PT2486041E - Derivados hidroxilo, ceto e glucuronido de 3-(4-(7h-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-1h-pirazol-1-il)-3-ciclopentil-propanonitrilo - Google Patents

Derivados hidroxilo, ceto e glucuronido de 3-(4-(7h-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-1h-pirazol-1-il)-3-ciclopentil-propanonitrilo Download PDF

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James D Rodgers
Adam Shilling
Argyrios G Arvanitis
Stacey Shepard
Laurine G Galya
Mei Li
Frank M Nedza
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Description

1
DESCRIÇÃO "DERIVADOS HIDROXILO, CETO E GLUCURONIDO DE 3-(4-(7H-PIRROLO[2,3-d]PIRIMIDIN-4-IL)-1H-PIRAZOL-1-IL)-3-CICLOPENTIL-PROPANONITRILO"
CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção proporciona derivados hidroxilo, ceto e glucuronido de 3-(4-(7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-1H-pirazol-l-il)ciclopentil-propanonitrilo.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
As proteínas quinases (PKs) são um grupo de enzimas que regulam diversos processos biológicos importantes, incluindo o crescimento celular, diferenciação e sobrevivência, formação de órgãos e morfogénese, neovascularização, reparação e regeneração de tecidos, entre outros. As proteínas quinases exercem as suas funções fisiológicas catalisando a fosforilação de proteínas (ou substratos) e, assim, modulando as atividades celulares dos substratos em vários contextos biológicos. Para além das funções em tecidos/órgãos normais, muitas proteínas quinases desempenham também funções mais especializadas num hospedeiro de doenças humanas, incluindo o cancro. Um subconjunto de proteínas quinases (também referidas como proteínas quinases oncogénicas), quando desreguladas, podem provocar a formação e crescimento do tumor, e ainda contribuir para a manutenção e a progressão do tumor (Blume-Jensen P. et al, Nature 2001, 411 (6835) :355 -365) .
Até o momento, as proteínas quinases oncogénicas representam um dos maiores e mais atraentes grupos de proteínas alvo para intervenção em casos de cancro e desenvolvimento de fármacos. 2 A família da quinase de Janus (JAK) desempenha um papel na regulação, dependente de citoquinas, da proliferação e da função das células envolvidas na resposta imune. Atualmente, existem quatro membros conhecidos da família JAK de mamíferos: JAK1 (também conhecida como quinase de Janus 1), JAK2 (também conhecida como quinase de Janus 2), JAK3 (também conhecida como quinase de Janus, leucócito; JAKL; L-JAK e quinase de Janus 3) e TYK2 (também conhecida como proteína tirosina quinase 2). As proteínas JAK variam de tamanho de 120 a 140 kDa e compreendem sete domínios de homologia JAK conservados (JH); um deles é um domínio quinase catalítico funcional, e o outro é um domínio pseudo-quinase potencialmente servindo uma função de regulação e/ou servindo como um local de ligação para STATs (Scott, Godshall et al. 2002, supra). 0 bloqueio da transdução do sinal no nível das quinases JAK é promissor para o desenvolvimento de tratamentos para cancros humanos. Prevê-se que a inibição das quinases JAK também possa ter benefícios terapêuticos em pacientes que sofram de desordens imunes da pele, tais como a psoríase e sensibilização da pele. Por conseguinte, os inibidores de quinases Janus, ou quinases relacionadas, são amplamente procurados e várias publicações relatam classes eficazes de compostos. Por exemplo, certos inibidores de JAK, incluindo (R)-3-(4-(7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-lH-pirazol-1-il)ciclopentil-propanonitrilo mostrado abaixo, são relatados em EUA número de série 11/637,545 (EUA 2007/0135461), submetida a 12 de dezembro de 2006; EUA número de série 12/138,082 (EUA 2009/0181959), submetida a 16 de julho de 2009; e determinados metabolitos do composto 1 estão relatados na número de série dos EUA 12/137,883 (EUA 2008/0312258), submetida a 12 de junho de 2008. 3
CN I
Assim, agentes novos ou melhorados que inibam quinases, tais como quinases de Janus, são continuamente necessários para desenvolver fármacos novos e mais eficazes para tratar o cancro e outras doenças. Os metabolitos, composições e métodos aqui descritos são dirigidos para estas necessidades e outros fins.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção proporciona, entre outros, derivados hidroxilo, ceto e glucuronido de um composto de Fórmula I:
CN
I ou um sal farmacologicamente aceitável dele derivado.
Assim, num aspeto, é aqui proporcionado um composto de Fórmula I: 4
ou um sal farmacologicamente aceitável dele derivado em que: n grupos C-H são cada um independentemente substituídos com C-OH; ou, um grupo CH2 está substituído independentemente com um C=0; ou, um grupo C-H é substituído por:
dois grupos C-H são cada um independentemente substituídos com C-OH e um grupo C-H é substituído por:
n é 1, 2, 3 ou 4; desde que o composto não seja selecionado a partir de: 5 3-(4-(7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-lH-pirazol-l-il)-3-(3-hidroxiciclopentil)propanonitrilo; 3-(4-(7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-lH-pirazol-l-il)-3-(2-hidroxiciclopentil)propanonitrilo; 3 - (4-(7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-lH-pirazol-l-il)-3-(3-oxociclopentil)propanonitrilo; e de sais farmacologicamente aceitáveis deles derivados. Numa forma de realização da fórmula I, o átomo de carbono alfa para o grupo ciano não é substituído com um grupo C-OH ou C=0; e o átomo de carbono beta para o grupo ciano não é substituído com um grupo C-OH.
Numa outra forma de realização do composto, n grupos C-H são cada um independentemente substituídos com C-OH. Numa outra forma de realização, n é 1. Ainda numa outra forma de realização, n é 2. Ainda noutra forma de realização, n é 3. Numa outra forma de realização, n é 4.
Numa outra forma de realização da Fórmula I, um grupo CH2 está substituído independentemente com um C=0 Em ainda outra forma de realização, um grupo C-H é substituído por
6
Numa outra forma de realização, um grupo C-H saturado é substituído por 6 co2h
Em ainda outra forma de realização, dois grupos C-H são cada um independentemente substituídos com C-OH e um grupo C-H é substituído por: co2h
A presente invenção proporciona ainda composições que compreendem os compostos aqui descritos, ou um sal farmacologicamente aceitável deles derivado, e pelo menos um veículo farmacologicamente aceitável. A presente invenção proporciona ainda métodos para a modulação de uma atividade de JAK compreendendo o contacto de JAK com certos compostos aqui descritos, ou um sal farmacologicamente aceitável deles derivados. A presente invenção proporciona ainda métodos de tratamento de uma doença num paciente, compreendendo a administração ao paciente de uma quantidade terapeuticamente eficaz de certos compostos aqui descritos ou de um sal farmacologicamente aceitável deles derivado. Numa forma de realização particular, a doença está associada com a atividade de JAK. Tais doenças incluem, por exemplo, a rejeição de aloenxertos ou a doença do enxerto versus hospedeiro. A doença também pode ser uma doença autoimune, incluindo, mas não limitada a, uma doença de pele, a 7 esclerose múltipla, artrite reumatoide, artrite juvenil, diabetes do tipo I, lúpus, doença inflamatória do intestino, doença de Crohn, miastenia grave, nefropatias da imunoglobulina, miocardite ou distúrbios autoimunes da tiroide. A doença autoimune também pode ser doença de pele bolhosa, por exemplo, pênfigo vulgar (PV) ou penfigóide bolhoso (BP) . A doença de pele pode ser dermatite atópica, psoriase, sensibilização da pele, irritação da pele, erupção cutânea, dermatite de contato ou sensibilização alérgica de contato.
Numa outra forma de realização, a doença é uma doença virai. Exemplos de doenças virais que podem ser tratadas pelos compostos aqui descritos incluem virus de Epstein Barr (EBV) , Hepatite B, Hepatite C, VIH, HTLV 1, virus de varicela Zoster (VZV), ou virus do papiloma humano (HPV).
Numa outra forma de realização, a doença é cancro, por exemplo, um tumor sólido. 0 cancro a ser tratado pode ser cancro de próstata, cancro renal, cancro hepático, cancro de mama, cancro de pulmão, cancro de tiroide, sarcoma de Kaposi, doença de Castleman ou cancro do pâncreas. Numa forma de realização particular, o cancro é o cancro da próstata. 0 cancro pode ser hematológico. 0 cancro pode ser um linfoma, leucemia, ou mieloma múltiplo. Numa outra forma de realização, o cancro é um cancro da pele, por exemplo, linfoma de células T cutâneo ou linfomas de células B cutâneo. Numa outra forma de realização, o cancro é mieloma múltiplo. A doença a ser tratada pode ser também fadiga resultante de ou associada a cancro, ou anorexia ou caquexia resultante do ou associada a cancro.
Numa outra forma de realização, a doença a ser tratada é uma distúrbio mieloproliferativa, por exemplo, policitemia vera (PV), trombocitemia essencial (ET), metaplasia mieloide com mielofibrose (MMM), leucemia mieloide crónica (CML), leucemia mielomonocitica crónica (MML), sindrome hipereosinofilico (HES) ou doença de mastócitos sistémica (SMCD).
Numa outra forma de realização, a doença a ser tratada é uma doença inflamatória. A doença inflamatória pode ser uma doença inflamatória do olho, por exemplo, irite, uveite, esclerite, ou conjuntivite. A doença inflamatória pode ser uma doença inflamatória das vias respiratórias, por exemplo, do trato respiratório superior ou do trato respiratório inferior. A doença inflamatória pode ser uma miopatia inflamatória ou miocardite.
Numa outra forma de realização, a doença é isquemia-reperfusão ou está relacionada com um evento isquémico.
DESCRIÇÃO DETALHADA A presente invenção proporciona, entre outros, derivados hidroxilo, ceto e glucuronido de 3-(4-(7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-lH-pirazol-l-il)ciclopentil-propanonitrilo. Em algumas formas de realização, o composto é um metabolito do composto I. Em algumas formas de realização, o composto é um metabolito ativo que pode modular a atividade de uma ou mais JAKs e pode ser útil, por exemplo, no tratamento de doenças associadas com a expressão ou atividade de JAK. Em algumas formas de realização, o nível de um composto metabolito aqui descrito é medido e perfilado, de modo a ajudar um médico no ajustamento dos níveis de dosagem do composto de Fórmula I.
Por conseguinte, a presente invenção proporciona um composto de Fórmula I: 9
ou um sal farmacologicamente aceitável dele derivado, em que: n grupos CH são cada um independentemente substituídos com C-OH; ou, um grupo CH2 está substituído independentemente com um C=0; ou, um grupo C-H é substituído por:
dois grupos C-H são cada um independentemente substituídos com C-OH e um grupo CH é substituído por:
n é 1, 2, 3 ou 4; desde que o composto não seja selecionado a partir de: 10 3-(4-(7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-lH-pirazol-l-il)-3-(3-hidroxiciclopentil)propanonitrilo; 3-(4-(7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-lH-pirazol-l-il)-3-(2-hidroxiciclopentil)propanonitrilo; 3-(4-(7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-lH-pirazol-l-il)-3-(3-oxociclopentil)propanonitrilo; e os sais farmacologicamente aceitáveis deles derivados.
Em algumas formas de realização, n grupos C-H são cada um independentemente substituídos com C-OH. Em algumas formas de realização, n é 1. Em algumas formas de realização, n é 2. Em algumas formas de realização, n representa 3. Em algumas formas de realização, n é 4.
Em algumas formas de realização, um dos grupos CH2 está substituído independentemente com um C=0.
Em algumas formas de realização, um grupo C-H é substituído por co2h
OH
Em algumas formas de realização, um grupo C-H saturado é substituído por co2h
OH 11
Em algumas formas de realização, dois grupos C-H são cada um independentemente substituidos com C-OH e um grupo C-H é substituído com: 11 co2h
Em algumas formas de realização: o átomo de carbono alfa para o grupo ciano não é co2h c/yoh
C"0'^Y^vOH substituído com um grupo C-OH, C=0 ou grupo 0H .; e o átomo de carbono beta para o grupo ciano não é
co2h
OH 'cr γ oh
substituído com um grupo C-OH ou grupo OH
Em algumas formas de realização: o átomo de carbono alfa para o grupo ciano não é substituído com um grupo C-OH ou C=0; e o átomo de carbono beta para o grupo ciano não é substituído com um grupo C-OH.
Numa outra forma de realização, a presente invenção proporciona um composto de Fórmula II: 12
d Ν Ν Η II ou um sal farmacologicamente aceitável dele derivado, em que: 1, 2, 3 ou 4 dos átomos de carbono a, b, c, d, e, f, g, h, i, j, k ou m são cada um substituídos independentemente com OH; ou, um dos átomos de carbono h, i, j, k, ou m são substituídos independentemente com =0; ou, um dos átomos de carbono a, b, c, d, e, f, g, h, i, j, k ou m são substituídos com: co2h O'
OH OH OH dois dos átomos de carbono a, b, c, d, e, f, g, h, i, j, k, ou m são, em cada um, independentemente substituídos com OH e: co2h 0'
OH OH OH desde que o composto não seja selecionado a partir de: 13 3-(4-(7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-lH-pirazol-l-il)-3-(3-hidroxiciclopentil)propanonitrilo; 3-(4-(7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-ΙΗ-pirazol-l-il)-3-(2-hidroxiciclopentil)propanonitrilo; 3-(4-(7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-ΙΗ-pirazol-l-il)-3-(3-oxociclopentil)propanonitrilo e dos sais farmacologicamente aceitáveis deles derivados.
Em algumas formas de realização da Fórmula II, 1, 2, 3 ou 4 dos átomos de carbono a, b, c, d, e, f, g, h, j, k ou m são cada um independentemente substituídos com OH. Em algumas formas de realização, um dos átomos de carbono a, b, c, d, e, f, g, h, i, j, k ou m são substituídos com OH. Em algumas formas de realização, 2 dos carbonos a, b, c, d, e, f, g, h, i, j, k ou m são cada um independentemente substituídos com OH. Em algumas formas de realização, 3 dos carbonos a, b, c, d, e, f, g, h, i, j, k ou m são cada um independentemente substituídos com OH. Em algumas formas de realização, 4 dos carbonos a, b, c, d, e, f, g, h, i, j, k, ou m são cada um independentemente substituídos com OH.
Em algumas formas de realização, um dos carbonos h, i, j, k ou m são substituídos com =0.
Em algumas formas de realização, um dos carbonos a, b, c, d, e, f, g, h, i, j, k ou m são substituídos com: co2h
OH 14 Em f, algumas formas de g, h, i, j, k ou m realização, um dos átomos de carbono são substituídos com: co2h
Em algumas formas de realização, dois dos átomos de carbono a, b, c, d, e, f, g, h, i, j , k ou m são, cada um independentemente substituídos por OH e um dos átomos de carbono a, b, c, d, e, f, g, h, i, j , k ou m são substituídos com:
Em algumas formas de realização: o carbono m não é substituído com um OH, =0, ou grupo
o carbono f não é substituído com um OH ou grupo ço2h
OH o "r" "oh OH
Em algumas formas de realização: o carbono m não é substituído com um grupo OH ou =0; e co2h
15 o carbono f não é substituído com um grupo OH.
Cada uma das formas de realização acima mencionadas pressupõe que as regras para uma valência adequada sejam cumpridas.
Em algumas formas de realização, o composto é selecionado a partir de: Ácido 6-(3-(1-(4-(7H-pirrolo{2,3-d]pirimidin-4-il)-1H- pirazol-l-il)-2-cianoetil)ciclopentiloxi)-3, 4,5-trihidroxitetrahidro-2H-piran-2-carboxílico; 3-(4-(7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-lH-pirazol-l-il)-3-(1,2-dihidroxiciclopentil)propanonitrilo; e 3-(4-(7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-lH-pirazol-l-il)-3-(1-hidroxiciclopentil)propanonitrilo; ou um sal farmacologicamente aceitável de qualquer um dos acima mencionados.
Em algumas formas de realização, o composto é selecionado a partir de: 3-(4-(7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-lH-pirazol-l-il)-3-(1-hidroxiciclopentil)propanonitrilo; 3-(4-(7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-lH-pirazol-l-il)-3-ciclopentil-3-hidroxipropanonitrilo; 3-(4-(7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-lH-pirazol-l-il)-3-ciclopentil-2-hidroxipropanonitrilo; 16 3-ciclopentil-3-(5-hidroxi-4-(7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-lH-pirazol-l-il)propanonitrilo; 3-ciclopentil-3-(3-hidroxi-4-(7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-lH-pirazol-l-il)propanonitrilo; 3-ciclopentil-3-(4-(5-hidroxi-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-lH-pirazol-l-il)propanonitrilo; 3-ciclopentil-3-(4-(6-hidroxi-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-lH-pirazol-l-il)propanonitrilo; 3-ciclopentil-3-(4-(2-hidroxi-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-lH-pirazol-l-il)propanonitrilo; 3-(4-(7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-lH-pirazol-l-il)-3-(1,2-dihidroxiciclopentil)propanonitrilo; e Ácido 6- (4- (1- (2-ciano-l-ciclopentiletil)-lH-pirazol-4-il)- 7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-3,4,5-trihidroxotetrahidro-2H-piran-2-carboxílico; ou um sal farmacologicamente aceitável de qualquer um dos acima mencionados.
Em algumas formas de realização, os compostos aqui descritos podem incluir os compostos apresentados nos gráficos 1-7 em baixo, e enantiómeros, diasterisómeros, e os racematos deles derivados. 17 Gráfico 1
12. 18 Gráfico 3
ιζ 19 Gráfico 5
IZ. 20
Determinados metabolitos são indicadas na Tabela 1 em abaixo. As estruturas destinam-se a abranger todos os estereoisómeros possíveis.
Tabela 1
21
Metabolito 4 (35) 3 - (4 - (7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-1H-pirazol-l-il)-3 - (1,2 — dihidroxiciclopentil)pr opanonitrilo OH TOHÇCH N—N w Metabolito 5 (36) 3-(4-(7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-1H-pirazol-l-il)-3 - (1-hidroxiciclopentil)prop anenitrilo OHr-CN CxT ^ N-N Metabolito 6 (37) 3-ciclopentil-3- (4- (6- oxo-6,7-dihidro-5H- pirrolo[2,3— d]pirimidin-4-il)-1H- pirazol-1- il)propanonitrilo [>ΤΝ N-N H Metabolito 7 (38) 3- (3- hidroxiciclopentil) -3-(4- (6-oxo-6,7-dihidro-5H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-1H-pirazol-1-il)propanonitrilo O z:r o X Metabolito 8 3-(4-(7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-1H-pirazol-l-il)-3 - (3-hidroxiciclopentil)prop anonitrilo N-N W H 22
Metabolito 3 - (4 - (7H-pirrolo[2,3- O 9 d]pirimidin-4-il)-1H- h(j y _/CN pirazol-l-il)-3 - (2-hidroxiciclopentil)prop N-N V anonitrilo 1X N "N H * Os números em parêntesis referem-se aos números dos compostos na Tabela 2 (infra)
Os compostos aqui descritos são os metabolitos de (R)— 3 — (4 — (7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-lH-pirazol-1-il)ciclopentil-propanonitrilo. Os metabolitos da invenção foram isolados de amostras de urina de humano, rato ou de cão recolhidas a partir de estudos de farmacocinética e de toxicocinética do inibidor de JAK (R)-3-(4-(7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-lH-pirazol-l-il)ciclopentil-propanonitrilo (Composto I) . Certos metabolitos podem ser inibidores de JAK e podem ter propriedades vantajosas relacionadas com frações livres significativamente mais elevadas e uma maior estabilidade metabólica em microssomas humanos, em comparação com o Composto I. Os presentes metabolitos podem desejavelmente ter um tempo de semivida nos seres humanos mais longo do que o Composto I.
Em algumas formas de realização, os metabolitos da invenção são substancialmente isolados. Por "substancialmente isolados" entende-se que os compostos sejam, pelo menos, parcial ou substancialmente separados do ambiente no qual foram formados ou detetados. Separação parcial pode incluir, por exemplo, uma composição enriquecida no composto da invenção. Separação substancial pode incluir as composições que contêm, pelo menos, cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 23 95%, pelo menos cerca de 97% ou pelo menos cerca de 99% em peso do metabolito. A presente invenção também inclui sais farmacologicamente aceitáveis dos compostos aqui descritos. Tal como aqui utilizado, "sais farmacologicamente aceitáveis" refere-se a derivados dos compostos revelados em que o composto progenitor é modificado através da conversão de uma fração ácido ou base existente na sua forma de sal. Exemplos de sais farmacologicamente aceitáveis incluem, mas não estão limitados a, sais de ácidos minerais ou orgânicos de resíduos básicos, tais como aminas; sais alcalinos ou orgânicos de resíduos acídicos tais como ácidos carboxílicos; e semelhantes. Os sais farmacologicamente aceitáveis da presente invenção incluem os sais convencionais não tóxicos do composto progenitor formado, por exemplo, a partir de ácidos inorgânicos ou orgânicos não-tóxicos. Os sais farmacologicamente aceitáveis da presente invenção podem ser sintetizados a partir do composto progenitor que contém uma fração básica ou ácida por métodos químicos convencionais. Geralmente, esses sais podem ser preparados por reação das formas ácido ou base livres destes compostos com uma quantidade estequiométrica da base ou ácido apropriado em água ou num solvente orgânico, ou numa mistura dos dois; geralmente, meios não aquosos como éter, acetato de etilo, etanol, isopropanol ou acetonitrilo são preferidos. Listas de sais apropriados são encontrados em Remington's Pharmaceutical Sciences, 17a ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1985, p. 1418 e Journal of Pharmaceutical Science, 66, 2 (1977). A frase "farmacologicamente aceitável" é aqui empregue para se referir àqueles compostos, materiais, composições e/ou formas de dosagem que são, dentro do âmbito do discernimento médico, adequados para utilização em contacto 24 com os tecidos de seres humanos e animais sem toxicidade excessiva, irritação, resposta alérgica, ou outro problema ou complicação, comensurável com uma relação beneficio/risco razoável.
Os compostos aqui descritos são assimétricos (por exemplo, tendo um ou mais estereocentros). São pretendidos todos os estereoisómeros, tais como enantiómeros e diastereoisómeros, a menos que indicado de outra forma. Métodos de como preparar formas opticamente ativas a partir de materiais de partida opticamente ativos são conhecidos na técnica, tal como por resolução de misturas racémicas ou por síntese estereo-seletiva.
Os compostos aqui descritos também incluem todos os isótopos de átomos que ocorrem nos metabolitos. Os isótopos incluem aqueles átomos com o mesmo número atómico, mas diferentes números de massa. Por exemplo, os isótopos de hidrogénio incluem o trítio e o deutério. Os compostos podem também incluir solvatos e hidratos dos compostos ou formas de sal. 0 termo "composto", como utilizado aqui, pretende incluir todos os estereoisómeros, isómeros geométricos, tautómeros, e isótopos das estruturas representadas. Síntese
Os compostos aqui descritos, incluindo os seus sais, podem ser preparados utilizando técnicas de síntese orgânica conhecidas e podem ser sintetizados de acordo com qualquer uma das numerosas vias de síntese possíveis.
As reações para a preparação dos compostos aqui descritos podem ser realizadas em solventes adequados que podem ser 25 facilmente selecionados por um especialista na técnica da síntese orgânica. Os solventes adequados podem ser substancialmente não reativos com os materiais de partida (reagentes), os intermediários ou os produtos nas temperaturas às quais as reações são levadas a cabo, por exemplo, temperaturas que podem variar desde a temperatura de congelação do solvente até à temperatura de ebulição do solvente. Uma dada reação pode ser realizada num solvente ou numa mistura de mais do que um solvente. Dependendo da etapa reacional em particular, os solventes adequados para uma etapa de reação em particular podem ser selecionados pelo perito na técnica. A preparação de compostos aqui descritos pode envolver a proteção e desproteção de vários grupos químicos. A necessidade de proteção e desproteção e a seleção de grupos protetores apropriados pode ser facilmente determinada por um perito na técnica. A química dos grupos protetores pode ser encontrada, por exemplo, em T. W. Greene e P. G. M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 3a Ed., Wiley & Sons, Inc., Nova Iorque (1999).
As reações podem ser monitorizadas de acordo com qualquer método adequado conhecido na técnica. Por exemplo, a formação de produto pode ser monitorizada por meios espectroscópicos tais como espectroscopia de ressonância magnética nuclear (por exemplo, 1H ou 13C), espectroscopia de infravermelho, espectrofotometria (por exemplo, UV-visível), ou espectrometria de massa, ou por cromatografia, tal como cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) ou cromatografia em camada fina.
Os compostos aqui descritos podem ser preparados de acordo com numerosas vias de preparação conhecidas na literatura. Por exemplo, os compostos aqui descritos podem ser feitos 26 por processos análogos aos descritos em EUA número de série 11/637,545 (EUA 2007/0135461), submetido a 12 de dezembro, 2006; EUA número de série 12/138,082 (EUA 2009/0181959), submetido a 16 de julho de 2009, e EUA número de série 12/137,883 (EUA 2008/0312258), submetido a 12 de junho de 2008. Exemplos de métodos de síntese para a preparação de compostos aqui descritos são fornecidos nos Esquemas abaixo.
Tal como apresentado no Esquema 1, a síntese de composto 32 começa com o 4-cloro pirrolopirimidina Sl. O acoplamento Suzuki de Sl com o boronato de pirazol S2 em condições básicas na presença de Pd(0) como catalisador pode fornecer o composto tricíclico S3, que é subsequentemente convertido seletivamente no composto de iodo S4, utilizando N-iodosuccinimida. O composto de iodo S4 é transformado no correspondente acetato S5. Tratamento de S5 com brometo de hidrogénio a 4M em ácido acético fornece S6 com a oxidação desejada no anel pirrol juntamente com a desproteção do grupo metoxilo para o hidroxilo livre. O grupo ciano que foi hidrolisado para a amida sob estas condições é reinstalado em 32 por tratamento de S6 com cloreto de tricloroacetilo e trietilamina para se efetuar a desidratação. 27
Esquema 1 27
Ο'Ο dioxano ci
S1
Ν'Ν Kjé PíKPhjPU Ή KjC03 1 h2o
$4
S2 10G°G
O 'Ό'^Ν N H S3
\CN
OAc S6 N-N cnucncj
era HOAc 4U HBr
CC!3COC! TEA,
DCM
HO' N 0 H 32 0 composto mono-hidroxilado 42 (metabolito 8) foi reportado em EUA número de série 12/137,883, submetido a 12 de junho de 2008. Além disso, os compostos que possuem um grupo hidroxilo no anel ciclopentilo podem também ser sintetizados tal como no Esquema 2. Por exemplo, o S14 racémico disponível comercialmente no qual o álcool é protegido, seguido por redução do éster carboxilico para o aldeído, seguido por uma olefinação do aldeído para proporcionar S17. Adição conjugada de S9 a S17 em condições básicas proporciona S18 a partir do qual os grupos protetores no álcool e no anel pirrol são removidos sequencialmente para proporcionar uma mistura de diastereoisómeros que são em seguida separados utilizando várias colunas de HPLC quiral para proporcionar os quatro diastereoisómeros de S19. Em algumas formas de realização, a presente invenção proporciona um processo de fazer o composto 42, ou um sal farmacologicamente aceitável dele 28 derivado, que compreende um ou mais dos passos no esquema 2.
Esquema 2
TB SC I ímidaz&l DMF (rac-}S14
^~~co2e\ OTBS 1M DiBALH em tolueno hexanos
ores
(Ph)sP=^CN tolueno 80°C
CN OTBS $18 S17
N-NH
S17
DBU MeCN S9
SEM S15
HPLC quiral S19
Um outro exemplo do composto mono-hidroxilado 36 é obtido pela sequência apresentada no Esquema 3. A cianohidrina S31 protegida pode ser reduzida com DIBAL para o aldeído correspondente, seguido pela olefinação com o fosfonato, tal como S7, para proporcionar o crotonitrilo S33. A adição conjugada de S9 a S33 sob condições básicas proporciona S34, a partir do qual o grupo protetor no anel pirrol é removido para proporcionar uma mistura de diastereoisómeros que podem então ser separados utilizando várias colunas de 29 HPLC quiral para proporcionar os estereoisómeros individuais de 36.
Esquema 3
N 'TS SEM --- DBU MeCN
Q TMSO S31
DiBALHÍ hexano toluerto -45toO°C Q TOSO CH0 S32
(0Ef)2P{0)CH2CN NaH THF 0 to 23 °C
O
TMSQ
CN S33 O s/ n-ν' O S34 1 Ν'-V-·
CN
fT'N SEM
1) TFA/DCM 2}{CH2NH2)z ^ MeOH
36
HÕ^ -CN
Os metabolitos dihidroxilados podem ser obtidos de uma forma similar como se mostra no Esquema 4: o carboxaldeido ciclopenteno S6A pode ser tratado diretamente com o ileto S7 para dar o derivado de crotonitrilo S8. 0 nitrilo S8 pode então ser feito reaqir com o pirazole S9 na presença de uma base, tal como DBU, para se obter S10 como uma mistura de diastereoisómeros, que podem ser dihidroxilados com tetróxido de ósmio para proporcionar os cis-álcoois cis-S12A, após a remoção do grupo SEM. Os estereoisómeros individuais desta mistura (cis-Sl2A) podem ser separados por cromatografia quiral para dar os álcoois enantiomericamente puros. 0 trans-S12A pode ser obtido por epoxidação da olefina primeiro com m-CPBA seguido por abertura do epóxido sob condições ácidas. Os estereoisómeros individuais desta mistura (trans-S12A) podem ser separados por cromatograf ia quiral para dar os álcoois enantiomericamente puros. A mesma via sintética 30 pode ser adaptada para se obter o S12B e S12C isoméricos substituindo o aldeido de partida S6A com S6B e S6C. 30 Esquema 4
cis-S12A
Uma combinação dos métodos acima descritos juntamente com os descritos no pedido de patente dos EUA número de série 11/637,545, submetido a 12 de dezembro de 2006, e no pedido de patente dos EUA 12/137, 883, submetido a 12 de junho de 2008, podem ser utilizados para se obter os compostos trihidroxi da invenção. Por exemplo, os compostos de hidroxi e dihidroxi aqui descritos podem ser oxidados sob 31 condições de oxidação Swern descritas no pedido de patente dos EUA número de série 12/137,883, submetido a 12 de junho de 2008. Os glucuronidos de metabolitos que contêm grupos hidroxilo podem ser sintetizados de acordo com o procedimento de Suzuki et al. (Bioorg. Med. Chem. Lett. (1999), 9(5), 659-662). Métodos
Certos compostos aqui descritos podem modular a atividade de uma ou mais quinases Janus (JAKs). O termo "modular" pretende referir-se a uma capacidade para aumentar ou diminuir a atividade de um ou mais membros da família de quinases JAK. Assim, certos compostos aqui descritos podem ser utilizados em métodos de modulação de uma JAK fazendo contactar a JAK com qualquer um ou mais dos compostos ou composições aqui descritos. Em algumas formas de realização, determinados compostos podem agir como inibidores de uma ou mais JAKs. Em algumas formas de realização, determinados compostos aqui descritos podem atuar para estimular a atividade de uma ou mais JAKs. Em outras formas de realização, certos compostos podem ser utilizados para modular a atividade de uma JAK num indivíduo com necessidade de modulação do recetor, por administração de uma quantidade modulatória de um composto da invenção.
As JAKs a que os compostos se ligam e/ou modulam podem incluir qualquer membro da família JAK. Em algumas formas de realização, a JAK é JAK1, JAK2, JAK3 ou TYK2. Em algumas formas de realização, a JAK é JAK1 ou JAK2. Em algumas formas de realização, a JAK é JAK2. Em algumas formas de realização, a JAK é JAK3. 32
Em algumas formas de realização, os compostos ativos podem ser seletivos. Por "seletivo" quer se dizer que o composto se liga a ou inibe uma JAK com maior afinidade ou potência, respetivamente, em comparação com pelo menos uma outra JAK (por exemplo, inibidores seletivos de JAK1 ou JAK2 sobre JAK3 e/ou TYK2). Em algumas formas de realização, seletiva significa a inibição seletiva de JAK2 (por exemplo, mais do que JAK1, JAK3 e TYK2). Sem querer estar limitado pela teoria, porque os inibidores de JAK3 podem levar a efeitos imunossupressores, um composto que é seletivo para JAK2 sobre JAK3 e que é útil no tratamento do cancro (tal como mieloma múltiplo, por exemplo) , pode oferecer a vantagem adicional de ter menos efeitos secundários imunossupressores. A seletividade pode ser pelo menos cerca de 5 vezes, pelo menos cerca de 10 vezes, pelo menos cerca de 20 vezes, pelo menos cerca de 50 vezes, pelo menos cerca de 100 vezes, pelo menos cerca de 200 vezes, pelo menos cerca de 500 vezes ou, pelo menos, cerca de 1000 vezes. A seletividade pode ser medida por métodos de rotina na técnica. Em algumas formas de realização, a seletividade pode ser testada no Km de cada enzima. Em algumas formas de realização, a seletividade para JAK2 sobre JAK3 pode ser determinada pela concentração de ATP celular.
Um outro aspeto da presente invenção diz respeito a métodos de tratamento de uma doença ou distúrbio associado a JAK num individuo (por exemplo, paciente), por administração ao indivíduo em necessidade de tal tratamento de uma quantidade ou dose terapeuticamente eficaz de um determinado composto descrito aqui ou uma composição farmacêutica dele derivada. Uma doença associada a JAK pode incluir qualquer doença, distúrbio ou condição que está direta ou indiretamente ligada à expressão ou atividade da JAK, incluindo a sobreexpressão e/ou níveis de atividade anormais. Uma doença associada a JAK também pode incluir 33 qualquer doença, distúrbio ou condição que possa ser prevenida, melhorada ou curada por modulação da atividade de JAK.
Exemplos de doenças associadas a JAK incluem as doenças que envolvem o sistema imune incluindo, por exemplo, rejeição de órgãos transplantados (por exemplo, rejeição de aloenxertos e doença de enxerto versus hospedeiro).
Outros exemplos de doenças associadas a JAK incluem doenças autoimunes, tais como esclerose múltipla, artrite reumatoide, artrite juvenil, diabetes tipo I, lúpus, psoriase, doença inflamatória do intestino, colite ulcerativa, doença de Crohn, miastenia grave, nefropatia da imunoglobulina, desordens autoimunes da tiroide, e semelhantes. Em algumas formas de realização, a doença autoimune é uma doença autoimune da pele bolhosa, tal como pênfigo vulgar (PV) ou penfigóide bolhoso (BP).
Outros exemplos de doenças associadas a JAK incluem condições alérgicas, tais como asma, alergias alimentares, dermatite atópica e rinite. Outros exemplos de doenças associadas a JAK incluem doenças virais, tais como virus de Epstein Barr (EBV) , Hepatite B, Hepatite C, VIH, HTLV 1, virus da varicela Zoster (VZV) e virus de papiloma humano (HPV).
Outros exemplos de doenças ou condições associadas a JAK incluem doenças da pele tais como a psoriase (por exemplo, a psoriase vulgar), dermatite atópica, erupções cutâneas, irritação da pele, sensibilização da pele (por exemplo, dermatite de contacto, dermatite alérgica de contacto, ou sensibilização alérgica de contacto). Por exemplo, certas substâncias, incluindo alguns fármacos, quando aplicadas topicamente podem causar sensibilização da pele. Em algumas 34 formas de realização, a coadministração ou administração sequencial de pelo menos um inibidor de JAK, juntamente com o agente causador da sensibilização indesejado pode ser útil no tratamento de tal sensibilização indesejada ou dermatite. Em algumas formas de realização, o distúrbio de pele é tratado com a administração tópica de pelo menos um inibidor de JAK.
Em outras formas de realização, a doença associada a JAK é o cancro, incluindo aqueles caracterizados por tumores sólidos (por exemplo, cancro de próstata, cancro renal, cancro hepático, cancro pancreático, cancro gástrico, cancro de mama, cancro de pulmão, cancro da cabeça e pescoço, cancro da tiroide, glioblastoma, sarcoma de Kaposi, doença de Castleman, melanoma, etc.), os cancros hematológicos (por exemplo, linfoma, leucemia, como a leucemia linfoblástica aguda, leucemia mieloide aguda (LMA) ou mieloma múltiplo), e cancro da pele, tais como linfoma de células T cutâneo (CTCL) e linfoma de células B cutâneo. Exemplos de linfomas de células T cutâneos incluem o sindrome Sezary e micose fungóide.
As doenças associadas a JAK podem ainda incluir as caracterizadas por expressão de: mutantes JAK2 tais como os que têm pelo menos uma mutação no domínio de pseudo-quinase (por exemplo, JAK2V617F); mutantes JAK2 que possuem pelo menos uma mutação fora do domínio de pseudo-quinase; mutantes JAK1; mutantes JAK3; mutantes do recetor da eritropoietina (R-EPO); ou a expressão desregulada de CRLF2.
As doenças associadas a JAK podem ainda incluir desordens mieloproliferativas (MPDs) como policitemia vera (PV), trombocitemia essencial (ET), metaplasia mieloide com mielofibrose (MMM), leucemia mieloide crónica (CML), 35 leucemia mielomonocítica crónica (CMML), sindrome hipereosinofilico (HES), doença sistémica de mastócitos (SMCD), e semelhantes.
Outras doenças associadas a JAK incluem inflamação e doenças inflamatórias. Exemplos de doenças inflamatórias incluem sarcoidose, doenças inflamatórias do olho (por exemplo, o olho seco, irite, uveite, esclerite, conjuntivite, ou doença relacionada) , doenças inflamatórias das vias respiratórias (por exemplo, do trato respiratório superior, incluindo o nariz e os seios, tais como rinite ou sinusite ou do trato respiratório inferior, que inclui bronquite, doença pulmonar obstrutiva crónica, e afins), miopatias inflamatórias, tais como miocardite, e outras doenças inflamatórias. Outras doenças inflamatórias que podem ser tratadas por inibidores de JAK incluem a sindrome de resposta inflamatória sistémica (SIRS) e choque séptico.
Tal como aqui utilizado, "distúrbio do olho seco" pretende englobar os estados de doenças resumidos num recente relatório oficial do Dry Eye Workshop (DEWS), que definiu o olho seco como "uma doença multifatorial das lágrimas e da superfície ocular, que resulta em sintomas de dor, perturbações visuais, e da instabilidade do filme lacrimal, com danos potenciais para a superfície ocular. É acompanhada por um aumento da osmolaridade do filme lacrimal e inflamação da superfície ocular." Lemp, "The Definition and Classification of Dry Eye Disease: Report of the Definition and Classification Subcommittee of the International Dry Eye Workshop", The Ocular Surface, 5(2), 75-92 abril 2007. Em algumas formas de realização, o distúrbio do olho seco é selecionado de entre o olho seco deficiente em lágrimas aquosas (ADDE) ou distúrbio do olho seco por evaporação, ou combinações adequadas dos mesmos. Em algumas formas de realização, o distúrbio do olho seco é 36 o olho seco do síndrome de Sjogren (SSDE) . Em algumas formas de realização, o distúrbio do olho seco não é o síndrome de Sjogren (NSSDE).
Num outro aspeto, a presente invenção proporciona um método de tratamento de conjuntivite, uveíte (incluindo uveíte crónica), coroidite, retinite, ciclite, esclerite, episclerite, ou irite; tratamento de inflamação ou dor relacionada com o transplante de córnea, LASIK (laser assisted in situ keratomileusis), queratectomia fotorefrativa ou LASEK (laser assisted sub-epithelial keratomileusis); inibição da perda da acuidade visual relacionada com o transplante de córnea, LASIK, queratectomia fotorefrativa ou LASEK; ou inibição da rejeição de transplante num paciente em necessidade, compreendendo a administração ao paciente de uma quantidade terapeuticamente eficaz do composto da invenção, ou de um sal farmacologicamente aceitável dele derivado.
Os inibidores de JAK podem ainda ser utilizados para tratar lesões de reperfusão de isquemia ou uma doença ou condição relacionada com um evento isquémico inflamatório, tais como acidente vascular cerebral ou paragem cardíaca. Os inibidores de JAK podem ainda ser usados para tratar a anorexia, caquexia, ou a fadiga, como a que resulta de, ou esta associada ao cancro. Os inibidores de JAK podem ainda ser usados para tratar a restenose, esclerodermite ou fibrose. Os inibidores de JAK podem ainda ser utilizados para tratar condições associadas a hipoxia ou astrogliose, tal como, por exemplo, retinopatia diabética, cancro, ou neurodegeneração. Ver, por exemplo, Dudley, A.C. et al. Biochem. J. 2005, 390 (Pt 2):427-36 e Sriram, K. et al. J. Biol. Chem. 2004, 279(19):19936-47. Epub 2004 Mar 2. 37
Os inibidores de JAK podem ainda ser usados no tratamento da gota e aumento do tamanho da próstata, devido, por exemplo, a hipertrofia benigna da próstata ou hiperplasia benigna da próstata.
Outras doenças associadas a JAK incluem doenças de reabsorção óssea, como a osteoporose, osteoartrite. A reabsorção óssea pode também ser associada com outras condições, tais como o desequilíbrio hormonal e/ou terapia hormonal, a doença autoimune (por exemplo, sarcoidose óssea) ou cancro (por exemplo, mieloma múltiplo). A redução da reabsorção do osso, devido aos inibidores de JAK pode ser de cerca de 10%, cerca de 20%, cerca de 30%, cerca de 40%, cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 80%, ou cerca de 90%.
Tal como aqui utilizado, o termo "fazer contactar" refere-se à união de frações indicadas num sistema in vitro ou um sistema in vivo. Por exemplo, "fazer contactar" uma JAK com um composto inclui a administração de um composto da presente invenção a um indivíduo ou paciente, tal como um ser humano, tendo uma JAK, bem como, por exemplo, a introdução de um composto para uma amostra contendo uma preparação celular ou purificada contendo a JAK.
Tal como aqui utilizado, o termo "indivíduo" ou "paciente", utilizados indiferentemente, refere-se a qualquer animal, incluindo mamíferos, de preferência ratinhos, ratos, outros roedores, coelhos, cães, gatos, suínos, bovinos, ovinos, cavalos, ou primatas, e mais preferencialmente seres humanos.
Tal como aqui utilizada, a frase "quantidade terapeuticamente eficaz" refere-se à quantidade de composto ativo ou agente farmacêutico que suscita a resposta 38 biológica ou medicinal que está a ser procurada, num tecido, sistema, animal, indivíduo ou ser humano por um investigador, veterinário, médico ou outro clinico.
Tal como aqui utilizado, o termo "tratar" ou "tratamento" refere-se a um ou mais de (1) prevenir a doença; por exemplo, prevenir uma doença, condição ou distúrbio num indivíduo que possa estar predisposto à doença, condição ou distúrbio mas ainda não experimentou ou mostrou a patologia ou sintomatologia da doença; (2) inibir a doença, por exemplo, inibir uma doença, condição ou distúrbio num indivíduo que está a experimentar ou mostrar a patologia ou sintomatologia da doença, condição ou distúrbio; e (3) melhorar a doença, como por exemplo, melhorar uma doença, condição ou distúrbio num indivíduo que esteja a experimentar ou mostrar a patologia ou sintomatologia da doença, condição ou distúrbio (isto é, inversão da patologia e/ou sintomatologia) tal como diminuir a gravidade da doença.
Os niveis de metabolitos num paciente após a administração do composto I num indivíduo podem ser medidos e perfilados. Tal perfil de metabolito pode então ser usado para ajustar os regimes de dosagem (por exemplo, para a administração do composto I) nesse indivíduo. Por exemplo, uma remoção mais rápida do composto I, como mostrado pelos niveis de vários metabolitos depois de um determinado periodo de tempo, pode significar que as dosagens iniciais devem ser ajustadas para cima.
Terapias de Combinação
Um ou mais agentes farmacológicos adicionais, tais como, por exemplo, agentes quimioterapêuticos, agentes anti- 39 inflamatórios, esteróides, imunossupressores, bem como inibidores de Bcr-Abl, Flt-3, RAF e quinase FAK, tais como, por exemplo, aqueles descritos em WO 2006/056399, ou outros agentes podem ser usados em combinação com certos compostos aqui descritos para o tratamento de doenças, distúrbios ou condições associadas a JAK. Os um ou mais agentes farmacológicos adicionais podem ser administrados a um paciente simultânea ou sequencialmente.
Exemplo quimioterapêuticos incluem inibidores de proteossomas (por exemplo, bortezomib), talidomida, revlimida, e agentes que danificam o ADN, tais como melfalano, doxorrubicina, ciclofosfamida, vincristina, etoposido, carmustina, e semelhantes.
Exemplo de esteróides incluem corticosteroides tais como dexametasona ou prednisona.
Exemplos de inibidores de Bcr-Abl incluem os compostos, e sais farmacologicamente aceitáveis deles derivados, dos géneros e espécies descritos na Patente dos EUA N° 5.521.184, WO 04/005281, e EUA número de série 60/578,491.
Exemplo de inibidores de Flt-3 adequados incluem compostos e sais farmacologicamente aceitáveis deles derivados, como descritos em WO 03/037347, WO 03/099771 e WO 04/046120.
Exemplos de inibidores da RAF adequados incluem compostos e sais farmacologicamente aceitáveis deles derivados, como descritos em WO 00/09495 e WO 05/028444.
Exemplos de inibidores de FAK adequados incluem compostos e sais farmacologicamente aceitáveis deles derivados, como descritos em WO 04/080980, WO 04/056786, WO 03/024967, WO 01/064655, WO 00/053595 e WO 01/014402. 40
Em algumas formas de realização, um ou mais compostos aqui descritos podem ser utilizados em combinação com um ou mais de outros inibidores da quinase, incluindo o imatinib, em particular para o tratamento de pacientes com resistência a imatinib ou outros inibidores de quinase.
Em algumas formas de realização, um ou mais compostos podem ser usados em combinação com um agente quimioterapêutico no tratamento do cancro, tal como mieloma múltiplo, e podem melhorar a resposta ao tratamento, em comparação com a resposta ao agente quimioterapêutico sozinho, sem exacerbação dos seus efeitos tóxicos. Exemplos de agentes farmacológicos adicionais utilizados no tratamento de mieloma múltiplo, por exemplo, podem incluir, sem limitação, o melfalano, o melfalano mais prednisona [MP], doxorrubicina, dexametasona e Velcade (bortezomib). Outros agentes adicionais utilizados no tratamento de mieloma múltiplo incluem inibidores de quinase Bcr-Abl, Flt-3, RAF e FAK. Efeitos aditivos ou sinérgicos são resultados desejáveis da combinação de um composto da presente invenção com um agente adicional. Além disso, a resistência das células de mieloma múltiplo a agentes tais como dexametasona, pode ser reversível por tratamento com um composto da presente invenção. Os agentes podem ser combinados com o inibidor de JAK, numa forma de dosagem única ou continua, ou os agentes podem ser administrados simultaneamente ou sequencialmente como formas de dosagem separadas.
Em algumas formas de realização, um corticosteroide, como a dexametasona é administrado a um paciente em combinação com pelo menos um inibidor de JAK, onde a dexametasona é administrada de forma intermitente em vez de continuamente. 41
Em outras formas de realização, combinações de um ou mais compostos com outros agentes terapêuticos podem ser administradas a um paciente antes, durante e/ou depois de um transplante de medula óssea ou transplante de células estaminais.
Formulações Farmacológicas e Formas de Dosagem
Quando empregues como fármacos, os compostos aqui descritos podem ser administrados na forma de composições farmacológicas. Estas composições podem ser preparadas de um modo bem conhecido na técnica farmacêutica, e podem ser administradas por uma variedade de vias, dependendo de se o tratamento local ou sistémico é desejado e da área a ser tratada. A administração pode ser tópica (incluindo transdérmica, epidérmica, oftálmica e para as membranas mucosas, incluindo a administração intranasal, vaginal e rectal), pulmonar (por exemplo, por inalação ou insuflação de pós ou aerossóis, incluindo por nebulizador; intratraqueal ou intranasal), oral ou parentérica. Em algumas formas de realização, a composição é adequada para administração oral. A administração parentérica inclui a administração intravenosa, intra-arterial, subcutânea, intraperitoneal, intramuscular ou infusão; ou intracraniana, por exemplo, administração intratecal ou intraventricular. A administração parentérica pode estar na forma de uma dose em bolus único, ou poderá ser, por exemplo, por uma bomba de perfusão continua. As composições farmacológicas e as formulações para administração tópica podem incluir sistemas transdérmicos, unguentos, loções, cremes, géis, gotas, supositórios, sprays, líquidos e pós. Veículos farmacológicos convencionais, bases aquosas, em pó ou oleosas, espessantes e semelhantes podem ser necessários ou desejáveis. Preservativos revestidos, luvas e similares podem também ser úteis. 42 A presente invenção também inclui composições farmacológicas que contêm, como ingrediente ativo, um ou mais dos compostos aqui descritos, em combinação com um ou mais veículos farmacologicamente aceitáveis (excipientes). No fabrico das composições da invenção, o ingrediente ativo é normalmente misturado com um excipiente, diluído por um excipiente ou encerrado dentro de um tal transportador, na forma de, por exemplo, uma cápsula, saqueta, papel ou outro recipiente. Quando o excipiente serve como um diluente, ele pode ser um material sólido, semissólido ou líquido, que atua como um veículo, transportador ou meio para o ingrediente ativo. Assim, as composições podem ser na forma de comprimidos, pílulas, pós, pastilhas, saquetas, hóstias, elixires, suspensões, emulsões, soluções, xaropes, aerossóis (como um sólido ou num meio líquido), pomadas contendo, por exemplo, até 10% em peso do composto ativo, cápsulas moles e duras de gelatina, supositórios, soluções injetáveis estéreis, e pós embalados estéreis.
Na preparação de uma formulação, o composto ativo pode ser moído para fornecer o tamanho de partícula apropriado antes da combinação com os outros ingredientes. Se o composto ativo é substancialmente insolúvel, ele pode ser moído para um tamanho de partícula inferior a uma malha de 200. Se o composto ativo é substancialmente solúvel em água, o tamanho de partícula pode ser ajustado por moagem para proporcionar uma distribuição substancialmente uniforme na formulação, por exemplo, malha de cerca de 40. O ingrediente ativo pode ser moído através de procedimentos de moagem conhecidos tais como moagem húmida, para se obter um tamanho de partícula apropriado para a formação de comprimidos e para outros tipos de formulação. Preparações do ingrediente ativo finamente divididas (nanoparticulados) 43 podem ser preparadas por processos conhecidos na técnica, ver por exemplo Pedido de Patente Internacional No. WO 2002/000196.
Alguns exemplos de excipientes adequados incluem lactose, dextrose, sacarose, sorbitol, manitol, amidos, goma acácia, fosfato de cálcio, alginatos, tragacanto, gelatina, silicato de cálcio, celulose microcristalina, polivinilpirrolidona, celulose, água, xarope, e metil celulose. As formulações podem adicionalmente incluir: agentes lubrificantes tais como talco, estearato de magnésio e óleo mineral; agentes molhantes, emulsionantes e agentes de suspensão; agentes conservantes tais como metil-e propil- hidroxibenzoatos, agentes edulcorantes e agentes aromatizantes. As composições da invenção podem ser formuladas de modo a proporcionar uma libertação rápida, sustentada ou retardada do ingrediente ativo após administração ao paciente por procedimentos conhecidos na técnica.
As composições podem ser formuladas numa forma de dosagem unitária, contendo cada dosagem desde cerca de 5 a cerca de 1000 mg de (1 g) , mais usualmente cerca de 100 a cerca de 500 mg, do ingrediente ativo. O termo "formas de dosagem unitária" refere-se a unidades fisicamente discretas adequadas como dosagens unitárias para sujeitos humanos e outros mamíferos, cada unidade contendo uma quantidade predeterminada de material ativo calculada para produzir o efeito terapêutico desejado, em associação com um excipiente farmacêutico adequado.
Em algumas formas de realização, as composições da invenção contêm entre cerca de 5 mg a cerca de 50 mg do ingrediente ativo. Alguém com perícia normal na técnica apreciará que este incorpora compostos ou composições que contêm cerca de 44 5 mg a cerca de 10 mg, cerca de 10 mg até cerca de 15 mg, cerca de 15 mg ate cerca de 20 mg, cerca de 20 mg até cerca de 25 mg, cerca de 25 mg e cerca de 30 mg, cerca de 30 mg a cerca de 35 mg, cerca de 35 mg a cerca de 40 mg, cerca de 40 mg até cerca de 45 mg, ou cerca de 45 mg a cerca de 50 mg do ingrediente ativo.
Em algumas formas de realização, as composições da invenção contêm entre cerca de 50 mg a cerca de 500 mg do ingrediente ativo. Alguém com perícia normal na técnica apreciará que este incorpora compostos ou composições que contêm cerca de 50 mg a cerca de 100 mg, cerca de 100 mg até cerca de 150 mg, cerca de 150 mg a cerca de 200 mg, cerca de 200 mg a cerca de 250 mg, cerca de 250 mg e cerca de 300 mg, cerca de 350 mg a cerca de 400 mg, ou cerca de 450 mg a cerca de 500 mg do ingrediente ativo.
Em algumas formas de realização, as composições da invenção contêm entre cerca de 500 mg a cerca de 1000 mg do ingrediente ativo. Alguém com perícia normal na técnica apreciará que este incorpora compostos ou composições que contêm cerca de 500 mg a cerca de 550 mg, cerca de 550 mg a cerca de 600 mg, cerca de 600 mg a cerca de 650 mg, cerca de 650 mg a cerca de 700 mg, cerca de 700 mg e cerca de 750 mg, cerca de 750 mg a cerca de 800 mg, cerca de 800 mg a cerca de 850 mg, cerca de 850 mg a cerca de 900 mg, cerca de 900 mg a cerca de 950 mg, ou cerca de 950 mg a cerca de 1000 mg do ingrediente ativo. O composto ativo pode ser eficaz numa larga gama de dosagem e é geralmente administrado numa quantidade farmacologicamente eficaz. Será entendido, contudo, que a quantidade do composto realmente administrada irá ser determinada por um médico, em função das circunstâncias relevantes, incluindo a condição a ser tratada, a via de 45 administração escolhida, o composto real administrado, a idade, peso, e resposta do paciente individual, a gravidade dos sintomas do paciente, e semelhantes.
Para a preparação de composições sólidas tais como comprimidos, o ingrediente ativo principal é misturado com um excipiente farmacêutico para formar uma composição de pré-formulação sólida contendo uma mistura homogénea de um composto da presente invenção. Quando nos referimos a estas composições de pré-formulação como homogéneas, o ingrediente ativo é tipicamente disperso uniformemente por toda a composição de modo a que a composição possa ser facilmente subdividida em formas de dosagem unitárias igualmente eficazes tais como comprimidos, pílulas e cápsulas. Esta pré-formulação sólida é então subdividida em formas de dosagem unitária do tipo acima descrito contendo desde, por exemplo, cerca de 0,1 a cerca de 1000 mg do ingrediente ativo da presente invenção.
Os comprimidos ou pílulas da presente invenção podem ser revestidos, ou de outro modo compostos, de modo a proporcionar uma forma de dosagem proporcionando a vantagem de ação prolongada. Por exemplo, o comprimido ou pílula pode compreender uma dosagem interna e um componente de dosagem exterior, sendo este último sob a forma de um envelope sobre o primeiro. Os dois componentes podem ser separados por uma camada entérica que serve para resistir à desintegração no estômago e permite que o componente interno passe intacto para o duodeno ou para ser retardado na libertação. Uma variedade de materiais pode ser utilizada para tais camadas ou revestimentos entéricos, tais materiais incluindo um número de ácidos poliméricos e misturas de ácidos poliméricos com tais materiais como goma-laca, álcool cetílico, e acetato de celulose. 46
As formas líquidas nas quais os compostos e as composições podem ser incorporadas para administração por via oral ou por injeção incluem soluções aquosas, xaropes adequadamente aromatizados, suspensões aquosas ou oleosas, e emulsões aromatizadas com óleos comestíveis tais como óleo de semente de algodão, óleo de sésamo, óleo de coco, ou óleo de amendoim, bem como elixires e veículos farmacológicos semelhantes.
As composições para inalação ou insuflação incluem soluções e suspensões em solventes aquosos ou orgânicos farmacologicamente aceitáveis, ou misturas deles derivadas, e pós. As composições líquidas ou sólidas podem conter excipientes farmacologicamente aceitáveis adequados conforme descrito acima. Em algumas formas de realização, as composições são administradas pela via respiratória oral ou nasal para efeito local ou sistémico. As composições podem ser nebulizadas por utilização de gases inertes. Soluções de nebulização podem ser inaladas diretamente do dispositivo de nebulização ou o dispositivo de nebulização pode ser anexado a uma máscaras de rosto, ou máquina de respiração com pressão positiva intermitente. Composições em solução, suspensão ou pó podem ser administradas por via oral ou nasal a partir de dispositivos que entregam a formulação de um modo adequado. A quantidade de composto ou composição administrada a um paciente variará dependendo do que está a ser administrado, da finalidade da administração, tal como profilaxia ou terapia, do estado do paciente, do modo de administração, e afins. Em aplicações terapêuticas, as composições podem ser administradas a um paciente que já sofra de uma doença numa quantidade suficiente para curar ou pelo menos parar parcialmente os sintomas da doença e suas complicações. As doses eficazes irão depender da condição da doença a ser 47 tratada, bem como pelo julgamento do médico assistente dependendo de fatores tais como a gravidade da doença, a idade, peso e estado geral do paciente, e semelhantes.
As composições administradas a um paciente podem ser na forma de composições farmacológicas descritas acima. Estas composições podem ser esterilizadas por técnicas de esterilização convencionais, ou podem ser esterilizadas por filtração. As soluções aquosas podem ser embaladas para utilização imediata, ou liofilizadas, sendo a preparação liofilizada combinada com um veiculo aquoso estéril antes da administração. 0 pH das preparações compostas estará tipicamente entre 3 e 11, mais preferencialmente de 5 a 9 e mais preferivelmente de 7 a 8. Será entendido que a utilização de certos dos anteriores excipientes, transportadores ou estabilizadores resultará na formação de sais farmacológicos. A dosagem terapêutica dos compostos pode variar de acordo com, por exemplo, a utilização particular para a qual é feito o tratamento, o modo de administração do composto, a saúde e condição do paciente e do julgamento do médico que prescreve. A proporção ou a concentração de um composto numa composição farmacêutica pode variar dependendo de uma série de fatores, incluindo a dosagem, as caracteristicas químicas (por exemplo, hidrofobicidade) e a via de administração. Por exemplo, os compostos podem ser proporcionados numa solução tampão fisiológica aquosa contendo cerca de 0,1 a cerca de 10% p/v do composto para administração parentérica. Algumas gamas de doses típicas são desde cerca de 1 yg/kg a cerca de 1 g/kg de peso corporal por dia. Em algumas formas de realização, o intervalo de doses varia entre cerca de 0,01 mg/kg a cerca de 100 mg/kg de peso corporal por dia. A dosagem é provavelmente dependente de variáveis tais como o tipo e 48 extensão da progressão da doença ou distúrbio, o estado de saúde global do paciente particular, da eficácia biológica relativa do composto selecionado, da formulação do excipiente, e da sua via de administração. As doses eficazes podem ser extrapoladas a partir de curvas de dose-resposta derivadas de sistemas de ensaio em modelo in vitro ou animal.
As composições da invenção podem ainda incluir um ou mais agentes farmacológicos adicionais, tais como um composto quimioterapêutico, esteroide e anti-inflamatório, ou imunossupressor, exemplos dos quais estão listados acima.
Em algumas formas de realização, o composto, ou um sal farmacologicamente aceitável dele derivado, é administrado como uma composição oftálmica. Por conseguinte, em algumas formas de realização, os métodos compreendem a administração do composto, ou de um sal farmacologicamente aceitável dele derivado, e de um veiculo oftalmicamente aceitável. Em algumas formas de realização, a composição oftálmica é uma composição liquida, uma composição semissólida, implante, filme, microparticulas ou nanoparticulas. oftálmica
Em algumas formas de realização, a composição oftálmica é uma composição liquida. Em algumas formas de realização, a composição oftálmica é uma composição semissólida. Em algumas formas de realização, a composição oftálmica é uma composição tópica. As composições tópicas incluem, mas não estão limitadas a composições liquidas e semissólidas. Em algumas formas de realização, a composição oftálmica é uma composição tópica. Em algumas formas de realização, a composição tópica compreende uma solução aquosa, uma suspensão aquosa, uma pomada ou um gel. Em algumas formas de realização, a composição oftálmica é aplicada 49 topicamente para a frente do olho, sob a pálpebra superior, na pálpebra inferior e no cul-de-sac. Em algumas formas de realização, a composição oftálmica é esterilizada. A esterilização pode ser conseguida através de técnicas conhecidas como a filtração esterilizante da solução ou por meio de aquecimento da solução na ampola pronta a usar. As composições oftálmicas da presente invenção podem ainda conter excipientes farmacológicos adequados para a preparação de formulações oftálmicas. Exemplos de tais excipientes são agentes conservantes, agentes tamponantes, agentes quelantes, agentes antioxidantes e sais para regulação da pressão osmótica.
Tal como aqui utilizado, o termo "veiculo oftalmicamente aceitável" refere-se a qualquer material que possa conter e libertar o composto, ou sal farmacologicamente aceitável dele derivado, e que seja compatível com o olho. Em algumas formas de realização, o veículo oftalmologicamente aceitável é água ou uma solução ou suspensão aquosa, mas também inclui óleos tais como os utilizados para fazer pomadas e matrizes poliméricas como as utilizadas em implantes oculares. Em algumas formas de realização, a composição pode ser uma suspensão aquosa que compreenda o composto ou sal farmacologicamente aceitável dele derivado. As composições oftálmicas líquidas, incluindo ambas as pomadas e as suspensões, podem ter uma viscosidade que é adequada para a via de administração selecionada. Em algumas formas de realização, a composição oftálmica tem uma viscosidade na gama de cerca de 1.000 a cerca de 30.000 centipoise.
Em algumas formas de realização, as composições oftálmicas podem compreender adicionalmente um ou mais dos agentes tensioativos, adjuvantes, tamponantes, antioxidantes, ajustadores de tonicidade, conservantes (por exemplo, EDTA, 50 BAK (cloreto de benzalcónio), clorito de sódio, perborato de sódio, poliquatérnio-1), espessantes ou modificadores de viscosidade (por exemplo, carboximetilcelulose, hidroximetilcelulose, álcool polivinilico, polietilenoglicol, glicol 400, hidroximetil celulose de propilenoglicol, hidroxipropil-guar, ácido hialurónico e hidroxipropil celulose), e semelhantes. Os aditivos na formulação podem incluir, mas não estão limitados a, cloreto de sódio, bicarbonato de sódio, ácido sórbico, metil parabeno, propil parabeno, clorexidina, óleo de ricino, e perborato de sódio.
As composições oftálmicas aquosas (soluções ou suspensões), geralmente não contêm constituintes fisiologicamente ou oftalmologicamente nocivos. Em algumas formas de realização, água purificada ou desionizada, é utilizada na composição. O pH pode ser ajustado pela adição de quaisquer ácidos, bases ou tampões, fisiologicamente e oftalmologicamente aceitáveis, para o intervalo de cerca de 5,0 a 8,5. Exemplos oftalmicamente aceitáveis de ácidos incluem acético, bórico, cítrico, láctico, fosfórico, clorídrico, e outros semelhantes, e exemplos de bases incluem hidróxido de sódio, fosfato de sódio, borato de sódio, citrato de sódio, acetato de sódio, lactato de sódio, trometamina, tris-hidroximetilaminometano, e semelhantes. Sais e tampões incluem citrato/dextrose, bicarbonato de sódio, cloreto de amónio e misturas dos ácidos e das bases acima mencionados.
Em algumas formas de realização, os métodos envolvem a formação ou o fornecimento de um depósito de agente terapêutico em contacto com a superfície externa do olho. Um depósito refere-se a uma fonte de agente terapêutico que não seja removida rapidamente pelas lágrimas ou outros mecanismos de limpeza do olho. Isto permite a presença 51 continuada de concentrações elevadas sustentadas do agente terapêutico no fluido na superfície externa do olho, através de uma única aplicação. Sem querer estar limitado por qualquer teoria, acredita-se que a absorção e a penetração pode ser dependente quer da concentração do fármaco dissolvido quer da duração do contacto do tecido externo com o fluido contendo o fármaco. À medida que o fármaco é removido por recarga do fluido ocular e/ou absorção no tecido do olho, mais fármaco é fornecido, por exemplo dissolvido, no fluido ocular reabastecido a partir do depósito. Consequentemente, a utilização de um depósito pode mais facilmente facilitar o carregamento do tecido ocular de agentes terapêuticos mais insolúveis. Em algumas formas de realização, o depósito pode permanecer durante até oito horas ou mais. Em algumas formas de realização, a forma do depósito oftálmico inclui, mas não está limitada a, suspensões poliméricas aquosas, unguentos, e implantes sólidos.
Em algumas formas de realização, a composição oftálmica é uma pomada ou um gel. Em algumas forma de realização, a composição oftálmica é um veículo de entrega à base de óleo. Em algumas formas de realização, a composição compreende uma base de petróleo ou lanolina à qual é adicionado o ingrediente ativo, geralmente como 0,1 a 2%, e excipientes. Bases comuns podem incluir, mas não estão limitadas a, óleo mineral, petrolato e combinações deles derivadas. Em algumas formas de realização, a pomada é aplicada como uma fita na pálpebra inferior.
Em algumas forma de realização, a composição oftálmica é um implante oftálmico. Em algumas formas de realização, o implante oftálmico é biologicamente inerte, suave, bioerodível, viscoelástico, estável à esterilização após a exposição a agentes terapêuticos, resistente a infeções de 52 bactérias presentes no ar, bioerodivel, biocompativel, e/ou viscoelástico. Em algumas formas de realização, o implante compreende uma matriz oftalmicamente aceitável, por exemplo, uma matriz de polimero. A matriz é tipicamente um polímero e o agente terapêutico é geralmente disperso nele ou ligado à matriz de polímero. Em algumas formas de realização, o agente terapêutico pode ser libertado lentamente a partir da matriz por meio de dissolução ou de hidrólise da ligação covalente. Em algumas formas de realização, o polímero é biodegradável (solúvel) e a velocidade de dissolução do mesmo pode controlar a taxa de libertação do agente terapêutico disperso no mesmo. Numa outra forma, a matriz de polímero é um polímero biodegradável que se decompõe tal como por hidrólise, para desse modo libertar o agente terapêutico ligado ao mesmo ou disperso no mesmo. Em outras formas de realização, a matriz e o agente terapêutico podem ser rodeados por um revestimento polimérico adicional para um maior controlo da libertação. Em algumas formas de realização, o implante compreende um polímero biodegradável, tal como a policaprolactona (PCL), um copolímero de etileno/acetato de vinilo (EVA), polialquil cianoacrilato, poliuretano, nylon, ou poli(di-lactido-co-glicolido) (PLGA), ou um copolímero de qualquer um destes. Em algumas formas de realização, o agente terapêutico é disperso no material da matriz, ou disperso na composição de monómero utilizada para fazer o material da matriz antes da polimerização. Em algumas formas de realização, a quantidade de agente terapêutico é de cerca de 0,1 a cerca de 50%, ou desde cerca de 2 até cerca de 20%. Em outras formas de realização, a matriz de polímero biodegradável ou bioerodivel é utilizada de modo que o implante gasto não tenha de ser removido. À medida que o polímero biodegradável ou bioerodivel é degradado ou dissolvido, o agente terapêutico é libertado. 53
Em outras formas de realização, o implante oftálmico compreende um polímero, incluindo, mas não limitado a, aqueles descritos em Wagh, et al., "Polymers used in ocular dosage form and drug delivery Systems", Asian J. Pharm., páginas 12-17 (Jan. 2008). Em algumas formas de realização, o implante compreende um polímero selecionado a partir de polivinilpirrolidona (PVP), um polímero de acrilato ou metacrilato ou um copolímero (por exemplo, família de polímeros Eudragit® da Rohm ou Degussa), hidroximetil celulose, ácido poliacrílico, dendrímeros de poli(amidoamina), poli(dimetil siloxano), óxido de polietileno, poli(lactido-co-glicolido), poli (2-hidroxietilmetacrilato), poli (álcool vinílico) ou poli (fumarato de propileno). Em algumas formas de realização, o implante compreende Gelfoam® R. Em algumas formas de realização, o implante é um ácido poliacrílico de conjugado de cisteína com 450 kDa.
Em algumas formas de realização, a composição oftálmica é um filme oftálmico. Polímeros adequados para tais filmes incluem, mas não estão limitados a, aqueles descritos em Wagh, et al. (íbid) . Em algumas formas de realização, o filme é uma lente de contacto macia, tal como aquelas feitas a partir de copolímeros de N, N-dietilacrilamida e ácido metacrílico reticulado com dimetacrilato de etilenoglicol.
Em algumas formas de realização, a composição oftálmica compreende microesferas ou nanopartícuias. Em algumas formas de realização, as microesferas compreendem gelatina. Em algumas formas de realização, as microesferas são injetadas no segmento posterior do olho, no espaço coroidal, na esclera, intravítrea ou sub-retinalmente. Em algumas formas de realização, as microsferas ou nanopartícuias compreendem um polímero, incluindo, mas não 54 limitado a, aqueles descritos em Wagh, et al. (ibid), que é aqui incorporada por referência na sua totalidade. Em algumas formas de realização, o polímero é quitosano, um ácido policarboxílico tal como ácido poliacrilico, partículas de albumina, ésteres de ácido hialurónico, ácido poli-itacónico, poli(butil)cianoacrilato, policaprolactona, poli(isobutil)caprolactona, poli(ácido glicólico-co-ácido láctico) ou poli(ácido láctico). Em algumas formas de realização, as microsferas ou nanopartículas compreendem partículas lipídicas sólidas.
Em algumas formas de realização, a composição oftálmica compreende uma resina de troca iónica. Em algumas formas de realização, a resina de troca iónica é uma resina de zeólito inorgânico ou orgânico sintético. Em algumas formas de realização, a resina de troca iónica inclui, mas não se limita a, aquelas descritas em Wagh, et al. (ibid), que é aqui incorporada por referência na sua totalidade. Em algumas formas de realização, a resina de troca iónica é um ácido poliacrilico parcialmente neutralizado.
Em algumas formas de realização, a composição oftálmica é uma suspensão polimérica aquosa. Em algumas formas de realização, o agente terapêutico ou agente de suspensão polimérico é suspenso num meio aquoso. Em algumas formas de realização, as suspensões poliméricas aquosas podem ser formuladas de modo a que os mesmas mantenham a mesma ou substancialmente a mesma viscosidade no olho que tinham antes da administração no olho. Em algumas formas de realização, elas podem ser formuladas de modo a que haja um aumento de gelificação em contacto com o fluido lacrimal.
Compostos Marcados e Métodos de Ensaio 55
Um outro aspeto da presente invenção refere-se à versão marcada de certos compostos aqui descritos (com marcação radioativa, fluorescente, etc.) que seriam úteis não apenas em técnicas de imagiologia mas também em ensaios, tanto in vitro como in vivo , para localizar e quantificar JAK em amostras de tecido, incluindo humano, e para a identificação de ligandos de JAK pela inibição da ligação de um composto marcado. Consequentemente, a presente invenção inclui ensaios de JAK que contenham tais compostos marcados. A presente invenção inclui ainda compostos marcados isotopicamente. Um composto "isotopicamente" ou "radiomarcado" é um composto aqui descrito, onde um ou mais átomos são substituídos por um átomo com uma massa atómica ou número de massa diferente da massa atómica ou número de massa tipicamente encontrados na natureza (isto é, de ocorrência natural). Radionuclidos adequados que podem ser incorporados nos compostos aqui descritos incluem, mas não estão limitados a H (também escrito como D para deutério), 3H (também escrito como T para o tritio) , 41C, 13C, 14C, 13N, 15N, 15S, 17S, 18S, 18F, 35S, 36C1, 82Br, 75Br, 76Br, 77Br, 123I, 124 125 131 I, I e I. 0 radionuclido que é incorporado nos compostos radiomarcados instantâneamente dependerá da aplicação especifica desse composto radiomarcado. Por exemplo, por marcação in vitro de metaloprotease e ensaios de competição, os compostos que incorporam 3H, 14C, 82Br, 125X, 131I, 35S serão geralmente mais úteis. Para aplicações de rádio-imagiologia 14C, 18F, 125I, 123I, 124I, 131I, 75Br, 76Br ou 77Br serão em geralmente mais úteis.
Entende-se que um "composto radiomarcado" ou "marcado" é um composto que tem incorporado pelo menos um radionuclido. Em algumas formas de realização o radionuclido é selecionado do grupo que consiste em 3H, 14C, 125I, 35S e 82Br. 56 A presente invenção pode incluir ainda métodos sintéticos para a incorporação de radioisótopos em compostos aqui descritos. Os métodos sintéticos para a incorporação de radioisótopos em compostos orgânicos são bem conhecidos na técnica, e uma pessoa especialista na técnica reconhecerá prontamente os métodos aplicáveis para os compostos aqui descritos.
Um composto marcado da invenção pode ser usado num ensaio de triagem para identificar/avaliar os compostos. Por exemplo, um composto recentemente sintetizado ou identificado (isto é, composto de teste) que é marcado pode ser avaliado quanto à sua capacidade para se ligar a uma JAK, controlando-se a sua variação de concentração ao entrar em contato com a JAK através de rastreamento da marcação. Por exemplo, um composto de teste (marcado) pode ser avaliado quanto à sua capacidade para reduzir a ligação de outro composto que se sabe ligar-se a uma JAK (isto é, o composto padrão). Por conseguinte, a capacidade de um composto de teste para competir com o composto padrão para a ligação à JAK correlaciona-se diretamente com a sua afinidade de ligação. Por outro lado, em alguns outros ensaios de rastreio, o composto padrão é marcado e os compostos de teste não são marcados. Por conseguinte, a concentração do composto padrão marcado é monitorizada com o propósito de avaliar a competição entre o composto padrão e o composto de teste, e a afinidade relativa de ligação do composto de teste é assim verificada.
Ki ts A presente invenção também inclui kits farmacêuticos úteis, por exemplo, no tratamento ou prevenção de doenças ou distúrbios associados a JAK, tais como o cancro, que 57 incluem um ou mais recipientes que contêm uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto ativo. Esses kits podem ainda incluir, se desejado, um ou mais de vários componentes de kit farmacêuticos convencionais, tais como, por exemplo, recipientes com um ou mais veículos farmacologicamente aceitáveis, recipientes adicionais, etc., como será prontamente evidente para os peritos na técnica. As instruções, quer como bulas ou como rótulos, indicando as quantidades dos componentes a serem administrados, diretrizes para a administração, e/ou diretrizes para misturar os componentes, também podem ser incluídas no kit. A invenção será descrita em maior detalhe por meio de exemplos específicos. São fornecidos os seguintes exemplos para fins ilustrativos, e não se destinam a limitar a invenção de qualquer maneira. Os peritos na técnica reconhecerão facilmente uma variedade de parâmetros não críticos que podem ser alterados ou modificados para produzir essencialmente os mesmos resultados.
EXEMPLOS
Exemplo 1: (R) -3-ciclopentil-3-[4-(2-hidroxi-5-oxo-6,7- dihidro-5,1-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-lH-pirazol-1-il]propanonltrilo
N-N
58
Passo 1. (R)-3-ciclopentil-3-[4-(2-metoxi-7H-pirrolo[2,3- d]pirimidin-4-il)-lH-pirazol-l-il]propanonitrilo
4-Cloro-2-metoxi-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidina(0,4 g, 2,18 mmol, Toronto Research Chemicals) e (R)-3-ciclopentil-3-[4-(4,4,5,5-tetrametil-l,3,2-dioxaborolan-2-il)-lH-pirazol-1-il] propanonitrilo (0,824 g, 2,61 inmol, preparados tal como descrito em Org. Lett., 2009, 11(9), 1999-2002.) foram dissolvidos em 1,4-dioxano (4 mL) e foi adicionado carbonato de potássio (0, 903 g, 6,54 mmol) em água (2 mL) . A mistura foi desgaseifiçada e foi adicionado tetraquis(trifenilfosfina)paládio(0) (0,126 g, 0,109 mmol). A mistura de reação foi aquecida até 100 °C durante 16 h. A mistura de reação foi dividida entre água e acetato de etilo. A camada aquosa foi extraída com acetato de etilo três vezes. Os extratos combinados foram secos sobre sulfato de sódio, decantados e concentrados. A cromatografia em coluna flash, eluindo com um gradiente de 0-10% de MeOH em cloreto de metileno, foi utilizada para purificar o produto (670 mg, 91%) . 1H-NMR (300 MHz, CD3OD): δ 8,59 (s , 1H) , 8,35 (s, 1H) , 7,24 (d, 1H), 6,81 (d, 1H) , 4,47 (dt, 1H) , 4,04 (s, 3H), 3,21 (dd, 1H), 3,10 (dd, 1H) , 2,62-2,44 (m, 1H) , 2,02-1,86 (m, 1H) , 1,81-1,20 (m, 7H) ; LCMS (M+H) +: 337,0.
Passo 2. (R)-3-ciclopentil-3-[4-(5-iodo-2-metoxi-7H- pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-lH-pirazol-1-il]propanonitrilo 59
A uma solução de 3-ciclopentil-3-[4-(2-metoxi-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-lH-pirazol-1- il]propanonitrilo (0,532 g , 1,58 mmol) em tetrahidrofurano (20 mL) foi adicionada N-iodossuccinimida (0,36 g, 1,6 mmol). A reação foi agitada durante 30 min e o solvente foi removido em vácuo. O residuo foi purificado por cromatografia em coluna flash, eluindo com um gradiente de 0-65% de acetato de etilo em hexanos de modo a dar um sólido amarelo (250 mg, 34%) . 1H-NMR (300 MHz, CDCI3) : δ 10,31 (br s, 1H), 8,27 (s, 1H), 8,23 (s, 1H), 7,29 (s, 1H) , 4,34-4,21 (m, 1H) , 4,06 (s, 3H) , 3,14 (dd, 1H) , 3,03-2,90 (m, 1H), 2,66-2,49 (m, 1H), 2,02-1,17 (m, 8H); LCMS (M+H)+: 463,0.
Passo 3. Acetato de (R)-4-[1-(2-ciano-l-ciclopentiletil)-lH-pirazol-4-il]-2-metoxi-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-5-ilo
Uma solução de 3-ciclopentil-3-[4-(5-iodo-2-metoxi-7H- pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-lH-pirazol-1- il]propanonitrilo (0,25 g, 0,54 mmol) em ácido acético (3 60 mL) foi tratada com acetato de prata (0,27 g, 1,6 mmol) e aquecida até 70°C durante 16 h. A mistura foi filtrada, lavada com MeCN, foi adicionada água ao filtrado e esta mistura foi agitada durante 20 min. Cloreto de sódio sólido foi adicionado a esta solução. O produto foi obtido por extração desta mistura aquosa com três porções de acetato de etilo. Os extratos combinados foram secos sobre sulfato de sódio, decantados e concentrados. Uma porção do produto foi utilizada no passo da hidrólise (Passo 4) sem purificação adicional. 1H-NMR (300 MHz, CDCI3) : δ 9,87 (br s, 1H), 8,39 (s, 1H), 8,37 (s, 1H), 7,33 (s, 1H) , 4,22 (dt, 1H) , 4,06 (s, 3H) , 3,14 (dd, 1H) , 2,94 (dd, 1H) , 2,64-2,47 (m, 1H) , 2,36 (s, 3H) , 2,03-1, 86 (m, 1H) , 1,79-1,12 (m, 7H); LCMS (M+H)+: 395,1.
Passo 4. (R)-3-ciclopentil-3-[4-(2-hidroxi-5-oxo-6,7- dihidro-5H-pirrolo[2,3d]-pirimidin-4-il)-ΙΗ-pirazol-1 - il]propanamida
4 M de HBr em ácido acético (2 mL, 8 mmol) foram adicionados a acetato de 4-[ 1-(2-ciano-l-ciclopentiletil)-lH-pirazol-4-il]-2-metoxi-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-5-ilo (0,050 g, 0,13 mmol) e a reação foi agitada durante 1 h. Os voláteis foram removidos em vácuo. O residuo foi reconstituído e foi utilizada HPLC-MS preparativa (eluindo com um gradiente de MeCN/H20 contendo 0,15% de NH4OH) para se obter o produto purificado (12 mg, 26%) . 1H-NMR (500 MHz, d6-DMSO) : δ 9,20 (s, 1H) , 8,69 (s, 1H) , 7,34 (s, 1H) , 61 6,75 (s, 1H) , 2,64 (dd, 1H), 1,36 (m, 4H) , (M+H) +: 357,0. 4,49 (dt, 1H), 2,36-2,26 (m, 1,32-1,20 (m, 3,89 (s, 2H) , 1H), 1,83-1,74 2H), 1,15-1,05
2,80 (dd, 1H), (m, 1H) , 1,63-(m, 1H) ; LCMS
Passo 5. (R)-3-ciclopentil-3-[4-(2-hidroxi-5-oxo-6,7- dihidro-5H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-lH-pirazol-1-il]propanonitrilo A uma solução de 3-ciclopentil-3-[4-(2-hidroxi-5-oxo-6, 7-dihidro-5H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-lH-pirazol-1-il] propanonitrilo (0,006 g, 0,02 inmol) em cloreto de metileno (0,5 mL) contendo trietilamina (20 TL, 0,2 inmol) foi adicionado cloreto de tricloroacetilo (20 TL, 0,2 mmol). Quando a reação estava completa, HPLC-MS preparativa (MeCN/H20 contendo 0,15% de NH4OH) foi utilizada para se obter o produto purificado (3 mg, 52%) . NMR (400 MHz, d6-DMSO) : δ 11,39 (br s, 1H) , 9,37 (s, 1H) , 8,77 (s, 1H), 8, 63 (s, 1H) , 4, 68-4,59 (m, 1H) , 3,94 (S, 2H) , 3,19-3,15 (m, 2H) , 2,42-2,30 (m, 1H) , 1,86-1,75 (m, 1H) , 1,69-1,20 (m, 6H) , 1,18-1,05 (m, 1H); LCMS (M+H)+: 339, 1.
Exemplo 2: (3R) - e (3S) -3- [ (li?,2i?) -2-hidroxiciclopentil] -3- [4-(7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-lH-pirazol-1-il]propanonitrilo e (3R) - e (3S)-3-[ (IS, 25)-2- hidroxiciclopentil]-3-[4-(7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-lH-pirazol-l-il]propanonitrilo
N
'N H N '''Τ'Α
62
Passo 1. 2-(terc-butildimetilsiloxi)ciclopentanocarboxilato de (IS,2R) -etilo e 2-(terc-butildimetilsililoxi)ciclopentanocarboxilato de (1R,2S)~ etil
A uma solução de cloreto de terc-butildimetilsililo (0,524 g, 3,48 mmol) e lH-imidazol (0,473 g, 6,95 mmol) em N,N-dimetilformamida (15 mL) foi adicionado cis-2-hidroxi-l-ciclopentanocarboxilato de etilo (racémico, Acros) (0,50 g, 0. 0032 mol). A reação foi agitada durante 16 h. Mais imidazol (0,40 g, 5,8 mmol) e cloreto de terc-butildimetilsililo (0,50 g, 3,3 mmol) foram adicionados em porções e a reação foi agitada por mais 24 h. O produto foi extraído com hexano. Os extratos foram lavados com água, secos sobre sulfato de sódio, filtrados e evaporados de modo a se obter hidroxiéster protegido por TBS racémico (0,9 g) , os quais foram utilizados sem purificação adicional. NMR (400 MHz, CDC13) : δ 4,46 (ddd, 1H), 4,19 (dq, 1H), 4,01 (dq, 1H), 2,72 (dt, 1H), 2,22-2,11 (m, 1H), 1, 96-1,49 (m, 5H) , 1,26 (t, 3H) , 0,84 (s, 9H) , 0,03 (s, 3H), 0,01 (s, 3H).
Passo 2. (IS,2R)-2-(terc- butildimetilsililoxi)ciclopentanocarbaldeído e (1R,2S)~2-(terc-butildimetilsililoxi)ciclopentanocarbaldeído 63 %cr
SL
p—H θ'
O 2- (terc-(15, 2R) -2- (terc-(1R, 25) - A uma solução de de butildimetilsililoxi)ciclopentanocarboxilato etilo e de butildimetilsililoxi)ciclopentanocarboxilato etilo a partir do Passo 1 (0,86 g, 3,2 mmol) em hexanos (40 mL) a -78 °C foi adicionada, gota a gota, uma solução de 1,0 M de hidreto de diisobutilaluminio em tolueno (3,5 mL, 3,5 mmol). A mistura de reação foi agitada durante 1 h a -7 8 °C e esta temperatura foi extinta através da adição gota a gota de metanol (2 mL). O arrefecimento foi descontinuado e a mistura foi deixada a atingir a temperatura ambiente. Foi adicionada uma solução aquosa de sal de Rochelle. A mistura bifásica foi agitada vigorosamente durante 2 h e as camadas resultantes foram separadas. A camada aquosa foi extraída uma vez mais com hexanos, de seguida com três porções de acetato de etilo. Os extratos combinados foram lavados com salmoura, secos sobre sulfato de sódio, decantados e concentrados de modo a dar o produto aldeído racémico, utilizado sem purificação adicional (0,7 g, 97%). ΧΗ NMR (400 MHz, CDC13) : δ 9,74 (d, 1H) , 4,62 (ddd, 1H) , 2,68-2,61 (m, 1H) , 2,22-2,11 (m, 1H) , 1, 95-1,83 (m, 1H) , 1, 80-1,57 (m, 4H) , 0,85 (s, 9H) , 0,05 (s, 3H) , 0,04 (s, 3H) .
Etapa 3. (E)- e (Z)-3-((1R,2R)-2-(terc- butildimetilsililoxi}ciclopentil)acrilonitrilo e (E) - e (Z) -3- ((1S,2S) -2- (terc- butildimetilsililoxi}ciclopentil)acrilonitrilo 64
64 TBSO
TBSO e ó A uma solução de (15,2R)-2-(terc- butildimetilsililoxi)ciclopentanocarbaldeído e (IR, 25)-2-(terc-butildimetilsililoxi)ciclopentanocarbaldeído (0,36 g, 1,6 mmol, do Passo 2) em tolueno (9 mL) foi adicionado (trifenilfosforanilideno)acetonitrilo (0,475 g, 1,58 mmol) e a reação foi aquecida até 80 °C durante 2 h. A reação foi arrefecida até à temperatura ambiente e foi adicionada água. O produto foi extraido com três porções de éter etilico. Os extratos foram lavados com salmoura, secos sobre sulfato de sódio, decantados e concentrados para proporcionar a mistura racémica de isómeros E- e Z-olefina, a qual foi utilizada sem purificação adicional. 1H NMR (400 MHz, CDCI3) : δ 6,82 (dd, 1H, trans olefina) , 6,63 (dd, 1H, cis olefina), 5,307 (dd, 1H, trans olefina), 5,305 (dd, 1H, cis olefina), 4,24 (ddd, 1H), 4,20 (ddd, 1H), 2,96-2,86 (m, 1H) , 2,53-2,43 (m, 1H) , 1, 95-1,56 (m, 12H) , 0,87 (s, 9H) , 0,86 (s, 9H), 0,04-0,01 (singletos, em conjunto 12H).
Passo 4. (3R)~ e (3S) -3-[ (IR, 2R) -2-hidroxiciclopentil]-3- [4- (7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-lH-pirazol-1-il ] propanonitrilo e (3R)~ e (3S)-3-[ (IS, 2S)-2- hidroxiciclopentil]-3-[4 - (7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-íl)-lH-pirazol-l-il]propanonitrilo A uma solução de (E)- e (Z)-3-((IR,2R)-2-(terc-butildimetilsililoxi)ciclopentil)acrilonitrilo e (E) - e (Z) -3- ( (15, 25) -2- (terc- butildimetilsililoxi)ciclopentil)acrilonitrilo (0,40 g, 1,6 mmol, produto em bruto do Passo 3) em acetonitrilo (20 mL) foi adicionado 4-(lH-pirazol-4-il)-7-{[2- (trimetilsilil)etoxi]metil}-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidina 65 (0,50 g, 1,6 mmol) e 1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno (DBU, 0,24 mL , 1,6 mmol). A reação foi agitada durante 2 h à temperatura ambiente, e mais DBU (0,24 mL, 1,6 mmol) foi adicionado. A reação foi agitada durante 3 dias e foi concentrada. Cromatografia em coluna flash (eluindo com um gradiente de 10-40% acetato/hexanos de etilo) foi usada para purificar o produto, o qual foi em seguida tratado com 20% de TFA em DCM durante 3 h, evaporado e tratado com etilenodiamina em excesso numa solução de metanol durante a noite. Quando a remoção do grupo protetor SEM ficou completa, qualquer grupo de proteção TBS restante foi removido por agitação com Et0H/H20/c.HC1 durante 3 horas (relação de volume 10:4:3). Os produtos totalmente desprotegidos foram purificados por HPLC-MS preparativa (0,15% de NH4OH num gradiente de MeCN/H20) . Todas as frações de M+H=323 foram reunidas e evaporadas (aproximadamente 80 mg). Os produtos foram submetidos a uma série de purificações cromatográficas quirais, tal como se segue: Chiral Technologies Chiralcel OJ-H (3 x 25 cm, 5 Tm) eluindo com 20% de EtOH/80% de hexanos com um caudal de 25 mL/min para proporcionar o Pico 1 (19 mg), o seguinte pico menor não recolhido; Pico 2 (60 mg), Pico 3 (6 mg). Pico 2 era uma mistura que foi depois adicionalmente separada usando Chiral Technologies Chiralpak IA (2 x 25 cm, 5 Tm) eluindo com um gradiente de 70% de EtOH/30% de hexanos com um caudal de 8 mL/min em três componentes. Estes foram identificados Pico 2-1 (execução 2, pico 1, 1,32 mg), o qual era uma mistura de produtos, Pico 2-2 (6,5 mg) e Pico 2-3 (13,7 mg) . O Pico 2-1 foi adicionalmente dividido em três componentes utilizando Quiral Technologies Chiralpak IA (2 x 25 cm, 5 Tm) eluindo com um gradiente de 25% de EtOH/75% de hexanos com um caudal de 12 mL/min. Os produtos isolados foram marcados Pico 2-1-1 (10,5 mg); 2-1-2 (13 mg); e 2-1-3 (2,3 mg). 66
Pico 1: 1 H NMR (500 MHz , CD3OD) : δ 8,65 (s, 1H) , 8,62 (s, 1H) , 8,37 (s, 1H) , 7,49 (d, 1H), 6, 95 (d, 1H), 4,71 (ddd, 1H) , 4,28 (br t, 1H), 3 ,26 (dd, 1H), 3,21 1 (dd, 1H) , 2,53- 2,45 (m, 1H) , 1, 98- -1,73 (m, 3H) , 1, 62- 1,47 (m, 2H) , 1,38- 1,29 (m, 1H); LCMS (M+H) +: 323. Pico 2-1- 1 : XH NMR (300 MHz, CD3OD) : δ 8, 64 (s, 1H) , 8,59 (s, 1H) , 8,38 (s, 1H) , 7,49 (d, 1H) , 6, 94 (d, 1H) , 4, 90- 4,78 (m, 1H) , 3, 64 (br t, 1H), 3,21 (dd, 1H) , 3, 07 (dd, 1H) , 2,55-2,40 (m, 1H) , , 2,01-1, 58 (m, , 6H) ; LCMS (M+H)+: 323. Pico 2-1- 2 : XH NMR (500 MHz, CD3OD) : δ 8, 65 (s, 1H) , 8, 62 (s, 1H) , 8,37 (s, 1H) , 7,49 (d, 1H) , 6, 95 (d, 1H) , 4,71 (ddd , 1H) , 4,2 8 (b] c t, 1H), 3,26 (dd, 1H) , 3,21 (dd, 1H) , 2,53· -2,45 (m, 1H) , 1, 98 -1,73 (m, 3H) , 1, 62 -1,4í 3 (m, 2H) , 1,38· -1,26 (m, 1H) ; LCMS (M+H) +: 323. Pico 2-3: XH NMR (3 0 0 MH z, CD3OD) : : δ 8, 64 (s, r 1H) , 8,59 (s, 1H) , 8,38 (s, 1H) , 7,48 (d, 1H) , 6,93 (d, 1H) , 4, 90 -4,78 (m, 1H) , 3, 64 (br t, 1H), 3,21 (dd, 1H) , 3, 07 (dd, 1H) , 2,55-2,40 (m, 1H), 2,01-1,58 (m, 6H); LCMS (M+H)+: 323.
Exemplo 3. Sal de trifluoroacetato de 3-(1-hidroxiciclopentil)-3-[4-(7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-lH-pirazol-l-il]propanonitrilo racémico
N H 67
Passo 1. 1-[ (trimetilsilil)oxi]ciclopentanocarbaldeído \l βί
ο HC A reação foi realizada seguindo um procedimento similar ao descrito em Tetrahedron, 50(9), 2821-30; 1994: a uma solução de 1-[(trimetilsilil)oxi]ciclopentanocarbonitrilo (2,25 g, 12,3 mmol, preparada tal como descrito em Organometallics, 3(11), 1660-5; 1984), em tolueno (18 mL) a -45 °C, foi adicionado, gota a gota, 1,0 M de hidreto de diisobutilaluminio em hexano (17,2 mL, 17,2 mmol). A solução foi então deixada a aquecer até 0 °C e agitada durante lha esta temperatura. A mistura de reação foi vertida numa mistura de éter dietilico (25 mL) e cloreto de amónio (25 mL, saturado) . À mistura resultante, a 15 °C, foi adicionada uma solução diluída de ácido sulfúrico (preparada por diluição de 1,53 mL de H2SO4 concentrado com 50 mL de água) . A solução foi então agitada à temperatura de 5 °C durante a noite. A mistura foi extraída com três porções de éter dietilico, os extratos combinados foram lavados com solução salina, secos sobre sulfato de sódio, decantados e concentrados para se obter o produto (0,84 g, 36%) , o qual foi utilizado sem purificação adicional no Passo 2. NMR (300 MHz, CDCI3) : δ 9,47 (s, 1H) , 1,88-1,46 (m, 8H), 0,00 (s, 9H). (2Z) -3-{l-
Passo 2. (2E) - e [(trimetilsilil)oxi]ciclopentil}acrilonitrilo
68
Cianometilfosfonato de dietilo (0,912 mL, 5,64 mmol) foi adicionado, gota a gota, a uma suspensão de hidreto de sódio (0,198 g, 4,96 mmol) em tetrahidrofurano (10 mL) a 0 °C. Após a adição, a reação foi aquecida até à temperatura ambiente e agitada durante 45 minutos. A mistura foi novamente arrefecida para 0 °C e 1- [(trimetilsilil)oxi]ciclopentanocarbaldeido (0,84 g, 4,5 mmol) em tetrahidrofurano (20 mL) foi introduzido. A reação foi deixada aquecer até à temperatura ambiente e agitada durante 2 horas. Água e acetato de etilo foram adicionados à reação e as camadas foram separadas. A camada aquosa foi extraida com duas porções adicionais de acetato de etilo. Os extratos orgânicos combinados foram lavados com salmoura, secos sobre sulfato de sódio, decantados e concentrados de modo a se obter o produto como uma mistura de isómeros de olefina, utilizado sem purificação adicional no Passo 3. 1R NMR (300 MHz, CDC13): δ 6,80 (d, 1H, trans/produto principal), 6,53 (d, 1H, cis/produto menor), 5,52 (d, 1H, trans), 5,28 (d, 1H, cis), 2,06-0,76 (m, total de 16H para ambos os isómeros), 0,18 (s, 9H, produto menor), 0,13 (s, 9H, produto principal).
Etapa 3. 3- (1-hidroxiciclopentil) -3- (4-(7- ((2- (trimetilsilil)etoxi)me til)-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-lH-pirazol-l-il)propanonitrilo racémico
-'Si'" \ 69 A uma suspensão de (2E)- e (2Z)-3-{l- [(trimetilsilil)oxi]ciclopentil}acrilonitrilo (0,94 g, 4,5 mmol) e 4-(lH-pirazol-4-il)-7-{[2- (trimetilsilil)etoxi]metil}-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidina (1,4 g, 4,5 mmol) em acetonitrilo (20 mL) foi adicionado 1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno (0,67 mL, 4,5 mmol). A reação foi deixada a agitar à temperatura ambiente durante 6 dias. O acetonitrilo foi evaporado. O produto álcool desprotegido desejado foi isolado a partir da mistura de produtos de álcool protegido com TMS e de álcool desprotegido utilizando cromatografia em coluna flash, eluindo com um gradiente de 0-80% de acetato de etilo em hexanos (890 mg, 44%). ΧΗ NMR (300 MHz, CDC13) : δ 8,87 (s, 1H) , 8,56 (br s, 1H) , 8,35 (s, 1H) , 7,46 (d, 1H) , 6,84 (d, 1H) , 5,69 (s, 2H) , 4,40 (dd, 1H) , 4,03 (s, 1H) , 3,55 (dd, 2H), 3,46 (dd, 1H), 2,97 (dd, 1H), 2,04-1,27 (m, 8H), 0,93 (dd, 2H), -0,05 (s, 9H); LCMS (M+H)+: 453,1.
Passo 4. Sal de trifluoroacetato de 3-(1-hidroxiciclopentil)-3-[4 - (7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-lH-pirazol-l-il]propanonitrilo racémico
Uma solução de 3-(1-hidroxiciclopentil)-3-[4-(7-{[2-(trimetilsilil)etoxi]metil}-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-ΙΗ-pirazol-l-il]propanonitrilo racémico (0,100 g, 0,221 mmol) em cloreto de metileno (4 mL) e ácido trifluoroacético (1 mL) foi agitada durante 2 horas e os solventes foram evaporados. O residuo foi agitado com etilenodiamina (0,1 mL, 2 mmol) em metanol (4,5 mL) durante 1 hora e evaporado. O produto em bruto foi reconstituído em metanol e purificado por dois passos sucessivos de cromatografia utilizando HPLC-MS preparativa (eluindo com um gradiente de acetonitrilo/H20 contendo 0,15% de NH4OH para a primeira passagem, seguido por um gradiente de 70 acetonitrilo/H20 contendo 0,1% de TFA para segunda passagem), de modo a proporcionar o produto racémico como o
sal trifluoroacetato. 2H NMR (400 MHz, d6-DMSO) : δ 12,72 (br s, 1H), 8,94 (s, 1H) , 8,86 (s, 1H) , 8,49 (s, 1H), 7,82 (s, 1H) , 7,21 (s, 1H) , 4,80 (dd, 1H), 3 ,51 (dd, 1H), 3,22 (dd, 1H), 1,79-1,42 (m, 7H), 1 ,25-1, 15 (m, 1H); LCMS (M+H) +: 323, 1.
Exemplo A
Os metabolitos 1-39 foram isolados a partir de urina, plasma ou fezes humanas, de rato ou de cão, após a administração de Composto I em ligação com estudos farmacocinéticos e toxicocinéticos A identidade dos metabolitos foi determinada após o isolamento do metabolito utilizando métodos de HPLC. O método utilizado e os tempos de retenção correspondentes dos metabolitos são apresentados na Tabela 2. Análise tandem de espectroscopia de massa MS/MS e experiências de MSn de ordem superior foram realizadas conforme necessário de modo a elucidar a informação estrutural. O Composto I demonstra um ião molecular protonado a m/z 307, e um espectro de ião do produto mostrando sinais a m/z 266, 186 e 159. O ião fragmento a m/z 266 é consistente com a perda da fração de carbonitrilo. O ião fragmento diagnóstico a m/z 186 é indicativo da perda da fração intacta ciclopentil-propanonitrilo. O ião fragmento a m/z 159 indica a perda da ciclopentil-propanonitrilo em conjunto com a clivagem através do anel de pirazole do Composto I.
Os compostos metabolitos 1, 2, 27 e 29 foram observados principalmente na urina de sujeitos humanos, com niveis 71 vestigiais de compostos 27 e 29 observados no plasma. Uma análise completa de espectrometria de massa demonstrou um ião molecular protonado a m/z 339, consistente com a bis-hidroxilação do Composto I. Fragmentação do ião produto a m/z 339 produz espectros virtualmente idênticos para estes metabolitos, com os iões observados para m/z 321, 186, 159 e 154. 0 ião a m/z 321 é consistente com a perda de água e sugere que pelo menos uma hidroxilação pode estar no anel ciclopentilo. Os iões em m/z 186 e m/z 159 são consistentes com uma pirazole-pirrolopirimidina intacta. 0 ião a m/z 154 é consistente com a perda neutra da totalidade da fração pirazole/pirrolopirimidina não modificada. Iões fragmento menores a m/z 298 e m/z 280 sugerem a perda dos elementos de acetonitrilo, com e sem a perda fácil de água, restringindo adicionalmente a localização das hidroxilações à fração ciclopentilo. Isto é suportado adicionalmente pelo ião a m/z 237, o que é consistente com a perda do ciclopentilo modificado, deixando o resto da molécula inalterada. O composto 31 foi identificado na urina de sujeitos humanos. Uma análise completa de espectrometria de massa demonstrou um ião molecular protonado a m/z 339, consistente com a adição de 32 unidades de massa atómica (amu) ao Composto I. Fragmentação de ião produto do ião m/z 339 produz iões fragmento a m/z 311, 218 e 191. O fragmento principal a m/z 218 que é consistente com a adição de 32 amu à fração pirazole-pirrolopirimidina. O ião fragmento a m/z 191 é consistente com uma perda de CHN da fração pirazole da pirazole-pirrolopirimidina bis hidroxilada putativa, restringindo a localização da(s) modificação(ões) à pirrolopirimidina. O ião fragmento a m/z 311 provavelmente decorre de clivagem inicial da ligação amida, seguida pela perda de CO da pirrolidinona. A atribuição 72 estrutural do Composto 31 utilizando apenas espectrometria de massa conduziu a um resultado ambiguo, deste modo, o Composto 31 foi isolado a partir de urina humana e analisado por 3Η e 13C NMR. A estrutura 31 é identificada como um metabolito amida-álcool da fração pirrolopirimidina saturada do Composto I. 0 espectro NMR de protões de 31 tem um singleto a δ 3,56 com uma intensidade de 2H. Este singleto tem uma correlação de longo alcance com um carbono em δ 177,9, consistente com uma amida. Em adição, ocorre um aumento no efeito nuclear de Overhauser (nOe) entre H3 e H9. 0 composto 32 foi encontrado no plasma e na urina de sujeitos humanos. Análise completa de espectrometria de massa demonstrou um ião molecular protonado a m/z 339, consistente com a adição de 32 amu ao Composto I. Fragmentação do ião produto do ião m/z 339 produz iões fragmento a m/z 218 e 191. 0 fragmento principal a m/z 218, o que é consistente com a adição de 32 amu à fração pirazole-pirrolopirimidina. 0 ião fragmento a m/z 191 é consistente com a perda de CHN a partir da fração pirazole-pirrolopirimidina bis hidroxilada putativa, restringindo a localização da(s) modificação(ões) à pirrolopirimidina. A atribuição estrutural do Composto 32 utilizando apenas espectrometria de massa conduziu a um resultado ambiguo, deste modo, o Composto 32 foi isolado a partir de urina humana e analisado por 3Η e 13C NMR. A estrutura do Composto 32 é identificada como um metabolito ceto-álcool da fração pirrolopirimidina saturada de Composto I. 0 espectro NMR de protões de 32 tem um singleto a δ 3,82, que tem uma intensidade de 2H e mostra uma correlação de longo alcance no carbono em δ 191,5, consistente com uma cetona. Não foi observado nenhum aumento no efeito nuclear de Overhauser (nOe) a partir de H2 para qualquer outro protão. 73 0 Composto 4 0 foi observado no plasma e na urina de sujeitos humanos. Uma análise completa de espectrometria de massa demonstrou um ião molecular protonado a m/z 341, consistente com a adição de 34 amu ao Composto I. Fragmentação do ião produto do ião m/z 341 produz iões fragmento a m/z 323, 220, 202 e 175. O ião fragmento a m/z 323 surge a partir da perda de água do diol pirrolidina. Iões fragmento a m/z 220 e 202 são consistentes com uma pirrolopirimidina saturada duplamente hidroxilada, com e sem observação de perda fácil de água. O ião observado a m/z 175 é consistente com a perda de CHN partir da fração pirazole da pirrolopirimidina pirazole saturada duplamente hidroxilada a seguir a perda fácil de água. O composto 40 é identificado como 3-ciclopentil-3-(-(5,6-dihidroxi-6,7-dihidro-5H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-lH-pirazol-1-il)propanonitrilo. com uma
Os conjugados de metabolitos hidroxilados isoladamente do Composto I tendo um m/z de 499 foram observados na urina de humanos, com dois dos sete conjugados também observados em quantidades vestigiais no plasma humano. Fragmentação do ião produto inicial produz espectros virtualmente idênticos para seis destes metabolitos, sendo observado um ião a m/z 323, consistente com a perda do conjugado glucuronido. Δ fragmentação do ião produto (MS3) destes iões fragmento m/z 323 demonstrou novamente espectros de massa praticamente idênticos, com iões fragmento a m/z 305, 186 e 159. O ião fragmento encontrado a m/z 305 é consistente com a perda de água (18 amu), sugerindo hidroxilação e posterior fragmentação induzida por colisão numa fração saturada da molécula, restringindo o local de modificação à fração ciclopentilo. Os iões fragmento a m/z 186 e m/z 159 são consistentes com uma pirazole-pirrolopirimidina não modificada. Iões fragmento adicionais menores eram demasiado fracos para serem atribuídos com certeza. A identidade destes metabolitos putativos foi confirmada através da hidrólise dos conjugados glucuronidos isolados com β-glucuronidase de modo a revelar a aglicona, a qual foi depois sujeita a análise por HPLC-MS, onde os tempos de retenção e os espectros de massa das agliconas libertadas foram equivalentes aqueles dos padrões de metabolitos hidroxilados isolados. As agliconas destes metabolitos conjugados glucuronidos correspondem aos metabolitos 2-hidroxilo (Metabolito 9, Tabela 1) e aos metabolitos 3-hidroxilo (Metabolito 8, Tabela 1). A aglicona do sétimo metabolito glucuronido conjugado, composto 42, corresponde a um metabolito hidroxilado isoladamente da fração pirazole-pirrolopirimidina do Composto I, o qual não foi observado independentemente no plasma ou na urina de seres humanos. Uma análise completa de espectrometria de massa demonstrou um ião molecular protonado a m/z 323, consistente com a adição de 16 amu ao Composto I. Fragmentação do ião produto do ião m/z 323 produz um fragmento primário a m/z 202 que é consistente com a adição de 16 amu à fração pirazole-pirrolopirimidina. O ião fragmento a m/z 175 é consistente com a perda de CHN partir da fração pirazole da pirazole-pirrolopirimidina hidroxilada putativa, restringindo a localização da modificação à pirrolopirimidina. A estrutura do metabolito composto 42 é identificada como um conjugado de glucuronido de uma fração pirrolopirimidina hidroxilada isoladamente do Composto I. O composto metabolito 41 foi encontrado na urina de sujeitos humanos. Uma análise completa de espectrometria de massa indicou um ião molecular protonado a m/z 583, consistente com a conjugação glucuronido do Composto I não 75 modificado. Fragmentação de ião produto do ião m/z 583 produz um fragmento primário a m/z 307 que é consistente com a perda de um glucuronido intacto. Iões fragmento menores a m/z 186 e m/z 159 são consistentes com aqueles observados para o Composto I. Fragmentação MS3 do ião fragmento m/z 307 também revelou iões fragmento a m/z 186 e m/z 159. Composto 41 é identificado como um conjugado glucuronido ligado através do N do Composto I.
Tabela 2
Composto m/z Método de análise Tempo de retenção (min) Descrição do metabolito 1 339 A4 4,3 Dihidroxilação da fração ciclopentilo 2 339 Δ4 4,8 Dihidroxilação da fração ciclopentilo 3 499 Δ3 4,8 Ácido 6-(3-(1-(4-(7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-lH-pirazol-l-il)-2-cianoetil)ciclopentiloxi)-3,4,5-trihidroxitetrahidro-2H-piran-2-carboxílico 4 499 A3 5, 3 O-glucuronidação da fração ciclopentil 5 499 A3 5, 8 O-glucuronidação da fração ciclopentil 6 339 A4 5,9 Dihidroxilação 7 499 A3 6, 3 O-glucuronidação da fração ciclopentil 8 499 A3 6, 8 Ácido 6-(3-(1-(4-(7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-lH-pirazol-l-il)-2-cianoetil)ciclopentiloxi)- 76 3,4,5-trihidroxitetrahidro-2H-piran-2-carboxílico 9 339 Δ4 8,1 Hidroxilação em ciclopentilo e pirazole ou frações pirrolopirimidina 10 339 Δ4 8,4 Hidroxilação em ciclopentilo e pirazole ou frações pirrolopirimidina 11 355 AI 8,5 Tri-hidroxilação em frações ciclopentilpropanonitrilo 12 355 AI 14,6 Tri-hidroxilação em frações ciclopentilpropanonitrilo 13 499 A1/A3 15,3 O-glucuronidação na fração ciclopentilpropanonitrilo 14 499 A1/A3 18,6 O-glucuronidação na fração ciclopentilpropanonitrilo 15 499 A1/A3 25,3 O-glucuronidação na fração ciclopentilpropanonitrilo 16 321 A1/A3 26,5 Cetona em fração ciclopentilpropanonitrilo 17 339 AI 28 Hidroxilação em frações ciclopentilpropanonitrilo e pirrolidina 18 323 A1/A3 35 Hidroxilação na fração ciclopentilpropanonitrilo 19 499 A1/A3 42,2 O-glucuronidação na fração ciclopentilpropanonitrilo 20 355 AI 44,2 Di-hidroxilação na fração ciclopentilpropanonitrilo e hidroxilação na fração pirrolidina 21 355 AI 51,4 Di-hidroxilação na fração ciclopentilpropanonitrilo e hidroxilação na fração pirrolidina 22 339 AI 52,2 Hidroxilação em frações ciclopentilpropanonitrilo e 77 pirrolidina 23 339 AI 55,8 Hidroxilação em frações ciclopentilpropanonitrilo e pirrolidina 24 355 Al 4,7 Dihidroxilação na fração ciclopentilpropanonitrilo e hidroxilação na fração pirrolidina 25 339 AI 7,7 Dihidroxilação na fração ciclopentilpropanonitrilo 26 339 Al 8,4 Dihidroxilação na fração ciclopentilpropanonitrilo 27 339 Al 11,9 Dihidroxilação na fração ciclopentilpropanonitrilo 28 323 A1/A3 12,4 Dihidroxilação na fração ciclopentilpropanonitrilo 29 339 Al 12,7 Dihidroxilação da fração ciclopentilpropanonitrilo 30 515 A3 9, 6 Dihidroxilação da fração ciclopentilpropanonitrilo e O-glucuronidação 31 339 A3 27 3-ciclopentil-3-(4-(2,6-dioxo-3,5,6,7-tetrahidro-2H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-lH-pirazol-1-il)propanonitrilo 32 339 A3 29 3-ciclopentil-3-(4-(2-hidroxi-5-oxo-6, 7-dihidro-5H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-lH-pirazol-1-il)propanonitrilo 33 323 Al 55,8 Hidroxilação de frações pirrolopirimidina 34 499 A1/A3 37,5 O-glucuronidação de fração ciclopentilpropanonitrilo 35 339 A6 5,1 3 - (4 - (7H-pirrolo[2,3 — d]pirimidin-4-il)-lH-pirazol- 78 1-il)-3- (1,2- dihidroxiciclopentil)propanon itrilo 36 323 - - 3 - (4-(7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-lH-pirazol-1-il)-3- (1- hidroxiciclopentil)propanonit rilo 37 323 Δ6 8,1 3-ciclopentil-3-(4-(6-oxo-6,7-dihidro-5H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-lH-pirazol-1-il)propanonitrilo 38 339 Δ6 5,4 3- (3-hidroxiciclopentil)-3-(4- (6-oxo-6,7-dihidro-5H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-lH-pirazol-1-il)propanonitrilo 39 371 A3 17,7 Hidroxilação quádrupla 40 341 A7 27,7 3-ciclopentil-3-(4-(5, 6-dihidroxi-6,7-dihidro-5H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-lH-pirazol-1-il)propanonitrilo 41 483 A7 36,0 Ácido 6-(4-(1-(2-ciano-l-ciclopentiletil)-lH-pirazol-4 — i1)-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-3, 4,5-trihidroxitetrahidro-2H-piran-2-carboxílico 42 499 A7 37,7 Hidroxilação da fração pirrolopirimidina e 0-glucuronidação Método AI: Biotransformação de 14C-Composto I em amostras de plasma, urina e fecais de humanos, cão e ratinho 79
Preparação de Amostras para o estabelecimento de perfil de metabolitos:
Plasma:
As amostras de plasma de todos os sujeitos foram agrupadas por sujeito e/ou ponto no tempo. As amostras de plasma agrupadas foram preparadas para análise de HPLC- radiométrica tal como se segue: aliquotas de amostras de plasma agrupadas foram inicialmente extraídas com cerca de dois volumes (w/v) equivalentes de 1% de ácido fórmico em acetonitrilo de grau HPLC, seguido por vórtex vigoroso, e por centrifugação, de modo a remover as proteínas do plasma desnaturadas. 0 sobrenadante foi reservado e passado através de um cartucho precondicionado Waters C-18 de extração em fase sólida (SPE), e o filtrado foi retido. 0 cartucho SPE foi retido. 0 restante pellet de plasma foi de seguida extraido três vezes com 1% de ácido fórmico em acetonitrilo/água (90/10) de grau HPLC, com centrifugação após cada extração. Todos os sobrenadantes foram reservados. Cada sobrenadante de extração ácido fórmico/acetonitrilo/água foi utilizado para eluir o cartucho SPE. O cartucho de SPE foi de seguida enxaguado com 1% de ácido fórmico em metanol. Todos os eluentes foram retidos, combinados e evaporados sob um fluxo de azoto a 30 °C. O restante desta extração foi reconstituído em aproximadamente 0,6 mL de 0,1% de ácido fórmico em água, agitado em vórtex e centrifugado de modo a remover a matéria particulada. O sobrenadante foi então analisado por HPLC-Radiometria de Fluxo e HPLC-MS. 80
Urina :
As alíquotas de quantidades aproximadamente iquais de urina de cada um dos sujeitos foram reunidas de modo a representar intervalos de tempo pós-dose apropriados. Anteriormente à análise por HPLC-radiométrica, cada amostra de urina reunida foi centrifugada a 4.000 rpm durante 10 minutos de modo a remover matéria particulada, depois analisadas diretamente.
Fezes:
As aliquotas de homogenatos de fezes de cada sujeito foram reunidas para representar intervalos de tempo após a dose apropriados. Os homogenatos fecais reunidos foram preparados para análise por HPLC-radiométrica da seguinte forma:
As aliquotas de aproximadamente 5 gramas de homogeneizado fecal foram extraídas inicialmente com aproximadamente dois equivalentes (w/v) de volumes de água Millipore, seguidas de centrifugação para remover os sólidos. O sobrenadante foi reservado e passado através de um cartucho de extração em fase sólida precondicionado Waters C-18. O cartucho SPE foi reservado. O depósito fecal restante foi então extraido três vezes com 1% de ácido fórmico em acetonitrilo/água (90/10) de grau HPLC, com centrifugação após cada extração. Todos os sobrenadantes foram reservados. Cada sobrenadante de extração ácido fórmico/acetonitrilo/água foi utilizado para eluir o cartucho SPE. Todos os eluentes foram retidos, combinados e evaporados sob um fluxo de azoto a 30 °C. O restante desta extração foi reconstituído em aproximadamente 2,0 mL de 0,1% de ácido fórmico em água, vortexado e centrifugado de modo a remover a matéria 81 particulada. 0 sobrenadante foi então analisado por HPLC-Radiometria de Fluxo e HPLC-MS. Método analítico HPLC-Radiometria de Fluxo:
Todas as amostras foram analisadas por HPLC-Radiometria de Fluxo ou HPLC-MS utilizando sistemas analíticos que eram tão idênticos quanto praticável. 0 sistema de HPLC-Radiometria de Fluxo consistiu numa bomba Agilent HP1100 série Quaternário, auto-amostrador e detetor de UV ligado a um detetor de cintilação de fluxo Raytest Ramona-90 com uma célula de cintilação líquida de 500 yL. A separação do Composto I e dos seus metabolitos foi conseguida com uma coluna de HPLC Waters Symmetry C-18, 4,6 x 250 mm, coluna de HPLC com tamanho de partícula de 5 ym. A fase móvel "A" consistiu em 0,1% de ácido fórmico em água de grau HPLC, com a fase móvel "B" consistindo em metanol/acetonitrilo de grau HPLC (1:1) . A eluição dos analitos foi obtida através do uso de um gradiente linear crescente de fase móvel "B". Dois métodos de eluição em gradiente diferentes foram utilizados em diversas vezes, conforme necessário. Condições cromatográficas para estes dois métodos são descritas de seguida nas Tabelas 3 e 4. Método analítico HPLC-Espetroscopia de Massa: O sistema HPLC-Radiometria de Fluxo consistia numa bomba Agilent HP1100 série Quaternário, e de um auto-amostrador Leap Technologies CTC-PAL ligado a um Applied Biosystems API 4000 Qtrap, operado em modo de deteção de iões positivos. Uma análise completa (MS) e análise de dados dependente de iões produto (MS2) foram utilizadas na caracterização de metabolitos do Composto I. Transições MRM selecionadas também foram utilizadas para analisar e 82 identificar metabolitos previamente identificados e caracterizados. A separação do Composto I e dos seus metabolitos foi conseguida com uma coluna de HPLC Waters Symmetry C-18, 4,6 x 250 mm, coluna de HPLC com tamanho de particula 5 ym. A fase móvel "A" consistiu em 0,1% de ácido fórmico em água de grau HPLC, com a fase móvel "B" consistindo em metanol/acetonitrilo de grau HPLC (1:1). A eluição dos analitos foi realizada através do uso de um gradiente linear crescente da fase móvel "B". Dois métodos de eluição em gradiente diferentes foram utilizados em diversas vezes, conforme necessário. As condições cromatográficas para estes dois métodos são descritas de seguida nas Tabelas 3 e 4.
Tabela 3
Condições cromatográficas Tempo (min) %B Fluxo (pL/min) 0,0 10 1000 45,0 20 1000 50,0 50 1000 55,0 90 1000 57,0 90 1000 57,1 10 1000 65,0 10 1000
Tabela 4
Condições cromatográficas Tempo (min) %B Fluxo (pL/min) 0, 0 10 1000 45, 0 20 1000 90,0 40 1000 92,0 90 1000 97,0 90 1000 97,1 10 1000 102,0 10 1000 83 MÉTODO A2: Biotransformação do Composto I: Isolamento de metabolitos
Isolamento de metabolitos da urina humana:
Extração em fase sólida utilizando cartuchos 20 cc Waters HLB SPE (1 grama de adsorvente) foi utilizada para concentrar metabolitos do composto I a partir de amostras de urina reunidas. Os cartuchos foram inicialmente condicionados com 100% de metanol de grau HPLC, e depois com água Millipore. O cartucho foi então imediatamente carregado com até 10 mL da amostra de urina não processada. O cartucho foi sequencialmente eluido utilizando várias concentrações de metanol de grau HPLC em água (Tabela 5).
Tabela 5
Operação Composição do solvente Volume Condição 100% metanol 10 mL Condição 100% água Millipore 10 mL Carregar Urina 7-10 mL Eluir 5% metanol em água 10 mL Eluir 25% metanol em água 10 mL Eluir 50% metanol em água 10 mL Eluir 75% metanol em água 10 mL Eluir 100% metanol em água 10 mL
As alíquotas da urina inicial, o último volume de carga e todos os volumes de lavagem/eluição foram analisados por LC-MS para a presença do Composto I e metabolitos de interesse. Não se observou uma quantidade significativa dos compostos I nem dos seus metabolitos em qualquer um dos volumes de carga ou lavagens/eluições até 25% de metanol em água Millipore. Não foram observadas quantidades significativas de fármaco ou metabolitos nas aliquotas de 84 eluição de 100% de metanol. Volumes de eluição a partir das eluições de metanol de 50% e 75% foram cada um reduzidos em volume utilizando o evaporador centrífugo Genevac e reconstituídos até um volume final de ~2 mL antes de serem injetados em série no LC-MS para a recolha de frações dos metabolitos de interesse.
Condições analíticas:
As amostras foram analisadas por LC-MS utilizando um Finnigan LCQ Deca XP Plus, ligado a uma pilha HPLC Binária de Shimadzu consistindo num auto-amostrador Sil-HTC e num sistema controlo e duas bombas LC de alta pressão Sil lOADVp. A espectrometria de massa foi operada no modo de deteção de iões positivos, utilizando análise dependente de dados, de modo a produzir dados MS e MS2 dependentes de dados. Um detetor de UV Shimadzu, Sil SPD10 AVp, foi utilizado no comprimento de onda de deteção de 254 nm, de modo a monitorizar o eluente de HPLC em concertação com o espectrómetro de massa. A fase móvel "A" consistiu em 5 mM de formato de amónio, cujo pH foi ajustado para pH 3,2 com ácido fórmico (aproximadamente 0,1% em volume). A fase móvel "B" consistiu em 90% de acetonitrilo/10% de metanol. A coluna de HPLC utilizada foi um Zobax XDB C-18, 3,0 mm x 150 mm, com dimensão de partícula de 5, 0 Tm. A eluição do analito foi realizada através da utilização de um gradiente linear crescente da fase móvel "B". As condições cromatográficas para a análise de escala analítica estão descritas na Tabela 6 abaixo. 85
Tabela 6
Condições cromatográficas Tempo (min) %B Fluxo (pL/min) 0,0 10 300 1,0 10 300 45, 0 40 300 50, 0 90 300 54, 0 90 300 54, 1 10 300 60, 0 10 300
Condições analíticas Semi-Preparativas:
As amostras foram analisadas por LC-MS tal como acima com as seguintes modificações: A coluna de HPLC utilizada foi uma coluna Phenomenex Polar RP 10 mm x 150 mm tamanho de partícula 5 Tm. O fracionamento inicial foi levado a cabo usando acetato de amónio neutro como a fase "A", com uma segunda etapa de limpeza dos picos recolhidos individuais levada a cabo utilizando 0,025% de ácido fórmico em água como a fase "A". A fase móvel "B" consistiu em 90% de acetonitrilo/10% de metanol. A eluição inicial dos analitos e a recolha automática de frações foi realizada através da utilização de um gradiente linear crescente da fase móvel "B". As condições cromatográficas para a análise semi-preparativa inicial estão apresentadas na Tabela 7 em baixo, mas a %B foi otimizada, conforme necessário, para cada metabolito individual na segunda etapa de limpeza. 86
Tabela 7
Condições cromatográficas semi-preparativas Tempo (min) %B Fluxo (pL/min) 0,0 7 1,75 1,0 25* 1,75 24,0 35* 1,75 24,1 90 1,75 28,0 90 1,75 28,1 7 1,75 35, 0 7 1,75 * Otimizado para cada metabolito inc .ividual na segunda etapa de fracionamento 0 fluxo de eluente das análises semi-preparativas foi separado utilizando tubagem PEEK , com ~1,65 mL/min do fluxo de eluente sendo utilizado para a recolha de frações, e o restante indo para o espectrómetro de massa. A composição do fluxo de eluente foi monitorizada por experiências selecionadas MS e MS-MS. As frações contendo o analito de interesse foram recolhidas automaticamente através da utilização da válvula de desvio em conjunto com um coletor de frações. MÉTODO A3: Biotransformação do Composto I em amostras de plasma e urina humanas e de rato
Preparação da amostra:
As amostras de plasma e urina de animais e seres humanos que tenham sido doseadas oralmente com o Composto I foram obtidas após estudos de dose única e/ou de dose múltipla. Amostras de plasma residual para cada sujeito foram reunidas por agrupamento de média ponderada de tempo. As aliguotas das amostras de plasma reunidas (150 pL) foram 87 precipitadas com dois volumes de acetonitrilo, misturadas com vórtex e depois centrifugadas. Os sobrenadantes foram removidos e utilizados para análise por LC-MS. Para os humanos, as amostras de urina de cada indivíduo no estudo foram reunidas para representar 0-12 horas no Dia 1 (estudo de dose única) e Dia 10 (estudo de doses múltiplas) do estudo clinico. As amostras de urina foram centrifugadas a ~15000 x g durante 10 minutos antes da análise e injetadas diretamente.
Análise da amostra:
As amostras foram analisadas usando ionização por electropulverização LC-MS com um espectrómetro de massa Thermo Finnigan LCQ Deca-XP Plus Ion-Trap (Thermo Fisher Scientific Waltham, Massachusetts, EUA), operado em modo de ionização positiva. Análise dependente de dados foi utilizada para gerar os dados iniciais MS e MS2. Experiências MSn de ordem superior foram realizadas, sempre que necessário, de modo a elucidar a informação estrutural. O espectrómetro de massa foi acoplado a um amostrador automático/controlador combinado Shimadzu Sil HT-C, combinado com um sistema de bomba Shimadzu LC-10A de gradiente binário (Shimadzu Scientific Instruments, Colombia, MD, EUA). As condições do gradiente estão descritas na Tabela 8. A separação do Composto I e os seus metabolitos foi conseguida utilizando uma coluna de HPLC Zorbax XDB C-18 (3,0 x 150 mm, 3,5 ym) (Agilent, Santa Clara, CA, EUA) com uma taxa de fluxo da fase móvel de 300 yL/min. A fase móvel "A" consistiu em 5 mM de formato de amónio em água Millipore, cujo pH foi ajustado para pH 3,2 com ácido fórmico. A fase móvel "B" consistiu em 90% de acetonitrile/10% de metanol.
Tabela 8. Esquema de eluição de gradiente HPLC
Tempo % Fase B Móvel 0,0 10 1,0 10 45, 0 40 50,0 90 54,0 90 54,1 10 60,0 10 MÉTODO A4: Método para caracterização de metabollto da bllls, plasma e urina de Rato
Amostras de urina, fezes e bílis de ratos administrados com o Composto I foram reunidas. Aproximadamente 30% de cada amostra foi reunido de cada ponto no tempo, de tal modo que 90% da dose excretada de um ratinho estava contida numa única amostra. As amostras de cada ratinho foram analisadas separadamente. As amostras de fezes foram extraídas com acetonitrilo e a recuperação de extração determinada por contagem de cintilação líquida (LSC) do extrato e combustão e LSC do depósito não extraído. Quando disponível, padrões de metabolitos foram utilizados para confirmar estruturas. Os picos correspondendo a <5% da dose administrada não foram reportados a menos que indicado em contrário.
Amostras de urina, fezes, bílis e/ou plasma foram analisadas por HPLC e espectroscopia de massa de modo a determinar o peso molecular de quaisquer metabolitos marcados radioactivamente e obter informação estrutural destes metabolitos. 89 MÉTODO A5: Modo de isolamento
As amostras de urina do Composto I dos estudos farmacocinéticos e toxicocinéticos foram reunidas a partir de animais individuais da mesma espécie, ou seja, do cão ou do ratinho. As amostras de urina foram extraidas com acetato de etilo numa proporção de volume de 1 para 1 três vezes. As frações de extração de acetato de etilo foram combinadas e os voláteis foram removidos usando um evaporador rotativo. 0 resíduo resultante foi dissolvido em acetonitrilo:água (1:1, v/v), e a solução foi submetida a purificação por HPLC preparativa. 0 isolamento de cada metabolito foi conseguido utilizando as três condições de HPLC abaixo, em ordem sequencial. 0 extrato concentrado foi purificado usando uma fase móvel consistindo em 0,1% de TFA em água (solvente A) e 0,1% de TFA em acetonitrilo (solvente B), numa coluna Zobax SB C18 (19 x 150 mm, 5 Tm) usando um gradiente de 5% a 60% de solvente B durante 20 minutos, e uma taxa de fluxo de 15 mL/min. 1. As frações recolhidas a partir da primeira purificação por HPLC foram em seguida adicionalmente purificadas usando uma fase móvel consistindo de 0,1% de TFA em água (solvente A) e metanol (solvente B), numa coluna Zobax SB C18 (9,6 x 150 mm, 5 Tm) utilizando um gradiente de 5% a 95% de solvente B durante 25 minutos, e uma taxa de fluxo de 4 mL/min. 2. Cada fração recolhida a partir da segunda purificação com [M+H]+ = 321 e 323 foi sujeita a separação quiral utilizando uma fase móvel consistindo em 15% de etanol e 85% de hexanos ou 30% de etanol e 70% de hexanos, numa 90 coluna quiral (ChiralCel OD-H, 20 x 250 mm, 5 Tm) , com uma taxa de fluxo de 15 mL/min. MÉTODO A6: Método de Análise
Os tempos de retenção para 35, 37 e 38 foram obtidos a partir da análise por HPLC utilizando uma coluna Zorbax SB C18 (4,6 x 150 mm, de 80Â, 3,5 Tm), a uma temperatura de coluna de 40 °C, utilizando uma fase móvel consistindo em 0,05% de TFA em água (solvente A) e 0,05% de TFA em acetonitrilo (solvente B) , com uma taxa de fluxo de 1 mL/min, utilizando um esquema de eluição por gradiente apresentado na Tabela 9. Uma deteção de UV em linha foi realizada a 220 nm.
Tabela 9. Esquema de eluição gradiente
Tempo (min) % ACN 0 5 15 95 18 95 18,5 5 24 5 MÉTODO A7: Método alternativo de Análise
Os tempos de retenção para 40, 41 e 42 foram obtidos a partir da análise por HPLC utilizando uma coluna Waters Atlantis® T-3 (4,6 x 150 mm, 3,5 ym) (Waters Corporation,
Milford, Massachusetts, EUA) com uma taxa de fluxo da fase móvel de 400 yL/min. A fase móvel "A" consistiu em 5 mM de formato de amónio em água Millipore, cujo pH tinha sido ajustado para pH 3,2 com ácido fórmico. A fase móvel "B" consistiu em 100% de metanol. A condição inicial da fase 91 móvel foi de 90% de fase móvel "A"/10% de fase móvel "B", com um gradiente em degrau para 27% de fase móvel de "B" num minuto. O gradiente inicial progrediu em seguida de forma linear para 52% de fase móvel "B" em 57 minutos, seguido de um segundo gradiente linear de 95% de fase móvel "B" em 10 minutos. Um período de cinco minutos de lavagem da coluna a 95% da fase móvel "B" teve lugar e foi seguido por um retorno às condições iniciais e uma reequilibração da coluna durante 8 minutos antes da próxima injeção analítica. 100% do eluente da coluna foi encaminhado através de um detetor de UV Shimadzu com comprimento de onda fixo, SPD-lOAVp (Shimadzu Scientific Instruments, Columbia, Mariland, EUA) monitorizando λ 254 nm. Após a saída do detetor de UV, o fluxo de eluente foi dividido utilizando um "t" PEEK de modo a permitir que cerca de 100 pL de eluente sejam introduzidos através de ionização por electropulverização para o espectrómetro de massa. A voltagem da fonte de electropulverização foi fixada em 4,5 kV, com uma temperatura capilar de 325 °C, gases de varrimento e bainha foram fixados em 50 e 30 (unidades arbitrárias), respetivamente. Configurações de MS/MS dependentes de dados iniciais incluíram uma largura de isolamento de 2,0 amu e uma configuração para a colisão de energia de 42. Todas as outras configurações e potenciais de instrumentos foram otimizados de modo a se obter um rácio máximo de sinal-ruído para o Composto I. MÉTODO A8: Hidrólise enzimática de metabolitos glucuronidos do Composto I.
Metabolitos glucuronidos conjugados isolados do Composto I foram incubados com β-glucuronidase com a reação a prosseguir até à conclusão em todos os casos, resultando na aglicona associada, a qual foi analisada utilizando o mesmo 92 método de LC-MS, tal como descrito acima. Os tempos de retenção e espectros de massa das agliconas libertadas foram comparados com os tempos de retenção e espectros de massa dos padrões de metabolitos hidroxilados isolados do Composto I de modo a atribuir a identidade do conjugado.
EXEMPLO B
As amostras de metabolito de peso molecular 323 foram consideradas como sendo metabolitos contendo hidroxilo e foram dissolvidas em 200 pL de CD3OD, obtido da Isotec. As amostras de peso molecular 321 foram consideradas como contendo uma fração cetona e foram dissolvidas em 200 pL de CDCI3, obtido da Isotec. As amostras que tinham um peso molecular diferente do descrito acima foram dissolvidas em 200 pL de DMS0-d6, também obtido da Isotec. Após a dissolução, cada amostra foi colocada num tubo de NMR de 3 mm, obtido da Wilmad Glass. As amostras foram preparadas imediatamente antes da análise.
As amostras foram analisadas utilizando um espectrómetro de NMR Varian INOVA operando a 500 MHz para 1H e a 125 MHz para a 13C. Foi utilizada uma sonda de 3 mm de deteção inversa de gradiente de ressonância tripla. A amostra foi mantida a 30 °C durante o tempo em que a aquisição de todos os dados estava a ocorrer. A sonda foi bloqueada e ajustada para cada amostra. Outras experiências de NMR foram realizadas de modo a obter os dados necessários para determinar a estrutura.
Composto 31 αΗ (500 MHz, DMSO-D6) : δ 8,58 (s, 1H) , 8,23 (s, 1H), 4,47 (td, 1H) , 3,56 (S, 2H), 3,18 (dd, 1H), 3,13 (dd, 1H), 2,35 (m, 1H) , 1,79 (m, 2H) , 1,59-1,39 (m, 4H) , 1,29 (m, 2H). 93
Composto 32 (500 : MHz, DMSO-D6) : δ 9, 24 (s , 1H) , 8, 66 (s, 1H) , 4,56 (td, 1H) , 3, 82 (s, 2H), 3 ,17 (dd, 1H) , 3,1 .1 (dd, 1H) , 2,35 (m, 1H) , 1 ,79-1 ,12 (m, 4H) , 1,61-1 ,45 (m, 4H) • Composto 35 XH (500 MHz, DMSO-D6) : δ 12 , 25 (s, 1H) r 8,82 (s, 1H) , 8,73 (s, 1H), 8, 37 (s, 1H), 7, 64 (m , 1H) , 7, 08 (m, 1H) , 4, 93 (dd, J=ll, 6, 3, ,3, 1H), 3, 76 (d , J= = 4,8, 1H) r 3,52 (dd, J=17 ,2, 11,7, 1H) , 3,08 (dd, J=17, 4, 3, 6) , 2, 04 (m, 1H) , 1,76 (m, 1H) , 1, 63 (m, 1H) , 1,54 (m, 2H) , 0, 95 (m, 1H) . Composto 37 (500 MHz, CDC13) : δ 8,71 (s, 1H) , 8, 17 (s, 1H) , 8,00 (s, 1H) , 4 ,22 ( td, J=9, 6, 3,7, 1H) , 3,71 - (£ b 2H) , 3,09 (dd, J=1 7,0, S M, 1H) , 2,91 (dd, J=1 6,8, 3,7 r 1H) , 2,55 (m, 1H) , 1, 94 (m, 1H) , 1,80-: 1,45 (m, 5H) , 1, 27 (m, 1H) , 1,19 (m, 1H) .
Composto 38 XH (51 30 MHz, DMSO-D6) : δ 11 ,35 (s, 1H) , 8 , 60 (s, 1H) , 8,54 (s, 1H), 8, 09 (s, 1H), 4,55 (td, J=9,8, 3 ,8, 1H) , 4,10 (m, 1H) r 3,79 (s, 2H) , 3, 19 (dd, J= =16,9, 9 ,5, 1H) , 3, 13 (dd , J= 17 ,5, 4 ,5, 1H), 2, 39 (m, 1H) , 2, 01 (m, 1H) , 1,58 (m, 1H) , 1 ,48-1, 07 (m, 4H). EXEMPLO C:
Os dados da atividade para os metabolitos 1-39, juntamente com os dados da fração livre e remoção intrínseca, podem ser comparados com o do composto progenitor, Composto I. Testes de atividade de JAK, testes de fração livre e testes de remoção intrínseca são descritos em baixo. Os pontos de dados podem ser obtidos para estereoisómeros individuais dos metabolitos 1-39. Os metabolitos podem ser inibidores potentes de JAK1, JAK2 e JAK3, como o Composto I. 94
Teste In Vitro da quinase JAK
Os compostos aqui descritos podem ser testados quanto à atividade inibidora de alvos JAK de acordo com o seguinte teste in vitro descrito em Park et al., Analytical Biochemistry 1999, 269, 94-104. Os dominios catalíticos de JAK1 humana (a.a. 837-1142), de JAK2 (a.a. 828-1132) e de JAK3 (a.a. 781-1124), com uma cauda de His N-terminal, podem ser expressos utilizando baculovirus em células de inseto e purificados. A atividade catalítica de JAK1, JAK2 ou JAK3 pode ser analisada através da medição da fosforilação de um péptido biotinilado. O péptido fosforilado pode ser detetado por fluorescência resolvida no tempo homogénea (HTRF) . O valor IC50 dos compostos pode ser medido para cada quinase nas reações que contêm a enzima, o ATP e 500 nM de péptido em 50 mM de tampão Tris (pH 7,8), tampão com 100 mM de NaCl, 5 mM de DTT e 0,1 mg/mL (0,01%) de BSA . A concentração de ATP nas reações pode ser 90 μΜ para Jakl, 30 μΜ para Jak2 e 3 μΜ para Jak3. As reações podem ser efetuadas à temperatura ambiente durante 1 hora e, em seguida, paradas com 20 pL de 45 mM de EDTA, 300 nM de SA-APC, 6 nM de Eu-Py20 em tampão de ensaio (Perkin Elmer, Boston, MA) . A ligação ao anticorpo marcado com Európio pode durar 40 minutos e o sinal HTRF pode ser medido num leitor de placas Fusion (Perkin Elmer, Boston, MA) . Os compostos tendo um valor de IC50 de 10 μΜ ou inferior para qualquer um dos JAK acima mencionados, podem ser considerados ativos.
Teste de Fração Livre A proteina de ligação de um composto teste pode ser determinada por diálise em equilíbrio utilizando um sistema Dianorm da Harvard Apparatus (Holliston, MA) . A diálise 95 pode ser realizada a 37 °C durante 2 horas no soro humano. Os metabolitos podem ser incubados a 3 μΜ e o Composto I a 3 e 10 μΜ. As concentrações de composto no soro e no tampão após a diálise podem ser determinadas por análise por LC/MS/MS. A fração livre é definida como a razão entre a concentração do tampão e a do soro.
Teste de Remoção intrínseca A remoção intrínseca pode ser determinada através da incubação de 1 μΜ de composto teste em microssomas do fígado humanos com mistura de géneros (0,5 mg/mL de proteína) a 37 °C na presença de 1 mM de NADPH. O desaparecimento do composto teste pode ser monitorizado por LC/MS aos 0, 5, 10, 20 e 30 min. O declive do declínio da concentração do composto pode ser usado para calcular a remoção intrínseca humana empregando métodos padrão descritos na literatura.
Lisboa, 07 de Novembro de 2013

Claims (8)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Um composto de Fórmula I:
ou um sal farmacologicamente aceitável dele derivado, em que: n grupos C-H são, cada um, independentemente substituídos com C-OH; ou, um grupo 0¾ é independentemente substituído com um C=0; ou, um grupo C-H é substituído por:
dois grupos C-H são, cada um, independentemente substituídos com C-OH e um grupo C-H é substituído por: 2
n é 1, 2, 3 ou 4; desde que o composto não seja selecionado a partir de: 3-(4-(7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-lH-pirazol-1-il)-3-(3-hidroxiciclopentil)propanonitrilo; 3-(4-(7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-lH-pirazol-1-il)-3-(2-hidroxiciclopentil)propanonitrilo; 3-(4-(7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-lH-pirazol-1-il)-3- (3-oxociclopentil)propanonitrilo; e sais farmacologicamente aceitáveis deles derivados. 2. 0 composto da reivindicação 1, ou um sal farmacologicamente aceitável dele derivado, em que: o átomo de carbono alfa para o grupo ciano não é substituído com um grupo C-OH ou C=0; e o átomo de carbono beta para o grupo ciano não é substituído com um grupo C-OH. 3. 0 composto da reivindicação 1 ou 2, ou um sal farmacologicamente aceitável dele derivado, em que n grupos C-H são, cada um, substituídos independentemente com C-OH. 3 4. 0 composto da reivindicação 1 ou 2, ou um sal farmacologicamente aceitável dele derivado, em que n é 1. 5. 0 composto da reivindicação 1 ou 2, ou um sal farmacologicamente aceitável dele derivado, em que n é 2 . 6. 0 composto da reivindicação 1 ou 2, ou um sal farmacologicamente aceitável dele derivado, em que n é 3. 7. 0 composto da reivindicação 1 ou 2, ou um sal farmacologicamente aceitável dele derivado, em que n é 4 . 8. 0 composto da reivindicação 1 ou 2, ou um sal farmacologicamente aceitável dele derivado, em que um grupo CH2 é substituido independentemente com um C=0. 9. 0 composto da reivindicação 1 ou 2, ou um sal farmacologicamente aceitável dele derivado, em que um grupo C-H é substituido com
10. O composto da reivindicação 1 ou 2, ou um sal farmacologicamente aceitável dele derivado, em que um grupo C-H saturado é substituido com 4 4
CO?H OH '0 OH OH 11. 0 composto da reivindicação 1 ou 2, ou um sal farmacologicamente aceitável dele derivado, em que dois grupos C-H são, cada um, substituidos independentemente com C-OH e um grupo C-H é substituido por:
12. Um composto da reivindicação 1, selecionado a partir de: Ácido 6-(3 - (1- (4-(7H-pirrolo[2,3 — d]pirimidin-4-il)-1H-pirazol-l-il)-2-cianoetil)ciclopentiloxi) -3,4,5-trihidroxitetrahidro-2H-piran-2-carboxilico 3-(4-(7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-lH-pirazol-1-il)-3-(1,2-dihidroxiciclopentil)propanonitrilo; e 3-(4-(7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-lH-pirazol-1-il)-3-(1-hidroxiciclopentil)propanonitrilo; ou um sal farmacologicamente aceitável de qualquer um dos acima mencionados.
13. Um composto da reivindicação 1, selecionado a partir de: 5 3-(4-(7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-lH-pirazol-1-il)-3-(1-hidroxiciclopentil)propanonitrilo; 3 - (4 - (7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-lH-pirazol-1-il)-3-ciclopentil-3-hidroxipropanonitrilo ; 3-(4-(7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-lH-pirazol-1-il)-3-ciclopentil-2-hidroxipropanonitrilo; 3-ciclopentil-3-(5-hidroxi-4-(7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-ΙΗ-pirazol-l-il)propanonitrilo; 3-ciclopentil-3-(3-hidroxi-4-(7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-ΙΗ-pirazol-l-il)propanonitrilo; 3-ciclopentil-3-(4-(5-hidroxi-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-ΙΗ-pirazol-l-il)propanonitrilo; 3-ciclopentil-3-(4-(6-hidroxi-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-ΙΗ-pirazol-l-il)propanonitrilo; 3-ciclopentil-3-(4(2-hidroxi-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-ΙΗ-pirazol-l-il)propanonitrilo; 3-(4-(7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-lH-pirazol-1-il)-3-(1,2-dihidroxiciclopentil)propanonitrilo; 3-(4-(7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-lH-pirazol-1-il)-3-(1,3-dihidroxiciclopentil)propanonitrilo; 3-(4-(7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-lH-pirazol-1-il)-2-hidroxi-3-(1-hidroxiciclopentil)propanonitrilo; 3-(4-(7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-lH-pirazol-1-il)-3-hidroxi-3-(1-hidroxiciclopentil)propanonitrilo; 6 3-(3-hidroxi-4-(7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-1H-pirazol-l-il)-3-(1-hidroxiciclopentil)propanonitrilo; 3-(4-(2-hidroxi-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-1H-pirazol-l-il)-3-(1-hidroxiciclopentil)propanonitrilo; 3-(4-(5-hidroxi-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-1H-pirazol-l-il)-3-(1-hidroxiciclopentil)propanonitrilo; 3-(4-(6-hidroxi-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-1H-pirazol-l-il)-3-(1-hidroxiciclopentil)propanonitrilo; 3-(5-hidroxi-4-(7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-1H-pirazol-l-il)-3-(1-hidroxiciclopentil)propanonitrilo; 3-(4-(7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-lH-pirazol-1-il)-2-hidroxi-3-(2-hidroxiciclopentil)propanonitrilo; 3 - (4-(7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-lH-pirazol-1-il)-3-(2,3-dihidroxiciclopentil)propanonitrilo; 3-(4-(7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-lH-pirazol-1-il) -3-(2,4-dihidroxiciclopentil)propanonitrilo; 3-(4-(7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-lH-pirazol-1-il)-3-(2,5-dihidroxiciclopentil)propanonitrilo; 3-(4-(7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-lH-pirazol-1-il)-3-hidroxi-3-(2-hidroxiciclopentil)propanonitrilo; 3-(3-hidroxi-4-(7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-1H-pirazol-l-il)-3-(2-hidroxiciclopentil)propanonitrilo; 7 3-(4-(2-hidroxi-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-1H-pirazol-l-il)-3-(2-hidroxiciclopentil)propanonitrilo; 3-(4-(5-hidroxi-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-1H-pirazol-l-il)-3-(2-hidroxiciclopentil)propanonitrilo; 3-(4-(6-hidroxi-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-1H-pirazol-l-il)-3-(2-hidroxiciclopentil)propanonitrilo; 3-(5-hidroxi-4-(7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-1H-pirazol-l-il)-3-(2-hidroxiciclopentil)propanonitrilo; 3-(4-(7H-pirrolo[2,3 — d]pirimidin-4-il)-lH-pirazol-1-il)-2-hidroxi-3-(3-hidroxiciclopentil)propanonitrilo; 3-(4-(7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-lH-pirazol-1-il)-3-(3,4-dihidroxiciclopentil)propanonitrilo; 3 - (4 - (7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-lH-pirazol-1-il)-3-hidroxi-3-(3-hidroxiciclopentil)propanonitrilo; 3-(5-hidroxi-4-(7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-1H-pirazol-l-il)-3-(3-hidroxiciclopentil)propanonitrilo; 3-(3-hidroxi-4-(7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-1H-pirazol-l-il)-3-(3-hidroxiciclopentil)propanonitrilo; 3-(4-(2-hidroxi-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-1H-pirazol-l-il)-3-(3-hidroxiciclopentil)propanonitrilo; 3-(4-(5-hidroxi-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-1H-pirazol-l-il)-3-(3-hidroxiciclopentil)propanonitrilo; 3-(4-(6-hidroxi-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-1H-pirazol-l-il)-3-(3-hidroxiciclopentil)propanonitrilo; 3-(3-hidroxi-4-(7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-1H-pirazol-l-il)-3-(3-hidroxiciclopentil)propanonitrilo 3-(4-(2-hidroxi-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-1H-pirazol-l-il)-3-(3-hidroxiciclopentil)propanonitrilo 3-(4-(5-hidroxi-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-1H-pirazol-l-il)-3-(3-hidroxiciclopentil)propanonitrilo 3-(4-(6-hidroxi-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il) -1H-pirazol-l-il)-3-(3-hidroxiciclopentil)propanonitrilo 3-(4-(7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-lH-pirazol-1-il)-3-ciclopentil-2,3-dihidroxipropanonitrilo; 3-ciclopentil-3-hidroxi-3-(3-hidroxi-4-(7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-lH-pirazol-1-il)propanonitrilo; 3-ciclopentil-3-hidroxi-3-(4-(2-hidroxi-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-lH-pirazol-1- il)propanonitrilo; 3-ciclopentil-3-hidroxi-3-(4-(5-hidroxi-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-lH-pirazol-1-il)propanonitrilo; 3-ciclopentil-3-hidroxi-3-(4-(6-hidroxi-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-lH-pirazol-1-il)propanonitrilo; 3-ciclopentil-3-hidroxi-3-(5-hidroxi-4-(7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-lH-pirazol-1-il)propanonitrilo; 9 3-ciclopentil-2-hidroxi-3-(3-hidroxi-4-(7H-pirrolo[2,3 — d]pirimidin-4-il)-lH-pirazol-1-il)propanonitrilo; 3-ciclopentil-2-hidroxi-3-(4-(2-hidroxi-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-lH-pirazol-1-il)propanonitrilo; 3-ciclopentil-2-hidroxi-3-(4-(5-hidroxi-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-lH-pirazol-1-il)propanonitrilo; 3-ciclopentil-2-hidroxi-3-(4-(6-hidroxi-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-lH-pirazol-1-il)propanonitrilo; 3-ciclopentil-2-hidroxi-3-(5-hidroxi-4-(7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-lH-pirazol-1- il)propanonitrilo; 3-ciclopentil-3-(3,5-dihidroxi-4-(7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-lH-pirazol-l-il)propanonitrilo; 3-ciclopentil-3-(3-hidroxi-4-(2-hidroxi-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-lH-pirazol-1-il)propanonitrilo; 3-ciclopentil-3-(3-hidroxi-4-(5-hidroxi-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-lH-pirazol-1-il)propanonitrilo; 3-ciclopentil-3-(3-hidroxi-4-(6-hidroxi-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-lH-pirazol-1-il)propanonitrilo; 10 3-ciclopentil-3-(4-(2,5-dihidroxi-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-lH-pirazol-l-il)propanonitrilo; 3-ciclopentil-3-(4-(2,6-dihidroxi-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-ΙΗ-pirazol-l-il)propanonitrilo; 3-ciclopentil-3-(4-(5,6-dihidroxi-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-ΙΗ-pirazol-l-il)propanonitrilo; 3-ciclopentil-3-(5-hidroxi-4-(2-hidroxi-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-lH-pirazol-1-il)propanonitrilo; 3-ciclopentil-3-(5-hidroxi-4-(5-hidroxi-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-lH-pirazol-1-il)propanonitrilo; 3-ciclopentil-3-(5-hidroxi-4-(6-hidroxi-7H-pirrolo[2,3 — d]pirimidin-4-il)-lH-pirazol-1-il)propanonitrilo; Cianeto de 2-(4-(7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-1H-pirazol-l-il)-2-ciclopentilacetilo ; 3-(4-(7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-lH-pirazol-1-il)-3- (2-oxociclopentil)propanonitrilo; Ácido 6- (1- (1- (4-(7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-1H-pirazol-l-il)-2-cianoetil)ciclopentiloxi)-3,4,5-trihidroxitetrahidro-2H-piran-2-carboxílico; Ácido 6-(l-(4-(7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-1H-pirazol-l-il)-2-ciano-l-ciclopentiletoxi)-3,4,5-trihidroxitetrahidro-2H-piran-2-carboxílico; 11 Ácido 6-(2 - (1- (4-(7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-1H-pirazol-l-il)-2-cianoetil)ciclopentiloxi) -3,4,5-trihidroxitetrahidro-2H-piran-2-carboxílico; Ácido 6-(2-(4-(7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-1H-pirazol-l-il)-2-ciano-2-ciclopentiletoxi) -3,4,5-trihidroxitetrahidro-2H-piran-2-carboxílico; e Ácido 6-(3 - (1-(4-(7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-1H-pirazol-l-il)-2-cianoetil)ciclopentiloxi)-3,4,5-trihidroxitetrahidro-2H-piran-2-carboxílico; ou um sal farmacologicamente aceitável de qualquer um dos acima mencionados.
14. Um composto da reivindicação 1 selecionado a partir de: 3-ciclopentil-3-(4-(2,6-dioxo-3,5,6,7-tetrahidro-2H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-lH-pirazol-1-il)propanonitrilo; 3-ciclopentil-3-(4-(2-hidroxi-6-oxo-6,7-dihidro-5H-pirrolo[2,3 — d]pirimidin-4-il)-lH-pirazol-1-il)propanonitrilo; 3-ciclopentil-3-(4-(6-oxo-6,7-dihidro-5H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-lH-pirazol-l-il)propanonitrilo; 3-(3-hidroxiciclopentil)-3-(4-(6-oxo-6,7-dihidro-5H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-lH-pirazol-1-il)propanonitrilo; 12 3- ciclopentil-3-(4-(5,6-dihidroxi-6,7-dihidro-5H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-lH-pirazol-1- il)propanonitrilo; e Ácido 6- (4- (1- (2-ciano-l-ciclopentiletil)-lH-pirazol- 4- il)7H-pirrolo[2,3 — d]pirimidin-7-il)-3,4,5-trihidroxitetrahidro-2H-piran-2-carboxílico; ou um sal farmacologicamente aceitável de qualquer um dos acima mencionados.
15. Um composto da reivindicação 1 selecionado a partir de: Ácido 6- (4- (1- (2-ciano-l-ciclopentiletil)-lH-pirazol-4-il)-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-5-iloxi)-3,4,5-trihidroxitetrahidro-2H-piran-2-carboxilico; Ácido 6- (4- (1- (2-ciano-l-ciclopentiletil)-lH-pirazol-4-il)-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-6-iloxi)-3,4,5-trihidroxitetrahidro-2H-piran-2-carboxilico; Ácido 6- (4- (1- (2-ciano-l-ciclopentiletil)-lH-pirazol-4-il)-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-2-iloxi)-3,4,5-trihidroxitetrahidro-2H-piran-2-carboxílico; e Ácido 6- (4- (1- (2-ciano-l-ciclopentiletil)-lH-pirazol-4-il)-7H-pirrolo[2,3 — d]pirimidin-7-iloxi)-3,4,5-trihidroxitetrahidro-2H-piran-2-carboxilico; ou um sal farmacologicamente aceitável de qualquer um dos acima mencionado. 13 16. 0 composto de qualquer uma das reivindicações 1-15, ou um sal farmacologicamente aceitável dele derivado, o qual é substancialmente isolado.
17. Uma composição compreendendo um composto de qualquer uma das reivindicações 1-15, ou um sal farmacologicamente aceitável dele derivado, e pelo menos um veiculo farmacologicamente aceitável.
18. A composição da reivindicação 17, a qual é adequada para administração oral. Lisboa, 07 de Novembro de 2013
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