma),Cisplatin(CIS,P4394,sigma),Etoposide(ETO,E1383,sigma),Adriamycin(ADM,S1208,selleck),5-Fluorouracil(5-FU,F6627,sigma),Cytarabine(ARA,S1648,selleck),Azacitidine(AZA,A2385,sigma),Decitabine(DAC,A3656,sigma),Paclitaxel(TAX,S1150,selleck)。Bio-As和Bio-Dithi-As由Kenneth L.Kirk赠予(NIH;PMID:18396406)。
TP53野生型小鼠,雌性裸鼠和NOD/SCID小鼠获自中国科学院上海实验动物中心。TP53-R172H/R172H小鼠由购自Jackson Lab的亲本小鼠(026283)产生。TP53-/-小鼠(002101)从中国小鼠模型国家资源中心购买。
DNA样品在上海嘉因生物科技公司和上海伯豪生物技术有限公司进行测序。
6.2从细菌中制备PANDA(无p53N端和C端,无标签)
将表达重组p53核心的构建体转化到大肠杆菌BL21-Gold菌株中,将细菌在LB或M9培养基中于37℃培养至对数中期,在加入或不加入50μM As/Sb/Bi和1mM ZnCl2的情况下,在25℃下添加0.5mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)过夜。在存在或不存在50μM As/Sb/Bi下,通过以4000RPM离心20分钟(从1升培养基中获得菌体)离心收集细胞,然后在裂解物缓冲液(50mM Tris,pH 7.0,50mM NaCl,10mM DTT和1mM苯甲基磺酰基)中进行超声处理。将可溶性裂解物上样至SP-Sepharose阳离子交换柱(Pharmacia)上,并用NaCl梯度液(0-1M)洗脱,如有必要,再通过在Tris.HCl,pH 7.0,10mM DTT中的肝素-Sepharose柱(Pharmacia)进行亲和层析纯化,用NaCl(0-1M)梯度洗脱。使用Superdex 75色谱柱,按照标准程序通过凝胶过滤进行进一步纯化。
细胞裂解后的过程在4℃下进行。通过在280nm处使用消光系数为16 530cm-1M-1进行分光光度法测量蛋白质浓度。所有蛋白质纯化步骤均通过4-20%梯度SDS-PAGE进行监控,以确保它们几乎均质。
6.3从细菌中制备PANDA(GST标签)
将表达GST-p53(或GST-mp53)的构建体转化到大肠杆菌BL21-Gold菌株中。将细菌在800ml LB培养基中于37℃培养至对数中期,在加入或不加入50μM As/Sb/Bi的情况下,16℃下添加0.3mM IPTG24小时,通过4 000RPM离心20分钟收集细胞,然后在30ml裂解液(58mMNa2HPO4·12H2O,17mM NaH2 PO4·12H2O,68mM NaCl,1%Triton X-100)中超声处理。9000RMP离心1小时后的细胞上清液中加入400μl谷胱甘肽珠(Pharmacia)并孵育过夜。用裂解物缓冲液洗涤珠子3次,然后用300μl洗脱缓冲液(10mM GSH,100mM NaCl,5mM DTT和50mMTris-HCl,pH 8.0)洗脱重组蛋白。细胞裂解后的过程在4℃下进行。所有蛋白质纯化步骤均通过4-20%梯度SDS-PAGE进行监控,以确保它们几乎均质。
6.4在昆虫细胞中制备PANDA
收集加入或不加入50μM As/Sb/Bi的表达重组人全长p53或p53核心的杆状病毒感染的Sf9细胞,在加入或不加入50μM As/Sb/Bi的情况下用裂解液缓冲液(50mM Tris·HCl,pH 7.5,5mM EDTA,1%NP-40,5mM DTT,1mM PMSF和0.15M NaCl)裂解细胞,将裂解物在冰上孵育30分钟,然后以13000rpm离心30分钟。使用15%甘油,25mM HEPES,pH 7.6、0.1%Triton X-100、5mM DTT和1mM苯甲脒将上清液稀释4倍。将它们用0.45mm过滤器进一步过滤,并通过肝素-琼脂糖柱(Pharmacia)纯化。然后使用YM30 Centricon(EMD,密理博公司)浓缩纯化的蛋白质。所有蛋白质纯化步骤均通过4-20%梯度SDS-PAGE进行监控,以确保它们几乎均质。
6.5体外制备PANDA
通过将p53,包括纯化的p53或细胞裂解物中与PANDA试剂混合的p53,可以有效地形成PANDA。例如,在反应缓冲液(20mM HEPES,150mM NaCl,pH 7.5)中,我们将纯化的重组p53核心与As/Sb/Bi化合物在4℃下以10:1-1:100的比例混合过夜,然后通过透析纯化形成的PANDA以消除化合物。
6.6重组GST-p53-R175H和As的体外反应
向反应缓冲液(10mM GSH,100mM NaCl,5mM DTT和50mM Tris-HCl,pH 8.0)中的50μM纯化重组蛋白GST-p53-R175H中加入生物素-As,砷与p53的摩尔比为10:1或1:1。将混合物溶液在4℃孵育过夜,然后分成三部分。对每个部分进行SDS-PAGE,然后分别进行考马斯亮蓝染色(应用5μg GST-p53-R175H),p53免疫印迹(应用0.9μg GST-p53-R175H)或生物素免疫印迹(应用5μg GST-p53-R175H)。
6.7免疫沉淀反应
为了进行免疫沉淀,收集哺乳动物细胞或细菌细胞,并在带有蛋白酶抑制剂混合物(Roche Diagnostics)的NP40缓冲液(50mM Tris-HCl pH 8.0,150mM NaCl,1%NP40)中裂解,将细胞裂解物超声处理3次,然后以13,000RPM离心20分钟。使用450μl NP40缓冲液将上清液的终浓度调节为1mg/ml总蛋白,并与20μl G蛋白珠和1-3μg相应的一抗在4℃下孵育2小时。室温下用20-25℃NP40缓冲液洗涤磁珠3次。离心后,将珠子在2x SDS上样缓冲液中煮沸5分钟,然后进行蛋白质印迹。
6.8基于生物素-砷的拉下反应
细胞用4μg/ml生物素-As或Bio-dithi-As处理2小时,在具有蛋白酶抑制剂混合物(Roche Diagnostics)的NP40缓冲液(50mM Tris-HCl pH 8.0、150mM NaCl,1%NP40)中裂解细胞,然后将细胞裂解物超声处理3次,以13,000RPM离心1小时。使用450μl NP40缓冲液将上清液调节至终浓度为1mg/ml总蛋白,并在20℃下与20μl链霉亲和素珠孵育2小时,然后进行磁珠洗涤和蛋白质印迹。
6.9基于生物素-DNA的拉下实验
为了制备双链寡核苷酸,将等量的互补单链寡核苷酸在0.25M NaCl中于80℃加热5分钟,然后缓慢冷却至室温。单链寡核苷酸的序列如下:
共有序列 | 5’-生物素-TCGAGAGGCATGTCTAGGCATGTCTC |
PUMA | 5’-生物素-CTGCAAGTCCTGACTTGTCC |
PIG3 | 5’-生物素-AGAGCCAGCTTGCCCACCCATGCTCGCGTG |
BAX | 5’-生物素-TCACAAGTTAAGACAAGCCTGGGCGTGGGC |
MDM2 | 5’-生物素-CGGAACGTGTCTGAACTTGACCAGCTC |
p21 | 5’-生物素-CGAGGAACATGTCCCAACATGTTGCTCGAG |
共有序列-R | 5’-GAGACATGCCTAGACATGCCTCTCGA |
PUMA-R | 5’-GGACAAGTCAGGACTTGCAG |
PIG3-R | 5’-CACGCGAGCATGGGTGGGCAAGCTGGCTCT |
BAX-R | 5’-GCCCACGCCCAGGCTTGTCTTAACTTGTGA |
MDM2-R | 5’-GAGCTGGTCAAGTTCAGACACGTTCCG |
p21-R | 5’-CTCGAGCAACATGTTGGGACATGTTCCTCG |
收获细胞并在具有蛋白酶抑制剂混合物(Roche Diagnostics)的NP40缓冲液(50mM Tris-HCl pH 8.0,150mM NaCl,1%NP40)中裂解,将细胞裂解物超声处理3次,然后以13,000RPM离心1小时。使用450μl NP40缓冲液将上清液的终浓度调整为1mg/ml总蛋白,并与20μl链霉亲和素珠(s-951,Invitrogen),20pmol生物素化双链寡核苷酸和2μg poly(dI-dC)(sc-286691,Santaz cruz)一起孵育。将裂解液在4℃下孵育2小时,然后洗珠并进行免疫印迹。
6.10免疫印迹实验
免疫印迹实验如以前报道(Lu等,2013)。
6.11荧光素酶实验
将细胞以2×104细胞/孔的浓度铺在24孔板中,然后转染萤光素酶报告质粒24小时。所有的转染均包含300ng p53表达质粒,100ng荧光素酶报道质粒和5ng海肾质粒每孔。试剂处理后,将细胞在萤光素酶报告基因检测缓冲液中溶解,并使用萤光素酶检测试剂盒(Promega)进行测定。萤光素酶的活性除以海肾的活性,以标准化转染效率。有关更多详细信息,请参见(Lu等,2013)。
6.12克隆形成实验
用胰蛋白酶消化处理过的细胞。将100、1000或10,000个细胞/孔接种到12孔板中,并培养2-3周,每三天更换一次新鲜培养基。
6.13非变形聚丙烯酰胺凝胶电泳
将细胞在CHAPS缓冲液(TBS中18mM 3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基铵]-1-丙烷磺酸或含有DNase和蛋白酶抑制剂的M-PER缓冲液(78501,Invitrogen)中于4℃或37℃裂解15分钟。在加入3–12%Novex Bis-Tris梯度凝胶之前,向细胞裂解液中加入20%甘油和5mMCoomassie G-250。电泳按照制造商说明在4℃下进行。将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯膜上,并用8%的乙酸固定20分钟。然后将固定的膜风干并用100%甲醇脱色。免疫印迹之前,在4℃下用4%BSA的TBS封闭膜过夜。
6.14实时荧光定量PCR
使用总RNA纯化试剂盒(B518651,Sangon Biotech)从细胞中分离总RNA。按照制造商说明,使用逆转录酶系统(A5001,Promega)对1μg总RNA进行逆转录。使用SYBR绿色混合物(Applied Biosystems)和ViiATM7 Real-Time PCR系统(Applied Biosystems)一式三份进行PCR:在95℃下10分钟,然后进行40个循环95℃下15s和60℃1分钟。检查每个引物组和来自熔解曲线分析的样品的PCR产物的特异性。采用比较Ct法将靶基因的表达水平相对于β-肌动蛋白水平标准化。引物序列如下:MDM2正向5’-CCAGGGCAGCTACGGTTTC-3’,反向5’-CTCCGTCATGTGCTGTGACTG-3’;PIG3正向5’-CGCTGAAATTCACCAAAGGTG-3’,反向5’-AACCCATCGACCATCAAGAG-3’;PUMA正向5’-ACGACCTCAACGCACAGTACG-3’,反向5’-TCCCATGATGAGATTGTACAGGAC-3’;p21正向5’-GTCTTGTACCCTTGTGCCTC-3’,反向5’-GGTAGAAATCTGTCATGCTGG-3’;Bax正向5’-GATGCGTCCACCAAGAAGCT-3’,反向5’-CGGCCCCAGTTGAAGTTG-3’;β-actin正向5’-ACTTAGTTGCGTTACACCCTTTCT-3’,反向5’-GACTGCTGTCACCTTCACCGT-3’。
6.15异种移植实验
H1299异种移植。将悬浮在100μl生理盐水溶液中的强力霉素条件性调控关闭的p53-R175H的H1299细胞(1*106个细胞)皮下注射到8-9周龄雌性裸鼠的腹侧。当肿瘤面积达到0.1cm(第1天)时,每周连续6天腹膜内注射5mg/kg ATO。在DOX组中,将0.2mg/ml强力霉素添加到饮用水中。每三天用游标卡尺测量一次肿瘤大小。使用以下公式计算肿瘤体积:(L*W*W)/2,其中L代表肿瘤的大直径,W代表小直径。在任何一组中,当肿瘤面积达到1cm直径时,处死小鼠并称重分离出的肿瘤。使用Bonferroni校正的双向RM ANOVA对两组之间的差异进行分析。
CEM-C1异种移植。8-9周大的NOD/SCID小鼠通过尾静脉静脉注射1*107的CEM-C1T-ALL细胞(第1天)。植入后,从第16天到第26天每3或4天从小鼠眶后窦获取外周血样品。使用红细胞裂解缓冲液(NH4Cl 1.5mM,NaHCO3 10Mm,EDTA-2Na 1mM)除去残留的红细胞。分离的细胞用PerCP-Cy5.5偶联的抗小鼠CD45(mCD45)(BD PharmigenTM,San Diego,CA)和FITC偶联的抗人CD45(hCD45)(BD PharmigenTM,San Diego,CA)抗体双染色,然后再进行流式细胞分析。当一只小鼠的外周血中hCD45+细胞的百分比达到0.1%时(第22天),准备注射用ATO。在第23天,每周连续6天通过尾静脉注射在0.1ml生理盐水溶液中的5mg/kg ATO。各组之间hCD45+细胞百分比的比较通过不配对t检验进行。通过对数秩(Mantel-Cox)测试分析小鼠的寿命。
所有统计分析均使用微软的GraphPad Prism 6.00(La Jolla California,USA)进行。将动物饲养在无特定病原体的条件下。根据美国国立卫生研究院实验动物的护理和使用指南进行实验。
6.16 ATO通过提高熔点来极大地提高mp53的稳定性
我们通过差示扫描荧光法在pH 7.5HEPES缓冲液中以指示的ATO比例记录纯化的p53核心域R175H(94-293)的熔解曲线(图70A)。
我们将ATO和纯化的重组p53C(p53C-WT、p53C-R175H、p53C-G245S、p53C-R249S和p53C-R282W,每个反应5μM)按图70B中所示的比例在pH 7.5HEPES缓冲液中混合过夜。通过DSF在pH 7.5HEPES缓冲液中测量p53C的熔解曲线。在pH 7.5HEPES缓冲液中,p53C-R175H、p53C-G245S、p53C-R249S和p53C-R282W的表观Tm最高可提高1.1-6.5℃。显示了p53核心的熔解温度(平均值±标准差,n=3)(图70B)。
我们进一步测定了纯化p53核心域R175H(94-293)的熔解曲线,该曲线通过差示扫描荧光法在pH 7.5HEPES,150mM NaCl缓冲液中以指示的ATO比例记录(图70C)。
我们进一步将ATO和纯化的重组p53C(p53C-WT、p53C-R175H、p53C-G245S、p53C-R249S和p53C-R282W,每个反应5μM)按图70D中的比例在pH 7.5HEPES,150mM NaCl中混合过夜。通过DSF在pH 7.5HEPES,150mM NaCl缓冲液中测定p53C的熔解曲线。在pH 7.5HEPES,150mMNaCl缓冲液中,p53C-R175H、p53C-G245S、p53C-R249S和p53C-R282W的表观Tm最高可升高1.0-5.1℃。显示了p53核心的熔解温度(平均值±标准差,n=3)(图70D)。
我们通过在pH 7.5HEPES缓冲液中以指示的ATO比例通过差示扫描荧光法进一步测量了纯化的p53核心域(p53C-WT、p53C-G245S、p53C-R249S和p53C-R282W)的熔解曲线(图70E)。
我们通过在pH 7.5HEPES,150mM NaCl缓冲液中以指示的ATO比例通过差示扫描荧光法进一步测量了纯化的p53核心域(p53C-WT、p53C-G245S、p53C-R249S和p53C-R282W)的熔解曲线(图70E)。
综上所述,我们的结果表明通过差示扫描荧光法记录与ATO孵育的p53的熔解温度。在加入或不加入150mM NaCl的情况下,在pH 7.5HEPES缓冲液中培养的p53的Tm升高。在HEPES缓冲液中,p53C-R175H、p53C-G245S、p53C-R249S和p53C-R282W的Tm可以分别升高例如6.5℃,1.1℃,3.7℃和4.7℃(图70B)。在HEPES,150mM NaCl缓冲液中p53C-R175H、p53C-G245S、p53C-R249S和p53C-R282W的Tm分别提高例如5.1℃,1.0℃,2.3℃和3.0℃(图70D)。数据表明p53C-WT也可以被稍微稳定。图70A和70C中所代表的p53C-R175H在ATO孵育下的峰值曲线右移,表明PANDA-R175H在相同温度下比p53C-R175H更稳定。在p53C-WT、p53C-G245S、p53C-R249S和p53C-R282W中记录到了相似的数据(见图70E和70F)。
6.17 PANDA恢复了大多数p53靶基因的转录活性
我们用wtp53、p53-R273H或p53-R282W转染了SaOS-2细胞,并用1μg/ml ATO处理24小时。通过RNA测序确定p53靶标的表达水平。测定了报道的116个p53激活靶的倍数变化值的热图(指示的样品组与载体)(图71A),还测定了另一项研究中报道的127个p53靶标的倍数变化值的热图(图71B)。
我们进一步使用RNA测序(RNA-seq)确定了在p53靶标中形成的PANDA的功能。发现在报道的116个基因中p53激活的靶标里,大多数基因被PANDA-R282W上调,包括众所周知的p53靶标BBC3、BAX、TP53I3、CDKN1A和MDM2(图71A)。在另一项研究中报道的127个p53靶标(包括p53激活和抑制的基因)中也发现了相似的结果(图71B)。相比之下,涉及结合型突变体p53的PANDA-R273H的转录活性并未以相似的水平恢复。
6.18数据分析
除非另有说明,否则使用费舍尔精确检验(双尾)进行统计分析。除非另有说明,否则p值小于0.05被认为具有统计学意义。
6.19表1 1100个包含三种价态砷(“As”)的化合物被预测可有效结合PANDA口袋,并有效拯救结构性mp53。PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)中记录的所有9420万个结构均用于4C+筛选。在4C+筛选中,我们收集了具有结合2个以上半胱氨酸潜力的物质。碳结合As/Sb/Bi键在结合半胱氨酸方面存在缺陷,因为该键无法水解。另一个As/Sb/Bi键可以在细胞中水解,因此能够结合半胱氨酸。
6.20表2 3071个含五价砷(As)的化合物被预测可有效结合PANDA口袋和有效拯救结构性mp53。PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)中记录的所有9420万个结构均用于4C+筛选。在4C+筛选中,我们收集了具有结合2个以上半胱氨酸潜力的物质。碳结合As/Sb/Bi键在结合半胱氨酸方面存在缺陷,因为该键无法水解。另一个As/Sb/Bi键可以在细胞中水解,因此能够结合半胱氨酸。
6.21表3 558个包含三价铋(“Bi”)的化合物被预测有效结合PANDA Pocket并有效拯救结构性mp53。PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)中记录的所有9420万个结构均用于4C+筛选。在4C+筛选中,我们收集了具有结合2个以上半胱氨酸潜力的物质。碳结合As/Sb/Bi键在结合半胱氨酸方面存在缺陷,因为该键无法水解。另一个As/Sb/Bi键可以在细胞中水解,因此能够结合半胱氨酸。
6.22表4 125个五价锑(“Sb”)结构被预测可有效结合PANDA口袋并有效拯救mp53结构。PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)中记录的所有9420万个结构均用于4C+筛选。在4C+筛选中,我们收集了具有结合2个以上半胱氨酸潜力的物质。碳结合As/Sb/Bi键在结合半胱氨酸方面存在缺陷,因为该键无法水解。另一个As/Sb/Bi键可以在细胞中水解,因此能够结合半胱氨酸。
6.23表5937个三价铋(“Bi”)结构被预测可有效结合PANDA口袋,并有效拯救mp53结构。PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)中记录的所有9420万个结构均用于4C+筛选。在4C+筛选中,我们收集了具有结合2个以上半胱氨酸潜力的物质。碳结合As/Sb/Bi键在结合半胱氨酸方面存在缺陷,因为该键无法水解。另一个As/Sb/Bi键可以在细胞中水解,因此能够结合半胱氨酸。
6.24表6 1896个五价铋(“Bi”)结构被预测可有效结合PANDA口袋,并有效拯救mp53结构。PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)中记录的所有9420万个结构均用于4C+筛选。在4C+筛选中,我们收集了具有结合2个以上半胱氨酸结合潜力的物质。碳结合As/Sb/Bi键在结合半胱氨酸方面存在缺陷,因为该键无法水解。另一个As/Sb/Bi键可以在细胞中水解,因此能够结合半胱氨酸。
6.25表7通过我们的实验验证的具有拯救结构和转录活性的典型PANDA试剂。从表1至表6中随机选择化合物,以及仅具有结合一个或两个半胱氨酸潜能的其他化合物,并使用PAb1620 IP分析和荧光素酶实验性地测试了它们折叠p53-R175H和在PUMA启动子上转录激活p53-R175H的能力。“+”增加表示化合物处理后p53-R175H在PUMA启动子上的转录活性增加。
6.26表8 p53范例
6.27 p53s人野生型p53范例
野生型人p53变构体a(NCBI参考序列:NP_000537.3细胞肿瘤抗原p53异构体a【人类(homo sapiens)】;NCBI参考序列:NP_001119584.1,NP_001119584.1细胞肿瘤抗原p53异构体a【人类】),也称为p53同种型1(通用蛋白质数据库标识符:P04637-1,sp|P04637|P53_人类肿瘤抗原p53 OS=人类GN=TP53 PE=1SV=4),也称为p53,全长p53和p53α。PANDA半胱氨酸下划线标注。
393aa
MEEPQSDPSVEPPLSQETFSDLWKLLPENNVLSPLPSQAMDDLMLSPDDIEQWFTEDPGPDEAPRMPEAAPPVAPAPAAPTPAAPAPAPSWPLSSSVPSQKTYQGSYGFRLGFLHSGTAKSVTCTYSPALNKMFCQLAKTCPVQLWVDSTPPPGTRVRAMAIYKQSQHMTEVVRRCPHHERCSDSDGLAPPQHLIRVEGNLRVEYLDDRNTFRHSVVVPYEPPEVGSDCTTIHYNYMCNSSCMGGMNRRPILTIITLEDSSGNLLGRNSFEVRVCACPGRDRRTEEENLRKKGEPHHELPPGSTKRALPNNTSSSPQPKKKPLDGEYFTLQIRGRERFEMFRELNEALELKDAQAGKEPGGSRAHSSHLKSKKGQSTSRHKKLMFKTEGPDSD
野生型人p53变构体b(NCBI参考序列:NP_001119586.1,NP_001119586.1细胞肿瘤抗原p53异构体b【人类】),也称为p53同种型2(通用蛋白质数据库标识符:P04637-2,sp|P04637-2|P53_人类肿瘤抗原p53的异构体2p53 OS=人类GN=TP53),也称为p53β。PANDA半胱氨酸下划线标注。
341aa
MEEPQSDPSVEPPLSQETFSDLWKLLPENNVLSPLPSQAMDDLMLSPDDIEQWFTEDPGPDEAPRMPEAAPPVAPAPAAPTPAAPAPAPSWPLSSSVPSQKTYQGSYGFRLGFLHSGTAKSVTCTYSPALNKMFCQLAKTCPVQLWVDSTPPPGTRVRAMAIYKQSQHMTEVVRRCPHHERCSDSDGLAPPQHLIRVEGNLRVEYLDDRNTFRHSVVVPYEPPEVGSDCTTIHYNYMCNSSCMGGMNRRPILTIITLEDSSGNLLGRNSFEVRVCACPGRDRRTEEENLRKKGEPHHELPPGSTKRALPNNTSSSPQPKKKPLDGEYFTLQDQTSFQKENC
野生型人p53变构体c(NCBI参考序列:NP_001119585.1,NP_001119585.1细胞肿瘤抗原p53异构体c【人类】),也称为p53同种型3(通用蛋白质数据库标识符:P04637-3,sp|P04637-3|P53_人类肿瘤抗原p53的异构体3OS=人类GN=TP53),也称为p53γ。PANDA半胱氨酸下划线标注。
346aa
MEEPQSDPSVEPPLSQETFSDLWKLLPENNVLSPLPSQAMDDLMLSPDDIEQWFTEDPGPDEAPRMPEAAPPVAPAPAAPTPAAPAPAPSWPLSSSVPSQKTYQGSYGFRLGFLHSGTAKSVTCTYSPALNKMFCQLAKTCPVQLWVDSTPPPGTRVRAMAIYKQSQHMTEVVRRCPHHERCSDSDGLAPPQHLIRVEGNLRVEYLDDRNTFRHSVVVPYEPPEVGSDCTTIHYNYMCNSSCMGGMNRRPILTIITLEDSSGNLLGRNSFEVRVCACPGRDRRTEEENLRKKGEPHHELPPGSTKRALPNNTSSSPQPKKKPLDGEYFTLQMLLDLRWCYFLINSS
野生型人p53变构体g(NCBI参考序列:NP_001119590.1,NP_001119590.1细胞肿瘤抗原p53异构体g【人类】;NCBI参考序列:NP_001263689.1,NP_001263689.1细胞肿瘤抗原p53异构体g【人类】;NCBI参考序列:NP_001263690.1,NP_001263690.1细胞肿瘤抗原p53异构体g【人类】),也称为p53同种型4(通用蛋白质数据库标识符:P04637-4,sp|P04637-4|P53_人类肿瘤抗原p53的异构体4OS=人类GN=TP53),也称为Δ40p53α。PANDA半胱氨酸下划线标注。
354aa
MDDLMLSPDDIEQWFTEDPGPDEAPRMPEAAPPVAPAPAAPTPAAPAPAPSWPLSSSVPSQKTYQGSYGFRLGFLHSGTAKSVTCTYSPALNKMFCQLAKTCPVQLWVDSTPPPGTRVRAMAIYKQSQHMTEVVRRCPHHERCSDSDGLAPPQHLIRVEGNLRVEYLDDRNTFRHSVVVPYEPPEVGSDCTTIHYNYMCNSSCMGGMNRRPILTIITLEDSSGNLLGRNSFEVRVCACPGRDRRTEEENLRKKGEPHHELPPGSTKRALPNNTSSSPQPKKKPLDGEYFTLQIRGRERFEMFRELNEALELKDAQAGKEPGGSRAHSSHLKSKKGQSTSRHKKLMFKTEGPDSD
野生型人p53变构体i(NCBI参考序列:NP_001263625.1,NP_001263625.1细胞肿瘤抗原p53异构体i【人类】),也称为p53同种型5(通用蛋白质数据库标识符:P04637-5,sp|P04637-5|P53_人类肿瘤抗原p53的异构体5OS=人类GN=TP53),也称为Δ40p53β。PANDA半胱氨酸下划线标注。
302aa
MDDLMLSPDDIEQWFTEDPGPDEAPRMPEAAPPVAPAPAAPTPAAPAPAPSWPLSSSVPSQKTYQGSYGFRLGFLHSGTAKSVTCTYSPALNKMFCQLAKTCPVQLWVDSTPPPGTRVRAMAIYKQSQHMTEVVRRCPHHERCSDSDGLAPPQHLIRVEGNLRVEYLDDRNTFRHSVVVPYEPPEVGSDCTTIHYNYMCNSSCMGGMNRRPILTIITLEDSSGNLLGRNSFEVRVCACPGRDRRTEEENLRKKGEPHHELPPGSTKRALPNNTSSSPQPKKKPLDGEYFTLQDQTSFQKENC
野生型人p53变构体h(NCBI参考序列:NP_001263624.1,NP_001263624.1细胞肿瘤抗原p53异构体h【人类】),也称为p53同种型6(通用蛋白质数据库标识符:P04637-6,sp|P04637-6|人类肿瘤抗原p53的异构体6OS=人类GN=TP53),也称为Δ40p53γ。PANDA半胱氨酸下划线标注。
307aa
MDDLMLSPDDIEQWFTEDPGPDEAPRMPEAAPPVAPAPAAPTPAAPAPAPSWPLSSSVPSQKTYQGSYGFRLGFLHSGTAKSVTCTYSPALNKMFCQLAKTCPVQLWVDSTPPPGTRVRAMAIYKQSQHMTEVVRRCPHHERCSDSDGLAPPQHLIRVEGNLRVEYLDDRNTFRHSVVVPYEPPEVGSDCTTIHYNYMCNSSCMGGMNRRPILTIITLEDSSGNLLGRNSFEVRVCACPGRDRRTEEENLRKKGEPHHELPPGSTKRALPNNTSSSPQPKKKPLDGEYFTLQMLLDLRWCYFLINSS
7.参考文献
以下的出版物,参考文献,专利和专利申请等全部内容以引用形式纳入本文。
Alexandrova,E.M.,Yallowitz,A.R.,Li,D.,Xu,S.,Schulz,R.,Proia,D.A.,Lozano,G.,Dobbelstein,M.,和Moll,U.M.(2015年).治疗肿瘤依赖的稳定的突变型p53来提高生存,自然,第523卷,第352-356页.(Alexandrova,E.M.,Yallowitz,A.R.,Li,D.,Xu,S.,Schulz,R.,Proia,D.A.,Lozano,G.,Dobbelstein,M.,and Moll,U.M.(2015).Improving survival by exploiting tumour dependence on stabilized mutant p53for treatment.Nature 523,352-356.)
Aryee,D.N.,Niedan,S.,Ban,J.,Schwentner,R.,Muehlbacher,K.,Kauer,M.,Kofler,R.,和Kovar,H,2013年在尤因肉瘤中通过PRIMA-1(Met)/APR-246来恢复p53功能的多样性,英国癌症杂志,第109卷,第2696-2704页(Aryee,D.N.,Niedan,S.,Ban,J.,Schwentner,R.,Muehlbacher,K.,Kauer,M.,Kofler,R.,and Kovar,H.(2013).Variability in functional p53 reactivation by PRIMA-1(Met)/APR-246in Ewingsarcoma.British journal of cancer 109,2696-2704.)
Basse,N.,Kaar,J.L.,Settanni,G.,Joerger,A.C.,Rutherford,T.J.,和Fersht,A.R.2010年,稳定p53药物的理性设计,探究Y220C突变的蛋白表面,化学和生物,第17卷,第46-56页.(Basse,N.,Kaar,J.L.,Settanni,G.,Joerger,A.C.,Rutherford,T.J.,andFersht,A.R.(2010).Toward the rational design of p53-stabilizing drugs:probingthe surface of the oncogenic Y220C mutant.Chemistry&biology 17,46-56.)
Bauer,M.R.,Joerger,A.C.,和Fersht,A.R.2016年,Bauer,M.R.,Joerger,A.C.,and Fersht,A.R.(2016).2-磺酰嘧啶:温和的具有针对含突变型p53的细胞的烷化剂。美国科学院院刊,第113卷,第5271-5280页.(2-Sulfonylpyrimidines:Mild alkylatingagents with anticancer activity toward p53-compromised cells.Proceedings ofthe National Academy of Sciences of the United States of America 113,E5271-5280.)
Boeckler,F.M.,Joerger,A.C.,Jaggi,G.,Rutherford,T.J.,Veprintsev,D.B.,和Fersht,A.R.2008年,通过硅板筛选的化合物靶向一个不稳定的p53突变,美国科学院院刊,第105卷,第10360-10365页(Boeckler,F.M.,Joerger,A.C.,Jaggi,G.,Rutherford,T.J.,Veprintsev,D.B.,and Fersht,A.R.(2008).Targeted rescue of a destabilizedmutant of p53 by an in silico screened drug.Proceedings of the NationalAcademy of Sciences of the United States of America 105,10360-10365.)
Bullock,A.N.,和Fersht,2001年,恢复突变型p53的功能,自然综述癌症,第1卷,第68-76页。(Bullock,A.N.,and Fersht,A.R.(2001).Rescuing the function of mutantp53.Nature reviews Cancer 1,68-76.)
Bullock,A.N.,Henckel,J.,DeDecker,B.S.,Johnson,C.M.,Nikolova,P.V.,Proctor,M.R.,Lane,D.P.,和Fersht,A.R.1997年,野生型和突变型p53核心区的热力学稳定性,美国科学院院刊,第94卷,第14338-14342页。(Bullock,A.N.,Henckel,J.,DeDecker,B.S.,Johnson,C.M.,Nikolova,P.V.,Proctor,M.R.,Lane,D.P.,and Fersht,A.R.(1997).)Thermodynamic stability of wild-type and mutant p53 coredomain.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United Statesof America 94,14338-14342.
B ullock,A.N.,Henckel,J.,和Fersht,A.R.,2000年,在突变型p53核心区定量分析氨基酸折叠和DNA结合:定义治疗中用于恢复的突变状态,癌基因,第19卷,第1245-1256页。(Bullock,A.N.,Henckel,J.,and Fersht,A.R.(2000).Quantitative analysis ofresidual folding and DNA binding in mutant p53 core domain:definition ofmutant states for rescue in cancer therapy.Oncogene 19,1245-1256.)
B ykov,V.J.,Issaeva,N.,Shilov,A.,Hultcrantz,M.,Pugacheva,E.,Chumakov,P.,Bergman,J.,Wiman,K.G.,和Selivanova,G.2002年,通过一个小分子化合物恢复突变型p53的抗肿瘤功能,自然医学,第8卷,第282-288期。(Bykov,V.J.,Issaeva,N.,Shilov,A.,Hultcrantz,M.,Pugacheva,E.,Chumakov,P.,Bergman,J.,Wiman,K.G.,and Selivanova,G.(2002).Restoration of the tumor suppressor function to mutant p53 by a low-molecular-weight compound.Nature medicine 8,282-288.)
Cancer Genome Atlas Research,N.,Ley,T.J.,Miller,C.,Ding,L.,Raphael,B.J.,Mungall,A.J.,Robertson,A.,Hoadley,K.,Triche,T.J.,Jr.,Laird,P.W.,等2013年,成人原发急性髓系白血病的基因组和表观组的蓝图,新英格兰医学杂志,第368卷,第2059-2074页。(Cancer Genome Atlas Research,N.,Ley,T.J.,Miller,C.,Ding,L.,Raphael,B.J.,Mungall,A.J.,Robertson,A.,Hoadley,K.,Triche,T.J.,Jr.,Laird,P.W.,et al.(2013).Genomic and epigenomic landscapes of adult de novo acute myeloidleukemia.The New England journal of medicine 368,2059-2074.)
Demma,M.,Maxwell,E.,Ramos,R.,Liang,L.,Li,C.,Hesk,D.,Rossman,R.,Mallams,A.,Doll,R.,Liu,M.,等,2010年,SCH529074,一个恢复突变型p53的化合物,结合p53的DNA结合区,恢复突变型p53的功能,破坏HDM2介导的野生型p53的泛素化,生物化学杂志,第285卷,第10198-10212页。(Demma,M.,Maxwell,E.,Ramos,R.,Liang,L.,Li,C.,Hesk,D.,Rossman,R.,Mallams,A.,Doll,R.,Liu,M.,et al.(2010).SCH529074,a smallmolecule activator of mutant p53,which binds p53 DNA binding domain(DBD),restores growth-suppressive function to mutant p53 and interrupts HDM2-mediated ubiquitination of wild type p53.The Journal of biological chemistry285,10198-10212.)
Demma,M.J.,Wong,S.,Maxwell,E.,and Dasmahapatra,B.,2004年,CP31398恢复突变型p53的DNA结合能力,但不影响p53的同源蛋白p63和p73,生物化学杂志,第279卷,第45887-45896页。(Demma,M.J.,Wong,S.,Maxwell,E.,and Dasmahapatra,B.(2004).CP-31398restores DNA-binding activity to mutant p53 in vitro but does not affectp53homologs p63 and p73.The Journal of biological chemistry 279,45887-45896.)
Dolgin,E.2017年,人类基因组中最常见的基因,自然,第551卷,第427-431页。(Dolgin,E.(2017).The most popular genes in the human genome.Nature 551,427-431.)
Donoghue,N.,Yam,P.T.,Jiang,X.M.,和Hogg,P.J.2000年,人类细胞表面的空间上邻近的蛋白巯基,蛋白科学,第9卷,第2436-2445页。(Donoghue,N.,Yam,P.T.,Jiang,X.M.,and Hogg,P.J.(2000).Presence of closely spaced protein thiols on thesurface of mammalian cells.Protein science:a publication of the ProteinSociety 9,2436-2445.)
Feldser,D.M.,Kostova,K.K.,Winslow,M.M.,Taylor,S.E.,Cashman,C.,Whittaker,C.A.,Sanchez-Rivera,F.J.,Resnick,R.,Bronson,R.,Hemann,M.T.,等2010年,肺癌进展期间阶段特异性的对p53功能恢复敏感,自然,第468卷,第575-575页。(Feldser,D.M.,Kostova,K.K.,Winslow,M.M.,Taylor,S.E.,Cashman,C.,Whittaker,C.A.,Sanchez-Rivera,F.J.,Resnick,R.,Bronson,R.,Hemann,M.T.,et al.(2010).Stage-specific sensitivity to p53 restoration during lung cancerprogression.Nature 468,572-575.)
Fogal,V.,Hsieh,J.K.,Royer,C.,Zhong,S.,和Lu,X.2005年,通过E2F1介导的细胞周期依赖的p53核内停留需要p53第315位的磷酸化,EMBO杂志,第24期,第2768-2782页。(Fogal,V.,Hsieh,J.K.,Royer,C.,Zhong,S.,and Lu,X.(2005).Cell cycle-dependentnuclear retention of p53 by E2F1 requires phosphorylation of p53 atSer315.The EMBO journal 24,2768-2782.)
Foster,B.A.,Coffey,H.A.,Morin,M.J.,和Rastinejad,F.,1999年,治疗性恢复突变型p53的构象和功能,科学,第286卷,第2507-2510页。(Foster,B.A.,Coffey,H.A.,Morin,M.J.,and Rastinejad,F.(1999).Pharmacological rescue of mutant p53conformation and function.Science 286,2507-2510.)
Freed-Pastor,W.A.,和Prives,C.,2012年,突变型p53,一个名字,多个蛋白,基因和发展,第26卷,第1268-1286页。(Freed-Pastor,W.A.,and Prives,C.(2012).Mutantp53:one name,many proteins.Genes&development 26,1268-1286.)
Gao,J.,Aksoy,B.A.,Dogrusoz,U.,Dresdner,G.,Gross,B.,Sumer,S.O.,Sun,Y.,Jacobsen,A.,Sinha,R.,Larsson,E.,等,通过cBioportal来集成分析复杂的癌症基因组和临床信息,科学信号,第6卷。(Gao,J.,Aksoy,B.A.,Dogrusoz,U.,Dresdner,G.,Gross,B.,Sumer,S.O.,Sun,Y.,Jacobsen,A.,Sinha,R.,Larsson,E.,et al.Integrative analysisof complex cancer genomics and clinical profiles using the cBioPortal.SciSignal 6,pl1.)
Gillotin,S.,Yap,D.,和Lu,X.,2010年,丝氨酸392位突变的p53R175对mdm2介导的降解敏感,细胞周期,第9卷,第1390-1398页。(Gillotin,S.,Yap,D.,and Lu,X.(2010).Mutation at Ser392 specifically sensitizes mutant p53H175 to mdm2-mediateddegradation.Cell cycle 9,1390-1398.)
Grellety,T.,Laroche-Clary,A.,Chaire,V.,Lagarde,P.,Chibon,F.,Neuville,A.,和Italiano,A.,2015年,PRIMA-1(MET)在软组织肉瘤中诱导细胞死亡不依赖p53,BMC癌症,第15卷,第684页。(Grellety,T.,Laroche-Clary,A.,Chaire,V.,Lagarde,P.,Chibon,F.,Neuville,A.,and Italiano,A.(2015).PRIMA-1(MET)induces death in soft-tissuesarcomas cell independent of p53.BMC cancer 15,684.)
Heredia-Moya,J.,and Kirk,K.L.,2008年,合成砷偶联生物素的工艺改进,生物有机和化学生化,第16卷,第5743-5746页。(Heredia-Moya,J.,and Kirk,K.L.(2008).Animproved synthesis of arsenic-biotin conjugates.Bioorganic&medicinalchemistry 16,5743-5746.)
Hu,J.,Liu,Y.F.,Wu,C.F.,Xu,F.,Shen,Z.X.,Zhu,Y.M.,Li,J.M.,Tang,W.,Zhao,W.L.,Wu,W.,等,2009年,全反式维甲酸/三氧化二砷治疗新诊断的急性早幼粒细胞白血病的长期疗效和安全性,美国科学院院刊,第106卷,第3342-3347页。(Hu,J.,Liu,Y.F.,Wu,C.F.,Xu,F.,Shen,Z.X.,Zhu,Y.M.,Li,J.M.,Tang,W.,Zhao,W.L.,Wu,W.,et al.(2009).Long-term efficacy and safety of all-trans retinoic acid/arsenic trioxide-based therapy in newly diagnosed acute promyelocytic leukemia.Proceedings ofthe National Academy of Sciences of the United States of America 106,3342-3347.)
Joerger,A.C.,和Fersht,A.R.2007年,结构-功能-救援:常见p53癌症突变体的多样性。癌基因第26卷,第2226-2242页。(Joerger,A.C.,and Fersht,A.R.(2007).Structure-function-rescue:the diverse nature of common p53 cancermutants.Oncogene 26,2226-2242.)
Joerger,A.C.,和Fersht,A.R.2016年,p53途径:癌症的起源、失活和新的治疗方法。生物化学年度回顾第85卷,第375-404页。(Joerger,A.C.,and Fersht,A.R.(2016).Thep53 Pathway:Origins,Inactivation in Cancer,and Emerging TherapeuticApproaches.Annual review of biochemistry 85,375-404.)
Kandoth,C.,McLellan,M.D.,Vandin,F.,Ye,K.,Niu,B.,Lu,C.,Xie,M.,Zhang,Q.,McMichael,J.F.,Wyczalkowski,M.A.,等,2013年,12种主要癌症类型的突变景观和意义。自然第502卷,第333-339页。(Kandoth,C.,McLellan,M.D.,Vandin,F.,Ye,K.,Niu,B.,Lu,C.,Xie,M.,Zhang,Q.,McMichael,J.F.,Wyczalkowski,M.A.,et al.(2013).Mutational landscape and significance across 12major cancer types.Nature502,333-339.)
Khoo,K.H.,Verma,C.S.,和Lane,D.P.2014年,药物p53途径:了解临床疗效途径。自然评论药物发现第13卷,第217-236页。(Khoo,K.H.,Verma,C.S.,and Lane,D.P.(2014).Drugging the p53 pathway:understanding the route to clinical efficacy.Naturereviews Drug discovery 13,217-236.)
Lambert,J.M.,Gorzov,P.,Veprintsev,D.B.,Soderqvist,M.,Segerback,D.,Bergman,J.,Fersht,A.R.,Hainaut,P.,Wiman,K.G.,和Bykov,V.J.2009年,PRIMA-1通过与核心结构域的共价结合重新激活突变体p53。癌细胞第15卷,第376-388页。(Lambert,J.M.,Gorzov,P.,Veprintsev,D.B.,Soderqvist,M.,Segerback,D.,Bergman,J.,Fersht,A.R.,Hainaut,P.,Wiman,K.G.,and Bykov,V.J.(2009).PRIMA-1reactivates mutant p53 bycovalent binding to the core domain.Cancer cell 15,376-388.)
Li,D.,Marchenko,N.D.,和Moll,U.M.2011年,SAHA通过抑制HDAC6-Hsp90伴侣轴,破坏突变体p53的稳定性,表现出对突变体p53癌细胞的优先细胞毒性。细胞死亡与分化第18卷,第194-1913页。(Li,D.,Marchenko,N.D.,and Moll,U.M.(2011).SAHA showspreferential cytotoxicity in mutant p53 cancer cells by destabilizing mutantp53 through inhibition of the HDAC6-Hsp90 chaperone axis.Cell death anddifferentiation 18,1904-1913.)
Lindsley,R.C.,Saber,W.,Mar,B.G.,Redd,R.,Wang,T.,Haagenson,M.D.,Grauman,P.V.,Hu,Z.H.,Spellman,S.R.,Lee,S.J.,等2017年,干细胞移植后骨髓增生异常综合征的预后突变。新英格兰医学杂志第376卷,第536-547页。(Lindsley,R.C.,Saber,W.,Mar,B.G.,Redd,R.,Wang,T.,Haagenson,M.D.,Grauman,P.V.,Hu,Z.H.,Spellman,S.R.,Lee,S.J.,et al.(2017).Prognostic Mutations in Myelodysplastic Syndrome afterStem-Cell Transplantation.The New England journal of medicine 376,536-547.)
Liu,X.,Wilcken,R.,Joerger,A.C.,Chuckowree,I.S.,Amin,J.,Spencer,J.,和Fersht,A.R.,2013年,小分子诱导突变体p53在癌细胞中重新激活。核酸研究第41卷,第6034-6044页。(Liu,X.,Wilcken,R.,Joerger,A.C.,Chuckowree,I.S.,Amin,J.,Spencer,J.,and Fersht,A.R.(2013).Small molecule induced reactivation of mutant p53 incancer cells.Nucleic acids research 41,6034-6044.)
Lo-Coco,F.,Avvisati,G.,Vignetti,M.,Thiede,C.,Orlando,S.M.,Iacobelli,S.,Ferrara,F.,Fazi,P.,Cicconi,L.,Di Bona,E.,等,2013年,维甲酸和三氧化二砷治疗急性早幼粒细胞白血病。新英格兰医学杂志第369卷,第111-121页。(Lo-Coco,F.,Avvisati,G.,Vignetti,M.,Thiede,C.,Orlando,S.M.,Iacobelli,S.,Ferrara,F.,Fazi,P.,Cicconi,L.,Di Bona,E.,et al.(2013).Retinoic acid and arsenic trioxide foracute promyelocytic leukemia.The New England journal of medicine 369,111-121.)
Lu,M.,Breyssens,H.,Salter,V.,Zhong,S.,Hu,Y.,Baer,C.,Ratnayaka,I.,Sullivan,A.,Brown,N.R.,Endicott,J.,等,2013年,通过抑制MDM2和cyclinB1/CDK1-磷酸化核IASPP恢复人黑色素瘤细胞p53功能。癌细胞第23卷,第618-633页。(Lu,M.,Breyssens,H.,Salter,V.,Zhong,S.,Hu,Y.,Baer,C.,Ratnayaka,I.,Sullivan,A.,Brown,N.R.,Endicott,J.,et al.(2013).Restoring p53 function in human melanoma cells byinhibiting MDM2 and cyclin B1/CDK1-phosphorylated nuclear iASPP.Cancer cell23,618-633.)
Lu,M.,Muers,M.R.,and Lu,X.2016年,介绍STRaNDS:穿梭转录调节因子,是非DNA结合。自然评论分子细胞生物学第17卷,第523-532页。(Lu,M.,Muers,M.R.,and Lu,X.(2016a).Introducing STRaNDs:shuttling transcriptional regulators that arenon-DNA binding.Nature reviews Molecular cell biology 17,523-532.)
Lu,M.,Breyssens,H.,Salter,V.,Zhong,S.,Hu,Y.,Baer,C.,Ratnayaka,I.,Sullivan,A.,Brown,N.R.,Endicott,J.,等,2013年,通过抑制MDM2和cyclinB1/CDK1-磷酸化核IASPP恢复人黑色素瘤细胞p53功能。癌细胞第23卷,第618-633页。(Lu,M.,Breyssens,H.,Salter,V.,Zhong,S.,Hu,Y.,Baer,C.,Ratnayaka,I.,Sullivan,A.,Brown,N.R.,Endicott,J.,et al.(2013).Restoring p53 function in human melanoma cells byinhibiting MDM2 and cyclin B1/CDK1-phosphorylated nuclear iASPP.Cancer cell23,618-633.)
Lu,M.,Zak,J.,Chen,S.,Sanchez-Pulido,L.,Severson,D.T.,Endicott,J.,Ponting,C.P.,Schofield,C.J.,和Lu,X.2014年,在ankyrin重复序列中,RAN GDP结合的代码定义了一个核导入路径。细胞第157卷,第1130-1145页。(Lu,M.,Zak,J.,Chen,S.,Sanchez-Pulido,L.,Severson,D.T.,Endicott,J.,Ponting,C.P.,Schofield,C.J.,andLu,X.(2014).A code for RanGDP binding in ankyrin repeats defines a nuclearimport pathway.Cell 157,1130-1145.)
Lu,T.,Zou,Y.,Xu,G.,Potter,J.A.,Taylor,G.L.,Duan,Q.,Yang,Q.,Xiong,H.,Qiu,H.,Ye,D.,等,2016年,PRIMA-1Met通过靶向MEK抑制与p53无关的结直肠癌。癌症靶标。(Lu,T.,Zou,Y.,Xu,G.,Potter,J.A.,Taylor,G.L.,Duan,Q.,Yang,Q.,Xiong,H.,Qiu,H.,Ye,D.,et al.(2016b).PRIMA-1Met suppresses colorectal cancer independent ofp53 by targeting MEK.Oncotarget.)
Lukashchuk,N.,和Vousden,K.H.,2007年,Lukashchuk,N.,and Vousden,K.H.(2007).突变体p53的泛素化和降解。分子生物学和细胞生物学第27卷,第8284-8295页。(Lukashchuk,N.,and Vousden,K.H.(2007).Ubiquitination and degradation ofmutant p53.Molecular and cellular biology 27,8284-8295.)
Martins,C.P.,Brown-Swigart,L.,and Evan,G.I.2006年,模拟p53修复在肿瘤中的治疗效果。细胞第127卷,第1323-1334页。(Martins,C.P.,Brown-Swigart,L.,and Evan,G.I.(2006).Modeling the therapeutic efficacy of p53 restoration intumors.Cell 127,1323-1334.)
Muller,P.A.,Caswell,P.T.,Doyle,B.,Iwanicki,M.P.,Tan,E.H.,Karim,S.,Lukashchuk,N.,Gillespie,D.A.,Ludwig,R.L.,Gosselin,P.,等,2009年,突变的p53通过促进整合素回收来驱动入侵。细胞第139卷,第1327-1341页。(Muller,P.A.,Caswell,P.T.,Doyle,B.,Iwanicki,M.P.,Tan,E.H.,Karim,S.,Lukashchuk,N.,Gillespie,D.A.,Ludwig,R.L.,Gosselin,P.,et al.(2009).Mutant p53 drives invasion by promotingintegrin recycling.Cell139,1327-1341.)
Muller,P.A.,和Vousden,K.H.2013年,癌症的p53突变。自然细胞生物学第15卷,第2-8页。(Muller,P.A.,and Vousden,K.H.(2013).p53 mutations in cancer.Naturecell biology 15,2-8.)
Muller,P.A.,and Vousden,K.H.2014年,突变型p53在癌症中的作用:新功能和治疗机会。癌细胞第25卷,第304-317页。(Muller,P.A.,and Vousden,K.H.(2014).Mutantp53 in cancer:new functions and therapeutic opportunities.Cancer cell 25,304-317.)
Parrales,A.,Ranjan,A.,Iyer,S.V.,Padhye,S.,Weir,S.J.,Roy,A.,和Iwakuma,T.2016年,DNAJA1通过戊酸途径控制错误折叠突变体p53的命运。自然细胞生物学第18卷,第1233-1243页。(Parrales,A.,Ranjan,A.,Iyer,S.V.,Padhye,S.,Weir,S.J.,Roy,A.,andIwakuma,T.(2016).DNAJA1 controls the fate of misfolded mutant p53 through themevalonate pathway.Nature cell biology 18,1233-1243.)
Patyka,M.,Sharifi,Z.,Petrecca,K.,Mansure,J.,Jean-Claude,B.,和Sabri,S.2016年,Patyka,M.,Sharifi,Z.,Petrecca,K.,Mansure,J.,Jean-Claude,B.,andSabri,S.(2016).对PRIMA-1MET的敏感性与人胶质母细胞瘤细胞和胶质母细胞瘤干细胞中MGMT的降低有关,而不论p53状态如何。肿瘤靶标。(Patyka,M.,Sharifi,Z.,Petrecca,K.,Mansure,J.,Jean-Claude,B.,and Sabri,S.(2016).Sensitivity to PRIMA-1MET isassociated with decreased MGMT in human glioblastoma cells and glioblastomastem cells irrespective of p53 status.Oncotarget.)
Puca,R.,Nardinocchi,L.,Porru,M.,Simon,A.J.,Rechavi,G.,Leonetti,C.,Givol,D.,和D'Orazi,G.锌恢复p53活性构象,增加突变型p53肿瘤细胞对抗癌药物的反应。细胞周期第10卷,第1679-1689页。(Puca,R.,Nardinocchi,L.,Porru,M.,Simon,A.J.,Rechavi,G.,Leonetti,C.,Givol,D.,and D'Orazi,G.(2011).Restoring p53 activeconformation by zinc increases the response of mutant p53 tumor cells toanticancer drugs.Cell cycle 10,1679-1689.)
Riley,T.,Sontag,E.,Chen,P.,和Levine,A.2008年,人类p53调控基因的转录控制。自然评论分子细胞生物学第9卷,第402-412页。(Riley,T.,Sontag,E.,Chen,P.,和Levine,A.2008年,人类p53调控基因的转录控制。自然评论分子细胞生物学第9卷,第402-412页。(Riley,T.,Sontag,E.,Chen,P.,and Levine,A.(2008).Transcriptional controlof human p53-regulated genes.Nature reviews Molecular cell biology 9,402-412.)
Rippin,T.M.,Bykov,V.J.,Freund,S.M.,Selivanova,G.,Wiman,K.G.,andFersht,A.R.2002年,p53-救援药物CP-31398在体外和活细胞中的特性。癌基因第21卷,第2119-2129页。(Rippin,T.M.,Bykov,V.J.,Freund,S.M.,Selivanova,G.,Wiman,K.G.,andFersht,A.R.(2002).Characterization of the p53-rescue drug CP-31398in vitroand in living cells.Oncogene 21,2119-2129.)
Shoemaker,R.H.人NCI60肿瘤细胞系抗癌药物筛选。自然评论癌症第6卷,第813-823页。(Shoemaker,R.H.(2006).The NCI60 human tumour cell line anticancer drugscreen.Nature reviews Cancer 6,813-823.)
Soragni,A.,Janzen,D.M.,Johnson,L.M.,Lindgren,A.G.,Thai-Quynh Nguyen,A.,Tiourin,E.,Soriaga,A.B.,Lu,J.,Jiang,L.,Faull,K.F.,等,2016年,一种设计的抑制p53聚集的药物在卵巢癌中抑制p53肿瘤。癌细胞第29卷,第90-103页。(Soragni,A.,Janzen,D.M.,Johnson,L.M.,Lindgren,A.G.,Thai-Quynh Nguyen,A.,Tiourin,E.,Soriaga,A.B.,Lu,J.,Jiang,L.,Faull,K.F.,et al.(2016).A Designed Inhibitor ofp53 Aggregation Rescues p53Tumor Suppression in Ovarian Carcinomas.Cancercell 29,90-103.)
Tessoulin,B.,Descamps,G.,Moreau,P.,Maiga,S.,Lode,L.,Godon,C.,Marionneau-Lambot,S.,Oullier,T.,Le Gouill,S.,Amiot,M.,等,2014年,PRIMA-1Met通过损害GSH/ROS平衡而引起与p53无关的骨髓瘤细胞死亡。血液第124卷,第1626-1636页。(Tessoulin,B.,Descamps,G.,Moreau,P.,Maiga,S.,Lode,L.,Godon,C.,Marionneau-Lambot,S.,Oullier,T.,Le Gouill,S.,Amiot,M.,et al.(2014).PRIMA-1Met inducesmyeloma cell death independent of p53 by impairing the GSH/ROS balance.Blood124,1626-1636.)
Vassilev,L.T.,Vu,B.T.,Graves,B.,Carvajal,D.,Podlaski,F.,Filipovic,Z.,Kong,N.,Kammlott,U.,Lukacs,C.,Klein,C.,等,2004年,小分子拮抗剂MDM2在体内激活p53通路。科学第303卷,第844-848页。(Vassilev,L.T.,Vu,B.T.,Graves,B.,Carvajal,D.,Podlaski,F.,Filipovic,Z.,Kong,N.,Kammlott,U.,Lukacs,C.,Klein,C.,et al.(2004).In vivo activation of the p53 pathway by small-molecule antagonists ofMDM2.Science 303,844-848.)
Ventura,A.,Kirsch,D.G.,McLaughlin,M.E.,Tuveson,D.A.,Grimm,J.,Lintault,L.,Newman,J.,Reczek,E.E.,Weissleder,R.,和Jacks,T.,2007年,恢复p53功能导致体内肿瘤消退。自然第445卷,第661-665页。(Ventura,A.,Kirsch,D.G.,McLaughlin,M.E.,Tuveson,D.A.,Grimm,J.,Lintault,L.,Newman,J.,Reczek,E.E.,Weissleder,R.,and Jacks,T.(2007).Restoration of p53 function leads to tumour regression invivo.Nature 445,661-665.)
Vogelstein,B.,Lane,D.,and Levine,A.J.探索p53网络。自然第408卷,第307-310页。(Vogelstein,B.,Lane,D.,and Levine,A.J.(2000).Surfing the p53network.Nature 408,307-310.)
Wang,Y.,Suh,Y.A.,Fuller,M.Y.,Jackson,J.G.,Xiong,S.,Terzian,T.,Quintas-Cardama,A.,Bankson,J.A.,El-Naggar,A.K.,and Lozano,G.2011年,恢复野生型p53的表达抑制肿瘤生长,但不会导致p53错义突变小鼠的肿瘤消退。临床调查杂志第121卷,第893-904页。(Wang,Y.,Suh,Y.A.,Fuller,M.Y.,Jackson,J.G.,Xiong,S.,Terzian,T.,Quintas-Cardama,A.,Bankson,J.A.,El-Naggar,A.K.,and Lozano,G.(2011).Restoring expression of wild-type p53 suppresses tumor growth but does notcause tumor regression in mice with a p53 missense mutation.The Journal ofclinical investigation 121,893-904.)
Wassman,C.D.,Baronio,R.,Demir,O.,Wallentine,B.D.,Chen,C.K.,Hall,L.V.,Salehi,F.,Lin,D.W.,Chung,B.P.,Hatfield,G.W.,等,2013,瞬时打开的L1/S3口袋用于突变体p53再激活的计算鉴定。自然通讯第4卷,第1407页。(Wassman,C.D.,Baronio,R.,Demir,O.,Wallentine,B.D.,Chen,C.K.,Hall,L.V.,Salehi,F.,Lin,D.W.,Chung,B.P.,Hatfield,G.W.,et al.(2013).Computational identification of a transiently openL1/S3 pocket for reactivation of mutant p53.Nature communications 4,1407.)
Weinmann,L.,Wischhusen,J.,Demma,M.J.,Naumann,U.,Roth,P.,Dasmahapatra,B.,和Weller,M.一种新的p53拯救化合物诱导p53依赖的生长停滞,并使胶质瘤细胞对Apo2L/TRAIL诱导的细胞凋亡敏感。细胞死亡与分化第15卷,第718-729页。(Weinmann,L.,Wischhusen,J.,Demma,M.J.,Naumann,U.,Roth,P.,Dasmahapatra,B.,and Weller,M.(2008).A novel p53 rescue compound induces p53-dependent growth arrest andsensitises glioma cells to Apo2L/TRAIL-induced apoptosis.Cell death anddifferentiation 15,718-729.)
Xue,W.,Zender,L.,Miething,C.,Dickins,R.A.,Hernando,E.,Krizhanovsky,V.,Cordon-Cardo,C.,和Lowe,S.W.,2007,衰老和肿瘤清除是由p53恢复小鼠肝癌触发的。自然第445卷,第656-660页。(Xue,W.,Zender,L.,Miething,C.,Dickins,R.A.,Hernando,E.,Krizhanovsky,V.,Cordon-Cardo,C.,and Lowe,S.W.(2007).Senescence and tumourclearance is triggered by p53 restoration in murine liver carcinomas.Nature445,656-660.)
Zhang,T.D.,Chen,G.Q.,Wang,Z.G.,Wang,Z.Y.,Chen,S.J.,和Chen,Z.2001年,三氧化二砷,APL治疗剂。癌基因第20卷,第7146-7153页。(Zhang,T.D.,Chen,G.Q.,Wang,Z.G.,Wang,Z.Y.,Chen,S.J.,and Chen,Z.(2001).Arsenic trioxide,a therapeuticagent for APL.Oncogene 20,7146-7153.)
Zhang,X.W.,Yan,X.J.,Zhou,Z.R.,Yang,F.F.,Wu,Z.Y.,Sun,H.B.,Liang,W.X.,Song,A.X.,Lallemand-Breitenbach,V.,Jeanne,M.,等,2010年,三氧化二砷通过直接结合PML控制PML-Raralpha癌蛋白的命运。科学第328卷,第240-243页。(Zhang,X.W.,Yan,X.J.,Zhou,Z.R.,Yang,F.F.,Wu,Z.Y.,Sun,H.B.,Liang,W.X.,Song,A.X.,Lallemand-Breitenbach,V.,Jeanne,M.,et al.(2010).Arsenic trioxide controls the fate ofthe PML-RARalpha oncoprotein by directly binding PML.Science 328,240-243.)
Zhu,J.,Chen,Z.,Lallemand-Breitenbach,V.,和de The,H.2002年,急性早幼粒细胞白血病使砷复活。自然评论癌症第2卷,第705-713页。(Zhu,J.,Chen,Z.,Lallemand-Breitenbach,V.,and de The,H.(2002).How acute promyelocytic leukaemia revivedarsenic.Nature reviews Cancer 2,705-713.)
附录A
附录B
Claims (70)
1.一种在p53上形成的三级结构(“PANDA核心”),包括一PANDA口袋、一PANDA试剂和在PANDA口袋和PANDA试剂之间形成的至少一个紧密连接,其中:
所述PANDA口袋基本上是正确折叠的PANDA半胱氨酸周围约的区域,其包括与一个或多个正确折叠的PANDA半胱氨酸相邻的所有氨基酸、与一个或多个PANDA半胱氨酸接触的氨基酸,和所有PANDA半胱氨酸,与一个或多个正确折叠的PANDA半胱氨酸相邻及接触的所有氨基酸和所有PANDA半胱氨酸;
所述PANDA试剂是具有一个或多个有用特征的物质的组合,例如:
(a)能够导致正确折叠的p53群体的大量增加,优选比PRIMA-1引起的增加至少高3倍,更优选比PRIMA-1引起的增加至少高5倍,进一步优选比PRIMA-1引起的增加至少高10倍,更进一步优选比PRIMA-1引起的增加至少高100倍;
(b)可显著促进p53的转录功能,优选比PRIMA-1引起的促进至少高3倍,更优选比PRIMA-1引起的促进至少高5倍,进一步优选比PRIMA-1引起的促进至少高10倍,更进一步优选比PRIMA-1引起的促进至少高100倍;
(c)可显著提高p53蛋白的稳定性,例如增加p53 Tm,优选比PRIMA-1引起的增加至少高3倍,更优选比PRIMA-1引起的增加至少高5倍,进一步优选比PRIMA-1引起的增加至少高10倍,更进一步优选比PRIMA-1引起的增加至少高100倍;
其中所述PANDA试剂优选具有两个或更多个有用的特性,更优选具有三个或更多个有用的特性;和
所述PANDA半胱氨酸是对应于wtp53的半胱氨酸124(“C124”)、半胱氨酸135(“C135”)和半胱氨酸141(“C141”)位置(统称为“PANDA三联体”)。
2.如权利要求1所述的PANDA核心,其特征在于,所述PANDA口袋基本上由所述PANDA三联体和对应于wtp53 S116、C275、R273、Y234、V122、T123、T125、Y126、M133、F134、Q136、L137、K139、T140、P142、V143、L114、H115、G117、T118、A119、K120、S121、A138、I232、H233、N235、Y236、M237、C238、N239、F270、E271、V272、V274、A276、C277、P278、G279、R280、D281和R282位置的氨基酸组成。
3.如权利要求1和2所述的PANDA核心,其特征在于,PANDA口袋的排列基本如图14的左图,图14的右图和/或图18所示。
4.如任一项前述权利要求所述的PANDA核心,其特征在于,所述p53是任何野生型p53(“wtp53”),其包括所有天然的和人工的p53;任何突变p53(“mp53”),包括所有天然的和人工的p53;或其组合。
5.如任一项前述权利要求所述的PANDA核心,其特征在于:
所述wtp53是p53α、p53β、p53γ、Δ40p53α、Δ40p53β、Δ40p53γ或任何前述具有一个或多个单核苷酸多态性(“SNP”)的p53;
所述mp53在p53上具有至少一个突变,包括任何单个氨基酸突变,优选改变和/或部分改变p53的结构和/或功能的突变,例如,一个或多个对应于wtp53上R175、G245、R248、R249、R273、R282、C176、H179、Y220、P278、V143、I232和F270的突变;并包括一个或多个R175H、G245D/S、R248Q/W、R249S、R273C/H、R282W、C176F、H179R、Y220C、P278S、V143A、I232T和F270突变;和/或
所述人工p53包括任何人工改造的p53,包括p53融合蛋白、p53片段、p53肽段、p53衍生出来的融合大分子、p53重组蛋白、在第二个氨基酸位点具有抑制型突变(“SSSM”)的p53和超级p53。
6.如任一项前述权利要求所述的PANDA核心,其特征在于,所述紧密连接包括键、共价键、非共价键,及其组合。
7.如任一项前述权利要求所述的PANDA核心,其特征在于,所述非共价键是氢键。
8.如任一项前述权利要求所述的PANDA核心,其特征在于,所述PANDA试剂调节p53靶基因的水平,p53靶基因优选为Apaf1、Bax、Fas、Dr5、mir-34、Noxa、TP53AIP1、Perp、Pidd、Pig3、Puma、Siva、YWHAZ、Btg2、Cdkn1a、Gadd45a、mir-34a、mir-34b/34c、Prl3、Ptprv、Reprimo、Pai1、Pml、Ddb2、Ercc5、Fancc、Gadd45a、Ku86、Mgmt、Mlh1、Msh2、P53r2、Polk、Xpc、Adora2b、Aldh4、Gamt、Gls2、Gpx1、Lpin1、Parkin、Prkab1、Prkab2、Pten、Sco1、Sesn1、Sesn2、Tigar、Tp53inp1、Tsc2、Atg10、Atg2b、Atg4a、Atg4c、Atg7、Ctsd、Ddit4、Dram1、Foxo3、Laptm4a、Lkb1、Pik3r3、Prkag2、Puma、Tpp1、Tsc2、Ulk1、Ulk2、Uvrag、Vamp4、Vmp1、Bai1、Cx3cl1、Icam1、Irf5、Irf9、Isg15、Maspin、Mcp1、Ncf2、Pai1、Tlr1–Tlr10、Tsp1、Ulbp1、Ulbp2、mir-34a、mir-200c、mir-145、mir-34a、mir-34b/34c、Notch1,及其任意组合。
9.如任一项前述权利要求所述的PANDA核心,其特征在于,所述紧密连接基本上使p53稳定,优选p53的Tm增加至少约0.5℃,更优选至少约1℃,进一步优选至少约2℃,更进一步优选至少约5℃,再优选至少约8℃。
10.如任一项前述权利要求所述的PANDA核心,其特征在于,正确折叠的p53群体与PAb1620免疫沉淀测定法测定的增加至少约3倍,优选与PAb1620免疫沉淀测定法测定的增加至少约5倍,更优选与PAb1620免疫沉淀测定法测定的增加至少约10倍,进一步优选与PAb1620免疫沉淀测定法测定的增加至少约约100倍。
11.如任一项前述权利要求所述的PANDA核心,其特征在于,所述PANDA试剂包括一个或多个能够与PANDA口袋上一个或多个氨基酸结合的PANDA口袋结合基团(“R”),优选结合一个或多个半胱氨酸,更优选结合两个或多个半胱氨酸,进一步优选结合三个以上半胱氨酸,更进一步优选结合约三个到十二个半胱氨酸。
12.如任一项前述权利要求所述的PANDA核心,其特征在于,R是金属、非金属,或如迈克尔受体和硫醇基的基团,优选砷、锑、铋,以及前述的任一类似物,或其组合。
13.如任一项前述权利要求所述的PANDA核心,其特征在于,R包含3价和/或5价砷原子、3价和/或5价锑原子、3价和/或5价铋原子,和/或其组合。
14.如任一项前述权利要求所述的PANDA核心,其特征在于,所述PANDA试剂是选自表1、表2的化合物或化合物的组合。
15.如任一项前述权利要求所述的PANDA核心,其特征在于,所述PANDA试剂选自以下化合物,或化合物的组合:As2O3、As2O5、KAsO2、NaAsO2、HAsNa2O4、HAsK2O4、AsF3、AsCl3、AsBr3、AsI3、AsAc3、As(OC2H5)3、As(OCH3)3、As2(SO4)3、(CH3CO2)3As、C8H4K2O12As2·xH2O、HOC6H4COOAsO、[O2CCH2C(OH)(CO2)CH2CO2]As、Sb2O3、Sb2O5、KSbO2、NaSbO2、HSbNa2O4、HSbK2O4、SbF3、SbCl3、SbBr3、SbI3、SbAc3、Sb(OC2H5)3、Sb(OCH3)3、Sb2(SO4)3、(CH3CO2)3Sb、C8H4K2O12Sb2·xH2O、HOC6H4COOSbO、[O2CCH2C(OH)(CO2)CH2CO2]Sb、Bi2O3、Bi2O5、KBiO2、NaBiO2、HBiNa2O4、HBiK2O4、BiF3、BiCl3、BiBr3、BiI3、BiAc3、Bi(OC2H5)3、Bi(OCH3)3、Bi2(SO4)3、(CH3CO2)3Bi、C8H4K2O12Bi2·xH2O、HOC6H4COOBiO、C16H18As2N4O2(NSC92909)、C13H14As2O6(NSC48300)、C10H13NO8Sb(NSC31660)、C6H12NaO8Sb+(NSC15609)、C13H21NaO9Sb+(NSC15623),和其组合。
16.如任一项前述权利要求所述的PANDA核心,其特征在于,所述PANDA试剂包括与p53紧密连接形成的任何还原产物。
17.如任一项前述权利要求所述的PANDA核心,其特征在于,所述PANDA试剂是砷原子、锑原子、铋原子,以及它们的任何类似物,或其组合。
18.如任一项前述权利要求所述的PANDA核心,其特征在于,所述紧密连接在R与一个或多个PANDA半胱氨酸之间形成,优选两个或多个PANDA半胱氨酸,更优选所有三个PANDA半胱氨酸。
19.如任一项前述权利要求所述的PANDA核心,其由PANDA口袋和PANDA试剂之间反应而产生,其中所述反应优选由As、Sb和/或Bi基团介导的氧化PANDA半胱氨酸的一个或多个巯基(PANDA半胱氨酸损失一至三个氢),以及PANDA试剂的As、Sb和/或Bi基团被还原(PANDA试剂失去氧)。
20.如任一项前述权利要求所述的PANDA核心,其特征在于,所述PANDA核心基本类似于图14左图、图14右图和/或图18的三维结构。
21.如任一项前述权利要求所述的PANDA核心,其特征在于,比较图14左图、图14右图和/或图18的三维结构,所述PANDA核心在jCE循环排列中具有约3.00RMSD和/或0.50TM得分,优选约2.00RMSD和/或0.75TM得分拟合,更优选约1.00RMSD和/或0.90TM得分拟合。
22.如任一项前述权利要求所述的PANDA核心,其特征在于,所述PANDA核心具有图14左图、图14右图和/或图18的三维结构。
23.如任一项前述权利要求所述的PANDA核心,其特征在于,对应于wtp53氨基酸114-126、133-143、232-239和270-282位的氨基酸位置基本上类似于图14左图、图14右图和/或图18。
24.一种复合体(“PANDA”),包括p53和权利要求1-23中任一项所述的PANDA核心。
25.纯化的和分离的如任一项前述权利要求所述的PANDA。
26.如任一项前述权利要求所述的PANDA核心或PANDA,与未结合PANDA试剂时相比,所述PANDA获得了一个或多个wtp53结构,优选DNA结合结构;获得一种或多种wtp53功能,优选转录功能;和/或丧失和/或减少一种或多种mp53功能,优选致癌功能。
27.如任一项前述权利要求所述的PANDA核心或PANDA,在体外和/或体内获得了任何功能,包括任何野生型功能,如在分子水平上,与核酸的结合、靶基因的转录激活或抑制、与wtp53或mp53伴侣的结合、与wtp53或mp53伴侣的解离,和翻译后修饰的接收;在细胞水平上,例如对诸如营养缺乏、低氧、氧化应激、过度增殖信号、致癌性应激、DNA损伤、核糖核苷酸耗竭、复制性应激和端粒损耗等的应激反应,促进细胞周期停滞、促进DNA修复、促进细胞凋亡、促进基因组稳定性、促进衰老和促进自噬,调节细胞代谢重编程、调节肿瘤微环境信号传导,抑制细胞干细胞特性、存活、侵袭和转移;在生物体水平上,延迟或预防癌症复发,提高癌症治疗效力、提高对癌症治疗的反应率,调节发育、衰老、寿命、免疫过程和老化。
28.如任一项前述权利要求所述的PANDA核心或PANDA,在体外和/或体内丧失、受损和/或废止了功能,包括促进癌细胞转移、基因组不稳定、入侵、迁移、分散、血管生成,干细胞扩增、存活、增殖,组织重塑、抗药性和促有丝分裂缺陷的功能。
29.如任一项前述权利要求所述的PANDA核心或PANDA,其具有上调或下调一个或多个p53下游靶标的能力,在生物系统中,在RNA水平和/或蛋白质水平,优选约3倍,更优选约5倍,进一步优选约10-100倍。
30.如任一项前述权利要求所述的PANDA核心或PANDA,具有在表达mp53和/或没有功能性p53的受试者中治疗与p53异常相关的疾病的能力,其中所述疾病是癌症、肿瘤、衰老的结果、发育性疾病、加速老化、免疫学疾病,或其组合。
31.如任一项前述权利要求所述的PANDA核心或PANDA,其具有抑制肿瘤的能力,优选至少抑制至统计学上显著的水平,更优选具有以统计学上显著水平强烈抑制肿瘤的能力。
32.如任一项前述权利要求所述的PANDA核心或PANDA,其具有调节细胞生长或肿瘤生长的能力,优选将其调节至wtp53水平的约10%,更优选调节至wtp53水平的至少约100%,进一步优选调节至超过wtp53水平的约100%。
33.一种制备权利要求1-32中任一项所述的PANDA或PANDA核心的方法,包括将一个或多个PANDA试剂结合到p53的步骤。
34.如权利要求33所述的方法,其特征在于,所述p53选自权利要求4-5中的任一个。
35.如权利要求26所述的方法,其特征在于,所述PANDA试剂来自如权利要求1-32所述的任一个。
36.具有权利要求1所述的一个或多个有用特征的PANDA试剂,优选地所述PANDA试剂选自如权利要求1-32所述的任一个,且优选地所述mp53选自如权利要求1-32所述的任一个。
37.如权利要求36所述的PANDA试剂,其特征在于,所述PANDA试剂拯救一种或多种wtp53结构,优选DNA结合结构;拯救一种或多种wtp53功能,优选转录功能,更优选选自权利要求27-32的功能;消除和/或减损一种或多种mp53功能,优选致癌功能,更优选选自权利要求28的功能。
38.一种拯救一种或多种wtp53结构的方法,优选DNA结合结构;拯救一种或多种wtp53功能,优选转录功能,更优选选自权利要求27-32的功能;消除和/或减损一种或多种mp53功能,优选致癌功能,更优选选自权利要求28的功能;该方法包括权利要求26-35任一所述的步骤。
39.一种拯救一种或多种wtp53结构的方法,优选DNA结合结构;拯救一种或多种wtp53功能,优选转录功能,更优选选自权利要求27-32的功能;消除和/或减损一种或多种mp53功能,优选致癌功能,更优选选自权利要求28的功能;该方法包括以下步骤:将PANDA和/或PANDA试剂添加至细胞,优选人类细胞,和/或受试者,优选人类受试者。
40.如权利要求39所述的方法,其特征在于,p53来自权利要求4-5任一所述。
41.如权利要求39-40所述的方法,其特征在于,PANDA试剂来自任一权利要求1-32和36-37。
42.一种打开和关闭mp53的wtp53功能的方法,该方法包括以下步骤:
(a)将第一PANDA试剂与mp53结合以开启mp53的wtp53功能;
(b)添加第二化合物使得(i)从mp53中去除PANDA试剂,例如抗路易氏药剂(BAL)、二硫琥珀酸(DMSA)、二巯基丙磺酸钠(DMPS)和/或其组合;(ii)抑制改造的细胞或受试者中p53的表达,例如强力霉素;和/或(iii)关闭改造的细胞或受试者中p53的表达,例如他莫昔芬。
43.一种在体外和/或体内使用权利要求1-32任一所述的PANDA或PANDA核心的方法,以拯救一种或多种wtp53功能,优选转录功能,更优选选自权利要求27-32的功能;消除和/或减少一种或多种mp53功能,优选致癌功能,更优选选自权利要求28的功能;该方法包括将PANDA或PANDA试剂添加至细胞和/或受试者,优选人类细胞和/或人类受试者。
44.如权利要求43所述的方法,其特征在于,所述PANDA或PANDA核心选自权利要求1-32任一所述。
45.如权利要求39-40所述的方法,其特征在于,所述PANDA试剂来自权利要求1-32和36-37任一所述。
46.一种具有治疗携带mp53受试者疾病的能力的PANDA试剂,所述疾病优选癌症。
47.如权利要求46所述的PANDA试剂,其特征在于,所述PANDA试剂来自权利要求1-32和36-37任一所述。
48.如权利要求46或47所述的PANDA试剂,其特征在于,mp53选自任一权利要求4-5。
49.一种治疗有需要的受试者中与p53异常相关的疾病的方法,该方法包括对受试者施用有效量的治疗剂,其中所述治疗剂选自下组:
(a)权利要求1-32和36-37任一所述的PANDA试剂;和
(b)权利要求1-32任一所述的PANDA或PANDA核心。
50.如权利要求49所述的方法,其特征在于,所述治疗剂与一种或多种其他治疗剂组合给予,优选任何已知的可有效治疗癌症和/或DNA损伤的治疗剂。
51.如权利要求49-50所述的方法,其特征在于,所述疾病选自下组:癌症、肿瘤、衰老、发育性疾病、加速老化、免疫疾病,和/或其组合。
52.一种高效个性化的治疗有需要的受试者中p53异常相关疾病的方法,该方法包括以下步骤:
(a)从受试者获得p53 DNA样品;
(b)对p53 DNA样品进行测序;
(c)确定受试者的p53是否可拯救并确定最适合拯救受试者中的p53的一种或多种PANDA试剂和/或PANDA试剂的组合;和
(d)向受试者给予有效剂量的PANDA试剂和/或PANDA试剂的组合;
其中,步骤(c)包括步骤(i)在计算机上确定p53 DNA样品序列是否与数据库中可拯救的p53一致,并通过数据库确定最适合拯救p53的PANDA试剂和/或PANDA试剂的组合;和/或(ii)在体外和/或体内通过对一组PANDA试剂进行筛选来确定受试者的p53是否可以被拯救。
53.一种识别PANDA或PANDA核心的方法,该方法包括以下步骤:
使用正确折叠的PANDA的特异性抗体,例如PAb1620、PAb246和/或PAb240,进行免疫沉淀;
通过质谱检测分子量的增加;
在荧光素酶测定中检测转录活性是否恢复;
检测p53靶标的mRNA和蛋白质水平;
共结晶构建3-D结构;和/或
测量Tm增加。
54.一种具有在表达mp53或缺乏任何功能性p53的生物系统中,调节p53靶标水平的能力的PANDA试剂。
55.如权利要求54的PANDA试剂,其特征在于,所述PANDA试剂来自权利要求1-32和36-37任一所述。
56.如权利要求54或55所述的PANDA试剂,其特征在于,所述mp53选自权利要求1-32任一所述。
57.一种控制一种或多种受p53和/或PANDA调节的蛋白质和/或RNA的方法,该方法包括步骤:
将一调节剂给予生物系统,其中该调节剂选自:
(i)权利要求1-32和36-37任一所述的PANDA试剂;
(ii)权利要求1-32任一所述的PANDA或PANDA核心;
(iii)能从p53中去除PANDA试剂的化合物;
(iv)mp53;
(v)能去除PANDA的化合物,包括抗p53抗体、多西环素和抗PANDA抗体;和
(vi)以上的组合。
58.一种具有抑制生物系统中的肿瘤的能力的PANDA试剂,优选表达mp53的系统。
59.如权利要求58所述的PANDA试剂,其特征在于,所述PANDA试剂选自权利要求1-32和36-37任一所述。
60.如权利要求58或59所述的PANDA试剂,其特征在于,所述mp53选自权利要求1-32任一所述。
61.一种抑制肿瘤的方法,该方法包括将有效剂量的治疗剂给予有需要的受试者的步骤,其中所述抑制剂选自下组:
(a)权利要求1-32和36-37任一所述的PANDA试剂;和
(b)选自权利要求1-32任一所述的PANDA或PANDA核心。
62.如权利要求61的所述方法,其特征在于,所述抑制剂与一种或多种其他抑制剂联合给予,优选任何已知能有效抑制肿瘤生长的抑制剂和/或DNA损伤剂。
63.一种具有在生物系统中调节细胞生长或肿瘤生长的能力的PANDA试剂,优选表达mp53的系统。
64.如权利要求63所述的PANDA试剂,其特征在于,所述PANDA试剂选自权利要求1-32和36-37任一所述。
65.如权利要求63或64的所述PANDA试剂,其特征在于,所述mp53选自权利要求1-32任一所述。
66.一种调节细胞生长或肿瘤生长的方法,所述方法包括向有需要的受试者施用有效剂量的调节剂的步骤,其中所述调节剂选自:
(a)权利要求1-32和36-37任一所述的PANDA试剂;和
(b)权利要求1-32任一所述的PANDA或PANDA核心。
67.如权利要求66所述的方法,其特征在于,所述调节剂与一种或多种另外的调节剂联合给予,优选任何已知能有效减慢细胞生长的调节剂和/或DNA损伤剂。
68.一种在有此需要受试者中诊断p53异常相关疾病的方法,该方法包括对受试者施用有效剂量的治疗剂,以及检测PANDA或PANDA核心是否形成的步骤,其中所述治疗剂选自下组:
(a)权利要求1-32和36-37任一所述的PANDA试剂;和
(b)权利要求1-32的PANDA或PANDA核心。
69.权利要求68的方法其特征在于,所述治疗剂与一种或多种另外的治疗剂联合给予,优选任何已知的可有效治疗癌症的治疗剂和/或DNA损伤剂。
70.如权利要求49-50所述的方法,其特征在于,所述疾病选自下组:癌症、肿瘤、衰老、发育性疾病、加速老化、免疫疾病,和/或其组合。
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Cited By (4)
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---|---|---|---|---|
CN111565729A (zh) * | 2018-01-02 | 2020-08-21 | 上海交通大学医学院附属瑞金医院 | mp53拯救化合物和治疗p53疾病的方法 |
CN112029738A (zh) * | 2020-08-18 | 2020-12-04 | 浙江省人民医院 | 人parkin蛋白乙酰化及其在药物制备中的应用 |
CN114527054A (zh) * | 2022-01-28 | 2022-05-24 | 华南理工大学 | 一种基于相分离研究磷酸化p53稳定性以及细胞内定位的方法 |
CN115463152A (zh) * | 2021-06-11 | 2022-12-13 | 上海交通大学医学院附属瑞金医院 | 多功能p53复活药物及其用途 |
Families Citing this family (1)
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---|---|---|---|---|
WO2023086382A2 (en) * | 2021-11-09 | 2023-05-19 | Mayo Foundation For Medical Education And Research | Methods and materials for assessing and treating oral lichen planus |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1723029A (zh) * | 2002-10-09 | 2006-01-18 | 香港大学 | 包括三氧化二砷的口服组合物的制剂及其使用方法 |
US20110081331A1 (en) * | 2009-10-01 | 2011-04-07 | Peter Maccallum Cancer Institute | Cancer therapy |
CN105435228A (zh) * | 2014-08-14 | 2016-03-30 | 中国科学院上海生命科学研究院 | 三氧化二砷的抗肿瘤新用途及抗肿瘤制剂 |
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Family Cites Families (11)
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---|---|---|---|---|
CN1233476A (zh) * | 1998-04-24 | 1999-11-03 | 陆道培 | 治疗急性白血病的药物及其制备方法 |
US6485755B1 (en) * | 2000-01-06 | 2002-11-26 | Marantech Holding | Methods of using electron active compounds for managing cancer |
CN1159017C (zh) * | 2002-05-27 | 2004-07-28 | 苏州市第二人民医院 | 治疗白血病和淋巴瘤的卤化锑药物组合物 |
US7884107B2 (en) * | 2006-06-30 | 2011-02-08 | Merck | Substituted piperidines that increase P53 activity and the uses thereof |
WO2009049258A1 (en) * | 2007-10-12 | 2009-04-16 | The Johns Hopkins University | Compounds for hedgehog pathway blockade in proliferative disorders, including hematopoietic malignancies |
CN102365295A (zh) * | 2009-01-30 | 2012-02-29 | 阿德利夫股份有限公司 | 构象动力肽 |
WO2014113792A1 (en) * | 2013-01-19 | 2014-07-24 | New York University | Hydrogen-bond surrogate peptides and peptidomimetics for p53 reactivation |
RU2721423C2 (ru) * | 2013-08-07 | 2020-05-19 | Йеда Ресеарч Энд Девелопмент Ко. Лтд. | Пептиды, способные реактивировать мутанты р53 |
US9737546B2 (en) * | 2013-08-09 | 2017-08-22 | The Regents Of The University Of California | Small molecules to enhance P53 activity |
JP2017517520A (ja) * | 2014-05-29 | 2017-06-29 | メルク・シャープ・アンド・ドーム・コーポレーションMerck Sharp & Dohme Corp. | Wee1阻害剤を用いた癌を処置する方法 |
JP2016023182A (ja) * | 2014-07-24 | 2016-02-08 | 北海道公立大学法人 札幌医科大学 | がんを処置するための医薬 |
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Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1723029A (zh) * | 2002-10-09 | 2006-01-18 | 香港大学 | 包括三氧化二砷的口服组合物的制剂及其使用方法 |
US20110081331A1 (en) * | 2009-10-01 | 2011-04-07 | Peter Maccallum Cancer Institute | Cancer therapy |
CN105435228A (zh) * | 2014-08-14 | 2016-03-30 | 中国科学院上海生命科学研究院 | 三氧化二砷的抗肿瘤新用途及抗肿瘤制剂 |
CN111565729B (zh) * | 2018-01-02 | 2023-01-24 | 上海交通大学医学院附属瑞金医院 | mp53拯救化合物和治疗p53疾病的方法 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
VLADIMIR J.N.ET AL: "Mutant p53 reactivation by small molecules makes its way to the clinic", vol. 588, pages 2622 - 2627, XP029008740, DOI: 10.1016/j.febslet.2014.04.017 * |
Cited By (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN111565729A (zh) * | 2018-01-02 | 2020-08-21 | 上海交通大学医学院附属瑞金医院 | mp53拯救化合物和治疗p53疾病的方法 |
CN112029738A (zh) * | 2020-08-18 | 2020-12-04 | 浙江省人民医院 | 人parkin蛋白乙酰化及其在药物制备中的应用 |
CN112029738B (zh) * | 2020-08-18 | 2022-04-29 | 浙江省人民医院 | 人parkin蛋白乙酰化及其在药物制备中的应用 |
CN115463152A (zh) * | 2021-06-11 | 2022-12-13 | 上海交通大学医学院附属瑞金医院 | 多功能p53复活药物及其用途 |
CN114527054A (zh) * | 2022-01-28 | 2022-05-24 | 华南理工大学 | 一种基于相分离研究磷酸化p53稳定性以及细胞内定位的方法 |
CN114527054B (zh) * | 2022-01-28 | 2024-03-08 | 华南理工大学 | 一种基于相分离研究磷酸化p53稳定性以及细胞内定位的方法 |
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