EA026317B1 - КОМБИНИРОВАННОЕ ЛЕЧЕНИЕ С ПРИМЕНЕНИЕМ ИНГИБИТОРОВ mTOR/JAK - Google Patents

Abstract

В настоящем документе предоставлен способ лечения злокачественной опухоли у нуждающегося в этом субъекта путем введения субъекту ингибитора mTOR и (3R)-3-циклопентил-3-[4-(7Н-пирроло[2,3-d]пиримидин-4-ил)-1Н-пиразол-1-ил]пропаннитрила или его стереоизомеров, таутомеров, рацематов, сольватов или фармацевтически приемлемых солей, где ингибитор mTOR представляет собой эверолимус (RAD001) или 2-(4-амино-1-изопропил-1Н-пиразоло[3,4-d]пиримидин-3-ил)-1Н-индол-5-ол (РР242). Указанное комбинированное лечение пригодно для лечения различных злокачественных опухолей, включая MPN. В настоящем изобретении также описан способ ингибирования фосфорилирования STAT5 и фармацевтическая композиция.

Description

Настоящее изобретение относится к комбинированному лечению различных злокачественных опухолей, включая миелопролиферативные неоплазии, путем введения субъекту ингибитора тТОК и ингибитора 1ЛК.

Уровень техники

Миелопролиферативные неоплазии (ΜΡΝ) представляют собой группу нарушений, которые вызывают сверхпродукцию клеток крови (тромбоциты, лейкоциты и эритроциты) в костном мозге. ΜΡΝ включают истинную полицитемию (РУ), первичную или эссенциальную тромбоцитемию (ЕТ), первичный или идиопатический миелофиброз, хронический миелогенный (миелоцитарный) лейкоз (СМЬ), хронический нейтрофильный лейкоз (СЖЬ). ювенильный миеломоноцитарный лейкоз (ХМЬ) и хронический эозинофильный лейкоз (СЕЬ)/гиперэозинофильный синдром (НЕ§). Эти нарушения относят к одной группе, поскольку их объединяют несколько или все из следующих признаков: вовлечение в патологический процесс мультипотентной гематопоэтической клетки-предшественника, доминирование трансформированного клона над нетрансформированными гематопоэтическими клетками-предшественниками, сверхпродукция одной или нескольких гематопоэтических линий в отсутствие определяемого стимула, независимое от фактора роста образование колоний ίη νίΐτο, повышенное содержание паренхиматозных клеток в костном мозге, гиперплазия и дисплазия мегакариоцитов, аномалии, преимущественно касающиеся хромосом 1, 8, 9, 13 и 20, тромботический и геморрагический диатезы, избыточный экстрамедуллярный гемопоэз и спонтанная трансформация в острый лейкоз или развитие фиброза костного мозга, однако с низкой скоростью по сравнению со скоростью развития СМЬ. Заболеваемость ΜΡΝ широко варьирует в диапазоне приблизительно от 3 на 100000 субъектов старше 60 лет ежегодно для СМЬ, до 0,13 на 100000 детей от рождения до 14 лет ежегодно для 1МЬ (УатФтап Ь\У. е! а1., Βίοοά 100 (7): 2292302, 2002).

Таким образом, существует необходимость разработки новых способов лечения ΜΡΝ, а также других злокачественных опухолей.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к способу лечения злокачественной опухоли у нуждающегося в этом субъекта, включающему введение субъекту ингибитора тТОК и (3К)-3-циклопентил-3-[4-(7Нпирроло[2,3-б]пиримидин-4-ил)-1Н-пиразол-1-ил]пропаннитрила или его стереоизомеров, таутомеров, рацематов, сольватов или фармацевтически приемлемых солей, где ингибитор тТОК представляет собой эверолимус (КЛЭ001) или 2-(4-амино-1-изопропил-1Н-пиразоло[3,4-б]пиримидин-3-ил)-1Н-индол-5-ол (РР242).

В одном из аспектов настоящего изобретения ингибитор тТОК и (3К)-3-циклопентил-3-[4-(7Нпирроло[2,3-б]пиримидин-4-ил)-1Н-пиразол-1-ил]пропаннитрил или его фармацевтически приемлемая соль включены в единый состав или стандартную лекарственную форму.

В предпочтительном варианте единый состав или стандартная лекарственная форма дополнительно включает фармацевтически приемлемый носитель.

В другом аспекте настоящего изобретения ингибитор тТОК и (3К)-3-циклопентил-3-[4-(7Нпирроло[2,3-б]пиримидин-4-ил)-1Н-пиразол-1-ил]пропаннитрил или его фармацевтически приемлемую соль вводят раздельно.

В одном из аспектов настоящего изобретения злокачественная опухоль представляет собой миелопролиферативную неоплазию. В рамках настоящего изобретения миелопролиферативная неоплазия может быть выбрана из группы, включающей хронический миелолейкоз (СМЬ), истинную полицитемию (РУ), эссенциальную тромбоцитемию (ЕТ), первичный или идиопатический миелофиброз (РМР), хронический нейтрофильный лейкоз, хронический эозинофильный лейкоз, хронический миеломоноцитарный лейкоз, ювенильный миеломоноцитарный лейкоз, гиперэозинофильный синдром, системный мастоцитоз и атипичный хронический миелогенный лейкоз.

В частном случае настоящего изобретения миелопролиферативная неоплазия представляет собой первичный миелофиброз, истинную полицитемию в стадии миелофиброза или эссенциальную тромбоцитемию в стадии миелофиброза.

Согласно настоящему изобретению субъект представляет собой человека.

В одном из аспектов настоящего изобретения лечение включает введение ингибитора тТОК и (3К)3-циклопентил-3-[4-(7Н-пирроло[2,3-б]пиримидин-4-ил)-1Н-пиразол-1-ил]пропаннитрила или его фармацевтически приемлемой соли, по существу, одновременно.

В другом аспекте настоящего изобретения лечение включает введение ингибитора тТОК и (3К)-3циклопентил-3-[4-(7Н-пирроло[2,3-б]пиримидин-4-ил)-1Н-пиразол-1-ил]пропаннитрила или его фармацевтически приемлемой соли в разное время.

В предпочтительном варианте настоящего изобретения ингибитор тТОК вводят субъекту с последующим введением (3К)-3-циклопентил-3-[4-(7Н-пирроло[2,3-б]пиримидин-4-ил)-1Н-пиразол-1ил]пропаннитрила или его фармацевтически приемлемой соли.

В другом предпочтительном варианте настоящего изобретения (3К)-3-циклопентил-3-[4-(7Нпирроло[2,3-б]пиримидин-4-ил)-1Н-пиразол-1-ил]пропаннитрил или его фармацевтически приемлемую соль вводят субъекту с последующим введением ингибитора тТОК.

- 1 026317

В одном из аспектов настоящего изобретения ингибитор тТОК и (3К)-3-циклопентил-3-[4-(7Нпирроло[2,3-б]пиримидин-4-ил)-1Н-пиразол-1-ил]пропаннитрил или его фармацевтически приемлемая соль находятся в разных составах или стандартных лекарственных формах.

В одном из аспектов настоящего изобретения ингибитор тТОК и/или (3К)-3-циклопентил-3-[4-(7Нпирроло[2,3-б]пиримидин-4-ил)-1Н-пиразол-1-ил]пропаннитрил или его фармацевтически приемлемую соль вводят в дозах, которые не являются эффективными при раздельном введении одного или обоих ингибиторов тТОК и (3К)-3-циклопентил-3-[4-(7Н-пирроло[2,3-б]пиримидин-4-ил)-1Н-пиразол-1ил]пропаннитрила или его фармацевтически приемлемой соли, но которые являются эффективными при применении в комбинации.

Ещё одним объектом настоящего изобретения является способ ингибирования фосфорилирования 8ТАТ5. включающий введение ингибитора тТОК и (3К)-3-циклопентил-3-[4-(7Н-пирроло[2,3б]пиримидин-4-ил)-1Н-пиразол-1-ил]пропаннитрила или его фармацевтически приемлемой соли, где ингибитор тТОК представляет собой эверолимус (КАЭ001) или 2-(4-амино-1-изопропил-1Нпиразоло [3,4-б]пиримидин-3 -ил)-1Н-индол-5-ол (РР242).

В одном из аспектов настоящего изобретения введение указанного состава позволяет лечить злокачественную опухоль у нуждающегося в этом субъекта.

В другом аспекте настоящего изобретения введение состава позволяет лечить миелопролиферативную неоплазию у нуждающегося в этом субъекта.

Ещё одним объектом настоящего изобретения является способ лечения миелопролиферативной неоплазии, включающий введение нуждающемуся в этом субъекту эверолимуса и (3К)-3-циклопентил-3-[4(7Н-лирроло[2,3-б]пиримидин-4-ил)-1Н-пиразол-1-ил]пропаннитрила или их фармацевтически приемлемых солей.

Ещё одним другим объектом настоящего изобретения является способ лечения миелопролиферативной неоплазии, включающий введение нуждающемуся в этом субъекту РР242 и (3К)-3-циклопентил3-[4-(7Н-пирроло[2,3-б]пиримидин-4-ил)-1Н-пиразол-1-ил]пропаннитрила или их фармацевтически приемлемых солей.

Настоящее изобретение также относится к фармацевтлческой композиции, содержащей ингибитор тТОК и (3К)-3-циклопентил-3-[4-(7Н-пирроло[2,3-б]пиримидин-4-ил)-1Н-пиразол-1-ил]пропаннитрил, включая его стереоизомеры, таутомеры, рацематы, сольваты и фармацевтически приемлемые соли, где ингибитор тТОК представляет собой эверолимус (КАЭ001) или 2-(4-амино-1-изопропил-1Нпиразоло [3,4-б]пиримидин-3 -ил)-1Н-индол-5-ол (РР242).

В предпочтительном варианте указанная композиция может дополнительно содержать фармацевтически приемлемый носитель.

Ещё одним объектом настоящего изобретения является способ лечения злокачественной опухоли у нуждающегося в этом субъекта, включающий введение субъекту эффективного количества указанной фармацевтической композиции. В частном аспекте настоящего изобретения злокачественная опухоль представляет собой миелопролиферативную неоплазию.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1А-1Е показан эффект выбранных ингибиторов тТОК, ингибитора 1АК1/1АК2, ингибиторов гистондеацетилазы и гидроксимочевины на клеточный апоптоз и клеточный цикл в клетках 8ЕТ2 или НЕЬ.

На фиг. 2 показан эффект выбранных ингибиторов тТОК, ингибитора 1АК1/1АК2, ингибиторов гистондеацетилазы и гидроксимочевины на сигнальные пути тТОК и 1АК/8ТАТ в клетках 8ЕТ2.

Подробное описание

Показано, что введение комбинации ингибитора тТОК и ингибитора 1АК-киназы (например, ингибитор 1АК-киназы с формулой I (например, соединение А или его фармацевтически приемлемая соль)) предоставляет неожиданный синергический эффект для лечения злокачественной опухоли, например миелопролиферативных неоплазий (ΜΡΝ), у субъекта. Такой подход - сочетание или комбинированное введение двух типов средств -может быть полезным для лечения субъектов, страдающих от злокачественной опухоли и не отвечающих на или резистентных к существующим способам лечения. Комбинированное лечение, предоставленное в настоящем документе, также пригодно для повышения эффективности и/или сокращения побочных эффектов существующих способов лечения злокачественной опухоли у субъектов, которые отвечают на такие способы лечения.

Конкретные термины, применяемые в настоящем документе, описаны ниже. Соединения по настоящему изобретению описаны с применением стандартной номенклатуры. Если не определено иначе, все технические и научные термины, применяемые в настоящем документе, имеют то же значение, что и общепринятое среди специалистов в данной области, к которой принадлежит данное изобретение.

Комбинация ингибитора тТОК/ингибитора 1АК.

В настоящем документе предоставлена комбинация терапевтических средств и способов введения комбинации средств для лечения злокачественной опухоли, например ΜΡΝ. В рамках изобретения комбинация средств и сходные термины относятся к комбинации двух типов средств: (1) ингибитора тТОК и (2) ингибитора 1АК (например, ингибитора 1АК-киназы с формулой I (например, соединение А или его

- 2 026317 фармацевтически приемлемая соль)).

Мишень рапамицина у млекопитающих, общеизвестная как тТОК, представляет собой серин/треониновую протеинкиназу, которая регулирует клеточный рост, клеточную пролиферацию, клеточную подвижность, клеточную выживаемость, синтез белка и транскрипцию. тТОК является ключевым посредником во множестве митогенных путей передачи сигнала и играет центральную роль в модулировании пролиферации и ангиогенеза в нормальных тканях и в опухолевых образованиях. Гиперактивация сигнального пути тТОК вовлечена в образование опухоли, и исследования нескольких типов опухолей позволяют предположить, что антипролиферативные и антиангиогенные свойства ингибиторов тТОК полезны в лечении злокачественной опухоли. тТОК существует в составе двух комплексов, тТОКС1 и тТОКС2. тТОКС1 чувствителен к аналогам рапамицина (таким как темсиролимус или эверолимус), а тТОКС2 в основном нечувствителен к рапамицину. Несколько ингибиторов тТОК были изучены в клинических испытаниях для лечения злокачественной опухоли.

Термин ингибитор тТОК относится к соединению или лиганду, которые ингибируют по меньшей мере одну активность тТОК, такую как воздействие серин/треониновой протеинкиназы по меньшей мере на один из ее субстратов (например, р70§6 киназа 1, 4Е-ВР1, АКТ/РКВ и еЕР2). Специалист в данной области может легко определить, является ли соединение, такое как рапамицин или его аналог или производное, ингибитором тТОК. Способы определения таких соединений или лигандов известны в данной области. Примеры ингибиторов тТОК в рамках настоящего изобретения включают эверолимус (Сетйсап™) и 2-(4-амино-1-изопропил-1Н-пиразоло[3,4-б]пиримидин-3-ил)-1Н-индол-5-ол (РР242).

Термин селективный ингибитор тТОК относится к соединению или лиганду, которые ингибируют активность тТОК, но не ингибируют активность Р13К. Подходящий селективный ингибитор тТОК в рамках настоящего изобретения представляет собой КАО001. Таким образом, в одном из аспектов в настоящем документе предоставлено комбинированное лечение, включающее селективный ингибитор тТОК и ингибитор 1АК.

Рапамицин является известным макролидным антибиотиком, который получают из §1тер1отусе8 Ьудго8сор1си8. Подходящие производные рапамицина включают, например, соединения формулы II

где К_1аа представляет собой СН₃ или С_3-6алкинил,

К_2аа представляет собой Н или -СН₂-СН₂-ОН, 3-гидрокси-2-(гидроксиметил)-2-метилпропаноил или тетразолил и

Х_2аа представляет собой =О, (Н,Н) или (Н,ОН), или их пролекарственные формы, где К_2аа представляет собой -СН₂-СН₂-ОН, например их физиологически гидролизируемые простые эфиры.

Соединения формулы II описаны, например, в \УО 94/09010, \УО 95/16691, \УО 96/41807 патенте США № 5362718 и \УО 99/15530, которые включены в настоящий документ в качестве ссылки. Их можно получать с применением способов, описанных в этих ссылках.

Типичные производные рапамицина с формулой II представляют собой, например, 32деоксорапамицин, 16-пент-2-инилокси-32-деоксорапамицин, 16-пент-2-инилокси-32(§ или К)-дигидрорапамицин, 16-пент-2-инилокси-32(§ или К)-дигидро-40-О-(2-гидроксиэтил)рапамицин, 40-[3-гидрокси2-(гидроксиметил)-2-метилпропаноат]рапамицин (также называемый ССП79) или 40-эпи-(тетразолил) рапамицин (также называемый АВТ578). Производные рапамицина также могут включать так называемые рапалоги, например, как описано в \УО 98/02441 и \УО 01/14387, например АР23573, АР23464, АР23675 или АР23841. Другие примеры производных рапамицина раскрыты под названиями ТАРА-93 (пролекарственная форма рапамицина), биолимус-7 или биолимус-9.

- 3 026317

В предпочтительном варианте осуществления ингибитор тТОК, применяемый в комбинированном лечении, предоставленном в настоящем документе, представляет собой эверолимус (КАЭ001) или 2-(4амино-1-изопропил-1Н-пиразоло[3,4-б]пиримидин-3-ил)-1Н-индол-5-ол (РР242) (см., например, Арве1 с1 а1., №Циге СБетюа1 Вю1оду 4, 691-699 (2008)).

Семейство 1АК участвует в цитокин-зависимой регуляции пролиферации и функций клеток, вовлеченных в иммунный ответ. В настоящее время известно четыре представителя семейства 1АК у млекопитающих: 1АК1 (также известная как янус-киназа-1), 1АК2 (также известная как янус-киназа-2), 1АК3 (также известная как янус-киназа, лейкоцит; 1АКЬ; ШАК и янус-киназа-3) и ТУК2 (также известная как белок-тирозинкиназа 2). Белки 1АК варьируют по размеру от 120 до 140 кДа и содержат семь консервативных 1АК-гомологичных доменов ПН); один из них представляет собой функциональный каталитический киназный домен, а другой представляет собой псевдокиназный домен, потенциально выполняющий регуляторную функцию и/или выступающий в качестве стыковочного участка для 8ТАТ (8сой, МД., СоЙ8Йа11, С.1. е! а1. (2002) С1ш И1адп ЬаЬ 1ттипо1 9(6): 1153-9).

Термин ингибитор 1АК относится к соединению или лиганду, который ингибирует по меньшей мере одну активность 1АК-киназы. Ингибитор 1АК может также быть ингибитором 1АК1/1АК2. В рамках настоящего изобретения пример ингибитора 1АК включает соединение (3К)-3-циклопентил-3-[4(7Н-пирроло [2,3-й] пиримидин-4 -ил) -1Н-пиразол-1 -ил] пропаннитрил.

В рамках изобретения термин фармацевтически приемлемые соли относится к нетоксичным кислотным солям или солям щелочно-земельных металлов пиримидиновых соединений по изобретению. Эти соли можно получать ίη 8Йи во время итоговой изоляции и очистки пиримидиновых соединений или посредством раздельного взаимодействия основания или кислоты с подходящей органической или неорганической кислотой или основанием соответственно. Типичные соли в качестве неограничивающих примеров включают следующие: ацетат, адипат, альгинат, цитрат, аспартат, бензоат, бензолсульфонат, бисульфат, бутират, камфорат, камфорсульфонат, диглюконат, циклопентанпролионат, додецилсульфат, этансульфонат, глюкогептаноат, глицерофосфат, гемисульфат, гептаноат, гексаноат, фумарат, гидрохлорид, гидробромид, йодогидрат, 2-гидроксиэтансульфонат, лактат, малеат, метансульфонат, никотинат, 2нафт-аленесульфонат, оксалат, памоат, пектинат, персульфат, 3-фенилпропионат, пикрат, пивалат, пропионат, сукцинат, сульфат, тартрат, тиоцианат, п-толуолсульфонат и ундеканоат. Кроме того, основные азотсодержащие группы можно кватернизировать с такими средствами, как алкилгалогениды, такие как метил-, этил-, пропил- и бутилхлориды, бромиды и йодиды; диалкилсульфатами, такими как диметил-, диэтил-, дибутил- и диамилсульфатами, галогенидами с длинной цепью, такими как децил-, лаурил-, миристил- и стеарилхлориды, бромиды и йодиды, аралкилгалогенидами, такими как бензил- и фенэтилбромидами, и другими. В этом случае получают растворимые в воде или масле или диспергируемые продукты.

Примеры кислот, которые можно использовать для получения фармацевтически приемлемых солей присоединения кислот, включают такие неорганические кислоты как соляная кислота, гидроборная кислота, азотная кислота, серная кислота и фосфорная кислота, и такие органические кислоты как муравьиная кислота, уксусная кислота, трифторуксусная кислота, фумаровая кислота, винная кислота, щавелевая кислота, малеиновая кислота, метансульфоновая кислота, янтарная кислота, яблочная кислота, метансульфоновая кислота, бензолсульфоновая кислота и п-толуолсульфоновая кислота, лимонная кислота, и кислые аминокислоты, такие как аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота.

В настоящем документе предоставлено комбинированное лечение, включающее ингибитор тТОК и ингибитор 1АК (например, (3К)-3-циклопентил-3-[4-(7Н-пирроло[2,3-й]пиримидин-4-ил)-1Н-пиразол-1ил]пропаннитрил или его фармацевтически приемлемая соль). Введение комбинации (т.е. комбинации ингибитора тТОК и ингибитора 1АК (например, (3К)-3-циклопентил-3-[4-(7Н-пирроло[2,3й]пиримидин-4-ил)-1Н-пиразол-1-ил]пропаннитрила или его фармацевтически приемлемой соли) включает введение комбинации в единой композиции или в стандартной лекарственной форме, введение отдельных средств комбинации одновременно, но раздельно, и введение отдельных средств комбинации последовательно посредством любого подходящего способа. Дозировка отдельных средств комбинации может подразумевать более частое введение одного средства(ов) по сравнению с другим(и) средством(ами) комбинации. Таким образом, для обеспечения подходящего дозирования расфасованные фармацевтические препараты могут содержать одну или несколько лекарственных форм, которые содержат комбинацию средств, и одну или несколько лекарственных форм, которые содержат одно из средств комбинации, но не содержат другого(их) средства(ов) комбинации.

Термин единый состав в рамках изобретения относится к единому носителю или носителю, обеспечивающему доставку пациенту эффективных количеств обоих терапевтических средств.

Единый носитель обеспечивает доставку эффективного количества каждого средства, а также фармацевтически приемлемых носителей или эксципиентов. В некоторых вариантах осуществления носитель представляет собой таблетку, капсулу, пилюлю или пластырь. В других вариантах осуществления носитель представляет собой раствор или суспензию.

Термин стандартная доза используют в настоящем документе для обозначения одномоментного введения получающему лечение пациенту обоих средств в одной лекарственной форме. В некоторых вариантах осуществления стандартная доза представляет собой единый состав. В определенных вариан- 4 026317 тах осуществления стандартная доза включает один или несколько носителей, каждый из которых содержит эффективное количество по меньшей мере одного из средств наряду с фармацевтически приемлемыми носителями и эксципиентами. В некоторых вариантах осуществления стандартная доза представляет собой одну или несколько таблеток, капсул, пилюль или пластырей, которые применяют к пациенту одновременно.

Термин лечение используют в настоящем документе для обозначения облегчения, сокращения или смягчения по меньшей мере одного симптома заболевания у субъекта. Согласно настоящему изобретению термин лечение также обозначает остановку, задержку проявления заболевания (т.е. периода, предшествующего клиническому проявлению заболевания или симптома заболевания) и/или уменьшение риска развития или обострения симптомов заболевания.

Термин субъект включает животных. Примеры субъектов включают млекопитающих, например людей, собак, коров, лошадей, свиней, овец, коз, кошек, мышей, кроликов, крыс и трансгенных, не являющихся человеком животных. В определенных вариантах осуществления субъект представляет собой человека, например человека, страдающего от или характеризующегося риском развития или потенциально предрасположенного к заболеванию злокачественной опухолью, например миелопролиферативными неоплазиями.

Термин комбинированное лечение относится к введению двух или более терапевтических средств для лечения терапевтического состояния или нарушения, описанного в настоящей заявке. Такое введение включает совместное введение этих терапевтических средств, по существу, одновременно, например, в единой капсуле, содержащей фиксированное количество активного ингредиента, или в отдельных контейнерах (например, капсулах) для каждого активного ингредиента. Кроме того, такое введение также охватывает последовательное применение каждого типа терапевтического средства, либо приблизительно одновременно, либо в разные моменты времени. Во всех случаях схема лечения обеспечивает положительное воздействие комбинации лекарственных средств на лечение состояний или нарушений, описываемых в настоящем документе.

Комбинация средств, описываемых в настоящем документе, демонстрирует синергическое действие. Термин синергическое действие в рамках изобретения относится к действию двух средств, таких как, например, ингибитор тТОК и ингибитор 1ЛК (например, ингибитор 1ЛК формулы I), предоставляющих эффект, например, замедления симптоматического прогресса злокачественной опухоли или ее симптомов, который представляет собой более чем простое сложение эффектов каждого лекарственного средства при отдельной доставке. Синергическое действие можно оценивать, например, посредством подходящих способов, таких как уравнение 8щто1Й-Етах (НоПогй, Ν.Η.Ο. апй 8сПешег, Ь.В., СПп. РПагтасоктеЕ 6: 429-453 (1981)), уравнение аддитивности Лоу (Ьоете, 8. апй МшксНпек, Н., АгсН. Ехр. РаЙю1 РНагтасо1. 114: 313-326 (1926)) и уравнение среднего воздействия (СНои, Т.С. апй Та1а1ау, Р., Айу. Еп/уте Кеди1. 22: 27-55 (1984)). Каждое приведенное выше уравнение можно применять к экспериментальным данным с получением соответствующей диаграммы, посредством которой можно оценивать эффект комбинации лекарственных средств. Соответствующие диаграммы, связанные с приведенными выше уравнениями, представляют собой кривую концентрация-эффект, изоболограмму и кривую индекса комбинации соответственно.

В одном из вариантов осуществления в настоящем документе предоставлено комбинированное лечение, включающее эффективное количество ингибитора 1АК и ингибитора тТОК. Эффективное количество комбинации средств (т.е. ингибитора тТОК и ингибитора 1АК (например, ингибитора 1АК формулы I)) представляет собой количество, достаточное для обеспечения видимого улучшения по сравнению с базовыми клинически наблюдаемыми признаками и симптомами нарушений, подлежащих лечению посредством комбинации.

Пероральная лекарственная форма включает стандартную лекарственную форму, предписанную или предназначенную для перорального введения.

Способы лечения с применением комбинации ингибитора тТОК/ингибитора 1АК.

Изобретение относится к способу лечения у субъекта 1АК-ассоциированных заболеваний, например, злокачественной опухоли, например миелопролиферативных неоплазий, посредством введения субъекту комбинации ингибитора тТОК и ингибитора 1АК (например, ингибитора 1АК формулы I).

В одном из вариантов осуществления в настоящем документе предоставлены способы лечения 1АК-ассоциированного заболевания или нарушения у субъекта (например, пациента) посредством введения нуждающемуся в таком лечении субъекту терапевтически эффективного количества или дозы комбинации по настоящему изобретению или ее фармацевтической композиции. Согласно настоящему изобретению 1АК-ассоциированное заболевание включает злокачественную опухоль, которая может представлять собой миелопролиферативную неоплазию. В свою очередь миелопролиферативную неоплазию выбирают из группы, включающей хронический миелолейкоз (СМЬ), истинную полицитемию (РУ), эссенциальную тромбоцитемию (ЕТ), первичный или идиопатический миелофиброз (РМР), хронический нейтрофильный лейкоз, хронический эозинофильный лейкоз, хронический миеломоноцитарный лейкоз, ювенильный миеломоноцитарный лейкоз, гиперэозинофильный синдром, системный мастоцитоз и атипичный хронический миелогенный лейкоз.

- 5 026317

Хронические миелопролиферативные неоплазии (ΜΡΝ), которые включают истинную полицитемию (РУ), эссенциальную тромбоцитемию (ЕТ) и первичный миелофиброз (ΡΜΡ), характеризуются точечной мутацией У617Е в экзоне 14 янус-киназы 2 (1ΆΚ2), возникающей у более 95% пациентов с РУ и 60% пациентов с ЕТ или ΡΜΡ. Другие мутации экзона 12 в 1ΆΚ2 редко обнаруживают у пациентов с РУ, в то время как мутации в МРЬ обнаружили у 5-10% пациентов с ЕТ или ΡΜΡ (УаиииссЫ Α.Μ., ОидНе1теШ, Ρ., Тейеп, Α. Абуаисек ίη ипбегк1апбтд аиб тападетеШ оГ туе1оргоП1сга1ке пеор1актк. АС- Α Сапсег 1оита1 Гог Сктшапк. 2009; 59:171-191). Все эти молекулярные патологии ассоциированы с конститутивной активацией пути передачи сигнала с участием ΙΑΚ/сигнального трансдуктора и активатора транскрипции (8ΤΑΤ) и влияют на гиперчувствительность к цитокину и независимый рост цитокина в мутантных клетках, как показано на примере эритрспоэтин-независимых эритроидных колониях (ЕЕС). Трансплантация сверхэкспрессирующих 1ΑΚ2ν617Ρ гематопоэтических клеток мышам достаточна для воспроизведения фенотипа Ρν, который в некоторых моделях переходит в миелофиброз. Нарушение ΜΡΝ с фенотипом ГУ или ЕТ также получали на мышах кпоск-ш. Дисрегуляция сигнального пути 1ΑΚ/8ΤΑΤ ассоциирована с развитием солидных и гематологических злокачественных опухолей, и конститутивно активированные мутанты 8ΤΑΤ5Α или 8ΤΑΤ5Β ΧιδΤΑΤ5) демонстрируют онкогенные свойства 1п убго и ш уко. В сочетании 1ΑΚ2 представляет собой потенциально полезную терапевтическую мишень у пациентов с ΜΡΝ (там же), как показано на примере моделей ΜΡΝ с применением мышей и результатов клинических испытаний.

Активация других нисходящих сигнальных путей посредством фосфатидилинозитол-3-киназы (ΡΙ3Κ) и киназы, регулируемой внеклеточными сигналами (ΕΚΚ), показана на мутантных клетках ЗА^УбИЕ. Серин/треониная протеинкиназа Β/Α1Λ является следующим по отношению к ΡΙ3Κ звеном; она является ключевым регулятором многих клеточных процессов, включая клеточную выживаемость, пролиферацию и дифференцировку, и часто подвергается дисрегуляции в злокачественных клетках. Хотя Лк1 конститутивно активируется в мутантных клетках ^ЛΚ2У617Е ш убго и у трансгенных мышей и и мышей кпоск-ш У617Е (Лкаба Н, Уап Ό., 2ои Н., Е1еппд 8., НикЫкоп К.Е., ΜоЬ^ Μ.Ο. Сопббюпб ехргеккюп оГ беЮго/удоик ог бото/удоик 1ак2У617Е Ггот бк епбодепоик рготоЮг тбисек а ро1усу1бет1а уегаНке б1кеаке. В1ооб. 2010; 115:3589-3597), вклад сигнального пути ΡΙ3Κ/Α1: в патогенез ΜΡΝ до сих пор плохо изучен. ΑΚί фосфорилируется и активируется посредством ΡΙ3Κ в ответ на захват лигандов рецепторов эритропоэтина (ЕРО) и играет роль в нормальной эритроидной дифференцировке. В частности, Α1ι способен поддерживать эритроидную дифференцировку в дефицитных по 1ΑΚ2 эмбриональных клеткахпредшественниках печени посредством механизма, являющегося следующим по отношению к ЕроК звеном, и, по меньшей мере, частично участвует в фосфорилировании ΟΑΤΑ-1. Α61 активируется в эритробластах из костного мозга или селезенки мышей с условной аллелью кпоск-ш ^ЛΚ2У617Е, особенно у гомозиготных по У617Е животных. Относительно повышенное фосфорилирование 8ΤΑΤ5 и Α61 демонстрировали посредством иммуноцитохимии костного мозга, в частности мегакариоцитов, пациентов с ΜΡΝ. Селективную активацию Α1ι в мегакариоцитах можно регулировать посредством сильного ингибирования пролиферации предшественников мегакариоцитов человека после блокады сигнального пути тΤОК с применением рапамицина. Кроме того, низкомолекулярные ингибиторы сигнального пути 1ΑΚ/8ΤΑΤ или ΡΙ3Ι</ΑΚι вызывают сопоставимое ингибирование спонтанной и ЕРО-индуцированной эритроидной дифференцировки в клеточных культурах клеток-предшественников ΡУ.

Таким образом, в одном из вариантов осуществления злокачественная опухоль, которую можно лечить посредством комбинации, предоставленной в настоящем документе, представляет собой миелопролиферативное нарушение. Миелопролиферативные нарушения (ΜΡΌ), которые часто обозначают как миелопролиферативные неоплазии (ΜΡΝ), относятся к классу гематологических злокачественных новообразований, которые представляют собой клональные нарушения гематопоэтических предшественников. ΤеЛс^^. Α. апб Уагб1тап, IX., СбаккбюаОоп апб б1адпок1к оГ туе1орго1гГега1ке пеор1актк: Ню 2008 Хог1б Неабб Огдаш/аОоп сг11ег1а апб роиН-оГ-саге б1адпокбс а1догбктк, Ьеикет1а, 8ер1етЬег 2007, 22: 1422, включена в настоящий документ в качестве ссылки. Они характеризуются повышенной пролиферацией и выживаемостью одной или нескольких зрелых миелоидных линий. Эта категория в качестве неограничивающих примеров включает хронический миелолейкоз (ΕΜΕ), истинную полицитемию (ΡΜ), эссенциальную тромбоцитемию (ЕТ), первичный или идиопатический миелофиброз (ΡΜΕ), хронический нейтрофильный лейкоз, хронический эозинофильный лейкоз, хронический миеломоноцитарный лейкоз, ювенильный миеломоноцитарный лейкоз, гиперэозинофильный синдром, системный мастоцитоз и атипичный хронический миелогенный лейкоз. ΤеГГе^^. Α. апб ОбШапб, Ό.Ο., Опсодепек ш туе1оргоП1сга1ке б15огбегк, Се11 Сус1е. Μа^сб 2007, 6(5): 550-566 полностью включена в настоящий документ в качестве ссылки для всех целей.

В другом варианте осуществления комбинированное лечение, предоставленное в настоящем документе, пригодно для лечения первичного миелофиброза, истинной полицитемии в стадии миелофиброза, эссенциальной тромбоцитемии в стадии миелофиброза и вторичного острого миелогенного лейкоза.

В другом варианте осуществления комбинированное лечение, предоставленное в настоящем документе, можно использовать для лечения пациентов с промежуточным или характеризующимся высоким риском миелофиброзом, включая первичный миелофиброз, истинную полицитемию в стадии миелофиб- 6 026317 роза и эссенциальную тромбоцитемию в стадии миелофиброза.

В некоторых вариантах осуществления субъекта, подлежащего лечению (например, человека), определяют как не отвечающего или резистентного к одному или нескольким способам лечения миелопролиферативных нарушений.

В конкретном варианте осуществления в настоящем документе предоставлен способ лечения миелопролиферативной неоплазии у нуждающегося в этом субъекта, включающий введение субъекту эффективного количества композиции, содержащей Эверолимус и соединение А или их фармацевтически приемлемые соли.

В одном из вариантов осуществления в настоящем документе предоставлено применение ингибитора тТОК и ингибитора 1ЛК для получения лекарственного средства для лечения злокачественной опухоли, например, миелопролиферативного нарушения, например промежуточного или характеризующегося высоким риском миелофиброза, включая первичный миелофиброз, истинную полицитемию в стадии миелофиброза и эссенциальную тромбоцитемию в стадии миелофиброза.

В другом варианте осуществления в настоящем документе предоставлен способ лечения миелопролиферативной неоплазии у нуждающегося в этом субъекта, включающий введение субъекту эффективного количества композиции, содержащей РР242 и соединение А или их фармацевтически приемлемые соли.

В настоящем документе предоставлены способы лечения заболевания, например миелопролиферативного нарушения, посредством введения эффективного количества комбинации ингибитора тТОК и ингибитора 1ЛК субъекту, страдающему от заболевания. Количество комбинации средств является эффективным для лечения заболевания. Важно отметить синергическое действие комбинации средств: хотя один или несколько средств, введенных по отдельности в определенных дозах, могут оказаться неэффективными, при доставке в комбинации те же дозы каждого средства обеспечивают эффективное лечение. Дозы одного или нескольких средств в комбинации, таким образом, могут быть меньше доз, одобренных ΡΌΆ для каждого средства.

Дозировки.

Оптимальную дозу комбинации средств для лечения заболеваний можно определять эмпирическим путем для каждого субъекта с применением известных способов, и она зависит от различных факторов, включая в качестве неограничивающих примеров степень прогресса заболевания; возраст, массу тела, общее состояние здоровья, пол и питание субъекта; время и способ введения; и другие лекарственные средства, которые принимает субъект. Оптимальные дозировки можно определять с применением стандартного тестирования и способов, которые хорошо известны в данной области.

Количество комбинации средств, которое можно комбинировать с носителями для получения единой лекарственной формы, варьирует в зависимости от получающего лечение субъекта и конкретного способа введения. В некоторых вариантах осуществления стандартные лекарственные формы, содержащие комбинацию средств, как описано в настоящем документе, содержат количества каждого средства комбинации, которые соответствуют количествам при раздельной доставке средств.

Частота приема лекарственного средства может варьировать в зависимости от применяемого соединения и конкретного состояния, подлежащего лечению или предотвращению. В основном предпочтительно применение минимальной дозировки, достаточной для предоставления эффективного лечения. Пациентов, как правило, подвергают мониторингу на терапевтическую эффективность с применением подходящих для подлежащего лечению или предотвращению состояния анализов, которые известны специалистам в данной области.

Лекарственную форму можно получать различными общепринятыми способами смешивания, измельчения и обработки, известными специалистам по химии лекарственных средств.

Пероральная лекарственная форма, содержащая комбинацию средств или отдельные средства комбинации, может быть представлена в форме микротаблеток, заключенных в капсуле, например, желатиновой капсуле. Для этого можно использовать желатиновую капсулу, которая применяется в фармацевтических составах, такую как твердая желатиновая капсула, известная как СЛР§иОЕЬ, доступная от РП/сг.

Многие пероральные лекарственные формы, применяемые в настоящем документе, содержат комбинацию средств или отдельные средства, входящие в состав комбинации, в форме частиц. Такие частицы могут быть спрессованы в таблетку или присутствовать в покрытии лекарственной формы с оболочкой, такой как подслащенная лекарственная форма, спрессованная лекарственная форма с оболочкой или покрытая кишечнорастворимой оболочкой лекарственная форма, или может содержаться в капсуле, лекарственной форме в виде осмотического насоса или другой лекарственной форме.

Соединения лекарственных средств по настоящему изобретению (например, ингибитора тТОК и ингибитора 1ЛК) представлены в комбинациях, лекарственных формах, фармацевтических композициях и фармацевтических составах, описаны в настоящем документе в соотношении в диапазоне от 100:1 до 1:100. Например, соотношение соединения формулы I: ингибитора тТОК может быть представлено в диапазоне от 1:100 до 1:1, например 1:100, 1:90, 1:80, 1:70, 1:60, 1:50, 1:40, 1:30, 1:20, 1:10, 1:5, 1:2 или 1:1 формулы 1:ингибитора тТОК. В другом примере соотношение ингибитора тТОК:соединения фор- 7 026317 мулы I может быть представлено в диапазоне от 1:100 до 1:1, например 1:100, 1:90, 1:80, 1:70, 1:60, 1:50, 1:40, 1:30, 1:20, 1:10, 1:5, 1:2 или 1:1 ингибитора тТОК:соединения формулы I.

Оптимальные соотношения, индивидуальные и комбинированные дозировки и концентрации соединений лекарственных средств, которые обеспечивают эффективность без токсичности, определяются кинетикой доступности активных ингредиентов сайтам-мишеням, и их оценивают с применением способов, известных специалистам в данной области.

Фармацевтические композиции или комбинации, предоставленные в настоящем документе (т.е. ингибитор тТОК и ингибитор 1ЛК (например, ингибитор 1ЛК формулы I)) можно тестировать в клинических исследованиях. Подходящие клинические исследования могут представлять собой, например, открытые исследования с увеличением дозы, которые проводят на пациентах с пролиферативными заболеваниями. Такие исследования, в частности, подтверждают синергизм активных ингредиентов комбинации по изобретению. Положительное воздействие на пролиферативные заболевания можно определять напрямую по результатам этих исследований, известных специалистам в данной области. Такие исследования могут быть, в частности, подходящими для сравнения эффектов монотерапии с применением активных ингредиентов и комбинации по изобретению. В одном из вариантов осуществления дозу соединения ингибитора тТОК, например эверолимуса (КАЭ001) или РР242, повышают до достижения максимальной переносимой дозы и вводят фиксированную дозу ингибитора 1ЛК (например, ингибитора 1ЛК формулы I). Альтернативно, ингибитор 1АК (например, ингибитор 1АК формулы I) можно вводить в фиксированной дозе, а дозу ингибитора тТОК можно повышать. Каждый пациент может получать дозы соединений ежедневно или периодически. Эффективность лечения можно определять в исследованиях, например, через 12, 18 или 24 недели посредством оценки тяжести симптомов каждые 6 недель.

Применение комбинированного лечения по изобретению может оказывать не только положительное воздействие, например, синергический терапевтический эффект, например, в отношении облегчения, приостановки прогресса или ингибирования симптомов, но также обеспечивать дальнейшее неожиданное положительное воздействие, например уменьшение количества побочных эффектов, повышенное качество жизни или снижение заболеваемости, по сравнению с монотерапией, применяющей только один фармацевтически активный ингредиент комбинации по изобретению.

Другие преимущества могут заключаться в том, что можно использовать более низкие дозы активных ингредиентов комбинации по изобретению, например, в том, что дозы могут быть не только меньше, но и могут требовать менее частого приема, что может уменьшить частоту или тяжесть побочных эффектов. Это соответствует желаниям и требованиям пациентов, подлежащих лечению.

Одна из задач по настоящему изобретению заключается в предоставлении фармацевтической композиции, содержащей количество, которое может быть в совокупности терапевтически эффективным для лечения или предотвращения злокачественной опухоли, например миелопролиферативного нарушения. В данной композиции ингибитор тТОК и ингибитор 1АК (например, ингибитор 1АК формулы I) можно вводить совместно, последовательно или раздельно в одной комбинированной стандартной лекарственной форме или в двух раздельных стандартных лекарственных формах. Стандартная лекарственная форма также может представлять собой фиксированную комбинацию.

Фармацевтические композиции для раздельного введения обоих соединений или для введения в фиксированной комбинации, т.е. единой лекарственной композиции, содержащей оба соединения по изобретению, можно получать способом, известным рег 5С и подходящим для кишечного, такого как пероральное или ректальное, и парентерального введения млекопитающим (теплокровные животные), включая человека, и они содержат терапевтически эффективное количество по меньшей мере одного фармакологически активного ингредиента комбинации, например, как указано выше, или в комбинации с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми носителями или разбавителями, особенно подходящими для кишечного или парентерального применения.

Препараты.

Комбинации лекарственных средств, предоставленные в настоящем документе, можно формулировать посредством различных способов, известных специалистам в области фармацевтических составов. Различные свойства комбинаций, описанные выше, можно получать посредством различных способов. Подходящие препараты включают, например, таблетки, капсулы, спрессованные препараты с оболочкой и другие легко доставляемые препараты.

Подходящие фармацевтические препараты могут содержать, например, приблизительно от 0,1 до приблизительно 99,9%, предпочтительно приблизительно от 1 до приблизительно 60% активного ингредиента(ов). Фармацевтические препараты для комбинированного лечения для кишечного или парентерального введения могут быть представлены, например, в стандартных лекарственных формах, таких как покрытые сладкой оболочкой таблетки, таблетки, капсулы или суппозитории или ампулы. Если не указано иначе, эти препараты получают способами, известными рег 8е, например, посредством общепринятых способов смешивания, гранулирования, нанесения сладкой оболочки, растворения или лиофилизации. Следует понимать, что единица дозирования компонента комбинации в индивидуальной дозе каждой лекарственной формы не должна составлять эффективное количество, поскольку необходимое эффективное количество достигается введением нескольких единиц дозирования.

- 8 026317

В частности, терапевтически эффективное количество каждого компонента комбинации по изобретению можно вводить одномоментно или последовательно и в любом порядке, и компоненты можно вводить раздельно или в виде фиксированной комбинации. Например, способ лечения заболевания по изобретению может включать (ί) введение первого средства в свободной форме или в форме фармацевтически приемлемой соли и (ίί) введение второго средства в свободной форме или в форме фармацевтически приемлемой соли, одномоментно или последовательно в любом порядке, в совокупных терапевтически эффективных количествах, предпочтительно в синергически эффективных количествах, например в ежедневной или периодической дозировке, соответствующей количествам, описываемым в настоящем документе. Отдельные компоненты комбинации по изобретению можно вводить раздельно в разное время во время курса лечения или одновременно в раздельных или единых комбинациях. Кроме того, термин введение также охватывает применением пролекарственной формы компонента комбинации, которая ίη νίνο превращается в сам компонент комбинации. Данное изобретение, таким образом, необходимо понимать как охватывающее все подобные схемы одномоментного или чередующегося лечения, и термин введение следует понимать таким образом.

Эффективные дозировки каждого компонента комбинации, применяемые по изобретению, могут варьировать в зависимости от конкретного применяемого соединения или фармацевтической композиции, способа введения, подлежащего лечению состояния и тяжести подлежащего лечению состояния. Таким образом, режим дозирования комбинации по изобретению выбирают в зависимости от различных факторов, включая способ введения и функции почек и печени пациента. Врачи и доктора, обладающие средним уровнем компетентности, могут легко определять и предписывать эффективные количества отдельных активных ингредиентов, необходимых для смягчения, уменьшения или остановки прогресса состояния.

Предпочтительные подходящие дозы для соединений, применяемых в лечении, описываемом в настоящем документе, варьируют приблизительно от 1 до приблизительно 600 мг, предпочтительно приблизительно от 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 90, 95, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220, 240, 260, 280, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 420, 440, 460, 480, 500, 520, 540, 560, 580 до приблизительно 600 мг. В одном из вариантов осуществления ингибитор 1ЛК вводят в дозах 5, 10, 15, 20 или 25 мг.

Таким образом, в одном из вариантов осуществления в настоящем документе предоставлена композиция, содержащая ингибитор тТОК и соединение формулы I. В одном из вариантов осуществления соединение формулы I представляет собой (3К)-3-циклопентил-3-[4-(7Н-пирроло[2,3-б]пиримидин-4-ил)1Н-пиразол-1-ил]пропаннитрил или его фармацевтически приемлемую соль. В другом варианте осуществления ингибитор тТОК представляет собой эверолимус (КАЭ001) или 2-(4-амино-1-изопропил-1Нпиразоло[3,4-б]пиримидин-3-ил)-1Н-индол-5-ол (РР242). В другом варианте осуществления композиция дополнительно содержит фармацевтически приемлемый носитель.

Примеры

Изобретение далее иллюстрировано следующими примерами.

Примеры не следует рассматривать как ограничивающие.

Ниже предоставлено доказательство того, что лекарственные средства, воздействующие на сигнальный путь тТОК, предотвращают цитокин-индуцированную и цитокин-зависимую клеточную пролиферацию в различных клеточных моделях с ΜΡΝ и что одномоментное лечение с применением ингибитора 1ЛК1/1ЛК2 или интерферона-α приводит к синергетической активности. Эти результаты предоставляют основание для использования эффективности воздействия на Ак/тТОК в лечении миелопролиферативных неоплазий.

Способы и материалы

Реагенты.

КАЭ001 (специфичный аллостерический ингибитор тТОК), ΡΡ242 (АТФ-доменный ингибитор тТОК) и гидроксимочевину получали в §1§та-Л1Фтсй (δΐ. Ьошк, Оеттапу). Интерферон-α получали в Редакук. Антитела к фосфо(р)^ТЛТ5 (Туг694), δТΑТ5, р-4ЕВР1 (Тйт70), 4ΕΒΡ1, тТОК, р-1ЛК2 (Туг1007/1008) и 1ЛК2 получали в Се11 δίβηαΐίηβ Тесйпо1оду (Папмегк. Μ.Α., υδ). Антитела к тубулину человека получали в δаηίа Сти/ Вю1есйпо1оду (Ьап1а Сти/, СА, υδ). Рекомбинантные человеческие 1Ь-3, ΟΜ-ί’δΕ δСΡ и ΕΡО приобретали в МШепуа Вю1ес (О1абЬасй, Оеттапу). миРНК к тТОК получали в Ийаттасоп к^ОΕNОΜΕ διικιΠ роо1 (Тйегто δ^πΟΠα Уаййат, МА, υδ); к^ОΕNОΜΕ №п-Тагдейпд к1КΝΑ Ροο1#1 (Тйегто δ^πΟΓΚ) использовали в качестве отрицательного контроля.

Клеточные линии и клеточные культуры.

Клеточные линии человека НЕЙ, δΕТ2 и К562 приобретали в Немецкой коллекции микроорганизмов и культур клеток (ΌδΜΖ, Втаипксй№е1д, Оегтапу). Клетки ВаР/3 и ΒаΡ/3-ΕΡОК мышей, экспрессирующие 1АК2 дикого типа (χνΐ) или 1АК2У617Р, были получены от К. δкοάа (Ваке1, δ№^ΐζе^1аηά). Линии клеток культивировали в ΡΡΜΙ 1640, обогащенной 10% эмбриональной телячьей сывороткой (ΡΒδ; Ьоп/а, Ве1дшт) (20% для клеток δΕТ2), антибиотиками и Ь-глутамином. т1Ь-3 и ЕРО добавляли в среду для культивирования клеток 1АК2 УТ ВаР/3 и ΒаΡ/3-ΕΡОК соответственно.

- 9 026317

Клетки человека.

Образцы периферической крови (РВ) или костного мозга (ВМ) получали у пациентов с диагнозом РУ или РМР (критерии ВОЗ 2008 г.) согласно протоколу, одобренному Экспертным советом Л/юпба ОкребаПега-итуегейапа Сагеддц и после получения информированного согласия. Здоровые доноры гематопоэтических стволовых клеток предоставляли информированное согласие отдавать избыток клеток СИ34+. Исследование проводили согласно правилам Хельсинской декларации. Клетки СИ34+ подвергали иммуномагнитной сепарации, как описано. Мутационный статус 1АК2У617Р определяли посредством количественной ПЦР в реальном времени с применением гранулоцитов.

Анализ ингибирования пролиферации, анализ клоногенности и анализ апоптоза или клеточного цикла.

Клетки (2х10⁴) высевали на 96-луночные планшеты для культуры тканей с увеличивающимися концентрациями лекарственного средства(средств) в трех экземплярах; жизнеспособные клетки оценивали с применением анализа ^8Т-1 (КосЬе, И8Л) и помещали в ячейки, содержащие равный объем носителя (ИМ8О). Концентрацию, при которой наблюдалось 50% ингибирование пролиферации (1С₅₀), рассчитывали с применением программного обеспечения Опдт (У 7.5, ОпдтЬаЪ ОТйЬатрЮи, МА). В некоторых экспериментах также проводили анализ клоногенности. Клетки (5х 10³) высевали на 0,5% агар в среде, обогащенной РВ§, и различные количества лекарственного средства(средств) (или равный объем носителя в контрольных планшетах) добавляли однократно в начале культивирования. Колонии подсчитывали с применением инвертационного микроскопа через 7 суток после инкубации. Подсчет апоптических клеток проводили посредством проточной цитометрии с применением набора Аппехш-У-РЬиО8 81а1шид КЬ (КосЬе); было получено по меньшей мере 20000 событий. Для анализа клеточного цикла посредством проточной цитометрии 1х10⁶ клеток обрабатывали 95% этанолом, 10 мкг/мл РНКазой и 50 мг/мл йодидом пропидия.

Анализ колоний для гематопоэтических предшественников человека и генотипирование колоний.

Мононуклеарные клетки ВМ от пациентов с ΜΡΝ или контрольных субъектов высевали на 1х10⁵/мл метилцеллюлозы (МеШоСиЬ; 81етСе11 ТесЬпоКще^ Уаисоиуег, Саиаба), обогащенную 50 нг/мл 8СР, 10 нг/мл 1Ь-3, 10 нг/мл 1Ь-6, 10 нг/мл ОМ-С8Р, 10 нг/мл О-С8Р и 3И/мл ЕРО для роста ВРИ-Е и КОЕ-ОМ. Анализ ЕЕС проводили посредством посева 2,5х10⁵/мл мононуклеарных клеток РВ от пациентов с РУ на метилцеллюлозу, содержащую лейкоцит-кондиционированную среду без ЕРО (81етСе11 ТесЬио1., каталожный номер #04531). Для роста КОЕ-Мк, 5х10⁴/мл клеток СИ34+ высевали в 24луночный планшет в коллаген и среду с липидами МедасиЪ (§1етСе11 ТесЬио1.), обогащенную 50 нг/мл тромбопоэтином, 10 нг/мл 1Ь-3 и 10 нг/мл 1Ь-6. Колонии подсчитывали на 14 сутки согласно стандартным критериям.

Для генотипирования колоний 1АК2У617Р использовали аллель-специфичный анализ ПЦР. Разделенные колонии (по меньшей мере 40 колоний на точку) индивидуально снимали с полутвердой среды в 5 мкл свободную от ДНКазы/РНКазы воду, лизировали при 95°С в течение 5 мин и проводили амплификацию посредством ПЦР и электрофорез в геле.

Клеточный лизис и вестерн-блоттинг δΌδ-РАОЕ.

Клетки ресуспендировали в лизисном буфере К1РА (50 мМ, рН 7,4 ТГ18-НС1, 150 мМ №С1, 1% ОТ40, 1 мМ ЕИТА), содержащем смесь ингибиторов протеаз (НаЬ Рго1еа8е 1иИЪЬог СосОаП КЬ, Р1ЕКСЕ, Коск&гб, 1Ь, ϋδ), и проводили электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия для разделения и вестерн-блоттинг на мембране 1ттииоЪ1о1 РУИР (ВюКаб, Негси1е8, СА, υδ) согласно стандартным протоколам. Мембраны обрабатывали первичными антителами и затем конъюгатом антител к 1д, полученных от кроликов, с пероксидазой хрена ^1дта-А16псЬ); иммунореактивные белки выявляли посредством ЕСЬ с применением аппарата 1таде ОнаШ 350 (ОЕ НеаЬЬсаге, ЬЫ1е СЬа1Гои1, иК).

Выделение РНК и количественная ПЦР в реальном времени (КТЦ-ПЦР).

Тотальную РНК очищали с применением Тп/о1 (1иуЬгодеи-Ы£е ТесЬио1од1е8, РаМеуз иК) и концентрацию и чистоту/целостность РНК определяли с применением спектрофотометра №шоИгор ΝΏ-1000 (ОТиоИгор ТесЬи., ХУПттдЮн ИЕ, υδΛ). Один микрограмм РНК подвергали обратной транскрипции с применением набора ШдЬ Сарасйу с^NА АгсИуе КЬ (АррЬеб Вю8у81ет8, Ро81ег СЬу, СА). Реакции КТОРСК проводили с применением ТацМаи ишуеща1 РСК Ма81ег М1х и АВ1 РКРМ 7300 НТ и анализов экспрессии генов ТацМаи® (АррЬеб ВюкуИепъ) в трех экземплярах. Определение профиля генной экспрессии проводили посредством способа относительного порогового цикла (С_Т), определяющего относительные значения с применением У1С-меченного зонда КОТкеР в качестве конститутивного гена (ДС_Т).

Трансфекция клеток.

Экспоненциально растущие клетки НЕЬ электропорировали миРНК в нуклеофекторе Атаха (Атаха Вю8у81ет8, ОаЬЬегкЪигд, МИ, ^А) с применением набора Атаха КЬ К. В кратком изложении 25х10⁶ клеток в объеме 0,1 мл трансфицировали 1 мкМ миРНК и немедленно переносили в 24-луночные планшеты, содержащие предварительно нагретую среду для культивирования.

Эффективность трансфекции и выживаемость клеток оценивали посредством проточной цитомет- 10 026317 рии с ртахОРР® (Атаха Вю/Цспъ). которая всегда демонстрировала результат более 85%.

Статистические способы.

Сравнение групп проводили посредством И-критерия Манна-Уитни или теста Фишера с применением программного обеспечения 8Р88 (81а18ой, 1пс., Тика, ОК) или Опщп. Уровень значимости двусторонних критериев составлял Р<0,05. Комбинаторный индекс (С1), который представляет собой меру взаимодействия двух лекарственных средств, рассчитывали согласно принципу медиан-эффекта С1юиТа1а1ау с применением программного обеспечения Са1си8уп. Согласно этой формуле, когда С1<1, взаимодействие двух лекарственных средств считают синергическим, когда С1=1, взаимодействие считают аддитивным, и когда С1>1, взаимоействие считают антагонистическим.

Результаты

Ингибиторы тТОК подавляют пролиферацию мутантных линий клеток 1АК2У617Р.

Чтобы установить, чувствительны ли мутантные клетки лейкоза человека 1АК2У617Р к ингибированию тТОК, применяли селективный аллостерический ингибитор тТОК КАИ001 и АТФконкурентный ингибитор активного центра тТОК, РР242. Показано, что мутантные клетки 1АК2У617Р НЕЬ и 8ЕТ2 проявляют, по меньшей мере, такую же селективность по отношению к ингибированию тТОК, как позитивные по ВСК/АВЬ клетки К562, применяемые в качестве контроля. Значения 1С₅₀ показаны в табл. 1. Исследовали эффекты ингибиторов тТОК на 1Ь-3-зависимые клетки мышей дикого типа 1АК2 (Ва/Р3) или ЕРО-зависимые клетки (Ва/РЗ-ЕРОК) или цитокин-независимые аналоги 1АК2У617Р. Выявлено, что клетки У617Р Ва/РЗ являются более чувствительными к КАИ001, чем 1АК2 дикого типа, как в отсутствие, так и в присутствии 1Ь-3 в среде для культивирования. Аналогично, в клетках Ва/РЗ-ЕРОК 1С₅₀ мутантных клеток У617Р составлял 651 нМ и 1,213 нМ в отсутствие и в присутствии ЕРО, соответственно, по сравнению с 1С₅₀ >10000 нМ в клетках 1АК2 дикого типа. РР242 проявлял такую же эффективность: в клетках У617Р Ва/Р3 1С₅₀ составлял 800 нМ и 1600 нМ, соответственно, в отсутствие или в присутствии 1Ь-3 по сравнению с 3400 нМ в клетках дикого типа; в клетках дикого типа Ва/Р3-ЕРОК 1С₅₀ составлял 5931 нМ по сравнению с 500 нМ и 750 нМ в клетках У617Р, обогащенных или не обогащенных ЕРО соответственно (табл. 1). При данной концентрации 1С₅₀ КАИ001 и РР242 (не показано) вызывали остановку клеточного цикла клеток 8ЕТ2 и НЕЬ в фазе О0/О1 клеточного цикла (фиг. 1А). С другой стороны, обработка КАП001 была в основном неэффективной в отношении индуцирования гибели клеток, в то время как РР242 демонстрировали незначительный, однако дозозависимый клеточный апоптоз при более высоких концентрациях по сравнению с клетками 8ЕТ2 (фиг. 1В) или НЕЬ (не показано). В дополнение к ингибированию клеточной пролиферации выявлено, что КАП001 также снижало клоногенный потенциал мутантных клеток 1АК2У617Р НЕЬ, 8ЕТ2 и ПКЕ-1 более эффективно, чем К562. Кроме того, образование колоний клетками У617Р Ва/Р3 ингибировалось при значительно более низких концентрациях КАП001, независимо от наличия цитокина в среде, чем в отношении аналогов дикого типа (данные не показаны). В целом, эти данные указывают на то, что мутантные клетки 1АК2У617Р являются равномерно чувствительными к ингибированию тТОК, что позволяет предположить, что подавление клеточной пролиферации дает в основном цитостатический, а не апоптический эффект.

Кроме того, сравнивали механизмы ингибирования клеточной пролиферации, индуцированного ингибиторами тТОК, с механизмами для ингибитора 1АК1/1АК2 соединения А и ингибитора гистондеацетилазы (НИАС) панобиностата. Все эти молекулы были ингибиторами роста в клетках НЕЬ и 8ЕТ2 при концентрациях 1С₅₀, значительно более низких, чем значения для линии клеток К562 (табл. 1). Однако в отличие от ингибиторов тТОК, они выступали сильными дозозависимыми индукторами клеточного апоптоза (фиг. 1С, И). Клетки НЕЬ (1С₅₀=410 мкМ) и 8ЕТ2 (1С₅₀=3 3 0 мкМ) демонстрировали более высокую чувствительность к ингибитору рибонуклеозиддифосфатредуктазы в гидроксимочевине, чем клетки К562 (1С₅₀=4910 мкМ) (табл. 1); гидроксимочевина индуцировала дозозависимый клеточный апоптоз (фиг. 1Е).

Эффект ингибитора 1АК1/1АК2 также оценивали для клеток Ва/Р3 для изучения роли цитокина на чувствительность к лекарственным средствам. Выявлено, что клетки У617Р Ва/Р3 и Ва/Р3-ЕРОК являются более чувствительными к соединению А (1С₅₀=34 нМ и 220 нМ соответственно), чем их аналоги дикого типа (1600 нМ или 457 нМ для соединения А соответственно). Однако добавление подходящего цитокина в среду для культивирования подавляло селективный ингибирующий рост эффект ингибитора 1АК1/1АК2 на мутантные клетки У617Р (1С₅₀=1600 нМ для соединения А в клетках Ва/Р3; 1С₅₀=521 нМ для соединения А в клетках Ва/Р3-ЕРОК) (табл. 1).

В целом, эти данные указывают на то, что ингибирующая рост активность ингибиторов 1АК1/1АК2 и НИАС в клетках лейкоза 1АК2У617Р является в основном опосредованной клеточным апоптозом. Кроме того, подтверждали, что цитокины заметно уменьшали клеточную чувствительность к ингибиторам 1АК1ПАК2.

На фиг. 1 показан эффект селективных ингибиторов тТОК, ингибитора 1АК1/1АК2, ингибиторов гистондеацетилазы и гидроксимочевины на клеточный апопотоз и клеточный цикл в клетках 8ЕТ2 или НЕЬ. В панелях от (В) до (Е) измеряли процент положительных по аннексину У апоптических клеток посредством проточной цитометрии для клеток 8ЕТ2, которые в течение 48 ч подвергали воздействию

- 11 026317 различных количеств ингибиторов тТОК КАЭ001 или РР242 (В), ингибитора 1АК1/1ЛК2 соединения А (С), ингибитора НЭАС панобиностат (Ό) или гидроксимочевины (Е). Результаты представлены в виде процента жизнеспособных клеток по сравнению с контрольными лунками, содержащими только носитель (ΌΜδΟ). Фракцию некротических клеток идентифицировали как двойные положительные по аннексину ν/йодиду пропидия клетки. Приведен один из трех одинаковых экспериментов. * Р<0,05; ** Р<0,01.

В табл. 4 показано ингибирование клоногенного роста мутантных клеток линии 1ΑΚ2ν617Ρ ингибиторами тТОК, КАЭ001 или РР242 и ингибитором 1АК1/1АК2 соединением А. Мутантные полученные от человека линии клеток 1А1<2У617Е гетерозиготные (ЗЕТ-2) или гомозиготные (НЕЬ) и мутантную линию клеток ВСК/АВЬ К562 (использованную в качестве контроля) подвергали воздействию увеличивающихся концентраций КАЭ001, РР242 или соединения А. 10³ клеток высевали на агар в присутствии различного количества лекарственного средства; колонии подсчитывали на сутки 7 и выражали результаты в виде процента количества колоний, выросших на контрольных планшетах, содержащих носитель. Клетки ВаР/3 мыши, избыточно экспрессирующие ^ΑΚ2V617Ρ, также подвергали воздействию КАЭ001, РР242 или соединения А и сравнивали с клетками дикого типа (те!). В среду для культивирования добавляли или не добавляли интерлейкин-3 (10 нг/мл). Значения 1С₅₀ показаны в виде среднего значения+ЗЭ для по меньшей мере трех независимых экспериментов.

Ингибиторы тТОК ослабляют нисходящий сигнальный путь тТОК и уменьшают фосфорилирование ЗТАТ5 в мутантных линиях клеток ^ΑΚ2V617Ρ.

Исследовали эффект ингибирования тТОК на передачу сигнала в мутантных клетках 1АК2У617Р с применением клеток ЗЕТ2 в качестве модели (фиг. 2). Показано, что обработка ^ΑΚ2V617Ρ и РР242 дозозависимо уменьшала фосфорилирование мишени тТОК 4Е-ВР1 и, неожиданно, ЗТАТ5, в то время как 1АК2 не демонстрировали эффекта. Для сравнения, ингибитор 1АК1/1АК2 соединение А заметно и дозозависимо уменьшал фосфорилирование 1АК2 и ЗТАТ5, не оказывая эффекта на 4ЕВР1. Ингибитор НЭАС панобиностат дозозависимо уменьшал количество фосфорилированных и общих 1АК2, фосфорилированных ЗТАТ5 и демонстрировал незначительный эффект на фосфорилированные 4Е-ВР1. Напротив, гидроксимочевина не влияла на уровень или статус фосфорилирования 4ЕВР1 или ЗТАТ5.

Для более подробного изучения корреляции мутации 1АК2У617Р и активации тТОК, а также эффектов ингибирования тТОК на фосфорилирование ЗТАТ5, использовали клетки ВА/Р3 и Ва/Р3-ЕРОК. Сначала наблюдали, что 4Е-ВР1 незначительно фосфорилировались в клетках 1АК2 дикого типа Ва/Р3 и Ва/Р3-ЕРОК, лишенных цитокинов, однако гиперфосфорилировались в клетках ν617Ρ, что подтверждает более предыдущие результаты в отношении конститутивной активации Ак! в 1А1<2У617Р-мутированны.\ клетках. Добавление цитокинов приводило к повышению фосфорилирования 4Е-ВР1 в клетках 1АК2 дикого типа и мутантных клетках ν617Ρ Ва/Р3 и Ва/Р3-ЕРОК (данные не показаны). В клетках, инкубированных с КАЭ001, наблюдалось заметное ингибирование фосфорилирования 4Е-ВР1 (данные не показаны), которое сохранялось в течение по меньшей мере 24 ч (данные не показаны). Фосфорилирование ЗТАТ5 было выше в клетках ν617Ρ по сравнению с лишенными 1Ь-3 или ЕРО клетками 1АК2 дикого типа Ва/Р3 или Ва/Р3-ЕРОК, и оно существенно уменьшалось после воздействия цитокина.

Фосфорилирование ЗТАТ5 значительно снижалось, демонстрируя эффект, подобный эффекту на 4ЕВР1; ингибирование было заметно через 60 мин и сохранялось до 24 ч (не показано).

Чтобы подтвердить, что подавление фосфорилирования ЗТАТ5 опосредовано ингибированием тТОК, а не прямым воздействием КАЭ001 на фосфорилирование ЗТАТ5, тТОК отключали посредством специфичных миРНК в клетках НЕЬ. Хотя обработка миРНК снижала уровни тТОК только на 5060% через 24 ч, уровень фосфорилирования 4Е-ВР1 значительно уменьшался по сравнению с клетками, обработанными неподходящими контрольными миРНК; общее содержание белка 4Е-ВР1 не менялось (данные не показаны). Через 48 ч как фосфорилирование тТОК, так и фосфорилирование 4Е-ВР1 было почти незаметным. В то же время, уровень фосфорилирования ЗТАТ5 значительно уменьшался через 2448 ч в клетках, которые подвергались нуклеофекции специфичными к тТОК миРНК, по сравнению с контролем; общее содержание ЗТАТ5 не менялось.

На фиг. 2 представлен эффект выбранных ингибиторов тТОК, ингибитора 1АК1/1АК2, ингибиторов гистондеацетилазы и гидроксимочевины на сигнальные пути тТОК и 1АК/8ТАТ в клетках ЗЕТ2. Клетки ЗЕТ2 инкубировали в течение 24 ч с увеличивающимися концентрациями лекарственных средств, и уровень тотальных и фосфорилированных 1АК2, ЗТАТ5 и 4Е-ВР1 оценивали посредством вестерн-блоттинга. Тубулин использовали для нормализации. Представлены результаты от двух до четырех одинаковых экспериментов для различных лекарственных средств.

Комбинация КАЭ001 или РР242 с соединением А приводит к синергетическому ингибированию пролиферации и образованию колоний лейкемических клеток 1АК2У617Е

Эффекты конкурентного инигибирования тТОК и 1АК1/1АК2 в клетках ЗЕТ2 и ν617Ρ Ва/Р3ЕРОК оценивали посредством оценки эффекта ингибирования пролиферации. Клетки инкубировали с различными концентрациями КАЭ001 или РР242; посредством применения этих комбинаций лекарственных средств измеряли комбинаторный индекс (С1) в диапазоне от 0,12 до 0,44, который указывал на высокую синергетическую активность двух лекарственных средств (табл. 3).

Другие эксперименты с применением клеток ЗЕТ2 и Ва/Р3 ЕРОК ν617Ρ проводили для анализа

- 12 026317 клоногенности на агаре (табл. 5); в этих культурах измеряли С1 в диапазоне от 0,22 до 0,81, что указывало на синергизм лекарственных средств.

Комбинация Κ.ΛΌ001 или РР242 с соединением А приводит к синергетическому ингибированию гематопоэтических клеток-предшественников у пациентов с ΜΡΝ в анализе образования колоний ЕЕС.

Чтобы определить, можно ли влиять на пролиферацию лейкемических клеток от пациентов с ΜΡΝ посредством одновременного воздействия на сигнальные пути тТОК и 1АК, РВМС от пациентов с РУ инкубировали с увеличивающимися концентрациями К.АЭ001, РР242, соединения А или комбинации К.АЭ001 или РР242 и соединения А в анализе ЕЕС. Полученные из периферической крови мононуклеарные клетки пациентов с РУ культивировали в свободной от ЕРО метилцеллюлозной среде для роста ЕЕС, в отсутствие или в присутствии фиксированного количества ΚΑΌ001, РР242 и/или соединения А. ЕЕС подсчитывали на 12 сутки и выражали в виде процента числа колоний в контрольных планшетах, содержащих только носитель. * Р<0,05, ** Р<0,01. Результаты, приведенные в табл. 6, показывают С1 0,2 и 0,26 для этих культур, что также подтверждает синергизм ингибиторов тТОК и 1АК в отношении ингибирования роста клеток 1АК2У617Р.

Обсуждение.

ΜΡΝ-ассоциированная мутация 1АК2У617Р обуславливает конститутивную активацию сигнального пути 1АК2/8ТАТ; ингибиторы 1АК2 подавляют пролиферацию мутантных клеток 1АК2У617Р ίη νίΐτο, уменьшают миелопролиферацию у трансгенных по 1АК2У617Р животных (Ыи РС, Саи1йег Е, Ы 1, е! а1. СотЪшей ίηΐιφίΐίοη οί 1апик кшаке 1/2 ίοτ 1ке 1геа!тей οί 1АК2У617Р-йгАеп пеорПктк: ке1есОуе еГГес1к οη тиΐаηΐ се11к апй ипргоуететк ίη теакигек οί Фкеаке 5еνе^^ΐу. Οίη Сансег Кек. 2009; 15:6891-6900) и предоставляют значительное клиническое улучшение у пациентов с миелофиброзом (УегкГОукек §., Кайаграм Н., Мека К.А., еΐ а1. §а.Ге1у апй еГПсасу οί ШСВ018424, а 1АК1 апй 1АК2 ίηΜΜΐοτ, ίη πλόΙοΓ Фгокй Ν Еп§1. 1. Мей. 2010; 363:1117-1127) или устойчивыми к гидроксимочевине РУ или ЕТ. Однако вариации нагрузки 1АК2У617Р были незначительными, и молекулярная ремиссия пока не была обнаружена. Кроме того, инициирующая заболевание популяция клеток у мышей йюск-ίη 1АК2У617Р не отвечала на обработку ингибитором 1АК2 ТО101348. В целом, эти наблюдения указывают на возможность того, что эффективное воздействие на клон ΜΡΝ может быть недостижимым с применением доступных ингибиторов 1АК2. Таким образом, для создания более эффективных терапевтических стратегий необходимо более детальное изучение клеточных сигналов, вовлеченных в дисрегуляцию пролиферации мутантных клеток. В связи с этим показано, что комбинированная обработка НЭАО панобиностатом и ингибитором 1АК2 Т0101209 вызывала более сильное подавление сигнального пути 1АК/§ТАТ в 1АК2У617Рмутантных клетках человека и мыши и повышала цитотоксичность в отношении клеток ΜΡΝ СЭ34' по сравнению с раздельным применением лекарственных средств.

Объектом данного исследования является мишень рапамицина у млекопитающих (тТОК), ключевая мишень сигнального пути ΡI3К/ЛКТ. Серин/треониновая киназа тТОК выступает в качестве центрального регулятора клеточного метаболизма, выживания, роста, пролиферации и аутофагии. тТОК ингибируют посредством семейства молекул, называемых рапалогами по главному члену семейства рапамицину, которые в последнее время применяют в клинических испытаниях на злокачественных опухолях. тТОК существует в двух комплексах, ТОКС1 и ТОКС2. ТОКС1, в состав которого входит гарЮг. контролирует уровень кэп-зависимой трансляции мРНК и фосфорилирует эффекторы, такие как эукариотический фактор инициации 4Е-связывающий белок 1 (4Е-ВР1) и §6 киназу 1 (§6К1). В свою очередь, фосфорилированный 4Е-ВР1 приводит к ингибированному связыванию с эукариотическим фактором инициации 4Е (е1Р4Е) и предотвращает активацию трансляции нескольких генов, включая циклин Ό1, Вс1-2, ВС1-Хь и фактор роста эндотелия сосудов. С другой стороны, §6К1 регулирует клеточный рост посредством фосфорилирования ключевых мишеней, таких как е1Ре4, тТОК, эукариотический фактор инициации 4В и киназа фактора элонгации-2. е1Р4Е и §К1 вовлечены в клеточную трансформацию и сверхэкспрессируются при некоторых злокачественных опухолях с неблагоприятным прогнозом. Дополнительные компоненты ТОКС1 включают в качестве белка β-субъединицу Ь§Т8/О-белка млекопитающих (тТ§Т8/ОвЕ) и недавно идентифицированные партнеры ΡКА§40 и ОЕЕТОР. тТОК также комбинируется с Кюйг в тТОКС2, который, как правило, является нечувствительным к рапамицину и состоит из ΟβΕ и белка, взаимодействующего со стресс-активируемой протеинкиназой млекопитающих 1 (ηι§ΙΝ1); ТОКС2 вовлечен в фосфорилирование АЙ в §ег473. Эта отрицательная обратная связь тТОКС2 и АЙ может в некоторых случаях приводить к прогрессированию злокачественной опухоли, хотя РАОИИЕ как показано, ингибирует активность Ак! в лейкемических клетках посредством супрессии тТОКС1 и тТОКС2. Для преодоления возможных ограничений и недостатков аллостерических ингибиторов тТОК, таких как КЛ^001, были разработаны новые молекулы, которые действуют как конкурентные ингибиторы активного центра АТФ тТОК; одна из них, РР242, заметно супрессирует ТОКС1 и ТОКС2-опосредованную активность и проявляет цитотоксичность в отношении клеток лейкоза. КА0001 и РР242 использовали для изучения ίη νίΐτο предполагаемой роли тТОК в качестве мишени терапии при ΜΡΝ.

Показано, что ингибиторы тТОК вызывают остановку клеточной пролиферации мутантных лей- 13 026317 козных линий клеток человека и мыши 1АК2У617Р при концентрации лекарственных средств, значительно меньшей, чем в контрольных клетках (табл. 1). Напротив, КАЭ001 не индуцирует гибель клеток, в то время как РР242 вызывает клеточный апоптоз при более высоких концентрациях; таким образом, в этих экспериментальных условиях ингибиторы тТОК в основном являются цитостатическими. Этот механизм действия отличается от механизма ингибитора 1АК1/1АК2 соединения А и ингибитора НЭЛС панобиностата, которые заметно индуцировали клеточный апоптоз (фиг. 1). С другой стороны, показано, что ингибирование клеточной пролиферации, вызванное ингибиторами тТОК, не зависит от максимальной активации сигнального пути 1АК/8ТАТ, вызванной воздействием цитокина на клетки Ва/РЕ и Ва/Р3ЕРОК, в отличие от ингибитора 1АК1/1АК2. Последнее наблюдение согласуется с демонстрацией того, что чувствительность к ингибиторам 1АК2 эритроидных предшественников, полученных от пациентов с РУ, супрессируется добавлением ЕРО в среду для культивирования, и косвенно позволяет предположить, что механизмы, определяющие ингибирование клеточной пролиферации посредством КА0001, являются, по меньшей мере, частично зависимыми от цитокин-индуцированной активации 1АК/8ТАТ. Показано, что КАО001 является более селективным по отношению к мутантным 1АК2У617Р по сравнению с предшественниками дикого типа у пациентов с РУ, поскольку число колоний У617Р уменьшалось в среднем на 39% в сторону колоний дикого типа (табл. 2).

Преобладающий антипролиферативный, а не проапоптозный эффект КА0001 показан на нескольких других злокачественных клетках и указывает на целесообразность комбинированного лечения с применением средств, которые преимущественно индуцируют апоптоз. С учетом этого были исследованы эффекты комбинирования ингибиторов тТОК и 1АК1/1АК2 ίη νίΐτο и получены доказательства значительного синергизма в отношении ингибирования пролиферации (табл. 3) и клоногенного потенциала (табл. 5) линий клеток лейкоза. Кроме того, образование гематопоэтических колоний клеткамипредшественниками, полученными от пациентов с МРЫ, синергетически ингибировалось посредством комбинирования КА0001 или РР242 с ингибитором 1АК1/1АК2 соединением А (табл. 6).

Анализ ключевых сигнальных молекул показал, что КАЭ001 и РР242 ингибируют фосфорилирование мишени 4ЕВР1, в то время как ингибиторы ТАКШАК и НЭАС уменьшают фосфорилирование 1АК2 и 8ТАТ; следует отметить, что ингибиторы НЭАС также уменьшали экспрессию тотального 1АК2 (фиг. 2). Любопытное наблюдение заключалось в том, что ингибирование тТОК, вызванное КАЭ001 и РР242, ассоциировано с заметным снижением фосфорилирования 8ТАТ5, которое не объясняется снижением общего содержания белка 8ТАТ5. Эту положительную обратную связь тТОК и 8ТАТ5 подтверждали посредством демонстрации конкурентного снижения фосфорилирования 4Е-ВР1 и 8ТАТ5 с применением специфичных ингибиторных РНК (миРНК) к тТОК (данные не показаны). Уровень ингибирования фосфорилирования 8ТАТ5, опосредованного КА0001, был значительно более низким, чем в случае ингибитора •ТАКШАКЗ, который не влиял на фосфорилирование 4Е-ВР1, что позволяет предположить, что активация тТОК в клетках МРЫ может быть в целом 1АК2-независимой. С другой стороны, ингибитор НЭАС продемонстрировал незначительное ингибирование фосфорилирования 4ЕВР1, хотя имеющиеся данные не позволяют сделать вывод о том, является ли этот эффект прямым или косвенным. В целом, эти наблюдения указывают на то, что фосфорилирование 8ТАТ5 можно изменять посредством воздействия на сигнальные пути 1АК2 и тТОК. В отношении этого, рапамицин-чувствительная активация 8ТАТ3 посредством сигнального пути рецептора тирозинкиназы/РПК/АЙ была показана в нескольких злокачественных клетках и опухолях мыши и человека.

- 14 026317

Таблица 1

Определение 1С₅₀ ингибиторов тТОК, ингибитора 1АК1/1АК2, ингибиторов ΗΌΛΟ и гидроксимочевины посредством анализа ингибирования пролиферации для мутантных клеток 1АК2У617Р и контрольных клеток дикого типа 1АК2 человека и мыши

ВаР/З-ИЗ

Лекарственное

средство	КИ2	НЕ!_	8ЕТ2	__от	νβ17Ρ	νβ17Ρ+Η_3^
КАО001 (НМ)	16,000 ± 2,500	14,000 + 2,800	17,000 1 3,000 ”	2,60011,200	10 ±4	0 ±5
РР242 (нМ)	8,300 ± 1000	1,500 ± 113	2в5± 11	3,400 ± 300	800 + 200	1 еоо± 200'*
Соединение А (нМ)	>20 000	790 + 150	180124	1,600 ±500	34 ±2”	1,700 + 300
Панобиностат 1нМ)	31 ±8	8 13'	7 ±2‘	N О	ΝΟ	ΝΟ
НиОН (мкМ)	4,910+15	410120*	330 ±11 ·	N0	Ν □	ΝΟ

Лекарственное средство

ВаР/З -ЕРОК νβΐ 7Р

КА0001 (нМ)

РР242 (нМ)

Соединение А (нМ)

Панобиностат (нМ) νντ

1/В17Р +ЕРО

>10,000	851 ±50	1,231 ±100
5,931 ±1,000	500 ± 100	750 г 100'
457 ± 15	220 ±20	521 ±45
Ν □	ΝΟ	Ν □

*Р<0,05; **Р<0,00. Ν.Ό. - не выполнено

- 15 026317

Таблица 2

Эффекты КАЭ001 на пропорции клеток ΪΑΚ2 дикого типа и колоний У617Р в анализе клоногенности клеток ί'Ό34'. полученных от пациентов с ΜΡN

............................................................................~ М К2 генотип

Пациент	КАВ0О1	Дикий тип	νβ17Ρ	% уменьшения
#	(50 нМ)	(%)	{%>	νβ17Ρ
	-	80	20	70
1		94	6
	-	53	47
2				15
	+	60	40
	-	_ 28	72
3				21
		43	57
	-	52	48
4				17
	+	58	40
	-	68	32
5		91	9	72
			Среднее ±30	39 ±29

Таблица 3

Комбинация ингибитора тТОК и ΪΑΚ1/ΪΑΚ2 приводит к синергетической активности в отношении ингибирования пролиферации линии клеток §ЕТ2 и клеток 1АК2У617Р Ва/Р3-ЕРОК

Клеточная линия	Комбинация лекарственных средств
Юм(нМ)	(К*50,нМ}	С1 индекс
5ΕΤΖ	КЛ0001 17,080 ± 3000	Соединение А 180 ±24	Соединение А 3,0383 ^9	0.20
	РР242 285 ± 11	Соединение А	РР242 Соединение А 66	0.43

Л1К271в7Р

Ва/РЗ-ЕРОК КАЮ01	Соединение А	ЙДООЙ1	Соединение А	С! индекс
651 ± 50	220 ±20	363	1Ξ5	0.44
РР242	Соединение А	РР242	Соединение А
500 ±100	220 ±20	400	121	0,98

Значения 1С₅₀ рассчитывали в анализе ингибирования пролиферации в присутствии различных комбинаций лекарственных средств. Приведены средние значения 1С₅₀ по меньшей мере для 3 экспериментов с применением комбинаций лекарственных средств. Комбинаторный индекс (С1) рассчитывали согласно С1юи и Та1а1у, как описано в материалах и способах. С1<1 означает, что взаимодействие двух лекарственных средств является синергетическим. В первых двух столбцах (серого цвета) приведены для удобства значения 1С₅₀ индивидуальных лекарственных средств, подсчитанные на основе данных, приведенных в табл. 1.

- 16 026317

Таблица 4

Определение 1С₅₀ КЛЭ001. РР242 и 1ЫС242 с применением анализа клоногенности для мутантных и контрольных клеточных линий 1ЛК2У617Р человека и мыши

Клеточная 1С_ет (нМ}

линия	КАП001	РР242	Соединение А
К562	10,000 ± 3,500	3,800 ± 200	>15,000
НЕС	85 ± 30 *'	172 ±59“	374 ± 177“
8ЕТ2	130 ±30“	62 ±19“	27 ± 9
Ва/П ЛАК2 дикий тип	120 ± 13	100 ±10	380±120
Ва/ЕЗ ЗАК2 У167Е	6 + 2	18 ± 7“	15±10“
Ва/ЕЗ ероВ ЗАК2	22 ± 10	308±100	740 ±100
ДИКИЙ тип
Ва/ЕЗ ероВ	4 ±2“	47 ±12“	20 ±15“
ЗАК2 У167Е

Значения 1С₅₀ (т.е. концентрация лекарственного средства, которая сокращает число колоний до 50%, измеренная в контрольных планшетах, содержащих только носитель) рассчитывали в анализе клоногенности на агаре посредством подсчета колоний на сутки 7 в присутствии различных концентраций лекарственных средств. В случае клеточных линий человека контрольная линия клеток представляла собой К562, в то время как в случае клеток мыши референсными клетками были клетки Ва/Р3 дикого типа, которые содержали в присутствии 1Ь-3. ** Р<0,01.

Таблица 5

Комбинация ΚΛΌ001 или РР242 и 1ЫС242 приводит к синергетической активности в отношении ингибирования клоногенного потенциала мутантных клеточных линий 1ЛК2У617Р человека и мыши (нМ)

Комбинация лекарственных средств

Клеточная линия	КА0001	Соединение А	РАВ001	Соединение А	индекс
8ЕТ2	44 ±15	27 ±0	7	4	0.22
	РР242	Соединение А	РР242	Соединение А
Ва/РЗ ероК &АК2 νβΪ7Ρ!	62 ±19	27 ±9	17	7.6	0.81
КА13001 Соединение А	КАР001	Соединение А	С1 индекс
	4±2	20 ±15	1.1 (1.3-1)	5.9 (6.8-	0.59
				5.1)	(0.85-
					0.34)
	РР242	Соединение А	РР242	Соединение А
	47 ±12	20 ±15	6.3(10-2.5)	2.7 4.41.1)	0.24(0.38- 0.1)

Значения 1С₅₀ рассчитывали в анализе клоногенности на агаре посредством подсчета колоний на сутки 7 культивирования в присутствии различных комбинация лекарственных средств. Представлены средние значения по меньшей мере для 3 экспериментов и комбинаций двух лекарственных средств. Комбинаторный индекс (С1) рассчитывали, как описано в материалах и способах. С1<1 означает, что взаимодействие двух лекарственных средств является синергетическим. В двух первых столбцах (серого цвета) для удобства приведены значения 1С₅₀, подсчитанные для индивидуальных лекарственных средств и приведенные в табл. 4.

- 17 026317

Таблица 6

Комбинация АИ001 или РР242 и ΙΝΟ242 приводит к синергетической активности в отношении ингибирования клоногенного потенциала мононуклеарных клеток периферической крови человека, полученных от пациентов с РУ Юдд (н М)

Комбинация лекарственных средств

Клетки КА0001 Соединение А ГСАОООЧ Соединение А С!

индекс

РВМС от 15*10 1.8* 1 Ϊ.9 0.2 0.28 пациентов с РУ

РР242 Соединение А рр242 Соединение А ίβΐΐ ....... 0.05.............................67Ϊ.......................0.2...........

Значения 1С₅₀ рассчитывали в анализе клоногенности на агаре посредством подсчета колоний на сутки 7 культивирования в присутствии различных комбинаций лекарственных средств. Комбинаторный индекс (С1) рассчитывали, как описано в материалах и способах. С1<1 означает, что взаимодействие двух лекарственных средств является синергетическим.

Claims (25)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Способ лечения злокачественной опухоли у нуждающегося в этом субъекта, включающий введение субъекту ингибитора тТОК и (3К)-3-циклопентил-3-[4-(7Н-пирроло[2,3-б]пиримидин-4ил)-1Н-пиразол-1-ил]пропаннитрила или его стереоизомеров, таутомеров, рацематов, сольватов или фармацевтически приемлемых солей, где ингибитор тТОК представляет собой эверолимус (КАИ001) или 2-(4-амино-1-изопропил-1Нпиразоло [3,4-б]пиримидин-3 -ил)-1Н-индол-5-ол (РР242).
2. 2. Способ по п.1, где ингибитор тТОК и (3К)-3-циклопентил-3-[4-(7Н-пирроло[2,3-б]пиримидин-4ил)-1Н-пиразол-1-ил]пропаннитрил или его фармацевтически приемлемая соль включены в единый состав или стандартную лекарственную форму.
3. 3. Способ по п.2, где единый состав или стандартная лекарственная форма дополнительно включают фармацевтически приемлемый носитель.
4. 4. Способ по п.1, где ингибитор тТОК и (3К)-3-циклопентил-3-[4-(7Н-пирроло[2,3-б]пиримидин-4ил)-1Н-пиразол-1-ил]пропаннитрил или его фармацевтически приемлемую соль вводят раздельно.
5. 5. Способ по п.1, где злокачественная опухоль представляет собой миелопролиферативную неоплазию.
6. 6. Способ по п.5, где миелопролиферативная неоплазия выбрана из группы, включающей хронический миелолейкоз (СМЬ), истинную полицитемию (РУ), эссенциальную тромбоцитемию (ЕТ), первичный или идиопатический миелофиброз (РМР), хронический нейтрофильный лейкоз, хронический эозинофильный лейкоз, хронический миеломоноцитарный лейкоз, ювенильный миеломоноцитарный лейкоз, гиперэозинофильный синдром, системный мастоцитоз и атипичный хронический миелогенный лейкоз.
7. 7. Способ по п.5, где миелопролиферативная неоплазия представляет собой первичный миелофиброз, истинную полицитемию в стадии миелофиброза или эссенциальную тромбоцитемию в стадии миелофиброза.
8. 8. Способ по любому из пп.4-7, где субъект представляет собой человека.
9. 9. Способ по любому из пп.4-7, где лечение включает введение ингибитора тТОК и (3К)-3циклопентил-3-[4-(7Н-пирроло[2,3-б]пиримидин-4-ил)-1Н-пиразол-1-ил]пропаннитрила или его фармацевтически приемлемой соли, по существу, одновременно.
10. 10. Способ по любому из пп.4-7, где лечение включает введение ингибитора тТОК и (3К)-3циклопентил-3-[4-(7Н-пирроло[2,3-б]пиримидин-4-ил)-1Н-пиразол-1-ил]пропаннитрила или его фармацевтически приемлемой соли в разное время.
11. 11. Способ по п.10, где ингибитор тТОК вводят субъекту с последующим введением (3К)-3циклопентил-3-[4-(7Н-пирроло[2,3-б]пиримидин-4-ил)-1Н-пиразол-1-ил]пропаннитрила или его фармацевтически приемлемой соли.
12. 12. Способ по п.10, где (3К)-3-циклопентил-3-[4-(7Н-пирроло[2,3-б]пиримидин-4-ил)-1Н-пиразол-1ил]пропаннитрил или его фармацевтически приемлемую соль вводят субъекту с последующим введением ингибитора тТОК.
13. 13. Способ по любому из пп.4-7, где ингибитор тТОК и (3К)-3-циклопентил-3-[4-(7Н-пирроло[2,3б]пиримидин-4-ил)-1Н-пиразол-1-ил]пропаннитрил или его фармацевтически приемлемая соль находятся в разных составах или стандартных лекарственных формах.
14. 14. Способ по любому из пп.4-7, где ингибитор тТОК и/или (3К)-3-циклопентил-3-[4-(7Н- 18 026317 пирроло[2,3-Т]пиримидин-4-ил)-1Н-пиразол-1-ил]пропаннитрил или его фармацевтически приемлемую соль вводят в дозах, которые не являются эффективными при раздельном введении одного или обоих ингибиторов тТОК и (3К)-3-циклопентил-3-[4-(7Н-пирроло[2,3-Т]пиримидин-4-ил)-1Н-пиразол-1ил]пропаннитрила или его фармацевтически приемлемой соли, но которые являются эффективными при применении в комбинации.
15. 15. Способ ингибирования фосфорилирования ЗТАТ5, включающий введение ингибитора тТОК и (3К)-3-циклопентил-3-[4-(7Н-пирроло[2,3-Т]пиримидин-4-ил)-1Н-пиразол-1-ил]пропаннитрила или его фармацевтически приемлемой соли, где ингибитор тТОК представляет собой эверолимус (КАБ001) или 2-(4-амино-1-изопропил-1Н-пиразоло[3,4-Т]пиримидин-3-ил)-1Н-индол-5-ол (РР242).
16. 16. Способ по п.15, где введение состава позволяет лечить злокачественную опухоль у нуждающегося в этом субъекта.
17. 17. Способ по п.16, где введение состава позволяет лечить миелопролиферативную неоплазию у нуждающегося в этом субъекта.
18. 18. Способ по п.17, где миелопролиферативная неоплазия выбрана из группы, включающей хронический миелолейкоз (СМЬ), истинную полицитемию (РУ), эссенциальную тромбоцитемию (ЕТ), первичный или идиопатический миелофиброз (РМТ), хронический нейтрофильный лейкоз, хронический эозинофильный лейкоз, хронический миеломоноцитарный лейкоз, ювенильный миеломоноцитарный лейкоз, гиперэозинофильный синдром, системный мастоцитоз и атипичный хронический миелогенный лейкоз.
19. 19. Способ по п.17, где миелопролиферативная неоплазия представляет собой первичный миелофиброз, истинную полицитемию в стадии миелофиброза и эссенциальную тромбоцитемию в стадии миелофиброза.
20. 20. Способ лечения миелопролиферативной неоплазии, включающий введение нуждающемуся в этом субъекту эверолимуса и (3К)-3-циклопентил-3-[4-(7Н-пирроло[2,3-Т]пиримидин-4-ил)-1Н-пиразол1-ил]пропаннитрила или их фармацевтически приемлемых солей.
21. 21. Способ лечения миелопролиферативной неоплазии, включающий введение нуждающемуся в этом субъекту РР242 и (3К)-3-циклопентил-3-[4-(7Н-пирроло[2,3-Т]пиримидин-4-ил)-1Н-пиразол-1ил]пропаннитрила или их фармацевтически приемлемых солей.
22. 22. Фармацевтическая композиция, содержащая ингибитор тТОК и (3К)-3-циклопентил-3-[4-(7Нпирроло[2,3-Т]пиримидин-4-ил)-1Н-пиразол-1-ил]пропаннитрил, включая его стереоизомеры, таутомеры, рацематы, сольваты и фармацевтически приемлемые соли, где ингибитор тТОК представляет собой эверолимус (КАБ001) или 2-(4-амино-1-изопропил-1Н-пиразоло[3,4-Т]пиримидин-3-ил)-1Н-индол-5-ол (РР242).
23. 23. Фармацевтическая композиция по п.22, дополнительно содержащая фармацевтически приемлемый носитель.
24. 24. Способ лечения злокачественной опухоли у нуждающегося в этом субъекта, включающий введение субъекту эффективного количества композиции по п.22.
25. 25. Способ по п.24, где злокачественная опухоль представляет собой миелопролиферативную неоплазию.